JP4434479B2 - 標的の細胞および組織においてタンパク質を選択的に発現するための核酸配列および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は遺伝子治療に一般的に関する。さらに詳細には、本発明は、標的の細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための合成核酸配列に関する。この細胞または組織において、タンパク質をコードする親の核酸配列の少なくとも１つの存在コドンが類義コドンで置換されている。本発明はまた、１つ以上の合成核酸配列および本発明の方法を用いてのウイルス粒子の産生に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療が遺伝子欠陥の処置として臨床的に非常に興味深いものであるにもかかわらず、この治療が臨床現場で主流にならないないのは、標的の組織に対して遺伝子を選択的に送達するのが極めて困難であることが証明されているからである。現在、ウイルスベクター、特にレトロウイルスおよびアデノウイルスが使用されており、これらはある程度は選択的である。しかしながら、多くのベクター系はその本質からして安定な組込み体を産出できず、なかにはまた、免疫反応を起こして効果的な処置を妨害するものもある。あるいは、「裸」DNAがリポゾームまたは他の類似の送達系に封入される。解決すべき重要な問題は、特定の組織に対して遺伝子を選択的に標的化することが多くの疾患治療（例えばガン治療）にとって望ましいにもかかわらず、上述のような遺伝子送達系自体が組織選択的ではないことである。組織特異性プロモーターを使用した標的遺伝子治療は、ある種の動物モデルにおいては効果的ではあるが、ヒトの場合はそれほどの効果は証明されていない。そして、選択的組織特異性プロモーターは広範な組織に利用されていない。
【０００３】
本発明は、パピローマウイルス（PV）後期遺伝子がなぜ分化した角化細胞に限って発現するのかを調べた最近の研究から予想外になされた。この点について、PV後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は非分割分化角化細胞（ＫＣ）にのみ発現することがわかった。本発明者をはじめ多くの研究者達は、一連の、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）を含む通常のウイルスプロモーター、およびＣＭＶおよびＳＶ４０の強い構成プロモーターを使用して、重要なＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパク質の発現を、これらの遺伝子が未分化培養細胞中に形質導入またはトランスフェクトされたときに、検出できなかった。
【０００４】
しかしながら、ＰＶ Ｌ１ ｍＲＮＡは、ラビット・網状赤血球細胞溶解物を使用してインビトロで効果的に翻訳することができ、このことは、溶解物中にＬ１の翻訳を妨害する細胞阻害物質が存在しないことを示唆している。インビトロ翻訳系とインビボ翻訳系との主な相違点は、インビトロ翻訳反応においてはＬ１が優性Ｌ１ ｍＲＮＡを含むのに対し、無傷細胞内においてはＬ１が細胞ｍＲＮＡ中のマイナーフラクションを構成することである。
【０００５】
インビボにおいてＰＶ後期タンパク質は未分化ＫＣ内で産生されない。しかし、高度に分化したＫＣにおいては、このタンパク質は大量に発現される。後期遺伝子発現のこのきびしい調節メカニズムは、あまり理解されておらず、多数のグループによるＫＣ特異性ＰＶ遺伝子転写調節タンパク質の研究は、満足できる結果を得ていない。
【０００６】
インビボにおけるＬ１ ｍＲＮＡ翻訳の遮断は、Ｌ１ ＯＲＦ内における配列に起因すると考えられている（Tan et al.,1995,J.Virol.69 5607-5620; Tan and Schwartz, 1995, J. Virol. 69 2932-2945)。ＨＩＶのＲｅｖおよびＲｅｖ応答エレメントを使用すると、そのような阻害は克服できる（Tan et al. 1995, 後述)。したがって、本発明者は、Ｌ１ ＯＲＦにおける推定「阻害配列」の除去が未分化細胞内でのＬ１タンパク質の産生を可能にするかを調べた。推定配列の除去のためのＢＰＶ Ｌ１の欠失変異生成およびＣＶ−１細胞中で結果として生じる欠失突然変異体の発現からは、意外なことに、Ｌ１ ｍＲＮＡの発現にもかかわらず、Ｌ１タンパク質は検出できなかった。
【０００７】
前述の状況から理解するのがこれまで困難であったことは、パピローマウイルスが、この明らかに「翻訳不能な」遺伝子を利用して、ライフサイクル後期において、いかにして大量のＬ１タンパク質を産出するのかである。
【０００８】
しかしながら意外にも、ＰＶ Ｌ１タンパク質を、未分化宿主細胞において実質的に高レベルで産生し得ることが分かった。この産生は、天然Ｌ１遺伝子の存在コドンを、存在コドンと比較して未分化宿主細胞遺伝子で比較的高頻度で使用される類義コドンによって置換することでなされる。予想に反して、それぞれ違った細胞や組織において特定イソ受容ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の相対存在量が相違すること、およびこの相違が一定のコドン使用または組成を有する遺伝子からのタンパク質発現に重要な役割を果たすことが判明した。この発見によって、合成核酸配列および一般的な方法が実際的となった。そこでは、コドン改変を、特定の細胞または組織に対して、あるいは特殊な分化状態にある細胞に対するタンパク質の標的発現の手段として使用する。
【０００９】
（発明の対象）
本発明の目的は、合成核酸配列および標的の細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現する方法を提供することである。この配列および方法は、先行技術についての欠点の少なくともいくつかを改善するものである。
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明の１つの観点は、一つのタンパク質が哺乳動物の標的細胞または組織において選択的に発現しうるが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しない合成ポリヌクレオチドを構築する方法を提供するものであって、該方法は、親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在するコドンを類義コドンで置換して、該合成ポリヌクレオチドを形成する工程を包含する。
【００１１】
適切には、該方法は、上記類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡが、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するように類義コドンを選択する工程をさらに包含する。
【００１２】
好ましくは、選択工程が、下記工程によってさらに特徴付けられる；
（ａ）該標的の細胞または組織および１以上の他の細胞または組織において相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量を測定すること、および
（ｂ）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００１３】
好ましくは、選択工程は、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
あるいは、上記工程は、該類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、標的の細胞または組織から誘導された細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
【００１４】
好都合には、該選択工程は、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡが、該１以上の他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて、少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在することをさらに特徴とする。
【００１５】
あるいは、該方法は、次の（１）〜（８）よりなる群から該類義コドンを選択する工程をさらに包含する；（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）該１以上の他の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）該１以上の他の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）他の生物体の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（８）他の生物体の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン。
【００１６】
好ましい実施態様において、該方法は、該タンパク質が、該標的の細胞または組織における該親ポリヌクレオチドから発現されるタンパク質に比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで、該標的細胞または組織における該合成ポリヌクレオチドから発現するように、少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを選択する工程を包含する。
【００１７】
別の観点において、本発明は、上記方法のいずれかに従って構築された合成ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
好ましくは、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化細胞である。
より具体的には、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化ケラチノサイトである。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の標的細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための方法であって、該方法は下記工程を包含する；
（ａ）該タンパク質をコードする親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該タンパク質が該標的細胞または組織で選択的に発現され得るが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しないように該親ポリヌクレオチドに比べると異なる翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生すること；
（ｂ）１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを、哺乳動物に投与し、該標的の細胞または組織、または該標的の細胞または組織の前駆細胞または前駆組織に導入すること；
（ｃ）該標的の細胞または組織において該タンパク質を選択的に発現させるが、１以上の他の細胞または組織において発現しないこと。
【００２０】
好ましくは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む；
（ｉ）該標的の細胞または組織および該１以上の他の細胞または組織において相違のイソ−tＲＮＡの相対存在量を測定する。
（ii）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００２１】
適当には、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００２２】
あるいは、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
あるいは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む。（Ｉ）標的の細胞または組織の遺伝子、（II）各々他の細胞または組織の遺伝子、（III）哺乳動物の遺伝子および（IV）他の生物体の遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子により使用される特定のコドンの夫々の比較頻度に基づいて該少なくとも１つの存在コドンおよび該類義コドンを同定すること。
【００２３】
他の観点において、本発明は、第１ポリヌクレオチドから標的の細胞または組織でタンパク質を発現さす方法を提供する。この方法は、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組織中に、少なくとも１つのイソ受容tＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを導入すること、ここで、該第２ポリヌクレオチドは１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結しており、該少なくとも１つのイソtＲＮＡは該標的の細胞または組織において比較的低量で正常に存在し、該第１ポリヌクレオチドのコドンに対応する、からなる工程を含む。
【００２４】
さらなる観点において、本発明は周期中真核細胞におけるウイルス粒子を産生する方法に及ぶ。該ウイルス粒子はその集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに充分なレベルでは親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該方法は次の工程を含む。
（ａ）該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該親ポリヌクレオチドに比べると変化した翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生する。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞中で該合成ポリヌクレオチドから発現が可能である。
（ｂ）該細胞またはその前駆体細胞中に、１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを導入する。
（ｃ）少なくとも１つのタンパク質を該細胞中で、該ウイルス粒子の集合に必要な他のウイルスタンパク質の存在下で発現し、もって該ウイルス粒子を産生する。
【００２５】
本発明のさらなる観点において、周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法が提供される。該ウイルス粒子はその粒子の集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンは、該少なくとも１つのタンパク質の産生を該レベルにまで律速的にする。該方法は、該細胞中に、該少なくとも１つのコドンに特異的なイソ受容 t ＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチドを、導入する工程を含む。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動物遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２７】
図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動物遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−１Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２８】
図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、真核細胞における最適発現のために修飾された天然配列に同じであるが、パピロマウイルス遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２９】
図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現されるＬ１タンパク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３６時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３０】
図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【００３１】
図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダイゼーションによって調べた。
【００３２】
図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現されたＬ２タンパク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３６時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３３】
図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ２およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【００３４】
図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダイゼーションによって調べた。
【００３５】
図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成Ｌ１（ＨＢ）のインビトロ翻訳を表わす。ウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物を35Ｓ−メチオニンの存在において使用した。上部のパネルにおいて、ｗｔＬ１またはＨＢＬ１のプラスミドＤＮＡをＴ７ＤＮＡポリメラーゼ結合インビトロ翻訳系に加えた。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロット法で検出した。下部のパネルにおいて、ｗｔＬ１またはＨＢＬ１配列の翻訳効率をｔＲＮＡの存在または不存在で比較した。翻訳をウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物において行ない、８分から出発して２分毎にサンプルを収集した。下部パネルの左側は１０-5Ｍのウシ肝臓または酵母ｔＲＮＡが供給されたかを表わす。
【００３６】
図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定するのに用いたプラスミドの模式的表示である。野性型Ｌ１配列および大部分の野性型Ｌ２配列がＢＰＶ１ゲノムからＢａｍＨＩおよびＨindIII消化により検出され、残りのＢＰＶ１配列（黄色）をｐＵＣ１８にクローンした。野性型または合成ヒト化Ｌ２配列（赤色）をＢＰＶ１ゲノムのＢａｍＨＩ部位に挿入した。挿入ＳＶ４０ｏｒｉ配列（白色）の位置を表示する。修飾Ｌ２が使用されているが、ＳＶ４０ｏｒｉ配列のないプラスミドを対照として用いた。プラスミドをＣｏｓ−１細胞中にトランスフェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクローナル抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。
【００３７】
図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２タンパク質の発現を表わす。図５Ａで示されたプラスミドを用いてＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクローナル抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。細胞がプラスミドを受けつけない偽のトランスフェクションを対照として用いた。
【００３８】
図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。ｇｆｐまたはｐｇｆｐでトランスフェクトされた細胞から抽出されたｍＲＮＡは、32Ｐ標識ｇｆｐプローブでプローブされ、参照遺伝子としてgapdhを用いて、右側のパネルに示す。
【００３９】
図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのインビボでのＧＦＰの発現パターンを表わす。遺伝子銃を用いて、マウスにＧＦＰタンパク質をコードするＰＧＦＰ（左側パネル）およびＧＦＰ（右側パネル）発現プラスミドを射入した。マウス皮膚の横断面はｇｆｐ遺伝子が発現される箇所を表わす。同じ箇所の明るい視野の写真は、真皮（Ｄ）および表皮（Ｅ）を明示し、表皮における蛍光の位置を同定する。矢印は蛍光シグナルを示す。
【００４０】
（詳細な説明）
本発明は次のような予想されない発見から生じた。相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量が、別異の細胞または組織あるいは分化の別異の段階または細胞周期の別異なの段階にある細胞または組織において変化すること、および該相違が遺伝子のコドン組成とともにおこり、特定の細胞または組織に対して、あるいは分化の特異な状態または細胞周期の特異な段階にある細胞または組織に対してタンパク質の発現の調節および指令をなすことを発見した。本発明により、この選択的標的化は、タンパク質をコードする親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換することで実施される。
【００４１】
存在コドンを類義コドンで置換すること自体は新しくない。この点について国際出願公開Ｎｏ.ＷＯ９６／０９３７８を引用する。この出願で該置換が使用されているのは、インビトロ哺乳動物細胞培養系において高レベルで真核細胞またはウイルスに由来するタンパク質を発現する方法においてである。この方法の要点は該タンパク質を収穫することである。これに反して、本発明では、特定の細胞または組織に対して遺伝子の発現を標的化するために、遺伝子中の１以上のコドンの置換を使用し、その最終目的は本明細書記載のような遺伝子治療を容易にすることである。
【００４２】
用語“類義コドン”とは、存在コドンと相違するヌクレオチド配列を有するが、存在コドンと同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。
【００４３】
用語“イソ受容 t ＲＮＡ”は、アンチコドン構造が相違するが、同じアミノ酸に特異的である１以上の転移ＲＮＡ分子を意味する。
【００４４】
本明細書を通して、別記しない限り、用語“含む”および“包含する”は、記述した物または群を含み、他の物または群を排除するものでないと理解されるべきである。
【００４５】
（類義コドンの選択）
別異の細胞における相違するｔＲＮＡ種の相対存在量の測定
【００４６】
好都合に、類義コドンはイソｔＲＮＡに対応する。このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比較すると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比べて標的細胞または組織中に高い量で存在する。
【００４７】
２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの比較量を測定するには、いかなる方法も利用できる。例えば、該方法には、哺乳動物から２以上の特定の細胞または組織を単離し、ｔＲＮＡ含有の各細胞または組織からＲＮＡ抽出物を得て、各々が特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違の核酸配列で各抽出物を夫々プローブして、２以上の細胞または組織間のイソｔＲＮＡの比較量を測定する。
【００４８】
特定の細胞または組織を単離する適切な方法は当業者によく知られている。例えば、細胞または組織の１以上の特性を利用して異種集団から細胞または組織を特異的に単離することができる。該特性には、限定するわけではないが、組織の解剖的位置、細胞密度、細胞サイズ、細胞形態、細胞代謝活性、Ｃａ2+、Ｋ+およびＨ+などのイオンの細胞摂取、染料などの化合物の細胞摂取、細胞表面で発現されるマーカー、サイトカイン発現、タンパク質蛍光および膜電位がある。この点について使用できる適当な方法には、組織の外科的除去、蛍光活性セルソーター（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法、免疫親和性分離（例えば、Ｄynabead（商標）分離などの磁気ビード分離）、密度分離（メトリサミド、Ｐercoll（商標）またはＦicoll（商標）の順次遠心分離）および細胞型特異的密度分離（例えば、Ｌymphoprep（商標））がある。例えば、分割細胞または芽細胞は、ＦＡＣＳまたはメトリザミド順次分離によって細胞サイズに従って、非分割細胞または残留細胞から分離される。
【００４９】
細胞または組織から全ＲＮＡを単離するためにいかなる適当な方法も用いられる。本発明で用い得る典型的な方法は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａusubel，et al.，eds）（Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons，Ｉnc.１９９７）（出典明示により本明細書の一部とする）の頁４.２.１から頁４.２.７に記載されている。好ましくはｔＲＮＡの単離に適した方法は、例えばＢrunngraber，Ｅ.Ｆ.（１９６２，Ｂiochem，Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.８：１−３）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のように行なわれる。
【００５０】
ＲＮＡのプローブは、特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違のオリゴヌクレオチド配列で行なわれる。対象とする哺乳動物にとって、哺乳動物により発現される特定のイソｔＲＮＡ配列で特異的にハイブライドするオリゴヌクレオチド配列を選択する必要がある。該選択は、既知のイソｔＲＮＡ配列を基とする従来技術の一つの中にはいる。例えば、マウスの場合、用い得る例示的オリゴヌクレオチド配列には、Ｇauss and Ｓprinzel（１９８３，Ｎucleic Ａcids Ｒes.１１（１））（出典明示により本明細書の一部とする）記載のものがある。この点について、オリゴヌクレオチドは下記よりなる群から選択し得る。
【００５１】
5'-TAAGGACTGTAAGACTT-3' (配列番号13) AlaGCA
5'-CGAGCCAGCCAGGAGTC-3' (配列番号14) ArgCGA
5'-CTAGATTGGCAGGAATT-3' (配列番号15) AsnAAC
5'-TAAGATATATAGATTAT-3' (配列番号16) AspGAC
5'-AAGTCTTAGTAGAGATT-3' (配列番号17) CysTGC
5'-TATTTCTACACAGCATT-3' (配列番号18) GluGAA
5'-CTAGGACAATAGGAATT-3' (配列番号l9) GlnCAA
5'-TACTCTCTTCTGGGTTT-3' (配列番号20) GlyGGA
5'-TGCCGTGACTCGGATTC-3' (配列番号21) HisCAC
5'-TAGAAATAAGAGGGCTT-3' (配列番号22) IleATC
5'-TACTTTTATTTGGATTT-3' (配列番号23) LeuCTA
5'-TATTAGGGAGAGGATTT-3' (配列番号24) LeuCTT
5'-TCACTATGGAGATTTTA-3' (配列番号25) LysAAA
5'-CGCCCAACGTGGGGCTC-3' (配列番号26) LysAAG
5'-TAGTACGGGAAGGATTT-3' (配列番号27) Metelong
5'-TGTTTATGGGATACAAT-3' (配列番号28) PheTTC
5'-TCAAGAAGAAGGAGCTA-3' (配列番号29) ProCCA
5'-GGGCTCGTCCGGGATTT-3' (配列番号30) ProCCI
5'-ATAAGAAAGGAAGATCG-3' (配列番号31) SerAGC
5'-TGTCTTGAGAAGAGAAG-3' (配列番号32) ThrACA
5'-TGGTAAAAAGAGGATTT-3' (配列番号33) TyrTAC
5'-TCAGAGTGTTCATTGGT-3' (配列番号34) ValGTA
【００５２】
典型的には、イソｔＲＮＡ種の相対存在量はブロッティング法により測定し得る。この方法は、サンプルのＲＮＡまたはｔＲＮＡ抽出物をマトリックス（好ましくは、ニトロセルロースなどの合成膜）上に固定する工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含む。ノーザン・ブロッティング法が、核酸プローブに相補的なＲＮＡ配列を同定するのに用いられる。あるいは、ドットブロッディングおよびスロットブロッティングが、相補的なＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ核酸配列を同定するのに用いられる。該技術は、Ａusubel et al.（前出）の頁２.９.１から２.９.２０に記載されている。
【００５３】
該技術によってマトリックス上に固定されたサンプルのｔＲＮＡは、放射活性的、酵素的または蛍光色素的に標識された相補的ヌクレオチド配列（上記したような）に、ストリジェンシィな条件でハイブリダイズされる。
【００５４】
“ストリジェンシィ”とは、ハイブリダイセイションにおける、ある種の有機溶媒の存在または無存在下での温度およびイオンの強化条件を意味する。ストリジェンシィが高くなると、固定ヌクレオチド配列（すなわち、イソｔＲＮＡ）と標識オリゴヌクレオチド配列との間の相補性の度合が増加する。使用できる典型的なストリジェンシィの条件については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前出）の頁２.１０.１から２.１０.１６および Molecular CLONING. A LABORATORY MANUAL（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，1989）の章１.１０１から１.１０４を参照のこと（出典明示により本明細書の一部とする）。
【００５５】
ストリジェンシィ洗滌は温度約４２°から６８℃で典型的には行なわれるが、当業者は、他の温度もストリジェンシィ条件として用いうることが分かるであろう。最大ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリドの形成についてのＴｍが約２０から２５以下で典型的に起こる。既知技術で知られているように、Ｔｍは、融点または２種の相補的核酸配列が解離する温度である。Ｔｍを判定する方法はよく知られている（参照、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、前出、頁２.１０.８）。最大のハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドについてＴｍが約１０°から１５℃以下で起きる。
【００５６】
他のストリジェンシィ条件はよく知られている。当業者は分かるように、種々の要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最大化する。最終洗滌のストリジェンシィを最適化すると、高度のハイブリダイゼーションが保証される。
【００５７】
固定化ヌクレオチド配列にハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列を検出する方法は、当業者によく知られている。この検出方法には、オートラジオグラフィー、化学ルミネッセンス、蛍光法および比色法が含まれる。
好都合には、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの相対存在量は、イソｔＲＮＡに特異的な標識ヌクレオチド配列の結合の各々のレベルを２以上の細胞または組織から得た固定ＲＮＡの同等量と比較することによりなされる。同様の比較を適当に実施すると、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの各々の相対存在量が測定される。当業者は、種々の細胞または組織について比較ｔＲＮＡ存在量が測定できる（参照、例えば表２）。該比較から、各類義コドンがイソｔＲＮＡに対応するように、１以上の類義コドンが選択される。このイソｔＲＮＡは、親核酸配列の存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織中での存在量が高い。
【００５８】
好都合には、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡの選択は、哺乳動物の各々他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在するようになされる。
【００５９】
適切には、分化細胞、好ましくは分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現のための類義コドンは、ｇｃａ（Ａｌａ）、ｃｕｕ（Ｌｅｕ）およびｃｕａ（Ｌｅｕ）よりなる群から選択される。
【００６０】
非分化細胞、好ましくは非分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現のための類義コドンは、ｃｇａ（Ａｒｇ）、ｃｃｉ（Ｐｒｏ）およびａａｇ（Ａｓｎ）よりなる群から選択される。
【００６１】
（コドン使用分析）
別法として、類義コドンは、（ｉ）特定の細胞または組織、（ii）哺乳動物の実質的に全ての細胞または組織、または（iii）哺乳動物の特定細胞または組織に感染し得る生物体、で発現される遺伝子についてコドンが使用されている頻度を分析することにより選択され得る。
【００６２】
コドン頻度表および生物体におけるコドン使用頻度の測定に適した方法は、例えばシャープらによる文献（1988，Nucleic Acids Res. 16 8207−8211）に記載されており、これを引用して説明の一部とする。
【００６３】
遺伝子発現の相対レベル（例、検出可能なタンパク質発現と検出可能なタンパク質発現無し）により、相異なる細胞または組織で発現される特異的イソ−ｔＲＮＡの相対存在量の間接的尺度が得られる。例えば、ウイルスは、第１の細胞または組織（特定の分化段階にある細胞または組織を含み得る）内では増殖し得るが、第２の細胞または組織（別の分化段階にある細胞または組織を含み得る）では実質的に増殖できない場合があり得る。すなわち、ウイルスの遺伝子によるコドン使用パターンを第２の細胞または組織で発現された遺伝子によるコドン使用パターンと比較すると、第２の細胞または組織に対し第１の細胞または組織において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドンが間接的に得られ、逆もまた同様である。同時に、上記比較はまた、第１の細胞または組織に対し第２の細胞または組織において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドンを間接的に提供し得る。
【００６４】
前述したことから、本発明による類義コドンは、（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）その他または互いに別の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）その他または互いに別の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）別の生物の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、および（８）別の生物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドンを含むコドンに対応し得るが、これらに限定されるわけではない。
【００６５】
例えば、哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドンは、cuc（Leu）、cuu（Leu）、cug（Leu）、uua（Leu）、uug（Leu）、cgg（Arg）、cgc（Arg）、aga（Arg）、agg（Arg）、agu（Ser）、agc（Ser）、ucu（Ser）、ucc（Ser）、およびuca（Ser）から成る群から選択され得る。別法として、上記コドンは、auu（Ile）、auc（Ile）、guu（Val）、guc（Val）、gug（Val）、acu（Thr）、acc（Thr）、aca（Thr）、gcu（Ala）、gcc（Ala）、gca（Ala）、cag（Glu）、ggc（Gly）、gga（Gly）、ggg（Gly）を含み得る。
【００６６】
哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されているコドンはシャープら（1988、前出）により報告されている。上記コドンには、cua（Leu）、cga（Arg）、cgu（Arg）、cgu（Arg）、ucg（Ser）が含まれ得る。別法として、上記コドンには、aua（Ile）、gua（Val）、acg（Thr）、gcg（Ala）、caa（Glu）、ggu（Gly）が含まれ得る。
【００６７】
（合成核酸配列の構築）
存在コドンを類義コドンに置換する段階は、適当なものであればいかなる技術によっても遂行され得る。例えば、当業界の熟練者に熟知されているインビトロ突然変異誘発方法が使用され得る。適当な突然変異誘発方法は、例えばアウスベルら（前出）およびサムブルックら（前出）の関連部分に記載されており、それらを引用して説明の一部とする。別法として、適当なＤＮＡ改変方法は、例えば米国特許第４１８４９１７号、第４３２１３６５号および第４３５１９０１号に開示されており、それらを引用して説明の一部とする。インビトロ突然変異誘発法ではなく、容易に入手可能な機械装置を用いても、第２の核酸配列が新たに合成され得る。ＤＮＡの連続合成については、例えば米国特許第４２９３６５２号に記載されており、これを引用して説明の一部とする。しかしながら、本発明は、存在コドンを類義コドンと置き換えるためのいずれか１つの特定技術に依存的なものではなく、それを指向するわけではない。
【００６８】
親核酸配列の存在コドン全てを、他の細胞と比べ標的細胞において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換する必要はない。部分置換であっても、発現増加は達成され得る。好ましくは、置換段階は、親核酸配列の存在コドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、さらに好ましくは３５％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上に影響を及ぼし得る。
【００６９】
親核酸配列は、好ましくは天然遺伝子である。「天然遺伝子」とは、タンパク質を自然にコードする遺伝子を包含する。しかしながら、親核酸配列が、天然には存在しないが組換え技術を用いる遺伝子工学で作られたタンパク質をコードすることはあり得る。
【００７０】
親核酸配列は、必ずしも哺乳動物から入手される必要はないが、適当な供給源、例えば真核生物または原核生物から入手され得る。例えば、親核酸配列は、別の哺乳動物または他の動物から得られる。別法として、親核酸配列は病原体から得られる。かかる場合、病原体の天然宿主は、好ましくは哺乳動物である。例えば、病原体は酵母、細菌またはウイルスであり得る。
【００７１】
例えば、本発明による選択的発現に使用され得る適当なタンパク質には、嚢胞性線維症貫膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）があるが、これらに限定はされない。ＣＦＴＲの場合、合成核酸配列の製造に利用され得るＣＦＴＲタンパク質をコードする親核酸配列については、例えばリオーダンら（1989，Science 245 1066-1073）、および受入れ番号ＨＵＭＣＦＴＲＭとしてジーンバンクのデータベースに記載されており、これらを引用して説明の一部とする。
【００７２】
ここで使用されている「核酸配列」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。
【００７３】
合成核酸配列の発現調節に使用され得る調節ヌクレオチド配列には、プロモーター、エンハンサーおよび転写ターミネーターがあるが、これらに限定されるわけではない。上記調節配列については、当業者に熟知されている。
【００７４】
本発明による合成核酸配列は、発現ベクター形態において１以上の調節配列に機能し得るように結合され得る。「ベクター」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは哺乳動物もしくは昆虫ウイルスから誘導される核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味し、そこへは合成核酸配列が挿入またはクローン化され得る。ベクターは、好ましくは１以上の特有の制限部位を含み、標的の細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその前駆組織を含む特定宿主細胞において自律複製することが可能であるか、またはクローン化配列が再生され得るように特定宿主のゲノムに組み込まれ得る。すなわち、「発現ベクター」とは、タンパク質合成を指図し得る自律要素を全て包含する。上記発現ベクターは、当業者にはよく知られている。
【００７５】
ここで使用されている「前駆細胞」の語は、標的細胞のもととなる細胞を包含する。
【００７６】
本発明はまた、タンパク質の目的部分をコードする合成核酸部分配列をも包含する。核酸部分配列は、それに伴う機能を有するタンパク質のドメインをコードし、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０、５０、１００、１５０または５００個の隣接アミノ酸をコードする。
【００７７】
合成核酸配列を標的細胞に導入する段階は、意図された用途および／または種類により異なり、非ウイルス性およびウイルス性ベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルスおよびアデノウイルス、例えばムリガン、Ｒ．Ｃ．、（1993，Science 260 926-932）に記載されたものを含み得、これを引用して説明の一部とする。上記方法としては、次のものが挙げられる。
【００７８】
（ｉ）注入（ウォルフら、1990，Science 247 1465−1468、これを引用して説明の一部とする）、外科的内植、点滴または他のいずれかの手段による合成核酸配列の局所適用法。この方法はまた、合成核酸配列によりコードされるタンパク質に応答性を示す細胞の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段による局所適用と組み合わせて使用されることにより、その処置の有効性を高め得る。この方法はまた、上記タンパク質の活性に要求される別の因子または複数因子の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段による局所適用と組み合わせて使用され得る。
【００７９】
（ii）ＤＮＡ（カラブレッタら、1993，Cancer Treat． Rev． 19 169−179、これを引用して説明の一部とする）またはＲＮＡを、単独またはリポソーム（ズーら、1993，Science 261 209−212、これを引用して説明の一部とする）、ウイルスカプシドまたはナノ粒子（バートリングら、1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390−405、これを引用して説明の一部とする）または他のいずれかのデリバリー仲介物質と組み合わせたものの注入による一般的全身デリバリー。合成核酸配列を標的分子に結合すること（例えば抗体を用いるいわゆる「魔弾」法）、または上記合成核酸配列から製造されるタンパク質の活性に要求される別の因子または複数因子または上記タンパク質に応答性を示す細胞の注入、外科的内植または他のいずれかの手段による局所適用により、標的化の改善が達成され得る。
【００８０】
（iii）細胞における合成核酸配列の発現を増加させるため、トランスフェクション（例えば、燐酸カルシウムの存在下：チェンら、1987，Mole．Cell Biochem. 7 2745−2752、またはカチオン脂質およびポリアミン類の存在下：ローズら、1991，BioTech. 10 520−525、これらの文献を引用して説明の一部とする）、感染、注入、電気穿孔（シゲカワら、1988，BioTech. 6 742-751、これを引用して説明の一部とする）または他の何らかの方法により生体外（エクスビボ）修飾された細胞の注入または内植または何らかの手段による送達。この修飾は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス性（例えばアデノウイルスまたはレトロウイルス性、ムリガン、1993，Science 260 926-932、ミラー、1992，Nature 357 455−460、サーモンズら、1993，Hum. Gen. Ther. 4 129−141、これらの文献を引用して説明の一部とする）または他のベクター、または他の修飾作用物質、例えばリポソーム（ズーら、1993，Science 261 209−212、これを引用して説明の一部とする）、ウイルスカプシドまたはナノ粒子（バートリングら、1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390−405、これを引用して説明の一部とする）または他の修飾伝達物質により伝達され得る。遺伝子または遺伝子産物送達ビークルとしての細胞の使用については、バールら、1991，Science 254 1507−1512およびダバンら、1991，Science 254 1509−1512により報告されており、これらの文献を引用して説明の一部とする。処理された細胞は、処置対象におけるその生存を助長する栄養素、成長因子、マトリックスまたは他の薬剤と組み合わせて送達され得る。
【００８１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の合成核酸配列および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
「薬学的に許容し得る担体」とは、全身投与で安全に使用され得る固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路によって、当業界で公知の様々な薬学的に許容し得る担体が使用され得る。これらの担体は、糖類、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール類、アルギン酸、燐酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水および発熱物質不含有水を含む群から選択され得る。
【００８３】
特定の細胞または組織における上記合成核酸配列からのタンパク質の発現を測定するのに適したものであれば、いかなる技術でも使用され得る。例えば、発現は、興味の対象であるタンパク質またはその一部に特異的な抗体を用いて測定され得る。上記抗体および測定技術は、当業者にはよく知られている。
【００８４】
（適用法）
本発明の一具体例において、標的細胞は、好適には分化した細胞である。有利には、分化細胞における選択的発現が所望されているタンパク質は、前記タンパク質に随伴する特定機能を発揮するのに十分なレベルで親核酸配列からその前駆細胞（例えば哺乳動物の未分化または低分化細胞）において発現することはできない。この具体例において、少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと置換する段階は、類義コドンが、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比較した場合、前駆細胞と比べ分化細胞での存在量が比較的高いイソ−ｔＲＮＡに対応することを特徴としている。従って、親核酸配列と比べて改変された翻訳速度を有する合成核酸配列が製造され、その場合タンパク質は、分化細胞においてタンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで発現可能であるが、このタンパク質は前駆細胞において上記機能の発揮に充分なレベルでは発現され得ない。
【００８５】
ここで使用されている「機能」の語は、生物学的または治療的機能を指す。
【００８６】
上記具体例は、未分化細胞、例えば幹細胞におけるタンパク質の過剰発現が幹細胞の死または分化を含め望ましくない結果を有する体細胞遺伝子治療において有利に利用され得る。かかる場合、適当なタンパク質には、嚢胞性線維症貫膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）が含まれる。
【００８７】
分化細胞は、上皮、造血または神経起源の細胞を含むあらゆる系統の細胞を包含し得る。例えば、分化細胞は、成熟分化ケラチノサイト（ケラチン生成細胞）であり得る。
【００８８】
幹細胞自体ではなく幹細胞の子孫に対するタンパク質の標的発現
上記で製造された合成核酸配列は、所望の機能のため分化細胞へ直接トランスフェクションされるかまたは別法として前駆細胞へトランスフェクションされ得る。例えば、ＡＤＡ欠損の場合、幹細胞におけるＡＤＡ発現の結果、望ましくないステム表現型の喪失が起こり得る。しかしながら、有利な治療は、１以上の調節配列に機能し得るように結合された合成核酸配列をオートロガス骨髄幹細胞に導入する方法に基づいたものであり得、その場合に野生型ＡＤＡ遺伝子の存在コドンは、骨髄幹細胞と比べ分化リンパ球において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換されている。次いで、形質導入された幹細胞は患者へ再注入され得る。この方法により、ＡＤＡ自体を発現し得ないが、治療効果をもたらすのに充分なレベルでＡＤＡを発現し得る分化リンパ球の再生可能な集団を生じさせ得る形質導入された骨髄幹細胞が得られる。この点で、この目的に適当な細胞供給源は、患者の末梢血または骨髄からのＣＤ３４陽性細胞として単離された幹細胞を含み得る。遺伝子送達のため、適当なベクターは、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルスを含み得る。
【００８９】
別法として、細胞性免疫を誘導する場合、樹状細胞は重要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるが、一旦活性化された抗原提示に関する寿命は１４ないし２１日間と非常に限られている。従って、樹状細胞は最適ではあり得ない比較的短期間の免疫刺激を供する。しかしながら、本発明によると、長期免疫刺激は、オートロガス骨髄誘導ＣＤ３４陽性樹状細胞前駆体に抗原、例えば黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１をコードする合成ヌクレオチド配列を導入することにより与えられ得、この場合、合成配列は１以上の調節配列に機能し得るように結合されており、ＭＡＲＴ−１をコードする野生型ヌクレオチド配列の存在コドンは、樹状細胞前駆体と比べ樹状細胞で比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換されている。次いで、形質導入された樹状細胞前駆体は、患者に再注入され得る。この方法により樹状細胞前駆体が得られる。この前駆体は、ＭＡＲＴ−１自体を発現し得ないが、ＭＡＲＴ−１を発現し得る樹状細胞の再生可能な集団を生じ得る。この樹状細胞によるＭＡＲＴ−１の発現は、ＭＡＲＴ−１抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の終生間欠性再刺激を可能にするのに充分なレベルである。
【００９０】
幹細胞の子孫ではなく幹細胞に対するタンパク質の標的発現
別の態様において、標的細胞は、タンパク質が、未分化細胞においてタンパク質に伴う特定機能を発揮するのに充分なレベルではタンパク質をコードする親核酸配列から発現し得ない未分化細胞であり得る。かかる場合、親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比べたとき、分化細胞と比べ未分化細胞で存在量が比較的高いイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンと置換されている。この結果、上記親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列が得られ、この場合タンパク質はタンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞において発現可能であるが、このタンパク質は上記機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞から誘導された分化細胞においては発現し得ない。
【００９１】
実例として、この上記態様を用いることにより、特定未分化細胞または幹細胞での発現時に特定細胞系譜に沿った幹細胞の分化を容易にする転写調節タンパク質の発現が行われ得る。かかる場合、調節タンパク質は、存在コドンが他のイソ−ｔＲＮＡと比べ幹細胞において存在量が比較的低いイソ−ｔＲＮＡに対応する遺伝子から正常に発現され、従ってタンパク質は、特定細胞系譜に沿って分化する幹細胞の増殖に関与するには充分なレベルでは発現され得ない。また、特定細胞系譜に沿って分化する上記の関与を利用することにより、特定系譜の細胞、例えば癌細胞の生成が阻止され得ることは明らかである。
【００９２】
別法として、この態様による方法を用いることにより、治療剤（複数も可）の製造に関与する転写調節タンパク質が発現され得る。かかるタンパク質としては、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）の製造に関与するＮＦ−カッパ−Ｂ転写因子ｐ６５サブユニット（ＮＦ―カッパ―Ｂ ｐ６５）および顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）が含まれ得る。ＮＦ―カッパ―Ｂ ｐ６５は、幹細胞で比較的低い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する若干の存在コドンを含むヌクレオチド配列により自然にコードされる。従って、上記配列は、この態様による親核酸配列として使用され得る。このタンパク質をコードする適当なヌクレオチド配列は、例えばライルら（1994、Gene 138 265−266）および受付番号ＨＳＮＦＫＢ６５ＡとしてＥＭＢＬデータベースに記載されており、これらを引用して説明の一部とする。
【００９３】
この態様に従い利用され得る適当な未分化細胞には、幹細胞、例えばＣＤ３４陽性造血幹細胞があるが、これに限定されるわけではない。
【００９４】
この態様はまた、導入遺伝子の進行的調節発現が望まれる遺伝子治療に有利に利用され得る。例えば、確実ではあるが可逆的な受胎能調節は、獣医業務およびヒトにおいて望ましい。上記調節は、１以上の調節配列の制御下で黄体化ホルモン（ＬＨ）拮抗物質または黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）拮抗物質をコードする合成核酸配列をオートロガス胸管上皮細胞に形質導入することにより行われ得る。合成核酸は、親核酸の存在コドンを、休止胸管上皮細胞で元の分化細胞と比べて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンと置換することにより製造され得る。一旦形質導入細胞が患者に移植されると、発現はプロゲストーゲン（progestagen）の経口投与により切断され得、余儀なく幹細胞の大多数が分化し、拮抗物質の発現が失われる。一旦妊娠が確立されると、抑止は、自然に生成されたプロゲストーゲンにより自続式になる。休止およびエストロゲン駆動胸部上皮細胞のイソ−ｔＲＮＡ組成は、まず整復乳房形成術から休止細胞を得、エストロゲンの存在および非存在下において細胞ｔＲＮＡ組成を測定することにより確立され得る。合成核酸配列は、細胞の生体外電気穿孔によりオートローガス休止上皮細胞へ導入され得、それに続いて形質導入細胞は患者へ皮下移植され得る。プロゲストーゲンは、受胎能調節の逆転に対する要求に応じて投与され得る。
【００９５】
哺乳動物の他の細胞ではなく腫瘍細胞への毒素の標的発現
腫瘍細胞を殺し得る多くの毒素および薬剤は利用可能である。しかしながら、これらの毒素および薬剤は、一般に分裂中の細胞全てに毒性を示す。それにもかかわらず、この問題は、腫瘍クローンにおいてイソ受容ｔＲＮＡ組成を確立し、哺乳動物の正常な分裂細胞と比べると腫瘍クローンにおいて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンを用いて合成毒素遺伝子（例、リシン遺伝子）または合成抗増殖遺伝子（例、腫瘍サプレッサーｐ５３）を構築することにより改善され得る。次いで、合成遺伝子を適当な手段により患者に導入すると、合成遺伝子が腫瘍細胞において選択的に発現する。
【００９６】
別法として、腫瘍で効果的に発現されるとは思われないコドンパターンを用いる化学療法促進産物遺伝子（すなわち、薬剤耐性遺伝子、例、多剤耐性遺伝子）も使用され得る。
【００９７】
標的遺伝子治療による体脂肪制御
レプチンは、飽満を制御することが知られているタンパク質である。しかしながら、動物データから類推すると、患者に投与するレプチンが多すぎる場合、レプチン誘導飢餓が起こり得る。有利には、非活性化脂肪細胞と比べて活性化脂肪細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンを含むレプチンをコードする合成遺伝子が構築され得る。次いで、合成遺伝子は、レプチンが非活性化脂肪細胞の場合とは反対に活性化脂肪細胞でのみ実質的に発現されるように適当な手段により患者に導入され得る。体脂肪代謝回転がレプチンにより低減化した食欲の影響下で減少すると、脂肪細胞の代謝活性およびレプチン産生がそれに応じて減少する。
【００９８】
細胞周期の段階に対するタンパク質の標的発現
本発明の別の態様では、標的細胞は周期外細胞であり得る。この場合、細胞周期中細胞で選択的に発現されるのが望ましいタンパク質は、タンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで親核酸配列から哺乳動物の周期中細胞において発現可能である。類義コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比べた場合、周期中細胞と比較して周期外細胞で高存在量であるイソ−ｔＲＮＡに各々が対応するように選択される。従って、親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列が製造され、この場合、タンパク質は上記タンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで周期外細胞において発現され得るが、タンパク質が周期外細胞で発現され、上記機能を発揮することは不可能である。
【００９９】
ここで使用されている「周期外細胞」の語は、細胞周期から脱し、Ｇ０期に入った細胞を指す。この段階では、内生遺伝子の転写およびタンパク質翻訳は細胞周期の相、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期の場合と比べて実質的に低レベルであることがよく知られている。
【０１００】
「周期中細胞」は、細胞周期の上記相の１つにある細胞を意味する。
【０１０１】
標的細胞または組織におけるイソ−ｔＲＮＡのインビボ発現による標的細胞または組織でのタンパク質発現
別の態様において、本発明は、タンパク質が標的細胞で選択的に発現され得る方法であって、１以上のイソ受容ｔＲＮＡをそこで発現させ得る補助核酸配列を細胞へ導入することによる方法に関する。このｔＲＮＡは、細胞において比較的高い存在量で発現されることはないが、タンパク質に伴う機能の発揮に充分なレベルに達するまで親核酸配列からのタンパク質の発現について律速的である。この態様では、細胞における補助核酸配列の導入により、上記タンパク質がタンパク質に伴う機能を発揮するのに充分なレベルで発現されるように親核酸配列の翻訳速度が改変される。
【０１０２】
補助核酸配列を標的細胞または複数のこれらの細胞を含む組織へ導入する段階は、適当なものであればいかなる手段でも実施され得る。例えば、上記で示した合成核酸配列の類似導入方法は、上記周期中細胞へ補助核酸配列を送達するのに使用され得る。
【０１０３】
ウイルス粒子の集合を通常ではさせない細胞におけるウイルス粒子の集合
さらに別の態様において、本発明は、周期中真核生物細胞におけるウイルス粒子の産生方法に関する。ウイルス粒子は、ウイルス集合に必要な少なくとも１個のタンパク質を含み、その場合、少なくとも１個のタンパク質は、そこでウイルス集合させ得るのに充分なレベルで親核酸配列から細胞において発現されることはない。この方法は、親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと置換することにより、少なくとも１個のタンパク質がそこでウイルス集合させ得るのに充分なレベルで細胞において合成核酸配列から発現され得るように、親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列を製造することを特徴としている。その方法で製造された合成核酸配列は、１以上の調節ヌクレオチド配列に機能し得るように結合され、次いで細胞またはその前駆細胞へ導入される。それに続いて少なくとも１個のタンパク質が、ウイルス粒子の集合に要求される他のウイルスタンパク質の存在下で細胞において発現されることにより、ウイルス粒子が産生する。
【０１０４】
有利には、類義コドンは、存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡの場合と比べ細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する。
【０１０５】
周期中細胞は、ウイルスが複製し得るものであればいかなる細胞でもよい。好適には、周期中細胞は真核生物細胞である。好ましくは、ウイルス粒子製造のための周期中細胞は、インビトロで培養され得る真核生物セルライン、例えばＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはスポドプテラ（spodoptera）細胞である。
【０１０６】
好適には、ウイルス粒子の少なくとも１タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質である。好ましくは、ウイルスカプシドタンパク質は、パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質を含む。
【０１０７】
細胞におけるウイルス粒子の集合に要求される他のウイルスタンパク質は、好適にはウイルスゲノムの残りを含む別の核酸配列（複数も可）から発現され得る。パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２を含む少なくとも１タンパク質の場合、他の上記核酸配列（複数も可）は、好ましくはＬ１および／またはＬ２をコードするヌクレオチド配列を伴わないパピローマウイルスゲノムを含む。
【０１０８】
本発明のさらに別の態様では、周期中細胞におけるウイルス粒子の製造方法が提供され、該ウイルス粒子はウイルス粒子の集合に必要な少なくとも１タンパク質を含むものであり、少なくとも１タンパク質はウイルス集合をさせるのに充分なレベルでは親核酸配列から上記細胞で発現されず、上記親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンは上記レベルに達するまで上記の少なくとも１タンパク質の製造に関して律速的である。該方法は、上記の少なくとも１コドンに特異的なイソ受容ｔＲＮＡを発現させ得る核酸配列を上記細胞に導入する段階を含む。
【０１０９】
さらに別の態様において、本発明は、上記方法から得られるウイルス粒子に関するものである。
【０１１０】
さらに本発明は、本発明の合成核酸配列を含む細胞または組織、または別法として本発明方法から製造される細胞または組織を包含する。
【０１１１】
非限定的な下記実施例を通して本発明についてさらに記載する。
実施例１
未分化細胞中における合成Ｌ１およびＬ２タンパク質の発現
材料および方法
ウシＰＶ(ＢＰＶ)Ｌ１およびＬ２遺伝子のコドン置換
【０１１２】
野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１１３】
野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子の稀なコドンの存在が翻訳を阻害するかを調べるために、記載したとおりの類義置換を行ない、Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)遺伝子を合成した。合成配列を構成するために、Ｌ１用に１１対のオリゴヌクレオチドおよびＬ２用に１０対のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの各対は、後のクローニングを促進するために組み込まれた制限部位を有する(図１Ａおよび１Ｂ)。この変性オリゴヌクレオチドを用いて、Ｌ１およびＬ２配列をＰＣＲ(鋳型としてＢＰＶ１ゲノムを有するプラスミドを使用)で増幅した。増幅したフラグメントを適切な酵素で切断し、ｐＵＣ１８ベクターと経時的に結合し、ｐＵＣＨＢＬ１およびｐＵＣＨＢＬ２を調製した。合成Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)の配列を決定し、間違いないことを確認し、次いで、ＳＶ４０oriを含む哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３(Invitrogen)中でサブクローン化し、発現プラスミドｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２を得た。Ｌ１およびＬ２の発現物と元の配列の発現物とを比較するために、野生型Ｌ１(配列番号：１)およびＬ２(配列番号：５)遺伝子をｐＣＤＮＡ３ベクター中でクローン化し、ｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔを得た。
【０１１４】
免疫蛍光検査およびウエスタンブロット染色
免疫ブロットアッセイ用として、６穴プレート中のＣｏｓ-１細胞に、Ｌ１およびＬ２発現プラスミド ２μgを、リポフェクトアミン(Gibco)を使用して形質移入した。形質移入から３６時間後、細胞を０.１５Ｍ リン酸緩衝液の０.９％ 食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、ＳＤＳ添加液に溶かした。細胞タンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。Ｌ１およびＬ２タンパク質を、ＢＰＶ１ Ｌ１(ＤＡＫＯ)またはＬ２特異的(１７)抗血清を使用する電子化学発光(Amersham, UK)で確認した。免疫蛍光染色用として、Ｃｏｓ-１細胞を８チャンバースライドで増殖し、プラスミドを形質移入し、固定し、形質移入から３６時間後に８５％エタノールで透過した。スライドを５％ミルク-ＰＢＳでブロックし、Ｌ１およびＬ２特異的抗血清でプローブし、ＦＩＴＣが結合した抗ウサギ免疫グロブリンＧ(Sigma)を添加した。ＧＦＰまたはＰＧＦＰプラスミド形質移入細胞用として、細胞を４％緩衝ホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１５】
ノーザンブロット法,
様々なプラスミドを形質移入したＣｏｓ細胞を、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し供給者の手引きに従い、細胞質または全ＲＮＡを抽出するのに使用した。簡単に言うと、細胞質ＲＮＡ精製用として、緩衝液ＲＬＮ(５０mＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１４０mＭ ＮａＣｌ、１.５mＭ ＭｇＣｌ2および０.５％ＮＰ４０)を、単層細胞に直接加え、細胞を４℃で５分間溶かした。核を遠心分離で取り除いた後、細胞質ＲＮＡをカラムで精製した。ＲＮＡ抽出物全量用として、単層細胞を、キットから補充した緩衝液ＲＬＴを使用して溶かし、ＲＮＡをスピンカラムで精製した。精製したＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１.５％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡをナイロン膜上にブロットし、(ａ)５'末端を標識化したＬ１の重量とＨＢＬ１フラグメントの重量が１：１の混合物、(ｂ)５'末端を標識化したＬ２の重量とＨＢＬ２フラグメントの重量が１：１の混合物、(ｃ)５'末端を標識化したＧＦＰとＰＧＦＰフラグメントの１：１混合物、または(ｄ)ランダムに標識化したＰＡＧＤＨフラグメント、でプローブした。このブロットを６５℃で丁寧に洗浄し、３日間Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１１６】
結果
パピローマウイルス(ＰＶ)のＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質をコードする遺伝子のコドン構成が分化上皮細胞におけるその優先発現に寄与するという仮設を検証するために、合成ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)遺伝子を調製し、哺乳類遺伝子において優先的に使用されるコドンで、野生型ＢＰＶ１ Ｌ１およびＬ２配列(真核生物遺伝子としては稀)中に常に存在するコドンを置換した(図１Ａ、１Ｂ)。
【０１１７】
Ｌ１遺伝子について、全２０２塩基の置換は１９６コドンで行なわれるが、コードされたアミノ酸配列に変化はない(図１Ａ)。この合成"ヒト化"ＢＰＶ Ｌ１ 遺伝子(配列番号：３)をＨＢＬ１と表わした。同様に修飾したＢＰＶ Ｌ２ 遺伝子(配列番号：７)をＨＢＬ２と表わし、３０３塩基を変え、あまり頻繁には使われない２９０コドンを、対応する優先的に使われるコドンで置換した。合成ＨＢＬ１(配列番号：３)およびＨＢＬ２(配列番号：７)遺伝子を使用し、ｐＣＤＮＡ３に基づく２つの真核生物発現プラスミドを作成し、ｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２と表わした。野生型ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：１)およびＢＰＶ１ Ｌ２(配列番号：５)遺伝子で構築された同類の発現プラスミドを、ｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔと表わした。これらの各プラスミドにおいて、ＳＶ４０oriがＣｏｓ-１細胞中の複製を可能にし、Ｌ１またはＬ２遺伝子を強力構成ＣＭＶプロモーターで発現させた。
【０１１８】
合成ヒト化および野生型のＢＰＶ１ Ｌ１およびＢＰＶ１ Ｌ２遺伝子の発現を比較するために、それぞれ上述のＬ１およびＬ２プラスミドを形質移入したＣｏｓ-１細胞を分離した。形質移入した細胞を、形質移入から３６時間後の免疫蛍光検査で、Ｌ１(配列番号：２、４)またはＬ２(配列番号：６、８)タンパク質の発現を分析した(図２Ａおよび３Ａ)。合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)またはＬ２遺伝子を含むｐＣＤＮＡ３発現プラスミドを形質移入した細胞では、たくさんの該当するタンパク質の産出を観察できた。しかし野生型プラスミドＬ１(配列番号：１)またはＬ２(配列番号：５)配列の発現プラスミドを形質移入した細胞では、Ｌ１またはＬ２タンパク質の産出を検出できなかった(図２Ａおよび３Ａ、Ｌ１およびＬ２タンパク質の核染色を参照)。異なるＬ１およびＬ２構成の発現を厳密に比較するために、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現を野生型または合成ヒト化ＢＰＶ１Ｌ１またはＬ２ ｐＣＤＮＡ３発現構造を形質移入したＣｏｓ-１細胞中、免疫ブロットで評価した。たくさんの免疫反応性Ｌ１およびＬ２タンパク質が、合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)配列から発現したが、野生型Ｌ１およびＬ２配列(配列番号：１、５)からは、Ｌ１またはＬ２タンパク質は発現しなかった。
【０１１９】
コドン変化により生じたＬ１およびＬ２ ｍＲＮＡの一次配列変化が対応メッセージの定常状態の発現にも影響を及ぼすかどうかを確認するために、ｍＲＮＡを様々なキャプシドタンパク質遺伝子構築物を形質移入したＣｏｓ-１細胞で調製した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用して、野生型Ｌ１ ｍＲＮＡより修飾したものの方が２〜３倍高いことを、ノーザンブロットで確認した。野生型および修飾型Ｌ２ ｍＲＮＡの同様の段階が、形質移入細胞の細胞質で見られた(図２Ｃおよび３Ｃ)。Ｌ１またはＬ２ ｍＲＮＡの任意のユニット毎で発現したＬ１またはＬ２タンパク質は、ヒト化遺伝子構築物によるもののほうが天然遺伝子構築物のものより少なくとも１００倍高い。
【０１２０】
実施例２
インビトロでのパピローマウイルス後期タンパク質翻訳
材料および方法
インビトロ翻訳アッセイ
【０１２１】
各プラスミド１mgを、35Ｓ-メチオニン(Amersham) ２０μＣｉおよびＴ７結合ウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽溶解物(Promega) ４０μLとともにインキュベートした。３０℃で翻訳を行ない、ＳＤＳ添加液を加えて停止させた。このＬ１タンパク質を１０％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで確認した。
【０１２２】
アミノアシル-ｔＲＮＡの調製
２.５×１０-4 Ｍ ｔＲＮＡ(Boehringer)を、１０mＭ トリス-アセテート(ｐＨ.７.８)、４４mＭ ＫＣｌ、１２mＭ ＭｇＣｌ2、９mＭ メルカプトエタノール、３８mＭ ＡＴＰ、０.２５mＭ ＧＴＰ、および７μLウサギ網状赤血球抽出物を含む反応液 ２０μlに加えた。この反応を２５℃で２０分間行ない、次いで反応物にＨ2Ｏ ３０μLを加えて、ｔＲＮＡを１×１０-4に希釈した。このアミノアシル-ｔＲＮＡを一定量に分け、−７０℃で貯蔵した。
【０１２３】
結果
野生型ＢＰＶ Ｌ１およびＬ２遺伝子の主要な制限がシステム中で翻訳されると思われたので、この制限が遺伝子翻訳について適当なｔＲＮＡ種の利用性の制限を示すかどうかを調べた。無処置細胞内での合成遺伝子の一過性発現を多くのファクターで調節し得るので、ウサギ網状赤血球可溶化液(ＲＲＬ)またはコムギ胚芽可溶化液を使用する細胞が存在しないシステムで、我々の仮説を試験した。野生型または合成ヒト化ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子を発現する同量のプラスミドを35Ｓ-メチオニンの存在下で、ＲＲＬ転写/翻訳システムと結合したＴ７-ＤＮＡポリメラーゼに加えた。２０分後、翻訳されたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。修飾Ｌ１遺伝子の効率よい翻訳を観察できたが(図４、一番上の区画、２レーン)、野生型ＢＰＶ１ Ｌ１配列の翻訳は、弱い５５kＤａ Ｌ１帯域をもたらしたにすぎなかった(図４、上方区画、２レーン)。野生型配列をＲＲＬ中の翻訳で最大限に活用できないが、野生型Ｌ１配列に存在する"稀な"コドンと競合する細胞質のｍＲＮＡ種がないので、いくらかの翻訳は起こる、と判断した。上述のデータは、野生型および合成ヒト化Ｌ１遺伝子の翻訳効率の違いは、野生型遺伝子に存在する稀なコドンの翻訳を必要とするｔＲＮＡの制限された有効性と、因果関係があることを示唆する。それゆえに、インビトロ翻訳システムに過剰量のｔＲＮＡを加えると、野生型Ｌ１遺伝子の翻訳の阻害を克服できると考えた。この問題に取り組むために、酵母の１０-5Ｍ アミノアシル-ｔＲＮＡをＲＲＬ翻訳システム中に加え、Ｌ１タンパク質合成を評価した。外因性ｔＲＮＡの導入は野生型Ｌ１配列の翻訳で劇的な改良をもたらし、合成ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３)でみられるものに匹敵するＬ１タンパク質の収量が得られた(図４、一番上の区画)。野生型Ｌ１遺伝子(配列番号：１)のアミノアシル−ｔＲＮＡによる翻訳の増強は量依存的であり、１０-5Ｍ ｔＲＮＡで最適効率が得られた。外因性ｔＲＮＡの添加は野生型Ｌ１遺伝子配列(配列番号：１)から翻訳されるＬ１タンパク質の収量を向上させるので、野生型およびヒト化Ｌ１ ｍＲＮＡの翻訳の速さを評価した。２分毎に、翻訳混合物からサンプルを収集し、８分から始めた。野生型配列(配列番号：１)からのＬ１の翻訳(配列番号：２、４)は、ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３)のものよりかなり遅く(図４、下方パネル)、この翻訳遅延は市販の酵母ｔＲＮＡによる外因性ｔＲＮＡの添加によって完全に打ち消し得る。酵母ｔＲＮＡを上述の分析で選択したのは、酵母でのコドン使用がパピローマウイルスと似ているからである(表１)。外因性ｔＲＮＡの添加は、ヒト化Ｌ１遺伝子(配列番号：３)の翻訳を有意に向上させることはなかったが、この配列のウサギ網状赤血球翻訳機構用のコドン使用に関して最適化することを示す(図４、下方パネル)。分離実験で、ｗｔ Ｌ１翻訳もまた肝臓ｔＲＮＡ(図４)によって高められ、ウシ皮膚表皮から抽出されたｔＲＮＡによっても高められることを確立した(データ表示せず)（おそらく分化および未分化の細胞由来のｔＲＮＡ混合物を構成する）
【０１２４】
実施例３
野生型Ｌ１の翻訳は、小麦胚芽抽出物において効率的である。
tＲＮＡの利用性は野生型ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子（配列番号１）の発現の決定要素であるという我々の仮説をさらに試験するために、全く異なった組のtＲＮＡが利用できるであろう細胞種においてＬ１の翻訳を試験した。小麦胚芽の翻訳系では、野生型Ｌ１のmＲＮＡがヒト化Ｌ１のmＲＮＡと同じぐらい効率的に翻訳され、外因性アミノアシル−tＲＮＡの添加は、野生型配列またはヒト化配列のいずれの翻訳効率も改善しなかった（図４の下のパネル）。このことは、小麦胚芽には、ＲＲＬにおける野生型Ｌ１配列の翻訳を制限して、効率的なＬ１の翻訳を可能とするtＲＮＡが十分あることを示した。
【０１２５】
実施例４
パピローマウイルスのプロモーター由来の未分化細胞において、修飾された後期遺伝子を発現させることができる。
【０１２６】
上に提示したデータは、試験系において、翻訳がＢＰＶ１キャプシドタンパク質の製造を制限していることを示すが、これらの実験は、遺伝子を強力なＣＭＶプロモーターにより幾らか操作したので、ＢＰＶゲノムからのウイルス後期遺伝子の転写に関して実際には代表的ではない系で行った。確かめようとしたのは、天然のＢＰＶ１プロモーターから転写されるとすれば、合成のヒト化ＢＰＶキャプシドタンパク質のmＲＮＡが野生型のmＲＮＡより効率的に翻訳されるかどうかであった。このことは、翻訳が実際に未分化細胞において天然の潜在性後期遺伝子プロモーターから操作されるＢＰＶ１後期遺伝子の発現に関する制限因子の１つであるかどうかを確かめたことになる。ＢＰＶゲノムをＢamＨＩ／ＨindIIIでnt ４４５０および６９５８にて切断して、元のＬ１(nt ４１８６−５５９５)およびＬ２(５０６８−７０９５)のＯＲＦを除去した。真核細胞におけるプラスミド複製を可能とするＳＶ４０ ori配列を含む合成のヒト化Ｌ２遺伝子（配列番号７）を、Ｌ１／Ｌ２ ＯＲＦ配列を欠くＢＰＶゲノムに挿入した。このプラスミド（図５Ａ）をpＣＩＣＲ１と名付けた。同様のプラスミドを合成のヒト化Ｌ２よりむしろ野生型（配列番号５）で構築して、pＣＩＣＲ２と名付けた。これらのプラスミドでＣos−１細胞をトランスフェクトして、Ｌ２タンパク質の発現をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光により試験した。天然のＢＰＶ１プロモーターで操作した合成のヒト化Ｌ２（配列番号７）は効率的に発現されたが、同様の構築物から操作された野生型Ｌ２配列（配列番号５）は免疫反応性Ｌ２タンパク質（配列番号６、８）を全く製造しなかった（図５Ｂ）。未分化細胞は、ヒト化Ｌ２遺伝子（配列番号７）の発現を裏付けたが、潜在性後期ＢＰＶプロモーターから発現される野生型Ｌ２（配列番号５）の発現は裏付けなかったので、その結果は、ＣＭＶプロモーターを使用しての実験から、我々の早期の観察結果を確認した。しかしながら、ここで試験したプラスミドは、ＳＶ４０ oriを含み、Ｃos細胞においてＤＮＡを複製するよう設計された。ＢＰＶ１ Ｌ２プラスミドの複製数の増大またはＳＶ４０ oriの転写促進活性は、感染した皮膚と比較した場合、この実験系におけるＬ２の発現効率の増大を幾らか説明することができるかもしれない。しかしながら、ＣＭＶプロモーターの構築物で見られる天然の遺伝子とヒト化遺伝子との間の発現における著しい相違は、天然のプロモーターでも観察される。
【０１２７】
実施例５
パピローマウイルスの好ましいコドンの置換は、未分化細胞においてパピローマウイルス以外の遺伝子の翻訳を妨げるが、転写は妨げない。
【０１２８】
材料および方法
gfp遺伝子におけるコドン置換
パピローマウイルスの好ましいコドン(ＰＧＦＰ)を使用して、修飾されたgfp遺伝子（配列番号１１）を構築するために、６対のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの対は各々、組込まれた制限部位を有しており、ヒト化gfp遺伝子（配列番号９）(ＧＩＢＣＯ)を鋳型として使用して、gfpを増幅するために使用した。ＰＣＲフラグメントをpＵＣ１８ベクターに連結させて、pＵＣＰＧＦＰを製造した。ＰＧＦＰ遺伝子を配列決定して、ＣＭＶプロモーターの下に、同じ哺乳動物の発現ベクターであるpＣＤＮＡ３のＢamＨＩ部位へとクローン化した。ヒト化ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図１Ｃに示す。Ｐgfp遺伝子（配列番号１１）を製造するために、野生型gfp遺伝子（配列番号９）へと導入する変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの上部に示す。
【０１２９】
結果
コドン使用が哺乳動物の細胞における遺伝子発現を変えることができることをさらに確認するために、真核細胞における最適な発現のために修飾した合成のgfp遺伝子でのさらなる変異体をつくった(Ｚolotukhinら，１９９６，Ｊ. Ｖirol. ７０：４６４６−４６５４)。この変異体では、真核細胞での発現に最適化したコドンを、パピローマウイルスの後期遺伝子において優先的に使用されるコドンで代替した。培養細胞において高レベルの蛍光タンパク質を発現するヒト化gfp遺伝子（配列番号９）における２４０のコドンのうち、１５６を、対応するパピローマウイルスの後期遺伝子の好ましいコドンに変えて、Ｐgfpと名付ける新たなgfp遺伝子（配列番号１１）を製造した。未分化細胞におけるＰgfp（配列番号１１）の発現をヒト化gfp（配列番号９）の発現と比較した。ヒト化gfp（配列番号９）でトランスフェクトしたＣos−１細胞は、２４時間後に鮮やかな蛍光シグナルを発したが、Ｐgfp（配列番号１１）でトランスフェクトした細胞は、微かな蛍光シグナルしか発しなかった（図６Ａ）。この相違は異なった翻訳効率を反映したものであることを確認するために、gfpに特異的なmＲＮＡを両方のトランスフェクションで試験して、顕著に異なってはいないことを見出した（図６Ｂ）。従って、コドン使用および対応するtＲＮＡの利用性は、ＰＶ後期遺伝子の発現に関して観察される制限を明らかに決定し、他の遺伝子におけるコドン使用の変更は、未分化細胞におけるそれらの発現を同様に妨げる。
【０１３０】
実施例６
パピローマウイルスの好ましいコドンを含むＰＧＦＰは、分化したマウス表皮ケラチン細胞においてインビボで効率的に発現される。
【０１３１】
材料および方法
遺伝子銃によるマウス皮膚へのプラスミドＤＮＡの送達
製造業者の指示(Ｂio−Ｒad)に従って、ＤＮＡ５０μgをカルシウム沈降により金のマイクロ−キャリア２５μgに被覆した。Ｃ５７／blマウス皮膚に、６００psiの圧力にてＤＮＡプラスミドで被覆した金粒子で衝撃を与えた。その皮膚から連続した切片を取って、粒子分布を調べ、６００psiの圧力により粒子を表皮中に送達することができることを確認した。
【０１３２】
結果
マウスをＰＧＦＰ ＤＮＡプラスミドが付着した金ビースで撃ち、２４時間後、皮膚試料をＤＮＡの送達部位から切り取って、ＧＦＰタンパク質（配列番号１０、１２）の発現に関して試験した。蛍光の大部分が上部表皮ケラチン細胞層において検出され、これは分化した上皮を表し、未分化の基底細胞では見られなかった。これとは対照的に、ヒト化ＧＦＰプラスミドで撃った皮膚切片は、表皮全体にランダムに分布した細胞において蛍光を示した（図７）。ＧＦＰ陽性細胞がＰＧＦＰ（配列番号１１）接種マウス皮膚およびＧＦＰ（配列番号９）接種マウス皮膚の両方において稀であったが、ＰＧＦＰ試料（配列番号１１）中では分化した層でのみ蛍光が観察され、一方、ＧＦＰ（配列番号９）接種マウス皮膚では表皮の至る所で蛍光が観察された。この結果は、パピローマウイルスの好ましいコドンの使用が、上皮分化に依存する方法で発現されるタンパク質をもたらすことを確認した。
【０１３３】
実施例７
培養細胞への酵母tＲＮＡおよび野生型Ｌ１遺伝子のマイクロインジェクション
(酵母がそれ自身の遺伝子に関してパピローマウイルスで観察されるコドンと同様の組のコドンを使用する場合に)酵母tＲＮＡが野生型ＢＰＶ１ Ｌ１（配列番号１）の発現を促進することができるかどうかを試験するために、tＲＮＡ(２mg／ml)(精製した酵母tＲＮＡ(Ｂoehringer Ｍannheim)またはウシ肝臓tＲＮＡ−対照)およびＢＰＶ Ｌ１ ＤＮＡ(２μg／ml)を含む混合物２plをＣＶ−１細胞に注入することができる(ＬuおよびＣampisi，１９９２，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. ８９ ３８８９−３８９３)。次いで、注入した細胞を３７℃で４８時間培養し、ＢＰＶ Ｌ１に特異的な抗体を使用する標準的な免疫蛍光法により、Ｌ１遺伝子の発現に関して試験して、ＦＡＣＳ分析により定量することができる(Ｑiら １９９６，Ｖirology ２１６ ３５−４５)。
【０１３４】
実施例８
ＨＰＶウイルス粒子を連続的に製造することができるセルラインの確証
感染性ＰＶを製造するために、上皮ラフト培養系(Ｄollardら １９９２，Ｇenes Ｄev ６ １１３１−１１４２)、およびＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含むセルラインが含まれる様々な方法を試みて、ＢＰＶ−１ Ｌ１／Ｌ２の組換えワクシニアで感染させる(Ｚhouら １９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６８)か、またはＳＦＶ ＲＮＡでトランスフェクトした(Ｒodenら １９９６，Ｊ. Ｖirol. ７０ ５８７５−５８８３)。粒子の収率は、各々の場合において低い。我々の発見を実施に移す場合、合成のＢＰＶ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺伝子（配列番号７）(実施例１に記載した)を使用して、ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含むセルラインにおいて感染性ＢＰＶを製造することができる。ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含む線維芽細胞セルライン(ＣＯＮ／ＢＰＶ)(Ｚhouら １９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６８)を、ＣＭＶプロモーターの制御下での合成のＢＰＶ−１ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺伝子（配列番号７）のトランスフェクションに使用することができる。次いで、ＢＰＶ粒子を細胞ライゼートから精製して、精製した粒子をＢＰＶ−１ゲノムの存在に関して試験することができる。リポフェクトアミン(ＢＲＬ)でのトランスフェクション、およびトランスフェクトした細胞のＧ４１８選択といったような標準的な方法を利用して、ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡのバックグラウンドでヒト化Ｌ１（配列番号３）およびＬ２（配列番号７）を発現する適当なトランスフェクタントを生成することができる。ウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ１またはウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ２ポリクローナル抗体を使用して、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現の試験を行うことができる。次いで、我々の公表した方法(Ｚhouら １９９５，Ｖirology ２１４ １６７−１７６)を使用して、ＢＰＶ粒子を精製することができ、電子顕微鏡法およびＤＮＡブロッティング法により特性決定することができる。培養細胞から単離したＢＰＶ粒子の感染性は、Ｃ１２７線維芽細胞を使用するフォーカス形成アッセイで試験することができる。
【０１３５】
実施例９
組織からtＲＮＡを抽出して測定する方法
組織(１００ｇ)を、水で飽和したフェノール(Ｍallinckrodt，分析用試薬，８８％)(１５：３)１５０ml、および１.０Ｍ ＮaＣl １５０ml、０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)中の０.００５Ｍ ＥＤＴＡと共に、ワーリングブレンダーでホモジナイズする。ホモジネートを国際臨床遠心機での最高速度で１０分間遠心して、上層を慎重にデカントして分離した。この水層に、９５％ エタノール３体積を加えた。その結果得られた沈殿を国際臨床遠心機での最高速度で遠心沈降させて、０.１Ｍ トリス／クロリド緩衝液(pＨ ７.５)２５０mlに再び縣濁させた。この溶液を、冷たい０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース２ｇのカラム(２×１０cm)に加えた(１５−２０滴／分の流速)。次いで、カラムをトリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)１Ｌで洗浄して、ＲＮＡを０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)中の１.０Ｍ ＮaＣlで溶出した。ＮaＣl溶液の最初の１０mlを「ホールド−アップ」として捨てた。次いで、溶出物の光学濃度が２６０nmで３未満となるまで、十分な塩溶液(６０−８０ml)を集めた。溶液を、水で飽和した等体積のフェノールで２回抽出して、エーテルで２回抽出した。ＲＮＡを含む水溶液に、９５％ エタノール３体積を加えて、その溶液ワグ(wag)を冷たい状態で一晩放置した。沈殿を遠心沈降させ、まず最初に８０％ エタノールで洗浄した後、９５％ エタノールで２回洗浄して、減圧下に乾燥させた。可溶性ＲＮＡ約６０mgをラット肝臓１００ｇロットから得た。
【０１３６】
tＲＮＡの定量
次のナイロン膜を使用する：Ｂiodine ＡおよびＢ(ＰＡＬＬ)。ドットブロットの調製のために、１５％ ホルムアルデヒド１−５μl中、tＲＮＡ試料(１pg〜５ng)を６０℃で１５分間変性させる。１０ｘＳＳＣ(ＳＳＣは、ＮaＣl ０.３Ｍ、クエン酸三ナトリウム ０.０３Ｍである)。試料を適用する前に、脱イオン水に１５分間浸漬して、２枚の３ＭＭ Ｗhatman紙の間で少し乾燥させておいた膜上に、試料を１μlのアリコートでスポットする。tＲＮＡを(紫外線照射(紫外線ランプを２０cmの距離にて２５４nmおよび１００Ｗの強度で使用して１０mm)により膜に)共有結合で固定して、その膜を８０℃で２−３時間焼き付ける。
【０１３７】
tＲＮＡのＡ５４−Ａ７３配列に相補的な、５'末端を標識した合成のデオキシリボオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション実験のプローブとして使用する。５' ＯＨ'を末端とするプローブの直接リン酸化により、オリゴヌクレオチドの標識化を行う。
【０１３８】
ハイブリダイゼーション実験のために、５０％ 脱イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、０.０４％ フィコール、０.０４％ ポリビニルピロリドン、および２５０μl／mlの音波処理したサケ精子ＤＮＡ中、膜１００cm2あたり緩衝液５mlを使用して、ＵＶ照射した膜をまず最初に５０℃で５時間予めインキュベートしておく。最後に、標識化プローブを加えた上の溶液(２.５ml／１００cm2)中、ハイブリダイゼーションを５０℃で一晩行う。ハイブリダイゼーション後、その膜を、２ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中、室温で５分間２回洗浄し、２ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中、６０℃で３０分間２回洗浄し、最後に０.１ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中、室温で３０分間洗浄する。ハイブリダイズしたプローブを検出するために、膜を増感紙と共にＦuji ＸＲフィルムに７０℃で１６時間暴露する。
【０１３９】
tＲＮＡプローブの配列
tＲＮＡプローブの配列は、次の通りである：
ＡlaGCA：５'−ＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＴ（配列番号１３）
ＡrgCGA：５'−ＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１４）
ＡsnAAC：５'−ＣＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１５）
ＡspGAC：５'−ＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴ（配列番号１６）
ＣsyTGC：５'−ＡＡＧＴＣＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＴ（配列番号１７）
ＧluGAA：５'−ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号１８）
ＧlnCAA：５'−ＣＴＡＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１９）
ＧlyGGA：５'−ＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴ（配列番号２０）
ＨisCAC：５'−ＴＧＣＣＧＴＧＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１）
ＩleATC：５'−ＴＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＣＴＴ（配列番号２２）
ＬeuCTA：５'−ＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴ（配列番号２３）
ＬeuCTT：５'−ＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２４）
ＬysAAA：５'−ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡ（配列番号２５）
ＬysAAG：５'−ＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号２６）
Ｍetelong ５'−ＴＡＧＴＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２７）
ＰheTTC：５'−ＴＧＴＴＴＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＡＴ（配列番号２８）
ＰroCCA：５'−ＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡ（配列番号２９）
ＰroCCI：５'−ＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＧＧＧＡＴＴＴ（配列番号３０）
ＳerAGC：５'−ＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＧ（配列番号３１）
ＴhrACA：５'−ＴＧＴＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧ（配列番号３２）
ＴyrTAC：５'−ＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号３３）
ＶalGTA：５'−ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号３４）
【０１４０】
実施例１０
未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ種の相対存在量の比較
【０１４１】
材料および方法
表皮細胞の単離
２日齢のマウスを屠殺して、皮膚を剥いだ。皮膚を０.２５％ トリプシン ＰＢＳで４℃にて一晩消化した。鉗子を使用して、表皮を真皮から分離して、１０％ ＦＣＳ ＤＭＥＭ媒体中、鋏で切り刻んだ。まず最初に、細胞縣濁液を１mmのナイロンネットに通して濾過した後、０.２mmのナイロンネットに通して濾過した。次いで、細胞縣濁液をペレット化して、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４２】
密度勾配遠心分離法
表皮ケラチン細胞を３０％ パーコールに再び縣濁させて、不連続のパーコールグラジエント(１.０８５、１.０７５および１.０５０ｇ／ml)中、１２００×ｇで室温にて２５分間遠心分離することにより分離した。次いで、その細胞をＰＢＳで洗浄して、tＲＮＡを抽出するために使用した。
【０１４３】
tＲＮＡの精製
細胞を溶解緩衝液(０.２Ｍ ＮaＯＨ、１％ ＳＤＳ)５mlに室温で１０分間溶解した。そのライゼートを３.０Ｍ 酢酸カリウム(pＨ ５.５)５mlで中和した。遠心分離後、上清を１００mＭ トリス(pＨ ７.５)３体積で希釈して、１００mＭ トリス(pＨ ７.５)で平衡化したＤＥＡＥカラムに加えた。tＲＮＡを含む水溶液にイソプロパノールを等量加えて、その溶液を４℃で一晩放置した。tＲＮＡを遠心沈降させて、７５％ エタノールで洗浄した後、ＲＮアーゼを含まない水に溶解した。
【０１４４】
tＲＮＡのブロッティング
ホルムアルデヒド４μlおよび２０ｘＳＳＣ ５μl中、１μl中の各々のtＲＮＡ試料１０ngを６０℃で１５分間変性させた。帯電したナイロン膜(Ａmersham)上に、試料を１μlのアリコートでスポットし、tＲＮＡをＵＶで固定して、32Ｐ−オリゴヌクレオチドで探査した。
【０１４５】
結果
未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ種の存在量の比較は、幾つかのtＲＮＡ集団のレベルが劇的に変化することを示した。例えば、ＡlaGCA、ＬeuCTT、ＬeuCTAに特異的なtＲＮＡのレベルは、分化した細胞において増大したが、ＡrgCGA、ＰroCCI、ＡsnAAGに特異的なtＲＮＡは、未分化の表皮ケラチン細胞においてより豊富であった(表２を参照)。
【０１４６】
一般的考察
本明細書において、本発明者は、哺乳動物細胞中の遺伝子翻訳の効率についての決定要素がそのコドン組成であることを確証している。このことは、原核生物の遺伝子を真核細胞中で発現したときに普通一般に観察される（Smith, S. W., 1996, biotechnol., Prog. 12:417-422）。本発明者はまた、パピローマウイルスのカプシド遺伝子をコードするｍＲＮＡが培養の真核細胞中で効果的に翻訳されないこと、その理由は明らかにｔＲＮＡの利用性が翻訳にとって速度制限的であること、また培養中の真核細胞中のＰＶ後期遺伝子翻訳に対する遮断を、後期遺伝子のコドン使用を哺乳動物遺伝子の共通配列に適合させるように変換するか、または外因性のｔＲＮＡを供給して、克服できることを明確にした。ｍＲＮＡ二次構造あるいはタンパク質結合への変異（Sokolowaki, et al., 1998, J. Virol. 72:1504-1515)が、ＰＶカプシド遺伝子の一次配列への変化の結果として、培養細胞中の天然および修飾ＰＶカプシド遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の効率に観察された差異をもたらしたのであろう。しかしながら、天然の未修飾ｍＲＮA（ｔＲＮＡを哺乳動物インビトロ翻訳系に加えた後に観察され、植物翻訳系では観察されない）の翻訳が増強されたことは、ｔＲＮＡ利用性が哺乳動物の細胞中の天然遺伝子の翻訳について速度制限的であるという論拠を強化する。重要なｔＲＮＡの不足は、翻訳の未完成ペプチドまたは未成熟ペプチドの末端の伸張の遅れをもたらす（Oba, et. al., 1991, Biochimie 73:1109-1112）。伸張の遅れはＰＶ後期遺伝子にとって重大な問題のようである。ＰＶゲノムにおけるコドン使用の分析結果からすると、ＰＶ後期遺伝子は、哺乳動物の細胞ではまれにしか使用されないようなコドンを多く使用する。例えば、ＰＶは、ＵＵＡをロイシンに、ＣＧＵをアルギニンに、ＡＣＡをトレオニンに、ＡＵＡをイソロイシンにしばしば使用するのに対して、これらのコドンが哺乳動物遺伝子に使用されるのはごくまれである。これとは対照的に、パピローマウイルス後期遺伝子を酵母中で効果的に発現させることができる（Jansen, et al., 1995, Vaccine 13:1509-1514）(Sasagawa, et al., 1995, Virology 206:126-135)。そして、酵母およびパピローマウイルス遺伝子のコドン組成は類似している（表１）。明らかな例外は、PV Ｌ１遺伝子が組換型バキュロウイルスを用いて昆虫の細胞中で（Kirubauer, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12180-12184）、また組換型ワクシニアを用いて種々の哺乳動物の未分化細胞中で（Zhon, et al., 1991, Virology 185:251-257）効果的に発現されることである。ワクシニアまたはバキュロウイルスによる感染が、細胞タンパク質合成を低く調節するように、これらの状況においてＬ１カプシドタンパク質の効果的な発現が起こるのは、ウイルス感染細胞中において細胞性mRNAが少ししか利用されず、稀なtRNAについてＬ1 ｍＲＮＡと競合するためである。
【０１４７】
コドン組成は、同一組織の分化のそれぞれ違った段階における遺伝子発現の一般的な決定要素となるであろう。遺伝暗号は本質的には普遍的であるが、違った生物が相異した遺伝子のコドン組成を示す。ところが他方で、遺伝子のコドン組成は、それぞれの生物内のすべての遺伝子と比較的類似し、その生物のイソ−ｔRNA集団と適合する傾向にある（Ikemura, T., 1981, J. Mol. Biol. 146:1-21）。しかしながら、分化細胞および新形成細胞中のtRNA集団は相異しており（Kanduc, D., 1997, Arch. Biochem. Biophys. 342:1-6; Yang, and Comb, 1968, J. Mol. Biol. 31:138-142; Yang, and Novelli, 1968, Biochem. Biophys. Res. Commun. 31:534-539）、tRNA集団もまた異なった状況で成長する細胞中で変化している(Doi, et al., 1968, J. Baiol. Chem. 243:945-951)。したがって、本発明者の考えでは、コドン組成およびtRNAの利用性が合わさって遺伝子発現の空間的および／または時間的調節の原始的なメカニズムが提供される。ウイルス遺伝子のコドン組成について粗マーカーである多くのｄｓＤＮＡウイルスのＧ＋Ｃ含有量は、それらウイルスが感染した細胞のＤＮＡにおけるＧ＋Ｃ含有量と著しく相異している（Strauss, et al., 1995,“Virus Evolution” in Virology (eds. Fields, B. N. et al.), Lipipincott-Raven, Philadelphia, pp. 153-171）。したがって、ウイルスは、自らの遺伝子発現プログラムを調節するためにコドン組成を利用しつつ、おそらくウイルスがそのゲノムを複製するために使用する細胞機能を有する未分化細胞中で、ウイルスタンパク質の致死量を発現するのを避けて、進化してきたのであろう。
【０１４８】
本発明者による観察が単一組織中における遺伝子翻訳調節の明かに新しいメカニズムを説明するように、そのメカニズムが以前発表の仮説、すなわち分化上皮に対するＰＶ後期遺伝子発現制限に関する仮説といかに関連付けられるかを考えることは有意義なことである。ＰＶ後期遺伝子の効果的発現が分化上皮においてのみであるとの観察については、多数の解釈が提案されている。後期遺伝子転写の低下は、分化上皮中のみに発現する転写要因における後期プロモーターからの転写に依存することを反映し、あるいはウイルスによる後期プロモーター転写の抑制（Stubenrauch, et al., 1996, J. Virol. 70:119-126）あるいは未分化細胞中で発現した細胞遺伝子産物に起因するのであろう。ＨＰＶ３１ｂおよびＨＰＶ５の「後期」プロモーター（Haller, et al., 1995, Virology 214:245-255; Hummel, et at.,1992, J. Virol. 66:6070-6080)は分化依存的であると説明されているが、しかし、通常のフットプリンティング法およびＤＮＡ結合法による分化ケラチン生成細胞中の転写調節要因に関連する研究から、今までのところまだ満足できる結果が得られていない。本発明のデータによると、カプシドタンパク質はＣＭＶプロモーターを基とする発現ベクター（図２）によってトランスフェクトされた細胞中のＰＶ Ｌ１およびＬ２ ｍＲＮＡから翻訳されることがなく、このことは、存在し得るなんらかの転写コントロール機能に加えて、未分化細胞中のカプシドタンパク質合成に対して転写後遮断の存在を示唆している。５’スプライスドナー部位に類似した配列がＬ１またはＬ２ ｍＲＮＡ内または非翻訳メッセージ内に存在し、この配列は、関連する遺伝子の転写に対して阻害的である（Kennedy, et al., 1991, J. Virol. 65:2093-2097）（Furth, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:5278-5289）。Ｌ１またはＬ2 ｍＲＮＡ中の他のAUの多い配列は、ｍＲＮＡ分解を促進する（Sokolowski, et al., 1997, Oncogene 15:2303-2319）。未分化細胞中でのＬ１およびＬ２発現を阻害するこれらのメカニズムは、分化上皮において不活性であることを示していないし、この組織中における後期遺伝子の翻訳の成功をやはり説明していない。
【０１４９】
Ｌ１コード配列中の阻害ＲＮＡ配列が本明細書中に記述の実験において採用した系統的コドン置換によって機能化され得なかったという理由から、および非翻訳阻害配列が本発明者の実施した検査項目に含まれなかったという理由から、培養の哺乳動物細胞中でのＰＶ後期遺伝子発現の抑制における阻害配列およびコドンの誤対合のそれぞれの役割は確定できなかった。しかしながら、ＲＮＡ分解を促進あるいは翻訳を抑制する調節配列は、核または細胞質のタンパク質との相互作用を通じて働くと推定されており(Sokolowski, et al., 1998, J. Virol. 72:1504-1515)、天然配列Ｌ1 ｍＲＮＡの非効率的な翻訳が、無核細胞由来の細胞なしの翻訳系において観察された。このことは、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成がＰＶ後期遺伝子翻訳の調節になんらかの役割を果たしていることを示す。
【０１５０】
コドン組成がＰＶカプシド遺伝子発現において重要な決定要素であるという仮説を支えるさらなる証拠を、遺伝子銀行から現在入手できる８４種類のＰＶ Ｌ１配列の分析結果から集めた。Ｌ１遺伝子のコドン組成および特に稀なコドン使用頻度は、どの参考資料を調らべても本質的には同じであって（資料未記載）、パピローマウイルス・ゲノムのＧ＋Ｃ含有量の類似から推測される。ＰＶ Ｌ１遺伝子はアミノ酸レベルで比較的よく維持され、カプシド・タンパク質機能に対する抑制から予測されるように、ＰＶ遺伝子型間のアミノ酸相同性は６０〜８０％を示す。しかしながら、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成に対する明白な抑制影響はなく、本発明者の仮説以上のものでない。後期遺伝子領域は、他の読み枠の中で、あるいは相補的ＤＮＡ鎖の上のいずれにおいても、他の遺伝子をコードせず、そして既知のシス作用調節機能を有しないことである。もし、カプシド遺伝子のコドン組成がＰＶ機能にとって重要でないとすれば、ＰＶの進化的多様性を考えにいれると、コドン使用のかなりの異質性が予測できるかもしれない（Chan, et al., 1995, J. Virol, 69:3074-3083）。
【０１５１】
総体的にみれば、本明細書中に概括したデータおよび証明事項から強調される点は、コドン使用が未分化および分化の上皮細胞中におけるＰＶ後期遺伝子発現の重要な決定要素であり、この観察結果が一般化できるということである。分化組織中の発現決定におけるメッセージ不安定性およびコドン誤対合の相対的役割からして、分化および未分化の上皮において強力な構成プロモーターから発動されたＬ１またはＬ２遺伝子の転写能および翻訳について比較を必要とする。そのような研究は、形質転換技術あるいは角化細胞ラフト培養のいずれかを利用すれば現に実行可能であろう。
【０１５２】
分化上皮の表層におけるＰＶ Ｌ１またはＬ２遺伝子発現を転写調節するメカニズムが提供されているが（Zeltner et al., 1994, J. Virol. 68:3620; Brown, et al., 1995, Virology 214:259; Stoler et al., 1992, Hum. Pathol. 23:117; Hummel et al., 1995, J. Virol. 69:3381; Haller et al., 1995, Virology 214:245; Barksdale and Baker, 1993, J. Virol. 67:5605）、測定可能なＰＶ後期遺伝子ｍＲＮＡは常に後期タンパク質の産生と関連しているとは限らない（Zelter, et al., 1994, 後述,; Ozbun and Meyers, 1997, J. Virol. 71:5161）。本明細書中に記載したデータは、翻訳調節がＰＶ後期遺伝子発現のコントロールに重要な役割を演ずることを示唆している。この観察は、本明細書に記載したように、自己再生幹細胞集団における外因性遺伝子の発現の潜在的に有害な結果を回避しながら、すべての分化組織の特化機能に関連した遺伝子の発現を調節すること、およびそれらの組織に対し治療遺伝子発現を標的化することに密接な関係を有する。
【０１５３】
本明細書は、本発明の実施のための好ましい態様を含み、本発明者が見出し、提供する個々の具体例を記述している。当業者は、本明細書の開示にかんがみ、本発明の範囲を逸脱することなく、例示した個々の具体例について多数の修飾と変更をなし得ることを認識するであろう。それらすべての修飾は添付の請求項の範囲に含まれるものである。
【０１５４】
表の説明
表１
ヒト、ウシ、イーストおよびコムギタンパク質のコドン使用データを、刊行結果(１８)より用いた。ＢＰＶ１データはＧｅｎｂａｎｋデータベースの配列によるものである。
【０１５５】
表２
各イソ受容ｔＲＮＡを、上付き表示の対応コドンと共に上列に表示した。"＋"はｔＲＮＡの存在量を示し、各"＋"は約１０倍の増加を示す。
【０１５６】
表
【表１】
表１
個々の生物体のコドン使用回数(1/1000)
【０１５７】
【表２】
表１の続き
【０１５８】
【表３】
表１の続き
【０１５９】
【表４】
表１の続き
【０１６０】
【表５】
表１の続き
【０１６１】
【表６】
表２
ＫＣが分化し始めると、ｔＲＮＡ集団が変化する
【０１６２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。
【図２Ａ】 図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現されるＬ１タンパク質の検出を表わす。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。
【図３Ａ】 図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現されたＬ２タンパク質の検出を表わす。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ２およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。
【図４】 図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成Ｌ１（ＨＢ）のインビトロ翻訳を表わす。
【図５Ａ】 図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定するのに用いたプラスミドの模式的表示である。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２タンパク質の発現を表わす。
【図６】 図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。
【図７】 図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのインビボでのＧＦＰの発現パターンを表わす。
（発明の属する技術分野）
本発明は遺伝子治療に一般的に関する。さらに詳細には、本発明は、標的の細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための合成核酸配列に関する。この細胞または組織において、タンパク質をコードする親の核酸配列の少なくとも１つの存在コドンが類義コドンで置換されている。本発明はまた、１つ以上の合成核酸配列および本発明の方法を用いてのウイルス粒子の産生に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療が遺伝子欠陥の処置として臨床的に非常に興味深いものであるにもかかわらず、この治療が臨床現場で主流にならないないのは、標的の組織に対して遺伝子を選択的に送達するのが極めて困難であることが証明されているからである。現在、ウイルスベクター、特にレトロウイルスおよびアデノウイルスが使用されており、これらはある程度は選択的である。しかしながら、多くのベクター系はその本質からして安定な組込み体を産出できず、なかにはまた、免疫反応を起こして効果的な処置を妨害するものもある。あるいは、「裸」DNAがリポゾームまたは他の類似の送達系に封入される。解決すべき重要な問題は、特定の組織に対して遺伝子を選択的に標的化することが多くの疾患治療（例えばガン治療）にとって望ましいにもかかわらず、上述のような遺伝子送達系自体が組織選択的ではないことである。組織特異性プロモーターを使用した標的遺伝子治療は、ある種の動物モデルにおいては効果的ではあるが、ヒトの場合はそれほどの効果は証明されていない。そして、選択的組織特異性プロモーターは広範な組織に利用されていない。
【０００３】
本発明は、パピローマウイルス（PV）後期遺伝子がなぜ分化した角化細胞に限って発現するのかを調べた最近の研究から予想外になされた。この点について、PV後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は非分割分化角化細胞（ＫＣ）にのみ発現することがわかった。本発明者をはじめ多くの研究者達は、一連の、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）を含む通常のウイルスプロモーター、およびＣＭＶおよびＳＶ４０の強い構成プロモーターを使用して、重要なＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパク質の発現を、これらの遺伝子が未分化培養細胞中に形質導入またはトランスフェクトされたときに、検出できなかった。
【０００４】
しかしながら、ＰＶ Ｌ１ ｍＲＮＡは、ラビット・網状赤血球細胞溶解物を使用してインビトロで効果的に翻訳することができ、このことは、溶解物中にＬ１の翻訳を妨害する細胞阻害物質が存在しないことを示唆している。インビトロ翻訳系とインビボ翻訳系との主な相違点は、インビトロ翻訳反応においてはＬ１が優性Ｌ１ ｍＲＮＡを含むのに対し、無傷細胞内においてはＬ１が細胞ｍＲＮＡ中のマイナーフラクションを構成することである。
【０００５】
インビボにおいてＰＶ後期タンパク質は未分化ＫＣ内で産生されない。しかし、高度に分化したＫＣにおいては、このタンパク質は大量に発現される。後期遺伝子発現のこのきびしい調節メカニズムは、あまり理解されておらず、多数のグループによるＫＣ特異性ＰＶ遺伝子転写調節タンパク質の研究は、満足できる結果を得ていない。
【０００６】
インビボにおけるＬ１ ｍＲＮＡ翻訳の遮断は、Ｌ１ ＯＲＦ内における配列に起因すると考えられている（Tan et al.,1995,J.Virol.69 5607-5620; Tan and Schwartz, 1995, J. Virol. 69 2932-2945)。ＨＩＶのＲｅｖおよびＲｅｖ応答エレメントを使用すると、そのような阻害は克服できる（Tan et al. 1995, 後述)。したがって、本発明者は、Ｌ１ ＯＲＦにおける推定「阻害配列」の除去が未分化細胞内でのＬ１タンパク質の産生を可能にするかを調べた。推定配列の除去のためのＢＰＶ Ｌ１の欠失変異生成およびＣＶ−１細胞中で結果として生じる欠失突然変異体の発現からは、意外なことに、Ｌ１ ｍＲＮＡの発現にもかかわらず、Ｌ１タンパク質は検出できなかった。
【０００７】
前述の状況から理解するのがこれまで困難であったことは、パピローマウイルスが、この明らかに「翻訳不能な」遺伝子を利用して、ライフサイクル後期において、いかにして大量のＬ１タンパク質を産出するのかである。
【０００８】
しかしながら意外にも、ＰＶ Ｌ１タンパク質を、未分化宿主細胞において実質的に高レベルで産生し得ることが分かった。この産生は、天然Ｌ１遺伝子の存在コドンを、存在コドンと比較して未分化宿主細胞遺伝子で比較的高頻度で使用される類義コドンによって置換することでなされる。予想に反して、それぞれ違った細胞や組織において特定イソ受容ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の相対存在量が相違すること、およびこの相違が一定のコドン使用または組成を有する遺伝子からのタンパク質発現に重要な役割を果たすことが判明した。この発見によって、合成核酸配列および一般的な方法が実際的となった。そこでは、コドン改変を、特定の細胞または組織に対して、あるいは特殊な分化状態にある細胞に対するタンパク質の標的発現の手段として使用する。
【０００９】
（発明の対象）
本発明の目的は、合成核酸配列および標的の細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現する方法を提供することである。この配列および方法は、先行技術についての欠点の少なくともいくつかを改善するものである。
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明の１つの観点は、一つのタンパク質が哺乳動物の標的細胞または組織において選択的に発現しうるが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しない合成ポリヌクレオチドを構築する方法を提供するものであって、該方法は、親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在するコドンを類義コドンで置換して、該合成ポリヌクレオチドを形成する工程を包含する。
【００１１】
適切には、該方法は、上記類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡが、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するように類義コドンを選択する工程をさらに包含する。
【００１２】
好ましくは、選択工程が、下記工程によってさらに特徴付けられる；
（ａ）該標的の細胞または組織および１以上の他の細胞または組織において相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量を測定すること、および
（ｂ）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００１３】
好ましくは、選択工程は、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
あるいは、上記工程は、該類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、標的の細胞または組織から誘導された細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
【００１４】
好都合には、該選択工程は、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡが、該１以上の他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて、少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在することをさらに特徴とする。
【００１５】
あるいは、該方法は、次の（１）〜（８）よりなる群から該類義コドンを選択する工程をさらに包含する；（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）該１以上の他の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）該１以上の他の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）他の生物体の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（８）他の生物体の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン。
【００１６】
好ましい実施態様において、該方法は、該タンパク質が、該標的の細胞または組織における該親ポリヌクレオチドから発現されるタンパク質に比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで、該標的細胞または組織における該合成ポリヌクレオチドから発現するように、少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを選択する工程を包含する。
【００１７】
別の観点において、本発明は、上記方法のいずれかに従って構築された合成ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
好ましくは、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化細胞である。
より具体的には、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化ケラチノサイトである。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の標的細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための方法であって、該方法は下記工程を包含する；
（ａ）該タンパク質をコードする親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該タンパク質が該標的細胞または組織で選択的に発現され得るが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しないように該親ポリヌクレオチドに比べると異なる翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生すること；
（ｂ）１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを、哺乳動物に投与し、該標的の細胞または組織、または該標的の細胞または組織の前駆細胞または前駆組織に導入すること；
（ｃ）該標的の細胞または組織において該タンパク質を選択的に発現させるが、１以上の他の細胞または組織において発現しないこと。
【００２０】
好ましくは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む；
（ｉ）該標的の細胞または組織および該１以上の他の細胞または組織において相違のイソ−tＲＮＡの相対存在量を測定する。
（ii）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００２１】
適当には、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００２２】
あるいは、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
あるいは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む。（Ｉ）標的の細胞または組織の遺伝子、（II）各々他の細胞または組織の遺伝子、（III）哺乳動物の遺伝子および（IV）他の生物体の遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子により使用される特定のコドンの夫々の比較頻度に基づいて該少なくとも１つの存在コドンおよび該類義コドンを同定すること。
【００２３】
他の観点において、本発明は、第１ポリヌクレオチドから標的の細胞または組織でタンパク質を発現さす方法を提供する。この方法は、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組織中に、少なくとも１つのイソ受容tＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを導入すること、ここで、該第２ポリヌクレオチドは１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結しており、該少なくとも１つのイソtＲＮＡは該標的の細胞または組織において比較的低量で正常に存在し、該第１ポリヌクレオチドのコドンに対応する、からなる工程を含む。
【００２４】
さらなる観点において、本発明は周期中真核細胞におけるウイルス粒子を産生する方法に及ぶ。該ウイルス粒子はその集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに充分なレベルでは親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該方法は次の工程を含む。
（ａ）該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該親ポリヌクレオチドに比べると変化した翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生する。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞中で該合成ポリヌクレオチドから発現が可能である。
（ｂ）該細胞またはその前駆体細胞中に、１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを導入する。
（ｃ）少なくとも１つのタンパク質を該細胞中で、該ウイルス粒子の集合に必要な他のウイルスタンパク質の存在下で発現し、もって該ウイルス粒子を産生する。
【００２５】
本発明のさらなる観点において、周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法が提供される。該ウイルス粒子はその粒子の集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンは、該少なくとも１つのタンパク質の産生を該レベルにまで律速的にする。該方法は、該細胞中に、該少なくとも１つのコドンに特異的なイソ受容 t ＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチドを、導入する工程を含む。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動物遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２７】
図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動物遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−１Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２８】
図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、真核細胞における最適発現のために修飾された天然配列に同じであるが、パピロマウイルス遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のポリペプチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２９】
図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現されるＬ１タンパク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３６時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３０】
図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【００３１】
図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダイゼーションによって調べた。
【００３２】
図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現されたＬ２タンパク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３６時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３３】
図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ２およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【００３４】
図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダイゼーションによって調べた。
【００３５】
図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成Ｌ１（ＨＢ）のインビトロ翻訳を表わす。ウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物を35Ｓ−メチオニンの存在において使用した。上部のパネルにおいて、ｗｔＬ１またはＨＢＬ１のプラスミドＤＮＡをＴ７ＤＮＡポリメラーゼ結合インビトロ翻訳系に加えた。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロット法で検出した。下部のパネルにおいて、ｗｔＬ１またはＨＢＬ１配列の翻訳効率をｔＲＮＡの存在または不存在で比較した。翻訳をウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物において行ない、８分から出発して２分毎にサンプルを収集した。下部パネルの左側は１０-5Ｍのウシ肝臓または酵母ｔＲＮＡが供給されたかを表わす。
【００３６】
図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定するのに用いたプラスミドの模式的表示である。野性型Ｌ１配列および大部分の野性型Ｌ２配列がＢＰＶ１ゲノムからＢａｍＨＩおよびＨindIII消化により検出され、残りのＢＰＶ１配列（黄色）をｐＵＣ１８にクローンした。野性型または合成ヒト化Ｌ２配列（赤色）をＢＰＶ１ゲノムのＢａｍＨＩ部位に挿入した。挿入ＳＶ４０ｏｒｉ配列（白色）の位置を表示する。修飾Ｌ２が使用されているが、ＳＶ４０ｏｒｉ配列のないプラスミドを対照として用いた。プラスミドをＣｏｓ−１細胞中にトランスフェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクローナル抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。
【００３７】
図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２タンパク質の発現を表わす。図５Ａで示されたプラスミドを用いてＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクローナル抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。細胞がプラスミドを受けつけない偽のトランスフェクションを対照として用いた。
【００３８】
図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。ｇｆｐまたはｐｇｆｐでトランスフェクトされた細胞から抽出されたｍＲＮＡは、32Ｐ標識ｇｆｐプローブでプローブされ、参照遺伝子としてgapdhを用いて、右側のパネルに示す。
【００３９】
図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのインビボでのＧＦＰの発現パターンを表わす。遺伝子銃を用いて、マウスにＧＦＰタンパク質をコードするＰＧＦＰ（左側パネル）およびＧＦＰ（右側パネル）発現プラスミドを射入した。マウス皮膚の横断面はｇｆｐ遺伝子が発現される箇所を表わす。同じ箇所の明るい視野の写真は、真皮（Ｄ）および表皮（Ｅ）を明示し、表皮における蛍光の位置を同定する。矢印は蛍光シグナルを示す。
【００４０】
（詳細な説明）
本発明は次のような予想されない発見から生じた。相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量が、別異の細胞または組織あるいは分化の別異の段階または細胞周期の別異なの段階にある細胞または組織において変化すること、および該相違が遺伝子のコドン組成とともにおこり、特定の細胞または組織に対して、あるいは分化の特異な状態または細胞周期の特異な段階にある細胞または組織に対してタンパク質の発現の調節および指令をなすことを発見した。本発明により、この選択的標的化は、タンパク質をコードする親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換することで実施される。
【００４１】
存在コドンを類義コドンで置換すること自体は新しくない。この点について国際出願公開Ｎｏ.ＷＯ９６／０９３７８を引用する。この出願で該置換が使用されているのは、インビトロ哺乳動物細胞培養系において高レベルで真核細胞またはウイルスに由来するタンパク質を発現する方法においてである。この方法の要点は該タンパク質を収穫することである。これに反して、本発明では、特定の細胞または組織に対して遺伝子の発現を標的化するために、遺伝子中の１以上のコドンの置換を使用し、その最終目的は本明細書記載のような遺伝子治療を容易にすることである。
【００４２】
用語“類義コドン”とは、存在コドンと相違するヌクレオチド配列を有するが、存在コドンと同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。
【００４３】
用語“イソ受容 t ＲＮＡ”は、アンチコドン構造が相違するが、同じアミノ酸に特異的である１以上の転移ＲＮＡ分子を意味する。
【００４４】
本明細書を通して、別記しない限り、用語“含む”および“包含する”は、記述した物または群を含み、他の物または群を排除するものでないと理解されるべきである。
【００４５】
（類義コドンの選択）
別異の細胞における相違するｔＲＮＡ種の相対存在量の測定
【００４６】
好都合に、類義コドンはイソｔＲＮＡに対応する。このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比較すると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比べて標的細胞または組織中に高い量で存在する。
【００４７】
２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの比較量を測定するには、いかなる方法も利用できる。例えば、該方法には、哺乳動物から２以上の特定の細胞または組織を単離し、ｔＲＮＡ含有の各細胞または組織からＲＮＡ抽出物を得て、各々が特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違の核酸配列で各抽出物を夫々プローブして、２以上の細胞または組織間のイソｔＲＮＡの比較量を測定する。
【００４８】
特定の細胞または組織を単離する適切な方法は当業者によく知られている。例えば、細胞または組織の１以上の特性を利用して異種集団から細胞または組織を特異的に単離することができる。該特性には、限定するわけではないが、組織の解剖的位置、細胞密度、細胞サイズ、細胞形態、細胞代謝活性、Ｃａ2+、Ｋ+およびＨ+などのイオンの細胞摂取、染料などの化合物の細胞摂取、細胞表面で発現されるマーカー、サイトカイン発現、タンパク質蛍光および膜電位がある。この点について使用できる適当な方法には、組織の外科的除去、蛍光活性セルソーター（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法、免疫親和性分離（例えば、Ｄynabead（商標）分離などの磁気ビード分離）、密度分離（メトリサミド、Ｐercoll（商標）またはＦicoll（商標）の順次遠心分離）および細胞型特異的密度分離（例えば、Ｌymphoprep（商標））がある。例えば、分割細胞または芽細胞は、ＦＡＣＳまたはメトリザミド順次分離によって細胞サイズに従って、非分割細胞または残留細胞から分離される。
【００４９】
細胞または組織から全ＲＮＡを単離するためにいかなる適当な方法も用いられる。本発明で用い得る典型的な方法は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａusubel，et al.，eds）（Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons，Ｉnc.１９９７）（出典明示により本明細書の一部とする）の頁４.２.１から頁４.２.７に記載されている。好ましくはｔＲＮＡの単離に適した方法は、例えばＢrunngraber，Ｅ.Ｆ.（１９６２，Ｂiochem，Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.８：１−３）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のように行なわれる。
【００５０】
ＲＮＡのプローブは、特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違のオリゴヌクレオチド配列で行なわれる。対象とする哺乳動物にとって、哺乳動物により発現される特定のイソｔＲＮＡ配列で特異的にハイブライドするオリゴヌクレオチド配列を選択する必要がある。該選択は、既知のイソｔＲＮＡ配列を基とする従来技術の一つの中にはいる。例えば、マウスの場合、用い得る例示的オリゴヌクレオチド配列には、Ｇauss and Ｓprinzel（１９８３，Ｎucleic Ａcids Ｒes.１１（１））（出典明示により本明細書の一部とする）記載のものがある。この点について、オリゴヌクレオチドは下記よりなる群から選択し得る。
【００５１】
5'-TAAGGACTGTAAGACTT-3' (配列番号13) AlaGCA
5'-CGAGCCAGCCAGGAGTC-3' (配列番号14) ArgCGA
5'-CTAGATTGGCAGGAATT-3' (配列番号15) AsnAAC
5'-TAAGATATATAGATTAT-3' (配列番号16) AspGAC
5'-AAGTCTTAGTAGAGATT-3' (配列番号17) CysTGC
5'-TATTTCTACACAGCATT-3' (配列番号18) GluGAA
5'-CTAGGACAATAGGAATT-3' (配列番号l9) GlnCAA
5'-TACTCTCTTCTGGGTTT-3' (配列番号20) GlyGGA
5'-TGCCGTGACTCGGATTC-3' (配列番号21) HisCAC
5'-TAGAAATAAGAGGGCTT-3' (配列番号22) IleATC
5'-TACTTTTATTTGGATTT-3' (配列番号23) LeuCTA
5'-TATTAGGGAGAGGATTT-3' (配列番号24) LeuCTT
5'-TCACTATGGAGATTTTA-3' (配列番号25) LysAAA
5'-CGCCCAACGTGGGGCTC-3' (配列番号26) LysAAG
5'-TAGTACGGGAAGGATTT-3' (配列番号27) Metelong
5'-TGTTTATGGGATACAAT-3' (配列番号28) PheTTC
5'-TCAAGAAGAAGGAGCTA-3' (配列番号29) ProCCA
5'-GGGCTCGTCCGGGATTT-3' (配列番号30) ProCCI
5'-ATAAGAAAGGAAGATCG-3' (配列番号31) SerAGC
5'-TGTCTTGAGAAGAGAAG-3' (配列番号32) ThrACA
5'-TGGTAAAAAGAGGATTT-3' (配列番号33) TyrTAC
5'-TCAGAGTGTTCATTGGT-3' (配列番号34) ValGTA
【００５２】
典型的には、イソｔＲＮＡ種の相対存在量はブロッティング法により測定し得る。この方法は、サンプルのＲＮＡまたはｔＲＮＡ抽出物をマトリックス（好ましくは、ニトロセルロースなどの合成膜）上に固定する工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含む。ノーザン・ブロッティング法が、核酸プローブに相補的なＲＮＡ配列を同定するのに用いられる。あるいは、ドットブロッディングおよびスロットブロッティングが、相補的なＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ核酸配列を同定するのに用いられる。該技術は、Ａusubel et al.（前出）の頁２.９.１から２.９.２０に記載されている。
【００５３】
該技術によってマトリックス上に固定されたサンプルのｔＲＮＡは、放射活性的、酵素的または蛍光色素的に標識された相補的ヌクレオチド配列（上記したような）に、ストリジェンシィな条件でハイブリダイズされる。
【００５４】
“ストリジェンシィ”とは、ハイブリダイセイションにおける、ある種の有機溶媒の存在または無存在下での温度およびイオンの強化条件を意味する。ストリジェンシィが高くなると、固定ヌクレオチド配列（すなわち、イソｔＲＮＡ）と標識オリゴヌクレオチド配列との間の相補性の度合が増加する。使用できる典型的なストリジェンシィの条件については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前出）の頁２.１０.１から２.１０.１６および Molecular CLONING. A LABORATORY MANUAL（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，1989）の章１.１０１から１.１０４を参照のこと（出典明示により本明細書の一部とする）。
【００５５】
ストリジェンシィ洗滌は温度約４２°から６８℃で典型的には行なわれるが、当業者は、他の温度もストリジェンシィ条件として用いうることが分かるであろう。最大ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリドの形成についてのＴｍが約２０から２５以下で典型的に起こる。既知技術で知られているように、Ｔｍは、融点または２種の相補的核酸配列が解離する温度である。Ｔｍを判定する方法はよく知られている（参照、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、前出、頁２.１０.８）。最大のハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドについてＴｍが約１０°から１５℃以下で起きる。
【００５６】
他のストリジェンシィ条件はよく知られている。当業者は分かるように、種々の要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最大化する。最終洗滌のストリジェンシィを最適化すると、高度のハイブリダイゼーションが保証される。
【００５７】
固定化ヌクレオチド配列にハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列を検出する方法は、当業者によく知られている。この検出方法には、オートラジオグラフィー、化学ルミネッセンス、蛍光法および比色法が含まれる。
好都合には、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの相対存在量は、イソｔＲＮＡに特異的な標識ヌクレオチド配列の結合の各々のレベルを２以上の細胞または組織から得た固定ＲＮＡの同等量と比較することによりなされる。同様の比較を適当に実施すると、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの各々の相対存在量が測定される。当業者は、種々の細胞または組織について比較ｔＲＮＡ存在量が測定できる（参照、例えば表２）。該比較から、各類義コドンがイソｔＲＮＡに対応するように、１以上の類義コドンが選択される。このイソｔＲＮＡは、親核酸配列の存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織中での存在量が高い。
【００５８】
好都合には、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡの選択は、哺乳動物の各々他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在するようになされる。
【００５９】
適切には、分化細胞、好ましくは分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現のための類義コドンは、ｇｃａ（Ａｌａ）、ｃｕｕ（Ｌｅｕ）およびｃｕａ（Ｌｅｕ）よりなる群から選択される。
【００６０】
非分化細胞、好ましくは非分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現のための類義コドンは、ｃｇａ（Ａｒｇ）、ｃｃｉ（Ｐｒｏ）およびａａｇ（Ａｓｎ）よりなる群から選択される。
【００６１】
（コドン使用分析）
別法として、類義コドンは、（ｉ）特定の細胞または組織、（ii）哺乳動物の実質的に全ての細胞または組織、または（iii）哺乳動物の特定細胞または組織に感染し得る生物体、で発現される遺伝子についてコドンが使用されている頻度を分析することにより選択され得る。
【００６２】
コドン頻度表および生物体におけるコドン使用頻度の測定に適した方法は、例えばシャープらによる文献（1988，Nucleic Acids Res. 16 8207−8211）に記載されており、これを引用して説明の一部とする。
【００６３】
遺伝子発現の相対レベル（例、検出可能なタンパク質発現と検出可能なタンパク質発現無し）により、相異なる細胞または組織で発現される特異的イソ−ｔＲＮＡの相対存在量の間接的尺度が得られる。例えば、ウイルスは、第１の細胞または組織（特定の分化段階にある細胞または組織を含み得る）内では増殖し得るが、第２の細胞または組織（別の分化段階にある細胞または組織を含み得る）では実質的に増殖できない場合があり得る。すなわち、ウイルスの遺伝子によるコドン使用パターンを第２の細胞または組織で発現された遺伝子によるコドン使用パターンと比較すると、第２の細胞または組織に対し第１の細胞または組織において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドンが間接的に得られ、逆もまた同様である。同時に、上記比較はまた、第１の細胞または組織に対し第２の細胞または組織において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドンを間接的に提供し得る。
【００６４】
前述したことから、本発明による類義コドンは、（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）その他または互いに別の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）その他または互いに別の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）別の生物の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、および（８）別の生物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドンを含むコドンに対応し得るが、これらに限定されるわけではない。
【００６５】
例えば、哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドンは、cuc（Leu）、cuu（Leu）、cug（Leu）、uua（Leu）、uug（Leu）、cgg（Arg）、cgc（Arg）、aga（Arg）、agg（Arg）、agu（Ser）、agc（Ser）、ucu（Ser）、ucc（Ser）、およびuca（Ser）から成る群から選択され得る。別法として、上記コドンは、auu（Ile）、auc（Ile）、guu（Val）、guc（Val）、gug（Val）、acu（Thr）、acc（Thr）、aca（Thr）、gcu（Ala）、gcc（Ala）、gca（Ala）、cag（Glu）、ggc（Gly）、gga（Gly）、ggg（Gly）を含み得る。
【００６６】
哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されているコドンはシャープら（1988、前出）により報告されている。上記コドンには、cua（Leu）、cga（Arg）、cgu（Arg）、cgu（Arg）、ucg（Ser）が含まれ得る。別法として、上記コドンには、aua（Ile）、gua（Val）、acg（Thr）、gcg（Ala）、caa（Glu）、ggu（Gly）が含まれ得る。
【００６７】
（合成核酸配列の構築）
存在コドンを類義コドンに置換する段階は、適当なものであればいかなる技術によっても遂行され得る。例えば、当業界の熟練者に熟知されているインビトロ突然変異誘発方法が使用され得る。適当な突然変異誘発方法は、例えばアウスベルら（前出）およびサムブルックら（前出）の関連部分に記載されており、それらを引用して説明の一部とする。別法として、適当なＤＮＡ改変方法は、例えば米国特許第４１８４９１７号、第４３２１３６５号および第４３５１９０１号に開示されており、それらを引用して説明の一部とする。インビトロ突然変異誘発法ではなく、容易に入手可能な機械装置を用いても、第２の核酸配列が新たに合成され得る。ＤＮＡの連続合成については、例えば米国特許第４２９３６５２号に記載されており、これを引用して説明の一部とする。しかしながら、本発明は、存在コドンを類義コドンと置き換えるためのいずれか１つの特定技術に依存的なものではなく、それを指向するわけではない。
【００６８】
親核酸配列の存在コドン全てを、他の細胞と比べ標的細胞において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換する必要はない。部分置換であっても、発現増加は達成され得る。好ましくは、置換段階は、親核酸配列の存在コドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、さらに好ましくは３５％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上に影響を及ぼし得る。
【００６９】
親核酸配列は、好ましくは天然遺伝子である。「天然遺伝子」とは、タンパク質を自然にコードする遺伝子を包含する。しかしながら、親核酸配列が、天然には存在しないが組換え技術を用いる遺伝子工学で作られたタンパク質をコードすることはあり得る。
【００７０】
親核酸配列は、必ずしも哺乳動物から入手される必要はないが、適当な供給源、例えば真核生物または原核生物から入手され得る。例えば、親核酸配列は、別の哺乳動物または他の動物から得られる。別法として、親核酸配列は病原体から得られる。かかる場合、病原体の天然宿主は、好ましくは哺乳動物である。例えば、病原体は酵母、細菌またはウイルスであり得る。
【００７１】
例えば、本発明による選択的発現に使用され得る適当なタンパク質には、嚢胞性線維症貫膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）があるが、これらに限定はされない。ＣＦＴＲの場合、合成核酸配列の製造に利用され得るＣＦＴＲタンパク質をコードする親核酸配列については、例えばリオーダンら（1989，Science 245 1066-1073）、および受入れ番号ＨＵＭＣＦＴＲＭとしてジーンバンクのデータベースに記載されており、これらを引用して説明の一部とする。
【００７２】
ここで使用されている「核酸配列」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。
【００７３】
合成核酸配列の発現調節に使用され得る調節ヌクレオチド配列には、プロモーター、エンハンサーおよび転写ターミネーターがあるが、これらに限定されるわけではない。上記調節配列については、当業者に熟知されている。
【００７４】
本発明による合成核酸配列は、発現ベクター形態において１以上の調節配列に機能し得るように結合され得る。「ベクター」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは哺乳動物もしくは昆虫ウイルスから誘導される核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味し、そこへは合成核酸配列が挿入またはクローン化され得る。ベクターは、好ましくは１以上の特有の制限部位を含み、標的の細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその前駆組織を含む特定宿主細胞において自律複製することが可能であるか、またはクローン化配列が再生され得るように特定宿主のゲノムに組み込まれ得る。すなわち、「発現ベクター」とは、タンパク質合成を指図し得る自律要素を全て包含する。上記発現ベクターは、当業者にはよく知られている。
【００７５】
ここで使用されている「前駆細胞」の語は、標的細胞のもととなる細胞を包含する。
【００７６】
本発明はまた、タンパク質の目的部分をコードする合成核酸部分配列をも包含する。核酸部分配列は、それに伴う機能を有するタンパク質のドメインをコードし、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０、５０、１００、１５０または５００個の隣接アミノ酸をコードする。
【００７７】
合成核酸配列を標的細胞に導入する段階は、意図された用途および／または種類により異なり、非ウイルス性およびウイルス性ベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルスおよびアデノウイルス、例えばムリガン、Ｒ．Ｃ．、（1993，Science 260 926-932）に記載されたものを含み得、これを引用して説明の一部とする。上記方法としては、次のものが挙げられる。
【００７８】
（ｉ）注入（ウォルフら、1990，Science 247 1465−1468、これを引用して説明の一部とする）、外科的内植、点滴または他のいずれかの手段による合成核酸配列の局所適用法。この方法はまた、合成核酸配列によりコードされるタンパク質に応答性を示す細胞の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段による局所適用と組み合わせて使用されることにより、その処置の有効性を高め得る。この方法はまた、上記タンパク質の活性に要求される別の因子または複数因子の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段による局所適用と組み合わせて使用され得る。
【００７９】
（ii）ＤＮＡ（カラブレッタら、1993，Cancer Treat． Rev． 19 169−179、これを引用して説明の一部とする）またはＲＮＡを、単独またはリポソーム（ズーら、1993，Science 261 209−212、これを引用して説明の一部とする）、ウイルスカプシドまたはナノ粒子（バートリングら、1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390−405、これを引用して説明の一部とする）または他のいずれかのデリバリー仲介物質と組み合わせたものの注入による一般的全身デリバリー。合成核酸配列を標的分子に結合すること（例えば抗体を用いるいわゆる「魔弾」法）、または上記合成核酸配列から製造されるタンパク質の活性に要求される別の因子または複数因子または上記タンパク質に応答性を示す細胞の注入、外科的内植または他のいずれかの手段による局所適用により、標的化の改善が達成され得る。
【００８０】
（iii）細胞における合成核酸配列の発現を増加させるため、トランスフェクション（例えば、燐酸カルシウムの存在下：チェンら、1987，Mole．Cell Biochem. 7 2745−2752、またはカチオン脂質およびポリアミン類の存在下：ローズら、1991，BioTech. 10 520−525、これらの文献を引用して説明の一部とする）、感染、注入、電気穿孔（シゲカワら、1988，BioTech. 6 742-751、これを引用して説明の一部とする）または他の何らかの方法により生体外（エクスビボ）修飾された細胞の注入または内植または何らかの手段による送達。この修飾は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス性（例えばアデノウイルスまたはレトロウイルス性、ムリガン、1993，Science 260 926-932、ミラー、1992，Nature 357 455−460、サーモンズら、1993，Hum. Gen. Ther. 4 129−141、これらの文献を引用して説明の一部とする）または他のベクター、または他の修飾作用物質、例えばリポソーム（ズーら、1993，Science 261 209−212、これを引用して説明の一部とする）、ウイルスカプシドまたはナノ粒子（バートリングら、1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390−405、これを引用して説明の一部とする）または他の修飾伝達物質により伝達され得る。遺伝子または遺伝子産物送達ビークルとしての細胞の使用については、バールら、1991，Science 254 1507−1512およびダバンら、1991，Science 254 1509−1512により報告されており、これらの文献を引用して説明の一部とする。処理された細胞は、処置対象におけるその生存を助長する栄養素、成長因子、マトリックスまたは他の薬剤と組み合わせて送達され得る。
【００８１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の合成核酸配列および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
「薬学的に許容し得る担体」とは、全身投与で安全に使用され得る固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路によって、当業界で公知の様々な薬学的に許容し得る担体が使用され得る。これらの担体は、糖類、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール類、アルギン酸、燐酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水および発熱物質不含有水を含む群から選択され得る。
【００８３】
特定の細胞または組織における上記合成核酸配列からのタンパク質の発現を測定するのに適したものであれば、いかなる技術でも使用され得る。例えば、発現は、興味の対象であるタンパク質またはその一部に特異的な抗体を用いて測定され得る。上記抗体および測定技術は、当業者にはよく知られている。
【００８４】
（適用法）
本発明の一具体例において、標的細胞は、好適には分化した細胞である。有利には、分化細胞における選択的発現が所望されているタンパク質は、前記タンパク質に随伴する特定機能を発揮するのに十分なレベルで親核酸配列からその前駆細胞（例えば哺乳動物の未分化または低分化細胞）において発現することはできない。この具体例において、少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと置換する段階は、類義コドンが、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比較した場合、前駆細胞と比べ分化細胞での存在量が比較的高いイソ−ｔＲＮＡに対応することを特徴としている。従って、親核酸配列と比べて改変された翻訳速度を有する合成核酸配列が製造され、その場合タンパク質は、分化細胞においてタンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで発現可能であるが、このタンパク質は前駆細胞において上記機能の発揮に充分なレベルでは発現され得ない。
【００８５】
ここで使用されている「機能」の語は、生物学的または治療的機能を指す。
【００８６】
上記具体例は、未分化細胞、例えば幹細胞におけるタンパク質の過剰発現が幹細胞の死または分化を含め望ましくない結果を有する体細胞遺伝子治療において有利に利用され得る。かかる場合、適当なタンパク質には、嚢胞性線維症貫膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）が含まれる。
【００８７】
分化細胞は、上皮、造血または神経起源の細胞を含むあらゆる系統の細胞を包含し得る。例えば、分化細胞は、成熟分化ケラチノサイト（ケラチン生成細胞）であり得る。
【００８８】
幹細胞自体ではなく幹細胞の子孫に対するタンパク質の標的発現
上記で製造された合成核酸配列は、所望の機能のため分化細胞へ直接トランスフェクションされるかまたは別法として前駆細胞へトランスフェクションされ得る。例えば、ＡＤＡ欠損の場合、幹細胞におけるＡＤＡ発現の結果、望ましくないステム表現型の喪失が起こり得る。しかしながら、有利な治療は、１以上の調節配列に機能し得るように結合された合成核酸配列をオートロガス骨髄幹細胞に導入する方法に基づいたものであり得、その場合に野生型ＡＤＡ遺伝子の存在コドンは、骨髄幹細胞と比べ分化リンパ球において比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換されている。次いで、形質導入された幹細胞は患者へ再注入され得る。この方法により、ＡＤＡ自体を発現し得ないが、治療効果をもたらすのに充分なレベルでＡＤＡを発現し得る分化リンパ球の再生可能な集団を生じさせ得る形質導入された骨髄幹細胞が得られる。この点で、この目的に適当な細胞供給源は、患者の末梢血または骨髄からのＣＤ３４陽性細胞として単離された幹細胞を含み得る。遺伝子送達のため、適当なベクターは、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルスを含み得る。
【００８９】
別法として、細胞性免疫を誘導する場合、樹状細胞は重要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるが、一旦活性化された抗原提示に関する寿命は１４ないし２１日間と非常に限られている。従って、樹状細胞は最適ではあり得ない比較的短期間の免疫刺激を供する。しかしながら、本発明によると、長期免疫刺激は、オートロガス骨髄誘導ＣＤ３４陽性樹状細胞前駆体に抗原、例えば黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１をコードする合成ヌクレオチド配列を導入することにより与えられ得、この場合、合成配列は１以上の調節配列に機能し得るように結合されており、ＭＡＲＴ−１をコードする野生型ヌクレオチド配列の存在コドンは、樹状細胞前駆体と比べ樹状細胞で比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換されている。次いで、形質導入された樹状細胞前駆体は、患者に再注入され得る。この方法により樹状細胞前駆体が得られる。この前駆体は、ＭＡＲＴ−１自体を発現し得ないが、ＭＡＲＴ−１を発現し得る樹状細胞の再生可能な集団を生じ得る。この樹状細胞によるＭＡＲＴ−１の発現は、ＭＡＲＴ−１抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の終生間欠性再刺激を可能にするのに充分なレベルである。
【００９０】
幹細胞の子孫ではなく幹細胞に対するタンパク質の標的発現
別の態様において、標的細胞は、タンパク質が、未分化細胞においてタンパク質に伴う特定機能を発揮するのに充分なレベルではタンパク質をコードする親核酸配列から発現し得ない未分化細胞であり得る。かかる場合、親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比べたとき、分化細胞と比べ未分化細胞で存在量が比較的高いイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンと置換されている。この結果、上記親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列が得られ、この場合タンパク質はタンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞において発現可能であるが、このタンパク質は上記機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞から誘導された分化細胞においては発現し得ない。
【００９１】
実例として、この上記態様を用いることにより、特定未分化細胞または幹細胞での発現時に特定細胞系譜に沿った幹細胞の分化を容易にする転写調節タンパク質の発現が行われ得る。かかる場合、調節タンパク質は、存在コドンが他のイソ−ｔＲＮＡと比べ幹細胞において存在量が比較的低いイソ−ｔＲＮＡに対応する遺伝子から正常に発現され、従ってタンパク質は、特定細胞系譜に沿って分化する幹細胞の増殖に関与するには充分なレベルでは発現され得ない。また、特定細胞系譜に沿って分化する上記の関与を利用することにより、特定系譜の細胞、例えば癌細胞の生成が阻止され得ることは明らかである。
【００９２】
別法として、この態様による方法を用いることにより、治療剤（複数も可）の製造に関与する転写調節タンパク質が発現され得る。かかるタンパク質としては、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）の製造に関与するＮＦ−カッパ−Ｂ転写因子ｐ６５サブユニット（ＮＦ―カッパ―Ｂ ｐ６５）および顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）が含まれ得る。ＮＦ―カッパ―Ｂ ｐ６５は、幹細胞で比較的低い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する若干の存在コドンを含むヌクレオチド配列により自然にコードされる。従って、上記配列は、この態様による親核酸配列として使用され得る。このタンパク質をコードする適当なヌクレオチド配列は、例えばライルら（1994、Gene 138 265−266）および受付番号ＨＳＮＦＫＢ６５ＡとしてＥＭＢＬデータベースに記載されており、これらを引用して説明の一部とする。
【００９３】
この態様に従い利用され得る適当な未分化細胞には、幹細胞、例えばＣＤ３４陽性造血幹細胞があるが、これに限定されるわけではない。
【００９４】
この態様はまた、導入遺伝子の進行的調節発現が望まれる遺伝子治療に有利に利用され得る。例えば、確実ではあるが可逆的な受胎能調節は、獣医業務およびヒトにおいて望ましい。上記調節は、１以上の調節配列の制御下で黄体化ホルモン（ＬＨ）拮抗物質または黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）拮抗物質をコードする合成核酸配列をオートロガス胸管上皮細胞に形質導入することにより行われ得る。合成核酸は、親核酸の存在コドンを、休止胸管上皮細胞で元の分化細胞と比べて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンと置換することにより製造され得る。一旦形質導入細胞が患者に移植されると、発現はプロゲストーゲン（progestagen）の経口投与により切断され得、余儀なく幹細胞の大多数が分化し、拮抗物質の発現が失われる。一旦妊娠が確立されると、抑止は、自然に生成されたプロゲストーゲンにより自続式になる。休止およびエストロゲン駆動胸部上皮細胞のイソ−ｔＲＮＡ組成は、まず整復乳房形成術から休止細胞を得、エストロゲンの存在および非存在下において細胞ｔＲＮＡ組成を測定することにより確立され得る。合成核酸配列は、細胞の生体外電気穿孔によりオートローガス休止上皮細胞へ導入され得、それに続いて形質導入細胞は患者へ皮下移植され得る。プロゲストーゲンは、受胎能調節の逆転に対する要求に応じて投与され得る。
【００９５】
哺乳動物の他の細胞ではなく腫瘍細胞への毒素の標的発現
腫瘍細胞を殺し得る多くの毒素および薬剤は利用可能である。しかしながら、これらの毒素および薬剤は、一般に分裂中の細胞全てに毒性を示す。それにもかかわらず、この問題は、腫瘍クローンにおいてイソ受容ｔＲＮＡ組成を確立し、哺乳動物の正常な分裂細胞と比べると腫瘍クローンにおいて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンを用いて合成毒素遺伝子（例、リシン遺伝子）または合成抗増殖遺伝子（例、腫瘍サプレッサーｐ５３）を構築することにより改善され得る。次いで、合成遺伝子を適当な手段により患者に導入すると、合成遺伝子が腫瘍細胞において選択的に発現する。
【００９６】
別法として、腫瘍で効果的に発現されるとは思われないコドンパターンを用いる化学療法促進産物遺伝子（すなわち、薬剤耐性遺伝子、例、多剤耐性遺伝子）も使用され得る。
【００９７】
標的遺伝子治療による体脂肪制御
レプチンは、飽満を制御することが知られているタンパク質である。しかしながら、動物データから類推すると、患者に投与するレプチンが多すぎる場合、レプチン誘導飢餓が起こり得る。有利には、非活性化脂肪細胞と比べて活性化脂肪細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンを含むレプチンをコードする合成遺伝子が構築され得る。次いで、合成遺伝子は、レプチンが非活性化脂肪細胞の場合とは反対に活性化脂肪細胞でのみ実質的に発現されるように適当な手段により患者に導入され得る。体脂肪代謝回転がレプチンにより低減化した食欲の影響下で減少すると、脂肪細胞の代謝活性およびレプチン産生がそれに応じて減少する。
【００９８】
細胞周期の段階に対するタンパク質の標的発現
本発明の別の態様では、標的細胞は周期外細胞であり得る。この場合、細胞周期中細胞で選択的に発現されるのが望ましいタンパク質は、タンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで親核酸配列から哺乳動物の周期中細胞において発現可能である。類義コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡと比べた場合、周期中細胞と比較して周期外細胞で高存在量であるイソ−ｔＲＮＡに各々が対応するように選択される。従って、親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列が製造され、この場合、タンパク質は上記タンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで周期外細胞において発現され得るが、タンパク質が周期外細胞で発現され、上記機能を発揮することは不可能である。
【００９９】
ここで使用されている「周期外細胞」の語は、細胞周期から脱し、Ｇ０期に入った細胞を指す。この段階では、内生遺伝子の転写およびタンパク質翻訳は細胞周期の相、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期の場合と比べて実質的に低レベルであることがよく知られている。
【０１００】
「周期中細胞」は、細胞周期の上記相の１つにある細胞を意味する。
【０１０１】
標的細胞または組織におけるイソ−ｔＲＮＡのインビボ発現による標的細胞または組織でのタンパク質発現
別の態様において、本発明は、タンパク質が標的細胞で選択的に発現され得る方法であって、１以上のイソ受容ｔＲＮＡをそこで発現させ得る補助核酸配列を細胞へ導入することによる方法に関する。このｔＲＮＡは、細胞において比較的高い存在量で発現されることはないが、タンパク質に伴う機能の発揮に充分なレベルに達するまで親核酸配列からのタンパク質の発現について律速的である。この態様では、細胞における補助核酸配列の導入により、上記タンパク質がタンパク質に伴う機能を発揮するのに充分なレベルで発現されるように親核酸配列の翻訳速度が改変される。
【０１０２】
補助核酸配列を標的細胞または複数のこれらの細胞を含む組織へ導入する段階は、適当なものであればいかなる手段でも実施され得る。例えば、上記で示した合成核酸配列の類似導入方法は、上記周期中細胞へ補助核酸配列を送達するのに使用され得る。
【０１０３】
ウイルス粒子の集合を通常ではさせない細胞におけるウイルス粒子の集合
さらに別の態様において、本発明は、周期中真核生物細胞におけるウイルス粒子の産生方法に関する。ウイルス粒子は、ウイルス集合に必要な少なくとも１個のタンパク質を含み、その場合、少なくとも１個のタンパク質は、そこでウイルス集合させ得るのに充分なレベルで親核酸配列から細胞において発現されることはない。この方法は、親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと置換することにより、少なくとも１個のタンパク質がそこでウイルス集合させ得るのに充分なレベルで細胞において合成核酸配列から発現され得るように、親核酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列を製造することを特徴としている。その方法で製造された合成核酸配列は、１以上の調節ヌクレオチド配列に機能し得るように結合され、次いで細胞またはその前駆細胞へ導入される。それに続いて少なくとも１個のタンパク質が、ウイルス粒子の集合に要求される他のウイルスタンパク質の存在下で細胞において発現されることにより、ウイルス粒子が産生する。
【０１０４】
有利には、類義コドンは、存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡの場合と比べ細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する。
【０１０５】
周期中細胞は、ウイルスが複製し得るものであればいかなる細胞でもよい。好適には、周期中細胞は真核生物細胞である。好ましくは、ウイルス粒子製造のための周期中細胞は、インビトロで培養され得る真核生物セルライン、例えばＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはスポドプテラ（spodoptera）細胞である。
【０１０６】
好適には、ウイルス粒子の少なくとも１タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質である。好ましくは、ウイルスカプシドタンパク質は、パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質を含む。
【０１０７】
細胞におけるウイルス粒子の集合に要求される他のウイルスタンパク質は、好適にはウイルスゲノムの残りを含む別の核酸配列（複数も可）から発現され得る。パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２を含む少なくとも１タンパク質の場合、他の上記核酸配列（複数も可）は、好ましくはＬ１および／またはＬ２をコードするヌクレオチド配列を伴わないパピローマウイルスゲノムを含む。
【０１０８】
本発明のさらに別の態様では、周期中細胞におけるウイルス粒子の製造方法が提供され、該ウイルス粒子はウイルス粒子の集合に必要な少なくとも１タンパク質を含むものであり、少なくとも１タンパク質はウイルス集合をさせるのに充分なレベルでは親核酸配列から上記細胞で発現されず、上記親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンは上記レベルに達するまで上記の少なくとも１タンパク質の製造に関して律速的である。該方法は、上記の少なくとも１コドンに特異的なイソ受容ｔＲＮＡを発現させ得る核酸配列を上記細胞に導入する段階を含む。
【０１０９】
さらに別の態様において、本発明は、上記方法から得られるウイルス粒子に関するものである。
【０１１０】
さらに本発明は、本発明の合成核酸配列を含む細胞または組織、または別法として本発明方法から製造される細胞または組織を包含する。
【０１１１】
非限定的な下記実施例を通して本発明についてさらに記載する。
実施例１
未分化細胞中における合成Ｌ１およびＬ２タンパク質の発現
材料および方法
ウシＰＶ(ＢＰＶ)Ｌ１およびＬ２遺伝子のコドン置換
【０１１２】
野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１１３】
野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子の稀なコドンの存在が翻訳を阻害するかを調べるために、記載したとおりの類義置換を行ない、Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)遺伝子を合成した。合成配列を構成するために、Ｌ１用に１１対のオリゴヌクレオチドおよびＬ２用に１０対のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの各対は、後のクローニングを促進するために組み込まれた制限部位を有する(図１Ａおよび１Ｂ)。この変性オリゴヌクレオチドを用いて、Ｌ１およびＬ２配列をＰＣＲ(鋳型としてＢＰＶ１ゲノムを有するプラスミドを使用)で増幅した。増幅したフラグメントを適切な酵素で切断し、ｐＵＣ１８ベクターと経時的に結合し、ｐＵＣＨＢＬ１およびｐＵＣＨＢＬ２を調製した。合成Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)の配列を決定し、間違いないことを確認し、次いで、ＳＶ４０oriを含む哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３(Invitrogen)中でサブクローン化し、発現プラスミドｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２を得た。Ｌ１およびＬ２の発現物と元の配列の発現物とを比較するために、野生型Ｌ１(配列番号：１)およびＬ２(配列番号：５)遺伝子をｐＣＤＮＡ３ベクター中でクローン化し、ｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔを得た。
【０１１４】
免疫蛍光検査およびウエスタンブロット染色
免疫ブロットアッセイ用として、６穴プレート中のＣｏｓ-１細胞に、Ｌ１およびＬ２発現プラスミド ２μgを、リポフェクトアミン(Gibco)を使用して形質移入した。形質移入から３６時間後、細胞を０.１５Ｍ リン酸緩衝液の０.９％ 食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、ＳＤＳ添加液に溶かした。細胞タンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。Ｌ１およびＬ２タンパク質を、ＢＰＶ１ Ｌ１(ＤＡＫＯ)またはＬ２特異的(１７)抗血清を使用する電子化学発光(Amersham, UK)で確認した。免疫蛍光染色用として、Ｃｏｓ-１細胞を８チャンバースライドで増殖し、プラスミドを形質移入し、固定し、形質移入から３６時間後に８５％エタノールで透過した。スライドを５％ミルク-ＰＢＳでブロックし、Ｌ１およびＬ２特異的抗血清でプローブし、ＦＩＴＣが結合した抗ウサギ免疫グロブリンＧ(Sigma)を添加した。ＧＦＰまたはＰＧＦＰプラスミド形質移入細胞用として、細胞を４％緩衝ホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１５】
ノーザンブロット法,
様々なプラスミドを形質移入したＣｏｓ細胞を、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し供給者の手引きに従い、細胞質または全ＲＮＡを抽出するのに使用した。簡単に言うと、細胞質ＲＮＡ精製用として、緩衝液ＲＬＮ(５０mＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１４０mＭ ＮａＣｌ、１.５mＭ ＭｇＣｌ2および０.５％ＮＰ４０)を、単層細胞に直接加え、細胞を４℃で５分間溶かした。核を遠心分離で取り除いた後、細胞質ＲＮＡをカラムで精製した。ＲＮＡ抽出物全量用として、単層細胞を、キットから補充した緩衝液ＲＬＴを使用して溶かし、ＲＮＡをスピンカラムで精製した。精製したＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１.５％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡをナイロン膜上にブロットし、(ａ)５'末端を標識化したＬ１の重量とＨＢＬ１フラグメントの重量が１：１の混合物、(ｂ)５'末端を標識化したＬ２の重量とＨＢＬ２フラグメントの重量が１：１の混合物、(ｃ)５'末端を標識化したＧＦＰとＰＧＦＰフラグメントの１：１混合物、または(ｄ)ランダムに標識化したＰＡＧＤＨフラグメント、でプローブした。このブロットを６５℃で丁寧に洗浄し、３日間Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１１６】
結果
パピローマウイルス(ＰＶ)のＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質をコードする遺伝子のコドン構成が分化上皮細胞におけるその優先発現に寄与するという仮設を検証するために、合成ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)遺伝子を調製し、哺乳類遺伝子において優先的に使用されるコドンで、野生型ＢＰＶ１ Ｌ１およびＬ２配列(真核生物遺伝子としては稀)中に常に存在するコドンを置換した(図１Ａ、１Ｂ)。
【０１１７】
Ｌ１遺伝子について、全２０２塩基の置換は１９６コドンで行なわれるが、コードされたアミノ酸配列に変化はない(図１Ａ)。この合成"ヒト化"ＢＰＶ Ｌ１ 遺伝子(配列番号：３)をＨＢＬ１と表わした。同様に修飾したＢＰＶ Ｌ２ 遺伝子(配列番号：７)をＨＢＬ２と表わし、３０３塩基を変え、あまり頻繁には使われない２９０コドンを、対応する優先的に使われるコドンで置換した。合成ＨＢＬ１(配列番号：３)およびＨＢＬ２(配列番号：７)遺伝子を使用し、ｐＣＤＮＡ３に基づく２つの真核生物発現プラスミドを作成し、ｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２と表わした。野生型ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：１)およびＢＰＶ１ Ｌ２(配列番号：５)遺伝子で構築された同類の発現プラスミドを、ｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔと表わした。これらの各プラスミドにおいて、ＳＶ４０oriがＣｏｓ-１細胞中の複製を可能にし、Ｌ１またはＬ２遺伝子を強力構成ＣＭＶプロモーターで発現させた。
【０１１８】
合成ヒト化および野生型のＢＰＶ１ Ｌ１およびＢＰＶ１ Ｌ２遺伝子の発現を比較するために、それぞれ上述のＬ１およびＬ２プラスミドを形質移入したＣｏｓ-１細胞を分離した。形質移入した細胞を、形質移入から３６時間後の免疫蛍光検査で、Ｌ１(配列番号：２、４)またはＬ２(配列番号：６、８)タンパク質の発現を分析した(図２Ａおよび３Ａ)。合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)またはＬ２遺伝子を含むｐＣＤＮＡ３発現プラスミドを形質移入した細胞では、たくさんの該当するタンパク質の産出を観察できた。しかし野生型プラスミドＬ１(配列番号：１)またはＬ２(配列番号：５)配列の発現プラスミドを形質移入した細胞では、Ｌ１またはＬ２タンパク質の産出を検出できなかった(図２Ａおよび３Ａ、Ｌ１およびＬ２タンパク質の核染色を参照)。異なるＬ１およびＬ２構成の発現を厳密に比較するために、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現を野生型または合成ヒト化ＢＰＶ１Ｌ１またはＬ２ ｐＣＤＮＡ３発現構造を形質移入したＣｏｓ-１細胞中、免疫ブロットで評価した。たくさんの免疫反応性Ｌ１およびＬ２タンパク質が、合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)配列から発現したが、野生型Ｌ１およびＬ２配列(配列番号：１、５)からは、Ｌ１またはＬ２タンパク質は発現しなかった。
【０１１９】
コドン変化により生じたＬ１およびＬ２ ｍＲＮＡの一次配列変化が対応メッセージの定常状態の発現にも影響を及ぼすかどうかを確認するために、ｍＲＮＡを様々なキャプシドタンパク質遺伝子構築物を形質移入したＣｏｓ-１細胞で調製した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用して、野生型Ｌ１ ｍＲＮＡより修飾したものの方が２〜３倍高いことを、ノーザンブロットで確認した。野生型および修飾型Ｌ２ ｍＲＮＡの同様の段階が、形質移入細胞の細胞質で見られた(図２Ｃおよび３Ｃ)。Ｌ１またはＬ２ ｍＲＮＡの任意のユニット毎で発現したＬ１またはＬ２タンパク質は、ヒト化遺伝子構築物によるもののほうが天然遺伝子構築物のものより少なくとも１００倍高い。
【０１２０】
実施例２
インビトロでのパピローマウイルス後期タンパク質翻訳
材料および方法
インビトロ翻訳アッセイ
【０１２１】
各プラスミド１mgを、35Ｓ-メチオニン(Amersham) ２０μＣｉおよびＴ７結合ウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽溶解物(Promega) ４０μLとともにインキュベートした。３０℃で翻訳を行ない、ＳＤＳ添加液を加えて停止させた。このＬ１タンパク質を１０％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで確認した。
【０１２２】
アミノアシル-ｔＲＮＡの調製
２.５×１０-4 Ｍ ｔＲＮＡ(Boehringer)を、１０mＭ トリス-アセテート(ｐＨ.７.８)、４４mＭ ＫＣｌ、１２mＭ ＭｇＣｌ2、９mＭ メルカプトエタノール、３８mＭ ＡＴＰ、０.２５mＭ ＧＴＰ、および７μLウサギ網状赤血球抽出物を含む反応液 ２０μlに加えた。この反応を２５℃で２０分間行ない、次いで反応物にＨ2Ｏ ３０μLを加えて、ｔＲＮＡを１×１０-4に希釈した。このアミノアシル-ｔＲＮＡを一定量に分け、−７０℃で貯蔵した。
【０１２３】
結果
野生型ＢＰＶ Ｌ１およびＬ２遺伝子の主要な制限がシステム中で翻訳されると思われたので、この制限が遺伝子翻訳について適当なｔＲＮＡ種の利用性の制限を示すかどうかを調べた。無処置細胞内での合成遺伝子の一過性発現を多くのファクターで調節し得るので、ウサギ網状赤血球可溶化液(ＲＲＬ)またはコムギ胚芽可溶化液を使用する細胞が存在しないシステムで、我々の仮説を試験した。野生型または合成ヒト化ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子を発現する同量のプラスミドを35Ｓ-メチオニンの存在下で、ＲＲＬ転写/翻訳システムと結合したＴ７-ＤＮＡポリメラーゼに加えた。２０分後、翻訳されたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。修飾Ｌ１遺伝子の効率よい翻訳を観察できたが(図４、一番上の区画、２レーン)、野生型ＢＰＶ１ Ｌ１配列の翻訳は、弱い５５kＤａ Ｌ１帯域をもたらしたにすぎなかった(図４、上方区画、２レーン)。野生型配列をＲＲＬ中の翻訳で最大限に活用できないが、野生型Ｌ１配列に存在する"稀な"コドンと競合する細胞質のｍＲＮＡ種がないので、いくらかの翻訳は起こる、と判断した。上述のデータは、野生型および合成ヒト化Ｌ１遺伝子の翻訳効率の違いは、野生型遺伝子に存在する稀なコドンの翻訳を必要とするｔＲＮＡの制限された有効性と、因果関係があることを示唆する。それゆえに、インビトロ翻訳システムに過剰量のｔＲＮＡを加えると、野生型Ｌ１遺伝子の翻訳の阻害を克服できると考えた。この問題に取り組むために、酵母の１０-5Ｍ アミノアシル-ｔＲＮＡをＲＲＬ翻訳システム中に加え、Ｌ１タンパク質合成を評価した。外因性ｔＲＮＡの導入は野生型Ｌ１配列の翻訳で劇的な改良をもたらし、合成ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３)でみられるものに匹敵するＬ１タンパク質の収量が得られた(図４、一番上の区画)。野生型Ｌ１遺伝子(配列番号：１)のアミノアシル−ｔＲＮＡによる翻訳の増強は量依存的であり、１０-5Ｍ ｔＲＮＡで最適効率が得られた。外因性ｔＲＮＡの添加は野生型Ｌ１遺伝子配列(配列番号：１)から翻訳されるＬ１タンパク質の収量を向上させるので、野生型およびヒト化Ｌ１ ｍＲＮＡの翻訳の速さを評価した。２分毎に、翻訳混合物からサンプルを収集し、８分から始めた。野生型配列(配列番号：１)からのＬ１の翻訳(配列番号：２、４)は、ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３)のものよりかなり遅く(図４、下方パネル)、この翻訳遅延は市販の酵母ｔＲＮＡによる外因性ｔＲＮＡの添加によって完全に打ち消し得る。酵母ｔＲＮＡを上述の分析で選択したのは、酵母でのコドン使用がパピローマウイルスと似ているからである(表１)。外因性ｔＲＮＡの添加は、ヒト化Ｌ１遺伝子(配列番号：３)の翻訳を有意に向上させることはなかったが、この配列のウサギ網状赤血球翻訳機構用のコドン使用に関して最適化することを示す(図４、下方パネル)。分離実験で、ｗｔ Ｌ１翻訳もまた肝臓ｔＲＮＡ(図４)によって高められ、ウシ皮膚表皮から抽出されたｔＲＮＡによっても高められることを確立した(データ表示せず)（おそらく分化および未分化の細胞由来のｔＲＮＡ混合物を構成する）
【０１２４】
実施例３
野生型Ｌ１の翻訳は、小麦胚芽抽出物において効率的である。
tＲＮＡの利用性は野生型ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子（配列番号１）の発現の決定要素であるという我々の仮説をさらに試験するために、全く異なった組のtＲＮＡが利用できるであろう細胞種においてＬ１の翻訳を試験した。小麦胚芽の翻訳系では、野生型Ｌ１のmＲＮＡがヒト化Ｌ１のmＲＮＡと同じぐらい効率的に翻訳され、外因性アミノアシル−tＲＮＡの添加は、野生型配列またはヒト化配列のいずれの翻訳効率も改善しなかった（図４の下のパネル）。このことは、小麦胚芽には、ＲＲＬにおける野生型Ｌ１配列の翻訳を制限して、効率的なＬ１の翻訳を可能とするtＲＮＡが十分あることを示した。
【０１２５】
実施例４
パピローマウイルスのプロモーター由来の未分化細胞において、修飾された後期遺伝子を発現させることができる。
【０１２６】
上に提示したデータは、試験系において、翻訳がＢＰＶ１キャプシドタンパク質の製造を制限していることを示すが、これらの実験は、遺伝子を強力なＣＭＶプロモーターにより幾らか操作したので、ＢＰＶゲノムからのウイルス後期遺伝子の転写に関して実際には代表的ではない系で行った。確かめようとしたのは、天然のＢＰＶ１プロモーターから転写されるとすれば、合成のヒト化ＢＰＶキャプシドタンパク質のmＲＮＡが野生型のmＲＮＡより効率的に翻訳されるかどうかであった。このことは、翻訳が実際に未分化細胞において天然の潜在性後期遺伝子プロモーターから操作されるＢＰＶ１後期遺伝子の発現に関する制限因子の１つであるかどうかを確かめたことになる。ＢＰＶゲノムをＢamＨＩ／ＨindIIIでnt ４４５０および６９５８にて切断して、元のＬ１(nt ４１８６−５５９５)およびＬ２(５０６８−７０９５)のＯＲＦを除去した。真核細胞におけるプラスミド複製を可能とするＳＶ４０ ori配列を含む合成のヒト化Ｌ２遺伝子（配列番号７）を、Ｌ１／Ｌ２ ＯＲＦ配列を欠くＢＰＶゲノムに挿入した。このプラスミド（図５Ａ）をpＣＩＣＲ１と名付けた。同様のプラスミドを合成のヒト化Ｌ２よりむしろ野生型（配列番号５）で構築して、pＣＩＣＲ２と名付けた。これらのプラスミドでＣos−１細胞をトランスフェクトして、Ｌ２タンパク質の発現をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光により試験した。天然のＢＰＶ１プロモーターで操作した合成のヒト化Ｌ２（配列番号７）は効率的に発現されたが、同様の構築物から操作された野生型Ｌ２配列（配列番号５）は免疫反応性Ｌ２タンパク質（配列番号６、８）を全く製造しなかった（図５Ｂ）。未分化細胞は、ヒト化Ｌ２遺伝子（配列番号７）の発現を裏付けたが、潜在性後期ＢＰＶプロモーターから発現される野生型Ｌ２（配列番号５）の発現は裏付けなかったので、その結果は、ＣＭＶプロモーターを使用しての実験から、我々の早期の観察結果を確認した。しかしながら、ここで試験したプラスミドは、ＳＶ４０ oriを含み、Ｃos細胞においてＤＮＡを複製するよう設計された。ＢＰＶ１ Ｌ２プラスミドの複製数の増大またはＳＶ４０ oriの転写促進活性は、感染した皮膚と比較した場合、この実験系におけるＬ２の発現効率の増大を幾らか説明することができるかもしれない。しかしながら、ＣＭＶプロモーターの構築物で見られる天然の遺伝子とヒト化遺伝子との間の発現における著しい相違は、天然のプロモーターでも観察される。
【０１２７】
実施例５
パピローマウイルスの好ましいコドンの置換は、未分化細胞においてパピローマウイルス以外の遺伝子の翻訳を妨げるが、転写は妨げない。
【０１２８】
材料および方法
gfp遺伝子におけるコドン置換
パピローマウイルスの好ましいコドン(ＰＧＦＰ)を使用して、修飾されたgfp遺伝子（配列番号１１）を構築するために、６対のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの対は各々、組込まれた制限部位を有しており、ヒト化gfp遺伝子（配列番号９）(ＧＩＢＣＯ)を鋳型として使用して、gfpを増幅するために使用した。ＰＣＲフラグメントをpＵＣ１８ベクターに連結させて、pＵＣＰＧＦＰを製造した。ＰＧＦＰ遺伝子を配列決定して、ＣＭＶプロモーターの下に、同じ哺乳動物の発現ベクターであるpＣＤＮＡ３のＢamＨＩ部位へとクローン化した。ヒト化ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図１Ｃに示す。Ｐgfp遺伝子（配列番号１１）を製造するために、野生型gfp遺伝子（配列番号９）へと導入する変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの上部に示す。
【０１２９】
結果
コドン使用が哺乳動物の細胞における遺伝子発現を変えることができることをさらに確認するために、真核細胞における最適な発現のために修飾した合成のgfp遺伝子でのさらなる変異体をつくった(Ｚolotukhinら，１９９６，Ｊ. Ｖirol. ７０：４６４６−４６５４)。この変異体では、真核細胞での発現に最適化したコドンを、パピローマウイルスの後期遺伝子において優先的に使用されるコドンで代替した。培養細胞において高レベルの蛍光タンパク質を発現するヒト化gfp遺伝子（配列番号９）における２４０のコドンのうち、１５６を、対応するパピローマウイルスの後期遺伝子の好ましいコドンに変えて、Ｐgfpと名付ける新たなgfp遺伝子（配列番号１１）を製造した。未分化細胞におけるＰgfp（配列番号１１）の発現をヒト化gfp（配列番号９）の発現と比較した。ヒト化gfp（配列番号９）でトランスフェクトしたＣos−１細胞は、２４時間後に鮮やかな蛍光シグナルを発したが、Ｐgfp（配列番号１１）でトランスフェクトした細胞は、微かな蛍光シグナルしか発しなかった（図６Ａ）。この相違は異なった翻訳効率を反映したものであることを確認するために、gfpに特異的なmＲＮＡを両方のトランスフェクションで試験して、顕著に異なってはいないことを見出した（図６Ｂ）。従って、コドン使用および対応するtＲＮＡの利用性は、ＰＶ後期遺伝子の発現に関して観察される制限を明らかに決定し、他の遺伝子におけるコドン使用の変更は、未分化細胞におけるそれらの発現を同様に妨げる。
【０１３０】
実施例６
パピローマウイルスの好ましいコドンを含むＰＧＦＰは、分化したマウス表皮ケラチン細胞においてインビボで効率的に発現される。
【０１３１】
材料および方法
遺伝子銃によるマウス皮膚へのプラスミドＤＮＡの送達
製造業者の指示(Ｂio−Ｒad)に従って、ＤＮＡ５０μgをカルシウム沈降により金のマイクロ−キャリア２５μgに被覆した。Ｃ５７／blマウス皮膚に、６００psiの圧力にてＤＮＡプラスミドで被覆した金粒子で衝撃を与えた。その皮膚から連続した切片を取って、粒子分布を調べ、６００psiの圧力により粒子を表皮中に送達することができることを確認した。
【０１３２】
結果
マウスをＰＧＦＰ ＤＮＡプラスミドが付着した金ビースで撃ち、２４時間後、皮膚試料をＤＮＡの送達部位から切り取って、ＧＦＰタンパク質（配列番号１０、１２）の発現に関して試験した。蛍光の大部分が上部表皮ケラチン細胞層において検出され、これは分化した上皮を表し、未分化の基底細胞では見られなかった。これとは対照的に、ヒト化ＧＦＰプラスミドで撃った皮膚切片は、表皮全体にランダムに分布した細胞において蛍光を示した（図７）。ＧＦＰ陽性細胞がＰＧＦＰ（配列番号１１）接種マウス皮膚およびＧＦＰ（配列番号９）接種マウス皮膚の両方において稀であったが、ＰＧＦＰ試料（配列番号１１）中では分化した層でのみ蛍光が観察され、一方、ＧＦＰ（配列番号９）接種マウス皮膚では表皮の至る所で蛍光が観察された。この結果は、パピローマウイルスの好ましいコドンの使用が、上皮分化に依存する方法で発現されるタンパク質をもたらすことを確認した。
【０１３３】
実施例７
培養細胞への酵母tＲＮＡおよび野生型Ｌ１遺伝子のマイクロインジェクション
(酵母がそれ自身の遺伝子に関してパピローマウイルスで観察されるコドンと同様の組のコドンを使用する場合に)酵母tＲＮＡが野生型ＢＰＶ１ Ｌ１（配列番号１）の発現を促進することができるかどうかを試験するために、tＲＮＡ(２mg／ml)(精製した酵母tＲＮＡ(Ｂoehringer Ｍannheim)またはウシ肝臓tＲＮＡ−対照)およびＢＰＶ Ｌ１ ＤＮＡ(２μg／ml)を含む混合物２plをＣＶ−１細胞に注入することができる(ＬuおよびＣampisi，１９９２，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. ８９ ３８８９−３８９３)。次いで、注入した細胞を３７℃で４８時間培養し、ＢＰＶ Ｌ１に特異的な抗体を使用する標準的な免疫蛍光法により、Ｌ１遺伝子の発現に関して試験して、ＦＡＣＳ分析により定量することができる(Ｑiら １９９６，Ｖirology ２１６ ３５−４５)。
【０１３４】
実施例８
ＨＰＶウイルス粒子を連続的に製造することができるセルラインの確証
感染性ＰＶを製造するために、上皮ラフト培養系(Ｄollardら １９９２，Ｇenes Ｄev ６ １１３１−１１４２)、およびＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含むセルラインが含まれる様々な方法を試みて、ＢＰＶ−１ Ｌ１／Ｌ２の組換えワクシニアで感染させる(Ｚhouら １９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６８)か、またはＳＦＶ ＲＮＡでトランスフェクトした(Ｒodenら １９９６，Ｊ. Ｖirol. ７０ ５８７５−５８８３)。粒子の収率は、各々の場合において低い。我々の発見を実施に移す場合、合成のＢＰＶ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺伝子（配列番号７）(実施例１に記載した)を使用して、ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含むセルラインにおいて感染性ＢＰＶを製造することができる。ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含む線維芽細胞セルライン(ＣＯＮ／ＢＰＶ)(Ｚhouら １９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６８)を、ＣＭＶプロモーターの制御下での合成のＢＰＶ−１ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺伝子（配列番号７）のトランスフェクションに使用することができる。次いで、ＢＰＶ粒子を細胞ライゼートから精製して、精製した粒子をＢＰＶ−１ゲノムの存在に関して試験することができる。リポフェクトアミン(ＢＲＬ)でのトランスフェクション、およびトランスフェクトした細胞のＧ４１８選択といったような標準的な方法を利用して、ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡのバックグラウンドでヒト化Ｌ１（配列番号３）およびＬ２（配列番号７）を発現する適当なトランスフェクタントを生成することができる。ウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ１またはウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ２ポリクローナル抗体を使用して、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現の試験を行うことができる。次いで、我々の公表した方法(Ｚhouら １９９５，Ｖirology ２１４ １６７−１７６)を使用して、ＢＰＶ粒子を精製することができ、電子顕微鏡法およびＤＮＡブロッティング法により特性決定することができる。培養細胞から単離したＢＰＶ粒子の感染性は、Ｃ１２７線維芽細胞を使用するフォーカス形成アッセイで試験することができる。
【０１３５】
実施例９
組織からtＲＮＡを抽出して測定する方法
組織(１００ｇ)を、水で飽和したフェノール(Ｍallinckrodt，分析用試薬，８８％)(１５：３)１５０ml、および１.０Ｍ ＮaＣl １５０ml、０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)中の０.００５Ｍ ＥＤＴＡと共に、ワーリングブレンダーでホモジナイズする。ホモジネートを国際臨床遠心機での最高速度で１０分間遠心して、上層を慎重にデカントして分離した。この水層に、９５％ エタノール３体積を加えた。その結果得られた沈殿を国際臨床遠心機での最高速度で遠心沈降させて、０.１Ｍ トリス／クロリド緩衝液(pＨ ７.５)２５０mlに再び縣濁させた。この溶液を、冷たい０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース２ｇのカラム(２×１０cm)に加えた(１５−２０滴／分の流速)。次いで、カラムをトリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)１Ｌで洗浄して、ＲＮＡを０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)中の１.０Ｍ ＮaＣlで溶出した。ＮaＣl溶液の最初の１０mlを「ホールド−アップ」として捨てた。次いで、溶出物の光学濃度が２６０nmで３未満となるまで、十分な塩溶液(６０−８０ml)を集めた。溶液を、水で飽和した等体積のフェノールで２回抽出して、エーテルで２回抽出した。ＲＮＡを含む水溶液に、９５％ エタノール３体積を加えて、その溶液ワグ(wag)を冷たい状態で一晩放置した。沈殿を遠心沈降させ、まず最初に８０％ エタノールで洗浄した後、９５％ エタノールで２回洗浄して、減圧下に乾燥させた。可溶性ＲＮＡ約６０mgをラット肝臓１００ｇロットから得た。
【０１３６】
tＲＮＡの定量
次のナイロン膜を使用する：Ｂiodine ＡおよびＢ(ＰＡＬＬ)。ドットブロットの調製のために、１５％ ホルムアルデヒド１−５μl中、tＲＮＡ試料(１pg〜５ng)を６０℃で１５分間変性させる。１０ｘＳＳＣ(ＳＳＣは、ＮaＣl ０.３Ｍ、クエン酸三ナトリウム ０.０３Ｍである)。試料を適用する前に、脱イオン水に１５分間浸漬して、２枚の３ＭＭ Ｗhatman紙の間で少し乾燥させておいた膜上に、試料を１μlのアリコートでスポットする。tＲＮＡを(紫外線照射(紫外線ランプを２０cmの距離にて２５４nmおよび１００Ｗの強度で使用して１０mm)により膜に)共有結合で固定して、その膜を８０℃で２−３時間焼き付ける。
【０１３７】
tＲＮＡのＡ５４−Ａ７３配列に相補的な、５'末端を標識した合成のデオキシリボオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション実験のプローブとして使用する。５' ＯＨ'を末端とするプローブの直接リン酸化により、オリゴヌクレオチドの標識化を行う。
【０１３８】
ハイブリダイゼーション実験のために、５０％ 脱イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、０.０４％ フィコール、０.０４％ ポリビニルピロリドン、および２５０μl／mlの音波処理したサケ精子ＤＮＡ中、膜１００cm2あたり緩衝液５mlを使用して、ＵＶ照射した膜をまず最初に５０℃で５時間予めインキュベートしておく。最後に、標識化プローブを加えた上の溶液(２.５ml／１００cm2)中、ハイブリダイゼーションを５０℃で一晩行う。ハイブリダイゼーション後、その膜を、２ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中、室温で５分間２回洗浄し、２ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中、６０℃で３０分間２回洗浄し、最後に０.１ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中、室温で３０分間洗浄する。ハイブリダイズしたプローブを検出するために、膜を増感紙と共にＦuji ＸＲフィルムに７０℃で１６時間暴露する。
【０１３９】
tＲＮＡプローブの配列
tＲＮＡプローブの配列は、次の通りである：
ＡlaGCA：５'−ＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＴ（配列番号１３）
ＡrgCGA：５'−ＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１４）
ＡsnAAC：５'−ＣＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１５）
ＡspGAC：５'−ＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴ（配列番号１６）
ＣsyTGC：５'−ＡＡＧＴＣＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＴ（配列番号１７）
ＧluGAA：５'−ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号１８）
ＧlnCAA：５'−ＣＴＡＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１９）
ＧlyGGA：５'−ＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴ（配列番号２０）
ＨisCAC：５'−ＴＧＣＣＧＴＧＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１）
ＩleATC：５'−ＴＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＣＴＴ（配列番号２２）
ＬeuCTA：５'−ＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴ（配列番号２３）
ＬeuCTT：５'−ＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２４）
ＬysAAA：５'−ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡ（配列番号２５）
ＬysAAG：５'−ＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号２６）
Ｍetelong ５'−ＴＡＧＴＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２７）
ＰheTTC：５'−ＴＧＴＴＴＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＡＴ（配列番号２８）
ＰroCCA：５'−ＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡ（配列番号２９）
ＰroCCI：５'−ＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＧＧＧＡＴＴＴ（配列番号３０）
ＳerAGC：５'−ＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＧ（配列番号３１）
ＴhrACA：５'−ＴＧＴＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧ（配列番号３２）
ＴyrTAC：５'−ＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号３３）
ＶalGTA：５'−ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号３４）
【０１４０】
実施例１０
未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ種の相対存在量の比較
【０１４１】
材料および方法
表皮細胞の単離
２日齢のマウスを屠殺して、皮膚を剥いだ。皮膚を０.２５％ トリプシン ＰＢＳで４℃にて一晩消化した。鉗子を使用して、表皮を真皮から分離して、１０％ ＦＣＳ ＤＭＥＭ媒体中、鋏で切り刻んだ。まず最初に、細胞縣濁液を１mmのナイロンネットに通して濾過した後、０.２mmのナイロンネットに通して濾過した。次いで、細胞縣濁液をペレット化して、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４２】
密度勾配遠心分離法
表皮ケラチン細胞を３０％ パーコールに再び縣濁させて、不連続のパーコールグラジエント(１.０８５、１.０７５および１.０５０ｇ／ml)中、１２００×ｇで室温にて２５分間遠心分離することにより分離した。次いで、その細胞をＰＢＳで洗浄して、tＲＮＡを抽出するために使用した。
【０１４３】
tＲＮＡの精製
細胞を溶解緩衝液(０.２Ｍ ＮaＯＨ、１％ ＳＤＳ)５mlに室温で１０分間溶解した。そのライゼートを３.０Ｍ 酢酸カリウム(pＨ ５.５)５mlで中和した。遠心分離後、上清を１００mＭ トリス(pＨ ７.５)３体積で希釈して、１００mＭ トリス(pＨ ７.５)で平衡化したＤＥＡＥカラムに加えた。tＲＮＡを含む水溶液にイソプロパノールを等量加えて、その溶液を４℃で一晩放置した。tＲＮＡを遠心沈降させて、７５％ エタノールで洗浄した後、ＲＮアーゼを含まない水に溶解した。
【０１４４】
tＲＮＡのブロッティング
ホルムアルデヒド４μlおよび２０ｘＳＳＣ ５μl中、１μl中の各々のtＲＮＡ試料１０ngを６０℃で１５分間変性させた。帯電したナイロン膜(Ａmersham)上に、試料を１μlのアリコートでスポットし、tＲＮＡをＵＶで固定して、32Ｐ−オリゴヌクレオチドで探査した。
【０１４５】
結果
未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ種の存在量の比較は、幾つかのtＲＮＡ集団のレベルが劇的に変化することを示した。例えば、ＡlaGCA、ＬeuCTT、ＬeuCTAに特異的なtＲＮＡのレベルは、分化した細胞において増大したが、ＡrgCGA、ＰroCCI、ＡsnAAGに特異的なtＲＮＡは、未分化の表皮ケラチン細胞においてより豊富であった(表２を参照)。
【０１４６】
一般的考察
本明細書において、本発明者は、哺乳動物細胞中の遺伝子翻訳の効率についての決定要素がそのコドン組成であることを確証している。このことは、原核生物の遺伝子を真核細胞中で発現したときに普通一般に観察される（Smith, S. W., 1996, biotechnol., Prog. 12:417-422）。本発明者はまた、パピローマウイルスのカプシド遺伝子をコードするｍＲＮＡが培養の真核細胞中で効果的に翻訳されないこと、その理由は明らかにｔＲＮＡの利用性が翻訳にとって速度制限的であること、また培養中の真核細胞中のＰＶ後期遺伝子翻訳に対する遮断を、後期遺伝子のコドン使用を哺乳動物遺伝子の共通配列に適合させるように変換するか、または外因性のｔＲＮＡを供給して、克服できることを明確にした。ｍＲＮＡ二次構造あるいはタンパク質結合への変異（Sokolowaki, et al., 1998, J. Virol. 72:1504-1515)が、ＰＶカプシド遺伝子の一次配列への変化の結果として、培養細胞中の天然および修飾ＰＶカプシド遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の効率に観察された差異をもたらしたのであろう。しかしながら、天然の未修飾ｍＲＮA（ｔＲＮＡを哺乳動物インビトロ翻訳系に加えた後に観察され、植物翻訳系では観察されない）の翻訳が増強されたことは、ｔＲＮＡ利用性が哺乳動物の細胞中の天然遺伝子の翻訳について速度制限的であるという論拠を強化する。重要なｔＲＮＡの不足は、翻訳の未完成ペプチドまたは未成熟ペプチドの末端の伸張の遅れをもたらす（Oba, et. al., 1991, Biochimie 73:1109-1112）。伸張の遅れはＰＶ後期遺伝子にとって重大な問題のようである。ＰＶゲノムにおけるコドン使用の分析結果からすると、ＰＶ後期遺伝子は、哺乳動物の細胞ではまれにしか使用されないようなコドンを多く使用する。例えば、ＰＶは、ＵＵＡをロイシンに、ＣＧＵをアルギニンに、ＡＣＡをトレオニンに、ＡＵＡをイソロイシンにしばしば使用するのに対して、これらのコドンが哺乳動物遺伝子に使用されるのはごくまれである。これとは対照的に、パピローマウイルス後期遺伝子を酵母中で効果的に発現させることができる（Jansen, et al., 1995, Vaccine 13:1509-1514）(Sasagawa, et al., 1995, Virology 206:126-135)。そして、酵母およびパピローマウイルス遺伝子のコドン組成は類似している（表１）。明らかな例外は、PV Ｌ１遺伝子が組換型バキュロウイルスを用いて昆虫の細胞中で（Kirubauer, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12180-12184）、また組換型ワクシニアを用いて種々の哺乳動物の未分化細胞中で（Zhon, et al., 1991, Virology 185:251-257）効果的に発現されることである。ワクシニアまたはバキュロウイルスによる感染が、細胞タンパク質合成を低く調節するように、これらの状況においてＬ１カプシドタンパク質の効果的な発現が起こるのは、ウイルス感染細胞中において細胞性mRNAが少ししか利用されず、稀なtRNAについてＬ1 ｍＲＮＡと競合するためである。
【０１４７】
コドン組成は、同一組織の分化のそれぞれ違った段階における遺伝子発現の一般的な決定要素となるであろう。遺伝暗号は本質的には普遍的であるが、違った生物が相異した遺伝子のコドン組成を示す。ところが他方で、遺伝子のコドン組成は、それぞれの生物内のすべての遺伝子と比較的類似し、その生物のイソ−ｔRNA集団と適合する傾向にある（Ikemura, T., 1981, J. Mol. Biol. 146:1-21）。しかしながら、分化細胞および新形成細胞中のtRNA集団は相異しており（Kanduc, D., 1997, Arch. Biochem. Biophys. 342:1-6; Yang, and Comb, 1968, J. Mol. Biol. 31:138-142; Yang, and Novelli, 1968, Biochem. Biophys. Res. Commun. 31:534-539）、tRNA集団もまた異なった状況で成長する細胞中で変化している(Doi, et al., 1968, J. Baiol. Chem. 243:945-951)。したがって、本発明者の考えでは、コドン組成およびtRNAの利用性が合わさって遺伝子発現の空間的および／または時間的調節の原始的なメカニズムが提供される。ウイルス遺伝子のコドン組成について粗マーカーである多くのｄｓＤＮＡウイルスのＧ＋Ｃ含有量は、それらウイルスが感染した細胞のＤＮＡにおけるＧ＋Ｃ含有量と著しく相異している（Strauss, et al., 1995,“Virus Evolution” in Virology (eds. Fields, B. N. et al.), Lipipincott-Raven, Philadelphia, pp. 153-171）。したがって、ウイルスは、自らの遺伝子発現プログラムを調節するためにコドン組成を利用しつつ、おそらくウイルスがそのゲノムを複製するために使用する細胞機能を有する未分化細胞中で、ウイルスタンパク質の致死量を発現するのを避けて、進化してきたのであろう。
【０１４８】
本発明者による観察が単一組織中における遺伝子翻訳調節の明かに新しいメカニズムを説明するように、そのメカニズムが以前発表の仮説、すなわち分化上皮に対するＰＶ後期遺伝子発現制限に関する仮説といかに関連付けられるかを考えることは有意義なことである。ＰＶ後期遺伝子の効果的発現が分化上皮においてのみであるとの観察については、多数の解釈が提案されている。後期遺伝子転写の低下は、分化上皮中のみに発現する転写要因における後期プロモーターからの転写に依存することを反映し、あるいはウイルスによる後期プロモーター転写の抑制（Stubenrauch, et al., 1996, J. Virol. 70:119-126）あるいは未分化細胞中で発現した細胞遺伝子産物に起因するのであろう。ＨＰＶ３１ｂおよびＨＰＶ５の「後期」プロモーター（Haller, et al., 1995, Virology 214:245-255; Hummel, et at.,1992, J. Virol. 66:6070-6080)は分化依存的であると説明されているが、しかし、通常のフットプリンティング法およびＤＮＡ結合法による分化ケラチン生成細胞中の転写調節要因に関連する研究から、今までのところまだ満足できる結果が得られていない。本発明のデータによると、カプシドタンパク質はＣＭＶプロモーターを基とする発現ベクター（図２）によってトランスフェクトされた細胞中のＰＶ Ｌ１およびＬ２ ｍＲＮＡから翻訳されることがなく、このことは、存在し得るなんらかの転写コントロール機能に加えて、未分化細胞中のカプシドタンパク質合成に対して転写後遮断の存在を示唆している。５’スプライスドナー部位に類似した配列がＬ１またはＬ２ ｍＲＮＡ内または非翻訳メッセージ内に存在し、この配列は、関連する遺伝子の転写に対して阻害的である（Kennedy, et al., 1991, J. Virol. 65:2093-2097）（Furth, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:5278-5289）。Ｌ１またはＬ2 ｍＲＮＡ中の他のAUの多い配列は、ｍＲＮＡ分解を促進する（Sokolowski, et al., 1997, Oncogene 15:2303-2319）。未分化細胞中でのＬ１およびＬ２発現を阻害するこれらのメカニズムは、分化上皮において不活性であることを示していないし、この組織中における後期遺伝子の翻訳の成功をやはり説明していない。
【０１４９】
Ｌ１コード配列中の阻害ＲＮＡ配列が本明細書中に記述の実験において採用した系統的コドン置換によって機能化され得なかったという理由から、および非翻訳阻害配列が本発明者の実施した検査項目に含まれなかったという理由から、培養の哺乳動物細胞中でのＰＶ後期遺伝子発現の抑制における阻害配列およびコドンの誤対合のそれぞれの役割は確定できなかった。しかしながら、ＲＮＡ分解を促進あるいは翻訳を抑制する調節配列は、核または細胞質のタンパク質との相互作用を通じて働くと推定されており(Sokolowski, et al., 1998, J. Virol. 72:1504-1515)、天然配列Ｌ1 ｍＲＮＡの非効率的な翻訳が、無核細胞由来の細胞なしの翻訳系において観察された。このことは、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成がＰＶ後期遺伝子翻訳の調節になんらかの役割を果たしていることを示す。
【０１５０】
コドン組成がＰＶカプシド遺伝子発現において重要な決定要素であるという仮説を支えるさらなる証拠を、遺伝子銀行から現在入手できる８４種類のＰＶ Ｌ１配列の分析結果から集めた。Ｌ１遺伝子のコドン組成および特に稀なコドン使用頻度は、どの参考資料を調らべても本質的には同じであって（資料未記載）、パピローマウイルス・ゲノムのＧ＋Ｃ含有量の類似から推測される。ＰＶ Ｌ１遺伝子はアミノ酸レベルで比較的よく維持され、カプシド・タンパク質機能に対する抑制から予測されるように、ＰＶ遺伝子型間のアミノ酸相同性は６０〜８０％を示す。しかしながら、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成に対する明白な抑制影響はなく、本発明者の仮説以上のものでない。後期遺伝子領域は、他の読み枠の中で、あるいは相補的ＤＮＡ鎖の上のいずれにおいても、他の遺伝子をコードせず、そして既知のシス作用調節機能を有しないことである。もし、カプシド遺伝子のコドン組成がＰＶ機能にとって重要でないとすれば、ＰＶの進化的多様性を考えにいれると、コドン使用のかなりの異質性が予測できるかもしれない（Chan, et al., 1995, J. Virol, 69:3074-3083）。
【０１５１】
総体的にみれば、本明細書中に概括したデータおよび証明事項から強調される点は、コドン使用が未分化および分化の上皮細胞中におけるＰＶ後期遺伝子発現の重要な決定要素であり、この観察結果が一般化できるということである。分化組織中の発現決定におけるメッセージ不安定性およびコドン誤対合の相対的役割からして、分化および未分化の上皮において強力な構成プロモーターから発動されたＬ１またはＬ２遺伝子の転写能および翻訳について比較を必要とする。そのような研究は、形質転換技術あるいは角化細胞ラフト培養のいずれかを利用すれば現に実行可能であろう。
【０１５２】
分化上皮の表層におけるＰＶ Ｌ１またはＬ２遺伝子発現を転写調節するメカニズムが提供されているが（Zeltner et al., 1994, J. Virol. 68:3620; Brown, et al., 1995, Virology 214:259; Stoler et al., 1992, Hum. Pathol. 23:117; Hummel et al., 1995, J. Virol. 69:3381; Haller et al., 1995, Virology 214:245; Barksdale and Baker, 1993, J. Virol. 67:5605）、測定可能なＰＶ後期遺伝子ｍＲＮＡは常に後期タンパク質の産生と関連しているとは限らない（Zelter, et al., 1994, 後述,; Ozbun and Meyers, 1997, J. Virol. 71:5161）。本明細書中に記載したデータは、翻訳調節がＰＶ後期遺伝子発現のコントロールに重要な役割を演ずることを示唆している。この観察は、本明細書に記載したように、自己再生幹細胞集団における外因性遺伝子の発現の潜在的に有害な結果を回避しながら、すべての分化組織の特化機能に関連した遺伝子の発現を調節すること、およびそれらの組織に対し治療遺伝子発現を標的化することに密接な関係を有する。
【０１５３】
本明細書は、本発明の実施のための好ましい態様を含み、本発明者が見出し、提供する個々の具体例を記述している。当業者は、本明細書の開示にかんがみ、本発明の範囲を逸脱することなく、例示した個々の具体例について多数の修飾と変更をなし得ることを認識するであろう。それらすべての修飾は添付の請求項の範囲に含まれるものである。
【０１５４】
表の説明
表１
ヒト、ウシ、イーストおよびコムギタンパク質のコドン使用データを、刊行結果(１８)より用いた。ＢＰＶ１データはＧｅｎｂａｎｋデータベースの配列によるものである。
【０１５５】
表２
各イソ受容ｔＲＮＡを、上付き表示の対応コドンと共に上列に表示した。"＋"はｔＲＮＡの存在量を示し、各"＋"は約１０倍の増加を示す。
【０１５６】
表
【表１】
表１
個々の生物体のコドン使用回数(1/1000)
【表２】
表１の続き
【表３】
表１の続き
【表４】
表１の続き
【表５】
表１の続き
【表６】
表２
ＫＣが分化し始めると、ｔＲＮＡ集団が変化する
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。
【図２Ａ】 図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現されるＬ１タンパク質の検出を表わす。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。
【図３Ａ】 図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現されたＬ２タンパク質の検出を表わす。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ２およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出されたＬ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた。
【図４】 図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成Ｌ１（ＨＢ）のインビトロ翻訳を表わす。
【図５Ａ】 図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定するのに用いたプラスミドの模式的表示である。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２タンパク質の発現を表わす。
【図６】 図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。
【図７】 図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのインビボでのＧＦＰの発現パターンを表わす。
Claims (35)
- ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−類義コドンによる置換のために親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも哺乳動物の第１細胞においてより高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、を含む方法。 - 該第１コドンおよび該類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞中で各コドンの翻訳効率を比較すること、
−該比較に基づいて、第１コドンおよび類義コドンを選択すること、
によって選択される、請求項１記載の方法。 - 各コドンの翻訳効率が、第２細胞に比して第１細胞中の各コドンに対応するイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項２記載の方法。
- 該類義コドンが、第２細胞に比して第１細胞において高い存在量であるイソｔＲＮＡに対応する、請求項３記載の方法。
- 第１コドンおよび類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞において異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定すること、
−該測定を基にして第１コドンおよび類義コドンを選択すること、該類義コドンは、第２細胞に比して第１細胞で存在量が高いイソｔＲＮＡに対応する、
を含む、請求項３記載の方法。 - 該類義コドンが、第２細胞中に存在するイソｔＲＮＡのレベルの少なくとも１１０％であるレベルで、第１細胞中に存在するイソｔＲＮＡに対応する、請求項３記載の方法。
- 該類義コドンが、（１）第１細胞の遺伝子によって、別の類義コドンより高頻度で使用されるコドン、（２）哺乳動物の遺伝子によって、別の類義コドンより高頻度で使用されるコドン、（３）第２細胞の遺伝子によって、別の類義コドンより低頻度で使用されるコドン、（４）哺乳動物以外の生物体の遺伝子により別の類義コドンより低頻度で使用されるコドン、よりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
- 第１コドンおよび類義コドンが、
第２細胞で合成ポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドのレベルの少なくとも１１０％のレベルで第１細胞における合成ポリヌクレオチドからポリペプチドが発現されるように、選択される、請求項１の方法。 - 第２細胞が第１細胞の前駆体細胞である、請求項１の方法。
- 該第２細胞が第１細胞から誘導される、請求項１の方法。
- 該ポリペプチドが第２細胞中では発現され得ない、請求項１の方法。
- 第１細胞が第２細胞と同じ型であるが、分化が異なる段階である、請求項１の方法。
- 第１細胞が第２細胞と同じ型であるが、細胞周期が異なる段階である、請求項１の方法。
- 哺乳動物の第１細胞においてポリペプチドを選択的に発現する方法であって、
−類義コドンによる置換のために、ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも第１細胞においてより高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、および
−合成ポリヌクレオチドを、第１細胞中に導入すること、ここで該合成ポリヌクレオチドは調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合されている、
を含み、これによって該ポリペプチドが第１細胞で選択的に発現する方法。 - 哺乳動物の第１細胞においてポリペプチドを選択的に発現する方法であって、
−類義コドンによる置換のために、ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも第１細胞においてより高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
−合成ポリヌクレオチドを、第１細胞の前駆体細胞中に導入すること、ここで該合成ポリヌクレオチドは調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合されている、および
−該前駆体細胞を第１細胞を産生するのに十分な条件に暴露すること
を含み、これによって該ポリペプチドが第１細胞で選択的に発現する方法。 - 該類義コドンが、第２細胞よりも第１細胞において高い翻訳効率を有する、請求項１４または１５の方法。
- ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築するための方法であって、
−類義コドンによる置換のための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも哺乳動物の第１細胞における低い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。 - 該第１コドンと該類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞における各コドンの翻訳効率を比較すること；および
−この比較に基づいて、第１コドンおよび類義コドンを選択すること、
によって選択される、請求項１７記載の方法。 - 各コドンの翻訳効率が、第２細胞に比して第１細胞中で各コドンに対応するイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項１８記載の方法。
- 該類義コドンが第２細胞に比して第１細胞中の存在量がより低いイソｔＲＮＡに対応する、請求項１９の方法。
- 第１コドンおよび類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞において異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定すること、
−該測定を基にして第１コドンおよび類義コドンを選択すること、該類義コドンは、ここで第２細胞に比して第１細胞で存在量が低いイソｔＲＮＡに対応する、
を含む、請求項１８記載の方法。 - 哺乳動物の特定の細胞において第１ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現する方法であって、
−該細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、該細胞において他の類義コドンより低い翻訳効率を示す第１ポリヌクレオチドのコドンを選択すること、
−該コドンに対応するイソｔＲＮＡをコードし、調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合されている第２ポリヌクレオチドを該細胞に導入すること；および
−該細胞中で第２ポリヌクレオチドを発現し、これにより該ポリペプチドが該細胞中で発現されること、
を含む方法。 - 哺乳動物の特定の細胞において第１ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現する方法であって、
−該細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、該細胞において他の類義コドンより低い翻訳効率を示す第１ポリヌクレオチドのコドンを選択すること、
−該コドンに対応するイソｔＲＮＡをコードし、調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合される第２ポリヌクレオチドを該細胞の前駆体に導入すること、該前駆体は、該細胞を生成するのに充分な条件で暴露される；および
−該細胞中で第２ポリヌクレオチドを発現し、これにより該ポリペプチドが該細胞中で発現されること、
を含む方法。 - 細胞周期の特定の相にある周期中動物細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、その集合に必要なポリペプチドを含んでおり、該ポリペプチドは、親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されるが、ウイルス集合ができるのに充分なレベルではない、
次の工程、
−該細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、類義コドンと置換するための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、ここで該類義コドンは該第１コドンよりも該細胞中で高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該ポリペプチドが、そのウイルス集合ができるのに十分なレベルで、該細胞中で合成ポリヌクレオチドから発現可能であるように、該第１コドンを該類義コドンと置換し、親ポリヌクレオチドに比べると増強された翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを構築すること、
−調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合した合成ポリヌクレオチドを該細胞に導入し、それによって該ポリペプチドが発現され、該ウイルス粒子が該細胞中で産生されること、
を含む方法。 - 細胞周期の特定の相にある周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、その粒子の集合に必要な少なくとも１つのポリペプチドを含んでおり、該ポリペプチドは、第１ポリヌクレオチドから該細胞において発現されるが、ウイルス集合ができるのに十分なレベルではなく、
次の工程、
−該細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、該細胞において他の類義コドンよりも低い翻訳効率を示す第１ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、
−該第１コドンに特異的なイソｔＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを該細胞中に導入すること、
−該細胞中の第２ポリヌクレオチドを発現し、これによってウイルス粒子が該周期中細胞中で産生されること、
を含む、方法。 - 細胞周期の特定の相にある周期中真核生物細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、該粒子の集合に必要なポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されるが、ウイルス集合ができるのには十分なレベルではない、
下記工程、
−該細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、類義コドンと置換するための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、ここで該類義コドンは該第１コドンよりも該細胞中で高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該ポリペプチドが、そのウイルス集合ができるのに十分なレベルで、該細胞中で合成ポリヌクレオチドから発現可能であるように、該第１コドンを類義コドンで置換し、親ポリヌクレオチドに比べると増強された翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを構築すること、；
−該細胞の前駆体中に、調節ポリヌクレオチドに操作可能なように連結した合成ポリヌクレオチドを導入すること；および
−該前駆体が該細胞を産生する条件に暴露し、該細胞は、そのウイルスの集合に必要なポリペプチドを含むこと、
それによって該ポリペプチドが発現され、該ウイルス粒子が細胞中で産生される、
を含む方法。 - ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−哺乳動物の特定の細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−該比較から、類義コドンと置換するための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは該第１コドンよりも該細胞中で高い翻訳効率を示すことを基にして選択される；および
−第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。 - 類義コドンが、第１コドンに対応するイソｔＲＮＡに比して、該細胞中において高い存在量であるイソｔＲＮＡに対応する、請求項２７の方法。
- 第１コドンおよび類義コドンが、
該ポリペプチドが該細胞において親ポリヌクレオチドから発現されるレベルの少なくとも１１０％のレベルで、該ポリペプチドが該細胞において該合成ポリヌクレオチドから発現されるように選択される、請求項２７の方法。 - 該比較が、該細胞中の各コドンの翻訳効率を比較することによって提供される、請求項２７記載の方法。
- 翻訳効率が、該細胞中の異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項２７記載の方法。
- ポリペプチオドをコードしている合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−哺乳動物の特定の細胞における各コドンの翻訳効率の比較を提供すること；
−該比較から、類義コドンと置換するための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは該第１コドンよりも該細胞中で低い翻訳効率を示すことを基にして選択される；および
−第１コドンを類義コドンで置換して、該合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。 - 該類義コドンが、第１コドンに対応するイソｔＲＮＡに比して、該細胞における存在量がより低いイソｔＲＮＡに対応する、請求項３２の方法。
- 該比較が、該細胞中の各コドンの翻訳効率を比較することによって提供される、請求項３２の方法。
- 翻訳効率が、該細胞中の異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定することにより比較される、請求項３４の方法。
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