JP2001509388A - 標的の細胞および組織においてタンパク質を選択的に発現するための核酸配列および方法 - Google Patents

標的の細胞および組織においてタンパク質を選択的に発現するための核酸配列および方法

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Abstract

(57)【要約】 哺乳動物の標的の細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現し得る合成核酸配列を提供することである。この選択的発現は、親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換してなされ、該合成核酸配列を形成する。類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は遺伝子治療に一般的に関する。さらに詳細には、本発明は、標的の細
胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための合成核酸配列に関す
る。この細胞または組織において、タンパク質をコードする親の核酸配列の少な
くとも１つの存在コドンが類義コドンで置換されている。本発明はまた、１つ以
上の合成核酸配列および本発明の方法を用いてのウイルス粒子の産生に関する。
【０００２】 （発明の背景） 遺伝子治療が遺伝子欠陥の処置として臨床的に非常に興味深いものであるにも
かかわらず、この治療が臨床現場で主流にならないないのは、標的の組織に対し
て遺伝子を選択的に送達するのが極めて困難であることが証明されているからで
ある。現在、ウイルスベクター、特にレトロウイルスおよびアデノウイルスが使
用されており、これらはある程度は選択的である。しかしながら、多くのベクタ
ー系はその本質からして安定な組込み体を産出できず、なかにはまた、免疫反応
を起こして効果的な処置を妨害するものもある。あるいは、「裸」DNAがリポゾ ームまたは他の類似の送達系に封入される。解決すべき重要な問題は、特定の組
織に対して遺伝子を選択的に標的化することが多くの疾患治療（例えばガン治療
）にとって望ましいにもかかわらず、上述のような遺伝子送達系自体が組織選択
的ではないことである。組織特異性プロモーターを使用した標的遺伝子治療は、
ある種の動物モデルにおいては効果的ではあるが、ヒトの場合はそれほどの効果
は証明されていない。そして、選択的組織特異性プロモーターは広範な組織に利
用されていない。
【０００３】 本発明は、パピローマウイルス（PV）後期遺伝子がなぜ分化した角化細胞に限
って発現するのかを調べた最近の研究から予想外になされた。この点について、
PV後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は非分割分化角化細胞（ＫＣ）にのみ発現すること
がわかった。本発明者をはじめ多くの研究者達は、一連の、レトロウイルス長末
端反復（ＬＴＲ）を含む通常のウイルスプロモーター、およびＣＭＶおよびＳＶ
４０の強い構成プロモーターを使用して、重要なＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパク
質の発現を、これらの遺伝子が未分化培養細胞中に形質導入またはトランスフェ
クトされたときに、検出できなかった。
【０００４】 しかしながら、ＰＶ Ｌ１ ｍＲＮＡは、ラビット・網状赤血球細胞溶解物を
使用してインビトロで効果的に翻訳することができ、このことは、溶解物中にＬ
１の翻訳を妨害する細胞阻害物質が存在しないことを示唆している。インビトロ
翻訳系とインビボ翻訳系との主な相違点は、インビトロ翻訳反応においてはＬ１
が優性Ｌ１ ｍＲＮＡを含むのに対し、無傷細胞内においてはＬ１が細胞ｍＲＮ
Ａ中のマイナーフラクションを構成することである。
【０００５】 インビボにおいてＰＶ後期タンパク質は未分化ＫＣ内で産生されない。しかし
、高度に分化したＫＣにおいては、このタンパク質は大量に発現される。後期遺
伝子発現のこのきびしい調節メカニズムは、あまり理解されておらず、多数のグ
ループによるＫＣ特異性ＰＶ遺伝子転写調節タンパク質の研究は、満足できる結
果を得ていない。
【０００６】 インビボにおけるＬ１ ｍＲＮＡ翻訳の遮断は、Ｌ１ ＯＲＦ内における配列
に起因すると考えられている（Tan et al.,1995,J.Virol.69 5607-5620; Tan an
d Schwartz, 1995, J. Virol. 69 2932-2945)。ＨＩＶのＲｅｖおよびＲｅｖ応 答エレメントを使用すると、そのような阻害は克服できる（Tan et al. 1995, 後述)。したがって、本発明者は、Ｌ１ ＯＲＦにおける推定「阻害配列」の除 去が未分化細胞内でのＬ１タンパク質の産生を可能にするかを調べた。推定配列
の除去のためのＢＰＶ Ｌ１の欠失変異生成およびＣＶ−１細胞中で結果として
生じる欠失突然変異体の発現からは、意外なことに、Ｌ１ ｍＲＮＡの発現にも
かかわらず、Ｌ１タンパク質は検出できなかった。
【０００７】 前述の状況から理解するのがこれまで困難であったことは、パピローマウイル
スが、この明らかに「翻訳不能な」遺伝子を利用して、ライフサイクル後期にお
いて、いかにして大量のＬ１タンパク質を産出するのかである。
【０００８】 しかしながら意外にも、ＰＶ Ｌ１タンパク質を、未分化宿主細胞において実
質的に高レベルで産生し得ることが分かった。この産生は、天然Ｌ１遺伝子の存
在コドンを、存在コドンと比較して未分化宿主細胞遺伝子で比較的高頻度で使用
される類義コドンによって置換することでなされる。予想に反して、それぞれ違
った細胞や組織において特定イソ受容ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の相対存在量が相違
すること、およびこの相違が一定のコドン使用または組成を有する遺伝子からの
タンパク質発現に重要な役割を果たすことが判明した。この発見によって、合成
核酸配列および一般的な方法が実際的となった。そこでは、コドン改変を、特定
の細胞または組織に対して、あるいは特殊な分化状態にある細胞に対するタンパ
ク質の標的発現の手段として使用する。
【０００９】 （発明の対象） 本発明の目的は、合成核酸配列および標的の細胞または組織においてタンパク
質を選択的に発現する方法を提供することである。この配列および方法は、先行
技術についての欠点の少なくともいくつかを改善するものである。
【００１０】 （発明の要旨） 従って、本発明の１つの観点は、哺乳動物の標的の細胞または組織においてタ
ンパク質を選択的に発現し得る合成核酸配列を提供することである。この選択的
発現は、親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換してなさ
れ、該合成核酸配列を形成する。
【００１１】 適切には、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少な
くとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の１以上
の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するも
のである。
【００１２】 好ましくは、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少
なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞また
は組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００１３】 別法として、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少
なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞または
組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【００１４】 好都合には、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡは、哺乳動
物の各々他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて、少なく
とも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５
００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在する。
【００１５】 あるいは、類義コドンは、次の（１）〜（８）よりなる群から選ばれる。（１
）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻
度で使用されるコドン、（２）各々他の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子によ
り比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度
発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組
織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）各々他の細胞または
組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子
により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）他の生物体の遺伝子により比較
的高頻度で使用されるコドン、（８）他の生物体の遺伝子により比較的低頻度で
使用されるコドン。
【００１６】 好ましい実施態様において、少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンの
好ましい選択は、該標的の細胞または組織における該合成核酸配列から該タンパ
ク質が、該標的の細胞または組織における該親核酸配列から発現されるタンパク
質に比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好まし
くは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで発現
するように行なわれる。
【００１７】 他の観点において、本発明は哺乳動物の標的の細胞または組織においてタンパ
ク質を選択的に発現さす方法に存する。この選択的発現は、親核酸配列の少なく
とも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該合成核酸配列を形成する。
【００１８】 好ましくは、この方法は次の工程をさらに特徴とする。 （ａ）該タンパク質をコードする親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを
類義コドンで置換し、該タンパク質が該標的の細胞または組織で選択的に発現さ
れ得るように、該親核酸配列に比べると異なる翻訳速度を有する合成核酸配列を
産生する。 （ｂ）１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成核酸配列を、
哺乳動物に投与し、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組
織に導入する。 （ｃ）該標的の細胞または組織において該タンパク質を選択的に発現させる。
好ましくは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む。 （ｉ）該標的の細胞または組織および哺乳動物の１以上の他の細胞または組織
において相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量を測定する。 （ii）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを
同定する。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なく
とも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の他の細胞
または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである
。
【００１９】 適当には、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイ
ソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応
するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞また
は組織が高い存在量を有するものである。
【００２０】 あるいは、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイ
ソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応
するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞または組織に比較して標的の細胞または
組織が高い存在量を有するものである。
【００２１】 あるいは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む。（Ｉ）標的の
細胞または組織の遺伝子、（II）各々他の細胞または組織の遺伝子、（III）哺 乳動物の遺伝子および（IV）他の生物体の遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子
により使用される特定のコドンの夫々の比較頻度に基づいて該少なくとも１つの
存在コドンおよび該類義コドンを同定すること。
【００２２】 他の観点において、本発明は、第１核酸配列から標的の細胞または組織でタン
パク質を発現さす方法を提供する。この方法は次の工程を含む。
【００２３】 該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組織中に、少なくと
も１つのイソ受容tＲＮＡをコードする第２核酸配列を導入する。該第２核酸配 列は１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結しており、該少なくとも１つ
のイソ受容 tＲＮＡは該標的の細胞または組織において比較的低量で正常に存在
し、該第１核酸配列のコドンに対応する。
【００２４】 さらなる観点において、本発明は周期中真核細胞におけるウイルス粒子を産生
する方法に及ぶ。該ウイルス粒子はその集合に必要な少なくとも１つのタンパク
質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに充分な
レベルでは親核酸配列から該細胞中で発現されない。該方法は次の工程を含む。
（ａ）該親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該
親核酸配列に比べると変化した翻訳速度を有する合成核酸配列を産生する。該少
なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞
中で該合成核酸配列から発現が可能である。 （ｂ）該細胞またはその前駆体中に、１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的
に連結した該合成核酸配列を導入する。 （ｃ）少なくとも１つのタンパク質を該細胞中で、該ウイルス粒子の集合に必
要な他のウイルスタンパク質の存在下で発現し、もって該ウイルス粒子を産生す
る。
【００２５】 本発明のさらなる観点において、周期中細胞においてウイルス粒子を産生する
方法が提供される。該ウイルス粒子はその粒子の集合に必要な少なくとも１つの
タンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるの
に十分なレベルで親核酸配列から該細胞中で発現されない。該親核酸配列の少な
くとも１つの存在コドンは、該少なくとも１つのタンパク質の産生を該レベルに
まで律速的にする。該方法は、該細胞中に、該少なくとも１つのコドンに特異的
なイソ受容 t ＲＮＡを発現し得る核酸配列を、導入する工程を含む。
【００２６】 （図面の簡単な説明） 図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹アミ
ノ酸配列（配列番号２）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、各コドンの第２
ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元の配列の対応ヌ
クレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および酵素を示す。ヌ
クレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動物遺伝子によく
用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−Ｌ１ポリペプチドをコードす
る核酸配列が得られた。
【００２７】 図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列（配列番号５）
および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は、
各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、元
の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位および
酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、野性型に同じであるが、哺乳動
物遺伝子によく用いられる類義コドンを有するアミノ酸のＢＰＶ−１Ｌ２ポリペ
プチドをコードする核酸配列が得られた。
【００２８】 図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列（配列番号９）
および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。アミノ酸（１文字表記）は
、各コドンの第２ヌクレオチドの下に提示する。遺伝子中に導入された変異は、
元の配列の対応ヌクレオチドの上に示す。横線はクローニングに用いた部位およ
び酵素を示す。ヌクレオチドのこの置換によって、真核細胞における最適発現の
ために修飾された天然配列に同じであるが、パピロマウイルス遺伝子によく用い
られる類義コドンを有するアミノ酸のポリペプチドをコードする核酸配列が得ら
れた。
【００２９】 図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現されるＬ１タン
パク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ
／ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトラ
ンスフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３
６時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベート
し、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３０】 図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ１お
よびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞から
のＬ１タンパク質を表わす。
【００３１】 図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出された
Ｌ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた
。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダ イゼーションによって調べた。
【００３２】 図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現されたＬ２タンパ
ク質の検出を表わす。Ｃｏｓ−１細胞が、合成Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／
ＨＢＬ１および野性型Ｌ１発現プラスミドｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトラン
スフェクトされた。Ｌ１の発現が免疫蛍光染色によって検出された。細胞を３６
時間後に固定し、ウサギアンチＢＰＶ１ Ｌ１抗血清とともにインキュベートし
、ＦＩＴＣ複合ヤギアンチウサギＩｇＧ抗体で処理した。
【００３３】 図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮＡ／ＨＢＬ２お
よびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏｓ−１細胞から
のＬ１タンパク質を表わす。
【００３４】 図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞から抽出された
Ｌ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識によりプローブされた
。各レーンのｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡサンプルとgapdhプローブとのハイブリダ イゼーションによって調べた。
【００３５】 図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成Ｌ１（ＨＢ）
のインビトロ翻訳を表わす。ウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物を35 Ｓ−メチオニンの存在において使用した。上部のパネルにおいて、ｗｔＬ１また
はＨＢＬ１のプラスミドＤＮＡをＴ７ＤＮＡポリメラーゼ結合インビトロ翻訳系
に加えた。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロット法で検出した。下部のパネルに
おいて、ｗｔＬ１またはＨＢＬ１配列の翻訳効率をｔＲＮＡの存在または不存在
で比較した。翻訳をウサギ網状赤血球分解物または小麦胚芽抽出物において行な
い、８分から出発して２分毎にサンプルを収集した。下部パネルの左側は１０-5 Ｍのウシ肝臓または酵母ｔＲＮＡが供給されたかを表わす。
【００３６】 図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定するのに用いたプラ
スミドの模式的表示である。野性型Ｌ１配列および大部分の野性型Ｌ２配列がＢ
ＰＶ１ゲノムからＢａｍＨＩおよびＨindIII消化により検出され、残りのＢＰＶ
１配列（黄色）をｐＵＣ１８にクローンした。野性型または合成ヒト化Ｌ２配列
（赤色）をＢＰＶ１ゲノムのＢａｍＨＩ部位に挿入した。挿入ＳＶ４０ｏｒｉ配
列（白色）の位置を表示する。修飾Ｌ２が使用されているが、ＳＶ４０ｏｒｉ配
列のないプラスミドを対照として用いた。プラスミドをＣｏｓ−１細胞中にトラ
ンスフェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクロ
ーナル抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。
【００３７】 図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２タンパク質の発
現を表わす。図５Ａで示されたプラスミドを用いてＣｏｓ−１細胞をトランスフ
ェクトし、Ｌ２タンパク質の発現の測定は、ＢＰＶ１Ｌ２特異的ポリクローナル
抗血清、次いでＦＩＴＣ連結アンチウサギＩｇＧを用いて行った。細胞がプラス
ミドを受けつけない偽のトランスフェクションを対照として用いた。
【００３８】 図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコド
ンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトランスフェクト
されたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。ｇｆｐまたはｐｇｆｐで
トランスフェクトされた細胞から抽出されたｍＲＮＡは、32Ｐ標識ｇｆｐプロー
ブでプローブされ、参照遺伝子としてgapdhを用いて、右側のパネルに示す。
【００３９】 図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用いられたコド
ンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのインビボでのＧ
ＦＰの発現パターンを表わす。遺伝子銃を用いて、マウスにＧＦＰタンパク質を
コードするＰＧＦＰ（左側パネル）およびＧＦＰ（右側パネル）発現プラスミド
を射入した。マウス皮膚の横断面はｇｆｐ遺伝子が発現される箇所を表わす。同
じ箇所の明るい視野の写真は、真皮（Ｄ）および表皮（Ｅ）を明示し、表皮にお
ける蛍光の位置を同定する。矢印は蛍光シグナルを示す。
【００４０】 （詳細な説明） 本発明は次のような予想されない発見から生じた。相違のイソ受容 t ＲＮＡ の相対存在量が、別異の細胞または組織あるいは分化の別異の段階または細胞周
期の別異なの段階にある細胞または組織において変化すること、および該相違が
遺伝子のコドン組成とともにおこり、特定の細胞または組織に対して、あるいは
分化の特異な状態または細胞周期の特異な段階にある細胞または組織に対してタ
ンパク質の発現の調節および指令をなすことを発見した。本発明により、この選
択的標的化は、タンパク質をコードする親核酸配列の少なくとも１つの存在コド
ンを類義コドンで置換することで実施される。
【００４１】 存在コドンを類義コドンで置換すること自体は新しくない。この点について国
際出願公開Ｎｏ.ＷＯ９６／０９３７８を引用する。この出願で該置換が使用さ れているのは、インビトロ哺乳動物細胞培養系において高レベルで真核細胞また
はウイルスに由来するタンパク質を発現する方法においてである。この方法の要
点は該タンパク質を収穫することである。これに反して、本発明では、特定の細
胞または組織に対して遺伝子の発現を標的化するために、遺伝子中の１以上のコ
ドンの置換を使用し、その最終目的は本明細書記載のような遺伝子治療を容易に
することである。
【００４２】 用語“類義コドン”とは、存在コドンと相違するヌクレオチド配列を有するが
、存在コドンと同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。
【００４３】 用語“イソ受容 t ＲＮＡ”は、アンチコドン構造が相違するが、同じアミノ 酸に特異的である１以上の転移ＲＮＡ分子を意味する。
【００４４】 本明細書を通して、別記しない限り、用語“含む”および“包含する”は、記
述した物または群を含み、他の物または群を排除するものでないと理解されるべ
きである。
【００４５】 （類義コドンの選択） 別異の細胞における相違するｔＲＮＡ種の相対存在量の測定
【００４６】 好都合に、類義コドンはイソｔＲＮＡに対応する。このイソｔＲＮＡは、少な
くとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比較すると、哺乳動物の１以
上の他の細胞または組織に比べて標的細胞または組織中に高い量で存在する。
【００４７】 ２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの比較量を測定するには、いかなる
方法も利用できる。例えば、該方法には、哺乳動物から２以上の特定の細胞また
は組織を単離し、ｔＲＮＡ含有の各細胞または組織からＲＮＡ抽出物を得て、各
々が特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違の核酸配列で各抽出物を夫々プロー
ブして、２以上の細胞または組織間のイソｔＲＮＡの比較量を測定する。
【００４８】 特定の細胞または組織を単離する適切な方法は当業者によく知られている。例
えば、細胞または組織の１以上の特性を利用して異種集団から細胞または組織を
特異的に単離することができる。該特性には、限定するわけではないが、組織の
解剖的位置、細胞密度、細胞サイズ、細胞形態、細胞代謝活性、Ｃａ2+、Ｋ+お よびＨ+などのイオンの細胞摂取、染料などの化合物の細胞摂取、細胞表面で発 現されるマーカー、サイトカイン発現、タンパク質蛍光および膜電位がある。こ
の点について使用できる適当な方法には、組織の外科的除去、蛍光活性セルソー
ター（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法、免疫親和性分離（例えば、Ｄ
ynabead（商標）分離などの磁気ビード分離）、密度分離（メトリサミド、Ｐerc
oll（商標）またはＦicoll（商標）の順次遠心分離）および細胞型特異的密度分
離（例えば、Ｌymphoprep（商標））がある。例えば、分割細胞または芽細胞は 、ＦＡＣＳまたはメトリザミド順次分離によって細胞サイズに従って、非分割細
胞または残留細胞から分離される。
【００４９】 細胞または組織から全ＲＮＡを単離するためにいかなる適当な方法も用いられ
る。本発明で用い得る典型的な方法は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａusubel，et al.，eds）（Ｊoh
n Ｗiley ＆ Ｓons，Ｉnc.１９９７）（出典明示により本明細書の一部とす る）の頁４.２.１から頁４.２.７に記載されている。好ましくはｔＲＮＡの単離
に適した方法は、例えばＢrunngraber，Ｅ.Ｆ.（１９６２，Ｂiochem，Ｂiophys
.Ｒes.Ｃommun.８：１−３）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載の
ように行なわれる。
【００５０】 ＲＮＡのプローブは、特定のイソｔＲＮＡに特異的である相違のオリゴヌクレ
オチド配列で行なわれる。対象とする哺乳動物にとって、哺乳動物により発現さ
れる特定のイソｔＲＮＡ配列で特異的にハイブライドするオリゴヌクレオチド配
列を選択する必要がある。該選択は、既知のイソｔＲＮＡ配列を基とする従来技
術の一つの中にはいる。例えば、マウスの場合、用い得る例示的オリゴヌクレオ
チド配列には、Ｇauss and Ｓprinzel（１９８３，Ｎucleic Ａcids Ｒes. １１（１））（出典明示により本明細書の一部とする）記載のものがある。この
点について、オリゴヌクレオチドは下記よりなる群から選択し得る。
【００５１】 5'-TAAGGACTGTAAGACTT-3' (配列番号13) AlaGCA 5'-CGAGCCAGCCAGGAGTC-3' (配列番号14) ArgCGA 5'-CTAGATTGGCAGGAATT-3' (配列番号15) AsnAAC 5'-TAAGATATATAGATTAT-3' (配列番号16) AspGAC 5'-AAGTCTTAGTAGAGATT-3' (配列番号17) CysTGC 5'-TATTTCTACACAGCATT-3' (配列番号18) GluGAA 5'-CTAGGACAATAGGAATT-3' (配列番号l9) GlnCAA 5'-TACTCTCTTCTGGGTTT-3' (配列番号20) GlyGGA 5'-TGCCGTGACTCGGATTC-3' (配列番号21) HisCAC 5'-TAGAAATAAGAGGGCTT-3' (配列番号22) IleATC 5'-TACTTTTATTTGGATTT-3' (配列番号23) LeuCTA 5'-TATTAGGGAGAGGATTT-3' (配列番号24) LeuCTT 5'-TCACTATGGAGATTTTA-3' (配列番号25) LysAAA 5'-CGCCCAACGTGGGGCTC-3' (配列番号26) LysAAG 5'-TAGTACGGGAAGGATTT-3' (配列番号27) Metelong 5'-TGTTTATGGGATACAAT-3' (配列番号28) PheTTC 5'-TCAAGAAGAAGGAGCTA-3' (配列番号29) ProCCA 5'-GGGCTCGTCCGGGATTT-3' (配列番号30) ProCCI 5'-ATAAGAAAGGAAGATCG-3' (配列番号31) SerAGC 5'-TGTCTTGAGAAGAGAAG-3' (配列番号32) ThrACA 5'-TGGTAAAAAGAGGATTT-3' (配列番号33) TyrTAC 5'-TCAGAGTGTTCATTGGT-3' (配列番号34) ValGTA
【００５２】 典型的には、イソｔＲＮＡ種の相対存在量はブロッティング法により測定し得
る。この方法は、サンプルのＲＮＡまたはｔＲＮＡ抽出物をマトリックス（好ま
しくは、ニトロセルロースなどの合成膜）上に固定する工程、ハイブリダイゼー
ション工程および検出工程を含む。ノーザン・ブロッティング法が、核酸プロー
ブに相補的なＲＮＡ配列を同定するのに用いられる。あるいは、ドットブロッデ
ィングおよびスロットブロッティングが、相補的なＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ
／ＲＮＡ核酸配列を同定するのに用いられる。該技術は、Ａusubel et al.（ 前出）の頁２.９.１から２.９.２０に記載されている。
【００５３】 該技術によってマトリックス上に固定されたサンプルのｔＲＮＡは、放射活性
的、酵素的または蛍光色素的に標識された相補的ヌクレオチド配列（上記したよ
うな）に、ストリジェンシィな条件でハイブリダイズされる。
【００５４】 “ストリジェンシィ”とは、ハイブリダイセイションにおける、ある種の有機
溶媒の存在または無存在下での温度およびイオンの強化条件を意味する。ストリ
ジェンシィが高くなると、固定ヌクレオチド配列（すなわち、イソｔＲＮＡ）と
標識オリゴヌクレオチド配列との間の相補性の度合が増加する。使用できる典型
的なストリジェンシィの条件については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIO
LOGY（前出）の頁２.１０.１から２.１０.１６および Molecular CLONING. A LA
BORATORY MANUAL（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，1989）の章１.１０１から１
.１０４を参照のこと（出典明示により本明細書の一部とする）。
【００５５】 ストリジェンシィ洗滌は温度約４２°から６８℃で典型的には行なわれるが、
当業者は、他の温度もストリジェンシィ条件として用いうることが分かるであろ
う。最大ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリドの形成について
のＴｍが約２０から２５以下で典型的に起こる。既知技術で知られているように
、Ｔｍは、融点または２種の相補的核酸配列が解離する温度である。Ｔｍを判定
する方法はよく知られている（参照、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
、前出、頁２.１０.８）。最大のハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリドについてＴｍが約１０°から１５℃以下で起きる。
【００５６】 他のストリジェンシィ条件はよく知られている。当業者は分かるように、種々
の要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最大化する。最終洗滌の
ストリジェンシィを最適化すると、高度のハイブリダイゼーションが保証される
。
【００５７】 固定化ヌクレオチド配列にハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列を検出
する方法は、当業者によく知られている。この検出方法には、オートラジオグラ
フィー、化学ルミネッセンス、蛍光法および比色法が含まれる。 好都合には、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの相対存在量は、イソ
ｔＲＮＡに特異的な標識ヌクレオチド配列の結合の各々のレベルを２以上の細胞
または組織から得た固定ＲＮＡの同等量と比較することによりなされる。同様の
比較を適当に実施すると、２以上の細胞または組織中のイソｔＲＮＡの各々の相
対存在量が測定される。当業者は、種々の細胞または組織について比較ｔＲＮＡ
存在量が測定できる（参照、例えば表２）。該比較から、各類義コドンがイソｔ
ＲＮＡに対応するように、１以上の類義コドンが選択される。このイソｔＲＮＡ
は、親核酸配列の存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の他
の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織中での存在量が高い。
【００５８】 好都合には、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡの選択は、
哺乳動物の各々他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて少
なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくと
も５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在するようにな
される。
【００５９】 適切には、分化細胞、好ましくは分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現の
ための類義コドンは、ｇｃａ（Ａｌａ）、ｃｕｕ（Ｌｅｕ）およびｃｕａ（Ｌｅ
ｕ）よりなる群から選択される。
【００６０】 非分化細胞、好ましくは非分化角化細胞中のタンパク質の選択的発現のための
類義コドンは、ｃｇａ（Ａｒｇ）、ｃｃｉ（Ｐｒｏ）およびａａｇ（Ａｓｎ）よ
りなる群から選択される。
【００６１】 （コドン使用分析） 別法として、類義コドンは、（ｉ）特定の細胞または組織、（ii）哺乳動物の
実質的に全ての細胞または組織、または（iii）哺乳動物の特定細胞または組織 に感染し得る生物体、で発現される遺伝子についてコドンが使用されている頻度
を分析することにより選択され得る。
【００６２】 コドン頻度表および生物体におけるコドン使用頻度の測定に適した方法は、例
えばシャープらによる文献（1988，Nucleic Acids Res. 16 8207−8211）に記載
されており、これを引用して説明の一部とする。
【００６３】 遺伝子発現の相対レベル（例、検出可能なタンパク質発現と検出可能なタンパ
ク質発現無し）により、相異なる細胞または組織で発現される特異的イソ−ｔＲ
ＮＡの相対存在量の間接的尺度が得られる。例えば、ウイルスは、第１の細胞ま
たは組織（特定の分化段階にある細胞または組織を含み得る）内では増殖し得る
が、第２の細胞または組織（別の分化段階にある細胞または組織を含み得る）で
は実質的に増殖できない場合があり得る。すなわち、ウイルスの遺伝子によるコ
ドン使用パターンを第２の細胞または組織で発現された遺伝子によるコドン使用
パターンと比較すると、第２の細胞または組織に対し第１の細胞または組織にお
いて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドン
が間接的に得られ、逆もまた同様である。同時に、上記比較はまた、第１の細胞
または組織に対し第２の細胞または組織において比較的高い存在量で発現される
イソ−ｔＲＮＡに対応する一連の類義コドンを間接的に提供し得る。
【００６４】 前述したことから、本発明による類義コドンは、（１）標的の細胞または組織
の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、
（２）その他または互いに別の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺
伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好まし
くは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞
または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）その他また
は互いに別の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、
（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）別の生
物の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、および（８）別の生物の遺
伝子により比較的低頻度で使用されるコドンを含むコドンに対応し得るが、これ
らに限定されるわけではない。
【００６５】 例えば、哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で
使用されるコドンは、cuc（Leu）、cuu（Leu）、cug（Leu）、uua（Leu）、uug （Leu）、cgg（Arg）、cgc（Arg）、aga（Arg）、agg（Arg）、agu（Ser）、agc
（Ser）、ucu（Ser）、ucc（Ser）、およびuca（Ser）から成る群から選択され 得る。別法として、上記コドンは、auu（Ile）、auc（Ile）、guu（Val）、guc （Val）、gug（Val）、acu（Thr）、acc（Thr）、aca（Thr）、gcu（Ala）、gcc
（Ala）、gca（Ala）、cag（Glu）、ggc（Gly）、gga（Gly）、ggg（Gly）を含 み得る。
【００６６】 哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されているコドンはシャープら（
1988、前出）により報告されている。上記コドンには、cua（Leu）、cga（Arg）
、cgu（Arg）、cgu（Arg）、ucg（Ser）が含まれ得る。別法として、上記コドン
には、aua（Ile）、gua（Val）、acg（Thr）、gcg（Ala）、caa（Glu）、ggu（G
ly）が含まれ得る。
【００６７】 （合成核酸配列の構築） 存在コドンを類義コドンに置換する段階は、適当なものであればいかなる技術
によっても遂行され得る。例えば、当業界の熟練者に熟知されているインビトロ
突然変異誘発方法が使用され得る。適当な突然変異誘発方法は、例えばアウスベ
ルら（前出）およびサムブルックら（前出）の関連部分に記載されており、それ
らを引用して説明の一部とする。別法として、適当なＤＮＡ改変方法は、例えば
米国特許第４１８４９１７号、第４３２１３６５号および第４３５１９０１号に
開示されており、それらを引用して説明の一部とする。インビトロ突然変異誘発
法ではなく、容易に入手可能な機械装置を用いても、第２の核酸配列が新たに合
成され得る。ＤＮＡの連続合成については、例えば米国特許第４２９３６５２号
に記載されており、これを引用して説明の一部とする。しかしながら、本発明は
、存在コドンを類義コドンと置き換えるためのいずれか１つの特定技術に依存的
なものではなく、それを指向するわけではない。
【００６８】 親核酸配列の存在コドン全てを、他の細胞と比べ標的細胞において比較的高い
存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換する必要は
ない。部分置換であっても、発現増加は達成され得る。好ましくは、置換段階は
、親核酸配列の存在コドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、
さらに好ましくは３５％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上に影
響を及ぼし得る。
【００６９】 親核酸配列は、好ましくは天然遺伝子である。「天然遺伝子」とは、タンパク
質を自然にコードする遺伝子を包含する。しかしながら、親核酸配列が、天然に
は存在しないが組換え技術を用いる遺伝子工学で作られたタンパク質をコードす
ることはあり得る。
【００７０】 親核酸配列は、必ずしも哺乳動物から入手される必要はないが、適当な供給源
、例えば真核生物または原核生物から入手され得る。例えば、親核酸配列は、別
の哺乳動物または他の動物から得られる。別法として、親核酸配列は病原体から
得られる。かかる場合、病原体の天然宿主は、好ましくは哺乳動物である。例え
ば、病原体は酵母、細菌またはウイルスであり得る。
【００７１】 例えば、本発明による選択的発現に使用され得る適当なタンパク質には、嚢胞
性線維症貫膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびアデノシ
ンデアミナーゼ（ＡＤＡ）があるが、これらに限定はされない。ＣＦＴＲの場合
、合成核酸配列の製造に利用され得るＣＦＴＲタンパク質をコードする親核酸配
列については、例えばリオーダンら（1989，Science 245 1066-1073）、およ び受入れ番号ＨＵＭＣＦＴＲＭとしてジーンバンクのデータベースに記載されて
おり、これらを引用して説明の一部とする。
【００７２】 ここで使用されている「核酸配列」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮ
ＡまたはＤＮＡを指す。
【００７３】 合成核酸配列の発現調節に使用され得る調節ヌクレオチド配列には、プロモー
ター、エンハンサーおよび転写ターミネーターがあるが、これらに限定されるわ
けではない。上記調節配列については、当業者に熟知されている。
【００７４】 本発明による合成核酸配列は、発現ベクター形態において１以上の調節配列に
機能し得るように結合され得る。「ベクター」とは、例えば、プラスミド、バク
テリオファージまたは哺乳動物もしくは昆虫ウイルスから誘導される核酸分子、
好ましくはＤＮＡ分子を意味し、そこへは合成核酸配列が挿入またはクローン化
され得る。ベクターは、好ましくは１以上の特有の制限部位を含み、標的の細胞
もしくは組織または前駆細胞もしくはその前駆組織を含む特定宿主細胞において
自律複製することが可能であるか、またはクローン化配列が再生され得るように
特定宿主のゲノムに組み込まれ得る。すなわち、「発現ベクター」とは、タンパ
ク質合成を指図し得る自律要素を全て包含する。上記発現ベクターは、当業者に
はよく知られている。
【００７５】 ここで使用されている「前駆細胞」の語は、標的細胞のもととなる細胞を包含
する。
【００７６】 本発明はまた、タンパク質の目的部分をコードする合成核酸部分配列をも包含
する。核酸部分配列は、それに伴う機能を有するタンパク質のドメインをコード
し、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０、５０、１００、１５０また
は５００個の隣接アミノ酸をコードする。
【００７７】 合成核酸配列を標的細胞に導入する段階は、意図された用途および／または種
類により異なり、非ウイルス性およびウイルス性ベクター、カチオン性リポソー
ム、レトロウイルスおよびアデノウイルス、例えばムリガン、Ｒ．Ｃ．、（1993
，Science 260 926-932）に記載されたものを含み得、これを引用して説明の 一部とする。上記方法としては、次のものが挙げられる。
【００７８】 （ｉ）注入（ウォルフら、1990，Science 247 1465−1468、これを引用して
説明の一部とする）、外科的内植、点滴または他のいずれかの手段による合成核
酸配列の局所適用法。この方法はまた、合成核酸配列によりコードされるタンパ
ク質に応答性を示す細胞の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段によ
る局所適用と組み合わせて使用されることにより、その処置の有効性を高め得る
。この方法はまた、上記タンパク質の活性に要求される別の因子または複数因子
の注入、外科的内植、点滴または他の何らかの手段による局所適用と組み合わせ
て使用され得る。
【００７９】 （ii）ＤＮＡ（カラブレッタら、1993，Cancer Treat． Rev． 19 169−179 、これを引用して説明の一部とする）またはＲＮＡを、単独またはリポソーム（
ズーら、1993，Science 261 209−212、これを引用して説明の一部とする）、
ウイルスカプシドまたはナノ粒子（バートリングら、1991，Biotech. Appl. B
iochem. 13 390−405、これを引用して説明の一部とする）または他のいずれ かのデリバリー仲介物質と組み合わせたものの注入による一般的全身デリバリー
。合成核酸配列を標的分子に結合すること（例えば抗体を用いるいわゆる「魔弾
」法）、または上記合成核酸配列から製造されるタンパク質の活性に要求される
別の因子または複数因子または上記タンパク質に応答性を示す細胞の注入、外科
的内植または他のいずれかの手段による局所適用により、標的化の改善が達成さ
れ得る。
【００８０】 （iii）細胞における合成核酸配列の発現を増加させるため、トランスフェク ション（例えば、燐酸カルシウムの存在下：チェンら、1987，Mole．Cell Bioch
em. 7 2745−2752、またはカチオン脂質およびポリアミン類の存在下：ローズ ら、1991，BioTech. 10 520−525、これらの文献を引用して説明の一部とする ）、感染、注入、電気穿孔（シゲカワら、1988，BioTech. 6 742-751、これを 引用して説明の一部とする）または他の何らかの方法により生体外（エクスビボ
）修飾された細胞の注入または内植または何らかの手段による送達。この修飾は
、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス性（例えばアデノウイ
ルスまたはレトロウイルス性、ムリガン、1993，Science 260 926-932、ミラ ー、1992，Nature 357 455−460、サーモンズら、1993，Hum. Gen. Ther. 4 129−141、これらの文献を引用して説明の一部とする）または他のベクター、
または他の修飾作用物質、例えばリポソーム（ズーら、1993，Science 261 20
9−212、これを引用して説明の一部とする）、ウイルスカプシドまたはナノ粒子
（バートリングら、1991，Biotech. Appl. Biochem. 13 390−405、これを引 用して説明の一部とする）または他の修飾伝達物質により伝達され得る。遺伝子
または遺伝子産物送達ビークルとしての細胞の使用については、バールら、1991
，Science 254 1507−1512およびダバンら、1991，Science 254 1509−1512
により報告されており、これらの文献を引用して説明の一部とする。処理された
細胞は、処置対象におけるその生存を助長する栄養素、成長因子、マトリックス
または他の薬剤と組み合わせて送達され得る。
【００８１】 さらに別の態様において、本発明は、本発明の合成核酸配列および薬学的に許
容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】 「薬学的に許容し得る担体」とは、全身投与で安全に使用され得る固体または
液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路によって、当業
界で公知の様々な薬学的に許容し得る担体が使用され得る。これらの担体は、糖
類、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシ
ウム、植物油、合成油、ポリオール類、アルギン酸、燐酸緩衝液、乳化剤、等張
食塩水および発熱物質不含有水を含む群から選択され得る。
【００８３】 特定の細胞または組織における上記合成核酸配列からのタンパク質の発現を測
定するのに適したものであれば、いかなる技術でも使用され得る。例えば、発現
は、興味の対象であるタンパク質またはその一部に特異的な抗体を用いて測定さ
れ得る。上記抗体および測定技術は、当業者にはよく知られている。
【００８４】 （適用法） 本発明の一具体例において、標的細胞は、好適には分化した細胞である。有利
には、分化細胞における選択的発現が所望されているタンパク質は、前記タンパ
ク質に随伴する特定機能を発揮するのに十分なレベルで親核酸配列からその前駆
細胞（例えば哺乳動物の未分化または低分化細胞）において発現することはでき
ない。この具体例において、少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと置換す
る段階は、類義コドンが、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮ
Ａと比較した場合、前駆細胞と比べ分化細胞での存在量が比較的高いイソ−ｔＲ
ＮＡに対応することを特徴としている。従って、親核酸配列と比べて改変された
翻訳速度を有する合成核酸配列が製造され、その場合タンパク質は、分化細胞に
おいてタンパク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで発現可能であるが、こ
のタンパク質は前駆細胞において上記機能の発揮に充分なレベルでは発現され得
ない。
【００８５】 ここで使用されている「機能」の語は、生物学的または治療的機能を指す。
【００８６】 上記具体例は、未分化細胞、例えば幹細胞におけるタンパク質の過剰発現が幹
細胞の死または分化を含め望ましくない結果を有する体細胞遺伝子治療において
有利に利用され得る。かかる場合、適当なタンパク質には、嚢胞性線維症貫膜コ
ンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質およびアデノシンデアミナーゼ（
ＡＤＡ）が含まれる。
【００８７】 分化細胞は、上皮、造血または神経起源の細胞を含むあらゆる系統の細胞を包
含し得る。例えば、分化細胞は、成熟分化ケラチノサイト（ケラチン生成細胞）
であり得る。
【００８８】 幹細胞自体ではなく幹細胞の子孫に対するタンパク質の標的発現 上記で製造された合成核酸配列は、所望の機能のため分化細胞へ直接トランス
フェクションされるかまたは別法として前駆細胞へトランスフェクションされ得
る。例えば、ＡＤＡ欠損の場合、幹細胞におけるＡＤＡ発現の結果、望ましくな
いステム表現型の喪失が起こり得る。しかしながら、有利な治療は、１以上の調
節配列に機能し得るように結合された合成核酸配列をオートロガス骨髄幹細胞に
導入する方法に基づいたものであり得、その場合に野生型ＡＤＡ遺伝子の存在コ
ドンは、骨髄幹細胞と比べ分化リンパ球において比較的高い存在量で発現される
イソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義コドンと置換されている。次いで、形質導入
された幹細胞は患者へ再注入され得る。この方法により、ＡＤＡ自体を発現し得
ないが、治療効果をもたらすのに充分なレベルでＡＤＡを発現し得る分化リンパ
球の再生可能な集団を生じさせ得る形質導入された骨髄幹細胞が得られる。この
点で、この目的に適当な細胞供給源は、患者の末梢血または骨髄からのＣＤ３４
陽性細胞として単離された幹細胞を含み得る。遺伝子送達のため、適当なベクタ
ーは、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルスを含み得る。
【００８９】 別法として、細胞性免疫を誘導する場合、樹状細胞は重要な抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ）であるが、一旦活性化された抗原提示に関する寿命は１４ないし２１日間
と非常に限られている。従って、樹状細胞は最適ではあり得ない比較的短期間の
免疫刺激を供する。しかしながら、本発明によると、長期免疫刺激は、オートロ
ガス骨髄誘導ＣＤ３４陽性樹状細胞前駆体に抗原、例えば黒色腫抗原ＭＡＲＴ−
１をコードする合成ヌクレオチド配列を導入することにより与えられ得、この場
合、合成配列は１以上の調節配列に機能し得るように結合されており、ＭＡＲＴ
−１をコードする野生型ヌクレオチド配列の存在コドンは、樹状細胞前駆体と比
べ樹状細胞で比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する類義
コドンと置換されている。次いで、形質導入された樹状細胞前駆体は、患者に再
注入され得る。この方法により樹状細胞前駆体が得られる。この前駆体は、ＭＡ
ＲＴ−１自体を発現し得ないが、ＭＡＲＴ−１を発現し得る樹状細胞の再生可能
な集団を生じ得る。この樹状細胞によるＭＡＲＴ−１の発現は、ＭＡＲＴ−１抗
原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の終生間欠性再刺激を可能にす
るのに充分なレベルである。
【００９０】 幹細胞の子孫ではなく幹細胞に対するタンパク質の標的発現 別の態様において、標的細胞は、タンパク質が、未分化細胞においてタンパク
質に伴う特定機能を発揮するのに充分なレベルではタンパク質をコードする親核
酸配列から発現し得ない未分化細胞であり得る。かかる場合、親核酸配列の少な
くとも１個の存在コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔＲ
ＮＡと比べたとき、分化細胞と比べ未分化細胞で存在量が比較的高いイソ−ｔＲ
ＮＡに対応する類義コドンと置換されている。この結果、上記親核酸配列と比べ
て翻訳速度が改変された合成核酸配列が得られ、この場合タンパク質はタンパク
質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞において発現可能であるが
、このタンパク質は上記機能の発揮に充分なレベルで未分化細胞から誘導された
分化細胞においては発現し得ない。
【００９１】 実例として、この上記態様を用いることにより、特定未分化細胞または幹細胞
での発現時に特定細胞系譜に沿った幹細胞の分化を容易にする転写調節タンパク
質の発現が行われ得る。かかる場合、調節タンパク質は、存在コドンが他のイソ
−ｔＲＮＡと比べ幹細胞において存在量が比較的低いイソ−ｔＲＮＡに対応する
遺伝子から正常に発現され、従ってタンパク質は、特定細胞系譜に沿って分化す
る幹細胞の増殖に関与するには充分なレベルでは発現され得ない。また、特定細
胞系譜に沿って分化する上記の関与を利用することにより、特定系譜の細胞、例
えば癌細胞の生成が阻止され得ることは明らかである。
【００９２】 別法として、この態様による方法を用いることにより、治療剤（複数も可）の
製造に関与する転写調節タンパク質が発現され得る。かかるタンパク質としては
、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−
３）の製造に関与するＮＦ−カッパ−Ｂ転写因子ｐ６５サブユニット（ＮＦ―カ
ッパ―Ｂ ｐ６５）および顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ
ＣＳＦ）が含まれ得る。ＮＦ―カッパ―Ｂ ｐ６５は、幹細胞で比較的低い存在
量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに各々対応する若干の存在コドンを含むヌクレオ
チド配列により自然にコードされる。従って、上記配列は、この態様による親核
酸配列として使用され得る。このタンパク質をコードする適当なヌクレオチド配
列は、例えばライルら（1994、Gene 138 265−266）および受付番号ＨＳＮＦ ＫＢ６５ＡとしてＥＭＢＬデータベースに記載されており、これらを引用して説
明の一部とする。
【００９３】 この態様に従い利用され得る適当な未分化細胞には、幹細胞、例えばＣＤ３４
陽性造血幹細胞があるが、これに限定されるわけではない。
【００９４】 この態様はまた、導入遺伝子の進行的調節発現が望まれる遺伝子治療に有利に
利用され得る。例えば、確実ではあるが可逆的な受胎能調節は、獣医業務および
ヒトにおいて望ましい。上記調節は、１以上の調節配列の制御下で黄体化ホルモ
ン（ＬＨ）拮抗物質または黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）拮抗物質を
コードする合成核酸配列をオートロガス胸管上皮細胞に形質導入することにより
行われ得る。合成核酸は、親核酸の存在コドンを、休止胸管上皮細胞で元の分化
細胞と比べて比較的高い存在量で発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コド
ンと置換することにより製造され得る。一旦形質導入細胞が患者に移植されると
、発現はプロゲストーゲン（progestagen）の経口投与により切断され得、余儀 なく幹細胞の大多数が分化し、拮抗物質の発現が失われる。一旦妊娠が確立され
ると、抑止は、自然に生成されたプロゲストーゲンにより自続式になる。休止お
よびエストロゲン駆動胸部上皮細胞のイソ−ｔＲＮＡ組成は、まず整復乳房形成
術から休止細胞を得、エストロゲンの存在および非存在下において細胞ｔＲＮＡ
組成を測定することにより確立され得る。合成核酸配列は、細胞の生体外電気穿
孔によりオートローガス休止上皮細胞へ導入され得、それに続いて形質導入細胞
は患者へ皮下移植され得る。プロゲストーゲンは、受胎能調節の逆転に対する要
求に応じて投与され得る。
【００９５】 哺乳動物の他の細胞ではなく腫瘍細胞への毒素の標的発現 腫瘍細胞を殺し得る多くの毒素および薬剤は利用可能である。しかしながら、
これらの毒素および薬剤は、一般に分裂中の細胞全てに毒性を示す。それにもか
かわらず、この問題は、腫瘍クローンにおいてイソ受容ｔＲＮＡ組成を確立し、
哺乳動物の正常な分裂細胞と比べると腫瘍クローンにおいて比較的高い存在量で
発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドンを用いて合成毒素遺伝子（例、
リシン遺伝子）または合成抗増殖遺伝子（例、腫瘍サプレッサーｐ５３）を構築
することにより改善され得る。次いで、合成遺伝子を適当な手段により患者に導
入すると、合成遺伝子が腫瘍細胞において選択的に発現する。
【００９６】 別法として、腫瘍で効果的に発現されるとは思われないコドンパターンを用い
る化学療法促進産物遺伝子（すなわち、薬剤耐性遺伝子、例、多剤耐性遺伝子）
も使用され得る。
【００９７】 標的遺伝子治療による体脂肪制御 レプチンは、飽満を制御することが知られているタンパク質である。しかしな
がら、動物データから類推すると、患者に投与するレプチンが多すぎる場合、レ
プチン誘導飢餓が起こり得る。有利には、非活性化脂肪細胞と比べて活性化脂肪
細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する類義コドン
を含むレプチンをコードする合成遺伝子が構築され得る。次いで、合成遺伝子は
、レプチンが非活性化脂肪細胞の場合とは反対に活性化脂肪細胞でのみ実質的に
発現されるように適当な手段により患者に導入され得る。体脂肪代謝回転がレプ
チンにより低減化した食欲の影響下で減少すると、脂肪細胞の代謝活性およびレ
プチン産生がそれに応じて減少する。
【００９８】 細胞周期の段階に対するタンパク質の標的発現 本発明の別の態様では、標的細胞は周期外細胞であり得る。この場合、細胞周
期中細胞で選択的に発現されるのが望ましいタンパク質は、タンパク質に伴う特
定機能の発揮に充分なレベルで親核酸配列から哺乳動物の周期中細胞において発
現可能である。類義コドンは、少なくとも１個の存在コドンに対応するイソ−ｔ
ＲＮＡと比べた場合、周期中細胞と比較して周期外細胞で高存在量であるイソ−
ｔＲＮＡに各々が対応するように選択される。従って、親核酸配列と比べて翻訳
速度が改変された合成核酸配列が製造され、この場合、タンパク質は上記タンパ
ク質に伴う特定機能の発揮に充分なレベルで周期外細胞において発現され得るが
、タンパク質が周期外細胞で発現され、上記機能を発揮することは不可能である
。
【００９９】 ここで使用されている「周期外細胞」の語は、細胞周期から脱し、Ｇ０期に入
った細胞を指す。この段階では、内生遺伝子の転写およびタンパク質翻訳は細胞
周期の相、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期の場合と比べて実質的に低レベルであるこ
とがよく知られている。
【０１００】 「周期中細胞」は、細胞周期の上記相の１つにある細胞を意味する。
【０１０１】 標的細胞または組織におけるイソ−ｔＲＮＡのインビボ発現による標的細胞ま
たは組織でのタンパク質発現 別の態様において、本発明は、タンパク質が標的細胞で選択的に発現され得る
方法であって、１以上のイソ受容ｔＲＮＡをそこで発現させ得る補助核酸配列を
細胞へ導入することによる方法に関する。このｔＲＮＡは、細胞において比較的
高い存在量で発現されることはないが、タンパク質に伴う機能の発揮に充分なレ
ベルに達するまで親核酸配列からのタンパク質の発現について律速的である。こ
の態様では、細胞における補助核酸配列の導入により、上記タンパク質がタンパ
ク質に伴う機能を発揮するのに充分なレベルで発現されるように親核酸配列の翻
訳速度が改変される。
【０１０２】 補助核酸配列を標的細胞または複数のこれらの細胞を含む組織へ導入する段階
は、適当なものであればいかなる手段でも実施され得る。例えば、上記で示した
合成核酸配列の類似導入方法は、上記周期中細胞へ補助核酸配列を送達するのに
使用され得る。
【０１０３】 ウイルス粒子の集合を通常ではさせない細胞におけるウイルス粒子の集合 さらに別の態様において、本発明は、周期中真核生物細胞におけるウイルス粒
子の産生方法に関する。ウイルス粒子は、ウイルス集合に必要な少なくとも１個
のタンパク質を含み、その場合、少なくとも１個のタンパク質は、そこでウイル
ス集合させ得るのに充分なレベルで親核酸配列から細胞において発現されること
はない。この方法は、親核酸配列の少なくとも１個の存在コドンを類義コドンと
置換することにより、少なくとも１個のタンパク質がそこでウイルス集合させ得
るのに充分なレベルで細胞において合成核酸配列から発現され得るように、親核
酸配列と比べて翻訳速度が改変された合成核酸配列を製造することを特徴として
いる。その方法で製造された合成核酸配列は、１以上の調節ヌクレオチド配列に
機能し得るように結合され、次いで細胞またはその前駆細胞へ導入される。それ
に続いて少なくとも１個のタンパク質が、ウイルス粒子の集合に要求される他の
ウイルスタンパク質の存在下で細胞において発現されることにより、ウイルス粒
子が産生する。
【０１０４】 有利には、類義コドンは、存在コドンに対応するイソ−ｔＲＮＡの場合と比べ
細胞において比較的高レベルで発現されるイソ−ｔＲＮＡに対応する。
【０１０５】 周期中細胞は、ウイルスが複製し得るものであればいかなる細胞でもよい。好
適には、周期中細胞は真核生物細胞である。好ましくは、ウイルス粒子製造のた
めの周期中細胞は、インビトロで培養され得る真核生物セルライン、例えばＣＶ
−１細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはスポドプテラ（spodoptera）細胞である。
【０１０６】 好適には、ウイルス粒子の少なくとも１タンパク質は、ウイルスカプシドタン
パク質である。好ましくは、ウイルスカプシドタンパク質は、パピローマウイル
スのＬ１および／またはＬ２タンパク質を含む。
【０１０７】 細胞におけるウイルス粒子の集合に要求される他のウイルスタンパク質は、好
適にはウイルスゲノムの残りを含む別の核酸配列（複数も可）から発現され得る
。パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２を含む少なくとも１タンパク質
の場合、他の上記核酸配列（複数も可）は、好ましくはＬ１および／またはＬ２
をコードするヌクレオチド配列を伴わないパピローマウイルスゲノムを含む。
【０１０８】 本発明のさらに別の態様では、周期中細胞におけるウイルス粒子の製造方法が
提供され、該ウイルス粒子はウイルス粒子の集合に必要な少なくとも１タンパク
質を含むものであり、少なくとも１タンパク質はウイルス集合をさせるのに充分
なレベルでは親核酸配列から上記細胞で発現されず、上記親核酸配列の少なくと
も１個の存在コドンは上記レベルに達するまで上記の少なくとも１タンパク質の
製造に関して律速的である。該方法は、上記の少なくとも１コドンに特異的なイ
ソ受容ｔＲＮＡを発現させ得る核酸配列を上記細胞に導入する段階を含む。
【０１０９】 さらに別の態様において、本発明は、上記方法から得られるウイルス粒子に関
するものである。
【０１１０】 さらに本発明は、本発明の合成核酸配列を含む細胞または組織、または別法と
して本発明方法から製造される細胞または組織を包含する。
【０１１１】 非限定的な下記実施例を通して本発明についてさらに記載する。実施例１ 未分化細胞中における合成Ｌ１およびＬ２タンパク質の発現材料および方法 ウシＰＶ(ＢＰＶ)Ｌ１およびＬ２遺伝子のコドン置換
【０１１２】 野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子の
ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１１３】 野生型Ｌ１(配列番号：１、２)および野生型Ｌ２(配列番号：５、６)遺伝子の
稀なコドンの存在が翻訳を阻害するかを調べるために、記載したとおりの類義置
換を行ない、Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)遺伝子を合成した。
合成配列を構成するために、Ｌ１用に１１対のオリゴヌクレオチドおよびＬ２用
に１０対のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの各対は、後の
クローニングを促進するために組み込まれた制限部位を有する(図１Ａおよび１ Ｂ)。この変性オリゴヌクレオチドを用いて、Ｌ１およびＬ２配列をＰＣＲ(鋳型
としてＢＰＶ１ゲノムを有するプラスミドを使用)で増幅した。増幅したフラグ メントを適切な酵素で切断し、ｐＵＣ１８ベクターと経時的に結合し、ｐＵＣＨ
ＢＬ１およびｐＵＣＨＢＬ２を調製した。合成Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２( 配列番号：７)の配列を決定し、間違いないことを確認し、次いで、ＳＶ４０ori
を含む哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３(Invitrogen)中でサブクローン化し、発
現プラスミドｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２を得た。Ｌ１およ
びＬ２の発現物と元の配列の発現物とを比較するために、野生型Ｌ１(配列番号 ：１)およびＬ２(配列番号：５)遺伝子をｐＣＤＮＡ３ベクター中でクローン化 し、ｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔを得た。
【０１１４】 免疫蛍光検査およびウエスタンブロット染色 免疫ブロットアッセイ用として、６穴プレート中のＣｏｓ-１細胞に、Ｌ１お よびＬ２発現プラスミド ２μgを、リポフェクトアミン(Gibco)を使用して形質 移入した。形質移入から３６時間後、細胞を０.１５Ｍ リン酸緩衝液の０.９％
食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、ＳＤＳ添加液に溶かした。細胞タンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜上にブロ
ットした。Ｌ１およびＬ２タンパク質を、ＢＰＶ１ Ｌ１(ＤＡＫＯ)またはＬ２ 特異的(１７)抗血清を使用する電子化学発光(Amersham, UK)で確認した。免疫蛍
光染色用として、Ｃｏｓ-１細胞を８チャンバースライドで増殖し、プラスミド を形質移入し、固定し、形質移入から３６時間後に８５％エタノールで透過した
。スライドを５％ミルク-ＰＢＳでブロックし、Ｌ１およびＬ２特異的抗血清で プローブし、ＦＩＴＣが結合した抗ウサギ免疫グロブリンＧ(Sigma)を添加した 。ＧＦＰまたはＰＧＦＰプラスミド形質移入細胞用として、細胞を４％緩衝ホル
ムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１５】 ノーザンブロット法, 様々なプラスミドを形質移入したＣｏｓ細胞を、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ ミニキットを使用し供給者の手引きに従い、細胞質または全ＲＮＡを抽出するの
に使用した。簡単に言うと、細胞質ＲＮＡ精製用として、緩衝液ＲＬＮ(５０mＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１４０mＭ ＮａＣｌ、１.５mＭ ＭｇＣｌ2および０.５ ％ＮＰ４０)を、単層細胞に直接加え、細胞を４℃で５分間溶かした。核を遠心 分離で取り除いた後、細胞質ＲＮＡをカラムで精製した。ＲＮＡ抽出物全量用と
して、単層細胞を、キットから補充した緩衝液ＲＬＴを使用して溶かし、ＲＮＡ
をスピンカラムで精製した。精製したＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１.５ ％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡをナイロン膜上にブロットし、(ａ)５'末 端を標識化したＬ１の重量とＨＢＬ１フラグメントの重量が１：１の混合物、( ｂ)５'末端を標識化したＬ２の重量とＨＢＬ２フラグメントの重量が１：１の混
合物、(ｃ)５'末端を標識化したＧＦＰとＰＧＦＰフラグメントの１：１混合物 、または(ｄ)ランダムに標識化したＰＡＧＤＨフラグメント、でプローブした。
このブロットを６５℃で丁寧に洗浄し、３日間Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１１６】結果 パピローマウイルス(ＰＶ)のＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質をコードす
る遺伝子のコドン構成が分化上皮細胞におけるその優先発現に寄与するという仮
設を検証するために、合成ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：
７)遺伝子を調製し、哺乳類遺伝子において優先的に使用されるコドンで、野生 型ＢＰＶ１ Ｌ１およびＬ２配列(真核生物遺伝子としては稀)中に常に存在する コドンを置換した(図１Ａ、１Ｂ)。
【０１１７】 Ｌ１遺伝子について、全２０２塩基の置換は１９６コドンで行なわれるが、コ
ードされたアミノ酸配列に変化はない(図１Ａ)。この合成"ヒト化"ＢＰＶ Ｌ１
遺伝子(配列番号：３)をＨＢＬ１と表わした。同様に修飾したＢＰＶ Ｌ２ 遺伝
子(配列番号：７)をＨＢＬ２と表わし、３０３塩基を変え、あまり頻繁には使わ
れない２９０コドンを、対応する優先的に使われるコドンで置換した。合成ＨＢ
Ｌ１(配列番号：３)およびＨＢＬ２(配列番号：７)遺伝子を使用し、ｐＣＤＮＡ
３に基づく２つの真核生物発現プラスミドを作成し、ｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ１およ びｐＣＤＮＡ/ＨＢＬ２と表わした。野生型ＢＰＶ１ Ｌ１(配列番号：１)および
ＢＰＶ１ Ｌ２(配列番号：５)遺伝子で構築された同類の発現プラスミドを、ｐ ＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ１ｗｔおよびｐＣＤＮＡ/ＢＰＶＬ２ｗｔと表わした。これら
の各プラスミドにおいて、ＳＶ４０oriがＣｏｓ-１細胞中の複製を可能にし、Ｌ
１またはＬ２遺伝子を強力構成ＣＭＶプロモーターで発現させた。
【０１１８】 合成ヒト化および野生型のＢＰＶ１ Ｌ１およびＢＰＶ１ Ｌ２遺伝子の発現を
比較するために、それぞれ上述のＬ１およびＬ２プラスミドを形質移入したＣｏ
ｓ-１細胞を分離した。形質移入した細胞を、形質移入から３６時間後の免疫蛍 光検査で、Ｌ１(配列番号：２、４)またはＬ２(配列番号：６、８)タンパク質の
発現を分析した(図２Ａおよび３Ａ)。合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)またはＬ２
遺伝子を含むｐＣＤＮＡ３発現プラスミドを形質移入した細胞では、たくさんの
該当するタンパク質の産出を観察できた。しかし野生型プラスミドＬ１(配列番 号：１)またはＬ２(配列番号：５)配列の発現プラスミドを形質移入した細胞で は、Ｌ１またはＬ２タンパク質の産出を検出できなかった(図２Ａおよび３Ａ、 Ｌ１およびＬ２タンパク質の核染色を参照)。異なるＬ１およびＬ２構成の発現 を厳密に比較するために、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現を野生型または合成ヒ
ト化ＢＰＶ１Ｌ１またはＬ２ ｐＣＤＮＡ３発現構造を形質移入したＣｏｓ-１ 細胞中、免疫ブロットで評価した。たくさんの免疫反応性Ｌ１およびＬ２タンパ
ク質が、合成ヒト化Ｌ１(配列番号：３)およびＬ２(配列番号：７)配列から発現
したが、野生型Ｌ１およびＬ２配列(配列番号：１、５)からは、Ｌ１またはＬ２
タンパク質は発現しなかった。
【０１１９】 コドン変化により生じたＬ１およびＬ２ ｍＲＮＡの一次配列変化が対応メッ セージの定常状態の発現にも影響を及ぼすかどうかを確認するために、ｍＲＮＡ
を様々なキャプシドタンパク質遺伝子構築物を形質移入したＣｏｓ-１細胞で調 製した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用して、野生型Ｌ１ ｍＲＮＡより修飾 したものの方が２〜３倍高いことを、ノーザンブロットで確認した。野生型およ
び修飾型Ｌ２ ｍＲＮＡの同様の段階が、形質移入細胞の細胞質で見られた(図２
Ｃおよび３Ｃ)。Ｌ１またはＬ２ ｍＲＮＡの任意のユニット毎で発現したＬ１ま
たはＬ２タンパク質は、ヒト化遺伝子構築物によるもののほうが天然遺伝子構築
物のものより少なくとも１００倍高い。
【０１２０】実施例２ インビトロでのパピローマウイルス後期タンパク質翻訳材料および方法 インビトロ翻訳アッセイ
【０１２１】 各プラスミド１mgを、35Ｓ-メチオニン(Amersham) ２０μＣｉおよびＴ７結合
ウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽溶解物(Promega) ４０μLとともにインキュ ベートした。３０℃で翻訳を行ない、ＳＤＳ添加液を加えて停止させた。このＬ
１タンパク質を１０％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オー トラジオグラフィーで確認した。
【０１２２】 アミノアシル-ｔＲＮＡの調製 ２.５×１０-4 Ｍ ｔＲＮＡ(Boehringer)を、１０mＭ トリス-アセテート(ｐ Ｈ.７.８)、４４mＭ ＫＣｌ、１２mＭ ＭｇＣｌ2、９mＭ メルカプトエタノール
、３８mＭ ＡＴＰ、０.２５mＭ ＧＴＰ、および７μLウサギ網状赤血球抽出物を
含む反応液 ２０μlに加えた。この反応を２５℃で２０分間行ない、次いで反応
物にＨ2Ｏ ３０μLを加えて、ｔＲＮＡを１×１０-4に希釈した。このアミノア シル-ｔＲＮＡを一定量に分け、−７０℃で貯蔵した。
【０１２３】結果 野生型ＢＰＶ Ｌ１およびＬ２遺伝子の主要な制限がシステム中で翻訳される と思われたので、この制限が遺伝子翻訳について適当なｔＲＮＡ種の利用性の制
限を示すかどうかを調べた。無処置細胞内での合成遺伝子の一過性発現を多くの
ファクターで調節し得るので、ウサギ網状赤血球可溶化液(ＲＲＬ)またはコムギ
胚芽可溶化液を使用する細胞が存在しないシステムで、我々の仮説を試験した。
野生型または合成ヒト化ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子を発現する同量のプラスミドを35 Ｓ-メチオニンの存在下で、ＲＲＬ転写/翻訳システムと結合したＴ７-ＤＮＡポ リメラーゼに加えた。２０分後、翻訳されたタンパク質をＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。修飾Ｌ１遺
伝子の効率よい翻訳を観察できたが(図４、一番上の区画、２レーン)、野生型Ｂ
ＰＶ１ Ｌ１配列の翻訳は、弱い５５kＤａ Ｌ１帯域をもたらしたにすぎなかっ た(図４、上方区画、２レーン)。野生型配列をＲＲＬ中の翻訳で最大限に活用で
きないが、野生型Ｌ１配列に存在する"稀な"コドンと競合する細胞質のｍＲＮＡ
種がないので、いくらかの翻訳は起こる、と判断した。上述のデータは、野生型
および合成ヒト化Ｌ１遺伝子の翻訳効率の違いは、野生型遺伝子に存在する稀な
コドンの翻訳を必要とするｔＲＮＡの制限された有効性と、因果関係があること
を示唆する。それゆえに、インビトロ翻訳システムに過剰量のｔＲＮＡを加える
と、野生型Ｌ１遺伝子の翻訳の阻害を克服できると考えた。この問題に取り組む
ために、酵母の１０-5Ｍ アミノアシル-ｔＲＮＡをＲＲＬ翻訳システム中に加え
、Ｌ１タンパク質合成を評価した。外因性ｔＲＮＡの導入は野生型Ｌ１配列の翻
訳で劇的な改良をもたらし、合成ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３)でみられるもの
に匹敵するＬ１タンパク質の収量が得られた(図４、一番上の区画)。野生型Ｌ１
遺伝子(配列番号：１)のアミノアシル−ｔＲＮＡによる翻訳の増強は量依存的で
あり、１０-5Ｍ ｔＲＮＡで最適効率が得られた。外因性ｔＲＮＡの添加は野生 型Ｌ１遺伝子配列(配列番号：１)から翻訳されるＬ１タンパク質の収量を向上さ
せるので、野生型およびヒト化Ｌ１ ｍＲＮＡの翻訳の速さを評価した。２分毎 に、翻訳混合物からサンプルを収集し、８分から始めた。野生型配列(配列番号 ：１)からのＬ１の翻訳(配列番号：２、４)は、ヒト化Ｌ１配列(配列番号：３) のものよりかなり遅く(図４、下方パネル)、この翻訳遅延は市販の酵母ｔＲＮＡ
による外因性ｔＲＮＡの添加によって完全に打ち消し得る。酵母ｔＲＮＡを上述
の分析で選択したのは、酵母でのコドン使用がパピローマウイルスと似ているか
らである(表１)。外因性ｔＲＮＡの添加は、ヒト化Ｌ１遺伝子(配列番号：３)の
翻訳を有意に向上させることはなかったが、この配列のウサギ網状赤血球翻訳機
構用のコドン使用に関して最適化することを示す(図４、下方パネル)。分離実験
で、ｗｔ Ｌ１翻訳もまた肝臓ｔＲＮＡ(図４)によって高められ、ウシ皮膚表皮 から抽出されたｔＲＮＡによっても高められることを確立した(データ表示せず)
（おそらく分化および未分化の細胞由来のｔＲＮＡ混合物を構成する）
【０１２４】実施例３ 野生型Ｌ１の翻訳は、小麦胚芽抽出物において効率的である。 tＲＮＡの利用性は野生型ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子（配列番号１）の発現の決定要
素であるという我々の仮説をさらに試験するために、全く異なった組のtＲＮＡ が利用できるであろう細胞種においてＬ１の翻訳を試験した。小麦胚芽の翻訳系
では、野生型Ｌ１のmＲＮＡがヒト化Ｌ１のmＲＮＡと同じぐらい効率的に翻訳さ
れ、外因性アミノアシル−tＲＮＡの添加は、野生型配列またはヒト化配列のい ずれの翻訳効率も改善しなかった（図４の下のパネル）。このことは、小麦胚芽
には、ＲＲＬにおける野生型Ｌ１配列の翻訳を制限して、効率的なＬ１の翻訳を
可能とするtＲＮＡが十分あることを示した。
【０１２５】実施例４ パピローマウイルスのプロモーター由来の未分化細胞において、修飾された後期
遺伝子を発現させることができる。
【０１２６】 上に提示したデータは、試験系において、翻訳がＢＰＶ１キャプシドタンパク
質の製造を制限していることを示すが、これらの実験は、遺伝子を強力なＣＭＶ
プロモーターにより幾らか操作したので、ＢＰＶゲノムからのウイルス後期遺伝
子の転写に関して実際には代表的ではない系で行った。確かめようとしたのは、
天然のＢＰＶ１プロモーターから転写されるとすれば、合成のヒト化ＢＰＶキャ
プシドタンパク質のmＲＮＡが野生型のmＲＮＡより効率的に翻訳されるかどうか
であった。このことは、翻訳が実際に未分化細胞において天然の潜在性後期遺伝
子プロモーターから操作されるＢＰＶ１後期遺伝子の発現に関する制限因子の１
つであるかどうかを確かめたことになる。ＢＰＶゲノムをＢamＨＩ／ＨindIIIで
nt ４４５０および６９５８にて切断して、元のＬ１(nt ４１８６−５５９５)お
よびＬ２(５０６８−７０９５)のＯＲＦを除去した。真核細胞におけるプラスミ
ド複製を可能とするＳＶ４０ ori配列を含む合成のヒト化Ｌ２遺伝子（配列番号
７）を、Ｌ１／Ｌ２ ＯＲＦ配列を欠くＢＰＶゲノムに挿入した。このプラスミ ド（図５Ａ）をpＣＩＣＲ１と名付けた。同様のプラスミドを合成のヒト化Ｌ２ よりむしろ野生型（配列番号５）で構築して、pＣＩＣＲ２と名付けた。これら のプラスミドでＣos−１細胞をトランスフェクトして、Ｌ２タンパク質の発現を
トランスフェクトした細胞の免疫蛍光により試験した。天然のＢＰＶ１プロモー
ターで操作した合成のヒト化Ｌ２（配列番号７）は効率的に発現されたが、同様
の構築物から操作された野生型Ｌ２配列（配列番号５）は免疫反応性Ｌ２タンパ
ク質（配列番号６、８）を全く製造しなかった（図５Ｂ）。未分化細胞は、ヒト
化Ｌ２遺伝子（配列番号７）の発現を裏付けたが、潜在性後期ＢＰＶプロモータ
ーから発現される野生型Ｌ２（配列番号５）の発現は裏付けなかったので、その
結果は、ＣＭＶプロモーターを使用しての実験から、我々の早期の観察結果を確
認した。しかしながら、ここで試験したプラスミドは、ＳＶ４０ oriを含み、Ｃ
os細胞においてＤＮＡを複製するよう設計された。ＢＰＶ１ Ｌ２プラスミドの 複製数の増大またはＳＶ４０ oriの転写促進活性は、感染した皮膚と比較した場
合、この実験系におけるＬ２の発現効率の増大を幾らか説明することができるか
もしれない。しかしながら、ＣＭＶプロモーターの構築物で見られる天然の遺伝
子とヒト化遺伝子との間の発現における著しい相違は、天然のプロモーターでも
観察される。
【０１２７】実施例５ パピローマウイルスの好ましいコドンの置換は、未分化細胞においてパピローマ
ウイルス以外の遺伝子の翻訳を妨げるが、転写は妨げない。
【０１２８】材料および方法 gfp遺伝子におけるコドン置換 パピローマウイルスの好ましいコドン(ＰＧＦＰ)を使用して、修飾されたgfp 遺伝子（配列番号１１）を構築するために、６対のオリゴヌクレオチドを合成し
た。オリゴヌクレオチドの対は各々、組込まれた制限部位を有しており、ヒト化
gfp遺伝子（配列番号９）(ＧＩＢＣＯ)を鋳型として使用して、gfpを増幅するた
めに使用した。ＰＣＲフラグメントをpＵＣ１８ベクターに連結させて、pＵＣＰ
ＧＦＰを製造した。ＰＧＦＰ遺伝子を配列決定して、ＣＭＶプロモーターの下に
、同じ哺乳動物の発現ベクターであるpＣＤＮＡ３のＢamＨＩ部位へとクローン 化した。ヒト化ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図１Ｃに示す。
Ｐgfp遺伝子（配列番号１１）を製造するために、野生型gfp遺伝子（配列番号９
）へと導入する変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの上部に示す。
【０１２９】結果 コドン使用が哺乳動物の細胞における遺伝子発現を変えることができることを
さらに確認するために、真核細胞における最適な発現のために修飾した合成のgf
p遺伝子でのさらなる変異体をつくった(Ｚolotukhinら，１９９６，Ｊ. Ｖirol.
７０：４６４６−４６５４)。この変異体では、真核細胞での発現に最適化した
コドンを、パピローマウイルスの後期遺伝子において優先的に使用されるコドン
で代替した。培養細胞において高レベルの蛍光タンパク質を発現するヒト化gfp 遺伝子（配列番号９）における２４０のコドンのうち、１５６を、対応するパピ
ローマウイルスの後期遺伝子の好ましいコドンに変えて、Ｐgfpと名付ける新た なgfp遺伝子（配列番号１１）を製造した。未分化細胞におけるＰgfp（配列番号
１１）の発現をヒト化gfp（配列番号９）の発現と比較した。ヒト化gfp（配列番
号９）でトランスフェクトしたＣos−１細胞は、２４時間後に鮮やかな蛍光シグ
ナルを発したが、Ｐgfp（配列番号１１）でトランスフェクトした細胞は、微か な蛍光シグナルしか発しなかった（図６Ａ）。この相違は異なった翻訳効率を反
映したものであることを確認するために、gfpに特異的なmＲＮＡを両方のトラン
スフェクションで試験して、顕著に異なってはいないことを見出した（図６Ｂ）
。従って、コドン使用および対応するtＲＮＡの利用性は、ＰＶ後期遺伝子の発 現に関して観察される制限を明らかに決定し、他の遺伝子におけるコドン使用の
変更は、未分化細胞におけるそれらの発現を同様に妨げる。
【０１３０】実施例６ パピローマウイルスの好ましいコドンを含むＰＧＦＰは、分化したマウス表皮
ケラチン細胞においてインビボで効率的に発現される。
【０１３１】材料および方法 遺伝子銃によるマウス皮膚へのプラスミドＤＮＡの送達 製造業者の指示(Ｂio−Ｒad)に従って、ＤＮＡ５０μgをカルシウム沈降によ り金のマイクロ−キャリア２５μgに被覆した。Ｃ５７／blマウス皮膚に、６０ ０psiの圧力にてＤＮＡプラスミドで被覆した金粒子で衝撃を与えた。その皮膚 から連続した切片を取って、粒子分布を調べ、６００psiの圧力により粒子を表 皮中に送達することができることを確認した。
【０１３２】結果 マウスをＰＧＦＰ ＤＮＡプラスミドが付着した金ビースで撃ち、２４時間後 、皮膚試料をＤＮＡの送達部位から切り取って、ＧＦＰタンパク質（配列番号１
０、１２）の発現に関して試験した。蛍光の大部分が上部表皮ケラチン細胞層に
おいて検出され、これは分化した上皮を表し、未分化の基底細胞では見られなか
った。これとは対照的に、ヒト化ＧＦＰプラスミドで撃った皮膚切片は、表皮全
体にランダムに分布した細胞において蛍光を示した（図７）。ＧＦＰ陽性細胞が
ＰＧＦＰ（配列番号１１）接種マウス皮膚およびＧＦＰ（配列番号９）接種マウ
ス皮膚の両方において稀であったが、ＰＧＦＰ試料（配列番号１１）中では分化
した層でのみ蛍光が観察され、一方、ＧＦＰ（配列番号９）接種マウス皮膚では
表皮の至る所で蛍光が観察された。この結果は、パピローマウイルスの好ましい
コドンの使用が、上皮分化に依存する方法で発現されるタンパク質をもたらすこ
とを確認した。
【０１３３】実施例７ 培養細胞への酵母tＲＮＡおよび野生型Ｌ１遺伝子のマイクロインジェクション (酵母がそれ自身の遺伝子に関してパピローマウイルスで観察されるコドンと 同様の組のコドンを使用する場合に)酵母tＲＮＡが野生型ＢＰＶ１ Ｌ１（配列 番号１）の発現を促進することができるかどうかを試験するために、tＲＮＡ(２
mg／ml)(精製した酵母tＲＮＡ(Ｂoehringer Ｍannheim)またはウシ肝臓tＲＮＡ −対照)およびＢＰＶ Ｌ１ ＤＮＡ(２μg／ml)を含む混合物２plをＣＶ−１細胞
に注入することができる(ＬuおよびＣampisi，１９９２，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad.
Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. ８９ ３８８９−３８９３)。次いで、注入した細胞を３７℃ で４８時間培養し、ＢＰＶ Ｌ１に特異的な抗体を使用する標準的な免疫蛍光法 により、Ｌ１遺伝子の発現に関して試験して、ＦＡＣＳ分析により定量すること
ができる(Ｑiら １９９６，Ｖirology ２１６ ３５−４５)。
【０１３４】実施例８ ＨＰＶウイルス粒子を連続的に製造することができるセルラインの確証 感染性ＰＶを製造するために、上皮ラフト培養系(Ｄollardら １９９２，Ｇen
es Ｄev ６ １１３１−１１４２)、およびＢＰＶ−１エピソームＤＮＡを含むセ
ルラインが含まれる様々な方法を試みて、ＢＰＶ−１ Ｌ１／Ｌ２の組換えワク シニアで感染させる(Ｚhouら １９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６
８)か、またはＳＦＶ ＲＮＡでトランスフェクトした(Ｒodenら １９９６，Ｊ.
Ｖirol. ７０ ５８７５−５８８３)。粒子の収率は、各々の場合において低い。
我々の発見を実施に移す場合、合成のＢＰＶ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺 伝子（配列番号７）(実施例１に記載した)を使用して、ＢＰＶ−１エピソームＤ
ＮＡを含むセルラインにおいて感染性ＢＰＶを製造することができる。ＢＰＶ−
１エピソームＤＮＡを含む線維芽細胞セルライン(ＣＯＮ／ＢＰＶ)(Ｚhouら １ ９９３，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ７４ ７６３−７６８)を、ＣＭＶプロモーターの制
御下での合成のＢＰＶ−１ Ｌ１（配列番号３）およびＬ２遺伝子（配列番号７ ）のトランスフェクションに使用することができる。次いで、ＢＰＶ粒子を細胞
ライゼートから精製して、精製した粒子をＢＰＶ−１ゲノムの存在に関して試験
することができる。リポフェクトアミン(ＢＲＬ)でのトランスフェクション、お
よびトランスフェクトした細胞のＧ４１８選択といったような標準的な方法を利
用して、ＢＰＶ−１エピソームＤＮＡのバックグラウンドでヒト化Ｌ１（配列番
号３）およびＬ２（配列番号７）を発現する適当なトランスフェクタントを生成
することができる。ウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ１またはウサギ抗−ＢＰＶ Ｌ２ポリク
ローナル抗体を使用して、Ｌ１およびＬ２タンパク質発現の試験を行うことがで
きる。次いで、我々の公表した方法(Ｚhouら １９９５，Ｖirology ２１４ １６
７−１７６)を使用して、ＢＰＶ粒子を精製することができ、電子顕微鏡法およ びＤＮＡブロッティング法により特性決定することができる。培養細胞から単離
したＢＰＶ粒子の感染性は、Ｃ１２７線維芽細胞を使用するフォーカス形成アッ
セイで試験することができる。
【０１３５】実施例９ 組織からtＲＮＡを抽出して測定する方法 組織(１００ｇ)を、水で飽和したフェノール(Ｍallinckrodt，分析用試薬，８
８％)(１５：３)１５０ml、および１.０Ｍ ＮaＣl １５０ml、０.１Ｍ トリス−
クロリド緩衝液(pＨ ７.５)中の０.００５Ｍ ＥＤＴＡと共に、ワーリングブレ ンダーでホモジナイズする。ホモジネートを国際臨床遠心機での最高速度で１０
分間遠心して、上層を慎重にデカントして分離した。この水層に、９５％ エタ ノール３体積を加えた。その結果得られた沈殿を国際臨床遠心機での最高速度で
遠心沈降させて、０.１Ｍ トリス／クロリド緩衝液(pＨ ７.５)２５０mlに再び 縣濁させた。この溶液を、冷たい０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５) で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース２ｇのカラム(２×１０cm)に加え
た(１５−２０滴／分の流速)。次いで、カラムをトリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５)１Ｌで洗浄して、ＲＮＡを０.１Ｍ トリス−クロリド緩衝液(pＨ ７.５) 中の１.０Ｍ ＮaＣlで溶出した。ＮaＣl溶液の最初の１０mlを「ホールド−アッ
プ」として捨てた。次いで、溶出物の光学濃度が２６０nmで３未満となるまで、
十分な塩溶液(６０−８０ml)を集めた。溶液を、水で飽和した等体積のフェノー
ルで２回抽出して、エーテルで２回抽出した。ＲＮＡを含む水溶液に、９５％ エタノール３体積を加えて、その溶液ワグ(wag)を冷たい状態で一晩放置した。 沈殿を遠心沈降させ、まず最初に８０％ エタノールで洗浄した後、９５％ エタ
ノールで２回洗浄して、減圧下に乾燥させた。可溶性ＲＮＡ約６０mgをラット肝
臓１００ｇロットから得た。
【０１３６】 tＲＮＡの定量 次のナイロン膜を使用する：Ｂiodine ＡおよびＢ(ＰＡＬＬ)。ドットブロッ トの調製のために、１５％ ホルムアルデヒド１−５μl中、tＲＮＡ試料(１pg〜
５ng)を６０℃で１５分間変性させる。１０ｘＳＳＣ(ＳＳＣは、ＮaＣl ０.３Ｍ
、クエン酸三ナトリウム ０.０３Ｍである)。試料を適用する前に、脱イオン水 に１５分間浸漬して、２枚の３ＭＭ Ｗhatman紙の間で少し乾燥させておいた膜 上に、試料を１μlのアリコートでスポットする。tＲＮＡを(紫外線照射(紫外線
ランプを２０cmの距離にて２５４nmおよび１００Ｗの強度で使用して１０mm)に より膜に)共有結合で固定して、その膜を８０℃で２−３時間焼き付ける。
【０１３７】 tＲＮＡのＡ５４−Ａ７３配列に相補的な、５'末端を標識した合成のデオキシ
リボオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション実験のプローブとして使用す
る。５' ＯＨ'を末端とするプローブの直接リン酸化により、オリゴヌクレオチ ドの標識化を行う。
【０１３８】 ハイブリダイゼーション実験のために、５０％ 脱イオン化ホルムアミド、５ ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、０.０４％ フィコール、０.０４％ ポリビニルピロリ ドン、および２５０μl／mlの音波処理したサケ精子ＤＮＡ中、膜１００cm2あた
り緩衝液５mlを使用して、ＵＶ照射した膜をまず最初に５０℃で５時間予めイン
キュベートしておく。最後に、標識化プローブを加えた上の溶液(２.５ml／１０
０cm2)中、ハイブリダイゼーションを５０℃で一晩行う。ハイブリダイゼーショ
ン後、その膜を、２ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中、室温で５分間２回洗浄し、２
ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中、６０℃で３０分間２回洗浄し、最後に０.１ｘＳＳＣ
、０.１％ ＳＤＳ中、室温で３０分間洗浄する。ハイブリダイズしたプローブを
検出するために、膜を増感紙と共にＦuji ＸＲフィルムに７０℃で１６時間暴露
する。
【０１３９】 tＲＮＡプローブの配列 tＲＮＡプローブの配列は、次の通りである： ＡlaGCA：５'−ＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＴ（配列番号１３） ＡrgCGA：５'−ＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１４） ＡsnAAC：５'−ＣＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１５） ＡspGAC：５'−ＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴ（配列番号１６） ＣsyTGC：５'−ＡＡＧＴＣＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＴ（配列番号１７） ＧluGAA：５'−ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号１８） ＧlnCAA：５'−ＣＴＡＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１９） ＧlyGGA：５'−ＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴ（配列番号２０） ＨisCAC：５'−ＴＧＣＣＧＴＧＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１） ＩleATC：５'−ＴＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＣＴＴ（配列番号２２） ＬeuCTA：５'−ＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴ（配列番号２３） ＬeuCTT：５'−ＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２４） ＬysAAA：５'−ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡ（配列番号２５） ＬysAAG：５'−ＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号２６） Ｍetelong ５'−ＴＡＧＴＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２７） ＰheTTC：５'−ＴＧＴＴＴＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＡＴ（配列番号２８） ＰroCCA：５'−ＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡ（配列番号２９） ＰroCCI：５'−ＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＧＧＧＡＴＴＴ（配列番号３０） ＳerAGC：５'−ＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＧ（配列番号３１） ＴhrACA：５'−ＴＧＴＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧ（配列番号３２） ＴyrTAC：５'−ＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号３３） ＶalGTA：５'−ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号３４）
【０１４０】実施例１０ 未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ種 の相対存在量の比較
【０１４１】材料および方法 表皮細胞の単離 ２日齢のマウスを屠殺して、皮膚を剥いだ。皮膚を０.２５％ トリプシン Ｐ ＢＳで４℃にて一晩消化した。鉗子を使用して、表皮を真皮から分離して、１０
％ ＦＣＳ ＤＭＥＭ媒体中、鋏で切り刻んだ。まず最初に、細胞縣濁液を１mmの
ナイロンネットに通して濾過した後、０.２mmのナイロンネットに通して濾過し た。次いで、細胞縣濁液をペレット化して、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４２】 密度勾配遠心分離法 表皮ケラチン細胞を３０％ パーコールに再び縣濁させて、不連続のパーコー ルグラジエント(１.０８５、１.０７５および１.０５０ｇ／ml)中、１２００× ｇで室温にて２５分間遠心分離することにより分離した。次いで、その細胞をＰ
ＢＳで洗浄して、tＲＮＡを抽出するために使用した。
【０１４３】 tＲＮＡの精製 細胞を溶解緩衝液(０.２Ｍ ＮaＯＨ、１％ ＳＤＳ)５mlに室温で１０分間溶解
した。そのライゼートを３.０Ｍ 酢酸カリウム(pＨ ５.５)５mlで中和した。遠 心分離後、上清を１００mＭ トリス(pＨ ７.５)３体積で希釈して、１００mＭ トリス(pＨ ７.５)で平衡化したＤＥＡＥカラムに加えた。tＲＮＡを含む水溶液
にイソプロパノールを等量加えて、その溶液を４℃で一晩放置した。tＲＮＡを 遠心沈降させて、７５％ エタノールで洗浄した後、ＲＮアーゼを含まない水に 溶解した。
【０１４４】 tＲＮＡのブロッティング ホルムアルデヒド４μlおよび２０ｘＳＳＣ ５μl中、１μl中の各々のtＲＮ Ａ試料１０ngを６０℃で１５分間変性させた。帯電したナイロン膜(Ａmersham) 上に、試料を１μlのアリコートでスポットし、tＲＮＡをＵＶで固定して、32Ｐ
−オリゴヌクレオチドで探査した。
【０１４５】結果 未分化の表皮ケラチン細胞および分化した表皮ケラチン細胞におけるtＲＮＡ 種の存在量の比較は、幾つかのtＲＮＡ集団のレベルが劇的に変化することを示 した。例えば、ＡlaGCA、ＬeuCTT、ＬeuCTAに特異的なtＲＮＡのレベルは、分化
した細胞において増大したが、ＡrgCGA、ＰroCCI、ＡsnAAGに特異的なtＲＮＡは
、未分化の表皮ケラチン細胞においてより豊富であった(表２を参照)。
【０１４６】 一般的考察 本明細書において、本発明者は、哺乳動物細胞中の遺伝子翻訳の効率について
の決定要素がそのコドン組成であることを確証している。このことは、原核生物
の遺伝子を真核細胞中で発現したときに普通一般に観察される（Smith, S. W.,
1996, biotechnol., Prog. 12:417-422）。本発明者はまた、パピローマウイル スのカプシド遺伝子をコードするｍＲＮＡが培養の真核細胞中で効果的に翻訳さ
れないこと、その理由は明らかにｔＲＮＡの利用性が翻訳にとって速度制限的で
あること、また培養中の真核細胞中のＰＶ後期遺伝子翻訳に対する遮断を、後期
遺伝子のコドン使用を哺乳動物遺伝子の共通配列に適合させるように変換するか
、または外因性のｔＲＮＡを供給して、克服できることを明確にした。ｍＲＮＡ
二次構造あるいはタンパク質結合への変異（Sokolowaki, et al., 1998, J. Vir
ol. 72:1504-1515)が、ＰＶカプシド遺伝子の一次配列への変化の結果として、 培養細胞中の天然および修飾ＰＶカプシド遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の効率に観察さ
れた差異をもたらしたのであろう。しかしながら、天然の未修飾ｍＲＮA（ｔＲ ＮＡを哺乳動物インビトロ翻訳系に加えた後に観察され、植物翻訳系では観察さ
れない）の翻訳が増強されたことは、ｔＲＮＡ利用性が哺乳動物の細胞中の天然
遺伝子の翻訳について速度制限的であるという論拠を強化する。重要なｔＲＮＡ
の不足は、翻訳の未完成ペプチドまたは未成熟ペプチドの末端の伸張の遅れをも
たらす（Oba, et. al., 1991, Biochimie 73:1109-1112）。伸張の遅れはＰＶ後
期遺伝子にとって重大な問題のようである。ＰＶゲノムにおけるコドン使用の分
析結果からすると、ＰＶ後期遺伝子は、哺乳動物の細胞ではまれにしか使用され
ないようなコドンを多く使用する。例えば、ＰＶは、ＵＵＡをロイシンに、ＣＧ
Ｕをアルギニンに、ＡＣＡをトレオニンに、ＡＵＡをイソロイシンにしばしば使
用するのに対して、これらのコドンが哺乳動物遺伝子に使用されるのはごくまれ
である。これとは対照的に、パピローマウイルス後期遺伝子を酵母中で効果的に
発現させることができる（Jansen, et al., 1995, Vaccine 13:1509-1514）(Sas
agawa, et al., 1995, Virology 206:126-135)。そして、酵母およびパピローマ
ウイルス遺伝子のコドン組成は類似している（表１）。明らかな例外は、PV Ｌ
１遺伝子が組換型バキュロウイルスを用いて昆虫の細胞中で（Kirubauer, et al
., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12180-12184）、また組換型ワクシニ
アを用いて種々の哺乳動物の未分化細胞中で（Zhon, et al., 1991, Virology 1
85:251-257）効果的に発現されることである。ワクシニアまたはバキュロウイル
スによる感染が、細胞タンパク質合成を低く調節するように、これらの状況にお
いてＬ１カプシドタンパク質の効果的な発現が起こるのは、ウイルス感染細胞中
において細胞性mRNAが少ししか利用されず、稀なtRNAについてＬ1 ｍＲＮＡと 競合するためである。
【０１４７】 コドン組成は、同一組織の分化のそれぞれ違った段階における遺伝子発現の一
般的な決定要素となるであろう。遺伝暗号は本質的には普遍的であるが、違った
生物が相異した遺伝子のコドン組成を示す。ところが他方で、遺伝子のコドン組
成は、それぞれの生物内のすべての遺伝子と比較的類似し、その生物のイソ−ｔ
RNA集団と適合する傾向にある（Ikemura, T., 1981, J. Mol. Biol. 146:1-21）
。しかしながら、分化細胞および新形成細胞中のtRNA集団は相異しており（Kand
uc, D., 1997, Arch. Biochem. Biophys. 342:1-6; Yang, and Comb, 1968, J.
Mol. Biol. 31:138-142; Yang, and Novelli, 1968, Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 31:534-539）、tRNA集団もまた異なった状況で成長する細胞中で変化し ている(Doi, et al., 1968, J. Baiol. Chem. 243:945-951)。したがって、本発
明者の考えでは、コドン組成およびtRNAの利用性が合わさって遺伝子発現の空間
的および／または時間的調節の原始的なメカニズムが提供される。ウイルス遺伝
子のコドン組成について粗マーカーである多くのｄｓＤＮＡウイルスのＧ＋Ｃ含
有量は、それらウイルスが感染した細胞のＤＮＡにおけるＧ＋Ｃ含有量と著しく
相異している（Strauss, et al., 1995,“Virus Evolution” in Virology (eds
. Fields, B. N. et al.), Lipipincott-Raven, Philadelphia, pp. 153-171） 。したがって、ウイルスは、自らの遺伝子発現プログラムを調節するためにコド
ン組成を利用しつつ、おそらくウイルスがそのゲノムを複製するために使用する
細胞機能を有する未分化細胞中で、ウイルスタンパク質の致死量を発現するのを
避けて、進化してきたのであろう。
【０１４８】 本発明者による観察が単一組織中における遺伝子翻訳調節の明かに新しいメカ
ニズムを説明するように、そのメカニズムが以前発表の仮説、すなわち分化上皮
に対するＰＶ後期遺伝子発現制限に関する仮説といかに関連付けられるかを考え
ることは有意義なことである。ＰＶ後期遺伝子の効果的発現が分化上皮において
のみであるとの観察については、多数の解釈が提案されている。後期遺伝子転写
の低下は、分化上皮中のみに発現する転写要因における後期プロモーターからの
転写に依存することを反映し、あるいはウイルスによる後期プロモーター転写の
抑制（Stubenrauch, et al., 1996, J. Virol. 70:119-126）あるいは未分化細 胞中で発現した細胞遺伝子産物に起因するのであろう。ＨＰＶ３１ｂおよびＨＰ
Ｖ５の「後期」プロモーター（Haller, et al., 1995, Virology 214:245-255;
Hummel, et at.,1992, J. Virol. 66:6070-6080)は分化依存的であると説明され
ているが、しかし、通常のフットプリンティング法およびＤＮＡ結合法による分
化ケラチン生成細胞中の転写調節要因に関連する研究から、今までのところまだ
満足できる結果が得られていない。本発明のデータによると、カプシドタンパク
質はＣＭＶプロモーターを基とする発現ベクター（図２）によってトランスフェ
クトされた細胞中のＰＶ Ｌ１およびＬ２ ｍＲＮＡから翻訳されることがなく
、このことは、存在し得るなんらかの転写コントロール機能に加えて、未分化細
胞中のカプシドタンパク質合成に対して転写後遮断の存在を示唆している。５’
スプライスドナー部位に類似した配列がＬ１またはＬ２ ｍＲＮＡ内または非翻
訳メッセージ内に存在し、この配列は、関連する遺伝子の転写に対して阻害的で
ある（Kennedy, et al., 1991, J. Virol. 65:2093-2097）（Furth, et al., 19
94, Mol. Cell. Biol. 14:5278-5289）。Ｌ１またはＬ2 ｍＲＮＡ中の他のAUの
多い配列は、ｍＲＮＡ分解を促進する（Sokolowski, et al., 1997, Oncogene 1
5:2303-2319）。未分化細胞中でのＬ１およびＬ２発現を阻害するこれらのメカ ニズムは、分化上皮において不活性であることを示していないし、この組織中に
おける後期遺伝子の翻訳の成功をやはり説明していない。
【０１４９】 Ｌ１コード配列中の阻害ＲＮＡ配列が本明細書中に記述の実験において採用し
た系統的コドン置換によって機能化され得なかったという理由から、および非翻
訳阻害配列が本発明者の実施した検査項目に含まれなかったという理由から、培
養の哺乳動物細胞中でのＰＶ後期遺伝子発現の抑制における阻害配列およびコド
ンの誤対合のそれぞれの役割は確定できなかった。しかしながら、ＲＮＡ分解を
促進あるいは翻訳を抑制する調節配列は、核または細胞質のタンパク質との相互
作用を通じて働くと推定されており(Sokolowski, et al., 1998, J. Virol. 72:
1504-1515)、天然配列Ｌ1 ｍＲＮＡの非効率的な翻訳が、無核細胞由来の細胞 なしの翻訳系において観察された。このことは、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成が
ＰＶ後期遺伝子翻訳の調節になんらかの役割を果たしていることを示す。
【０１５０】 コドン組成がＰＶカプシド遺伝子発現において重要な決定要素であるという仮
説を支えるさらなる証拠を、遺伝子銀行から現在入手できる８４種類のＰＶ Ｌ
１配列の分析結果から集めた。Ｌ１遺伝子のコドン組成および特に稀なコドン使
用頻度は、どの参考資料を調らべても本質的には同じであって（資料未記載）、
パピローマウイルス・ゲノムのＧ＋Ｃ含有量の類似から推測される。ＰＶ Ｌ１
遺伝子はアミノ酸レベルで比較的よく維持され、カプシド・タンパク質機能に対
する抑制から予測されるように、ＰＶ遺伝子型間のアミノ酸相同性は６０〜８０
％を示す。しかしながら、ＰＶ後期遺伝子のコドン組成に対する明白な抑制影響
はなく、本発明者の仮説以上のものでない。後期遺伝子領域は、他の読み枠の中
で、あるいは相補的ＤＮＡ鎖の上のいずれにおいても、他の遺伝子をコードせず
、そして既知のシス作用調節機能を有しないことである。もし、カプシド遺伝子
のコドン組成がＰＶ機能にとって重要でないとすれば、ＰＶの進化的多様性を考
えにいれると、コドン使用のかなりの異質性が予測できるかもしれない（Chan,
et al., 1995, J. Virol, 69:3074-3083）。
【０１５１】 総体的にみれば、本明細書中に概括したデータおよび証明事項から強調される
点は、コドン使用が未分化および分化の上皮細胞中におけるＰＶ後期遺伝子発現
の重要な決定要素であり、この観察結果が一般化できるということである。分化
組織中の発現決定におけるメッセージ不安定性およびコドン誤対合の相対的役割
からして、分化および未分化の上皮において強力な構成プロモーターから発動さ
れたＬ１またはＬ２遺伝子の転写能および翻訳について比較を必要とする。その
ような研究は、形質転換技術あるいは角化細胞ラフト培養のいずれかを利用すれ
ば現に実行可能であろう。
【０１５２】 分化上皮の表層におけるＰＶ Ｌ１またはＬ２遺伝子発現を転写調節するメカ
ニズムが提供されているが（Zeltner et al., 1994, J. Virol. 68:3620; Brown
, et al., 1995, Virology 214:259; Stoler et al., 1992, Hum. Pathol. 23:1
17; Hummel et al., 1995, J. Virol. 69:3381; Haller et al., 1995, Virolog
y 214:245; Barksdale and Baker, 1993, J. Virol. 67:5605）、測定可能なＰ Ｖ後期遺伝子ｍＲＮＡは常に後期タンパク質の産生と関連しているとは限らない
（Zelter, et al., 1994, 後述,; Ozbun and Meyers, 1997, J. Virol. 71:5161
）。本明細書中に記載したデータは、翻訳調節がＰＶ後期遺伝子発現のコントロ
ールに重要な役割を演ずることを示唆している。この観察は、本明細書に記載し
たように、自己再生幹細胞集団における外因性遺伝子の発現の潜在的に有害な結
果を回避しながら、すべての分化組織の特化機能に関連した遺伝子の発現を調節
すること、およびそれらの組織に対し治療遺伝子発現を標的化することに密接な
関係を有する。
【０１５３】 本明細書は、本発明の実施のための好ましい態様を含み、本発明者が見出し、
提供する個々の具体例を記述している。当業者は、本明細書の開示にかんがみ、
本発明の範囲を逸脱することなく、例示した個々の具体例について多数の修飾と
変更をなし得ることを認識するであろう。それらすべての修飾は添付の請求項の
範囲に含まれるものである。
【０１５４】表の説明 表１ ヒト、ウシ、イーストおよびコムギタンパク質のコドン使用データを、刊行結
果(１８)より用いた。ＢＰＶ１データはＧｅｎｂａｎｋデータベースの配列によ
るものである。
【０１５５】 表２ 各イソ受容ｔＲＮＡを、上付き表示の対応コドンと共に上列に表示した。"＋"
はｔＲＮＡの存在量を示し、各"＋"は約１０倍の増加を示す。
【０１５６】 表
【表１】表１ 個々の生物体のコドン使用回数(1/1000)
【０１５７】
【表２】表１の続き
【０１５８】
【表３】表１の続き
【０１５９】
【表４】表１の続き
【０１６０】
【表５】表１の続き
【０１６１】
【表６】 表２ ＫＣが分化し始めると、ｔＲＮＡ集団が変化する
【０１６２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> The University of Queensland <120> NUCLEIC ACID SEQUENCE AND METHOD FOR SELECTIVELY EXPRESSING A PROTEIN IN A TARGET CELL OR TISSUE <130> Selective Expression <140> PCT/AU98/00530 <141> 1998-07-09 <150> PO7765 <151> 1997-07-09 <150> PO9467 <151> 1997-09-11 <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1488 <212> DNA <213> Bovine papillomavirus type 1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1488) <220> <223> L1 open reading frame (wild-type) <400> 1 atg gcg ttg tgg caa caa ggc cag aag ctg tat ctc cct cca acc cct 48 Met Ala Leu Trp Gln Gln Gly Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 gta agc aag gtg ctt tgc agt gaa acc tat gtg caa aga aaa agc att 96 Val Ser Lys Val Leu Cys Ser Glu Thr Tyr Val Gln Arg Lys Ser Ile 20 25 30 ttt tat cat gca gaa acg gag cgc ctg cta act ata gga cat cca tat 144 Phe Tyr His Ala Glu Thr Glu Arg Leu Leu Thr Ile Gly His Pro Tyr 35 40 45 tac cca gtg tct atc ggg gcc aaa act gtt cct aag gtc tct gca aat 192 Tyr Pro Val Ser Ile Gly Ala Lys Thr Val Pro Lys Val Ser Ala Asn 50 55 60 cag tat agg gta ttt aaa ata caa cta cct gat ccc aat caa ttt gca 240 Gln Tyr Arg Val Phe Lys Ile Gln Leu Pro Asp Pro Asn Gln Phe Ala 65 70 75 80 cta cct gac agg act gtt cac aac cca agt aaa gag cgg ctg gtg tgg 288 Leu Pro Asp Arg Thr Val His Asn Pro Ser Lys Glu Arg Leu Val Trp 85 90 95 cca gtc ata ggt gtg cag gtg tcc aga ggg cag cct ctt gga ggt act 336 Pro Val Ile Gly Val Gln Val Ser Arg Gly Gln Pro Leu Gly Gly Thr 100 105 110 gta act ggg cac ccc act ttt aat gct ttg ctt gat gca gaa aat gtg 384 Val Thr Gly His Pro Thr Phe Asn Ala Leu Leu Asp Ala Glu Asn Val 115 120 125 aat aga aaa gtc acc acc caa aca aca gat gac agg aaa caa aca ggc 432 Asn Arg Lys Val Thr Thr Gln Thr Thr Asp Asp Arg Lys Gln Thr Gly 130 135 140 cta gat gct aag caa caa cag att ctg ttg cta ggc tgt acc cct gct 480 Leu Asp Ala Lys Gln Gln Gln Ile Leu Leu Leu Gly Cys Thr Pro Ala 145 150 155 160 gaa ggg gaa tat tgg aca aca gcc cgt cca tgt gtt act gat cgt cta 528 Glu Gly Glu Tyr Trp Thr Thr Ala Arg Pro Cys Val Thr Asp Arg Leu 165 170 175 gaa aat ggc gcc tgc cct cct ctt gaa tta aaa aac aag cac ata gaa 576 Glu Asn Gly Ala Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Lys His Ile Glu 180 185 190 gat ggg gat atg atg gaa att ggg ttt ggt gca gcc aac ttc aaa gaa 624 Asp Gly Asp Met Met Glu Ile Gly Phe Gly Ala Ala Asn Phe Lys Glu 195 200 205 att aat gca agt aaa tca gat cta cct ctt gac att caa aat gag atc 672 Ile Asn Ala Ser Lys Ser Asp Leu Pro Leu Asp Ile Gln Asn Glu Ile 210 215 220 tgc ttg tac cca gac tac ctc aaa atg gct gag gac gct gct ggt aat 720 Cys Leu Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Glu Asp Ala Ala Gly Asn 225 230 235 240 agc atg ttc ttt ttt gca agg aaa gaa cag gtg tat gtt aga cac atc 768 Ser Met Phe Phe Phe Ala Arg Lys Glu Gln Val Tyr Val Arg His Ile 245 250 255 tgg acc aga ggg ggc tcg gag aaa gaa gcc cct acc aca gat ttt tat 816 Trp Thr Arg Gly Gly Ser Glu Lys Glu Ala Pro Thr Thr Asp Phe Tyr 260 265 270 tta aag aat aat aaa ggg gat gcc acc ctt aaa ata ccc agt gtg cat 864 Leu Lys Asn Asn Lys Gly Asp Ala Thr Leu Lys Ile Pro Ser Val His 275 280 285 ttt ggt agt ccc agt ggc tca cta gtc tca act gat aat caa att ttt 912 Phe Gly Ser Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Thr Asp Asn Gln Ile Phe 290 295 300 aat cgg ccc tac tgg cta ttc cgt gcc cag ggc atg aac aat gga att 960 Asn Arg Pro Tyr Trp Leu Phe Arg Ala Gln Gly Met Asn Asn Gly Ile 305 310 315 320 gca tgg aat aat tta ttg ttt tta aca gtg ggg gac aat aca cgt ggt 1008 Ala Trp Asn Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Gly Asp Asn Thr Arg Gly 325 330 335 act aat ctt acc ata agt gta gcc tca gat gga acc cca cta aca gag 1056 Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Ala Ser Asp Gly Thr Pro Leu Thr Glu 340 345 350 tat gat agc tca aaa ttc aat gta tac cat aga cat atg gaa gaa tat 1104 Tyr Asp Ser Ser Lys Phe Asn Val Tyr His Arg His Met Glu Glu Tyr 355 360 365 aag cta gcc ttt ata tta gag cta tgc tct gtg gaa atc aca gct caa 1152 Lys Leu Ala Phe Ile Leu Glu Leu Cys Ser Val Glu Ile Thr Ala Gln 370 375 380 act gtg tca cat ctg caa gga ctt atg ccc tct gtg ctt gaa aat tgg 1200 Thr Val Ser His Leu Gln Gly Leu Met Pro Ser Val Leu Glu Asn Trp 385 390 395 400 gaa ata ggt gtg cag cct cct acc tca tcg ata tta gag gac acc tat 1248 Glu Ile Gly Val Gln Pro Pro Thr Ser Ser Ile Leu Glu Asp Thr Tyr 405 410 415 cgc tat ata gag tct cct gca act aaa tgt gca agc aat gta att cct 1296 Arg Tyr Ile Glu Ser Pro Ala Thr Lys Cys Ala Ser Asn Val Ile Pro 420 425 430 gca aaa gaa gac cct tat gca ggg ttt aag ttt tgg aac ata gat ctt 1344 Ala Lys Glu Asp Pro Tyr Ala Gly Phe Lys Phe Trp Asn Ile Asp Leu 435 440 445 aaa gaa aag ctt tct ttg gac tta gat caa ttt ccc ttg gga aga aga 1392 Lys Glu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Arg 450 455 460 ttt tta gca cag caa ggg gca gga tgt tca act gtg aga aaa cga aga 1440 Phe Leu Ala Gln Gln Gly Ala Gly Cys Ser Thr Val Arg Lys Arg Arg 465 470 475 480 att agc caa aaa act tcc agt aag cct gca aaa aaa aaa aaa aaa taa 1488 Ile Ser Gln Lys Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Lys Lys Lys Lys 485 490 495 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Bovine papillomavirus type 1 <400> 2 Met Ala Leu Trp Gln Gln Gly Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 Val Ser Lys Val Leu Cys Ser Glu Thr Tyr Val Gln Arg Lys Ser Ile 20 25 30 Phe Tyr His Ala Glu Thr Glu Arg Leu Leu Thr Ile Gly His Pro Tyr 35 40 45 Tyr Pro Val Ser Ile Gly Ala Lys Thr Val Pro Lys Val Ser Ala Asn 50 55 60 Gln Tyr Arg Val Phe Lys Ile Gln Leu Pro Asp Pro Asn Gln Phe Ala 65 70 75 80 Leu Pro Asp Arg Thr Val His Asn Pro Ser Lys Glu Arg Leu Val Trp 85 90 95 Pro Val Ile Gly Val Gln Val Ser Arg Gly Gln Pro Leu Gly Gly Thr 100 105 110 Val Thr Gly His Pro Thr Phe Asn Ala Leu Leu Asp Ala Glu Asn Val 115 120 125 Asn Arg Lys Val Thr Thr Gln Thr Thr Asp Asp Arg Lys Gln Thr Gly 130 135 140 Leu Asp Ala Lys Gln Gln Gln Ile Leu Leu Leu Gly Cys Thr Pro Ala 145 150 155 160 Glu Gly Glu Tyr Trp Thr Thr Ala Arg Pro Cys Val Thr Asp Arg Leu 165 170 175 Glu Asn Gly Ala Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Lys His Ile Glu 180 185 190 Asp Gly Asp Met Met Glu Ile Gly Phe Gly Ala Ala Asn Phe Lys Glu 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Lys Ser Asp Leu Pro Leu Asp Ile Gln Asn Glu Ile 210 215 220 Cys Leu Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Glu Asp Ala Ala Gly Asn 225 230 235 240 Ser Met Phe Phe Phe Ala Arg Lys Glu Gln Val Tyr Val Arg His Ile 245 250 255 Trp Thr Arg Gly Gly Ser Glu Lys Glu Ala Pro Thr Thr Asp Phe Tyr 260 265 270 Leu Lys Asn Asn Lys Gly Asp Ala Thr Leu Lys Ile Pro Ser Val His 275 280 285 Phe Gly Ser Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Thr Asp Asn Gln Ile Phe 290 295 300 Asn Arg Pro Tyr Trp Leu Phe Arg Ala Gln Gly Met Asn Asn Gly Ile 305 310 315 320 Ala Trp Asn Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Gly Asp Asn Thr Arg Gly 325 330 335 Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Ala Ser Asp Gly Thr Pro Leu Thr Glu 340 345 350 Tyr Asp Ser Ser Lys Phe Asn Val Tyr His Arg His Met Glu Glu Tyr 355 360 365 Lys Leu Ala Phe Ile Leu Glu Leu Cys Ser Val Glu Ile Thr Ala Gln 370 375 380 Thr Val Ser His Leu Gln Gly Leu Met Pro Ser Val Leu Glu Asn Trp 385 390 395 400 Glu Ile Gly Val Gln Pro Pro Thr Ser Ser Ile Leu Glu Asp Thr Tyr 405 410 415 Arg Tyr Ile Glu Ser Pro Ala Thr Lys Cys Ala Ser Asn Val Ile Pro 420 425 430 Ala Lys Glu Asp Pro Tyr Ala Gly Phe Lys Phe Trp Asn Ile Asp Leu 435 440 445 Lys Glu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Arg 450 455 460 Phe Leu Ala Gln Gln Gly Ala Gly Cys Ser Thr Val Arg Lys Arg Arg 465 470 475 480 Ile Ser Gln Lys Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Lys Lys Lys Lys 485 490 495 <210> 3 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1488) <220> <223> Description of Artificial Sequence: Bovine papillomavirus type 1 L1 open reading frame (humanized) <220> <223> Wild-type codons replaced with synonymous codons used at relatively high frequency by human genes <400> 3 atg gcc ctg tgg cag cag ggc cag aag ctg tac ctg ccc cct acc ccc 48 Met Ala Leu Trp Gln Gln Gly Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 gtg agc aag gtg ctt tgc agt gaa acc tat gtg caa aga aaa agc att 96 Val Ser Lys Val Leu Cys Ser Glu Thr Tyr Val Gln Arg Lys Ser Ile 20 25 30 ttt tat cat gca gaa acg gag 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atc ctg ctg ctg ggc tgt acc cct gct 480 Leu Asp Ala Lys Gln Gln Gln Ile Leu Leu Leu Gly Cys Thr Pro Ala 145 150 155 160 gaa ggg gaa tat tgg aca aca gcc cgt cca tgt gtg acc gac cgt cta 528 Glu Gly Glu Tyr Trp Thr Thr Ala Arg Pro Cys Val Thr Asp Arg Leu 165 170 175 gaa aac ggc gcc tgc cct cct ctg gag ctg aaa aac aag cac atc gaa 576 Glu Asn Gly Ala Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Lys His Ile Glu 180 185 190 gat ggg gat atg atg gaa att ggg ttt ggt gca gcc aac ttc aaa gaa 624 Asp Gly Asp Met Met Glu Ile Gly Phe Gly Ala Ala Asn Phe Lys Glu 195 200 205 att aat gca agt aaa tca gat cta cct ctg gac atc caa aat gag atc 672 Ile Asn Ala Ser Lys Ser Asp Leu Pro Leu Asp Ile Gln Asn Glu Ile 210 215 220 tgc ctg tac ccc gac tac ctg aaa atg gct gag gac gcc gcc ggc aac 720 Cys Leu Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Glu Asp Ala Ala Gly Asn 225 230 235 240 agc atg ttc ttc ttc gcc agg aag gag cag gtg tac gtg aga cac atc 768 Ser Met Phe Phe Phe Ala Arg Lys Glu Gln Val Tyr Val Arg His Ile 245 250 255 tgg acc aga ggc ggc tcc gag aaa gaa gcc cct acc aca gat ttt tat 816 Trp Thr Arg Gly Gly Ser Glu Lys Glu Ala Pro Thr Thr Asp Phe Tyr 260 265 270 ttg aag aac aac aag ggc gac gcc acc ctg aag atc ccc agc gtg cac 864 Leu Lys Asn Asn Lys Gly Asp Ala Thr Leu Lys Ile Pro Ser Val His 275 280 285 ttc ggc agc ccc agc ggc tca cta gtg tcc acc gac aac cag atc ttc 912 Phe Gly Ser Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Thr Asp Asn Gln Ile Phe 290 295 300 aac cgg ccc tac tgg ctg ttc cgc gcc cag ggc atg aac aat gga att 960 Asn Arg Pro Tyr Trp Leu Phe Arg Ala Gln Gly Met Asn Asn Gly Ile 305 310 315 320 gcc tgg aac aac ctg ctg ttc ctg acc gtg ggc gac aac aca cgt ggc 1008 Ala Trp Asn Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Gly Asp Asn Thr Arg Gly 325 330 335 acc aac ctg acc atc agc gtg gcc tcc gat gga acc cca ctg acc gag 1056 Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Ala Ser Asp Gly Thr Pro Leu Thr Glu 340 345 350 tat gat agc tcg aaa ttc aac gtg tac cac aga cac atg gag gag tat 1104 Tyr Asp Ser Ser Lys Phe Asn Val Tyr His Arg His Met Glu Glu Tyr 355 360 365 aag cta gcc ttc atc ctg gag ctg tgc tcc gtg gag atc acc gcc cag 1152 Lys Leu Ala Phe Ile Leu Glu Leu Cys Ser Val Glu Ile Thr Ala Gln 370 375 380 acc gtg tcc cat ctg caa gga ctg atg ccc tcc gtg ctg gag aat tgg 1200 Thr Val Ser His Leu Gln Gly Leu Met Pro Ser Val Leu Glu Asn Trp 385 390 395 400 gag atc ggc gtg cag ccc ccc acc tca tcg atc ttg gag gac acc tac 1248 Glu Ile Gly Val Gln Pro Pro Thr Ser Ser Ile Leu Glu Asp Thr Tyr 405 410 415 cgc tac atc gag tcc ccc gcc acc aag tgt gcc agc aac gtg att cct 1296 Arg Tyr Ile Glu Ser Pro Ala Thr Lys Cys Ala Ser Asn Val Ile Pro 420 425 430 gca aaa gaa gac cct tat gca ggg ttt aag ttc tgg aac atc gac ctg 1344 Ala Lys Glu Asp Pro Tyr Ala Gly Phe Lys Phe Trp Asn Ile Asp Leu 435 440 445 aag gag aag ctg tct ctg gac ctg gat cag ttc ccc ttg ggc aga aga 1392 Lys Glu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Arg 450 455 460 ttt ctg gcc cag cag ggg gcc ggc tgt tcc acc gtg aga aaa cgc agg 1440 Phe Leu Ala Gln Gln Gly Ala Gly Cys Ser Thr Val Arg Lys Arg Arg 465 470 475 480 atc agc cag aag acc tcc agc aag ccc gcc aag aag aag aaa aag taa 1488 Ile Ser Gln Lys Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Lys Lys Lys Lys 485 490 495 <210> 4 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala Leu Trp Gln Gln Gly Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 Val Ser Lys Val Leu Cys Ser Glu Thr Tyr Val Gln Arg Lys Ser Ile 20 25 30 Phe Tyr His Ala Glu Thr Glu Arg Leu Leu Thr Ile Gly His Pro Tyr 35 40 45 Tyr Pro Val Ser Ile Gly Ala Lys Thr Val Pro Lys Val Ser Ala Asn 50 55 60 Gln Tyr Arg Val Phe Lys Ile Gln Leu Pro Asp Pro Asn Gln Phe Ala 65 70 75 80 Leu Pro Asp Arg Thr Val His Asn Pro Ser Lys Glu Arg Leu Val Trp 85 90 95 Pro Val Ile Gly Val Gln Val Ser Arg Gly Gln Pro Leu Gly Gly Thr 100 105 110 Val Thr Gly His Pro Thr Phe Asn Ala Leu Leu Asp Ala Glu Asn Val 115 120 125 Asn Arg Lys Val Thr Thr Gln Thr Thr Asp Asp Arg Lys Gln Thr Gly 130 135 140 Leu Asp Ala Lys Gln Gln Gln Ile Leu Leu Leu Gly Cys Thr Pro Ala 145 150 155 160 Glu Gly Glu Tyr Trp Thr Thr Ala Arg Pro Cys Val Thr Asp Arg Leu 165 170 175 Glu Asn Gly Ala Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Lys His Ile Glu 180 185 190 Asp Gly Asp Met Met Glu Ile Gly Phe Gly Ala Ala Asn Phe Lys Glu 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Lys Ser Asp Leu Pro Leu Asp Ile Gln Asn Glu Ile 210 215 220 Cys Leu Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Glu Asp Ala Ala Gly Asn 225 230 235 240 Ser Met Phe Phe Phe Ala Arg Lys Glu Gln Val Tyr Val Arg His Ile 245 250 255 Trp Thr Arg Gly Gly Ser Glu Lys Glu Ala Pro Thr Thr Asp Phe Tyr 260 265 270 Leu Lys Asn Asn Lys Gly Asp Ala Thr Leu Lys Ile Pro Ser Val His 275 280 285 Phe Gly Ser Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Thr Asp Asn Gln Ile Phe 290 295 300 Asn Arg Pro Tyr Trp Leu Phe Arg Ala Gln Gly Met Asn Asn Gly Ile 305 310 315 320 Ala Trp Asn Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Gly Asp Asn Thr Arg Gly 325 330 335 Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Ala Ser Asp Gly Thr Pro Leu Thr Glu 340 345 350 Tyr Asp Ser Ser Lys Phe Asn Val Tyr His Arg His Met Glu Glu Tyr 355 360 365 Lys Leu Ala Phe Ile Leu Glu Leu Cys Ser Val Glu Ile Thr Ala Gln 370 375 380 Thr Val Ser His Leu Gln Gly Leu Met Pro Ser Val Leu Glu Asn Trp 385 390 395 400 Glu Ile Gly Val Gln Pro Pro Thr Ser Ser Ile Leu Glu Asp Thr Tyr 405 410 415 Arg Tyr Ile Glu Ser Pro Ala Thr Lys Cys Ala Ser Asn Val Ile Pro 420 425 430 Ala Lys Glu Asp Pro Tyr Ala Gly Phe Lys Phe Trp Asn Ile Asp Leu 435 440 445 Lys Glu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Arg 450 455 460 Phe Leu Ala Gln Gln Gly Ala Gly Cys Ser Thr Val Arg Lys Arg Arg 465 470 475 480 Ile Ser Gln Lys Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Lys Lys Lys Lys 485 490 495 <210> 5 <211> 1410 <212> DNA <213> Bovine papillomavirus type 1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <220> <223> L2 open reading frame (wild-type) <400> 5 atg agt gca cga aaa aga gta aaa cgt gcc agt gcc tat gac ctg tac 48 Met Ser Ala Arg Lys Arg Val Lys Arg Ala Ser Ala Tyr Asp Leu Tyr 1 5 10 15 agg acc tgc aag caa gcg ggc aca tgt cca cca gat gtg ata cga aag 96 Arg Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Val 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Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 11 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gfp gene (Papillomavirusized) <220> <223> Codons of humanized gfp gene replaced with synonymous codons used at relatively high frequency by papillomavirus genes <400> 11 atg agt aaa ggg gaa gaa cta ttt aca ggg gtg gtg cct ata cta gtg 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 gaa cta gat ggg gat gtg aat ggg cac aaa ttt tct gtc agt ggg gaa 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 ggg gaa ggg gat gca aca tat ggg aaa cta aca cta aaa ttt ata tgc 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 aca aca ggg aaa cta cct gtg cca tgg cct aca cta gtg aca aca ttt 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 agt tat ggg gtg caa tgc ttt agt aga tat cct gat cat atg aaa caa 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 cat gat ttt ttt aaa agt gca atg ccc gag ggg tat gtg caa gaa aga 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 aca ata ttt ttt aaa gat gat ggg aat tat aaa aca aga gca gaa gtc 336 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 aaa ttt gaa ggg gat aca cta gtg aat aga ata gag ctc aaa ggg ata 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 gat ttt aaa gaa gat ggg aat ata cta ggg cat aaa cta gaa tat aat 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 tat aat agt cat aat gtg tat ata atg gca gat aaa caa aaa aat ggg 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 ata aaa gtg aat ttt aaa ata ata aga cat ata gaa gat gga tcc gtg 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Ile Arg His Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 caa cta gca gat cat tat caa caa aat aca cct ata ggg gat ggg cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtg cta cta cct gat aac cat tat cta agt aca caa agt gca cta agt 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aaa gat cct aat gaa aaa aga gat cat atg gtg cta ctc gag ttt gtg 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 aca gca gca ggg ata aca cat ggg atg gat gaa cta tat aaa tga 717 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 12 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Ile Arg His Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Ala(GCA) <400> 13 taaggactgt aagactt 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Arg(CGA) <400> 14 cgagccagcc aggagtc 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Asn(AAC) <400> 15 ctagattggc aggaatt 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Asp(GAC) <400> 16 taagatatat agattat 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Cys(TGC) <400> 17 aagtcttagt agagatt 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Glu(GAA) <400> 18 tatttctaca cagcatt 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Gln(CAA) <400> 19 ctaggacaat aggaatt 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Gly(GGA) <400> 20 tactctcttc tgggttt 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for His(CAC) <400> 21 tgccgtgact cggattc 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Ile(ATC) <400> 22 tagaaataag agggctt 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Leu(CTA) <400> 23 tacttttatt tggattt 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Leu(CTT) <400> 24 tattagggag aggattt 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Lys(AAA) <400> 25 tcactatgga gatttta 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Lys(AAG) <400> 26 cgcccaacgt ggggctc 17 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Met (elong) <400> 27 tagtacggga aggattt 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Phe(TTC) <400> 28 tgtttatggg atacaat 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Pro(CCA) <400> 29 tcaagaagaa ggagcta 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Pro(CCI) <400> 30 gggctcgtcc gggattt 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Ser(AGC) <400> 31 ataagaaagg aagatcg 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Thr(ACA) <400> 32 tgtcttgaga agagaag 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Tyr(TAC) <400> 33 tggtaaaaag aggattt 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide specific for Val(GTA) <400> 34 tcagagtgtt cattggt 17
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ＢＰＶ１ Ｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１）
および演繹アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＢＰＶＩ Ｌ２ ＯＲＦに関するヌクレオチド配列
（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）を表わす。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のヌクレオチド配列
（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）を表わす。
【図２Ａ】 図２Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子から発現
されるＬ１タンパク質の検出を表わす。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮ
Ａ／ＨＢＬ１およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ１ｗｔでトランスフェクトされたＣｏ
ｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞
から抽出されたＬ１ｍＲＮＡが、野性型Ｌ１配列から産生された32Ｐ標識により
プローブされた。
【図３Ａ】 図３Ａは、合成および野性型のＢＰＶ１Ｌ２遺伝子から発現さ
れたＬ２タンパク質の検出を表わす。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ウェスタンブロット法による検出であり、ｐＣＤＮ
Ａ／ＨＢＬ２およびｐＣＤＮＡ／ＢＰＶＬ２ｗｔでトランスフェクトされたＣｏ
ｓ−１細胞からのＬ１タンパク質を表わす。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、ノーザンブロット法であり、トランスフェクト細胞
から抽出されたＬ２ｍＲＮＡが、野性型Ｌ２配列から産生された32Ｐ標識により
プローブされた。
【図４】 図４は、ＢＰＶＬ１配列、野性型ＢＰＶＬ１（ｗｔ）または合成
Ｌ１（ＨＢ）のインビトロ翻訳を表わす。
【図５Ａ】 図５Ａは、ＢＰＶ潜在プロモーターからのＬ２配列を決定する
のに用いたプラスミドの模式的表示である。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、天然のパピロマウイルス・プロモーターからのＬ２
タンパク質の発現を表わす。
【図６】 図６は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用
いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ（ｗｔ）または合成ｇｆｐ遺伝子でトラ
ンスフェクトされたＣｏｓ−１細胞におけるＧＦＰの発現を表わす。
【図７】 図７は、パピロマウイルス遺伝子（ｐ）により比較的高頻度で用
いられたコドンを保持する野性型ｇｆｐ遺伝子または合成ｇｆｐ遺伝子からのイ
ンビボでのＧＦＰの発現パターンを表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA90Y AA97Y AA99Y BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA05 4C087 AA01 BC83 CA12 NA05 ZB21

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物の標的の細胞または組織においてタンパク質を選択
    的に発現し得る合成核酸配列であって、該選択的発現は、親核酸配列の少なくと
    も１つの存在コドンを類義コドンで置換してなされ、該合成核酸配列を形成する
    配列。
  2. 【請求項２】 該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは
    、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の
    １以上の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有
    する、請求項１の核酸配列
  3. 【請求項３】 該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは
    、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞
    または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有する、請求項１の
    核酸配列。
  4. 【請求項４】 該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは
    、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞ま
    たは組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有する、請求項１の核
    酸配列。
  5. 【請求項５】 該タンパク質の選択的発現のための該類義コドンが、ｃｇａ
    （Ａｒｇ）、ｃｃｉ（Ｐｒｏ）およびａａｇ（Ａｓｎ）よりなる群から選択され
    る、請求項１の核酸配列。
  6. 【請求項６】 該分化細胞が分化ケラチノサイトである、請求項１の核酸配
    列。
  7. 【請求項７】 該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡが、哺
    乳動物の各々他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて、少
    なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくと
    も５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在する、請求項
    ２−４の核酸配列。
  8. 【請求項８】 類義コドンが、（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ま
    しくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）各々他の
    遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（
    ３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用さ
    れるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用さ
    れるコドン、（５）各々他の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用
    されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン
    、（７）他の生物体の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（８）他
    の生物体の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドンよりなる群から選ばれ
    る、請求項１の核酸配列。
  9. 【請求項９】 少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンの好ましい選
    択が、該標的の細胞または組織における該合成核酸配列から該タンパク質が、該
    標的の細胞または組織における該親核酸配列から発現されるタンパク質に比べて
    少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なく
    とも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで発現するように
    、行なわれる請求項１の核酸配列。
  10. 【請求項１０】 哺乳動物の標的の細胞または組織においてタンパク質を選
    択的に発現さす方法であって、該選択的発現は、親核酸配列の少なくとも１つの
    存在コドンを類義コドンで置換し、該合成核酸配列を形成する方法。
  11. 【請求項１１】 該方法は次の工程、 （ａ）該タンパク質をコードする親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを
    類義コドンで置換し、該タンパク質が該標的の細胞または組織で選択的に発現さ
    れ得るように、該親核酸配列に比べると異なる翻訳速度を有する合成核酸配列を
    産生し、 （ｂ）１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成核酸配列を、
    哺乳動物に投与し、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組
    織に導入し、 （ｃ）該標的の細胞または組織において該タンパク質を選択的に発現させる、
    ことをさらに特徴とする、請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 工程（ａ）の前に次の工程、 （ｉ）該標的の細胞または組織および哺乳動物の１以上の他の細胞または組織
    において相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量を測定し、 （ii）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを
    同定し、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくと
    も１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の他の細胞ま
    たは組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである、
    ことをさらに含む、請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 工程（ii）が、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、こ
    のイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べ
    ると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有
    するものであることをさらに特徴とする、請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 工程（ii）が、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、こ
    のイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べ
    ると、元の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有す
    るものであることをさらに特徴とする、請求項１２の方法。
  15. 【請求項１５】 工程（ａ）の前に、（Ｉ）標的の細胞または組織の遺伝子
    、（II）各々他の細胞または組織の遺伝子、（III）哺乳動物の遺伝子および（I
    V）他の生物体の遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子により使用される特定の コドンの夫々の比較頻度に基づいて該少なくとも１つの存在コドンおよび該類義
    コドンを同定することをさらに含む、請求項１１の方法。
  16. 【請求項１６】 第１核酸配列から標的の細胞または組織でタンパク質を発
    現さす方法であって、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆
    組織中に、少なくとも１つのイソ受容tＲＮＡをコードする第２核酸配列を導入 し、該第２核酸配列は１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結しており、
    該少なくとも１つのイソ受容 tＲＮＡは該標的の細胞または組織において比較的
    低量で正常に存在し、該第１核酸配列のコドンに対応する、工程を含む方法。
  17. 【請求項１７】 周期中真核細胞におけるウイルス粒子を産生する方法であ
    って、該ウイルス粒子はその集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含み、
    該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに充分なレベルでは
    親核酸配列から該細胞中で発現されず、該方法は、次の工程、 （ａ）該親核酸配列の少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該
    親核酸配列に比べると変化した翻訳速度を有する合成核酸配列を産生し、該少な
    くとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞中
    で該合成核酸配列から発現が可能であり、 （ｂ）該細胞またはその前駆体中に、１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的
    に連結した該合成核酸配列を導入し、 （ｃ）少なくとも１つのタンパク質を該細胞中で、該ウイルス粒子の集合に必
    要な他のウイルスタンパク質の存在下で発現し、もって該ウイルス粒子を産生す
    ること、 を含む方法。
  18. 【請求項１８】 周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって
    、該ウイルス粒子はその粒子の集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含み
    、該少なくとも１つのタンパク質はウイルス集合ができるのに十分なレベルで親
    核酸配列から該細胞中で発現されず、該親核酸配列の少なくとも１つの存在コド
    ンは該少なくとも１つのタンパク質の産生を該レベルにまで律速的にし、該方法
    は、該細胞中に該少なくとも１つのコドンに特異的なイソ受容tＲＮＡを発現し 得る核酸配列を導入する工程を含む方法。
  19. 【請求項１９】 該合成核酸配列が１以上の核酸配列に操作的に連結してい
    る、請求項１−９の核酸配列を含むベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１−９いずれかの核酸配列を薬学的に許容される担
    体と共に含む医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項１９のベクターを薬学的に許容される担体と共に含
    む医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項１−９いずれかの核酸配列を含む細胞または組織。
  23. 【請求項２３】 請求項１９のベクターを含む細胞または組織。
  24. 【請求項２４】 請求項１０−１８いずれかの方法からもたらされる細胞ま
    たは組織。
  25. 【請求項２５】 請求項１７または１８の方法から生産されるウイルス粒子
    。
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