JP2002525109A - 組織発現を調節するための特異的ハイブリッドプロモーターの使用 - Google Patents

組織発現を調節するための特異的ハイブリッドプロモーターの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は強力な遍在性プロモーター／エンハンサーのエンハンサー領域の全部又は一部と、平滑筋細胞特異的発現を可能にするプロモーター領域を含むハイブリッドプロモーター、前記プロモーターを含む任意ベクター及び細胞並びにその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は生物学分野、特に遺伝子発現調節分野に関する。本発明は特に高度遺
伝子標的発現を可能にする新規構築物及び新規ベクターに関する。本発明は多数
の分野で利用可能であり、特に組換えタンパク質製造、トランスジェニック動物
モデル創製、細胞系創製、スクリーニング試験開発又は遺伝子及び細胞治療に利
用できる。
【０００２】 遺伝子発現の調節及び誘導可能性はバイオテクノロジーの発展に非常に重要で
ある。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは特定細胞集団を使用することにより組換えタンパク
質の生産条件を改善することが可能になる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは試料中の特定
細胞集団の存在を検出又は明示したり、物質の性質を試験したり、特定細胞集団
における遺伝子を調節することも可能になる。遺伝子発現調節は治療分子の生産
を選択的に制御できることが重視されるｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ治療
アプローチにも非常に重要である。実際に、用途によっては、導入する遺伝子に
より、治療作用を集中して拡散と副作用を制限するように所定組織又は生物の所
定部位のみにターゲティングできることが重要である。
【０００３】 所与核酸の発現のターゲティングは種々のアプローチにより実施することがで
きる。第１のアプローチは例えば所与細胞特異性をもつベクター又は導入物質の
使用である。しかし、この種のベクターにより付与される特異性は一般にかなり
大まかであり、厳密な細胞集団をターゲティングすることはできない。所定細胞
型の特異的発現シグナルを使用するアプローチもある。これについては、例えば
ピルビン酸キナーゼ、ビリン、ＧＦＡＰをコードする遺伝子のプロモーター、脂
肪酸結合腸タンパク質プロモーター、平滑筋細胞αアクチンプロモーター、ＳＭ
２２プロモーター又はヒトアルブミン遺伝子プロモーター等の所謂「特異的」プ
ロモーターが文献に記載されている。しかし、これらのプロモーターは組織特異
性をもつとしても、その能力は比較的低い。即ち、これらのプロモーターの大半
は所謂「強力」プロモーターに較べて活性レベルが著しく劣り、一般に１０〜１
００分の１以下である。更に、プロモーターの特異性はその強度に反比例し、強
度が増すにつれて非特異活性レベルが増すと一般に考えられている。
【０００４】 従って、所定組織に特異的でありながら強力なプロモーターを入手できるなら
ば特に有利であると思われる。本発明の目的は厳密には高度遺伝子標的発現を可
能にする新規構築物を提供することである。
【０００５】 本発明は特に平滑筋細胞に特異的な高度遺伝子発現を可能にする新規キメラプ
ロモーターに関する。本発明は更に前記プロモーターを含むベクターと、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子細胞導入のためのその使
用にも関する。本発明の構築物は高い選択性と高い転写活性という相反する性質
を初めて兼備することができた。従って、本発明は遺伝子発現を平滑筋細胞にｉ
ｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏターゲティングし、この発現を調節するため
の特に高性能の手段を提供する。
【０００６】 本発明はより詳細には起源及び機能の異なる領域を含むキメラ（又はハイブリ
ッド）プロモーターの構築にある。より詳細には、本発明の第１の目的は強力な
遍在性プロモーター／エンハンサーのエンハンサー領域の全部又は一部と、平滑
筋細胞特異的発現を可能にするプロモーター領域を含むハイブリッドプロモータ
ーにある。
【０００７】 エンハンサー領域とプロモーター領域の結合は既に従来技術に記載されている
。例えば、ＣＭＶのエンハンサー領域をニワトリβアクチン遺伝子のプロモータ
ー（ＷＯ９６／１３５９７）等の非特異的プロモーターと結合してその強度を増
すことは公知である。しかし、このような構築物は平滑筋細胞に特異的な高度発
現を得る目的では記載又は示唆されていない。本発明は特定「エンハンサー」エ
レメントと特定「プロモーター」エレメントの選択及び組み合わせにもある。本
発明はこのエレメントの組み合わせが平滑筋の標的細胞に対するプロモーターの
選択性を損なわずに高レベル発現を達成できることを立証することにもある。従
って、本発明は平滑筋細胞における高レベルの分子標的生産を可能にするという
点で特に有利な構築物を提供する。更に、本発明はこれらの構築物をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも利用できることも立証する。
【０００８】 本発明のハイブリッドプロモーターにおいて、エンハンサー領域とプロモータ
ー領域は機能的に結合されており、即ちエンハンサー領域がプロモーター領域の
活性に刺激活性を発揮するように結合されている。従って、一般にこれらの２領
域は遺伝子結合されており、エンハンサー領域がプロモーター領域を活性化でき
るように相互に十分近接している。エンハンサー領域とプロモーター領域の距離
は好ましくは１ｋｂ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満である。本発明の特に
好ましい構築物において、これらの２領域の距離は４００ｂｐ未満、より好まし
くは２００ｂｐ未満である。更に、実施例に示すように、２領域の夫々の向きは
本発明のハイブリッドプロモーターの活性に有意影響を与えない。従って、エン
ハンサー領域はプロモーター領域の転写方向と同じ向きに配置してもよいし、逆
向きに配置してもよい。
【０００９】 好適実施態様において、エンハンサー領域はサイトメガロウイルスの極初期遺
伝子（ＣＭＶ−ＩＥ）のエンハンサー領域、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（ＬＴ
Ｒ−ＲＳＶ）のエンハンサー領域、ＳＶ４０ウイルスのエンハンサー領域及びＥ
Ｆ１α遺伝子のエンハンサー領域から選択される。より好ましくは、本発明のハ
イブリッドプロモーターにおいて、エンハンサー領域はサイトメガロウイルスの
極初期遺伝子（ＣＭＶ−ＩＥ）、好ましくはヒトサイトメガロウイルスの極初期
遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ）のエンハンサー領域である。具体的なエンハンサー領
域は例えばｈＣＭＶ−ＩＥ遺伝子の−５２２〜−６３フラグメント、又は前記遺
伝子の少なくとも一部を含み、エンハンサー活性をもつ任意フラグメントから構
成される。
【００１０】 プロモーター領域については、本発明を実施するには平滑筋細胞のαアクチン
（ＳＭａｃｔ）をコードする遺伝子又はＳＭ２２遺伝子のプロモーターの全部又
は一部を含む領域を使用すると有利である。これらの遺伝子のプロモーターは平
滑筋細胞特異性であることが記載されている（特にＵｅｙａｍａ Ｈら，Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４（１９８４）１０７３−１０７８； Ｓｏｌｗａｙ
Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）１３４６０−１３４
６９参照）。
【００１１】 本発明の第１の特に有利な態様は、ヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子
（ｈＣＭＶ−ＩＥ）のエンハンサー領域の全部又は一部と、平滑筋細胞のαアク
チン（ＳＭａｃｔ）をコードする遺伝子、好ましくはヒトＳＭａｃｔ遺伝子のプ
ロモーターの全部又は一部を含むハイブリッドプロモーターにより構成される。
【００１２】 本発明の第２の特に有利な態様は、ヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子
（ｈＣＭＶ−ＩＥ）のエンハンサー領域の全部又は一部と、ＳＭ２２遺伝子、好
ましくはマウスＳＭ２２α遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むハイブリ
ッドプロモーターにより構成される。
【００１３】 更に、本発明の特定実施態様では、使用するプロモーター領域はベースプロモ
ーターと、ＳＭａｃｔプロモーターもしくはＳＭ２２プロモーター又は両者の組
み合わせから誘導され、組織特異性を付与する配列を含むキメラ領域である。こ
の実施態様では、ベースプロモーターは「最小」プロモーター即ち転写プロモー
ター活性に必須の配列（例えばＴＡＴＡボックス）のみを含むプロモーターとす
ることができる。このベースプロモーターはＳＭａｃｔ又はＳＭ２２遺伝子の固
有ベースプロモーターでもよいし、異種起源（例えばβグロビン、ＨＳＶ−ＴＫ
、ＳＶ４０又はＥＦ１−α）でもよい。組織特異性を付与する配列はＳＭａｃｔ
プロモーター（Ｒ．Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（
１９９５）７６３４−７６４３）及び／又はＳＭ２２プロモーター（Ｌ．Ｌｉら
，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３２（１９９６）８４９−８５９； Ｓ．Ｋｉｍ
ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００（１９９７）１００６−１０１４；
Ｋｅｍｐら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（１９９５）１０３７−１０４３）の
配列の一部を含むと有利である。
【００１４】 従って、本発明の特定型のハイブリッドプロモーターは、強力な遍在性プロモ
ーター／エンハンサーのエンハンサー領域の全部又は一部と、ベースプロモータ
ーと、ＳＭａｃｔプロモーター及び／又はＳＭ２２プロモーターの全部又は一部
を含む組織特異性を付与する配列を含む。
【００１５】 本発明のハイブリッドプロモーターを構築するためには、当業者に公知の分子
生物学技術を使用することができる。例えば、エンハンサー領域とプロモーター
領域（ベースプロモーターと組織特異性を付与する配列を含む）は例えば特異的
プローブで増幅することにより核酸バンク又は全細胞ＤＮＡから慣用技術により
単離することができる。これらのフラグメントは当技術分野で入手可能な配列情
報を使用することにより人工的に合成することもできる。これらのフラグメント
が得られたら、リガーゼ及び他の制限酵素により容易に相互に結合し、本発明の
ハイブリッドプロモーターを作製することができる。更に、そのクローニングを
助長する目的又はその機能性を改変する目的でこれらのフラグメントを消化、突
然変異、塩基対の挿入又は付加により修飾してもよい。更に、上述のように、フ
ラグメントを相互に直接結合してもよいし、逆にハイブリッドプロモーターの活
性に有意影響をもたない塩基対を挟んで結合してもよい。
【００１６】 従って、本発明のハイブリッドプロモーターは目的核酸を平滑筋細胞で特異的
に発現させる能力をもつ。発現の「特異」性とは、プロモーターの活性が平滑筋
細胞で有意に高いことを意味する。他の細胞で非特異的発現があってもよいが、
対応する活性レベルは一般に平滑筋細胞で観察される活性レベルよりも著しく低
く（無視できる程度）、一般に１０分の１以下である。実施例に示す結果から明
らかなように、この点では発現差は１４０倍にまで達し、本発明のプロモーター
の高い選択性を立証している。この点では、実施例に示す結果は血管、特に動脈
内の近接する内皮細胞で発現が全く検出されなかったことからも平滑筋細胞に対
する高い特異性を立証している。実施例に示す結果は更に、本発明のプロモータ
ーの強度が非ハイブリッド特異プロモーターよりも著しく高く、１００倍以上で
あることも立証している。従って、これらの点は本発明のハイブリッドプロモー
ターが平滑筋細胞で目的核酸を発現させるために強度と特異性の点で有利な予想
外の特性をもつことを示している。
【００１７】 この点で、本発明は上記ハイブリッドプロモーターの制御下に置かれた目的Ｒ
ＮＡ又はポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットにも関する。本発明
のカセットは更に核酸の３’に配置された転写終結シグナルを含むと有利である
。
【００１８】 本発明のカセットによりターゲティングされる細胞集団を考慮すると、核酸は
例えば下記群から選択されるタンパク質をコードするものが挙げられる。 −細胞周期に関与するタンパク質。例えばｐ２１又はサイクリン依存性キナーゼ
（ｃｄｋ）の他の任意インヒビタータンパク質、網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子産物、
ＧＡＸ、ＧＡＳ−１、ＧＡＳ−３、ＧＡＳ−６、Ｇａｄｄ４５、Ｇａｄｄ１５３
、サイクリンＡ、Ｂ及びＤ。 −アポトーシスを誘導するタンパク質。例えばｐ５３、アポトーシスインデュー
サーファミリーメンバー（例えばＢａｓ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ又はＢｃｌ２及
びＢｃｌ−Ｘ１の他の任意アンタゴニスト）。 −平滑筋細胞の増殖を調節することが可能なタンパク質。例えば細胞内抗体又は
細胞増殖に関与するタンパク質（例えばＲａｓタンパク質、ＭＡＰキナーゼ、又
はチロシンキナーゼもしくは増殖因子レセプター）の活性を阻害するＳｃＦｖ。 −増殖試験又は診断試験を目的とする標識タンパク質（ＬａｃＺ、ＧＦＰ、Ｌｕ
ｃ、分泌アルカリホスホターゼ（ＳｅＡＰ）、成長ホルモン（ＧＨ）等）。 −血管形成を誘導するタンパク質。例えばＶＥＧＦファミリーメンバー、ＦＧＦ
ファミリーメンバー、より具体的にはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５
、アンジオジェニン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、散乱因子／ＨＧ
Ｆ、アンジオポエチンファミリーメンバー、サイトカイン、特にインターロイキ
ン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８）、アンジオテンシン−２、プラスミ
ノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、活性脂質合成に
関与する分子（プロスタグランジン、Ｃｏｘ−１）。 −転写因子。例えばＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン及び転写アクチ
ベーター又はインヒビタードメインを含む天然又はキメラ核酸レセプター、例え
ばｔｅｔＲ−ＮＬＳ−ＶＰ１６融合タンパク質、エストロゲンレセプターから誘
導される融合タンパク質、ステロイドホルモンレセプターから誘導される融合タ
ンパク質、プロゲステロンレセプターから誘導される融合タンパク質、Ｒｉｖｅ
ｒａら（Ｒｉｖｅｒａら，（１９９６），Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅ
ｍ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｅｃｉｎｅ，２：１０２８−１０
３２）により記載されているＣＩＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ
Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）系タンパク質。
【００１９】 当然のことながら本発明はタンパク質又はＲＮＡの特定例に限定されず、簡単
な慣用実験操作により平滑筋細胞で任意核酸を発現させるために当業者により使
用することができる。
【００２０】 本発明は更に上記ハイブリッドプロモーター又はカセットを含む任意ベクター
にも関する。本発明のベクターは例えばプラスミド、コスミド又はウイルスによ
りパッケージングされていない任意ＤＮＡ、ファージ、人工染色体、組換えウイ
ルス等とすることができる。プラスミド又は組換えウイルスが好ましい。
【００２１】 プラスミド型ベクターとしては、一般に複製起点を含む当業者に公知の全クロ
ーニング及び／又は発現ベクターを挙げることができる。例えば国際出願ＷＯ９
６／２６２７０及びＰＣＴ／ＦＲ９６／０１４１４に記載されているような改良
複製起点及び／又はマーカーをもつ新世代プラスミドも挙げられる。
【００２２】 組換えウイルス型ベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス
、ヘルペスウイルス又はアデノ随伴ウイルスを挙げることができる。この種の複
製欠損組換えウイルスの構築とこれらのベクターの感染性については文献に広く
記載されている（特にＳ．ＢａｅｃｋとＫ．Ｌ．Ｍａｒｃｈ（１９９８），Ｃｉ
ｒｃｕｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．８２，ｐｐ２９５−３０５， Ｔ．Ｓｈ
ｅｎｋ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙら
（１９９６），Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ： ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ）．ｐｐ２１
１−２１４８，ＥＤＳ−Ｒａｖｅｎｓｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ／Ｐｈｉｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ，Ｐ．ＹｅｈとＭ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９７），ＦＡＳＥＢ
Ｖｏｌ．１１，ｐｐ６１５−６２３参照）。
【００２３】 本発明の実施に特に好ましい組換えウイルスは欠損組換えアデノウイルスであ
る。
【００２４】 アデノウイルスは約３６ｋｂ（キロベース）のサイズの直鎖状２本鎖ＤＮＡウ
イルスである。構造と性質は少しずつ異なるが、類似の遺伝子構成をもつ種々の
血清型が存在する。より詳細には、組換えアデノウイルスはヒト又は動物起源で
あり得る。ヒト起源のアデノウイルスについては、Ｃ亜属に分類されるもの、特
に２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、７（Ａｄ７）又は１２（Ａｄ１２）型のアデノ
ウイルスを好適例として挙げることができる。動物起源の種々のアデノウイルス
のうちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全ＣＡＶ２アデノウイルス株［例
えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］を好適例と
して挙げることができる。動物起源の他のアデノウイルスは特に参考資料として
本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９４／２６９１４に記載されている。
【００２５】 アデノウイルスのゲノムは特に、各末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）と、パッ
ケージング配列（Ｐｓｉ）と、初期遺伝子と、後期遺伝子を含む。主要な初期遺
伝子はＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域に含まれる。このうち、Ｅ１領域に含まれ
る遺伝子は特にウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子はＬ１〜Ｌ５領域
に含まれる。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全に配列決定されており、デー
タベースから入手できる（特にＧｅｎｅｂａｎｋ Ｍ７３２６０参照）。更に、
他のアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等）も部分的又は完全に
配列決定されている。
【００２６】 組換えベクターとして使用するために、種々の治療遺伝子を組込んだ種々のア
デノウイルス由来構築物が作製されている。これらの構築物の各々で、アデノウ
イルスは感染細胞で複製できないように改変されている。例えば、従来技術に記
載されている構築物は、ウイルス複製に必須のＥ１領域を欠失し、このレベルに
異種ＤＮＡ配列を挿入したアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ
１０１（１９９１）１９５； Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ
５０（１９８６）１６１）。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウ
イルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば
、突然変異株ｔｓ１２５に感熱性点突然変異を導入して７２ｋＤａのＤＮＡ結合
タンパク質（ＤＢＰ）を不活化している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら，１９
７５）。この他、ウイルス複製及び／又は増殖に必須の別の領域であるＥ４領域
の欠失を含むベクターもある。Ｅ４領域は実際に後期遺伝子の発現の調節、後期
核ＲＮＡの安定性、宿主細胞のタンパク質発現の減弱及びウイルスＤＮＡの複製
効率に関与している。従って、Ｅ１及びＥ４領域を欠失するアデノウイルスベク
ターは転写バックグラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このよ
うなベクターは例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、
ＷＯ９６／２２３７８に記載されている。更に、ＩＶａ２遺伝子のレベルに変異
をもつベクターも記載されている（ＷＯ９６／１００８８）。
【００２７】 本発明の１好適実施態様では、組換えアデノウイルスはＣ亜属のヒトアデノウ
イルスである。アデノウイルスＡｄ２又はＡｄ５が特に好ましい。
【００２８】 有利な態様によると、本発明の範囲で使用する組換えアデノウイルスはそのゲ
ノムのＥ１領域に欠失を含む。より詳細には、Ｅａ１及びＥ１ｂ領域の欠失を含
む。具体的には、（Ａｄ５のゲノムに対して）ヌクレオチド４５４〜３３２８、
３８２〜３４４６又は３５７〜４０２０の欠失を挙げることができる。
【００２９】 好適態様によると、本発明の範囲で使用する組換えアデノウイルスは更にその
ゲノムのＥ４領域にも欠失を含む。より詳細には、Ｅ４領域の欠失はオープンリ
ーディングフレーム全体に及ぶ。具体的には、３３４６６〜３５５３５又は３３
０９３〜３５５３５の欠失を挙げることができる。Ｅ４領域における他の型の欠
失については参考資料として本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９５／０２６９
７及びＷＯ９６／２３３７８に記載されている。
【００３０】 発現カセットは組換えゲノムの種々の部位に挿入することができる。Ｅ１、Ｅ
３又はＥ４領域のレベルに欠失配列の代わりに又は追加して挿入することができ
る。ウイルス生産にシス位で必要な配列（ＩＴＲ配列とパッケージング配列）を
除き、他の任意部位にも挿入できる。
【００３１】 組換えアデノウイルスは、パッケージング系即ち組換えアデノウイルスゲノム
における欠損機能の１個以上をトランス相補することが可能な細胞系で作製され
る。当業者に公知のパッケージング系としては、例えばアデノウイルスのゲノム
の一部を組み込んだ２９３系を挙げることができる。より詳細には、２９３系は
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含
むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ１ｂ
を含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質
をコードする領域の一部を含む。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又
は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価
をもつウイルスストックを生産することができる。この系は、感熱性Ｅ２突然変
異を更に含むウイルスストックを許容温度（３２℃）で生産することもできる。
Ｅ１領域を相補することが可能な他の細胞系としては、特にヒト肺癌細胞Ａ５４
９（ＷＯ９４／２８１５２）やヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（
１９９６）２１５）に由来するものが記載されている。また、アデノウイルスの
複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、Ｅ
１及びＥ４領域を相補する系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）ｐ
ｐ５５９−５６５； Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２
； Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７
５）と、Ｅ１及びＥ２領域を相補する系（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０
２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）を挙げることができる。
【００３２】 組換えアデノウイルスは一般に、パッケージング系にウイルスＤＮＡを導入後
、約２又は３日後に細胞を溶解させることにより作製される（アデノウイルス周
期は２４〜３６時間）。この方法を実施するために導入するウイルスＤＮＡとし
ては完全組換えウイルスゲノムが挙げられ、場合により細菌（ＷＯ９６／２５５
０６）又は酵母（ＷＯ９５／０３４００）で構築し、細胞にトランスフェクトす
る。パッケージング系に感染させるために使用する組換えウイルスでもよい。ウ
イルスＤＮＡは、パッケージング細胞に導入後に種々のフラグメント間の相同組
換えにより組換えウイルスゲノムを再構成することが可能な相同ゾーンと組換え
ウイルスゲノムの一部を各々もつフラグメントとして導入してもよい。
【００３３】 細胞溶解後、組換えウイルス粒子を塩化セシウム勾配遠心分離により単離する
。別法も参考資料として本明細書の一部とする仏国出願ＦＲ９６／０８１６４に
記載されている。
【００３４】 本発明は更に上記ベクターと化学的又は生化学的導入物質を含む組成物にも関
する。「化学的又は生化学的導入物質」なる用語は核酸の細胞導入を助長する任
意（即ち組換えウイルス以外の）化合物を意味する。例えばカチオン脂質、ペプ
チド、ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリリジン）、ナノ粒子等の非ウイルス
カチオン物質や、非カチオンリポソーム、非カチオンポリマー又はナノ粒子等の
非ウイルス非カチオン物質が挙げられる。このような物質は当業者に周知である
。
【００３５】 本発明は更に上記組換えウイルスと生理的に許容可能なキャリヤーを含む組成
物にも関する。
【００３６】 本発明は更に上記ベクターを含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物
は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で
投与するように処方することができる。
【００３７】 医薬組成物は注射用製剤、特に筋肉内又は平滑筋組織内注射剤に医薬的に許容
可能なキャリヤーを含むことが好ましい。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩
類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又
は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る
乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。例えばヒドロゲル等の他の賦形剤も
利用できる。このヒドロゲルは生体適合性で非細胞毒性の任意（ホモ又はヘテロ
）ポリマーから調製できる。このようなポリマーは例えば国際出願ＷＯ９３／０
８８４５に記載されている。特にエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシ
ドから得られるようなポリマーは市販されている。血管壁、特に血管壁の平滑筋
細胞に核酸を導入するにはヒドロゲルを使用すると特に有利である。注射用量は
種々のパラメーター、特に使用する投与方法、所期目的（標識、病理試験、スク
リーニング等）、発現させようとする遺伝子、又は所望発現期間に応じて適応で
きる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは１０4〜１０14ｐｆｕ、好
ましくは１０6〜１０10ｐｆｕの用量形態で処方及び投与される。ｐｆｕ（「プ
ラーク形成単位」）なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養
物の感染により測定され、感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ
力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖ
ｉｖｏで使用するためには、本発明のカセット、ベクター又は組成物を選択細胞
集団の存在下に慣用量でインキュベートすればよい、これらのインキュベーショ
ンは培養容器、フラスコ、発酵槽又は他の任意選択装置で実施することができる
。
【００３８】 更に、本発明は上記カセット又はベクター（特にアデノウイルス）により改変
された任意細胞にも関する。「改変」細胞なる用語は本発明の構築物を含む任意
細胞を意味する。これらの細胞は組換えタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生産に使
用することができる。国際出願ＷＯ９５／１４７８５に記載されている方法に従
って生物移植にも利用することができる。これらの細胞はヒト平滑筋細胞が好ま
しい。
【００３９】 本発明は更に核酸を平滑筋細胞で特異的にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ
又はｉｎ ｖｉｖｏ発現させるための上記ハイブリッドプロモーターの使用にも
関する。
【００４０】 本発明は更に核酸を血管近傍の内皮細胞ではなく平滑筋細胞でｉｎ ｖｉｖｏ
発現させるための組成物を製造するための上記ハイブリッドプロモーターの使用
にも関する。
【００４１】 本発明の構築物は平滑筋細胞に特異的であるため、血管病動物モデルの創製又
は標識試験の実施又は試料中の平滑筋細胞の存在の検出もしくはスクリーニング
法でも使用できる。
【００４２】 本発明は更に上記ベクターを細胞集団に導入し、前記組換え細胞集団を培養し
、生産されたタンパク質を回収することからなる組換えタンパク質の製造方法に
も関する。本発明の方法を実施するためには、平滑筋細胞を使用すると有利であ
る。使用する細胞は樹立細胞系でも初代培養細胞でもよい。
【００４３】 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる
例示であり、発明を制限するものではない。
【００４４】 図面の説明 表１：初代培養ウサギ平滑筋細胞（ウサギＳＭＣ）、ＥＣＶ３０４細胞、筋芽
細胞Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、癌細胞ＴＵ１８２及び腎細
胞２９３でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクションにより評価したハイブ
リッドプロモーター（ｈＳＭαアクチン）の相対活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌ
ｅａｄＴＫで得られたルシフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーター
の相対活性を表す。Ｅｎｈ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモ
ーターの上流に順方向にクローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハン
サー配列をＸプロモーターの上流に逆方向にクローニング。
【００４５】 表２：初代培養ウサギ平滑筋細胞（ウサギＳＭＣ）、ＥＣＶ３０４細胞、筋芽
細胞Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、癌細胞ＴＵ１８２及び腎細
胞２９３でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクションにより評価したハイブ
リッドプロモーター（ｍＳＭ２２）の相対活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄ
ＴＫで得られたルシフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーターの相対
活性を表す。Ｅｎｈ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモーター
の上流に順方向にクローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配
列をＸプロモーターの上流に逆方向にクローニング。
【００４６】 図１：ｈＳＭαアクチンハイブリッドプロモーターを発現カセットに含むプラ
スミドの模式図。
【００４７】 図２：ｍＳＭ２２αハイブリッドプロモーターを発現カセットに含むプラスミ
ドの模式図。
【００４８】 図３：初代培養ウサギ平滑筋細胞（ウサギＳＭＣ）、ヒト臍帯癌由来内皮細胞
（ＥＣＶ３０４）、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）及びヒト子宮頚癌由来上皮細
胞（ＨｅＬａ）でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクションにより評価した
ハイブリッドプロモーターの活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫで得られ
たルシフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーターの相対活性を表す。
Ｅｎｈ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモーターの上流に順方
向にクローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモ
ーターの上流に逆方向にクローニング。
【００４９】 図４：マウス胎仔繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、ヒトＯＲＬ癌由来細胞（ＴＵ
１８２）及び形質転換ヒト胎児腎細胞（２９３）でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トラ
ンスフェクションにより評価したハイブリッドプロモーターの活性。プラスミド
ｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫで得られたルシフェラーゼ活性に対する百分率として各
プロモーターの相対活性を表す。Ｅｎｈ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配
列をＸプロモーターの上流に順方向にクローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−Ｉ
Ｅのエンハンサー配列をＸプロモーターの上流に逆方向にクローニング。
【００５０】 図５：マウス前脛骨筋Ｃ５７ＢＬ６でｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入により評価し
たハイブリッドプロモーターの活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫで得ら
れたルシフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーターの相対活性を表す
。
【００５１】 材料と方法 プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離
、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、塩類溶媒中の
ＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子生
物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載さ
れている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
，１９８９）。
【００５２】 各プロモーター領域のクローニングに使用したプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉ
ｃは市販品である（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。プラスミドｐ
ＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）及びｐＵ
Ｃ１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）も市販品である。
【００５３】 ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）法によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、
ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施できる。
【００５４】 大腸菌細胞へのプラスミドＤＮＡのエレクトロポレーションはエレクトロポレ
ーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施で
きる。
【００５５】 ヌクレオチド配列の確認は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販
されているキットを製造業者の指示に従って使用することにより、Ｓａｎｇｅｒ
ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６
３−５４６７）により開発された方法により実施できる。
【００５６】 実施例 実施例１：ハイブリッドプロモーターとこれらのハイブリッドプロモーターを
含む発現プラスミドの構築 １．１．ｈＳＭαアクチンハイブリッドプロモーター ・プラスミドｐｈＳＭａｃｔ。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）により記載されている方法に従ってヒト大動
脈平滑筋細胞の初代培養物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）から高分子量ゲノムＤＮＡを
作製した。
【００５７】 このＤＮＡを鋳型として使用し、下記プライマーを使用して第１回目のＰＣＲ
増幅を行った。
【００５８】 −特異的ヒト平滑筋αアクチン遺伝子の−１０３４位（プロモーター領域）か
ら開始するプライマー６４１７（５’ＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＧＣＴ
ＧＣＴＡ３’）（配列番号１）（Ｕｅｙａｍａ Ｈ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，４（１９８４）１０７３−１０７８。Ａｃｃｅｓｓ Ｇｅｎｂａｎｋ
Ｄ００６１８）。
【００５９】 −ｈＳＭａｃｔ遺伝子の最初のイントロンの内側に位置するＤ００６１８配列
の１９７４位のプライマー６４１８（５’ＣＴＴＣＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣ
ＴＡＣＡＴＡ３’）（配列番号２）。反応混合物はゲノムＤＮＡ１ｍｇ、２種の
プライマー（６４１７及び６４１８）各１０ｐｍｏｌ、各デオキシリボヌクレオ
チド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２２ｍ
Ｍ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）５単位を含む
。反応容量を５０ｍｌにし、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒにより推奨されている最
適ＰＣＲバッファー濃度に調整した。
【００６０】 サーモサイクラーＰＴＣ−１００（登録商標）（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉ
ｎｃ．）を使用してＭｉｃｏａｍｐ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
チューブでＰＣＲ増幅を実施した。この増幅は９５℃で２分間の変性段階後に、
９５℃で１５秒間の変性段階と、６０℃で３０秒間のハイブリダイゼーション段
階と、７２℃で１分間の伸長段階を含むサイクルを３０サイクルにより実施した
。この３０サイクル後に更に５分間伸長させた後、ＰＣＲ反応産物を１０℃に維
持した。
【００６１】 この反応産物１μｌをこの第１回目の反応から分取した後、水１０ｍｌで希釈
した。次にこの希釈液１ｍｌを使用し、下記プライマー対に変えた以外は第１回
目の反応（上記）と同一条件下で第２回目のＰＣＲを実施した。
【００６２】 −プライマー６４５３（５’ＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＧｃａｃｇａｇＧＡＣＡＡ
ＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡ３’）（配列番号３）。この配列はプロモーターｈＳＭａ
ｃｔの上流（−６８０位）にＸｈｏＩ部位（小文字下線部）を導入する。
【００６３】 −プライマー６４５６（５’ＣＣＣＴＧＡＣＡａａｇｃｔｔＧＧＣＴＧＧＧＣ
ＴＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧ３’）（配列番号４）。このプライマーはｈＳＭａｃｔ
の＋３０位にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。
【００６４】 アガロースゲル分析、次いで精製後、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメン
トをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で３時間消化した後、これらの同一制限
酵素で予め消化しておいたベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
クローニングし、プラスミドｐｈＳＭａｃｔを作製した（図１）。
【００６５】 ・プラスミドｐＸＬ３１３０及びｐＸＬ３１３１。プラスミドｐＣＭＶβを鋳
型として使用し、オリゴヌクレオチド８５５７（５’ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ
ＴＧＣ ＣＣＧ ＴＴＡ ＣＡＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＣＧＧ３’）（配列番号５
）及び８５５８（５’ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＴＣＣ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＣ
Ｇ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＡＧＴ ＴＧ３’）（配列番号６）をプ
ライマーとして使用することにより、転写開始部位に対して−５２２〜−６３位
に位置するヒトサイトメガロウイルスのＩＥ遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ）のプロモ
ーターのエンハンサー領域に対応するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。こ
のフラグメントをＭｌｕＩで消化した後、予めＭｌｕＩで消化してアルカリホス
ファターゼで処理しておいたプラスミドｐｈＳＭａｃｔにクローニングした。フ
ラグメントの挿入方向により、２種の異なるプラスミドｐＸＬ３１３０及びｐＸ
Ｌ３１３１が得られた。これらのプラスミドの模式図を図面にまとめる（図１）
。これらのプラスミドはｈＣＭＶ−ＩＥ遺伝子のプロモーターのエンハンサーと
ｈＳＭαアクチン遺伝子のプロモーターから構成されるハイブリッドプロモータ
ーをＭｌｕＩ−ＮｃｏＩフラグメントとして含む。
【００６６】 １．２．ｍＳＭ２２ハイブリッドプロモーター ・プラスミドｐｍＳＭ２２。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）により記載されている方法に従ってＢａｌｂｃ
マウス肝臓から高分子量ゲノムＤＮＡを作製した。
【００６７】 このＤＮＡを鋳型として使用し、下記プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行っ
た。
【００６８】 −プライマー６５１７（５’ＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡｃｔｃｇａｇＡＣＴＡＧＴ
ＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡ３’）（配列番号７）。このプライマーはマウス
ＳＭ２２α遺伝子のプロモーターの−４３６位にＸｈｏＩ部位（小文字下線部）
を導入する（Ｓｏｌｗａｙ Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９
９５）１３４６０−１３４６９；Ａｃｃｅｓｓ Ｇｅｎｂａｎｋ Ｌ４１１６１
）。
【００６９】 −プライマー６５１８（５’ＴＣＧＴＴＴＧａａｇｃｔｔＧＧＡＡＧＧＡＧＡ
ＧＴＡＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣ３’）（配列番号８）。このプライマーはＳＭ２
２αの＋４３位にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。
【００７０】 マウスゲノムＤＮＡ１ｍｇと２種のプライマー（６５１７及び６５１８）各１
０ｐｍｏｌを含む反応混合物をｈＳＭａｃｔと同一反応体及び同一濃度で調製し
た後、同一条件でＰＣＲ増幅した（実施例１．１．参照）。
【００７１】 アガロースゲル分析、次いで精製後、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメン
トをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で３時間消化した後、これらの同一制限
酵素で予め消化しておいたベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
クローニングした。得られたプラスミドをｐｍＳＭ２２と命名した（図２）。
【００７２】 ・プラスミドｐＸＬ３１５２及びｐＸＬ３１５３。プラスミドｐＣＭＶβを鋳
型として使用し、オリゴヌクレオチド８５５７（５’ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ
ＴＧＣ ＣＣＧ ＴＴＡ ＣＡＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＣＧＧ３’）（配列番号５
）及び８５５８（５’ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＴＣＣ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＣ
Ｇ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＡＧＴ ＴＧ３’）（配列番号６）をプ
ライマーとして使用することにより、転写開始部位に対して−５２２〜−６３位
に位置するｈＣＭＶ−ＩＥ遺伝子のプロモーターのエンハンサー領域に対応する
ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。このフラグメントをＭｌｕＩで消化した
後、予めＭｌｕＩで消化してアルカリホスファターゼで処理しておいたプラスミ
ドｐｍＳＭ２２にクローニングした。フラグメントの挿入方向により、２種の異
なるプラスミドｐＸＬ３１５２及びｐＸＬ３１５３が得られた。これらのプラス
ミドの模式図を図２にまとめる。これらのプラスミドはｈＣＭＶ−ＩＥ遺伝子の
プロモーターのエンハンサーとｍＳＭ２２遺伝子のプロモーターから構成される
ハイブリッドプロモーターをＭｌｕＩ−ＮｃｏＩフラグメントとして含む。
【００７３】 １．３．対照プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫ Ｔａｎａｋａら（Ｃｅｌｌ，６０（１９９０）３７５−３８６）により従来記
載されている発現ベクターｐＣＧＮはヘマグルチニンのエピトープをコードする
配列の上流にＨＳＶのｔｋ遺伝子の「リーダー」（＋５１／＋１０１）に融合し
たＣＭＶプロモーター（−５２２／＋７２）を含む。プラスミドｐＣＧＮ（１０
ｎｇ）をＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ｈＳＭａｃｔ及びｍＳＭ２２（実施
例１．１及び１．２）に使用した条件と同一条件下でＰＣＲ反応と増幅を行った
。使用したプライマーは以下の通りである。
【００７４】 −プライマー６７１８（５’ＣＣＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡ
ＡＴＧＧＣＣＣＧ３’）（配列番号９）。このプライマーは−５２２位（ｐＣＧ
ＮのＥｃｏＲＩ部位の８ヌクレオチド下流）でＣＭＶプライマーとハイブリダイ
ズする。
【００７５】 −プライマー６７１９（５’ｇＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＧＣ
ＴＧＧＣＣＧＡＡ３’）（配列番号１０）。このプライマーはｔｋ「リーダー」
の１０１位までハイブリダイズする。太字で示した最初のヌクレオチドＧは以下
に説明するようにｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＮｃｏＩ部位を復元するために用いら
れる。
【００７６】 こうして得られたＰＣＲフラグメントを精製後、Ｔ４ファージのポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりリン酸化した
。同時に、ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＮｃｏＩで直鎖
化し、精製後、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）で処理し、ＮｃｏＩ部位を充填した。このベクターを次にアルカリ
ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱リン酸化した後
、リン酸化ＰＣＲフラグメントの挿入に使用した。こうして、ＣＭＶ−ｔｋリー
ダーフラグメントをｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流で５’部
分（プライマー６７１８、ＣＭＶの−５２２位）と同じ向きにし、その３’末端
（プライマー６１７９、ｔｋリーダー）をｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＮｃｏＩ部位
（ルシフェラーゼの最初のＡＴＧ）に連結する場合のみに、プライマー６１７９
のグアノシン（Ｇ）はＮｃｏＩ部位を復元することができる。こうして得られた
プラスミドをｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫと命名する。
【００７７】 実施例２：ハイブリッドプロモーターのｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性 本実施例は本発明のハイブリッドプロモーターのｉｎ ｖｉｔｒｏ組織特異性
を立証する。
【００７８】 ２．１．細胞培養 ウサギ平滑筋細胞（ＳＭＣ）は２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥ
Ｍ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養
した。ＥＣＶ３０４細胞は１０％ＦＢＳを加えた１９９（登録商標）培地（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養した。筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２
、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＴＵ１８２細胞は１０％ＦＢＳを加えた
ＤＭＥＭ（登録商標）培地で培養した。２９３細胞はピルビン酸、非必須アミノ
酸及び１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養した。全培養は湿潤雰囲気で５％ＣＯ２分圧下
に３７℃インキュベーターで実施した。
【００７９】 ２．２．ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション トランスフェクションは２４ウェルプレートで実施し、各トランスフェクショ
ンを３回ずつ実施した。トランスフェクションの２４時間前に（ｉ）ウサギ平滑
筋細胞、ＥＣＶ３０４、ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞５×１０４個／ウェル、
（ｉｉ）ＴＵ１８２細胞１０５個／ウェル、（ｉｉｉ）Ｃ２Ｃ１２細胞３×１０ ４ 個／ウェル、（ｉｖ）２９３細胞２×１０５個／ウェルを播いた。
【００８０】 各ウェルにつき、１５０ｍＭ ＮａＣｌと５０ｍＭ重炭酸塩を含むＤＭＥＭ（
登録商標）培地（最終２０μｌ）中脂質６ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡの割合でプラス
ミドＤＮＡ５００ｎｇ（目的プラスミド２５０ｇとｐＵＣ１８ ２５０ｎｇ）を
カチオン脂質ＲＰＲ１２０５３５Ｂ（ＷＯ９７／１８１８５）と混合した。周囲
温度で２０分後にＤＮＡ／脂質混合物２０μｌをＦＢＳの不在下に細胞と２時間
接触させた。その後、各細胞型の培養に必要なＦＢＳ百分率が得られるように培
地にＦＢＳを加えた。
【００８１】 トランスフェクションから４８時間後に培地を捨て、細胞をＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で２回濯いだ。次に、Ｌｕｃｉｆｅｒ
ａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を製造業者の指示に従って使用してルシフェラーゼ活性を
測定した。
【００８２】 ２．３．ハイブリッドプロモーターの特異活性 ７種の異なる細胞型でｉｎ ｖｉｔｒｏ測定した（ｐＣＭＶ−ｌｅａｄ ＴＫ
に対する）ハイブリッドプロモーターの相対ルシフェラーゼ活性を図３及び４と
表１及び２にまとめた。これらの結果から明らかなように、ｈＳＭａｃｔ（表１
）及びｍＳＭ２２（表２）プロモーターの相対活性は文献（Ｓｋａｌｌｉら，Ｊ
．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３７（１９８９）３１５−３２１
； Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）７６３
１−７６４３； Ｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３２（１９９６）８４
９−８５９）に既に記載されている平滑筋細胞に対するこれらのプロモーターの
特異性を確かに実証している。実際に、ウサギＳＭＣにおける相対活性は他の細
胞型で観察される活性の少なくとも５倍以上であり、（ｉ）ｈＳＭａｃｔプロモ
ーターで５〜２０倍（表１）、（ｉｉ）ｍＳＭ２２プロモーターで５〜２５倍（
表２）である。
【００８３】 表１及び２に示す結果は、平滑筋細胞における本発明の４種のハイブリッドプ
ロモーター（Ｅｎｈ−ｈＳＭａｃｔ、ｈｎＥ−ｈＳＭａｃｔ、Ｅｎｈ−ｍＳＭ２
２及びｈｎＥ−ｍＳＭ２２）の活性がＣＭＶプロモーターと同等の強度であるこ
とを明示している。他方、別の細胞型におけるこれらのプロモーターの各々の相
対活性は平滑筋細胞で観察される活性に比較してｈＳＭａｃｔハイブリッドプロ
モーターで１０分の１以下、ｍＳＭ２２ハイブリッドプロモーターで４分の１以
下であり、（ｉ）ｈＳＭａｃｔハイブリッドプロモーターでは１０〜１４０分の
１、（ｉｉ）ｍＳＭ２２ハイブリッドプロモーターでは４〜５５分の１である。
従って、これらのハイブリッドプロモーターは特異的プロモーターｈＳＭａｃｔ
及びｍＳＭ２２で観察されると同一の組織特異性を維持する。
【００８４】 これらの結果は更に、本発明のハイブリッドプロモーターにおけるエンハンサ
ー領域の向きがその活性に有意影響がないことを示している。
【００８５】 従って、４種のハイブリッドプロモーターはプロモーターｈＳＭａｃｔ及びｍ
ＳＭ２２と同等又はそれ以上の組織特異性を維持しながら、（強力プロモーター
として知られる）ＣＭＶプロモーターと同等の強いｉｎ ｖｉｔｒｏ平滑筋細胞
特異性をもつ。
【００８６】 実施例３：ハイブリッドプロモーターのｉｎ ｖｉｖｏ特異性 本実施例は本発明のハイブリッドプロモーターのｉｎ ｖｉｖｏ組織特異性を
立証する。
【００８７】 ３．１．遺伝子の骨格筋導入 各プラスミドを５週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの前脛骨筋に筋肉内注射した。各
プラスミドは最終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で希釈し、１０μｇ／筋肉の割
合で注射した。注射から３日後にＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ（登録商標）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）２ｍｌに筋肉を取り、ホモジナイザーＤｉａｘ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）で粉砕し
た。次に、粉砕物を１５分間４０００ｇで遠心分離した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ
ｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）を製造業者の指示に従って使用してルシフェラーゼ活性を測定
した。
【００８８】 ３．２．骨格筋におけるハイブリッドプロモーターのｉｎ ｖｉｖｏ活性 マウス前脛骨筋に裸のＤＮＡを導入後に２種の特異的プロモーター（ｈＳＭａ
ｃｔ及びｍＳＭ２２）と本発明の２種のハイブリッドプロモーター（Ｅｎｈ−ｈ
ＳＭａｃｔ及びＥｎｈ−ｍＳＭ２２）のｉｎ ｖｉｖｏ相対活性も測定した。図
５にまとめる結果から明らかなように、プロモーターＥｎｈ−ｈＳＭａｃｔの活
性はＣＭＶプロモーターの１００分の１である。同様に、プロモーターＥｎｈ−
ｍＳＭ２２の活性はＣＭＶプロモーターの１７分の１である。このように、特に
ｉｎ ｖｉｖｏで使用されるモデルに最も近いモデルを構成するＣ２Ｃ１２細胞
でｉｎ ｖｉｔｒｏで観察される組織特異性はｉｎ ｖｉｖｏでも維持される。
【００８９】 実施例４：特異的ハイブリッドプロモーターの制御下にＧＡＸタンパク質を発
現する組換えアデノウイルスの構築 本実施例は、ＣＭＶエンハンサーとＳＭαアクチンプロモーターから構成され
る本発明のハイブリッドプロモーター（ｅｎｈ−ｈＳＭａｃｔ）に作動的に結合
したＧＡＸタンパク質をコードする遺伝子をもつアデノウイルスベクターに関す
る。
【００９０】 ヒトｇａｘ遺伝子は９１２塩基対を含み、細胞増殖停止に関与し、ヒト平滑筋
細胞増殖に役割を果たす３０３アミノ酸転写因子（増殖停止特異的ホメオボック
ス、ｇｒｏｗｔｈ−ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）をコ
ードする。このホメオドメイン遺伝子は最初に大動脈から単離され、特に成人心
臓血管組織で発現される（Ｇｏｒｓｋｉら，１９９３）。
【００９１】 ヒトｇａｘ遺伝子の配列はＷａｌｓｈら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９４），２
４，ｐ５３５）に報告されているヒトｇａｘ遺伝子から誘導される配列をプライ
マーとして使用することにより骨格筋ｃＤＮＡバンクからＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）によりクロー
ニングされた。その後、この配列は発現ベクターｐＸＬ３２９７でクローニング
された。このプラスミドはヒトＣＭＶ−ＩＥエンハンサー／プロモーター（−５
２２／＋７２）（Ｃｅｌｌ（１９８５），４１，ｐ５２１）とＳＶ４０のポリＡ
（２５３８〜２７５９）（ＧｅｎＢａｎｋ ｌｏｃｕｓ ＳＶ４ＣＧ）を含むプ
ラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から誘導される。
【００９２】 構築にはＳＭαアクチンプロモーターを予め導入しておいた実施例１に記載の
プラスミドｐＸＬ３１３０（図１）を使用した。プラスミドｐＸＬ３２９７はヒ
トｇａｘ遺伝子を含む発現ベクターである。このプラスミドを酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ及びＡｖｒＩＩで消化し、同様に酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化し
ておいた上記プラスミドｐＸＬ３２８２にヒトｇａｘ遺伝子を導入し、プラスミ
ドｐＸＬ３３００を得た。上記プラスミドの各構築段階を詳示した図６から明ら
かなように、最終プラスミドｐＸＬ３３１０は本発明により結合すると共にヒト
ＧＡＸタンパク質をコードする遺伝子に作動的に結合したＣＭＶ−ＩＥエンハン
サー及びＳＭαアクチンプロモーター（ｐＳＭＡ）から構成される発現カセット
とＳＶ４０ポリＡ終結シグナルを含む。
【００９３】 次に、ｇａｘ遺伝子の発現カセットをもつプラスミドとアデノウイルスをパッ
ケージング細胞にコトランスフェクトして相同組換えを行うにより、Ｅ１及びＥ
３領域を欠失する血清型５（Ａｄ５）の組換えヒトアデノウイルスにヒトｇａｘ
遺伝子の発現カセットを導入した。パッケージング細胞としては２９３系が好ま
しい。組換えウイルス粒子の感染及び単離から２又は３日後に塩化セシウム勾配
遠心分離によりパッケージング細胞を溶解させ、ヒトｇａｘ遺伝子の発現カセッ
トを含むアデノウイルスストックを生成した。
【００９４】 次に、ウイルス粒子を使用し、平滑筋細胞における本発明のプロモーターの制
御下のヒトｇａｘ遺伝子の発現を試験した。
【００９５】 ウサギ抗ｇａｘポリクローナル抗体を使用することにより、初代平滑筋細胞の
感染から２４時間後に免疫蛍光法又はウェスタンブロットによりＧＡＸタンパク
質の発現を確認した。
【００９６】 ｇａｘ遺伝子に含まれる配列をもつオリゴヌクレオチドを使用することにより
、平滑筋細胞の感染から２４時間後にドットブロットとノーザンブロットにより
メッセンジャーＲＮＡの発現を分析した。
【００９７】 ｇａｘ遺伝子をコードするアデノウイルスの生物活性の分析を次のように行っ
た。
【００９８】 （４８ウェルプレートで）リポフェクチン１２５ｎｇの不在下及び存在下にプ
ロモーターＥｎｈ−ｈＳＭａｃｔの制御下にＧＡＸタンパク質をコードする遺伝
子を含むアデノウイルスを指数増殖期の平滑筋細胞に感染させた。（可変希釈度
の）アデノウイルスとリポフェクタミンを無血清培地で周囲温度で３０分間イン
キュベートした。混合物又はウイルス単独を細胞と１時間３７℃で接触させた。
感染期間後に、ウイルスを含む培地を捨て、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地
で細胞をインキュベートした。感染後２４時間以内に培養物の半分について培地
を増殖培地に交換し、４８時間インキュベーションを続け、細胞をＳ期に進めた
。残りの半分の培養物については、弱分裂促進性培地を加えて細胞を休止基に維
持した。Ａｌａｍａｒプロトコールを使用することにより感染から７２時間後に
生存細胞を計数した。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｈＳＭαアクチンハイブリッドプロモーターを発現カセットに含むプラスミドの
模式図。
【図２】 ｍＳＭ２２αハイブリッドプロモーターを発現カセットに含むプラスミドの模
式図。
【図３】 初代培養ウサギ平滑筋細胞（ウサギＳＭＣ）、ヒト臍帯癌由来内皮細胞（ＥＣ
Ｖ３０４）、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）及びヒト子宮頚癌由来上皮細胞（Ｈ
ｅＬａ）でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクションにより評価したハイブ
リッドプロモーターの活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫで得られたルシ
フェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーターの相対活性を表す。Ｅｎｈ
−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモーターの上流に順方向にク
ローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸプロモーター
の上流に逆方向にクローニング。
【図４】 マウス胎仔繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、ヒトＯＲＬ癌由来細胞（ＴＵ１８２
）及び形質転換ヒト胎児腎細胞（２９３）でｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフ
ェクションにより評価したハイブリッドプロモーターの活性。プラスミドｐＣＭ
Ｖ−ｌｅａｄＴＫで得られたルシフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモ
ーターの相対活性を表す。Ｅｎｈ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエンハンサー配列をＸ
プロモーターの上流に順方向にクローニング。ｈｎＥ−Ｘ：ｈＣＭＶ−ＩＥのエ
ンハンサー配列をＸプロモーターの上流に逆方向にクローニング。
【図５】 マウス前脛骨筋Ｃ５７ＢＬ６でｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入により評価したハイ
ブリッドプロモーターの活性。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫで得られたル
シフェラーゼ活性に対する百分率として各プロモーターの相対活性を表す。
【図６】 ＡＶ１．０ＳＭＡ．Ｇａｘの構築段階を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 マフデイ，アブデライム フランス国、エフ−94440・マロル・ア ン・ブリ、リユ・デ・ベルジエ・41 (72)発明者 シエルマン，ダニエル フランス国、エフ−75012・パリ、リユ・ エラール・10 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA07 AA11 CA01 EA02 EA04 EA06 FA02 FA06 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AA97X AB01 AC14 BA01 4C084 AA13 ZB21 ZC02 4C087 BC83 ZB21 ZC02

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 強力な遍在性プロモーター／エンハンサーのエンハンサー領
    域の全部又は一部と、平滑筋細胞特異的発現を可能にするプロモーター領域を含
    むハイブリッドプロモーター。
  2. 【請求項２】 エンハンサー領域がサイトメガロウイルスの極初期遺伝子（
    ＣＭＶ−ＩＥ）のエンハンサー領域、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（ＬＴＲ−Ｒ
    ＳＶ）のエンハンサー領域、ＳＶ４０ウイルスのエンハンサー領域及びＥＦ１α
    遺伝子のエンハンサー領域から選択されることを特徴とする請求項１に記載のハ
    イブリッドプロモーター。
  3. 【請求項３】 エンハンサー領域がサイトメガロウイルスの極初期遺伝子（
    ＣＭＶ−ＩＥ）、好ましくはヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子（ｈＣＭ
    Ｖ−ＩＥ）のエンハンサー領域であることを特徴とする請求項２に記載のハイブ
    リッドプロモーター。
  4. 【請求項４】 プロモーター領域が平滑筋細胞のαアクチン（ＳＭａｃｔ）
    をコードする遺伝子又はＳＭ２２遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むこ
    とを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  5. 【請求項５】 ヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ
    ）のエンハンサー領域の全部又は一部と、平滑筋細胞のαアクチン（ＳＭａｃｔ
    ）をコードする遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むハイブリッドプロモ
    ーター。
  6. 【請求項６】 ヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ
    ）のエンハンサー領域の全部又は一部と、ＳＭ２２遺伝子のプロモーターの全部
    又は一部を含むハイブリッドプロモーター。
  7. 【請求項７】 プロモーター領域がベースプロモーターと、ＳＭａｃｔプロ
    モーター及び／又はＳＭ２２プロモーターから誘導され、組織特異性を付与する
    配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  8. 【請求項８】 請求項１から７のいずれか一項に記載のハイブリッドプロモ
    ーターの制御下に置かれた目的ＲＮＡ又はポリペプチドをコードする核酸を含む
    発現カセット。
  9. 【請求項９】 更に転写終結シグナルを含むことを特徴とする請求項８に記
    載のカセット。
  10. 【請求項１０】 核酸が細胞周期に関与するタンパク質、アポトーシスを誘
    導するタンパク質、平滑筋細胞の増殖を調節することが可能なタンパク質、血管
    形成を誘導するタンパク質及び転写因子から選択されるタンパク質をコードする
    ことを特徴とする請求項８又は９に記載のカセット。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載のハイブリッドプロモーター又は請求項８
    に記載のカセットを含むベクター。
  12. 【請求項１２】 プラスミド、コスミド又はウイルスによりパッケージング
    されていない任意ＤＮＡであることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 好ましくはアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウ
    イルス又はアデノ随伴ウイルスから誘導される組換えウイルスであることを特徴
    とする請求項１１に記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のベクターと化学的又は生化学的導入物
    質を含む組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の組換えウイルスと生理的に許容可能な
    キャリヤーを含む組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項８に記載のカセット又は請求項１１に記載のベクタ
    ーにより改変された細胞。
  17. 【請求項１７】 核酸を平滑筋細胞で選択的に発現させるための組成物を製
    造するための請求項１から７のいずれか一項に記載のハイブリッドプロモーター
    の使用。
  18. 【請求項１８】 核酸を血管近傍の内皮細胞ではなく平滑筋細胞で発現させ
    るための組成物を製造するための請求項１から７のいずれか一項に記載のハイブ
    リッドプロモーターの使用。
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