JP2002330786A - 抗炎症性ベクター - Google Patents

抗炎症性ベクター

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JP2002330786A JP2001311559A JP2001311559A JP2002330786A JP 2002330786 A JP2002330786 A JP 2002330786A JP 2001311559 A JP2001311559 A JP 2001311559A JP 2001311559 A JP2001311559 A JP 2001311559A JP 2002330786 A JP2002330786 A JP 2002330786A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】抗炎症性ベクターの提供。 【解決手段】本発明は、E3領域の少なくとも一部が欠失
しているかまたは非機能性であるアデノウイルスゲノム
に由来する組換えアデノウイルスベクターであって、機
能性14.7Kタンパク質、機能性14.5Kタンパク質、および
／または10.4Kタンパク質をコードするE3配列を保持し
ていることを特徴とする、上記アデノウイルスベクター
に関する。本発明は、宿主細胞、組織または生体におけ
る炎症反応から保護するための、アデノウイルスのE3領
域の少なくとも１個以上の遺伝子を個々にまたは組合わ
せて含んでなるポリヌクレオチドの使用にも関する。本
発明は、更に上記組換えアデノウイルスベクターまたは
上記ポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子、宿主
細胞、および組成物、並びに治療または予防目的でのそ
れらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明は、E3領域の少なくとも一部が欠
失しているかまたは非機能性であるアデノウイルスゲノ
ムに由来する組換えアデノウイルスベクターであって、
機能性14.7Kタンパク質、機能性14.5Kタンパク質、およ
び／または10.4Kタンパク質をコードするE3配列を保持
していることを特徴とする、上記アデノウイルスベクタ
ーに関する。本発明は、宿主細胞、組織または生体にお
ける炎症反応から保護するための、アデノウイルスのE3
領域の少なくとも１個以上の遺伝子を個々にまたは組合
わせて含んでなるポリヌクレオチドの使用にも関する。
本発明は、更に上記組換えアデノウイルスベクターまた
は上記ポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子、宿
主細胞、および組成物、並びに治療または予防目的での
それらの使用にも関する。本発明は、TNF（腫瘍壊死因
子）またはFasによって伝達される炎症性疾患の遺伝子
治療用途および保護において極めて興味深いものであ
る。
【０００２】遺伝子治療は、遺伝子材料の細胞または生
体への導入として定義することができる。遺伝子治療に
よるヒトの疾患の治療の可能性は、この数年間で理論的
考察の段階から臨床的応用の段階へと変化してきた。ヒ
トに応用された最初のプロトコールは、１９９０年９月
に米国においてアデニンデアミナーゼ(ADA)欠損症の患
者で開始された。この最初の有望な実験に続いて、遺伝
子治療に基づいた多くの新たな応用や有望な臨床試験が
現在進行中である（例えば、http://cnetdb.nci.nih.go
v/trialsrch.shtmlまたはhttp://www.wiley.co.uk/gene
therapy/clinical/に記載の臨床試験を参照された
い）。現在行われているプロトコールの大半は、治療を
行う細胞に治療遺伝子を運ぶためのベクターを用いてい
る。
【０００３】ウイルス性および非ウイルス性の２種類の
主要な遺伝子伝達ベクターがある。ウイルスベクターは
天然に存在するウイルスに由来し、野生型ウイルスが発
達して細胞膜を通過し、リソソーム分解を回避し、その
ゲノムを核に送達する多様且つ高度に複雑化した機構を
用いている。多くの種々のウイルスはベクターとして適
合しているが、最も進歩したものはレトロウイルス、ア
デノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)である(Ro
bbins et al., 1998, Trends Biotechnol. 16,35-40; M
iller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803-815; Montai
n et al., 2000, Tibtech 18, 119-128)。ポックスウイ
ルス（特にワクシニアウイルス）および単純疱疹ウイル
ス(HPV)の開発にもかなりの努力が傾注されている。非
ウイルス法としては、裸のDNA（すなわち、プラスミドD
NA；Wolff et al., 1990, Science 247, 1465-1468)、
カチオン性脂質と複合体形成したDNA（総説について
は、例えば、Rolland, 1998, Critical Reviews in the
rapeutic Drug Carrier Systems 15, 143-198を参照さ
れたい）、およびカチオン性ポリマーと縮合したDNAを
含んでなる粒子（Wagner et al., 1990, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87, 3410-3414、およびGottschalk et a
l., 1996, Gene Ther. 3, 448-457）が挙げられる。開
発の現段階では、ウイルスベクターが一般に最も効率的
なトランスフェクションを行うが、その主要な欠陥とし
てはそのクローニング容量が限定されており、免疫や炎
症応答を誘発しやすく、製造が難しいことが挙げられ
る。非ウイルスベクターはトランスフェクション効率が
劣るが、挿入サイズに制限がなく、免疫原性が低く、製
造が容易である。
【０００４】アデノウイルスは多くの動物種で検出され
ており、非組込み型であり、病原性は低い。それらは様
々な種類の細胞に感染することができ、静止細胞と同様
に分割する。それらは、気道上皮に対して天然の親和性
を有する。更に、それらは、多年にわたり生きた腸内ワ
クチンとして用いられており、安全性の特性に優れてい
る。最後に、それらは、増殖が容易であり、多量に精製
することができる。これらの特徴により、アデノウイル
スは治療およびワクチン目的の遺伝子治療ベクターとし
て用いるのに特に適している。
【０００５】それらのゲノムは、ウイルスサイクルを完
結するのに必要な約３０の遺伝子より多くを有する約３
６kbの線状二本鎖DNA分子からなっている。初期遺伝子
は、アデノウイルスゲノムに分散した４領域に分割され
る（E1〜E4）。E1、E2およびE4領域は、ウイルス複製に
とって本質的なものである。初期領域３（E3）は、E3領
域内で欠失した天然に存在する突然変異体またはハイブ
リッドウイルスは培養細胞における野生型ウイルスのよ
うに複製するという観察に基づいて「非本質領域」と呼
ばれている(Kelly and Lewis, 1797, J. Virol. 12, 64
3-652)。後期遺伝子（L1〜L5）は、その大半においてウ
イルスキャプシドを構成する構造遺伝子をコードする。
それらは、少なくとも部分的には初期転写ユニットと重
複し、ユニークプロモーターから転写される（MLP、主
要後期プロモーター）。更に、アデノウイルスゲノム
は、両末端にそれぞれ5'および3'ITR（逆方向末端反復
配列）であるDNA複製に本質的なシス作用領域、および
パッケージング配列を有する。
【０００６】E3領域はマップ単位（MU）76.6〜86.2（Ad
5ではヌクレオチド27329〜31103）に亙り、発現のため
のE1転写因子の存在に極めてストリンジェントに依存す
るそれ自身のプロモーター（E3プロモーター）によって
調節される。転写はアデノウイルスゲノムに関して左か
ら右へ起こり（センス配向）、スプライシングパターン
およびポリA部位利用のいずれにおいても異なっている
多種多様なmRNAを産生する。E3プロモーターから開始す
るmRNAによって潜在的にコードされる９種類のタンパク
質のうち、７種類が明確に同定されている。それらは、
推定分子量によってそれぞれ19、14.7、14.5、12.5、1
1.6、10.4および6.7kDaと命名されている。これまで
に、それらの５種類だけの機能が特定されている。E3 1
1.6Kタンパク質はアデノウイルス感染細胞のリーシスに
関与し(Tollefson et al., 1996, J.Virol. 70, 2296-2
306)、E3-gp19K、10.4K、14.5Kおよび14.7Kタンパク質
はアデノウイルス感染細胞に対する宿主免疫応答を減衰
させる免疫調節タンパク質である。
【０００７】最もよく特性決定されたE3タンパク質であ
るE3-gp19Kは、小胞体（ＥＲ）の膜に固定された内在性
膜タンパク質である。イン・ビトロでの研究により、E3
gp19Kタンパク質は、主要な組織適合複合体(MHC)クラ
スＩ抗原に結合することによるCTL（細胞傷害性Ｔリン
パ球）による細胞溶解をブロックすることが証明された
(Signas et al., 1982, Nature 299, 175-178)。この相
互作用により、ERにクラスＩ分子が保持され、それらの
細胞表面での発現(Burgert et al., 1985, Cell 41, 98
7-997)、究極的にはCTLによるアデノウイルス感染細胞
の認識(Andersson et al., 1987, J. Immunol. 138, 39
60-3966)が防止される。
【０００８】腫瘍壊死因子α(TNFα)は、感染時のアデ
ノウイルスクリアランスにとって重要であることが示さ
れている。TNFαは、多種多様な生理学的および免疫学
的効果に関与している強力なサイトカインである。これ
は、ウイルス感染、組織損傷、細菌内毒素および他のサ
イトカインに応答して活性化したマクロファージおよび
リンパ球によって分泌される。TNFαは特異受容体に結
合し、シグナル形質導入経路、転写因子およびタンパク
質キナーゼを活性化する。TNFαは、多種多様な原発性
腫瘍や形質転換細胞系に対して細胞傷害性である(Browi
ng and Ribolini, 1989, J. Immunol. 143, 1859-196
7)。ＴＮＦαはまた、感染細胞においてＤＮＡおよびＲ
ＮＡウイルスの両方の複製を抑制することができる（Me
stan et al.,, 1986, nature 323, 816-819）。TNFはホ
スホリパーゼA2(PLA2)を活性化して、炎症状態の確立に
関与するアラキドン酸(AA)を放出する。
【０００９】多数の実験的証拠が、それぞれ14.7K、10.
4Kおよび14.5Kである３種類のE3によってコードされた
タンパク質がTNFαによって誘導される細胞溶解およびT
NFによって誘導されるAAの放出を阻害することを示唆し
ている(Krajcsi et al., 1996, J. Virol. 70, 4904-49
13)。14.7Kタンパク質は、アデノウイルス感染細胞のサ
イトゾルおよび核の可溶性分画に見いだされる親水性タ
ンパク質である。14.7Kタンパク質がTNFαによって伝達
される細胞溶解を阻害する機構は完全には解明されてい
ないが、これはTNFα受容体シグナル形成経路を妨げる
ものと思われる。
【００１０】E3 10.4KおよびE3 14.5Kタンパク質は、TN
Fαの溶解作用から細胞を保護する複合体（受容体イン
ターナリゼーションおよび分解についてはRID複合体と
命名）として作用する内在性膜タンパク質である(Goodi
ng et al., 1991, J. Virol.65, 4114-4123)。これらの
タンパク質は細胞表面受容体調節において追加の機能を
有しており、分解のためリソソームにターゲッティング
することにより表皮増殖因子受容体、インスリン受容体
およびFas受容体（Fas）のインターナリゼーションを促
進することが示されている(Steward et al., 1995, J.
Virol. 69, 172-181; Shisler et al., 1997, J. Viro
l. 71, 8299-8306; Tollefson et al.,1998, Nature 39
2, 726-730)。RID複合体とこれらの細胞性タンパク質と
の相互作用の性質は知られていない。Fasは多数の組
織、特にＴ細胞、肝細胞、心臓および腎臓細胞で発現す
る。これは、多数の器官並びに免疫系のホメオスタシス
だけでなくCTLによるウイルス感染細胞の除去の中心と
なっている。
【００１１】アデノウイルスリード(adenoviruses lead
s)によってコードされる豊富な抗TNFα機能は、ウイル
ス病原性に関連していると考えられる。感染宿主におけ
るウイルスの保持に対するE3によってコードされたTNF
αアンタゴニストの実際の寄与は、トランスジェニック
マウスの気道上皮におけるE3-14.7K遺伝子の発現が肺の
炎症を減少し且つアデノウイルスベクター遺伝子発現を
高めるという観察を除けば、未だ検討されていない。
【００１２】更に、TNFαおよびFasは、多数の病理学的
症状にも関与している。例えば、高レベルのTNFαは、
リポ多糖類（LPS）およびConAによって誘導される肝臓
傷害などの多くの動物モデルにおける急性肝毒性に関連
している。これは、敗血症性ショックおよび劇症肝機能
不全における重要なメディエーターである(Jo et al.,2
000, Nat. Med. 6, 564)。高レベルの循環TNFは、ウイ
ルス性のＢおよびＣ型肝炎やアルコール性肝臓病の患者
では予知の価値はあまりない（Bradham et al.,1998, T
he American Journal of Physiology 275, 4387)。蓄積
された証拠は、Fasリガンド(FasL)と会合したFasが炎症
および組織損傷に対して寄与することを示唆している。
これらの分子の役割は、アルコールによって誘発される
肝硬変、肝炎、臓器移植拒絶反応、および自己免疫疾患
で示されている。
【００１３】現在遺伝子治療のプロトコールに用いられ
るアデノウイルスベクターはE1領域のほとんどを欠き、
環境および宿主生体における伝播を回避するためにウイ
ルスを複製欠損にしている。更に、アデノウイルスベク
ターのほとんどはE3も欠失しており、それらのクローニ
ング能を増加している。これらのベクターを用いて遺伝
子導入を行うことの可能性は、イン・ビボでの様々な組
織中で示されている（例えば、Yei et al., 1994, Hum.
Gene Ther. 5, 731-744; Dai et al., 1995,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 92, 1401-1405; Howell et al., 19
98, Hum. GeneTher., 9, 629-634; Nielsen et al., 19
98, Hum. Gene Ther. 9, 681-694;米国特許第６，０９
９，８３１号明細書;米国特許第６．０１３，６３８号
明細書を参照されたい）。しかしながら、それらの使用
は、多くの動物モデルにおける急性炎症および毒性(Yan
g et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 440
7-4411; Zsengeller et al., 1995, Hum. Gene Ther.
6, 457-467)、並びにウイルスベクターおよび遺伝子産
物に対する宿主免疫応答と関連し、感染細胞および一過
性の遺伝子発現が除去される。
【００１４】遺伝子発現の持続性は、特に慢性および遺
伝病の治療を考慮したヒト遺伝子治療プロトコールにお
けるアデノウイルスベクターの広汎な使用を考える前の
必要条件である。アデノウイルスによって伝達される遺
伝子発現を向上させるために、E3によってコードされた
タンパク質を発現するアデノウイルスベクターを作成す
ることが示唆されており、現在利用可能な検討が全E3領
域で行われている。欧州特許出願第ＥＰ７０７０７１号
明細書には、E1領域の代わりに挿入された外来遺伝子を
有し且つそれ自身のプロモーターによって駆動される完
全なサイズの野生型E3領域を保持している組換えアデノ
ウイルスが開示されている。実験データは、これらのＥ
１−Ｅ３＋アデノウイルスが外来遺伝子産物を発現させ
て様々な動物モデルで治療効果を提供することができる
ことを示しているが、比較データが全くないため、E3欠
失ウイルスと比較して全E3領域を保持していることの利
点は明確に示されてはいなかった。アデノウイルス免疫
応答の長期遺伝子発現および減衰は、強力且つ構成的プ
ロモーターによって駆動される全E3領域を含むE1欠失組
換えアデノウイルスを投与したラットモデルで観察され
た(Ilan et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
4, 2587-2592)。しかしながら、これらの検討のいずれ
においても、全E3領域の保持が感染宿主細胞の速やかな
除去、多面発現効果を有するプロ炎症性物質の一過性遺
伝子発現および活性化に関与する通常のアデノウイルス
ベクターで一般に見られる炎症および毒性に保護効果を
有するかどうかについては検討されていなかった。
【００１５】
【発明の概要】本発明は、14.7Kタンパク質および／ま
たは（10.4Kおよび14.5Kタンパク質の会合によって形成
した）RID複合体をコードするE3領域の（複数の）遺伝
子を保持する遺伝子治療のためのアデノウイルスベクタ
ーを提供する。意外なことには、14.7K発現アデノウイ
ルスベクターは、TNFによって誘導された肝病理のネズ
ミモデルで使用するとき、動物を炎症反応による死から
から保護することを見いだした。同様なモデルでは、RI
D発現アデノウイルスベクターが抗Fas抗体によって誘発
される急性肝炎を阻害する。これらの結果により、感染
細胞、組織または生体を炎症から保護するためのこれら
のベクターの機能性が確認される。
【００１６】従って、本発明の下にある技術的問題は、
これまでこの目的について開示した通常のベクターに関
連した多数の欠点を持たない組換えアデノウイルスベク
ター、および特にTNFまたはFasによって伝達されまたは
遺伝子治療（アデノウイルス）ベクターの投与によって
誘導される炎症疾患から保護する手段を提供することで
ある。
【００１７】
【発明の具体的説明】この問題は、特許請求の範囲に記
載の態様の提供によって解決される。
【００１８】従って、本発明は、E3領域の少なくとも一
部が欠失しておりまたは非機能性であるアデノウイルス
ゲノム由来の組換えアデノウイルスベクターであって、
該アデノウイルスベクターが （ｉ） 機能性１４．７Ｋタンパク質、 （ｉｉ） 機能性１４．５Ｋタンパク質、 （ｉｉｉ） 機能性１０．４Ｋタンパク質 をコードするE3配列を保持し、および／または該組換え
アデノウイルスベクターが目的遺伝子を含んでなり、上
記の保持されたE3配列と上記の目的遺伝子が宿主細胞に
おいてそれらを発現させる調節エレメントに作動可能に
連結されていることを特徴とする、組換えアデノウイル
スベクターに関する。
【００１９】本明細書で用いられる「由来する」という
用語は、上記の特徴は別として、本発明のアデノウイル
スベクターを構築する供給源として採用されるアデノウ
イルスゲノムが変化しないままであり、且つ5'ITR、パ
ッケージング配列、E1領域、E2領域、前に引用したE3遺
伝子の１個以上を保持している部分欠失E3領域、E4領
域、後期遺伝子、およびITR3'を含む。しかしながら、
本発明の範囲内では、アデノウイルスゲノムの供給源
は、上記特徴が含まれる限り（以後に示されるように）
当業者に知られている方法に準じて修飾することもでき
る。
【００２０】本発明に関して用いられる保持されたE3領
域は、単独でまたは組合わせて、直接または他の細胞ま
たはウイルス因子によって、炎症疾患、特にTNFおよび
／またはFasによって誘発される炎症から少なくとも部
分的に保護することができる。それらは、毒性（例え
ば、肝毒性）に対して防御することもでき、本発明のア
デノウイルスベクターが有する目的遺伝子の長期発現を
行うこともできる。
【００２１】E3領域は異なるアデノウイルス株間で変化
する可能性があるが、これは様々な起源での利用可能な
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいて(Wold et a
l.,1995, Current Topics in Microbiology and Immuno
logy 199, 237-274, 上記文献の内容は、その開示の一
部として本明細書に引用される)、または詳細に特性決
定されたAd5 E3領域（Ad5については登録番号M73260
で、またAd2についてはK02559でGenbankに開示されてい
る配列，Chroboczek et al., 1992, Virol. 186,280-28
6および米国特許第６，０４０，１７４号明細書，上記
文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用さ
れる）との相同性によって同定することができる。一つ
の指摘としては、E3領域はアデノウイルスゲノムの右末
端に位置し、E3プロモーターはE3領域の左端部分に存在
している。特に、Ad5ゲノムでは、14.7Kをコードする遺
伝子はヌクレオチド（nt）30453〜30839に亙り、14.5K
をコードする遺伝子はnt 30062〜30459に亙り、10.4Kを
コードする遺伝子はnt 29884〜30059に亙っている。野
生型アデノウイルス感染に関しては、RID複合体を構成
する14.5Kおよび10.4Kタンパク質は、同一RNAから翻訳
されると思われる。
【００２２】当業者であれば、通常の分子生物学の手法
によってアデノウイルスゲノムの元のE3領域を修飾し
て、１個以上の上記E3遺伝子を保持し且つ変更された
（非機能性）または欠失した非保持E3配列を有するE3領
域を得ることができる。特に、例えば、適当な制限また
はエンドヌクレアーゼ消化および再連結によりアデノウ
イルスE3領域からDNAの特異的部分を欠失することは、
当業者にとって十分に達成し得る範囲内のことである。
もう一つの可能性は、PCRによって保持されたE3配列を
単離することである。
【００２３】好ましくは、本発明の組換えアデノウイル
スベクターは、開始ATGから停止コドンに亙る上記E3配
列の１個以上の全コード配列を保持している。しかしな
がら、発現産物の炎症に対する保護能力が保存されるな
らば、変異体を用いることも可能である。変異体は、関
連した元のE3配列とは異なるがそのコーディング産物が
その本質的特性を保持している核酸を表す。一般に、変
異体は、１個以上のヌクレオチドまたは元の配列の任意
の位置におけるヌクレオチドの配列の欠失、付加および
／または置換によって得られる。このような修飾は、標
準的組換え手法（すなわち、突然変異、酵素による制限
切断および再連結、PCR技術など）によって得ることが
できる。有利には、本発明に関しては、変異体は元のE3
配列と高度の相同性を共有し、特に少なくとも７０％の
配列の同一性、更に好ましくは少なくとも８０％、更に
一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有す
る。特に好ましいものは、絶対的同一性である。元の配
列と７０％の配列同一性を有する変異体とは、ヌクレオ
チド配列が元のヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌク
レオチド当たり３０までの点突然変異を含み、これはサ
イレントであるかまたはコードされたアミノ酸残基の修
飾を生じることができることを意図するものである。実
際的方法としては、特定の変異体が参考配列（元のE3配
列）に対して少なくとも７０％同一であるかどうかを伝
統的に既知のコンピュータープログラムを用いて決定す
ることができる。変異体と元の配列との間の最良の全般
的組合せを決定するための好ましい方法は包括的配列整
合(global sequence alignment)とも呼ばれ、Brutlag e
t al. (1990, Comp. App. Biosci. 6, 237-245)のアル
ゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを用
いて決定することができる。
【００２４】当業者であれば、変異体が機能性である
（細胞、組織または生体を以後に定義されるような炎症
疾患から保護することができる）かどうかを決定するこ
とができる。変異体の機能性は、変異体の発現産物によ
って示される抗炎症特性を関連した元のE3配列の発現産
物によって示される抗炎症特性と比較することによって
イン・ビトロでも（適当な培養細胞での発現産物の関連
機能、例えばEGF受容体のダウンレギュレーション、Fas
またはTNFによって伝達されるアポトーシスの阻害を評
価することにより）、またはイン・ビボでも（ガラクト
サミンおよびLPS、または抗Fas抗体投与マウスであっ
て、それぞれTNFまたはFasによって伝達される炎症を再
生するような炎症動物モデル）容易に決定することがで
きる。抗炎症特性を分析するためのイン・ビトロおよび
イン・ビボでの実験条件は、本明細書の例１および２に
提供される。しかしながら、当業者に熟知されている他
の方法も本発明に関して用いることができる。好ましく
は、本発明に用いられる変異体は、元のE3配列とほぼ同
程度またはこれより広範囲の抗炎症特性を示す。
【００２５】第一の態様によれば、本発明による組換え
アデノウイルスベクターは機能性14.7Kタンパク質をコ
ードするE3配列を保持している。特定の態様では、保持
されたE3配列は元の14.7Kタンパク質をコードするE3遺
伝子にある。
【００２６】第二の態様によれば、本発明による組換え
アデノウイルスベクターは機能性14.5Kおよび10.4Kタン
パク質をコードするE3配列を保持している。特定の態様
では、これらの配列は（同一プロモーターによって調節
される）ジシストロンとして配置され、（野生型に関し
てみられるように）10.4Kコード配列は14.5Kコード配列
に先行し、10.4Kコード配列の終止コドンは14.5Kコード
配列の開始コドンから２bpだけ離れている。この立体配
置は10.4Kおよび14.5Kタンパク質の効率的に産生させる
のに有利であることが観察されている。特定の態様で
は、保持されたE3配列は元の14.5Kおよび10.4Kタンパク
質をコードするE3遺伝子にある。E3 10.4Kコード配列お
よび14.5Kコード配列を同一アデノウイルスベクター
（同一または異なる位置）または２個の別個のアデノウ
イルスベクターに挿入された（独立したプロモーターに
よって調節される）独立したシストロンとして発現させ
ることも可能である。
【００２７】本発明のアデノウイルスベクターが機能性
14.5Kおよび10.4Kタンパク質をコードする態様によれ
ば、上記タンパク質が宿主細胞で会合して複合体、例え
ばいわゆるRID複合体を形成できることが好ましい。
【００２８】本発明のアデノウイルスベクターに保持さ
れたE3配列は、調節エレメントに作動可能に結合して、
宿主細胞でそれらを発現させる。「作動可能に結合し
て」とは、調節エレメントと目的遺伝子とが併置され、
それらが予想された方法で操作できる関係にあることを
表す。例えば、プロモーターが遺伝子を転写することが
できる場合には、プロモーターは目的遺伝子に作動可能
に結合する。プロモーターと目的遺伝子との機能性関係
が保存されている限りはそれらの間に追加の残基がある
ことがある。
【００２９】このような調節エレメントは、天然の調節
エレメント（例えば、E3プロモーター）であることがで
きる。もう一つの好ましい態様によれば、保持されたE3
配列は、構成的または調節可能（誘導性または組織特異
的）であることができる異種プロモーターによって調節
される。適当なプロモーターの代表適例としては、(i)
SV40（シミアンウイルス40）プロモーター、単純疱疹ウ
イルスチミジンキナーゼ遺伝子(TK-HSV-1)のプロモータ
ー、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTR、およびアデノウイ
ルス主要後期プロモーター(MLP)のようなウイルスプロ
モーター、(ii)高等真核生物におけるタンパク質コード
遺伝子の転写を調節する任意の細胞プロモーター、例え
ば構成的PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子(Ad
ra et al., 1987, Gene 60, 65-74)、肝特異的α１−ア
ンチトリプシンおよびFIX遺伝子、平滑筋細胞特異的SM2
2遺伝子(Moessler et al., 1996, Development 122, 24
15-2425;ＥＰ００４４０２０８．７号明細書)のプロモ
ーターが挙げられるが、これらに限定されない。サイト
メガロウイルスの極初期プロモーター（CMVプロモータ
ー）が、本発明に関して好ましい（Boshart et al., 19
85, Cell 41, 521）。
【００３０】発現を安定させるには、保持されたE3配列
がスプライシング配列を含んでなることが有利であるこ
とがある。それらは、（E3配列に対して）相同性または
非相同性（すなわち、任意の真核生物遺伝子由来または
合成起源のもの）であることがある。スプライシング配
列は文献に公表されており、当業者には容易に得ること
ができる。実例としては、αまたはβグロブリン（ウサ
ギまたはヒト）、アポリポタンパク質、免疫グロブリ
ン、IX因子、VIII因子およびCFTRをコードする遺伝子か
ら単離したスプライシング配列、およびマウス免疫グロ
ブリン受容体に融合したヒトβグロブリンドナーからな
るpCIベクター(Promega)に含まれるキメラスプライシン
グ配列が挙げられる。
【００３１】本発明によるアデノウイルスベクターに保
持されたE3配列は、そのようなベクター中に天然に存在
するものであることができる。特に、それらは、その天
然の位置に留まることができる。しかしながら、このベ
クターは、総てのE3配列、特に全E3領域を欠失し、アデ
ノウイルスベクターの同一または他のアデノウイルス主
鎖から保持されたE3配列をE3領域が通常存在する位置ま
たは異なる位置に、例えば欠失したE1領域の代わりに挿
入することによって構築することも可能である。
【００３２】好ましくは、本質的なウイルス遺伝子と重
複するE3配列は、欠失されない（例えば、L4後期遺伝子
と重複するE3領域の5'末端に存在する12.5Kをコードす
るE3配列）。本質的ウイルス遺伝子と重複しているE3配
列を、本質的な遺伝子産物の産生が阻害されるような方
法で（例えば、突然変異によって）欠失または変更すれ
ば、補完細胞系(complementing cell line)またはヘル
パーウイルスによって本質的ウイルス産物の産生をイン
トランスに補完することができる。
【００３３】好ましい態様では、本発明のアデノウイル
スベクターはE3 gp19Kタンパク質をコードする配列を保
持しない。
【００３４】保持されたE3配列は、それらが位置してい
る野生型領域の転写の方向に対してセンスまたはアンチ
センスで配向させることができる。特に、本発明のアデ
ノウイルスベクターが機能性14.7Kタンパク質をコード
するE3配列を保持するときには、上記の保持されたE3配
列を(i) E3領域が通常に存在する位置に元のE3領域の転
写方向に対してアンチセンス配向で、または(ii) E1領
域が通常存在し、元のE1領域の転写方向に対してセンス
配向で挿入するのが好ましい。機能性14.5Kタンパク質
および機能性10.4Kタンパク質をコードするE3配列を保
持するアデノウイルスベクターの態様に関しては、上記
の保持されたE3配列をE3領域が通常に存在する位置に元
のE3領域の転写方向に対してセンス配向で挿入するのが
好ましい。
【００３５】本発明によるアデノウイルスベクターを、
Heise and Kirn (2000, J. Clin. Invest. 105, 847-85
1)に記載されているように、条件的に複製するように処
理し、特異的宿主細胞（すなわち、増殖細胞）で選択的
に複製するようにすることができる。
【００３６】もう一つの好ましい態様によれば、本発明
のアデノウイルスベクターは、少なくともE1領域の全体
または部分的欠失および／またはE1領域を構築する１個
以上の遺伝子の突然変異によって複製性欠損である。有
利には、E1欠失がヒトアデノウイルス５型（Genbankに
登録番号M73260で、およびChroboczek et al., 1992,Vi
rol. 186, 280-285に開示されている）の配列に関して
ほぼヌクレオチド459〜3328または459〜3510をカバーす
る。好ましくは、pIX遺伝子と重複するE1配列は、欠失
されない。
【００３７】更に、アデノウイルスベクターの主鎖は、
追加の修飾（１個以上のウイルス遺伝子の１個以上のヌ
クレオチドの欠失、挿入および／または突然変異）を含
んでなることがある。アデノウイルス配列は、E2領域の
全部または一部を欠失することもある。E2修飾の一例
は、遺伝子をコードするDBP（DNA結合タンパク質）の感
熱突然変異(thermosensible mutation)によって示され
る(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339)。
アデノウイルス配列は、E4領域の全部または一部を欠失
していることもある。ORF 3および4またはORF 3および6
/7を保持している部分欠失が有利であることがある（例
えば、欧州特許出願第ＥＰ９７４６６８号明細書および
ＷＯ００／１２７４１号明細書を参照されたい）。ITR
およびパッケージング配列を保持し且つウイルス抗原の
残基合成をなくするための実質的遺伝子修飾を含むアデ
ノウイルスベクターを考えることもできる（ＷＯ９４／
２８１５２号明細書；Lusky et al., 1998, J. Virol.
72, 2022-2032）。
【００３８】本発明により用いるのに適するアデノウイ
ルスは、ヒトまたは動物供給源、特にイヌ（例えば、CA
V-1またはCAV-2; それぞれGenbank参照番号CAV1GENOMお
よびCAV77082）、トリ（Genbank参照番号AAVEDSDNA）、
ウシ（例えば、BAV3; Seshidhar Reddy et al., 1998,
J. Virol. 72, 1394-1402）、ネズミ（Genbank参照番号
ADRMUSMAV1）、ヒツジ、ネコ、ブタ、またはサルアデノ
ウイルス、またはそれらのハイブリッド由来であること
ができる。任意の血清型を用いることができる。しかし
ながら、サブグループＣのヒトアデノウイルスが好まし
く、特にアデノウイルス2 (Ad2)および5 (Ad5)が好まし
い。概して、引用されたウイルスはATCCのようなコレク
ションで入手することができ、それらの配列、組織およ
び生物学を記載している多数の刊行物の主題となってお
り、熟練者であればそれらを応用することができる。例
えば、ヒトアデノウイルス５型の配列は、Genebankデー
タベース（登録番号M73260）およびChroboczek et al.
(1992, Virol. 186, 280-285)に開示されており、その
内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００３９】上記のように、本発明のアデノウイルスベ
クターは組換え体であり、調節エレメントに作動可能に
結合した目的遺伝子を含んでなり、宿主細胞で発現させ
ることができる。
【００４０】「目的遺伝子」という用語は、任意の起源
であり且つゲノムDNA、cDNA、またはRNAをコードする任
意のDNA、例えばゲノムRNA、mRNA、アンチセンスRNA、
リボソームRNA、リボザイム、またはトランスファーRNA
から単離することができる核酸を表す。目的遺伝子は、
オリゴヌクレオチド（すなわち、１００bp未満の短いサ
イズの核酸）であることもできる。これは、ゲノムDNA
から処理して１個以上のイントロン配列（すなわち、ミ
ニジーン）の全部または一部を除去することができる。
【００４１】好ましい態様では、本発明で用いられる目
的遺伝子は、治療上目的遺伝子産物をコードする。「治
療上目的遺伝子産物」は、患者、特に疾患または疾病に
罹っているまたはこの疾患または疾病から保護すべき患
者に適当に投与するときに、治療または保護活性を有す
るものである。このような治療または保護活性は、上記
疾患または上記疾病の症状の経過に対する有益な効果に
相関させることができる。治療を行う疾患または疾病に
よって治療上重要な適当な遺伝子産物をコードする遺伝
子を選択することは、当業者が到達し得る範囲内のこと
である。一般的には、上記で得た結果に基づいて選択を
行うことにより、特許請求の範囲に記載の発明の実施を
除き過度の実験を行うことなく、このような治療特性を
得ることを合理的に期待することができる。
【００４２】本発明に関して、目的遺伝子は、これを導
入する宿主細胞に対して相同性または非相同性であるこ
とができる。有利なことには、それは、ポリペプチド、
リボザイム、またはアンチセンスRNAをコードする。
「ポリペプチド」という用語は、サイズに関わらずポリ
ヌクレオチドの任意の翻訳生成物として理解されるべき
であり、７残基（ペプチド）程度を有するポリペプチド
が挙げられるが、更に典型的にはタンパク質が挙げられ
る。更に、これは、任意の起源（原核生物、下等または
高等真核生物、植物、ウイルスなど）に由来することが
できる。それは、天然のポリペプチド、変異体、天然で
は対応するものを持たないキメラポリペプチドまたはそ
れらの断片であることができる。有利には、本発明に用
いられる目的遺伝子は、動物またはヒト生体における１
個以上の欠陥または欠損細胞性タンパク質を保証するこ
とができまたは毒性効果により身体から有害な細胞を制
限しまたは除去する作用を行う少なくとも１種類のポリ
ペプチドをコードする。適当なポリペプチドは、免疫付
与性であり、抗原として作用して体液性または細胞性応
答または両方を誘発することもできる。
【００４３】目的遺伝子によってコードされるポリペプ
チドの代表例としては、細胞サイクルに関与したポリペ
プチド、例えばp21、p16、網膜芽腫(Rb)遺伝子の発現産
物、キナーゼインヒビター（好ましくはサイクリン依存
型）、GAX、GAS-1、GAS-3、GAS-6、Gadd45、およびサイ
クリンA、BおよびD、アポトーシス誘導物質、例えばp5
3、Bas、Bcl2、BclX、Bad、およびそれらの拮抗物質、
血管新生ポリペプチド、例えば脈管内皮増殖因子（VEG
F;すなわちヘパリン結合VEGF Genbank登録番号M3297
7）、トランスフォーミング増殖因子（TGF、特にTGFα
およびβ）、上皮増殖因子（EGF）、繊維芽細胞増殖因
子（FGF、特にFGFαおよびβ）、腫瘍壊死因子（TNF、
特にTNFαおよびβ）、CCN（CTGF、Cyr61、Nov、Elm-
1、Cop-1およびWisp-3など）、散乱因子／肝細胞増殖因
子（SH/HGF）、アンギオゲニン(angiogenin)、アンギオ
ポエチン(angiopoietin)（、特に１および２）、アンギ
オテンシン−２、プラスミノーゲンアクチベーター(tP
A)、およびウロキナーゼ(uPA)、サイトカイン（インタ
ーロイキン、特にIL-2、IL-6、IL-8、IL-12、コロニー
刺激因子、例えばGM-CSF、G-CSF、M-CSFなど）、IFN
α、IFNβ、またはIFNγ、細胞増殖を現象または阻害す
ることができるポリペプチドであって、抗体、毒素、免
疫毒素、癌遺伝子発現産物を阻害するポリペプチド（例
えば、ras、mapキナーゼ、チロシンキナーゼ受容体、増
殖因子）、Fasリガンド、自殺遺伝子産物、宿主免疫系
を活性化するポリペプチド（MUC-1、パピローマウイル
スなどの初期または後期抗原）など、細菌、寄生生物ま
たはウイルスの感染またはその発生を阻害することがで
きるポリペプチド、例えば抗原決定基、競争によるウイ
ルスの天然タンパク質の作用を阻害するトランスドミナ
ント変異体（欧州特許第６１４９８０号明細書、ＷＯ９
５／１６７８０号明細書）、HIV受容体CD4の細胞外ドメ
イン(Traunecker et al.,1988, Nature 331, 84-86)、
免疫接着(Capon et al., 1989, Nature 337,525-531; B
yrn et al., 1990, Nature 344, 667-670)、免疫毒素(K
urachi et al.,1985, Biochemistry 24, 5494-5499)、
および抗体(Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 19
1-195)、免疫刺激ポリペプチド、例えばB7.1、B7.2、IC
AMなど、酵素、例えばウレアーゼ、レニン、トロンビ
ン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼ（eNOS
およびiNOS）、SOD、カタラーゼ、ヘムオキシゲナー
ゼ、リポタンパク質リパーゼ類、酸素ラジカルスキャベ
ンジャー、酵素阻害剤、例えばα１−アンチトリプシ
ン、アンチトロンビンIII、プラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビターPAI-1、メタロプロテイナーゼ1-4の
組織阻害剤、病理学的状況に関与する欠損細胞機能を少
なくとも部分的に回復することができるポリペプチド、
例えばジストロフィンまたはミニジストロフィン（ミオ
パシーに関して）、インスリン（糖尿病に関して）、凝
固因子（血友病に関してFVIII、FIX）、CFTR（嚢胞性繊
維症に関して）、血管新生インヒビター、例えばアンギ
オスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、転写因
子、例えばDNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、
および転写を活性化または阻害するドメインを含んでな
る核受容体（例えば、エストロゲン、ステロイドおよび
プロゲステロン受容体由来の融合生成物）、マーカー
（β−ガラクトシダーゼ、CAT、ルシフェラーゼ、GFPな
ど）、および臨床症状の治療または予防に有用であると
認められている任意のポリペプチドからなる群から選択
されるポリペプチドが挙げられるが、それらに限定され
ない。
【００４４】目的遺伝子としては、元の配列に対する１
個以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または修飾
を挙げることができる。
【００４５】本発明に関して、「自殺遺伝子」という用
語は、任意の遺伝子であって、その産物が不活性物質
（プロドラッグ）を細胞傷害性物質に転換することによ
って細胞死をもたらすことができるものを包含する。HS
V-1のチミジンキナーゼ(TK)をコードする遺伝子は、自
殺遺伝子類の原型を構成し(Caruso et al., 1993, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et a
l., 1992, Science 256,1550-1552)、アシクロビールま
たはガンシクロビールのようなヌクレオシド類似体（プ
ロドラッグ）の毒性ヌクレオシドへの形質転換を触媒し
て新たに形成されるDNA鎖に組込み、細胞分裂を阻害す
る。多数の自殺遺伝子／プロドラッグの組合せが、現在
用いられている。更に具体的にあげることができるもの
は、シトシンデアミナーゼをコードする細菌および真菌
遺伝子(Erbs et al., 1997, Curr.Genet. 31, 1-6; Ｗ
Ｏ９３／０１２８１号明細書; 欧州特許第４０２１０８
号明細書)、およびウラシルホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Anderson et al.,1992, Eur. J. Biochem. 2
04, 51-56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157）で
あり、これらはプロドラッグ５−フルオロシトシン(5-F
C)と共に用いることができる。本発明は、ＷＯ９６／１
６１８３号明細書およびＷＯ９９／５４４８１号明細書
に記載されているような突然変異体自殺遺伝子の使用も
包含する。
【００４６】上記のように、目的遺伝子としては、特異
的細胞RNA、好ましくは癌遺伝子および原癌遺伝子(c-my
c、c-fos、c-jun、c-myb、c-ras、KcおよびJE)のような
選択された正に作用する増殖調節遺伝子、に結合して不
活性化することができるアンチセンス配列およびリボザ
イムをコードする遺伝子のＲＮＡも挙げられる。
【００４７】上記のように、目的遺伝子は、調節エレメ
ントに作動可能に結合して、宿主細胞でそれを発現させ
る。このような調節エレメントとしては、任意のウイル
ス、細菌または真核生物遺伝子から（あるいは目的遺伝
子から）得ることができ、構成的または調節可能とする
ことができるプロモーターが挙げられる。場合によって
は、これを修飾して、その転写活性を改良し、ネガティ
ブ配列を欠失し、その調節を変更し、適当な制限部位を
導入することなどを行うことができる。適当なプロモー
ターとしては、アデノウイルスE1a、MLP、PGK、MT（メ
タロチオネイン;Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Bio
l. 7, 838-848）、α−１アンチトリプシン、CFTR、界
面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン、SRα、SV4
0、RSV LTR、TK-HSV-1、SM22、デスミン（ＷＯ９６／２
６２８４号明細書）、および初期CMVが挙げられるが、
それらに限定されない。あるいは、乳癌および前立腺癌
で過剰発現したMUC-1 (Chen et al., 1995, J. Clin. I
nvest. 96, 2775-2782)、結腸癌で過剰発現したCEA（癌
胎児性抗原）コード遺伝子(Schrewe et al., 1990,Mol.
Cell. Biol. 10, 2738-2748)、乳癌および膵臓癌で過
剰発現したERB-2コード遺伝子(Harris et al., 1994, G
ene Therapy 1, 170-175)、および肝臓癌で過剰発現し
たα−フェトプロテインコード遺伝子(Kanai et al., 1
997, Cancer Res. 57, 461-465)のプロモーターのよう
な主要細胞で過剰発現した遺伝子から単離した増殖細胞
中で活性化することができるプロモーターを用いること
もできる。
【００４８】目的遺伝子発現を制御する調節エレメント
は、エキソン／イントロン配列、ターゲッティング配
列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在化シグナル配
列、IRES、ポリA転写終止配列、トリパルタイトリーダ
ー配列(tripartile leader sequences)、複製または組
込みに関与する配列のような追加エレメントを含むこと
もできる。上記エレメントは文献に記載されており、当
業者であれば容易に入手することができる。
【００４９】本発明のアデノウイルスベクターは、１個
以上の目的遺伝子を含んでなることができる。これに関
して、自殺遺伝子産物とサイトカイン（例えば、IL-2、
IL-8、IFNγ、GM-CSF）または免疫刺激ポリペプチド
（例えば、B7.1、B7.2、ICAMなど）をコードする遺伝子
の組合せが本発明に関して有利であることがある。異な
る目的遺伝子を、同一（ポリシストロン性）または別個
の調節エレメントであって同一または逆方向でベクター
内の様々な部位に挿入することができるものによって制
御することができる。
【００５０】本発明は、炎症性疾患から宿主細胞、組織
または生体を保護するための、アデノウイルスのE3領域
の少なくとも１個以上の遺伝子を個々にまたは組合わせ
て含んでなるポリヌクレオチドの使用も提供する。好ま
しくは、アデノウイルスのE3領域の上記（複数の）遺伝
子は、機能性14.7K、14.5Kおよび10.4Kタンパク質をコ
ードする遺伝子からなる群から選択される。
【００５１】アデノウイルスのE3領域のある種の遺伝子
の発現が炎症の保護にとって有利であるという知見は、
アデノウイルスベクター以外の発現ベクターでこのよう
な効果を得る上でも重要である。従って、アデノウイル
スE3領域の１個以上の遺伝子は、一般に細胞性因子（例
えば、TNFおよび／またはFas）または細胞外因子（例え
ば、目的遺伝子、特に細胞傷害性遺伝子を発現させる組
換えアデノウイルスベクター）の様々な因子によって伝
達される炎症性疾患から保護するために用いることがで
きる。
【００５２】本明細書で用いられる「ポリヌクレオチ
ド」という用語は、ヌクレオチドまたはその類似体の任
意の長さのポリマー性形態を定義する。これは、任意の
可能な核酸（RNA、DNA）、特にDNAを包含し、これは一
本または二本鎖、線状または環状、天然または合成であ
ることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレ
オチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオ
チドを含んでなることができる（修飾の例としては、米
国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第４，
７１１，９５５号明細書またはＥＰＡ３０２１７５号明
細書を参照されたい）。このようなポリヌクレオチド
は、存在している核酸供給源（例えば、ゲノム性，DN
A）から得ることができるが、（例えば、オリゴヌクレ
オチド合成によって生成した）合成品であることもでき
る。その配列は、非ヌクレオチドエレメントによって中
断してもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に更に修
飾することもできる。
【００５３】上記のように、E3領域は異なるアデノウイ
ルス株間で変化することができる。しかしながら、アデ
ノウイルスのE3領域並びにそれに含まれる遺伝子を同定
することは、十分に当業者の技術の範囲内にある。従っ
て、当業者であれば、アデノウイルスゲノムからE3領域
の少なくとも１個以上を含んでなるポリヌクレオチドを
単離して、本発明に準じて用いることが可能である。E3
遺伝子およびそれらの発現を制御する調節エレメントに
関しては、本発明によるアデノウイルスベクターに関し
て既述したのと同じものが適用される。
【００５４】（複数の）E3遺伝子は、単独でまたは組合
わせて、直接または他の細胞またはウイルス性因子によ
って宿主細胞、組織または生体を炎症性疾患から保護す
ることができる。本明細書で用いられる「宿主細胞、組
織または生体を炎症性疾患から保護する」という表現
は、本発明で用いるポリヌクレオチドの存在下での炎症
状態をポリヌクレオチドの非存在下または発現の非存在
下と比較した場合の改良を表す。結果として、上記ポリ
ヌクレオチドを発現する宿主細胞、組織または生体は炎
症を起こしにくく、上記ポリヌクレオチドを含まないま
たは発現しない宿主細胞、組織または生体より一層速や
かにまたは一層効率的に回復する。このような炎症状態
の改良は、TNF、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、および／
またはIFNβのような炎症反応の経過中に産生される１
個または数個の炎症マーカーの濃度を測定することによ
って（血液循環中に存在するおよび／またはそのコグネ
イト受容体に会合したこれらのマーカーの少なくとも１
種類が２以上のファクターだけ減少することは、炎症状
態の改良を示している）、または器官の病理学的分析に
よって（リンパ球浸潤の減少が観察されたことは、炎症
状態の改良と解釈することができた）、または炎症状態
を模倣して動物の生存率を測定することによって（少な
くとも３日間にわたって少なくとも２のファクターだけ
生存率が増加することは、炎症状態の改良と解釈するこ
とができた）決定することができる。手続きを行う一つ
の方法は、保持された（複数の）E3遺伝子を運ぶポリヌ
クレオチドと炎症状態を確立および／または発生させる
生成物（例えば、TNF依存性炎症を誘発するグルコサミ
ンおよびLPS、Fas依存性炎症を誘発する抗Fas抗体、ア
デノウイルス依存性炎症を誘発するアデノウイルス粒
子）とをマウスに投与し、E3発現ポリヌクレオチドを投
与されなかったコントロールマウスと比較して数日間に
わたって生存率を決定することである。
【００５５】場合によっては、本発明に関して用いられ
るポリヌクレオチドは、炎症状態（特に、肝毒性）と関
連することが多い毒性反応を減少または抑制することも
できる。毒性状態の改良は、一般に肝毒性と関連してい
るトランスアミナーゼのような毒性反応の経過中に産生
される１または数個のマーカーの血清レベルを測定する
ことによって（ファクターの２以上の減少は、毒性状態
の改良を示唆する可能性がある）、または器官の病理学
的分析によって（壊死または組織変性の観察し得るほど
の減少は、毒性状態の改良を示唆する可能性がある）、
または毒性反応を模倣して動物の生存率を測定すること
によって（少なくとも３日間にわたってファクターが少
なくとも２だけ生存率が増加することは、毒性状態の改
良と解釈することができる）測定することができる。
【００５６】本発明の好ましい態様は、(i) 機能性14.7
Kタンパク質をコードするアデノウイルスのE3領域の遺
伝子、または(ii) 機能性14.5Kタンパク質および機能性
10.4Kタンパク質をコードするアデノウイルスのE3領域
の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを包含する。こ
れに関して、上記機能性14.5Kタンパク質および上記機
能性10.4Kタンパク質は宿主細胞中で会合して、複合
体、すなわちいわゆるRID複合体を形成することができ
ることが好ましい。特定の態様では、ポリヌクレオチド
は14.7Kタンパク質をコードするE3遺伝子または14.5Kお
よび10.4Kタンパク質を両方ともコードするE3遺伝子に
ある。
【００５７】好ましくは、本発明で用いられる（複数
の）E3遺伝子は、完全なコード配列、すなわち開始ATG
コドンから終止コドンまでを含んでなる。しかしなが
ら、このようなE3遺伝子の機能性変異体、すなわち上記
で定義したように、機能性E3産物を更にコードする欠
失、突然変異またはトランケイション(truncation)によ
って得られた変異体を用いることが可能である。
【００５８】本発明の範囲で用いられる（複数の）E3遺
伝子は、上記のように任意のアデノウイルス起源（動物
またはヒト）由来であることができる。好ましくは、そ
れらは、サブグループＣのヒトアデノウイルス、特に好
ましくはAd2またはAd5由来のものである。
【００５９】本発明で用いられるポリヌクレオチドに含
まれる（複数の）E3遺伝子は、調節エレメントに作動可
能に結合して宿主細胞、組織または生体中で発現させ
る。このようなエレメントとしては、真核生物またはウ
イルス起源の任意の遺伝子から単離することができるプ
ロモーターが挙げられる。E3遺伝子は相同E3プロモータ
ーによって制御することができるが、上記に引用したも
のから選択することができる非相同プロモーター（調節
可能または構成的）を用いるのが好ましく、CMVの極初
期プロモーターが好ましい。当業者であれば、上記ポリ
ヌクレオチドを適当なプロモーターに適切に結合するこ
とができる。ポリヌクレオチドが数個のE3遺伝子を含ん
でなるときには、これらをユニークプロモーターまたは
独立したプロモーターから発現させることができる。こ
の場合には、異なるE3カセットが同一または反対方向で
あり且つ１個以上のベクター内の同一または異なる位置
にあることができる。しかしながら、ユニークプロモー
ターを用いて選択したE3配列の転写を行うことが、特に
ポリヌクレオチドが機能性14.5Kタンパク質および機能
性10.4Kタンパク質を両方ともコードする場合に好まし
い。これに関連して、野生型の場合に見られるように、
14.5Kコード配列の前に10.4Kコード配列があり、10.4K
タンパク質の終止コドンは14.5Kタンパク質の開始コド
ンから２bpだけ離れているようにするのが有利である。
【００６０】発現を安定化させるには、（複数の）E3遺
伝子がスプライシング配列を保持しまたは含んでなるこ
とが有利であることがある。それらは、相同性（E3配列
由来）または非相同性（任意の真核生物遺伝子または合
成起源由来）であってもよい。上記に引用したものなど
の当該技術分野の状態で記載した多種多様なスプライシ
ング配列は、本発明に関して適当である。
【００６１】本発明で用いられるポリヌクレオチドを発
現ベクターに挿入するのが有利である。このような発現
ベクターは、調節エレメントに作動可能に結合した目的
遺伝子を含んでなり、宿主細胞で発現させることもでき
る。目的遺伝子および調節領域の性質に関しては、本発
明によるアデノウイルスベクターに関連して既述したの
と同じことが適用される。
【００６２】本発明に関しては、発現ベクターはプラス
ミドまたはウイルスベクターであることができる。ポリ
ヌクレオチドと目的遺伝子を同一発現ベクターに挿入す
る好ましい態様では、それらを同じ位置（すなわち、E1
-アデノウイルスベクター中の欠失したE1配列の代わり
に）または異なる位置（例えば、欠失したE1配列の代わ
りに目的遺伝子および元のE3領域の代わりにポリヌクレ
オチド、またはその逆）に挿入することができる。それ
ぞれ上記ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を有する２
種類の独立した発現ベクターを用いることも可能であ
る。この場合には、両方のベクターを、宿主細胞、組織
または生体に一緒に（同時トランスフェクションまたは
同時感染）または別個に導入することができる。特に、
目的遺伝子を有するベクターが炎症疾患を誘発しやすい
ときには、この前にポリヌクレオチドを有するベクター
を投与するのが好ましい。
【００６３】「プラスミド」という用語は、所定の細胞
で自発複製を行うことができる染色体外環状DNAを表
す。適当なプラスミドの範囲は、極めて大きい。好まし
くは、プラスミドは細菌での増幅および真核生物の標的
細胞での発現のためにデザインされる。このようなプラ
スミドは、様々な製造業者から購入することができる。
適当なプラスミドとしては、pBR322 (Gibco BRL)、pUC
(Gibco BRL)、pBluescrip (Stratagene)、pREP4、pCEP4
(Invitrogene)、pCI (Promega)、およびpPoly (Lathe
et al., Gene 57 (1987), 193-201)から誘導されるもの
が挙げられるが、これらに限定されない。これは、標準
的分子生物学の手法(Sambrook et al., 実験室便覧(Lab
oratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, コールドスプリングハーバー(1989), ニューヨー
ク)によって作成することもできる。これは、選択遺伝
子を含んでなり、トランスフェクションした細胞（例え
ば、細胞栄養要求性の相補性または抗生物質耐性によ
る）、安定化エレメント（例えば、cer配列, Summers a
nd Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103)、または組込
みエレメント（例えば、LTRウイルス配列およびトラン
スポゾン）を選択または同定することもできる。
【００６４】好ましい態様は、ヘルペスウイルス、サイ
トメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイル
ス、セムリキ森林ウイルス、AAV（アデノ随伴ウイル
ス）、ポックスウイルス、アデノウイルス、およびレト
ロウイルスからなる群から選択されるウイルス由来のウ
イルスベクターの使用に関する。このようなウイルスベ
クターは、当該技術分野で周知である。「由来」とは、
ウイルスゲノムのコードまたは非コード部分に含まれる
１または数個のヌクレオチドの（複数の）欠失、付加お
よび／または置換などの１以上の修飾を導入することに
よって元のウイルスゲノムから遺伝学的に作成されるこ
とを意味する。
【００６５】本発明に特に適するウイルスベクターは、
アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクタ
ーの性質および構造、挿入されるE3遺伝学の位置、およ
び調節領域に関しては、本発明によるアデノウイルスベ
クターに関して上記したのと同じことが適用される。
【００６６】本発明で用いられるポリヌクレオチドは、
シス作用配列を除き、アデノウイルスゲノムの任意の位
置に挿入することができる。好ましくは、上記のアデノ
ウイルスベクターは、E1領域の全部または一部および元
のE3領域の全部が欠失されているかまたは非機能性であ
るアデノウイルスゲノムに由来する。更に、アデノウイ
ルス主鎖は、追加の修飾を含んでなることもできる。特
定の態様は、E2、E4および／またはL1〜L5領域の１個以
上のウイルス遺伝子が更に欠失または非機能性であるア
デノウイルスベクターの使用を包含する（このような修
飾の実例は上記に引用されている）。上記のように、本
発明による使用に適合するアデノウイルスは、人のヒト
または動物供給源から誘導することができ、任意の血清
型を用いることができ、アデノウイルス２(Ad2)および
５(Ad5)が特に好ましい。本発明は、特定のアデノウイ
ルス（すなわち、ヒトアデノウイルス５）のゲノム由来
のアデノウイルスベクターおよび別のアデノウイルス
（すなわち、ヒトアデノウイルス２）のゲノムから単離
した（複数の）E3遺伝子を有するポリヌクレオチドの使
用を包含する。
【００６７】本発明で用いられる（複数の）E3遺伝子
は、欠失した領域、特に好ましくは欠失したE1および／
またはE3領域の代わりに挿入され、問題の領域の転写方
向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置され
る。好ましくは、ポリヌクレオチドが機能性14.7Kタン
パク質をコードするときには、上記アデノウイルスベク
ターの(i) E3領域が一般に存在し、元のE3領域の転写方
向に対してアンチセンス配向であるか、または(ii) E1
領域が一般に存在し、元のE1領域の転写方向に対してセ
ンス配向である位置に挿入される。ポリヌクレオチドが
機能性14.5Kタンパク質および機能性10.4Kタンパク質を
コードする態様に関しては、上記ポリヌクレオチドは、
好ましくは上記アデノウイルスベクターのE3領域が一般
に存在し、元のE3領域の転写方向に対してセンス配向で
ある位置に挿入される。
【００６８】更に、アデノウイルス粒子または空のアデ
ノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第５，９２
８，９４４号明細書に記載のウイルス依存性同時インタ
ーナリゼーション法によって核酸（例えば、プラスミド
ベクター）を導入することもできる。この方法は、ポリ
カルベン、または１個以上の脂質層を含んでなる脂質小
胞のような（複数の）カチオン性化合物の存在下で行う
ことができる。
【００６９】レトロウイルスベクターも、適当である。
レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転
写酵素を用いて複製する組込みウイルス(integrative v
iruses)のクラスであって、感染した宿主細胞の染色体D
NAに組込まれる二本鎖DNAにウイルスRNAゲノムを複製す
る。文献に記載されている多数のベクター、特にネズミ
白血病ウイルス、特にMoloney(Gilboa et al., 1988, A
dv. Exp. Med. Biol. 241, 29)またはFriend's FB29株
（ＷＯ９５／０１４４７号明細書）由来のものを、本発
明の枠内で用いることができる。一般に、レトロウイル
スベクターはウイルス遺伝子gag、polおよびenvの全部
または一部を欠失しており、5'および3'LTRおよびキャ
プシド化配列を保持している。これらのエレメントを修
飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安
定性を増加させることができる。このような修飾として
は、VL30のようなレトロトランスポゾンの一つによるレ
トロウイルスキャプシド化配列の置換が挙げられる（米
国特許第５，７４７，３２３号明細書）。目的遺伝子は
一般に非レトロウイルスプロモーターによって制御さ
れ、生成するカセットはキャプシド化配列の下流、好ま
しくはレトロウイルスゲノムの転写方向に対してアンチ
センス配向で挿入される。
【００７０】ポックスウイルスは、DNAゲノムが大きい
ことおよび複製の細胞質部位によって上記ウイルスとは
区別される複雑なエンベロープウイルスのグループであ
る。ポックスウイルスの幾つかのメンバーのゲノムはマ
ッピングされて、配列決定されている。これは約２００
のタンパク質であって、そのうちの約１００がウイルス
組立てに関与しているものをコードする約２００kbの二
本鎖DNAである。本発明に関連して、ポックスウイルス
ベクターは、ポックスウイルスの任意のメンバー、特に
カナリア痘ウイルス、鶏痘およびワクシニアウイルスか
ら得ることができ、後者が好ましい。適当なワクシニア
ウイルスとしては、Copenhagen株(Goebel et al., 199
0, Virol. 179, 247-266 and 517-563; Johnson et a
l., 1993, Virol. 196, 381-401)、Wyeth株および改良A
nkara (MVA)株(Antoine et al., 1998, Virol. 244, 36
5-396)が挙げられるが、それらに限定されない。アデノ
ウイルスE3領域の１個以上の遺伝子および場合によって
は目的遺伝子を含んでなるワクシニアウイルスを構築す
るための一般的条件は、当該技術分野で周知である（例
えば、Copenhagenワクシニアウイルスについては欧州特
許第８３２８６号明細書および欧州特許第２０６９２０
号明細書、およびMVAウイルスについてはMayret al., 1
975, Infection 3, 6-14およびSutter and Moss, 1992,
Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89, 10847-10851を参照さ
れたい）。
【００７１】（複数の）E3遺伝子および目的遺伝子は、
好ましくは非コード遺伝子間領域、または不活性化また
は欠失がウイルス増殖および複製を著しく損なわない任
意のポックスウイルス遺伝子のようなポックスウイルス
ゲノム内の非本質的座に挿入される。チミジンキナーゼ
遺伝子は、Copenhagenワクシニアウイルスに挿入するの
に特に適している(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J.
Virol. 46, 530-537)。MVAに関する限り、発現カセッ
トの挿入は、切出しI〜VIIのいずれかで、好ましくは切
出しII〜III で(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol.
72, 1031-1038; Sutter et al., 1994,Vaccine 12,1032
-1040)、またはD4R座で行うことができる。鶏痘ウイル
スについては、チミジンキナーゼ遺伝子および／または
非コード遺伝子間領域内での挿入を考えることができる
（例えば、欧州特許第３１４５６９号明細書および米国
特許第５，１８０，６７５号明細書を参照されたい）。
欠陥機能がヘルパーウイルスを介してまたはプロデュー
サー細胞系での発現によってイン・トランスで供給され
る場合には、本質的ウイルス座での挿入を考えることも
できる。
【００７２】有利な態様によれば、本発明に用いられる
ウイルスまたは特に非ウイルス（すなわち、プラスミ
ド）ベクターは、脂質および／またはポリマー（合成ベ
クター）と複合体形成することができる。好ましい脂質
は、核酸に高親和性を有し且つ細胞膜と相互作用するカ
チオン性脂質である(Felgner et al., 1989, Nature 33
7, 387-388)。結果として、それらは核酸と複合体を形
成することにより、細胞に入ることができるコンパクト
な粒子を生成することができる。適当な脂質としては、
DOTMA (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 84, 7413-7417)、DOGSまたはTransfectam
（商品名）(Behr et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86, 6982-6986)、DMRIEまたはDORIE (Felgner e
t al., 1993, Methods 5, 67-75)、DC-CHOL (Gao- and
Huang, 1991, BBRC 179, 280-285)、DOTAP （商品名）(M
cLachlan et al., 1995, Gene Therapy 2, 674-622)、L
ipofetamine（商品名）、およびグリセロ脂質化合物
（牡牛９０１４６３号明細書およびＷＯ９８／３７９１
６号明細書を参照されたい）が挙げられるが、これらに
限定されない。
【００７３】適当なポリマーは、好ましくはポリアミド
アミン(Haensler and Szoka, 1993,Bioconjugate Chem.
4, 372-379)のようなカチオン性ポリマー、樹脂状ポリ
マー（ＷＯ９５／２４２２１号明細書）、ポリエチレン
イミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６
５５号明細書）、ポリリシン（ＵＳ−Ａ−５５９５８９
７号明細書または仏国特許第２７１９３１６号明細
書）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号明細
書）、またはDEAEデキストラン(Lopata et al.,1984, N
ucleic Acid Res. 12, 5707-5717)である。
【００７４】本発明は、ウイルス粒子の調製法であっ
て、(i) 本発明に準じて用いられるアデノウイルスベ
クターまたは本発明に準じる使用に関して記載したウイ
ルス発現ベクターを許容細胞に導入して、トランスフェ
クションした許容細胞を得て、(ii) 該トランスフェク
ションした許容細胞を適当な時間、適当な条件下で培養
して、上記ウイルス粒子を産生させ、(iii) 細胞培養物
から該ウイルス粒子を回収し、(iv) 場合によっては、
上記の回収したウイルス粒子を精製する、ことを含んで
なる、方法にも関する。
【００７５】ベクターは、当該技術分野で知られている
様々な方法のいずれか一つによって許容細胞に導入する
ことができる。ベクターまたはその断片のトランスフェ
クションによって、リポフェクション、電気穿孔によっ
て、および／または感染によって続行することができ
る。許容細胞は、好ましくは補完細胞であり、感染性ウ
イルス粒子を産生するのに必要な総ての遺伝子産物をイ
ン・トランスで提供する。ビリオンは培養上清から回収
することができるが、化学的、機械的または任意の他の
手段によって（例えば、一連の融解／凍結サイクルによ
って）溶解することができる細胞から回収することもで
きる。場合によっては、ビリオンは、標準的手法（クロ
マトグラフィー、超遠心、例えば塩化セシウムグラディ
エントなどにおいて）によって増幅し、精製することが
できる。
【００７６】もう一つの態様では、本発明は、本発明に
よるアデノウイルスベクター、または本発明の使用に関
連して記載したウイルス発現ベクターを含んでなる、ウ
イルス粒子にも関する。
【００７７】アデノウイルス粒子は、許容細胞系（例え
ば、Graham and Prevect, 1991, 分子生物学の方法(Met
hods in Molecular Biology), Vol 7, 遺伝子導入およ
び発現プロトコール(Gene Transfer and Expression Pr
otocols); E.J. Murray監修,The Human Press Inc, ク
リントン, ニュージャージーに記載）またはEscherichi
a coli（ＷＯ９６／１７０７０号明細書に記載）におけ
る相同組換えのような当該技術分野における任意の通常
の方法によって調製することができる。増殖は、補完細
胞系でまたはイン・トランスに補完するヘルパーウイル
スの存在下で行うのが有利である。「補完(complementi
ng)」または「相補性」は、ベクターを欠いているが成
長力のあるウイルス粒子の生成に必要な機能をコードし
および／または発現する能力を表す。細胞系293 (Graha
m et al., 1977, J. Gen. Virol.36, 59-72)およびPERC
6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 190
9-1917)は、E1機能を補完する目的で普通に用いられ
る。二重欠陥ベクターを補完する目的で、他の細胞系に
遺伝子工学処理が行われている(Yeh et al., 1996, J.
Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Hu
man Gene Ther. 6, 1575-1586; Wang et al., 1995, Ge
ne Ther. 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J. Virol.
72, 2022-2033; 欧州特許第９１９６２７号明細書およ
びＷＯ９７／０４１１９号明細書)。アデノウイルス粒
子は培養上清から回収することができるが、リーシスの
後に細胞から回収することもでき、場合によっては標準
的手法（ＷＯ９６／２７６７７号、ＷＯ９８／００５２
４号およびＷＯ９８／２６０４８号明細書に記載のクロ
マトグラフィー、超遠心）によって増幅し、精製するこ
とができる。更に、ビリオンを許容細胞で連続的経路に
よって増幅し、臨床ロットの調製に用いることができる
高力価のウイルス貯蔵物を生成することができる。
【００７８】レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルス
の存在下でまたはレトロウイルスが欠いているレトロウ
イルス遺伝子（例えば、gag/polおよびenv）をゲノム中
に組込んで含んでいる適当な相補性（パッケージング）
細胞系で調製される。このような細胞系は、従来の技術
に記載されている(Miller and Rosman, 1989, BioTechn
iques 7, 980; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Nat
l. Acad. Sci USA 85,6460; Markowitz et al., 1988,
Virol. 167, 400)。env遺伝子の産物は標的細胞の表面
に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関
与しているので、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定
する。本発明に関しては、両種指向性エンベロープタン
パク質を含み、ヒトおよび他の腫の宿主細胞に感染する
PA317細胞(ATCC CRL 9078)または293E16（ＷＯ９７／３
５９９６号明細書）のようなパッケージング細胞系を用
いるのが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましく
は培養上清から回収され、場合によっては標準的手法
（例えば、クロマトグラフィー、超遠心）によって更に
精製することができる。
【００７９】ポックスウイルス粒子は、当業者が利用で
きる多数の文献に記載されている方法で調製される（Pi
ccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545
-563; 米国特許第４，７６９，３３０号明細書; 米国特
許第４，７７２，８４８号明細書;４，６０３，１１２
号明細書;米国特許第５，１００，５８７号明細書およ
び米国特許第５，１７９，９９３号明細書）。開発され
ている主要な手法は、挿入を行う遺伝子（例えば、ポリ
ヌクレオチドおよび／または目的遺伝子）を含むドナー
プラスミドと野生型ポックスウイルスゲノムとの間の相
同組換えを用いている。一般に、ドナープラスミドは、
E. coliで構築されて、増幅され、通常の手続きによっ
て単離される。次に、これをポックスウイルスゲノムと
共に適当な細胞培養物（例えば、ニワトリ胎児繊維芽細
胞）に導入に、相同組換えによって本発明のポックスウ
イルス粒子を産生する。それらは、培養上清からまたは
培養済細胞からリーシス段階（化学物質、凍結／融解、
低浸透圧ショック、機械的ショック、音波処理など）の
後に回収することができ、必要ならば、野生型混入物か
ら連続ラウンドのプラーク精製によって単離した後、当
該技術分野の手法（クロマトグラフィー法、塩化セシウ
ムまたはスクロースグラディエントでの超遠心）を用い
て精製することができる。
【００８０】本発明は、特定の標的細胞を優先的にター
ゲッティングするように修飾されたベクターまたは粒子
も包含する。（ポリマー−および脂質−複合体形成した
ベクターのようなウイルスおよび非ウイルス性起源の）
本発明のターゲッティングしたベクター／粒子の特徴
は、細胞性および表面露出成分を認識して、結合するこ
とができるターゲッティング残基が表面に存在すること
である。このようなターゲッティング残基としては、化
学的接合体、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー
（例えば、PEG、ポリリシン、PEIなど）、ペプチド、ポ
リペプチド（例えば、ＷＯ９４／４０９５８号明細書に
記載のようなJTS1）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、
抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が挙げられ
るが、これらに限定されない。それらは、好ましくは細
胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、
ウイルス抗原、抗原エピトープまたは腫瘍関連マーカー
を任意して、これに結合することができる。
【００８１】細胞型特異的ターゲッティングは、ウイル
ス表面タンパク質の修飾による広汎な宿主範囲を有する
ウイルス由来のベクターで行うことができる。例えば、
アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に含
まれる細胞受容体に付着することによって決定される。
これに関して、アデノウイルスキャプシドの表面に存在
する繊維およびペントンが、細胞付着に重要な役割を果
たす(Defer et al., J. Virol. 64 (1990), 3661-367
3)。従って、アデノウイルスの細胞ターゲッティング
は、繊維および／またはペントンをコードするウイルス
遺伝子の遺伝子修飾によって行い、ユニークな細胞表面
ポリペプチドと特異的相互作用が可能な修飾した繊維お
よび／またはペントンを産生することができる。このよ
うな修飾の例は、文献に記載されている（例えば、Wick
am et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg
et al., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael et al.,
1995,Gene Therapy 2, 660-668; ＷＯ９４／１０３２
３号明細書）。例えば、EGFをコードする配列をアデノ
ウイルス繊維をコードする配列内に挿入することによ
り、EGF受容体発現細胞をターゲッティングできる。
【００８２】細胞特異的ターゲッティングの他の方法
は、抗体または抗体断片をレトロウイルスエンベロープ
タンパク質に接合することによって(Michael et al., 1
993, J. Biol. Chem. 268, 6866-6869; Roux et al., 1
989, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86, 9079-9083; Mill
er and Vile, 1995, FASB J. 9, 190-199およびＷＯ９
３／０９２２１号明細書）、および核酸結合ドメインと
ターゲッティング残基とを有するポリペプチドの接合
（ＷＯ９５／０２８４９４号明細書）によって行われて
きた。
【００８３】本発明は、本発明のアデノウイルスベクタ
ーを含んでなる宿主細胞、本発明の使用に関して定義し
たまたは本発明のウイルス粒子に感染したポリヌクレオ
チドまたは発現ベクターも提供する。宿主細胞はユニー
ク型の細胞または異なる型の細胞の群であってもよく、
培養済細胞系、主要細胞および増殖細胞を包含し、ヒト
起源の細胞が特に好ましい。好ましい宿主細胞として
は、繊維芽細胞、筋肉細胞（例えば、心筋細胞、筋繊維
芽細胞、衛星細胞、筋細胞、筋原細胞、平滑筋細胞、特
に動脈系、具体的には血管系のもの）、造血細胞（全能
幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージな
ど）、肺、気管、肝、上皮および内皮細胞が挙げられ
る。
【００８４】本発明は、組成物、好ましくは作用薬とし
て本発明によるアデノウイルスベクター、本発明の使用
に関して記載したポリヌクレオチドまたは発現ベクタ
ー、本発明によるまたは本発明の方法によって調製した
宿主細胞またはウイルス粒子を含んでなる医薬組成物に
も関する。特別な場合には、この組成物は２種類以上の
E3遺伝子、ベクター、ウイルス粒子または真核生物宿主
細胞を含んでなることができ、これらは(i)上記E3遺伝
子、および／または(ii)宿主細胞で発現させる調節エレ
メント、および／または(iii)ベクターによって最終的
には支持される目的遺伝子、および／または(iv)ベクタ
ー主鎖（backbone）の性質によって異なることがある。
【００８５】本発明による組成物は、全身、局所および
局部投与などの様々な投与様式について通常の方法で製
造することができる。全身投与については、注射、例え
ば、静脈内、腹腔内、胃内、皮下、心臓内、動脈内、冠
動脈内、血管内、動脈内、筋肉内、鞘内、腫瘍内、鼻
内、肺内、または気管内経路が好ましい。局部投与とし
ては、エアゾール化点滴注入、および経口投与が挙げら
れる。投与は、単回用量で、または一定時間間隔の後に
１〜数回反復される用量で行うことができる。適当な投
与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば個
人、治療を行う症状または疾患、疾患が進行した段階、
予防または治療の必要性、および導入される目的遺伝子
によって変化する。一つの指針としては、ウイルス粒子
に基づく組成物は、１０４〜１０１４iu（感染単位）、
有利には１０５〜１０１３iu、好ましくは１０６〜１０
１２iuの用量の形態で処方することができる。力価は、
通常の手法によって測定することができる（例えば、Lu
sky et al., 1998,上記引用を参照されたい）。DNAベク
ターの用量は、好ましくは０．０１〜１０mg/kgであ
り、更に具体的には０．５〜２mg/kgである。本発明の
組成物は様々な形態、例えば固形物（粉末、凍結乾燥形
態）または液体（例えば、水溶液）を採ることができ
る。
【００８６】好ましい態様では、組成物は、薬学上許容
可能なキャリヤーを含んでなり、ヒトまたは動物の治療
処理法に用いることができる。この特別な場合には、キ
ャリヤーは、好ましくは使用投薬量および濃度ではヒト
または動物体に毒性のない薬学上適当な注射用キャリヤ
ーまたは希釈液である（例えば、レミントンの製薬科学
(Remington's Pharmaceutical Science), 第１６版，１
９８０年, Mack Publishing Coを参照されたい）。これ
は、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、
スクロース溶液によって提供されるような比較的低いイ
オン強度を有する。更に、これは、任意の関連溶媒、滅
菌した発熱物質不含水、分散媒、コーティングなどを含
んでなる水性または部分的に水性液体キャリヤー、また
は希釈液（例えば、（Tris-HCl、アセテート、ホスフェ
ート）、乳化剤、可溶化剤、賦形剤またはアジュバント
を含むことができる。組成物のpHを適当に調節して、緩
衝し、ヒトまたは動物での使用に適するようにする。注
射用組成物のキャリヤーまたは希釈剤の代表例として
は、水、等張食塩溶液であって、好ましくは生理pHで緩
衝されているもの（例えば、リン酸緩衝食塩水、Tris緩
衝食塩水、マンニトール、デキストロース、グリセロー
ル含有または不含ポリペプチドまたはタンパク質、例え
ばヒト血清アルブミン）が挙げられる。例えば、このよ
うな組成物は、１０mg/mlマンニトール、１mg/mlHSA、
２０mM Tris pH7.2および１５０mM NaClを含んでなるこ
とができる。
【００８７】更に、本発明による組成物は、脂質（例え
ば、ＷＯ９８／４４１４３号明細書; Felgner et al.,
1987, Proc. West. Pharmocol. Soc. 32, 115-121; Hod
gsonand Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 3
39-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry
5, 647-654に記載されているようなカチオン性脂質、リ
ポソーム、脂質）、ヌクレアーゼインヒビター、ヒドロ
ゲル、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３号明細
書）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート化剤（欧州特
許第８９０３６２号明細書）のような１種類以上の安定
化物質を含み、動物／人体内でその分解を保存し、およ
び／または宿主細胞への送達を改良することができる。
このような物質は、単独でまたは組合わせて（例えば、
カチオン性および中性脂質）用いることができる。これ
は、動脈内経路による送達を促進するポリリシンとラク
トースのゲル複合体(Midoux et al., 1993, Nucleic Ac
id Res. 21, 871-878)、またはポロキサマー407 (Pasto
re, 1994, Circulation90, I-517)のような特殊な用途
の遺伝子導入を促進しやすい物質を含んでなることもで
きる。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不
安定化し、細胞中へのDNAの摂取を促進することができ
ることも示されている。アデノウイルスを脂質複合体形
成したプラスミドベクターを含む溶液に混合し、または
タンパク質架橋剤を用いてアデノウイルスに共役結合し
たポリリシンにDNAを結合させると、ベクターの摂取お
よび発現を実質的に向上させることができる(Curiel et
al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247
-252)。
【００８８】本発明の組成物は、特に敗血症ショック、
劇症肝障害、肝炎（特にＢおよびＣ型肝炎）、肝硬変、
アルコール性肝疾患、化学療法によって誘発される毒
性、臓器移植拒絶反応、免疫障害（例えば、慢性炎症ま
たは自己免疫）、腫瘍性疾患（例えば、腫瘍および腫瘍
転移）、および結合組織障害（例えば、慢性関節リウマ
チ、アテローム性硬化症）のような炎症性疾患からの保
護（予防または治療）を目的とするものである。
【００８９】好ましい応用は、遺伝子治療ベクターの投
与に関連した炎症疾患からの保護である。通常の遺伝子
治療ベクターの投与は治療される生体に急性炎症および
毒性と関連づけられ、これにより上記生体から感染細胞
が除去され、遺伝子発現が速やかに喪失する。本発明の
アデノウイルスベクター、またはポリヌクレオチドおよ
び発現ベクターは、少なくとも部分的にこのような炎症
疾患および／または毒性から保護することができ、従っ
て遺伝子発現を延長することができる。遺伝子発現は、
フローサイトフルオリメトリー、ELISA、免疫蛍光、ウ
ェスタンブロッティング、生物活性測定などの標準的方
法によってイン・ビトロ（例えば、培養細胞中）で、ま
たはイン・ビボ（例えば、動物モデル）で経時的に遺伝
子産物のレベルを評価することによって測定することが
できる。本発明のアデノウイルスベクター、ポリヌクレ
オチドによって支持される（複数の）E3遺伝子を含まな
いまたは発現しないコントロールと比較して遺伝子発現
が向上することは、遺伝子産物の量に関して、または発
現の持続性（更に長時間にわたる安定性）に関して見る
ことができる。
【００９０】本発明は、遺伝子導入、好ましくはヒトま
たは動物体への遺伝子導入を目的とする医薬品を調製す
るための、本発明によるアデノウイルスベクター、本発
明による使用に関連して記載したポリヌクレオチドまた
は発現ベクター、本発明によるウイルス粒子または宿主
細胞の使用を提供する。本発明の範囲内では、「遺伝子
導入」は任意の目的遺伝子を細胞中に導入するための方
法として理解すべきである。従って、これは、潜在的に
抗原性エピトープを細胞に導入して、細胞性または体液
性または両方でもあることができる免疫応答を誘発する
ことに関する免疫治療をも包含する。
【００９１】この目的のため、本発明のアデノウイルス
ベクター、ポリヌクレオチドおよび発現ベクター、また
はウイルス粒子は、治療を行う病因に適合した特異的な
送達手段によってヒトまたは動物体にイン・ビボで送達
することができる。例えば、アデノウイルスベクター、
ポリヌクレオチドを有する発現ベクター、またはウイル
ス粒子をコーティングしたバルーンカテーテルまたはス
テントを用いて、（Riessen et al., 1993, Hum. Gene
Ther. 4, 749-758; Feldman and Steg, 1996,Medecine/
Science 12, 47-55に記載されているように）循環器系
に効率的に到達することができる。直接投与によって、
例えば、エアゾール化などによる肺の接近可能な腫瘍で
は、静脈内に、上記治療薬を送達することもできる。あ
るいは、エクス・ビボで遺伝子工学処理を行って本発明
によるアデノウイルスベクター、ポリヌクレオチドを有
する発現ベクター、またはウイルス粒子を含むようにし
た真核生物宿主細胞を用いることもできる。このような
エレメントを真核細胞に導入する方法は当業者には周知
であり、微量のDNAの細胞核への微量注入(Capechiet a
l., 1980, Cell 22, 479-488)、CaPO4を用いるトランス
フェクション(Chenand Okayama, 1987, Mol. Cell Bio
l. 7, 2745-2752)、電気穿孔(Chu et al., 1987, Nucle
ic Acid Res. 15, 1311-1326)、リポフェクション／リ
ポソーム融合(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 84, 7413-7417)、および粒子衝撃(Yang et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-95
72)が挙げられる。遺伝子工学処理を行った細胞の移植
も、本発明に関連して可能である(Lynch et al., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1138-1142)。
【００９２】本発明は、本発明のアデノウイルスベクタ
ー、本発明の使用に関して記載したポリヌクレオチドま
たは発現ベクター、ウイルス粒子、または本発明の宿主
細胞の使用であって、炎症性疾患の治療または予防を目
的とする医薬品を調製するための使用も提供する。投与
経路については、遺伝子導入のための使用に関連して既
述したのと同様のものが適用される。
【００９３】本発明の上記使用の第一の好ましい態様で
は、炎症性疾患はTNF、更に具体的にはTNFαによって伝
達される。これに関して好ましく用いられるE3遺伝子
は、機能性14.7Kタンパク質をコードする。
【００９４】本発明の上記使用の第二の好ましい態様で
は、炎症性疾患はFasによって伝達される。これに関し
て好ましく用いられるE3遺伝子は、機能性10.4Kおよび1
4.5Kタンパク質をコードする（好ましくは、複合体、例
えば、いわゆるRID複合体として会合して）。
【００９５】本発明の上記使用の第三の好ましい態様で
は、炎症性疾患は遺伝子治療ベクターによって、例え
ば、ウイルス遺伝子治療ベクターの（複数の）ウイルス
遺伝子産物によって、および／または目的遺伝子の発現
産物によって伝達される。これに関して好ましく用いら
れる（複数の）E3遺伝子は、機能性14.7K、10.4Kまたは
14.5Kタンパク質を個々にまたは組合わせてコードす
る。
【００９６】本発明は、ヒトまたは動物体の治療法であ
って、上記生体に治療上有効量の本発明のアデノウイル
スベクター、本発明による使用に関連して記載したポリ
ヌクレオチドまたは発現ベクター、本発明によるウイル
ス粒子または真核生物細胞を投与することを含んでな
る、方法にも関する。
【００９７】「治療上有効量」とは、治療を行うことが
所望な質感または疾病に通常付随する１種類以上の症状
を緩和するのに十分な用量である。予防的使用に関する
場合には、この用語は疾患または疾病の発症を防止しま
たは遅延させるのに十分な用量を意味する。
【００９８】本発明の方法を、上記疾患または疾病に関
する予防目的および治療用途に用いることができる。本
発明の方法は、通常の遺伝子治療ベクターの投与後の炎
症性応答の発症を防止または減少させるのに特に有用で
ある。本発明の方法は、様々な方法のいずれかによって
行うことができることを理解すべきである。有利には、
本発明のベクター、ウイルス粒子、細胞または医薬組成
物は、任意の通常且つ生理学的に許容可能な投与経路に
よって、例えば、静脈内注射によって、接近可能な腫瘍
への直接注射によって、または脈管系への適当なカテー
テルなどによってイン・ビボで直接投与することができ
る。あるいは、本発明によるアデノウイルスベクター、
ポリヌクレオチドまたはウイルス粒子を細胞中に導入
し、トランスフェクション／感染した細胞をイン・ビト
ロで増殖させた後、それらを治療を行う患者に再導入す
ることからなるエクス・ビボ法を採用することもでき
る。
【００９９】遺伝子導入を改良するために、患者は、本
発明の組成物の投与前にマクロファージ涸渇（depletio
n）治療を行うことができる。このような手法は、文献
に記載されている（例えば、Van Rooijen et al., 199
7, TibTech, 15, 178-184）。
【０１００】本発明の方法が自殺遺伝子を発現するよう
に遺伝子工学処理した遺伝子治療ベクターを用いるとき
には、発現した自殺遺伝子産物に特異的なプロドラッグ
の薬学上許容可能な量を追加投与するのが有利である可
能性がある。２回の投与を同時にまたは連続的に行うこ
とができるが、プロドラッグを本発明の組成物の後に投
与するのが好ましい。例えば、５０〜５００mg/kg/日の
プロドラッグの用量を用いることが可能であり、２００
mg/kg/日の用量が好ましい。プロドラッグは、標準的実
施に準じて投与される。経口投与が好ましい。プロドラ
ッグの単回投与量、または宿主生物または標的細胞内に
毒性代謝物を産生することができるほど十分長時間反復
される投与量を投与することが可能である。上記のよう
に、プロドラッグガンシクロビールまたはアシクロビー
ルをTK HSV-1遺伝子産物と組合わせて、5-FCをシトシン
デアミナーゼおよび／またはウラシルホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子産物と組合わせて用いることができる。
【０１０１】疾患または疾病の予防または治療は、本発
明の方法を単独で、または所望ならば、現在利用可能な
方法（例えば、放射線、化学療法、および血管形成術の
ような手術）と組合わせて用いて行うことができる。
【０１０２】本発明は、本発明に関して用いられる（複
数の）E3遺伝子によってコードされる（複数の）発現産
物を用いて、宿主細胞、組織または生体を炎症性疾患か
ら保護することにも関する。抗炎症防御効果は、以前に
定義されている。本発明は、抗炎症機能が保存される場
合には、アデノウイルスに感染した細胞、その断片、ま
たは修飾変異体に見られるような元のE3発現産物の使用
を包含する。
【０１０３】（複数の）E3遺伝子の（複数の）発現産物
は、化学合成の通常の方法によってあるいは組み替えDN
A技術によって産生させることができる（例えば、Mania
tiset al., 1989, 実験室便覧(Laboratory Manual), コ
ールドスプリングハーバー,ニューヨークを参照された
い）。更に具体的には、調製法は、問題の（複数の）発
現産物をコードする（複数の）E3遺伝子をトランスフェ
クションした細胞を培養して産生細胞を生成するように
する段階、および上記の（複数の）発現産物を細胞培養
物から回収する段階を含んでなる。産生細胞はいずれの
起源のものでもよく、細菌、酵母または哺乳類細胞でも
よいがこれらに限定されず、考えられる（複数の）E3遺
伝子は細胞ゲノムに組込まれるか、または適当な発現ベ
クターに組込まれる。（複数の）E3遺伝子は、産生細胞
でそれ（ら）を発現させる転写および翻訳シグナルの制
御下に置かれることは当然である。発現ベクターおよび
コントロールシグナルは当業者に知られており、例は上
記されている。
【０１０４】本発明は、（複数の）発現産物を含んでな
る組成物、および炎症性疾患の治療または予防を目的と
した薬剤を調製するためのその使用にも関する。機能性
14.7Kタンパク質をコードするE3遺伝子の発現産物は、
好ましくはTNF依存性の炎症性疾患の治療または予防を
目的とする薬剤の調製に用いられ、機能性14.5Kおよび1
0.4Kタンパク質を両方ともコードするE3遺伝子の発現産
物は、好ましくはFas依存性の炎症性疾患の治療または
予防を目的とする薬剤の調製に用いられる。機能性14.7
Kタンパク質、または機能性14.5Kおよび10.4Kタンパク
質または機能性14.7K、14.5Kおよび10.4Kタンパク質を
いずれもコードする（複数の）E3遺伝子の発現産物は、
好ましくは遺伝子治療ベクターによって伝達される炎症
性疾患の治療または予防を目的とする薬剤の調製に用い
られる。
【０１０５】本発明を例示的に説明してきたが、用いて
きた用語は制限よりはむしろ単語の性質において説明、
使用とするものであることを理解すべきである。本発明
の多くの修飾および変更が、上記教示の観点から可能で
あることが明らかである。従って、特許請求の範囲内
で、本発明を具体的に本明細書に記載されているのとは
異なる方法で実施することができることを理解すべきで
ある。
【０１０６】上記に引用した特許明細書、刊行物および
データーベース記載事項の開示内容の総ては、個々の特
許明細書、刊行物または記載事項の内容がその開示の一
部として具体的且つ個別的に本明細書に引用されるのと
同程度に、それらの全体の内容はその開示の一部として
本明細書に引用される。
【０１０７】
【実施例】下記の例を用いて、本発明を例示する。
【０１０８】例プラスミドおよびウイルスベクター 下記の様々な構築物に用いるアデノウイルスゲノム断片
は、Chroboczek et al. (1992, Virol. 186, 280-285)
に開示されているようにAd5ゲノムのヌクレオチド配列
におけるそれらの位置に準じて得られる。
【０１０９】標準的クローニング法（Sambrook et al.,
1989, 実験室便覧(Laboratory Manual), コールドスプ
リングハーバー, ニューヨーク）を用いて、下記のベク
ターを生成した。
【０１１０】総てのウイルスベクターのゲノムは、Char
tier et al. (1996, J. Virol. 70,4805-4810)に記載の
ように、伝達プラスミドとウイルス主鎖を含む線形化プ
ラスミドの間の相同組換えによって生成した。簡単に説
明すれば、ベクターは、ヌクレオチド459〜3327のE1領
域およびヌクレオチド28249〜30758のE3領域で欠失して
いる。
【０１１１】14.7K発現カセットは、サイトメガロウイ
ルス極初期プロモーター(Boshart etal., 1985, Cell 4
1, 521-530)、キメライントロン（免疫グロブリン遺伝
子受容体に融合したヒトβ−グロビンドナーから作られ
るPromega製pCIベクターで見られる）、および14.7KDNA
断片をクローニングしたSV40ポリアデニル化配列（Ad5
ゲノムのヌクレオチド30453〜30836）から作成される。
14.7ORFを、発現カセットのポリリンカーのAatII部位に
おいてクローニングすることができる両末端にAatII部
位を含むオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって増幅
した（5'オリゴヌクレオチド: 5'-TACGACGTCATGACTGACA
CCCTAGATCTAGAAATGGA-3'M（配列番号：１）、および3'
オリゴヌクレオチド: 5'-CATGACGTCTACGTATTAGTTAAAGGG
AATAAGATCTTTGAG-3'（配列番号：２））。シークエンシ
ングの後、増幅の産物を伝達プラスミドでサブクローニ
ングした。14.7K発現カセットを、ウイルスゲノムプラ
スミドでの伝達に要するアデノウイルス配列によってフ
ランキングした。E1領域における相同組換えについては
ヌクレオチド1〜458および3328〜5788であり、E3領域に
おける相同組換えについてはヌクレオチド21638〜21562
および30758〜35935。
【０１１２】RID複合体発現ベクターは、10.4〜14.5遺
伝子にわたる（ヌクレオチド29748〜30470）Af1III-Xba
I断片を14.7K遺伝子の代わりにクローニングしたことを
除き、上記の同じ伝達ベクターを用いることによって得
た。
【０１１３】ウイルス生成、ウイルス増殖、および滴定 ウイルスを、PacI消化により組換えプラスミドからウイ
ルスゲノムを放出し、それらを適当な相補性細胞系にト
ランスフェクションすることによって生成させた。ウイ
ルス増殖、精製、およびウイルスDNA結合タンパク質(DB
P)の間接免疫蛍光による感染性単位(IU)の滴定は、以前
に報告されている方法で行った(Lusky et al., 1998,
J. Virol. 72, 2022-2032)。精製ウイルスは、ウイルス
貯蔵緩衝液（１Mスクロース,１０mM Tris-HCl[pH8.5],
１mM MgCl2, １５０mM NaCl, ０．００５％[v/v]Tween
80）に保管した。
【０１１４】イン・ビトロTNFαによって誘発されるア
ポトーシス抑制分析法 14.7K発現カセットを有するベクターがイン・ビトロで
機能性であるかどうかを試験するため、９６穴プレート
のウェル当たり１０４個のA549細胞(ヒト肺癌ATCC CCL-
185)、Hela細胞(ATCC CCL-2)またはマウス繊維芽細胞系
C3H (Reznikoffet al., 1973, Cancer Res. 33, 3231-3
238)を培養し、２４時間後に細胞を指定感染多重度(MO
I)で野生型アデノウイルス血清型５、E1欠失E3欠失（E1
°E3°）ベクター、または14.7K構成的ベクターに感染
させた。翌日、ウイルスを除去し、透析して熱不活性化
したウシ胎児血清を補足したフェノールレッド(Sigma)
なしのDMEM中でウェルの半数をシクロヘキシミン（２５
μg/ml）およびTNFα（５００単位/ml; Valbiotech）、
またはシクロヘキシミン単独に暴露し、１６時間後に上
清５０μlをそれぞれのウェルから採取し、ラクテート
デヒドロゲナーゼの含量をCytotox96試験(Promega)を用
いて測定した。計算に用いたOD値は、３回測定の平均値
である。結果を特異的溶解率（％）として表し、下式 特異的溶解率（％）＝（試料のOD値−自然放出のOD値）
／（１００％溶解のOD値−自然放出のOD値） を用いて計算した。バックグラウンドOD値をそれぞれの
値から差し引いた後、計算を行った。
【０１１５】細胞表面からのEGFRのダウンモジュレーシ
ョン 感染細胞の表面からのEGF受容体のダウンモジュレーシ
ョンを、サイトフルオロメトリーによって測定した。模
造品に感染したA549細胞、またはコントロールベクター
(E1-E3-)またはRID構成的ベクターに感染した細胞を、
１０mMEDTAのPBS溶液で培養容器から取出した。それぞ
れの個体群からの２×１０５個の細胞を、FITCに接合し
た抗EGFR抗体（Novus Molecular Inc, サンディエゴ,
カリフォルニア）（１０μg/ml; 加えた総容量５０μ
l）に氷上で１０分間暴露した。細胞を２回洗浄し、蛍
光のレベルをFacsan (Becton Dickenson)を用いて測定
した。
【０１１６】動物での検討 ６週齢の雌Balb/Cを、IFFA-CREDO (L'Arbreles, 仏国)
から購入した。静脈内投与のため、指示量に相当するベ
クターの容量を保管緩衝液で希釈し、それぞれのマウス
に最終容積２００μlのウイルス用量が投与されるよう
にした。気管内投与には、所望なウイルス用量に相当す
るウイルスの容積を、０．９％NaClで希釈した。動物を
指定した時間に屠殺して、気管を取出し、等しい大きさ
の細片に切断し、分析まで直ちに液体窒素で冷凍し、ま
たは病理学的分析またはアポトーシスの検出のために４
％ホルムアルデヒドで固定した。
【０１１７】急性肝炎を誘発するため、それぞれの動物
の左側部腹腔内に２５mgのd(+)ガラクトサミン(Sigma;
G1639)をPBS １００mlに溶解したものを投与した後、LP
S (Sigma; L3137)３００ngをPBS１００μlに溶解したも
のを投与した。あるいは、それぞれの動物に、抗Fas抗
体(Pharmingen 15400D)６μgを総容積が２００μlのPBS
に溶解したものを静脈内投与した。死亡率を、初日は３
時間毎に、２日以降は毎日観察した。
【０１１８】核酸分析 総DNA抽出のため、組織を、プロテイナーゼK溶液（プロ
テイナーゼK １mgを１％ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)、１０mM Tris-HCl (pH 7.4)、４００mM NaCl、２mM
EDTAに溶解したもの）で一晩消化した。総細胞DNAを、
フェノール−クロロホルム抽出の後エタノール沈澱によ
って単離した。DNA（１０μg）をHindIIIで消化し、Ad5
ゲノムDNA（nt 18318〜26328）から精製した32Pで標識
したHindIII制限断片を用いるサザンブロット分析法に
よって分析した。DNAの品質および量を、導入の前にゲ
ルの臭化エチジウム染色によって観察した。
【０１１９】遺伝子発現は、ノーザンブロット分析によ
って観察した。この目的のため、総RNAをRNA Nowキット
（Ozyme, Saint-Quentin-les-Y velines, 仏国）を用い
て供給業者の推奨する方法で器官から抽出した。総RNA
１０μgにアガロースゲル電気泳動を施し、ニトロセル
ロースフィルターに移した。移した後、フィルターを染
色して、等量の総細胞RNAが装填され、移されたことを
確認した。14.7特異的mRNAを、32Pで標識したオリゴヌ
クレオチド（5' AGGTGAGTGAATGCAGCCTTCGGT 3'; 配列番
号：３）を用いて検出した。RID複合体特異的mRNAを、
32Pで標識したオリゴヌクレオチド（5' AGTGATGAGGCTGC
AGATGAGCGTGA 3'; 配列番号：４）を用いて検出した。
【０１２０】インシテュー（in situ）での細胞死分析
法 試料採取の時点に４％ホルムアルデヒドで固定した器官
を、増加強度のエタノールを用いて脱水し、パラフィン
に埋設した。６μmの厚みの断面をキシレンで脱パラフ
ィン化し、PBS中で再水和した。スライドをプロテイナ
ーゼＫ（１０μg/ml）で３７℃にて１０分間処理し、氷
上で２分間Triton-X（０．１％，PBS中）処理によって
浸透性にした。アポトーシス細胞は、インシテュー細胞
死検出キット(Boehringer Mannheim)を用いて製造業者
によって記載された方法で確認した。スライドをメチル
グリーンで対比染色し、ペルマウント(permount)(Bake
r)に固定した。
【０１２１】例１：RID発現アデノウイルスベクターの
機能性 A. RID複合体を構成的に発現するアデノウイルスベクタ
ーのイン・ビトロ機能性 ２種類のRIDαβ−構成的ベクターをデザインした。第
一のシリーズは、10.4K-IRES-14.5K型組織でIRESによっ
て分離されたそれぞれのタンパク質のcDNAを用いた。こ
の構築物を、サイトメガロウイルス極初期プロモーター
(CMVp) キメライントロン（免疫グロブリン遺伝子アダ
プターに融合したヒトβ−グロビンドナーからなるpCI
ベクターのイントロン）およびSV40ポリアデニル化配列
からなる発現カセットに置き、E1領域においてセンス配
向でまたはウイルス主鎖のE3領域において代替配向で導
入した。これらのベクターの幾つかは、A549細胞におい
て予想した分子量（約１６５０塩基）のRID複合体特異
的mRNAを生成する。しかしながら、いずれも、Fas-また
はTNFα依存性アポトーシスの有意な阻害または（１０
〜５００の範囲の）試験したMOIのいずれかの細胞表面
からEGFRのダウンモジュレーションを検出することは全
く不可能であるという点においてRID関連機能を示さな
い。
【０１２２】第二のシリーズのベクターは、上記の発現
カセットにおけるAd5 E3領域のAf1III-XbaI DNA断片を
クローニングすることによって得た。このセグメント
は、10.4K開始コドンの上流３５塩基対(bp)から14.5K終
止コドンの下流１２bpまでを包含する。これらのベクタ
ーは図１に表されており、RID(E1+)は欠失したアデノウ
イルスE1領域の代わりにセンス配向での挿入を表し、RI
D(E3+)は欠失したアデノウイルスE3領域の代わりにセン
ス配向での挿入を表し、RID(E3-)は欠失したアデノウイ
ルスE3領域の代わりにアンチセンス配向での挿入を表
す。予想した１１００ヌクレオチド長のRID特異的mRNA
は、センス配向(RID(E3+))でE3領域からRIDカセットを
発現するベクターで感染したA549細胞において構築物毎
に検出され、２種類の他のベクター（RID(E1+)およびRI
D(E3-)）の多量のRID特異的メッセージを示している。R
ID複合体関連機能についてイン・ビトロで試験すると、
異なる構築物間に重要な変更が見られる。総てのベクタ
ーはFas依存性アポトーシスを阻害し、EGFRをダウンモ
ジュレーションすることができるが、効率は変動し、RI
D(E3+)ベクターはいずれのパラメーターについても最も
効率的である（ポジティブコントロールに対するFasに
よって誘発されるアポトーシスの阻害率が、RID(E1+)お
よびRID(E3+)についてそれぞれ７３％および５８％であ
るのと比較して９２％）；（野生型発現レベルに対する
EGFRのダウンモジュレーションは、他のベクターと比較
して（RID(E1+)およびRID(E3-)についてそれぞれ４４％
および５２％）８１％）。また、RID(E3+)ベクターは、
TNFαによって誘発されるアポトーシスを阻害すること
もできる。
【０１２３】B. RID発現ベクターのイン・ビボ機能性 RID複合体mRNAの発現のレベルおよび期間を、静脈内投
与後にマウス肝臓で、またはそれぞれのベクターの２×
１０９感染単位を気管内投与後に肺で評価した。総RNA
を標的器官から抽出し、RID複合体特異的mRNAについて
ノーザンブロット法によって検討した。形質導入した肝
臓または肺で見られるmRNAのパターンは、ベクターのそ
れぞれについてイン・ビトロで見られるものに密接に相
当している。同量の様々なベクターを投与した動物から
採取した器官から得た総RNAの同一量については、RID特
異的シグナルの強度には明確な差異は見られなかった。
総てのベクターについて、いずれの器官でも、RID複合
体発現は、少なくとも投与後１５日間検出された。
【０１２４】C. RID発現ベクターによるFas により誘発
される急性肝炎からの保護 RID複合体はTNFおよびFasによって誘発されるアポトー
シスを阻害することが知られているので、２種類の急性
肝炎モデルでのRID構成的ベクターのイン・ビボでの挙
動を評価した。簡単に説明すれば、マウスにコントロー
ルまたはRID構成的ベクターを静脈内投与した５日後
に、LPSまたは抗Fas抗体の致死用量を投与した。予備実
験では、イン・ビトロで機能性のRID発現ベクターのそ
れぞれの２×１０９IUを投与した。５日後、LPSまたは
抗Fas抗体の致死用量を投与し、死亡率を観察した。RID
発現ベクターはいずれも抗LPS効果を持たないが、CMV-R
ID(E3+)ベクターは抗Fas抗体を投与した動物を保護する
ことができる。用量応答実験は、このベクターの用量を
高くすると（５×１０９IU）、Fasを投与した動物を完
全に保護することができることを示した（図２）。
【０１２５】緩衝液またはコントロールベクターを投与
した動物から採取した抗Fasで処理した肝臓の病理学的
分析は、病理学的マーカーのそれ以上の説明を妨げるレ
ベルの凝固性壊死および組織変性を示している。あるい
は、RID発現ベクターで形質導入することにより抗Fasに
よって誘発される死から保護された動物由来の肝臓は、
組織の損傷が余り広範囲ではなく、肝臓組織を保持し
た。これらの器官で見られた主要な病理学的特徴は、単
細胞壊死および洞様毛細血管の炎症性凝集(sinusoidal
inflammatory aggregation)である。インシテューでの
細胞死分析法により、未保護肝における一般化した広汎
なアポトーシス／壊死が明らかになった。保護された
（生存している）動物の肝臓では、アポトーシス細胞は
少なく、少数が細胞質に標識した細胞である。しかしな
がら、保護された器官における核の大半は染色され、広
汎な組織再生を示唆している。もう一つの組の実験で
は、動物は、抗原投与後から３日以上生きることができ
た。抗Fasの投与後３日間生存した総ての動物は、この
時点を越えて少なくとも８日間生存した。これにより、
RIDタンパク質の発現が肝細胞のLPS依存性アポトーシス
を単に遅延させ、真の保護を立証しているという可能性
が除外される。
【０１２６】例２： 14.7K発現ベクターの機能性 A. 14.7K発現ベクターのイン・ビトロ機能性 図１に要約したように、３種類のアデノウイルス構築物
を生成した。内在性E3プロモーターから転写したmRNAを
コードしたE3領域の複合体スプライシングパターンのた
めに、最初にベクター主鎖に対して異なる配向および領
域に置かれた各種カセット（14.7K(E1+)、14.7K(E3+)お
よび14.7K(E3-)）から効率的発現を検討した。A549細胞
で予想した分子量（約７７０ヌクレオチド）の14.7K特
異的mRNAを生じる唯一の構築物は、CMVプロモーター、p
CIキメライントロンおよびSV40ポリアデニル化配列を用
いたベクターである。同じ３種類のベクターは、MOIが
５００で、TNFαによって誘発されるアポトーシスを約
５０％まで抑制することができ、この値は模造品に感染
した培養物で得られたものである（図３）。これらのベ
クターは、ヒト細胞において２００より低いMOIではこ
の機能を緩める。MOIが１００のネズミ細胞系(C3H)で
は、14.7K構成的ベクターはTNFαによって誘発されるア
ポトーシスを約８０％まで抑制することができ、この値
は模造品感染細胞で誘発される。有意な抑制は、５０程
度のMOIでも見られる（模造品感染培養物に対して５０
％抑制）（図4B）。
【０１２７】B. 14.7K発現ベクターのイン・ビボ機能性 14.7Kの発現のレベルおよび期間を、マウス肝臓で評価
した。総RNAを、静脈内投与した動物の肝臓から抽出
し、14.7K特異的mRNAを検討した。14.7K構成的ベクター
で形質導入した肝臓で見られるmRNAのパターンは、イン
・ビトロで見られるものに密接に相当している。同量の
異なるベクターで形質導入した器官における14.7K特異
的シグナルには、明確な差異は見られなかった。イン・
ビボ発現は、ノーザンブロット法により、投与後１５日
まで検出可能である。
【０１２８】C. 14.7K発現ベクターによるLPSによって
誘発される急性肝炎の保護 14.7Kベクターがイン・ビボでのTNFα依存性アポトーシ
スを抑制することができるかどうかを決定するために、
急性肝炎のマウスモデルを用いた。簡単に説明すれば、
マウスにコントロールまたは14.7K構成的ベクターの静
脈内投与から５日後に、致死用量のLPSを投与した。総
ての緩衝液投与または空ベクター投与動物（６匹／群）
は、LPSの投与から２４時間以内に死亡した（図4a）。
ヒト細胞系におけるTNFによって誘発されるアポトーシ
スを抑制する３種類の構築物のうち、E1に置かれたカセ
ットから14.7K cDNAを発現するベクターは動物を１００
％保護した。ベクターのE3領域にアンチセンス配向で置
かれた発現カセットを有するベクターは部分的保護を示
すが、センス配向の発現カセットを有するものは全く保
護しなかった。これらの観察は、総てのベクターが同様
に行うイン・ビトロでの保護実験で見られるものと対照
的である（上記参照）。用量応答実験は、ベクター14.7
K(E1+)の用量２×１０９IUはLPSを投与した動物を完全
に保護することができることを示した（図4b）。
【０１２９】緩衝液またはコントロールベクターを投与
した瀕死の動物から採取したLPSを投与した肝臓の病理
学的分析は、病理学的マーカーのそれ以上の説明を妨げ
るレベルの凝固性壊死および組織変性を示している。あ
るいは、14.7K発現ベクターで形質導入することによりL
PSによって誘発される死から保護された動物由来の肝臓
は、組織の損傷が余り広範囲ではなく、肝臓組織を保持
した。これらの器官で見られた主要な病理学的特徴は、
単細胞壊死および洞様毛細血管の炎症性凝集である。イ
ンシテューでの細胞死分析法により、未保護肝における
一般化した広汎なアポトーシス／壊死が明らかになっ
た。保護された（生存している）動物の肝臓では、アポ
トーシス細胞は少なく、少数が細胞質に標識した細胞で
ある。しかしながら、保護された器官における核の大半
は染色され、広汎な組織再生を示唆している。もう一つ
の組の実験では、動物は、抗原投与後から３日以上生き
ることができた。LPSの投与後３日間生存した総ての動
物は、この時点を越えて少なくとも８日間生存した。こ
れにより、RIDタンパク質の発現が肝細胞のLPS依存性ア
ポトーシスを単に遅延させるだけであるという可能性が
除外される。
【０１３０】 SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE S.A. <120> Anti-inflammatory vectors <130> adenoviral E3 region <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer for cloning Ad5 14.7K gene containing an AatII site at its extremity <400> 1 tacgacgtca tgactgacac cctagatcta gaaatgga 38 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3' PCR primer for cloning the Ad5 14.7K gene containing an AatII site at its extremity <400> 2 catgacgtct acgtattagt taaagggaat aagatctttg ag 42 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> human adenovirus 5 <400> 3 aggtgagtga atgcagcctt cggt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> human adenovirus 5 <400> 4 agtgatgagg ctgcagatga gcgtga 26
【図面の簡単な説明】
【図１】14.7KおよびRID発現遺伝子を発現するアデノウ
イルスベクターの略図。遺伝子は、初期CMVプロモータ
ー(hCMVp)、キメライントロン（スプライシング）、お
よびSV40ポリアデニル化配列（ポリA）の制御下に置か
れ、センス配向(E1+)で欠失したE1領域（nt 459〜3327
の欠失）の代わりに、またはセンス(E3+)またはアンチ
センス(E3-)配向で欠失したE3領域（nt 28250〜30757の
欠失）の代わりに挿入される。
【図２】急性肝炎モデルにおけるRID発現アデノウイル
スベクターのイン・ビボでの挙動。増加投与量のRID(E3
+)ベクターまたはネガティブコントロール（緩衝液また
はE1またはE3欠失ベクター）を、マウスの静脈内に投与
した。５日後、致死用量の抗Fas抗体をマウスに投与し
て、死亡率を観察した。
【図３】TNFαによって誘発されるアポトーシスのイン
・ビトロでの阻害。A549細胞を、シクロヘキシミンおよ
びTNFαに暴露する２４時間前に指示されたベクターに
感染させた。１６時間後、上清を集め、溶解（リーシ
ス）を測定するための比色分析法を行った（Cytotox96,
Promega）。結果は３回の平均であり、溶解率＝［（試
験のOD値）−（自然放出のOD値）×１００］：［（１０
０％溶解のOD値）−（自然放出のOD値）］で表される。
【図４】急性肝炎モデルでの14.7K発現アデノウイルス
ベクターのイン・ビボでの挙動。(a)マウスに致死用量
のガラクトサミンおよびLPSを投与し、５日後にE1およ
びE3欠失ベクター（ネガティブコントロール）または様
々な14.7K発現ベクターを静脈内投与し、死亡率を観察
した。(b) 増加投与量の14.7K(E1+)ベクターまたはネガ
ティブコントロール（緩衝液またはE1およびE3欠失ベク
ター)をマウスの静脈内に投与した。５日後、致死用量
のLPSをマウスに投与して、死亡率を観察した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 31/04 29/00 35/00 31/04 37/00 35/00 37/06 37/00 39/02 37/06 43/00 １０５ 39/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 43/00 １０５ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA03 DA02 EA02 FA02 GA11 GA18 HA01 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 AC20 CA24 CA44 4C084 AA13 ZA75 ZB09 ZB11 ZB21 ZB26 ZB35 ZC37 4C087 AA01 BB63 BC83 ZA75 ZB09 ZB11 ZB21 ZB26 ZB35 ZC37

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｅ３領域の少なくとも一部が欠失しており
    または非機能性であるアデノウイルスゲノム由来の組換
    えアデノウイルスベクターであって、該アデノウイルス
    ベクターが （ｉ） 機能性１４．７Ｋタンパク質、 （ｉｉ） 機能性１４．５Ｋタンパク質、 （ｉｉｉ） 機能性１０．４Ｋタンパク質 をコードするＥ３配列を保持し、および／または該組換
    えアデノウイルスベクターが目的遺伝子を含んでなり、 上記の保持されたＥ３配列と上記の目的遺伝子が宿主細
    胞においてそれらを発現させる調節エレメントに作動可
    能に連結されていることを特徴とする、組換えアデノウ
    イルスベクター。
  2. 【請求項２】保持されたＥ３配列が機能性１４．７Ｋタ
    ンパク質をコードする、請求項１に記載の組換えアデノ
    ウイルスベクター。
  3. 【請求項３】保持されたＥ３配列が機能性１４．５Ｋお
    よび１０．４Ｋタンパク質をコードする、請求項１に記
    載の組換えアデノウイルスベクター。
  4. 【請求項４】機能性１４．５Ｋおよび１０．４Ｋタンパ
    ク質が宿主細胞で会合して、複合体（ＲＩＤ複合体）を
    形成することができる、請求項３に記載の組換えアデノ
    ウイルスベクター。
  5. 【請求項５】保持されたＥ３配列が異種プロモーターの
    制御下に置かれ、好ましくはサイトメガロウイルスの極
    初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）の制御下に置
    かれている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換
    えアデノウイルスベクター。
  6. 【請求項６】上記の保持されたＥ３配列が機能性１４．
    ７Ｋタンパク質をコードし、上記アデノウイルスベクタ
    ーの（ｉ） Ｅ３領域が一般に存在し、元のＥ３領域の
    転写方向に対してアンチセンス配向であるか、または
    （ｉｉ） Ｅ１領域が一般に存在し、元のＥ１領域の転
    写方向に対してセンス配向である位置にある、請求項１
    〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベク
    ター。
  7. 【請求項７】上記の保持されたＥ３配列が機能性１４．
    ５Ｋタンパク質および機能性１０．４Ｋタンパク質をコ
    ードし、上記アデノウイルスベクターのＥ３領域が一般
    に存在し、元のＥ３領域の転写の方向に対してセンス配
    向である位置にある、請求項１〜５のいずれか一項に記
    載の組換えアデノウイルスベクター。
  8. 【請求項８】炎症性疾患から宿主細胞、組織または生体
    を保護するための、アデノウイルスのＥ３領域の少なく
    とも１個以上の遺伝子を個々にまたは組合わせて含んで
    なるポリヌクレオチドの使用。
  9. 【請求項９】アデノウイルスのＥ３領域の上記（複数
    の）遺伝子が、機能性１４．７Ｋ、１４．５Ｋおよび１
    ０．４Ｋタンパク質をコードする遺伝子からなる群から
    選択される、請求項８に記載の使用。
  10. 【請求項１０】アデノウイルスのＥ３領域の上記遺伝子
    が機能性１４．７Ｋタンパク質をコードする、請求項９
    に記載の使用。
  11. 【請求項１１】アデノウイルスのＥ３領域の上記遺伝子
    が機能性１４．５Ｋタンパク質および機能性１０．４Ｋ
    タンパク質をコードする、請求項９に記載の使用。
  12. 【請求項１２】上記機能性１４．５Ｋタンパク質および
    上記機能性１０．４Ｋタンパク質が宿主細胞で会合して
    複合体（ＲＩＤ複合体）を形成することができる、請求
    項１１に記載の使用。
  13. 【請求項１３】上記の１個以上の遺伝子がサイトメガロ
    ウイルスの極初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）
    に作動可能に連結されている、請求項８〜１２のいずれ
    か一項に記載の使用。
  14. 【請求項１４】上記ポリヌクレオチドを発現ベクターに
    挿入する、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の使
    用。
  15. 【請求項１５】上記ポリヌクレオチドを、宿主細胞にお
    いて発現させる調節エレメントに作動可能に連結された
    目的遺伝子をも含んでなる発現ベクターに挿入する、請
    求項１４に記載の使用。
  16. 【請求項１６】上記発現ベクターがプラスミドまたはウ
    イルスベクターである、請求項１４または１５に記載の
    使用。
  17. 【請求項１７】上記ウイルスベクターがアデノウイルス
    ベクターである、請求項１６に記載の使用。
  18. 【請求項１８】上記アデノウイルスベクターが、Ｅ１領
    域の全部または一部、および元のＥ３領域の全部が欠失
    しているかまたは非機能性である、アデノウイルスゲノ
    ムに由来する、請求項１７に記載の使用。
  19. 【請求項１９】上記アデノウイルスベクターが、Ｅ２、
    Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域の１個以上のウイル
    ス遺伝子が更に欠失しているかまたは非機能性である、
    アデノウイルスゲノムに由来する、請求項１８に記載の
    使用。
  20. 【請求項２０】上記アデノウイルスベクターがヒトアデ
    ノウイルス５（Ａｄ５）のゲノムに由来し、上記（複数
    の）Ｅ３遺伝子がヒトアデノウイルス２（Ａｄ２）のゲ
    ノムから単離される、請求項１７〜１９のいずれか一項
    に記載の使用。
  21. 【請求項２１】上記ポリヌクレオチドが機能性１４．７
    Ｋタンパク質をコードし、上記アデノウイルスベクター
    の（ｉ） Ｅ３領域が一般に存在し、元のＥ３領域の転
    写方向に対してアンチセンス配向であるか、または（ｉ
    ｉ） Ｅ１領域が一般に存在し、元のＥ１領域の転写方
    向に対してセンス配向である位置に挿入される、請求項
    １７〜２０のいずれか一項に記載の使用。
  22. 【請求項２２】上記ポリヌクレオチドが機能性１４．５
    Ｋタンパク質および機能性１０．４Ｋタンパク質をコー
    ドし、上記アデノウイルスベクターのＥ３領域が一般に
    存在し、元のＥ３領域の転写方向に対してセンス配向で
    ある位置に挿入される、請求項１７〜２０のいずれか一
    項に記載の使用。
  23. 【請求項２３】ウイルス粒子の調製法であって、 （ｉ） 請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデ
    ノウイルスベクター、または請求項１４〜２２のいずれ
    か一項に記載の使用に関して記載したウイルス発現ベク
    ターを許容細胞に導入して、トランスフェクションした
    許容細胞を得て、 （ｉｉ） 該トランスフェクションした許容細胞を適
    当な時間、適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子
    を産生させ、 （ｉｉｉ） 細胞培養物から該ウイルス粒子を回収し、 （ｉｖ） 場合によっては、上記の回収したウイルス
    粒子を精製する、ことを含んでなる、方法。
  24. 【請求項２４】請求項１〜７のいずれか一項に記載のア
    デノウイルスベクターまたは請求項１４〜２２のいずれ
    か一項に記載された発現ベクターを含んでなるか、また
    は請求項２３に記載の方法に従って産生された、ウイル
    ス粒子。
  25. 【請求項２５】請求項１〜７のいずれか一項に記載のア
    デノウイルスベクターまたは請求項１４〜２２のいずれ
    か一項に記載されたポリヌクレオチドまたは発現ベクタ
    ーを含んでなるか、または請求項２４に記載されまたは
    請求項２３に記載の方法に従って産生されたウイルス粒
    子に感染した、宿主細胞。
  26. 【請求項２６】請求項１〜７のいずれか一項に記載のア
    デノウイルスベクター、請求項１４〜２２のいずれか一
    項に記載されたポリヌクレオチドまたは発現ベクター、
    または請求項２４に記載されまたは請求項２３に記載の
    方法に準じて得られたウイルス粒子に感染した宿主細
    胞、または請求項２５に記載される宿主細胞を含んでな
    る、組成物。
  27. 【請求項２７】遺伝子導入を目的とする医薬品の調製の
    ための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウ
    イルスベクター、請求項８〜２２のいずれか一項に記載
    のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、請求項２４に
    記載されまたは請求項２３に記載の方法に準じて得られ
    たウイルス粒子、または請求項２５に記載の宿主細胞の
    使用。
  28. 【請求項２８】炎症性疾患の治療または予防を目的とす
    る医薬品の調製のための、請求項１〜７のいずれか一項
    に記載のアデノウイルスベクター、請求項８〜２２のい
    ずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクタ
    ー、請求項２４に記載されまたは請求項２３に記載の方
    法に準じて得られたウイルス粒子、または請求項２５に
    記載の宿主細胞の使用。
  29. 【請求項２９】該炎症性疾患がＴＮＦによって媒介され
    る、請求項２８に記載の使用。
  30. 【請求項３０】該ＴＮＦがＴＮＦαである、請求項２９
    に記載の使用。
  31. 【請求項３１】上記アデノウイルスベクターが請求項
    １、２、５または６のいずれか一項に定義した通りであ
    り、上記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターが請求項
    ９、１０、１３〜２１のいずれか一項に記載されている
    通りである、請求項２９または３０に記載の使用。
  32. 【請求項３２】上記炎症性疾患がＦａｓによって媒介さ
    れる、請求項２８に記載の使用。
  33. 【請求項３３】上記アデノウイルスベクターが請求項
    １、３〜５、または７のいずれか一項に定義した通りで
    あり、上記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターが請求
    項９、１１〜２０、または２２のいずれか一項に記載さ
    れている通りである、請求項３２に記載の使用。
  34. 【請求項３４】上記炎症性疾患が遺伝子治療ベクターに
    よって媒介される、請求項２８に記載の使用。
  35. 【請求項３５】該炎症性疾患として、敗血症性ショッ
    ク、劇症肝機能不全、肝炎（特に、ＢおよびＣ型肝
    炎）、肝硬変、アルコール性肝疾患、化学療法によって
    誘発される毒性、臓器移植拒絶反応、免疫障害、腫瘍性
    疾患、および／または結合組織障害が挙げられる、請求
    項２８〜３４のいずれか一項に記載の使用。
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