JP2003189887A - 筋肉細胞での発現を制御するためのキメラプロモーター - Google Patents

筋肉細胞での発現を制御するためのキメラプロモーター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 循環器疾患などの筋を侵す疾患の治療を目的
とする遺伝子治療に有用な遺伝子構築物等を提供するこ
と。 【解決手段】 本発明は、ヒト遺伝子のと操作可能に結
合した骨格α−アクチン遺伝子プロモーターを含んでな
るキメラ構築物に関する。本発明は、目的の遺伝子の発
現を制御する上記キメラ構築物を含んでなる発現カセッ
トも提供する。本発明は、上記発現カセットを含んでな
るベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、医薬組成
物、および骨格筋細胞での特異的発現のためであって治
療または予防目的のためのそれらの使用にも関する。最
後に、本発明はまた、特に末梢虚血の治療の目的で骨格
α−アクチン遺伝子プロモーターおよび筋特異的エンハ
ンサーの制御下に置かれた目的遺伝子を含んでなる発現
カセット、ベクターおよびウイルス粒子の治療上の使用
を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ヒト遺伝子の骨格筋特異的エンハンサーと操
作可能に結合した少なくとも１種類の骨格α−アクチン
遺伝子プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関す
る。本発明は、治療遺伝子の発現を制御する上記キメラ
構築物を含んでなる発現カセットも提供する。本発明
は、上記発現カセットを含んでなるベクター、ウイルス
粒子、真核宿主細胞、医薬組成物、および骨格筋細胞で
の特異的発現のためであって治療または予防目的のため
のそれらの使用にも関する。最後に、本発明はまた、特
に末梢虚血（peripheral ischemia）の治療の目的で骨
格α−アクチン遺伝子プロモーターおよび筋特異的エン
ハンサーの制御下に置かれた目的遺伝子を含んでなる発
現カセット、ベクターおよびウイルス粒子の治療上の使
用を提供する。本発明は、組織特異的遺伝子発現の分野
に関し、培養細胞系での組換えポリペプチドの産生、ト
ランスジェニック動物モデルの構築、遺伝子調節の研
究、および筋ターゲッティング技術の開発など多くの用
途に用いられる。本発明は、特に循環器疾患（cardiova
scular disorder）などの筋を侵す疾患の治療を目的と
する遺伝子治療に関して極めて興味深いものである。
【０００２】背景技術 循環器疾患は、現在先進諸国での死亡の主因となってい
る。２００１年には、米国心臓協会の報告は、アメリカ
合衆国で６千万人が循環器疾患に罹っていると算定して
いる。これらの患者の中、４５０万人が末梢虚血に罹っ
ており、８０万人が危険な段階にあり、また２０万人の
患者は肢切断を勧められている。更に、来る１０年間
で、ストレス、喫煙、脂質の多い食物、および肉体を動
かさなくなることなどの複合危険因子の出現に関係する
工業化のため、循環器疾患は第三世界にも関係すること
になるであろうと想定されている。
【０００３】循環器疾患は、世界保険機構によって定義
されているように、主として脂質、炭水化物、血小板、
繊維状組織および石灰化の蓄積による動脈壁の変化であ
るアテローム性動脈硬化症に起因する。アテローム性動
脈硬化症またはアテロームによって動脈腔が減少するこ
とによって、閉塞部の下流の血流が減少する。虚血性疾
患は、沿革組織における血液送達が不十分であることか
ら生じる酸素欠乏によって引き起こされる。慢性的虚血
の発現は、四肢虚血および狭心症である。下肢虚血は休
息痛および跛行を特徴とし、狭心症の症状は胸、顎、
肩、背中、および腕の不快感である。アテローム破裂の
場合には、血塊が完全に下流の血管を遮断し、傷ついた
血管の血栓症、心筋梗塞、または卒中などの急性虚血性
症状を引き起こし、血流を回復するために緊急治療が必
要となる。
【０００４】多因性起源のアテローム性動脈硬化症で
は、それ自身の治療およびそれによって生じる虚血性疾
患の治療が極めて困難になる。緊急時には、血流を回復
するために外科的方法（バイパス手術、ステンティング
を用いるまたは用いない血管形成術）が用いられるが、
原稿の慢性虚血性疾患の治療は血管拡張薬または抗凝固
薬に基づいている。これらの治療は満足なものとはほど
遠いものであるので、遺伝子治療に本当に希望がかけら
れている。心臓または末梢虚血の場合には、自然の代償
治癒過程が副次的循環を発生させるために設定され、遮
断された動脈を緩和し、血液送達を部分的に回復する。
遺伝子治療法は、血管内皮増殖因子(VEGP)および基礎的
繊維芽細胞増殖因子(bFGF)のようなプロアンギオゲニン
因子（pro-angiogenic factor）を用いてこの新血管新
生現象を促進するようにデザインされている。これらの
治療遺伝子は、血管の内層を構成している内皮細胞の増
殖、移動、および分化を刺激するので、血管新生を促進
することができる(Thomas, 1996, J. Biol. Chem. 271,
603-606)。
【０００５】遺伝子治療は、個体の体細胞への核酸の導
入と定義することができる。この導入は、エクス・ビボ
またはイン・ビボのいずれでも様々な種類のベクターに
よって達成することができる。エクス・ビボ法では、標
的細胞または組織は患者から採取され、再移植の前にイ
ン・ビトロで修飾される。これらの手法は遺伝子導入を
極めて効率的に行うことができるが、それらは患者にあ
った処理が必要であり、非常に高価である。エクス・ビ
ボでの循環器の遺伝子治療の例は、ごく僅かしかない。
例えば、筋芽細胞のアデノウイルス−遺伝子導入の後に
心臓へそれらを再注入することによる心不全の治療法に
より、遺伝子発現を数週間持続することができた(Taylo
r et al., 1997, Proc. Assoc. Am. Physicians 109, 2
45-253)。バイパス手術では、静脈移植組織への裸のＤ
ＮＡのエクス・ビボでのトランスフェクションにより、
最近一次移植組織機能不全が著しく減少することが明ら
かにされた(Mangi and Dzau, 2001, Ann, Med. 33, 153
-155)。イン・ビボ法は、遺伝子導入ベクターの患者へ
の直接投与を伴う。これは、全身または標的組織へ直接
行うことができるので、安全性と遺伝子導入効率を増加
することができる。虚血性疾患の遺伝子治療は、主とし
てイン・ビボで行われる。末梢虚血の場合には、虚血領
域での直接筋肉内投与を行い、前に存在している血管か
ら内皮細胞を引きつけ、傷ついた領域の血管再生を促進
する。更に、カテーテル法の開発により、末梢および心
虚血のいずれの場合にも制御して焦点を定めた投与を行
うことができる。
【０００６】遺伝子治療の成功は、主として治療遺伝子
の生体の細胞への効率的送達と、遺伝情報の発現による
ものである。機能遺伝子を様々な手法によって細胞に導
入し、一過性発現、または上記遺伝子の宿主ゲノムへの
組込みによる宿主細胞の永続的形質転換を生じることが
できる。遺伝子治療法の大部分はウイルスまたは合成
（非ウイルス）ベクターを用いるが、目的遺伝子を標的
細胞に運ぶのに裸のＤＮＡ（すなわち、プラスミドＤＮ
Ａ）を用いることもできる(Wolff et al., l990, Scie
nce 247, 1465-1468)。サイトメガロウイルス(CMV)プロ
モーターの制御下でVEGFをコードする裸のプラスミドＤ
ＮＡを筋肉内投与することからなる第一相臨床試験で
は、非治癒性の虚血性潰瘍および休息痛に罹っている１
０名の患者の中８名の末梢血流に改善が認められた。更
に、３名の患者は膝下切断を勧められていたが、肢切断
せずに回復が認められた(Baumgartner et al., 1998, C
iration 97, 1114-1123)。
【０００７】合成ベクターは、核酸（例えば、プラスミ
ドＤＮＡ）を、ベクターの細胞吸収を促進する１種類以
上のトランスフェクション促進薬、例えば、脂質（ＤＮ
Ａ−リポプレックスまたはリポソーム）またはポリマー
（ＤＮＡ−ポリプレックス）と空間的に組み合わせたも
のを表す。現在では、様々な脂質および／またはポリマ
ーを基材とするベクターが入手できる（例えば、Rollan
d, 1998, 治療薬キャリヤー系概説(Critical Reviews i
n Therapeutic Drug Carrier Systems) 15, 143-198; W
agner et al., 1990, Proc. Natl. Aexd. Sci. USA 87,
5410-34141、およびGottschalk et al., 1996, Gene T
her. 3, 448-457)。ウイルスベクターよりは効率的でな
いが、合成ベクターは大規模生産、安全性、低免疫原
性、およびクローニング能に関して潜在的利点を有する
(Ledley, 1995, Human Gene Ther. 6, 1129-1144)。
【０００８】ウイルスはそれらのゲノムを核に送達する
ために、細胞膜を通って輸送を行い、リソソーム分解を
回避するための様々な極めて複雑な機構を発達させてお
り、従って多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。レ
トロウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)およびアデノ
ウイルス由来のものが広汎に用いられてきたが（総説に
ついては、Cristal, 1995, Science 270, 404-410; Kov
esdi et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol 8, 583
-589; Miller, 1997, Human Gene Ther. 8, 803-815を
参照されたい）、ポックスウイルス由来のベクターなど
の他のウイルスベクターがイン・ビボでの遺伝子導入の
有望な候補として現れている。
【０００９】例えば、病体生理学的病変に暴露された標
的細胞外マトリックス(ECM)に作製したレトロウイルス
ベクターが、最近開発されている。動脈内点滴注入時に
は新内膜細胞の遺伝子導入がバルーン血管形成のラット
モデルで示された(Hall et al., 2000, Human Gene The
r. 11, 983-993)。心筋層へ遺伝子導入を効果的に行う
ために、AAVベクターも用いられている(Svenssn et a
l.. 1999, Circulation99, 201-205)。
【００１０】かなりの数の公表文献では、血管の疾患で
アデノウイルスの使用の成功が報告されている。血管内
皮増殖因子(VEGF)を発現するアデノウイルスベクターの
筋肉内投与により、ラット(Mack et al., 1998, J. Vas
c. Surg 27, 699-709)および糖尿病マウス(Rivard et a
l., 1999, Am. J. Pathol. 154, 355-363)における後肢
虚血期間中に血管形成が刺激された。治療用血管形成
は、冠動脈疾患にも極めて有望であることを示してい
る。これに関して、繊維芽細胞増殖因子−５およびVEGF
が、アデノウイルスによる遺伝子導入後の慢性虚血心筋
層のブタモデルにおける副次的血管発生および心筋灌流
および機能の向上を誘発することが示された(Mack et a
l., 1998, J. Thorac. Cardiovasc Surg. 115, 168-17
7; Gaordano et al., 1996, Nature Med. 2, 534-53
9)。末梢虚血遺伝子治療の目的で、アデノウイルスを骨
格筋に反復投与することができ、これは遺伝子治療の効
力を向上させることができることが、最近明らかにされ
た(Chen et al., 2000, Gene Ther.7, 587-595)。
【００１１】しかしながら、現在の遺伝子治療ベクター
の宿主範囲が広汎であることが、それらの使用を制限し
ている主因である可能性がある。この特異性の欠如によ
って、特に細胞傷害性遺伝子を導入するときに患者に有
害である可能性がある治療遺伝子が広汎に発現する可能
性がある。例えば、プロアンギオゲニン因子の広汎な発
現により、前に存在している腫瘍の血管新生が促進され
る可能性があると考えられている(Claffey et al., 199
6, Cancer Res. 56, 172-181)。超生理学的VEGF産生は
血管腫の形成(Lee et al., 2000, Circulation 1O2, 89
8-901)または網膜症のような血管形成関連病状の発生(L
ashkari et al., 2000, Am. J. Pathol.156, 1337-134
4)を誘発することがある。従って、遺伝子発現を標的設
定した範囲の細胞に制限する手段は、遺伝子治療におい
て有用であろう。
【００１２】数名の研究者が、標的細胞表面ポリペプチ
ドに特異的に結合するリガンドを結合することによって
ベクターの特異性を変化させることを提案している（例
えば、WO94/10323号明細書、米国特許第5,543,328号明
細書、および米国特許第5,770,442号明細書を参照され
たい）。しかしながら、この手法は複雑であり、特異的
にするには、ベクターとその天然に存在する細胞受容体
との間に存在する相互作用を排除する必要がある。現在
までのところ、ウイルスの野生型親和性を完全に変化さ
せることは可能でないが、標的細胞遺伝子導入の促進は
報告された。例えば、繊維瘤でのポリリシンの付加によ
り、イン・ビトロおよびイン・ビボでの筋細胞遺伝子導
入が４倍に向上した(Bouri et al.. 1999, Human Gene
Ther. 10,1633-1640)。物理的ターゲッティングは、ウ
イルスキャプシドの疑似タイピングによって、すなわち
繊維を別のアデノウイルスの血清型繊維に弛緩すること
によって行うこともできる。特に、血清型１６繊維を有
する血清５アデノウイルスは、野生型ウイルスに比較し
て内皮細胞および平滑筋細胞を形質導入する上でそれぞ
れ３倍および１０倍効率的であった(Havenga et al., 2
001, J. Virol. 75, 3335-3342)。
【００１３】もう一つの代替法は、組織特異的転写調節
要素を用いて遺伝子発現を所望の細胞個体に限定するこ
とである。この方法は、トランスジーン発現を標的設定
した細胞の種類に限定することに基づいているが、この
方法では感染は制御されない。
【００１４】筋肉などの様々な組織で遺伝子を特異的且
つ選択的に発現させることができる多数の組織特異的プ
ロモーター／エンハンサーが文献に記載されている（総
説については、Maniatis et al., 1987, Science 236,
1237-1245; Fickett et al.,2000, Current Opinion i
n Biotechnology 11,19-241を参照されたい）。骨格筋
特異的プロモーター／エンハンサーの例としては、ミオ
シン、ミオゲニン（myogenin）(Edmondson et al., 199
2, Mol. Cell. Biol. 12. 3665-3677)、デスミン（欧州
特許出願第EP 0 999 278号明細書; Mericskay et al.,
1999, 病理学における最新の話題(Current Topics in
Pathology) Vol 93, pp 7-17; Desmouliebe and Tuchwe
ber, Springer-Verlag Berlin Heidelberg）、トロポニ
ン、β−エノラーゼ(Feo et al., 1995, Mol. Cell. Bi
ol. 15, 5991-6002)、クレアチンキナーゼ(Sternberg e
t al., 1988. Mol. Cell. Biol. 8, 2896-29O9: Traske
t al., 1988, J. Biol. Chem. 263. 17142-17149)、お
よび骨格α−アクチン(Taylor et al., 1988, Genomics
3, 323-336)遺伝子から単離したものが挙げられる。
【００１５】アクチンは、筋繊維の基礎単位であるサル
コメアの主要なタンパク質成分である。転写開始部位(+
1)のすぐ上流の２キロ塩基対(kbp)が、筋整列限定方式
での遺伝子発現をプログラムに組込むのに十分である(T
aylor et al.. 1988, Genomics 3, 323-336)。更に、連
続欠失研究に基づき、転写開始部位に対して−４３２〜
＋２３９位に伸張している６７０bpの断片が、筋管での
完全長（２kbp）のプロモーターの活性の５５%を保持す
るのに十分であることが示された(Muscat al., 1987, M
ol. Cell. Biol. 7, 4089-4099)。
【００１６】Feo et al.によって明らかにされているよ
うに(1995, Mol. Cell. Biol. 15.5991-6002)、ヒトβ
−エノラーゼ遺伝子(ENO-3)の転写は、第一のイントロ
ンの＋５０４〜＋６３７位で同定されたイントロン性の
筋特異的エンハンサーによって調節される。トランスフ
ェクション研究により、この１３８bpの要素がβ−エノ
ラーゼおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(H
SV TK)プロモーター活性をそれぞれ２５および３倍増加
させ、いずれの場合にもこれに結合したレポーター遺伝
子に筋特異的発現を賦与する能力が明らかにされた。
【００１７】しかしながら、上記転写要素は筋限定方式
で適正に調節されるが、それらは通常は弱く、サイトメ
ガロウイルス(CMV; Boshart et al., 1985, Cell 41, 5
21-530)または他のウイルス（すなわち、ラウス肉腫ウ
イルス; RSV）のような「強力な」プロモーター／エン
ハンサーで得られるものよりずっと低い発現レベル（１
０〜２００分の１）を提供する。しかしながら、このよ
うなウイルス転写要素は通常は非特異的であり、多くの
種由来の多種多様な細胞の種類で活性である。
【００１８】骨格α−アクチン遺伝子 プロモーターを
用いる構築物などのCMVまたは筋特異的エンハンサーを
筋特異的遺伝子プロモーターと結合するキメラ構築物は
文献に記載されている(Barthart et al., 1998, Human
Gene Ther. 9, 2545-2553)。CMVエンハンサーとヒト骨
格α−アクチン(HSA)遺伝子プロモーターとの会合によ
り、（エンハンサーなしの構築物と比較して）筋細胞で
はイン・ビトロおよびイン・ビボのいずれでもレポータ
ー遺伝子の発現が有意に向上するが、強力な発現は筋細
胞以外でも見られ、コントロールとして用いた強力なCM
Vプロモーター／エンハンサーで得られた発現レベル１
００%までに達する(Barnhart et al., 1998,Human Gene
Ther. 9, 2545-2553; Hagstrom et al., 2000, Blood
95, 2536-2542)。更に、イン・ビトロで強い向上を示す
幾つかのキメラ構築物は、骨格筋に投与したときにはイ
ン・ビボでこのような増加を再現しない。Barnhart et
al.によって記載されているように、遺伝子発現を定義
する重要なパラメーターは複雑であり、プロモーター配
列並びに配列環境に対してエンハンサーの性質、数、配
向および位置によって変化する。
【００１９】マウス筋クレアチンキナーゼエンハンサー
（天然の転写開始部位に対して−１３５１〜−１０５０
位）に結合した様々な筋特異的プロモーターの発現活性
を、骨格筋でのヒトFIXを発現させるため、レトロウイ
ルスベクターに関して検討した(Wang et al., 1996, Hu
man Gene Therapy 7, 1743-1756)。マウスCKエンハンサ
ー（−６８９〜＋８６位）を骨格α−アクチンプロモー
ターと結合する構築物により筋管の培地にFIXを産生す
ることができるが、この特異的組合せは他のマウスCKエ
ンハンサー／プロモーター会合と比較して余り行われな
かった。
【００２０】筋以外の細胞に標的設定されている非特異
的発現は、特に細胞傷害性遺伝子またはプロアンギオゲ
ニン因子の送達が考えられるときには、ヒト遺伝子治療
と不適合性であることがある。標的設定した細胞での発
現レベルがよくないことも、治療を行う宿主生物で予想
される治療上の利益が少なくなることもある。
【００２１】要するに、これらの研究から、有意なレベ
ルの遺伝子発現が可能であり、特異性を筋細胞、好まし
くは骨格筋細胞に限定する適当なプロモーター／エンハ
ンサーのデザインは困難であることが明らかである。
【００２２】
【発明の概要】従って、当該技術分野では、筋細胞、特
に虚血部分の骨格筋細胞で遺伝子を高水準で特異的に発
現させ、タンパク質発現の治療水準を達成し、広汎な遺
伝子発現に固有の潜在的副作用を回避するための転写要
素をデザインする必要が未だにある。
【００２３】この技術的問題は、特許請求の範囲に定義
されている態様を提供することによって解決される。
【００２４】従って、本発明は、少なくとも１種類の下
記(ii)と操作可能に結合した少なくとも１種類の下記
(i)を含んでなる、宿主細胞または生物において目的の
遺伝子を発現させるためのキメラ構築物を提供する： （ｉ）骨格α−アクチン遺伝子プロモーター （ii）ヒト遺伝子の骨格筋特異的エンハンサー
【００２５】
【発明の具体的説明】本明細書で用いられる「キメラ構
築物」という用語は、種、遺伝子など様々な起源の少な
くとも２種類以上の配列を含んでなる核酸構築物を表
す。本発明において、「核酸」および「ポリヌクレオチ
ド」は互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドま
たはリボヌクレオチドである任意の長さのヌクレオチド
のポリマー形態、またはその類似体を定義する。ポリヌ
クレオチドは、一本鎖または二本鎖の線状または環状の
ものであることができる。ポリヌクレオチド配列は現存
する核酸供給源（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ）から得る
ことができるが、合成によるもの（オリゴヌクレオチド
合成によって製造される）であることもできる。ポリヌ
クレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド類似体のような修飾ヌクレオチドを含んでなることも
できる（修飾の例として、米国特許第5,525,711号明細
書、米国特許第4,711,955号明細書、または欧州特許出
願第302 l75号明細書を参照されたい）。修飾が存在す
るときには、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの
組立前または後に付与することができる。ヌクレオチド
の配列は、非ヌクレオチド要素によって中断されていて
もよい。ポリヌクレオチドは、重合後に標識成分による
接合などによって更に修飾することができる。
【００２６】「目的の遺伝子」という用語は、任意の遺
伝子であって、その転写が本発明の上記キメラ構築物に
よって制御されるものを表す。詳細には、本発明のキメ
ラ構築物は、筋細胞での遺伝子発現を指示する経口を示
し、筋細胞以外では、これは全くまたは余り活性を示さ
ない（筋細胞での発現活性に比較して、少なくとも５、
好ましくは少なくとも１０、更に好ましくは少なくとも
１００分の１の活性）。これに関して、「筋特異的発
現」という用語は、筋以外の細胞に比較して筋細胞であ
る宿主細胞の目的の遺伝子の特異的に高められた遺伝子
発現であって、これらの宿主細胞が培養細胞または宿主
生物の細胞であることができるものを表す。従って、本
発明のキメラ構築物は筋細胞で最大の遺伝子発現を生
じ、従って目的の上記遺伝子を優先的に筋細胞へ転写的
に標的設定する可能性を提供する。
【００２７】「宿主細胞または生物」は、目的の遺伝子
の発現が予想される細胞または生物である。従って、宿
主細胞は、例えば、目的の遺伝子の特性の試験に用いら
れる細胞系、エクス・ビボでの遺伝子修飾のための一次
細胞、または本発明のキメラ構築物を有するベクターの
イン・ビボでの導入によって修飾されるヒトまたは動物
体内の細胞であることができる。本発明に関連して、宿
主細胞は、好ましくは筋細胞である。
【００２８】「筋」とは、骨格、心および平滑筋などの
任意の種類の筋を表す。「平滑筋」としては、内臓およ
び血管平滑筋、特に動脈平滑筋細胞(SMCs)が挙げられ、
特に好ましくは、大動脈、冠動脈、乳房、大腿および頸
動脈、並びに伏在静脈の新内膜および内側SMCが挙げら
れる。「骨格筋細胞」としては、筋芽細胞、筋管、筋繊
維、筋原繊維、および未分化細胞が挙げられる。「心筋
細胞」としては、心筋細胞および未分化細胞が挙げられ
る。骨格筋が、本発明に関して好ましい。
【００２９】「操作可能に結合」とは、上記キメラ構築
物の制御下に置かれた目的遺伝子の筋特異的遺伝子発現
を伝達させる本発明のキメラ構築物の要素の並置を表
す。例えば、エンハンサーが関連遺伝子の転写を促進す
る場合には、エンハンサーはプロモーターに操作結合し
て、宿主細胞または生物での関連遺伝子の発現を増強す
る。しかしながら、本明細書で用いられる「操作可能に
結合」という用語はさらに、その転写を制御する配列を
有する目的の遺伝子の並置をも表す。例えば、プロモー
ターが宿主細胞または生物で目的の遺伝子を転写させる
ときには、プロモーターはこの遺伝子に操作結合する。
この機能関係が保存される限り、プロモーターと目的の
遺伝子との間には追加の残基があってもよい。
【００３０】引用したプロモーターおよびエンハンサー
について本明細書で表されるヌクレオチド位置は、関係
した（元の）遺伝子の仮の転写開始部位（または+1位を
表すキャップ部位）に対して番号が付けられる。例え
ば、転写開始部位のすぐ上流の第一のヌクレオチドは-1
と番号が付けられ、一方その後のヌクレオチドは+2と番
号が付けられる。転写の開始部位は、S1マッピングまた
はプライマー伸張などの標準的手法によって決定するこ
とができる（Sambrook et al., 1989, 実験室便覧(Labo
ratory Manual), Cold Spring Habor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor NY）。
【００３１】本発明は、骨格α−アクチン遺伝子プロモ
ーターをヒト筋特異的エンハンサーと共に用いて目的の
遺伝子の組織特異的発現のためのキメラ構築物を開示す
る。好ましくは、本発明は、上記のような筋以外の細胞
または組織と比較して、筋細胞または組織、特に骨格筋
細胞または組織で最大発現を生じる。
【００３２】通常の文脈において、「骨格α−アクチン
遺伝子プロモーター」は、骨格α−アクチンオープンリ
ーディングフレームによってコードされた転写体の発現
を制御する。本発明のキメラ構築物で用いられるプロモ
ーターは、元の骨格α−アクチン遺伝子のコード配列の
すぐ上流の５′フランキング領域から単離または得ら
れ、且つその制御下に置かれた遺伝子の転写を促進する
ことができる任意の核酸配列であることができる。本発
明に関連して、このようなプロモーター配列は、下記に
更に記載するように、更に修飾することができる。
【００３３】本発明で用いられる骨格α−アクチン遺伝
子プロモーターは、筋細胞で、少なくとも低レベルで
も、遺伝子発現を促進するのに必要なおよび／または十
分な要素を少なくとも包含する。このようなプロモータ
ーは、いわゆる「最小プロモーター」であることがで
き、ＲＮＡポリメラーゼ結合およびキャップ部位で転写
を開始するのに必要なシス作用配列、例えば、TATAボッ
クス（コンセンサス配列TATAAAA）またはTATAボックス
様要素（TATAボックス機能を有するATリッチ配列）であ
って、好ましくはキャップ部位の２５〜３５bp上流に位
置したものを包含する。TATAボックスの存在は、配列分
析によって決定することができ、転写の開始部位は上記
の標準的手法（Slマッピング、またはプライマー伸張）
によって決定することができる。好ましくは、骨格α−
アクチン遺伝子プロモーターは、通常は転写開始部位に
対して５′（上流）に位置した２００塩基対(bp)の断片
内、有利には１００塩基対(bp)内で構成され、５′また
は３′、または５′および３′の両方向に更に伸張する
ことができる。
【００３４】第二の好ましい代替法によれば、本発明の
キメラ構築物は、追加のシス作用配列であって、筋細胞
で最小プロモーターによって指示される遺伝子発現を実
質的に増加させるものを含む骨格α−アクチン遺伝子プ
ロモーターを用いている。このようなシス作用配列は、
遍在しているかまたは調節の役割（一時的または組織特
異的）を有する転写因子、特に筋特異的転写因子によっ
て結合させることができる。代表的な例としては、NF-1
因子が結合したCAATボックス（コンセンサスGGCCAATC
T）、SP1因子が結合したGCボックス（コンセンサスGGGC
GG）、Oct因子が結合したオクタマーATTTGCAT、NFκBが
結合したκB（コンセンサスGGGACTTTCC）、ATF因子Ap2
が結合したATF（コンセンサスGTGACGT）、Sp1、Egr1、Y
Y1、TGT3-3、Eボックス（CANNTG）、CarGボックス（CC
(A/T)6GG）、および／またはMEF-2（YTAWAAATAR）配列
が挙げられるが、これらに限定されない。これらのシス
作用配列は単独でまたは様々な組合せで用いることがで
き、相同性（本発明で用いる骨格α−アクチン遺伝子プ
ロモーターから単離）または非相同性（別のプロモータ
ー領域から単離）であることができる。これに関して、
幾つかの筋特異的プロモーターの様々な部分を融合し
て、骨格α−アクチン遺伝子プロモーターによって提供
される遺伝子発現を最適にするのが有利なことがある。
【００３５】この好ましい態様によれば、本発明のキメ
ラ構築物で用いられる骨格α−アクチン遺伝子プロモー
ターは、天然では上記骨格α−アクチンの転写開始部位
の上流に位置した１０００bpの断片内に、有利には８０
０bpの断片内に、好ましくは５００bpの断片内に、更に
好ましくは４３２bpの断片いないに含まれる。
【００３６】更に、本発明のキメラ構築物で用いられる
骨格α−アクチン遺伝子プロモーターは、目的の隣接遺
伝子に存在しない場合には、筋細胞で機能的な転写開始
部位を含んでなることができる。好ましくは、本発明の
キメラ構築物は、プロモーターが生じる骨格α−アクチ
ン遺伝子の天然に存在する転写開始部位を用いる。
【００３７】本発明で用いられる骨格α−アクチン遺伝
子プロモーター配列は、天然に存在する脊椎動物、好ま
しくはヒトから既知の組換え技術を用いてクローニング
することができ、必要に応じて下記に説明するように修
飾することができる。
【００３８】従って、本発明で用いられる単離したＤＮ
Ａ断片は、所定の生物の骨格α−アクチン遺伝子プロモ
ーター領域の元の配列に比較して多くの変異を含んでな
ることがあり、但し、これらの変異は元の配列によって
付与された転写機能を変更しない。例えば、ある生物の
異なる種、亜種または株から単離された領域は、本明細
書で上記した元の配列と実質的に同じであるが、同一で
はない配列を付与する配列多形を有することがある。従
って、本発明は、配列相同性の適当な水準の範囲内で元
の骨格α−アクチン遺伝子プロモーターの１種類以上の
ヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換を示す
総ての変異体を包含しようとするものである。本明細書
で考えられる変異体配列は、本明細書に記載されている
天然に存在しおよび／または例示された配列またはその
断片に対して少なくとも約７０%の配列同一性、好まし
くは少なくとも８０%、更に好ましくは少なくとも９０
%、更に一層好ましくは少なくとも９５%の配列同一性を
有するものであり、絶対的同一性（１００%同一性）を
有するものが特に好ましい。
【００３９】この同一性を決定するため、変異体および
元の配列を、ギャップおよびインサートを用いて最大の
対が得られるように整列させる。下記のように最大の一
致が得られるように整列したときに、残基の配列が同じ
であるときには、２つの配列が「同一である」といわれ
る。比較のために配列を最適整列させることは、Smith
and Watermanの局部相同性アルゴリズム(1981, Adv. Ap
pl. Math. 2, 482-489)、Needleman and Wunschの相同
整列法(1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453)、Pearson a
nd Lippmanの類似法の探索(1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85, 2444-2448)などによって行うことができ
る。上記アルゴリズムのコンピューターによる実行は、
Genetics Computer Group (GCG) Wisconsin Genetics S
oftware Package (GAP, BESTFIT, BLASTA, FASTA, TFAS
TA and FASTDB, Madison, WI)の一部として知られてい
る。これらのプログラムは、好ましくは総てのパラメー
ターについてデフォルト値を用いて行う。変異体と元の
配列との間で最良の全般的対を決定するための好ましい
方法は、Brutlag et al. のアルゴリズムに基づいたFAS
TDBコンピュータープログラムを用いて決定することが
できる(1990, Comp. App. Biosci. 6, 237-245)。
【００４０】本発明のキメラ構築物は、任意の種、特に
ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたはブタ
由来の骨格α−アクチン遺伝子プロモーターを用いるこ
とができる。様々な種の骨格α−アクチン遺伝子プロモ
ーターは、当業者には文献または専門のデーターバンク
（ヒト配列については、受託番号M20543、マウス配列に
ついてはX67686、およびラット配列についてはV01218で
Genebank）から入手することができる。重要なシス作用
配列の位置は、公表データーに基づいて決定することが
できる。
【００４１】好ましい態様によれば、本発明のキメラ構
築物は、ヒト遺伝子から得られる骨格α−アクチン遺伝
子プロモーター、特に配列番号１の１〜４３２位（転写
開始部位の上流のヒト骨格α−アクチン遺伝子プロモー
ターの４３２bp断片に相当する）に示されるヌクレオチ
ド配列または実質的に４３２bp断片と同じ転写促進活性
を有するその一部を含んでなるヒト骨格α−アクチン遺
伝子プロモーターを含んでなる。例えば、その有利な部
分は、上記のような少なくとも最小限の骨格α−アクチ
ン遺伝子プロモーターを含んでなる。ヒト骨格α−アク
チン遺伝子プロモーターは、Taylor et al.が記載した
方法で単離することができる(1988, Genomics 3, 323-3
36)。骨格α−アクチン遺伝子プロモーターの他の哺乳
類の形態は、通常の分子生物学的手法を用いて、または
適当な鋳型からＰＣＲによって得ることができる（例え
ば、上記文献に記載の従来技術によるプラスミド、また
はゲノムＤＮＡ）。例えば、ヒト遺伝子の断片を用い
て、相同配列をハイブリダイズさせる条件下で他の種の
哺乳類から作製したゲノムライブラリーを探査すること
ができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、標準
的手引を参照して決定することができる（例えば、Samb
rook et al., 1989, 実験室便覧(Laboratory Manual),
Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor NY）。
【００４２】本明細書で用いられる「ヒト遺伝子の骨格
筋特異的エンハンサー」という用語は、（複数の）因子
が直接または間接的に（すなわち、別の細胞因子との相
互作用を介して）結合することによって、本発明のキメ
ラ構築物、特に筋細胞に存在する骨格α−アクチン遺伝
子プロモーターによって進められる遺伝子発現を増強す
るヌクレオチド配列を表す。このような増強は、イン・
ビトロ（例えば、培養筋細胞中）またはイン・ビボで
（例えば、トランスジェニック動物中、または動物モデ
ルへ直接投与することによって）ヒト遺伝子の骨格筋特
異的エンハンサーの存在下および非存在下骨格α−アク
チン遺伝子プロモーターの制御下、および同一実験条件
下でレポーター遺伝子の発現を比較することなどによっ
て決定することができる。このような遺伝子発現分析の
例は、本明細書の例の節で提供されるが、当業者に周知
の他の方法を本発明に関連して用いることもできる。
【００４３】多数のヒト由来の骨格筋特異的エンハンサ
ーが当該技術分野で周知であり、（例えば、ATCCまたは
他の商業的または個人的供給源のような受託機関から）
クローニングしたヌクレオチド配列としてまたは内で入
手できる。従って、好ましい態様では、このようなエン
ハンサーは、 a) クレアチンキナーゼ(Trask et al., 1988, J. Bio
l. Chem., 263, 17142-17149; Genbank受託番号AH00346
0)。好ましいクレアチンキナーゼエンハンサーは、配列
番号２（ヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位
の上流の約−９１９〜約−７１１位に相当する）に示さ
れる配列、またはその一部である、 b) β−エノラーゼ、特にヒトENO-3遺伝子であって、
配列番号３（ヒトβエノラーゼ遺伝子の最初のイントロ
ンでの転写開始部位の下流の約＋５０４〜約＋６３７位
に相当する）に示される配列、またはその一部を含んで
なる、エンハンサー断片が特に好ましい、 c) ミオゲニン（Genbank受託番号X62155）、 d) トロポニン、特にトロポニンＣ（Genbank受託番号M
37984）、Ｉ（Genbank受託番号X90780）、またはＴ（Ge
nbank受託番号AJ011712） をコードするヒト遺伝子のエンハンサーの群から選択さ
れる。
【００４４】下記に検討するように、「その一部」とい
う用語は、エンハンサー活性が実質的に保存される（元
の配列によって付与された活性の少なくとも８０%）と
いう条件で、上記に定義したエンハンサー配列の任意の
機能性部分を包含する。
【００４５】上記のように、ヒト骨格筋特異的エンハン
サーがプロモーターによって進められる遺伝子発現を増
加するときには、このエンハンサーは骨格α−アクチン
遺伝子プロモーターと操作結合している。操作結合した
エンハンサーは、遺伝子配列内のプロモーターの上流ま
たは下流の、または上記遺伝子配列の下流のキメラ構築
物中に置くことができる。更に、このエンハンサーは、
骨格α−アクチン遺伝子プロモーターに近接距離でまた
は数kbまでの距離を介して隣接することができる。有利
には、ヒト骨格筋特異的エンハンサーは骨格α−アクチ
ン遺伝子プロモーターの上流に、有利にはプロモーター
とエンハンサーを５００bp未満、好ましくは２００bp未
満だけ分離する距離で、更に好ましくはプロモーターに
直接隣接して配置される。更に、ヒト骨格筋特異的エン
ハンサーの配向は、骨格α−アクチン遺伝子プロモータ
ーによって付与される転写方向に対してセンス（５′→
３′）またはアンチセンス（３′→５′）であることが
できる。本発明のキメラ構築物に含まれるそれぞれの要
素の最適位置および配向は、任意の特定のキメラ構築物
について日常的実験によって決定することができる。本
発明に関連して、キメラ構築物は、好ましくは骨格α−
アクチン遺伝子プロモーターに対してアンチセンス配向
で配置されたエンハンサー（例えば、クレアチンキナー
ゼまたはβ−エノラーゼエンハンサー）を含んでなる。
β−エノラーゼエンハンサーは、骨格α−アクチン遺伝
子プロモーターの下流に（すなわち、イントロンとし
て、またはイントロン内に）挿入することもできる。上
記で定義した２種類以上のヒト骨格筋特異的エンハンサ
ーを含むキメラ構築物も包含される。
【００４６】本発明のキメラ構築物の操作性は、適当な
培養細胞中でイン・ビトロでまたはイン・ビボ（トラン
スジェニック動物でまたは動物モデルに直接投与するこ
とによって）、筋細胞中で（例えば、細菌性酵素クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β
−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはeGFPをコー
ドするレポーター遺伝子の）遺伝子発現を進める能力を
測定することによって容易に決定することができる。遺
伝子発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫
蛍光、ウェスタンブロット法、生物活性測定などの標準
的方法によって決定することができる。
【００４７】更に、本発明のキメラ構築物の遺伝子発現
活性を、ウイルスＣＭＶまたはＲＳＶなどの強力なプロ
モーター／エンハンサーと比較することができる。更に
具体的には、ヒトβ−エノラーゼエンハンサーを用いる
本発明のキメラ構築物は、培養筋管で同様な実験条件下
でＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて得たレポ
ーター遺伝子の発現レベルの少なくとも３０%、有利に
は少なくとも４０%、好ましくは少なくとも７０%以上、
具体的には約８０%の培養筋管でのレポーター遺伝子の
発現レベルを提供する。ヒトクレアチンキナーゼエンハ
ンサーと結合したヒトの骨格α−アクチン遺伝子プロモ
ーターを用いるときには、筋管でのレポーター遺伝子発
現はリファレンスＣＭＶプロモーター／エンハンサーで
得た発現レベルの少なくとも５０%、好ましくは７５〜
８５%になり、リファレンスＲＳＶプロモーター／エン
ハンサーを用いて得た発現レベルの少なくとも１００
%、好ましくは５００〜９００%になる可能性がある。筋
以外の細胞では、本発明のキメラ構築物によって進めら
れる遺伝子発現は低く（ＣＭＶプロモーター／エンハン
サーを用いて得た遺伝子発現の５%未満、有利には２%未
満、好ましくは１%未満）、または検出不能である。
【００４８】本発明のキメラ構築物は、当該技術分野で
周知の標準的な分子生物学の手法によって構築すること
ができる。骨格α−アクチン遺伝子プロモーターおよび
ヒト骨格筋特異的エンハンサーは、例えば、ＤＮＡライ
ブラリーからクローニング技術によって、または適当な
プローブまたはプライマーを用いる増幅法（ＰＣＲ）に
よって単離することができる。あるいは、それらは、当
該技術分野で利用可能な配列データーに基づいて化学合
成によって産生させることができる。プロモーターおよ
びエンハンサーを有する断片を、制限酵素およびリガー
ゼを用いることによって会合させ、本発明のキメラ構築
物を生成させることができる。
【００４９】本発明に関連して、キメラ構築物で用いる
プロモーターまたはエンハンサー、または両方は、上記
で定義したそれらのそれぞれの活性が実質的に保存され
る（元の配列の活性の少なくとも８０%）ときには、１
または数個のヌクレオチドの欠失、付加および／または
置換によって修飾することができる。このような修飾
は、(i) 筋細胞以外の種類の細胞、特に骨格筋細胞で
の発現を制御して筋特異性を向上させるポジティブシス
作用配列、または(ii) 発現レベルを減少させるネガテ
ィブシス作用配列（「サイレンサー」）を除去すること
を目的とすることができる。位置指定突然変異誘発を用
いて、元の配列を修飾することができる。
【００５０】本発明は、本発明によるキメラ構築物の制
御下に置かれ、宿主細胞または生物、好ましくは筋細胞
または組織で発現させる目的の遺伝子を含んでなる発現
カセットも提供する。
【００５１】上記の定義の他に、「目的の遺伝子」とい
う用語は、任意の起源のものであり且つゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えば、ゲノムＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボチ
ームまたはトランスファーＲＮＡをコードする任意のＤ
ＮＡから単離することができる核酸を表す。目的の遺伝
子は、オリゴヌクレオチド（すなわち、１００bp未満の
短いサイズの核酸）であることもできる。
【００５２】好ましい態様では、本発明で用いられる目
的の遺伝子は、治療遺伝子、すなわち治療上興味深い遺
伝子産物をコードするものである。「治療上興味深い遺
伝子産物」とは、患者、特に疾患または疾病疾病に罹っ
ている、または疾患または疾病を予防するべき患者、に
適当に投与するとき、治療または予防活性を有するもの
である。このような治療または予防活性は、上記疾患ま
たは上記疾病の症状の経過に対する有利な高価に相関さ
せることができる。治療を行う疾患または疾病によって
治療上興味深い適当な遺伝子産物をコードする遺伝子を
選択することは、当業者の技術範囲内にある。一般的に
は、その選択は以前に得られた結果に基づき、過度の実
験を行うことなく、すなわち特許請求した初面を実施す
ることなく、このような治療特性を得ることができるよ
うにすることができる。
【００５３】本発明に関連して、目的の遺伝子は、導入
を行う標的細胞または生物に対して相同性でも非相同性
であることもできる。有利には、この遺伝子は、ポリペ
プチド、リボチームまたはアンチセンスＲＮＡをコード
する。「ポリペプチド」という用語は、サイズに関係な
くポリヌクレオチドの任意の翻訳産物として理解すべき
であり、７個程度のアミノ酸残基を有するポリペプチド
が挙げられるが、更に典型的にはタンパク質が挙げられ
る。更に、これは、任意の起源（原核生物、下等または
高等真核生物、植物、ウイルスなど）のものであること
ができる。これは、天然のポリペプチド、変異体、天然
に相対物を持たないキメラポリペプチド、またはそれら
の断片であってもよい。有利には、本発明で用いられる
目的の遺伝子は、動物またはヒトの生体で１種類以上の
欠陥または欠損細胞タンパク質を代償することができ
る、または毒性効果によって作用して体内から有害な細
胞を制限しまたは除去する少なくとも一種類のポリペプ
チドをコードする。適当なポリペプチドは免疫付与性で
あってもよく、体液性または細胞性応答、または両方を
刺激する抗原として作用する。
【００５４】本発明の発現カセットで用いられる目的の
遺伝子によってコードされるポリペプチドの例として
は、血管内皮増殖因子(VEGF)、形質転換増殖因子（TG
F、特にTGFaおよびb）、上皮増殖因子（EGF）、繊維芽
細胞増殖因子（FGF、特にFGFaおよびb）、腫瘍壊死因子
（TNF、特にTNFaおよびb）、CCN（CTGFポリペプチド、C
yr61、Nov、Elm-1、Cop-1、およびWisp-3など）、散乱
因子／肝細胞増殖因子（SH/HGF）、アンギオゲニン、ア
ンギオポエチン（特に1および2）、アンギオテンシン-2
の群のものなどのプロアンギオゲニンポリペプチド、イ
ンターロイキン（特に、IL-2、IL-8）、コロニー刺激因
子（GM-CSF、G-CSF、M-CSF）、インターフェロン（IFN
α、βまたはγ）、プラスミノーゲン活性化因子（tP
A）、およびウロキナーゼ（uPA）などのサイトカイン、
細胞増殖を減少または抑制することができるポリペプチ
ド、例えば、抗体、毒素、免疫毒素、腫瘍遺伝子発現産
物を阻害するポリペプチド（例えば、ras、mapキナー
ゼ、チロシンキナーゼ受容体、増殖因子）、Fasリガン
ド、自殺遺伝子産物、例えば、HSV-1 TK (Caruso et a
l., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-702
8; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552）、
チロシンデアミナーゼ(Erbs et al., 1997, Curr. Gene
t. 31, 1-6; WO93/01281号明細書; 欧州特許第402 108
号明細書)、ウラシルホスホリボシルトランスフェラー
ゼ(Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51
-56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157)、およびW
O96/16183号明細書およびWO99/54481号明細書に記載さ
れているもの、細胞遺伝子の発現を調整または調節する
ことができるポリペプチド、抗原性ポリペプチド（例え
ば、ウイルス免疫原性ポリペプチド）、酵素、例えば、
ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナー
ゼ、酸化窒素シンターゼeNOSまたはiNOS、SOD、カタラ
ーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、リポタンパク質リパーゼ
類、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（Sanes
et al., 1986, EMBO J. 5,3133-3142）、マーカー（β
−ガラクトシダーゼ、CAT、ルシフェラーゼ、GFPな
ど）、および筋細胞から産生および／または分泌するこ
とができ、臨床疾病、更に具体的には骨格筋細胞を冒す
疾病の治療または予防に有用であると当該技術分野で認
められている任意のポリペプチドからなる群から選択さ
れるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００５５】目的の遺伝子として、元の配列に関して１
種類以上のヌクレオチドの付加、欠失、および／または
修飾が挙げられることは、本発明の範囲内にある。
【００５６】好ましい態様は、発現カセットであって、
目的の遺伝子が、CTG-F2（結合組織増殖因子2; PCT/US0
1/21799）、VEGF（Genbank受託番号AY047581）およびVE
GF様，bFGF（基礎繊維芽増殖因子、Genbank受託番号NM0
02006）およびbFGF様、およびアンギオテンシン1（Genb
ank受託番号XM030821）および２（Genbank受託番号XM03
4836）、ポリペプチドであって、好ましくはヒト由来の
ものをコードすることを特徴とする発現カセットに関す
る。
【００５７】本発明の発現カセットは、１個以上の目的
の遺伝子を含んでなることができる。これに関して、プ
ロアンギオゲニンポリペプチド（例えば、VEGFおよびbF
GF）をコードする遺伝子の組合せが、本発明に関連して
有利である。異なる種類の目的の遺伝子を本発明のキメ
ラ構築物（ポリシストン性カセット）または独立したプ
ロモーターであって、少なくとも１個は上記で定義した
キメラ構築物であり、同一または反対方向に配置されて
いるものによって制御することができる。更に、それら
は同一ベクターまたは独立したベクターによって運ぶこ
とができる。
【００５８】有利な態様によれば、本発明の発現カセッ
トは、特定の誘導物質に応答して誘導されるように処理
することができる。この態様によれば、本発明の発現カ
セットは上記で定義したキメラ構築物の制御下に置かれ
たリガンドであって、治療遺伝子の発現を制御するリガ
ンドによって調節されるプロモーターを活性化すること
ができる上記リガンドをコードする目的の遺伝子を含
む。本発明のキメラ構築物は、その不活性形態でリガン
ドの発現を進める。誘導物質との相互作用により、リガ
ンドの形態が変化して、活性になる。リガンドがリガン
ドによって調節されるプロモーターへ結合することによ
り、このプロモーターが活性化去れ、治療遺伝子の発現
が指示される。この方法では、本発明のキメラ構築物に
よって提供された転写ターゲッティングがリガンドによ
って調節されるプロモーターと結合して、治療遺伝子産
物が空間的だけでなく、一時的にも制御されるようにな
る。多くのリガンドによって調節される系が本発明に関
連して適しており、テトラサイクリンリプレッサー／オ
ペレーター系およびアンチプロゲスチンによって調節さ
れる遺伝子スイッチが挙げられる（総説については、例
えば、Harvey and Caskey, 1998, Current Opin. Chem.
Biol. 2, 512-518を参照されたい）。２種類の発現カ
セット、すなわちそれぞれリガンド発現を進めるキメラ
構築物を含むものおよび治療遺伝子発現を進めるリガン
ドによって調節されるプロモーターを含むものを、同一
ベクター（すなわち、E1およびE3欠失アデノウイルスベ
クター）または独立したベクターに導入することができ
る。
【００５９】本発明の発現カセットは、エキソン／イン
トロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、分泌シ
グナル配列、核局在化シグナル配列、IRES、ポリA転写
終結配列、トリパルタイトリーダー配列(tripartite le
ader sequences)、複製または組込みに関与する配列の
ような追加の機能要素をも含んでなることができる。上
記配列は文献に記載されており、当業者であれば容易に
得ることができる。
【００６０】好ましい態様では、本発明の発現カセット
は、１個以上のエキソンまたはその部分、好ましくは非
コードエキソン、および必要に応じて１個以上のイント
ロンをも含んでなる。このようなエキソンおよび／また
はイントロン配列は発現の安定化に有利であり、例え
ば、本発明のキメラ構築物に含まれる要素の一つ（骨格
α−アクチン遺伝子、または骨格筋特異的エンハンサー
が得られるヒト遺伝子）、または任意の他の起源（例え
ば、真核生物、ウイルス、合成物）から得ることができ
る。当該技術分野の状態で記載されている多種多様なエ
キソン／イントロン配列は、本発明に関連して適してい
る。それらは、好ましくは転写開始部位の後であって目
的の遺伝子の前に挿入される。
【００６１】ヒトの骨格α−アクチン遺伝子プロモータ
ーを含んでなるキメラ構築物の好ましい態様に関して
は、適当なエキソン配列はヒトの骨格α−アクチンの＋
１位から約＋２３９位まで伸張している第一の非コード
エキソンの一部を含んでなる（すなわち、配列番号１の
４３３〜６７１位）。
【００６２】本発明の発現カセットは、（２個以上の）
目的の遺伝子に操作結合したポリアデニル化シグナルを
含むこともできる。ポリアデニル化配列は、転写を終結
することができるときには、転写を行う遺伝子に操作結
合している。これは、好ましくは目的の遺伝子の（下流
の）３′に配置されている。適当なポリアデニル化シグ
ナルとしては、β増殖ホルモン（bGHpA）、SV40、およ
びβ−グロブリンポリアデニル化シグナルが挙げられ
る。
【００６３】本発明は、本発明によるキメラ構築物また
は発現カセットを含んでなるベクターも提供する。熟練
者であれば、広汎なベクターから適当なベクターを選択
することができる。例えば、ベクターは、最終的には１
種類以上のトランスフェクション促進剤と複合体形成し
または混合した例えばプラスミドまたはウイルスベクタ
ーの形態の裸のＤＮＡであることができる。「プラスミ
ド」という用語は、所定の細胞で自律複製できる染色体
外の環状ＤＮＡを表す。適当なプラスミドの範囲は非常
に大きい。好ましくは、プラスミドは、細菌での増幅お
よび真核標的細胞での発現のためにデザインされる。こ
のようなプラスミドは、様々な製造業者から購入するこ
とができる。適当なプラスミドとしては、pBR322（Gibc
o BRL）、pUC（Gibco BRL）、pBleuescript（Stratagen
e）、pREP4、pCEP4（Invitrogene）、pCI（Promega）、
およびpPoly（Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-20
1）に由来するものが挙げられるが、これらに限定され
ない。これは、標準的な分子生物学の手法によって処理
加工することもできる（Sambrook et al., 1989, 実験
室便覧(Laboratory Manual), Cold Spring Habor Labor
atory Press, Cold Spring Harbor NY）。これは、選択
遺伝子を含んでなり、トランスフェクション細胞（例え
ば、細胞栄養要求性の相補性によって、または抗生物質
耐性によって）、安定化要素（例えば、cer配列、Summe
rs and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103）、または
統合要素（例えば、LTRウイルス配列およびトランスポ
ゾン）を選択または同定することもできる。
【００６４】本発明のベクターの好ましい態様は、ヘル
ペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイ
ルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、AAV
（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、レトロウ
イルス、およびアデノウイルスからなる群から選択され
るウイルスに由来するウイルスベクターに関する。この
ようなウイルスベクターは、当該技術分野で周知であ
る。「由来の」とは、ウイルスゲノムのコードまたは非
コード部分に存在する１または数個のヌクレオチドの１
以上の修飾、例えば欠失、付加、および／または置換を
導入することによって元のウイルスゲノムから遺伝学的
に処理加工したものを意味する。
【００６５】本発明に特に適するウイルスベクターは、
アデノウイルスベクターである。このアデノウイルスゲ
ノムは、ウイルスサイクルを完成するのに必要な約３０
を上回る遺伝子を有する約３６kbの線状の二本鎖ＤＮＡ
分子からなっている。暑気遺伝子は、E3領域を除きウイ
ルス複製に本質的な４つの領域（E1-E4）に分割され（P
ettersson and Roberts, 1986, 癌細胞(In Cancer Cell
s) (Vol 4): ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumer Viruses),
Botchan and Glodzicker Sharp監修 pp 37-47, Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.;
Halbert etal., 1985, J. Virol. 56, 250-257）、E3
領域は、E3内に欠失を有する天然に存在する突然変異体
または雑種は培養細胞で野生型ウイルスのように複製を
行うという観察に基づいて、ウイルス複製には重要でな
いと考えられている(Kelly andLewis, 1973, J. Virol.
12, 643-652)。E1遺伝子産物は、ウイルスゲノムの転
写の調節に関与しているタンパク質をコードする。E2遺
伝子産物は、ウイルスＤＮＡ合成における開始および連
鎖伸張に必要である。E3によってコードされるタンパク
質は、細胞傷害性T細胞および腫瘍壊死因子による細胞
溶解を防止する（Wold and Gooding, 1991, Virology 1
84, 1-8）。E4領域によってコードされるタンパク質
は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現およびスプライシン
グ、および宿主細胞シャットオフに関与している（Halb
ert et al., 1985, J. Virol. 56, 250-257）。後期遺
伝子（L1-L5)は、それらの大部分がウイルスキャプシド
を構成する構造タンパク質をコードする。それらは、初
期転写単位と少なくとも部分的に重複しており、ユニー
クプロモーター（MLP、主要後期プロモーター）から転
写される。更に、アデノウイルスゲノムは、両端にシス
作用性の５′および３′ITR（逆方向末端反復配列）と
ＤＮＡ複製に本質的なパッケージング配列を有する。IT
RはＤＮＡ複製の起源を含んでおり、キャプシド化領域
が感染性粒子へのアデノウイルスＤＮＡのパッケージン
グに必要である。
【００６６】一つの態様では、本発明のアデノウイルス
ベクターを条件的に複製性となるように処理加工し（CR
Adベクター）、Heise and Kim に記載されているように
特異的細胞（例えば、増殖細胞）で選択的に複製する
（2000, J. Clin. Invest. 105, 847-851）。
【００６７】もう一つの好ましい態様によれば、本発明
のアデノウイルスベクターは、E1領域を構成する１種類
以上の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失および／また
は突然変異していることによって、少なくともE1機能に
ついて複製欠損である。有利には、E1欠失はGenebankデ
ーターベースに受託番号M73260で開示されているヒトア
デノウイルス５型の配列に関してヌクレオチド(nt) 458
-3328または458-3510をカバーしている。
【００６８】更に、このベクターのアデノウイルス主鎖
は、追加の修飾（１種類以上のウイルス遺伝子での欠
失、挿入または突然変異）を含んでなることがある。E2
修飾の一例は、DBP（ＤＮＡ結合タンパク質）コード遺
伝子上に局在した熱感受精突然変異によって示される
（Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339）。
アデノウイルス配列は、E4領域の全部または一部が欠失
していることもある。ORF3および4 、またはORF 3およ
び6/7を保持している部分的欠失が有利なことがある
（例えば、欧州特許出願第EP 974 668号明細書; Christ
et al., 2000, HumanGene Ther. 11, 415-427; Lusky
et al., 1999, J. Virol. 73, 8308-8319を参照された
い）。本質的でないE3領域内での追加の欠失はクローニ
ング能を増加することがあるが（総説については、例え
ばYeh et al. FASEB Journal 11 (1997) 615-623を参照
されたい）、宿主免疫系（Gooding et al., 1990, Crit
ical Review of Immunology 10, 53-71）または炎症反
応（EP00440267.3号明細書）を回避させるポリペプチド
をコードするE3配列を全部または一部保持しているのが
有利なことがある。形質導入した細胞での発現した遺伝
子の長期間発現を向上させるために、ITRおよびパッケ
ージング配列を保持し且つウイルス抗原の残基合成の廃
止を目的とする実質的遺伝子修飾を含む第二世代ベクタ
ーを考えることもできる（WO94/28152号明細書; Lusky
et al., 1998, J. Virol 72,2022-2032）。
【００６９】本発明の発現カセットは、シス作用配列を
除き、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入するこ
とができる。好ましくは、これは、欠失領域（E1、E3お
よび／またはE4）の代わりに挿入され、欠失したE1領域
の代わりに挿入するのが特に好ましい。更に、発現カセ
ットは、問題とする利用域の転写方向に対してセンスま
たはアンチセンス配向で配置することができる。
【００７０】本発明による使用に適したアデノウイルス
は、任意のヒトまたは動物供給源、特にイヌ（例えば、
CAV-1またはCAV-2; それぞれGenbank 参照番号CAV1GENO
MおよびCAV77082）、トリ（Genbank 参照番号AAVEDSDN
A）、ウシ（例えば、BAV3; Seshidhar Reddy et al., 1
998, J. Virol. 72, 1394-1402）、ネズミ（Genbank参
照番号ADRMUSMAV1）、ヒツジ、ネコ、ブタ、またはサル
アデノウイルス、あるいはそれらの雑種から誘導するこ
とができる。任意の血清型を用いることができる。しか
しながら、Cサブグループのヒトアデノウイルスが好ま
しく、特にアデノウイルス2 (Ad2)および5 (Ad5)が好ま
しい。概して、引用したウイルスはATCCのようなコレク
ションで入手することができ、これらの配列、構成およ
び生物学を記載している多数の公表文献の主題となって
おり、熟練した者であれば、それらを応用することがで
きる。
【００７１】更に、アデノウイルス粒子または空のアデ
ノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第5,928,944
号明細書に記載されているようなウイルス依存性の同時
インターナリゼーション法によって核酸（例えば、プラ
スミドベクター）を導入することもできる。この方法
は、ポリカルベンまたは１以上の脂質層を含んでなる脂
質小胞のような（複数の）カチオン性薬剤の存在下で行
うことができる。
【００７２】レトロウイルスベクターも適している。レ
トロウイルスは、ウイルスによってコードされた逆転写
酵素を用いて複製し、感染細胞の染色体ＤＮＡに組込ま
れている二本鎖ＤＮＡ中にウイルスＲＮＡゲノムを複製
する組込みウイルスのクラスである。文献記載の多数の
ベクターを本発明の枠内で用いることができ、特にネズ
ミ白血病ウイルス由来のもの、特にMoloney（Gilboa et
al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29）またはFr
iend's FB29株（WO95/01447号明細書）が用いられる。
一般に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子ga
g、polおよびenvの総てまたは一部を欠失しており、
５′および３′LTRおよびキャプシドか配列を保持して
いる。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクタ
ーの発現レベルまたは安定性を増加させることができ
る。このような修飾としては、VL30（米国特許第5,747,
323号明細書）のようなレトロトランスポゾンの一つに
よるレトロウイルスキャプシド化配列の置換が挙げられ
る。本発明の発現カセットは、キャプシド化配列の下流
に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向
に挿入される。
【００７３】ポックスウイルスは、ＤＮＡゲノムが大き
いことおよび複製の細胞質部位とによって上記ウイルス
から区別される複雑なエンベロープ付きウイルスの群で
ある。ポックスウイルスの幾つかのゲノムはマッピング
されており、且つ配列決定されている。これは、約２０
０個のタンパク質であってその中の約１００個がウイル
ス組立に関与しているもの コードする約２００kbの二
本鎖ＤＮＡである。本発明に関連して、ポックスウイル
スベクターは任意の種類のポックスウイルスから得ら
れ、特にカナリア痘ウイルス、鶏痘、およびワクシニア
ウイルスであり、後者のものが好ましい。適当なワクシ
ニアウイルスとしては、Copenhagen株（Goebel et al.,
1990, Virol. 179, 247-266および517-563; Johnson e
t al., 1993, Virol. 196, 381-401）、Wyeth株、およ
び改良Ankara (MVA)株（Antoine etal., 1998, Virol.,
244, 365-396）が挙げられるが、これらに限定されな
い。本発明による発現カセットを含んでなるワクシニア
ウイルスを構築する一般的条件は、当該技術分野で周知
である（例えば、Copenhagenワクシニアウイルスについ
ては、EP 83 286号明細書およびEP 206 920号明細書、
およびMVAウイルスについては、Mayr et al., 1975, In
fection 3, 6-14、およびSutter and Moss, 1992, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851を参照され
たい）。
【００７４】本発明の発現カセットは、好ましくは非コ
ード遺伝子間領域、または不活性化または欠失がウイル
ス増殖および複製を余り損なわない任意の遺伝子のよう
な非本質的座におけるポックスウイルスゲノム内に挿入
される。チミジンキナーゼ遺伝子は、Copenhagenワクシ
ニアウイルスでの挿入に特に適当である（Hruby et a
l., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411-341
5; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537）。MVA
に関する限り、発現カセットの挿入は切断I-VIIのいず
れにおいて行うこともでき、好ましくは切断IIまたはII
I（Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-103
8; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040）ま
たはD4R座で行われる。鶏痘ウイルスについては、チミ
ジンキナーゼ遺伝子内での挿入が考えられるが、発現カ
セットは好ましくは非コード遺伝子間利用いきに導入さ
れる（例えば、欧州特許第314 569号明細書および米国
特許第5,180,675号明細書を参照されたい）。欠陥機能
がヘルパーウイルスを介してまたはプロデューサー細胞
系での発現によってイントランスに供給される場合に
は、本質的なウイルス座での挿入を考えることもでき
る。
【００７５】有利な代替法によれば、本発明のベクター
を、脂質および／またはポリマーのような１種類以上の
トランスフェクション促進剤と複合体形成することがで
きる（合成ベクター）。好ましい脂質は、核酸に高親和
性を有し、且つ細胞膜と相互作用するカチオン性脂質で
ある（Felgner et al., 1989, Nature 337, 387-38
8）。結果として、それらは核酸と複合体形成すること
によって細胞にはいることができるコンパクトな粒子を
生成することができる。適当な脂質としては、DOTMA（F
elgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4, 7413-7417）、DOGSまたはTransfectam（商標）（Beh
r et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 698
2-6986）、DMRIEまたはDORIE（Felgner et al., 19993,
Methods 5, 67-75）、DC-CHOL（Gao and Huang, 1991,
BBRC 179, 280-285）、DOTAP（商標）（McLachlan et
al., 1995, Gene Therapy 2, 674-622）、Lipofectamin
e（商標）およびグリセロ脂質化合物（欧州特許第90146
3号明細書およびWO98/37916号明細書を参照されたい）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】適当なポリマーは、好ましくはカチオン性
の例えばポリアミドアミン（Haensler and Szoka, 199
3, Bioconjugate Chem. 4, 372-379）、樹枝状ポリマー
（WO95/24221号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポ
リプロピレンイミン（WO96/02655号明細書）、ポリリシ
ン（米国特許第5,595,897号明細書またはフランス国特
許第2,719,316号明細書）、キトサン（米国特許第5,74
4,166号明細書）、またはDEAEデキストラン（Lopata et
al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 5707-5717）であ
る。
【００７７】もう一つの態様では、本発明は、宿主細胞
または生物中で目的の遺伝子を筋特異的に発現させるウ
イルス粒子の調製方法であって、 a) 本発明のウイルスベクターを許容細胞系に導入し、 b) 工程a)で得た許容細胞系を適当な期間適当な条件下
で培養して、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子
を産生させ、 c) 前記ウイルス粒子を細胞培養から回収し、 d) 必要に応じて、回収したウイルス粒子を精製する 工程を含んでなる、方法に関する。
【００７８】好ましい態様では、許容細胞系は、感染性
ビリオンを産生するのに必要な総ての遺伝子産物をイン
トランスで提供する相補細胞系である。
【００７９】本発明はまた、本発明によるベクター、好
ましくはウイルスベクターを含んでなるウイルス粒子、
またはこのようなウイルス粒子を調製する方法によって
得ることができるウイルス粒子も提供する。
【００８０】アデノウイルス粒子は、相補細胞系または
ヘルパーウイルスであって、本発明のアデノウイルスベ
クターが欠陥となっているウイルス遺伝子をイントラン
スに供給するものを用いて当該技術分野における任意の
通常の手法によって調製し、増殖することができる（例
えば、Graham and Prevect, 1991, 分子生物学の方法(M
ethods in Molecular Biology),第7巻, 遺伝子導入およ
び発現プロトコール(Gene Transfer and Expression Pr
otocol); E.J. Murray監修, The Human PressInc, Clin
ton, NJ、またはWO96/17070号明細書に記載）。細胞系2
93 (Graham etal., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72)
およびPERC6 (Fallaux et al., 1998,Human Gene Thera
py 9, 1909-1917)が、E1機能を補完する目的で普通に用
いられる。他の細胞系は、二重に欠陥のあるベクターを
補完するために処理加工されている（Yeh et al., 199
6, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 19
95, Human Gene Ther. 6, 1575-1586; Wang et al., 19
95, Gene Ther. 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J.
Virol. 72, 2022-2033; 欧州特許第919627号明細書、お
よびWO97/04119号明細書）。アデノウイルス粒子は培養
上清から回収することができるが、リーシス後の細胞か
ら回収することもでき、必要に応じて標準的手法（例え
ば、WO96/27677号明細書、WO98/00524号明細書、WO98/2
6048号明細書、およびWO00/50573号明細書に記載のクロ
マトグラフィー、超遠心）によって更に精製することが
できる。
【００８１】レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルス
の存在下で、またはレトロウイルスベクターが欠陥とな
っているレトロウイルス遺伝子（例えば、gag/polおよ
びenv）をそのゲノムに組込んで含む適当な相補性（パ
ッケージング）細胞系で調製される。このような細胞系
は、従来の技術に記載されている（Miller and Rosman,
1989, BioTechniques 7, 980; Danos and Mulligan, 19
88, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85, 6460; Markowitz
et al., 1988, Virol. 167, 400）。env遺伝子の産物
は、標的細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイ
ルス粒子の結合に関与しており、従ってレトロウイルス
粒子の宿主範囲を決定する。本発明に関連して、両種指
向性エンベロープタンパク質を含むPA317細胞（ATCC CR
L 9078）または293E16（WO97/35996号明細書）のような
パッケージング細胞系を用いて、ヒトおよび他の種の標
的細胞を感染させるのが有利である。レトロウイルス粒
子は、好ましくは培養上清から回収され、必要に応じて
標準的手法（例えば、クロマトグラフィー、超遠心）に
よって更に精製することができる。
【００８２】ポックスウイルス粒子は、当業者が入手し
得る多数の文献に記載されている方法で調製される（Pi
ccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545
-563; 米国特許第4,769,330号明細書; 米国特許第4,77
2,848号明細書; 米国特許第4,603,112号明細書; 米国特
許第5,100,587号明細書および米国特許第5,179,993号明
細書）。開発されている主な手法は、両側にpoxＤＮＡ
配列（所望の挿入部位を包含する）がフランキングした
本発明の発現カセットを含む供与体プラスミドと野生型
ポックスウイルスゲノムとの間の相同組換えを用いてい
る。一般に、供与体プラスミドは、E. coliでの成長に
よって構築されて、増幅され、通常の手続きによって単
離される。次に、これはポックスウイルスゲノムと一緒
に適当な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞）
に導入され、相同組換えによって本発明のポックスウイ
ルス粒子を産生する。それらは、培養上清からまたはリ
ーシス工程（化学的、凍結／融解、浸透圧衝撃、機械的
衝撃、超音波処理など）後に培養細胞から回収すること
ができ、必要ならば、連続的にプラーク精製を行うこと
によって野生型混入物から単離した後、当該技術分野の
手法（クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたはスク
ロースグラディエント上での超遠心）を用いて精製する
ことができる。
【００８３】本発明は、修飾を行って特定の標的細胞を
優先的にターゲッティングしたベクターまたは粒子も包
含する。（ポリマーおよび脂質と複合体形成したベクタ
ーのようなウイルスおよび非ウイルス性の）本発明の標
的設定したベクター／粒子の特徴は、細胞および表面が
暴露した成分または細胞外マトリックス（ECM）、例え
ばコラーゲンを認識し、結合することができるターゲッ
ティング残基がその表面に存在することである（Hall e
t al., 2000, Human Gene Therapy 11, 983-993）。こ
のようなターゲッティング残基としては、化学的接合
体、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、
PEG、ポリリシン、ポリエチレンイミンなど）、ペプチ
ド、ポリペプチド（例えば、WO94/40958号明細書に記載
のJTS1）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レク
チン、抗体、およびそれらの断片が挙げられるが、これ
らに限定されない。これらは、好ましくは細胞特異的マ
ーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗
原、抗原性エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識
し、結合することができる。
【００８４】細胞の種類に特異的なターゲッティング
は、ウイルス表面タンパク質を修飾することによって広
い宿主範囲を有するウイルスから誘導されたベクターを
用いて行うことができる。例えば、アデノウイルスの感
染特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への
結合によって決定される。これに関して、アデノウイル
スキャプシドの表面に存在する繊維およびペントンが、
細胞結合に重要な役割を果たす（Defer et al., 1990,
J. Virol. 64, 3661-3673）。例えば、アデノウイルス
の細胞ターゲッティングは、繊維および／またはペント
ンをコードするウイルス遺伝子の遺伝子修飾によって行
い、ユニーク細胞表面受容体と特異的相互作用を行うこ
とができる修飾した繊維および／またはペントンを生成
することができる。このような修飾の例は文献に記載さ
れている（例えば、Wickam et al.,1997, J. Virol. 7
1, 8221-8229; Amberg et al., 1997, Virol. 227, 239
-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-66
8; WO94/10323号明細書, WO01/16344号明細書およびWO0
1/38361号明細書）。例えば、アデノウイルス繊維をコ
ードする配列内にEGFをコードする配列を挿入すること
によって、EGF受容体発現細胞を標的設定することがで
きる。
【００８５】他の細胞特異的ターゲッティングの方法
は、レトロウイルスエンベロープタンパク質への抗体ま
たは抗体断片（Michael et al. 1993, J. Biol. Chem.
268, 6866-6869; Roux et al., 1989, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86, 9079-9083; Miller and Vile, 1995,
FASEB J. 9, 190-199およびWO93/09221号明細書）、お
よび核酸結合ドメインとターゲッティング残基を有する
ポリペプチド（WO95/28494号明細書）の接合によって行
われている。
【００８６】本発明は、本発明によるキメラ構築物、発
現カセットまたはベクターを含んでなるか、または本発
明によるウイルス粒子に感染した真核宿主細胞も提供す
る。本発明に関連して、「真核宿主細胞」という用語
は、本発明で用いられる骨格α−アクチン遺伝子プロモ
ーターおよび／またはヒト骨格筋特異的エンハンサーに
含まれるシス作用配列と相互作用することができる１ま
たは数個の転写因子を含んでなる任意の細胞を表してい
る。このような細胞はユニークな型の細胞でもまたは異
なる型の細胞の群であってもよく、哺乳類起源の培養細
胞系、一次細胞、および増殖細胞を包含するが、ヒト起
源のものが特に好ましい。好ましい真核宿主細胞として
は、繊維芽細胞、および筋細胞（上記で定義した通り）
が挙げられ、特に骨格筋細胞が挙げられる。
【００８７】更に、特定の態様によれば、真核宿主細胞
は更にカプセル化されている。細胞カプセル化技術は、
以前に報告されている（Tresco et al., 1992, ASAIO
J. 38, 17-23; Aebischer et al., 1996, Human Gene T
her. 7, 851-860）。上記の特定の態様によれば、トラ
ンスフェクションまたは感染した宿主細胞は多孔性膜を
形成する化合物でカプセル化され、このカプセル化細胞
は更にイン・ビボで移植される。目的の細胞を含むカプ
セルは、ポリエーテルスルホン（PES）製の中空多孔性
膜を用いて調製することができる（Akzo Nobel Faser A
G, Wuppertal, ドイツ; Deglon et al., 1996, Human G
ene Ther. 7, 2135-2146）。この膜は分子量カットオフ
が１Mdaを上回り、カプセル内外の間をタンパク質およ
び栄養物が自由に通過できるが、移植細胞と宿主細胞と
の接触を防止している。
【００８８】本発明は、本発明によるキメラ構築物、発
現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細
胞と、必要に応じて薬学上許容可能なキャリヤーとを含
んでなる医薬組成物も提供する。特別な場合には、この
組成物は２種類以上の発現カセット、ベクターウイルス
粒子または真核宿主細胞とを含んでなることがあるが、
これは(i)発現カセット（すなわち、リガンドによって
調節される系）、(ii)ヒト骨格筋特異的エンハンサー、
(iii)骨格α−アクチン遺伝子プロモーター、(iv)目的
の遺伝子、および／または(v)ベクター主鎖、の性質に
よって異なることがある。
【００８９】本発明による組成物は、全身、局所および
局部化投与などの様々な投与様式に対して通常の方法で
製造することができる。全身投与には、注射、例えば、
皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、髄腔内、心臓内
（例えば、経心臓内および心膜）、腫瘍内、膣内、肺
内、鼻内、気管内、血管内、動脈内、冠動脈内または脳
室内注射が好ましい。筋肉内注射は、好ましい投与用式
である。投与は、単回用量、または一定時間間隔を置い
た後１または数回の反復用量で行うことができる。適当
な投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例え
ば、治療を行う疾病または疾患、これが進行した段階、
予防または治療の必要性、および導入しようとする治療
遺伝子によって変化することがある。例えば、ウイルス
粒子に基づいた組成物は、１０４〜１０１４iu（感染単
位）、有利には１０５〜１０１３iu、好ましくは１０６
〜１０１２iuの用量形態に処方することができる。力価
は通常の手法で決定することができる。ＤＮＡベクター
の用量は、好ましくは０．０１〜１０mg/kg、更に具体
的には０．１〜２mg/kgである。本発明の組成物は、様
々な形態、例えば、固形物（例えば、粉末、凍結乾燥形
態）、液体（例えば、水溶液）であることができる。
【００９０】好ましい態様では、組成物は、薬学上許容
可能なキャリヤーを含んでなり、ヒトまたは動物の治療
法で使用することができる。この特定の場合には、キャ
リヤーは、使用投薬量および濃度でヒトまたは動物体に
対して毒性がない薬学上適当な注射用キャリヤーまたは
希釈剤が好ましい（例えば、レミントンの薬科学(Remin
gton's Pharmaceutical Science), 第１６版, １９８０
年, Mack PublishingCoを参照されたい）。これは、好
ましくは等張、低張または弱高張性であり、スクロース
溶液によって提供されるような比較的低いイオン強度を
有する。更に、これは、任意の関連溶媒、水性または部
分的に水性キャリヤーであって、滅菌した、発熱性物質
不含水、分散媒、コーティング剤など、または希釈剤
（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、乳化剤、可
溶化剤またはアジュバントを含んでなるものを含むこと
ができる。医薬製剤のｐＨは、ヒトまたは動物での使用
に適するように、適当に調節され、緩衝される。注射用
組成物用のキャリヤーまたは希釈剤の代表的例として
は、水、等張食塩溶液であって好ましくは生理学的ｐＨ
に緩衝されているもの（例えば、リン酸緩衝食塩水、Tr
is緩衝食塩水、マンニトール、デキストロース、ヒト血
清アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質を
含むまたは含まないグリセロール）が挙げられる。例え
ば、このような組成物は、１M サッカロース、１５０mM
ＮａＣｌ、１mMＭｇＣｌ２、５４mg/l Tween 80、１０
mM Tris, ｐＨ８．５を含んでなることができる。
【００９１】更に、本発明による組成物は１種類以上の
安定剤、例えば、脂質（例えば、カチオン性脂質、リポ
ソーム、WO98/44143号明細書に記載の脂質）、ヌクレア
ーゼ阻害剤、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（WO98/538
53号明細書）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート化剤
（欧州特許第890362号明細書）を含み、動物/ヒト体内
でその分解を保存し、および／または宿主細胞へのベク
ターのトランスフェクション／感染を向上させることが
できる。このような物質は単独でまたは組み合わせて用
いることができる（例えば、カチオン性および中性脂
質）。これは、ポリリシンとラクトースとのゲル複合体
（Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871-8
78）またはポロキサマー407 (Pastore, 1994, Circulat
ion 90, 1-517)のような動脈細胞で遺伝子導入を促進す
ることができる物質を含んでなることもある。アデノウ
イルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し且つＤ
ＮＡの細胞中への摂取を増進することができることも示
されている。アデノウイルスの脂質複合体形成したＤＮ
Ａベクターを含む溶液に混合、またはＤＮＡをタンパク
質架橋剤を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリ
シンへ結合することによって、組換え遺伝子の摂取およ
び発現を実質的に向上させることができる（Curiel et
al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247-
252）。
【００９２】本発明の組成物は、特に、虚血性疾患（末
梢、下肢、心虚血、および狭心症）、アテローム性動脈
硬化症、高血圧、アテローム発生、脈管内膜肥厚、血管
形成またはステント配置後の（再）再狭窄、腫瘍性疾患
（例えば、腫瘍、および腫瘍転移）、良性腫瘍、結合組
織障害（例えば、慢性関節リウマチ）、眼の欠陥形成性
疾患（例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、角膜移植拒
絶反応、血管新生緑内障）、循環器疾患、脳血管疾患、
糖尿病性疾患、免疫傷害（例えば、慢性炎症または自己
免疫）、および遺伝病（ベッカー−デュシューヌ（Back
er-Duchenne）、多発性硬化症のような筋ジストロフィ
ー）など、これらに限定されない筋肉、血管（好ましく
は、動脈）および／または循環器系に関連した傷害、疾
病または疾患の予防的または治癒的治療を目的とするも
のである。好ましい用途は、虚血性疾患（急性または慢
性）の予防または治療である。バルーン血管形成は、閉
塞した血管中でバルーンを膨張させて、遮断された血管
を開くことを伴う主要な治療法である。ステント配置
も、血流を回復するのに用いられる。不運なことには、
これらの治療法は、血管の内壁を覆っている内皮細胞を
傷付けることが多い。平滑筋細胞が再開した血管中に浸
透して、二次的閉塞を引き起こすことが多い（再狭窄と
呼ばれる過程）。ウイルス性の遺伝治療をこの症例に応
用して、バルーン血管形成またはステンティング処置に
よって作られた損傷にSMC増殖を阻害する生成物をコー
ドする治療遺伝子を送達することができる。
【００９３】本発明は、本発明によるキメラ構築物、発
現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核宿主
細胞を用いる、ヒトまたは動物体の疾患の遺伝治療によ
る治療または予防のための薬剤の調製をも提供する。
【００９４】本発明の範囲内では、「遺伝治療」は、任
意の発現配列を細胞に導入する方法と理解されなければ
ならない。従って、これは、血管新生の潜在能力を有す
るエピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性ま
たは両方であることができる免疫応答を誘導することに
関する免疫療法をも包含する。
【００９５】好ましい態様では、このような使用は、循
環器疾患、特に末梢虚血の治療または予防を目的とする
ものである。この目的のため、本発明の発現カセット、
ベクターまたはウイルス粒子イン・ビボでカテーテル、
ステントなどこの病理に適合した特定の送達手段によっ
てヒトまたは動物体へ送達することができる。例えば、
本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を
コーティングしたバルーンカテーテルまたはステントを
用いることができる（Riessen et al., 1993,Hum Gene
Ther. 4, 749-758; Feldman and Steg, 1996, Medecine
/Science 12,47-55）。本発明に関連した使用に適する
カテーテルは、Advanced Cardiovascular Systems (AC
S)、Boston Scientific、IVT、Target Therapeuticsま
たはCordis、または仏国特許第00 08751号明細書に記載
されているような商業的供給業者から入手することがで
きる。例えば、カテーテルを好都合に大腿動脈に導入
し、腸骨動脈および腹部大動脈を通り、冠動脈に逆行し
て通すことができる。これらの手法の詳細な説明は、当
該技術分野で見出すことができる（例えば、Rutherfor
d, 血管手術(Vascular Surgery), 第３版(Saunders Co,
１９８９年)）。本発明の発現カセット、ベクターまた
はウイルス粒子を、外科手術後に動脈に直接送達するこ
ともできる。もう一つの代替法は、患部動脈に沿って治
療薬を含浸させたグリッドフレームを導入すること（Fe
ldman et al., 1995, J. Clin. Invest.95, 2662-267
1）、または筋肉内注射により操作することである。
【００９６】あるいは、エクス・ビボで処理加工した真
核宿主細胞を用いて、本発明による発現カセット、ベク
ターまたはウイルス粒子を含むようにすることができ
る。このような要素を真核細胞に導入する方法は当業者
に周知であり、微量のＤＮＡの細胞核への微量注入（Ca
pechi et al., 1980, Cell 22, 479-488）、ＣａＰＯ４
を用いるトランスフェクション（Chen and Okayama, 19
87 Mol. Cell. Biol. 7,2745-2752）、電気穿孔（Chu e
t al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326）、リ
ポフェクション／リポソーム融合（Felgner et al., 19
87, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84, 7413-7417）、お
よび粒子衝撃（Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 9568-9572）が挙げられる。処理加工ま
たはカプセル化した筋細胞の移植も、本発明に関連して
官能である（Lynch et al., 1992,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 89, 1138-1142）。
【００９７】本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法で
あって、上記生体に本発明による発現カセット、ベクタ
ー、ウイルス粒子または真核細胞の治療上有効量を投与
することを含んでなる、方法にも関する。
【００９８】「治療上有効量」とは、治療が望まれる疾
患または疾病に普通に伴う１以上の症状の緩和に十分な
用量である。予防使用に関するときには、この用語は、
疾患または疾病の発症を防止しまたは遅延させるのに十
分な用量を意味する。
【００９９】本発明の方法は、上記疾患または疾病に対
する予防目的および治療用途に用いることができる。本
発明の方法は、本明細書に記載したのと同様の方法を用
いて虚血の発症の防止またはその開始後に虚血を逆転さ
せるのに特に有用である。本発明の方法は様々な方法の
いずれによって行うこともできることを理解すべきであ
る。有利なことには、本発明の発現カセット、ベクター
または医薬組成物は、任意の通常の生理学的に許容可能
な投与経路によって、例えば、筋肉内注射によって、ま
たは血管系への適当なカテーテルによって、イン・ビボ
で直接投与することができる。あるいは、本発明による
発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を細胞中に
導入して、トランスフェクション／感染した細胞をイン
・ビトロで増殖させた後、適当な膜で最終的にカプセル
化した後に、それらを治療を行う患者に再導入すること
からなるエクス・ビボ法を採用することもできる。
【０１００】疾患または疾病の予防または治療は、本発
明の方法を単独で、または所望ならば、現在利用可能な
方法（例えば、放射線、化学療法、および血管形成など
の外科手術）と組み合わせて用いて行うことができる。
好ましい態様では、本発明による方法は、例えば、血管
またはリンパ管のような流体管への投与を伴い、また求
心性および／または遠心性流体管への注射を上記管の透
過性の増加と組み合わせることによって有利に改良する
ことができる。特に好ましい態様では、上記増加は、静
水圧の増加（すなわち、流出および／または流入の遮
断）、浸透圧（すなわち、高張溶液を用いて）、および
／または生物活性分子の導入（すなわち、投与した組成
物へのヒスタミン；WO98/58542号明細書）によって得ら
れる。もう一つの態様では、患者に筋変性を促進する物
質を投与して、治療の効力を向上させることもできる。
更に、トランスフェクション率を向上させるため、患者
はマクロファージ枯渇治療を受けた後、本発明の組成物
の投与を受けてもよい。このような手法は、文献に記載
されている（例えば、Van Rooijen et al., 1997, TibT
ech, 15, 178-184)。
【０１０１】本発明は、骨格筋細胞で目的の遺伝を特異
的に発現させるための本発明によるキメラ構築物、発現
カセット、ベクターまたはウイルス粒子の使用も提供す
る。
【０１０２】本発明は、ヒト以外のトランスジェニック
動物、特にトランスジェニックマウスであって、そのゲ
ノムに本発明による発現カセットまたはベクターを組込
んでなるものも提供する。このような動物は通常のトラ
ンスゲネシス法によって生成することができ、治療遺伝
子の潜在的効果または活性、または本発明の発現カセッ
トに含まれる骨格α−アクチン遺伝子プロモーターおよ
び／またはヒト骨格筋特異的エンハンサーの調節を研究
するためのモデルとして用いることができる。
【０１０３】本発明は、遺伝治療によるヒトまたは動物
体の循環器疾患を治療または予防する薬剤を調製するた
め、少なくとも(i)１種類の骨格α−アクチン遺伝子プ
ロモーターおよび(ii)１種類の筋特異的エンハンサーの
制御下に置かれた目的の遺伝を含んでなる発現カセッ
ト、ベクター、ウイルス粒子の使用にも関する。様々な
異なる供給源からの多数の筋特異的エンハンサーは当該
技術分野で周知であり、クローニングしたポリヌクレオ
チド配列（例えば、ATCCのような寄託機関、または商業
的および個人の供給源からのもの）として利用可能であ
り、またはその中にある。上記したもの以外で、適当な
筋特異的エンハンサーとしては、平滑筋、骨格筋および
心筋細胞で操作可能なものが挙げられる。代表例として
は、哺乳類クレアチンキナーゼ遺伝（すなわち、マウス
遺伝由来のもの; Janes etal., 1988, Mol. Cell. Bio
l. 8, 62-70）であって、特に好ましくは上記で定義し
たヒトクレアチンキナーゼエンハンサーに対するもの、
哺乳類β−エノラーゼ遺伝子であって、特に好ましくは
上記で定義したヒトβ−エノラーゼエンハンサーに対す
るもの、哺乳類α−アクチン（Shimizu et al., 1995,
J. Biol. Chem. 270, 7631-7643）、特に心筋、骨格筋
または平滑筋α−アクチン（Genbank受託番号D0061
8）、哺乳類トロポニン、特にトロポニンC（Genbank受
託番号M37984）、I（Genbank受託番号X90780）、または
T（Genbank受託番号AJ011712）、哺乳類ミオシン。数種
類のミオシンエンハンサーが、今日までにミオシン軽鎖
およびミオシン重鎖遺伝子のいずれからも同定されてい
る（例えば、Donoghue et al., 1988, Genes and Devel
opment 2, 1779-1790）。好ましいものはミオシン重鎖
エンハンサーであり、更に好ましくはウサギのものであ
り、特に好ましくはウサギミオシン重鎖をコードする遺
伝子の転写開始部位の上流の約−１３３２位〜約−１２
２５位に配置されたエンハンサーに対するものである
（Kallmeieret al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 30949
-30957）、哺乳類APEG-1（大動脈で優先的に発現した遺
伝子−１; Hsieh et al., 1999,J. Biol. Chem. 274 14
344-14351）、哺乳類スムーセリン(smoothelin)（Genba
nk受託番号AH007691）、哺乳類SM20遺伝子産物、特にヒ
ト由来のもの（Wax et al., 1996, Lab. Invest. 74, 7
97-808）、哺乳類Timp4（メタロプロテイナーゼ４の組
織阻害剤）、特にヒト由来のもの（Genbank受託番号U76
456）、哺乳類カルポニン、特に好ましくはネズミカル
ポニン遺伝子の第一のイントロン内の約＋１３８位〜約
＋１８７５位に配置された配列に対するもの（Miano et
al., 2000, J. Biol. Chem. 275 9814-9822）をコード
する遺伝子から単離されたまたは誘導されたものが挙げ
られる。
【０１０４】好ましくは、骨格α−アクチン遺伝子プロ
モーターおよび／または筋特異的エンハンサーおよび／
または目的の遺伝子および／またはベクターは、上記で
定義した特性を有する。本明細書で用いられる「および
／または」という用語は、「および」、「または」、お
よび「上記用語によって結合された要素の総てのまたは
任意の他の組合せ」の意味を包含する。好ましい使用
は、抹消虚血の予防または治療を意図している。
【０１０５】本発明を実例で説明してきたが、用いられ
てきた用語は単語の性質で制限よりはむしろ説明を意図
していることを理解すべきである。本発明の多くの修飾
および変更が、上記の教示を考慮すれば可能であること
は明らかである。従って、特許請求の範囲内で、本発明
を具体的に本明細書に記載されているのとは異なるやり
方で実施することができることを理解すべきである。
【０１０６】上記に引用された特許明細書、公表文献お
よびデーター記載事項の総ての開示内容は、それぞれの
上記特許明細書、公表文献およびデーター記載事項が具
体的および個別的に参考として記載されるのと同程度ま
でその開示の一部として本明細書に引用されている。
【０１０７】下記の実施例によって、本発明を説明す
る。
【０１０８】
【実施例】A. 材料および方法 以下に記載される様々な構築物で用いられるアデノウイ
ルスゲノム断片は、Chroboczek et al.によって開示さ
れているAd5ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれら
の位置に準じて正確に与えられる(1992, Virol. 186, 2
80-285)。
【０１０９】標準的クローニング法（Sambrook and Rus
sell, 2001, 分子クローニング, A：実験室便覧(Molecu
lar Cloning: A, Laboratory Manual), Cold Spring Ha
borLaboratory Press, Cold Spring Harbor NY）を用い
て、以後に説明するキメラ構築物を生成した。
【０１１０】1. 分子生物学 ポリメラーゼ連鎖反応 a) HSAプロモーターおよびβ−エノラーゼエンハンサ
ー配列のＰＣＲ増幅 ＰＣＲキット（Taq Plymeraseおよび緩衝剤）は、Qiage
nから購入した。ヒトゲノムＤＮＡ（ＰＣＲ反応当たり
１μg）を、鋳型として用いた含んでなる。特異的プラ
イマー（ＰＣＲ当たりそれぞれ５０ピコモル）をHSAプ
ロモーター（配列番号４に記載の前進プライマー5'-aaa
cgcgtcgacattggaagtcagcagtcaggc-3'および配列番号５
に記載の復帰プライマー5'-ttcgacgtcgacaaagcgcgtgtgg
ctccgga-3')、およびβ−エノラーゼエンハンサー（配
列番号６に記載の前進プライマー5'-aaacgcgtcgacgattc
ttaggatgggagggtg-3'および配列番号７に記載の復帰プ
ライマー5'-ttcgacgtcgacgattcttccccactccaagaa-3'）
に用いた。反応混合物に、２５０μM（最終濃度）のdNT
Pを補足した。ＰＣＲは、Perkin Elmer Gene Amp PCRSy
stemで行った。増幅プログラムは、最初の変性工程（５
分間、９５℃）の後、５０サイクルの変性（１分間、９
５℃）、プライマーアニーリング（１分間、６４℃）、
および伸張（１分間、７２℃）からなっていた。最後
に、伸張の追加工程を、７２℃で１０分間行った。
【０１１１】b) マウス臓器での組換えアデノウイルス
ＤＮＡのＰＣＲ検出 マウス臓器から抽出したＤＮＡを、鋳型として用いた。
特異的プライマーをデザインした（配列番号８に記載の
フォワードプライマー5'-ttccgcgttccgggtcaa-3'および
配列番号９に記載のリバースプライマー5'-tccagcggttc
catcctcta-3'）。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度（６
０℃）とサイクル数（３０）を除いて、上記とほとんど
同様であった。
【０１１２】c) C2C12筋芽細胞および筋管におけるマ
ウス骨格α−アクチンおよびマウスグリセロアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(MGAPDH)ｍＲＮＡのＲＴ
−ＰＣＲ検出 RT-PCR One-Step Systemキットは、Life Technologies
から購入した。全ＲＮＡ抽出物を、鋳型として用いた。
特異的MSAプライマー（配列番号１０に記載のフォワー
ドプライマー57-ccaactgggacgacatggaga-3'および配列
番号１１に記載のリバースプライマー5'-atgctgttgtagg
tggtctcat-3'）およびMGAPDHプライマー（配列番号１２
に記載のフォワードプライマー5'-ccatggagaaggctgggg-
3'および配列番号１３に記載のリバースプライマー5'-c
aaagttgtcatggatgacc-3'）をデザインした。ＲＴ−ＰＣ
Ｒは、ｃＤＮＡ合成工程（３０分間、４２℃）、予備変
性（５分間、９５℃）、および４０サイクルの変性（１
５秒間、９５℃）、プライマーアニーリング（３０秒
間、６４℃）および伸張（１分間、７２℃）から構成さ
れた。
【０１１３】ＤＮＡクローニング a) クローニング法 遺伝子導入ベクターは、５′から３′へ、アデノウイル
ス領域１〜４５８を有する相同配列、レポーター−遺伝
子としてのホタルルシフェラーゼ、b増殖ホルモンポリ
アデニル化シグナル（bGHpA）、およびアデノウイルス
領域３５１１〜５７８８を有する相同配列を含んでい
る。ＰＣＲによって増幅したHSAプロモーターは両端にS
alI制限部位を有し、ルシフェラーゼｃＤＮＡの上流の
ユニークXhoI部位でクローニングした。ＰＣＲによって
増幅されたβ−エノラーゼエンハンサー（ENO）も両端
にSalI部位を有し、クレアチンキナーゼ（CK）エンハン
サー配列はＰＣＲによって増幅されなかったが、前に存
在しているプラスミド（Ribault et al., 2001, Circul
ation Res. 88, 468-475）からXhoI消化によってサブク
ローニングされた。これらのエンハンサーは、pHSAの上
流のSalI部位に挿入した。
【０１１４】b) クローニング技術 ＤＮＡ断片を１%アガロースゲル上で分離し、Qiagen Qi
aquick Gel Extraction Kitで精製した。
【０１１５】総ての制限酵素は、New England Biolabs
から購入した。酵素１単位（U）を用いて、１μgＤＮＡ
を消化した。反応は適当な緩衝液（必要ならば、ウシ血
清アルブミン（BSA）を補足）で行い、推奨温度で１時
間インキュベーションした。
【０１１６】Roche Diagnostics Klenow酵素の５′−
３′ポリメラーゼ活性を用いて、平滑末端ＤＮＡ断片を
生成した。反応は、２mM dNTP（最終濃度）とＤＮＡ１
μg当たり酵素２．５Uを細くした適当な緩衝液で行っ
た。
【０１１７】脱リン酸化を行って、ベクターの自己再連
結を回避した。ＤＮＡは、Roche Diagnostics Calf Int
estine Phosphatase（ＤＮＡ１μg当たり１U）と共に３
７℃で１時間インキュベーションした。
【０１１８】連結キット（T4 ＤＮＡリガーゼおよび緩
衝液）は、Gibco BRLから購入した。ベクターとインサ
ートは、分子の大きさに準じて１：４〜１：２０の分子
比ランキングで混合した。反応は、最終容積２０μlで
行い、付着断片連結については室温で２時間インキュベ
ーション、または平滑末端断片連結については一晩イン
キュベーションした。
【０１１９】E. coli DH5α細菌細胞の形質転換 コンピテント細胞（１００μl）を連結反応１０μlと混
合し、氷上で１０分間インキュベーションし、３７℃で
２分間熱衝撃を加え、氷上で更に１０分間インキュベー
ションした。次に、総てのベクターはそれらの主鎖にAm
p（商標）選択遺伝子を有しているので、５００μlのLu
ria-Broth培地（LB）を細胞に加え、この混合物１００
および２００μlを１００μg/mlアンピシリンを補足し
たLB寒天プレートに塗布した。プレートは、３７℃で一
晩インキュベーションした。
【０１２０】プラスミドのミニ調製 プラスミドＤＮＡは、Maniatisの実験室便覧に記載の方
法で調製し、精製した（実験室便覧(Laboratory Manua
l), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor NY）。
【０１２１】プラスミドの大量調製 プラスミドの大量調製は、Nucleobond AXカートリッジ
を用いて製造業者の指示に従って行った（Macherey-Nag
el, Hoerdt, フランス）。Tris EDTA緩衝液（TE,１０mM
Tris, １mM EDTA, ｐＨ７．５）に再懸濁した後、ＤＮ
ＡをＯＤ２６０nm測定によって定量し（１ＯＤ＝５０μ
g/ml）、純度をＯＤ２６０nm／ＯＤ２８ ０nm比によって
算定した。
【０１２２】E. coli BJ5I83における相同組換え ウイルスベクターは、Chartier et al.によって記載さ
れた方法で感染性プラスミドとして構築した（1996, J.
Virol. 70, 4805-4810）。簡単に説明すれば、線形化
したE1欠失アデノウイルスゲノムプラスミドを、１００
μlのコンピテントE. coli BJ5183細胞中でインサート
（すなわち、相同領域Ad 1-458およびAd3511-5788を有
する発現カセット）と共に１：１０の分子比で同時形質
転換した。形質転換は、熱衝撃法によって行った。
【０１２３】A549細胞からヒトゲノムＤＮＡの抽出 A549細胞を、下記の緩衝液：５０μg/ml Proteinase K,
０．５％ＳＤＳ, ５mMＥＤＴＡ, ５mM Tris, ｐＨ８中
で３７℃で２時間インキュベーションした。フェノール
／ジクロロメタン抽出の後、ＤＮＡを無水エタノールで
沈澱させ、遠心分離（１６，０００g）によってペレッ
ト化した。ペレットを７０%エタノールで洗浄して、風
乾し、ＴＥに再懸濁し、ＯＤ２６０nm測定によって定量
した。
【０１２４】マウス臓器からのＤＮＡの抽出 臓器をプロテイナーゼK溶液（０．２mg/mlプロテイナー
ゼK, １%ＳＤＳ, ５mMＥＤＴＡ, １０mM Tris HCl,
０．３M酢酸ナトリウム, ｐＨ８）中で一晩インキュベ
ーションした後、ＤＮＡを前節に記載の方法で調製し
た。適当なＴＥ容積を用いて、再懸濁した：それぞれ、
肝臓については３００μl、脾臓および肺については１
００μl、心臓ＤＮＡについては５０μl。
【０１２５】C2C12筋芽細胞および筋管からのＲＮＡの
抽出 ＲＮＡを、Biogentex RNA Now 法（Ozyme, Montigny-le
Bx, フランス）を用いてC2C12筋芽細胞および筋管から
抽出した。簡単に説明すれば、試薬１mlをそれぞれのウ
ェルに加え、ＲＮＡを反復ピペッティングによって可溶
化した。次に、ＲＮＡを細胞ホモジェネートからクロロ
ホルムで抽出し、イソプロパノールで沈澱させ、遠心分
離（１０，０００g）によってペレット化し、７０%エタ
ノールで洗浄した。ＲＮＡを超純水に再懸濁し、ＯＤ
２６０nm測定によって定量した（１ＯＤ＝４０μg/m
l）。
【０１２６】2. 細胞生物学 特に断らない限り、総ての細胞系は、１７５cm２フラス
コ（Falcon)中で、１０%ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Life T
echnologies）、２mMグルタミン、４０μg/mlゲンタマ
イシンを補足したDulbecco改良Eagle培地（ＤＭＥＭ、L
ife Technologies）で培養した。細胞を３７℃、５%Ｃ
Ｏ２でインキュベーションした。１週間に２回、細胞を
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Life Technologies）を用
いる洗浄工程の後に、トリプシン処理を行い、１：２〜
１：１０に分割し、新たな１７５cm２フラスコに移し
た。
【０１２７】マウスC2C12筋芽細胞（ATCC: CRL-1722）
およびヒト肺上皮癌A549細胞（ATCC:CCL-185）は、Amer
ican Type Culture Collectionから購入した。
【０１２８】E1アデノウイルス領域を発現するヒト網膜
PER.C6相補性細胞系（Fallaux et al., 1998, Human Ge
ne Ther. 9, 1909-1917）は、細胞が基質へ付着するの
に必要な１０mMMgＣｌ２を補足したＤＭＥＭで増殖させ
た。
【０１２９】538細胞（Lusky et al., 1998, J. Virol.
72, 2022-2032）は、一次ヒト胚性腎細胞（293, ATCC:
CRL-1573）に由来する。それらはE1をトランスコンプ
ルメントし、アデノウイルスE4領域由来のORF 6および7
も発現する。
【０１３０】ヒト骨格筋細胞（HSKMC、ヒト筋芽細胞）
およびヒト臍帯静脈内比細胞（HUVEC）はPromcellから
購入して、提供された培地で培養した。
【０１３１】3. 組換えアデノウイルス産生 PerC6トランスフェクション ０日目（Ｄ０）に、１０６個の細胞（継代数４５未満）
を、直径６cmのペトリ皿に接種した。Ｄ１に、細胞をＣ
ａＰＯ４沈澱法を用いてトランスフェクションした。
【０１３２】E. coli BJ5183での相同組換えによって産
生したアデノウイルスゲノムを、SwaIまたはPacI消化に
よって線形化した。フェノール／ジクロロメタン抽出の
後、アデノウイルスＤＮＡを（２容の無水エタノールお
よび１／１０容の３M酢酸ナトリウムｐＨ５を用いて）
沈澱させ、滅菌ＴＥに再懸濁して、定量した。５μgの
プラスミドを最終容積が２１０μlのＴＥに希釈し、２M
ＣａＣｌ２３０μlと混合した。次に、このＤＮＡ溶液
を、ＨＢＳ２ｘ（２８０mMＮａＣｌ，５０mMＨＥＰＥ
Ｓ，１．５mMＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．１２）２４０μ
lに徐々にピペットで移し替えた。混合物を、室温で１
５〜３０分間インキュベーションした。生成するＤＮＡ
沈澱を、次に細胞に均質に分布させた。プレートを一晩
インキュベーションした。Ｄ２に、培地を除き、細胞を
１０%ＦＣＳを含むＤＭＥＭで２回洗浄し、リーシスが
起こるまで２%ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した。次
に、トランスフェクションを回収して、凍結した。
【０１３３】ウイルスのプレストック産生 ウイルスを増幅するため、２個の７５cm２フラスコに５
×１０６個のPER.C6細胞を培養し、２%ＦＣＳを補足し
たＤＭＥＭで感染多重度（ＭＯＩ）１〜５に相当するト
ランスフェクション５００および８００μlを感染させ
た。プレストックをリーシス後に回収し、凍結した。
【０１３４】ウイルスストック産生 １０個の５００cm２フラスコを５０〜６０%の集密度で
２%ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中フラスコ当たりプレストッ
ク１mlを感染させた。リーシスの後、細胞を回収し、５
３８gで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を
１０ml培地に再懸濁した。ウイルス放出を増強させるた
め、細胞膜を３回の凍結−融解サイクルによって破壊し
た。次に、細胞溶解生成物を、４，８４５gで１０分間
の遠心分離を２回行って透明にした。塩化セシウム（Ｃ
ｓＣｌ）グラディエントをSW40ポリアロマーBeckman超
遠沈管で調製し、無菌濾過した１．２５g/mlＣｓＣｌ４
mlを１．４g/mlＣｓＣｌ４ml上に徐々にピペットで加え
た。透明になった上清を伸張にこのグラディエントに塗
布し、２１８，０００gおよび１５℃で２時間遠心分離
した。ウイルスを回収して、無菌濾過した１．３４g/ml
ＣｓＣｌ８mlにピペットで移し替えた。２１８，０００
gおよび１５℃で一晩遠心分離した後、ウイルスを前回
と同様に回収し、６０%スクロース緩衝液（最終スクロ
ース濃度３０%）で希釈し、Pierce Slide-A-Lyzer透析
カセットに注入した。ウイルスを、１Mスクロース、１
５０mMＮａＣｌ、１mMＭｇＣｌ２、１０mM Tris, Tween
80 １mM/l緩衝液，ｐＨ８．５の緩衝液２リットルに対
して２時間３回透析した。ウイルスストックを最後に
１．２mlのNunc冷凍試験管に等分し、−８０℃で凍結し
た。
【０１３５】アデノウイルス感染単位（iu）の滴定 Ｄ０に、Nunc LabTekに１０%ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ
５００μl中ウェル当たり１．５×１０５個の538細胞を
接種し、一晩インキュベーションした。Ｄ１に、培地を
除き、２%ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中ウイルスストック連
続希釈物（２×１０−６、１０−６、５×１０−７、
２．５×１０−７、１．２５×１０−７、６．２５×１
０−８、３．１２５×１０−８）２００μlに置き換え
た。希釈当たり２個のウェルを感染させ、２個のウェル
は感染を行わず、ネガティブコントロールとして用い
た。１６時間のインキュベーションの後、培地を除き、
細胞をアセトン／メタノール（v/v）中で室温にて１０
分間固定した。ウェルをスライドから分離した後、これ
を免疫化学染色して、ウイルス複製が起こる感染細胞で
合成が誘導されるＤＮＡ結合タンパク質（DBP）を検出
した。３%ＦＣＳを補足したＰＢＳで３０分間飽和した
後、スライドを第一の抗体（α72K B6-8マウス抗DBPハ
イブリドーマ上清; Reich et al., 1983, Virology 12
8, 480-484）と共に室温で４５分間インキュベーション
し、３%ＦＣＳを含むＰＢＳで１０分間洗浄した。次
に、スライドを第二の抗体（ウサギ抗マウス免疫グロブ
リン（Ig）抗体, Dako）と共に３０分間インキュベーシ
ョンし、前回と同様に洗浄した。最後に、フルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ, Sanofi Pasteur）に
結合したヒツジ抗ウサギIg抗体を用いて、ポジティブ細
胞を明らかにした（暗所で３０分間インキュベーショ
ン）。スライドをカバーグラスで保護し、４℃で保存し
た。蛍光細胞をＵＶ光線下で計数し、iu力価を下式によ
って決定した： フィールド当たり蛍光細胞の平均数×４８５×５／希釈
度＝iu／ml。
【０１３６】総粒子滴定 ウイルスを０．１%ＳＤＳを補足したＴＥで希釈し、２
分間攪拌し、９，５００gで５分間遠心分離した。ＯＤ
２６０nmを測定し、総粒子力価を下式によって決定し
た： ＯＤ２６０nm×希釈度×１．１．１０１２＝総粒子／m
l。
【０１３７】総粒子／iu比を計算し、空キャプシドの比
率を求めた。
【０１３８】ウイルスＤＮＡ分析：Hirth改良法 ウイルス濃度に従って、ウイルス１００−１６５μlを
２．５μl ProteinanseK（１０mg/ml）、３３２．５μl
リーシス緩衝液（０．５%ＳＤＳ，５mMＥＤＴＡ，５mM
Tris，ｐＨ８）、および超純水qsp ５００μlと混合し
た。一晩３７℃でインキュベーションした後、タンパク
質をフェノール／ジクロロメタン抽出によって除去し
た。ウイルスＤＮＡを沈澱させ、６０μlＴＥに再懸濁
した。次に、５回の制限酵素消化を行い（１０μl／消
化）、ウイルスＤＮＡを制御した。
【０１３９】ＲＣＡ（複製コンピテントアデノウイル
ス）の決定 この試験を用いて、産生した組換えウイルスは複製に欠
陥があることを確かめた。Ｄ０に、２×個のA549細胞を
６cmの直径のペトリ皿に接種した。Ｄ１に、細胞に２×
１０６個のiu（ＭＯＩ＝１）を感染させた。細胞が集密
となったとき（通常はＤ３）、１７５cm２フラスコに移
し、集密性が達成されるまでインキュベーションした。
この時点でリーシスプラークが見られなかった場合に
は、ウイルス懸濁液は非複製アデノウイルスベクターに
ついての遺伝学的に修飾された生物についてのフランス
委員会(French Commission for Genetically Modified
Organisms)の要件を満たしていた。
【０１４０】4. イン・ビトロでのベクター評価 アデノウイルス感染症に対する感染性 細胞を、ウェル当たり３ml培地を有する６ウェルプレー
トに接種した。それぞれの実験について、ウイルス（お
よびネガティブコントロール）当たり２〜６個のウェル
に接種し、もう１個のウェルを感染前の細胞の計数に用
いた。細胞に、１０〜１０００のMＯＩで、ＣＭＶプロ
モーターの制御下で増強した緑色蛍光タンパク質（eGF
P）を発現するアデノウイルスを感染させた。ウイルス
を適当な培地で希釈し、相当するウェルに加えた。感染
上清を６時間放置した後、培地を除き、新たな培地に取
り換えた。プレートを３７℃で３日間インキュベーショ
ンした。Ｄ３に、細胞をトリプシン処理し、３%ホルム
アルデヒド中で室温にて１０分間固定し、ＰＢＳで２回
洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した（Bect
on Dickinson FACScan）。
【０１４１】感染条件 感染は、レポーター発現分析（ルシフェラーゼ、次節を
参照）を除き、前節に記載の方法で行った。
【０１４２】ＨＳＫＭＣ筋芽細胞をウェル当たり６×１
０４個の細胞の密度で接種し、ＭＯＩ５００で感染させ
た。
【０１４３】他の実験では、ＨＳＫＭＣを筋管にも融合
させた。細胞を、ウェル当たり２×１０５個の密度で接
種した。成長培地を、集密時に分化培地に変更し、６〜
１０日後にシンシチウムの発生が見られた。筋管へ分化
したならば、ＨＳＫＭＣは計数することはできなかった
が、３×１０８IU（６×１０５個の算定した細胞でＭＯ
Ｉ５００）と感染した。
【０１４４】C2C12をウェル当たり２×１０４個の密度
で接種し、ＭＯＩ４００で感染した。感染後、培地を１
０%ＦＣＳを補足した新鮮なＤＭＥＭに代えて、低血清
条件で速やかに起こる分化を回避した。筋管に関連した
ベクターを評価するため、C2C12を融合し、細胞１０６
個の細胞／ウェルの密度で接種し、培地を集密時に２%
ＦＣＳを含むＤＭＥＭに代えた。一日後、ヒト筋管とは
異なり、分化したネズミ細胞は計数することができた。
次に、これらを、ＭＯＩ４００で感染させた。
【０１４５】A549を、２×１０５個の細胞／ウェルの密
度で接種し、ＭＯＩ１０で感染させた。感染後、培地を
２%ＦＣＳを補足した新鮮なＤＭＥＭに代えた。ＨＵＶ
ＥＣをウェル当たり２×１０５個の細胞で接種し、ＭＯ
Ｉ１０で感染させた。
【０１４６】ルシフェラーゼ発現測定 総てのベクターは、レポーター遺伝学としてホタルルシ
フェラーゼを有している。感染から３日後、培地を６ウ
ェルプレートから除き、細胞を１mlＰＢＳで洗浄した。
３００μlの容積のPromega Reporter Lysis Buffer (RL
B)をそれぞれのウェルに加え、プレートを−８０℃で少
なくとも２時間凍結し、細胞リーシスを完成した。次
に、２０μl試料のルシフェラーゼ活性をPerkin Elmer
不透明マルチウェルプレート、Promega Luciferase Ass
ay ReagentおよびMicroLumat EG&GBerthold照度計を用
いて定量した。生成した光を３０秒間測定し、平均し
て、ＲＬＵ（相対光単位）を得た。結果を総タンパク質
含量によって規格化し、ＲＬＵ／mgで表した。２０μl
の細胞溶解生成物の総タンパク質含量を、Bradford試験
を用いて定量した。試料を再構成したBCA Pierce Prote
in Assay Reagent２００μlと混合して、３７℃で３０
分間インキュベーションした。標準曲線を０、５、１
０、１５、２０、２５、３０および４０μgＢＳＡを用
いて作製し、ＯＤ５ ５０nmをSoftMaxプログラムで読み
取った。
【０１４７】5. イン・ビボでのベクター評価 総ての動物実験は特別な無病原体施設で行い、動物実験
についてのフランス国の規制に準じて行った（Decret N
o. 87-848, 19.10.1987）。
【０１４８】プロモーター強度 ６週齢の雌免疫コンピテントC57BL/6マウス（Iffra-Cre
do）の前頸骨筋、四頭筋、または手根骨伸筋に、０．９
%ＮａＣｌ５０μl中それぞれのアデノウイルス２×１０
８iuを加えたものを投与した。Ｄ３に注射後にマウスを
屠殺して、この時点で動態研究において最大レポーター
活性に相当することを見出した（データーは示さず）。
筋肉を切開して、液体窒素で凍結し、−８０℃に保持し
た。筋肉をPT3100 Polytron装置を用いてRLB５００μl
中で摩砕した。細胞膜を崩壊させるため、凍結−融解サ
イクルを３回行った。細胞溶解生成物を１６，０００
g、４℃で１５分間遠心分離した。上清をルシフェラー
ゼ発現測定および総タンパク質含量の定量（A4節に記載
の方法）に用いた後、−８０℃で凍結した。
【０１４９】プロモーター特異性 マウスの尾静脈に０．９%ＮａＣｌ２５０μl中にアデノ
ウイルス２×１０９iuを加えたものを投与した。動物を
Ｄ３に投与後に屠殺し、肝臓、肺、心臓および脾臓を採
取した。臓器の半分を液体窒素で凍結し、Polytronを用
いて、適当なRLB容積、すなわち肝臓については１ml、
肺および脾臓については５００μl、心臓については２
００μl中で摩砕した。次に、組織ホモジェネートを用
いて、ルシフェラーゼおよび総タンパク質含量を定量し
た。臓器の第二の半分をProteinaseK溶液中で一晩イン
キュベーションし、ＤＮＡ抽出に用いた（A1節を参照さ
れたい）。
【０１５０】6. 統計分析 総ての結果は平均値±ＳＥＭとして表し、Studentのt検
定によって分析した。Ｐ＜０．０５の値では、差は統計
学的に有意であると考えた。
【０１５１】B. 結果 例１：ＨＳＡに基づくプロモーターの強度および特異性
のイン・ビトロ評価 一連のアデノウイルスベクターを構築し、材料および方
法に記載の方法でPER.C6細胞で産生した。総ての発現カ
セットはレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝
子、非コードエキソン、イントロン、およびbGH ポリA
を含んでいるが、それらはエンハンサーおよびプロモー
ター要素で異なっている。図１のpTG 15331に示される
ように、ルシフェラーゼ遺伝子発現はキャップ部位(+1)
に対して−４３２位から＋２３９位まで伸びているヒト
骨格α−アクチンプロモーター(pHSA)によって進められ
る。HSAプロモーターによって提供される転写活性が筋
特異的エンハンサー、すなわち元のキャップ部位に対し
て＋５０４位から＋６３７位へ伸びているヒトβ−エノ
ラーゼ(ENO)エンハンサー(pTG15442)、または元のキャ
ップ部位に対して−９１９位から−７１１位まで伸びて
いるヒトクレアチンキナーゼ(CK)エンハンサー(pTG1568
0)によって強化されている２種類の発現ベクターをデザ
インした。ポジティブコントロールベクターとして、pT
G15198およびpTG15760は、それぞれウイルスIE CMVエン
ハンサー／プロモーターおよびRSV LTRによって進めら
れるルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。それぞれの場
合に、ルシフェラーゼ発現カセットを、４５９〜３５１
０位から構成されるアデノウイルス配列の代わりにE1お
よびE3を欠失したアデノウイルス主鎖に挿入した。ルシ
フェラーゼ遺伝子発現を、それぞれの種類の組換えアデ
ノウイルスによって感染したヒト(HSKMC)およびネズミ
(C2C12)筋芽細胞で分析した。
【０１５２】HSAプロモーター（エンハンサーなし）に
よって進められるルシフェラーゼ発現レベルは、HSKMC
で５×１０７RLU/mgおよびC2C12筋芽細胞で６．４×１
０６RLU/mgに達し、それぞれウイルスRSVプロモーター
で得た発現レベルの０．３%および４２．４%に相当し
た。発現レベルは筋芽細胞への分化と共に著しく増加
し、それぞれHSKMCおよびC2C12筋芽細胞におけるRSVに
よって促進された発現の１．３%および１００%に達し
た。
【０１５３】分化の際にpHSAによって進められる発現に
おけるこの増加を内因性のマウス骨格α−アクチン(MS
A)転写のアップレギュレーションと相関させることがで
きるかどうかを検討するため、筋芽細胞と筋管との差が
特に著しい特異的ＲＴ−ＰＣＲをC2C12の総ＲＮＡ抽出
物について行った。検出されたMSA特異的シグナルは増
殖筋芽細胞より分化した筋芽細胞で強かったが、GAPDH
シグナルは予想の通り変化しないままであった。従っ
て、分化の際のルシフェラーゼ遺伝子発現の増加は、プ
ロモーターの内在性レギュレーションによって直接影響
されると思われる。
【０１５４】pHSAの上流でENOエンハンサーを付加して
も、それぞれヒトおよびネズミ筋芽細胞でのルシフェラ
ーゼ発現の改良は、少なくともアデノウイルスに関して
は見られなかった（図２）。更に、このENOエンハンサ
ーの付加は、HSKMC金貨細胞でのpHSAによって進められ
る発現に有意な効果は見られなかった。しかしながら、
正の効果が分化したC2C12筋芽細胞で見られ、レポータ
ー発現は２倍に増加した。ルシフェラーゼ活性は６．７
×１０８RLU/mgに達し、RSVによって進められる発現の
２５０%に相当した。
【０１５５】pHSAとCKエンハンサーとの組合せにより、
ヒト筋芽細胞でのレポーター遺伝子発現が統計学的に有
意に増加した（pHSA単独では５×１０７RLU/mgであるの
に対して、６．８×１０７RLU/mg）。C2C12筋芽細胞で
は、ベクターはENO/pHSAと同じ発現パターンを示した。
ヒト筋芽細胞では、発現は若干増加した（pHSA単独では
１．２×１０８RLU/mgであるのに対して、１．６×１０
８RLU/mg）。しかしながら、C2C12筋芽細胞では、CKエ
ンハンサーの存在によって、発現は５倍増加し、RSV活
性の５７０%に達した。
【０１５６】上記のようなエンハンサーと組合せたHSA
に基づくプロモーターの高い筋特異性を立証するため、
ベクターをA549およびHUVEC細胞で試験した。いずれの
型の細胞でもバックグラウンドのみが検出され、実際
に、これらの筋以外の細胞でpHSA単独で進められる発現
は分化したHSKMCまたはC2C12筋芽細胞におけるより弱く
１００〜１０００分の１であった。更に、特異性は、エ
ンハンサーの付加によって更に３〜４倍増加した。
【０１５７】例２：HSAに基づくプロモーターのイン・
ビボでの評価 HSAに基づくキメラプロモーターの強度 マウスの前頸骨筋(TA)、四頭筋(Q)および手根骨伸筋(E
C)へのpHSA含有ベクターを筋肉内投与することによっ
て、３種類の筋肉で同様なレポーター遺伝子発現を生
じ、１．３×１０５RLU/mgであり、RSV発現の５%に相当
した（図３）。ENOエンハンサーが存在すると、TA筋で
のプロモーター活性が若干増加した。一方、CK/pHSA構
築物では、総ての筋肉で２〜６倍強いルシフェラーゼ発
現が得られ、活性はRSV発現の２８%まで到達した。
【０１５８】HSAに基づくキメラプロモーターの特異性 pHSAによって進められるイン・ビボでの発現の厳密な筋
特異性を立証するため、pHSAに基づくベクター２×１０
８iuを筋肉ないと紆余した後、マウスの肝臓、脾臓、心
臓および肺を採取した。レポーター遺伝子発現は見られ
なかったが総ての臓器は、アデノウイルスＤＮＡのＰＣ
Ｒ検出によって示されるように正確に感染した。反対
に、ＣＭＶ含有ベクターでは、総ての臓器で有意なレポ
ーター発現が生じ、例えば、肝臓では３．８×１０７RL
U/mgに達した。これは、ＣＭＶプロモーターとは異な
り、pHSAに基づくキメラ調節配列は筋肉内藤与野の地に
標的組織にトランスジーン発現を制限するが、アデノウ
イルスベクターは全身に広がることを示唆している。
【０１５９】次に、大量用量のベクターを静脈内投与
し、アデノウイルスが全身に広がった後に見られる最大
非特異的発現を評価した。２×１０９iuで、総ての臓器
が感染した。特異的ＰＣＲによるアデノウイルスＤＮＡ
の検出は、未飽和条件（３０回の増幅サイクル）下で行
い、臓器での感染グラディエントを示すことができるよ
うにした。肝臓は最大感染の臓器であり、次いで脾臓お
よび肺であり、最後に心臓であった。肝臓では、pHSA単
独によって進められる発現のバックグラウンドはＣＭＶ
発現の０．０２%にすぎなかった。更に、pHSA特異性
は、エンハンサーの使用によって有意に向上した。実際
に、肝臓では、ENO/pHSAおよびCK/pHSAはpHSA単独より
も弱いそれぞれ８および２０分の１の発現を生じた。同
様の結果は脾臓および肺で見られたが、心臓では、発現
の有意な現象は見られなかった（CK/pHSA構築物は、心
臓では３倍高いプロモーター活性を生じた）。
【０１６０】これらの結果により、遺伝子治療による末
梢虚血の治療を目的とする細胞性調節配列に基づくキメ
ラプロモーターの重要性が確かめられた。実際に、これ
らはアデノウイルスに関連して強力且つ組織特異的発現
が可能であり、これにより遺伝子導入の効力および安全
性が保証される。
【０１６１】例３：治療遺伝子の発現 塩基性プラスミドpTG11236 (Meyer et al., 2000, Gene
Ther., 7, 1606-1611)は、完全なIE1 CMVプロモーター
の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するpREP4に基
づくプラスミドである。ルシフェラーゼ発現カセット
は、ルシフェラーゼコード領域の上流に位置したハイブ
リッド16S/19S SV40イントロン(Okayma and Berg, 198
3, Mol. Cell. Biol. 3, 280-289)および下流に位置し
たSV40ポリAも含んでいる。CKプロモーターによって増
強されたpHSAプロモーターをpTG15680（例１）からSacI
-BamHI断片として単離し、IE1 CMVプロモーターの代わ
りにクローニングした。ネズミジストロフィン遺伝子を
従来技術のプラスミドから単離し（Koenig et al., 198
7, Cell 50, 509-517; Hoffman et al., 1987, Science
238, 347-350; Lee et al., 1991, Nature 349, 34-36;
Bies et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 1725-17
31; Clements et al., 1995, Human Gene Ther.6, 1477
-1485; Genbank受託番号M68859）、ルシフェラーゼ遺伝
子の代わりに生成するプラスミドでクローニングし、pT
G15810を得た。例えば、pTG15810は、cer配列に続いて
カナマイシン耐性遺伝子、Co1E1複製起点、非コードエ
キソンと共にネズミジストロフィン遺伝子の発現を進め
るpHSAプロモーターに融合したCKエンハンサー、および
ジストロフィンコード領域の上流に位置したハイブリッ
ド16S/19S SV40イントロンおよび下流に位置したSV40ポ
リAを含んでいる。
【０１６２】pTG15810構築物から産生したジストロフィ
ンの発現を、C2C12細胞系(ATCC CRL1772)で検討した。C
2C12細胞系は、ジストロフィンタンパク質を欠いてい
る。これはC3Hマウス筋芽細胞から誘導され、細胞が集
密に到達した後に筋管に分化する。
【０１６３】トランスフェクションの約２４時間前、５
×１０４個のC2C12細胞を３５cmのペトリ皿に接種し、
１０%ウシ胎児血清およびグルタミン２mMを補足したDul
becco改良Eagle培地（ＤＭＥＭ、３g/lグルコース）で
増殖した。培地をトランスフェクションの３時間前に代
え、リン酸カルシウム共沈をＴＥ−ＣａＣｌ２緩衝液
（Tris-HCl １mM，ｐＨ７．５，ＥＤＴＡ０．０５mM，
ＣａＣｌ２２５０mM）１００μlで希釈したプラスミドp
TG15810１０または２５μgを用いて行い、HBS 2X緩衝液
（ＮａＣｌ ２８０mM，Hepes５０mM，Ｎａ２ＨＰＯ４
１．５M）１容量で沈澱した。１６時間のインキュベー
ションの後、トランスフェクションした細胞をDulbecco
のリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、培養物をＤＭＥＭ培
地に４８時間または９日間保持した。プラスミド１０μ
gでトランスフェクションした細胞培養物をトランスフ
ェクションの４８時間後にDulbeccoのリン酸緩衝食塩水
で洗浄した後、−２０℃でメタノール／アセトン１：１
で１０分間固定した。プラスミド２５μgでトランスフ
ェクションした細胞をＤＭＥＭ中で９日間培養して、筋
管を形成した後、同じ技術的プロトコールに従ってメタ
ノール／アセトン１：１で固定した。ペトリ皿を、使用
まで−２０℃で保管した。ジストロフィンタンパク質の
検出は、再水和した細胞培養物についてジストロフィン
特異的モノクローナル抗体（MANDRA1; Sigma）を用いて
免疫蛍光染色の後、抗マウスIgG抗体(Dako)およびフル
オレセインを標識した抗ウサギIgG 抗体(Sanofi Diagno
stic Pasteur)を添加することによって行った。
【０１６４】フルオレセインは、筋芽細胞C2C12細胞
（培養４８時間）並びに筋管（培養９日間）で検出さ
れ、CKエンハンサーおよびHSAプロモーター領域によっ
て制御するときには分化工程中ジストロフィン発現が持
続することを示している。
【０１６５】ジストロフィン発現を、C2C12細胞でpTG15
810のリン酸カルシウムトランスフェクションの後ウェ
スタンブロット法によっても評価した。このために、５
×１０４個のC2C12細胞を３５cmのペトリ皿に接種し、
上記のようにして増殖した。約４８時間後、細胞をリン
酸カルシウム共沈法（上記参照）を用いてプラスミドpT
G15810５または２５μgでトランスフェクションした。
１６時間インキュベーションした後、トランスフェクシ
ョンした細胞をＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、培養物をこ
の場位置中に２４時間または８〜９日間保持した。細胞
をＰＢＳで２回洗浄し、それぞれの時点に抽出緩衝液
（７５ml Tris，２０％グリセロール，１５％ＳＤＳ，
１００mMＤＴＴ，１ｘアンチプロテアーゼComplete (Ro
che)，ｐＨ６．８）で直接リーシスにより採取した。細
胞抽出物を、NCL-DYS2抗体(Novocasta)を用いるウェス
タンブロット法によってジストロフィンの存在について
分析した。ジストロフィン産生は筋芽細胞C2C12細胞
（トランスフェクションの２４時間後）では弱かった
が、筋管（８〜９日間培養）では明らかに検出され、CK
エンハンサーおよびHSAプロモーター領域によって制御
されるときにはジストロフィンの発現が持続することが
確かめられた。
【０１６６】プラスミド導入効率も、免疫コンピテント
なジストロフィン欠落mdx5cvマウス（C57BL/6Ros-DMD
mdx-5cv株）で、炎症が最大になる条件下、すなわちノ
テキシン(notexin)前処理および反復投与下で、ジスト
ロフィン発現プラスミドpTG15810を筋肉内投与した後、
イン・ビボで評価した。実験は、最初のプラスミド投与
の３日前にノテキシン(Sigma)３ngを筋肉内投与された
６〜８週齢の動物について行った。次に、８匹のmdx5cv
マウスの右および左脛骨にpTG15810プラスミド２５μg
を食塩水２５μlで希釈したものを経皮的に筋肉内に１
回投与した。次に、処理したマウスの半数に、最初の投
与から３週間後にpTG15810プラスミドの同量を再投与し
た。マウスを、最初の投与から７日後（１回投与マウ
ス）または４６日後（２回投与マウス）に屠殺した。筋
肉を採取し、OCT化合物（Labonord, Templemars, フラ
ンス）に埋設し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で
冷凍し、−８０℃で保管した。免疫組織化学染色は、筋
肉の全体をカバーするように２５０μm毎に採取した５
μmの切片について行った。総てのインキュベーション
を室温で行い、次いでPBSで５分間３回洗浄した。切片
をメタノール／アセトン（v/v）中で１０分間固定し、P
BS中０．５％BSAで３０分間ブロックした。次に、それ
らを１：２５０に希釈した抗ジストロフィンモノクロー
ナル抗体(MANDRA1, Sigma)と共に１．５時間、１：５０
０に希釈したヤギ抗マウス免疫グロブリンG F(ab)2断片
ビオチンと共に３０分間(Immunotech)、および１：２０
００に希釈したストレプトアビジンFITCと共に３０分間
(Caltag Laboratories)、総てPBS中でインキュベーショ
ンした。次に、スライドをアンチファッディング培地(a
nti-fadding medium) Mowiol (Calbiochem/Novabioche
m)に設置し、エピ蛍光顕微鏡(Eclipse 800, Nikon)下で
観察した。それぞれの筋肉について、ポジティブな繊維
の最大数を考察した。
【０１６７】結果として、pTG15810プラスミドを投与し
たマウスにおいて、７日後と比較して４６日後に同数の
ジストロフィンポジティブな骨格筋繊維が見られた。こ
れらの結果から、本発明の転写要素が筋ジストロフィー
mdx5cvマウスにおけるジストロフィンの発現を進める能
力が確かめられる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE S.A. <120> Chimeric promoters for controlling expression in muscle cells. <130> promoter HSA and ENO or CK enhancer <140> <141> <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 671 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 attggaagtc agcagtcagg caccttcccg agcgcccagg gcgctcagag tggacatggt 60 tggggaggcc tttgggacag gtgcggttcc cggagcgcag gcgcacacat gcacccaccg 120 gcgaacgcgg tgaccctcgc cccaccccat cccctccggc gggcaactgg gtcgggtcag 180 gaggggcaaa cccgctaggg agacactcca tatacggccc ggcccgcgtt acctgggacc 240 gggccaaccc gctccttctt tggtcaacgc aggggacccg ggcgggggcc caggccgcga 300 accggccgag ggagggggct ctagtgccca acacccaaat atggctcgag aagggcagcg 360 acattcctgc ggggtggcgc ggagggaatc gcccgcgggc tatataaaac ctgagcagag 420 ggacaagcgg ccaccgcagc ggacagcgcc aagtgaagcc tcgcttcccc tccgcggcga 480 ccagggcccg agccgagagt agcagttgta gctacccgcc caggtagggc aggagttggg 540 aggggacagg gggacagggc actaccgagg ggaacctgaa ggactccggg gcagaaccca 600 gtcggttcac ctggtcagcc ccaggcctcg ccctgagcgc tgtgcctcgt ctccggagcc 660 acacgcgctt t 671 <210> 2 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggccacccag ggccccgtgg ctgcccttgt aaggaggcga ggcccgagga cacccgagac 60 gcccggttat aattaaccag gacacgtggc gaacccccct ccaacacctg cccccgaacc 120 cccccatacc cagcgcctcg ggtctcggcc tttgcggcag aggagacagc aaagcgccct 180 ctaaaaataa ctcctttccc ggcgaccgag 210 <210> 3 <211> 134 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gattcttagg atgggagggt ggaataagag ctgttctgag tgggggaggg ggctgcgcct 60 gcctctttgg tctgtgacct ttttgtaggg tatttttagc tccagcacct gccttcttgg 120 agtggggaag aatc 134 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for cloning pHSA promoter <400> 4 aaacgcgtcg acattggaag tcagcagtca ggc 33 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for cloning pHSA promoter <400> 5 ttcgacgtcg acaaagcgcg tgtggctccg ga 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for cloning beta enolase enhancer <400> 6 aaacgcgtcg acgattctta ggatgggagg gtg 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for cloning beta enolase enhancer <400> 7 ttcgacgtcg acgattcttc cccactccaa gaa 33 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for PCr detection of adenoviral DNA <400> 8 ttccgcgttc cgggtcaa 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for PCR detection of recombinant adenoviral DNA <400> 9 tccagcggtt ccatcctcta 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: specificprimer for detection of mouse skeletal alpha actin mRNA <400> 10 ccaactggga cgacatggag a 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: specific prime for detection of r mouse skeletal alpha actin mRNA <400> 11 atgctgttgt aggtggtctc at 22 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:specific primer for detection of mouse GAPDH mRNA <400> 12 ccatggagaa ggctgggg 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: specific primer for detection of mouse GAPDH mRNA <400> 13 caaagttgtc atggatgacc 20
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】エンハンサーの非存在下でまたはβ−エノラ
ーゼ(ENO)エンハンサーまたはクレアチンキナーゼ(CK)
エンハンサーによって増強されたヒト骨格α−アクチン
プロモーターの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発
現するベクターpTG15331 (1a)、pTG15442 (1b)およびpT
G15680 (1c)の略図。
【図１ｂ】エンハンサーの非存在下でまたはβ−エノラ
ーゼ(ENO)エンハンサーまたはクレアチンキナーゼ(CK)
エンハンサーによって増強されたヒト骨格α−アクチン
プロモーターの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発
現するベクターpTG15331 (1a)、pTG15442 (1b)およびpT
G15680 (1c)の略図。
【図１ｃ】エンハンサーの非存在下でまたはβ−エノラ
ーゼ(ENO)エンハンサーまたはクレアチンキナーゼ(CK)
エンハンサーによって増強されたヒト骨格α−アクチン
プロモーターの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発
現するベクターpTG15331 (1a)、pTG15442 (1b)およびpT
G15680 (1c)の略図。
【図２】筋細胞と筋以外の細胞での骨格α−アクチンプ
ロモーター(pHSA)含有ベクターによるプロモーター活性
の測定値。pHSAプロモーターは、単独で（pHSA; 黒
棒）、またはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー（CK
/pHSA; 白棒）またはヒトβ−エノラーゼエンハンサー
（ENO/pHSA; 灰（斜線）色棒）と組合せて用いた。HSKM
CおよびC2C12筋芽細胞および筋管、A549およびHUVECを
様々なベクターに感染させ、ルシフェラーゼ活性を３日
目に測定した。結果は、タンパク質１mg当たりのルシフ
ェラーゼ活性（RLU/mg）として示される。
【図３】pHSAに基づくベクターを用いる筋特異的プロモ
ーター活性のイン・ビボ評価。マウスの前頸骨筋、四頭
筋、または手根骨伸筋に、様々なアデノウイルス２×１
０８iuを投与した。ルシフェラーゼ発現は、pHSAプロモ
ーター単独で（pHSA; 黒棒）、またはヒトクレアチンキ
ナーゼエンハンサー（CK/pHSA; 白棒）またはヒトβ−
エノラーゼエンハンサー（ENO/pHSA; 灰（斜線）色棒）
と組合せて用いた。動物は３日目に屠殺し、ルシフェラ
ーゼ活性を筋肉において測定した。結果は、タンパク質
１mg当たりのルシフェラーゼ活性（RLU/mg）として示さ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 7/00 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ａ Ｂ (72)発明者 セバッチャン、リボー フランス国プラン、ド、キュク、アブニ ュ、デュ、ジェネラル、ド、ゴール、レジ ダンス、シャントコート (72)発明者 バレリ、カランダ フランス国ストラスブール、リュ、デ、バ イ、６ (72)発明者 メラニ、フローリ フランス国ストラスブール、リュ、デ、ロ ーズ、24 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 DA20 EA02 FA02 GA11 HA08 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA95X AB01 BA01 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA362 ZA452 ZB212 4C087 AA02 BB65 BC83 NA14 ZA36 ZA45

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１種類の下記(ii)と操作可能に
    結合した少なくとも１種類の下記(i)を含んでなる、宿
    主細胞または生物において目的の遺伝子を発現させるた
    めのキメラ構築物： （ｉ）骨格α−アクチン遺伝子プロモーター、（ii）ヒ
    ト遺伝子の骨格筋特異的エンハンサー。
  2. 【請求項２】骨格α−アクチン遺伝子プロモーターがヒ
    トから得られる、請求項１に記載のキメラ構築物。
  3. 【請求項３】ヒト骨格α−アクチン遺伝子プロモーター
    が、配列番号１の１〜４３２位に示されるヌクレオチド
    配列またはその一部を含んでなる、請求項２に記載のキ
    メラ構築物。
  4. 【請求項４】骨格筋特異的エンハンサーが、ヒトクレア
    チンキナーゼ遺伝子、ヒトβ−エノラーゼ(ENO-3)遺伝
    子、ヒトミオゲニン遺伝子、およびヒトトロポニン遺伝
    子から得られたエンハンサーからなる群から選択され
    る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ構築
    物。
  5. 【請求項５】骨格筋特異的エンハンサーがヒトクレアチ
    ンキナーゼ遺伝子から得られ、配列番号２に示される配
    列またはその一部を含んでなる、請求項４に記載のキメ
    ラ構築物。
  6. 【請求項６】骨格筋特異的エンハンサーがヒトβ−エノ
    ラーゼ(ENO-3)遺伝子から得られ、配列番号３に示され
    る配列またはその一部を含んでなる、請求項４に記載の
    キメラ構築物。
  7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメ
    ラ構築物の制御下に置かれた目的の遺伝子を含んでな
    り、宿主細胞または生物でそれを発現することができ
    る、発現カセット。
  8. 【請求項８】前記目的遺伝子が、１種類以上のプロアン
    ギオゲニン(proangiogenic)ポリペプチドであって、好
    ましくはヒト起源のものをコードする、請求項７に記載
    の発現カセット。
  9. 【請求項９】前記目的遺伝子が、治療遺伝子発現を制御
    するリガンドによって調節されるプロモーターを活性化
    することができるリガンドをコードする、請求項７また
    は８に記載の発現カセット。
  10. 【請求項１０】請求項１〜６のいずれか一項に記載のキ
    メラ構築物、または請求項７〜９のいずれか一項に記載
    の発現カセットを含んでなる、ベクター。
  11. 【請求項１１】ヘルペスウイルス、サイトメガロウイル
    ス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森
    林ウイルス、AAV（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウ
    イルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスからな
    る群より選択されるウイルス由来のウイルスベクターで
    ある、請求項１０に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】ウイルスベクターが複製欠損アデノウイ
    ルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 【請求項１３】宿主細胞または生物中で目的の遺伝子を
    筋特異的に発現させるウイルス粒子の調製方法であっ
    て、 a) 請求項１１または１２に記載のウイルスベクターを
    許容細胞系に導入し、 b) 工程a)で得た許容細胞系を適当な期間適当な条件下
    で培養して、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子
    を産生させ、 c) 前記ウイルス粒子を細胞培養から回収し、 d) 必要に応じて、回収したウイルス粒子を精製する 工程を含んでなる、方法。
  14. 【請求項１４】請求項１１または１２に記載のベクター
    を含んでなる、または請求項１３に記載の方法によって
    得ることができる、ウイルス粒子。
  15. 【請求項１５】請求項１〜６のいずれか一項に記載のキ
    メラ構築物、請求項７〜９のいずれか一項に記載の発現
    カセット、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のベ
    クターを含んでなる、または、請求項１４に記載のウイ
    ルス粒子に感染した、真核宿主細胞。
  16. 【請求項１６】骨格筋細胞である、請求項１５に記載の
    真核宿主細胞。
  17. 【請求項１７】請求項１〜６のいずれか一項に記載のキ
    メラ構築物、請求項７〜９のいずれか一項に記載の発現
    カセット、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のベ
    クター、請求項１４に記載のウイルス粒子、または請求
    項１５または１６に記載の真核宿主細胞と、必要に応じ
    て、薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでなる、医薬
    組成物。
  18. 【請求項１８】遺伝子治療によるヒトまたは動物体の疾
    病の治療または予防用の薬剤を調製するための、請求項
    １〜６のいずれか一項に記載のキメラ構築物、請求項７
    〜９のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１０
    〜１２のいずれか一項に記載のベクター、請求項１４に
    記載のウイルス粒子、または請求項１５または１６に記
    載の真核宿主細胞の使用。
  19. 【請求項１９】循環器疾患、特に末梢虚血の治療または
    予防用の薬剤を調製するための、請求項１８に記載の使
    用。
  20. 【請求項２０】請求項７〜９のいずれか一項に記載の発
    現カセット、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の
    ベクター、請求項１４に記載のウイルス粒子、または請
    求項１５または１６に記載の真核宿主細胞の治療上有効
    量をヒトまたは動物体に投与することを含んでなる、ヒ
    トまたは動物体の治療方法。
  21. 【請求項２１】骨格筋細胞において目的の遺伝子を特異
    的に発現するための、請求項１〜６のいずれか一項に記
    載のキメラ構築物、請求項７〜９のいずれか一項に記載
    の発現カセット、請求項１０〜１２のいずれか一項に記
    載のベクター、または請求項１４に記載のウイルス粒子
    の使用。
  22. 【請求項２２】少なくとも１種類の(i)骨格α−アクチ
    ン遺伝子プロモーターと少なくとも１種の(ii)筋特異的
    エンハンサーとの制御下に置かれた目的の遺伝子を含ん
    でなる、発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子の
    使用であって、遺伝子治療によるヒトまたは動物体の循
    環器疾患の治療または予防用の薬剤の調製のための、使
    用。
  23. 【請求項２３】骨格α−アクチン遺伝子プロモーターが
    請求項２または３に記載の特徴を有し、筋特異的エンハ
    ンサーが請求項４〜６のいずれか一項に記載の特徴を有
    し、目的遺伝子が請求項８または９に記載の特徴を有
    し、および／またはベクターが請求項１１または１２に
    記載の特徴を有する、請求項２２に記載の使用。
  24. 【請求項２４】循環器疾患が末梢虚血である、請求項２
    ３に記載の使用。
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