JP2005518807A - 筋細胞中の目的とする遺伝子の発現の持続のための発現カセット - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または指定した位置内の上記配列番号１に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である配列を有する部分を含んでなる核酸断片を用いて、この核酸断片に操作可能に連結した目的とする１以上の遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性を向上させることに関する。本発明は、１以上の目的とする遺伝子を発現させる発現カセットであって、この発現が１以上の制御配列と上記で定義した通りの核酸断片によって制御されるものにも関する。本発明は、上記発現カセットを含むベクター、および上記発現カセットまたはベクターを含む真核生物宿主細胞、並びに治療または予防目的で上記発現カセット、ベクターまたは真核生物宿主細胞を含んでなる組成物も提供する。本発明は、特に筋肉を冒す疾患の治療または予防のためのトランスジェニック動物モデルおよび体細胞遺伝子療法の構築など多くの用途に有用である。

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性であるか、または指定した位置内の上記配列番号１に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、配列を有する部分を含んでなる核酸断片を用いて、この核酸断片に操作可能に連結した目的とする１以上の遺伝子を発現する細胞の持続性を向上させることに関する。本発明はまた、１以上の目的とする遺伝子を発現させる発現カセットであって、この発現が１以上の制御配列と、上記で定義した通りの核酸断片によって制御されるものにも関する。本発明は、上記発現カセットを含むベクター、および上記発現カセットまたはベクターを含む真核生物宿主細胞、並びに治療または予防目的で上記発現カセット、ベクターまたは真核生物宿主細胞を含んでなる組成物も提供する。最後に、本発明は、ヒトまたは動物体の疾患の遺伝子療法による治療または予防用の薬剤の調製の目的での上記発現カセット、ベクターまたは真核生物宿主細胞の使用にも関する。本発明は、特に筋肉を冒す疾患の治療または予防のためのトランスジェニック動物モデルおよび体細胞遺伝子療法の構築など多くの用途に有用である。

背景技術
遺伝子療法は、細胞または生体への遺伝子材料の導入と定義することができる。遺伝子療法は、当初は機能的に活性な治療遺伝子を罹患細胞に送達することによって遺伝病を修正するための特定遺伝子の代替治療として考えられた。ヒトに応用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に罹っている患者について１９９０年９月に米国で開始された。この最初の励みになる実験に続いて多数の新たな応用が行われてきており、有望な臨床試験が現在進行中である（例えば、http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtmlまたはhttp://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/、およびMountain et al., 2000, Tibtech 18, 119-128を参照されたい）。過去２年間に、それらの多くについて有益な治療効果が報告されてきている（Isner and Asahara, 1999, J. Clin. Invest. 103, 1231-1236; Kay et al., 2000, Nature Genetics 24, 257-261; Cavazzana-Calvo et al., 2000, Science 288, 669-672; Khuri et al., 2000 Nature Medicine 6, 879-885）。

遺伝子療法の成功は、主として治療遺伝子の生体の細胞への効率的送達と遺伝情報の発現に依存している。機能的遺伝子は様々な手法によって細胞に導入して、上記遺伝子を宿主ゲノム中に組込むことによる宿主細胞の一過性発現または恒久的形質転換を生じることができる。遺伝子療法プロトコールの大半はウイルスまたは合成（非ウイルス性）ベクターを用いているが、裸の核酸（すなわち、プラスミドＤＮＡ）を用いて、目的とする遺伝子をターゲット細胞へ運ぶこともできる（Wolff et al., 1990, Science 247, 1465-1468）。

ウイルスは、リソソーム分解を免れるため細胞膜を通って輸送を行う様々な極めて精巧な機構を発達させ、それらのゲノムを核に送達してきたので、多くの遺伝子送達用途におけるベクターとして用いられてきている。レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびアデノウイルスが広く用いられてきたが（総説については、Crystal, 1995, Science 270, 404-410; Kovesdi et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol 8, 583-589; Miller, 1997, Human Gene Ther. 8, 803-815を参照されたい）、ポックスウイルス由来のベクターのような他のウイルスベクターがイン・ビボでの遺伝子導入用の有望な候補として現れてきている。合成ベクターは、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）とベクターの取り込みを促進する脂質（ＤＮＡ−リポプレックスまたはリポソーム）のような１種類以上のトランスフェクション促進剤との特殊な組合せを表す。様々な脂質およびポリマーを基剤とするベクターが、現在利用可能である（例えば、Rolland, 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143-198; Wagner et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414およびGottschalk et al., 1996, Gene Ther. 3, 448-457をさんしょうされたい）。合成ベクターはウイルスベクターより効率的でないが、大規模生産、安全性、低免疫原性およびクローニング能に関して潜在的に有利である（Ledley, 1995, Human Gene Ther. 6, 1129-1144）。

プラスミドＤＮＡの直接的筋肉内投与は、循環器疾患（例えば、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、虚血）および骨格筋を冒す疾患（例えば、筋ジストロフィー、硬化症）のような罹病率および死亡率の大きな比を説明する筋肉関連疾患の遺伝子療法を行うための効果的方法であると思われる。更に、筋肉を、血流に分泌される遺伝子産物を伴う疾患のイン・ビボ発現系として用いることができる（Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1401-1405）。この技術の興味深い用途は、特に様々な病原体（すなわち、最近、ウイルス、寄生生物、およびマイコプラスマ生物）に対する体液性応答を誘発するためのＤＮＡワクチン接種である（Barry et al., 1995, Nature 377, 632-635; Davis et al., 1996, Vaccine 14, 910-915）。

遺伝子発現プラスミドを骨格筋に投与した後、齧歯類および霊長類における遺伝子産物の長期発現および持続性が報告されてきたが、この観察は特定の異種タンパク質が投与された宿主に対して余り免疫原性ではなかったという事実に関係していると思われる（Wolff et al., 1992, Hum.Mol. Genet. 1, 363-369）。しかしながら、多くの場合に、骨格筋繊維における異種遺伝子産物の持続性は、宿主免疫応答（細胞性、体液性および／または固有）の発生によって制限することができる（Davis et al., 1997, Gene Ther. 4, 181-188）。β−ガラクトシダーゼ−特異的ＣＴＬ応答の存在はβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを投与した動物でWells et al. (1997, FEBS letter 407, 164-168)によって実際に観察され、酵素レベルの減少および遺伝子発現繊維の破壊と一致した。隣接する非トランスフェクション筋繊維では同様な破壊の証拠はなかった。更に、Ferrer et al. (2000, Gene Ther. 7, 1439-1446)は、発現プラスミドの筋肉内投与の後にジストロフィン産生繊維の破壊を報告した。ジストロフィン陽性繊維の附近にＣＤ８＋Ｔ細胞が存在することは、細胞傷害性ＣＤ８＋細胞を介する細胞性免疫応答を示唆している。免疫欠損（SCID）マウスで見られる遺伝子発現繊維が保存されることは、免疫適格（immunocompetent）マウスでのジストロフィンレベルの降下がジストロフィンタンパク質の遺伝子発現の損失または細胞傷害性効果よりは免疫応答の進化によることを支持している。

筋肉へのＤＮＡ投与後の免疫応答の誘導の基礎をなす機構は、部分的にしか理解されていない。筋肉に含まれる樹状細胞またはマクロファージは、プラスミドＤＮＡで直接トランスフェクションされおよび／または筋肉によって放出される抗原を捕捉すると思われる。プラスミドＤＮＡの筋肉内投与後には、活性化マーカーおよびＴ細胞補助的刺激リガンドを示すトランスフェクションしたマクロファージまたは樹状細胞はマウスの末梢区画並びにリンパ節に含まれることが示された（Chattergon et al, 1998, J. Immunol. 160, 5707-5718）。ウイルスベクターの場合には、樹状細胞の形質導入は異種抗原を産生する筋細胞に対する細胞性免疫応答の効率的誘導に重要であることも示された（Jooss et al., 1998, J. Virol. 72, 4212-4223）。専門的な抗原生成細胞が直接トランスフェクションされないときには、損傷を受けたまたは漏れやすいトランスフェクションした繊維から放出される異種遺伝子産物を受け取り、「クロス−プライミング経路（cross-priming pathway）」を通ってＭＨＣ Ｉにペプチドを提供することができる（Ulmer et al., 1996, Immunology 89, 59-67）。

望ましくない免疫応答の他に、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの投与後には、炎症も報告された（例えば、Kliman et al., 1997, J. Immunol. 158, 3635-3639）。

特異的な「前炎症要素」を除去することによるＤＮＡ配列の修飾が考えられてきたが、この方法は多数の変更を必要とすることがあり且ついくつかが遺伝子発現を妨げるので達成が困難である。更に、この方法は、現在までに余り改良が加えられなかった（Yew et al., 2000, Mol. Ther. 1, 255-262）。

本発明は、天然ではデスミン（desmin）遺伝子の発現を制御し且つ上記デスミン遺伝子のプロモーターとエンハンサーの上流の５’−フランキング領域に存在する核酸断片が、宿主細胞または生物中で目的とする遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性の向上を促進することを開示する。このような改良は、遺伝子産物または発現細胞に対する宿主の免疫応答、特に細胞性免疫応答の減少によるものと思われる。

デスミンは、中間径フィラメントタンパク質類の筋肉に特異的なタンパク質であり、筋芽細胞や衛星細胞および高レベルの分化した筋管におけるような筋発生の初期段階で産生される（Li et al., 1993, Development 117, 947-959）。これは、単一遺伝子によってコードされる（Li et al., 1989, Gene 78, 243-254）。ヒト（Li and Paulin, 1991, J. Biol. Chem. 266, 6562-6570）およびマウス（Li and Capetanaki, 1993, Nucleic Acids Res. 21, 335-343）デスミン遺伝子の近位上流領域の機能分析により、これらの遺伝子の筋肉特異的発現に少なくとも部分的に関与していると思われる共通エンハンサー要素（ヒト遺伝子では−６９３〜−９７３およびマウスでは−５７８〜−９７６）が明らかになった。このエンハンサー領域は、筋形成転写因子（ＭＥＦ−２およびＥボックス）によって認識される「筋肉特異的」シス作用配列並びに遍在性転写因子（Mt, SP1およびKrox-20の潜在的結合部位を有するＧＣリッチな領域）に結合するシス作用配列の組合せを含む（Li and Paulin, 1991, J. Biol. Chem. 266, 6562-6570; Li et al., 1993, Development 117, 947-959; Li and Capetanaki, 1993, Nucleic Acids Res. 21, 335-343; Li and Capetanaki, 1994, EMBO J. 13, 3580-3589）。プロモーター／エンハンサー要素を包含する近位の１ｋｂ上流デスミンを用いて、トランスジェニックマウスでのレポーター遺伝子を運搬してきた。これらの結果は、ヒトデスミンプロモーター／エンハンサーが胚で筋節および骨格筋発現を生じることしかできないことを示している（Li et al., 1993, Development 117, 947-959）。更に、トランスジーン発現は、出産から１５日後には骨格筋でも完全に抑制される（Lescaudron et al., 1993, Neuromusc. Disord. 3, 419-422）。

追加の調節要素も、デスミンプロモーター／エンハンサー領域の上流に同定された。欧州特許第９９９ ２７８号明細書には、特に動脈平滑筋細胞で遺伝子発現を制御するシス作用配列がマウスデスミン遺伝子の転写開始部位に対して−４０００〜−２５００位に存在することが開示されている。一方、Raguz et al.は、ヒトデスミン座に及ぶ２４０ｋｂのゲノムクローン（それぞれ、２２０および１０ｋｂの上流および下流配列を有する全デスミン遺伝子）を有するトランスジェニックマウスを発生させた（1998, Developmental Biology 201, 26-42）。再生可能な生理学的レベルのヒトデスミン遺伝子が、成熟動物の３種類の筋肉（骨格筋、心筋および平滑筋）総てで観察された。しかしながら、マウス胚では、「２４０ｋｂトランスジーン」由来のヒトデスミン遺伝子発現は、特に心筋および平滑筋組織中では内因性の（ネズミ）遺伝子と比較して著しく遅延している。ヒトおよびマウスデスミン遺伝子の発現時期の変動は、おそらくこれら２種類の遺伝子の調節要素における差により、ネズミ遺伝子が発生のずっと初期段階で活性化することができることによると思われる。しかしながら、Raguz et al.は、成熟したトランスジェニックマウスで筋特異的発現を生じると思われるヒトデスミン遺伝子の２２０ｋｂの５’フランキング領域中の遺伝子要素を同定しなかった。

要するに、これらの研究は、当該技術分野では、遺伝子産物および／またはトランスフェクション細胞に対する有害な免疫応答の誘発を会費または最小限にしながら、遺伝子の有意な持続発現を行うのに重要なＤＮＡ要素を同定する必要が未だにあることを明らかにしている。

この技術的問題は、特許請求の範囲で定義した通りの態様を提供することによって解決される。

発明の概要

従って、本発明は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、配列を有する部分を含んでなる核酸断片の使用であって、前記核酸断片に結合した目的とする１以上の遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性を向上させるための使用を提供する。

発明の具体的説明

本発明に関して、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を定義する。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のような修飾したヌクレオチドを含んでなることもできる（修飾の例としては、米国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第４，７１１，９５５号明細書、または欧州特許出願第３０２ １７５号明細書を参照されたい）。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾はポリマーの組立の前後に行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオシド要素によって中断させることもできる。ポリヌクレオチドは、重合の後に標識成分による接合などによって更に修飾することもできる。

「断片」という用語は、配列番号１に示された配列から、または特定の配列を含んでなる存在している核酸供給源（例えば、デスミン遺伝子の上流の天然に存在するＤＮＡ、特に上記デスミン遺伝子の転写開始部位に対して約−５０ｋｂ〜約−ｌｋｂの位置に存在するゲノムＤＮＡ）から、またはその断片から、またはそれらの相同配列から得ることができる制限エンドヌクレアーゼによって生成したおよびＰＣＲによって生成した核酸分子を包含するものと解釈される。本発明は、合成断片（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生成したもの）も包含する。

核酸断片は、線状または環状の一本鎖または二本鎖であることができる。一本鎖断片は、指定したヌクレオチド（ｎｔ）位置中の配列番号１に示された配列またはその少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分、またはそれらに相同性である配列と同一の配列を有する「＋」鎖であることができる。あるいは、一本鎖断片は、指定したｎｔ位置中の配列番号１に示された配列またはその少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分、またはそれらに相同性である配列と相補的な配列を有する「−」鎖であることができる。二本鎖断片は、相補的対の鎖（例えば、１本の＋鎖と１本の−鎖）を含む。当然のことながら、本発明で用いられるＲＮＡ断片は、指定したｎｔ位置中の配列番号１に示された鋳型鎖のデオキシチミジル酸残基（Ｔ）の代わりにウリジル酸（Ｕ）残基を含むか、または鋳型配列に相補的である場合には、それらは指定したｎｔ位置中の配列番号１に示された配列のアデニル酸（Ａ）残基に相補的な位置にＵ残基を含む。好ましくは、本発明で用いられる核酸断片は、二本鎖ＤＮＡ断片である。有利には、これは、指定したｎｔ位置中の配列番号１に示された配列と同一または相同性である配列を有する少なくとも５００個の連続したヌクレオチド塩基対（ｂｐ）、有利には少なくとも１０００ｂｐ、好ましくは少なくとも２０００ｂｐ、更に好ましくは少なくとも５０００ｂｐ、更に一層好ましくは少なくとも１００００ｂｐの部分も含む。

本明細書で用いられる「相同性」という用語は、配列番号１に示された配列の対応する部分に関して相同性の百分率が少なくとも７０％であり、好ましくは少なくとも８０％であり、更に好ましくは少なくとも９０％であり、更に一層好ましくは少なくとも９５％であることを表す。しかしながら、絶対的同一性（１００％相同）が好ましい。指定した配列またはその断片とほぼ（または本質的に）同一の配列を有する核酸も、本発明に包含される。

配列番号１に示された配列の対応する部分に関して本発明で用いられる核酸断片の配列の相同性を決定するため、両配列を整列させて、ギャップおよびインサートを用いて最大マッチを得るようにする。２個の配列は、下記のように類似が最大となるように整列するときに残基の配列が同じであるときには、「同一」であると言われる。比較のための配列の最適整列は、Smith and Watermanの局部的相同性アルゴリズム（1981, Adv. Appl. Math. 2, 482-489）、Needlemen and Wunschの相同整列法（1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453）、Pearson and Lippmanの類似法の探索（1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448）などによって行うことができる。上記アルゴリズムのコンピューターによる実施は、Genetics Computer Group (GCG) Wisconsin genetics Software Package （GAP, BESTFIT, BLASTA, FASTA, TFASTA and FASTDB,マジソン，ウィスコンシン）の一部として知られている。これらのプログラムは、好ましくは総てのパラメーターに対してデフォルト値を用いて行われる。整列した配列の最良の全体的マッチを決定するための好ましい方法は、Brutlag et al.のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる（1990, Comp. App. Biosci. 6, 237-245）。

配列相同性（または同一性）の割合は、比較ウインドウに関して２種類の最適整列した配列を比較することによって決定され、比較ウインドウの配列部分は、比較を行う２種類の最適整列の参照配列と比較した付加または欠失（ギャップ）を含んでなることがある。相同性の割合は、マッチした位置の数を得るための同一残基が両配列で存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較ウインドウの位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算される。例えば、２種類の配列の１０個の位置の８個が同一であれば、それらは８０％相同であるかまたは８０％の配列同一性を有する。次に、全同一性は、完全な疑惑配列を包含する総てのウインドウに関する平均同一性として決定される。

「約」という用語は、指定した位置に関して０〜１２個のヌクレオチドの変動を表す。例えば、指定位置が制限部位中に配置されるときには、５’または３’方向でのいくつかのヌクレオチドへの指定位置のシフトを生じる通常の分子生物学の手法（例えば、ヌクレアーゼ活性によって切断して過剰末端を与える）によってこのような制限部位を改変することができる。

核酸断片を本発明に関して用いて、目的とする遺伝子を発現する細胞の持続性を向上させ、更に具体的には目的とする遺伝子を発現するトランスフェクション細胞を調製する。核酸断片によって与えられるトランスフェクション細胞の持続性の改良は、日常的実験によって容易に決定することができる。特に、トランスフェクション細胞の持続性は、細胞内に産生し、宿主細胞の表面に固定しまたは細胞外に（例えば、体液中に）分泌することができる遺伝子産物の性状がどのようなものであっても、宿主細胞または生物における目的とする上記遺伝子の発現の持続性と相関する。このような改良は、目的とする遺伝子（例えば、細菌酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはＥＧＦＰをコードするレポーター遺伝子）の上流の上記核酸断片を適当な転写および／または翻訳制御配列（例えば、プロモーター、および場合によってはエンハンサー）の存在下でクローニングすることによって、生成する構築物を適当なベクター（例えば、プラスミドベクター）に導入することによって、および好ましくはイン・ビボで（トランスジェニック動物において、または動物モデルに直接投与することによって）宿主細胞で産生される遺伝子産物がどのくらいの長さであるかを評価することによって、評価することができる。このような遺伝子発現分析の例は、本明細書の実施例の部で提供されるが、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロット法、生物活性測定などのような当業者に周知の他の方法も本発明に関して用いることができる。トランスフェクション細胞の持続性の改良は、目的とする遺伝子の産物が同じ実験条件下で核酸断片を欠いている従来の構築物より長期間にわたって検出されるとき、特に遺伝子産物の産生が（レベルに関係なく）１ヶ月間より長期間安定に保持されるときに確立される。

好ましくは、目的とする遺伝子を発現するトランスフェクション細胞のこのような持続性は、目的とする上記（複数の）遺伝子の産物または目的とする上記（複数の）遺伝子を発現するトランスフェクション細胞に対する宿主免疫応答の誘導および／または発生を最小限にしまたは減少させることによって得られる。例えば、宿主の免疫応答の減少を、例えば、宿主の免疫応答の減少を、例えば、宿主生物での炎症状態の減少（これは、特に投与部位の近傍での細胞形態学の観察によって評価することができる）および／または発現組織における細胞浸潤の減少（特に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、すなわち免疫組織学による）および／または（ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）α、ＩＦＮ（インターフェロン）γ、ＩＬ（インターロイキン）−６およびＩＬ−１２のような）ベクター投与後のサイトカイン産生の減少と相関させることができる。

本明細書で用いられる「結合した」という用語は、核酸断片に発現細胞の持続性またはトランスフェクション細胞または生物における目的とする上記の（複数の）遺伝子産物の持続性についてその最適効果を発揮させる機能的並置を表す。この目的に対して、核酸断片は目的とする（複数の）遺伝子のいずれの側にもその配向（転写方向に関してゲノムまたは逆ゲノム配向）に関わりなく挿入することができる。好ましくは、核酸断片は、ゲノム配向での目的とする遺伝子の上流に配置される。更に、この機能的関係が保存される限り、核酸断片と目的とする遺伝子との間には追加の残基（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような１種類以上の制御配列）があることがある。

指定したｎｔ位置中の配列番号１に示された配列は、転写開始部位（位置＋１を表す）に対して約−１８６６２〜約−１７８４の位置の間のヒトデスミン遺伝子の上流領域に由来する。この特定の配列は、自然な文脈ではその遺伝子の発現を制御する調節要素を含むことができる。これに関して、本発明で用いられる核酸断片は、１以上のＤＮアーゼＩ高感受性部位を含んでなることができる。ＤＮアーゼＩ高感受性部位は、タンパク質の核酸への結合を反映している。これらのタンパク質は、転写因子であることができる。この態様によれば、４個の顕著な筋特異的ＤＮアーゼＩ高感受性部位は、ヒトデスミン遺伝子の転写開始部位に対してそれぞれ約−１５．１ｋｂ、−１３．８〜−１３．２ｋｂ、−１１．８ｋｂおよび−１０．２ｋｂの位置に同定されている。一層弱い５番目の部位が、約−１６．７ｋｂの位置に存在することができる。有利な態様によれば、本発明で用いられる核酸は、少なくとも１個の、有利には少なくとも２個の、好ましくは少なくとも３個の、更に一層好ましくはヒトデスミン遺伝子の−１５．１と−１０．２ｋｂの位置の間に配置された４個の主要なＤＮアーゼ高感受性部位を含む。

当然のことながら、本発明で用いられる核酸断片は、追加配列、好ましくは配列番号１の部分に対して５’または３’方向のいずれか、または５’および３’方向の両方に伸長するヒトデスミン遺伝子の配列を含むことができる。この態様によれば、本発明に関して用いられる核酸断片は、有利にはデスミン遺伝子の転写開始部位の上流の約−５０ｋｂまで、好ましくは約−４０ｋｂまで、更に好ましくは約−３０ｋｂまで、更に一層好ましくは約−２０ｋｂまで５’方向に伸長することができる。追加のデスミン配列は、デスミン遺伝子の転写開始部位に対して約−１．４ｋｂまで、または好ましくは約−１ｋｂまで（例えば、エンハンサー配列の５’末端に対応する約−９７４位まで）３’方向で伸長することができ、プロモーターまたはエンハンサー、または非コードエキソン配列またはそれらの任意の組合せを包含することもできる。

上記のように、本発明は、配列番号１に示された配列に相同性の核酸断片または少なくとも１００個の連続したヌクレオチドの部分の使用も包含する。この態様によれば、「相同」配列を有する核酸断片は、適当なレベルの配列相同性の領域内で配列番号１に示された配列の対応する部分と比較して１以上の変動を示す。本明細書で用いられる「変動」という用語は、１以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換を包含する。このような（複数の）変動は、組換え手法（例えば、位置指定突然変異誘発）によって得ることができる。あるいは、本発明で用いられる核酸断片は、異なる種または亜種のデスミン遺伝子の上流領域であって、その配列を本明細書に記載のヒトデスミン遺伝子の配列と実質的に同じであるが同一ではなくする配列多型を有することがある領域から単離しまたは得る（誘導する）ことができる。この有利な態様によれば、本発明で用いられる核酸断片は非ヒトデスミン遺伝子のゲノム部分からクローニングしまたは得ることができ、このゲノム部分はヒトデスミン遺伝子の約−１８６６２〜約−１７８４位に対応する。適当なデスミン遺伝子としては、任意の脊椎動物の、好ましくは任意の哺乳類、例えば、霊長類（例えば、サル）、反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ）、鳥類（例えば、ニワトリ）、鳥類、ネコ、ウマ、イヌ、ブタ（例えば、ブタ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）などのものが挙げられる。例えば、ヒトおよび動物（例えば、マウス）デスミン遺伝子の５’−フランキング配列の詳細な比較配列分析は、ヒトデスミン遺伝子の転写開始部位に対して−１５．１と−１０．２ｋｂの間で同定された４個の主要なＤＮアーゼ高感受性部位に対応するもののような保存された転写調節要素に対応することがある高相同性の領域を見出す試みにおいて行うことができる。様々なデスミン遺伝子の転写の開始部位は入手可能な文献から知られているが、あるいはＳ１マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することもできる（「分子生物学の最新のプロトコール（Current protocols in Molecular Biology）」， Ausubel et al., 1994, John Wiley & Sons Inc; Sambrook et al, 2001，「分子クローニング：実験室便覧（Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cloning)」, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。

好ましくは、本発明は、結合した遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性の向上に関して、（例えば、配列番号１に示された配列を示す）「本来の」核酸断片によって付与される全般的機能を本質的に保存している部分または相同核酸断片（上記で定義したとおり）を包含するものと解釈される。当業者であれば、特定の部分または相同核酸断片を適当な制御配列（例えば、プロモーター、および場合によってはエンハンサー）の制御下に置かれたレポーター遺伝子に連結して構築物を生成し、この構築物を宿主細胞または生物に導入し、同じ実験条件下で非修飾核酸断片によって制御するときに得られた結果に対して遺伝子産物の持続性を測定することによって、特定の部分または相同核酸断片が活性であるかどうかを決定することができる。遺伝子産物のレベルに関わりなく、特定の部分／相同部分が本来の配列と同じ程度（少なくとも８０％）まで所定の宿主細胞での遺伝子産物の持続性を付与することができるときには、機能性が保存される。

本発明に関して用いられる有利な核酸断片は、配列番号１に示された配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性であり、
− 約１のヌクレオチドから出発して約１５４６５のヌクレオチドで終わる、または約１のヌクレオチドから出発して約１５４６５のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である、または
− 約７５６９のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わる、または約７５６９のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である
配列を含んでなる。

好ましい態様によれば、本発明で用いられる核酸断片は、
− 約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わるか、
− 約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わるか、または
− 約７５６９のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる
配列番号１に示された配列の部分と同一であるかまたは相同性である配列を含んでなる。

極めて好ましくは、核酸断片は、
− 約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わるか、
− 約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わるか、または
− 約７５６９のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる
配列番号１に示された配列と同一の配列を含んでなる。

配列番号１に示された配列の他の制限断片も本発明に関して適しており、例えば、約８２２１のヌクレオチドから約１４７５０のヌクレオチドまで伸長するＰｓｔＩ断片、約５１２８のヌクレオチドから約１６７８６のヌクレオチドまで伸長するＢａｍＨＩ断片、約７５６９のヌクレオチドから約１６８７９のヌクレオチドまで伸長するＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片、約１０３８３のヌクレオチドから約１６８７９のヌクレオチド伸長するＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片、および約５３６６のヌクレオチドから約１１３００のヌクレオチドまで伸長するＳａｃＩ断片である。

もう一つの態様によれば、本発明で用いられる核酸断片は、宿主細胞または生物で目的とする上記遺伝子を発現させる１以上の制御配列に操作可能に連結している。

本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体の一つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、複写、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または宿主細胞または生物への輸送などのポリヌクレオチドの機能調節を行い、引き起こしまたは調節する任意の配列を表す。調節は工程の頻度、速度および／または特異性に影響を与えることがあり、且つ増進または抑制性であることがある。本明細書で定義した核酸断片とは別に、制御配列が当該技術分野で知られている。典型的な例としては、プロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、およびｍＲＮＡの安定性に影響する要素が挙げられるが、これらに限定されない。

「操作可能に連結した」（operably linked）とは、（複数の）制御配列と目的とする遺伝子の並置を表し、それらを予想されたやり方で操作することができるようにする関係になっている。例えば、プロモーターが宿主細胞または生物で目的とする遺伝子を転写することができるときには、プロモーターはこの遺伝子に操作可能に連結する。この機能的関係が保存される限り、プロモーターと目的とする遺伝子の間には追加残基があることがある。エンハンサーが転写を増進するときには、エンハンサーはプロモーターに操作可能に連結し、宿主細胞または生物で関連遺伝子の発現を増進する。好ましくは、本明細書で用いられる「操作可能に連結した」という用語は、目的とする遺伝子とその転写を制御する制御配列との並置をも表す。

引用したプロモーターおよびエンハンサーについて本出願明細書で関係づけたヌクレオチド位置は、（本来の）関係遺伝子の仮想転写開始部位（またはキャップ部位であり、＋１位に相当する）に対して番号が付けられている。例えば、転写開始部位のすぐ上流の最初のヌクレオチドは−１の番号が付けられ、一方その後のヌクレオチドは＋２の番号が付けられる。転写の開始部位は、Ｓ１マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる（Sambrook et al., 2001,「分子クローニング：実験室便覧（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」， Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク）。

「宿主細胞」は、目的とする遺伝子の発現が期待される細胞である。本明細書で用いられる「宿主細胞」という用語は、単一存在物を表すか、または細胞が集まって一層大きくなったものの一部であることができる。このような細胞のより大きな集合は、例えば、細胞培養物（混合または純粋）、組織（例えば、上皮または他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、膀胱、筋肉、または他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、神経系、外皮系、または他の器官系）、または生物（例えば、哺乳類、特にヒトなど）を含んでなることができる。本発明に関しては、宿主細胞は、好ましくは筋細胞である。「筋」は、骨格筋、心筋および平滑筋など任意の種類の筋肉を表す。「平滑筋」としては、内臓および血管平滑筋、更に具体的には動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）が挙げられ、特に好ましくは大動脈、冠状動脈、乳房動脈、大腿動脈および頸動脈、並びに伏在静脈の新内膜および内側ＳＭＣが挙げられる。「骨格筋細胞」としては、筋芽細胞、筋管、筋原繊維、および衛星細胞が挙げられる。「心筋細胞」としては、心筋細胞および衛星細胞が挙げられる。骨格筋が、本発明に関して好ましい。

有利には、上記制御配列は、好ましくは哺乳類の核遺伝子から得られるかまたはウイルスプロモーターであり、特に好ましくは比較的弱い哺乳類プロモーター（例えば、デスミンプロモーターと同じ程度）であるプロモーターを含んでなる。

本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し且つこのプロモーターの下流に位置している遺伝子の転写を開始することができるＤＮＡ領域を表す。このようなプロモーターは、宿主細胞または生物において適当な開始部位で低レベルであっても目的とする遺伝子の転写を開始するのに十分な少なくともシス作用配列を含む。好ましくは、転写開始部位の２５〜３５ｂｐの位置にある少なくともＴＡＴＡボックス（コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＡＡ）またはＴＡＴＡボックス様要素（ＴＡＴＡボックス機能を有するＡＴリッチ配列）が挙げられる。本発明に関して用いられるプロモーターは１個以上の追加のシス作用配列を含んでなり、例えば、遺伝子転写を実質的に増加しおよび／または遺伝子発現細胞を外部シグナルまたは薬剤によって型特異的、始祖基特異的または誘導性にすることができ、特に好ましくは筋特異的シス作用配列を含んでなることができる。典型的例としては、ＮＦ−１因子によって結合されたＣＡＡＴボックス（コンセンサスＧＧＣＣＡＡＴＣＴ）、ＳＰ１因子によって結合されたＧＣボックス（コンセンサスＧＧＧＣＧＧ）、Ｏｃｔ因子によって結合されたオクタマーＡＴＴＴＧＣＡＴ、ＮＦκＢによって結合されたκＢ（コンセンサスＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）、ＡＴＦ因子によって結合されたＡＴＦ（コンセンサスＧＴＧＡＣＧＴ）、Ａｐ２、Ｓｐ１、Ｅｇｒ１、ＹＹ１、ＴＧＴ３−３、Ｅボックス（ＣＡＮＮＴＧ）、ＣａｒＧボックス（ＣＣ（Ａ／Ｔ）_６ＧＧ）および／またはＭＥＦ−２（ＹＴＡＷＡＡＡＴＡＲ）配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのシス作用配列は、単独でもまたは様々な組合せで用いることもでき、相同（本発明で用いられるプロモーターから単離）または異種（別のプロモーター領域から単離）であることができる。これに関して、幾つかのプロモーターを融合して宿主細胞または生物での遺伝子発現を最適にするのが有利なことがある。

本発明に従って用いることができるプロモーターは、宿主細胞または生物で機能することができる任意のプロモーターであることができる。このようなプロモーターは、遺伝子座の転写開始部位のすぐ上流の約５００塩基対（ｂｐ）までの範囲内にあり、有利には約４００ｂｐまでの範囲内に、更に好ましくは約２００ｂｐまでの範囲内にある。必要に応じて、保持されたプロモーターを修飾して、その転写活性を向上させ、ネガティブ配列を欠失し、その調節を変更し、適当な制限部位の導入などを行うことができる。

例えば、最小ＩＥ ＣＭＶプロモーター、特にＣＭＶゲノムの転写開始部位のすぐ上流の１１９ｂｐが本発明に関して適している（Boshart et al, 1985, Cell 41, 521-530）。

好ましい態様によれば、本発明は筋特異的プロモーターを用いる。筋特異的プロモーターの例としては、ミオシン、ミオゲニン（Edmondson et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12, 3665-3677）、デスミン（欧州特許出願第０ ９９９ ２７８号明細書；Mericskay et al., 1999, Current Topics in Pathology Vol 93, pp 7-17; Desmouliere and Tuchweber監修，Springer-Verlag Berlin Heidelberg）、トロポニン、β−エノラーゼ（Feo et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 5991-6002）、クレアチンキナーゼ（Sternberg et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 2896-2909; Trask et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 17142-17149）および骨格α−アクチン（Taylor et al., 1988, Genomics 3, 323-336）遺伝子から単離したものが挙げられる。

特に好ましい筋特異的プロモーターは、デスミン遺伝子から単離されたまたは得られた（誘導された）プロモーターである。任意の種類の任意のデスミン遺伝子プロモーター、特にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタのデスミン遺伝子プロモーターを、本発明に関して用いることができる。様々なデスミン遺伝子を、通常の分子生物学の手法を用いてまたは文献や特定のデータバンク（例えば、ヒト配列については受入番号Ｘ５３１５４、マウス配列についてはＡＪ２５０６３３、およびラット配列についてはＸ７３５２４でＧｅｎｅｂａｎｋ）に開示されている配列に基づく適当なゲノムライブラリーからＰＣＲによって得ることができる。重要なシスチン作用配列は、公表データに基づいて決定することができる。

ヒトデスミン遺伝子から単離されたまたは得られたプロモーター、特に転写開始部位の上流の５３７ｂｐ断片の範囲内から構成される部分（すなわち、配列番号１では、約１８１２２〜約１８６６３の位置）またはその機能的部分が、本発明に関して特に好ましい。

従って、本発明は、好ましくは、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である配列を有する部分を含んでなるヒトデスミン遺伝子から得たプロモーターを用いる。

絶対的に好ましくは、上記プロモーターは、約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同じ配列を含んでなる。

必要に応じて、プロモーターは、別のプロモーターおよび／または１個以上のエンハンサーと共に用いることができる。

もう一つの態様によれば、本発明で用いられる（複数の）制御配列はエンハンサーを含んでなる。

本明細書で用いられるエンハンサーという用語は、（複数の）因子が直接または間接的に（すなわち、別の細胞因子との相互作用を介して）結合し、それによって本発明に関して用いられる他の（複数の）制御配列（例えば、プロモーター）によって行われる遺伝子発現を増進するヌクレオチド配列を表す。

このような増進は、例えば、イン・ビトロ（例えば、培養宿主細胞中）でまたはイン・ビボで（例えば、トランスジェニック動物中でまたは動物に直接投与することによって）および同じ実験条件下でエンハンサーの存在下または非存在下で所定のプロモーターの制御下でレポーター遺伝子の発現を比較することによって決定することができる。遺伝子発現は、上記で引用したように、標準的方法によって決定することができる。

多種多様な異なる供給源からの多数のエンハンサーが当該技術分野で周知であり、クローニングしたポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＴＣＣのような受託機関、または他の商業的または個人的供給源由来）としてまたはの範囲内で入手可能である。有利には、上記エンハンサーは哺乳類の核遺伝子から単離または得られるか、またはウイルスエンハンサーである。例えば、ほんのこの太陽により用いられる適当なエンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、および特に転写開始部位に対して−７５０位から−１２０位まで伸びているその部分（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０３９２２）が挙げられる。

好ましい態様によれば、本発明に関して用いられるエンハンサーは筋特異的エンハンサーである。本発明に関して用いることができる筋特異的エンハンサーとしては、
ａ） α−アクチン（Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,7631-7643）、特に心筋、骨格筋または平滑筋α−アクチン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｄ００６１８）；
ｂ） トロポニン、特にトロポニンＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ３７９８４）、Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ９０７８０）またはＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＪ０１１７１２）；
ｃ） ミオゲニン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ６２１５５）；
ｄ） ミオシン。幾つかのミオシンエンハンサーが、今日までにミオシン軽鎖およびミオシン重鎖遺伝子のいずれからも同定されている（例えば、Donoghue et al., 1988, Gene and Development 2, 1779-1790）。ミオシン重鎖エンハンサーが好ましく、更に好ましいものはウサギのものであり、特に好ましいものはウサギミオシン重鎖コード遺伝子の転写開始部位の上流の約−１３３２位−約−１２２５位に配置されたエンハンサーである（Kallmeier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 30949-30957）；
ｅ） クレアチンキナーゼ、特にヒト（Trask et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 17142-17149; Genbank受入番号ＡＨ００３４６０）またはマウス（Jaynes et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8,62-70）由来のもの。好ましい筋特異的エンハンサーは、好ましくはヒトクレアチンキナーゼの転写開始部位の上流の約−９１９位−約−７１１位に配置された配列を用いる；
ｆ） スムーテリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＨ００７６９１）；
ｇ） カルポニン。ネズミカルポニン遺伝子の第一のイントロン内の約＋１３８位−約＋１８７５位の間に配置された配列が特に好ましい（Miano et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 9814-9822）；
ｈ） β−エノラーゼ、特にヒトＥＮＯ−３遺伝子であり、ヒトβ−エノラーゼ遺伝子の第一のイントロンにおける転写開始部位の下流の約＋５０４位から約＋６３７位まで伸びている配列を含んでなるエンハンサー断片が特に好ましい（Feo et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15, 5991-6002）；
ｉ） デスミン
をコードする下記の哺乳類遺伝子から単離または得られたものが挙げられるが、これらに限定されない。

デスミン遺伝子から、特にヒトデスミン遺伝子から単離または得られた筋特異的エンハンサーが好ましく、ヒトデスミン遺伝子の転写開始部位に対して少なくともｎｔ−９７３〜ｎｔ−６９３を含んでなるその部分が特に好ましい（Li and Paulin, 1991, J. Biol. Chem. 266, 6562-6570）。あるいは、マウスデスミン遺伝子から単離または得られたエンハンサーも適しており、特に転写開始部位に対して少なくともｎｔ−５７８〜ｎｔ−９７６を含んでなる部分が適している（Li and Capetanaki, 1993, Nucleic Acids Res. 21, 335-343 ; Li and Capetanaki, 1994, EMBO J. 13, 3580-3589）。

好ましい態様によれば、本発明で用いられるエンハンサーはヒトデスミン遺伝子から得られ、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８１２１のヌクレオチドで終わる（すなわち、ヒトデスミン遺伝子の転写開始部位に対して約−１７８４位から約−５３７位まで伸びているＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限断片に対応する）配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８１２１のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である配列を有する部分を含んでなる。

上記のように、エンハンサーがプロモーターによって行われる遺伝子発現を増進するときには、このエンハンサーはプロモーターと操作可能に連結している。操作可能に連結したエンハンサーは、遺伝子配列中のプロモーターの上流または下流に置くことができ、または上記遺伝子配列の下流に置くことができる。更に、エンハンサーは、プロモーターに対して接近した距離でまたは数ｋｂまでの距離を置いて隣接することができる。有利には、エンハンサーはプロモーターの上流に配置され、プロモーターとエンハンサーを分離する距離は有利には５００ｂｐ未満であり、好ましくは２００ｂｐ未満であり、更に好ましくはプロモーターにすぐ隣接している。更に、エンハンサーの配向は、プロモーターによって付与された転写方向に対してセンス（ゲノム）またはアンチセンス（逆ゲノム）であってもよい。それぞれの要素の他のものに対する最適位置および配向は、任意の特定の構築物についての日常的実験によって決定することができる。本発明に関して、エンハンサー（例えば、ヒトデスミンエンハンサー）は、プロモーター（例えば、ヒトデスミンプロモーター）の上流にセンス配向で配置される。

核酸断片に対するプロモーターおよび／またはエンハンサーの最適位置および配向も、日常的実験によって決定することができる。例えば、核酸断片は、ゲノム配向でエンハンサーの上流に少なくとも約２００ｂｐ−約１ｋｂ、好ましくは約４００ｂｐ−約８００ｂｐの距離で配置される。しかしながら、当業者であれば、プロモーターおよび／またはエンハンサーおよび／または目的とする遺伝子に対する核酸断片の距離は指標として提供されており、これらの異なる要素の相対的大きさによって変化することがあることを理解するであろう。あるいは、核酸断片は、プロモーターおよび／またはエンハンサーと距離を置き、かつ目的とする遺伝子の下流に配置することができる。絶対的に好ましくは、核酸断片を、目的とする（複数の）遺伝子の上流に配置されているプロモーターの上流に配置されているエンハンサーの上流にセンス（すなわち、ゲノム）配向で配置される。

本発明は、上記で定義した１個より多いエンハンサーの使用も包含する。

並置の操作可能性は、適当な培養細胞中でイン・ビトロでまたはイン・ビボで（トランスジェニック動物中でまたは動物モデルに直接投与することによって）、宿主細胞または生物での遺伝子発現を行う能力を測定することによって腰囲に決定することができる。遺伝子発現は、上記した標準的方法によって決定することができる。

本発明で用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、例えば、ＤＮＡライブラリーからクローニング技術によってまたは適当なプローブまたはプライマーを用いる増幅法（ＰＣＲ）によって単離することができる。あるいは、それらは、当該技術分野で入手可能な配列データに基づく化学合成によって産生することもできる。プロモーターおよびエンハンサーを支持している断片同士は、制限酵素およびリガーゼを用いて結合させることができる。

本発明に関連して、本発明で用いられるプロモーターまたはエンハンサー、または両方は、上記で定義したそれぞれの活性が実質的に（本来の配列の活性の少なくとも８０％）保存されるという条件で１または数個のヌクレオチドの欠失、付加および／または置換によって修飾することができる。このような修飾は、（ｉ）組織特異性を向上させるための正のシス作用配列または（ii）発現レベルを減少させる負のシス作用配列（「サイレンサー」）を除去することを目的とすることができる。位置指定突然変異誘発を用いて、本来の配列を修飾することができる。

好ましい態様では、本発明は、ヒトデスミン遺伝子から単離または得た核酸断片、エンハンサーおよびプロモーターを並置して、宿主細胞または生物、特に骨格筋細胞中で目的とする１以上の遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性を改良することができる。この態様によれば、本発明は、約１のｎｔから出発して約１６８７９のｎｔで終わる配列番号１に示された（すなわち、転写開始部位に対して約−１８６６２位から約＋１位まで伸びているヒトデスミン遺伝子の部分に対応する）配列またはその相補的配列と同一であるかまたは相同性である配列を用いる。

「目的とする遺伝子」という用語は、任意の起源のものであり且つゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイムまたは転移ＲＮＡのようなＲＮＡをコードする任意のＤＮＡから単離することができる核酸を表す。目的とする遺伝子は、オリゴヌクレオチド（すなわち、１００ｂｐ未満の短いサイズの核酸）であることもできる。

好ましい態様では、本発明で用いられる目的とする遺伝子は治療遺伝子であり、すなわち、治療上重要な遺伝子産物、好ましくはデスミン以外の遺伝子産物をコードする。「治療上重要な遺伝子産物」とは、患者、特に疾患または疾病状態に罹っている、または疾患または疾病状態から防御する必要がある患者に適当に投与したとき、治療または予防活性をを有するものである。このような治療または予防活性は、上記疾患または上記疾病状態の症状の経過について有益な効果が得られるように相関させることができる。治療を行う疾患または症状によって治療上重要な適当な遺伝子産物をコードする遺伝子を選択することは、当業者の到達範囲内にある。一般的に、当業者は以前に得られた結果に基づいて選択することができ、従って角の実験を行うことなく、すなわち特許請求を行う発明を実施すること以外はこのような治療特性が得られることを合理的に予想することができる。

本発明に関連して、目的とする遺伝子は、これを導入する宿主細胞または生物に関して相同または異種であることができる。有利には、これはポリペプチド、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードする。「ポリペプチド」という用語はポリヌクレオチドの大きさがどのようなものであれ、ポリヌクレオチドの任意の翻訳生成物として理解されるべきものであり、７個程度のアミノ酸残基（ペプチド）を有するポリペプチドが挙げられるが、更に典型的には、タンパク質が挙げられる。更に、これは任意の起源のものであってよい（原核生物、下等または高等真核生物、植物、ウイルスなど）。これは、天然のポリペプチド、変異体、事実上相対物を持たないキメラポリペプチド、またはそれらの断片であってもよい。有利には、本発明で用いられる目的とする遺伝子は、動物またはヒトの生態で１以上の欠陥のあるまたは不完全な細胞タンパク質を補償することができるまたは毒性効果によって体内から有害な細胞を制限しまたは除去する作用を行う少なくとも１個のポリペプチドをコードする。適当なポリペプチドは免疫付与性であることもでき、抗原として作用して、例えば、体液性応答を誘発する。

目的とする遺伝子によってコードされるポリペプチドの典型例としては、
− ｐ２１、ｐｌ６、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子の発現産物、キナーゼ阻害薬（好ましくは、サイクリン依存型）、ＧＡＸ、ＧＡＳ−１、ＧＡＳ−３、ＧＡＳ−６、Ｇａｄｄ４５、およびＡ、ＢおよびＤのような細胞サイクルに関与するポリペプチド；
− 血管内皮増殖因子のファミリーの一員（ＶＥＧＦ；すなわち、ヘパリン結合性ＶＥＧＦ；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ３２９７７）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ、特にＴＧＦαおよびβ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＦＧＦαおよびβ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、特にＴＮＦαおよびβ）、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ、Ｅｌｍ−１、Ｃｏｐ−１およびＷｉｓｐ−３など）、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＳＨ／ＨＧＦ）、アンギオゲニン、アンギオポエチン（特に、１および２）、アンギオテンシン−２、プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）のようなアンギオゲニンポリペプチド；
− インターロイキン（特に、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ−β；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２５４６０；ＩＦＮ−γ；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２９３８３；ＩＦＮ−αなど）のようなサイトカイン；
− ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、ＭＩＰ−１β、ＤＣＣＫ１、ＭＤＣ、ＩＬ−１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ１６７２０）およびＭＣＰ−１などのケモカイン；
− 抗体、毒素、免疫毒素、オンコジーン発現産物を阻害するポリペプチド（例えば、ｒａｓ、ｍａｐキナーゼ、チロシンキナーゼ受容体、増殖因子）、Ｆａｓリガンド（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ０８１３７）、宿主免疫系を活性化するポリペプチド（ＭＵＣ−ｌ、パピローマウイルス初期または後期抗原など）のような細胞増殖を減少させまたは阻害することができるポリペプチド；
− 抗原決定基、競合によるウイルスの天然タンパク質の作用を阻害するトランスドミナント（transdominant）変異体（欧州特許第６１４９８０号明細書、Ｗ０９５／１６７８０号明細書）、ＨＩＶ受容体ＣＤ４の細胞外ドメイン（Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86）、イムノアドヘシン（Capon etal., 1989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670）、免疫毒素（Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499）、および抗体（Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195）のような最近、寄生生物またはウイルス感染またはその発生を阻害することができるポリペプチド；
− ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ９５２９６）およびｉＮＯＳ）、ＳＯＤ、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０６９８５）、エナーゼ、リポタンパク質リパーゼ類のような酵素；
− 酸素ラジカルスカベンジャー；
− α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１、メタロプロテイナーゼ１−４の組織阻害剤のような酵素阻害剤；
− ジストロフィンまたはミニジストロフィン（ミオパシーに関しては、England et al., 1990, Nature 343, 180-182）、インスリン（糖尿病に関して）、血友病因子（VIIa因子（米国特許第４，７８４，９５０号明細書）、VIII因子（米国特許第４，９６５，１９９号明細書）またはその誘導体（米国特許第４，８６８，１１２号明細書、Ｂドメインを欠失）およびＩＸ因子（米国特許第４，９９４，３７１号明細書）のような血友病および血液疾患の治療について）、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症に関しては、Riordan et al., 1989, Science 245, 1066-1072）、エリトロポエチン（貧血）、グルコセレブロシダーゼ（Ｇａｕｃｈｅｒ病；米国特許第５，８７９，６８０号明細書および米国特許第５，２３６，８３８号明細書）、α−ガラクトシダーゼ（Ｆａｂｒｙ病；米国特許第５，４０１，６５０号明細書）、酸性α−グルコシダーゼ（Ｐｏｍｐｅ病；ＷＯ００／１２７４０号明細書）、α−ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ病；米国特許第５，３８２，５２４号明細書）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病；米国特許第５，６８６，２４０号明細書）、およびα−イデュロニダーゼ（ＷＯ９３／１０２４４号明細書）などのリソソーム蓄積酵素のような病状の原因となる欠損した細胞機能を少なくとも部分的に回復することができるポリペプチド；
− アンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４のような新脈管形成阻害剤；
− ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、および転写を活性化または阻害するドメイン（例えば、エストロゲン、ステロイドおよびプロゲステロン受容体から誘導される融合生成物）；
− レポーターイデュロニダーゼ（例えば、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、ｅＧＦＰなど）；
− 抗体（任意のクラスの全イムノグロブリン、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体およびそれらの断片、例えば、ハイブリッド断片および抗イディオタイプを包含するＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）、および
− 臨床症状の治療または予防に有用であると当該技術分野で認められている任意のポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

目的とする遺伝子は本来の配列に関して１個以上のヌクレオチドの（複数の）付加、（複数の）欠失、および／または（複数の）修飾を含むことができることは本発明の範囲内にある。

筋細胞は本発明に関して好ましい宿主細胞であるので、目的とする遺伝子は、好ましくは筋細胞によって発現され且つ最終的に血流に分布されて宿主生物に治療を提供する治療ポリペプチドをコードする。本発明の１つの重要な態様は、目的とする上記遺伝子がジストロフィンまたはミニジストロフィンをコードすることを特徴とする筋ジストロフィーの治療方法である。

上記のように、目的とする遺伝子は、アンチセンス配列をコードする遺伝子、および特異的な細胞ＲＮＡ、好ましくはオンコジーンおよびプロトオンコジーン（ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｒａｓ、ＫｃおよびＪＥ）のような選択された積極的に作用する増殖調節因子のものに結合して不活性化することができるリボザイムも包含する。

本発明は、１個以上の目的とする遺伝子を用いることができる。目的とする様々な遺伝子は、同じまたは反対方向に配置されている共通（ポリシストンカセット）または独立した制御配列によって制御することができる。この変法では、本発明で用いられる核酸断片は目的とする２個の遺伝子を調節して、それぞれの遺伝子のプロモーター／エンハンサー制御発現の間に配置することができる。あるいは、好ましくはそれぞれの遺伝子を用いる目的で用いられるプロモーター／エンハンサーの上流に配置された１個より多い核酸断片を用いることもできる。

当業者であれば、本発明は、宿主細胞または生物への目的とする（複数の）遺伝子の転写および翻訳の適当な開始、調節および／または終結のための追加の制御配列を用いることもできることを理解されるであろう。このような制御配列としては、非コードエキソン、イントロン、ターゲッティング配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在化シグナル配列、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配列、三連リーダー配列、複製または組込みに関与する配列が挙げられるが、これらに限定されない。上記制御配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に得ることができる。

これに関して、制御配列は少なくとも非コードエキソンまたはその一部、および必要に応じて１個以上のイントロンを含んでなるのが好ましい。このようなエキソンおよび／またはイントロン配列は発現を最適にするのに有利であることがあり、且つ核酸断片および／または（複数の）制御配列が由来する遺伝子（例えば、デスミン）または任意の他の起源（例えば、真核生物、ウイルス、合成）から得ることができる。当該技術分野の状態で記載された多種多様なエキソン／イントロン配列は、本発明に関して適している（例えば、ＷＯ９８／５５６３９号明細書を参照されたい）。それらは、好ましくは転写開始部位の後であって目的とする遺伝子の開始コドンの前に挿入される。好ましい態様について説明すれば、適当なエキソン配列は、転写開始部位に対して＋２位から約＋６０位まで伸びている第一の非コードエキソンの部分（すなわち、約ｎｔ１８６６４から約ｎｔ１８７２２までの配列番号１に示された配列）を含んでなる。イントロンに関しては、これ（ら）は（目的とする遺伝子に対して）相同または異種（すなわち、任意の真核生物の核遺伝子または合成起源から誘導された）であることができる。イントロンは文献に公表されており、当業者であれば容易に得ることができる。実例としては、αまたはβグロビンをコードする遺伝子から単離したイントロン（すなわち、ウサギβグロビン遺伝子の第二イントロン；Green et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16, 369; Karasuyama et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18, 97-104）、卵白アルブミン、アポリポタンパク質、免疫グロブリン、IX因子、VIII因子およびＣＦＴＲをコードする遺伝子から単離したイントロン、およびマウス免疫グロビンアクセプターに融合したヒトβグロビンドナーから作成されたｐＣＩベクター（Promega Corp，ｐＣＩ哺乳類発現ベクターＥ１７３１）に含まれるイントロンのような合成イントロン、または（ＳＶ４０ １６ＳおよびＳＶ４０ １９Ｓ後期ｍＲＮＡの形成においてスプライシングされる配列の結合からなる；Okayma and Berg, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 280-289）ＳＶ４０のイントロン１６Ｓ／１９Ｓが挙げられる。

本発明に関して用いられる制御配列は、目的とする（複数の）遺伝子に操作可能に連結したポリアデニル化シグナルを含むこともある。ポリアデニル化配列は、これが転写を終結させるときには、転写を行う遺伝子に操作可能に連結している。これは、目的とする遺伝子の下流に配置するのが好ましい。

もう一つの態様によれば、本発明は、少なくとも１個以上の目的とする遺伝子を含んでなる宿主細胞または生物において上記（複数の）遺伝子を発現するための発現カセットであって、１個以上の制御配列と１個の核酸断片によって発現が制御されるものであって、上記核酸断片が約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である配列を有する少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分を含んでなることを特徴とする発現カセットも提供する。

好ましくは、核酸断片および／または（複数の）制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーおよび／またはエキソン配列および／またはポリアデニル化配列など）および／または目的とする遺伝子は、上記で定義したとおりの特徴を有する。「および／または」という用語は、いずれにしても本明細書で用いられるときには、「および」、「または」、および「上記用語によって結合された要素のすべての組み合わせまたは任意の他の組み合わせ」の意味を包含する。

特に、本発明の発現カセットは筋細胞での直接的遺伝子発現の傾向を示すが、非筋細胞では、全くまたは少しも活性でなく（筋細胞での発現活性と比較して少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、更に好ましくは少なくとも１００分の１まで活性が減少）、従ってこれらの宿主細胞は培養細胞または宿主生物の細胞であることができる。従って、本発明の発現カセットは筋細胞で遺伝子発現が最大となるので、筋細胞へ優先的に上記の目的とする遺伝子の発現を転写的にターゲッティングすることができる。好ましくは、筋細胞は骨格筋細胞である。

好ましい態様によれば、本発明の発現カセットは、少なくとも
− 約１のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
− 約１のヌクレオチドから出発して約１８７２２のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
− 約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わり、約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
− 約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わり、約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８７２２のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
− 約７５６９のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、または
− 約７５６９のヌクレオチドから出発して約１８７２２のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列
を含んでなる。

本発明の発現カセットは、当該技術分野で周知の標準的分子生物学の手法によって構築することができる。様々な制御配列および核酸断片が、天然供給源からまたは合成手段によって得ることができる。例えば、それらは、ＤＮＡライブラリーからクローニング技術によってまたは適当なプローブを用いる増幅法（ＰＣＲ）によって単離することができる。あるいは、それらは、当該技術分野で入手可能な配列データに基づく化学合成によって製造することができる。プロモーター、エンハンサーおよび核酸断片は、制限酵素およびリガーゼを用いることによって結合させることができる。

本発明は、本発明による発現カセットを含んでなるベクターも提供する。当業者であれば、広汎なベクターから適当なベクターを選択することができる。

好ましい態様によれば、本発明のベクターは裸のＤＮＡ分子、例えば、プラスミドベクターである。「プラスミド」という用語は、染色体外の環状ＤＮＡ（すなわち、エピソームプラスミド）および宿主ゲノム中で組込みを行うことができる組込みプラスミドの両方を包含する。好ましくは、プラスミドは、細菌での増幅および真核生物宿主細胞での発現のためにデザインされる。これは、選択遺伝子を含んでなり、（例えば、細胞栄養要求性の相補性によって、または抗生物質耐性によって）トランスフェクション細胞、安定化要素（例えば、ｃｅｒ配列；Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103）、組込み要素（例えば、ＬＴＲウイルス配列およびトランスポゾン）、並びに細胞中のベクターのコピー数とは独立して自己複製機能を提供し且つベクターを細胞中で安定に保持することができる要素を選択しまたは同定することもできる。自己複製機能は、複製のウイルス起源を用いて特定のウイルス起源によって伝達される複製に必要な１以上のウイルス複製因子を提供することによって提供される（ＷＯ９５／３２２９９号明細書）。複製の起源および任意の複製因子は、Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）ヒトおよびウシパピローマウイルスおよびパポバウイルスなど様々なウイルスから得ることができる。しかしながら、本発明のベクターの好ましい態様は、非自己複製プラスミドベクターに関する。

適当なプラスミドの範囲はきわめて大きく、様々な製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２（Gibco BRL）、ｐＵＣ（Gibco BRL）、pBluescript（Stratagene）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Invitrogene）、ｐＣＩ（Promega）およびｐ Ｐｏｌｙ（Lathe et al., Gene 57 (1987), 193-201）から誘導されたものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、標準的分子生物学の技術によって遺伝子工学処理を行うこともできる（Sambrook et al. 2001,「分子クローニング： 実験室便覧（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」， Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー，ニューヨーク）。更に、ベクターの形態は発現効率に影響を及ぼす可能性があり、ベクターの大きな部分が超へリックス化形態であるのが好ましい。

本発明は、ウイルスベクターも包含する。このようなウイルスベクターは、任意の野生型ウイルス、特にヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルスから誘導することができる。このようなウイルスベクターは、当該技術分野で周知である。「誘導される」とは、ウイルスゲノムのコードまたは非コード部分に含まれる１または数個のヌクレオチドの（複数の）欠失、（複数の）付加および／または（複数の）置換のような１以上の修飾を導入することによって野生型ウイルスゲノムから遺伝子工学処理を行ったことを意味する。

ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることができる。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完結するのに必要な約３０個より多い遺伝子を有する約３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、Ｅ３領域を除きウイルス複製に本質的な４領域（Ｅ１−Ｅ４）に分割され（Pettersson and Roberts, 1986，「癌細胞（Cancer Cells）（第４巻）：ＤＮＡ腫瘍ウイルス（DNA Tumor Viruses）」，Botchan and Glodzicker Sharp監修，pp 37-47, Cold Spring Harbor Laboratory，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク； Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250-257）、Ｅ３領域は、Ｅ３領域中で欠失した天然に存在する突然変異体またはハイブリッドウイルスが培養細胞での野生型ウイルスと同様に複製を行い続けるという観察に基づいて、ウイルス複製には重要でないと考えられる（Kelly and Lewis, 1973, J. Virol. 12, 643-652）。Ｅｌ遺伝子産物は、ウイルスゲノムの転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡ合成における開始および鎖伸張に必要である。Ｅ３によってコートとされたタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を予防する（Wold and Gooding, 1991, Virology 184, 1-8）。Ｅ４領域によってコートとされたタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現およびスプライシング、および宿主細胞シャットオフに関与する（Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250-257）。後期遺伝子（ＬＩ−Ｌ５）は、通常はウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードする。それらは、少なくとも部分的に初期転写単位と重複し、ユニークプロモーター（主要後期プロモーターの代わりにＭＬＰ）から転写される。更に、アデノウイルスゲノムは、両末端であるシス作用５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）、およびＤＮＡ複製に本質的なパッケージング配列を有する。ＩＴＲはＤＮＡ複製の起源を含み、一方キャプシド化領域は whereas
the encapsidation 領域 is required for the packaging of アデノウイルスＤＮＡの感染性粒子へのパッケージングに必要とされる。

一態様では、本発明のアデノウイルスベクターを工学処理して条件的に複製性とし、Heise and Kirnによって記載されているように、特異的細胞（例えば、増殖細胞）において選択的に複製させる（2000, J. Clin. Invest. 105, 847-851）。

もう一つの好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域を構成する１以上の遺伝子の完全なまたは部分的欠失および／または突然変異によって少なくともＥ１機能について複製欠損である。有利には、Ｅ１欠失は、受入番号Ｍ７３２６０でＧｅｎｅｂａｎｋデータベースに開示されたヒトアデノウイルス５型の配列を参照することによってヌクレオチド（ｎｔ）４５８−３３２８または４５８−３５１０を包含する。

更に、ベクターのアデノウイルス主鎖は、追加の修飾（１以上のウイルス遺伝子における欠失、挿入または突然変異）を含んでなることがある。Ｅ２修飾の一例は、遺伝子をコードするＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）上に局在化した熱感受性突然変異によって例示される（Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339）。アデノウイルス配列は、Ｅ４領域のすべてまたは一部から欠失していることもある。ＯＲＦ ３および４、またはＯＲＦ ３および６／７を保持している部分的欠失が有利である（例えば、欧州特許出願第９７４ ６６８号明細書； Christ et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 415-427; Lusky et al., 1999, J. Virol. 73, 8308-8319）。Ｅ３領域中での追加欠失はクローニング容量を増加させることができるが（総説については、例えば、Yeh et al. FASEB Journal 11 (1997) 615-623を参照されたい）、ポリペプチド（例えばｇｐｌ９ｋ）をコードするＥ３配列のすべてまたは一部を保持し、宿主免疫系（Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71）または炎症反応（欧州特許第００４４０２６７．３号明細書）を免れるようにするのが有利なことがある。ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持し且つウイルス抗原の残基合成をなくすることを目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第二世代ベクターも考えられ、形質導入細胞における発現遺伝子の長期発現を改良することもできる（ＷＯ９４／２８１５２号明細書； Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032）。ＩＴＲおよびパッケージング配列のみを保持し、総てのウイルス遺伝子を欠いている中身のないアデノウイルスベクターを、本発明に関して考えることができる

本発明の発現カセットは、シス作用配列を除き、アデノウイルスゲノムの任意の部位に挿入することができる。好ましくは、欠失領域（Ｅｌ、Ｅ３および／またはＥ４）の代わりに挿入され、欠失したＥ１領域の代わりに挿入するのが特に好ましい。更に、発現カセットは、問題の領域の転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。

本発明によって用いるのに適したアデノウイルスは、任意のヒトまたは動物供給源、特にイヌ（例えば、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２；それぞれＧｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡＶ１ＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、トリ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（例えば、BAV3; Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol. 72, 1394-1402）、ネズミ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＤＲＭＵＳＭＡＶ１），ヒツジ、ネコ、ブタ、またはサルアデノウイルス、あるいはそれらのハイブリッドから誘導することができる。任意の血清型を用いることができる。しかしながら、Ｃサブグループのヒトアデノウイルスが好ましく、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。概して、引用したウイルスはＡＴＣＣのようなコレクションで入手可能であり、それらの配列、組織および生物学を記載している多数の公表文献の主題であり、当業者であればそれらを利用することができる。

更に、アデノウイルス粒子または中空アデノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第５，９２８，９４４号明細書に記載のウイルス性同時インターナリゼーション法によって核酸（例えば、プラスミドベクター）を導入することもできる。この方法は、ポリカルベンまたは１以上の脂質層を含んでなる脂質小胞のような（複数の）カチオン性薬剤の存在下で行うことができる。

レトロウイルスベクターも、本発明に関して適している。レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を用いて複製する組込みウイルスのクラスであり、感染細胞の染色体ＤＮＡに組込まれる二本鎖ＤＮＡにウイルスＲＮＡゲノムを複製する。文献に記載の多数のベクターを本発明の枠内で用いることができ、特にネズミ白血病ウイルス、特にＭｏｌｏｎｅｙ（Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29）またはＦｒｉｅｎｄのＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７号明細書）から誘導したものを用いることができる。一般に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの総てまたは一部を欠失しており、且つ５’および３’ＬＴＲおよびキャプシド化配列を保持している。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させることができる。このような修飾としては、レトロウイルスキャプシド化配列のＶＬ３０のようなレトロトランスポゾンの一つの置換が挙げられる（米国特許第５，７４７，３２３号明細書）。本発明の発現カセットはキャプシド化配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向で挿入される。

ポックスウイルスベクターも、本発明に関して適している。ポックスウイルスは、それらの大きなＤＮＡゲノムとそれらの複製の細胞質部位によって上記ウイルスから識別される複雑なエンベロープウイルスのグループである。ポックスウイルスの数種類のゲノムがマッピングされ、配列決定されている。これは、約２００のタンパク質であってその中の約１００がウイルスアセンブリーに関与しているものをコードする約２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡである。本発明に関して、ポックスウイルスベクターは任意の種類のポックスウイルス、特にカナリアポックスウイルス、トリポックスウイルスおよびワクシニアウイルスから得ることができ、後者が好ましい。適当なワクシニアウイルスとしては、Copenhagen株（Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266および517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401）、Ｗｙｅｔｈ株および改質Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株（Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による発現カセットを含んでなるワクシニアウイルスを構築するための一般的条件は、当該技術分野で周知である（例えば、Copenhagenワクシニアウイルスについては欧州特許第８３ ２８６号明細書および欧州特許第２０６ ９２０号明細書を、ＭＶＡウイルスについてはMayr et al., Infection 3, 6-14およびSutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851を参照されたい）。本発明の発現カセットは、好ましくは非コード遺伝子間領域または不活性化または欠失がウイルス増殖および複製を有意に損なわない任意の遺伝子のような非本質的座のポックスウイルスゲノム中に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子が、Copenhagenワクシニアウイルスでの挿入に特に適している（Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411-3415; Weir et al, 1983, J. Virol. 46, 530-537）。ＭＶＡに関する限り、発現
カセットの挿入は削除Ｉ−VIIのいずれかで、好ましくは削除IIまたはIIIで（Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040）、またはＤ４Ｒ座でで行うことができる。ニワトリウイルスについては、チミジンキナーゼ遺伝子中での挿入が考えられるが、発現カセットは好ましくは非コード遺伝子間領域に導入される（例えば、欧州特許第３１４ ５６９号明細書および米国特許第５，１８０，６７５号明細書を参照されたい）。欠陥のある機能がヘルパーウイルスを介してまたはプロデューサー細胞系での発現によってトランスに供給される場合には、本質的なウイルス座に挿入を考えることもできる。

本発明は、本発明によるベクター、好ましくはウイルスベクターを含んでなるウイルス粒子も提供する。このようなウイルス粒子は、標準的手法に準じて適当な細胞系で製造することができる。

アデノウイルス粒子は、相補性細胞系またはヘルパーウイルスであって、本発明のアデノウイルスベクターが欠陥があるウイルス遺伝子をトランスに供給するものを用いて当該技術分野の任意の通常の手法（例えば、Graham and Prevect, 1991, 「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology），第７巻，遺伝子導入および発現プロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）」； E. J. Murray監修， The Human Press Inc, クリントン，ニュージャージー、またはＷＯ９６／１７０７０号明細書に記載）に準じて調製し、増殖することができる。細胞系２９３（Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72）およびＰＥＲＣ６（Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 1909-1917）は、Ｅ１機能を補足する目的で一般に用いられる。他の細胞系を遺伝子工学処理して、二重に欠陥のあるベクターを補足している（Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6, 1575-1586; Wang et al., 1995, Gene Ther. 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033；欧州特許第９１９６２７号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書）。アデノウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、リーシス後に細胞から回収し、必要に応じて標準的手法に従って更に精製することもできる（例えば、ＷＯ９６／２７６７７号明細書、ＷＯ９８／００５２４号明細書、ＷＯ９８／２６０４８号明細書およびＷＯ００／５０５７３号明細書に記載のクロマトグラフィー、超遠心）。

レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下でまたはレトロウイルスベクターに欠陥があるレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）をそのゲノムに組込んで含む適当な相補性（パッケージング）細胞系で調製される。このような細胞系は、従来技術において報告されている（Miller and Rosman, 1989, BioTechniques 7, 980; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6460; Markowitz et al., 1988, Virol. 167, 400）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、ターゲット細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与しているので、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明に関しては、両栄養性エンベロープタンパク質を含むＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０７８）または２９３Ｅ１６（ＷＯ９７／３５９９６号明細書）のようなパッケージング細胞系を用いて、ヒトおよび他の種のターゲット細胞を感染させるのが有利である。レトロウイルス粒子は好ましくは培養上清から回収され、必要に応じて標準的手法（例えば、クロマトグラフィー、超遠心）に準じて更に精製することができる。

ポックスウイルス粒子は、当業者が入手し得る多数の文書に記載の方法で調製される（Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563；米国特許第４，７６９，３３０号明細書；米国特許第４，７７２，８４８号明細書；米国特許第４，６０３，１１２号明細書；米国特許第５，１００，５８７号明細書および米国特許第５，１７９，９９３号明細書）。開発されてきた主要な手法は、ポックスＤＮＡ配列（所望な挿入部位を包含する）によって両側に存在する本発明の発現カセットを含むドナープラスミドとおよび野生型ポックスウイルスゲノムとの間の相同的組換えを利用する。一般に、ドナープラスミドはＥ．ｃｏｌｉでの増殖によって構築して増幅し、通常の手法によって単離する。次に、これをポックスウイルスゲノムと共に適当な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞）に導入して、相同的組換えによって本発明のポックスウイルス粒子を製造する。それらは培養上清からまたはリーシス段階（化学的、凍結／融解、浸透性衝撃、機械的衝撃、音波処理など）の個のに培養細胞から回収することができ、必要ならば、プラーク精製の連続過程によって野生型汚染物から単離した後、当該技術分野の手法（クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたはスクロース勾配での超遠心）を用いて精製することができる。

好ましくは、ベクターは裸の核酸（すなわち、プラスミド）である。本明細書で用いられる「裸の」（naked）という用語は、共有または非共有結合があってもなくともタンパク質、脂質、炭水化物との直接的な物理結合のない核酸を表す。

もう一つの有利な代替態様によれば、本発明のベクターはベクター送達効率を改良することができる様々な化合物と錯体形成することができる。このような化合物としては、脂質、ポリマー、ペプチド、縮合剤（スペルミン、スペルミジン、ヒストン、ペプチド）、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、当業者が入手可能な科学文献に広汎に記載されている。

これに関して、好ましい脂質は、核酸（例えば、本発明のベクター）に高深紅和製を有し且つ細胞膜と相互作用するカチオン性脂質である（Felgner et al., 1989, Nature 337, 387-388）。その結果、それらは核酸に錯体形成することができ、従って細胞に入ることができるコンパクトな粒子を生成する。本発明で用いることができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合物としては、Lipofectin（商品名）、ＤＯＴＭＡ：Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Felgner, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417），ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンまたはTransfectam（商品名）（Behr, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986），ＤＭＲＩＥ：１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムおよびＤＯＲＩＥ： １，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（Felgner, 1993, Methods 5, 67-75），ＤＣ−ＣＨＯＬ：３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（Gao, 1991, BBRC 179, 280-285）、ＤＯＴＡＰ（McLachlan, 1995, Gene Therapy 2, 674-622）、Lipofectamine（商品名）、スペルミン−およびスペルミジン−コレステロール、Lipofectace（商品名）（総説については、例えば、Legende, 1996, Medecine/Science 12, 1334-1341またはGao, 1995, Gene Therapy 2, 710-722を参照されたい）、および特許出願ＷＯ９８／３４９１０号明細書、ＷＯ９８／１４４３９号明細書、ＷＯ９７／１９６７５号明細書、ＷＯ９７／３７９６６号明細書に開示されているカチオン性脂質、およびそれらの異性体が挙げられる。しかしながら、このリストは完全に網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカチオン性脂質も同様に本発明に関連して用いることができる。

本発明で用いることができるカチオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマーの混合物としては、キトサン（ＷＯ９８／１７６９３号明細書）、ポリリシンのようなポリ（アミノ酸）（米国特許第５，５９５，８９７号明細書または仏国特許第２ ７１９ ３１６号明細書）；ポリ第四級化合物；プロタミン；ポリイミン；ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）；ポリビニルアミン；ＤＥＡＥデキストランのようなＤＥＡＥを用いて誘導したポリカチオン性ポリマー（Lopata et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 5707-5717）；ポリビニルピリジン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；ポリオキセタン；ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ（ＴＤＡＥ））；ポリヒスチジン；ポリオルニチン；ポリ−ｐ−アミノスチレン；ポリオキセタン；コポリメタクリレート（例えば、ＨＰＭＡ：Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドのコポリマー）；ＵＳ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書に開示の化合物、ＤＥＡＥとメタクリレート、デキストラン、アクリルアミド、ポリイミン、アルブミン、オンジメチルアミノメチルメタクリレートおよびポリビニルピロリドン−メチルアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとのポリビニルピロリド錯体；ポリアミドアミン（Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem. 4, 372-379）；テロマー性化合物（欧州特許出願第９８４０１４７１．２号明細書）；樹状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１号明細書）が挙げられる。しかしながら、このリストは完全に網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカチオン性ポリマーも同様に本発明による組成物に用いることができる。

補助脂質（colipids）を必要に応じて包含させて、ベクターが細胞に入るのを容易にすることができる。このような補助脂質は、中性または双性イオン性脂質であることができる。典型例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシド、およびそれらの誘導体のいずれかが挙げられる。

モルベースでのベクター対カチオン性化合物（例えば、脂質またはポリマー）の比は、０．１〜２０、好ましくは０．３〜１０、最も好ましくは０．５〜５の間で変化する。この比は、総ての潜在的カチオン性基は実際にカチオン状態であり、且つ総ての潜在的アニオン性基は実際にアニオン状態であると仮定して、カチオン性化合物によって提供される正電荷の数とベクターによって提供された負電荷の数を割ることによって得られた理論電荷比（＋／−）を特徴とする。一般に、組成物上の正電荷が過剰であると、負に帯電した細胞表面への組成物の結合が促進される。

（複数の）補助脂質が錯体に同時に存在しているときには、カチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー対（複数の）補助脂質の比（重量対重量ベース）は、１：０〜１：１０の範囲であることができる。好ましい態様では、この比は、１：０．５〜１：４の範囲である。

このような化合物に錯体形成したベクターは、平均直径が小さい（２μｍ未満）であることを特徴とすることができる。好ましい態様では、この平均直径は約２０〜８００ｎｍであり、好ましくは約５０〜５００ｍｎであり、更に好ましくは約７５〜２００ｎｍであり、更にいっそう好ましくは約１００ｎｍである。平均直径の測定は、動的レーザー光散乱（光子相関分光分析法、ＰＣＳ）並びに当業者に知られている他の手法が挙げられるが、これらに限定されない（Washington，「医薬および他の産業における粒度分析（Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries）」，Ellis Horwood, New York, 1992,135-169を参照されたい）。サイジング手続きをベクター錯体にも適用して、決定された直径を選択することができる。このサイジング段階で用いることができる方法としては、押し出し、音波処理、および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィー、フィールドフロー分別、電気泳動、および超遠心が挙げられるが、これらに限定されない。

ベクターと１個以上の以前に引用した化合物との錯体形成は、ベクターの表面で反応性官能基を介して、必要に応じて架橋剤または他の活性剤（例えば、「バイオコンジュゲート技術（Bioconjugate techniques）」，1996; G Hermanson監修；Academic Pressを参照）の使用を介して、直接、またはＳＰＤＰまたはＳＭＣＣのようなヘテロ二官能価反応性物質または当業者に周知である官能化ＰＥＧを用いるスペーサーを介して行うことができる（Mattson et al., 1993, Mol. Biol. Reports, 17, 167-183）。

本発明のベクターと１個以上の上記化合物との錯体形成は、標準的手法によって行うことができる。例えば、（複数の）化合物（例えば、カチオン性脂質）を、クロロホルムのような適当な有機溶媒に溶解させる。次に、混合物を真空乾燥する。得られるフィルムを溶媒または水と混和性の溶媒の混合物、特にエタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または好ましくは１：１（ｖ：ｖ）エタノール：ＤＭＳＯ混合物の適量に更に溶解して、既知の方法（ＷＯ９６／０３９７７号明細書）により脂質凝集体を形成し、あるいはオクチルグルコシド（例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたは６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）のような潜在の溶液の適量に懸濁させる。次に、この懸濁液を、所望量のポリヌクレオチドを含んでなる溶液と混合することができる。次の透析を行って、潜在を除去し、本発明の組成物を回収することができる。このような方法の原理は、Hofland et al.によって報告されている（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7305-7309）。

１個以上の化合物を緩衝液に懸濁することも可能であり、次にこの懸濁液に、視覚上均質になるまで音波処理を施す。次に、懸濁液を、適当な圧力を加えて２枚の微孔質膜を通して押し出す。このいわゆる音波処理−押し出し法は、当業者には周知である。

例えば、イン・ビボまたはイン・ビトロ投与後の錯体の分布を視覚化することができる標識分子（例えば、米国特許第４，７１１，９５５号明細書に開示の分子を参照）、ターゲッティング残基（リガンド）、固定分子、フソゲニックペプチド（fusogenic peptides）、核局在化ペプチド、または細胞への浸透、エンドソームのリーシス（例えば、ＪＴＳ１ペプチド、Gottchalk et al., 1996, Gene Therapy, 3, 448-457）または核または上記化合物の組み合わせへの輸送を促進する要素のような他の化合物を、ベクター−合成ベクター錯体に包含することができる。これらの化合物は、糖、グリコール、ペプチド（例えば、ＧＲＰ，ガストリン放出ペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質（特に、Ｃ２−Ｃ２２のもの）、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（またはそれらの断片）の全部または一部から構成されていることがある。ターゲッティング残基の特徴は、細胞および表面に露出した成分を認識して結合することができることである。このようなターゲッティング残基としては、化学的接合体、ホルモン、糖、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、好ましくは細胞特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識し、結合することができる。典型例としては、例えば、肝細胞の表面上のアシアログリコプロテイン受容体をターゲッティングするためのガラクトシル残基が挙げられる。フソゲニックペプチドとしては、膜融合のためのインフルエンザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニットから誘導されるＩＮＦ−７フソゲニックペプチドが挙げられる（Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924）。核シグナル配列は、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原から（Lanford and Butel, 1984, Cell 37,801-813）またはEpstein BarrウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質から（Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65,1466-1478）誘導することができる。更に、反応性基はアルキルＣ１−Ｃ６で置換して、例えば、ペルメチル化組成物とすることができる。反応性基は、アミノ基で置換することもできる。このような置換ポリヌクレオチドまたは化合物は、文献に記載の手法を用いて、特に化学カップリングによって、特にアミン残基上のトリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）またはＢＯＣ（第三ブチルオキシカルボニル）のような保護基を用いることによって容易に得ることができる。次に、保護基を選択的に除去して化合物をカップリングさせた後、完全に脱保護を行う（Greene and Wuts, 1991，「有機合成における保護基（Protective groups in organic synthesis）」，Ed. J. Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク）。

当然のことながら、宿主細胞または生物で本発明のベクターを導入する前に、上記ポリヌクレオチドを精製して、内毒素や他の発熱物質のような望ましくない汚染物質を十分に除いて、ベクター構築物を受け入れる個体に不都合な反応が起こらないようにするのが有利である。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配（すなわち、塩化セシウム勾配遠心分離法）またはＷＯ９８／１１２０８号明細書およびＷＯ００／５０５７３号明細書に記載の手法の使用を包含する。

本発明は、発現カセットまたはベクター、または本発明によるウイルス粒子を含んでなる真核生物宿主細胞も提供する。

本発明の目的には、「細胞」という用語は、組織、器官などまたは哺乳類（好ましくは、ヒト）の単離細胞における特定の組織に関して全く制限なしに広義に理解されるべきである。このような細胞はユニーク型の細胞または異なる型の細胞のグループであってもよく、培養細胞系、一次細胞および哺乳類起源由来の増殖細胞を包含するが、特に好ましいものはヒト起源のものである。適当な宿主細胞としては、造血細胞（全能細胞、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、または繊維芽細胞が挙げられ、筋細胞（上記で定義した通り）、特に骨格筋細胞が特に好ましいが、これらに限定されない。本発明に関連して、本発明のベクターを宿主細胞のゲノムに組込みまたは染色体外要素として保持することができる。

更に、特定の態様によれば、真核生物宿主細胞は更にカプセル化することができる。細胞カプセル化の手法は、以前に報告されている（Trescoet al., 1992, ASAIO J. 38, 17-23; Aebischer et al., 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860）。上記特定の態様によれば、トランスフェクションまたは感染宿主細胞は微孔性膜を形成する化合物でカプセル化され、上記のカプセル化された細胞は更にイン・ビボで移植することができる。目的とする細胞を含むカプセルは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（Akzo Nobel Faser AG，ブッペルタール，ドイツ；Deglon et al. 1996, Human Gene Ther. 7, 2135-2146）製の中空微孔性膜を用いて調製することができる。この膜は分子量カットオフが１Ｍｄａより大きく、タンパク質および栄養がカプセル内外を自由に通過することができるが、移植細胞と宿主細胞との接触を防止する。

本発明は、本発明による発現カセットまたはベクターをゲノムに組込んだ細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物も提供する。このトランスジェニック動物は完全なトランスジェニック（その総ての細胞が外来トランスジーンを有する）あるいはモザイク（外来トランスジーンが全部ではないが一定の比率で存在する）であることができる。このトランスジェニック動物は非ヒト哺乳類であり、更に具体的には齧歯類であり、最も好ましくはマウスである。通常は、トランスジェニック動物は、本発明の発現カセットまたはベクター（好ましくは、線形化）を投与した卵の発生によって得られる。トランスジェニック動物を生成する手法は当該技術分野では通常のものである（例えば、Jaenisch et al., 1988, Science 240, 1468-1474およびCapechi et al., 1989, Science 244, 1288-1292）。

本発明は、組成物、更に具体的には医薬組成物であって、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核生物宿主細胞と薬学上許容可能なビヒクルを含んでなる組成物も提供する。特別な場合には、組成物は２個維持用の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核生物宿主細胞を含んでなり、（ｉ）制御配列および／または（ii）目的とする遺伝子および／または（iii）ベクター主鎖の性状が異なることがある。

本発明による組成物は、全身、局所および局在化投与（例えば、局所、エアゾール、点滴、経口）などの様々な投与様式について通常の方法で製造することができる。全身投与には、例えば、皮下、皮内、筋肉内、滋養脈内、腹腔内、髄腔内、心臓内（経心臓内および心臓周囲など）、腫瘍内、肺内、鼻内、気管内、脈管内、動脈内、冠状動脈内、または脳室内などの注射が好ましい。筋肉内注射が、好ましい投与様式である。投与は、単回投与または一定時間間隔の後１または数回の反復投与を行うことができる。適当な投与経路および投薬量は、例えば、治療を行う症状または疾患、これが進行している段階、予防または治療の必要性、および導入を行う治療遺伝子などの様々なパラメーターによって変化することができる。一つの目安として、ウイルス粒子を基剤とする組成物は、１０^４〜１０^１４ｉｕ（感染性単位）、有利には１０^５〜１０^１３ｉｕ、好ましくは１０^６〜１０^１２ｉｕの用量形態で処方することができる。力価は、通常の手法によって決定することができる。ＤＮＡベクターの用量は、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇである。本発明の組成物は、固形物（例えば、粉末、凍結乾燥形態）、液体（例えば、水溶液）など様々な形態であることができる。

更に、本発明の組成物は、上記発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核生物宿主細胞をヒトまたは動物体に送達するための薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなることもできる。このキャリヤーは、好ましくは用いられる投薬量および濃度ではヒトまたは動物生体に毒性がない薬学上適合性の注射用キャリヤーまたは希釈剤である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬化学（Remington's Pharmaceutical Sciences）第１６版」， 1980, Mack Publishing Coを参照されたい）。これは、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるようにイオン強度が比較的低い。更に、これは、滅菌し発熱物質不含水、分散媒、コーティング物質など、または希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、乳化剤、可溶化剤またはアジュバントを含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤーである任意の関連溶媒を含むことができる。医薬製剤のｐＨは、適当に調整し且つ緩衝し、ヒトまたは動物での使用に適当であるようにする。注射用組成物のキャリヤーまたは希釈剤の典型例としては、水、等張食塩溶液であって好ましくは生理学的ｐＨで緩衝したもの（例えば、リン酸緩衝食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ヒト血清アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質を含むまたは含まないマンニトール、デキストロース、グリセロール）が挙げられる。例えば、このような希釈剤は、１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５４ｍｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５を含んでなることがある。

更に、本発明による組成物は、ヒトまたは動物体内でその分解を保存しおよび／または宿主細胞への摂取を改良することができる１以上の「安定化」添加剤を含むことができる。このような添加剤は単独でまたは組み合わせて用いることができ、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３号明細書に記載のように、宿主細胞の細胞外マトリックスを不安定化させると考えられる）、クロロキニン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル Ｌ−２−ピロリドンまたはそれらの誘導体のようなプロトン性化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル（欧州特許第８９０ ３６２号明細書参照）のような非プロトン性化合物、サイトカイン、特にインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）（ＰＣＴ／ＥＰ／９９ ０３０８２号明細書）、アクチンＧのようなヌクレアーゼ阻害剤（ＷＯ９９／５６７８４号明細書）、およびマグネシウム（Ｍｇ^２＋）（欧州特許第９９８９４５号明細書）およびリチウム（Ｌｉ^＋）（欧州特許第９９ ４０ ３３１０．８号明細書）、およびそれらの誘導体のいずれかが挙げられる。本発明の組成物におけるカチオン性塩の量は、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲であり、更に一層好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し且つ細胞へのＤＮＡの取り込みを増進することができる。組成物（特に、脂質と錯体形成したＤＮＡベクターを基剤とする組成物）とアデノウイルス粒子またはタンパク質との混合物は、本発明に関して目的とする遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に向上させると考えることができる（Curiel et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247-252）。また、ポリリシンとラクトースのゲル錯体（Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871-878）またはポロキサマー４０７（Pastore, 1994, Circulation 90, 1-517）のような動脈細胞への遺伝子導入を促進し易い物質を用いることもできる。

本発明の組成物は、特に、虚血性疾患（末梢、下肢、心虚血、および狭心症）、動脈硬化症、高血圧、アテローム発生、内膜過形成、血管形成またはステント配置後の（再）再狭窄、腫瘍性疾患（例えば、腫瘍および腫瘍転移）、良性腫瘍、結合組織障害（例えば、慢性関節リウマチ）、眼の血管由来疾患（例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障）、循環器疾患（心筋梗塞）、脳血管疾患、糖尿病関連疾患、免疫異常（例えば、慢性炎症または自己免疫）、神経変性疾患、パーキンソン病、および遺伝病（ベッカー型およびデュシェンヌ型のような筋ジストロフィー、硬化症）などこれらに限定されない筋肉、血管（好ましくは、動脈）および／または循環器系に関連した異常、症状または疾患の予防または治療を目的とするものである。もう一つの応用は、血流に分泌される遺伝子産物を伴う疾患についてイン・ビボ発現系として筋肉を用いて、タンパク質欠損（例えば、適当な凝固因子を発現することによる血友病、リソソーム蓄積症、貧血）を回復することである。

本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核生物宿主細胞を用いる遺伝子療法によるヒトまたは動物生体の疾患の治療または予防のための薬剤の調製も提供する。

本発明の範囲内では、「遺伝子療法」とは、任意の発現可能な配列を細胞へ導入する方法と理解すべきである。従って、これは、潜在的に抗原性エピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性または両方であることができる免疫応答を誘発することに関する免疫療法も包含する。

好ましい態様では、このような使用は、上記した疾患のいずれか、更に詳細には筋肉に影響を及ぼす疾患、特に筋ジストロフィーの治療または予防に適している。この目的について、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子は、この病理学に適合した特異的な送達手段によってヒトまたは動物生体にイン・ビボで送達することができる。これに関連して、直接的筋肉内注射または電気穿孔によって操作することができる（Aihara et al,1998, Nature Biotech., 16, 867-870）。

あるいは、本発明による発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を含むようにエクス・ビボで遺伝子工学処理を行った真核生物宿主細胞を用いることができる。このような要素を真核生物細胞に導入する方法は当業者に周知であり、微量のＤＮＡの細胞の核への微量注入（Capechi et al., 1980, Cell 22, 479-488）、ＣａＰＯ_４によるトランスフェクション（Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752）、電気穿孔（Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326）、リポフェクション／リポソーム融合（Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417）および粒子衝撃（Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572）が挙げられる。遺伝子工学処理を行ったまたはカプセル化した筋細胞は、本発明に関して移植することもできる（Lynch et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1138-1142）。

本発明はまた、ヒトまたは動物体に、治療上有効量の、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核細胞を投与することを含んでなる、ヒトまたは動物体の治療方法にも関する。

「治療上有効量」とは、治療が望まれる疾患または症状に通常伴う１以上の症状を緩解するのに十分な容量である。予防的使用に関するときには、この用語は、疾患または症状の発症を防止しまたは遅延させるのに十分な容量を意味する。

本発明の方法は、上記の疾患または症状に関して呼ぼう目的でまたは治療応用で用いることができる。本発明の方法は様々な方法のいずれによっても行うことができることを理解すべきである。この目的について、本発明の発現カセット、ベクターまたは組成物を、任意の従来のおよび生理学的に許容可能な投与経路によって、例えば、筋肉内注射または電気穿孔によって、またはカテーテル、ステントなどのようなこの投与経路に適合した特異的送達手段を用いる血管内投与によってイン・ビボで直接投与することができる（Riessen et al., 1993, Hum Gene Ther. 4, 749- 758; Feldman and Steg, 1996, Medecine/Science 12, 47-55）。あるいは、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を細胞に導入し、トランスフェクション／感染細胞をイン・ビトロで増殖させ、次に、最終的に適当な膜にカプセル化した後に、治療を行う患者にそれらを再導入することからなるエクス・ビボ法を採用することもできる。

疾患または症状の予防または治療は、本発明の方法を単独で用いて、または所望ならば、現在利用可能な方法（例えば、放射線療法、化学療法、および血管形成のような手術法）と共に用いて行うことができる。例えば、本発明による方法は、注射と血管の透過性の増加を組み合わせることによって改良することができる。特に好ましい態様では、上記の増加は、静水圧を増加させることによって（すなわち、流出量および／または流入量をふさぐことにより）、浸透圧を増加させることによって（すなわち、高張溶液を用いて）、および／または生物活性分子を導入することによって（すなわち、ヒスタミンを投与した組成物に；ＷＯ９８／５８５４２号明細書）得られる。もう一つの態様では、患者に筋肉の変性を促進する物質を投与して、治療の効力を向上させることもできる。更に、トランスフェクション速度を改良するために、患者はマクロファージ枯渇治療を行った後、本発明の組成物を投与することができる。このような手法は、文献に記載されている（例えば、Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184）。

本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子を用いる骨格筋細胞での目的とする遺伝子の特異的発現も提供する。意外なことには、潜在的に免疫原性の遺伝子産物を発現する本発明のベクターを免疫担当マウスに筋肉内投与することにより、遺伝子産物の持続性が著しく向上することを見いだした。このような改良は、遺伝子産物および／またはトランスフェクションした筋繊維に対する宿主免疫応答、特に細胞性免疫応答の減少によるものと考えられる。結果として、本発明は、治療した宿主中に著しい免疫反応を誘発する危険性を減少することによって宿主生物に対して治療効果を持続し且つ多数回の投与を回避することができる。本発明は、１回で投与される発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、真核生物宿主細胞または組成物の用量を減少させることもできる。

本発明を例示的に記載してきたが、用いられてきた用語は制限よりもむしろ記載する用語の性質を表そうとするものであることを理解すべきである。本発明の多くの修飾および変更は、上記教示の観点から可能であることは明らかである。従って、特許請求の範囲内において、本発明は本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で実施することができることを理解すべきである。

特許明細書、公表文献およびデータベースの記載事項の上記で引用した総ての開示内容は、それらの個々の特許明細書、公表文献または記載事項がその開示の一部として本明細書に引用されるように具体的且つ個別的に記述されたのと同程度に、その開示の一部として本明細書に引用されている。

下記の実施例により、本発明を説明する。

標準的クローニング法（Sambrook et al., 2001,「分子クローニング： 実験室便覧（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」， Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク）を用いて、下記のベクター生成させた。相同的組換えは、Oliner etal, 1993, Nucl. Acids Res. 21, 5192-5197に記載されている通りにE.coli JC5176株（Capaldo-Kimball and Barbour, 1971, J. Bact. 106, 204-212）で行った。動物研究については、８週齢の雌Ｂａｌｂ／ＣをＩＦＦＡ−ＣＲＥＤＯ（L'Arbreles，仏国）から購入した。筋肉内投与には、指定量に対応する容量のベクターを０．９％ ＮａＣｌで希釈し、それぞれのマウスが２５μｌの最終容量でＤＮＡ用量を投与されるようにした。動物を指定した時間に屠殺し、筋を取り出し、ルシフェラーゼ分析のための分析まで液体窒素で凍結した。細胞は、標準的手続きまたは製造御者の推奨法に従って培養する。

例１： 発現ベクターの構築
コントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（図１；Meyer et al., 2000, Gene Ther., 7, 1606-1611）は、完全ＩＥ１ ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するｐＲＥＰ４を基にしたプラスミドである。ルシフェラーゼ発現カセットは、ルシフェラーゼコード領域の上流に位置したハイブリッド１６Ｓ／１９Ｓ ＳＶ４０イントロン（Okayma and Berg, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 280-289）と下流に位置したＳＶ４０ポリＡも含む。デスミン配列をコスミドＭＡ２８１から単離したが、ヒトデスミン遺伝子の５’フランキング配列を含んでなる任意の従来技術によるポリヌクレオチドも適当である（例えば、Raguz et al., 1998, Developmental Biology 201, 26-42）。例えば、ＭＡ２８１は約４０ｋｂのヒトデスミン配列（転写開始部位の上流の５’フランキング領域の２５ｋｂ、コード領域および３’フランキング領域）。いわゆる５’デスミン領域は、−１８６６２位から−１７８５位までで構成されるデスミン配列に及んでいる。エンハンサーは−５３７位から−１７８４位に位置し、プロモーターは−５３６位から転写開始部位（＋１）まで伸びており、非コードエキソン配列は＋２位から＋６０位まで伸びている。

完全デスミン５’フランキング配列（５’デスミン領域、エンハンサー、プロモーターおよびエキソン配列を含む）を、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの代わりにｐＴＧ１１２３６に挿入した。ＩＥ１ ＣＭＶプロモーターに及ぶｐＴＧ１１２３６のＡｃｌＩ−ＫｐｎＩ断片を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１３４３４（配列番号２）およびＯＴＧ１３４３５（配列番号３）から構成される合成断片に変えた。この断片は、ＰｖｕＩＩ制限部位によって隔てられたデスミン５’領域の５’配列（−１８６６２，−１８６４０）に相同性の３０ｐｂとデスミンプロモーターの３’配列（＋３１，＋６０）に相同性の３０ｐｂを含むので、相同性組換えによるデスミン５’領域をクローニングすることができた。生成するプラスミドをＰｖｕＩＩによって線形化した後、ＭＡ２８１コスミドをＳａｌＩによって開裂することによって得た約２２ｋｂの断片を用いて、デスミン配列を相同性組換えによってクローニングした。生成するプラスミドｐＴＧ１４８４３（図２）において、ルシフェラーゼ遺伝子を、５’デスミン領域（−１８６６２位〜−１７８５位）、エンハンサー（−１７８４位〜−５３８位）、プロモーター、およびヒトデスミン遺伝子のエキソン配列の短い伸び（−５３７位〜＋６０位）を含むヌクレオチド−１８６６２から＋６０まで伸びているデスミン配列によって制御する。

デスミン５’領域およびエンハンサーを、最小ＩＥ１ ＣＭＶプロモーター（−１１９，＋７）で結合した。ＩＥ１ ＣＭＶエンハンサーをユニークＢａｎＩ部位を含むｐＴＧ１１０２２（Braun et al, 2000, Gene Ther. 7, 1447-1457）からＡｃｌＩ−ＢａｎＩによる消化によって欠失し、この断片をオリゴヌクレオチドＯＴＧ１３４４１（配列番号４）およびＯＴＧ１３５５３（配列番号５）から構成される合成断片に代えた。この断片は、ＰｖｕＩＩ制限部位によって隔てられたデスミン５’領域の５’配列（−１８６６２，−１８６４０）に相同性の３０ｐｂとデスミンエンハンサーの３’配列（−５６５，−５３７）に相同性の３０ｐｂを含むので、相同性組換えによるデスミン配列をクローニングすることができた。生成するプラスミドをＡｃｌＩ−ＳａｃＩによって開裂し、この断片をプラスミドｐＴＧ１１２３６のＡｃｌＩ／ＳａｃＩ部位に挿入してｐＴＧ１４８３９を生じた。このプラスミドをＰｖｕＩＩによって線形化した後、ＭＡ２８１コスミドをＳａｌＩによって開裂することによって得た約２２ｋｂの断片を用いて、デスミン５’領域とエンハンサーを相同性組換えによってクローニングした。生成するプラスミドｐＴＧ１４８４０（図２）において、ルシフェラーゼ遺伝子を、ヌクレオチド−１８６６２から＋６０まで伸びているデスミン配列に続いて最小ＣＭＶプロモーターによって制御する。

デスミン５’領域とエンハンサーも、完全ＩＥ１ ＣＭＶプロモーター（−７５０，＋７）で結合した。オリゴヌクレオチドＯＴＧ１３６７２（配列番号６）とＯＴＧ１３６７３（配列番号７）から構成される合成断片を、ＡｃｌＩによって線形化したｐＴＧ１１２３６においてクローニングした。この断片は、ＰｖｕII制限部位によって隔てられたデスミン５’領域の５’配列（−１８６６２，−１８６４０）に相同性の３０ｐｂとデスミンエンハンサーの３’配列（−５６５，−５３７）に相同性の３０ｐｂを含むので、相同性組換えによるデスミン配列をクローニングすることができた。この生成するプラスミドをＰｖｕＩＩによって線形化した後、デスミン断片（ｐＴＧ１４８４３をＦｓｐＩとＮｈｅＩで開裂することによって得た）を用いてデスミン５’領域とエンハンサーを相同性組換えによってクローニングした。生成するプラスミドにおいて、ｐＴＧ１４８６３（図２）はヌクレオチド−１８６６２から−５３８まで伸びているデスミン配列に続いて最小ＣＭＶプロモーターを有している。

ｐＴＧ１４９５２（図２）は、デスミンエンハンサーとプロモーター（−１７８４位〜＋６０位）の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するコントロールプラスミドである。この目的に対して、ｐＴＧ１４８４３をＸｈｏＩで開裂し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、ＳｐｈＩで消化して、約１．８ｋｂ断片（デスミンエンハンサー／プロモーター、１６Ｓ／１９Ｓイントロンおよびルシフェラーゼ遺伝子の初期段階を有する）を得て、これをＡｃｌＩで開裂し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、ＳｐｈＩで消化したｐＴＧ１１２３６に挿入した。

５’デスミン領域の２個の切りつめ体（truncated version）も構築した。第一のもの（ａ体）は、５’デスミン領域の２．４ｋｂ上流の欠失と６．８ｋｂ下流の欠失を含んでなる。５’デスミン領域をＮｏｔＩとＳｐｅＩで制限することによってｐＴＧ１４８４３から取り出し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１４０４６（配列番号８）とＯＴＧ１４０４７（配列番号９）から構成される合成断片に置き換えた。この断片はデスミン５’領域の５’配列（−１６３０４，−１６２４７）に相同性の６０ｐｂを含んでいた。生成するプラスミドをＳｐｅＩで線形化した後、プラスミドＭＡ５９０（ヌクレオチド−１６３０４から＋６０まで伸びており、ヌクレオチド−８５９５から−１７８５までの内部欠失を有する５’デスミン領域を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）をＸｈｏＩおよびＮａｅＩで開裂することによって得た９．５ｋｂ断片を用いて、切りつめた５’デスミン領域を相同性組換えによってクローニングし、ｐＴＧ１５２９８（図２）を得た。このプラスミドは、切りつめた５’デスミン領域（−１６３０４位から−８５９６位まで伸びており、デスミンエンハンサーおよびプロモーター（−１７８４〜＋６０）と結合した５’Ｄｅｓ＊ａを含んでいる。

第二の切りつめ体（ｂ体）は、５’デスミン領域の７．５ｋｂ上流の欠失に対応する。この目的のため、ｐＴＧ１４８４３をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、ＮｄｅＩで消化した。この領域を、ｐＴＧ１４８４３をＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＮｄｅＩで消化することによって生成した断片で置き換えた。生成するプラスミドｐＴＧ１５４２９（図２）は、切りつめた５’デスミン領域（−１１０９３位から−１７８４位まで伸びている５’Ｄｅｓ＊ｂ）に続いてデスミンエンハンサーとプロモーター（−１７８４〜＋６０）を含んでいる。

例II： イン・ビトロ評価（トランスフェクション研究）
例Ｉの様々な構築物の機能性を、マウス筋細胞系Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）でトランスフェクション分析法によって試験した。５ｘ１０^３個の細胞をプラスミドＤＮＡ ６０ｎｇを用いてリン酸カルシウム沈殿によってトランスフェクションし、ルシフェラーゼの量をトランスフェクションから１、３および４日後（４日目は分化から生じる筋管の出現に対応する）に定量した。図３に示すように、２４時間後には、それぞれｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４８６３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＣＭＶ）であるＣＭＶエンハンサーを有するプラスミドでは、２４時間後には高レベルの発現が得られたが、それぞれｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）、ｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）であるデスミンエンハンサーを含むプラスミドでは、発現レベルは１〜２ ｌｏｇ低かった。これらの結果は、目的とする遺伝子の発現を制御する最強の転写領域の一つとしてＣＭＶエンハンサーを報告している文献データと一致する。しかしながら、４日後には、発現は、ＣＭＶエンハンサー（デスミン５’領域があるまたはない）を有する総てのプラスミドで２〜３ ｌｏｇだけ減少した。対照的に、デスミンエンハンサーを有するプラスミドでは、発現は保持され、または増加さえ見られた。一見したところでは、どのようなエンハンサーが用いられたとしても５’デスミン領域の存在または非存在下で同様な発現レベルが得られたので、デスミン５’領域は発現に関して重要な役割を果たしていないと思われる。しかしながら、デスミン５’領域を有するプラスミドは４倍大きく、培養細胞についてトランスフェクションしたＤＮＡを少数生じ、より少数のプラスミドが関わっているので、デスミン５’領域の正の効果が起こりえることを示している点に留意すべきである。

トランスフェクション分析は、一次ヒト筋細胞でも行った。これらの細胞はBraun et al.が記載した方法で得て、調製した（1999, FEBS Lett. 454, 277-282）。５ｘ１０^３個の細胞をＤＮＡ ５００ｎｇを用いてリン酸カルシウム沈殿によってトランスフェクションし、ルシフェラーゼ産生を１および６日後に測定した。この種の細胞がトランスフェクション後には比較的「脆弱」であると思われるため、筋管の分化は６日後にはあまり効率的ではないことに留意すべきである。結果は、Ｃ２Ｃ１２細胞で得た結果と全く同様であった。発現レベルはデスミンエンハンサーを有するプラスミドではＤ１−Ｄ６の間は増加したが、ＣＭＶエンハンサーを有するプラスミドでは減少が観測された。この減少は、Ｃ２Ｃ１２細胞（最大１０倍）より著しくなかった。

例Ｉの様々な構築物によって提供される発現の特異性を、筋肉以外のＡ５４９細胞系（ヒト肺上皮細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８５）でトランスフェクション分析法によって評価した。１ｘ１０^４個の細胞を６０ｎｇのＤＮＡを用いてトランスフェクションし、ルシフェラーゼの量を１および４日後に定量した。デスミンエンハンサー（デスミン５’領域のあるまたはない）を有するプラスミドでは、ルシフェラーゼ産生は検出されず、これらの制御配列についての筋細胞特異性を示していた。対照的に且つ予想されたように、ＣＭＶエンハンサーを有する構築物ｐＴＧ１１２３６およびｐＴＧ１４８６３はＡ５４９細胞で発現された。

例III： 免疫担当および免疫欠損マウスでのルシフェラーゼ遺伝子産物の持続性
ルシフェラーゼ産生を、免疫担当（Ｂ６／ＳＪＬ）および免疫欠損（ＣＢ１７／ＳＣＩＤ）マウス（それぞれ、図４Ａおよび４Ｂ）の両方で筋肉内注射の後１ヶ月間評価した。プラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）、ｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）２ｘ２５μｇを、右および左前頸骨筋に投与した。図４に示されるように、ｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）を投与された免疫担当マウスでは、７日目から３４日目までに活性の２−ｌｏｇ減少が見られ、ＳＣＩＤマウスでの実験では同等なルシフェラーゼレベルが見られた。免疫担当マウスでのルシフェラーゼ活性の実測減少は、ルシフェラーゼポリペプチドまたは発現する筋繊維に対する細胞傷害性免疫応答から生じるものと思われる。

ｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）の投与から７日後に得られたルシフェラーゼレベルは、ｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）で得られた結果と比較して１００分の１であった。しかしながら、遺伝子産物の持続性は、免疫担当マウス並びに免疫欠損マウスで得られた。デスミン５’領域に連結したデスミンエンハンサーを有するこれらのプラスミドの投与後に観察された遺伝子産物の持続性は、おそらく治療を行った宿主における免疫応答の減少によるものと思われる。

例IV： 様々なデスミン構築物による遺伝子産物持続性の比較
例IIIの実験を、５’デスミン領域を含むプラスミドの総てで再現した。プラスミドを免疫担当Ｂ６／ＳＪＬマウス（２ｘ２５μｇ，右および左脛骨筋）に投与し、筋を集めて７および３５日後のルシフェラーゼ産生について分析した。結果を図５に示す。７日後には、ルシフェラーゼレベルは、デスミンエンハンサー（ｐＴＧ１４８４０、ｐＴＧ１４８４３およびｐＴＧ１４９５２）を含むプラスミドを投与したマウスと比較してＣＭＶエンハンサー（ｐＴＧ１１２３６、ｐＴＧ１４８６３）を有するプラスミドを投与されたマウスでは１０−１００倍高かった。これらの結果はイン・ビトロデータと一致せず、これは分化した筋細胞（感染から９６時間後）では筋特異的プロモーターでは一層高い発現を示した。３５日後には、培養筋細胞で観察されたように、ＣＭＶエンハンサーを含むプラスミドを投与したマウスではルシフェラーゼレベルは１０−１００分の１に減少し、デスミン５’領域の存在はこれに関して効果を示さない。しかしながら、ルシフェラーゼ産生が減少しないことは、デスミンエンハンサーに結合したデスミン５’領域を有するプラスミドを用いて明らかにされた。デスミンエンハンサーの存在のみでは、この効果を有するのに十分ではないと思われた（ｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）対ｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）を参照されたい）。

要するに、予想されるように、Ｄ７での発現の初期レベルは、筋特異的プロモーターを有するプラスミドではＣＭＶエンハンサー／プロモーターを有するプラスミドと比較して低かった。しかしながら、後者の場合には、遺伝子産物レベルは時間と共に減少した。著しく対照的に、５’デスミン領域に結合したデスミンエンハンサーを有するプラスミドで得たルシフェラーゼレベルは、実験の初期段階では低かったが時間と共に維持されまたは増加さえし、１ヶ月（３５日）後には、ルシフェラーゼの産生は、これらのプラスミドによって行ったときには、ＣＭＶ配列を有するプラスミドで行ったときより高い。これらのプラスミドで見られたルシフェラーゼの持続性を、抗原（ルシフェラーゼ）が低レベルであることによる免疫応答の減少に関連させることは、除外することができなかった。

例Ｖ： ＣＭＶエンハンサーおよびデスミンエンハンサーから誘導したプラスミドを用いる用量−応答実験
用量−効果分析を行って、ＣＭＶまたはデスミンエンハンサーを有するプラスミドについてルシフェラーゼの初期レベルが同じである条件を見いだした。免疫担当Ｂ６／ＳＪＬマウスの右および左脛骨筋に、６段階の異なる量のプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）またはｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）（５０、２５、１０、３、１または０．３μｇ）を投与した。７日後、筋肉を集めて、ルシフェラーゼ産生について分析を行った。ルシフェラーゼは、０．３μｇ程度のＤＮＡ量を筋肉内等予後に検出することができる。予想されるように、産生は投与したＤＮＡの量と共に増加し、最大活性はプラスミド１０μｇの投与後に得られる。同様なルシフェラーゼレベルは、投与したＤＮＡの量を増加することによって得られる（２５または５０μｇ）。匹敵するルシフェラーゼのレベル（約１０^７ＲＬＵ／ｍｇ）は、デスミンを含むプラスミド（ｐＴＧ１４８４３） １０μｇおよびＣＭＶエンハンサーを含むエンハンサー（ｐＴＧ１１２３６）０．３−１μｇを用いて得ることができた。

例VI： 免疫担当マウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子産物の追跡
Ｂ６／ＳＪＬマウスにデスミンエンハンサー由来のプラスミド（ｐＴＧ１４８４０、ｐＴＧ１４８４３およびｐＴＧ１４９５２）１０もしくは２５μｇ、およびＣＭＶエンハンサー由来のプラスミド（ｐＴＧ１１２３６）０．３もしくは１μｇを投与した。ｐＴＧ１１２３６の場合には、コントロールエンプティプラスミド（ｐＴＧ１１０１８）を加えて、ＤＮＡ総量１０μｇを投与した。７日後、図６に示されるように、同様なレベルのルシフェラーゼ（約１０^７ＲＬＵ／ｍｇ）を１０μｇのｐＴＧ１４８４０、ｐＴＧ１４８４３およびｐＴＧ１４８５２、および０．３μｇのｐＴＧ１１２３６で得た。３５日後、どのようなＤＮＡ用量を用いても、遺伝子産物レベルの減少（５０〜１００分の１）がｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）で見られた。遺伝子産物レベルの同様な減少はデスミンエンハンサー／プロモーターを含むプラスミド（ｐＴＧ１４９５２、ｅ−ｐＤｅｓ）で見られたが、遺伝子産物持続性はデスミンエンハンサーに結合したデスミン５’領域 含むプラスミド（ｐＴＧ１４８４０およびｐＴＧ１４８４３）で得られた。従って、デスミン５’領域とデスミンエンハンサーの結合が、ルシフェラーゼの持続的レベルを得るのに必要であると思われる。

例VII： ５’デスミン領域の切りつめ体の評価
Ｂ６／ＳＪＬマウスに、完全な５’デスミン領域を含むプラスミドｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＤｅｓ）、または切りつめ体である、それぞれｐＴＧ１５２９８（５’Ｄｅｓ−１６３０４，−８５９６／ｅ−ｐＤｅｓ）およびｐＴＧ１５４２９（５’Ｄｅｓ−１１０９３，−１７８５／ｅ−ｐＤｅｓ）、またはコントロールｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）２５μｇを投与した。ルシフェラーゼレベルは、図７に示されるように、どのようなプラスミドを投与しても７日後には同様であった。しかしながら、２８日後には、プラスミドｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）でルシフェラーゼ産生の減少が見られたが、完全または切りつめた５’デスミン領域を含む他のプラスミドでは遺伝子産物の持続性が得られた。従って、−１６３０４位から−８５９６位まで、または−１１０９３位から−１８７５位まで伸びているデスミン領域は、結合した遺伝子配列に発現の持続性を付与するのに十分である。

例VIII： 治療遺伝子の発現
プラスミドｐＴＧ１５２９８を修飾して、レポータールシフェラーゼ遺伝子をジストロフィン遺伝子に置き換えた。３個のプラスミドであって、いずれも切りつめた５’デスミン領域（−１６３０４〜−８５９６）に続いて、ネズミジストロフィン遺伝子の発現を行うデスミンエンハンサーおよびプロモーター（−１７８４ ｔｏ ＋６０）（Lee et al., 1991, Nature 349, 34-36）、イヌジストロフィン遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０７０４８５）またはネズミミニジストロフィン遺伝子（Clemens et al., 1995, Human Gene Ther. 6, 1477-1485）を含むものを構築して、それぞれｐＴＧ１５８０６、ｐＴＧ１５８０７およびｐＴＧ１５８０８を得た。これらの異なる構築物から産生されたジストロフィンの発現を、Ｃ２Ｃ１２細胞系で検討した。Ｃ２Ｃ１２細胞系は、ジストロフィン産生を欠損している。これはＣ３Ｈマウス筋芽細胞に由来し、細胞がコンフルエンスに達した後に筋管で分化する。

ジストロフィン発現プラスミドでトランスフェクションを行う約２４時間前に、５ｘ１０^４個のＣ２Ｃ１２細胞を３５ｃｍペトリ皿に接種し、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭグルタミンを補足したＤｕｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ ３ｇ／ｌグルコース）で増殖した。培地をトランスフェクションの３時間前に交換し、リン酸カルシウム共沈をＴＥ−ＣａＣｌ_２緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ ｐＨ７．５，ＥＤＴＡ ０．０５ｍＭ，ＣａＣｌ_２ ２５０ｍＭ）１００μｌで希釈したプラスミドｐＴＧ１５８０６、ｐＴＧ１５８０７またはｐＴＧ１５８０８ １０もしくは２５μｇで行い、ＨＢＳ ２Ｘ緩衝液（ＮａＣｌ ２８０ｍＭ，Ｈｅｐｅｓ ５０ｍＭ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １．５Ｍ）１容に沈殿させた。１６時間インキュベーションした後、トランスフェクション細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、培養物をＤＭＥＭ培地に４８時間または１週間保持した。プラスミド１０μｇでトランスフェクションした細胞培養物をトランスフェクションの４８時間後にＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、−２０℃でメタノール／アセトン１：１で１０分間固定した。プラスミド２５μｇでトランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ中で１週間培養して、筋管形成を得た後、同じ技術的プロトコールに従ってメタノール／アセトンで固定した。ペトリ皿は、更に使用まで−２０℃で保管した。

ジストロフィンタンパク質の検出は、再水和細胞培養物で、ネズミ（ミニ）ジストロフィン（Mandra 1；Sigma）またはイヌジストロフィン（Mandys 8；Sigma）に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫蛍光染色法に続いて抗マウスＩｇＧ抗体および抗ウサギＩｇＧ抗体にフルオレセインを標識したものを添加することによって行った。

いずれの場合にも、ジストロフィン産生は筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞（４８時間培養）ではきわめて弱い。著しく対照的に、蛍光は筋管で重要であり（１週間培養）、デスミン５’領域によって制御されるときにはジストロフィン発現の持続性を示している。

ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、デスミンエンハンサー／プロモーターおよび完全または切りつめた５’デスミン領域によって行われるジストロフィンの発現も、対応するジストロフィン発現プラスミドを免疫担当ジストロフィン欠損ｍｄｘ^５ｃｖマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｒｏｓ−ＤＭＤ^{ｍｄｘ−５ｃｖ}株）に炎症が最大となる条件で、すなわちノテキシン（ｎｏｔｅｘｉｎ）前処理および反復投与下で筋肉内投与した後、イン・ビボで評価した。実験は、プラスミドを最初に投与する３日前にノテキシン（Ｓｉｇｍａ）３ｎｇを筋肉内投与した６−８週齢の動物で行った。次に、ｍｄｘ^５ｃｖマウスに、ｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐ ＣＭＶ）、ｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）またはｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ ｅ−ｐ Ｄｅｓ）２５μｇを食塩水２５μｌで希釈したものを、右および左頸側部に経皮筋肉内単回投与によって投与した。次に、投与を行ったマウスに、最初の投与から３週間後に同量のジストロフィン発現プラスミドを再投与した。マウスを、プラスミド投与の１週間後または６週間後に屠殺した。筋肉を採取して、ＯＣＴ化合物（Labonord,Templemars；仏国）に埋設し、液体窒素で冷却したイソペンタンで凍結し、−８０℃で保管した。免疫組織化学的染色は、２５０μｍ毎に採取した５μｍ断片について筋肉全体にわたるように行った。総てのインキュベーションは室温で行った後、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。切片をメタノール／アセトン（ｖ／ｖ）で１０分間固定し、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間ブロックした。次に、それらを、１：２５０に希釈した抗ジストロフィンモノクローナル抗体（MANDRA1,Sigma）で１．５時間、１：５００に希釈したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ Ｆ（ａｂ）_２断片^{ｂｉｏｔｉｎ}（Immlnotech）で３０分間、１：２０００に希釈したストレプトアビジン^ＦＩＴＣ（Caltag Laboratories）で３０分間、いずれもＰＢＳ中でインキュベーションした。次に、スライドをアンチ・ファッディング（anti-fadding）培地Ｍｏｗｉｏｌ（Calbiochem/Novabiochem）に設置し、エピ蛍光顕微鏡（Eclipse 800,Nikon）下で観察した。切片あたりの正の繊維の最大数を、それぞれの筋肉について考察した。

結果として、プラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐ ＣＭＶ）およびｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐ Ｄｅｓ）では、ジストロフィン産生の減少（投与から１週間後と比較して６週間後におけるジストロフィン陽性繊維の数の減少）が見られたが、完全なデスミン領域ｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ ｅ−ｐ Ｄｅｓ）を含むプラスミドでは、遺伝子産物の持続性（投与から１週間および６週間後のジストロフィン陽性繊維が同数）が得られた。

第二シリーズの実験は、切りつめた５’デスミン領域によって行われるネズミジストロフィンの発現を評価する目的で行った。この目的に対して、上記のように、同コピー数の試験およびコントロールプラスミドを、それぞれｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐ ＣＭＶ）２５μｇ、ｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐ Ｄｅｓ）２０．５μｇ、およびｐＴＧ１５２９８（５’Ｄｅｓ＊ａ／ｅ−ｐ Ｄｅｓ）３２．５μｇを用いて、ｍｄｘ^５ｃｖマウスの右および左頸側部に経皮筋肉内単回投与によって投与した。マウスを、投与から１週間または１２週間後に屠殺した。同様に、プラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐ ＣＭＶ）およびｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐ Ｄｅｓ）では、１週間後と比較して１２週間後にはジストロフィン陽性繊維の減少が観察されたが、５’デスミン領域ｐＴＧ１５２９８を含むプラスミドでは、ジストロフィン陽性繊維の数は投与から１週間後と１２週間後とで同等であった。更に、１２週間後に観察されたジストロフィン陽性繊維の数は、５’デスミン領域を欠いた構築体を投与した筋肉におけるよりこのような領域を含む構築体を投与した筋肉においての方が少なくとも同等であり且つ高くさえあった。

更に予想外なことには、投与を行った動物の血清で定量された抗ジストロフィン抗体のレベルも、完全および切りつめた５’デスミン領域を含むジストロフィン発現構築体を投与したマウスで減少した。

これらの結果により、本発明の転写要素が筋ジストロフィーｍｄｘ^５ｃｖマウスにおけるジストロフィン発現のレベルを持続し且つ保持することができることが確認される。

結論として、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を操作する５’デスミン配列は、一過性にトランスフェクションした組織培養細胞で厳密な筋特異的発現を示した。ジストロフィンｃＤＮＡ遺伝子を発現する完全長（キャップ部位の上流の５’配列の１８．６ｋｂ）および切りつめた５’デスミン配列は、トランスフェクションしたネズミ筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞を筋管に融合したときに、高く均一なレベルの制御発現を生じた。ジストロフィン遺伝子を含むプラスミドをジストロフィーｍｄｘ−５ｃｖマウスの前頸骨筋に筋肉内投与したところ、ＣＭＶを基剤とするカセットは７日後には多数のジストロフィー陽性筋原繊維を生じたが、これは１２週間後には抗ジストロフィー免疫応答の出現と平行して５０％だけ減少した。著しく対照的に、完全長または切りつめた５’デスミン配列を含む発現ベクターはＣＭＶで見られるものより陽性の筋原繊維を同数生じるだけでなく、これは実験の１２週間にわたって安定であった。５’デスミンを含む発現ベクターを投与したマウスでは、ジストロフィーに対する免疫応答はほとんどまたは全く見られなかった。

総て一緒に、これらのデータは、ヒトデスミン遺伝子の上流に存在する５’配列が筋細胞型において予想可能な高く且つ持続したレベルの遺伝子発現を行う可能性を有することを支持している。５’Ｄｅｓ配列はヒトデスミン遺伝子（５’Ｄｅｓ）の転写開始部位の１８．６ｋｂ ５’内に位置し、デスミンプロモーターと協力して作用するＣａｐ部位から−１０．２ｋｂ〜−１５．１ｋｂ上流に位置した４個の筋特異的ＤＮアーゼＩ過感作（ＨＳ）部位を含む。

例IX： トランスジェニックマウスでの発現
５’デスミン配列の転写活性を、トランスジェニックマウスで検討した。第一シリーズの実験では、筋特異的ＤＮアーゼＩ ＨＳ部位の総て（転写開始部位の上流のヒトデスミン遺伝子の５’フランキング配列の２２ｋｂを有する２２ＤＥＳ構築体；図８Ａ）を包含するまたは（転写開始部位の上流のヒトデスミン遺伝子の５’フランキング配列の５ｋｂを有する５ＤＥＳ構築体；図８Ａ）を全く包含しない様々な程度の５’フランキング配列を有するデスミン遺伝子に伸びているコスミドクローンを含むマウス経を生成した。様々な筋（骨格脚筋、平滑子宮および膀胱筋、心筋）の型の範囲並びに筋以外の組織の分析は、５ＤＥＳではなく２２ＤＥＳが、総ての筋細胞型における同等なネズミ遺伝子と比較してトランスジーンコピーあたり完全な生理学的レベルでヒトデスミントランスジーンを再現可能に発現することを示した（図８Ｂ）。しかしながら、興味深いことには、５ＤＥＳは心臓で低いが有意なレベルの発現を保持し、このトランスジーン上に存在する５ｋｂ上流領域内に心筋特異的転写調節要素の存在を示唆していた。

第二のシリーズの実験は、ヒトβ−グロビンレポーター遺伝子に連結した様々な程度の５’フランキング配列を有するデスミン配列を含む幾つかのトランスジェニックマウス系を生成することによって行った。１８．６Ｄｅｓβ構築体（図９Ａ）は、−１８．６ｋｂから＋３０ｂｐまで伸びているデスミン配列を含む。１６ＤｅｓβΔＢＸ（図９Ａ）は、（ｐＴＧ１５２９８と同様の）デスミン転写開始部位から−１．７ｋｂで連結したデスミンＨＳ部位を包含する７．７ｋｂ ＸｂａＩ−ＢｇｌII断片を含む。これは、−１．７ｋｂ ＸｈｏＩと−８．６ｋｂ ＢｇｌII部位の間のデスミンの５’フランキング領域内に６．９ｋｂの内部欠失を効果的に生成する。

２２ＤＥＳゲノムコスミドクローンと同様に、１８．６Ｄｅｓβは総ての筋細胞型においてコピー数に比例する高レベルのトランスジーン発現を示した（図９Ｂ，１８．６Ｄｅｓ）。１６ＤｅｓβΔＢＸ構築体は、心臓区画において発現が増進した総ての筋細胞型での高レベルのトランスジーンコピー数依存性発現も保持し（図９Ｂ，１６ＤｅｓβΔＢＸ）、デスミンプロモーターと結合した５’ＤＮアーゼＩ ＨＳ部位を包含する領域が適当な筋特異的転写機能を付与するのに十分であることを示唆していた。更に、１６ＤｅｓβΔＢＸ構築体は、欠失のない１８．６Ｄｅｓ構築体よりトランスジーンコピー当たり高レベルで発現する。

例Ｘ： 機能分析およびｄｅｓＬＣＲの大きさの最小化
１６ＤｅｓβΔＢＸはマウスでは完全に機能性であるので（図９Ｂ、１６ＤｅｓｓβΔＢＸ）、きわめて小さいが完全に機能的な存在を決定するための他の欠失研究の理想的出発点となる。個々のＨＳ部位は、適当な制限酵素を用いて生成したＤＮＡ断片同士の連結および／またはＰＣＲによって除去することができる。この要素を組込む様々な発現ベクターを構築して、上記のようにイン・ビボおよびイン・ビトロの両方で、例えば筋組織培養細胞（例えば、ネズミＣ２Ｃ１２筋芽細胞、ネズミ心筋細胞ＨＬ−１およびヒト血管ＡＵ１細胞）中でのトランスフェクションによって、ネズミの筋肉やトランスジェニックマウスに直接投与して筋特異的遺伝子発現を持続させるための最小限の用件を決定することによって試験することができる。

例XI： 遺伝子療法ベクター
今日までの研究によって、遺伝子療法を用いて筋ジストロフィー（ＤＭＤおよびＬＧＭＤ； Skuk et al., 2002, Curr Opin Neurol. 15, 563-569参照）を治療する可能性、並びに欠けている因子を循環に分泌するための「タンパク質工場」としての筋肉の使用が明らかとなってきた（例えば、血友病におけるＶｌ１Ｉ／ＩＳ因子；Ｈｉｇｈ，２００１，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８８，１３７−１４４を参照されたい）。筋肉への遺伝子送達の目的で最も広く用いられる系は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および裸のプラスミドＤＮＡベクターである。電気浸透化（electropermeabilisation）（McMahon et al., 2001, Gene Ther. 8, 1264-1270; Wells and Wells, 2002, Neuromuscular Disord. 12 Suppl 1: S1-S22）または高動脈圧（Zhang etal., 2001, Hum. Gene Ther. 12, 427-438）によるイン・ビボでの筋肉によるプラスミドベクター摂取の増進により、プラスミドベクターを筋肉へ効率的に送達することができるようになった。更に最近の進歩としては、分裂および非分裂筋細胞の両方においてトランスジーンを組込むことができるレンチウイルス、ＨＩＶを基剤とするベクターが挙げられる（Kafri et al., 1997; Nat. Genet. 17, 314-317 ; Sakoda et al., 1999, J. Mol. Cell Cardio. 31, 2037-2047）。

筋ジストロフィーのような遺伝性疾患の遺伝子療法プロトコール内の転写単位の適当な遺伝子制御は、多くの理由から必要である。しっかりした組織特異的遺伝子発現により、治療タンパク質のエピトープ発現から生じることがある潜在的な毒性効果が回避される。治療タンパク質発現のレベルを正確に制御して、ジストロフィー表現型を生じるＬＧＭＤのマウスモデルでγ−サルコグリカンの過剰発現によって示されたような標的組織内の潜在的な負の効果を回避することも重要である（Zhu et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 21785-21790）。治療用転写単位のしっかりした組織特異的発現によって、専門的抗原提供細胞によるベクターの不注意による取り込みによる発現を回避して、治療タンパク質に対する免疫応答の危険性を最小限にする（Wells & Wells, 2002, Neuromuscular Disord. 12 Suppl 1: S1-S22）。

筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）由来のような古典的プロモーター／エンハンサー要素の使用によって、骨格筋で組織特異的発現を行うことができる（Dai et al., 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10892-10895; Kumar-Singh and Chamberlain, 1996; Hum. Mol. Genet. 5, 913-921; Larochelle et al., 1997, Gene Ther. 5, 465-472）。しかしながら、プロモーター／エンハンサーの組み合わせのみによって組込まれたレトロウイルスおよびレンチウイルストランスジーンは、クロマチン位置効果およびある種の場合には完全なサイレンシングにより発現がきわめて変わりやすくなる（Dai etal., 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10892-10895; Verma and Somia, 1997; Nature 389, 239-242; Chen et al., 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5798-5803; Chen and Townes, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 377-382）。これは、これらの転写調節要素がクロマチンを転写担当配置に改造することができず、治療上非生産的な多くの組込みを生じるためである。

上記の実験データは、５’デスミン制御領域配列が、組織特異的な長時間の遺伝子発現に必要な転写担当オープンクロマチン構造を確立して保持することができることを示唆している。５’デスミン配列によって付与された遺伝子発現の再現性のあるレベルは、バイオテクノロジーの応用にとって効率的な発現ベクターの生成に明確な効用を有する。遺伝子療法ベクターに５’デスミン配列を包含させることは、現在のところ筋特異的治療遺伝子発現の予想可能な持続レベルを得る最も効率的な方法である。この目的について、５’デスミンを基剤とする発現カセットを、ウイルスおよび非ウイルスベクターなどの様々なベクターに組込むことができる。

例えば、ほとんどがＥＢＶまたはＢＰＶＦ由来の成分を基剤とする複製エピソームベクター（ＲＥＶ）は、長期間のトランスジーン持続および発現を達成するための安定な組込みの魅力的な代替法を提供する（Stoll and Calos, 2002, Curr. Opin. Mol. Ther 4, 299-305）。コスミドのＲＥＶ（50kb; Chow et al., 2002, Gene Ther. 9, 327-336）および大きめの（１００ｋｂより大きい； Black and Vos, 2002, Gene Ther. 9,, 1447-1454）サイズを構築し、非ウイルス的手段によって送達し、レトロウイルスベクターで最近観察された挿入による突然変異誘発の問題を回避することができる。５’デスミン配列によって行われる治療上重要な遺伝子を含んでなる発現カセットを構築して、ＥＢＶを基剤とするＲＥＶ ｐ２２０．２に組込むことができる。完全長およびミニジストロフィンｃＤＮＡ遺伝子を組込む構築体を、ヒト血管平滑筋細胞系ＡＵ１、および正常なおよびジストロフィーのヒト筋芽細胞のような多種多様な細胞系でトランスジーン発現並びにエピソーム保持の効率および安定性について評価することができる。

レンチウイルスベクターは、レトロウイルスと比較して治療遺伝子の安定組込みおよび長期間発現について多くの点で有利である。それらは比較的多量（８−９ｋｂ）の遺伝子材料を収容することができ、非分裂細胞を効率的に形質導入し、且つレトロウイルスとは異なり、力価に大きな影響を与えることなく複雑なゲノムを受け入れる（Ailles and Naldini, 2002; Curr. Top. Microbiol. Immunol. 261, 31-52; Galimi and Venna, 2002, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 261, 245-254を参照されたい）。有望な結果は、既にレンチウイルスベクターおよび筋肉への遺伝子送達に関して報告されている（Kafri et al., 1997; Nat. Genet. 17, 314-317; Sakoda et al., 1999, J. Mol. Cell Cardiol. 31, 2037-2047）。しかしながら、総ての組込まれたトランスジーンと同様に、レンチウイルスベクターによって送達されたものはクロマチン位置効果を受け、様々な組込みにおいてきわめて変動しやすい発現レベルを生じやすい（例えば、May et al., 2000, Nature 406, 82-86を参照されたい）。レンチウイルスベクターに５’デスミン要素を包含させると、原則としてこれらの問題が解決される。５’デスミン配列の切りつめ体は、これらの要素から構成される発現カセットのサイズを十分減少させ、レンチウイルスベクター中に収容することができるようにする。ニワトリβ−グロビンＬＣＲ由来のインシュレーター要素（ｃＨＳ４）による５’デスミンを基剤とする発現カセットのフランキングを考慮することも有利である（West etal.,2002, Genes Dev. 16, 271-288を参照されたい）。これによって、レンチウイルス組込みの部位におけるデスミン配列による隣接する遺伝子配列の不注意による活性化をブロックするｃＨＳ４の能力が評価される。ｃＨＳ４要素は、ウイルスベクターＬＴＲ中に容易に収容することができる（Emery et al. 2000, Proc. Natl Acad. Sci USA 97, 9150-9155; Lotti et al., 2002, J. Virol. 76, 3996-4007）。

最後に、アデノウイルスベクターは、（ｉ）きわめて高力価でで製造することができ、（ii）広汎な出発細胞（筋肉など）に高効率で感染することができ、（iii）筋肉に数ヶ月間存在し続けることが分かっているので、筋遺伝子療法の魅力的なオプションである（Chamberlain, 2002; Hum. Mol. Genet. 11, 2355-2362; Skuk et al., 2002, Curr. Opin. Neurol. 15, 563-569を参照されたい）。総てのウイルス遺伝子を欠いている無気力アデノウイルスベクター（ＷＯ９４／２８１５２号明細書参照）は３５ｋｂまでのＤＮＡを収容することができ、従来のＡｄベクターで見られた免疫学的問題点はほとんど誘発しない。無気力アデノウイルスベクターは、完全５’デスミン配列（１８．６Ｄｅｓβ； 図９Ａ）を完全長ジストロフィーｃＤＮＡと共に収容することができるベクターの効力は、筋組織培養細胞、および正常なおよびジストロフィーのｍｄｘマウスで評価することができる。

ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）の転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターｐＴＧ１１２３６の略図。 様々な要素であるＣＭＶプロモーターに対応するｐＣＭＶ（例えば、−１１９位〜＋７位）、ＣＭＶエンハンサーに対応するｅＣＭＶ（例えば、−７５０位〜−１２０位）、ヒトデスミン遺伝子に続いてエキソン性の非コード配列の短い伸張のプロモーターを表すｐＤｅｓ（例えば、−５３７位〜＋６０位）、ヒトデスミン遺伝子のエンハンサーを表すｅＤｅｓ（例えば、−１７８４位〜−５３８位）、ヒトデスミン遺伝子のプロモーター／エンハンサーの上流の５’フランキング領域を表す５’Ｄｅｓ（例えば、−１８６６２位〜−１７８４位）、その第一の切りつめ体を表す５’Ｄｅｓ＊ａ（例えば、−１６３０４位〜−８５９６位）、およびその第二の切りつめ体を表す５’Ｄｅｓ＊ｂ（例えば、−１１０９３位〜−１７８４位）の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現する実施例に記載の構築体の略図。 ５’デスミン領域を含むベクターｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐ Ｄｅｓ）、ｐＴＧ１４８６３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）、コントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）およびｐＴＧ１５００５（ｅＣＭＶ／ｐＤｅｓ）。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を様々なベクターでトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を２４時間、４８時間および９６時間後に測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性として示す。 ５’デスミン領域を含むベクターｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐ−Ｄｅｓ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）、およびコントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）のイン・ビボでの評価。免疫担当（図４ａ）および免疫欠損マウス（図４ｂ）の右および左前頸骨筋に、上記ベクター２ｘ２５μｇを投与した。動物を７日および３５日後に屠殺し、投与を行った筋でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。 ５’デスミン領域を含むベクターｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐ−Ｄｅｓ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）、およびコントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）のイン・ビボでの評価。免疫担当（図４ａ）および免疫欠損マウス（図４ｂ）の右および左前頸骨筋に、上記ベクター２ｘ２５μｇを投与した。動物を７日および３５日後に屠殺し、投与を行った筋でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。 ５’デスミン領域を含むベクターｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐ Ｄｅｓ）、ｐＴＧ１４８６３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）、およびコントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）のイン・ビボでの評価。免疫担当マウスの右および左前頸骨筋に、上記ベクター２ｘ２５μｇを投与した。動物を７日および３５日後に屠殺し、投与を行った筋でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。 ５’デスミン領域を含むベクターｐＴＧ１４８４３（５’Ｄｅｓ／ｅ−ｐ Ｄｅｓ）およびｐＴＧ１４８４０（５’Ｄｅｓ／ｅＤｅｓ／ｐＣＭＶ）、およびコントロールプラスミドｐＴＧ１１２３６（ｅ−ｐＣＭＶ）およびｐＴＧ１４９５２（ｅ−ｐＤｅｓ）のイン・ビボでの評価。免疫担当マウスに、デスミン由来ベクター２ｘ１０μｇまたは２ｘ２５μｇ、およびｐＴＧ１１２３６（エンプティプラスミドｐＴＧ１１０１８を添加、総ＤＮＡ１０μｇを得た）２ｘ０．３または２ｘ１μｇを投与した。動物を７日および３５日後に屠殺し、投与を行った筋でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。 完全な５’デスミン領域備えたプラスミドｐＴＧ１４８４３および５’デスミン領域を欠いているコントロールプラスミドｐＴＧ１４９５２と比較した５’デスミン領域の切りつめ体を含むベクターｐＴＧ１５２９８およびｐＴＧ１５４２９のイン・ビボでの評価。免疫担当マウスの右および左前頸骨筋に、上記ベクター２ｘ２５μｇを投与した。動物を７日および２８日後に屠殺し、投与を行った筋でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。 図８Ａは、５’フランキング配列の２２ｋｂ（２２ＤＥＳ）または５ｋｂ（５ＤＥＳ）を有するヒトデスミン遺伝子（黒色長方形）に及ぶコスミドゲノムクローンを示す。垂直矢印は、筋特異的ＤＮアーゼＩ過感作部位の位置を示す。水平矢印は、転写の方向を示す。 ２２ＤＥＳおよび５ＤＥＳコスミドクローンを用いて、トランスジェニックマウスを生成した。ヒトデスミントランスジーン発現は、筋肉の種類（膀胱、子宮、心臓、骨格脚）の範囲でＳ１ヌクレアーゼ保護分析によって決定した。結果は、トランスジーンコピー数に対する内在性ネズミデスミン遺伝子の比率として表す。括弧内の数字は、所定の系におけるトランスジーンコピー数を表し、Ｆは、系を確立するまで飼育し続けず、従って最初の数として分析した。 図９Ａは、ヒトβ−グロビンレポーター遺伝子に連結したデスミン５’フランキング領域構築体を表す。垂直矢印は、筋特異的ＤＮアーゼＩ過感作部位の位置を示す。水平矢印は、転写の方向を示す。 １８．６ＤＥＳｂおよび１６ＤＥＳｂＤＢＸ構築体を用いて、トランスジェニックマウスを生成した。ヒトトランスジーン発現は、筋肉の種類（膀胱、子宮、心臓、骨格脚）の範囲でＳ１ヌクレアーゼ保護分析によって決定した。結果は、トランスジーンコピー数に対する内在性ネズミデスミン遺伝子の比率として表す。括弧内の数字は、所定の系におけるトランスジーンコピー数を表す。

Claims (33)

1. 少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性であるか、または約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、配列を有する部分を含んでなる核酸断片の使用であって、上記核酸断片に結合した目的とする１以上の遺伝子を発現するトランスフェクション細胞の持続性を向上させるための使用。
2. 核酸断片が、約１のヌクレオチドから出発して約１５４６５のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である、または約１のヌクレオチドから出発して約１５４６５のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である、配列を含んでなる、請求項１に記載の使用。
3. 核酸断片が、約７５６９のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である、または約７５６９のヌクレオチドから出発して約１００６９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の部分の全部または一部と同一であるかまたは相同性である、少なくとも１個の配列を含んでなる、請求項２に記載の使用。
4. 核酸断片が、
   約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わるか、
   約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わるか、または
   約７５６９のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる
   配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 核酸断片が、
   約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わるか、
   約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わるか、または
   約７５６９のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる
   配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列を含んでなる、請求項４に記載の使用。
6. 核酸断片が、宿主細胞または生物で目的とする上記遺伝子を発現させる１以上の制御配列に操作可能に連結している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 制御配列が、哺乳類の核遺伝子から得られるかまたはウイルスプロモーターである、プロモーターを含んでなる、請求項６に記載の使用。
8. プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項７に記載の使用。
9. 筋肉特異的プロモーターがデスミン遺伝子から得られる、請求項８に記載の使用。
10. デスミン遺伝子がヒトデスミン遺伝子である、請求項９に記載の使用。
11. ヒトデスミン遺伝子から得られたプロモーターが、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、配列を有する部分を含んでなる、請求項１０に記載の使用。
12. プロモーターが約１８１２２のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一の配列を含んでなる、請求項１１に記載の使用。
13. 制御配列がエンハンサーを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
14. エンハンサーが哺乳類の核遺伝子から得られるかまたはウイルスエンハンサーである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
15. エンハンサーが筋肉特異的エンハンサーである、請求項１４に記載の使用。
16. 筋肉特異的エンハンサーがデスミン遺伝子から得られる、請求項１５に記載の使用。
17. デスミン遺伝子がヒトデスミン遺伝子である、請求項１６に記載の使用。
18. ヒトデスミン遺伝子から得られたエンハンサーが、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分であって、約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８１２１のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８１２１のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、配列を有する部分を含んでなる、請求項１７に記載の使用。
19. 少なくとも目的とする１個以上の遺伝子を含んでなる宿主細胞または生物中で目的とする遺伝子を発現し、１個以上の制御配列と１個の核酸断片によって制御される発現のための発現カセットであって、
    核酸断片が約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である、または約１のヌクレオチドから出発して約１６８７９のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列に相補的な配列の対応する長さの部分と同一であるかまたは相同性である配列を有する少なくとも１００個の連続したヌクレオチド塩基の部分を含んでなる、発現カセット。
20. 核酸断片が、請求項２〜６のいずれか一項に記載のものである、請求項１９に記載の発現カセット。
21. 制御配列が、請求項７〜１８のいずれか一項に記載のものである、請求項１９または２０に記載の発現カセット。
22. 宿主細胞が筋細胞である、請求項２２に記載の発現カセット。
23. 筋細胞が骨格筋細胞である、請求項２２に記載の発現カセット。
24. 約１のヌクレオチドから出発して約１６６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
    約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わり且つ約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
    約２３５８のヌクレオチドから出発して約１００６７のヌクレオチドで終わり且つ約１６８８０のヌクレオチドから出発して約１８７２２のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、
    約７５６９のヌクレオチドから出発して約１８６６３のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列、または
    約７５６９のヌクレオチドから出発して約１８７２２のヌクレオチドで終わる配列番号１に示された配列と同一であるかまたは相同性である配列
    を少なくとも含んでなる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット。
25. 請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の発現カセットを含んでなる、ベクター。
26. プラスミドベクターである、請求項２５に記載のベクター。
27. 非自己複製型プラスミドベクターである、請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項２５に記載のベクターを含んでなる、ウイルス粒子。
29. 請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２８に記載のウイルス粒子を含んでなる、真核生物宿主細胞。
30. 筋細胞である、請求項２９に記載の真核生物宿主細胞。
31. 筋細胞が骨格筋細胞である、請求項３０に記載の真核生物宿主細胞。
32. 請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のベクター、請求項２８に記載のウイルス粒子、または請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の真核生物宿主細胞と、薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでなる、組成物。
33. ヒトまたは動物体の疾患の遺伝子療法による治療または予防のための薬剤を調製するための、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の発現カセット、２５〜２７のいずれか一項に記載のベクター、請求項２８に記載のウイルス粒子、または請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の真核生物宿主細胞の使用。

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