KR20000075924A - 알파-페토단백질 발현 세포에 특이적인 아데노바이러스 벡터 및 그것의 사용방법 - Google Patents

알파-페토단백질 발현 세포에 특이적인 아데노바이러스 벡터 및 그것의 사용방법 Download PDF

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Abstract

α-페토단백질(AFP)발현세포에 특이적인 아데노바이러스 벡터 복제와 그 사용방법이 제공된다. AFP 발현에 의존적인 전사 개시조절을 제공함으로써 바이러스 복제는 AFP발현 표적세포, 특히 간세포 암세포에 제한된다. 아데노바이러스 벡터는 AFP생산 악성 세포를 선택적으로 죽이는 것뿐만 아니라 AFP 생산세포의 존재에 대해 샘플을 검출 및 모니터하기 위해 사용될 수 있다.

Description

알파-페토단백질 발현 세포에 특이적인 아데노바이러스 벡터 및 그것의 사용방법{ADENOVIRUS VECTORS SPECIFIC FOR CELLS EXPRESSING ALPHA-FETOPROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF}
광범위한 의학적인 연구와 많은 진보에도 불구하고 암은 미국에서 두 번째의 사망원인으로 남아있다. 간세포성 암종 (HCC 또는 악성 간암)은 전세계적으로 가장 보편적인 암중 하나이며, 특히 아시아에서는 큰 문제가 되고 있다.
간세포성 암종에 걸려 있는 환자에 대한 치료적 전망은 밝지 않다. 치료법이 개선되고 간 이식이 활용됨에도 불구하고, 단지 소수의 환자들만이 절제술 또는 이식중 어느 한가지에 의해 종양이 제거됨으로써 치료될 뿐이다. 다수의 환자들에게는 현재의 치료가 만족스럽지 못한 상태로 남아있으며, 병의 경과를 예상하는 것도 쉽지 않다.
특별히 관심의 대상이 되는 것은, 특히 성공적인 치료가 어려운, 에컨대 간암과 같은 암에서, 보다 특이하고 표적화된 형태의 암 치료법을 개발하는 것이다. 상대적으로 특이하지 않고 때로는 심각한 독성까지도 유발하는 종래의 암 치료법과는 대조적으로, 건강한 세포는 무상으로 남겨두면서 악성세포를 선택적으로 억제 또는 죽이기 위한 보다 특이적인 치료처방이 시도된다.
간암과 같은 암에 대한 가능한 한가지 치료 접근법은 유전자 치료법인데, 이 방법으로 관심의 유전자가 악성 세포안에 도입된다. 관심의 유전자는 다른 화합물로 처리했을 때 독성 물질로 전환되는 단백질, 또는 선구약물을 약물로 전환시키는 효소를 코드화할 수 있다. 예를 들면, 티미딘 키나아제를 코드화하고 있는 단순 포진 유전자 (HSV-tk)가 도입되면 세포가 간시클로비어 (ganciclovir, GCV)에 대해 조건부로 민감해진다. 또는 달리, 관심의 유전자는 직접적으로 독성인 화합물, 예컨대 디프테리아 독소 (DT)와 같은 화합물을 코드화할 수도 있다. 이들 치료법이 암세포에 대하여 특이적으로 되기 위해서는, 관심의 유전자가 암세포에서 특이적으로 (즉, 우선적으로) 활성화되는 전사 개시 영역의 제어하에 있어야 한다. 세포 또는 조직에 특이적인 발현은 세포-특이적 인핸서 및/또는 프로모터를 사용함에 의해 이루어질 수 있다 [Huber et al. (1995) Adv. Drug Delivery Reviews 17:279-292].
다양한 바이러스성 및 비-바이러스성 (예컨대 리포솜성) 비히클, 또는 벡터들이 이들 유전자를 전달하기 위하여 개발되었다. 그런 바이러스들중에서 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 신드비스 바이러스, 폭스바이러스 및 아데노바이러스 벡터가 유전자 전달에 대해 제안되었고, 그 중 현재 진행되고 있는 많은 연구들중 핵심이 되고 있는 것은 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스들은 가장 쉽게 제조되고 정제될 수 있는 것인 반면, 레트로바이러스들은 불안정하고, 제조 및 정제가 어려우며, 숙주 게놈안에 통합되어 위험한 돌연변이가 일어날 가능성을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 아데노바이러스들은 형질도입을 고효율로 이룰 수 있다는 장점이 있으며 세포의 효과적인 형질도입을 위하여 세포 증식을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 및 아데노바이러스성 벡터 시스템의 개발에 대해서는 문헌을 참조한다 [Graham et al. (1973) Virology 52:456-467; Takiff et al. (1981) Lancet 11:832-834, Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11:6003-6020; Graham (1984) EMBO J 3:2917-2922; Bett et al. (1993) J. Virology 667:5911-5921; 및 Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806].
유전자 전달 비히클로서 사용될 때, 아데노바이러스 벡터들은 때로 복제를 할 수 없도록 디자인됨으로써 관심의 표적 세포에서 복제할 수 없도록 (복제-결핍) 고의로 처리된다. 이들 비히클에서는, 초기 아데노바이러스 유전자 생성물 E1A 및/또는 E1B 가 결실되고 팩키징 셀라인인 293 에 의하여 반대쪽으로 (in trans) 제공된다 [Graham et al. (1987) J. Gen. Virol. 36:59-72; Graham et al. (1977) J. Genetic Virology 68:937-940]. 형질도입되는 유전자는 통상적으로 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 영역으로 아데노바이러스에 삽입된다 [Bett et al. (1994)]. 유전자의 효과적인 형질도입을 위한 비히클로서의 복제-결핍 아데노바이러스 qprxj에 대해서는 여러 문헌에 설명되어 있다 [Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1:241-256; Rosenfeld (1991) Science 252:431-434; Wang et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309:61-66; Jaffe et al. (1992) Nat. Gen. 1:372-378; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Stratford-Perricaudet et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:626-630; Le Gal Le Salle et al. (1993) Science 259:988-990; Mastrngeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234; Ragot et al. (1993) Nature 361:647-650; Hayaski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23872-23875; Bett et al. (1994)].
유전자 치료법을 위한 아데노바이러스 벡터의 개발에서 실질적으로 집중적인 초점이 되는 것은, 아데노바이러스 자체의 이펙터로서의 사용이 아니라 아데노바이러스를 단순히 관심의 유전자의 도입을 위한 비히클로서 사용하는 것이다. 아데노바이러스의 복제는 대부분은 숙주의 면역 반응으로 인한 바람직하지 못한 결과로서 관찰되었다. 복제-결핍 아데노바이러스에 의한 암 치료에서, 숙주 면역 반응은 두가지 수준에서 반복 용량의 지속 기간을 제한한다. 첫째, 아데노바이러스 전달 비히클 자체의 캡시드 단백질이 면역원성이다. 둘째, 바이러스 후기 유전자가 형질도입된 세포에서 빈번하게 발현되어 세포 면역을 유발한다. 그러므로, 사이토킨, 종양 억제 유전자, 리보자임, 자살 유전자, 또는 선구약물을 활성 약물로 전환시키는 유전자들을 반복적으로 투여하는 능력은 유전자 전달 비히클 및 유전자 발현의 과도기적 성질뿐만 아니라 전달 비히클의 바이러스성 유전자 생성물 두가지의 면역원성에 의해 제한되었다. 따라서 벡터에 대한 특이한 면역학적 반응이 추가의 처리를 방해하기 전에 최소한의 횟수의 투여로 모든 암성 세포를 본질적으로 제거할 수 있는 벡터 구성물이 필요하게 되었다.
조직-특이적 조절 단백질에 대한 설명은 완전히 별도의 연구 영역에 속한다. α-페토단백질(AFP)은 종양을 일으키는 태아의 단백질로서, 그것의 발현은 비록 그것의 발현 수준이 조직과 발생 단계에 따라 크게 달라지긴 하지만 주로 내피세포 기원의 발생 조직 (난황낭, 태아의 간, 및 소화관)에 제한된다. AFP 는 AFP 의 혈청 농도가 대부분의 간암 환자에서 상승되며, 고수준의 AFP 가 진전된 질병의 환자에게서 발견되었기 때문에 임상적으로 중요하다. 환자의 혈청 AFP 수준은 주변의 정상적인 간에서가 아니라 간세포 암종에서의 AFP 발현에 의하여 조절되는 것으로 여겨진다. 그러므로, AFP 유전자는 간암세포-특이적 발현으로 조절되는 것으로 보인다.
사람 AFP 유전자의 5' 상류 플랭킹 서열은 세포-특이적 인핸서 활성을 부여하는 것으로 밝혀졌다 [Watanabe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4812-4818; Sakai et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:5055-5060 (사람 AFP 유전자의 클로닝에 대해 설명되어 있음); 캐나다 특허 출원 번호 제 2,134,994 호]. 인핸서는 유전자 발현의 세포-특이성을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 같은 쪽에서 (cis)-작용하는 전사 조절 엘레먼트이다. 인핸서는 또한 전형적으로 긴 거리에 걸쳐서 전사를 증대시키는 능력을 가지는 것을 특징으로 하며, 상대적으로 그것의 각각의 유전자에 대한 위치 및 배향에 무관하다. 프로모터는 전사 출발 부위 바로 옆(상류쪽) 5'에 위치해 있으며 일반적으로 TATA 상자라고 불리는 AT-풍부 영역을 포함하고 있다.
간암을 치료하기 위하여 세포-특이적 AFP 인핸서를 사용하는 유전자 치료법에 대한 여러 가지 접근법들이 발표되어 있다. 타마오끼와 나카바야시는 AFP-생성 세포에서 발현을 유발하기 위하여 AFP 전사 조절 영역을 사용하는 것, 특히 AFP 전사 조절 영역에 암세포 독소를 코드화하는 유전자를 연결시키는 것을 발표하였다 (Tamaoki and Nakabayashi, 캐나다 특허 출원 번호 제 2,134,994 호). 그러나, 이 출원의 전체적인 핵심은 디프테리아 독소 (DT)를 코드화하는 유전자와 같은 이종 독소 유전자의 발현에 대한 것이었고, 아데노바이러스는 단지 이 독소 유전자에 대한 전달 비히클의 관점에서만 설명되어 있었다. 카네코 등 및 카나이 등은 간세포성 암종 세포에 대한 HSV-tk 유전자의 발현을 제한하기 위하여 AFP 의 5' 상류 영역을 사용하고, 이어서 뉴클레오시드 아날로그 GCV 로 처리하는, 간암의 아데노바이러스-중재 유전자 치료법을 발표하였다 [Kaneko et al. and Kanai et al., Cancer Res. 55:5283-5287 (1995); Hepatology 22 (4 Part 2): Abstract 158A (1995); Hepatology 23:1359-1368 (1996); Hepatology 22: Abstract 328 (1995)]. 그러나, 이들 아데노바이러스 구성물들은 복제를 할 수 없고, 이들 공보물들의 전체적인 핵심은 비-아데노바이러스 유전자의 발현을 조절하기 위하여 AFP 5' 상류 전사 조절 영역을 사용하는 것이었다. 윌스 등은 또한 선택적으로 HSV-tk 를 발현하는 복제-결핍 아데노바이러스 벡터에 대해 발표하였다 [Wills et al. (1995) Cancer Gene Ther.2:191-197]. 카나이 등도 또한 HSV-tk 유전자외에 대장균의 시토신 탈아민효소 (CD) 및 lacZ 유전자의 발현을 유발시키기 위하여 AFP 인핸서-프로모터를 사용하는 것에 대해 보고하였다 [Kanai et al. (1996) Gastroenterology (Supp) 110:A1227]. 다시 말하면, 핵심 및 접근법은 복제-결핍 아데노바이러스를, 그 자체가 선택적인 성장 억제를 이루기 위한 제제로서가 아니라 치료용 전달 비히클로서 사용하는 것을 수반하였다 [참조: Arbuthnot et al. (1996) Human Gene Ther. 7:1503-1514: 래트의 AFP 유전자로부터 얻어지는 5' 플랭킹 서열을 사용하는 것을 설명함].
간세포성 암종은 표준 치료법에 의해서는 좀처럼 치료될 수 없다. 그러므로, 이 질병에 대한 새로운 치료 접근법을 개발하는 것이 결정적이다. 본 발명은 AFP-생성 세포에서의 복제에 특이적인 아데노바이러스를 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다.
(발명의 요약)
본 발명에서는 무엇보다도 AFP 를 발현하는 세포에 특이한 복제-경합 아데노바이러스 벡터 및 그것의 사용방법이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 이들 복제 경합-아데노바이러스 벡터들은 AFP 전사 조절 엘레먼트 (TRE)의 전사 제어하에 있는 아데노바이러스 증식을 위해 필수적인 초기 및/또는 후기 유전자들을 하나 또는 그 이상 포함하고 있다. AFP-TRE 세포-특이적 프로모터의 제어하에 있는 트랜스유전자 (transgene)도 또한 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 세포-특이적 전사 조절하에 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP)에 대한 코딩 서열을 포함하고 있는 비-자연-발생 아데노바이러스 벡터도 제공한다.
따라서, 본 발명은 한 측면으로 아데노바이러스 유전자, 바람직하게는 복제에 필수적인 아데노바이러스 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터를 제공하는데, 상기 아데노바이러스 유전자는 α-페토단백질 전사 반응 엘레먼트 (AFP-TRE)의 전사적 조절하에 있다. 한 구체예에서, AFP-TRE 는 사람이다. 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 AFP-특이적 프로모터와 인핸서 (즉, AFP 유전자로부터 얻어지는 프로모터와 인핸서)를 포함한다.
어떤 구체예에서는, 복제에 필수적인 아데노바이러스 유전자가 초기 유전자이다. 다른 구체예에서는, 초기 유전자가 E1A 이다. 또 다른 구체예에서는 초기 유전자가 E1B 이다. 또 다른 구체예에서는 E1A 와 E1B 두가지가 모두 AFP-TRE 의 전사적 조절하에 있다. 또 다른 구체예에서는 E1A, E1B, 및 E4 가 AFP-TRE 의 조절하에 있다.
다른 구체예에서는, 복제에 필수적인 아데노바이러스가 후기 유전자이다.
또 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 인핸서 엘레먼트 A 를 포함한다. 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 인핸서 엘레먼트 B 를 포함하고 있다. 또 다른 구체예에서는 AFP-TRE 가 인핸서 엘레먼트 A 와 B 를 포함하고 있다.
다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO.:1 의 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 기능적으로 보존된 변이체룰 포함하고 있다. 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO.:1 의 약 +1 부터 약 +600 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO.:1 의 약 +600 부터 약 +827 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다. 다른 구체예에서는, AFP-TRE 는 SEQ ID NO.:1 의 약 +1 부터 약 +300 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다.
다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO.:2 의 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 기능적으로 보존된 변이체를 포함하고 있다.
다른 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 추가로 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 있는 트랜스유전자를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서는 트랜스유전자가 세포독성 유전자이다.
다른 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 추가로 다른 아데노바이러스 유전자, 예컨대 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 있는 복제에 필요한 아데노바이러스 유전자를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 또 다른 추가의 아데노바이러스 유전자가 세 번째의 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 있을 수 있다.
다른 측면으로 본 발명은 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터(들)을 포함하고 있는 숙주 세포를 제공한다.
추가의 측면으로, 본 발명은 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터(들), 특히 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터(들)을 포함하고 있는 조성물을 제공한다. 본원에서 설명되는 조성물은 또한 추가로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 차폐된 (masked) 아데노바이러스를 생성하기 위하여 친수성 중합체 ("차폐제")와 복합체를 형성하는 아데노바이러스 벡터(들)을 제공한다. 친수성 중합체는 아데노바이러스의 캡시드 단백질, 특히 헥손과 섬유 단백질에 부착된다(공유 결합 또는 비-공유 결합에 의하여). 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터들은 차폐된 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위하여 차폐제와 복합체를 형성한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 차폐제는 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 공유 결합된 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이다.
다른 측면으로, 본 발명은 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터(들)을 함유하는 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 AFP-TRE 가 기능할 수 있는 세포, 특히 AFP 를 발현하거나 또는 AFP 를 발현할 수 있는 포유류 세포에서 우선적으로 복제되는 아데노바이러스이다.
다른 측면으로, AFP-TRE 가 기능할 수 있는 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 세포 (특히 포유동물 세포)에 특이한 아데노바이러스를 증식시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)을 AFP-TRE 가 기능할 수 있는 세포와 조합시키고, 그로써 상기 아데노바이러스를 증식시키는 것으로 이루어진다.
다른 측면으로, AFP-발현 세포를 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)과 접촉시키고, 그러면 아데노바이러스 벡터가 세포에 들어가는 것으로 이루어지는, AFP-TRE 가 기능할 수 있는 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 세포에서 선택적인 세포독성을 부여하는 방법이 제공된다.
다른 측면으로, 생물학적 샘플중의 세포를 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)과 접촉시킨 후, 발생한 경우의 AFP-TRE 중재 발현을 검출하는 것으로 이루어지는, AFP-TRE 의 기능이 가능한 세포를 검출하는 방법이 제공된다.
다른 측면으로, 생물학적 샘플중의 세포를 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)과 접촉시킨 후, 발생한 경우의 아데노바이러스 벡터의 복제를 검출하는 것으로 이루어지는, 생물학적 샘플중의 α-페토단백질을 발현하는 세포를 검출하는 방법이 제공된다.
다른 측면으로, 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)이 개체에게 투여되는 치료 방법이 제공된다.
다른 측면으로 본 발명은 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP) 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 비-자연 발생 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 어떤 구체예에서, ADP 코딩 서열은 예컨대 AFP-TRE 또는 전립선-세포 특이적 TRE 와 같은 세포-특이적 TRE 의 전사적 제어하에 있다.
본 발명은 아데노바이러스 벡터를 사용하는 세포 형질전환에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 알파-페토단백질을 발현하는 세포, 특히 간암세포에서의 아데노바이러스 벡터의 세포-특이적 복제에 관한 것이다.
도 1A 는 사람 AFP 인핸서 및 프로모터 영역의 개략적인 지도를 도시한다 (일정 비율로 축소하지 않음). 도 1A 는 인핸서 도메인 A 와 B; 원위의 사일런서 (silencer)(Sd); 기부의 사일런서 (Sp); 및 글루코코르티코이드 반응 엘레멘트 (GRE)를 포함하고 있는 프로모터/인핸서 영역의 특징중 일부를 도시한다. 숫자는 전사 출발 부위 (구부러진 화살표로 표시됨)와 관련하여 뉴클레오티드 위치를 나타낸다. 도 1B 는 AFP-TRE (실시예 1 에서 설명됨)를 구성하는데 사용된 두 개의 5' AFP 영역을 개략적으로 도시한다.
도 2(A) 및 (B) 는 AFP-TRE 에 대한 리포터 검정 실험을 요약한 것이다. 도 2 (A)는 AFP-TRE 의 전사 활성을 평가하기 위하여 사용되었던 루시페라제 리포터 플라스미드 구성물인 CN236 의 개략도이다. 도 2 (B) 는 800 bp 의 AFP-TRE 에 대한 루시페라제 리포터 검정을 도시한 막대 그래프이다. 800 bp 에 대하여 AFP 를 생성하는 Hep3B 세포에서 루시페라제의 발현을 유도하는 능력에 대하여 시험하였다. pGL2-Luc 는 그 안에서 루시페라제 유전자가 AFP-TRE 서열에 연결되어 있지 않은 네가티브 대조표준이다.
도 3 은 실시예 1 에서 설명되는 바와 같은 다양한 아데노바이러스 벡터 구성물을 개략적으로 도시한다.
도 4 는 서로 반대 배향인 E1A 와 E1B 가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 아데노바이러스 벡터의 개략적인 도면이다.
도 5A 와 5B 는 Ad 에 삽입시키기 위한 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP) 카세트를 개략적으로 도시한다. 도 5A 의 밑에 있는 화살표는 프라이머의 위치를 나타낸다. 도 5B 는 Y 리더 서열과 ADP 코딩 서열을 함유하고 있는 아닐링된 단편을 도시한다.
도 6(A) 와 (B) 는 CN733 (두개의 AFP-TRE 를 함유하고 있음)과 CN702 (대조표준) 감염 세포에서 E1A 수준에 대한 웨스턴 분석결과를 도시하는 반색조부의 재생물이다. 도 6(A) 에서, 왼쪽의 패널은 Huh-7 (AFP+) 세포를 나타내고; 오른쪽 패널은 Dld-1 (AFP-) 세포를 나타낸다. 도 6(B) 에서, Sk-Hep-1 은 사용된 AFP-세포였다.
도 7 (A)-(C) 는 AFP 생성 세포 (Huh-7; 도 7(A)) 및 AFP 를 생성하지 않는 세포 (Sk-Hep-1, 도 7(B); Dld-1, 도 7(C))에서의 CN733 의 성장을 도시하는 그래프도이다.
도 8(A)-(C) 는 대조 CN702 (검은 색 네모)와 비교하여 HepG2 세포에서의 CN732 (도 8(A); 검은색 다이아몬드), CN733 (도 8(B); 검은색 다이아몬드), 및 CN734 (도 8(C); 검은색 다이아몬드)의 성장을 도시한 그래프도이다.
도 9(A)-(C) 는 대조 CN702 (검은 색 다이아몬드)와 비교하여 일차 간세포에서의 CN732 (도 9(A); 검은색 네모), CN733 (도 9(B); 검은색 원), 및 CN734 (도 9(C); 검은색 원)의 성장을 도시한 그래프도이다.
도 10(A)-(B) 는 간암종 셀라인 HepG2 를 은닉하고 있고 CN733 으로 (도 9(A); 네모) 또는 대조 완충액으로 (원형) 처리된 마우스들에서의 종양의 크기를 비교한 그래프도이다. 도 10(A) 는 43 일동안 (6 주)에 걸쳐 측정한 종양의 크기를 나타낸다. 도 10(B) 에서, CN733 을 1 회 종양안에 투여한 것 ("B")이 CN733 을 매일 연속적으로 5 회 투여한 것 ("J")과 비교되었다.
도 11 은 CN733 (삼각형) 또는 완충액 (원형)을 받은 종양을 포함하고 있는 마우스들에서의 혈청내 AFP 수준을 도시한 그래프도이다.
도 12 는 대조 CN702 (검은색 원형), Rec 700 (검은색 세모) 및 위조 (mock)감염 (Xs)과 비교하여, 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP), CN751 (검은색 네모)에 대한 코딩 서열을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터의 세포독성을 나타내는 그래프도이다.
도 13 은 CN751 (검은색 네모) 및 CN702 (검은색 원형)의 세포외재성 바이러스 수율을 비교하는 그래프도이다.
도 14 는 CM751 ("H"), CN702 ("J"), 또는 완충액 ("B")으로 도전된 LNCaP 종양 이종이식편을 은닉하고 있는 마우스들에서의 종양의 크기를 비교한 그래프도이다.
도 15 는 아데노바이러스의 공유 페길레이션 (pegylation) 방법을 설명하는 개략도이다. 이 방법에서, 아데노바이러스에 메톡시-PEG 를 공유적으로 부착시키기 위하여 숙신이미딜 숙신이미드가 사용된다. 페길레이트된 아데노바이러스는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 반응 성분들로부터 분리된다.
도 16 은 페길레이트된 아데노바이러스 단백질의 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔 (이동성 변환)을 보여주는 반색조의 재생 설명도이다. 레인 1 과 2 는 페길레이트되지 않은 CN706 (대조표준)이고, 레인 3 에서 6 은 다양한 pH 및 온도 조건하에서 페길레이트된 CN706 이다 (레인 3, pH 7.6, 실온 (RT); 레인 4, pH 7.6, 4 ℃; 레인 5, pH 8.2, RT; 레인 6, pH 8.2, 4 ℃).
도 17 은 대조 아데노바이러스 CN706 과 혼합된 페길레이트된 아데노바이러스 (PEG-706)의 이온 교환 크로마토그래피 분석의 크로마토그램이다.
본 발명자들은 α-페토단백질 (AFP)을 발현하는 세포에서 우선적으로 복제할 수 있는 복제 경합-아데노바이러스 벡터를 발견하여 제조하였고, 이들 아데노바이러스 벡터들을 사용하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 AFP 유전자의 전사에 필요한 전사 인자(들) 및/또는 보조인자(들)의 결합에 의하여 특이하게 조절되는 전사 반응 엘레먼트 (TRE)(AFP-TRE)의 전사적 제어하에 있는 최소한 하나의 아데노바이러스 유전자, 바람직하게는 세포독성을 부여하는 아데노바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 유전자, 바람직하게는 최소한 하나의 초기 유전자를 포함하고 있다. 복제에 필요한 최소한 하나의 아데노바이러스 유전자의 세포-특이적 전사를 제공함으로써, 본 발명은 선택적인 복제로 인한 특이한 세포독성 효과에 대하여 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 이것은 특히 표적화된 세포의 사망이 바람직한 암과 관련하여 유용하다. 벡터는 또한 예를 들면 적절한 생물학적 (예컨대 임상적) 샘플중의 AFP-생성 세포의 존재를 검출하는 데 유용할 수 있다. 나아가, 아데노바이러스 벡터(들)은 AFP-TRE 를 사용함으로써 표적 세포에서 임의로 하나 또는 그 이상의 관심의 단백질을 선택적으로 생성할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 AFP-생성 세포에서 우선적으로 (즉, 비-AFP-생성 세포에서보다 상당히 더 높은 수율로) 복제한다는 것을 발견하였다. 이러한 복제 선호성은 AFP 를 생성하는 세포에서의 복제 수준 (즉 역가)을 AFP 를 생성하지 않는 세포에서의 복제 수준에 비교함으로써 나타난다. 복제 선호성은 훨씬 더 중요한데, 왜냐하면 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 실제로 야생형보다 비-AFP 생성 세포에서 상당히 더 낮은 속도로 복제하기 때문이다. AFP- 세포타입이 역가에 대한 AFP+ 세포 타입의 역가의 비교는 전체적인 복제 선호도가 야생형 아데노바이러스에 비교했을 때 AFP+ 세포에서의 복제뿐만 아니라 AFP- 세포에서의 침체된 복제로 인하여 증강된다는 결정적인 징후를 제공한다. 이러한 측면은 비-표적 (즉 비-암성 세포)에 대한 세포독성 손상이 최소화되는 것이 바람직한 암과 관련된 상황에서 특히 중요하고 유용하다. 실시예 1 은 이러한 실험 빛 발견에 대하여 보다 상세한 설명을 제공한다.
나아가, 본 발명자들은 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 털이 깍인 (누드: nude) 마우스에서 HepG2 이종이식편의 성장을 상당히 저지한다는 것을 발견하였다 (실시예 5). 그러므로, 본 발명에서는 아데노바이러스 벡터의 바람직하지 못한 측면들로 간주되었던 성질, 즉, 그것들의 복제와 아마도 부수적인 면역원성이 이용되고 그것들이 장점으로 간주된다. 감염이 급등할 가능성은 바이러스 복제의 세포-특이적 요구조건으로 인하여 상당히 감소된다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만, 본 발명자들은 아데노바이러스 단백질의 제조가 일반적으로 및/또는 특이하게 아데노바이러스 단백질을 생성하는 표적 세포를 향하여 면역 시스템을 활성화 및/또는 자극하기 위하여 사용될 수 있음을 주지한다. 이러한 사실은 환자들이 때로 온건하게 내지는 심각하게 면역학적으로 위험에 처하게 되는 암과 관련된 상황에서 중요하게 간주될 수 있다.
본 발명자들은 또한 ADP 에 대한 코딩 서열의 포함이 이 서열이 없는 아데노바이러스 벡터와 비교할 때 세포독성, 세포 사망, 및 바이러스 생성의 정도가 크게 증가한다는 것을 발견하였다. 따라서, ADP 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 함유하고 있는 비-자연 발생적인 아데노바이러스 벡터가 본원에서 포함되고 설명된다. ADP 코딩 서열은 예컨대 AFP-TRE 와 같은 세포-특이적인 TRE 의 제어하에 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
일반적인 기법
본 발명에서는 실제로 다른 언급이 없는 한, 해당 기술 분야내에 있는 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 종래 기법들이 사용될 것이다. 그러한 기법들은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonuclotide Synthesis"(M. J. Gait, ed., 1984); "Animal cell Culture"(R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology"(D. M. Wei ＆ C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J. M. Miller ＆ M. P. Calos, eds. 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"(F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology"(J. E. Coligan et al., eds., 1991)].
아데노바이러스에 관련된 여러 기법들도 문헌을 참고한다 [Felgner and Ringold (1989) Nature 337:387-388; Berkner and Sharp (1983) Nucl. Acids Res. 11:6003-6020; Graham (1984) EMBO J. 3:2917-2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67:5911-5921; Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806].
정의
본원에서 사용되는 바, "α-페토단백질 전사 반응 엘레먼트", 또는 "AFP-TRE" 는 AFP-TRE 가 제기능을 할 수 있도록 하는 숙주 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 증가시키는 폴리뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 DNA 서열이다. 공개된 보고에 따르면, AFP-TRE 는 APP-생성 세포와 관련된 세포성 단백질 (전사 인자들 및/또는 보조인자(들)), 예컨대 AFP-결합 단백질 (예컨대 미국 특허 제 5,302,698 호 참조)에 반응하며, 최소한 일부분의 AFP 프로모터 및/또는 AFP 인핸서를 포함한다. AFP-TRE 의 활성을 측정하고 주어진 세포가 AFP-TRE 의 기능을 가능하게 하는지의 여부를 측정하는 방법도 본원에 설명된다.
본 발명에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, AFP-TRE 는 예를 들면 그것에 제한되는 것은 아니지만, AFP 프로모터; AFP 인핸서; AFP 프로모터 및 AFP 인핸서; AFP 프로모터와 이종 인핸서; 이종 프로모터와 AFP 인핸서; 및 전술한 것들의 다량체를 포함하여 여러 가지 경우의 형태를 취할 수 있다. AFP-TRE 의 프로모터 및 인핸서 성분들은 원하는 AFP 세포-특이적 전사 활성이 얻어지기만 하면 어떠한 배향이든지 및/또는 관심의 코딩 서열로부터 거리가 얼마나 되든지 관계가 없을 것이다. 전사적 활성화는 당해 기술분야에 공지되어 있는 (그리고 하기에서 보다 상세하게 설명되는) 여러 가지 방법으로 측정될 수 있지만, 일반적으로는 AFP-TRE 의 제어하에 (즉, 작동가능하게 연결된) 코딩 서열의 mRNA 또는 단백질 생성물의 검출 및/또는 정량화에 의하여 측정된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, AFP-TRE 는 다양한 길이 및 다양한 서열 성분을 가질 수 있다. "전사적 활성화" 또는 "전사의 증가"는 전사가 표적 세포 (즉 AFP-생성 세포)의 기본 수준 이상으로, 최소한 약 2 배, 바람직하게는 최소한 약 5 배, 바람직하게는 최소한 약 10 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 20 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 200 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 400 배 내지 약 500 배, 가장 바람직하게는 최소한 약 1000 배 증가된 것을 나타낸다. 기본 수준은 일반적으로 (만약 있다면) 비-AFP 생성 세포에서의 활성 수준, 또는 AFP-생성 세포에서 시험되는 바 AFP-TRE 가 결핍된 리포터 구성물의 (만약 있다면) 활성 수준이다. 임의로, 전사 터미네이터 또는 전사 "사일런서"가 AFP-TRE 의 상류에 놓일 수 있고, 그로써 PB-TRE 의 전사적 제어하에 코딩 절편의 원하지 않는 판독-통과 전사가 방지된다. 또한 임의로, PB-TRE 의 전사적 제어하에 놓일 수 있는 코딩 절편의 내인성 프로모터가 결실될 수 있다.
AFP-TRE 의 "기능적으로-보존된" 변이체는 다른 AFP-TRE 와는 구별되지만, 여전히 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사를 증가시키는 능력, 특히 AFP 세포-특이적 전사 활성을 보유하고 있는 AFP-TRE 이다. AFP-TRE 의 차이는 예를 들면, 염기의 단일 또는 다중 염기 돌연변이(들), 첨가(들), 결실(들), 및/또는 변형(들)로부터 발생하는 선형 서열의 차이로 인한 것일 수 있다. 이 차이는 또한 당 성분, 및/또는 AFP-TRE 의 염기들간의 연결(들)로부터 발생할 수도 있다.
"세포-특이적 TRE" 는 상이한 기능성을 가지고 있는 다른 유형의 세포들에 비하여 특이한 유형의 세포에서 우선적으로 기능적인 것을 의미한다. 세포-특이적 TRE 는 종양 세포 특이적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "표적 세포-특이적"은 아데노바이러스 벡터의 복제에 필수적인 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는, 또는 트랜스유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 TRE 서열이 특이하게 그 표적 세포에서 작용함으로써 복제가 그 표적 세포에서 진행되거나 또는 트랜스유전자 폴리뉴클레오티드가 그 표적 세포에서 발현되는 것을 의미한다. 이것은 작동가능하게 연결된 전사 제어 서열에 의해 유도된 전사를 활성화하는 전사 인자들이 비-표적 세포에서가 아니라 그 표적 세포에서 존재하고 있기 때문에 일어날 수 있다. 또한 그것은 정상적으로 비-표적 세포에서 발생하고 작동가능하게 연결된 전사 제어 서열에 의해 유도된 전사를 방해하는 전사 억제 인자들의 부재에 의해서도 일어날 수 있다. 본원에서 사용되는 바 용어 "표적 세포-특이적"은 세포 유형 특이성, 조직 특이성, 및 뿐만 아니라 주어진 표적 세포의 암성 상태에 대한 특이성을 포함하는 것으로 의도된다. 후자의 경우, 정상 세포의 암성 상태에 대한 특이성은 정상적인 비-암성 세포 대응물과 비교된다.
"아데노바이러스 벡터" 또는 "아데노바이러스성 벡터" (이들 용어는 상호교환적으로 사용됨)는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 용어로, 일반적으로 아데노바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 목적에 대해서는, 아데노바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 AFP-TRE 를 함유한다. 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 유전자일수도 있고 또는 이종 유전자일 수도 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터 구성물은 그것들에 제한되는 것은 아니지만, DNA 자체, 아데노바이러스 코트안에 캡슐화된 DNA, 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태 (예컨대 단순 포진, 및 AAV)안에 패키지되어 있는 DNA, 리포솜안에 캡슐화되어 있는 DNA, 폴리라이신과 복합체를 형성한 DNA, 합성 다중양이온 분자와 복합체를 형성한 DNA, 트란스페린과 포합된 DNA, 분자를 면역학적으로 "차폐"하기 위하여 및/또는 반감기를 증가시키기 위하여 PEG 와 같은 화합물과 복합체를 형성한 DNA, 및 비바이러스 단백질에 포합되어 있는 DNA 를 포함하여 여러 가지 형태중 어느 한가지일 수 있다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다. 본원에서 사용되는 "DNA" 는 염기 A,T,C, 및 G 를 포함할 뿐만 아니라 이들 염기의 어떠한 유사체 또는 변형된 형태중 하나, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드, 하전된 연결 및 티오에이트와 같은 뉴클레오티드간 변형, 당 유사물의 사용, 및 폴리아미드와 같은 변형된 및/또는 변경된 골격 구조를 포함한다. 본 발명의 목적에 대해서는, 아데노바이러스 벡터는 표적 세포에서 복제-경합성이다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 어떠한 길이의 것이든지 뉴클레오티드의 다량체 형태, 즉, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 말한다. 이들 용어는 단일-, 이중-, 또는 삼중-가닥의 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하고 있는 중합체, 또는 다른 천연, 화학적으로, 생화학적으로 변형된 비-천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 골격은 당과 인산염 기 (전형적으로 RNA 또는 DNA 에서 발견됨), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 인산염 기를 포함할 수 있다. 또는 달리, 폴리뉴클레오티드의 골격은 포스포라미데이트와 같은 합성 하위단위체의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오티드 포스포라미데이트 (P-NH2) 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다 [Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973]. 포스포로티에이트 연결이 포스포디에스테르 연결 대신에 사용될 수 있다 [Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064]. 또한, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드는, 상보 가닥의 합성 및 적절한 조건하에서의 가닥들의 아닐링에 의해, 또는 적절한 프라이머와 DNA 중합효소를 사용한 새로운 상보 가닥의 합성에 의해 화학적으로 합성되는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 얻어질 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 비-제한적 실예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 가지친 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 어떠한 서열의 단리된 DNA, 어떠한 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 플루오로리보오스 및 티오에이트와 같은 다른 당 및 연결기, 및 뉴클레오티드 가지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해받을 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 추가로 중합화후에, 예컨대 표지화 성분과의 포합에 의하여 변형될 수 있다. 본 정의에 포함되는 다른 유형의 변형으로는 캡스 (caps), 하나 또는 그 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지화 성분, 다른 폴리뉴클레오티드, 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다. 본원에서 사용되는 용어 "DNA" 는 염기 A,T,C, 및 G 를 포함할 뿐만 아니라 이들 염기의 어떠한 유사체 또는 변형된 형태중 하나, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드, 하전된 연결 및 티오에이트와 같은 뉴클레오티드간 변형, 당 유사물의 사용, 및 폴리아미드와 같은 변형된 및/또는 변경된 골격 구조를 포함한다.
다른 서열에 대하여 특정 백분율 (예컨대 80 %, 85 %, 90 %, 또는 95 %)의 "서열 동일성"을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역은, 배열되었을 때 염기의 그 백분율이 두 개의 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 이러한 배열 및 % 상동성 또는 서열 동일성은 당해 기술분야에 공지되어 있는 소프트 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]. 바람직한 배열 프로그램은 ALIGN Plus 이다 [Scientific and Educational Software, Pennsylvania].
"전사적 제어하에" 란 당해 기술 분야에 잘 인지되어 있는 용어로, 폴리뉴클레오티드 서열, 보통 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 또는 전사를 촉진하는 엘레먼트에 작동가능하게 (작동하게) 연결되어 있는 상태에 좌우된다는 것을 의미한다. 하기에서 주지되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 은 엘레먼트들이 기능하는 것이 허용되는 배열인 병렬상태를 말한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 어떠한 길이의 것이든지 아미노산의 중합체를 언급하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지된 것일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 간섭받을 수 있으며, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 된 복합체로 조립될 수도 있다. 또한 상기 용어들은 자연적으로 또는 중재; 예컨대 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 다른 어떠한 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 포합화에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이 정의에는 예를 들면, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예컨대 비천연 아미노산 등)와 뿐만 아니라 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 변형을 함유하고 있는 폴리펩티드도 포함된다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열" 은 서열의 서로 이웃해 있는 잔기들이 폴리펩티드의 일차 구조에서 연속적으로 존재하는, N-말단에서 C-말단 방향으로의 폴리펩티드의 아미노산의 순서이다. "부분 서열"은 하나 또는 두 개의 방향으로 추가의 잔기를 포함하고 있는 것으로 알려져 있는 폴리펩티드의 부분의 선형 서열이다.
ADP (또는 "ADP 단편" 또는 "ADP 영역")의 폴리펩티드 "단편"(또는 "영역"이라고도 불림)은 ADP 의 최소한 5 개의 연속 아미노산, 바람직하게는 최소한 10 개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 최소한 15 개의 연속 아미노산, 더욱 바람직하게는 최소한 약 25 개의 연속 아미노산, 보다 더 바람직하게는 최소한 약 30 개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 최소한 약 40 개의 연속 아미노산을 가지고 있는 ADP 의 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이다. ADP 단편은 본원에서 설명되는 기능들을 포함하여 ADP 에 부여된 모든 기능을 가지고 있는 것을 특징으로 한다.
"복제" 및 "증식" 은 상호교환적으로 사용되며, 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 재생, 또는 증식하는 능력을 말한다. 이 용어는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 목적에 대해서는, 복제는 아데노바이러스 단백질의 생성을 포함하고, 일반적으로 아데노바이러스의 재생산을 지시한다. 복제는 당해 기술분야에 공지이고 본원에서 설명되는 검정 표준, 예컨대 버스트 (burst) 검정, 플라크 검정, 또는 1-단계 성장 곡선 검정을 사용하여 측정될 수 있다. "복제" 및 "증식" 은 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 유전자 발현; 바이러스 단백질, 핵산 또는 다른 성분들의 생성; 바이러스 성분들의 완전한 바이러스안으로의 패키징; 및 세포 용해를 포함하여 바이러스 제조과정에 직접적으로 또는 간접적으로 포함된 모든 활성을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "세포독성" 은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 하나 또는 그 이상의 세포의 통상적인 생화학적 또는 생물학적 기능이 비정상적으로 손상된 (즉 억제되거나 상승된) 상태를 말한다. 이런 활성들로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 대사; 세포 복제; DNA 복제; 전사; 번역; 및 분자의 흡수가 있다. "세포독성" 은 세포 사망 및/또는 세포용해를 포함한다. 세포독성을 가리키는 검정으로서 예컨대 염료 축출,3H-티미딘 흡수, 및 플라크 검정이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "선택적인 세포독성" 은 본원에서 사용되는 바, AFP-TRE 가 기능하는 것이 허용되지 않는 세포에 대해 아데노바이러스에 의해 부여된 세포독성과 비교할 때 AFP-TRE 가 기능하도록 허용된 세포에 대해 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 부여된 세포독성을 말한다. 그러한 세포독성은 예를 들면 플라크 검정에 의하여, 또는 표적 세포를 포함하고 있는 종양의 크기의 감소 또는 안정화에 의하여, 또는 종양 세포 또는 조직-특이적 마아커, 예컨대 AFP 또는 전립선-특이적 항원과 같은 암 마아커의 특징적인 마아커의 혈청 수준의 감소 또는 안정화에 의하여 측정될 수 있다.
"이종 유전자" 또는 "트랜스유전자" 는 야생형 아데노바이러스에는 존재하지 않는 모든 유전자이다. 바람직한 것은, 트랜스유전자는 아데노바이러스 벡터에 의한 도입전에는 발현되거나 존재하지 않을 것이다. 바람직한 트랜스유전자의 실예는 하기에 나타낸다.
"이종" 프로모터 또는 인핸서는 AFP 5' 플랭킹 서열과 결합되어 있지 않거나 또는 그것으로부터 유도되지 않는 것이다. 이종 프로모터 또는 인핸서의 실예로는 알부민 프로모터 또는 인핸서 및 다른 바이러스 프로모터 및 인핸서, 예컨대 SV40 이 있다.
"내인성" 프로모터, 인핸서, 또는 TRE 는 천연의 것이거나 또는 아데노바이러스로부터 유도된다.
용어 "작동가능하게 연결된" 은 기능적 관계로 폴리뉴클레오티드 엘레먼트들이 배향된 것을 말한다. TRE 는 만약 TRE 가 코딩 서열의 전사를 촉진한다면 코딩 절편에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된이 의미하는 것은 연결된 DNA 서열이 일반적으로 연속적이고, 필요에 따라 두 개의 단백질 코딩 영역이 결합되는 경우 연속적이며 동일한 리딩 프레임내에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 수킬로염기만큼 프로모터로부터 분리되었을 때 일반적으로 기능하고 인트론 서열이 가변적인 길이를 가지고 있기 때문에, 일부의 폴리뉴클레오티드 엘레먼트들은 연속적이지는 않지만 작동가능하게 연결된다.
"숙주 세포" 는 본 발명의 아데노바이러스 벡터(들)의 수용체일 수 있거나 또는 그 수용체였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일한 숙주 세포의 자손을 포함하며, 그 자손은 천연적인, 우연한, 또는 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 부모 세포와 반드시 완전히 동일 (형태 또는 총 DNA 상보물에서)할 필요는 없을 것이다. 숙주 세포에는 본 발명의 아데노바이러스 백터로 생체내에서 또는 시험관내에서 형질전환된 또는 감염된 세포가 포함된다.
"표적 세포" 는 AFP-TRE 가 기능할 수 있도록 허용되는 모든 세포이다. 바람직하게도, 표적 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 포유동물의 AFP-발현 세포, 보다 바람직하게는 AFP 를 발현하는 사람 세포이다.
본원에서 사용되는 바, "신생 세포", "신생 조직 형성", "종양", "종양 세포", "암" 및 "암 세포" (상호교환적으로 사용됨)는 상대적으로 자체의 성장을 나타냄으로써, 그것들이 세포 증식의 제어가 크게 소실되는 것을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 말한다. 신생 조직 형성 세포는 양성 또는 악성일 수 있다.
본원에 사용되는 바, "AFP-TRE 가 기능할 수 있는 세포", AFP-TRE 의 기능이 "충분하게 보존된" 세포, "AFP-TRE 가 기능성인 세포", 등은 AFP-TRE 가 예를 들면 리포터 유전자에 작동가능하게 연결될 때, AFP-TRE 에 연결되지 않았을 때 동일한 리포터 유전자의 발현과 비교하여 최소한 약 2 배, 바람직하게는 최소한 약 5 배, 바람직하게는 최소한 약 10 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 20 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 200 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 400 배 내지 약 500 배, 가장 바람직하게는 최소한 약 1000 배로 리포터 유전자의 발현을 증가시키는 세포이다. 발현의 (상대적인 또는 절대적인) 수준을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 설명되어 있다.
"비-자연적으로 발생하는" 또는 "재조합" 아데노바이러스 벡터는 상호교환적으로 사용되고, 자연에서 발생하지 않는 아데노바이러스 벡터이거나 자연에서 발견되지 않는 배열의 폴리뉴클레오티드 엘레먼트 (또는 성분들)을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터를 의미한다. 본원에서 논의되는 바와 같이, ADP 에 대한 코딩 서열(들)을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터와 관련하여, 이 용어는 비-자연 발생적이거나 또는 ADP 서열을 포함하는 조작 및/또는 ADP 서열을 포함하지 않은 조작으로 인한 재조합체인 그러한 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, ADP 코딩 서열을 포함하고 있는 비-자연 발생적 아데노바이러스 벡터는 어떠한 조작전에 ADP 서열을 함유하였었지만, 다른 서열 엘레먼트(들)의 삽입 및/또는 결실로 인해 비-자연 발생적이 되는 경향을 띄게 되었다. 예를 들면, 그러한 아데노바이러스 벡터들은 또한 함유하는 아데노바이러스 벡터의 초기 유전자의 전사를 조절하는 세포 특이적 TRE 및 ADP 코드화 서열을 포함할 수 있다. 다른 실예로서, 비-자연 발생 아데노바이러스 벡터는 ADP 코드화 서열을, 그러한 서열을 함유하고 있지 않은 아데노바이러스 벡터에 첨가함으로써 발생할 수 있다 (실시예 5 참조).
"ADP 코딩 서열" 은 ADP 또는 그것의 기능성 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드이다. ADP 와 관련하여, ADP 의 "기능성 단편" 은 아데노바이러스 복제에 대하여 세포독성 활성, 특히 세포 용해를 나타내는 것이다. 세포독성 활성을 측정하는 방법들은 당해 기술분야에 공지이며 본원에서도 설명된다.
ADP 폴리펩티드를 "코드화하는" 폴리뉴클레오티드는 전사 및/또는 번역될 수 있어서 ADP 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 생성할 수 있는 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 안티-센스 가닥도 또한 서열을 코드화하는 것으로 여겨진다.
"ADP 폴리펩티드" 는 ADP 의 아미노산 서열 (예컨대 SEQ ID NO.:23)의 최소한 일부분, 또는 영역을 함유하고 있는 폴리펩티드이며, ADP 와 관련된 기능, 특히 세포독성, 보다 구체적으로는 세포 용해를 나타낸다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 이들 기능은 당해 기술분야에 공지된 기법들을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 서열 변이가 예를 들면 ADP 폴리펩티드를 제공할 수 있는 보존성 아미노산 치환으로 인하여 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
SEQ ID NO 에 "도시된" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 서열이 SEQ ID NO 에서 동일한 연속적인 서열로서 존재함을 의미한다. 이 용어는 SEQ ID NO 내에 함유된 전체 서열뿐만 아니라 SEQ ID NO 의 일부분, 또는 영역을 포함한다.
"생물학적 샘플" 은 개체로부터 얻어지는 다양한 유형의 샘플을 포함하며 진단용 또는 관찰용 검정에 사용될 수 있다. 이 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 생검 시편 또는 조직 배양물 또는 그것으로부터 유도된 세포와 같은 고체 조직 샘플, 및 그것들의 자손을 포함한다. 이 정의는 또한 예컨대 시약으로의 처리, 가용화, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특정 성분에 대한 풍부화에 의하여서와 같이 획득된 후에 어떠한 방법으로든지 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플" 은 임상 샘플을 포함하며, 또한 배양중의 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.
"개체" 는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람이다. 포유동물로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 농장 동물, 스포츠 동물, 및 애완동물이 있다.
"유효량" 은 유익한 또는 바람직한 임상 결과를 실제화하기에 충분한 양이다. 유효량은 1 회 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해서는, 아데노바이러스 벡터의 유효량은 질병 상태의 진행을 완화, 호전, 안정화, 역전, 서행 또는 지연시키기에 충분한 양이다.
본원에서 사용되는 바, "치료" 는 유익한 또는 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 대해서, 유익한 또는 바람직한 임상 결과는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 검출가능한 것이든 그렇지 못한 것이든 징후의 경감, 질병 크기의 감소, 질병의 안정화된 (즉, 나빠지지 않는) 상태, 질병의 확산 (즉, 전이) 방지, 질병 진전의 서행 또는 지연, 질병 상태의 호전 또는 완화, 및 회복 (전체적이든 부분적이든)이다. "치료" 는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
질병의 "완화" 는 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여하지 않았을 경우와 비교하였을 때, 질병 상태의 크기 및/또는 바람직하지 못한 임상적 징후가 줄어들고 및/또는 진행의 시간 경과가 느려지거나 또는 길어지는 것을 의미한다.
"차폐된 아데노바이러스" 는 친수성 중합체 ("차폐제")와 복합체가 형성되어 있는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 아데노바이러스의 자연 발생 단리물 또는 본원 발명에서 설명되는 것과 같은 유전공학적으로 처리된 아데노바이러스 벡터를 포함하여 어떠한 바이러스든지 좋다. 차폐제는 바람직하게는 면역원성이 낮은 것이 좋다. 허용되는 친수성 중합체로는 다음과 같은 것들이 있다: 폴리에틸렌/폴리프로필렌 공중합체, 폴리아크릴산 유사체, 셀룰로오스와 같은 당 중합체, 폴리포름알데히드, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 등. 친수성 중합체는 공유 또는 비-공유 부착에 의하여 바이러스의 캡시드 단백질, 특히 헥손 및 섬유 캡시드 단백질과 복합체를 형성할 수도 있다. 바람직한 친수성 중합체는 PEG 이며, 바람직한 차폐된 아데노바이러스는 PEG 에 공유 결합된 아데노바이러스 ("공유적으로 페길레이트된 아데노바이러스")이다.
AFP-생성 세포에 대하여 복제 특이성을 가지고 있는 아데노바이러스 벡터
본 발명은 AFP-TRE 의 전사적 조절하에 아데노바이러스 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터 구성물을 제공한다. 바람직하게도, 아데노바이러스 유전자는 세포독성에 기여하며 (직접적으로 및/또는 간접적으로), 보다 바람직하게는 세포 사망에 기여하거나 또는 세포 사망을 유발하며, 가장 바람직하게는 아데노바이러스 복제에 필수적이다. 세포독성에 기여하는 유전자의 실예로는, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP; 하기에서 논의됨)이 있다. 아데노바이러스 벡터(들)이 AFP 를 발현하는 표적 세포들에서의 증식에 대하여 선택적으로 (즉, 우선적으로) 복제 경합성일 때, 이들 세포는 아데노바이러스가 증식할 때 우선적으로 사망할 것이다. 아데노바이러스 벡터(들)이 악성 및 정상 간세포의 혼합물과 예를 들면 시험관내에서 또는 생체내에서 조합됨으로써, 아데노바이러스 벡터(들)은 우선적으로 표적 악성 간세포에서 복제할 것이다. 일단 표적 세포가 선택적인 세포독성 및/또는 세포용해성 복제로 인해 파괴되면, 아데노바이러스 벡터 복제는 크게 감소되며, 그로써 감염 급등의 가능성과 바람직하지 못한 방관적 효과가 감소된다. 시험관내 배양물은 표적 세포, 예컨대 AFP-생성 신생 세포의 발생 (즉, 존재) 및/또는 재발에 대하여 혼합물 (예컨대 생검 또는 다른 적절한 생물학적 샘플)을 모니터하기 위하여 보유될 수 있다. 추가로 세포독성을 확인하기 위해서는, 세포독성 효과를 가지고 있는 하나 또는 그 이상의 트랜스유전자가 존재하고 선택적인 전사적 조절하에 놓일 수 있다. 이런 구체예에서는, 누구든지 표적 세포가 파괴될 것이라는 보다 높은 확신을 제공할 수 있다. 추가로, 또는 다르게는, 세포독성 및/또는 세포 사망에 기여하는 아데노바이러스 유전자 (예컨대 ADP)가 선택적인 전사적 조절하에, 또는 그것과 관계없이 아데노바이러스 벡터안에 도입될 것이다.
본 발명에 사용되는 AFP-TRE 는 포유동물 세포, 예컨대 그것들에 제한되는 것은 아니지만 사람, 래트, 및 마우스로부터 유도된다. 설치류 및 사람의 AFP 5' 플랭킬 서열은 문헌에 설명되어 있고, 따라서 본 발명의 실시를 위해 이용될 수 있으며, 본원에서 상세하게 설명될 필요는 없다. 래트의 AFP 5' 플랭킹 서열에 대해서는 설명되어 있고 특성이 확인되어 있다 [Wen et al. (1991) DNA Cell Biol. 10:525-536; Wen et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:1911-1918]. 래트의 AFP 5' 플랭킹 영역은 컴플렉스 1 (-2800 부터 -2400 까지), 컴플렉스 2 (-4500 부터 -3500 까지), 및 컴플렉스 3 (-7000 부터 -4900 까지)으로 언급되는 세 개의 상류 인핸서를 함유하고 있다. 프로모터 영역은 -250 부터 -1 까지를 포함하며, -178 부터 -155 까지의 프로모터 엘레먼트는 만약 인핸서가 멀리 떨어져 있지만 인핸서가 보다 가까워진다면 필요없는 경우에 필요하다 [Wen et al. (1991 및 1993)]. 그루프 등은 가장 멀리 있는 인핸서인 컴플렉스 3 (344 bp 의 HincII 단편상에 있는)의 활성에 대해 보고하였다 [Groupp et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22178-22187]. 아버놋 등은 사람 간암 셀라인 HuH7, Hep 3B, 및 HepG2 에서 가장 기부쪽에 가까운 인핸서와 프로모터 (및 마우스의 사일런서 서열과 상동하는 영역)를 포함하고 있는 서열 -3127 부터 +102 까지의 활성을 발표하였다.
마우스의 5' 플랭킹 AFP 서열도 설명되어 있고 특성이 확인되어 있다 [Ghebranious et al. (1995) Mol. Reprod. Devel. 42:1-6]. 래트와 같이, 마우스 5' 플랭킹 AFP 서열도 세 개의 별도의 인핸서 엘레먼트들을 함유하고 있다. 사일런서, 또는 성인의 간에서 중단 (shut off)과 관련되어 있는 엘레먼트는 -838 과 -250 사이에서 발견된다 [Emerson et al. (1992) Devel. Dynam. 195:55-66].
바람직하게는, AFP-TRE 는 사람이다. AFP-특이적 인핸서 활성의 클로닝 및 특성확인은 문헌에 설명되어 있다 [Watanabe et al. (1987)]. 전체의 5' AFP 플랭킹 영역 (프로모터, 잠재적인 사일런서, 및 인핸서 엘레먼트를 함유함)은 전사 출발 부위로부터 상류쪽으로 대략 5 kb 내에 함유된다. 사람에서 AFP 인핸서는 AFP 유전자의 전사 출발 (CAP) 부위와 관련하여 약 -3954 와 약 -3335 사이에 위치한다. 사람의 AFP 프로모터는 약 -174 부터 약 +29 까지의 영역을 포함한다. 이도 등은 HCC 에 특이적인 259 bp 의 프로모터 단편 (-230 에서 +29 까지)을 발표하였다 [Ido et al. (1995) Cancer Res. 55:3105-3109]. AFP 인핸서는 전사 출발 부위와 관련하여 -3954 와 -3335 사이에 위치한, A 와 B 로 언급되는 두 개의 영역을 함유하고 있다. 프로모터 영역은 전형적인 TATA 및 CAAT 상자를 함유하고 있다. 바람직한 것은, AFP-TRE 는 최소한 하나의 인핸서 영역을 함유한다는 것이다. 보다 바람직한 것은 AFP-TRE 가 두가지의 인핸서 영역을 함유하는 것이다.
카네코 등은 4.9 kb 의 HindIII - HindIII 단편을 사용하였다 (Kaneko et al. (1995)). 카나이 등은 0.2 kb (BglII 에서 HindIII)의 프로모터 절편과 인핸서 A 및 B 를 함유하고 있는 절편 (-4.0 에서 -3.3 kb; ApaI 에서 BglII)을 함유한 보다 짧은 단편상에서의 활성을 나타냈다 (Kanai et al. (1995 및 1996)).
한 구체예에서, AFP-TRE 는 대략 0.6 kb 의 인핸서 영역 (-3954 에서 -3335 까지)과 0.2 kb 의 프로모터 영역 (-174 에서 +29 까지)을 포함하며, 이 두 영역은 모두 도 1B 에서 알 수 있는 바와 같이 AFP-생성 세포에 특이적이다. 이들 두 유전적 엘레먼트의 병렬상태로 인해 완전히 기능적인 AFP-TRE 가 생성된다 (실시예 1). 따라서, 본 발명은 또한 AFP-TRE 가 SEQ ID NO:1 을 포함하는 아데노바이러스 벡터 (즉, SEQ ID NO:1 의 서열)를 포함한다.
다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO:1 의 약 +1 에서 약 +600 까지의 서열을 포함한다. 이 구체예는 그러므로 인핸서 영역 A 와 B 를 포함한다. 다른 구체예에서, AFP-TRE 는 SEQ ID NO:1 의 약 +600 부터 약 +827 까지의 서열을 포함하며; 따라서 AFP 프로모터를 포함한다. 인핸서 영역은 추가로 세분화될 수 있다 (영역 A 및 B); 그러므로, 추가의 구체예는 (a) SEQ ID NO:1 의 약 +1 부터 약 +300 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AFP-TRE; (b) SEQ ID NO:1 의 약 +300 부터 약 +600 까지의 서열을 포함하는 AFP-TRE 를 포함한다.
다른 구체예에서, AFP-TRE 는 전체의 5.1 kb 의 5' 플랭킹 서열 (SEQ ID NO:2)을 함유한다.
AFP-TRE 는 또한 다량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, AFP-TRE 는 최소한 두 개, 최소한 세 개, 최소한 네 개, 또는 최소한 다섯 개의 AFP 프로모터 단편들로 이루어진 탠덤 시리즈를 포함할 수 있다. 또는 달리, AFP-TRE 는 하나 또는 그 이상의 AFP 인핸서 영역을 따라 하나 또는 그 이상의 AFP 프로모터 영역을 가질 수 있다. 이들 다량체들은 또한 이종 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 함유할 수 있다.
AFP-TRE 는 사일런서가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 사일런서 (즉, 네가티브 조절 엘레먼트)의 존재는 비-허용 (즉, 비-AFP-생성) 세포에서 전사 (및 그로써 복제)를 중단하는데 보조역할을 할 것이다. 그러므로, 사일런서의 존재는 비-표적 세포에서 아데노바이러스 벡터의 복제를 보다 효과적으로 방해함으로써 증강된 세포-특이적 복제를 제공할 수 있다. 또는 달리, 사일런서의 결핍은 표적 세포에서의 복제를 이루는데 보조할 수 있으며, 그로써 표적 세포에서의 보다 효과적인 복제로 인하여 증강된 세포-특이적 복제를 제공한다. AFP 유전자의 5' 플랭킹 영역은 -1822 부터 -951 까지 (원위 엘레먼트) 및 -402 부터 -169 까지 (기부 엘레먼트)의 두 개의 사일런서 엘레먼트를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다 [Nakabayashi et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11:5885-5893]. 카나이 등은 사일런서가 없는 단편의 활성이 대략 5.0 kb 의 천연 5' 플랭킹 영역에 대한 보고된 활성보다 더 높다고 보고하였다.
당업자에 의하여 쉽게 인지되는 바와 같이, AFP-TRE 는 폴리뉴클레오티드 서열이고, 그 자체로서 다양한 서열 변경에도 불구하고 기능을 나타낼 수 있다. 뉴클레오티드의 치환, 첨가, 및 결실 방법은 당해 기술분야에 공지이며, 쉽게 활용할 수 있는 기능성 검정 (예컨대 CAT 또는 루시페라제 리포터 유전자 검정)으로 인하여, 당업자가 서열 변이체가 필요한 세포-특이적 전사 기능을 나타내는지의 여부를 측정하는 것이 가능하다. 그러므로, 본 발명은 또한 핵산 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함한, 본원에 설명되는 핵산 서열의 기능적으로 보존된 변이체를 포함한다. 한가지 이론에 구속되는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은 특정 변형이 그 결과로서 증강된 발현 수준을 포함하여 조절된 발현 수준을 초래할 가능성이 있음을 주지한다. 조절된 결과의 발현 수준, 바람직하게는 증강된 발현 수준의 달성은 특히 간암의 특정한, 보다 공격적인 형태의 경우에, 또는 보다 신속하고 및/또는 공격적인 패턴의 사망이 경고되는 경우에 (예를 들면 개체의 면역손상된 상태로 인하여) 바람직할 것이다.
어떻게 AFP-TRE 활성이 측정될 수 있는 지의 한 실예로서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그러한 서열의 세트가 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법, 예컨대 화학적 합성법, 부위-특정 돌연변이 생성법, PCR, 및/또는 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 시험될 서열(들)은 적절한 리포터 유전자, 예를 들어 그것들에 한정되는 것은 아니지만 클로르암페니콜 아세틸 트란스페라제 (CAT), β-갈락토시다제 (lacZ 유전자에 의해 코드화됨), 루시페라제 (luc 유전자에 의해 코드화됨), 녹색 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 및 양고추냉이 과산화효소를 함유하고 있는 벡터안에 삽입된다. 그러한 벡터들 및 검정법들은 무엇보다도 상업적으로 쉽게 활용할 수 있다. 그렇게 구성된 플라스미드는 잠재적인 AFP-TRE 에 의하여 조절되는 결과로 리포터 유전자의 발현에 대하여 시험하기 위하여 적당한 숙주 세포안에, 당해 기술분야에 공지되어 있는 형질전환방법, 예컨대 칼슘 포스페이트 침전법, 일렉트로포레이션, 리포솜 (리포펙틴), 및 DEAE-덱스트란을 사용하여 형질전환된다. 적당한 숙주 세포로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, Hep3B, Hep G2, HuH7, HuH1/C12 및 AFP-SK-Hep-1 을 포함하여, AFP 를 생성하는 모든 세포타입을 포함한다. AFP 를 생성하지 않는 세포, 예컨대 LNCaP, HBL-100, 창 간세포, MCF-7, HLF, HLE, 3T3, 및 HeLa 가 대조표준으로서 사용된다. 결과는 표준 검정법을 사용하여 리포터 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 얻어진다. AFP-생성 세포와 대조 세포 사이의 발현의 비교 결과는 전사적 활성화의 존재 또는 부재가 나타낸다. 하기 실시예 2 에서는 800 bp 의 잠재적인 AFP-TRE (상술된 바와 같이, 0.2 kb 의 프로모터 영역에 융합된 0.6 kb 의 인핸서 영역)가 루시페라제 리포터 검정을 사용하여 시험된 실험에 대해 설명된다.
전사적 증가 또는 활성화에 의하여, 전사는 표적 세포 (즉, AFP-생성 세포)에서 기본 수준이상으로 최소한 약 2 배, 바람직하게는 최소한 약 5 배, 바람직하게는 최소한 약 10 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 20 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 200 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 400 배 내지 약 500 배, 가장 바람직하게는 최소한 약 1000 배로 증가되는 것으로 의도된다. 다양한 AFP-TRE 사이의 또는 그것들중의 비교 결과는 단일한 AFP-생성 세포내에서 발현의 수준을 측정하고 비교함으로써 평가될 수 있다. AFP-TRE 의 절대적인 전사 활성은 여러 가지 인자들, 예컨대 표적 세포의 성질, AFP-TRE 의 전달방식 및 형태, 및 선택적으로 전사적으로 활성화될 코딩 서열에 따라 좌우될 것임이 인지된다. 사용된 다양한 플라스미드 크기를 상쇄하기 위하여, 활성은 형질전환된 플라스미드의 몰당 상대 활성으로서 표현될 수 있다. 또는 달리, 전사 수준 (즉 mRNA)은 표준 노던 분석 및 혼성화 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 형질전환의 수준 (즉, 형질전환 효율)은 상이한 TRE, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMVV) 즉석 초기 프로모터의 제어하에 상이한 리포터 유전자를 코드화하는 플라스미드를 공-형질전환시킴으로써 측정된다. 이 분석은 또한 네가티브 조절 영역, 즉 사일런서를 나타낼 수 있다.
또는 달리 AFP 를 발현하는 세포에 대한 아데노바이러스성 복제 선호성을 부여하는 능력에 대하여 잠재적인 AFP-TRE 가 평가될 수 있다. 이 검정을 위해서는, 잠재적인 AFP-TRE 에 작동가능하게 연결된 복제에 필수적인 아데노바이러스 유전자를 함유하고 있는 구성물이 AFP 를 발현하는 세포안에 형질전환된다. 그런 세포안에서의 바이러스 복제는, 예를 들면, AFP 를 생성하지 않는 세포중의 구성물에 의한 바이러스 복제와 비교된다. 이런 종류의 검정에 대해서는 하기 실시예 1 에서 보다 상세하게 설명된다.
본 발명을 실시하기 위해서 반드시 최대 활성을 가지거나, 또는 최소 크기를 가지는 AFP-TRE 를 사용할 필요는 없음이 주지된다. 필수적인 활성 정도는 무엇보다도 예상된 용도와 원하는 결과에 의하여 결정된다. 예를 들어, 만약 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 AFP-생성 활성에 대하여 세포를 모니터하기 위하여 사용된다면, AFP-TRE 에 의한 최대 반응도보다 적은 반응도로도 그러한 세포의 존재를 정성적으로 나타내기에 충분할 것이라는 것이 가능하다. 유사하게, 만약 질병 상태를 치료 또는 완화시키기 위하여 사용된다면, 만약, 예를 들어 AFP-생성 세포가 특히 병원성이지 않거나 및/또는 질병의 크기가 상대적으로 한정된다면 원하는 결과에 대해 최대 반응도보다 작은 반응도로도 충분할 수 있다.
AFP-TRE 의 크기는 부분적으로 아데노바이러스 벡터의 용량에 의해 측정될 것이며, 계속해서 벡터의 예상된 형태에 따라 좌우된다 (하기 참조). 일반적으로 최소 크기가 바람직할 다른 서열, 예컨대 트랜스유전자 (하기에서 논의됨) 또는 추가의 조절 서열의 삽입을 위한 잠재적인 공간을 제공하기 때문에, 최소 크기가 바람직하다. 그러나, 만약 추가 서열이 예상되지 않는다면, 또는 예를 들어 아데노바이러스 벡터가 유지되고 어떠한 바이러스 패키징 강제요소와 관계없이 전달된다면, 그 결과의 아데노바이러스 벡터가 복제 경합 성질을 띄는 한 보다 큰 AFP-TRE 가 사용될 수 있다.
만약 아데노바이러스 서열이 결실되었다면, 아데노바이러스 벡터는 게놈 크기의 총 약 5 % 까지의, 또는 대략 1.8 kb 의 외부 서열로 패키지될 수 있다. 만약 비-필수 서열이 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다면, 그 때에는 추가의 4.6 kb 의 삽입물이 허용될 수 있다 (즉, 총 약 1.8 kb 플러스 4.6 kb, 약 6.4 kb). 결실될 수 있는 비-필수 아데노바이러스 서열의 실예는 E3 과 E4 이다 (E4 ORF6 이 유지되는 한).
AFP-특이적 전사 활성이 5.1 kb 5' 플랭킹 단편에서 나타났기 때문에, AFP-TRE 는 최소한 약 5.0 kb 정도로까지 클 수 있다. 바람직하게는, AFP-TRE 는 약 2.5 kb, 보다 바람직하게는 약 1 kb, 보다 바람직하게는 약 0.8 kb, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 kb, 가장 바람직하게는 약 0.3 kb (이 크기들은 AFP 인핸서 엘레먼트중 하나의 대략적인 크기이다)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
다양한 복제-경합 아데노바이러스 벡터들은 단일 또는 다중 아데노바이러스 유전자(들)이 AFP-TRE 의 제어하에 있는 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, AFP-TRE 는 복제 유전자, 예컨대 E1A, E1B 또는 E4 와 같은 초기 유전자, 또는 L1, L2, L3, L4, 또는 L5 와 같은 후기 유전자의 바로 상류에 있는 또는 이들 유전자에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 벡터안에 도입될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 아데노바이러스 벡터가 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E1A 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서는, 아데노바이러스 벡터가 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E1B 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서는, 아데노바이러스 벡터가 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E4 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서는, 상술한 것들의 다양한 조합 및 변경이 실시될 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서는, 아데노바이러스 벡터가 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 EA1 유전자와, AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E1B 유전자를 포함한다 (즉, "이중" AFP-TRE 구성물). 다른 구체예에서는, 아데노바이러스 벡터는 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E1A 유전자, 두 번째 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E1B 유전자, 및 세 번째 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 E4 유전자를 포함한다. 상기에서 "첫 번째", "두 번째", "세 번째" 등의 AFP-TRE 는 별도의 AFP-TRE 가 각각 각각의 유전자를 구동시킴을 의미한다. 사용된 AFP-TRE 는 동일한 서열 조성을 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 그러나, 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 또한 하나 이상의 아데노바이러스 유전자의 단일한 AFP-TRE 조절된 전사를 가지는 것이 가능하다.
한 구체예에서, E1A 및 E1B 는 다음의 구성물을 제조함에 의하여 하나 또는 그 이상의 AFP-TRE 의 제어하에 있다. 야생형 아데노바이러스에서는, E1A 와 E1B 가 세로 배향으로 존재한다. E1A 로부터 E1B 프로모터에 이르는 코딩 영역을 함유하고 있는 단편은 아데노바이러스 게놈으로부터 절출되고 반대 배향으로 재삽입된다 (도 4). 이 형태로, E1A 와 E1B 프로모터는 서로 바로 옆에 있게 되고, 다음에 반대 배향의 E1A 코딩 절편이 있으며 (따라서 E1A 또는 E1B 프로모터중 어느 것도 E1A 에 작동가능하게 연결되지 않는다), 이어서 E1A 와 관련하여 반대 배향으로 E1B 가 있게 된다. AFP-TRE(s) 는 E1A 와 E1B 코딩 영역 (이것들은 반대 배향이다) 사이에 삽입될 수 있으며, 따라서 이들 영역은 TRE(s) 의 제어하에 놓이게 된다. 적절한 프로모터 서열이 도 4 에 도시된 바와 같이 E1A 와 E1B 영역에 가깝게 삽입된다. 그러므로, AFP-TRE 는 E1A 와 E1B 를 둘다 유도할 수 있다. 그러한 형태는 예를 들어 만약 각각이 E1A 와 E1B 의 코딩 영역의 5' 인 두 개의 AFP-TRE 가 무상 (천연)의 Ad 게놈에 삽입되었다면, 일어날 수 있는 가능한 루프-아웃 (loop-out) 사건을 방해할 것이다. E1A 와 E1B 사이에 다중 클로닝 부위를 도입시킴으로써 다른 유형의 AFP, 또는 간-특이적 TRE 가 삽입될 수 있고, 또는 다른 세포-특이적 조절 엘레먼트, 바람직하게는 질병 상태, 예컨대 신생물 (종양)과 관련된 엘레먼트들이 삽입될 수 있다. 그러므로, 이 구성물은 일반적으로 아데노바이러스 E1A 및 E1B 의 세포-특이적 제어, 일시적 제어, 또는 다른 제어 수단에 사용될 수 있으며, 그로써 아데노바이러스 복제가 선택된 전사 매개변수에 따라 좌우되도록 하는 편리하고 강력한 방법을 제공한다.
단일 또는 다중 아데노바이러스 유전자(들)이 AFP-TRE 의 제어하에 있는 것 외에 리포터 유전자(들)이 AFP-TRE 의 제어하에 있는 다양한 다른 복제-경합성 아데노바이러스 벡터들이 본 발명에 따라 제조될 수 있다.
예를 들어, AFP-TRE 는 아데노바이러스 벡터안에 E1A 또는 E1B 와 같은 초기 유전자에 작동가능하게 연결되고 초기 유전자의 바로 상류에 도입될 수 있으며, 이 구성물은 또한 리포터 유전자의 발현을 유도하는 두 번째의 AFP-TRE 를 함유할 수 있다. 리포터 유전자는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 클로르암페니콜 아세틸 트란스페라제 (CAT), β-갈락토시다제 (lacZ 유전자에 의해 코드화됨), 루시페라제, 알칼리 포스파타제, 녹색 형광 단백질, 및 양고추냉이 과산화효소를 포함하는 리포터 단백질을 코드화한다. 생물학적 샘플중에 있는 추정되는 전립선 세포(들)을 검출하기 위해서, 생물학적 샘플은 리포터 유전자 (예컨대 루시페라제)가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 변형된 아데노바이러스로 처리될 수 있다. AFP-TRE 는 AFP-TRE 가 제 기능을 할 수 있는 세포 (예컨대 AFP-발현 세포)에서 전사적으로 활성일 것이며, 그 결과 루시페라제가 생성될 것이다. 이런 생성으로 예컨대 사람 숙주 또는 생물학적 샘플중에서 안드로겐 수용체를 생성하는 세포의 검출이 가능해진다. 또는 달리, 생존을 위해 조건적으로 필요한 생성물 (예컨대 항생물질 내성 마아커)을 코드화하는 유전자가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 아데노바이러스 벡터가 구성될 수도 있다. 이 아데노바이러스 벡터가 생물학적 샘플에 도입되면, AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 예컨대 AFP-발현 세포는 항생물질 내성이 될 것이다. 그런 다음 항생물질이 배지안에 도입되어 비-안드로겐 수용체 생성 세포가 죽게 될 수 있다.
비-특이적 복제를 최소화하기 위하여, 내인성 (즉, 아데노바이러스의) TRE 가 제거되는 것이 바람직하다. 이 작업으로 또한 아데노바이러스 벡터안에 삽입물에 대한 더 많은 공간이 제공될 것이며, 만약 아데노바이러스 벡터가 바이러스로서 패키지된다면 이것은 특별히 관심있는 일이다 (하기 참조). 보다 중요한 것은 내인성 TRE 의 결실이 재조합 사건의 가능성을 방해함으로써 AFP-TRE 가 결실되고, 내인성 TRE 가 그것의 각각의 아데노바이러스 코딩 서열의 전사적 제어를 모방하게 된다 (그로써 비-특이적 복제가 가능해진다). 한 구체예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 유전자(들)의 내인성 전사 조절 서열이 결실되고 AFP-TRE 에 의해 교체되도록 구성된다. 그러나, 내인성 TRE 는 또한 충분한 세포-특이적 복제 선호성이 보존된다면 아데노바이러스 벡터(들)안에 보유될 수 있다. 이들 구체예는 내인성 TRE 외에 AFP-TRE 를, 바람직하게는 TRE 와 복제 유전자 코딩 절편 사이에 AFP-TRE 를 끼워넣는 상태로 제공함으로써 구성될 수 있다. 요구되는 세포-특이적 복제 선호성은 AFP 를 발현하는 세포에서의 아데노바이러스 벡터의 복제와 비-AFP 생성 세포에서의 복제를 비교하는 검정을 수행함으로써 표시된다. 일반적으로, 최소한 약 2 배, 바람직하게는 최소한 약 5 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 10 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 200 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 400 배 내지 약 500 배, 가장 바람직하게는 최소한 약 1000 배의 복제 차이가 바람직하다. 허용가능한 차이는 경험적으로 (예를 들어 실시예에서 설명되는 검정을 사용하여) 측정될 수 있으며, 아데노바이러스 벡터의 예상되는 용도 및/또는 원하는 결과에 따라 좌우될 것이다.
적당한 표적 세포는 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 것이면 어떤 세포 유형이든지 좋다. 바람직한 세포는 그것에 한정되는 것은 아니지만, AFP 를 발현하는 종양 세포를 포함하여 AFP 를 발현하거나, 생성하거나, 또는 발현할 수 있는, 또는 생성할 수 있는 세포이다. 그러한 세포의 실예로는 간세포성 암종 세포, 생식선 및 다른 체세포 종양 (특히 내배엽 만곡 종양), 뇌종양 세포, 난소 종양세포, 췌장의 소엽 세포 암종 [Kawamoto et al. (1992) Hepatogastroenterology 39:282-286], 일차 담낭 종양 [Kat suragi et al. (1989)Rinsko Hoshasen 34:371-374], 자궁내막 선암종 세포 [Koyama et al. (1996) Jpn. J. Cancer Res. 87:612-617], 및 전술한 것들의 모든 전이 (폐, 부신, 골수, 및/또는 비장에서 발생할 수 있는)가 있다. 어떤 경우에는, 특정 췌장 및 위암으로부터 간으로 전이된 질병이 AFP 를 생성한다. 특히 바람직한 것은 간세포성 암종 세포 및 그것의 모든 전이이다. AFP 생성은 당해기술분야의 표준 검정, 예컨대 RIA, ELISA 또는 AFP 단백질 생성수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯 (면역검정) 또는 AFP mRNA 생성수준을 측정하기 위한 노던 블롯을 사용하여 측정될 수 있다. 또는 달리, 그러한 세포들은 AFP-TRE 를 전사적으로활성화시키는 (즉 AFP-TRE 의 기능을 허용하는) 능력에 의해 확인 및/또는 특성확인될 수 있다.
아데노바이러스의 다양한 혈청형중 어느 것이든지, 예컨대 Ad2, Ad5, Ad12 및 Ad40 중 어느 것이든지 사용될 수 있다. 예시를 목적으로, 혈청형 Ad5 가 하기에서 설명될 것이다.
어떤 구체예에서는, AFP-TRE 가 증식에 필수적인 아데노바이러스와 함께 사용됨으로써, 복제 경합이 AFP 를 발현하는 표적 세포에서 우선적으로 이루어질 수 있다. 바람직하게도, 유전자는 초기 유전자, 예컨대 E1A, E1B, E2, 또는 E4 인 것이 좋다. (E3 은 바이러스 복제에는 필수적이지 않다.) 보다 바람직한 것은 AFP-TRE 의 제어하에 있는 초기 유전자는 E1A 및/또는 E1B 및/또는 E4 인 것이 좋다. 하나 이상의 초기 유전자가 AFP-TRE 의 제어하에 놓일 수 있다. 하기 실시예 1 에서는 그러한 구성물에 대하여 보다 상세하게 설명된다.
E1A 유전자는 바이러스 감염 직후 (0 내지 2 시간)에 발현되고 어떠한 다른 바이러스 유전자보다 먼저 발현된다. E1A 단백질은 반대쪽으로-작용하고, 포지티브로 작용하는 전사 조절 인자로서 작용하고, 다른 초기 바이러스 유전자 E1B, E2, E3, E4, 및 프로모터-기부 주요 후기 유전자들의 발현에 필요하다. 명명법에도 불구하고 주요 후기 프로모터에 의해 유도된 프로모터 기부 유전자들은 Ad5 감염후 초기 시간동안에 발현된다 [Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175-208; Flint (1986) Advances Virus Research 31:169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25-38]. 기능성 E1A 유전자가 없을 때에는, 바이러스 DNA 복제에 필요한 유전자 생성물이 생성되지 않기 때문에 바이러스 감염이 진행되지 않는다 [Nevins (1989) Adv. Virus Res. 31:35-81]. Ad5 E1A 의 전사 출발 부위는 바이러스 게놈상에서 498 에 있으며, E1A 단백질의 ATG 출발 부위는 560 에 있다.
E1B 단백질은 반대쪽으로 작용하며 핵으로부터 세포질로의 후기 mRNA 의 전달에 필요하다. E1B 발현의 결핍은 후기 바이러스 단백질들의 불량한 발현 및 숙주 세포 단백질 합성을 중단시키는 능력의 부재를 초래한다. E1B 의 프로모터는 Ad40 과 Ad5 의 숙주 범위에서 차이를 규정하는 엘레먼트로서 관련되어 있다: 임상적으로 Ad40 은 장내바이러스이고, Ad5 는 급성 결막염을 유발한다 [Bailey, Mackay et al. (1993) Virology 193:631; Bailey et al. (1994) Virology 202:695-706]. Ad5 의 E1B 프로모터는 Sp1 과 TATA 상자에 대한 단일한 고친화성 인지 부위로 구성된다.
아데노바이러스의 E2 영역은 72 kDa 의 DNA-결합 단백질, 80 kD 의 선구 말단 단백질 및 바이러스의 DNA 중합효소를 포함하여 아데노바이러스 게놈의 복제에 관련된 단백질들을 코드한다. Ad5 의 E2 영역은 각각 76.0 과 72.0 지도 유니트에서 지도화되어 있는 두 개의 프로모터, E2 초기와 E2 후기로부터 오른 쪽 방향으로 전사된다. E2 후기 프로모터가 감염의 후기 단계동안 일시적으로 활성이고 E1a 트랜스액티베이터 (transactivator) 단백질과 무관한 반면, E2 초기 프로모터는 바이러스 복제의 초기 단계동안 중요하다.
27050 부터 27150 에 걸쳐 Ad5 에 지도화되어 있는 E2 초기 프로모터는 주요 전사 개시 부위 및 E2 전사물의 약 5 % 를 차지하는 중요하지 않은 전사 개시 부위, 두 개의 비-표준 TATA 상자, 두 개의 E2F 전사 인자 결합 부위 및 ATF 전사 인자 결합 부위로 구성된다.
E2 프로모터 구조에 관한 상세한 설명은 문헌을 참조한다 [Swaminathan et al., Curr. Topics in Micro. and Imm. (1995) 199 part 3:177-194].
E2 후기 프로모터는 대응하는 가닥에 의해 코드화된 유전자의 코딩 서열과 겹치고, 그러므로 유전자 조작이 쉽지 않다. 그러나, E2 초기 프로모터는 대응하는 가닥상의 33 kD 단백질에 대한 코딩 서열과 단지 몇 개의 염기쌍만 겹친다. SpeI 제한 부위 (Ad5 위치 27082)는 상기 언급된 33 kD 단백질에 대한 중지 코돈의 일부이며, 주요 E2 초기 전사 개시 부위와 TATA-결합 단백질 부위를 상류의 전사 인자 결합 부위 E2F 와 ATF 로부터 편리하게 분리시킬 수 있음이 주지된다. 그러므로, SpeI 단부를 가지고 있는 AFP 를 1-가닥의 SpeI 부위안에 삽입시키는 것은 내인성 E2 초기 프로모터를 파괴하게 될 것이고, E2 전사물의 AFP-제한 발현을 허용하게 될 것이다.
E4 유전자는 많은 전사 생성물을 가지고 있다. E4 영역은 바이러스 게놈 DNA 의 복제를 자극하고 후기 유전자 발현을 자극하는 원인이 되는 두 개의 폴리펩티드를 코드한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF) 3 과 6 의 단백질 생성물은 E1B 로부터 얻어지는 55 kD 단백질이 E2F-1 과 DP-1 의 이종이량체와 결합됨으로써 이들 기능을 수행할 수 있다. ORF 6 단백질은 활성을 위해 E1B 55 kD 단백질과의 상호작용을 필요로 하는 반면, ORF 3 단백질은 그렇지 않다. ORF3 및 ORF 6 으로부터 얻어지는 기능성 단백질이 없을 때, 야생형 바이러스의 효율의 10-6보다 적은 효율을 가지는 플라크들이 생성된다. 추가로 바이러스 복제를 AFP-생성세포에만 제한시키기 위하여, E4 ORF 6 단백질에 좌우되는 후기 유전자 합성과 바이러스 DNA 복제를 지시하는 E4 ORF 1 내지 3 이 결실될 수 있다. 그러한 돌연변이체가 E1B 영역이 AFP-TRE 에 의해 조절되는 서열과 조합됨으로써, E1B 기능과 E4 기능이 모두 AFP-TRE 유도 E1B 에 좌우되는 바이러스가 얻어질 수 있다.
본 발명과 관련된 주요 후기 유전자들은 아데노바이러스 단백질들을 코드화하는 유전자 L1, L2, L3, L4, 및 L5 이다. 이들 유전자는 모두 (전형적으로 구조 단백질들을 코드함) 아마도 아데노바이러스 복제에 필요하다. 후기 유전자들은 모두 Ad5 의 +5986 에서 +6048 사이에 위치한 주요 후기 프로모터 (MLP)의 제어하에 있다.
AFP-TRE 가 기능하는 것을 허용하는 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 세포에서 우선적인 복제 경합성에 의하여 선택적인 세포독성 및/또는 세포용해성 활성을 부여하는 것외에, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 추가로 AFP-TRE 의 제어하에 있는 이종 유전자 (트랜스유전자)를 포함할 수 있다. 이 방법으로, 다양한 유전적 능력이 AFP 를 발현하는 표적 세포, 특히 AFP-생성 암세포안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 어떤 경우에는, AFP- 생성 표적 세포의 예컨대 다루기 어려운 성질 또는 특정 공격성으로 인한 세포독성 활성의 정도 및/또는 속도를 증강시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이것은 세포-특이적 복제성 세포독성 활성을 예컨대 HSV-tk 및/또는 세포가 5-플루오로시토신 (5-FC)을 화학치료제인 5-플루오로우라실 (5-FU)로 대사할 수 있도록 만들어주는 시토신 탈아민효소 (cd)의 세포-특이적 발현과 결합시킴으로써 이루어질 수 있다. 이런 유형의 트랜스유전자를 사용함으로써 또한 부수적인 효과를 제공할 수 있다.
아데노바이러스 벡터(들)을 경유하여 도입될 수 있는 다른 바람직한 트랜스유전자로는 세포독성 단백질, 예컨대 디프테리아 독소, 리신 또는 아브린의 A 사슬을 코드화하는 유전자 [Palmiter et al. (1987) Cell 50:435; Maxwell et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1576; Behringer et al. (1988) Genes Dev. 2:453; Messing et al. (1992) Neuron 8:507; Piatak et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4937; Lamb et al. (1985) Eur. J. Biochem. 148:265; Frankel et al. (1989) mol. Cell. Biol. 9:415], 아폽토시스 (apoptosis)를 개시할 수 있는 인자를 코드화하는 유전자, 안티센스 전사물 또는 리보자임을 코드화하는 서열 (이것은 다른 능력중에서도 증식에 필수적인 단백질, 예컨대 구조 단백질을 코드화하는 mRNA 를 특정할 수 있다), 또는 전사 인자; 바이러스 또는 다른 병원성 단백질 (병원체는 세포내에서 증식한다); 핵산 가수분해효소 (예컨대 RNase A) 또는 단백질 분해효소 (예컨대 아위신 (awsin), 파파인, 단백질 가수분해효소 K, 카르복시펩티다제 등)의 유전공학적으로 처리된 세포질 변이체를 코드화하는, 또는 Fas 유전자 등을 코드화하는 유전자가 있다. 관심의 다른 유전자들로는 시토카인, 항원, 경막 단백질, 등, 예컨대 IL-1, -2, -6, -12, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IFN-α, -β, -γ, TNF-α, -β, TGF-α, -β, NGF 등이 있다. 양성의 이펙터 유전자들은 초기상에서 사용될 수 있으며, 이어서 복제로 인한 세포독성 활성이 이어진다.
상기에서 논의된 바와 같이, 어떤 구체예에서는, E3 영역내에 코드화된 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP)이 아데노바이러스 벡터안에 유지된다 (즉, 함유된다). 주요 후기 프로모터 (MLP) 의 제어하에 있는 ADP 유전자는 숙주 세포 용해를 촉진하는데 중요한 단백질을 코드하는 것으로 여겨진다 [Tollefson et al. (1996) J. Virol. 70(4):2296; Tollefson et al. (1992) J. Virol. 66(6):3633]. 그러므로, ADP 유전자를 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터들은 아데노바이러스 벡터를 보다 더 강력하게 만드는 경향을 가질 수 있으며, 이것은 보다 더 효과적인 치료 및/또는 더 낮은 용량 요구를 가능하게 만든다.
따라서, 본 발명은 ADP 를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. ADP 를 코드화하는 DNA 서열 및 ADP 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22 와 SEQ ID NO:23 에 각각 도시되어 있다. 간단히 설명하면, ADP 코딩 서열은 바람직하게도 당해기술분야에 공지되어 있는 기법, 예컨대 PCR 을 사용하여 Ad2 로부터 얻어진다 (왜냐하면 Ad2 가 ADP 가 보다 완전하게 특성확인되어있는 스트레인이기 때문이다). 바람직하게도, Y 리더 (후기 유전자의 정확한 발현을 위해 중요한 서열이다)가 또한 얻어지고 ADP 코딩 서열에 결찰된다. 그런 다음 ADP 코딩 서열 (Y 리더가 있거나 없는)이 아데노바이러스 게놈에, 예컨대 E3 영역 (이곳에서는 ADP 코딩 서열이 MLP 또는 E3 프로모터에 의해서 유도될 것이다)안으로 도입될 수 있다. ADP 코딩 서열은 또한 아데노바이러스 게놈의 다른 위치, 예를 들면 E4 영역에 삽입될 수 있을 것이다. 또는 달리, ADP 코딩 서열은 그것에 한정되는 것은 아니지만, 다른 바이러스 프로모터, AFP 와 같은 조직 특이적 프로모터, 암배항원 (CEA), 뮤신, 및 래트의 프로바신을 포함한 이종 프로모터 (인핸서(들)이 있거나 없는)에 작동가능하게 연결될 수도 있다. 하기 실시예 4 에는 ADP 에 대한 코딩 서열이 Ad5 의 E3 영역에 삽입된 ADP 구성물에 대해 설명되어 있다.
ADP 와 관련하여, ADP 를 코드화하는 서열이 함유되어 있는 아데노바이러스 벡터의 세포독성 성질, 바이러스 수율, 및 생체내 세포독성 성질이 조사되었다. CN751 로 특성확인된 바이러스 구성물은 이들 서열을 함유하지 않은 대조 벡터와 비교했을 때 시험관내 세포를 죽이는데 및 바이러스 수율에서 상당히 효과적인 것으로 나타났다. 나아가, 털이 없는 마우스에서 LNCaP (전립선 암종 셀라인) 종양 이종이식편은 대조 아데노바이러스 벡터 또는 완충액을 받은 마우스들의 종양 크기와 비교할 때 크기가 감소하거나 또는 동일한 크기가 유지되었고 (즉, 성장이 억제되었다), 투여후 7 일이 지났을 때 CN751 과 대조 처리된 종양 사이의 종양 크기가 통계학적으로 큰 차이가 있었다. 종합적으로, 이들 데이터는 ADP-함유 아데노바이러스가 효과적인 세포독성제임을 강하게 시사한다.
따라서, 본 발명은 또한 ADP 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 비-자연 발생 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 ADP- 코드화 서열의 많은 복사물을 함유할 수 있으며, 만약 다수의 복사물에 존재한다면, ADP 폴리펩티드가 최소한 두 개의 이들 서열로부터 생성되는 한, 서열은 동일할 필요는 없다. 상기에서 논의된 바와 같이, "ADP 폴리펩티드" 는 ADP 와 관련된 최소한 하나의 기능, 특히 세포독성, 바람직하게는 세포 사망과 관련된 기능을 나타내는 폴리펩티드이다. "ADP 폴리펩티드" 는 상기에서 논의된 ADP 형태를 포함하며, 또한 ADP 기능을 나타내는 모든 폴리펩티드 단편도 포함한다. ADP 기능이 세포독성 활성, 특히 용해와 관련이 있기 때문에, 추정되는 ADP 폴리펩티드는 당해 기술분야의 규격화된 방법, 예컨대 플라크 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
어떤 구체예에서는, ADP 폴리펩티드가 SEQ ID NO:23 에 도시된 폴리펩티드 서열이며, SEQ ID NO:23 의 전체 서열을 포함한다. 다른 구체예에서는, ADP 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:22 에 도시되며, SEQ ID NO:22 의 전체 서열을 포함한다. ADP 의 아미노산 서열이 주어지면, SEQ ID NO:22 에 도시된 것 이외의 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 SEQ ID NO:23 의 전부 또는 일부를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 디자인하기 위하여 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들을 사용하는 것이 가능하다. 나아가, 당업자에 의해 쉽게 만들 수 있는 축퇴성 프로브와 같은 도구가 주어지면, 예를 들어 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 다른 ADP 서열을 얻고 그것을 시험하는 것이 가능하다.
ADP-코드화 서열은 세포-특이적, 조직-특이적, 및/또는 종양-특이적 TRE 의 전사적 제어하에 놓일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 어떤 구체예에서는, ADP 를 코드화하는 서열이 세포-특이적 TRE, 예컨대 AFP-TRE 또는 전립선-세포 특이적 TRE 의 전사적 제어하에 있다. 전립선-세포 특이적 TRE 의 실예로는 전립선 특이적 항원으로부터 유도된 것 (미국 특허 제 5,698,443 호 및 5,648,478 호), 프로바신 (미국 특허 출원 USSN 60/039,762 호 및 USSN 08/---- 에 설명되어 있음), 및 사람 칼리크리엔 2 (미국 특허 출원 USSN 60/---- 및 USSN 60/054,523 호에 설명되어 있음)가 있다. 세포-특이적 TRE 의 다른 실예로는 암배항원 및 뮤신이 있다. 이들 및 다른 TRE 에 대한 기능성 단편들에 대한 설명은 당해 기술분야에서 이용할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 두 번째 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 추가의 아데노바이러스 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 전사적 제어하에 있는 추가의 아데노바이러스 유전자의 실예는 ADP (상기에서 논의됨) 및 복제에 필요한 유전자들, 예컨대 초기 유전자들이다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 첫 번째 AFP-TRE 가 하나의 초기 유전자의 전사를 조절하고, 두 번째 AFPTRE 가 다른 초기 유전자의 전사를 조절하도록 구성될 수 있다. 이들 다중 구성물은 그것들이 복제와 관련하여 세포 특이성의 하나 이상의 공급원을 제공할 수 있다는 점에서 보다 바람직할 수 있다 (실시예 1 참조). 그러한 이중 구성물인 CN733 은 HuH7 종양 이종이식편을 은닉하고 있는 털없는 마우스에서 종양의 성장을 성공적으로 억제하였다 (실시예 4).
본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터들중 어느 것이든지, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 네이키드 폴리뉴클레오티드 (통상 DNA) 구성물; 세포안으로의 도입을 용이하게 해주는 제제, 예컨대 양이온성 리포솜 또는 다른 양이온성 화합물, 예를 들면 폴리라이신과 복합체를 형성한 폴리뉴클레오티드 구성물; 감염성 아데노바이러스 입자 (아데노바이러스 벡터(들)을 보다 면역원성으로 만들 수 있음)안으로 패키지된 형태; HSV 또는 AAV 와 같은 다른 입자형 바이러스 형태안으로 패키지된 형태; 면역 반응을 증강시키거나 또는 무디게 하기 위한 제제 (예컨대 PEG)와 복합체를 형성한 형태; 생체내 형질전환을 용이하게 해주는 제제, 예컨대 DOTMATM, DOTAPTM, 및 폴리아민과 복합체를 형성한 형태를 포함한 다양한 형태로 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 AFP-생성 세포에서 우선적으로 복제할 수 있는 아데노바이러스를 제공한다. "우선적으로 복제한다" 는 것은 아데노바이러스 복제물이 비-AFP-생성 세포에서보다 AFP-생성세포에서 더 많음을 의미한다. 바람직하게도, 아데노바이러스는 비-AFP-생성세포보다 AFP-생성세포에서 상당히 더 높은 수준, 바람직하게는 최소한 약 2 배, 바람직하게는 최소한 약 5 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 10 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 배, 보다 바람직하게는 최소한 약 400 배 내지 약 500 배, 더욱 더 바람직하게는 최소한 약 1000 배, 가장 바람직하게는 최소한 약 1 × 106배 더 높게 복제한다. 가장 바람직한 것은 아데노바이러스가 AFP-생성 세포에서 단독으로 복제하는 것이다 (즉, 비-AFP-생성 세포에서는 복제하지 않거나 아주 낮은 수준으로 복제한다). 만약 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 안에 패키지된다면, 추가로 표적화를 증강시키기 위하여 아데노바이러스 자체가 또한 선택될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 섬유는 친화성 (tropism)을 보조하는 세포 수용체(들)과의 일차 접촉을 중재한다 [예컨대 Amberg et al. (1997) Virol. 227:239-244 참조]. 만약 아데노바이러스 혈청형의 아속이 친화성에 표적 세포타입에 대하여 친화성을 나타내고 및/또는 비-표적 세포 타입에 대한 친화성을 감소시켰다면, 그러한 아속 (또는 아속들)은 추가로 세포독성 및/또는 세포용해의 세포-특이성을 증강시키기 위하여 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서는, 패키지된 아데노바이러스 벡터(들)이 친수성 중합체와 복합체를 형성하여 차폐된 아데노바이러스가 생성된다. 친수성 중합체는 아데노바이러스의 캡시드 단백질, 특히 헥손 및 섬유 단백질에 (공유적으로 및 비-공유적으로) 부착된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 차폐제와 복합체를 형성하여 차폐된 아데노바이러스 벡터가 생성된다. 차폐된 아데노바이러스는 (a) 순환계중의 항체 또는 옵시닌을 중화시키는 아데노바이러스에 대한 아데노바이러스 표면의 차폐, 및 (b) 신체의 비-특이적 정화 메카니즘 (즉, 대식세포 등)의 감소에 의한 아데노바이러스 입자들의 전신적인 순환시간의 증가로 인하여 유익하다. 생체내 상황에서는, 차폐된 아데노바이러스의 전신적인 전달이 바이러스 입자들의 더 긴 시간동안의 순환, 면역원성의 감소, 및 간 및 비장에 의한 정화의 감소를 수반하는 증가된 생체내파괴를 초래한다. 친수성 중합체 (특히 PEG)를 사용하여 단백질 및 지질을 변형시키는 것에 대하여 집중적인 연구가 행해졌지만, 본 발명자들은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 구성물과 관련하여 어떠한 차폐제도 사용되지 않았었음을 인지하였다.
따라서, 본 발명은 차폐제와 복합된 아데노바이러스를 제공한다. 바람직하게도, 차폐제는 PEG 이다. 차폐된 아데노바이러스를 제조하는 한 가지 개략적인 방법이 도 15 에 도시되어 있다 (실시예 7 참조). 바람직한 구체예는 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터(들)을 포함하는 차폐된 아데노바이러스이고, 보다 바람직한 구체예는 본원에서 설명되는 아데노바이러스를 포함하는 페길레이트된 아데노바이러스로 이루어진다. 본 발명은 또한 이들 차페된 아데노바이러스를 제조하고 사용하는 방법을 제공하며, 이 방법들은 본원의 설명으로부터 명백하게 드러난다.
차폐제는 원하는 복합체 및 요구되는 기능성이 얻어지기만 하면, 다양한 분자량을 가질 수 있다. 상업적인 공급원으로부터 얻어진 대부분의 차폐제는 규정된 분자량에 대하여 정상적으로 다분산계이다 (즉, 차폐제는 정상적인 분자량 주위의 분자량 분포로 공급된다). 본 발명에 따라 아데노바이러스를 차폐하는 데 유용한 차폐제는 약 2000 내지 약 50,000; 바람직하게는 약 2500 내지 약 30,000; 바람직하게는 약 3000 내지 약 25,000; 보다 바람직하게는 약 5000 내지 약 20,000의 공식적인 중량을 가질 수 있다. 바람직하게도, 공식적인 분자량은 약 20,000 미만이며, 보다 바람직하게는 약 10,000 미만, 보다 바람직하게는 약 7500 미만, 가장 바람직하게는 약 5000 미만이다. 바람직하게도, 차폐제는 공식적인 분자량이 약 5000 Da 미만인 PEG 이다. 상이한 중량을 가지고 있는 차페제들의 혼합물도 또한 고려된다.
차폐제는 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다. 비-공유 부착의 경우에, 부착은 정전기적, 소수성, 또는 친화성 상호작용을 경유하여 이루어질 수 있다. 비-공유 부착에 사용된 차폐제는 변형된 차폐제일 수 있다 (즉, 차폐제는 차폐제에서는 정상적으로 발견되지 않는 특정한 화학적 부분을 함유하기 위하여 합성되거나 또는 변형된다). 아데노바이러스 벡터에 대하여 정전기적 부착을 하기에 유용한 차폐제는 정전기적 상호작용에 의하여 아데노바이러스 표면에 결합하는 하전된 부분을 함유하거나, 또는 하전된 부분을 함유하도록 변형되거나 합성된 차폐제일 것이다. 음으로 하전된 차폐제로는 포스페이트기, 술페이트기, 카르복시기, 등을 함유하는 차폐제가 있다. 아데노바이러스에 대한 차폐제의 정전기적, 비-공유 부착을 위한 양으로 하전된 부분으로서 4차 아민기가 유용하다. 소수성 기, 예컨대 지질 (예컨대 포스파티딜에탄올아민 등) 및 다른 소수성 기 (예컨대 페닐기 또는 긴 알킬 사슬)을 함유하고 있는, 또는 그러한 기를 가지도록 변형 또는 합성된 차폐제들은, 바이러스상에 있는 안정한 소수성 영역과의 소수성 상호작용에 의하여 아데노바이러스 벡터와 복합체를 형성할 수 있다. 친화성 및 소수성 부분은 당해기술분야에 공지되어 있는 방법중 어느 것이든지에 의해, 바람직하게는 화학적 교차결합제와의 화학적 교차결합에 의하여 차폐제에 부착될 수 있다.
만약 차페제가 공유적으로 부착된다면, 화학적 교차결합제는 바람직하게도 차폐제를 아데노바이러스에 공유적으로 결합시킨다. 교차결합제는 차폐제와 아데노바이러스 사이에 공유 결합 또는 가교를 생성할 수 있는 모든 교차결합제일 수 있다. 차폐제와 단백질 사이에 교차결합을 생성할 당해 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 화학적 교차결합제든지 사용하여 공유적으로 차폐된 아데노바이러스를 생성하기 위하여, 아데노바이러스, 차폐제 및 별도의 교차결합제 분자가 반응하는 직접적인 교차결합이 사용될 수 있다. 차폐제 또는 아데노바이러스는 교차결합 반응전에 변형될 수 있고, 그러므로 화학적 교차결합제가 두 개의 분자와 반응할 것이다 (예컨대 차폐제는 아민기를 첨가하기 위하여 변형될 수 있고, 그로써 아민과 반응하는 교차결합제에 의하여 아데노바이러스에 교차결합되는 것이 가능해진다).
바람직하게는, 차폐제 또는 아데노바이러스가 먼저 교차결합제와의 반응에 의하여 활성화된다. 그런 다음 미반응된 교차결합제가 차폐제 또는 아데노바이러스로부터 제거된다. 활성화 반응은 바람직하게는 차폐제의 분자당 교차결합제의 하나 또는 두 분자, 보다 바람직하게는 차폐제의 분자당 교차결합제의 단일 분자를 초래한다. 그런 다음 활성화된 차폐제 또는 아데노바이러스는 차폐된 아데노바이러스를 형성하기에 적절한 반응 조건하에 아데노바이러스 (만약 차폐제가 활성화되어 있다면) 또는 차폐제 (만약 아데노바이러스가 활성화되어 있다면)와 혼합된다. 차폐제는 활성화된 후에 아데노바이러스와 반응되는 것이 바람직하다.
바람직한 차폐제는 PEG 이다. 바람직한 활성화된 PEG 로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음과 같은 것들이 있다: 단부 말단 아민 PEG, PEG 아미노산 에스테르, PEG 하이드라진 염산염, 티올 PEG, 등과 같은 친핵성 교차결합 PEG; 숙시네이트 PEG, 카르복시메틸화된 PEG, PEG-프로피온산, 및 PEG 아미노산을 포함하는 카르복실 PEG; PEG-말레이미드, PEG-오르토피리딜-디술파이드 등과 같은 술프히드릴-선택성 PEG; 아민 및 산 PEG, NHS-말레이미드 PEG 및 NHS-비닐술폰 PEG 를 포함하는 이종기능성 PEG; PEG 실란; 비오틴 PEG; 알릴 PEG, PEG 아크릴레이트, PEG 메타크릴레이트 등과 같은 PEG 의 비닐 유도체; 및 친전자성 활성 PEG, 예컨대 PEG 숙신이미딜 숙시네이트, PEG 숙신이미딜 숙신아미드, PEG 숙신이미딜 프로피오네이트, 카르복시메틸화된 PEG 의 숙신이미딜 에스테르, PEG2-NHS, 아미노산 PEG 의 숙신이미딜 에스테르, 펜단트 변형된 PEG NHS 에스테르 (예컨대 Innophase, Inc. 사로부터 구매할 수 있는 것들), PEG-글리시딜 에테르 (에폭시드), PEG-옥시카르보닐이미다졸, PEG 니트로페닐 카보네이트, PEG 트리클로로페닐 카보네이트, PEG 트레슬레이트, PEG-알데하이드, PEG-이소시아네이트, PEG 알릴 에테르와 말레산 무수물과의 공중합체, PEG 비닐술폰, 및 당업자에게 명백할 다른 활성화된 PEG. 활성화된 PEG 는 바람직하게는 PEG-N-히드록시숙신이미딜 숙신아미드 또는 PEG-숙신이미딜 숙시네이트이고, 보다 바람직하게는 PEG-N-히드록시숙신이미딜 숙신아미드이다.
아데노바이러스 벡터는 다양한 방법, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 리포솜, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 일반적인 형질전환 방법 (칼슘 포스페이트 침전법 또는 일렉트로포레이션법), 직접적인 주사, 및 정맥내 주입에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 전달 수단은 표적 세포의 유형 및 위치 (즉 세포가 생체내에 있는 지 또는 시험관내에 있는지) 뿐만 아니라 특정 아데노바이러스 벡터 (그것의 형태를 포함하여)에 크게 좌우될 것이다.
만약 패키지된 아데노바이러스로서 사용된다면, 아데노바이러스 벡터는 적절한 생리적으로 허용되는 담체중에 약 104내지 약 1014의 용량으로 투여될 수 있다. 감염의 복합성은 일반적으로 약 0.001 내지 100 의 범위내에 있을 것이다. 만약 폴리뉴클레오티드 구성물로서 (즉 바이러스로서 패키지되지 않음) 투여된다면, 약 0.01 ㎍ 내지 약 1000 ㎍ 의 아데노바이러스 벡터가 투여될 수 있다. 아데노바이러스 벡터(들)은 의도된 용도 및 숙주의 면역 반응 가능성에 따라 1 회 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 또한 다중으로, 동시 주사로서 투여될 수 있다. 만약 변역 반응이 바람직하지 않은 것이라면, 면역 반응은 다양한 면역억제제를 사용함으로써 감소될 수 있고, 그로써 강한 면역 반응없이 반복적인 투여가 가능해진다. 만약 다른 바이러스 형태, 예컨대 HSV 로서 패키지된다면, 투여될 양은 그 특정 바이러스에 대한 표준 지식 (예를 들면 공개된 문헌을 통하여 쉽게 얻을 수 있다)을 기초로 하여 정해지고 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터를 포함하고 있는 (즉, 그것으로 형질전환된) 숙주 세포를 제공한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포가 그 숙주에서의 유지를 위해 필요한 서열, 예컨대 적절한 복제 기원(들)이 존재하기만 한다면 두가지 모두 사용될 수 있다. 원핵 숙주 세포로는 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 고초균, 및 미코박테리아가 있다. 진핵 숙주 세포중에는 효모, 곤충, 조류, 식물, 시. 엘레간스 (C. elegans)(nemotode) 및 포유동물류 세포가 있다. 진균류 (효모를 포함함) 숙주 세포의 실예로는 맥주효모균, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)를 포함한 칸디다종, 아스페르길루스 니듈란스 (Aspergillus nidulans), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 및 야로비아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)가 있다. 포유동물 세포의 실예로는 COS 세포, 마우스 L 세포, LNCaP 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 사람 배 신장 (HEK) 세포, 및 아프리카 녹색 원숭이 세포가 있다. 제노푸스 래비스 오오사이트 (Xenopus laevis oocytes), 또는 다른 양서류 기원의 세포도 또한 사용될 수 있다. 숙주 시스템은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 따라서 본원에서는 상세하게 설명하지 않는다. 적당한 숙주 세포는 또한 AFP 또는 AFP-TRE 를 활성화시키는 것으로 알려져 있는 어떠한 단백질 (이 단백질이 자연적으로 또는 재조합적으로 생성되는 지의 여부는 관계없음)을 생성하는 모든 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터를 함유하고 있으며, 약학 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 시험관내 투여에, 예를 들면 개체에서 형질도입 정도 및/또는 세포 사망의 효율을 측정할 때 유용하다. 바람직하게도, 이들 조성물은 추가로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제중에 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 유효량을 포함할 수 있는 이들 조성물은 단위 용량 형태, 멸균 비경구용 용액 또는 현탁액, 멸균 비-비경구용 용액 또는 경구용 용액 또는 현탁액, 유중수 또는 수중유 에멀젼 등의 형태로 개체에 전신 투여하기에 적당하다. 비경구 및 경구용 약물 전달에 대한 제형은 당해기술분야에 공지이며, 문헌에도 설명되어 있다 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing (1990)]. 약학 조성물은 또한 동결건조된 및/또는 재구성된 형태의 본 발명의 아데노바이러스 벡터 (바이러스로서 패키지된 것들, 예컨대 아데노바이러스를 포함함)를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 벡터(들)을 함유하고 있는 키트를 포함한다. 이들 키트는 진단 및/또는 모니터용으로, 바람직하게는 모니터용으로 사용될 수 있다. 이들 키트를 사용하는 과정은 임상 실험실, 실험적 실험실, 의학적 실시장, 또는 개인에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 의해 구체화된 키트는 누구든지 적당한 생물학적 샘플, 예컨대 생검 시편에서 AFP-생성 세포의 존재를 검출하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 키트는 적당한 패키징내에 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터를 포함하고 있다. 키트는 임의로 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 전개 시약, 표지, 반응 표면, 검출 수단, 제어 샘플, 지시사항, 재생 정보를 포함한, 과정에 유용한 추가의 성분을 제공할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스의 제조
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 당해 기술분야에서 표준화되어있는 재조합 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, AFP-TRE 는 관심의 아데노바이러스 유전자, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 초기 유전자 (비록 후기 유전자(들)도 사용될 수 있지만)의 5' 에 삽입된다. AFP-TRE 는 올리고뉴클레오티드 합성법 (만약 서열이 공지되어 있다면) 또는 재조합 방법 (예컨대 PCR 및/또는 제한 효소)을 사용하여 제조될 수 있다. 천연 아데노-DNA 서열중에 있거나 또는 올리고뉴클레오티드 특정 돌연변이생성 및 PCR 과 같은 방법들에 의하여 도입된 편리한 제한 부위들이 AFP-TRE 에 대한 삽입 부위를 제공한다. 따라서, AFP-TRE 를 아닐링 (즉, 삽입)하기에 편리한 제한 부위들이 PCR 과 같은 표준 재조합 방법을 사용하여 AFP-TRE 의 5' 과 3' 단부에 유전공학적으로 처리될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위하여 사용된 폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 방법들, 예컨대 화학적 합성을 사용하여, 재조합 방법에 의하여, 및/또는 생물학적 공급원으로부터 원하는 서열(들)을 얻음으로써 얻어질 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 두 개: 아데노바이러스의 왼쪽손 영역을 제공하는 한 플라스미드와, 오른쪽손 영역을 제공하는 다른 플라스미드를 사용함으로써 편리하게 제조되는데, 이 두 개의 플라스미드는 동종 재조합에 대하여 중간 부분의 최소한 약 500 nt 를 공유한다. 이 방법으로, 각각의 플라스미드는 필요에 따라 독립적으로 조작된 후, 경합하는 숙주로 함께 형질전환되어, 필요에 따라 경합하는 유전자들을 제공하거나, 또는 아데노바이러스의 증식을 위해 CEA-TRE 로부터의 전사를 개시하기 위한 적절한 전사 인자들을 제공한다. 플라스미드는 일반적으로 293 과 같은 적당한 숙주 세포안에, 형질도입, 예컨대 양이온성 리포솜과 같은 적절한 수단에 의하여 도입된다. 또는 달리, 아데노바이러스 게놈의 모든 복제-필수 부분들을 함유하고 있는 재조합 아데노바이러스 구성물을 구성하기 위하여 아데노바이러스 게놈의 왼손 및 오른손 부분의 시험관내 결찰이 또한 사용될 수 있다 [Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11:6003-6020; Bridge et al. (1989) J. Virol. 63:631-638].
편리하게도, 아데노바이러스의 필요한 부분들을 제공하는 플라스미드를 얻을 수 있다. 플라스미드 pXC.1 [McKinnon (1982) Gene 19:33-42]은 Ad5 의 야생형 왼손 단부를 함유한다. pBHG10 [Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806; Microbix Biosystems Inc., Toronto]은 E3 이 결실된 Ad5 의 오른손 단부를 제공한다. E3 의 결실은 바이러스에 내인성 인핸서/프로모터가 결실되지 않은 3 kb 의 AFP-TRE 를 삽입시키기 위한 공간을 제공한다 [Bett et al. (1994)]. E3 에 대한 유전자는 E4 로부터의 반대 가닥 (r-가닥)상에 위치한다. pBHG11 은 심지어 더 큰 E3 결실 (추가의 0.3 kb 가 결실된다)을 제공한다 [Bett et al. (1994)].
초기 유전자를 조작하기 위해서는, Ad5 E1A 의 전사 출발 부위는 바이러스 게놈의 498 에 있으며, E1A 단백질의 ATG 출발 부위는 560 에 있다. 이 영역은 AFP-TRE 의 삽입을 위해 사용될 수 있다. 제한 부위는 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하여 도입될 수 있고, 이 때 사용되는 프라이머는 Ad5 게놈에 제한될 수 있거나, 또는 Ad5 게놈 DNA 를 포함하고 있는 플라스미드의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, pBR322 가 사용되면, 프라이머는 pBR322 골격에 있는 EcoRI 부위와 Ad5 의 1339 에 있는 Xball 부위를 사용할 수 있다. PCR 을, 영역의 중심에서 중복하는 프라이머로 30 개의 서열 변화가 도입되고, 그로써 독특한 제한 부위가 형성되는 두 단계로 수행함으로써, 누구든지 그 부위에 AFP-TRE 를 삽입할 수 있다. 하기 실시예 1 에서는 E1A 가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 아데노바이러스 벡터에 대해 상세하게 설명된다.
E1B 를 조절하기 위하여 AFP-TRE 를 삽입하기 위해 유사한 전략이 또한 사용될 수 있다. Ad5 의 E1B 프로모터는 SpI 에 대한 단일한 고-친화성 인지 부위와 TATA 상자로 구성된다. 이 영역은 1636 으로부터 1701 까지 뻗어 있다. 이 영역에 AFP-TRE 를 삽입함으로써, 누구든지 E1B 유전자의 세포-특이적 전사를 제공할 수 있다. E1B 를 조절하기 위하여 AFP-TRE 를 도입하기 위한 주형으로서 AFP-TRE 를 조절하는 E1A 로 변형된 왼손 영역을 사용함으로써, 그 결과의 아데노바이러스 벡터는 E1A 와 E1B 두 가지의 발현에 대해 세포-특이적 전사 인자들에 좌우될 것이다. 하기 실시예 1 에는 어떻게 그러한 구성물이 제조될 수 있는 지에 대해 보다 상세하게 설명된다.
유사하게, AFP-TRE 는 E2 유전자의 상류에 삽입되어 그것의 발현을 세포-특이적으로 만들 수 있다. Ad5 에 27050 으로부터 27150 까지에 지도화되어 있는 E2 초기 프로모터는 주요 및 중요하지 않은 (이것은 E2 전사물의 약 5 % 를 차지한다) 전사 개시 부위, 두 개의 E2F 전사 인자 결합 부위들 및 ATF 전사 인자 결합 부위로 구성된다. E2 프로모터 구조에 대한 상세한 검토는 문헌을 참조한다 [Swaminathan et al., Curr. Topics in Micro. and Imm. (1995) 199(part 3):177-194].
E2 후기 프로모터는 대응가닥에 의해 코드화된 유전자의 코딩 서열과 중복되며, 그러므로 유전학적 조작이 쉽지 않다. 그러나, E2 초기 프로모터는 대응가닥상의 33-kDa 단백질을 코드하는 서열과 단지 몇 개의 염기쌍만이 중복한다. SpeI 제한 부위 (Ad5 위치 27082)는 상기 언급된 33 kDa 단백질에 대한 중지 코돈의 일부이며, 주요 E2 초기 전사 개시 부위 및 TATA-결합 단백질 부위를 상류 전사 인자 결합 부위 E2F 와 ATF 로부터 편리하게 분리한다. 그러므로, SpeI 단부를 가지고 있는 PB-TRE 의 1-가닥의 SpeI 부위에 삽입시키면, Ad5 의 내인성 E2 초기 프로모터를 파괴할 것이고 E2 전사물의 AR-제한된 발현이 가능하게 될 것이다.
E4 에 대해서는 아데노바이러스 게놈의 오른손 부분만이 사용되어야 한다. E4 전사 출발 부위는 35609 에 있으며, TATA 상자는 35638 에 있고, ORF 의 첫 번째 ATG/CTG 는 35532 에 있다 [Virtanen et al. (1984) J. Virol. 51:822-831]. 다른 유전자들에 대한 상기 전략들중 어느 것을 사용하여서, AFP-TRE 가 전사 출발 부위로부터 상류에 도입될 수 있다. E4 영역에 돌연변이를 일으킨 돌연변이체의 구성을 위해서, 공형질전환 및 동종 재조합이 W162 세포에서 수행되고 [Weinberg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:5383-5386], 그로써 E4 단백질이 이들 단백질의 합성시의 결핍을 반대쪽에서(in trans) 상쇄할 수 있게 된다. 또는 달리, 이들 구성물은 시험관내 결찰에 의하여 제조될 수도 있다.
ADP-함유 아데노바이러스 벡터의 제조는 상기에서 대강 언급되고 당해 기술 분야에서 공지된 원리를 따른다. 만약 ADP 를 코드화하는 서열이 도입될 예정이라면, 그것은 하기 실시예 5 및 6 에서 설명되는 것과 같은 방법들을 사용하여 재조합적으로 삽입될 수 있다. 또는 달리, 이미 ADP 를 코드화하는 서열을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터가 다른 첨가된 및/또는 조작된 엘레먼트, 예컨대 TRE 또는 트랜스유전자를 함유하고 있는 재조합 벡터를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
아데노바이러스 폴리뉴클레오티드를 아데노바이러스 입자안에 패키징하는 방법은 당해 기술 분야에 공지이며 하기 실시예에서도 설명된다.
차폐된 아데노바이러스를 제조하는 방법은 차폐제 및 부착 방식 (공유 또는 비-공유)에 따라 달라진다. 차폐제가 비-공유적으로 부착되어 있는 차폐된 아데노바이러스는 아데노바이러스와 차폐제를 철저하고 치밀하게 혼합함으로써 제조된다. 교차결합 시약에 적절한 조건하에서 반응 성분들을 혼합함으로써 공유 교차결합이 이루어진다. 화학적 교차결합 프로토콜은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 어떠한 주어진 화학적 교차결합제에 대한 정확한 반응 조건은 당업자에게 명백하게 나타나는 바와 같이, 교차결합제의 화학 및 (있다면) PEG 와 아데노바이러스에 대한 변형에 따라 달라질 것이다. 차폐제가 PEG 인 경우, 아데노바이러스의 PEG 에 대한 비율은 바람직하게는 1:1 ×106및 1:1×107사이에 있으며, 보다 바람직하게는약 1:4×106이다. 바람직한 PEG, PEG-NHS-숙신아미드의 경우에, 활성화된 PEG 는 교차결합 반응물중에 바람직하게는 0.5 내지 5 mM 사이에, 보다 바람직하게는 약 2 mM 에 있다. 교차결합 반응물중의 아데노바이러스는 106과 1012사이에 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 5×109에 있는 것이 좋다. 바람직한 활성화된 PEG 를 사용하여, 교차결합 반응의 pH 는 7 과 9 사이에 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 7.5 와 8 사이에 있는 것이 좋고, 반응은 약 4 ℃ 내지 실온 (약 20 ℃) 범위의 온도에서 10 내지 30 분동안 계속되는 것이 바람직하다.
교차결합후에, 차폐된 아데노바이러스는 반응 성분들로부터 분리된다. 분리는 당업자에게 공지된 방법중 어느 것에 의하여, 예를 들면 크로마토그래피 방법, 예컨대 크기 축출 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마노그래피, 전기영동적 방법, 또는 여과 방법, 예컨대 투석, 다이아필터레이션 (diafilteration) 또는 한외여과에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터의 사용방법
본 발명의 벡터는 원하는 결과 또는 의도하는 결과에 따라 달라질 다양한 목적에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상술된 아데노바이러스 벡터의 사용방법을 포함한다.
한 구체예에서, 세포를 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 것으로 이루어지는, AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포(즉, 표적 세포), 바람직하게는 AFP 를 발현하는 세포에 선택적인 세포독성을 부여하는 방법들이 제공된다. 세포독성은 당해 기술분야의 표준 검정, 예컨대 염료 축출,3H-티미딘 통합, 및/또는 용해를 사용하여 측정될 수 있다.
다른 구체예에서는, AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 바람직하게는 AFP 를 발현하는 포유동물 세포에 특이적인 아데노바이러스를 증식시키는 방법들이 제공된다. 이들 방법은 아데노바이러스 벡터를 세포와 조합시키고, 그로써 상기 아데노바이러스가 증식되는 것을 수반한다.
다른 구체예는 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 세포를 세포 혼합물중에서 죽이는 방법을 제공하는데, 그 방법은 세포 혼합물을 본 발명의 아데노바이러스 벡터와 조합시키는 것으로 이루어진다. 세포 혼합물은 일반적으로 정상 세포와 안드로겐 수용체를 생성하는 암성 세포의 혼합물이고, 생체내 혼합물 또는 시험관내 혼합물일 수 있다.
본 발명은 또한 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 예컨대 AFP 를 발현하는 세포를 생물학적 샘플중에서 검출하는 방법을 포함한다. 이들 방법은 특히 개체 (즉, 포유동물)의 임상적 및/또는 생리적 조건을, 그것이 실험적이든 또는 임상적 세팅이든 모니터하는데 유용하다. 이들 방법에서, 생물학적 샘플의 세포들이 아데노바이러스 벡터와 접촉되고, 아데노바이러스 벡터의 복제가 검출된다. 또는 달리, 샘플은 리포터 유전자가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 아데노바이러스와 접촉될 수 있다. 리포터 유전자의 발현은 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 예컨대 AFP-생성 세포의 존재를 나타낸다. 또는 달리, 세포 생존에 조건적으로 요구되는 유전자가 AFP-TRE 의 제어하에 있는 아데노바이러스가 구성될 수 있다. 이 유전자는 예를 들어 항생물질 내성을 코드화할 수 있다. 아데노바이러스는 생물학적 샘플에 도입되고, 나중에 그 샘플은 항생물질로 처리된다. 항생물질 내성을 나타내는 생존하는 세포의 존재는 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포, 예컨대 AFP 를 생성하는 (또는 생성할 수 있는) 세포의 존재를 나타낸다. 적당한 생물학적 샘플은 AFP-생성 세포가 존재할 수 있는 또는 존재할 수 있을 것으로 예상되는 샘플이다. 일반적으로, 포유동물에서, 적당한 임상적 샘플은 AFP 를 생성하는 암성 세포, 예컨대 간세포성 암종 세포가 존재할 것으로 예상되는 샘플이다. 그러한 세포들은 예를 들면 주사바늘 생체검사 또는 다른 외과수술 과정에 의하여 얻어질 수 있다. 접촉될 세포들은 검정 조건, 예를 들면 선택적인 풍부화, 및/또는 가용화를 촉진시키기 위하여 처리될 수 있다. 이들 방법에서, AFP-생성 세포는 아데노바이러스 증식을 검출하는, 당해 기술분야에서 표준화되어 있는 시험관내 검정을 사용하여 검출될 수 있다. 그러한 표준화된 검정으로는 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 버스트 (burst) 검정 (바이러스 수율을 측정함) 및 플라크 검정 (세포당 감염성 입자를 측정함)이 있다. 증식은 또한 특이한 아데노바이러스 DNA 복제를 측정함으로써 검출될 수 있으며, 이 방법 또한 표준 검정법이다.
본 발명은 표적 세포를 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키고, 그로써 아데노바이러스 벡터가 세포안으로 들어가는 것으로 이루어지는, 표적 세포의 유전형을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 종양 세포를 본 발명의 아데노바이러스 벡터와 접촉시키고, 그로써 아데노바이러스 벡터가 종양 세포안으로 들어가 종양 세포에 대한 선택적인 세포독성을 나타내는 것으로 이루어지는, 종양 세포, 바람직하게는 AFP 를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 종양 세포 성장은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 모든 방법, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 종양 크기의 측정,3H-티미딘 통합 검정을 사용하여 종양 세포가 증식하는 지의 여부를 측정, 또는 종양 세포의 계수에 의하여 평가될 수 있다. 종양 세포 성장을 "억제한다" 는 것은 다음 상태의 어느 하나 또는 전부를 의미한다: 종양 성장의 둔화, 지연, 및 정지, 및 종양 수축. 종양 성장을 "억제한다" 는 것은 본원에서 설명된 아데노바이러스 벡터와의 접촉, 즉 그 벡터에 의한 형질전환이 없는 성장과 비교할 때 축소된 성장 상태를 의미한다.
본 발명은 또한 개체에서 종양 세포 마아커의 수준을 저하시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 개체에게 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것으로 이루어지며, 그러면 아데노바이러스 벡터는 종양 세포 마아커를 생성하는 세포에 대해 선택적으로 세포독성이 된다. 종양 세포 마아커로는 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, AFP, PSA, hK2, 및 암배항원이 있다. 종양 세포 마아커의 수준을 측정하는 방법들은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 종양 세포 마아커에 특이한 항체를 사용하는 면역학적 검정, 예컨대 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)이 있다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 시험될 개체로부터 얻어지고, 적당한 검정, 예컨대 ELISA 는 그 생물학적 샘플에 대해 수행된다.
본 발명은 또한 본원에서 설명되는 아데노바이러스 벡터(들)의 유효량을 개체에 투여하는 치료방법을 제공한다. 아데노바이러스 벡터(들)을 사용하는 치료는 간세포성 암종과 같은 종양에 걸려 있는 개체에서 필요하다. 또한 치료가 필요한 개체는 AFP-관련 질병 (암을 포함해서)이 전개될 위험이 있는 것으로 간주되는 개체, 예컨대 질병(들)의 가족력이 있고, 및/또는 어떤 다른 방식으로, 예컨대 화학치료법으로 절제된 적이 있거나 치료된 적이 있었던 개체이다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터(들)을 투여하는 적합성 여부의 측정은 무엇보다도 평가할 수 있는 임상적 매개변수, 예컨대 조직 생검의 혈청학적 징후 및 조직학적 조하에 좌우될 것이다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터(들)을 포함하고 있는 약학 조성물이 투여된다. 약학 조성물은 하기에서 설명된다.
투여될 아데노바이러스 벡터(들)의 양은 여러 가지 인자, 예컨대 투여 경로, 개체의 상태, 질병의 진전 정도, 사용된 특정 PB-TRE, 및 특정 벡터 구성물 (즉, 아데노바이러스 유전자(들)이 PB-TRE 제어하에 있음)에 좌우될 것이다.
만약 패키지된 아데노바이러스로서 투여된다면, 약 104내지 1014, 바람직하게는 약 104내지 약 1012, 보다 바람직하게는 약 104내지 1010개가 좋다. 만약 폴리뉴클레오티드 구성물 (즉 바이러스로서 패키지되지 않음)로서 투여된다면, 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 바람직하게는 약 0.1 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 보다 바람직하게는 약 0.5 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 이 투여될 수 있다. 하나 이상의 아데노바이러스 벡터가 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 주기적으로, 나타나는 어떠한 반응이든지 모니터되면서 이루어진다. 투여는 예를 들면, 종양내로, 정맥내로 또는 복강내로 주어질 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 단독으로 또는 원하는 목적을 촉진시키는 다른 활성 제제들, 예컨대 화학치료요법제와 조합되어 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시할 목적으로 제공된다.
실시예 1: E1A 및/또는 E1B 의 전사를 유도하는 AFP-TRE 를 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터
사람 배의 신장 셀라인인 293 은 Ad5 의 E1A 및 E1B 유전자를 효과적으로 발현하고, 아데노바이러스 DNA 를 이용했을 때 매우 높은 형질전환 효율을 나타낸다. 이 실험을 위하여, 293 세포를 왼쪽 단부의 Ad5 플라스미드와 오른쪽 단부의 Ad5 플라스미드로 함께 형질전환시켰다. 동종 재조합으로 293 세포에서의 복제에 필요한 유전적 엘레먼트들을 가지고 있는 아데노바이러스가 생성되며, 그것은 E1A 와 E1B 단백질의 합성의 결함을 상보하기 위한 E1A 및 E1B 단백질을 반대쪽으로 (in trans) 제공한다.
조합될 플라스미드들을 양이온성 리포솜, 예컨대 Lipofectin (DOTMA:DOPETM, Life Technologies)을 사용하여 두 개의 플라스미드를 조합함으로써 293 세포에 함께 형질전환시킨 후, 플라스미드 DNA 용액 (혈청 또는 다른 첨가물이 없는 최소 필수 배지 (MEM) 500 ㎕ 중에 각각의 플라스미드 10 ㎍)을 동일한 완충액 200 ㎕ 중의 4-배 몰량의 리포솜과 혼합하였다. 그런 다음 DNA-지질 복합체를 세포상에 놓고 37 ℃, 5 % CO2중에서 16 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝난 후, 배지를 10 % 의 우태아혈청이 첨가된 MEM 으로 교환하고 다시 세포를 37 ℃, 5 % CO2중에서 10 일동안 인큐베이션하였다. 이 기간동안 배지를 2 회 교환하였다. 이 기간이 끝날 때 세포와 배지를 튜브에 옮기고, 3 회 동결-해빙을 반복한 다음, 용해물을 사용하여 적절한 비율로 293 세포를 감염시킴으로써 개별적인 바이러스들을 플라크로서 검출하였다.
얻어진 플라크를 2 회 정제하고, PCR 및 때로 DNA 서열화에 의하여 원하는 서열의 존재에 대하여 바이러스들을 특성확인하였다. 추가의 실험을 위하여, 바이러스들을 염화 세슘 구배 원심분리에 의하여 대규모로 정제하였다.
상기의 과정을 사용하여, 다음과 같은 세가지의 복제 경합성, 간암세포-특이적 아데노바이러스들을 제조하였다: E1A 유전자의 발현을 유도하는 AFP-TRE 를 함유하는 CN732; E1A 와 E1B 유전자의 발현을 유도하는 두 개의 AFP-TRE 를 함유하는 CN733; 및 E1B 유전자의 발현을 유도하는 AFP-TRE 를 함유하는 CN734. 바이러스들을 293 세포에서의 동종 재조합에 의하여 제조하였고, 플라크 정제에 의하여 2 회 클론하였다. 게놈 DNA 의 구조를 PCR 및 삽입된 서열과 Ad 게놈 서열 사이의 연결부의 서열화에 의하여 분석하여 바이러스들이 원하는 구조를 가지고 있는 지를 확인하였다. 바이러스들의 구조를 또한 서던 블롯에 의하여 확인하였다.
하기 표 1 은 원하는 특징을 가지는 재조합 Ad5 를 생성하기 위하여 사용된 오른쪽 단부 및 왼쪽 단부 Ad5 플라스미드의 조합을 열거한 것이다.
AFP-TRE 를 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터들
바이러스 명칭 왼쪽 단부 플라스미드 오른쪽 단부 플라스미드
E1A-AFP CN732 CN219 BHG10
E1A/E1B-AFP CN733 CN224 BHG10
E1B-AFP CN734 CN234 BHG10
바이러스 제조
플라스미드 pXC.1 을 Microbix Biosystems Inc. (Toronto)에서 구입하였다. pXC.1 은 (뉴클레오티드) 22 부터 5790 까지의 Ad5 서열을 함유하고 있다. 본 발명자들은 E1A 개시 코돈 (Ad5 547)에 대해 5' 쪽으로 AgeI 부위 12 bp 를 올리고-특정된 돌연변이생성법 및 관련된 PCR 에 의하여 도입시켰다. 이것을 이루기 위하여, pXC.1 을 하기의 프라이머:
EcoRI 부위를 함유하고 있는 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA (15.133A)(SEQ ID NO:3), 및
엑스트라 A 를 함유하고 있는 5'-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA (15.134B)(SEQ ID NO:4)
를 사용하여 PCR 증폭시켜서 AgeI 부위를 도입시켰다. 이것으로 pBR322 골격의 EcoRI 부위로부터 Ad5 560 에 이르는 절편이 생성되었다. Ad 541 부터 Ad 뉴클레오티드 1339 에 있는 XbaI 부위까지의 두 번째 pXC.1 절편을 하기의 프라이머:
XbaI 부위를 함유하고 있는 5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG (15.133B)(SEQ ID NO:5), 및
엑스트라 T 를 함유하고 있는 5'-TCCGACACCGGTGACTGAAA (15.134A)(SEQ ID NO:6)
을 사용하여 증폭시켜서 AgeI 부위를 도입시켰다. 이들 두 개의 PCR 증폭된 DNA 절편을 혼합하여 프라이머 15.133A 와 15.133B 를 사용하여 증폭시켜서 pXC.1 의 EcoRI 부위로부터 XbaI 부위까지의 DNA 절편을 만들었다. 이 DNA 절편은 Ad 서열의 가장 왼쪽의 1317 염기를 포함하고 Ad 547 의 AgeI 부위를 함유한다. 이 DNA 절편을 사용하여 PXC.1 의 대응하는 절편을 교체하여 CN95 를 생성하였다.
상기와 같이 올리고뉴클레오티드 특정 돌연변이생성에 의하여 Ad5 1682 에 G 잔기를 삽입함으로써 E1B 출발 부위의 상류에 EagI 부위를 생성하였다. EagI 부위에 AFP-TRE 를 간단히 삽입시키기 위하여, CN95 의 내인성 EagI 부위를 EagI 을 이용한 소화, 녹두 핵산가수분해효소로의 처리, 및 재결찰에 의하여 제거함으로써 CN114 를 제조하였다. 하기의 프라이머:
EcoRI 부위를 함유하고 있는 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA (15.133A)(SEQ ID NO:3),
EagI 부위를 함유하고 있는 5'-GCCCACGGCCGCATTATATAC (9.4)(SEQ ID NO:7),
엑스트라 G 와 EagI 부위를 함유하고 있는 5'-GTATATAATGCGGCCGTGGGC (9.3)(SEQ ID NO:8), 및
KpnI 부위를 함유하고 있는 5'-CCAGAAAATCCAGCAGGTACC (24.020)(SEQ ID NO:9) 를 사용하여 1682 와 Ad5 2048 의 KpnI 부위사이에서 절편을 증폭시켰다. 두 개의 절편을 프라이머 15.133A 와 24.020 으로 함께 형질전환시켜서 Ad5 1682 에 EagI 부위가 있는 단편을 만들었고, 이것을 pXC.1 의 상응하는 EcoRI/KpnI 부위를 교체하는데 사용하여 CN124 를 제조하였다.
CN732 를 제조하기 위하여, 사람 AFP 인핸서 도메인 A 및 B (AFP 캡 부위와 관련하여 영역 -3954 bp 에서 -3335 bp 까지에 포함되어 있음)를 다음의 프라이머들을 사용하여 사람 게놈 DNA (Clontec, Palo Alto, CA)로부터 증폭시켰다:
5' GTGACCGGTGCATTGCTGTGAACTCTGTA 3' (39.055B)(SEQ ID NO:10), 및
5' ATAAGTGGCCTGGATAAAGCTGAGTGG 3' (39.044D)(SEQ ID NO:11).
AFP 프로모터를 다음의 프로모터를 사용하여 -163 으로부터 +34 까지를 증폭시켰다:
5' GTCACCGGTCTTTGTTATTGGCAGTGGT 3' (39.055J)(SEQ ID NO:12), 및
5' ATCCAGGCCACTTATGAGCTATGTGTCCTT 3' (29.055M)(SEQ ID NO:13).
인핸서 및 프로모터 절편을 아닐링하고, 융합 구성물을 프라이머 39.055B 와 39.055J 를 사용하여 중복 PCR 을 이용하여 생성하였다. 이 최소의 인핸서/프로모터 단편을 PinA1 으로 소화시키고 E1A 캡 부위의 유전공학적으로 조작된 AgeI 부위5' 을 사용하여 CN124 와 결찰시켜서 CN219 를 제조하였다. 293 세포를 CN219 와 BHG10 으로 함께 형질전환시킴으로써 동종 재조합에 의하여 간 특이적 바이러스 벡터 CN732 를 제조하였다.
상술된 인핸서/프로모터 엘레먼트를 증폭시키기 위하여 다음의 두 개의 PCR 프라이머 (-3954 에서 -3335 까지 및 -174 에서 +29 까지)를 사용함으로써 CN733 을 제조하였다:
5' TATCGGCCGGCATTGCTGTGAACTCT 3' (39.077A)(SEQ ID NO:14),
5' TTACGGCCGCTTTGTTATTGGCAGTG 3' (39.077C)(SEQ ID NO:15).
PCR 생성물을 EagI 으로 소화시키고 유사하게 절단된 CN219 에 결찰시켰다. 그 결과의 플라스미드인 CN224 는 두 개의 동일한 AFP 조절 엘레먼트를 함유하며, 이 엘레먼트 각각은 E1A 유전자와 E1B 유전자의 발현을 조절한다. 293 세포에서의 동종 재조합에 의하여 CN224 와 BHG10 을 함께 형질전환시킴으로써 CN733 을 제조하였다.
CN734 를 제조하기 위하여, PinA1 으로 플라스미드를 소화시킴으로써 E1A 유전자의 발현을 조절하는 AFP-TRE 를 절출하고, 벡터를 재결찰하였다. 그 결과의 플라스미드인 CN234 를 293 세포에서 BHG10 과 함께 형질전환시켜서 CN734 를 제조하였다.
시험관 내에서의 바이러스 성장
CN732, CN733, 및 CN734 의 성장 선택성을, 단일한 감염성 입자가 다중 횟수의 감염 및 복제에 의하여 가시적인 플라크를 생성하는 플라크 검정으로 분석하였다. 바이러스 스톡을 동일한 pfu/ml 로 희석한 후, 세포 단층을 1 시간동안 감염시키기 위하여 사용하였다. 그런 다음 접종물을 제거하고 세포를 배지를 함유하고 있는 반고체 아가에 겹쳐놓고 37 ℃ 에서 10 일동안 인큐베이션하였다 (표 4 에서는 12 일동안). 그런 다음 단층에 생성된 플라크를 계수하고 다양한 세포상의 감염성 바이러스의 역가를 계산하였다. 그 데이터를 293 세포상에서의 CN702 (야생형)의 역가로 표준화하였다. 네 번의 대표적인 검정에 대한 결과를 하기 표 2 내지 5 에 나타낸다.
야생형 바이러스 CN702 는 시험된 셀라인 각각에 대해 플라크를 생성하였다. CN702 에 의해 생성된 플라크의 수를, CN733 에 의한 플라크 형성을 비교할 수 있는 기본선으로 사용하였다.
293 세포에서 바이러스 성장은 이 셀라인에서의 반대쪽 컴플리멘테이션으로 인한 E1 영역의 변경과는 무관하여야 한다. 예상했던 바와 같이, CN702 와 CN733 은 둘다 293 세포상에서 유사한 수의 플라크를 생성하였다.
상기 표 1 로부터의 데이터와 관련하여, AFP 양성 셀라인인 Hep3B 와 HepG2 에서 CN702 는 293 세포와 관련하여 유사한 수의 플라크를 생성하였다. 대조적으로, CN733 은 AFP 양성 셀라인에서 293 세포에서보다 대략 4 배 더 많은 플라크를 생성하였다. AFP 양성 셀라인에서 CN733 에 의한 플라크 형성의 초정상 수준은 AFP 인핸서가 이들 세포에서 활성임을 의미한다.
AFP 음성 셀라인인 LNCaP 와 HBL 100 에서 이 두 바이러스의 성장은 축소되었지만, 그 정도는 상이하였다. 야생형 CN702 바이러스는 LNCaP 세포에서 293 세포에서 볼 수 있었던 수준의 대략 30 % 의 플라크를 생성하였다. HBL-100 세포에서는, CN702 는 293 세포에서 형성된 수준의 0.02 % 에서 플라크를 형성하였다. CN733 플라크 형성은 CN702 와 관련하여 이들 AFP 음성 셀라인에서 한층 더 감소되었다. LNCaP 세포에서 CN733 은 293 세포에서 볼 수 있었던 수준의 0.1 % 수준에서 플라크를 생성하였다. HBL 100 세포에서 CN733 은 플라크를 전혀 생성하지 못하였다. CN702 와는 대조적으로, AFP 음성 셀라인상에서의 CN733 의 성장은 최소한 100 배 감소되었다. 이것은 Ad40 의 E1B 프로모터가 소화관과 결막 내피 조직사이에서 대략 100 배의 차이를 지정하는 것으로 나타나는 (Bailey et al. 1994) 선행 결과 및 p53+ 와 p53- 세포 사이의 Ad 성장의 100 배의 차이를 지정하는 것으로 나타난 (Bischoff et al., 1996) E1b 유전자의 결실 돌연변이체와 유리하게 비교된다. 마지막으로, AFP+ 세포 타입의 역가와 AFP- 세포 타입의 역가의 비교로 전체적인 복제 선호성이 AFP+ 세포에서의 복제뿐만 아니라 AFP- 세포에서의 침체된 복제에 의해서도 증강된다는 중요한 표시를 얻었다.
표 3 으로부터의 데이터와 관련하여, 여러 가지 관찰을 수행하였다. 먼저, CN732, CN733, 및 CN7334 는 모두 Huh-7 세포에서 CN7-2 처럼 효과적으로 플라크를 생성하였다. 대조적으로, 두 개의 아데노바이러스 (CN732 및 CN733)에 대한 플라크 형성 효율은 실험에 포함된 비-AFP 생성 세포에서 극적으로 감소된다. 비-AFP 생성 간세포성 암종 셀라인인 Sk-Hep-1 에서, CN732 와 CN733 은 시험된 희석률에서 플라크를 생성하지 못하였다. 그 결과는 HeLa 에서의 이들 두 바이러스, MCF-7, 및 DLD-1 에 대해서 유사하다. DLD-1 세포에서의 CN702 의 효율은 CN733 의 효율을 4000 배 이상이나 초과한다.
표 4 (역가는 293 세포에서 1×107으로 정상화됨)의 데이터와 관련하여 CN732, CN733, 및 CN734 는 HepG2 세포에서 야생형 (CN702)과 유사하게 플라크를 형성하였다. 그러나, 이들 바이러스는 AFP 를 발현하지 않는 셀라인에서는 CN702 와 비교하여 플라크 생성이 불량하였다. CN732 와 CN733 은 SK-Hep-1, OVCAR-3 및 HBL-100 에서 시험된 휘석률에서 플라크를 생성하지 못하였으며, 그로써 상당한 역가 차이를 나타냈다. 이것은 HBL-100 에서 야생형과 최소한 10,000 배의 차이, 그리고 SK-Hep-1 에서는 1,000 배의 차이에 상응한다. CN734 는 또한 OVCAR-3 (25 배) 과 HBL-100 (200 배) 세포에서 CN702 보다 덜 효과적으로 플라크를 생성하였다.
표 5 의 데이터는 CN732, CN733, 및 CN734 가 AFP 를 발현하는 세포에서 CN702 만큼 효과적으로 플라크를 형성함을 시사한다. 그러나, 이것들은 AFP 를 발현하지 못하는 셀라인에서는 CN702 만큼 효과적으로 플라크를 생성하지 못하였다. 예를 들어, CN732 나 CN733 어느 것도 HBL 100 세포 또는 OVCAR-3 세포에서 시험된 희석률에서 어떤 플라크도 생성하지 못하였다. CN734 의 플라크형성 차이는 시험된 셀라인에서 CN732 또는 CN733 의 그것들만큼 인상적이지 않았다. 각각 DU145, HBL 100, 및 OVCAR-3 에서 야생형보다 13 배, 40 배 및 67 배나 덜 효과적으로 플라크가 생성되었다.
플라크 검정 데이터는 사람 아데노바이러스가 AFP-TRE 를 사용하여 변형되어 AFP 생성 세포, 특히 간 암종 세포와 같이 AFP- 생성 종양 세포에 대하여 선택적인 성장 성질을 가지는 바이러스들을 개발할 수 있음을 증명한다.
E1A 발현의 웨스턴 분석
다음 실험으로, 본 발명자들은 CN733 감염된 세포에서 E1A 단백질의 축적에 미치는 AFP-TRE 의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 만약 CN733 에 삽입된 AFP 조절 영역중 하나가 E1A 유전자를 조절한다면, 감염된 세포에서의 E1A 단백질의 수준도 또한 영향을 받을 것으로 생각하였다. 이 가설을 시험하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
CN733 의 E1A 축적을 Huh-7, SK-Hep-1 및 DLD-1 세포에서 평가하였다. 단층을 CN702 또는 CN733 중 하나로 10 의 MOI 에서 감염시키고, 감염후 다양한 시간점에서 수확하였다. 샘플을 10 % 의 아크릴아미드 겔을 통하여 전기영동시키고, 전기영동에 의하여 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. E1A 단백질을 ECL 웨스턴 검출 시스템 (Amersham, Arlington Heights, IL)을 사용하여 제시된 프로토콜을 사용하여 검출하였다. 사용된 일차 항체는 토끼 항-Ad2 E1A 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 였다. 그 결과는 도 6(A) 에 도시된다.
E1A 는 CN702 및 CN733 으로 감염된 Huh-7 세포에서 신속하게 축적되었다. 고수준의 E1A 가 또한 CN702 로 감염된 Dld-1 세포에서 검출되었다. 그러나, CN733 으로 감염된 Dld-1 세포에서는 E1A 단백질이 거의 검출되지 않았다. 이 결과는 그것이 비 AFP 생성 셀라인에서 CN733 의 불량한 플라크형성 효율이 그것의 제한된 E1A 발현에 기여할 것임을 시사하기 때문에 관심을 끈다. 이들 데이터는 AFP-TRE 가 비-허용 세포타입에서 CN733 의 손상된 복제에 영향을 미친다는 가정과 일치한다.
상기 실험을 비 AFP 생성 세포로서 Sk-Hep-1 세포를 사용하여 반복하였다. 감염 후 24 시간 후에 데이터를 얻었다. 그 결과는 도 6(B) 에 도시된다. 이 실험의 결과는 선행 실험의 결과와 동일하였다: E1A 발현은 AFP-TRE 에 의하여 정확하게 조절된다.
CN733 의 성장
AFP 생성 세포 및 비-AFP 생성 세포에서의 CN733 의 성장을 평가하였다. Huh-7, Sk-Hep-1, 및 Dld-1 세포의 단층을 10 의 MOI 로 CN702 또는 CN733 으로 감염시켰다. 감염후 다양한 시간이 지난후에, 2 벌 샘플을 수확하고, 동결-해동을 3 회 한 후, 293 세포상에서 적정하여 총 바이러스 수율을 측정하였다. CN702 및 CN733 에 대한 바이러스 수율 곡선은 도 7(A)-(C) 에 도시된다.
CN702 와 CN733 은 Huh-7 세포에서 효율적으로 성장하였다. Huh-7 세포는 감염성 CN702 와 CN733 과 유사한 양을 생성하였다. 대조적으로, CN733 의 성장은 SK-Hep-1 세포에서 심각하게 제한되었다. 실험 결과의 CN702 의 역가는 CN733 의 역가보다 약 1000 배 더 컸다. 이 결과는 Dld-1 세포에서와 유사하다.
HepF2 세포에서의 CN732, CN733, 및 CN734 의 성장을 비교하기 위하여 성장 실험을 수행하였다. HepG2 세포의 단층을 2 의 감염 다중성 (MOI)으로 감염시키고 감염후 다양한 시간대에 수확하였다. 샘플을 293 세포에 대하여 적정하여 최종 바이러스 수율을 측정하였다. 그 결과를 도 8(A)-(C) 에 도시한다. 데이터는 AFP-TRE 를 함유하고 있는 아데노바이러스가 이 암 셀라인에서 효율적으로 성장함을 증명한다. CN732, CN733, 및 CN734 는 각각 감염 후 36 시간 후에 높은 최종 역가에 도달하였는데, 이것은 CN702 의 그것과 유사하다.
다른 실험에서, 증식을 실험 시작 3 일 전에 공여자 (32 세의 흑인 남성)로부터 단리된 일차 간세포 (hNheps)에서 평가하였다. 세포의 단층을 2 의 MOI 로 바이러스로 감염시키고, 감염 후 다양한 시간대에 수확하여 293 단층에 대해 적정하였다. 그 결과는 도 9 (A)-(C)에 도시된다. 데이터는 CN732 와 CN733 이 CN702 보다 덜 효율적으로 hNheps 에서 성장함을 시사한다. CN732 의 성장은 CN702 의 성장과 비교하여 24 시간정도 지연되었다. 감염후 36 시간째에, CN733 보다 CN702 감염이 거의 1000 배 더 많았다. CN734 는 CN702 에 유사하게 성장한다. 데이터는 또한 CN733 이 가장 제한적인 표현형이고, 그 다음이 CN732 와 CN734 임을 시사한다. 이들 결과를 함께 고려하면 또한 E1A 유전자의 상류에 삽입된 AFP-TRE 가 E1B 영역의 상류에 공학적으로 처리된 AFP-TRE 보다 숙주-범위를 제한하는데 더 효과적일 수 있음을 나타낸다. 두 개의 AFP-TRE 의 존재는 훨씬 더 효과적이었다.
결론적으로, 상술된 실험은 아데노바이러스 벡터의 숙주 범위를 AFP 생성 세포로 제한하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다. 플라크 검정 및 성장 검정에 의해 증명된 바와 같이, AFP-TRE 를 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터들이 HepG2 및 Huh-7 세포에서 효율적으로 증식하지만, 비 AFP 생성 세포에서는 불량하다.
실시예 2: 플라스미드 CN236 을 사용한 일시적인 발현 검정
CN236 의 800 bp 의 AFP-TRE 의 루시페라제 유전자의 발현을 유도하는 능력을 일시적인 발현 검정으로 측정하였다. AFP 와 Hep3B 세포를 만들지 못하고 AFP 를 생성하는 Chang 간세포를 양이온성 지질 (즉, 리포펙틴) 방법을 사용하여 CN236 또는 pGL2Luc 로 형질전환시켰다. pGL2-베이직 (Promega)은 AFP 조절 유전자가 함유되지 않았고, 단지 골격유전자만이 삽입되어 있으며, 따라서 검정에 대해 네가티브 대조 구성물이다. 플라스미드 벡터, pGL2-Luc (Promega)를 포지티브 대조표준으로서 활용하였다. 세포를 10 % 의 우태아혈청 (FCS)이 첨가된 DMEM 에서 배양하고, 48 시간후에, 루시페라제 활성에 대하여 검정하였다. 루시페라제 활성을 키트의 제조업자 (Packard Instruments)의 지시에 따라 측정하고 발광계를 사용하여 정량하였다. 그 결과를 하기 표 6 에 상대 길이 단위 (RLU)로 나타낸다.
셀라인 네가티브 대조표준 pGL2-Luc CN236
Hep3B 0.017 4.118 7549
Chang 간 0.29 2.94 7.0
이들 데이터는 DNA 의 단편이 AFP 양성 간세포 (Hep3B)에서는 활성이지만, AFP 네가티브 간 세포 (Chang 간)에서는 그렇지 못하다.
실시예 3: HhH7 종양 이종이식편에 미치는 아데노바이러스 벡터의 세포독성 능력의 시험
AFP-특이적 아데노바이러스 벡터의 개발에서 특히 유용한 목적은 AFP-생성 종양, 예컨대 간세포성 암종에 걸려 있는 환자를 치료하는 것이다. 실행가능성의 초기 표시자는 벡터(들)을 Balb/c nu/nu 마우스에서 피하로 성장하고 있는 HuH7 종양 이종이식편에 대한 세포독성 활성을 시험하는 것이다. 마우스들에게 PBS 중의 1×107개의 HhH7 암종 세포를 피하로 주사하였다. 종양 세포를 표준 검정 (예컨대 ELISA)을 사용하여 혈청중의 AFP 에 대하여 검정함으로써 AFP 생성에 대하여 시험할 수 있다.
이 실험을 위하여, 시험 아데노바이러스 벡터를 0.1 ml 의 PBS + 10 % 글리세롤중의 약 108pfu 의 바이러스 (만약 패키지된 바이러스로서 투여된다면)로 마우스에 직접 종양내로, 정맥내로, 또는 복강내 주사로 도입되거나 또는 꼬리 정맥을 경유하여 정맥내로 도입시킨다. 만약 폴리뉴클레오티드 구성물 (즉 바이러스로 패키지되지 않음)로서 투여된다면, 0.1 ㎍ 내지 100 ㎍ 또는 그 이상을 투여할 수 있다. 종양의 크기를 측정하고, 어떤 실험에서는 혈액 샘플을 주마다 취하였다. 종양 크기 및 AFP 수준에 미치는 아데노바이러스 벡터 (예컨대 CN733)의 종양내 주사의 효과를 위조 (sham) 처리와 비교한다.
본원에서 설명된 바이러스를 토대로 한 치료법이 병변내로 (즉 직접 주사)주어질 가능성이 아주 높은 반면, 또한 아데노바이러스 벡터의 정맥내 (IV) 투여가 종양 성장에 영향을 미칠 수 있을 것인지를 측정하는 것도 바람직할 것이다. 만일 그렇다면, 바이러스가 직접적인 주사로는 접근이 어려운 전이성 종양 침착을 치료하기위해 사용될 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 이 실험을 위해서는, HhH7 종양을 포함하고 있는 3 내지 5 마리씩의 마우스 군을 108pfu 의 아데노바이러스 벡터 (예컨대 CN733)를 꼬리 정맥 주사에 의해, 또는 네가티브 대조표준으로서 바이러스를 운반하기 위해 사용했던 완충액으로 접종하였다. 종양 크기 및 혈청 AFP 수준에 미치는 아데노바이러스 벡터의 IV 주사의 효과를 위조 처리와 비교한다.
실시예 4: HepG2 종양 이종이식편에 미치는 아데노바이러스 벡터 CN733 의 세포독성 능력의 시험
HCC 마우스 이종이식편 모델을 사용하여 간암에 대한 치료용 아데노바이러스로서의 CN733 의 잠재력을 평가하였다. AFP 생성 HCC 셀라인인 HepG2 를 Balb/c nu/nu 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 자리잡도록 여러 주동안 방치한 후에, 각각의 동물에게 PBS 중의 1.5×1011입자의 CN733, 글리세롤 또는 완충액중 어느 하나를 종양내 주사하였다. HepG2 종양을 가지고 있는 11 마리의 마우스를 처리하였는데, 6 마리에게 CN733 을 주었고, 5 마리에게 완충액을 주었다. 종양을 실험이 끝날 때까지 주마다 조사하였다. 종양의 길이를 그것의 폭의 제곱으로 곱한 다음 그 값을 둘로 나누어서 종양의 크기를 계산하였다. 도 10(A) 는 각각의 처리군 대 시간에 대한 평균 종양 크기의 그래프도이다.
6주째에, 완충액만을 받은 HepG2 종양은 원래 크기의 5 배 이상으로 성장하였다. 대조적으로, CN733 으로 처리된 마우스에서의 종양 크기는 감소되었다. 한 종양은 그것의 최대 크기의 3 % 까지 줄어들었다. 이들 데이터는 CN733 이 종양에 침입하여 세포독성을 전달했음을 시사한다.
종양의 성장을 모니터하는 것 외에, 본 발명자들은 혈청 샘플을 수확하여 AFP 수준을 검정하였다. 그 결과는 도 11 에 도시된다. 데이터는 혈청 AFP 수준이 완충액을 받은 대조마우스에서보다 CN733 을 받은 마우스에서 더 서서히 증가함을 시사한다.
다른 실험으로 상이한 투여 처방의 항종양 활성을 CN733 에 대해 비교하였다. 동물들을 완충액 (n=8, 부피=919 mm3) 또는 1.5×1011입자의 CN733 (n=8, 부피=944 mm3) 중 어느 하나를 1 회에 장기벽내로 투여함으로써 처리하였다. 세 번째 군의 동물에게는 1.5×1011입자의 CN733 (n=8, 부피=867 mm3)을 연속적으로 5 일 처리하였다. 커다란 전신성 바이러스 부담에도 불구하고, 마우스들은 명백한 독성 신호를 나타내지 않았다. 종양을 주사후 4 주동안 외부의 칼리퍼에 의해 매주 측정하였다. CN733 및 완충액을 1 회 투여한 군의 동물들을 과도한 종양 부담 때문에 처리후 4 주후에 희생시켰다. CN733 을 5 회 투여한 군의 동물들은 모두 연구가 끝날 때까지 생존하였다. 커다란 전신적 바이러스 부담에도 불구하고, 이들 동물은 처리와 관련된 독성에 대한 명백한 신호를 전혀 나타내지 않았다. 그 결과를 도 10(B)에 도시한다. 평균적으로, 완충액으로 처리된 종양은 처리후 4 주동안 원래의 크기의 3 배로 증가하였다. CN733 으로 1 회 처리된 종양은 4 주후에 원래의 크기의 4 배로 증가하였다. 대조적으로, CN733 으로 5 회 처리한 종양은 동일한 크기를 유지하였다. 8 개의 종양중 5 개(63 %)가 처리에 반응하였다. 한 동물은 연구가 끝날 때 촉진가능한 종양이 없었다.
Students T-시험을 이용한 통계학적 분석 결과,완충액으로 처리된 동물과 CN733 으로 1 회 처리된 동물 사이에 어떠한 시간점에서든지 상당한 차이가 없었음이 나타났다 (p〉0.5). 그러나, 완충액으로 처리된 동물과 CN733 으로 5 회 처리한 동물 사이에는 주사후 2 주째에 시작해서 (p=0.045) 4 주까지 계속되는 (p=0.034) 상당한 차이가 있었다.
이 데이터는 CN733 이 HepG2 누드 마우스 이종이식편에서 상당한 항종양 활성을 나타냄을 시사한다. CN733 을 매일 연속적으로 5 일동안 1.5×1011입자의 용량으로 투여하였을 때 일부 동물에서는 종양의 퇴화를 유발할 수 있었다. 그러나 1 회 용량으로는 종양의 죽음을 유발하기에는 충분하지 못하였다.
첫 번째 실험에서, 종양은 1 회 용량의 CN733 에 반응하였지만, 두 번째에서는 반응하는 것으로 나타나지 않았다. 본 발명자들은 실험에 따라 때로 종양의 표현형 (성장 특징과 AFP 발현을 포함하여)에 변이가 있음을 주지하였다.
결론적으로, 생체내 실험은 CN733 이 큰 간암 이종이식편에서 상당한 종양 죽음을 유발하는 것을 시사한다. 5 회의 종양내로 투여된 바이러스는 8 마리 동물중 4 마리의 동물에서 종양의 퇴화를 유도하였고, 주사후 28 일후에 한 마리의 동물을 치료하였다. 평균적으로, 완충액으로 처리된 종양은 세배가 된 반면, CN733 으로 처리된 종양은 동일한 크기로 유지되었다.
실시예 5: 아데노바이러스 사망 단백질 (ADPP) 에 대한 코딩 영역을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터의 구성
AFP-특이적 바이러스 벡터 CN733 (실시예 1 에서 설명됨)에서 E3 영역을 결실시켜서 AFP-TRE 를 E1 영역에 순응시켰다. Ad2 로부터의 ADP 코딩 영역을 Ad5 의 E3 영역에 다음과 같이 재도입하였다.
중복 PCR 을 사용하여 ADP 카세트를 구성하였다. 동일한 후기 유전자의 정확한 발현을 위해 중요한 서열인 Y 리더를 다음의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
5' GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG...Ad2 28287bp (37.124.1)(SEQ ID NO:16); 및
5' GTGGAACAAAAGGTGATTAAAAAATCCCAG...Ad2 28622bp (37.146.1)(SEQ ID NO:17).
ADP 코딩 영역을 다음의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
5' CACCTTTTGTTCCACCGCTCTGCTTATTAC...Ad2 29195bp (37.124.3)(SEQ ID NO:18), 및
5' GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGAGC...Ad2 29872bp (37.124.4)(SEQ ID NO:19).
두 개의 단편을 아닐링하고 중복하는 생성물을 프라이머 37.124.1 과 37.124.4 를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 생성물의 단부를 클레노우 단편으로 두가닥의 길이를 같게 하고 BamHI 으로 절단되어 있는 pGEM-72(+)에 결찰시켰다 (CN241; Promega, Madison, WI). ADP 카세트를 CN241 을 Pac I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킴으로써 절출시키고 두 개의 벡터, CN247 과 CN248 에 결찰시켜서 각각 플라스미드 CN252 와 CN270 을 생성하였다. CN247 은 E3 영역에 독특한 Pac I 부위가 있고, 다음과 같이 구성되었다. 전길이의 Ad5 게놈을 함유하고 있는 플라스미드, TG3602 (Transgene, France)를 BamHI 으로 소화시키고 재결찰하여 CN221 을 만들었다. 이 플라스미드의 골격 (Ad5 서열의 바깥쪽)은 추가의 조작을 쉽게 하기 위하여 제거될 필요가 있는 PacI 부위를 함유하였다. 이것은 CN221 을 PacI 으로 소화시키고 T4 DNA 중합효소로 양단부를 동일한 길이의 두가닥으로 만듬으로써 이루어졌고, 그 결과 CN246 이 생성되었다. CN246 을 AscI 및 AvrII 로 소화시켰다 (무상 E3 영역을 제거하기 위하여). 이 단편을 BHG11 로부터 유도된 유사하게 절단된 단편으로 교체하였다. 그 결과의 플라스미드인 CN247 은 결실된 E3 영역과 ADP 카세트 단편의 삽입을 위해 적당한 PacI 부위 (상기에서 설명됨)를 함유하였다. CN247 의 ADP 카세트와의 결찰로 CN252 가 생성되었다.
CN248 (E4 영역에 결실/치환을 또한 함유하고 있는 Ad 에 ADP 의 도입을 허용할 구성물)을 다음과 같이 만들었다. (BHG10 으로부터 유도된) E3 영역에 독특한 EcoRI 부위로부터의 오른손 단부 Ad5 서열을 함유하고 있는 구성물인 CN108 을 AvrII 와 AflII 로 소화시킴으로써 E4 영역을 결실시켰다. 바이러스 복제에 필요한 유일한 E4 ORF 인 ORF6 을 하기으 프라이머로 ORF 를 PCR 증폭시킴으로써 재도입시켰다:
33.81.1 (Ad5 33096): GCAGCTCACTTAAGTTCATGTCG (SEQ ID NO:20), 및
33.81.2 (Ad5 34084): TCAGCCTAGGAAATATGACTACGTCCG (SEQ ID NO:21).
그 결과의 플라스미드는 CN203 이다. CN203 을 EcoRI 으로 소화시키고 셔틀 플라스미드인 CN209 에 결찰시켜서 CN208 을 만들었다. 최종 클로닝 단계로, CN208 을 AscI 및 AvrII 로 소화시키고 유사하게 절단된 E4 결실/치환에 ADP 카세트를 이용하여 결찰시켰다.
CN252 와 CN270 은 둘다 E3 결실을 함유한다. 또한, CN270 은 상술된 바와 같이 E4 영역의 일부가 결핍되어 있다. 아데노바이러스 벡터를 (1) BamHI 으로 소화된 적절하게 제조된 바이러스 DNA 및 (2) 또한 BamHI 으로 소화된 CN252 또는 CN257 의 결찰을 통하여 얻었다. 결찰 생성물을 사용하여 293 세포를 형질전환시켰다. 플라크 검정은 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 수행하였다.
실시예 6: 아데노바이러스 사망 단백질 유전자를 함유한, E3 결실된 아데노바이러스, CN751 의 특성확인
아데노바이러스 사망 단백질 돌연변이체인 CN751 을, 그러한 구성물이 세포독성에 더 효과적인지를 알아보기 위하여 구성하였다. 감염의 후기에 높은 수준으로 발현된 11.6 kD 의 Asn-글리코실화된 통합 막 펩티드인 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP)은 감염된 세포의 핵 막으로 이동하고 숙주의 효율적인 용해에 영향을 준다. 아데노바이러스 5 (Ad5) E3 영역은 adp 유전자를 발현한다.
CN751 의 제조
CN751 을 두 부분으로 제조하였다. 먼저, 21562 bp 에 BamHI 부위로부터의 Ad5 서열 3'을 함유하고 있는 E3 결실된 플랫폼 플라스미드를 생성하였다. Ad2 adp 를 이 플라스미드의 나머지 E3 영역에 공학적으로 처리하여 CN252 를 만들었다 (이 클로닝에 대해서는 상술한 바 있다). 두 번째 부분을 구성하기 위하여, CN751 에 필요한 5' Ad5 서열을, 정제된 CN702 DNA 를 EcoRI 으로 소화시키고, 왼손 단편을 겔 추출에 의하여 단리함으로써 얻었다. CN252 를 EcoRI 으로 소화시킨 다음에, CN702 및 CN252 의 왼손 단편을 결찰시켰다. 이 결찰 혼합물로 리포펙틴 형질전환에 의하여 293 세포를 형질전환시키고, 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 10 일 후에, 세포를 수확하여 냉동-해동을 3 회 수행하고, 상층액을 293 단층위에 반점을 찍었다. 개개의 플라크를 취하여 293 세포의 단층을 감염시켜 시험용의 충분한 바이러스로 성장시키기 위하여 사용하였다. 여러 날이 지난후, 플레이트 용해물을 후보 바이러스를 검출하기 위하여 중합효소 사슬 반응 (PCR) 기초 검정법을 사용하여 스크린하였다. 양성으로 기록된 플라크중 하나를 CN751 로 표시하였다.
CN751 의 구조적 특성확인
CN751 의 구조를 두가지 방법에 의하여 확인하였다. 먼저, 프라이머 37.124.1 (5' GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG Ad2 28287bp; SEQ ID NO:16) 및 37.124.4 (5' GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGCTGC Ad2 29872bp; SEQ ID NO:19)를 사용하여 PCR 에 의하여 후보 바이러스를 스크린함으로써 adp 카세트의 존재를 검출하였다. CN751 은 예상되는 생성물 (1065bp)과 일치하는 연장 단편을 생성하였다. 두 번째로, CN751 을 서던 블롯에 의해 분석하였다. 바이러스 DNA 를 정제하고, PacI, SacI, 및 AccI/XhoI 으로 소화시킨 후, ADP 코딩 영역에 상동하는 서열로 프로브하였다. CN751 의 구조는 예상된 패턴에 매치하였다.
CN751 의 시험관내 특성확인
CN751 의 세포독성 및 바이러스 수율을 조사하기 위하여 두가지 실험을 수행하였다. 첫 번째 연구에서, CN751 의 세포독성을 시토졸 효소, 락테이트 탈수소효소 (LDH)의 상층액중의 축적을 여러날 동안 측정함으로써 평가하였다. 세포외재성 LDH 의 수준은 세포 용해의 정도와 상관관계가 있다. 건강한 세포는 있다 하더라도 아주 조금 효소를 방출하는 한편, 죽은 세포는 다량의 효소를 방출한다. LDH 는 간단한 프로토콜에 의해서 쉽게 검출될 수 있는 안정한 단백질이기 때문에 그것을 마아커로서 선택하였다. 세포 사망을 유도하는 CN751 의 능력을 ADP 유전자가 없는 벡터인 CN702, 및 ADP 유전자를 함유하고 있는 벡터인 Rec700 의 그것과 비교하였다.
LNCaP 세포의 단층을 1 의 MOI 로 CN702, Rec700(adp + 대조표준), 또는 CN751 중 어느 하나로 감염시킨 후 96 웰 접시에 시드하였다. 샘플을 감염후 하루째 되는 날부터 하루에 한 번 수확하고 프로메가사의 Cytotox 96 키트를 사용하여 기록하였다. 이 검정은 플레이트 판독기에서 490 nm 에서 측정될 수 있는 적색의 포르마잔 생성물로 테트라졸리움 염을 전환시키는 결합된 효소적 반응을 사용한다.
샘플의 흡광도가 감염된 세포로부터 방출된 LDH 의 수준에 상응하기 때문에, 어떻게 샘플의 흡광도가 시간에 따라 변하는 지를 보여주는 도표는 연구되는 바이러스가 어떻게 효과적으로 세포 용해를 유도하는 지 설명해준다 (도 12). 각각의 데이터점은 16 개의 별도의 샘플의 평균은 나타낸다. 그 결과는 CN751 이 adp- 대조표준인 CN702 에서보다 더 효과적으로, 그리고 adp+ 대조표준인 Rec700 과 유사하게 세포를 죽인다는 것을 시사한다. 상층액중의 LDH 의 농도는 CN751 로 감염된 웰에서 2 일째부터 급속하게 증가하여 4 일째에 최대치에 도달한다. 대조적으로, CN702 로 감염된 세포의 상층액의 LDH 농도는 2 일째에 서서히 증가하기 시작하여 실험이 끝날 때까지 지속된다. 중요한 것은 CN751 로 감염된 세포로부터 방출된 LDH 의 양이 CN702 로 감염된 세포로부터 방출된 양의 2 배라는 것이다. 이 데이터는 ADP 유전자를 포함하는 아데노벡터가 ADP 유전자가 없는 아데노벡터보다 더 효과적으로 세포를 죽인다는 것을 증면한다.
Ad 벡터가 세포를 효과적으로 죽이는 것이 중요할 뿐만 아니라, 다른 암세포도 감염시킬 수 있는 자손을 방출할 수 있어야 한다. 다량의 바이러스를 방출할 수 있는 바이러스 벡터는 단지 소량만을 방출하는 것보다 더 치료적으로 나아야 할 것이다. CN751 이 감염된 세포로부터 그것의 자손의 효과적인 방출을 유도할 수 있는지를 평가하기 위하여 바이러스 수율 검정을 수행하였다. A549 세포를 5 의 MOI 로 감염시켰다. 상층액을 감염후 다양한 시간점에서 수확하여 293 세포에 대하여 적정함으로써 바이러스 수율을 측정하였다 (도 13). 얻어진 데이터는 CN751 로 감염된 세포가 CN72 로 감염된 세포보다 더 효과적으로 바이러스를 방출하는 것을 시사한다. 감염 후 48 시간이 지난후, CN751 감염된 세포는 CN702 로 감염된 세포보다 10 배 더 많은 바이러스를 방출하였다. 감염후 72 시간이 지난후, CN751 로 감염된 세포는 40 배 더 많은 바이러스를 방출하였다. 요약하면, 바이러스 수율 데이터는 ADP 유전자를 함유하는 아데노벡터가 더 많은 바이러스를 방출한다는 것을 증명한다.
CN751 의 생체내 특성확인
LNCaP 누드 마우스 이종이식편을 ADP 유전자를 함유하고 있는 CN751, 또는 이 유전자가 없는 벡터인 CN702 중 어느 하나의 종양내 용량 (1×104입자/mm3종양) 으로 1 회 도전시켰다. 세 번째 종양군은 완충액만으로 처리하였다. 종양을 6 주동안 매주 1 회 모니터하고, 종양의 상대적인 크기를 시간에 대하여 그래프로 표시하였다. 그 결과는 도 14 에 도시한다. 에러 막대는 각 샘플 군에 대한 표준 에러를 나타낸다. CN751 로 처리된 동물들 (n=14)에 대한 초기의 평균 종양 크기는 320 mm3이었고, CN702 로 처리된 동물들 (n=14)에 대해서는 322 mm3이었으며, 완충액으로 처리된 동물들 (n=8)에 대해서는 343 mm3이었다. 데이터는 CN751 이 CN702 보다 더 효과적으로 종양 세포를 죽인다는 것을 시사한다. 평균적으로, CN751 로 도전받은 종양이 실험의 전 과정을 통하여 동일한 크기로 유지된 반면, 14 개의 종양중 9 개 (64 %)가 퇴화하였다. CN702 로 도전받은 것들은 크기가 두배가 되었다. 완충액으로 처리된 종양은 그것들의 원래 크기의 거의 5 배까지 자랐다. 학생 T-시험의 결과는 CN751 과 CN702 로 처리한 종양의 종양 크기의 차이가 제 9 일째 (p=0.016)부터 실험이 끝날 때까지 (p=0.003) 통계학적으로 유의할만함을 나타낸다.
실시예 7: 공유적으로 페길레이트된 아데노바이러스의 제조
아데노바이러스의 표면 캡시드를 변경시키기 위하여 아데노바이러스를 PEG 와 복합체를 형성함에 의해 일련의 실험을 수행하였다. 아데노바이러스 표면을 차폐하는 PEG 복합화의 목적은 다음과 같다: 1) 순환계에 있는 아데노바이러스 중화 항체 또는 옵시닌, 및 2) 신체의 비-특이적 정화 메카니즘 (즉, 대식세포 등)의 감소에 의한 아데노바이러스 입자의 전신성 순환 시간의 증가.
야생형 아데노바이러스 CN706 의 표면 캡시드를 N-히드록시숙신이미딜 숙신아미드 (NHS)를 사용하여 헥손 및 섬유 단백질에 PEG 를 공유 부착시킴으로써 변형시켰다. PEG (Shearwater Polymers, Inc.)의 공식적인 분자량은 5000 Da 이다. 활성화된 PEG (대략 2 mM)를 트리스-HCl 완충액중의 5×109입자/ml 의 아데노바이러스와 반응시켰다 (바이러스 입자 대 PEG 의 몰비는 대략 1:4×106). pH, 온도, 및 반응 시간을 다양하게 조합하여 사용하였다. 반응후, 미반응된 활성화된 PEG, 미반응된 아데노바이러스, 및 페길레이트된 아데노바이러스를 Q 세파로스 XL (Pharmacia)상에서, 50 mM 트리스, pH 8.0 중의 0 내지 1.5 M NaCl 로 작동시키는 음이온성 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 분리하였다. 구배는 10 배의 칼럼 부피에서 행하였다.
PEG-CN706 의 특성확인
CN706 의 페길화를 SDS-Page 에 의하여 증명하였다. 도 16 은 CN706 의 페길화 및 페길레이트된 단백질의 이동성 이동을 도시한다. 레인 1 및 2 는 비-페길레이트된 CN706 (대조표준)을 나타내고, 레인 3 내지 6 은 여러 가지 pH 및 온도 조건하의 페길레이트된 CN706 을 나타낸다. 레인 3 내지 6 은 CN706 의 헥손 단백질보다 위에 있는 가장 잘 페길레이트된 것같은 헥손인 두 번째 밴드의 출현, 및 섬유 단백질 밴드의 소실을 보여준다. PEG-헥선 단백질에 상응하는 것 외에는 바이러스와 관련된 추가의 밴드가 없기 때문에, 페길레이트된 섬유 단백질은 SDS 겔상에서 페길레이트되지 않은 단백질의 제어하에 있는 것으로 추정된다.
도 17 은 CN706 의 표면 성질을 보여주는 이온 교환 크로마토그램이다. CN706 의 페길화는 바이러스를 포획하기 위하여 사용된 Q 세파로스 수지로무터 조기에 용출되는 결과를 초래한다. 이 결과는 가장 크게는 바이러스가 외관상으로는 보다 더 중성의 전하를 띄도록 PEG 가 만들고, 따라서 이온 교환 매트릭스에 대한 결합 잠재력이 감소되기 때문인 것 같다. 바이러스의 크로마토그램의 확산은 CN706 의 페길화가 상이한 백분율로 일어나기 때문에 예상된다.
페길레이트된 CN706 의 감염성을 293 세포상에서 시험관내 플라크 검정으로 평가하였다. 하기의 표 7 은 CN706 과 비교했을 때 PEG-CN706 의 플라크형성 효율의 5 내지 10 배 감소를 보여준다. 이것은 가장 크게는 바이러스 입자의 인지 및 엔도시토시스를 감소시키는 결과를 초래하는 바이러스 세포의 페길화 차폐로 인한 것일 것이다.
CN706 과 PEG-CN706 의 플라크형성 효율의 비교
샘플 표시 플라크의 수 (임의 단위)
CN706 15 ± 5
PEG-CN706 4 ± 1
비록 전술한 발명이 이해를 분명히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 어느 정도 상세하게 설명되었지만, 당업자에게는 특정 수정 및 변형이 실시될 수 잇음이 명백할 것이다. 그러므로, 설명 및 실시예는 첨부되는 특허청구의 범위에 의해 윤곽이 정해지는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되어서는 안된다.
〈110〉 CALYDON, INC.
〈120〉 ADENOVIRUS VECTORS SPECIFIC FOR CELLS EXPRESSING ALPHA-FETOPROTEI
N AND METHODS OF USE THEREOF
〈130〉 1
〈150〉 US 60/039,597
〈151〉 1997-03-03
〈150〉 US 09/033,428
〈151〉 1998-03-02
〈160〉 22
〈170〉 KOPATIN 1.5
〈210〉 1
〈211〉 822
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 1
gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacac atagattgag 60
gattgtttgc tgttagcata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 120
aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 180
catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 240
cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 300
ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 360
cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 420
tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 480
taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 540
caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 600
ctttatccag gccacttatg agctctgtgt ccttgaacat aaaatacaaa taaccgctat 660
gctgttaatt attggcaaat gtcccatttt caacctaagg aaataccata aagtaacaga 720
tataccaaca aaaggttact agttaacagg cattgcctga aaagagtata aaagaatttc 780
agcatgattt tccatattgt gcttccacca ctgccaataa ca 822
〈210〉 2
〈211〉 5224
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 2
gaattcttag aaatatgggg gtaggggtgg tggtggtaat tctgttttca ccccataggt 60
gagataagca ttgggttaaa tgtgctttca cacacacatc acatttcata agaattaagg 120
aacagactat gggctggagg actttgagga tgtctgtctc ataacacttg ggttgtatct 180
gttctatggg gcttgtttta agcttggcaa cttgcaacag ggttcactga ctttctcccc 240
aagcccaagg tactgtcctc ttttcatatc tgttttgggg cctctggggc ttgaatatct 300
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tcatttgtat caatgaatga atgaggacaa ttagtgtata aatccttagt acaacaatct 420
gagggtaggg gtggtactat tcaatttcta tttataaaga tacttatttc tatttattta 480
tgcttgtgac aaatgttttg ttcgggacca caggaatcac aaagatgagt ctttgaattt 540
aagaagttaa tggtccagga ataattacat agcttacaaa tgactatgat ataccatcaa 600
acaagaggtt ccatgagaaa ataatctgaa aggtttaata agttgtcaaa ggtgagaggg 660
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gtgagataag agaaggaatt ttctcacaac ccacacgtat agctcaactg ctctgaagaa 900
gtatatatct aatatttaac actaacatca tgctaataat gataataatt actgtcattt 960
tttaatgtct ataagtacca ggcatttaga agatattatt ccatttatat atcaaaataa 1020
acttgagggg atagatcatt ttcatgatat atgagaaaaa ttaaaaacag attgaattat 1080
ttgcctgtca tacagctaat aattgaccat aagacaatta gatttaaatt agttttgaat 1140
ctttctaata ccaaagttca gtttactgtt ccatgttgct tctgagtggc ttcacagact 1200
tatgaaaaag taaacggaat cagaattaca tcaatgcaaa agcattgctg tgaactctgt 1260
acttaggact aaactttgag caataacaca catagattga ggattgtttg ctgttagcat 1320
acaaactctg gttcaaagct cctctttatt gcttgtcttg gaaaatttgc tgttcttcat 1380
ggtttctctt ttcactgcta tctatttttc tcaaccactc acatggctac aataactgtc 1440
tgcaagctta tgattcccaa atatctatct ctagcctcaa tcttgttcca gaagataaaa 1500
agtagtattc aaatgcacat caacgtctcc acttggaggg cttaaagacg tttcaacata 1560
caaaccgggg agttttgcct ggaatgtttc ctaaaatgtg tcctgtagca catagggtcc 1620
tcttgttcct taaaatctaa ttacttttag cccagtgctc atcccaccta tggggagatg 1680
agagtgaaaa gggagcctga ttaataatta cactaagtca ataggcatag agccaggact 1740
gtttgggtaa actggtcact ttatcttaaactaaatatat ccaaaactga acatgtactt 1800
agttactaag tctttgactt tatctcattc ataccactca gctttatcca ggccacttat 1860
ttgacagtat tattgcgaaa acttcctaac tggtctcctt atcatagtct tatccccttt 1920
tgaaacaaaa gagacagttt caaaatacaa atatgatttt tattagctcc cttttgttgt 1980
ctataatagt cccagaagga gttataaact ccatttaaaa agtctttgag atgtggccct 2040
tgccaacttt gccaggaatt cccaatatct agtattttct actattaaac tttgtgcctc 2100
ttcaaaactg cattttctct cattccctaa gtgtgcattg ttttccctta ccggttggtt 2160
tttccaccac cttttacatt ttcctggaac actataccct ccctcttcat ttggcccacc 2220
tctaattttc tttcagatct ccatgaagat gttacttcct ccaggaagcc ttatctgacc 2280
cctccaaaga tgtcatgagt tcctcttttc attctactaa tcacagcatc catcacacca 2340
tgttgtgatt actgatacta ttgtctgttt ctctgattag gcagtaagct caacaagagc 2400
tacatggtgc ctgtctcttg ttgctgatta ttcccatcca aaaacagtgc ctggaatgca 2460
gacttaacat tttattgaat gaataaataa aaccccatct atcgagtgct actttgtgca 2520
agacccggtt ctgaggcatt tatatttatt gatttattta attctcattt aaccatgaag 2580
gaggtactat cactatcctt attttatagt tgataaagat aaagcccaga gaaatgaatt 2640
aactcaccca aagtcatgta gctaagtgac agggcaaaaa ttcaaaccag ttccccaact 2700
ttacgtgatt aatactgtgc tatactgcct ctctgatcat atggcatgga atgcagacat 2760
ctgctccgta aggcagaata tggaaggaga ttggaggatg acacaaaacc agcataatat 2820
cagaggaaaa gtccaaacag gacctgaact gatagaaaag ttgttactcc tggtgtagtc 2880
gcatcgacat cttgatgaac tggtggctga cacaacatac attggcttga tgtgtacata 2940
ttatttgtag ttgtgtgtgt atttttatat atatatttgt aatattgaaa tagtcataat 3000
ttactaaagg cctaccattt gccaggcatt tttacatttg tcccctctaa tcttttgatg 3060
agatgatcag attggattac ttggccttga gagtgatata tctacatcta tatctatatc 3120
tatatctata tctatatcta tatctatatc tatatctata tatgtatatc agaaaagctg 3180
aaatatgttt tgtaaagtta taaagatttc agactttata gaatctggga tttgccaaat 3240
gtaacccctt tctctacatt aaacccatgt tggaacaaat acatttatta ttcattcatc 3300
aaatgttgct gagtcctggc tatgaaccag acactgtgaa agcctttggg atattttgcc 3360
catgcttggg caagcttata tagtttgctt cataaaactc tatttcagtt cttcataact 3420
aatacttcat gactattgct tttcaggtat tccttcataa caaatacttt ggctttcata 3480
tatttgagta aagtccccct tgaggaagag tagaagaact gcactttgta aatactatcc 3540
tggaatccaa acggatagac aaggatggtg ctacctcttt ctggagagta cgtgagcaag 3600
gcctgttttg ttaacatgtt ccttaggaga caaaacttag gagagacacg catagcagaa 3660
aatggacaaa aactaacaaa tgaatgggaa ttgtacttga ttagcattga agaccttgtt 3720
tatactatga taaatgtttg tatttgctgg aagtgctact gacggtaaac cctttttgtt 3780
taaatgtgtg ccctagtagc ttgcagtatg atctattttt taagtactgt acttagctta 3840
tttaaaaatt ttatgtttaa aattgcatag tgctctttca ttgaagaagt tttgagagag 3900
agatagaatt aaattcactt atcttaccat ctagagaaac ccaatgttaa aactttgttg 3960
tccattattt ctgtctttta ttcaacattt tttttagagg gtgggaggaa tacagaggag 4020
gtacaatgat acacaaatga gagcactctc catgtattgt tttgtcctgt ttttcagtta 4080
acaatatatt atgagcatat ttccatttca ttaaatattc ttccacaaag ttattttgat 4140
ggctgtatat caccctactt tatgaatgta ccatattaat ttatttcctg gtgtgggtta 4200
tttgatttta taatcttacc tttagaataa tgaaacacct gtgaagcttt agaaaatact 4260
ggtgcctggg tctcaactcc acagattctg atttaactgg tctgggttac agactaggca 4320
ttgggaattc aaaaagttcc cccagtgatt ctaatgtgta gccaagatcg ggaacccttg 4380
tagacaggga tgataggagg tgagccactc ttagcatcca tcatttagta ttaacatcat 4440
catcttgagt tgctaagtga atgatgcacc tgacccactt tataaagaca catgtgcaaa 4500
taaaattatt ataggacttg gtttattagg gcttgtgctc taagttttct atgttaagcc 4560
atacatcgca tactaaatac tttaaaatgt accttattga catacatatt aagtgaaaag 4620
tgtttctgag ctaaacaatg acagcataat tatcaagcaa tgataatttg aaatgaattt 4680
attattctgc aacttaggga caagtcatct ctctgaattt tttgtacttt gagagtattt 4740
gttatatttg caagatgaag agtctgaatt ggtcagacaa tgtcttgtgt gcctggcata 4800
tgataggcat ttaatagttt taaagaatta atgtatttag atgaattgca taccaaatct 4860
gctgtctttt ctttatggct tcattaactt aatttgagag aaattaatta ttctgcaact 4920
tagggacaag tcatgtcttt gaatattctg tagtttgagg agaatatttg ttatatttgc 4980
aaaataaaat aagtttgcaa gttttttttt tctgccccaa agagctctgt gtccttgaac 5040
ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa atgtcccatt ttcaacctaa 5100
ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta ctagttaaca ggcattgcct 5160
gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat tttccatatt gtgcttccac cactgccaat 5220
aaca 5224
〈210〉 3
〈211〉 19
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 3
tcgtcttcaa gaattctca 19
〈210〉 4
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 4
tttcagtcac cggtgtcgga 20
〈210〉 5
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 5
gcattctcta gacacaggtg 20
〈210〉 6
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 6
tccgacaccg gtgactgaaa 20
〈210〉 7
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 7
gcccacggcc gcattatata c 21
〈210〉 8
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 8
gtatataatg cggccgtggg c 21
〈210〉 9
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 9
ccagaaaatc cagcaggtac c 21
〈210〉 10
〈211〉 29
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 10
gtgaccggtg cattgctgtg aactctgta 29
〈210〉 11
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 11
ataagtggcc tggataaagc tgagtgg 27
〈210〉 12
〈211〉 28
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 12
gtcaccggtc tttgttattg gcagtggt 28
〈210〉 13
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 13
atccaggcca cttatgagct ctgtgtcctt 30
〈210〉 14
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 14
tatcggccgg cattgctgtg aactct 26
〈210〉 15
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 15
ttacggccgc tttgttattg gcagtg 26
〈210〉 16
〈211〉 29
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 16
gccttaatta aaagcaaacc tcacctccg 29
〈210〉 17
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 17
gtggaacaaa aggtgattaa aaaatcccag 30
〈210〉 18
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 18
caccttttgt tccaccgctc tgcttattac 30
〈210〉 19
〈211〉 28
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 19
ggcttaatta actgtgaaag gtgggagc 28
〈210〉 20
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 20
gcagctcact taagttcatg tcg 23
〈210〉 21
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 21
tcagcctagg aaatatgact acgtccg 27
〈210〉 22
〈211〉 307
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (2)..(304)
〈400〉 22
g atg acc ggc tca acc atc gcg ccc aca acg gac tat cgc aac 43
Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn
1 5 10
acc act gct acc gga cta aca tct gcc cta aat tta ccc caa gtt cat 91
Thr Thr Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His
15 20 25 30
gcc ttt gtc aat gac tgg gcg agc ttg gac atg tgg tgg ttt tcc ata 139
Ala Phe Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile
35 40 45
gcg ctt atg ttt gtt tgc ctt att att atg tgg ctt att tgt tgc cta 187
Ala Leu Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu
50 55 60
aag cgc aga cgc gcc aga ccc ccc atc tat agg cct atc att gtg ctc 235
Lys Arg Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu
65 70 75
aac cca cac aat gaa aaa att cat aga ttg gac ggt ctg aaa cca tgt 283
Asn Pro His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys
80 85 90
tct ctt ctt tta cag tat gat taa 307
Ser Leu Leu Leu Gln Tyr Asp
95 100
〈210〉 23
〈211〉 101
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 23
Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His Ala Phe
20 25 30
Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala Leu
35 40 45
Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu Lys Arg
50 55 60
Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu Asn Pro
65 70 75 80
His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys Ser Leu
85 90 95
Leu Leu Gln Tyr Asp
100

Claims (70)

  1. α 페토단백질 전사 조절 엘레먼트 (AFP-TRE)의 전사적 제어하에 아데노바이러스 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자가 바이러스 복제에 필수적인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자가 초기 유전자인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  4. 제 2 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자가 후기 유전자인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  5. 제 3 항에 있어서, 아데노바이러스 초기 유전자가 E1A 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  6. 제 3 항에 있어서, 아데노바이러스 초기 유전자가 E1B 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  7. 제 3 항에 있어서, 아데노바이러스 초기 유전자가 E4 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자가 아데노바이러스 사망 단백질 유전자 (ADP) 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  9. 제 1 항에 있어서, AFP-TRE 가 AFP 유전자로부터의 인핸서를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 인핸서가 SEQ ID NO:1 의 약 1 부터 약 300 까지의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  11. 제 9 항에 있어서, AFP-TRE 가 SEQ ID NO:1 의 약 300 부터 약 600 까지의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  12. 제 9 항에 있어서, AFP-TRE 가 SEQ ID NO:1 의 약 1 부터 약 600 까지의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  13. 제 1 항에 있어서, AFP-TRE 가 AFP 유전자로부터의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, AFP-TRE 가 SEQ ID NO:1 의 약 600 부터 약 827 까지의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  15. 제 1 항에 있어서, AFP-TRE 가 AFP 프로모터와 AFP 인핸서를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서, AFP-TRE 가 SEQ ID NO:1 을 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  17. 제 15 항에 있어서, AFP-TRE 가 SEQ ID NO:2 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  18. 제 1 항의 아데노바이러스를 포함하고 있는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 추가로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 1 항에 있어서, 추가로 두 번째 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 최소한 하나의 추가의 아데노바이러스 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, AFP-TRE 의 전사적 제어하에 있는 유전자가 둘다 초기 유전자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, AFP-TRE 의 전사적 제어하에 있는 유전자가 E1A 및 E1B 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 20 항에 있어서, 추가로 세 번째 AFP-TRE 의 전사적 제어하에 추가의 아데노바이러스 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 전사적 제어하에 있는 아데노바이러스 유전자들이 E1A, E1B, 및 E4 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 21 항의 아데노바이러스를 포함하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 추가로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP) 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 비-자연 발생 아데노바이러스 벡터.
  28. 제 27 항에 있어서, ADP 폴리펩티드가 SEQ ID NO:23 에 도시된 서열인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  29. 제 27 항에 있어서, ADP 폴리펩티드가 SEQ ID NO:23 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  30. 제 27 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:22 내에 함유되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  31. 제 27 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:22 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  32. 제 27 항에 있어서, ADP 를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 세포-특이적 전사 조절 엘레먼트의 전사적 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  33. 제 32 항에 있어서, 세포-특이적 전사 조절 엘레먼트가 전립선-세포 특이적인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  34. 제 33 항에 있어서, 전립선-세포 특이적 TRE 가 잔립선 특이적 항원 유전자, 사람 칼리크리엔 유전자, 또는 프로바신 유전자로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  35. 제 32 항에 있어서, 세포-특이적 전사 엘레먼트가 AFP-TRE 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  36. 제 1 항의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  37. 제 20 항의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. 제 24 항의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  39. 제 27 항의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 제 1 항에 따르는 아데노바이러스 벡터를 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포와 조합시키고, 그로써 상기 아데노바이러스가 증식하는 것으로 이루어지는, AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포에 특이적인 아데노바이러스의 증식 방법.
  41. 제 20 항에 따르는 아데노바이러스 벡터를 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포와 조합시키고, 그로써 상기 아데노바이러스가 증식하는 것으로 이루어지는, AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포에 특이적인 아데노바이러스의 증식 방법.
  42. 표적 세포와 제 1 항의 아데노바이러스 벡터를 접촉시켜서 벡터가 세포안으로 들어가도록 허용하는 것으로 이루어지는, 표적 세포의 유전자형을 변형시키는 방법.
  43. 표적 세포와 제 20 항의 아데노바이러스 벡터를 접촉시켜서 벡터가 세포안으로 들어가도록 허용하는 것으로 이루어지는, 표적 세포의 유전자형을 변형시키는 방법.
  44. AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포와 제 1 항의 아데노바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 벡터가 세포안으로 들어가는 것으로 이루어지는, 표적 세포에 선택적인 세포독성을 부여하는 방법.
  45. AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포와 제 20 항의 아데노바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 벡터가 세포안으로 들어가는 것으로 이루어지는, 표적 세포에 선택적인 세포독성을 부여하는 방법.
  46. 생물학적 샘플을, 세포안에서 AFP-TRE-중재된 유전자 발현에 적당한 조건하에서 제 1 항의 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계; 그리고
    AFP-TRE 가 생물학적 샘플중의 유전자 발현을 중재하는 지의 여부를 측정하는 단계로 이루어지며,
    AFP-TRE-중재된 유전자 발현은 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포의 존재를 나타내는 것임을 특징으로 하는,
    생물학적 샘플중에서 AFP-TRE 의 기능을 허용하는 세포를 검출하는 방법.
  47. 종양 세포를 제 2 항의 아데노바이러스 벡터와 접촉시킴으로써, 아데노바이러스 벡터가 종양 세포를 형질전환시키고 복제하는 것으로 이루어지는, AFP-발현 종양을 가지고 있는 개체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  48. 개체에게 유효량의 제 2 항의 아데노바이러스를 투여하는 것으로 이루어지는, AFP-생성 종양을 가지고 있는 개체에서의 암 치료방법.
  49. 차폐제와 복합체를 형성하고 있는 제 1 항의 아데노바이러스 벡터를 포함하고 있는 아데노바이러스.
  50. 제 49 항에 있어서, 차페제가 폴리에틸렌글리콜 (PEG)인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  51. 제 50 항에 있어서, PEG 가 약 2500 내지 약 30,000 사이의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  52. 제 51 항에 있어서, PEG 가 약 3000 내지 약 20,000 사이의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  53. 제 52 항에 있어서, PEG 가 약 5000 내지 약 10,000 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  54. 제 50 항에 있어서, PEG 가 아데노바이러스에 공유 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  55. 제 50 항에 있어서, PEG 가 아데노바이러스에 비-공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  56. 제 54 항에 있어서, PEG 가 N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르를 사용함으로써 공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  57. 제 56 항에 있어서, N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 숙신아미드 및 숙신이미딜 프로피오네이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  58. 제 57 항에 있어서, N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르가 숙신이미딜 숙시네이트인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  59. 차폐제는 약 2500 내지 약 20,000 의 분자량을 가지고 있는 차폐제를 아데노바이러스에 공유 부착시킴으로써, 차폐된 아데노바이러스가 생성되는 것으로 이루어지는, 차폐된 아데노바이러스의 제조 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 차폐제가 폴리에틸렌글리콜 (PEG)인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 차폐제와 복합체를 형성한 아데노바이러스.
  62. 제 61 항에 있어서, 차폐제가 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  63. 제 62 항에 있어서, PEG 가 약 2500 내지 약 30,000 사이의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  64. 제 63 항에 있어서, PEG 가 약 3000 내지 약 20,000 사이의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  65. 제 64 항에 있어서, PEG 가 약 5000 내지 약 10,000 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  66. 제 62 항에 있어서, PEG 가 아데노바이러스에 공유 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  67. 제 62 항에 있어서, PEG 가 아데노바이러스에 비-공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  68. 제 66 항에 있어서, PEG 가 N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르를 사용함으로써 공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  69. 제 68 항에 있어서, N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 숙신아미드 및 숙신이미딜 프로피오네이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  70. 제 69 항에 있어서, N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 활성 에스테르가 숙신이미딜 숙시네이트인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
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