JP2002516568A

JP2002516568A - α−フェトタンパク質を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用の方法

Info

Publication number: JP2002516568A
Application number: JP53867698A
Authority: JP
Inventors: エス．リトル，アンドリュー; ジー．ランパルスキ，ヘンリー; アール．ヘンダーソン，ダニエル; アール．シュア，エリック
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレイティド
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2002-06-04
Also published as: DE69839071D1; AU745560B2; EP0972063B1; AU6679698A; WO1998039465A2; CN100390292C; CA2282706A1; CN1252840A; CA2282706C; WO1998039465A3; ATE385256T1; EP0972063A2; US20020164799A1; US6254862B1; US6585968B2; DE69839071T2; KR20000075924A

Abstract

(57)【要約】 α−フェトプロテイン（AFP）を発現する細胞に複製特異的なアデノウイルスベクター、およびそれらの使用方法が提供される。AFP発現に依存する転写開始調節を提供することにより、ウイルス複製は、AFPを発現する標的細胞、特に肝細胞ガン細胞に制限される。このアデノウイルスベクターを使用して、AFP産生細胞の存在についてサンプルを検出およびモニターし得、およびAFPを産生する悪性細胞を選択的に殺傷し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 α-フェトタンパク質を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用の方法関連出願の相互参照本出願は1997年3月3日に出願された、米国仮出願番号60／039,597の利益を請求する。技術分野本発明は、アデノウイルスベクターを使用する細胞トランスフェクションに関する。より詳細には、本発明は、α-フェトタンパク質を発現する細胞、特に肝ガン細胞におけるアデノウイルスベクターの細胞特異的複製に関する。発明の背景広範な医学的研究および多くの進歩にもかかわらず、ガンは米国における死因の第２位にとどまっている。肝細胞ガン（HCCまたは悪性肝ガン）は、世界で最も一般的なガンの１つであり、とりわけアジアにおいて問題である。肝細胞ガン患者の処置の見込みはかすかである。治療の改善および肝臓移植の利用可能性をもってさえ、患者の少数のみが切除または移植のいずれかによる腫瘍の除去によって治癒する。患者の大多数にとって、現在の処置は不満足なままであり、そして予後は貧弱である。特に興味深いのは、とりわけ肝ガンのような、成功裡に処置することが困難なガンにおける、より特異的で、標的化された形態のガン治療の開発である。比較的非特異的であり、しばしば重篤な毒性を生ずる従来のガン治療と対照的に、より特異的な処置様式は、健常細胞を無傷のままにしつつ、選択的に悪性細胞を阻害するかまたは殺すように試みる。肝ガンのようなガンへの１つの可能な処置アプローチは遺伝子治療であり、それによって目的の遺伝子が悪性細胞に導入される。目的の遺伝子は、別の化合物での処置の際に毒性の物質に転換するタンパク質、またはプロドラッグを薬物に転換する酵素をコードし得る。例えば、チミジンキナーゼ（HSV-tk）をコードする単純ヘルペス遺伝子の導入は、細胞に条件的にガンシクロビル（GCV）に対する感受性を与える。あるいは、目的の遺伝子は、ジフテリア毒素（DT）のような直接毒性の化合物をコードし得る。これらの処置をガン細胞に特異的に与えるために、目的の遺伝子は、特異的に（すなわち、優先的に）ガン細胞中で活性化される転写開始領域の制御下にあり得る。細胞または組織特異的発現は、細胞特異的エンハンサーおよび／またはプロモーターを使用して達成され得る。一般的に、Huberら、（1995）Adv．Drug．Delivery Reviews 17:279-292を参照のこと。種々のウイルスおよび非ウイルス（例えば、リポソーム）ビヒクル、またはベクターは、これらの遺伝子を移入するために開発されてきた。これらのウイルスのうち、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、シンドビスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスが遺伝子移入のために提唱されており、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターに、最近の多くの研究では焦点が当てられている。中でもアデノウイルスは最も容易に産生および精製されるが、レトロウイルスは不安定で、産生および精製が困難であり、そして宿主のゲノムに組み込まれて、危険な変異の可能性を生じ得る。さらに、アデノウイルスは高効率の形質導入をもたらすという利点を有し、そして細胞の効率的な形質導入のために細胞の増殖を必要としない。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発に関する一般的な背景の参考文献について、Grahamら、（1973）Virology 52:456-467；Takiffら、（1981）Lancet 11:832 -834；Berknerら、（1983）Nucleic Acid Research 11:6003-6020；Grahamら、（1984）EMBO J 3:2917-2922;Bettら、（1993）J．Virology 67:5911-5921；およびBettら、（1994）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:8802-8806を参照のこと。遺伝子移入ビヒクルとして使用される場合、アデノウイルスベクターは、しばしば複製欠損であるように設計され、従って目的の標的細胞中で複製しないように故意に操作される。これらのビヒクルにおいて、アデノウイルス初期遺伝子産物E1Aおよび／またはE1Bは欠失され、そしてパッケージング細胞株293によってイントランスに提供される。Grahamら、（1987）J．Gen．Virol 36:59-72；Grah a m（1977）J．Genetic Virology 68:937-940。形質導入される遺伝子は、一般的にウイルスゲノムのE1AおよびE1B領域においてアデノウイルス中に挿入される。 Bettら、(1994)。効率的な遺伝子の形質導入のためのビヒクルとしての複製欠損アデノウイルスベクターは、特に、Stratford-Perricaudet（1990）Human Gene Therapy 1:241-256；Rosenfeld（1991）Science 252:431-434；Wangら、（1991 ）Adv．Exp．Med．Biol．309:61-66；Jaffeら、（1992）Nat．Gen．1:372-378； Quantinら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2581-2584；Rosenfeldら、（1992）Cell 68:143-155；Stratford-Perricaudetら、（1992）J．Clin．Inv est．90:626-630；Le Gal Le Salleら、（1993）Science 259:988-990 Mastrang eliら、（1993）J．Clin．Invest．91:225-234；Ragotら、（1993）Nature 361: 647-650；Hayaskiら、（1994）J．Biol．Chem．269:23872-23875；Bettら、（19 94）によって記載されている。遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの開発における実質的に独占的な焦点は、単に目的の遺伝子を導入するためのビヒクルとしてのアデノウイルスの使用であり、それ自身の中のエフェクターとしてではない。アデノウイルスの複製は、主に宿主の免疫応答に起因して、所望されない結果とみなされている。複製欠損アデノウイルスによるガンの処置において、宿主の免疫応答は、反復用量の持続時間を２つのレベルに限定する。第１は、アデノウイルス送達ビヒクルそれ自身のキャプシドタンパク質が免疫原性である。第２は、ウイルス後期遺伝子が、形質導入された細胞で頻繁に発現し、細胞性免疫を誘発する。従って、サイトカイン、腫瘍サプレッサー遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、またはプロドラッグを活性な薬物に転換させる遺伝子を反復して投与する能力は、遺伝子移入ビヒクルおよび移入ビヒクルのウイルス遺伝子産物の両方の免疫原性、ならびに遺伝子発現の一過性の性質によって限定される。ベクターに対する特異的な免疫学的応答がさらなる処置を妨害する前に、最小限の投与回数で本質的にすべてのガン細胞を死滅させ得るベクター構築物が必要とされる。完全に別個の研究の分野は、組織特異的な調節タンパク質の記載に関する。α -フェトタンパク質（AFP）は腫瘍胎児性のタンパク質であり、その発現は主に内胚葉起源の発達組織（卵黄嚢、胎児肝、および腸）に限定されるが、その発現のレベルは、組織および発達段階に依存して大きく変化する。AFPの血清濃度が肝ガン患者の大多数において上昇しており、進行した疾患を有する患者においては高レベルのAFPが見出されるので、AFPは臨床的に興味がもたれる。患者における血清AFPレベルは、周りを取り囲む正常肝ではなく、肝細胞ガンにおけるAFP発現によって調節されているようである。従って、AFP遺伝子は、肝ガン細胞特異的発現に調節されているようである。ヒトAFP遺伝子の5'上流隣接配列は、細胞特異的エンハンサー活性を与えることが示された。Watanabeら、（1987）J．Biol．Chem．262:4812-4818；また、Sa kaiら、（1985）J．Biol．Chem．260:5055-5060（ヒトAFP遺伝子のクローニングを記載）を参照のこと。カナダ国特許出願番号第2,134,994号。エンハンサーは、遺伝子発現の細胞特異性の決定に主要な役割を演じることが知られるシス作動転写調節エレメントである。エンハンサーはまた、代表的には、長い距離にわたり、かつそれぞれの遺伝子に関して配向および位置とは比較的独立して転写を増大させる能力によって特徴付けられる。プロモーターは、転写開始部位の5'（上流）すぐ隣に位置し、そして一般的にはTATAボックスと呼ばれるATリッチ領域を含む。肝ガンを処置するために、細胞特異的AFPエンハンサーを使用する遺伝子治療のためのいくつかのアプローチが記載されている。TamaokiおよびNakabayashiは、AFP転写調節領域を使用して、AFP産生細胞における発現を駆動すること、特に、ガン細胞毒素をコードする遺伝子をAFP転写調節領域と連結することを記載する。カナダ国特許出願番号第2,134,994号。しかし、この刊行物の全体の焦点は、ジフテリア毒素（DT）をコードする遺伝子のような、異種毒素遺伝子の発現であり、そしてアデノウイルスはこの毒素遺伝子のための送達ビヒクルの手段として記載されているのみであった。KanekoらおよびKanaiらは、肝細胞ガン細胞にH SV-tk遺伝子発現を制限するためにAFPの5'上流領域を使用し、続いてヌクレオシドアナログGCVによる処置による、アデノウイルスを介する肝ガンの遺伝子治療を記載する。Cancer Res.55:5283-5287(1995)；Hepatology 22(4 part 2):Abstr act 158A(1995)；Hepatology 23:1359-1368(1996)；Hepatology 22:Abstract 32 8(1995)。しかし、これらのアデノウイルス構築物は、複製欠損であり、そしてこれらの刊行物の全体の焦点は非アデノウイルス遺伝子の発現を制御するための AFPの5'上流転写制御領域の使用である。Willsら（1995）はまた、HSV-tkを選択的に発現する、複製欠損アデノウイルスベクターを記載する。Cancer Gene Ther ．2:191-197。Kanaiら（1996）はまた、AFPエンハンサー-プロモーターを使用して、HSV-tk遺伝子に加えて、lacZ遺伝子およびE．coliシトシンデアミナーゼ（C D）の発現を駆動することを報告した。Gastroenterology（補遺）110:A1227。再度、焦点およびアプローチは、治療遺伝子送達ビヒクルとして複製欠損アデノウイルスを使用することに限られており、それ自体が選択的増殖阻害をもたらす因子としてではない。Arbuthnotら、（1996）(ラットAFP遺伝子からの5'隣接配列の使用を記載している)Human Gene Ther．7:1503-1514も参照のこと。肝細胞ガンは、標準的な治療法では滅多に治癒できない。したがって、この疾患に対する新規の治療アプローチを開発することは重要である。本発明は、AFP 産生細胞における複製に特異的なアデノウイルスベクターを提供することによってこの必要性に取り組む。本明細書中で引用される全ての刊行物はこの結果、それら全体が参考として援用される。発明の要旨とりわけ、AFPを発現する細胞に特異的な複製能を有するアデノウイルスベクターおよびそれらの使用についての方法が提供される。好ましい実施態様において、これらの複製能を有するアデノウイルスベクターは、１つ以上のアデノウイルスの増殖に必須の初期および／または後期遺伝子を、AFP転写制御配列エレメント(TRE)の複製制御下に含む。AFP-TRE細胞特異的プロモーターの制御下のトランスジーンもまた存在し得る。本発明はまた、アデノウイルス死タンパク質(ADP )ポリペプチドに関するコード配列を含む天然に存在しないアデノウイルスベクターを提供する。これは、細胞特異的転写制御下にあってもよく、またはなくてもよい。したがって、１つの局面において、本発明は、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須のアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供し、ここで、上記アデノウイルス遺伝子は、α−フェトプロテイン転写応答エレメント(AFP-TRE)の転写制御下にある。１つの実施態様において、AFP-TREはヒト性である。１つの実施態様において、AFP-TREはAFP特異的プロモーターおよびエンハンサー（すなわち、AFP遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー）を含む。いくつかの実施態様において、複製に必須のアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。別の実施態様において、初期遺伝子はE1Aである。別の実施態様において、初期遺伝子はE1Bである。さらに別の実施態様において、E1AおよびE1Bの両方はAFP-TREの転写制御下にある。さらに別の実施態様において、E1A、E1B、およびE4は、AFP-TREの制御下にある。他の実施態様において、複製に必須のアデノウイルス遺伝子は後期遺伝子である。別の実施態様において、AFP-TREはエンハンサーエレメントＡを含む。別の実施態様において、AFP-TREはエンハンサーエレメントＢを含む。別の実施態様において、AFP-TREはエンハンサーエレメントＡおよびＢを含む。別の実施態様において、AFP-TREは配列番号１のヌクレオチド配列、または機能的に保存されたその改変体を含む。別の実施態様において、AFP-TREは配列番号１の約+1から約+600のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、AFP- TREは配列番号１の約+600から約+827のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、AFP-TREは配列番号１の約+1から約+300のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、AFP-TREは配列番号２のヌクレオチド配列、または機能的に保存されたその改変体を含む。別の実施態様において、アデノウイルスベクターはさらにトランスジーンを含み得、ここで、上記トランスジーンは、AFP-TREの転写制御下にある。いくつかの実施態様において、トランスジーンは細胞傷害性遺伝子である。他の実施態様において、アデノウイルスベクターはAFP-TREの転写制御下に、さらに別のアデノウイルス遺伝子（例えば、複製に必要なアデノウイルス遺伝子）を含み得る。他の実施態様において、なおさらなる別のアデノウイルス遺伝子が第３のAFP-TREの転写制御下にあり得る。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを含む宿主細胞を提供する。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクター、特に本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターの効果的な量を含む組成物を提供する。本明細書中に記載されるこの組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含み得る。ある実施態様において、本発明は、マスクされたアデノウイルスを産生するために、親水性ポリマー（「マスキング剤」）と複合体化したアデノウイルスベクターを提供する。親水性ポリマーは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質、特にヘキソンおよび線維タンパク質に（共有結合的、または非共有結合的）に結合する。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、マスクされたアデノウイルスベクターを産生するために、マスキング剤と複合体化される。さらに好ましい実施態様において、マスキング剤は、本発明のアデノウイルスベクターと共有結合したポリエチレングリコール(PEG)である。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。本発明の別の実施態様は、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞（特に、AFP を発現する、またはAFPを発現可能な哺乳動物細胞）中で優先的に複製するアデノウイルスである。別の局面において、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞（例えば、AFPを発現する細胞（特に、哺乳動物細胞））に特異的なアデノウイルスを増殖するための方法が提供され、上記方法は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞と合わせる工程であって、それによって、上記アデノウイルスは増殖する、工程を包含する。別の局面において、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞（例えば、AFPを発現する細胞）において、選択的細胞傷害性を与えるための方法が提供され、これは、AFPを発現する細胞を、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程であって、ここで、アデノウイルスベクターが細胞に侵入する、工程を包含する。別の局面において、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞を検出するための方法が提供され、これは、生物学的サンプルの細胞を、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程、および、もしあればAFP-TREが媒介する発現を検出する工程を包含する。別の局面において、生物学的サンプル中でα−フェトプロテインを発現する細胞を検出する方法が提供され、これは以下を包含する：生物学的サンプルの細胞を、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程、および、もしあればアデノウイルスベクターの複製を検出する工程。別の局面において、処置の方法が提供され、ここで、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターは、個体に投与される。別の局面において、本発明は、アデノウイルス死タンパク質(ADP)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、天然に存在しないアデノウイルスベクターを提供する。いくつかの実施態様において、ADPをコードする配列は、細胞特異的TRE（例えば、AFP-TREまたは前立腺細胞特異的TRE）の転写制御下にある。図面の簡単な説明図１は、ヒトAFPエンハンサーおよびプロモーター領域の模式的地図である（一定の縮尺ではない）。図1Aは、プロモーター／エンハンサー領域の特徴のいくつかを示し、これは以下を含む：エンハンサードメインＡおよびＢ；遠位サイレンサー（Sd）；近位サイレンサー（Sp）；およびグルココルチコイド応答エレメント（GRE）。数字は転写開始部位に関連したヌクレオチドの位置を示す（屈曲した矢印によって示す）。図1Bは、AFP-TREの構築（実施例１に記載する）に使用した２つの5'AFP領域を示す模式図である。図2（A）および（B）は、AFP-TREについてのレポーターアッセイ実験を要約する。図２（Ａ）はCN236である、ルシフェラーゼレポータープラスミド構築物の模式図であり、これはAFP-TREの転写活性を評価するために使用された。図２（Ｂ）は、800bp AFP-TREについてのルシフェラーゼレポーターアッセイを示す棒グラフである。800bpのフラグメントは、AFPを産生するHep3B細胞において、ルシフェラーゼの発現を駆動するその能力について試験された。pGL2-Lucは、ルシフェラーゼ遺伝子がAFP-TRE配列に連結されていない、ネガティブコントロールである。図３は、実施例１に記載される、種々のアデノウイルスベクター構築物を示す模式図である。図４は、E1AおよびE1BがAFP-TREの制御下にあり、E1AおよびE1Bは反対に配向しているアデノウイルスベクターの模式図である。図5AおよびBは、Adへの挿入のためのアデノウイルス死タンパク質（ADP）カセットの模式図である。図5Aの下方の矢印はプライマーの位置を示す。図5Bは、Y リーダー配列およびADPコード配列を含むアニール型フラグメントを示す。図６（A）、（B）および（Ｃ）は、CN733（２つのAFP-TREを含む）およびCN70 2（コントロール）感染細胞におけるE1Aレベルのウエスタン分析を示すハーフトーン模写である。図6(A)において、E1A発現Huh-7（AFP+）細胞におけるE1A発現を示し；図６ＢはDld-1（AFP-）細胞におけるE1A発現を示す。図6(C)において、 Sk-Hep-1は使用したAFP細胞であった。図７（Ａ）〜（Ｃ）は、AFP産生細胞（Huh-7;図7(A)）および非AFP産生細胞（ Sk-Hep-1、図7(B)；Dld-1、図7(C)）におけるCN733の増殖を示すグラフである。図８（Ａ）〜（Ｃ）は、コントロールCN702（黒四角）と比較した、HepG2細胞におけるCN732（図8(A)；黒菱形）、CN733（図8(B)；黒菱形）およびCN734（図8 (C)；黒菱形）の増殖を示すグラフである。図９（Ａ）〜（Ｃ）は、コントロールCN702（黒菱形）と比較した、初代肝細胞におけるCN732（図９(A)；黒四角）、CN733（図９(B)；黒丸）およびCN734（図９(C)；黒丸）の増殖を示すグラフである。図10（A）〜（B）は、肝細胞ガン細胞株HepG2を保有するマウスの腫瘍容量と、CN733（図9(A)；四角）で、またはコントロール緩衝液（丸）で処置した腫瘍容量を比較したグラフである。図10(A)は、43日間（６週間）の期間にわたる腫瘍容量の測定を示す。図10(B)において、CN733（「Ｂ」）の腫瘍内単回投与を、 CN733（「Ｊ」）の５日間連続の毎日の投与量と比較した。図11は、CN733（三角）を受けた、または緩衝液（丸）を受けた腫瘍保有マウスにおける血清AFPレベルを示すグラフである。図12は、コントロールCN702（黒丸）、Rec 700（黒三角）、および偽感染（X s）と比較した、アデノウイルス死タンパク質（ADP）、CN751（黒四角）についてのコード配列を含むアデノウイルスベクターの細胞障害性を示すグラフである。図13は、CN751（黒四角）およびCN702（黒丸）の細胞外ウイルス産生を比較するグラフである。図14は、CN751（「H」）、CN702（「J」）、または緩衝液（「B」）でチャレンジした、LNCaP腫瘍異種移植片を有するマウスにおける腫瘍容量を比較するグラフである。図15は、アデノウイルスの共有結合によるPEG化（pegylation）のための方法の模式図である。この方法において、スクシンイミジルスクシンアミドはアデノウイルスに対してメトキシ-PEGを共有結合するために使用される。PEG化されたアデノウイルスは、イオン交換クロマトグラフィーによって反応成分から分離される。図16は、PEG化されたアデノウイルスタンパク質の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（移動シフト）のハーフトーン模写を示す。レーン１および２はPEG化されていないCN706（コントロール）であり、レーン３〜６は、種々のpHおよび温度条件下でPEG化されたCN706である（レーン３、pH7.6、室温（RT）；レーン４、pH7.6、４℃；レーン5、pH8.2、RT ；レーン６、pH8.2、４℃）。図17は、コントロールアデノウイルスCN706と混合された、PEG化アデノウイルス（PEG-706）のイオン交換クロマトグラフィー分析のクロマトグラムである。発明を実施するための様式本発明者らは、α-フェトプロテイン（AFP）を発現する細胞において優先的に複製し得る複製コンピテントアデノウイルスベクターを発見および構築し、そしてこれらのアデノウイルスベクターを使用する方法を開発した。本発明のアデノウイルスベクターは、転写因子、および／またはAFP遺伝子（AFP-TRE）の転写に必須な補因子の結合によって特異的に制御される転写応答エレメント（TRE）の転写制御下にある、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子、好ましくは細胞障害性に寄与するアデノウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス複製に必須であるアデノウイルス遺伝子、好ましくは、少なくとも１つの初期遺伝子を含む。複製に必要とされる少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子の細胞特異的な転写を提供することにより、本発明は、選択的複製に起因する特異的な細胞障害性効果のために使用され得るアデノウイルスベクターを提供する。このことは、標的化された細胞の殺傷が所望されるガンの状況において、特に有用である。ベクターはまた、例えば、適切な生物学的（例えば、臨床用）サンプル中のAFP産生細胞の存在を検出するために有用であり得る。さらに、アデノウイルスは、AFP-TR Eを使用することによって、標的細胞中で、１つ以上の目的のタンパク質を必要に応じて選択的に産生し得る。本発明者らは、本発明のアデノウイルスベクターが、AFP産生細胞中で優先的に（すなわち、非AFP産生細胞におけるよりも有意により高い収率で）複製することを見い出した。この複製の優先性は、AFPを産生する細胞での複製のレベル（すなわち力価）を、AFPを産生しない細胞での複製のレベルと比較することによって示される。AFPを産生しない細胞において、本発明のアデノウイルスベクターは、野生型ウイルスよりも有意により低い割合で実際には複製するので、複製の優先性はさらにより重要である。ATP+細胞型の力価とAFP-細胞型の力価との比較は、全体の複製の優先性が、野生型アデノウイルスと比較した場合AFP-細胞における複製の低下ならびにAFP+細胞における複製に起因して増強される、という重要な示唆が提供される。この局面は、ガンの状況において非常に有用であり、かつ重要である。というのも、この局面においては、非標的（すなわち、ガン性ではない細胞）に対する細胞傷害性障害を最小化することが望まれるからである。実施例１は、これらの実験および知見のより詳細な記載を提供する。さらに本発明者らは、本発明のアデノウイルスベタターが、ヌードマウスにおけるHepG2異種移植片の増殖を有意に遅らせることを見出した（実施例５）。従って、本発明は、アデノウイルスベクター望まれない局面、すなわち、その複製および共存する可能性のある免疫原性を考慮した利点を使用し、そして用いる。急性感染（runaway infection）の可能性は、細胞特異的な、ウイルス複製の必要条件に起因して有意に減少される。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、アデノウイルスタンパク質の産生は、患者がしばしば中程度〜重篤度に免疫無防備状態である場合に、ガンの状況において重要であると考えられ得るアデノウイルスタンパク質を産生する標的細胞に対して、遺伝的および／または特異的に、免疫系を活性化および/または刺激するように作用し得ることを留意する。本発明者らはまた、この配列を欠損したアデノウイルスベクターと比較した場合、ADPをコードする配列の封入が有意に細胞傷害性、細胞殺傷、およびウイルス産生の程度を増強することを見出した。従って、ADPポリペプチドをコードする配列を含む、天然には存在しないアデノウイルスベクターが、本明細書中に含まれ、そして記載される。ADPコード配列は、AFP-TREのような、細胞特異的TRE の転写制御下（すなわち、選択的転写制御下）に存在してもしなくてもよい。一般技術本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内にある。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Man ual」、第２版（Sanbrookら、1989）；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J．Ga it編、1984);「Animal Cell Culture」(R．I．Freshney編、1987)；「Methods i n Enzymology」(Academic Press，Inc.)；「Handbook of Experimental Immunol ogy」(D．M．Wei & C．C．Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammal ian Cells」(J.M．Miller & M.P．Calos編、1987)；「Current Protocols in Mo lecular Biology」(F.M．Ausubelら編、1987)；「PCR:The Polymerase Chain Re action」(Mullisら編、1994)；「Current Protocols in Immunology」（J.E．Co liganら編、1991）のような文献において十分に説明される。アデノウイルスに関連した技術については、特に、FelgnerおよびRingold（19 89）Nature 337:387-388；BerknerおよびSharp（1983）Nucl．Acids Res．11:60 03-6020;Graham（1984）EMBO J．3:2917-2922;Bettら(1993)J．Virology 67:591 1-5921;Bettら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:8802-8806を参照のこと。定義「α−フェトプロテイン転写性応答エレメント」すなわち「AFP-TRE」は、AFP を発現する宿主細胞のような、AFP-TREが機能することを許容する宿主細胞において、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加させる、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。公開された報告によると、AFP-TRE は、APP産生細胞に関連した細胞性タンパク質（転写因子および／または転写補因子）（例えば、AFP結合タンパク質（例えば、米国特許第5,302,698号を参照のこと））に応答性であり、そして少なくともAFPプロモーターおよび／またはAFP エンハンサーの一部を含む。本明細書中でAFP-TRE活性の測定のための方法が記載され、従って、所定の細胞がAFP-TREが機能することを許容するか否かの決定のための方法が記載される。本明細書中により詳細に記載されるように、AFP-TREは、AFPプロモーター；AF Pエンハンサー；AFPプロモーターおよびAFPエンハンサー；AFPプロモーターおよび異種エンハンサー；異種プロモーターおよびAFPエンハンサー；ならびに上記の多量体を含むがこれらに限定されない、任意の数の立体配置を含み得る。AFP- TREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、所望されるAFP細胞特異的転写活性が得られる限り、目的のコード配列から任意の方向および/または距離にあり得る。転写活性化は、当該分野で公知の（および以下により詳細に記載する）多数の様式で測定され得るが、一般には、mRNA、またはAFP-TREの制御下の（すなわち、作動可能に連結された）コード配列のタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。本明細書中に記載される場合、AFP-TREは多様な長さであり得、そして多様な配列組成であり得る。「転写活性化」または「転写の増加」によって、転写は、上記の基底レベルよりも、標的細胞（すなわち、AFP 産生細胞）中で、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200 倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍増加することが意図される。一般的には、基底レベルは（もしあれば）非AFP産生細胞における活性レベルであるか、またはAFP産生細胞において試験した場合、（もしあれば）AFP-TREを欠損するレポーター構築物の活性レベルである。必要に応じて、転写ターミネーターまたは転写「サイレンサー」はAFP-TREの上流に配置され得、従って、PB-TREの転写制御下のコードセグメントの所望でないリードスルー（read-through）転写を防止する。また、必要に応じて、PB-TREの転写制御下に配置されるコードセグメントの内因性プロモーターは、欠失され得る。 AFP-TREの「機能的に保存された」改変体は、別のAFP-TREとは異なるが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写、特にAFP細胞特異的転写活性を増加する能力を依然として保持するAFP-TREである。AFP-TREにおける差異は、例えば、一重または多重塩基変異、塩基の付加、欠失および/または改変から生じる線状配列における差異に起因し得る。差異はまた、糖、および/またはAFP-TREの塩基間の連結における変化から生じ得る。「細胞特異的TRE」は、他の型の細胞の異なる機能と比較して、特異的な型の細胞における優先的な機能である。細胞特異的TREは、腫瘍細胞特異的であってもなくてもよい。本明細書中に使用されるように、用語「標的細胞特異的」とは、アデノウイルスベクターの複製に必須である遺伝子に作動可能に連結されているTRE配列、またはトランスジーンに作動可能に連結されたTRE配列が、標的細胞特異的に機能することを意味し、その結果、標的細胞中で複製が起こる、またはトランスジーンポリヌクレオチドが標的細胞中で発現されることを意味することが意図される。このことは、標的細胞において、作動可能に連結された転写制御配列によって駆動される転写を活性化する転写因子の、その存在の長所に起因して生じ得、そして非標的細胞中においては生じ得ない。このことは、通常は非標的細胞中では生じ、そして作動可能に連結された転写制御配列によって駆動される転写を阻止する、転写阻害因子が存在しないことの長所によってもまた生じ得る。本明細書中で使用される場合、用語「標的細胞特異的」とは、細胞型特異性、組織特異性、ならびに所定の標的細胞のガン性状態に対する特異性を包含することが意図される。後者の場合、正常細胞のガン性状態に対する特異性は、正常、非ガン性対応物に照らし合わされる。「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」（交換可能に使用される）は、当該分野でよく理解されている用語であり、そして一般的に、アデノウイルスゲノムのすべてまたは一部を含むポリヌクレオチドを含む。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたAFP-TREを含む。この作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、アデノウイルス遺伝子または異種遺伝子であり得る。本発明のアデノウイルスベクター構築物は、いくつかの形態のいずれかであり得る。この形態には、裸のDN A、アデノウイルスコート中にカプセル化されたDNA、別のウイルス形態もしくはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスウイルスおよびAAV）にパッケージングされたDNA、リポソームにカプセル化されたDNA、ポリリジンと複合体形成したDN A、合成ポリカチオン分子と複合体形成したDNA、トランスフェリンと結合したDN A、ならびに免疫学的に分子を「マスク」するため、および／もしくは半減期を増加させるためにPEGのような化合物で複合体形成したDNA、ならびに非ウイルスタンパク質と結合したDNAが含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書で使用するように、「DNA」は、塩基A、T 、C、およびGを含むだけではなく、任意のそれらのアナログ、またはメチル化されたヌクレオチドのような、これらの塩基の修飾された形態、非荷電連結およびチオエートのようなヌクレオチド間の修飾、糖アナログの使用、ならびに修飾された骨格構造、および／またはポリアミドのような、別の骨格構造もまた含む。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは標的細胞内において複製コンピテントである。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で交換可能に使用するように、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌタレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドをいう。これらの用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは三本鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（代表的にはRNAまたはDNAにおいて見い出され得るように）、あるいは修飾または置換された糖またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（P-NH₂ ）または混合型ホスホルアミデート-ホスホジエステルオリゴマーであり得る。 Peyrottesら（1996）Nucleic Acids Res．24:1841-8；Chaturvediら（1996）Nuc leic Acids Res．24:2318-23；Schultzら（1996）Nucleic Acids Res．24:2966- 73。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用され得る。Braunら（1988）J．Immunol.141:2084-9；Latimerら（1995）Mol.Immunol．32 :1057-1064。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖の合成および適切な条件下でのこの鎖のアニーリングによって、または適切なプライマーとともにDNAポリメラーゼを使用する新規な相補鎖の合成のいずれかによって、得られ得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログ、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエートのような他の糖および結合基、ならびに修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分との結合によって、さらに修飾され得る。この定義に含まれる他のタイプの修飾は、キャップ、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログによる置換、およびタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体にポリヌクレオチドを結合させる手段の導入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書中で使用される場合、「DNA」にはA、T、GおよびＣだけではなく、任意のこれらのアナログ、またはこれらの塩基の改変された形態（例えば、メチル化ヌクレオチド、非電荷性連結のようなヌクレオチド内改変、ならびにチオエート、糖アナログの使用、ならびに改変および／またはポリアミドのような代替骨格構造がまた含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、特定の百分率（例えば、80 %、85%、90%、または95%）の「配列同一性」を、別の配列に対して有する。このことは、整列させた場合、この百分率の塩基が２つの配列の比較において同一であることを意味する。この整列および相同性%、または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular B iology（Ausubelら、編、1987）補遺30、7.7.18節、表7.7.1に記載されるプログラムを使用して決定され得る。好ましい整列プログラムは、ALIGN Plus（Scient ific and Educational Software，Pennsylvania）である。「転写制御下にある」は、当該分野でよく理解されている用語であり、そしてポリヌクレオチド配列、通常DNA配列の転写が、その配列が転写の開始または促進に寄与するエレメントに対して作動可能に（作動的に）連結していることに依存することを示す。以下に述べるように、「作動可能に連結された」とは、エレメントが機能することを許容する配列にある、並列状態をいう。用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中において交換可能に、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために使用される。ポリマーとは、直鎖状または分岐状であり得、これは改変型アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得、そして１つより多いポリペプチド鎖の複合体に集合化され得る。この用語はまた、天然において、または干渉によって改変されているアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化（lipidation）、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作または改変（例えば、標識成分との連結）を含む。例えば、定義内には、１つ以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然のアミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、ならびに当該分野において公知である他の改変もまた含まれる。ポリペプチドの文脈においては、「線状配列」または「配列」とは、Ｎ末端からＣ末端方向へのポリペプチドのアミノ酸の順序であり、この中では配列中でお互い隣接した残基は、ポリペプチドの一次構造において連続的である。「部分配列」とは、一方向または両方向のさらなる残基を含むことが公知であるポリペプチドの線状配列の部分である。 ADP（または「ADPフラグメント」もしくは「ADP領域」）ポリペプチド「フラグメント」（「領域」とも呼ばれる）は、ADPの配列の少なくとも５個の連続的なアミノ酸、より好ましくは少なくとも10個の連続的なアミノ酸、より好ましくは少なくとも約15個の連続的なアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約25 個の連続的なアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約30個の連続的なアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約40個の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ADPフラグメントは、ADPに付与された任意の機能を有するとして特徴づけられ得、これは本明細書中に記載されるADPを含む。「複製」および「増殖」は交換可能に使用され、そして本発明のアデノウイルスベクターが複製、すなわち増殖する能力を言う。この用語は、当該分野においてよく理解されている。本発明の目的のために、複製は、アデノウイルスタンパク質の産生を含み、および一般的にアデノウイルスの繁殖に関する。複製は、バーストアッセイ、プラークアッセイ、もしくはワンステップ増殖曲線アッセイのような当該分野における、および本明細書に記載される標準アッセイを使用して測定され得る。「複製」および「増殖」は、ウイルス製造のプロセス、直接的または間接的に関与する任意の活性（ウイルス遺伝子発現；ウイルスタンパク質、核酸もしくは他の成分の産生；完全なウイルスへのウイルス成分のパッケージング；および細胞溶解を含むがそれには限定されない）を含む。本明細書で使用される「細胞傷害性」は、当該分野でよく理解されている用語であり、そして１つ以上の細胞の通常の生化学的または生物学的機能が異常に傷付けられる（すなわち、阻害されるかまたは上昇する）状態をいう。これらの活性は、代謝；細胞複製；DNA複製；転写；翻訳；および分子の取り込みを含むがこれらに限定されない。「細胞傷害性」は、細胞死および／または細胞溶解を含む。細胞傷害性を示すアッセイは当該分野で公知であり、例えば、色素排除、³H チミジン取り込み、およびプラークアッセイを含む。本明細書で使用される用語「選択的細胞傷害性」は、AFP-TREが機能するのを可能にしない細胞にアデノウイルスによって与えられる細胞傷害性と比較した場合に、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞に本発明のアデノウイルスベクターによって与えられる細胞傷害性をいう。このような細胞傷害性は、例えば、プラークアッセイ、標的細胞を含む腫瘍のサイズの低下もしくは安定化、あるいは腫瘍細胞に特徴的なマーカーまたは組織特異的なマーカー、例えばAFPもしくは前立腺特異的抗原のような、ガンマーカーの血清レベルの低下または安定化によって測定され得る。「異種遺伝子」または「トランスジーン］は、野生型アデノウイルスに存在しない任意の遺伝子である。好ましくは、トランスジーンはまた、アデノウイルスベクターによる導入前に標的細胞で発現されないか、または存在しない。好ましいトランスジーンの例を、以下に提供する。「異種」プロモーターまたはエンハンサーは、AFP遺伝子5'隣接配列に結合していないか、またはそれに由来しないものである。異種プロモーターまたはエンハンサーの例は、アルブミンプロモーターまたはエンハンサー、ならびにSV40のような、他のウイルスプロモーターおよびエンハンサーである。「内在性」プロモーター、エンハンサー、またはTREは、アデノウイルスにネイティブか、またはアデノウイルス由来である。用語「作動可能に連結される」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの方向に関する。TREは、TREがコード配列の転写を促進する場合に、コードセグメントに作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結された DNA配列が、一般的に隣接し、およびそこでは２つのタンパク質コード領域が隣接し、そして同じリーディングフレームに結合される必要があることを意味する。しかし、エンハンサーは一般的に、プロモーターから数kb離れている場合に機能し、そして介在配列は様々な長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは隣接することなく、作動可能に連結され得る。「宿主細胞」は、本発明のアデノウイルスベクターの受容者であり得るか、受容者である、個々の細胞もしくは細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、自然の、偶発の、または故意の変異および／または変化によって、もともとの親の細胞と、必ずしも完全に同一（形態学的にまたは全DNA相補性において）である必要性はない。宿主細胞は、インビボまたはインビトロにおいて、本発明のアデノウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。「標的細胞」は、ARF-TREが機能することを可能にする任意の細胞である。好ましくは、標的細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、哺乳動物AFP-発現細胞であり、より好ましくはAFPを発現するヒト細胞である。本明細書で使用される「新生物性細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「ガン」、および「ガン細胞」（交換可能に使用される）は、比較的自律的な増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の顕著な喪失により特徴付けられる異常な増殖表現型を示す細胞をいう。新生物性細胞は、良性または悪性であり得る。本明細書で使用される「AFP-TREが機能するのを可能にする細胞」AFP-TREの機能が「十分に保存された」細胞、「AFP-TREが機能的である細胞」などは、AFP-T REが、例えば、レポーター遺伝子に作動可能に連結される場合、AFP-TREに連結していない同じレポーター遺伝子の発現と比較した場合、レポーター遺伝子の発現が、少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、さらにより好ましくは少なくとも約４００〜５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０００倍増加する細胞である。発現のレベル（相対的であれ絶対的であれ）を測定する方法は、当該分野で知られており、および本明細書に記載されている。「天然に存在しない」もしくは「組換え」アデノウイルスベクターは、交換可能に使用され、および天然に存在しないかまたは天然では見られない配置にあるかのいずれかであるポリヌクレオチドエレメント（もしくは成分）を含むアデノウイルスベクターを意味する。本明細書に述べたように、ADPコード配列を含むアデノウイルスベクターの文脈において、ADP配列を含む操作および／またはADP 配列を含まない操作による、この用語は、天然に存在しないまたは組換えのアデノウイルスベクターを含む。例えば、ADPコード配列を含む、天然に存在しないアデノウイルスベクターは、任意の操作より先にADPコード配列を含み得るが、他の配列エレメントの挿入および／または欠失によって、天然で存在しないようにされている。例えば、このようなアデノウイルスベクターは、さらにADPコード配列を含むアデノウイルスベクター中に初期遺伝子の細胞特異的TRE調節転写を含み得る。別の例として、天然に存在しないアデノウイルスベクターは、このような配列を含まないアデノウイルスベクターにADPコード配列を付加することによって生じ得る（実施例５を参照）。「ADPコード配列」は、ADPもしくはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチドである。ADPの文脈において、ADPの「機能的フラグメント」は、アデノウイルス複製に対して、細胞傷害活性、特に細胞溶解を示すものである。細胞傷害活性を測定する方法は、当該分野に公知であり、および本明細書に記載されている。 ADPポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドは、転写および／または翻訳されてADPポリペプチドまたはそのフラグメントを産生し得るものである。このようなポリヌクレオチドのアンチセンス鎖はまた、この配列をコードするといわれる。「ADPポリペプチド」は、ADPアミノ酸配列（例えば、配列番号２３を参照のこと）の少なくとも一部、すなわち領域を含むポリペプチドであり、ADP関連機能、特に細胞傷害性、より詳細には細胞溶解を示す。本明細書で議論されるように、これらの機能は当該分野で知られる技術を使用して測定され得る。特定の配列改変体は、例えば、ADPポリペプチドを提供し得る保存的アミノ酸置換によって使用され得ることが理解される。配列番号に「示された」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列は、配列が、配列番号中に同一の隣接配列として存在することを意味する。この用語は、配列番号の一部、すなわち領域、ならびに配列番号中の全体配列を含む。「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプルタイプを包含し、そして診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、血液および生物学的起源の他の液体サンプル、生検サンプルのような固形組織サンプル、または組織培養物もしくはそれに由来する細胞、およびその子孫を包含する。この定義はまた、入手後に、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドのような特定の成分の富化のような、任意の方法で操作したサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」は、臨床サンプルを含み、また、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織サンプルを含む。「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定されない。「有効量」は、有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、低速化または遅延するのに十分な量である。本明細書で使用される「処置」は、有益なまたは所望の臨床的な結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床的な結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡散（すなわち、転移）の妨害、疾患の進行の遅延または低速化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測される生存期間と比較して長くなった生存期間をまた意味し得る。疾患を「緩和する」は、本発明のアデノウイルスベクターを投与していない場合と比較して、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床的な症状発現が軽減する、ならびに／または進行の時間経過が遅くなるかもしくは長くなることを意味する。「マスクされたアデノウイルス」は、親水性ポリマー（「マスキング剤」）と複合体形成したアデノウイルスである。アデノウイルスは、天然に存在するアデノウイルスの単離物、または本出願に開示されるベクターのような、操作したアデノウイルスベクターを含む任意のアデノウイルスであり得る。マスキング剤は、好ましくは低免疫原性のものである。受容可能な親水性ポリマーの例としては：ポリエチレン／ポリプロピレンコポリマー、ポリアクリル酸アナログ、セルロースのような糖ポリマー、ポリホルムアルデヒド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリエチレングリコール（PEG）などが挙げられる。親水性ポリマーは、ウイルスのキャプシドタンパク質、特にヘキソンおよびファイバーキャプシドタンパク質と共有結合または非共有結合により複合体形成し得る。好ましい親水性ポリマーは、PEGであり、および好ましいマスクしたアデノウイルスは、アデノウイルスに共有的に結合したPEGである（「共有的にPEG化されたアデノウイルス」）。 AFP産生細胞に複製特異性を有するアデノウイルスベクター本発明は、AFP−TREの転写制御下でアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクター構築物を提供する。好ましくはアデノウイルス遺伝子は、細胞傷害性（直接的および／または間接的のいずれにせよ）に寄与するものであり、より好ましくは、細胞死に寄与するか、または細胞死を引き起こすものであり、そしてさらにより好ましくは、アデノウイルス複製に必須である。細胞傷害性に寄与する遺伝子の例は、アデノウイルス死タンパク質（ADP；以下に述べる）を含むが、これに限定されない。アデノウイルスベクターが、AFPを発現する標的細胞において、増殖のために選択的に（すなわち、優先的に）複製コンピテントである場合、これらの細胞は、アデノウイルス増殖において優先的に殺傷される。例えば、インビトロまたはインビボで、アデノウイルスベクターと悪性肝細胞および正常肝細胞の混合物を組み合わせることによって、アデノウイルスベクターは標的悪性肝細胞において優先的に複製する。一旦標的細胞が選択的細胞傷害性および／または細胞溶解性複製によって破壊されると、アデノウイルスベクター複製は顕著に減少し、従って、ランナウェイ（runaway）感染および所望でない傍（b ystander）効果の可能性は減少する。インビトロ培養は、標的細胞（例えば、AF P産生新生物性細胞）の発生（すなわち、存在）および／または再発について混合物（例えば、生検または他の適切な生物学的サンプル）をモニターするために保持され得る。細胞傷害性をさらに保証するために、細胞傷害性効果を有する１つ以上のトランスジーンがまた存在し得、そして選択的転写制御下にあり得る。この実施態様において、標的細胞が破壊されるという、より高度な確信を与え得る。さらに、またはその代わりに、細胞傷害性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子（例えばADP）は、選択的転写制御なし、または選択的転写制御下のいずれかで、アデノウイルスベクターに含まれ得る。本発明に使用されるAFP-TREは、ヒト、ラット、およびマウスを含むがそれらに限定されない哺乳動物細胞由来である。齧歯類およびヒトAFP5'隣接配列は、文献中に記載されており、従って本発明の実施のために利用可能にされており、本明細書に詳細に記載される必要はない。ラットAFP5'隣接配列は記載され、そして特徴付けられている。Wenら、(1991)DNA Cell Biol.10:525-536;Wenら、(19 93)Nucl.Acids Res.21:1911-1918。ラットAFP5'隣接領域は、複合体１（-2800〜 -2400）、複合体２（-4500〜-3500）、および複合体３（-7000〜-4900）と示した３つの上流のエンハンサーを含む。プロモーター領域は、-250〜-1を含み；-1 78〜-155のプロモーターエレメントは、エンハンサーが遠い場合に必要とされるが、エンハンサーが、より近い場合はなくても済む。Wenら、(1991および1993) 。Grouppら(1994)は、最も遠いエンハンサーエレメントである複合体３（344bp HincIIフラグメント上）の活性を報告する。J.Biol.Chem.269:22178-22187。Arb uthnotら(1996)は、ヒトの肝細胞ガン株HuH7、Hep3P、およびHepG2における最も近位のエンハンサーおよびプロモーター（およびマウスサイレンサー配列に相同な領域）を含む-3127〜+102の配列の活性を示した。マウス5'隣接AFP配列は、記載および特徴付けられている。Ghebraniousら、(1 995)Mol.Reprod.Devel.42:1-6.ラットと同様に、マウス5'隣接AFP配列は、３つの別々のエンハンサーエレメントを含む。サイレンサー、すなわち成体肝臓における遮断に関連するエレメントは、-838と-250との間で見られる。Emersonら、( 1992)Devel.Dynam.195:55-66。好ましくは、AFP-TREは、ヒトのものである。AFP特異的エンハンサー活性のクローニングおよび特徴付けは、Watanabeら(1987)に記載されている。5'AFP隣接領域全体（プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーエレメントを含む）は、転写開始部位からおよそ５kb上流の中に含まれる。ヒトのAFPエンハンサー領域は、AFP遺伝子の転写開始（CAP）部位に対して、約-3954と約-3335との間に位置する。ヒトAFPプロモーターは、約-174〜約+29の領域を含む。Idoら( 1995)は、HCCに特異的な259bpのプロモーターフラグメント（-230〜+29）を記述している。Cancer Res.55:3105-3109。AFPエンハンサーは、発現開始部位に対して-3954と-3335との間に位置する、AおよびBと記載した２つの領域を含む。プロモーター領域は、典型的なTATAボックスおよびCAATボックスを含む。好ましくは、AFP-TREは、少なくとも１つのエンハンサー領域を含む。さらに好ましくは、A FR-TREは、両方のエンハンサー領域を含む。 Kanekoら(1995)は、4.9kb HindIII〜HindIIIフラグメントを使用した。Kanai ら(1995および1996)は、0.2kb(BglII〜HindIII)プロモーターセグメント、ならびにエンハンサーAおよびB(-4.0〜-3.3kb;ApaI〜BglII)を含むセグメントを含む、より短いフラグメントにおける活性を示した。１つの実施態様において、AFP-TREは、およそ0.6kbのエンハンサー領域（-395 4〜-3335）および0.2kbのプロモーター領域（-174〜+29）を含み、その両方は、図１Bに示したようにAFP産生細胞に特異的である。これらの２つの遺伝エレメントが並列されることにより、十分に機能的AFP-TRE（実施例１）が得られる。従って、本発明はまた、AFP-TREが配列番号１（すなわち、配列番号１の配列）を含むアデノウイルスベクターを含む。別の実施態様において、AFP-TREは、配列番号１の約+1〜約+600の配列を含む。従って、この実施態様は、エンハンサー領域AおよびBを含む。別の実施態様において、AFP-TREは、配列番号１の約+600〜約+827の配列を含み、従ってAFPプロモーターを含む。そのエンハンサー領域は、さらに細分化され得る（領域AおよびB）；従って、さらなる実施態様は、以下を含む：(a)配列番号１の約+1〜約+3 00のヌクレオチド配列を含むAFP-TRE；(b)配列番号１の約+300〜約+600のヌクレオチド配列を含むAFP-TRE。別の実施態様において、AFP-TREは、5.1kbの5'隣接配列全体（配列番号２）を含む。 AFP-TREはまた、多量体を含み得る。例えば、AFP-TREは、タンデムな一連の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つの AFPプロモーターフラグメントを含み得る。あるいは、AFP-TREは、１つ以上のAF Pエンハンサー領域とともに１つ以上のAFPプロモーター領域を有し得る。これらの多量体はまた、異種プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る。 AFP-TREは、サイレンサーを欠いていても欠かなくともよい。サイレンサー（すなわち負の調節エレメント）の存在は、非許容的（すなわち非AFP産生）な細胞において転写（従って複製）を遮断することを補助し得る。従って、サイレンサーの存在は、非標的細胞において、より効果的にアデノウイルスベクター複製を防ぐことによって増強した細胞特異的複製を与え得る。あるいは、サイレンサーの欠乏は、標的細胞におけるより効果的な複製に起因して、複製をもたらすこと、従って増強した細胞特異的複製を与えることを補助し得る。AFP遺伝子の5 '隣接領域は、-1822〜-951(遠位のエレメント)および-402〜-169(近位のエレメント)の２つのサイレンサーエレメントを含むことが示されている。Nakabayashi ら、(1991)Mol.Cell.Biol.11:5885-5893。Kanaiら(1995)は、サイレンサーを欠乏したフラグメントの活性が、およそ5.0kbのネイティブな5'隣接領域について報告された活性より高いことを報告している。当業者によって容易に理解されるように、AFP-TREは、ポリヌクレオチド配列であり、および、それ自体、様々な配列置換を超える機能を示し得る。ヌクレオチド置換、付加、および欠損の方法は、当該分野で公知であり、および容易に入手可能である機能性アッセイ（例えば、CATもしくはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）は、配列改変体が必須の細胞特異的転写機能を示すか否かを当業者が決定することを可能にする。それ故、本発明はまた、核酸の置換、付加、および／または欠損を含む本明細書に開示した核酸配列の機能的に保存された改変体を含む。単一の理論に結び付けられることを望まないが、本発明者らは、特定の修飾は、発現レベルの増強を含む結果として起こる発現レベルの調節となり得ると記載している。結果として起こる発現レベルの調節、好ましくは、発現レベルの増強の達成が、特に特定のより攻撃的な形態の肝細胞ガンの場合、または迅速および／もしくは攻撃的なパターンのより細胞死が（例えば、固体の免疫無防備状態により）保証される場合において所望され得る。 AFP-TRE活性がどのように決定され得るかの例として、ポリヌクレオチド配列もしくはこのような配列のセットは、化学合成、部位特異的を変異誘発、PCR、および／または組換え方法のような当該分野で知られた方法を使用することにより作製され得る。試験される配列は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によってコードされる)、ルシフェラーゼ(luc遺伝子によってコードされる)、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがこれらに限定されないレポータータンパク質を含む適切なレポーター遺伝子を含むベクターに挿入される。このようなベクターおよびアッセイは、特に市販の供給源から容易に利用できる。このように構築されるプラスミドは、リン酸カルシウム沈澱、電気穿孔法、リポソーム（リポフェクション）、およびDEAE-デキストランのような当該分野で公知のトランスフェクション方法を使用して推定AFP-TREによってコントロールされるようなレポーター遺伝子の発現について試験をするために適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。適切な宿主細胞は、Hep3B、HepG2、HuH7 、HuH1/Cl2およびAFP-SK-Hep-1を含むが、これらには限定されない、AFPを産生する任意の細胞型を含む。LNCaP、HBL-100、Chang肝細胞、MCF-7、HLF、HLE、3T 3、およびHeLaのような非AFP産生細胞は、コントロールとして使用される。結果は、標準アッセイを使用してレポーター遺伝子の発現レベルを測定することによって得られる。AFP産生細胞とコントロールとの間の発現比較化は、転写活性化があるか無いかを示す。実施例２は、800bpの推定AFP-TRE（上記に記載したように0.2kbのプロモーター領域に融合した0.6kbのエンハンサー領域）がルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して試験した実験を記載する。転写の増加または活性化により、転写が、標的細胞（すなわち、AFP産生細胞）において、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約 50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍、基礎レベルを越えて増加することが意図される。種々のAFP-TR E間の比較は、１つのAFP産生細胞株中での発現レベルを測定し比較することにより、評価され得る。絶対的な、AFP-TREの転写活性は、いくつかの因子（例えば、標的細胞の性質、AFP-TREの送達態様および形態、ならびに選択的に転写が活性化されるコード配列）に依存することが理解される。種々の用いられるプラスミドサイズを補整するために、活性は、トランスフェクトしたプラスミド１モルあたりの比活性として表され得る。あるいは、転写（すなわち、mRNA）のレベルは、標準的なノザン分析およびハイブリダイゼーション技術を用いて測定され得る。トランスフェクションのレベル（すなわち、トランスフェクション効率）は、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーターのような異なるTREの制御下の異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドの同時トランスフェクションにより測定される。この分析はまた、負の調節領域すなわちサイレンサーを示し得る。あるいは、推定AFP-TREは、AFP発現細胞についてのアデノウイルス複製の優先性を与える能力につき評価され得る。このアッセイのために、推定AFP-TREと作動可能に連結された、複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含有する構築物は、 AFPを発現する細胞にトランスフェクトされる。これらの細胞におけるウイルス複製は、例えば、AFPを産生しない細胞中の構築物によるウイルス複製と比較される。この種のアッセイにつき、実施例１に、より詳細に記載する。本発明を実施するために、最大の活性を有する、または最小のサイズを有する AFP-TREを使用する必要はないことが理解される。特に、活性の必要な程度は、予測される使用と所望の結果により決定される。例えば、本発明のアデノウイルスベクターが、細胞をAFP産生活性についてもモニターするために用いられる場合、AFP-TREによる応答性の最大限未満の程度が、そのような細胞の存在を定性的に示すのに十分である。同様に、疾患状態の処置または緩和のための使用の場合において、例えば、AFP産生細胞が特に病原性でなく、そして／または疾患の範囲が比較的限定されていれば、最大限未満の応答性は所望の結果のために十分である。 AFP-TREのサイズは、部分的にアデノウイルスベクターの容量によって決まり、その容量は、次にベクターの意図される形態に依存する（下記を参照）。一般的に、最小のサイズが好ましい。なぜなら、これにより所望され得る他の配列（例えば、トランスジーン（下記）またはさらなる調節配列）の挿入のための潜在的な余裕を提供するからである。しかし、さらなる配列が意図されない場合、または、例えば、アデノウイルスベクターが維持され、いかなるウイルスパッケージング制約もなしに送達される場合、生じるアデノウイルスベクターを複製コンピテントにする限り、より大きなAFP-TREが用いられ得る。アデノウイルス配列が欠失していない場合、アデノウイルスベクターは、合計がゲノムサイズの約5%、または約1.8kbまでの、余分な配列を伴いパッケージングされ得る。非必須配列が、アデノウイルスゲノムより除去される場合、さらなる4.6kbのインサートが許容され得る（すなわち、合計約1.8kb＋4.6kb＝約6.4kb ）。欠失され得る非必須アデノウイルス配列の例は、E3およびE4である（E4 OR F6が維持される限り）。 AFP特異的転写活性は、5.1kb 5'隣接フラグメントにおいて示されるので、AFP -TREは、少なくとも約5.0kb程度の大きさであり得る。好ましくは、AFP-TREは、約2.5kbのポリヌクレオチド配列を含み、より好ましくは約1kbのポリヌクレオチド配列を含み、より好ましくは約0.8kbのポリヌクレオチド配列を含み、さらにより好ましくは約0.5kbのポリヌクレオチド配列を含み、さらにより好ましくは約0.3kb（AFPエンハンサーエレメントの１つのおよそのサイズである）のポリヌクレオチド配列を含む。種々の複製コンピテントアデノウイルスベクターは、本発明に従い作製され得、ここで１つ以上のアデノウイルス遺伝子は、AFP-TREの制御下にある。例えば、AFP-TREは、アデノウイルスベクター中に、複製遺伝子（例えば、E1A、E1B、もしくはE4のような初期遺伝子、またはL1、L2、L3、L4、もしくはL5のような後期遺伝子）のすぐ上流に導入され得、そしてこれと作動可能に連結され得る。いくつかの実施態様において、アデノウイルスベクターは、AFP-TREの転写制御下にE1A遺伝子を含有する。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、A FP-TREの転写制御下にE1B遺伝子を含有する。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、AFP-TREの転写制御下にE4遺伝子を含有する。他の実施態様において、上記の種々の組み合わせおよび順列が、実施され得る。例えば、いくつかの実施態様において、アデノウイルスベクターは、AFP-TREの転写制御下のE 1A遺伝子、およびAFP-TREの転写制御下のE1B遺伝子を含有する（すなわち、「２重」AFP-TRE構築物」）。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、A FP-TREの転写制御下のE1A遺伝子、第２のAFP-TREの転写制御下のE1B遺伝子、および第３のAFP-TREの転写制御下のE4遺伝子を含有する。この文脈において「第１」のAFP-TRE、「第２」のAFP-TRE、「第３」のAFP-TRE、などは、別々のAFP-T REが各々別個の遺伝子を駆動することを意味する。使用されるAFP-TREは、同一の配列組成を有しても有しなくても良い。しかし、別に記載するように、１より多いアデノウイルス遺伝子の転写を１つのAFP-TREに調節させることは可能である。１つの実施態様において、E1AおよびE1Bは、以下の構築物を作製することにより、１つ以上のAFP-TREの制御下に存在する。野生型アデノウイルスにおいて、E 1AおよびE1Bは、直列配向である。E1Aのコード領域からE1Bプロモーターまでを含むフラグメントは、アデノウイルスゲノムから切除され、そして逆配向で再度挿入される（図４）。この配置において、E1AおよびE1Bプロモーターはお互いに隣接し、E1Aコード七グメントが逆配向で続き（そのため、E1AプロモーターまたはE1Bプロモーターのいずれも作動可能にE1Aと連結していない）、E1BがE1Aに対し逆配向で続く。AFP-TREは、E1Aコード領域およびE1Bコード領域間に挿入され得、（E1AおよびE2Bのコード領域は逆の配向である）、そのためこれらの領域は TREの制御下にある。適切なプロモーター配列は、図４に示すように、E1Aおよび E1B領域に対して近位に挿入される。従って、AFP-TREは、E1AおよびE1Bの両方を駆動し得る。このような配置は、例えば、２つのAFP-TREがインタクトな（ネイティブの）Adゲノムに挿入される場合（それぞれが、E1AおよびE1Bのコード領域の5'側に）に起こり得る可能性のあるループ−アウト事象を防止し得る。E1AおよびE1B間に多重クローニング部位を導入することにより、他の型のAFP、または肝臓特異的TRE、または、他の細胞特異的調節エレメント（好ましくは新生物のような疾患状態と関連するもの）が、挿入され得る。従って、この構築物は、アデノウイルス遺伝子E1AおよびE1Bを制御する細胞特異的な、一過性の、または他の手段のための一般的な使用を見出し得、これによりアデノウイルスの複製を選択された転写パラメーターに依存性にする簡便で強力な方法を提供する。種々の他の複製コンピテントアデノウイルスベクターは、本発明に従い作製され得る。ここで、１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子がAFP-TREの制御下に存在させられていることに加え、レポーター遺伝子もAFP-TREの制御下にある。例えば、AFP-TREは、アデノウイルスベクター中にE1AまたはE1Bのような初期遺伝子の直ぐ上流で導入され得、そしてこれに作動可能に連結され得、そしてこの構築物はまた、レポーター遺伝子発現を駆動する第２のAFP-TREを含有し得る。レポーター遺伝子はレポータータンパク質をコードし得、これにはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、βガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子にコードされる）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質、および西洋わさびペルオキシダーゼが挙げられるが、これに限定されない。生物学的サンプル中の推定前立腺細胞の検出のために、生物学的サンプルは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がAFP-TRE制御下にある改変アデノウイルスにより処理され得る。AFP-TREは、AFP-TREが機能することを可能にする細胞（例えば、AFP発現細胞）中で転写的に活性であり、ルシフェラーゼは産生される。この産生は、例えば、ヒト宿主または生物学的サンプル中でアンドロゲンレセプターを産生する細胞の検出を可能にする。あるいは、アデノウイルスベクターは、条件付きでに生存に必要である産物をコードする遺伝子（例えば、抗生物質耐性マーカー）が、AFP-TREの制御下にあるように構築され得る。このアデノウイルスベクターが生物学的サンプルに導入される場合、AFP発現細胞のようなAFP-TREが機能するのを可能にする細胞は、抗生物質耐性となる。次に、抗生物質は、非アンドロゲンレセプター産生細胞を殺すために、培地中に導入され得る。非特異的複製を最小化するために、内因性（すなわち、アデノウイルスの）TR Eは、好ましく除去されるべきである。これはまた、アデノウイルスベクターにおいてインサートのためのさらなる余裕を提供する。このことは、アデノウイルスベクターがウイルスとしてパッケージングされる場合（下記を参照）、特に重要であり得る。さらにより重要なことには、内因性TREの欠失は組換え事象の可能性を防ぎ、それにより、AFP-TREは欠失され、そして内因性TREが、それぞれのアデノウイルスのコード配列を転写制御する（従って、非特異的複製を可能とする）と想定される。１つの実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子の内因性転写制御配列が欠失され、AFP-TREで置き換わるように構築される。しかし、十分な細胞特異的複製の優先性が保存される場合、内因性TREは、アデノウイルスベクターで維持され得る。これらの実施態様は、内因性TREに加えAFP-TREを提供することにより、構築され得、好ましくは、 AFP-TREは、内因性TREおよび複製遺伝子コードセグメント間に介在する。必要とされる細胞特異的複製の優先性は、AFPを発現する細胞におけるアデノウイルスベクターの複製と非AFP産生細胞における複製とを比較するアッセイを行うことにより、示される。一般的に、複製の差は、少なくとも約２倍が好ましく、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約50倍、なおより好ましくは少なくとも約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍である。許容される差は、経験的に決定され得（例えば、実施例のセクションに記載のアッセイを用いて）、そしてアデノウイルスベクターの予想される使用および／または所望の結果に依存する。適切な標的細胞は、AFP-TREが機能するのを可能にする任意の細胞型である。好ましいのは、AFPを発現するか、もしくは産生するか、または発現もしくは産生可能である細胞（AFPを発現する腫瘍細胞を含むがこれに限定されない）である。このような細胞の例は、肝細胞ガン細胞、生殖腺細胞肺瘍および他の生殖細胞腫瘍（特に、内胚葉洞腫瘍）、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の細葉細胞ガン（Kawamotoら（1992）Hepatogastroenterology 39:282-286）、原発性胆嚢腫瘍（Kat suragiら（1989）Rinsko Hoshasen 34:371-374）、子宮内膜腺ガン細胞（Koyamaら（1996）Jpn．J．CancerRes．87:612-617）、および前記の任意の転移（肺、副腎、骨髄、および／または脾臓で生じ得る）である。いくつかの場合において、特定の膵臓ガンおよび胃ガンから肝臓への転移性の疾患は、AFPを産生する。特に好ましいのは、肝細胞ガン細胞およびその任意の転移である。AFP 産生は、当該分野で標準のアッセイ（例えば、AFPタンパク質産生のレベルを決定する、RIA、ELISA、またはウエスタンブロッティング（免疫アッセイ）または AFP mRNA産生のレベルを決定するノザンブロット）を用いて測定され得る。あるいは、このような細胞は、AFP-TREを転写的に活性化する能力（すなわち、AFP-T REが機能するのを可能にする能力）により、同定され、そして／または特徴づけられ得る。種々の血清型のアデノウイルス（例えば、Ad2、Ad5、Ad12、およびAd40）の任意の型が、用いられ得る。説明のために、血清型Ad5を、本明細書中で例示する。いくつかの実施態様において、AFP-TREは、増殖に必須なアデノウイルス遺伝子とともに用いられ、その結果、複製コンピテンスは、AFPを発現する標的細胞で、優先的に達成可能である。好ましくは、遺伝子は初期遺伝子（例えば、E1A 、E1B、E2、またはE4）である。（E3は、ウイルス複製に必須ではない。）より好ましくは、AFP-TRE制御下の初期遺伝子は、E1Aおよび／またはE1Bおよび／またはE4である。１つより多いの初期遺伝子が、AFP-TREの制御下に配置され得る。実施例１は、このような構築物のより詳細な記載を提供する。 E1A遺伝子は、ウイルス感染の直後（0〜2時間）で、そして他の任意のウイルス遺伝子の前に、発現する。E1Aタンパク質は、トランス作用性正作用性転写調節因子として作用し、そして他の初期ウイルス遺伝子E1B、E2、E3、E4、およびプロモーター近位主要後期遺伝子の発現に必要である。命名法にもかかわらず、主要後期プロモーターにより駆動するプロモーター近位遺伝子は、Ad5感染後の初期の間に発現する。Flint(1982)Biochem．Biophys．Acta 651:175-208;Flint( 1986)Advances Virus Research 31:169-228;Grand(1987)Biochem．J．241:25-38 。機能的E1A遺伝子の非存在下において、ウイルス感染は進行しない。なぜなら、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物は、産生されないからである。Nevins(19 89)Adv．Virus Res．31:35-81。Ad5 E1Aの転写開始部位は、498位であり、E1Aタンパク質のATG開始部位は、ウイルスゲノムの560位である。 E1Bタンパク質は、イントランス（in trans）で機能し、そして後期mRNAの核から細胞質への輸送に必要である。E1B発現の欠損は、後期ウイルスタンパク質の乏しい発現、および宿主細胞タンパク質合成の遮断の不能を生じる。E1Bプロモーターは、Ad40とAd5の宿主範囲の差を規定するエレメントとしての意味を有し；臨床的には、Ad40はエンテロウイルスであり、一方Ad5は急性結膜炎を生じる。Bailey、Mackayら、（1993）Virology 193:631;Baileyら、（1994）Virolog y 202:695-706。Ad5のE1Bプロモーターは、１つのSp1高親和性認識部位とTATAボックスからなる。アデノウイルスのE2領域は、アデノウイルスゲノムの複製に関係するタンパク質（72-kDa DNA結合タンパク質、80-kDa前駆体末端タンパク質およびウイルスDN Aポリメラーゼを含む）をコードする。Ad5のE2領域は、２つのプロモーター（E2 初期およびE2後期と名付けられ、それぞれ76.0および72.0マップ単位にマッピングされる）から右向き方向に転写される。E2後期プロモーターは、感染の後期段階の間で一過的に活性であり、そしてE1Aトランスアクチベータータンパク質に依存しないが、E2初期プロモーターは、ウイルス複製の初期の間において重要である。 E2初期プロモーター（Ad5において、27050〜27150にマッピングされる）は、主要なおよびマイナーな（minor）転写開始部位（後者はE2転写物の約5%となる）、２つの非正準（non-canonical）TATAボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位よりなる。 E2プロモーター構築の詳細な総説のために、Swaminathanら（Curr．Topics in Micro．and Imm.(1995)199第３部:177-194）を参照のこと。 E2後期プロモーターは、反対鎖にコードされる遺伝子のコード配列と重なり、従って遺伝子操作になじまない。しかし、E2初期プロモーターは、反対鎖の33kD aタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重なる。特に、SpeI制限部位（Ad5 27082位）は、上記33kOaタンパク質の終結コドンの一部であり、主要E2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を、上流の転写因子結合部位E2FおよびA TFより、簡便に分離する。従って、SpeI末端を有するAFP-TREの、１鎖中のSpeI 部位への挿入は、Ad5の内在性E2初期プロモーターを破壊し、E2転写物のAFP制限化発現を可能にするべきである。 E4遺伝子は、多くの転写産物を有する。E4領域は、ウイルスゲノムDNA複製の刺激および後期遺伝子発現の剌激を担う２つのポリペプチドをコードする。オープンリーディングフレーム（ORF）3および6のタンパク質産物は、ともにE1Bからの55-kDaタンパク質、ならびにE2F-1およびDP-1のヘテロ２量体と結合することにより、これらの機能を行い得る。ORF6タンパク質は、活性のためにE1B 55-kDa タンパク質との相互作用を必要とし、一方、ORF3タンパク質は必要としない。OR F3およびORF6からの機能的タンパク質の非存在下において、プラークは、野生型ウイルスの場合の10^-6未満の効率で産生される。AFP産生細胞にウイルス複製をさらに制限するために、E4 ORF1〜3は、除去され、ウイルスDNA複製および後期遺伝子合成をE4 ORF6タンパク質依存性にし得る。そのような変異体を、E1B領域がAFP-TREにより調節される配列と組み合わせることより、E1B機能およびE4機能の両方がE1Bを駆動するAFP-TRE依存のウイルスを得ることができる。本発明と関連する主要後期遺伝子は、遺伝子L1、L2、L3、L4、およびL5であり、これらはアデノウイルスビリオンのタンパク質をコードする。これらの遺伝子すべて（代表的には構造タンパク質をコードする）は、おそらくアデノウイルス複製に必要である。後期遺伝子は全て、主要後期プロモーター（MLP）の制御下にあり、Ad5において+5986〜+6048に位置する。 AFP-TREが機能するのを可能とする細胞（例えば、AFPを発現する細胞）における優先的な複製コンピテンスによる選択的細胞傷害活性および／または細胞溶解活性を与えることに加え、本発明のアデノウイルスベクターは、さらにAFP-TRE 制御下の異種遺伝子（トランスジーン）を含み得る。このようにして、種々の遺伝的能力は、AFPを発現する標的細胞（特にAFP産生ガン細胞）へ導入され得る。例えば、AFP産生標的細胞の比較的抵抗性の性質または特定の攻撃性のために、例えば、特定の例において、細胞傷害活性の程度および／または割合を増強することが所望され得る。これは、例えば、HSV-tkおよび／またはシトシンデアミナーゼ（cd）（細胞が5-フルオロシトシン（5-FC）の化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）への代謝を可能なようにする）の細胞特異的発現と細胞特異的複製的細胞傷害活性との共役により達成され得る。これらの型のトランスジーンを使用することはまた傍効果（bystander effect）を与え得る。アデノウイルスベクターを介し導入され得る他の所望のトランスジーンとしては、細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ジフテリアトキシンのＡ鎖、リシンまたはアブリン［Palmiterら(1987)Cell 50:435;Maxwellら(1987)M ol．Cell．Biol．7:1576;Behringerら(1988)Genes Dev．2:453;Messingら(1992) Neuron 8:507;Piatakら(1988)J．Biol．Chem．263:4937;Lambら(1985)Eur．J．B iochem．148:265;Frankelら(1989)Mol．Cell．Biol．9:415］）、アポトーシスを開始し得る因子をコードする遺伝子、アンチセンス転写物またはリボザイムをコードする配列（他の能力の中でも、これらは増殖に必須のタンパク質（例えば、構造タンパク質、または転写因子）をコードするmRNAを指向し得る）、ウイルスタンパク質または他の病原性タンパク質（病原体は細胞内で増殖する）、ヌクレアーゼ（例えば、RNアーゼＡ）またはプロテアーゼ（例えば、アウシン（awsi n）、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼなど）の操作された細胞質性改変体をコードする遺伝子、あるいはFas遺伝子をコードする遺伝子などが挙げられる。目的の他の遺伝子は、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質など（例えば、IL-1、-2、-6、-12、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFN-α、-β、- γ、TNF-α、-β、TGF-α、-β、NGFなど）が挙げられる。正のエフェクター遺伝子は、初期において、複製を原因とする細胞傷害性活性に続き、用いられ得る。上記に考察したように、いくつかの実施態様において、E3領域内にコードされるアデノウイルス死タンパク質（ADP）は、アデノウイルスベクターに維持される（すなわち含まれる）。主要後期プロモーター（MLP）の制御下のADP遺伝子は、宿主細胞の溶解を促進するのに重要なタンパク質（ADP）をコードするようである。Tollefsonら(1996)J.Virol．70(4):2296;Tollefsonら(1992)J.Virol．66( 6):3633。従って、ADP遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターをより強力にし、より効率的な処置および／またはより低投薬量要求性を可能とする。従って、本発明は、ADPをコードするポリヌクレオチド配列を含有するアデノウイルスベクターを提供する。ADPをコードするDNA配列およびADPのアミノ酸配列を、配列番号22および配列番号23にそれぞれ示した。手短に言えば、ADPをコードする配列は、好ましくは、PCRのような当該分野で公知である技術を用い、A d2より得られる（なぜなら、Ad2は、ADPがより十分に特徴づけられた株であるからである）。好ましくは、Ｙリーダー（後期遺伝子の正確な発現に重要な配列）はまた、得られ、そしてADPコード配列と連結される。次に、ADPコード配列（Ｙリーダーとともに、またはＹリーダーなしで）は、アデノウイルスゲノム中（例えば、E3領域（ここでADPコード配列は、MLPまたはE3プロモーターにより駆動される））に導入され得る。ADPコード配列はまた、E4領域のようなアデノウイルスゲノムの他の位置に挿入され得る。あるいは、ADPコード配列は、異種プロモーター（エンハンサーとともにまたはエンハンサーなしで）（別のウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、AFP、ガン胎児性抗原（CEA）、ムチン、およびラットプロバシン（probasin）を含むがこれらに限定されない）と作動可能に連結され得る。実施例４は、ADPのコード配列がAd5のE3領域に挿入されたADP構築物の記載を提供する。 ADPに関して、ADPコード配列を含むアデノウイルスベクターの細胞傷害特性、ウイルス収量、およびインビボ細胞傷害特性を検査した。特徴付けられたウイルス構築物CN751は、これらの配列を含まないコントロールベクターと比較した場合、有意な、効率的なインビトロ細胞殺傷およびウイルス収量を示した。さらに、ヌードマウスにおけるLNCaP(前立腺ガン細胞株)腫瘍異種移植片は、コントロールアデノウイルスベクターまたは緩衝液を与えられたマウスの腫瘍サイズと比較した場合、サイズが減少したか、または同じサイズのままであった(すなわち、増殖が抑制された)かのいずれかであり、投与７日後に、CN75１処置腫瘍とコントロールの処置腫瘍との間で腫瘍サイズに統計学的に有意な差があった。まとめると、これらのデータは、ADP含有アデノベクターが、効果的な細胞傷害因子であることを強く示唆する。したがって、本発明はまた、ADPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、天然に存在しないアデノウイルスベクターを提供する。これらのベクターは、ADPコード配列の複数のコピーを含み得ること、および、複数のコピーで存在する場合、ADPポリペプチドが少なくとも２つのこれらの配列から産生される限り、配列は同じである必要はないことが理解される。上記のように、「ADPポリペプチド」は、ADPと関連する少なくとも１つの機能、特に、細胞傷害性(好ましくは、細胞死)に関連する機能を示すポリペプチドである。「ADPポリペプチド」は、上記のADPの形態、および、ADP機能を示す任意のポリペプチドフラグメントを含む。ADP機能は細胞傷害活性(特に溶解)に関連するので、推定のADPポリペプチドは、当該分野において標準的な方法(例えば、プラークアッセイ)を使用することによって試験され得る。いくつかの実施態様において、ADPポリペプチドは、配列番号23に示されるポリペプチド配列(配列番号23の全体配列を含む)である。他の実施態様において、 ADPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号22(配列番号22の全体配列を含む)に示される。ADPのアミノ酸配列が与えられると、当該分野において公知の方法を使用して、配列番号22に示される配列以外のポリヌクレオチド配列を使用して、配列番号23の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを設計することが可能である。さらに、当業者により容易に作製される縮重プローブのようなツールが与えられると、例えば、他のアデノウイルス血清型由来の他の ADP配列を入手し、そして試験することが可能である。 ADPコード配列は、細胞特異的、組織特異的、および/または腫瘍特異的なTRE の転写制御下にあってもなくてもよい。いくつかの実施態様において、ADPポリペプチドコード配列は、細胞特異的TRE(例えば、AFP-TRE)または前立腺細胞特異的TREの転写制御下にある。前立腺細胞特異的TREの例は、前立腺特異的抗原(米国特許第5,698,443号および第5,648,478号)、プロバシン(probasin；共有に係る米国特許出願第60/039,762号および米国特許出願第08/ 号（代理人整理番号34802/2000700)に記載)、およびヒトカリクレイン２(kallikrien 2；共有に係る米国特許出願第60/ 号(代理人整理番号34802/3000920)および米国特許出願第60/054,523号に記載)に由来するものである。細胞特異的TREの他の例は、ガン胎児性抗原およびムチンである。これらおよび他のTREに関する機能的フラグメントの記載は、当該分野において入手可能である。いくつかの実施態様において、本発明は、第２のAFP-TREの転写制御下にさらなるアデノウイルス遺伝子を含む、アデノウイルスベクターを提供する。転写制御下のさらなるアデノウイルス遺伝子の例は、ADP(上記の)および複製に必要な遺伝子(例えば、初期遺伝子)である。例えば、アデノウイルスベクターは、第１のAFP-TREが、ある初期遺伝子(例えば、E1AまたはE1B)の転写を調節し、そして第２のAFP-TREが別の初期遺伝子の転写を調節するように、構築され得る。これらの多重構築物は、これらが複製に関する細胞特異性の１より多い供給源を提供する点(実施例１を参照)で、より所望され得る。CN733(このような二重構築物) は、HuH7腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおいて腫瘍増殖を首尾良く阻害した(実施例４)。本明細書に記載の任意のアデノウイルスベクターは、種々の形態で使用され得る。その形態には、裸のポリヌクレオチド(通常、DNA)構築物；細胞への侵入を容易にするための因子(例えば、カチオン性リポソームまたは他のカチオン性化合物(例えば、ポリリジン))と複合体化されたポリヌクレオチド構築物；感染性アデノウイルス粒子(これは、アデノウイルスベクターをより免疫原性にし得る) 中にパッケージングされたポリヌクレオチド構築物；他の粒子状ウイルス形態( 例えば、HSVまたはAAV)中にパッケージングされたポリヌクレオチド構築物；免疫応答を増強するかまたは鈍らせるための因子(例えば、PEG)と複合体化されたポリヌクレオチド構築物；インビボトランスフェクションを容易にするための因子(例えば、DOTMA^TM、DOTAP^TM、およびポリアミン)と複合体化したポリヌクレオチド構築物が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明はまた、 AFP産生細胞において優先的に複製し得るアデノウイルスを提供する。「優先的に複製する」とは、AFP産生細胞において、非AFP産生細胞よりも多くのアデノウイルスが複製することを意味する。好ましくは、アデノウイルスは、AFP産生細胞において、非AFP産生細胞よりも有意に高いレベル、好ましくは少なくとも約２倍高いレベル、好ましくは少なくとも約５倍高いレベル、より好ましくは少なくとも約10倍高いレベル、なおより好ましくは少なくとも約50倍高いレベル、なおより好ましくは少なくとも約100倍高いレベル、なおより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍高いレベル、なおより好ましくは少なくとも約1000倍高いレベル、最も好ましくは少なくとも１×10⁶高いレベルで複製する。最も好ましくは、アデノウイルスはAFP産生細胞においてのみ複製する(すなわち、非AFP産生細胞においては、複製しないか、または非常に低いレベルで複製する)。アデノウイルスベクターが、アデノウイルスにパッケージングされる場合、アデノウイルス自体はまた、標的化をさらに増強するために選択され得る。例えば、アデノウイルス線維は、向性を補助する細胞レセプターとの一次接触を媒介する。例えば、Ambergら(1997)Virol．227:239-244を参照。アデノウイルス血清型の特定の亜属が、標的細胞タイプに関する向性、および/または非標的細胞タイプに関する減少した親和性を示す場合、そのような亜属は細胞傷害性および/または細胞溶解の細胞特異性をさらに増大させるために使用され得る。いくつかの実施態様において、パッケージングされたアデノウイルスベクターは、親水性ポリマーに複合体化されて、マスクされたアデノウイルスを作製する。親水性ポリマーはアデノウイルスのキャプシドタンパク質(特にヘキソンおよびファイバータンパク質)に結合(共有結合または非共有結合)される。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターはマスキング剤と複合体化され、マスクされたアデノウイルスベクターを作製する。マスクされたアデノウイルスは、(a)アデノウイルス中和抗体または循環のオプソニン(opsinin)に対する、アデノウイルス表面のマスキング、および(b)体内の非特異的クリアランス機構(すなわち、マクロファージなど)の減少によるアデノウイルス粒子の全身循環時間の増加に起因して有利である。インビボの文脈において、マスクされたアデノウイルスの全身送達は、ウイルス粒子のより長い循環、より少ない免疫原性、ならびに肝臓および膵臓によるクリアランスの減少とともに、増加した生体分布を生じる。大規模な調査において、親水性ポリマー(特にPEG)によるタンパク質および脂質の改変を行ったが、本発明者らは、アデノウイルスまたはアデノウイルス構築物に関連したマスキング剤の任意の他の使用には気付いていない。従って、本発明は、マスキング剤と複合体化されたアデノウイルスを提供する。好ましくは、マスキング剤はPEGである。マスクされたアデノウイルスの作製の１つ方法の図を図15に示す(実施例７もまた参照のこと)。好ましい実施態様は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含むマスクされたアデノウイルスであり、より好ましい実施態様では、これは、本明細書中に記載のアデノウイルスを含むPEG化されたアデノウイルスを含む。本発明はまた、これらのマスクされたアデノウイルスを作製するためおよび使用するための方法を提供し、これらは本明細書中の記載から明らかである。マスキング剤は、所望の複合体および必要な機能が得られる限り、種々の分子量のものであり得る。商業的供給源から得られるほとんどのマスキング剤は、規定された分子量に関連して通常多分散体である(すなわち、マスキング剤は、公称分子量の周辺に分子量が分布して供絵される)。本発明に従うアデノウイルスのマスキングに有用なマスキング剤は、約2000〜約50,000；好ましくは約2500〜約30,000；好ましくは約3000〜約25,000；より好ましくは約5000〜約20,000の公称重量を有し得る。好ましくは、公称分子竜は、約20,000未満、より好ましくは約10,000未満、より好ましくは約7500未満、より好ましくは約5000未満である。好ましくは、マスキング剤は、約5000Da未満の公称分子量を有するPEGである。種々の重量のマスキング剤の混合物もまた意図される。マスキングは、共有結合または非共有結合であり得る。非共有結合の場合、結合は、静電気、疎水性、または親和性相互作用を介し得る。非共有結合に用いられるマスキング剤は、修飾されたマスキング剤であり得る(すなわち、マスキング剤は、通常マスキング剤にはみられない特定の化学部分を含むように、合成または修飾される)。アデノウイルスベクターへの静電気結合に有用なマスキング剤は、静電気相互作用によってアデノウイルス表面に結合する荷電した部分を含む、またはこれを含むように修飾されたかもしくは合成された、マスキング剤である。負に荷電したマスキング剤には、リン酸基、硫酸基、カルボキシ基などを含むマスキング剤が含まれる。四級アミン基は、アデノウイルスへのマスキング剤の静電気、非共有結合のための正に荷電した部分として有用である。脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンなど)のような疎水性基および他の疎水性基(例えば、フェニル基または長いアルキル鎖)を含む、またはこれらを含むように修飾されたかもしくは合成されたマスキング剤は、ウイルス上の安定な疎水性領域との疎水性相互作用によりアデノウイルスベクターと複合体化され得る。親和性マスキング剤は、アデノウイルスに結合する任意の低分子、ペプチド、またはタンパク質を使用して作製され得る。親和性および疎水性部分は、当該分野で公知の任意の方法によって、好ましくは化学架橋剤との化学的な架橋によってマスキング剤に結合され得る。マスキング剤が共有結合される場合、化学架橋剤は好ましくはアデノウイルスへマスキング剤を共有結合するために使用される。架橋剤は、マスキング剤とアデノウイルスとの間で共有結合または架橋を作製し得る、任意の架橋剤であり得る。アデノウイルス、マスキング剤、および別々の架橋分子が反応する直接架橋は、マスキング剤とタンパク質との間の架橋を作製する当該分野で公知の任意の化学架橋剤を使用して、共有結合によりマスクされたアデノウイルスを作製するために使用され得る。マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかは、架橋反応の前に改変され得、その結果、化学架橋剤は２つの分子と反応する(例えば、マスキング剤は、アミン基を添加するように修飾され得、マスキング剤はアミンと反応する架橋剤によってアデノウイルスと架橋し得る)。好ましくは、マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかは、架橋剤との反応によってまず活性化される。未反応の架橋剤を、次いで、マスキング剤またはアデノウイルスから除去する。活性化反応は、好ましくは、マスキング剤分子あたり１または２の架橋剤分子、より好ましくはマスキング剤分子あたり１つの架橋剤分子を生じる。活性化マスキング剤またはアデノウイルスは、次いでアデノウイルス(マスキング剤が活性化される場合)またはマスキング剤(アデノウイルスが活性化される場合)と、マスクされたアデノウイルスを形成する適切な反応条件下で混合される。好ましくは、マスキング剤は活性化され、次いでアデノウイルスと反応する。好ましいマスキング剤はPEGである。好ましい活性化PEGとしては、末端アミン (end terminal amine)PEG、PEGアミノ酸エステル、PEG塩酸ヒドラジン、チオールPEGなどのような求核性架橋PEG；スクシネートPEG、カルボキシメチル化PEG、 PEG-プロピオン酸、およびPEGアミノ酸を含むカルボキシルPEG；PEG-マレイミド、PEG-オルトピリジルジスルフィドなどのようなスルフヒドリル選択性PEG；アミンおよび酸PEG、NHS-マレイミドPEG、およびNHS-ビニルスルホンPEGを含むヘテロ官能性(heterofunctional)PEG；PEGシラン；ビオチンPEG；アリルPEG、PEG アクリレート、PEGメタクリレートなどのようなPEGのビニル誘導体；および、PE Gスクシンイミジルスクシネート、PEGスクシンイミジルスクシンアミド、PEGスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル、PEG2-NHS、アミノ酸PEGスクシンイミジルエステル、ペンダント修飾PEG NHSエステル(例えば、Innophase，Inc.から入手可能なもの)、PEG-グリシジルエーテル(エポキシド)、PEG-オキシカルボニルイミダゾール、PEGニトロフェニルカルボネート、PEGトリクロロフェニルカルボネート、PEGトレスレート(tresl ate)、PEG-アルデヒド、PEG-イソシアネート、PEGアリルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー、PEGビニルスルホンを含む求電子活性PEGが挙げられるが、これらに限定されず、そして他の活性化PEGもまた当業者に明らかである。活性化PEGは、好ましくは、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドまたはPEG-スクシンイミジルスクシネートであり、より好ましくはPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドである。アデノウイルスベクターは、種々の方法で標的細胞に送達され得る。その方法には、リポソーム、当該分野において周知の一般的なトランスフェクション方法 (例えば、リン酸カルシウム沈澱またはエレクトロポレーション)、直接注射、および静脈内注入が挙げられるが、これらに限定されない。送達手段は、特定のアデノウイルスベクター(その形態を含む)および標的細胞のタイプおよび位置(すなわち、細胞がインビトロにあるかまたはインビトロにあるか)に大部分依存する。パッケージングされたアデノウイルスとして使用する場合、アデノウイルスベクターは、適切な生理学的に受容可能なキャリアで、約10⁴〜約10¹⁴の用量にて投与され得る。感染多重度は、一般に、約0.001〜100の範囲にある。ポリヌクレオチド構築物として投与される場合(すなわち、ウイルスとしてパッケージングされない場合)、約0.01μg〜約100μgのアデノウイルスベクターが投与され得る。アデノウイルスベクターは、意図する使用および宿主の免疫応答の潜在能力に依存して、１回またはそれ以上で投与され得、そして複数の同時注射としてもまた投与され得る。免疫応答を所望しない場合、免疫応答は、種々の免疫抑制剤を用いることによって排除され、強力な免疫応答を伴わずに繰り返し投与を可能にし得る。別のウイルス形態(例えば、HSV)としてパッケージングされる場合、投与される量は、その特定のウイルスについての標準的な知識(例えば、公開された文献から容易に入手可能である)に基づき、そして経験的に決定され得る。本発明はまた、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを含む(すなわち、そのベクターで形質転換された)、宿主細胞を提供する。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞は、共に、その宿主における維持に必須である配列(例えば、適切な複製起点)が存在する限り使用され得る。便宜上、選択マーカーもまた提供される。原核生物宿主細胞には、細菌細胞(例えば、E．coli、B．subti lis、および放線菌)が挙げられる。真核生物宿主細胞には、酵母、昆虫、トリ、植物、C．elegans(線虫)および哺乳動物がある。真菌(酵母を含む)宿主細胞の例は、S．cerevisiae、Kluyveromyces lactis(K．lactis)、Candidaの種(C．albic ansおよびC．glabrataを含む)、Aspergillus nidulans、Schizosaccharomyces p ombe(S．pombe)、Pichia pastoris、およびYarrowia lipolyticaである。哺乳動物細胞の例は、COS細胞、マウスＬ細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児性腎臓(HEK)細胞、およびアフリカミドリザル細胞である。Xenopus laevis卵母細胞、または両生類起源の他の細胞もまた使用され得る。宿主系は当該分野において公知であり、そして本明細書に詳細に記載する必要はない。適切な宿主細胞には、AFP、またはAFP-TREを活性化することが公知である任意のタンパク質(このタンパク質が天然に産生されるか組換え的に産生されるかに拘わらず)を産生する任意の細胞もまた含まれる。本発明はまた、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含有する薬学的な組成物を含む組成物を含む。このような組成物は、例えば、個体中の細胞殺傷の導入および/または効果の程度を測定する場合、インビボでの投与に有用である。好ましくは、これらの組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む。これらの組成物は薬学的に受容可能な賦形剤中に有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含み得、単位投薬形態、滅菌非経口溶液または懸濁物、滅菌非経口でない溶液または経口溶液または懸濁物、水中油型または油中水型のエマルジョンなどにおいて、個体への全身投与に適切である。非経口および非経口でない薬物送達のための処方は当該分野で公知であり、そしてRemington's Pharmaceutic al Sciences，第18版、Mack Publishing(1990)に示される。薬学的組成物もまた、本発明のアデノウイルスベクター(アデノウイルスのような、ウイルスとしてパッケージングされたものを含む)の、凍結乾燥形態および/または再構成形態を含む。本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットを含む。これらのキットは、診断および/またはモニタリング目的(好ましくは、モニタリング) に使用され得る。これらのキットを使用する手順は、臨床検査室、実験研究室、医療実務者、または私的な個人によって行われ得る。本発明に含まれるキットは、適切な生物学的サンプル(例えば、生検片)中のAFP産生細胞の存在の検出を可能にする。本発明のキットは、適切なパッケージングにおける、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含む。キットは、必要に応じて、手順に有用なさらなる成分(緩衝液、発色試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、説明書、および解説情報(interpretive information)を含むが、これらに限定されない)を提供し得る。本発明のアデノウイルスベクターの調製本発明のアデノウイルスベクターは、当該分野で標準の組換え技術を使用して調製され得る。一般には、AFP-TREを目的のアデノウイルス遺伝子、好ましくは１つ以上の初期遺伝子(後期遺伝子も使用され得るが)の5'に挿入する。AFP-TRE は、オリゴヌクレオチド合成(配列が公知であれば)または組換え法(例えば、PCR および/または制限酵素)を使用して調製され得る。天然のアデノDNA配列中またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびPCRのような方法によって導入されたかのいずれかにおける簡便な制限部位は、AFP-TREの挿入部位を提供する。従って、AFP-TREをアニーリング(すなわち、挿入)するための簡便な制限酵素部位は、PCRのような標準的な組換え法を使用してAFP-TREの5'および3'末端上に操作され得る。本発明のアデノウイルスベクターを作製するために使用されるポリヌクレオチドは、化学合成法のような当該分野で標準方法を使用してか、組換え法によってか、そして/または生物学的供給源から所望の配列を得ることによって得られ得る。アデノウイルスベクターは、２つのプラスミド(一方のプラスミドはアデノウイルスの左腕領域を提供し、そして他方のプラスミドは右腕部分を提供する)を使用して簡便に調製される。ここで、２つのプラスミドは少なくとも約500ntの相同組換えの中間領域を共有する。この方法において、各プラスミドは、所望である場合、独立して操作され得、続いてコンピテント宿主へ同時トランスフェクトされ得、適切な遺伝子の補足、またはアデノウイルスの増殖のためのCEA-TRE からの転写開始のための適切な転写因子を提供する。プラスミドは一般に、カチオン性リポソームのような適切な形質導入手段を使用して、293細胞のような適切な宿主細胞に導入される。あるいは、アデノウイルスゲノムの右腕部分または左腕部分のインビトロ連結がまた使用され得、アデノウイルスゲノムの全ての複製必須部分を含む組換えアデノウイルス誘導体を構築し得る。Berknerら(1983)N ucleic Acid Research 11:6003-6020；Bridgeら(1989)J．Virol．63:631-638。便宜上、アデノウイルスの必要な部分を提供するプラスミドは入手可能である。プラスミドpXC.1(McKinnon（1982）Gene 19:33-42)は、Ad5の野生型左腕末端を含む。pBHG10(Bettら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:8802-8806；Micr obix Biosystems Inc.，Toronto)は、E3に欠失を有するAd5の右腕末端を提供する。E3における欠失は、ウイルスに、内因性エンハンサー/プロモーターを欠失することなく3-kb PB-TREを挿入する場所を提供する。Bettら(1994)。E3の遺伝子は、E4から反対の鎖(r鎖)に位置する。pBHG11は、さらにより長いE3欠失(さらに0.3kbが欠失されている)を提供する。Bettら(1994)。初期遺伝子の操作のために、ウイルスゲノムにおいて、Ad5E1Aの転写開始部位は498位であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位は560位である。この領域は、AFP-TREの挿入に使用され得る。制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって導入され得、ここで、使用されるプライマーは、Ad5ゲノムに制限され得るか、またはAd5ゲノムDNAを保有するプラスミドの一部に含まれ得る。例えば、pBR322が使用される場合、プライマーはpBR322骨格中のEcoRI部位を使用し得、そしてXbaI部位はAd5の1339位にある。領域の中心での重複プライマーが、独特な制限部位を生じる30配列の変化を導入する場合、PCRを２工程で実施することによって、その部位にAFP-TREの挿入を提供し得る。実施例１は、E 1AがAFP-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターのより詳細な説明を提供する。類似のストラテジーが、E1Bを調節するためのAFP-TREの挿入のために使用され得る。Ad5のE1Bプロモーターは、Sp1の単一な高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。この領域は、1636位〜1701位に及ぶ。この領域におけるAFP-TRE の挿入によって、E1B遺伝子の細胞特異的転写を提供し得る。E1Aを調節するAFP- TREで改変された左腕領域を、E1Bを調節するためのAFP-TREを導入するためのテンプレートとして使用することによって、得られたアデノウイルスベクターは、 E1AおよびE1Bの両方の発現のための細胞特異生転写因子に依存する。実施例１は、このような構築物が調製され得る方法のより詳細な説明を提供する。同様に、AFP-TREはE2遺伝子の上流に挿入され、その発現を細胞特異的にさせる。E2初期プロモーターは、27050-27150からのAd5にマッピングし、主要および少数の転写開始部位(後者はE2転写物の約５％を占める)、２つの非カチオン性TA TAボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位からなる。E2プロモーター構築の詳細な概説については、Swaminathanら、Curr．Topics in Micro．and Imm．(1995)199(パート3):177-194を参照のこと。 E2後期プロモーターは、対向鎖(counterstrand)によってコードされる遺伝子のコード配列と重複し、それゆえ、遺伝子操作の影響を受けない。しかし、E2h 初期プロモーターは、対向鎖における33kDaタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重複する。特に、SpeI制限部位(Ad5 27082位)は、上記の33kDaタンパク質の終止コドンの部分であり、そして上流の転写因子結合部位E2FおよびATFから、主要なE2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を簡便に分離する。それゆえ、SpeI末端を有するPB-TREの、1-鎖におけるSpeI部位への挿入は、Ad5 の内因性E2初期プロモーターを破壊させ、そしてE2転写物のAR制限された発現を可能にするべきである。 E4について、アデノウイルスゲノムの右腕部分を使用しなければならない。E4 転写開始部位は、35609位で優先的であり、TATAボックスは35638位であり、そしてORF1の第１のAUG/CTGは35532位である。Virtanenら、（1984）J．Virol．51:8 22-831。他の遺伝子について任意の上記のストラテジーを使用して、AFP-TREは、転写開始部位から上流に導入され得る。E4領域における変異体の構築物について、同時トランスフェクションおよび相同組換えは、これらのタンパク質の合成における欠損を補充するためにE4タンパク質をトランスで提供するW162細胞において行われる(Weinbergら、（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．80:5383-5386)。あるいは、これらの構築物は、インビトロ連結によって作製され得る。 ADP含有アデノウイルスベクターの調製は、上記で概説しそして当該分野において公知の原理に従う。ADPコード配列が導入される場合、それは、実施例５および６に記載されるような方法を使用して、組換え的に挿入され得る。あるいは、ADPコード配列を既に含むアデノウイルスベクターが、他の付加され、そして/ または操作されたエレメント(例えば、TREまたはトランスジーン)を含む組換えベクターを構築するために使用され得る。アデノウイルスポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子中にパッケージングする方法は、当該分野において公知であり、そして実施例に記載される。マスクされたアデノウイルスの調製方法は、マスキング剤および結合(共有または非共有)様式によって変化する。非共有結合的に結合したマスキング剤でマスクされたアデノウイルスは、十分にそして完全に、アデノウイルスおよびマスキング剤を混合することによって調製される。共有架橋は、架橋試薬に適切な条件下で反応成分を混合することによって達成される。化学的架橋プロトコールは当該分野で周知である。任意の所定の化学架橋剤のための正確な反応条件は、架橋剤の化学ならびにPEGおよびアデノウイルスに対する変更(あるとすれば)に従って、当業者に明らかなように、変更される。マスキング剤がPEGである場合、アデノウイルスのPEGに対するモル比は、好ましくは１：１×10⁶と１：１×10⁷ との間、より好ましくは約１：４×10⁶である。好ましい活性化PEGであるPEG-NH S-スクシンアミドについては、活性化PEGは、好ましくは架橋反応中0.5と５mMとの間、より好ましくは約2mMである。好ましくは架橋反応中のアデノウイルスは、10⁶と10¹²との間であり、より好ましくは約５×10⁹である。好ましい活性化PE Gの使用には、架橋反応のpHは好ましくは約７と９との間、より好ましくは約7.5 と８との間であり、そして反応は好ましくは10〜30分間、約４℃〜室温(約20℃) の範囲の温度で行われる。架橋反応に続いて、マスクされたアデノウイルスは反応成分から分離される。分離は当業者に公知の任意の方法によって達成され得、これには、クロマトグラフィー法(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー)、電気泳動法、またはフィルター法(例えば、透析、ダイアフィルトレーション、もしくは限外濾過)が含まれる。本発明のアデノウイルスベクターを使用する方法本発明のベクターは、種々の広範な目的のために使用され得、これは所望または意図される結果とともに変更される。従って、本発明は、上記のアデノウイルスベクターを使用する方法を包含する。１つの実施態様において、AFP-TREが機能することを許容する細胞(すなわち、標的細胞)、好ましくはAFPを発現する細胞において選択的な細胞障害性を与えるための方法が提供され、細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含する。細胞障害性は、当該分野における標準アッセイ(例えば、色素排除、³H-チミジン取込み、および/または溶解)を使用して測定され得る。別の実施態様において、AFP-TREが機能することを許容する細胞、好ましくはA FPを発現する哺乳動物細胞に特異的なアデノウイルスを増殖するための方法を提供する。これらの方法は、アデノウイルスベクターを細胞と組み合わせる工程( それによってアデノウイルスは増殖する)を包含する。別の実施態様は、細胞混合物中でAFPを発現する細胞のような、AFP-TREが機能することを許容する細胞を殺傷する方法を提供し、これは、細胞混合物を本発明のアデノウイルスベクターと組合わせる工程を包含する。細胞混合物は、一般には、正常細胞とアンドロゲンレセプターを産生するガン細胞との混合物であり、そしてインビボ混合物またはインビトロ混合物であり得る。本発明はまた、生物学的サンプル中でAFPを発現する細胞のような、AFP-TREが機能することを許容する細胞を検出するための方法を含む。これらの方法は、実験または臨床のいずれかの設定において、個体(すなわち、哺乳動物)の臨床的および/または生理学的状態のモニタリングに特に有用である。これらの方法について、生物学的サンプルの細胞はアデノウイルスベクターと接触され、そしてアデノウイルスベクターの複製が検出される。あるいは、サンプルは、レポーター遺伝子がAFP-TREの制御下にあるアデノウイルスと接触され得る。レポーター遺伝子の発現は、AFP産生細胞のような、AFP-TREが機能することを許容する細胞の存在を示す。あるいは、アデノウイルスは、条件的に細胞生存に必要とされる遺伝子がAFP-TREの制御下に配置されるように構築され得る。この遺伝子は、例えば、抗生物質耐性をコードし得る。アデノウイルスは生物学的サンプルに導入され、そして後にサンプルは抗生物質で処理される。抗生物質耐性を発現する生存細胞の存在は、AFP-TREが機能することを許容する細胞(例えば、AFPを産生する( か、または産生し得る)細胞)の存在を示す。適切な生物学的サンプルは、AFP産生細胞が存在すると予期され得るかまたは予期されるものである。一般には、哺乳動物において、適切な臨床サンプルは、AFPを産生するガン細胞(例えば、肝臓ガン細胞)が存在すると予測されるサンプルである。このような細胞は、例えば、針生検または他の外科的手順によって得られ得る。接触されるべき細胞は、選択性富化および/または可溶化のようなアッセイ条件を促進するために処理され得る。これらの方法において、AFP産生細胞は、当該分野において標準である、アデノウイルス増殖を検出するインビトロアッセイを使用して検出され得る。このような標準アッセイの例には、破裂(burst)アッセイ(これはウイルス産生を測定する)およびプラークアッセイ(これは細胞当たりの感染した粒子を測定する)が含まれるが、これらに限定されない。また、増殖は、特異的なアデノウイルスDN A複製を測定することによって検出され得、これもまた、標準アッセイである。本発明はまた、標的細胞の遺伝型を改変する方法を提供し、これは、標的細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程（ここで、アデノウイルスベクターは細胞に侵入する)を包含する。本発明はさらに、腫瘍細胞(好ましくは、AFPを発現する腫瘍細胞)増殖を抑制する方法を提供し、これは、腫瘍細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させ、その結果アデノウイルスベクターは腫瘍細胞に侵入し、そして腫瘍細胞への選択的な細胞障害性を示す工程を包含する。腫瘍細胞増殖は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得、これは、腫瘍サイズを測定する工程、³H-チミジン取込みアッセイを使用して腫瘍細胞が増殖するか否かを決定する工程、または腫瘍細胞を計数する工程を包含するが、これらに限定されない。「抑制した」腫瘍細胞増殖は、任意のまたは全ての以下の状況を意味する：遅鈍した腫瘍増殖、遅延した腫瘍増殖、および停止した腫瘍増殖、ならびに腫瘍萎縮。「抑制した」腫瘍増殖は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターとの接触(すなわち、アデノウイルスベクターによるトランスフェクション)なしの増殖と比較した場合、短縮した(curtail)増殖状態を示す。本発明はまた、個体における腫瘍細胞マーカーのレベルを低下させる方法を提供し、これは、本発明のアデノウイルスベクターを個体に投与する工程を包含する。ここで、アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞マーカーを産生する細胞に対して選択的に細胞障害性である。腫瘍細胞マーカーは、AFP、PSA、hK2、およびガン胎児性抗原を含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞マーカーのレベルを測定する方法は当業者に公知であり、そして酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA) のような、腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を使用する免疫学的アッセイを含むが、これに限定されない。一般には、生物学的サンプルは試験される個体から得られ、そしてELISAのような適切なアッセイを生物学的サンプルにおいて行う。本発明はまた、本明細書中に記載の有効量のアデノウイルスベクターが個体に投与される処置方法を提供する。アデノウイルスベクターを使用する処置は、肝臓ガンのような腫瘍を有する個体において示される。疾患の家族歴を有する個体および/または何からの他の様式(例えば、化学療法)で切除または処置された疾患を有したことのある個体のような、AFP関連疾患(ガンを含む)を発症する危険性があると考えられる個体もまた示される。本発明のアデノウイルスベクターの投与の適性の決定は、とりわけ、評価可能な血清学的徴候および組織生検の組織学的試験のような臨床パラメーターに依存する。一般には、アデノウイルスベクターを含む薬学的な組成物が投与される。薬学的な組成物は、上で記載される。投与されるべきアデノウイルスベクターの量は、投与経路、個体の状態、疾患の病原力の程度、使用される特定のPB-TRE、および特定のベクター構築物(すなわち、アデノウイルス遺伝子がPB-TREの制御下である)のようないくつかの因子に依存する。パッケージングされたアデノウイルスとして投与される場合、約10⁴〜約10¹⁴ 、好ましくは約10⁴〜約10¹²、より好ましくは約10⁴〜約10¹⁰である。ポリヌクレオチド構築物(すなわち、ウイルスとしてパッケージングされない)として投与される場合、約0.01μg〜約100μg、好ましくは0.1μg〜約500μg、より好ましくは約0.5μg〜約200μgが投与され得る。１つより多いアデノウイルスベクターが、同時または連続的のいずれかでが投与され得る。投与は、代表的には、定期的に行われるが、いかなる応答をもモニタリングする。投与は、例えば、腫瘍内、静脈内、または腹腔内で与えられ得る。本発明のアデノウイルスベクターは、単独、または所望の目的を促進する他の活性化剤(例えば、化学治療剤)と組合わせて使用され得る。以下の実施例は、例示の目的で、しかし本発明を制限することなく提供される。実施例実施例１：E1Aおよび/またはE1Bの転写を駆動する、AFP-TRE含有アデノウイルスベクターヒト胎児性腎臓細胞株293は、Ad5のE1AおよびE1B遺伝子を効率的に発現し、そしてアデノウイルスDNAでの高トランスフェクション効率を示す。これらの実験のために、293細胞を、１つの左端Ad5プラスミドおよび１つの右端Ad5プラスミドで同時トランスフェクトした。相同組換えにより、E1AおよびE1Bタンパク質をトランスで提供して、これらのタンパク質の合成における欠損を補償する、293 細胞における複製に必要な遺伝子エレメントを有するアデノウイルスを作成した。組み合わされるプラスミドを、その２つのプラスミドを組み合わせ、次いでプラスミドDNA溶液(血清も他の添加物も含まない、500μlの最少必須培地(MEM)中の10μgの各プラスミド)と200μlの同じ緩衝液中の４倍モル過剰のリポソームを混合することによって、カチオン性リポソーム(例えば、Lipofectin(DOTMA:DOPE^TM ，Life Technologies))を使用して293細胞に同時トランスフェクトした。次いで、DNA脂質複合体を細胞上に配置し、そして37℃、５％CO₂にて16時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を、10％ウシ胎児血清を含むMEMに交換し、細胞を37℃、５％CO₂にて10日間さらにインキュベートし、その間培地を２回交換した。この期間の終了時、細胞および培地をチューブに移し、３回凍結融解し、そして溶解物を使用して適切な希釈で293細胞に感染させて個々のウイルスをプラークとして検出した。得られたプラークを２回プラーク精製し、PCRおよび場合によってはDNA配列決定によりウイルスを所望の配列の存在について特徴づけした。さらなる実験のために、塩化セシウム勾配遠心分離により、大規模にウイルスを精製した。上記の手順を使用して、３つの複製コンピテント(replication competent)肝ガン細胞特異的アデノウイルスを作製した：E1A遺伝子の発現を駆動するAFP-TRE を含むCN732；E1AおよびE1B遺伝子の発現を駆動する２つのAFP-TREを含むCN733 ；およびE1B発現を駆動するAFP-TREを含むCN734。293細胞における相同組換えによりウイルスを作製し、そしてプラーク精製により２回クローニングした。挿入配列とAdゲノム配列との間の接合部のPCRおよび配列決定により、ゲノムDNAの構造を分析して、ウイルスが所望の構造を含んでいることを確認した。ウイルスの構造をまた、サザンブロットにより確認した。表１は、所望の特徴を有する組換えAd5を作製するために使用した、右端Adプラスミドおよび左端Adプラスミドの組合せを列挙する。表１．AFP-TREを含むアデノウイルスベクターウイルス構築プラスミドpXC.1を、Microbix Biosystems Inc.(Toronto)から購入した。pXC. 1はAd5配列を(ヌクレオチド)22から5790まで含む。本発明者らは、オリゴ特異的変異誘発および連結PCRにより、AgeI部位を、E1A開始コドン(Ad5 547)の12bp ５ '側に導入した。これを達成するために、pXC.1を以下のプライマーを使用してPC R増幅した： 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA(15.133A)(配列番号３)(EcoRI部位を含む)および 5'-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA(15.134B)(配列番号４)(AgeI部位を導入するための余分なＡを含む)。これは、pBR322骨格中のEcoRI部位からAd5 560までのセグメントを作製した。Ad 541からAdヌクレオチド1339のXbaI部位までの第２のセグメントを以下のプライマーを使用して増幅した： 5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG(15.133B)(配列番号５)(XbaI部位を含む)、および 5'-TCCGACACCGGTGACTGAAA(15.134A)(配列番号６)(AgeI部位を導入するための余分なＴを含む)。これら２つのPCR増幅DNAセグメントの混合物を、プライマー1 5.133Aおよび15.133Bと混合し、そして増幅して、pXC.1のEcoRI部位からXbaI部位までのDNAセグメントを作製した。このDNAセグメントは、Ad配列の最も左の13 17塩基を包含し、そしてAd 547にAgeI部位を含む。このDNAセグメントを使用して、pXC.1の対応するセグメントを置換してCN95を作製した。上記のようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により、Ad5 1682へのG残基の挿入によって、E1B開始部位の上流にEagI部位を作製した。EagI部位へのAFP-T REの挿入を単純化するために、CN95中の内因性EagI部位を、EagIでの消化、マングマメヌクレアーゼでの処理、および再連結により除去して、CN114を構築した。以下のプライマー： 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA(15.133A)(配列番号３)(EcoRI部位を含む)、および 5'-GCCCACGGCCGCATTATATAC(9.4)(配列番号７)(EagI部位を含む)、および 5'-GTATATAATGCGGCCGTGGGC(9.3)(配列番号８)(余分なＧおよびEagI部位を含む )、および 5'-CCAGAAAATCCAGCAGGTACC(24.020)(配列番号９)(KpnI部位を含む)を使用して、1682とAd5 2048のKpnI部位との間のセグメントを増幅した。プライマー15.133 Aおよび24.020での２つのセグメントの同時増幅により、Ad5 1682のEagI部位を有するフラグメントを作製した。このフラグメントを使用して、pXC.1中の対応するEcoRI/KpnI部位を置換し、CN124を構築した。 CN732の構築のために、ヒトAFPエンハンサードメインＡおよびＢ(AFPキャップ部位に対して領域-3954bp〜-3335bpに含まれる)を、ヒトゲノムDNA(Clontec，Pa l Alto，CA)から以下のプライマーを使用してPCR増幅した： AFPプロモーターを、以下のプライマーを使用して-163〜+34から増幅した：エンハンサーセグメントおよびプロモーターセグメントをアニールさせ、そしてプライマー39.055Bおよび39.055Jを用いる重複PCRを使用して、融合構築物を作製した。この最小エンハンサー/プロモーターフラグメントを、PinA1で消化し、そしてE1Aキャップ部位の５'側の操作したAgeI部位を使用してCN124と連結して、CN219を作製した。肝臓特異的ウイルスベクターCN732を、CN219およびBHG10 で293細胞を同時トランスフェクトすることによる相同組換えによって作製した。以下の２つのPCRプライマーを使用して、上記のエンハンサー/プロモーターエレメント(-3954〜-3335および-174〜+29)を増幅することによって、CN733を構築した： PCR産物をEagIで消化し、そして同様に切断したCN219に連結した。得られたプラスミドCN224は、２つの同一のAFP調節エレメントを含み、それぞれ、E1A遺伝子およびE1B遺伝子の発現を調整する。CN224およびBHG10を同時トランスフェクトすることによる、293細胞における相同組換えによって、CN733を作製した。 CN734を作製するために、プラスミドをPinA1で消化し、そしてベクターに再連結することによって、E1A遺伝子の発現を調節するAFP-TREをCN224から切り出した。得られたプラスミドCN234を293細胞においてBHG10と同時トランスフェクトして、CN734を作製した。インビトロでのウイルス増殖 CN732、CN733およびCN734の増殖選択性を、プラークアッセイにおいて分析した。そのアッセイでは、単一感染粒子が、複数回の感染および複製によって可視プラークを産生する。ウイルスストックを等しいpfu/mlにまで希釈し、次いでこれを使用して細胞の単層を１時間感染させた。次いで接種物を除去し、細胞を半固形寒天を含む培地で覆い、37℃にて10日間(表４については12日間)インキュベートした。次いで、単層中のプラークを計数し、種々の細胞についての感染ウイルスの力価を算出した。データを、293細胞についてのCN702(野生型)の力価に対して規格化した。４つの代表的なアッセイの結果を表２〜５に示す。表２．733(E1A/E1B)についてのプラークアッセイ表３．CN732、CN733、CN734プラークアッセイデータ表４．CN732、CN733、CN734プラーク形成効率表５．CN732、CN733およびCN734についてのプラークアッセイ野生型ウイルスCN702は、試験した各細胞株上にプラークを産生した。CN702が産生したプラークの数を、CN733によるプラーク形成を比較するためのベースラインとして使用した。 293細胞において、ウイルス増殖は、この細胞株におけるトランス補償に起因して、E1領域に対する変化に依存していないはずである。期待されるように、CN 702およびCN733は、共に、293細胞に対しで同様な数のプラークを産生した。表１のデータに関して、AFPポジティブ細胞株Hep3BおよびHepG2において、CN7 02は、293細胞に比して、同様な数のプラークを産生した。対照的に、CN733は、 AFPポジティブ細胞株において、293細胞においてより約４倍多いプラークを産生した。CN733による、AFPポジティブ株における正常を上回るレベルのプラーク形成は、AFPエンハンサーがこれらの細胞において活性であることを示す。 AFPネガティブ細胞株LNCaPおよびHBL100において、両ウイルスの増殖は縮小されたが、その程度は異なった。野生型CN702ウイルスは、LNCaP細胞において、29 3細胞で見られるレベルの約30％でプラークを産生した。HBL-100細胞において、 CN702は、293細胞において形成されるレベルの0.02％でプラークを形成した。CN 733プラーク形成は、CN702に比して、これらAFPネガティブ細胞株において、なおさらに減少した。LNCaP細胞において、CN733は、293細胞で見られるレベルの0 .1％でプラークを産生した。HBL100細胞において、CN733はプラークを全く産生しなかった。CN702と比較して、AFPネガティブ細胞株におけるCN733の増殖は、少なくとも100倍減少した。これは、好ましいことに、Ad40のE1Bプロモーターは、腸と結膜上皮組織との間の約100倍の差を特徴づけることが示された以前の結果(Baileyら、1994)、および、p53+細胞とp53-細胞との間でのAd増殖の100倍の差を特徴づけることが示されたE1B遺伝子の欠失変異体(Bischoffら、1996)に匹敵する。最後に、AFP+細胞タイプの力価とAFP-細胞タイプの力価との比較により、全体的な複製の優先性は、AFP-細胞における抑制された複製およびAFP+細胞における複製に起因して増強されるという重要な示唆が提供される。表３のデータに関して、いくつかの観察がなされ得る。第一に、CN732、CN733 およびCN734はすべて、CN702と同程度に効率的に、Huh-7細胞においてプラーク形成する。対照的に、２つのアデノウイルス(CN732およびCN733)についてのプラーク形成効率は、この実験に含まれた非AFP産生細胞株において劇的に減少する。非AFP産生性肝細胞ガン細胞株Sk-Hep-1において、CN732およびCN733は、試験した希釈率でプラークを産生しない。HeLa、MCF-7、およびDLD-1において、これら２つのウイルスについての結果は同様である。DLD-1におけるCN702の効率は、 CN733の効率を4000倍上回る。表４のデータ(力価が、293細胞における１×10⁷に対して規格化されている)に関して、CN732、CN733およびCN734は、HepG2細胞において野生型(CN702)と同様にプラーク形成した。しかし、これらのウイルスは、AFPを発現しない細胞株において、CN702と比較して貧弱にプラーク形成した。CN732およびCN733は、SK-He p-1、OVCAR-3およびHBL-100において、試験した希釈率でプラークを全く産生せず、したがって有意な力価差を示した。これは、少なくとも、野生型と、HBL-10 0およびOVCAE-3における10,000倍の差、そしてSK-Hep-1における1,000倍の差に相当する。CN734もまた、OVCAR-3細胞(25倍)およびHBL-100細胞(200倍)において、CN702より低い効率でプラーク形成した。表５のデータは、CN732、CN733およびCN734が、AFPを発現する細胞において、 CN702と同程度に効率的にプラーク形成することを示唆する。しかし、これらは、AFPを発現しない細胞株において、CN702と同程度に効率的にはプラーク形成しない。例えば、CN732もCN733も、HBL100細胞においてもOVCAR-3細胞においても、試験した希釈率でプラーク形成しなかった。CN734のプラーク形成の差は、試験した細胞株において、CN732やCN733程顕著ではなかった。これは、DU145、HBL 100、およびOVCAR-3において、野生型より、それぞれ13倍、40倍、および67倍低い効率でプラーク形成した。プラークアッセイデータにより、ヒトアデノウイルスが、AFP-TREを使用して改変されて、AFP産生細胞、特に、AFP産生腫瘍細胞(例えば、肝ガン細胞)について選択的増殖特性を有するウイルスを開発し得ることが示される。 E1A発現のウェスタン分析次の実験において、本発明者らは、CN733感染細胞におけるE1Aタンパク質の蓄積に対するAFP-TREの効果を検査した。本発明者らは、CN733に組み込んだAFP調節領域の１つが、E1A遺伝子を調節している場合、感染細胞におけるE1Aタンパク質のレベルもまた影響されるはずであると推論した。ウェスタンブロットを実施してこの仮説を検定した。 CN733のE1A蓄積を、Huh-7細胞、SK-Hep-1細胞、およびDLD-1細胞において、評価した。単層に、CN702またはCN733のいずれかを、10のMOIで感染させ、そして感染後種々の時点で回収した。サンプルを10％アクリルイミドゲルを通じて電気泳動し、そして電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。推奨プロトコルを使用して、ECL Western Detectionシステム(Amersham，Arlington Heights，IL) を使用することによって、E1Aタンパク質を検出した。使用した一次抗体は、ウサギ抗Ad2 E1A抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)であった。結果を図6(A)および6(B)に示す。 E1Aは、CN702およびCN733感染Huh-7細胞において迅速に蓄積した。高レベルの E1Aを、CN702感染Dld-1細胞においても検出した。しかし、CN733感染Dld-1細胞においてはE1Aタンパク質をほとんど検出しなかった。この結果は非常に興味深い。なぜなら、これは、非AFP産生細胞株におけるCN733の貧弱なプラーク形成効率が、その限定されたE1A発現に起因し得ることを示唆するからである。これらのデータは、AFP-TREが、非許容細胞タイプにおけるCN733の妥協した複製に影響するという仮説と一致する。非AFP産生細胞としてSk-Hep-1細胞を使用して実験を繰り返した。感染の24時間後にデータを得た。結果を図6(C)に示す。この実験の結論は、E1A発現は、AFP -TREにより緊密に調節されるという、前の実験と同じである。 CN733の増殖 AFP産生細胞および非AFP産生細胞におけるCN733の増殖を評価した。Huh-7、Sk -Hep-1、およびDld-1細胞の単層を、CN702またはCN733のいずれかを用いて10のM OIで感染させた。感染後の種々の時間で、２連のサンプルを採取し、３回凍結融解し、そして293細胞上で力価測定して、総ウイルス収率を決定した。CN702およびCN733についてのウイルス収率曲線を、図７(A)〜(C)にプロットする。 CN702およびCN733は、Huh-7細胞において効率的に増殖した。Huh-7細胞は、類似する量の感染性CN702およびCN733を産生した。対照的に、CN733の増殖は、SK- Hep-1細胞において非常に制限された。実験の終わりでのCN702の力価は、CN733 の力価よりも約1000倍大きい。結果は、Dld-1細胞において同様であった。増殖実験をまた、HepG2細胞において、CN732、CN733、およびCN734の増殖を比較するために行った。HepG2細胞の単層を、２の感染多重度（MOI）で感染させ、そして感染後の種々の時間で採取した。サンプルを293細胞上で力価測定して、最終ウイルス収率を決定した。結果を図８(A)〜(C)に示す。データは、AFP-TRE を含有するアデノウイルスが、このガン細胞株において効率的に増殖することを示す。CN732、CN733、およびCN734は、各々、感染後36時間でCN702の力価と同様の高い最終力価に達する。別の実験において、増殖を、実験開始の３日前にドナー（32歳の黒人男性）から単離した初代肝細胞（hNhep）において評価した。細胞の単層を、２のMOIでウイルスにより感染させ、感染後種々の時間に採取し、そして293単層上で力価測定した。結果を、図９(A)〜(C)に示す。データは、CN732およびCN733が、hNhep においてCN702ほど効率的に増殖しないことを示唆する。CN732の増殖は、CN702 に比較して24時間遅延する。感染後36時間で、CN733よりも10倍を超えて多い感染性CN702が存在する。CN733の増殖は、36時間遅延する。感染後36時間で、CN73 3よりも、約1000倍多い感染性CN702が存在する。CN734は、CN702と同様に増殖する。データはまた、CN733が最も制限的な表現型を有し、次いでCN732およびCN73 4であることを示唆する。まとめると、これらの結果はまた、E1A遺伝子のAFP-TR Eが挿入された上流が、制限宿主範囲において、E1B領域のAFP-TREで操作された上流よりも有効であり得ることを示す。２つのAFP-TREの存在は、さらにより有効である。結論として、上記の実験は、アデノウイルスベクター宿主範囲をAFP産生細胞に制限することが可能であることを示す。プラークアッセイおよび増殖アッセイによって示されるように、AFP-TREを含有するアデノウイルスベクターは、HepG2 およびHuh-7細胞において効率的に増殖するが、非AFP産生細胞においてはあまり増殖しない。実施例２：プラスミドCN236での一過性発現アッセイ CN236における800bp AFP-TREのルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動する能力を、一過性発現アッセイにおいて決定した。AFPを産生しないChang肝臓細胞、およびAFPを産生するHep3B細胞を、カチオン性脂質（すなわち、リポフェクチン）法を使用して、CN236またはpGL2Lucで形質転換した。pGL2-Basic（Promega）は、遺伝子が挿入されたバックボーンのみを含み、AFP調節遺伝子を含まない構築物であり、従ってアッセイのネガティブコントロール構築物である。プラスミドベクター、pGL2-Luc(Promega)は、ポジティブコントロールとして作用した。細胞を10％仔ウシ血清（FCS）を補充したDMEMにおいて培養し、そして48時間後、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性を、キットの中の製造業者（Packard Instrument）の指示に従って測定し、そしてルミノメーター（luminometer）を使用して定量した。以下の表６に示す結果は、相対光単位（r elative light unit）(RLU)によって表されている。表６これらのデータは、DNAのフラグメントが、AFPポジティブ肝臓細胞（Hep3B）において活性であるが、AFPネガティブ肝臓細胞（Chang肝臓）においては活性でないことを示す。実施例３：HuH7腫瘍異種移植片上でのアデノウイルスベクターの細胞傷害性能力の試験 AFP特異的アデノウイルスベクターの開発における特に有用な目的は、AFP産生腫瘍（例えば、肝細胞ガン）を有する患者を処置することである。可能性（feas ibility）の初期指標は、ベクターを、Balb/c nu/nuマウスで皮下で増殖したHuH 7腫瘍異種移植片に対する細胞傷害活性について試験することである。マウスに、 PBS中の１×10⁷ HuH7ガン細胞でs.c.注射を与える。腫瘍細胞は、標準的なアッセイ（例えば、ELISA）を使用することによって、血清中でAFPについてアッセイすることによって、AFP産生について試験され得る。この実験について、試験アデノウイルスベクターを、0.1mlのPBS＋10％グリセロール中で約10⁸pfuのウイルス（パッケージングされたウイルスとして投与される場合）の直接的腫瘍内、静脈内、もしくは腹腔内注射によって、または尾部静脈を介して静脈内で、マウスに導入する。ポリヌクレオチド構築物として投与される場合（すなわち、ウイルスにパッケージングされていない場合）、0.1μg〜 100μgまたはそれを超えて投与され得る。腫瘍サイズを測定し、そしていくつかの実験において、血液サンプルが毎週採取され得る。アデノウイルスベクター（例えば、CN733）の腫瘍サイズおよび血清AFPレベルに対する腫瘍内注射の効果は、偽処置と比較する。本明細書中に記載されるウイルスに基づく治療が、傷害内に与えられる（すなわち、直接注入）ことは非常に可能であるが、アデノウイルスベクターの静脈内（IV）投与が腫瘍増殖に影響を与え得るか否かを決定することもまた望ましい。その場合、ウイルスが、直接注入が利用できない転移腫瘍沈着を処置するために使用され得ることが考えられる。この実験のために、HuH7腫瘍を保有する３〜５匹のマウスの群を、10⁸pfuのアデノウイルスベクター（例えば、CN733）またはネガティブコントロールとしてのウイルスを運ぶために使用する緩衝液を、尾静脈注射によって接種する。アデノウイルスベクターのIV注射の腫瘍サイズおよび AFPレベルに対する効果を、偽処置と比較する。実施例４：アデノウイルスベクターCN733のHepG2腫瘍異種移植片に対する細胞傷害性能力の試験 HCCマウス異種移植片モデルを使用して、肝臓ガンのための治療用アデノウイルスとしてのCN733の潜在性を評価した。AFP産生HCC細胞株HepG2を、Balb/c nu/ nuマウスの右脇腹に皮下注射した。数週間経過した後、各々を、PBS中の1.5×10¹¹ のCN733の粒子、グリセロール、または緩衝液単独のいずれかの腫瘍内注射で処置した。HepG2腫瘍を保有する11匹のマウスを、６匹をCN733で、そして５匹を緩衝液で処置した。腫瘍を、実験が完了するまで毎週測定した。腫瘍容量を、腫瘍の長さにその幅を掛け、そしてその積を２で割ることによって計算した。図10 (A)は、各処置群の対時間の平均腫瘍容量のグラフである。６週目に、緩衝液でチャレンジしたHepG2腫瘍は、その元々のサイズの５倍を超えて増殖した。対照的に、CN733処置マウスにおける腫瘍増殖は減少した。ある腫瘍は、その最大容量の３％にまで減少した。これらのデータは、CN733が腫瘍を侵襲し、そして細胞傷害性を送達したことを示唆する。腫瘍増殖をモニタリングすることに加えて、本発明者らは、血清サンプルを収集し、そしてAFPレベルをアッセイした。結果を図11に示す。データは、血清AFP レベルが、CN733を与えたマウスにおいて、緩衝液を与えたコントロールマウスよりもゆっくりと上昇することを示唆する。別の実験では、異なる投与レジメの抗腫瘍活性をCN733について比較した。動物を、緩衝液（ｎ＝８、容量＝919mm³）または1.5×10¹¹粒子のCN733（ｎ＝８、容量＝944mm³）のいずれかの単回の壁内（intramuoral）投与で処置した。第３の動物群を、1.5×10¹¹粒子のCN733の日用量で５日間連続して処置した（ｎ＝８、容量＝867mm³）。大きな全身的なウイルス負荷量にもかかわらず、マウスは、毒性の明らかな徴候を示さなかった。腫瘍を、注射後４週間の間、１週間毎に外部カリパスにより測定した。単回用量のCN733および緩衝液で処置した群由来の動物を、腫瘍負荷量が過剰であるので、処置の４週間後に屠殺した。５用量のCN 733で処置した群由来の全ての動物は、研究終了まで生存していた。大きな全身的なウイルス負荷量にもかかわらず、これらの動物は、処置に関連する毒性の明らかな徴候を示さなかった。結果を図10(B)に示す。平均して、緩衝液で処置した腫瘍は、処置の４週間後にその最初の容量の３倍に増大した。単回用量のCN73 3で処置した腫瘍は、その最初の容量のほぼ４倍に増大した。対照的に、５用量のCN733で処置した腫瘍は、同じ容量のままであった。８つの腫瘍のうちの５つ（63％）は、処置に応答した。１つの動物は、研究終了まで触知可能な腫瘍を有さなかった。スチューデントＴ検定を用いる統計学的分析は、どの時点でも、緩衝液で処置した動物と、１用量のCN733で処置した動物との間に有意差が存在しなかったことを示唆する（p>0.5）。しかし、緩衝液で処置した動物と、５用量のCN733で処置した動物との間には、注射後２週間に始まって（ｐ＝0.045）、そして４週間を通して継続する（ｐ＝0.034）、有意差が存在した。このデータは、CN733が、HepG2ヌードマウス異種移植片において有意な抗腫瘍活性を示すことを示唆する。1.5×10¹¹粒子の用量で毎日連続して５日間投与したCN733は、いくつかの動物において腫瘍後退を生じ得る。しかし、単回用量は、腫瘍殺傷を生じるには充分ではなかった。第１の実験では、腫瘍は、単回用量のCN733に応答したが、第２のものには応答しないようであった。本発明者らは、実験毎に腫瘍の表現型（増殖特性および AFP発現を含む）にしばしば変動が存在することに注目する。結論として、インビボでの実験は、CN733が有意な腫瘍殺傷を大きな肝細胞ガン異種移植片において生じることを示唆する。腫瘍内に投与した５用量のウイルスは、注射28日後に、８つの動物のうち４つにおいて後退を誘導し、そして１つの動物を治癒させた。平均して、緩衝液で処置した腫瘍は３倍になったが、CN73 3で処置した腫瘍は同じままであった。実施例５：アデノウイルス死タンパク質（ADP）のコード領域を含むアデノウイルスベクターの構築 AFP特異的ウイルスベクターCN733（上記の実施例１に記載される）では、AFP- TREをE1領域に適応させるためにE3領域に欠失を作製した。Ad2由来のADPコード配列を、以下の通りにAd5のE3領域に再導入した。 ADPカセットを、オーバーラップPCRを用いて構築した。いくつかの後期遺伝子の正確な発現のために重要な配列であるＹリーダーを、以下のプライマーを用いてPCR増幅した： ADPコード領域を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した：２つのフラグメントをアニーリングさせ、そしてオーバーラップした産物を、プライマー37.124.1および37.124.4を用いてPCR増幅した。産物の末端を、Kleno wフラグメントを用いて研磨し、そしてBamHIで切断したpGEM-72(+)（CN241；Pro mega，Madison，WI）に連結させた。ADPカセットを、CN241をPac1制限エンドヌクレアーゼで消化することにより切り出し、そして２つのベクターCN247およびC N248に連結して、それぞれプラスミドCN252およびCN270を生じた。CN247は、E3 領域において固有のPacI部位を含み、そして以下の通り構築した。全長Ad5ゲノムを含むプラスミドTG3602（Transgene，France）を、BamHIで消化し、そして再連結してCN221を生じた。このプラスミドのバックボーン（Ad5配列の外側）は、さらなる操作を可能にするためには除去することが必要なPacI部位を含んでいた。これを、CN221をPacIで消化し、そして末端をT4 DNAポリメラーゼで研磨してC N246を得ることによりもたらされた。CN246を、AscIおよびAvrIIで消化し（てインタクトなE3領域を除去し）た。このフラグメントを、BHG11由来の同様に切断したフラグメントに置換した。得られたプラスミドCN247は、欠失したE3領域およびADPカセットフラグメント（上記）の挿入に適切なPacI部位を含んでいた。C N247とADPカセットとの連結により、CN252を生じた。 CN248（E4領域において欠失／置換もまた含むAdへのADPカセットの導入を可能にする構築物）を以下の通りに作製した。E4領域を、CN108をAvrIIおよびAfIII で消化することにより欠失させた。CN108は、E3領域（BHG10由来）において独特のEcoRI部位由来の右側の末端Ad5配列を含む構築物である。ウイルス複製に必要な唯一のE4 ORFであるORF6を、ORFを以下のプライマーでPCR増幅することにより再導入した：得られたプラスミドは、CN203である。CN203をEcoRIで消化し、そしてシャトルプラスミドであるCN209に連結し、CN208を作製した。最終クローニング工程では、CN208を、AscIおよびAvrIIで消化し、そしてADPカセットを有する同様に切断したE4欠失／置換物に連結した。 CN252およびCN270の両方は、E3欠失を含む。さらに、CN270は、以前に記載したようにE4領域におけるいくつかの配列を欠く。アデノウイルスベクターを、(1 )BamHIで消化した、適切に調製されたウイルスDNAと、(2)これもBamHIで消化したCN252またはCN257とのインビトロ連結を介して入手する。連結産物を用いて、 293細胞をトランスフェクトする。プラークアッセイを、実施例１に記載の通りに実施する。実施例６：アデノウイルス死タンパク質遺伝子を含むE3欠失アデノウイルスCN 751の特徴付けアデノウイルス死タンパク質変異体CN751を構築して、このような構築物が、細胞傷害性についてさらに有効であり得るか否かを試験した。感染後期において高レベルで発現される11.6kDのAsnグリコシル化内在性膜ペプチドであるアデノウイルス死タンパク質（ADP）は、感染細胞の核膜に移動し、そして宿主の効率的な溶解に影響を与える。アデノウイルス５（Ad5）E3領域は、adp遺伝子を発現する。 CN751の構築 CN751を、２つの部分に分けて構築した。第一に、21562bpでのBamHI部位から3 ’側にAd5配列を含むE3欠失プラットフォームプラスミドを産生した。このプラスミドのE3領域の残りの部分中にAd2 adpを操作して、CN252を産生した（このクローニングは先に記載している）。第二の部分を構築するために、CN751に必要な5'Ad5配列を、精製したCN702 DNAをEcoRIで消化する工程、およびゲル抽出によって左腕のフラグメントを単離する工程により得た。CN252をEcoRIで消化した後、CN702の左腕のフラグメントおよびCN252を連結した。293細胞を、リポフエクショントランスフェクションによってこの連結混合物でトランスフェクトし、そして37℃でインキュベートした。10日後、細胞を収集し、冷凍-解凍を３回繰り返し、そして上清を293単層上にプラークした。個々のプラークを採取し、そして293細胞の単層を感染させ、試験するに十分なウイルスを増殖させるために使用した。数日後、プレート溶解物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイを使用してスクリーニングして、候補ウイルスを検出した。陽性を示すプラークのうちの一つを、CN751と命名した。 CN751の構造的特徴付け CN751の構造を、２つの方法により確認した。第一に、プライマー37.124.1（5 ’GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG Ad2 28287bp；配列番号16）、および37.124. 4(5’GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGCTGC Ad2 29872bp；配列番号19）を使用して、 PCRにより候補ウイルスをスクリーニングし、adpカセットの存在を検出した。CN 751は、予測される産物(1065bp)と一致する伸長フラグメントを産生した。第二に、CN751をサザンブロットにより分析した。ウイルスDNAを精製し、PacI、SacI およびAccI/XhoIで消化し、そしてADPコード領域に相同な配列でプローブした。 CN751の構造は予測したパターンと合致した。 CN751のインビトロでの特徴付け CN751の細胞傷害性およびウイルス収量を試験するために２つの実験を実施した。第一の研究において、数日にわたり上清中のサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の蓄積を測定することにより、LNCaP細胞におけるCN751の細胞傷害性を評価した。細胞外LDHのレベルは、細胞溶解の程度と相関する。健常な細胞は、酵素を（もしあったとしても）非常にわずかしか放出しないが、死細胞は大量に放出する。LDHは、単純なプロトコルによって容易に検出され得る安定なタンパク質であるので、マーカーとして選択された。細胞死を引き起こすCN 751の能力を、ADP遺伝子を欠くベクターであるCN702、およびADP遺伝子を含むベクターであるRec700の能力と比較した。 LNCaP細胞の単層を、１のMOIで、CN702、Rec700（adp＋コントロール）、またはCN751のいずれかで感染させ、次いで96ウェル皿に播種した。サンプルを感染後１日目から５日目まで、１日に１度収集し、そしてPromegaのCytotox 96キットを使用してスコア付けした。このアッセイは、テトラゾリウム塩を、490nmでプレートリーダー内で決定され得る赤色のホルマザン産物に変換する共役酵素反応を使用する。サンプルの吸光度が、感染細胞から放出されるLDHのレベルに対応するので、サンプルの吸光度が時間とともにどのように変化するかのプロットは、試験したウイルスが、細胞溶解をどれほど効率的に誘導するかを説明する（図12）。各データ点は、16の別々のサンプルの平均を示す。結果は、CN751が、adp-コントロールCN702よりも高い効率で、そしてadp＋コントロールRec700と同様に細胞を殺傷することを示唆する。CN751で感染したウェル中において、上清中のLDHの濃度は、２日目から急激に増加し、そして４日目に最大に達する。対照的に、CN702 感染細胞の上清中のLDH濃度は、２日目にゆるやかに上昇し始め、そして実験終了まで継続する。意義深いことに、３日目でのCN751感染細胞から放出されるLDH の量は、CN702感染細胞から放出される量の２倍である。このデータは、ADP遺伝子を有するアデノベクターが、ADP遺伝子を欠くアデノベクターよりも高い効率で細胞を殺傷することを実証する。 Adベクターは、細胞を効率よく殺傷することだけが重要なのではなく、Adベクターはまた、他のガン細胞に感染し得る子孫を散布(shed)し得なくてはならない。大量のウイルスを散布し得るウイルスベクターは、少量のみを散布するウイルスベクターよりも優れた治療剤であり得る。CN751が感染細胞からの子孫の効率的放出を誘導し得るか否かを評価するために、ウイルス収量アッセイを行った。 A549細胞を５のMOIで感染させた。感染後の種々の時間に上清を収集し、そしてウイルス収量を決定するために、293細胞上で力価測定を行った(図13)。データは、CN751で感染した細胞はCN702で感染した細胞より高い効率でウイルスを散布することを示唆する。感染の48時間後、CN751感染細胞は、CN702感染細胞より10 倍多いウイルスを放出した。感染の72時間後では、CN751感染細胞は、40倍多いウイルスを放出した。要約すると、ウイルス収量のデータは、ADP遺伝子を有するアデノベクターが、より多くのウイルスを放出することを実証する。 CN751のインビボでの特徴付け LNCaPヌードマウス異種移植片を、ADP遺伝子を含むベクターであるCN751、または遺伝子を欠損するベクターであるCN702のいずれかの、単回腫瘍内用量（１ ×10⁴粒子/mm³腫瘍）で攻撃した。腫瘍の第３の群を、緩衝液のみで処置した。腫瘍を６週間、毎週モニターし、そしてその相対容量を時間に対してグラフ化した。結果を図14に示す。誤差のバーは、各サンプル群の標準誤差を示す。CN751 処置動物（ｎ＝14）の開始時平均腫瘍容量は320mm³であり、CN702処置動物（ｎ＝14）では322mm³であり、そして緩衝液処置動物（ｎ＝８）では343mm³であった。データは、CN751がCN702より高い効率で腫瘍細胞を殺傷することを示唆する。平均して、CN751で攻撃された腫瘍は、実験過程を通して同じサイズのままであったが、14個の腫瘍の内の９個(64％)が後退した。CN702処置動物の腫瘍はサイズが２倍になった。緩衝液処置腫瘍は、開始時容量のほぼ５倍に増殖した。スチューデントＴ検定は、CN751処置腫瘍とCN702処置腫瘍との間の腫瘍サイズの差異が、９日目（ｐ＝0.016）から実験終了（ｐ＝0.003）まで、統計的に有意であったことを示す。実施例７：共有結合的にPEG化したアデノウイルスの調製 PEGでアデノウイルスを複合体化することによるアデノウイルスの表面キャプシドを改変するための一連の実験を行った。アデノウイルス表面のPEG複合体化マスキングの目的は以下の通りである：1)循環内のアデノウイルス中和抗体またはオプソニン(opsinin)、および2)身体内の非特異的クリアランス機構（すなわち、マクロファージ等）の減少によるアデノウイルス粒子の体循環時間の増加。野生型アデノウイルスCN706の表面キャプシドを、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルコハク酸アミド(NHS)を使用して、ヘキソンおよび線維タンパク質へのPEGの共有結合を介して改変した。PEG（Shearwater Polymers，Inc.）は、5000Daという名目上の分子量を有した。活性化PEG（約２mM）を、tris-HCl緩衝液中で５×1 0⁹粒子/mlアデノウイルスと反応させた（ウイルス粒子のPEGに対するおよそのモル比は、1:4×10⁵であった）。pH、温度、および反応時間の種々の組み合わせを使用した。反応後、未反応の活性化PEG、未反応のアデノウイルス、およびPEG化した(pegylated)アデノウイルスを、pH8.0の50mM tris中で０から1.5MのNaCl勾配をかけて、Q Sepharose XL(Pharmacia)での陰イオン性イオン交換クロマトグラフィーにより分離した。勾配を、10カラム容量にわたってかけた。 PEG-CN706の特徴付け CN706のPEG化をSDS-PAGEにより検証した。図16は、CN706のPEG化およびPEG化タンパク質の移動度の変化を図示する。レーン１および２は、非PEG化CN706（コントロール）であり、レーン３〜６はいくつかのpHおよび温度条件下でのPEG化C N706である。レーン３〜６は、CN706のヘキソンタンパク質（PEG化ヘキソンの可能性が最も高い）の上部の第二バンドの出現、および線維タンパク質バンドの欠失を示す。PEG-ヘキソンタンパク質に対応するバンドを除いては、ウイルスと関連するさらなるバンドは存在しないので、PEG化線維タンパク質は、SDSゲル上の非PEG化タンパク質の内の一つの下にあると想定される。図17は、CN706の表面特性における変化を示すイオン交換クロマトグラムである。CN706のPEG化は、ウイルスを捕獲するために使用されるＱ Sepharose樹脂からのより早い溶出を生じる。この結果は、PECがウイルスの電荷を外見上はさらに中性にし、従ってイオン交換マトリクスに対する結合能力を低下させることに起因する可能性が最も高い。CN706のPEG化が異なる百分率で起こるために、ウイルスのクロマトグラムの幅が広がることが予測される。 PEG化CN706の感染性を、293細胞上のインビトロプラークアッセイにおいて評価した。表７は、CN706と比較した場合、PEG-CN706のプラーク形成効率が５分の１〜10分の１に低下することを示す。これは、PEG化がウイルス細胞をマスクし、ウイルス粒子の認識およびエンドサイトーシスを減少させることに起因する可能性が最も高い。表７：CN706およびPEG-CN706のプラーク形成効率の比較。前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および実施例によりいくぶん詳細に説明されたが、特定の変更および改変が実施され得ることは当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、添付の請求の範囲により記載される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヘンダーソン，ダニエルアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 94306, パロアルト，マタデロアベニュー 955 (72)発明者シュア，エリックアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 95014, クパティーノ，スティーブンスクリークブールバードナンバー305 20350

Claims

【特許請求の範囲】１．α−フェトプロテイン転写調節エレメント（AFP-TRE）の転写制御下のアデノウイルス遺伝子を含む、アデノウイルスベクター。２．前記アデノウイルス遺伝子がウイルス複製に必須である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。３．前記アデノウイルス遺伝子が初期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。４．前記アデノウイルス遺伝子が後期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。５．前記アデノウイルス初期遺伝子がE1Aである、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。６．前記アデノウイルス初期遺伝子がE1Bである、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。７．前記アデノウイルス初期遺伝子がE4である、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。８．前記アデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子(ADP)である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。９．前記AFP-TREがAPF遺伝子に由来するエンハンサーを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１０．前記エンハンサーが配列番号１の約１から約300のヌクレオチドを含む、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。１１．前記AFP-TREが配列番号１の約300から約600のヌクレオチドを含む、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。１２．前記AFP-TREが配列番号１の約１から約600のヌクレオチドを含む、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。１３．前記AFP-TREがAFP遺伝子に由来するプロモーターを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１４．前記AFP-TREが配列番号１の約600から約827のヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のアデノウイルスベクター。１５．前記AFP-TREがAFPプロモーターおよびAFPエンハンサーを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１６．前記AFP-TREが配列番号１を含む、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。１７．前記AFP-TREが配列番号２を含む、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。１８．請求項１に記載のアデノウイルスを含む、組成物。１９．薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。２０．第２のAFP-TREの転写制御下の少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２１．前記AFP-TREの転写制御下の遺伝子が両方とも初期遺伝子である、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２２．前記AFP-TREの転写制御下の遺伝子がE1AおよびE1Bである、請求項２１に記載のアデノウイルスベクター。２３．第３のAFP-TREの転写制御下のさらなるアデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２４．前記転写制御下のアデノウイルス遺伝子がE1A、E1B、およびE4である、請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。２５．請求項２１に記載のアデノウイルスを含む、組成物。２６．薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。２７．アデノウイルス死タンパク質（ADP）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、天然に存在しないアデノウイルスベクター。２８．前記ADPポリペプチドが配列番号23に記載の配列である、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。２９．前記ADPポリペプチドが配列番号23である、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。３０．前記ポリヌクレオチドが配列番号22に含まれる、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。３１．前記ポリヌクレオチドが配列番号22である、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。３２．ADPをコードする前記ポリヌクレオチドが、細胞特異的転写調節エレメントの転写制御下にある、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。３３．前記細胞特異的転写エレメントが前立腺細胞特異的である、請求項３２に記載のアデノウイルスベクター。３４．前記前立腺特異的TREが、前立腺特異的抗原遺伝子、ヒトカリクレイン遺伝子、またはプロバシン遺伝子由来である、請求項３３に記載のアデノウイルスベクター。３５．前記細胞特異的転写エレメントがAFP-TREである、請求項３２に記載のアデノウイルスベクター。３６．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。３７．請求項２０に記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。３８．請求項２４に記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。３９．請求項２７に記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。４０．AFP-TREが機能するのを可能にする細胞に特異的なアデノウイルスを増殖する方法であって、該方法は、請求項１に記載のアデノウイルスを、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞と合わせ、それにより該アデノウイルスが増殖される工程を包含する、方法。４１．AFP-TREが機能するのを可能にする細胞に特異的なアデノウイルスを増殖する方法であって、該方法は、請求項２０に記載のアデノウイルスを、AFP-TRE が機能するのを可能にする細胞と合わせ、それにより該アデノウイルスが増殖される工程を包含する、方法。４２．標的細胞の遺伝子型を改変するための方法であって、該方法は、細胞を請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させて、該細胞内への該ベクターの侵入を可能にする工程を包含する、方法。４３．標的細胞の遺伝子型を改変するための方法であって、該方法は、細胞を請求項２０に記載のアデノウイルスベクターと接触させて、該細胞内への該ベクターの侵入を可能にする工程を包含する、方法。４４．選択的細胞傷害性を標的細胞に与えるための方法であって、該方法は、AF P-TREが機能するのを可能にする細胞を、請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させ、それにより該ベクターが該細胞に侵入する工程を包含する、方法。４５．選択的細胞傷害性を標的細胞に与えるための方法であって、該方法は、AF P-TREが機能するのを可能にする細胞を、請求項２０に記載のアデノウイルスベクターと接触させ、それにより該ベクターが該細胞に侵入する工程を包含する、方法。４６．生物学的サンプル中においてAFP-TREが機能するのを可能にする細胞を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：該細胞においてAFP-TRE媒介遺伝子発現に適切な条件下で、生物学的サンプルを請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程；および AFP-TREが該生物学的サンプル中で遺伝子発現を媒介するか否かを決定する工程、を包含し、ここでAFP-TRE媒介遺伝子発現は、AFP-TREが機能するのを可能にする細胞の存在を示す、方法。４７．AFP発現腫瘍を有する個体における腫瘍増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を請求項２に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含し、ここで、該アデノウイルスベクターが、該腫瘍細胞をトランスフェクトし、そして複製する、方法。４８．AFP産生性脛瘍を有する個体におけるガンを処置する方法であって、請求項２に記載のアデノウイルスベクターの有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。４９．請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスであって、ここで該アデノウイルスはマスキング剤と複合体化される、アデノウイルス。５０．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項４９に記載のアデノウイルス。５１．前記PEGが約2500と約30,000との間の分子量のPEGである、請求項５０に記載のアデノウイルス。５２．前記PEGが約3000と約20,000との間の分子量のPEGである、請求項５１に記載のアデノウイルス。５３．前記PEGが約5000と約10,000との間の分子量のPEGである、請求項５２に記載のアデノウイルス。５４．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合している、請求項５０に記載のアデノウイルス。５５．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合している、請求項５０に記載のアデノウイルス。５６．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合している、請求項５４に記載のアデノウイルス。５７．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項５６に記載のアデノウイルス。５８．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項５７に記載のアデノウイルス。５９．マスクされたアデノウイルスを作製する方法であって、マスキング剤をアデノウイルスに共有結合させ、ここで該マスキング剤は約2500と約20,000との間の分子量を有し、それによりマスクされたアデノウイルスを産生する工程を包含する、方法。６０．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項５９に記載の方法。６１．マスキング剤と複合体化されたアデノウイルス。６２．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項６１に記載のアデノウイルス。６３．前記PEGが約2500と約30,000との間の分子量のPEGである、請求項６２に記載のアデノウイルス。６４．前記PEGが約3000と約20,000との間の分子量のPEGである、請求項６３に記載のアデノウイルス。６５．前記PEGが約5000と約10,000との間の分子量のPEGである、請求項６４に記載のアデノウイルス。６６．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合している、請求項６２に記載のアデノウイルス。６７．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合している、請求項６２に記載のアデノウイルス。６８．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合している、請求項６６に記載のアデノウイルス。６９．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項６８に記載のアデノウイルス。７０．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項６９に記載のアデノウイルス。