HU223733B1 - Rekombináns adenovírus vektor és eljárás alkalmazására - Google Patents

Abstract

A jelen találmány tárgya rekombináns adenovírus expressziós vektor,amelyet az jellemez, hogy az adenovirális IX DNS teljesen vagyrészlegesen ki van vágva belőle, és egy olyan gént tartalmaz, amelyegy idegen fehérjét, annak funkcionális fragmensét vagy mutánsátkódolja. A transzformált gazdasejtek, a rekombináns fehérjékelőállítási módszere és a génterápia is a jelen találmány oltalmikörébe tartozik. ŕ

Description

Ebben a bejelentésben különböző publikációkra hivatkozunk zárójelben. Ezeknek a publikációknak a leírását a találmány leírása során a továbbiakban referenciának tekintjük, amellyel részletesen ismertetni lehet annak a szakterületnek az állását, amelyhez a találmány tartozik.

A génterápiában jól használható rekombináns adenovírusok előállításához egy olyan sejtvonalra van szükség, amely transz-bán képes szolgáltami a virális El régió géntermékeit, amelyek ki vannak vágva ezekből a rekombináns vírusokból. Jelenleg az egyetlen hozzáférhető hasznos sejtvonal a 293-as sejtvonal, amelyet eredetileg Graham és munkatársai ismertettek [Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. és Naim, R.: J. Gén. Virol. 36, 59-74 (1977)]. A 293-as sejtek az 5ös típusú adenovírus genomjából hozzávetőleg 12%-ot tartalmaznak (4,3 kb) [Aiello, L. és munkatársai: Virology 94, 460-469 (1979); Spector, D. J.: Virology 130, 533-538(1983)].

A jelenleg génterápiás célokra vizsgált adeno vírusvektorokból általában ki van hasítva az Ad2 vagy Ad5 DNS, amely a virális genom 5’-végének körülbelül 400-as bázispárjától az 5’-végtől számított körülbelül 3,3 kilobázisos pontjáig terjed, azaz a teljes El deléció mérete körülbelül 2,9 kb. Ennek következtében egy korlátozott, körülbelül 1 kilobázisra kiterjedő homológ régió található a rekombináns vírus DNS-szekvenciája és a sejtvonalban levő Ad5 DNS DNS-szekvenciája között. Ez a homológia egy potenciális rekombinációs régiót határoz meg a virális és celluláris adenovírusszekvenciák között. Egy ilyen rekombináció eredménye egy vad fenotípusú vírus, amely a 293-as sejtből származó Ad5 El régiót hordozza. Valószínűleg ez a rekombinációs esemény a felelős a vad típusú adenovírus megjelenéséért a rekombinánsvírus-készítményekben, és közvetlenül igazolták, hogy ez okozza az Ad2-alapú rekombináns Ad2/CFTR-1 vírus vad típusú vírussal való fertőződését [Rich, D. P. és munkatársai: Humán Gene Therapy 4, 460-476 (1993)].

A C típusú adenovírus alcsoportban meglevő nagymértékű szekvenciahomológa következtében az ilyen rekombináció valószínűleg akkor fordul elő, ha a vektor bármely C csoportba tartozó adenovíruson alapul (1-es, 2-es, 5-ös és 6-os típus).

A rekombináns adenovírusok kis mennyiségben való előállításánál a vad típusú vírus keletkezése ellenőrizhető egy olyan szűrővizsgálattal, amely kiszelektálja azokat a víruspreparátumokat, amelyek szennyezettnek bizonyultak. Ahogy a vírustermelés mérete nő, hogy kielégítse a génterápia várható igényeit, annak valószínűsége is megnő, hogy egy olyan sarzsot állítanak elő, amely vad típusú vírussal van szennyezve, valamint annak nehézsége is megnő, hogy szennyezetlen rekombináns készítményeket állítsanak elő.

Ebben az évben több mint egymillió új rákos esetet fognak diagnosztizálni, és feleannyi rákhoz kapcsolódó halálesetet (American Cancer Society, 1993). A humán rákos megbetegedésekhez kapcsolódó legáltalánosabb genetikai elváltozások a p53-mutációk, amelyek a humán rákos megbetegedések 50-60%-ban előfordulnak [Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B.

és Harris, C.: Science 253, 49-53 (1991); Bartek, J., Bartkova, J., Vojtesek, B., Staskova, Z., Lukas, J., Rejthar, A., Kovarik, J., Midgley, C. A., Gannon, J. V. és Lane, D. P.: Onogene 6, 1699-1703 (1991); Levine, A. J.: „The Tumor Suppressor Genes” Annu. Rév. Biochem. 62, 623-651 (1993)]. A génterápia célja a p53-deficiens tumorok kezelésében például az, hogy helyreállítsa a vad típusú p53 gén normális, működőképes formáját, és ezzel helyreállítsa a sejtszaporodás feletti szabályozást. A p53 központi szerepet játszik a sejtciklus előrehaladásában, leállítva a növekedést, és ennek következtében a DNS-károsodásra adott válaszként repair vagy apoptózis játszódhat le. A vad típusú p53-at újabban úgy azonosították, mint a besugárzással vagy valamilyen kemoterápiás ágenssel indukált apoptózis szükséges komponensét [Lowe, S. W., Ruley, H. E., Jacks, T. és Housman, D. E.: Cell. 74, 957-967 (1993); Lowe, S. W., Schmitt, E. M., Smith, S. W., Osborne, B. A. és Jacks, J.: Natúré 362, 847-852 (1993)]. A p53-mutációk humán tumorokban való gyakori előfordulása miatt lehetséges, hogy azok a tumorok, amelyek ellenállókká váltak a kemoterápiával és a besugárzással szemben, valószínűleg részben azért váltak ilyenekké, mert nincs bennük vad típusú p53. Ha ezekbe a tumorokba visszavisszük a funkcionális p53at, akkor ésszerű, hogy érzékennyé válnak az apoptózisra, amely általában a besugárzással és kemoterápiával indukált DNS-károsodáshoz kapcsolódik.

A sikeres tumorszupresszor-génterápia kritikus pontjainak egyike az a képesség, hogy a rákos sejtek jelentős részét kell érintenie. A retrovirális vektorok használatát alaposan megvizsgálták számos különböző tumormodellben. Például, a máj rosszindulatú megbetegedéseinek kezelésénél retrovirális vektorokat alkalmaztak, kevés sikerrel, mivel ezek a vektorok nem képesek elérni az in vivő génterápiához szükséges géntranszfer magas szintjét [Huber, Β. E. és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 8038-8043 (1991)]. Egy létfontosságú gazdagénbe való stabil integráció vezethet patogén kóros állapotok kifejlődéséhez vagy öröklődéséhez.

A rekombináns adenovírusok számos előnnyel rendelkeznek a retrovirális vagy egyéb génbejuttató módszerekkel szemben [Siegfried, W.: Exp. Clin. Endocrinol. 101, 7-11 (1993)]. Az adenovírusokról még soha nem mutatták ki, hogy emberekben tumorokat okoznak, és biztonsággal használták élő vakcinaként őket [Straus, S. E.: „Adenovírus infections in humans” In: The Adenoviruses, szerk.: Ginsberg HS, New York: Plenum Press, 451-496 (1984)]. Replikációdeficiens rekombináns adenovírusokat úgy lehet előállítani, hogy a replikációhoz szükséges El régiót a célgénnel helyettesítjük. Az adenovírus nem integrálódik a humán genomba a fertőzés normális következményeként, ezáltal nagymértékben csökkenti a retrovírusoknál vagy adenoasszociált virális (AAV) vektoroknál lehetséges inszerciós mutagenezis kockázatát. A stabil integrációnak ez a hiánya egy további biztonsági tulajdonsághoz vezet, amennyiben az átvitt génhatás ideiglenes, mivel az extrakromoszomális DNS fokozatosan elvész a normális sejtek

HU 223 733 Bl folytatódó osztódása következtében. Stabil, magas titerű rekombináns adenovírus olyan magas szinten állítható elő, amit nem lehet elérni a retrovírusokkal vagy az AAV-vel, és így elég anyag áll rendelkezésre nagy betegpopuláció kezelésére. Emellett az adenovírusvektorok képesek a nagyon hatékony in vivő géntranszferre sok különböző szövetben és tumoros sejttípusban. Mások például kimutatták, hogy az adenovírus által közvetített génbejuttatásnak komoly lehetőségei vannak az olyan betegségek, mint például a cisztás fibrózis gyógyításában [Rosenfeld, M. A. és munkatársai: Cell. 68, 143-155 (1992); Rich, D. P. és munkatársai: Humán Gene Therapy 4, 460-476 (1993)] és az a_rantitripszindeficiencia gyógyításában [Lemarchand, P. és munkatársai : Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 6482-6486 (1992)]. Jóllehet a génbejuttatás egyéb alternatíváit, azaz például a kationos liposzóma/DNS komplexeket is vizsgálják jelenleg, még egyik sem bizonyult olyan hatékonynak mint az adenovírus által közvetített génbejuttatás.

Csakúgy mint a p53-deficiens tumorok kezelésénél, az egyéb tumorok kezelésénél is a génterápia célja a sejtszaporodás feletti ellenőrzés helyreállítása. A p53 esetében egy funkcionális gén bejuttatása helyreállítja a sejtciklus kontrollját, lehetővé téve a terápiás ágensek által indukált apoptotikus sejtpusztulást. Hasonlóképpen, a génterápia ugyanígy alkalmazható más tumorszupresszorgénekre is, amelyeket vagy önmagukban, vagy terápiás ágensekkel kombinálva lehet alkalmazni a tumorsejtek sejtciklusa előrehaladásának ellenőrzésére, és/vagy a sejtpusztulás indukálására. Emellett azok a gének, amelyek nem kódolnak sejtciklust szabályozó fehérjéket, hanem közvetlenül indukálják a sejtpusztulást, ilyenek például az öngyilkos gének, vagy azok a gének, amelyek közvetlenül toxikusak a sejtre, használhatók a génterápiás protokollokban, hogy közvetlenül elimináljuk a sejtciklus előrehaladását a tumorsejtekben.

Függetlenül attól, hogy milyen gént használunk a sejtciklus előrehaladása szabályozásának visszaállítására, ennek a megközelítésnek az értelme és gyakorlati alkalmazhatósága azonos. Nevezetesen nagy hatékonyságú géntranszfer elérése ahhoz, hogy a rekombináns termékből terápiásán hatásos mennyiség expresszálódjon. Annak megválasztása, hogy milyen vektort kell használni ahhoz, hogy lehetővé tegyük a nagy hatékonyságú géntranszfert a beteg számára minimális kockázattal, fontos ahhoz, hogy a génterápiás kezelés sikeres szintjét eléijük.

Tehát van igény olyan vektorokra és módszerekre, amelyek nagy hatékonyságú géntranszfert és fehérjeexpressziót biztosítanak, ami lehetővé teszi a biztonságos és hatékony génterápiás kezelést. A jelen találmány kielégíti ezt az igényt, valamint ezzel rokon előnyöket is szolgáltat.

A jelen találmány tárgya rekombináns adenovírus expressziós vektor, amelyet az jellemez, hogy az adenovirális IX DNS teljesen vagy részlegesen ki van vágva belőle, és egy olyan gént tartalmaz, amely egy idegen fehérjét, annak funkcionális fragmensét vagy mutánsát kódolja. A transzformált gazdasejtek, a rekombináns fehérjék előállítási módszere és a génterápia is a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

így például a jelen találmány szerinti adenovírusvektor tartalmazhat egy idegen gént egy olyan fehérje expresszálása céljából, amely hatékonyan szabályozza a sejtciklust (ilyen lehet például a p53, az Rb vagy a mitozin), vagy indukálja a sejtpusztulást (ilyen például a kondícionális öngyilkos timidin-kináz-gén). (Az utóbbit egy timidin-kináz-metabolittal együtt kell alkalmazni).

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán egy, a jelen találmány szerinti rekombináns adenovírusvektort láthatunk. A konstrukciót az 1. ábrán látható módon állítottuk össze. A kapott vírus tartalmaz egy 5’ deléciót az adenovírusszekvencia 356-4020-as bázispárjaira terjedően, ezáltal eliminálja az Ela és Elb géneket, valamint a teljes, IX fehérjét kódoló szekvenciát, ezáltal az Elb és pIX gének által közösen használt poliadenilezési helyet érintetlenül hagyja a felhasználás céljára, bármely kívánt gén transzkripciójának leállítására.

A 2. ábrán a pl 10^RB aminosav szekvenciája látható. A 3. ábrán egy retinoblasztóma tumorszupresszorfehérjét kódoló szekvencia látható.

A 4. ábrán a jelen találmány oltalmi körébe tartozó rekombináns p53/adenovírus konstrukciók sémája látható. A p53 rekombinánsok Ad5alapúak, és bennük a 360-3325-ös nukleotidok El régióját egy 1,4 kb méretű, teljes hosszúságú p53 cDNS helyettesíti, amelyet a humán CMV (A/C/53) Ad2 MLP (A/M/53) promoterek hajtanak meg, és az Ad2 háromrészes vezér-cDNS követi. Az A/M kontrolivírus ugyanazokat az Ad5 deléciókat tartalmazza mint az A/M/53 vírus, de hiányzik belőle az 1,4 kb méretű p53 cDNS-inszert. A megmaradó Elb szekvenciát (705 nukleotid) kivágtuk, így állítjuk elő azokat a konstrukciókat (A/M/N/53 és A/C/N/53), amelyekből a IX fehérjét kódoló szekvencia hiányzik. Ezekben a konstrukciókban is megvan az 5-ös típusú adenovírus E3 régiójában található 1,9 kb méretű deléció.

Az 5A. és 5B. ábrákon a p53 fehérje expressziója látható A/M/53 és A/C/53 konstrukciókai fertőzött tumorsejtekben. Az 5A. ábrán látható Saos-2 (oszteoszarkóma) sejteket ajelölt fertőzési multiplicitással (MOI) fertőztük, vagy az A/M/53 vagy az A/C/53 tisztított vírussal, majd 24 órával később nyertük ki. A pAb 1801 p53 ellenanyagot használtuk azonos fehérjekoncentrációban felvitt minták immunblotjainak megfestésére. Az SW480 sejtek, amelyek túlexpresszálják a mutáns p53 fehérjét, kivonatainak azonos fehérjekoncentrációját használjuk marker3

HU 223 733 Bl ként a p53 méret markereként. Az A/C/53 fejléc alatt látható „O” egy látszatfertőzést jelöl, amely kezeletlen Saos-2 lizátumot tartalmaz. Az 5B. ábrán az A/M/53 vagy A/C/53 vírussal fertőzött Hep 3B (hepatocelluláris karcinóma) sejtek láthatók, amelyeket az 5A. ábrán bemutatott MOI-val fertőztünk és elemeztünk. A nyíl a p53 fehérje pozícióját mutatja.

A 6A-tól a 6C-ig terjedő ábrák a p53 dependens Saos-2 morfológiai változásokat mutatják. A szubkonfluens (lxlO⁵ sejt/10 cm-es lemez) Saos-2 sejtek vagy fertőzetlenek (A), vagy 50-es MOI-val fertőzöttek a kontrollvírussal (B), vagy az A/C/53 vírussal. A sejteket a fertőzés után 72 órával fényképezzük.

A 7. ábrán a DNS-szintézis p53 dependens gátlása látható humán tumorsejtvonalakban A/M/N/53 és A/C/N/53 konstrukciókkal. Kilenc különböző tumorsejtet fertőzünk vagy az A/M kontrolladenovírussal (-χ-x-), vagy a p53-at expresszáló A/M/N/53 konstrukcióval (-Δ-Δ-), vagy az A/C/N/53 konstrukcióval (-O-O-), nagyobb MOI mellett, amint azt jelezzük. A tumor típusát és a p53 státusát minden egyes sejtvonalnál jelezzük (wt=vad típusú, null = nincs fehérjeexpresszió, műt=mutáns fehérje expresszálódik). A DNS-szintézist 72 órával a fertőzés után mérjük, az alábbiakban a II. számú kísérletben ismertetett módon. Az eredmények három párhuzamos mérésből származnak minden egyes dózisnál (átlag ±SD), és táptalaj kontroll versus MOI formában ábrázoljuk. *A H69 sejteket csak A/M és A/M/N/53 vírussal vizsgáltuk.

A 8. ábrán látható a p53-mal fertőzött Saos-2 sejtek tumorigenicitása meztelen egerekben. A Saos-2 sejteket vagy a kontroll A/M vírussal, vagy a p53 rekombináns A/M/N/53 vírussal fertőzzük, MOI=30 érték mellett. A kezelt sejteket szubkután injekciózzuk meztelen egerek lágyékába, majd nyolc hétig hetente kétszer mérjük a tumor dimenzióját (a II. számú kísérletben ismertetett módon). Az eredményeket tumorméret versus tumorbeültetés utáni napok száma formájában ábrázoljuk mind az A/M kontrollal (-χ-x-) mind az A/M/N/53 vírussal (-Δ-Δ-) kezelt sejteknél. A hibaoszlopok jelentik az átlagos tumorméret ±SEM értéket minden 4 állatból álló csoportnál, minden egyes időpontban.

A 9. ábrán az rAd/p53 RNS-expressziója látható megállapodott tumorokban. H69 (SCLC) sejteket injekciózunk meztelen egerekbe szubkután, majd 32 napig hagyjuk a tumorokat fejlődni, ameddig elérik a körülbelül 25-50 mm³ méretet. Az egereket randomizáljuk és peritumorálisan injekciózzuk

2χ 10⁹ tarfoltképző egységgel vagy a kontroll A/C/p-gal vagy az A/C/53 vírussal. A tumorokat az injekciózás után 2-7 nappal kivágjuk, majd minden egyes tumormintából poliA RNS-t készítünk. RT-PCR-t végzünk azonos RNS-koncentrációkkal és a p53 hírvivő-RNS-re specifikus primerek alkalmazásával. A PCR-amplifikálást 30 ciklusban végezzük, 94 °C-on 1 percig, 55 °Con 1,5 percig, 72 °C-on 2 percig, majd 10 percig 72 °C-on hagyjuk egy végleges extenzió céljából, egy Omnigen PCR-berendezésben (Hybaid). A használt PCR primer egy 5’ háromrészes vezérszekvencia cDNS (5’-CGCCACCGAGG GACCTGAGCGAGTC-3’) és egy 3’ p53 primer (5’TTCTGGGA AGGGACAGAAGA-3’). Az 1., 2., 4. és 5. sávok p53-mal kezelt minták, amelyeket a 2. vagy 7. napon vágtunk ki, amint azt jelezzük. A 3. és 6. sáv β-gallal kezelt tumorokból származnak. A 7., 8. és 9. sávok a 4., 5. és 6. sávok ismétlései, actinprimerrel amplifikálva, az azonos mintafelvitel igazolására. A 10. sáv egy pozitív kontroll, háromrészes/p53-at tartalmazó plazmidot alkalmazva.

A 10A. és 10B. ábrákon in vivő tumorszupresszió, valamint megnövekedett túlélési idő látható az A/M/N/53 vírussal. H69 (SCLC) tumorsejteket injekciózunk szubkután meztelen egerekbe, majd 2 hétig hagyjuk fejlődni őket. Csak a pufferből (-), kontroll A/M adenovírusból (-x-x-) vagy A/M/N/53 adenovírusból (-Δ-Δ-) (mindegyik vírusból 2 χ 10⁹ píü/injekciót adunk be) adunk be peritumorális injekciókat hetente kétszer, összesen 8 dózisban. A tumorok méretét hetente kétszer mérjük meg, majd a tumor térfogatát a II. számú kísérletbe ismertetett módon becsüljük. A) A tumor méretét minden egyes vírusnál az inokulálás óta eltelt idővel (napok) szemben ábrázoljuk a H69 sejteknél. A hibaoszlopok az átlagos tumorméret ±SEM értéket mutatják minden egyes, 5 állatból álló csoportra. A nyilak a vírusinjekciókat mutatják. B) Az egerek túlélését megfigyeljük, és a csoportonkénti túlélő egerek számát ábrázoljuk a beoltás óta eltelt idővel szemben, csak a pufferrel (-), a kontroll A/M-rel (.........) vagy az

A/M/N/53 (_) vírussal kezelt H69 sejteknél.

A 11A-1 IC. ábrákon a rekombináns plazmidkonstrukciók térképei láthatók. A plazmidokat az alábbiakban részletezett módon állítjuk elő. A konstrukciókban a vastag vonalak a számunkra érdekes szakaszokat jelzik, míg a félkövér betűtípus azokat a restrikciós hasítási helyeket jelzi, amelyekkel azokat a ffagmenseket állítjuk elő, amelyeket össze

HU 223 733 Bl kell ligálni egy új plazmid előállításához, amint azt a nyilak jelzik. AHA. ábrán a pACNTK plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pMLBKTK plazmidból (ATCC szám 39 369) származó HSV-TK-gént egy klónozóvektor polilinkerébe klónozzuk, majd izoláljuk a TK-gént a pACN vektorba való klónozáshoz szükséges végekkel. A pACN vektor tartalmaz az in vivő rekombinációhoz szükséges adenovírusszekvenciákat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy rekombináns adenovírus keletkezzen (lásd 12. ábra). A 11B. ábrán a pAANTK plazmid készítését mutatjuk be, ami az a-fetoprotein-fokozót (AFP-E) és a promoterrégiókat kódoló PCR-rel amplifikált fragmensekkel kezdődik, több lépésben szubklónozva egy végső plazmidba, ahol az AFP-fokozó és a promoter a HSV-TK-gén előtt található, ezt követik 2-es típusú adenovírusszekvenciák, amelyek ahhoz szükségesek, hogy in vivő rekombináció játszódjon le, és rekombináns adenovírus keletkezzen. A 1 IC. ábrán a pAANCAT plazmid készítése látható, ami a kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT)-gén izolálásával kezdődik egy kereskedelmi forgalomban levő plazmidból, majd a génnek a pAAN plazmidba való szubklónozásával folytatódik (lásd az előzőkben), így állítva elő a végleges pAANCAT plazmidot, amelyben a CAT-génnek az AFP-fokozó/promoter konstrukcióval való transzkripciója játszódik le adenovírusszekvenciaháttér mellett.

A 12. ábrán az ACNTK, AANTK és AANCAT rekombináns adenovírusok sematikus térképe látható. Ahhoz, hogy all. ábrán ismertetett plazmidokból rekombináns adenovírusokat készítsünk, mindegyik plazmidból (pACNTK, pAANTK, pAANCAT) 4 részt (20 pg) linearizálunk EcoRl restrikciós enzimmel, majd kotranszfektáljuk 1 rész (5 pg) Clal restrikciós enzimmel emésztett rekombináns adenovírus nagy fragmensével (rACP-gal), amely egy E3 régió deléciót tartalmaz [Wills, K. N. és munkatársai: Hűm. Gén. Ther. 5, 1079-1088 (1994)]. A kapott vírusokban a 360-4021-es Ad5 nukleotidókat vagy a CMV-promoterrel és a háromrészes vezér-cDNS-sel (TPL) helyettesítjük, vagy az a-fetoprotein-fokozóval és promoterrel (AFP), amely a HSV-1 vagy CAT-gén expresszióját hajtja meg, amint azt jeleztük az előzőkben. A kapott rekombináns adenovírusok jelzése ACNTK, AANTK és AANCAT.

A 13. ábrán a CAT-expresszió-promoter specifitása látható a rekombináns adenovírusvektorokban. A jelzett sejtvonalakból 2xl0⁶ sejtet fertőzünk az AANCAT rekombináns adenovírussal MOI=30 vagy MOI=100 érték mellett, vagy fertőzetlenül hagyjuk (UN). A HepG2 és Hep3B sejtek a-fetoproteint expresszálnak, míg az egyéb sejtvonalak nem. Három nap elteltével a sejteket összegyűjtjük, a kivonatok térfogatát úgy állítjuk be, hogy a fehérje koncentrációja azonos legyen, majd megmérjük a CAT-aktivitást, az alább következő Módszerek részben ismertetett módon. Azonos számú fertőzetlen sejt szolgál egyedi kontrollként a háttér-CATaktivitáshoz, míg a ¹⁴C-jelzett kloramfenikol (csak ^l4C) és egy CAT-aktivitást expresszáló stabil sejtvonal (B21) szolgál pozitív és negatív kontrollként. Az acetilkoenzim A százalékos konverzióját jelezzük, igazolva, hogy a CAT-expresszió csak az α-fetoproteint expresszáló sejtekre korlátozódik.

A 14. ábrán a TK/GCV kezelés hatásai látszanak hepatocelluláris karcinómasejtvonalakra, valamint a promoterspecifitás hatásai. A Hep-G2 (AFP pozitív) és HLF (AFP negatív) sejtvonalakat éjszakán át fertőzzük ACNTK (-Δ-), AANTK (-♦-), vagy kontroll-ACN (-)-vírussal 30-as fertőzési multiplicitás mellett, majd ezt követően egyetlen dózis ganciklovirrel kezeljük a jelzett koncentrációkban. A sejtek szaporodását úgy becsüljük meg, hogy ³H-timidint adunk a sejtekhez körülbelül 18 órával a begyűjtés előtt. A ³H-timidin beépülését a sejtek nukleinsavába a fertőzés után 72 órával mérjük (Top Count, Packard, majd a kezeletlen kontroll százalékában fejezzük ki (átlag ±SD.). Az eredmények a szaporodásnak egy nem szelektív, dózisdependens gátlását mutatják a CMV által meghajtott konstrukcióval, míg az AFP-vei meghajtott TK szelektíven gátolja a Hep-G2-t.

A 15. ábrán az ACNTK plusz ganciklovir citotoxicitása látható HCC-ben. A HLF-sejteket 30as MOI-értékkel fertőzzük meg vagy ACNTK-val (-·-) vagy a kontrolivírussal (-□-), majd a jelzett dózisokban ganciklovirrel kezeljük. Hetvenkét órával a ganciklovirkezelés után a sejtfelülúszóba kibocsátott laktát-dehidrogenáz (LDH) mennyiségét kolorimetriásan mérjük és a ganciklovirkoncentrációval szemben ábrázoljuk (átlag ±SEM) a két vírussal kezelt csoportnál.

A 16A. és 16B. ábrákon az ACNTK plusz ganciklovir hatása látható a megállapodott hepatocelluláris karcinóma (HCC)-tumorokra meztelen egereken. 1 χ 10⁷ Hep 3B sejtet injekcióztunk nőstény meztelen egerek lágyékába szubkután, majd 27 napig hagytuk növekedni. Az egerek ezután intratumorális és peritumorális injekciókat kaptak vagy az ACNTK (-) vagy a kontroll-ACN (-□ )-vírusból

HU 223 733 Bl (1 χ 10⁹ NE 100 μΐ térfogatban) minden második nap, összesen három dózist (nyíllal jelezve). A ganciklovirinjekciók (100 mg/kg ip.) 24 órával az indító vírusdózis után kezdődnek, és összesen tíz napig tartanak. A 6A. ábrán a tumorméreteket ábrázoljuk minden egyes vírusnál a fertőzés után eltelt napok, függvényében (átlag ±SEM). A 6B. ábrán az egyes vírussal kezelt állatcsoportok testsúlyát ábrázoljuk a fertőzés óta eltelt napok függvényében (átlag ±SEM).

Ahhoz, hogy a vad típusú adenovírusszennyeződés gyakoriságát csökkentsük, kívánatos, hogy vagy a vírust, vagy a sejtvonalat javítsuk, hogy csökkentsük a rekombináció valószínűségét. Például egy olyan adenovírus, amely a C csoportba tartozó adenovírusokkal alacsony homológiát mutat, használható rekombináns vírusok előállítására, annak kicsiny valószínűsége mellett, hogy rekombináció lép fel az Ad5 szekvenciákkal a 293-as sejtekben. Egy másik, könnyebb lehetőség azonban a virális és a celluláris szekvenciák közötti rekombináció csökkentésére az, ha növeljük a deléció méretét a rekombináns vírusban, és így csökkentjük a közös szekvenciák kiterjedését a vírus és a 293-as sejtekben levő Ad5 gének között.

Az adenovírus genom 5’ végétől számított 3,5 kilobázison túlnyúló deléciók érintik a IX-es adenovírus fehérjegénjét, és nem tekinthetők kívánatosnak az adenovírusvektorokban (lásd az alábbiakban).

Az adenovírus IX-es fehérjegénje a külső adenovíruskapszidnak egy minorkomponensét kódolja, amely stabilizál egy kilenc hexonból álló csoportot, amely a virális kapszid fő komponensét képezi [Stewart, P. L. és munkatársai: EMBO Journal 12, 2589-2599 (1993)]. Az adenovírus deléciós mutánsok tanulmányozása alapján a IX-es fehérjéről eredetileg azt gondolták, hogy nem esszenciális komponense az adenovírusnak, jóllehet hiánya összekötődik egy, a vad típusú vírusnál megfigyeltnél nagyobb hőérzékenységgel [Colby, W. W. és Shenk, T. J.: Virology 39, 977-980 (1981)]. Újabban kiderítették, hogy a IX-es fehérje lényeges a teljes hosszúságú virális DNS kapszidokba való csomagolásához, és a IX-es fehérje távollétében csak a vad típusnál legalább 1 kilobázissal kisebb genomok szaporíthatok rekombináns vírusokként [Ghosh-Choudhury, G., Haj-Ahmad, Y. és Graham, F. L.: EMBO Journal 6, 1733-1739 (1987)]. Figyelembe véve ezt a pakolási korlátozást a IX-es fehérjedeléciókat szándékosan nem vették figyelembe az adenovírusvektorok tervezésénél.

Ebben a bejelentésben hivatkozunk a molekuláris biológia szakkönyveire, amelyek tartalmaznak meghatározásokat, módszereket és eszközöket az alaptechnikák végrehajtásához, amelyeket a jelen találmány is alkalmaz [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)], valamint a szakkönyvekben található referenciákra is. Ezt a publikációt és az idézett publikációt is referenciának tekintjük a jelen találmány leírása során.

Ellentétben azzal, ami korábban a szakterületen ismert volt, a jelen találmány olyan rekombináns adenovírusok alkalmazását védi, amelyek a IX-es génben deléciókat tartalmaznak, annak eszközeként, hogy csökkentsük a vad típusú adenovírusfertőzést a diagnosztikai és terápiás célokra (azaz génterápiára) alkalmazott víruskészítményekben. A továbbiakban a „rekombináns” szakkifejezés” jelentése egy olyan utód, amely génsebészeti módszerek alkalmazásával jött létre. Ezekkel a deléciókkal további 500-700 bázispár DNSszekvenciát lehet eltávolítani, amely a szokványos El deléciós vírusokban jelen van (kisebb, kevésbé kívánatos deléciók is lehetségesek a pIX génben, és szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak), és a 293-as sejtekbe integrálódott Ad5 szekvenciákkal való rekombináció számára hozzáférhetők. Bármely C csoportra (1-es, 2-es, 5-ös és 6-os szerotípusú) alapuló rekombináns adenovírus a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány oltalmi körébe tartozik még egy hibrid Ad2/Ad5 alapú rekombináns vírus, amely a humán p53 cDNS-t expresszálja a 2-es típusú adenovírus késői fő promoteréről. Ezt a konstrukciót az 1. ábrán látható módon állítottuk össze. A kapott vírus egy 5’ deléciót hordoz az adenovírusszekvenciában, amely körülbelül a 357-4020-as nukleotidokra terjed ki, és eliminálja az Ela és Elb géneket, valamint a teljes IX-es fehérjét kódoló szekvenciát, míg az Elb és IX-es fehérje génjei által közösen használt poliadenilezési szekvenciát érintetlenül hagyja bármely kívánt gén transzkripciója terminációjához. Egy másik megvalósítási módot mutatunk be a 4. ábrán. Egy másik módszer szerint a deléció további 30-40 bázispárra terjedhet ki, anélkül, hogy ez érintené a szomszédos, a IVa2 fehérjét kódoló gént, jóllehet ebben az esetben egy exogén poliadenilezési jelet is biztosítani kell, amely leállítja a rekombináns vírusba beépített gének transzkripcióját. Az ezzel a delécióval készített kiindulási vírust könnyen lehet szaporítani 293-as sejtekben, miközben nincs bizonyíték a vad típusú virális fertőzésre, és erős p53-expressziót vezérel a deléció helyére beépített transzkripciós egységről.

Az előzőkben ismertetett IX-fehéije-deléciót hordozó rekombináns vírusok inszertálási kapacitása körülbelül 2,6 kilobázis. Ez számos génhez elegendő, beleértve a p53 cDNS-t is. Az inszertálási kapacitás fokozható, más deléciók bejuttatásával az adenovírusgerincbe, például a korai 3-as vagy 4-es régióba [Graham, F. L. és Prevec, L.: „Vaccines: New Approaches to Immunological Problems”; 363-390, szerk.: R. W. Ellis, Butterworth-Heinemann, Boston (1992)]. Használható például egy olyan adenovírusgerinc, amely egy 1,9 kilobázisos deléciót tartalmaz a 3-as korai régiója nem esszenciális szekvenciájában. Ezzel a további delécióval a vektor inszerciós kapacitása körülbelül 4,5 kilobázisra növelhető, ami elég számos nagy cDNS-hez, beleértve a retinoblasztóma-tumorszupresszorgént is.

A jelen találmány tárgyát képezi egy rekombináns adenovírus expressziós vektor, amelyet a IX-es adenovírusfehérje teljes vagy részleges deléciója jellemez, és egy idegen fehérjét kódoló gént, vagy annak funkcionális fragmensét vagy mutánsát tartalmazza. Ezek a vek6

HU 223 733 Bl torok jól használhatók a diagnosztikus és terápiás polipeptidek és fehérjék biztonságos, rekombináns módszerrel való előállítására, illetve, ami még fontosabb, a gének bejuttatására a génterápiához. így például a jelen találmány szerinti adenovírusvektor tartalmazhat egy idegen gént egy olyan fehérje expresszálására, amely hatékonyan szabályozza a sejtciklust. Ilyen fehérje lehet például a p53, az Rb vagy a mitozin. Az idegen fehérje indukálhat sejtpusztulást is, ilyen például a timidin-kináz öngyilkos gén. (Ez utóbbit egy timidin-kinázmetabolittal együtt kell használni ahhoz hogy hatékony legyen). Bármely expressziós kazetta használható a jelen találmány szerinti vektorokban. Egy „expressziós kazetta” egy olyan DNS-molekulát jelent, amely egy transzkripciópromoter/fokozószekvenciával rendelkezik, azaz például a CMV-promoter fokozóval stb., és tartalmaz egy idegen gént, valamint az alábbiakban meghatározott néhány esetben egy poliadenilezési szignált is. A továbbiakban az „idegen gén” szakkifejezés egy olyan DNS-molekulát jelent, amely nincs jelen a pontos orientációban és pozícióban partner molekulaként a vad típusú adenovírusban. Az idegen gén egy DNS-molekula, mérete maximum 4,5 kilobázis. Az „expressziós vektor” szakkifejezés jelentése egy olyan vektor, amely a bevitt DNS-szekvenciák expresszióját eredményezi, ha a megfelelő gazdasejtben expresszáljuk, azaz a DNS által kódolt fehérjét vagy polipeptidet a gazdaszervezet rendszere megszintetizálja. A rekombináns adenovírus expressziós vektor tartalmazhatja az adenovírus IX-es fehérjéjét kódoló gén egy részét, feltéve, hogy biológiailag aktív IX-es fehérje vagy annak fragmense nem keletkezik. Erre a vektorra jó példa egy expressziós vektor, amely az 1. vagy 4. ábrán látható restrikciósenzim-térképpel rendelkezik.

Az indukálható promoterek szintén használhatók a jelen találmány szerinti adenovírus vektorokban. Ezek a promoterek csak egy további molekula jelenlétében iniciálják a transzkripciót. Az indukálható promoterre jó példa a β-interferon-génből, egy hősokkgénből, egy metallotioneingénből, vagy szteroidhormonra reagáló génből származó promoter. A szövetspecifikus expressziót jól jellemezték a génexpresszió területén, és a szövetspecifikus, valamint indukálható promoterek, mint például az említettek, jól ismertek a szakterületen. Ezeket a géneket használják az idegen gén expressziójának szabályozására, miután az idegen gént bejuttatták a célsejtbe.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns adenovírus expressziós vektor, az előzőkben ismertetettek szerint, amelyben kevésbé kiterjedt a IX-es fehérje génjének a deléciója, azaz az 5’ vírus végtől körülbelül 4000 bázispáma terjed ki, az egyik megvalósítási mód szerint. Egy másik megvalósítási mód szerint a rekombináns adenovírus expressziós vektorban lehet egy további deléció az adenovírus korai 3-as és/vagy 4-es régiója nem esszenciális DNSszekvenciájában, és/vagy az Ela és Elb jelű adenovírusszekvenciában. Eszerint a megvalósítási mód szerint az idegen gén egy maximum 4,5 kilobázis méretű DNS-molekula.

Egy másik megvalósítási mód szerint egy maximum 40 nukleotid méretű deléció található a molekulában az Ela és Elb deléciótól és a pIX-től 3’ irányban, és egy poliadenilezési szignált kódoló idegen DNS-molekulát építünk be a rekombináns vektorba, az idegen génhez viszonyítva megfelelő pozícióban, hogy szabályozzuk az idegen gén expresszióját.

A jelen találmány szempontjából a rekombináns adenovírus expressziós vektor származhat egy vad típusú adenovírusvektorból, amelynek szerotípusa lehet 1-es, 2-es, 5-ös vagy 6-os.

Az egyik megvalósítási mód szerint a rekombináns adenovírus expressziós vektor tartalmaz egy idegen gént, amely egy funkcionális tumorszupresszor-fehérjét, illetve annak egy biológiailag aktív fragmensét kódolja. A továbbiakban a „funkcionális” szakkifejezés jelentése a tumorszupresszorgénnel kapcsolatban olyan tumorszupresszorgén, amely tumorszupresszor-fehérjét kódol, amely hatékonyan megakadályozza, hogy a sejt tumorsejtként viselkedjen. A funkcionális gének közé tartoznak például a vad típusú normális gének és a normális gének olyan módosulatai, amelyek megtartják azt a képességüket, hogy hatékony tumorszupresszorgéneket kódoljanak, valamint egyéb antitumor gének, azaz például a kondicionális öngyilkos fehérje vagy egy toxin génje.

Hasonlóképpen, a „nem funkcionális” jelentése a továbbiakban azonos az „inaktiválf’-tal. A nem funkcionális vagy defektív géneket számos esemény létrehozhatja, ilyen például a pontmutáció, deléció, metilezés és egyéb, a szakterületen jártas szakember számára ismert esemény.

A tumorszupresszorgénre egy másik példa a retinoblasztóma (RB). A komplett RB cDNS nukleotidszekvenciája és a keletkező RB fehérje (jele pllORB) számított aminosavszekvenciája Lee és munkatársai publikációjában található meg [Lee és munkatársai: Science 235, 1394-1399 (1987)]. A retinoblasztóma tumorszupresszor-fehérje expressziójához jól használható még egy DNS-molekula, amely a 2. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát kódolja, vagy a 3. ábrán látható DNS-szekvenciával rendelkezik. A pll0^RB-nek egy csonkított verziója, a p56⁵⁶ jelű fehérje is jól használható. A p56^RB szekvenciáját lásd Huang és munkatársai publikációjában [Huang és munkatársai: Natúré 350, 160-162 (1991)]. Egyéb tumorszupresszorgének is használhatók a jelen találmány szerinti vektorokban. Csak az illusztrálás céljára, ez lehet a pl6 fehérje [Kamb és munkatársai: Science 264, 436-440 (1994)], a p21 fehérje, a Wilm tumor WT1 fehérjéje, a mitozin, a h-NUC, vagy a vastagbélkarcinóma-DCC-fehérje. A mitozint X. Zhu és W-H Lee írja le (08/141,239 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, bejelentve 1993. október 22-én, valamint ennek a találmánynak egy követő bejelentése ugyanezektől a bejelentőktől, ügyvédi listaszáma P-CJ 1191, bejelentve 1994. október 24-én, amelyeket mind referenciának tekintünk a továbbiakban). Hasonlóképpen, a h-NUC-ot W-H Lee és P-L Chen írta le (08/170,586 USA bejelentési szám, benyújtva 1993.

HU 223 733 Bl december 20-án), amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk.

Amint az a szakterületen jártas szakember számára ismert, a „fehérje” szakkifejezés jelentése egy lineáris aminosavpolimer, amit egy specifikus szekvenciában peptidkötések tartanak össze. A továbbiakban az „aminosav” szakkifejezés jelentése az aminosav D vagy L sztereoizomerformájára vonatkozik, hacsak külön nem jelezzük. A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak még az ekvivalens fehérjék vagy ekvivalens peptidek, azaz például azok, amelyek a tisztított vad típusú tumorszupresszor-fehérje biológiai aktivitásával rendelkeznek. Az „ekvivalens fehérjék” és „ekvivalens polipeptidek” szakkifejezés olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek eltérnek a természetben előforduló fehérjék vagy polipeptidek lineáris szekvenciájától, de amelyekben olyan aminosavhelyettesítések vannak, amelyek nem változtatják meg a biológiai aktivitását. Ezek az ekvivalensek a természetes szekvenciáktól egy vagy több aminosav rokon aminosavakkal való helyettesítésében térhetnek el, azaz például hasonló töltésű aminosavakkal való helyettesítésben, vagy az oldalláncok vagy funkciós csoportok helyettesítésében vagy módosításában.

Egy funkcionális tumorszupresszor-fehérje definíciójába beletartozik minden olyan fehérje, amelynek jelenléte csökkenti a tumorigenicitást, malignanciát vagy a gazdasejt hiperproliferatív fenotípusát. Ennek a definíciónak az érvényességi körébe tartozó tumorszupresszor-fehérjék közé tartozik például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a pl00^RB, a

P56^RB, a mitozin, a h-NUC és a p53. A „tumorigenicitás” szakkifejezés jelentése az a képesség, hogy tumorokat hoz létre, vagy képes tumorképződést előidézni, és a neoplasztikus növekedés szinonimája. A „malignancia” szakkifejezésnek az a célja, hogy egy olyan tu10 morigénsejtet írjunk le vele, amelynek megvan a képessége a metasztázisra, és veszélyezteti a gazdaszervezet életét. A „hiperproliferatív fenotípus” szakkifejezéssel egy olyan sejtet írunk le, amely az adott sejttípusra jellemző növekedés normális korlátáit meghala15 dó sebességgel nő és osztódik. A „neoplasztikus” szakkifejezés jelentése olyan sejtekre vonatkozik, amelyekből hiányzik az endogén tumorszupresszor-fehérje, vagy a sejt nem képes egy funkcionális tumorszupresszor-fehérjét kódoló endogén nukleinsavat exp20 resszálni.

Egy jelen találmány szerinti vektorra példa egy jelen találmány szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amely tartalmaz egy idegen, a p53 fehérjét vagy annak aktív fragmensét kódoló gént.

A p53 gén kódolószekvenciáját az alábbi, I. táblázatban mutatjuk be.

I. táblázat

V*SHR PGSR*

SDPSV EPPLS

EDPGP DEAPR

SYGFR LGFLH

RVRAM AIYKQ

LDDRN TFRHS

TLEDS SGNLL

RALPN NTSSS GK.EPG GSRAH

LLGSG DTLRS

QETFS DLWKL

MPEAA PPVAP

SGTAK SVTCT

SQHMT EWRR

VWPY EPPEV

GRNSF EVRVC

PQPKK KPDLG SSHLK SKKGQ

GWERA FHDGD

LPENN VLSPL

APAAP TPAAP

YSPAL NKMFC

CPHHE RCSDS

GSDCT TIHYN

ACPGR DRRTE

EYFTL QIRGR STSRH KKLMF

TLPWI GSQTA

PSQAM DDLML

APAAP WPLSS

QLAKT CPVQL

DGLAP PQHLI

YMCNS SCMGG

EENLR KKGEP

ERFEM FRELN KTAGP DSD*

FRVTA MEEPQ 100

SPDDI EQWET 150

SVPSQ KTYOG 200

WVDST PPPGT 250

RVEGN LRVEY 300

MNRRP ILTII 350

HHELP PGSTK 400

EALEL KDAQA *=stopkodon

Az előzőkben ismertetett expressziós vektorok közül bármelyik alkalmas diagnosztikus vagy terápiás készítménynek. A vektorok használhatók szűrővizsgálatokra, amelyekben számos tumorszupresszorgén lehet hasznos a génterápiában. Például egy feltehetően neoplasztikus sejtminta eltávolítható egy alanyból és emlősből. A sejteket azután érintkezésbe hozhatjuk megfelelő körülmények között egy, a jelen találmány szerinti rekombináns vektor hatásos mennyiségével, amely vektorba inszertálva található egy idegen gén, amely egyet kódol a számos funkcionális tumorszup50 resszorgén közül. Azt, hogy ennek a génnek a bejuttatása visszafordítja-e a malignus fenotípust, lágyagarban mért telepképződéssel vagy meztelen egérben való tumorképződéssel mérhetjük. Ha a malignus fenotípus visszaalakult, akkor az idegen gént úgy definiálhatjuk, mint egy pozitív jelöltet a sikeres génterápiához az alanyban vagy emlősben. Ha gyógyászatilag alkalmazzuk, akkor egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálhatjuk. A gyógyászatilag elfogadható hordozók jól ismertek a szakirodalomban, idetar60 toznak a vizes oldatok, azaz például a fiziológiásán

HU 223 733 Β1 puffereit sóoldat vagy egyéb oldószer, illetve hordozó, azaz például a glikolok, a glicerin, növényi olajok (például olívaolaj), vagy az injekciózható szerves észterek. Egy gyógyászatilag elfogadható hordozó használható arra, hogy a készítményeket bejuttassuk egy sejtbe in vitro vagy egy alanyba in vivő.

Egy gyógyászatilag elfogadható hordozó tartalmazhat egy fiziológiásán elfogadható vegyületet, amely például úgy hat, hogy stabilizálja a készítményt vagy fokozza, illetve csökkenti az ágens felszívódását. Fiziológiásán elfogadható vegyület lehet például szénhidrát, azaz például glükóz, szacharóz vagy dextránok, antioxidánsok, azaz például aszkorbinsav vagy glutation, kelátképző ágensek, alacsony molekulasúlyú fehérjék vagy egyéb stabilizálószerek, vagy töltőanyagok. Az egyéb, fiziológiásán elfogadható vegyületek közé tartoznak a nedvesítőágensek, emulgeálóágensek diszpergálóágensek vagy konzerválószerek, amelyek különösen jól használhatók mikroorganizmusok növekedésének vagy működésének megakadályozására. A különböző konzerválószerek jól ismertek, idetartozik például a fenol és az aszkorbinsav. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a gyógyászatilag elfogadható hordozó, beleértve egy fiziológiásán elfogadható vegyületet is, megválasztása függ például a polipeptid beadási módjától és a specifikus polipeptid adott fizikokémiai jellemzőitől. Például egy fiziológiásán elfogadható vegyület, azaz például az alumíniummonosztearát vagy a zselatin különösen jól használható késleltetőágensként, amely meghosszabbítja egy alanynak beadott gyógyászati készítmény abszorpciós idejét. A hordozókra, stabilizálószerekre vagy adjuvánsokra további példák találhatók a szakirodalomban [Martin: „Remington’s Pharm. Sci.”, 15. kiadás (Mack Publ. Co., Easton) (1975)], amely szakirodalomra a továbbiakban mint referenciára hivatkozunk. A gyógyászati készítményeket bevihetjük még, ha szükséges, liposzómákba, mikrogömbökbe vagy egyéb polimer hordozókba [Gregoriadis: „Liposome Technology”, 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1984)], amely publikációra a továbbiakban mint referenciára hivatkozunk. A liposzómák például, amelyek foszfolipidekből vagy egyéb lipidekből állnak, nem toxikusak, fiziológiásán elfogadható és metabolizálható hordozók, amelyeket viszonylag egyszerűen elő lehet állítani és egyszerűen lehet beadni.

A továbbiakban a „gyógyászati készítmény” szakkifejezés bármelyik ismertetett készítményre vonatkozik, amelyet egy vagy több az előzőkben ismertetett gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálunk. A készítményeket azután alkalmazhatjuk terápiásán vagy profilaktikusan. Érintkezésbe hozhatók a gazdasejttel in vivő, ex vivő vagy in vitro, hatásos mennyiségben. A gazdasejtek in vitro vagy ex vivő érintkeztetését az alábbiakban ismertetjük. Amikor in vivő hajtjuk végre, akkor egy, a jelen találmány szerinti vektort tartalmazó készítmény beadási módja jól ismert a szakterületen, idetartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat az orális, intratumorális, intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitonális beadás. A beadás történhet folyamatosan vagy megszakítva, és a kezelendő alanytól, valamint állapottól függően változik, azaz ugyanúgy, mint más terápiás készítményeknél [Landmann és munkatársai: J. Interferon Rés. 12 (2), 103-111 (1992); Lantz és munkatársai: Cytokine 2 (6), 402-406 (1990); Supersaxo és munkatársai: Pharm. Rés. 5 (8), 472-476 (1988); Demetri és munkatársai: J. Clin. Oncol. 7 (10), 1545-1553 (1989); LeMaistre és munkatársai: Láncét 337, 1124-1125(1991)].

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy transzformált prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, azaz például egy állati vagy emlőssejt, amelybe az előzőkben ismertetett rekombináns adenovírusvektor van bejuttatva. A megfelelő prokariótatörzsek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a bakteriális sejtek, azaz például az Escherichia coli-seyek. A gazdasejtek retrovirális vektorokkal való transzformálásának módszerei jól ismertek a szakirodalomban [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)], és idetartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a transzfekció, az elektroporáció és a mikroinjekciózás.

Amint azt a találmány leírása során használjuk, az állat kifejezést az emlős szinonimájaként használjuk, és idetartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szarvasmarha, a sertés, a macska, a majom, a kutya, a ló, a rágcsálók, a patkány és az ember. A további gazdasejtek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, bármely neoplasztikus vagy tumorsejt, azaz például az oszteoszarkóma, a petefészek-szarkóma, emlőkarcinóma, melanoma, hepatokarcinóma, tüdőrák, agyrák, vastagbélrák, hematopoietikus sejt, prosztatarák, méhnyakrák, retinoblasztóma, nyelőcső-karcinóma, hólyagrák, neuroblasztoma vagy veserák.

Emellett bármely olyan eukarióta sejtvonal használható ennek a vektornak a gazdasejtjeként, amely képes az Ela és Elb vagy Ela, Elb és pIX expressziójára. Az egyik megvalósítási mód szerint a megfelelő eukarióta gazdasejt a 293-as sejtvonal, amely az American Type Culture Collectiontől szerezhető be (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20231).

Bármelyik, az előzőkben ismertetett transzformált gazdasejt jól használható diagnosztikai vagy terápiás készítményként. Amikor gyógyászatban alkalmazzuk, akkor különböző gyógyászatilag elfogadható hordozóval lehet kombinálni. A megfelelő gyógyászatilag elfogadható hordozók jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, ezek lehetnek például azok, amelyeket az előzőkben ismertettünk. A készítményeket azután beadhatjuk terápiásán vagy profilaktikusan, hatásos mennyiségben, az alábbiakban részletesen ismertetett módon.

Egy gazdasejt transzformálási módszere is a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. Ebben a módszerben egy gazdasejtet, azaz egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejtet érintkezésbe hozunk bármelyik ismertetett expressziós vektorral, megfelelő körülmények között. Az ezzel a módszerrel transzformált gazdasejtek

HU 223 733 Β1 is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Az érintkeztetést elvégezhetjük in vitro, in vivő vagy ex vivő, a szakterületen jól ismert módszerek alkalmazásával [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)] és az expressziós vektorból hatékony mennyiséget alkalmazva. A jelen találmány tárgyát képezi rekombináns fehérje vagy polipeptid előállítási eljárása, a transzformált gazdasejtet megfelelő körülmények között szaporítva, amely körülmények elősegítik a beépített idegen gén transzkripcióját és transzlációját. A rekombináns expresszió módszerei számos különböző gazdasejtben, azaz például emlős-, élesztő-, rovar- vagy baktériumsejtekben, jól ismertek, beleértve azokat is, amelyet Sambrokk és munkatársai foglaltak össze [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A lefordított fehérjét azután szokványos módszerekkel izolálhatjuk, azaz például oszlopon való tisztítással, vagy antifehérje ellenanyag alkalmazásával. Az izolált fehérje vagy polipeptid is a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. A továbbiakban a tisztított vagy izolált szakkifejezés jelentése természetes fehérje vagy nukleinsav, amely lényegében mentes a természetes, vagy a sejtben előforduló fehérjétől vagy polipeptidtől.

A találmány tárgyát képezik a nem humán állatok, amelyek hordozzák a jelen találmány szerinti expressziós vektorokat vagy transzformált gazdasejteket. Ezeket a „transzgenikus” állatokat a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel állítjuk elő, azaz például az 5,175,384 számú USA szabadalmi bejelentésben ismertetett módszerrel, vagy szokványos ex vivő terápiás technikával [Culver, K. W. és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3155-3159 (1991)].

Amint azt az alábbiakban részletesen bemutatjuk, egy vad típusú p53 tumorszupresszorgént expresszáló rekombináns adenovírus, amint azt az előzőkben ismertettük, képes hatékonyan gátolni a DNS-szintézist, és elnyomja nagyszámú különböző humán tumorsejttípus növekedését, beleértve a klinikai célpontokat is. Emellett a rekombináns adenovírusok képezek tumorszupressziós gének, azaz például a p53 expressziójára egy in vivő megállapodott tumorban, anélkül, hogy közvetlenül a tumorba kellene injekciózni, vagy előzőleg ex vivő kezelni kellene a rákos sejteket. Az expresszált p53 funkcionális és hatékonyan elnyomja in vivő körülmények között a tumomövekedést, és jelentősen növeli a meztelen egér humán tüdőrákmodellben a túlélési időt.

Tehát a jelen találmány szerinti vektorok különösen alkalmasak a génterápiára. Ennek megfelelően, az ezeket a vektorokat hasznosító génterápiás módszerek a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. A vektort tisztítjuk, majd hatékony mennyiséget juttatunk be in vivő vagy ex vivő az alanyba. A génterápia módszerei jól ismertek a szakirodalomban [Larrick, J. W. és Burck, K. L.: „Gene Therapy: Application of Molecular Biology”, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991); Kreigler, M.: „Gene Transfer and Expresszion: A Laboratory Manual”, W. H. Freeman and Company, New York (1990)]. Az „alany” jelentése bármely állat, emlős, patkány, rágcsáló, szarvasmarha, sertés, ló, kutya, macska vagy humán beteg. Ha az idegen gén egy tumorszupresszor-fehérjét vagy egyéb antitumorfehérjét kódol, akkor a vektor jól használható egy alanyban a hiperproliferatív sejtek kezelésére vagy csökkentésére, a tumor szaporodásának gátlására egy alanyban, vagy egy rokon patológia enyhítésére. A patológiás hiperproliferatív sejtek az alábbi kóros állapotokra jellemzők: tiroid hiperplázia - Grave-féle betegség, pszoriázis, rosszindulatú prosztatahipertrófia, Li-Fraumeni-szindróma, beleértve az emlőrákot, szarkómákat és egyéb neoplazmákat, hólyagrák, vastagbélrák, tüdőrák, különböző leukémiák és limfómák. A nem patológiás hiperproliferatív sejtek megtalálhatók például az emlővezetékek epiteliális sejtjeiben a laktáció kifejlődése idején, valamint a sebgyógyuláshoz kapcsolódó sejtekben. A patológiás hiperproliferatív sejtek jellemzően elvesztik a kontakt gátlás képességét, és az a képességük is csökken, hogy szelektíven tapadjanak, ami sejtfelszíni tulajdonságainak változását is jelenti, valamint az intercelluláris kommunikáció további leromlását. Ezek közé a változások közé tartozik az osztódás serkentése és a proteolitikus enzimek szekretálásának képessége.

Emellett a jelen találmány tárgyát képezi egy módszer a csontvelő regenerálódása során a hematopoietikus prekurzorokat szennyező megfelelő patológiás emlős hiperproliferatív sejtmintacsökkentése, egy vad típusú tumorszupresszorgén bejuttatásával a sejtkészítménybe, a jelen találmány szerinti vektort használva (autológ perifériális vérből vagy csontvelőből származik). A továbbiakban a „megfelelő minta” szakkifejezést egy olyan heterogén sejtkészítményként határozzuk meg, amelyet egy betegből kaptunk, azaz sejteknek egy kevert populációja, amelyek mind fenotípusosan normál, mind fenotípusosan patogén sejteket tartalmaznak. A „beadás” szakkifejezés azt jelenti, hogy a sejtbe vagy a betegbe intravénásán, a tumorba való közvetlen injekcióval, intratumorális injekcióval, intraperitoneális úton, aeroszol formában a tüdőbe vagy topikálisan juttatjuk be az anyagot. Egy ilyen beadást egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálhatunk, amelyet az előzőkben ismertettünk.

A „csökkent tumorigenicitás” szakkifejezés jelentése olyan tumorsejtekre vonatkozik, amelyek kevésbé tumorigén vagy nem tumorigénsejtekké alakultak át. A csökkent tumorigenicitású sejtek vagy in vivő nem képeznek tumorokat, vagy hetekkel, hónapokkal meghosszabbodott lappangási idővel rendelkeznek az in vivő tumomövekedés megjelenése előtt, és/vagy lassabban növekedő háromdimenziós tumortömeget képeznek az inaktivált vagy nem működő tumorszupresszorgént tartalmazó tumorokkal összehasonlítva.

A továbbiakban a „hatékony mennyiség” szakkifejezés olyan mennyiségű vektort vagy rákellenes fehérjét jelent, amely pozitív eredményt ér el a sejtszaporo10

HU 223 733 BI dás gátlásában. Például egy dózis körülbelül 10⁸- 1O¹³ fertőzési egységet tartalmaz. Egy jellemző kezelés napi egy ilyen dózis öt napig. A hatékony mennyiség változik a patológiától vagy a kezelendő állapottól függően, a betegtől és az állapotától függően, valamint egyéb a szakterületen jártas szakember számára ismert faktoroktól függően. A hatékony mennyiséget a szakterületen jártas szakemberek könnyen meg tudják határozni.

A jelen találmány oltalmi körébe tartozik továbbá egy kóros állapot enyhítése, amelyet egy alanyban a hiperproliferatív sejtek vagy genetikai defektus jellemez, az alanynak az előzőkben ismertetett vektorból hatékony mennyiséget beadva, amely vektor egy génterméket kódoló idegen gént tartalmaz, amely géntermék megfelelő körülmények között képes a kóros állapotot enyhíteni. A továbbiakban a „genetikai defektus” jelentése bármely olyan betegség vagy rendellenesség, amely öröklött tényezők következménye, ilyen például a sarlósejtes vérszegénység vagy a Tay-Sachs-betegség.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás tumorsejtek szaporodásának gátlására egy alanyban, a tumor tömegébe hatékony mennyiséget juttatva egy adenovírus expressziós vektorból, amely egy tumorszupresszorgéntől eltérő antitumorgént tartalmaz. Az antitumorgén kódolhat például timidin-kinázt (TK). Az alanynak azután hatásos mennyiséget adunk be egy terápiás ágensből, amely az antitumorgén jelenlétében toxikus a sejtre. A timidin-kináz specifikus esetében a terápiás ágens egy timidin-kináz-metabolit, azaz például a ganciklovir (GCV), a 6-metoxi-purin-arabinonukleozid (araM), illetve ezek funkcionális ekvivalensei. A timidin-kinázgént és a timidin-kinázt egyszerre kell használni ahhoz, hogy a gazdasejt számára toxikusak legyenek. A jelenlétében azonban a GCV foszforileződik és a DNS-szintézis hatékony inhibitora lesz, míg az araM a citotoxikus araATP-anabolittá alakul át. Más antitumorgének is használhatók a megfelelő terápiás ágenssel, hogy a tumorsejtek szaporodását csökkentsük. Az ilyen egyéb gén-terápiás ágens kombinációk jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Egy másik példa lehet a jelen találmány szerinti vektor, amely a citozindezamináz-enzimet kódolja. Ezt a vektort az 5-fluoruracil-gyógyszerrel együtt beadva használhatjuk [Austin, E. A. és Huber, Β. E.: Mól. Pharmaceutical 43, 380-387 (1993)], vagy a nemrég felfedezett Escherichia coli Deo Δ-gént használhatjuk a 6-metil-purin-2’dezoxiribonukleoziddal [Sorscher, E. J. és munkatársai: Gene Therapy 1, 233-238 (1994)].

Ugyanúgy, mint az előzőkben ismertetett tumorszupresszorgéneknél, az egyéb antitumorgének vagy önmagukban, vagy a megfelelő terápiás ágenssel együtt megfelelő kezelést jelentenek a tumorok és rosszindulatú állapotok ellenőrizetlen sejtnövekedésével szemben. A találmány tárgya tehát terápia a szabályozatlan növekedés megállítására a betegben, és ezáltal a betegben meglevő betegség vagy kahexia tüneteinek csökkentésére. Ennek a kezelésnek a hatásai közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a beteg hosszabb túlélési időtartama, a tumor tömegének vagy terhelésének csökkenése, a tumorsejtek apoptózisa, illetve a keringő tumorsejtek számának csökkenése. Ennek a kezelésnek az előnyös hatásainak mennyiségi becslési módszerei jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

A jelen találmány tárgya egy rekombináns adenovírus expressziós vektor, amelyet az adenovírus IX-es fehérje DNS-ének részleges vagy teljes deléciója jellemez, valamint az, hogy egy idegen fehérjét kódoló idegen gént tartalmaz, ahol is az idegen fehérje egy öngyilkos gén, illetve annak funkcionális ekvivalense. A rákellenes TK-gén, amelyet az előzőkben ismertettünk, az öngyilkos gének egy példája, mivel, ha expresszáljuk, akkor a géntermék letális, vagy letálissá tehető a sejt számára. A TK esetében a letalitást a GCV jelenléte indukálja. A TK-gén a herpesz szimplex vírusból származik, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerrel. Az Escherichia coli HB101 törzsben (ATCC #39 369) levő pMLBKTK plazmid a herpesz szimplex vírus (HSV-1) timidin-kináz (TK)-gén forrása a jelen találmányban való alkalmazás céljára. Azonban számos más forrás is létezik.

A TK-gént úgy lehet bejuttatni a tumortömegbe, hogy kombináljuk az adenovírus expressziós vektort egy megfelelő gyógyászatilag elfogadható hordozóval. A bejuttatást elvégezhetjük például a rekombináns adenovírusnak a tumortömegbe való közvetlen injekciózásával. Az egyes rákok specifikus eseteiben, mint például a hepatocelluláris karcinóma (HCC) esetében a máj artériákba való közvetlen injekciózás használható a bejuttatáshoz, mivel a legtöbb HCC az ezekben az artériákban való keringésükből származik. A tumor szaporodásának gátlására sejtpusztulást indukálunk, oly módon, hogy a beteget egy TK-metabolittal kezeljük, azaz például ganciklovirral, hogy elérjük a tumortömeg redukcióját. A TK-metabolitot beadhatjuk például szisztémásán, a tumorba való lokális beoltással, vagy a HCC specifikus esetében a májartériába való injekciózással. A TK-metabolitot előnyösen naponta egyszer injekciózzuk, de ez a gyakoriság szükség szerint növelhető vagy csökkenthető. A TK-metabolitot a TK-t tartalmazó vektorral egyszerre vagy egymás után is beadhatjuk. A szakterületen jártas szakember tudja, vagy meg tudja határozni azt a dózist és időtartamot, amely gyógyászatilag hatékony.

Egy tumorszupresszorgén tumorspecifikus bejuttatását úgy hajtjuk végre, hogy az egy állatban levő célszövetet a jelen találmány szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe. A génnek egy antitumor ágenst kell kódolnia, azaz egy funkcionális tumorszupresszorgénnek vagy öngyilkos génnek kell lennie. Az „érintkeztetés” szakkifejezés bármely olyan bejuttatási módszerre vonatkozhat, amely a vektor hatékony transzferét biztosítja, ilyen például az intratumorális injekció.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a jelen találmány szerinti adenovírusvektor alkalmazása egy betegség kezelésére szolgáló gyógyszerek készítéséhez.

Az alábbi példákkal a találmányt csak illusztráljuk, céljuk nem a jelen találmány oltalmi körének korlátozása.

HU 223 733 Β1

I. kísérlet

A pAd/MLP/p53/Elb- plazmidot használjuk ezeknek a manipulációknak a kiindulási anyagaként. Ez a plazmid a pML2 jelű pBR322 származékon alapul (a pBR322-ből a 1140-2490-es bázispárokat kivágtuk), és 5-ös típusú adenovírusszekvenciákat tartalmaz, amely az 1-5788-as bázispárokra terjed ki, azzal az eltéréssel, hogy a 357-3327-es 5-ös típusú adenovírusnukleotidokat kivágtuk belőle. Az Ad5 357/3327 deléciós pontnál egy transzkripciós egységet építettünk bele, amely a 2-es típusú adenovírus fő késői promoterét tartalmazza, valamint a 2-es típusú háromrészes vezér-cDNS-t és a humán p53 cDNS-t. Ez egy tipikus El-helyettesítő vektor, amelyből kivágtuk az Ad5 Ela és Elb géneket, de tartalmazza az Ad5 IX-es fehérje génjét [Graham, F. L. és Prevec, L.: „Vaccines: New Approaches to Immunological Problems”; 363-390, szerk.: R. W. Ellis, Butterworth-Heinemann, Boston (1992)]. Az Ad2 DNS-t a Gibco BRLtől szereztük be. A restrikciós endonukleázokat és a T4 DNS ligázt a New England Biolabs-tól szereztük be. Az Escherichia coli DH_sa kompetens sejteket a Gibco BRL-től szereztük be, a 293-as sejteket pedig az American Type Culture Collectiontől szereztük be (ATCC). A Prep-A-Gene DNS-tisztító gyantát a BioRad-tól szereztük be. Az LB baktérium szaporító táptalajt a Difcótól szereztük be. A Qiagen DNS-tisztító oszlopokat a Qiagen Inc-től szereztük be. Az Ad5 dl327-et R. J. Schneidertől szereztük be, NYU. Az MBS DNS transzfekciós kittet a Stratagene-től szereztük be.

Egy pg pAd/MLP/p53/Elb- DNS-t emésztünk 2020 egység Eel 13611 és NgoMI restrikciós enzimmel, a gyártó előírásai szerint. 5 pg Ad2 DNS-t emésztünk 20-20 egység Dral és BgoMI restrikciós enzimmel, a gyártó előírásai szerint. A restrikciós emésztés reakcióelegyét 0,8%-os agarózgél különböző sávjaiba visszük, majd 100 volt feszültség mellett 2 óra hosszat elektroforetizáljuk. A pAD/MLP/p53/Elb- mintából származó 4268 bp méretű restrikciós ffagmenst és az Ad2 mintából származó 6437 bázispár méretű restrikciós ffagmenst izoláljuk a gélből, Prep-A-Gene DNS extrakciós gyantával, a gyártó előírásai szerint. A restrikciós fragmenseket összekeverjük, majd T4 DNS ligázzal kezeljük 50 pl össztérfogatban 16 °C-on 16 óra hosszat, a gyártó előírásai szerint. A ligálást követően a reakcióelegyből 5 pl-t használunk Escherichia coli DH₅a-sejtek ampicillinrezisztenssé való transzformálására, a gyártó által megadott eljárás alapján. Az ebből az eljárásból származó hat baktériumtelepet használjuk 2-2 ml-es LB táptalaj beoltására, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, rázatás közben. Az egyes baktériumtenyészetekből DNS-t készítünk, standard eljárások alkalmazásával [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. Az egyes izolátumokból származó plazmidok egynegyedét 20 egység Xhol restrikciós enzimmel emésztjük, hogy megkapjuk azt a helyes rekombinánst, amely a 3627, 3167, 2466 és 1445 bázispár méretű Xhol restrikciós fragmenseket tartalmazza. A hat átvizsgált izolátumból öt a korrekt plazmidot tartalmazza. Ezek közül egyet használunk azután egy egyliteres LB táptalaj beoltására, nagyobb mennyiségű plazmid DNS tisztítása céljából. Éjszakán át való tenyésztés után plazmid DNS-t izolálunk az egyliteres tenyészetből, Qiagen DNS-tisztító oszlopokat alkalmazva, a gyártó előírásai szerint. A kapott plazmid jele pAD/MLP/p53/PIX-. Ebből a plazmidból 1993. október 22-én egy mintát letétbe helyeztünk az American Type Culture Collectionnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 12301). A letétet a Budapesti Egyezmény alapján helyeztük az International Deposit of Microorganisms fór the Purpose of Patent Procedure-nél. A letét ATCC letéti száma 75 576.

Egy rekombináns adenovírus készítéséhez 10 pg pAD/MLP/p53/PIX- plazmidot kezelünk 40 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal, a plazmid linearizálása céljából. Az 5-ös típusú dl327 DNS-t [Thimappaya, B. és munkatársai: Cancer Research 52, 2340-2343 (1992)] Clal restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd a nagy ffagmenst (körülbelül 33 kilobázispár) szacharózgradiens-centrifugálással tisztítjuk. 10 pg EcoRI-gyel kezelt pAD/MLP/p53/ElbDNS-t, 2,5 pg Clal restrikciós endonukleázzal kezelt Ad5 dl327 DNS-t összekeverünk, majd ezt használjuk körülbelül 10⁶ 293-as sejt transzfektálására, az MBS emlős transzfekciós kitet használva, a gyártó javaslatai szerint. A transzfekció után 8 nappal a 293-as sejteket 1:3 arányban friss táptalajba tesszük, majd két nappal ezután az adenovírussal indukált citopatikus hatás nyilvánvalóvá válik a transzfektált sejteken. 13 nappal a transzfekció után DNS-t készítünk a fertőzött sejtekből, standard eljárások alkalmazásával [Graham, F. L. és Prevec, L.: „Vaccines: New Approaches to Immunological Problems”; 363-390, szerk.: R. W. Ellis, Butterworth-Heinemann, Boston (1992)], majd restrikciós emésztéssel elemezzük, Xhol restrikciós endonukleáz alkalmazásával. A p53 vírussal vezérelt expresszióját Saos-2 oszteoszarkómasejteknek a víruslizátummal való fertőzése, majd egy 1801 jelű antip53 monoklonális ellenanyaggal (Novocasta Láb. Ltd., UK) való immunblotolásával mutatjuk ki.

II. kísérlet

Anyagok és módszerek

Sejtvonalak

A rekombináns adenovírusokat a 293-as humán embrionális vesesejtvonalban (ATCC CRL 1573) növesztjük és szaporítjuk, amit 10% meghatározott, kiegészített borjúszérumot (Hyclone) tartalmazó DME táptalajban tartunk fenn. A Saos-2 sejteket 15% borjúmagzatszérummal kiegészített Kaighn-féle táptalajban tartjuk fenn. A HeLa és Hep 3B sejteket 10% borjúmagzatszérummal kiegészített DME táptalajban tartjuk fenn. Minden egyéb sejtvonalat 10% borjúmagzatszérummal kiegészített DME táptalajban tartunk fenn. A Saos-2 sejteket Dr. Eric Stanbridge-től kaptuk. Minden egyéb sejtvonalat az ATCC-től szereztünk be.

HU 223 733 Bl

A rekombináns adenovírusok készítése

Az Ad5/p53 vírusok készítéséhez a p53 teljes hosszúságú cDNS-ét tartalmazó 1,4 kilobázis méretű HindlII-Smal fragmenst pGEMl-p53-B-T plazmidból izoláljuk (Dr. Wen Hwa Lee szívességéből), majd a pSP72 expressziós vektor (Promega) többszörös klónozóhelyére illesztjük be, standard klónozási eljárások alkalmazásával [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A p53-as inszertet ebből a vektorból nyerjük ki, XhoI-BglII restrikciós enzimekkel való emésztés és gélelektroforézis után. A p53-at kódoló szekvenciát azután vagy a pNL3C vagy a pNL3CMV adenovírus géntranszfer vektorokba illesztjük be (dr. Róbert Schneider szívességéből), amely az Ad5 5’ fordított terminális ismétlődést, valamint virális pakolást szignálokat, és az El A fokozót tartalmazza vagy az Ad2 fő késői promoter (MLP) vagy a humán citomegalovírus (CMV) korai génpromotere előtt, majd ezt követi egy háromrészes vezér-cDNS és a 3325-5525-ös Ad5 szekvencia egy PML2 háttérben. Ezek az új konstrukciók helyettesítik az Ad5 El régióját (360-3325-ös bázispár) a p53-mal, amit vagy az Ad2 MLP (A/M/53) vagy a humán CMV-promoter (A/C/53) hajt meg, és mindegyiket a háromrészes vezércDNS követi (lásd 4. ábra). A p53-as inszertek a 3’ irányban megmaradt Elb poliadenilezési helyet használják. További MLP-vei és CMV-vel meghajtott p53as rekombinánsokat (A/M/N/53, A/C/N/53) készítünk, amelyek az Ad 5 szekvenciában további 705 nukleotid hosszúságú deléciókat tartalmaznak, a IX-es fehérje (PIX) kódolórégiójának eltávolítására. Kontrollként egy rekombináns adenovírust készítünk a kiindulási pNL3C plazmidból, amely nem tartalmazza a p53-as inszertet (A/M). Egy második kontroll egy rekombináns adenovírus, amely a β-galaktozidázt kódoló gént tartalmazza, a CMV-promoter által meghajtva (A/C^-gal). A plazmidokat vagy Nrul vagy EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd Clal restrikciós enzimmel emésztett Ad5 dl309 vagy dl327 mutánssal kotranszfektáljuk [Jones, N. és Shenk, T.: Cell. 17, 683-689 (1979)], Ca/PO₄ transzfekciós kit alkalmazásával (Stratagene). A virális tarfoltokat izoláljuk, majd a rekombinánsokat mind restrikciós enzimes elemzéssel mind PCR-rel azonosítjuk, a háromrészes vezér-cDNS-szekvencia elleni rekombináns specifikus primerek és 3’ irányú cDNSszekvencia alkalmazásával. A rekombináns vírust tovább hígítjuk határhígítással, majd a vírusrészecskéket tisztítjuk és titerüket standard módszerekkel meghatározzuk [Graham, F. L. és van dér Erb A. J.: Virology 52, 456-467 (1973); Graham, F. L. és Prevec, L.: „Manipulation of adenovírus vectors” In: „Methods in Molecular Biology 7: Gene Transfer and Expresszion Protocols”; szerk.: Murray, E. J., The Humán Press Inc., CliftonN. J„ 7 109-128(1991)].

A p53 fehérje kimutatása

Saos-2 vagy Hep 3B sejteket (5 χ 10⁵) fertőzünk a jelzett rekombináns adenovírusokkal 24 óra hosszat, a vírus/sejt tarfoltképző egységek növekvő fertőzési multiplicitásával (MOI). A sejteket azután egyszer mossuk

PBS-sel, majd lizálópufferben gyűjtjük össze (50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,5, 250 mmol/1 NaCl, 0,1% NP40, 50 mmol/1 NaF, 5 mmol/1 EDTA, 10 pg/ml aprotinin, 10 pg/ml leupeptin és 1 mmol/1 PMSF). A sejtfehérjéket (körülbelül 30 pg) 10%-os SDS-PAGE-val választjuk el, majd nitrocellulózra visszük át. A membránokat PAb 1801 jelű a-p53 ellenanyaggal (Novocastro) inkubáljuk, majd birka-antiegér IgG-vel, amelyhez tormaperoxidázt konjugáltunk. A p53 fehérjét kemilumineszcenciával tesszük láthatóvá (ECL kit, Amersham) Kodak XAR-5 filmen.

A DNS-szintézis sebességének mérése

Sejteket (5x 10³/luk) 96 lukas mikrotiterlemezekre szélesztünk (Costar), majd hagyjuk, hogy egy éjszakán át megtapadjanak (37 °C, 7% CO₂). A sejteket azután 24 óra hosszat tisztított rekombináns vírusrészecskékkel fertőzzük 0,3-100 MOI-érték mellett, ahogy azt az előzőkben jeleztük. A táptalajt a fertőzés után 24 órával kicseréljük, majd az ínkubálást összesen 72 óra hosszat folytatjuk. A kinyerés előtt 18 órával ³H-timidint (Amersham, 1 pCi/luk) adunk a tenyészethez. A sejteket üvegszálas szűrőkre nyerjük ki, majd a beépült radioaktivitás szintjét béta-szcintillációs-számlálóval mérjük. A ³H-timidin beépülését a táptalaj kontrollátlagszázalékában (±SD) fejezzük ki, és a MOI-val szemben ábrázoljuk.

Tumorigenitás meztelen egerekben

Körülbelül 2,4 χ 10⁸ Saos-2 sejtet, T225 palackban szélesztve, kezelünk szuszpenziós pufferrel (1% szacharóz PBS-ben), amely vagy A/M/N/53, vagy A/M tisztított vírust tartalmaz, a MOI-értéke pedig 3 vagy 30. Egy éjszakán át tartó fertőzést követően a sejteket szubkután injekciózzuk BALB/c atímuszos meztelen egerek jobb és bal oldali ágyékába (4 egér per csoport). Az egyik ágyékot az Α/Μ/Ν/53-mal kezelt sejtekkel injekciózzuk, míg a másik ágyékot a kontroll A/M-mel kezelt sejtekkel injekciózzuk, mindegyik egér saját kontrollja egyben. További kontrollt jelentenek azok az állatok, amelyek pufferrel kezelt sejtekből kapnak kétoldali injekciót. Nyolc héten át minden egyes állatnál hetente kétszer megmérjük a tumor méreteit (hosszúság, szélesség és magasság) és a testsúlyokat. A tumorok térfogatát minden egyes állatnál gömbgeometriát feltételezve becsüljük meg, ahol a sugár egyenlő a mért tumordimenziók átlagának felével.

Intratumorális RNS-elemzés

BALB/c atímuszos egereket (körülbelül 5 hetesek) injekciózunk szubkután 1 χ ΙΟ⁷ H69 kissejtes tüdőkarcinóma (SCLC)-sejtekkel a jobb ágyékukba. A tumorokat 32 napig hagyjuk fejlődni, amíg el nem érik a körülbelül 25-50 mm³ térfogatot. Egerek az A/C/53 vagy A/C/p-gal rekombináns adenovírusból peritumorális injekciókat kapnak [2 χ 10⁹ tarfoltképző egység (pfü)] a tumortömeg alatti szubkután térbe. A tumorokat kivágjuk az állatokból 2-7 nappal az adenovíruskezelés után, majd PBS-sel öblítjük. A tumormintákat homogenizáljuk, majd össz-RNS-t izolálunk egy TriReagent kittel (Molecular Research Center, Inc.). PoliA RNS-t izolálunk, PolyTract mRNA Isolation Systemmel (Promega), majd körülbelül 10 ng mintát használunk a re13

HU 223 733 Bl kombináns p53 mRNS-expressziójának RT-PCR-es kimutatására [Wang, A. M., Doyle, Μ. V. és Mark, D. F.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 9717-9721 (1989)]. A primereket úgy terveztük, hogy az adenovírus háromrészes vezér-cDNS és a 3’ irányban levő p53 cDNS között szekvenciát amplifikálják, biztosítva ezzel, hogy csak rekombináns p53-at amplifikálunk, endogén p53-at nem.

Megállapodott tumorok p53-gén-terápiája meztelen egerekben

200 μΐ térfogatban körülbelül 1 χ 10⁷ H69 (SCLC) tumorsejtet injekciózunk szubkután nőstény BALB/c atimuszos egerekbe. A tumorokat 2 hétig hagyjuk fejlődni, amikor az állatokat a tumorméret alapján randomizáljuk (N=5/csoport). Az A/M/N/53 vagy a kontroll A/M adenovírus peritoneális injekciókat (2xl0⁹ pfu/injekció) hetente kétszer adjuk be, csoportonként összesen 8 dózisban. A tumordimenziókat és a testsúlyokat hetente kétszer mérjük 7 hétig, majd a tumortérfogatot az előzőkben ismertetett módon becsüljük meg. Ezután megfigyeljük az állatokat, hogy kiderüljön a kezelésnek az egér túlélésére gyakorolt hatása.

Eredmények

A rekombináns p53 adenovírus készítése

A p53 adenovírusokat úgy állítjuk elő, hogy az 5-ös típusú adenovírus Elb és Ela régióinak egy részét p53 cDNS-sel helyettesítjük, az Ad2 MLP (A/M/53) vagy a CMV (A/C/53) promoterrel meghajtva (sematizálva lásd a 4. ábrán). Ez az El-helyettesítés súlyosan károsítja a rekombináns adenovírusnak a replikációs képességét, szaporodását a 293-as sejtekre korlátozva, amelyek az Ad5 El géntermékeket szolgáltatják írazwz-ban [Graham, F. L., Smiley, I, Russell, W. C. és Naim, R.: J. Gén. Virol. 36, 59-74 (1977)]. A p53 rekombináns adenovírus restrikciós emésztéssel és PCR elemzéssel való azonosítása után az egyik rekombináns adenovírus (A/M/53) teljes p53 cDNS-szekvenciáját meghatározzuk, hogy igazoljuk azt, hogy nincsenek benne mutációk. Ezt követően a p53 rekombinánsok tisztított készítményeit használjuk HeLa-sejtek fertőzésére, hogy vizsgáljuk a vad fenotípusú adenovírusok jelenlétét. A HeLa-sejteket, amelyek nem engedik meg az El deléciót hordozó adenovírus replikációját, 1 -4 χ 10⁹ fertőzési egységnyi rekombináns adenovírussal fertőzzük, 3 hétig szaporítjuk, majd megfigyeljük a citopatikus hatás (CPE) feltűnését. Ezzel a vizsgálattal rekombináns adenovírusreplikáció vagy vad típusú fertőzés nem mutatható ki, amit könnyen nyilvánvalóvá tesz a vad típusú adenovírussal 1 χ 10⁹ érzékenységgel megfertőzött kontrolisejtekben megfigyelt CPE. p53 fehérje expressziója rekombináns adenovírusról

Annak meghatározására, hogy a p53 rekombináns adenovírusok expresszálnak-e p53 fehérjét, endogén p53-at nem expresszáló tumorsejteket fertőzünk. A Saos-2 (oszteoszarkóma) és Hep 3B (hepatocelluláris szarkóma) humán tumorsejteket 24 óráig fertőzzük A/M/53 vagy A/C/53 p53 rekombináns adenovírussal, a MOI-értékek 0,1-200 pfu/sejt között változnak. A fertőzött sejtekből készített lizátum Westem-blotelemzése mindkét sejttípusban dózisíuggő p53 fehérjeexpressziót mutat (5. ábra). Mindkét sejt magasabb szinten expresszálja a p53 fehérjét ha A/C/53 konstrukcióval fertőzzük, mint ha A/M/53 konstrukcióval fertőzzük (3. ábra). Nem mutatható ki p53 fehérje a nem fertőzött sejtekben. Az endogén vad típusú p53 szintje általában meglehetősen alacsony, és majdnem kimutathatatlan a sejtkivonat Westem-blot-elemzésével [Bartek, J., Bartkova, J., Vojtesek, B., Staskova, Z., Lukas, 1, Rejthar, A., Kovarik, J., Midgley, C. A., Gannon, J. V. és Lane, D. P.: Onogene 6, 1699-1703 (1991)]. Az azonban világos, hogy a vad típusú p53 fehéije szintje könnyen kimutatható A/M/53 konstrukcióval vagy A/C/53 konstrukcióval való fertőzés után, az alacsony MOI-k mellett (5. ábra), mutatva ezzel, hogy még alacsony dózisú p53 rekombináns adenovírusok is képesek potenciálisan hatékony szintű p53 szinteket produkálni. p53-dependens morfológiai változások

A vad típusú p53 újra bejuttatása a p53-negatív oszteoszarkóma-sejtvonalba a Saos-2-be, ezeknek a normális körülmények között orsó alakú sejteknek jellegzetes megnagyobbodását és kövéredését eredményezi [Chen, Y., Chen, P. L., Amaiz, N., Goodrich, D. és Lee, W. H.: Oncogene 6, 1799-1805 (1991)]. Nem teljesen egybefüggő Saos-2 sejteket (1 χ 10⁵ sejt/10 cm-es lemez) 50-es MOI-val fertőzünk az A/C/53 vagy a kontroll A/M vírussal, majd 72 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, ameddig a nem fertőzött kontroli-lemezek egybefüggőek nem lesznek. Ennél a pontnál a várt morfológiai változás nyilvánvaló az A/C/53 vírussal kezelt lemezen (6. ábra, C panel), de a fertőzetlenen nem (6. ábra, A panel), és a kontrolivírussal fertőzött lemezen sem (6. ábra, B panel). Ez a hatás nem a sejtsűrűség függvénye, mivel az először alacsonyabb sejtsűrűséggel beoltott kontroli-lemez megtartja a normális morfológiát 72 óra elteltével is, amikor az egybenövés mértéke megközelíti az A/C/53 konstrukcióval kezelt lemezek egybenövésének mértékét. A korábbi eredmények azt igazolják, hogy a p53 fehérje magas szinten expresszálódik Saos-2 sejtekben MOI 50es értéknél (5A. ábra), és ezek az eredmények bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az ezek által a rekombináns vírusok által expresszált p53 fehéije biológiailag aktív.

A sejt DNS-szintézisének gátlása p53-mal

Ahhoz, hogy tovább vizsgáljuk a p53 rekombináns adenovírusok aktivitását, azt a képességüket vizsgáljuk, hogy mennyire képesek gátolni a humán tumorsejtek szaporodását, a ³H-timidin-felvétel alapján mérve. Korábban kimutatták, hogy a vad típusú p53 bejuttatása a sejtekbe, amelyek nem expresszálnak endogén vad típusú p53 fehérjét, képes a sejteket a G_t/S átmenetben leállítani, ezzel meggátolja a jelzett timidin felvételét az újonnan szintetizált DNS-be [Baker, S. J., Markowitz, S., Fearon, E. R., Willson, J. K. V. és Vogelstein, B.: Science 249, 912-915 (1990); Mercer, W. E. és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 6166-6170 (1990); Diller, L. és munkatársai: Mól. Cell. Biology 10 5772-5781 (1990)]. A p53-deficiens tumorsejtvonalak egy varián14

HU 223 733 Bl sát fertőzzük az A/M/N/53 konstrukcióval, vagy az A/C/N/53 konstrukcióval, vagy egy p53-at nem expresszáló kontroll-rekombinánsvírussal. A vizsgált 9 tumorsejtvonal közül hétben a DNS-szintézis erős, dózisíüggő gátlása figyelhető meg mind az A/M/N/53, mind az A/C/N/53 rekombinánsokkal (7. ábra). Mindkét konstrukció képes gátolni a DNS szintézisét ezekben a humán tumorsejtekben, függetlenül attól, hogy képesek-e expresszálni a mutáns p53-at vagy nem. Az is kiderült, hogy ebben a vizsgálatban az A/C/N/53 konstrukció következetesen hatékonyabb mint az A/M/N/53 konstrukció. Saos-2 (oszteoszarkóma) és MDA-MB468 (emlőtumor) sejtekben a DNS szintézisét közel 100%-ban gátolja az A/C/N/53 konstrukció, még 10-es MOI-érték mellett is. Azoknál a dózisoknál, ahol a kontrolladenovírus által kifejtett gátlás csak 10-30%, egy 50-100%-os redukció figyelhető meg a DNS szintézisében, akármelyik p53 rekombináns használatával. Ezzel szemben a kontrollvírussal összehasonlítva nem figyelhető meg jelentős p53-specifikus hatás egyik konstrukcióval sem HEP G2 sejtekben [hepatokarcinómasejtek, amelyek endogén vad típusú p53-at expresszálnak [Bressac. B., Galvin, K. M., Liang, T. J., Isselbacher, K. J., Wands, J. R. és Ozturk, M.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 1973-1977 (1990)], sem a K562 (p53 null) leukémiás sejtvonalban.

Tumorigenitás meztelen egerekben

A p53 rekombináns adenovírusok működésének sokkal szigorúbb vizsgálata során tumorsejteket fertőzünk ex vivő, majd a sejteket meztelen egerekbe injekciózzuk, hogy megbecsüljük a rekombinánsok tumorelnyomó képességét in vivő. Α/Μ/Ν/53-mal vagy kontroll A/M vírussal 3-30-as MOI-val fertőzött Saos-2 sejteket injekciózunk meztelen egerek ellentétes ágyékába. A tumorok méretét 8 hétig hetente kétszer mérjük. A 30-as MOI-érték mellett nem figyelhető meg tumomövekedés egyik állat p53-mal kezelt ágyékában sem, míg a kontrollal kezelt tumorok folyamatosan nőttek. (8. ábra). A kontrollvírussal kezelt tumorok folyamatos növekedése hasonló a pufferrel kezelt kontrollállatoknál megfigyelthez. Világos különbség mutatkozott a tumomövekedésben a kontrolladenovírus és a p53 rekombináns között MOI=3 értéknél, jóllehet a 4 p53-mal kezelt egér közül kettőben a tumorok elkezdtek növekedni körülbelül 6 hét elteltével. Tehát az A/M/N/53 rekombináns adenovírus képes befolyásolni a p53-specifikus tumor szupresszióját in vivő környezetben.

Az Ad/p53 in vivő expressziója

Jóllehet a ráksejtek ex vivő kezelése, majd ezt követő injekciózása állatokba kritikus tesztjét szolgáltatja a tumorszupressziónak, egy klinikailag sokkal többet érő kísérlet az, ha meghatározzuk, hogy az injekciózott p53 rekombináns adenovírus képes-e fertőzni, és p53at expresszálni in vivő megállapodott tumorokban. Ennek vizsgálatához H69 (SCLC, p53^nul1) sejteket injekciózunk meztelen egerekbe szubkután, majd 32 napig hagyjuk a tumorokat fejlődni. Ekkor egyetlen, az A/C/53 vagy az A/C/[i-gal adenovírusból 2χ 10⁹ pfu-t tartalmazó injekciót injekciózunk a tumort körülvevő peritumorális térbe. A tumorokat azután kivágjuk vagy az adenovírusinjekció utáni 2., vagy a 7. napon, és minden egyes tumorból poliA RNS-t izolálunk. Ezután RT-PCR-t használunk rekombináns p53-specifikus primerekkel a p53 mRNS kimutatására a p53-mal kezelt tumorokban (9. ábra, 1., 2., 4. és 5. sáv). Nem mutatható ki p53 jel a β-gal-lal kezelt állatokból kivágott tumorokban (9. ábra, 3. és 4. sáv). Aktinprimerekkel végzett amplifikáció szolgál kontrollként az RT-PCT reakcióban (9. ábra, 7-9. sáv), míg a rekombináns p53 szekvenciát tartalmazó plazmid szolgál pozitív kontrollként a rekombináns p53-specifikus sávhoz (9. ábra, 10. sáv). Ez a kísérlet azt demonstrálja, hogy egy p53 rekombináns adenovírus képes specifikusan vezérelni a p53 mRNS expresszióját egy megállapodott tumorban, egyetlen, a peritumorális térbe adott injekciót követően. In vivő a vírus legalább egy hétig fennmarad egy p53 rekombináns adenovírussal való injekciózás után. In vivő hatékonyság

A génterápia megállapodott tumorok kezelésére való alkalmazhatóságának vizsgálatára egy tumorhordozó meztelenegér-modellt használunk. H69 sejteket injekciózunk egerek jobb ágyékának szubkután terébe, majd 2 hétig hagyjuk a tumorokat növekedni. Az egerek azután peritumorális injekciókat kapnak vagy csak pufferből, vagy a rekombináns vírusból, hetente kétszer, összesen 8 dózist. A pufferrel vagy kontroll A/M vírussal kezelt egerekben a tumorok gyorsan tovább nőttek a kezelés során, míg az A/M/N/53 vírussal kezeltek jelentősen csökkent sebességgel nőttek tovább (10A. ábra). Az injekciók leállítása után a kontrollal kezelt tumorok tovább nőttek, míg a p53-mal kezelt tumorok legalább egy hétig nagyon kis növekedést mutattak, vagy egyáltalán nem nőttek tovább exogén p53 további hozzáadása nélkül (10A. ábra). Jóllehet a csak pufferrel kezelt állatokban felgyorsult a tumomövekedés, bármelyik vírussal kezelt csoporttal összehasonlítva, a testsúlyban nem figyelhető meg szignifikáns eltérés a három csoport között a kezelés időtartama alatt. A 42. nap után néhány állatban a tumor kifekélyesedése korlátozta a tumorméret meghatározásának értékét. Azonban az állatok további megfigyelése a túlélési idő meghatározására a p53-mal kezelt állatok előnyét mutatja (10B. ábra). A kontrolladenovírussal kezelt állatok közül az utolsó a 83. napon pusztult el, míg a csak pufferrel kezelt kontrollok közül mindegyik elpusztult az 56. napig. Ezzel szemben mind az 5, A/M/V/53-mal kezelt állat tovább élt (a fertőzés utáni 130. napon is) (10B. ábra). Ezek az adatok együttesen egy p53-specifikus hatást mutatnak mind a tumomövekedésre, mind a túlélési időre, megállapodott p53-deficiens tumorokat hordozó állatok esetében.

p53-at expresszáló adenovírusok

Rekombináns humán adenovírusvektorokat készítünk, amelyek képesek nagy mennyiségű, vad típusú p53 fehérje expresszálására, dózisfüggő módon. Mindegyik vektor deléciót tartalmaz az Ela és Elb régiókban, amelyek a vírusreplikációra képtelenné teszik [Challberg, M. D. és Kelly, T. J.: Biochemistry

HU 223 733 Bl

76, 655-659 (1979); Horowitz, M. S.: „Adenoviridae and their replication”, In Fields Virology, szerk.: B. N. Fields (Raven Press, New York), 1679-1721 (1991)]. További jelentősége a dolognak, hogy ezek a deléciók az Elb 19 és 55 kDa-os fehérjéit kódoló szekvenciákra is kiterjednek. A 19 kDa méretű fehérjéről leírták, hogy szerepet játszik az apoptózisban [White, E. és munkatársai: Mól. Cell. Biology 12, 2570-2580 (1992); Rao, L., Debbas, M., Sabbatini, P., Hockenbery, D., Korsmeyer, S. és White, E.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 7742-7746 (1992)], míg az 55 kDa-os fehérje képes megkötni a vad típusú p53 fehérjét [Samov, P., Ho, Y. S., Williams, J. és Levine, A. J.: Cell. 28, 387-394 (1982); Heuvel, S. J. L„ Laar, T„ Kast, W. M., Melief, C. J. M., Zantema, A. és van dér Eb, A. J.: EMBO Journal 9, 2621-2629 (1990)]. Ezeknek az adenovírusszekvenciáknak a deléciójával eltávolítjuk a p53-funkció potenciális inhibitorait, amelyek vagy a p53-hoz való közvetlen kötődéssel, vagy a p53 által közvetített apoptózis potenciális gátlásával fejtik ki hatásukat. További konstrukciókat készítettünk, amelyekből kivágtuk az Elb szekvencia megmaradt 3’ részét is, beleértve minden IX fehérjét kódoló szekvenciát. Jóllehet erről leírták, hogy az adenovírus pakoló kapacitását körülbelül 3 kilobázissal csökkenti a vad típushoz viszonyítva [Ghosh-Choudhury, G., HajAhmad, Y. és Graham, F. L.: EMBO Journal 6, 1733-1739 (1987)], ezeket a konstrukciókat is kivágjuk az E3 régióban, így az A/M/N/53 és az A/C/N/53 konstrukciók bőven ezen a mérethatáron belül vannak. A pIX régió deléciójával a 293-as sejtekben levő szekvenciákkal homológ szekvenciák méretét körülbelül 300 bázispárra csökkentjük, ezzel csökkentve a valószínűségét annak, hogy replikációkompetens, vad típusú adenovírus regenerálódik rekombináció útján. Úgy látszik, hogy a pIX kódolószekvenciát nem tartalmazó konstrukciók ugyanolyan hatékonyak mint a pIX-et tartalmazó konstrukciók. p53/adenovírus hatékonyság in vitro

A p53 fehéije fertőzött sejtekben való expressziójának erős dózisfüggésével összhangban a tumorsejtek növekedésének dózisfüggő, p53-specifikus gátlását is ki lehet mutatni. A sejtosztódás és a DNS-szintézis gátlását nagyszámú különböző tumorsejttípusban sikerült kimutatni, amelyekben nincs vad típusú p53 expresszió. Bacchetti és Graham újabban leírták a DNS-szintézis p53-specifikus gátlását a SKOV-3 petefészekkarcinóma-sejtvonalban egy p53 rekombináns adenovírussal, hasonló kísérletekben [Bacchetti, S. és Graham, F.: International Journal of Oncology 3, 781-788 (1993)]. A petefészek-karcinóma mellett további, klinikailag fontos humán rákokra jellemző humán tumorsejtekről, beleértve a mutáns p53 fehérjét túlexpresszáló sejtvonalakat is, kimutatták, hogy növekedésüket gátolják a jelen találmány szerinti p53 rekombinánsok. Az olyan MOI-értékeknél, amelyeknél az A/C/N/53 rekombináns 90-100%-os hatékonysággal gátolja a DNS szintézisét ezekben a tumortípusokban, a kontrolladenovírus 20%nál alacsonyabb szupressziót mutat.

Jóllehet Feinstein és munkatársai leírták, hogy a vad típusú p53 újra bejuttatása K562 sejtekben indukálhatja a differenciálódást és növeli a G[ fázisban levő sejtek számát az S+G₂ fázisban levő sejtekkel szemben, ebben a sejtvonalban nem figyelhető meg p53specifikus hatás [Feinstein, E., Gale, R. P., Reed, J. and Canaani, E.: Oncogene 7, 1853-1857 (1992)]. Horváth és Weber leírták, hogy a humán perifériális vér limfocitái nagyon nem permisszívek az adenovírusfertőzésre [Horváth, J. and Weber, J. M.: J. Virol. 62, 341-345 (1988)]. Külön kísérletekben a rekombináns jelentősen megfertőzte a nem reagáló K562 sejteket a rekombináns A/C/3-gal adenovírussal, míg a többi sejtvonal, beleértve a kontroll Hep G2 sejtvonalat is, valamint azokat, amelyek erős p53-hatást mutatnak, könnyen fertőzhetők. Tehát a változatos hatékonyság legalább részben a fertőzés variabilitásának következményének látszik, jóllehet egyéb faktorok is szerepet játszhatnak.

Az A/M/N/53 vírussal kapott eredmények (8. ábra) azt mutatják, hogy egy in vivő környezetben lehetséges a teljes szupresszió. A négy, p53-mal kezelt állatból kettőnél a tumomövekedés újra beindulása a legalacsonyabb MOI-értéknél valószínűleg azok miatt a kis százalékban jelen levő sejtek miatt történik, amelyek ennél a dózisnál először nem fertőződtek meg a p53 rekombinánssal. A nagyobb dózisnál az A/M/N/53 konstrukcióval megfigyelt teljes szupresszió azt mutatja, hogy tumomövekedés regenerálódása legyőzhető. p53/adenovírus in vivő hatékonysága

Az itt ismertetett, valamint más csoportok által ismertetett munkák [Chen, P. L., Chen, Y., Bookstein, R. és Lee, W. H., Science 250, 1576-1580 (1990); Takahashi, T. és munkatársai: Cancer Research 52, 2340-2343 (1992)] rámutatnak, hogy azokat a humán tumorsejteket, amelyek nem képesek a vad típusú p53 expressziójára, ex vivő kezelhetők p53-mal, és ennek az eredménye a tumomövekedés szupressziója, ha a kezelt sejteket visszajuttatjuk az állati modellbe. A jelen találmány felfedezői mutatják be az első bizonyítékot arról, hogy egy in vivő megállapodott tumor génterápiával kezelhető, és ez csökkenti a tumor növekedését, valamint növeli a túlélési időt. A feltalálók rendszerében a tumorsejtek megfelelő helyre való juttatása nem a tumor tömegébe való közvetlen injekciózáson alapul. Ehelyett a p53 rekombináns adenovírusokat a peritumorális térbe injekciózzuk, és a p53 mRNS expresszióját a tumorban mutatjuk ki. A rekombinánsok által expresszált p53 működőképes, és erősen elnyomja a tumor növekedését a kontrolihoz, azaz a p53at nem expresszáló adenovírussal kezelt tumorokhoz viszonyítva. Azonban mind a p53-mal, mind a kontrolivírussal kezelt tumorcsoportok a pufferrel kezelt kontrolihoz viszonyítva tumorszupressziót mutatnak. Kimutatták, hogy a tumor-nekrózisfaktor (TNF), az interferon-γ, az interleukin (IL) —2, az IL-4 vagy az IL-7 T-sejttől független tranziens tumorszupresszióhoz vezet meztelen egerekben [Hock, H., Dorsch, M., Kuzendorf, U., Qin, Z., Diamantstein, T. és Blankenstein, T.: Proceedings of the National Academy of

HU 223 733 Bl

Sciences, USA 90, 2774-2778 (1992)]. A monociták adenovírusvirionokkal való érintkeztetése is az IFNα/β enyhe indukálását eredményezi [Gooding, L. R. és Wold, W. S. M.: Crit. Rév. Immunoi. 10, 53-71 (1990)]. Ennek következtében nem meglepő, hogy a meztelen egerekben még a kontrolladenovírussal is megfigyelhető valamennyi tumorszupresszió. Ez a vírus által közvetített tumorszupresszió nem figyelhető meg az előzőkben ismertetett, ex vivő körülmények között kontrollvírussal kezelt Saos-2 tumorsejtek esetében. A p53-specifikus in vivő tumorszupressziót erősen ki lehet mutatni az állatok folytatódó megfigyelésével (10. ábra). A p53-mal kezelt egerek túlélési ideje jelentősen megnőtt, ötből öt állat életben maradt 130 nappal a rákos sejtekkel való beoltás után, míg az 5, kontrolivírussal kezelt állatból egy sem maradt életben. A túlélő állatokban megfigyelhetők még a növekvő tumorok, ami valószínűleg azok miatt a sejtek miatt lép fel, amelyeket először nem fertőzött meg a p53 rekombináns adenovírus. A nagyobb vagy gyakoribb dózis megoldhatja ezt a problémát. Emellett a promoter lezárása [Palmer, T. D., Rosman, G. J., Osbome, W. R. és Miller, A. D.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 1330-1334 (1991)], vagy további mutációk bevezetése rezisztenssé teheti ezeket a sejteket a p53 rekombináns adenovírus kezelésre. Például az újonnan felfedezett WAF1 génben levő mutációk p53-rezisztens tumort eredményezhetnek. Ezt a gént a vad típusú p53 indukálja, amely ezt követően gátolja a sejtciklusnak az S-fázisba való előrehaladását [El-Deiry, W. S. és munkatársai: Cell. 75, 817-825 (1993); Hunter, T.: Cell. 75, 839-841 (1993)].

111. kísérlet

Ebben a példában az öngyilkos gének használatát, valamint ezeknek a géneknek szövetspecifikus expresszióját mutatjuk be, az ismertetett génterápiás módszerekben. Célsejtként a hepatocelluláris szarkómát választottuk, mivel ez az egyik legáltalánosabb humán rosszindulatú betegség, amely a világban évente 1 250 000-re becsült halálesetet okoz. Ennek a ráknak az előfordulása nagyon gyakori Délkelet-Azsiában és Afrikában, ahol a hepatitisz B- és C-fertőzéshez, valamint az aflatoxinnal való érintkezéshez kapcsolódik. Jelenleg az egyetlen kezelési mód a sebészet, amely a HCC gyógyítási lehetőségét kínálja, jóllehet a betegeknek kevesebb mint 20%-át lehet a reszekciónak alávetni [Ravoet, C. és munkatársai: Journal of Surgical Oncology Supplement 3, 104-111 (1993)]. A hepatocelluláris tumortól eltérő tumorokra azonban ugyanúgy alkalmazhatók az alábbiakban ismertetett módszerek a szaporodásuk gátlására.

Sejtvonalak

A HLF-sejtvonal kivételével minden sejtvonalat az American Type Culture Collectiontől (ATCC) szereztünk be (12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland). Az ATCC letéti számokat zárójelben adjuk meg. A 293-as humán embrionális vesesejtvonalat (CRL 1573) használjuk az ismertetett rekombináns adenovírus előállítására és szaporítására. A vírusokat 10%, meghatározott összetételű, kiegészített borjúszérumot (Hyclone) tartalmazó DME táptalajban tartjuk fenn. A Hep 3B (HB 8064) és Hep G2 (HB 8065) hepatocelluláris karcinóma-sejtvonalakat és a HLF-et DME/F12 táptalajon tartjuk fenn, amit 10%-os borjúmagzatszérummal egészítettünk ki, ugyanúgy, mint az MDA-MB468 (HTB 132) és BT-549 (HTB 122) emlőkarcinóma-sejtvonalakat. Chang-májsejteket (CCL 13) szaporítunk 10% borjúmagzatszérummal kiegészített MÉM táptalajon. A HLF-sejtvonalat Dr. T. Morsakitól és Dr. H. Kitsukitól kaptuk (Kyushu University School of Medicine in Japan).

Rekombináns vírus készítése

Két adenovírus expressziós vektor, jelük ACNTK és AANTK, amelyek nem tartalmazzák a IX-es fehérjét (lásd 11. ábra), képes a TK öngyilkos gén expressziójának vezérlésére tumorsejtekben. Egy harmadik adenovírus expressziós vektort is készítünk, jele AANCAT, hogy ezzel is demonstráljuk az adenovírusvektorokkal specifikus sejttípusokra specifikusan célzott génexpresszió használhatóságát. Ezeket az adenovíruskonstrukciókat a 11. és 12. ábrán bemutatott módon állítjuk össze, és az előzőkben ismertetett, tumorszupresszorgének expressziójára használt vektorok származékai.

Az idegen gén expressziójához expressziós kazettákat építünk be a vektorba, amelyek vagy a humán citomegalovírus (CMV) közvetlen korai promoter/fokozót használják [Boshart, M. és munkatársai: Cell. 41, 521-530 (1985)], vagy a humán alfa-fetoprotein (AFP) fokozó/promotert [Watanable, K. és munkatársai: The Journal of Biological Chemistry 262, 4812-4818 (1987); Nakabayashi, H. és munkatársai: The Journal of Biological Chemistry 264, 266-271 (1989)] a TKgén vagy a kloramfenikol-acetil-transzferáz-gén (CAT) transzkripciójának vezérlésére. A CMV-fokozó promoter képes nagyon erős génexpresszió vezérlésére számos különböző sejttípusban, míg az AFP-fokozó/promoter konstrukció az expressziót csak a hepatocelluláris karcinómasejtekben (HCC) tudja meghajtani, amelyek a HCC-betegpopuláció 70-80%-ában AFP-t expresszálnak. A CMV promoter/fokozót használó konstrukcióba a 2-es típusú adenovírus háromrészes vezérszekvencia is be van építve, hogy fokozzuk a TK-átirat transzlációját [Berkner, K. L. és Sharp: Nucleic Acids Research 13, 841-857 (1985)]. Az El deléció mellett mindkét adenovírusvektorból hiányzik még egy 1,9 kilobázis (kb) méretű DNS a vírus E3 régiójából. Az E3 régióból kivágott DNS nem esszenciális a vírus szaporodásához, és deléciója ekvivalens mértékben (1,9 kilobázis) fokozza a rekombináns vírus idegen DNS-re vonatkozó inszerciós kapacitását [Graham, F. L. és Prevec, L.: „Manipulation of adenovírus vectors” In: „Methods in Molecular Biology 7: Gene Transfer and Expresszion Protocols”; szerk.: Murray, E. J., The Humán Press Inc., Clifton N. J., 7 109-128 (1991)].

Az AFP promoter/fokozó specifitásának igazolására az AANCAT-vírust is előállítottuk, amelyben a kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) marker gén az AFP-fokozó/promoter szabályozása alatt áll. Az ACNTK-vírus-konstrukcióban az Ad2 háromrészes vezérszekven17

HU 223 733 Bl ciát a CMV promoter/fokozó és a TK-gén közé helyezzük. A háromrészes vezérszekvenciáról leírták, hogy fokozza a kapcsolt gének transzlációját. Az El szubsztitúció elrontja a rekombináns vírusoknak azt a képességét, hogy replikálódjanak, ezzel a szaporodásukat a 293-as sejtekre korlátozza, amelyek transz-b&n szolgáltatják az Ad5 El génterméket [Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. és Naim, R.: J. Gén. Virol. 36, 59-74 (1977)].

Az ACNTK adenovírusvektor: Az Escherichia coli HB101 sejtekben (ATCC #39 369) levő pMLBKTK plazmidot használjuk forrásként a herpesz szimplex vírus (HSV-1) timidin-kináz (TK)-gén forrásaként. Ebből a plazmidból a TK-t egy 1,7 kilobázis méretű génífagmens formájában vágjuk ki, Bglll és Pvull restrikciós enzimekkel való emésztés után, majd a pSP72 plazmid (Promega) kompatibilis BamHl, EcoRV restrikciós hasítási helyére klónozzuk, standard klónozási technikák alkalmazásával [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A TK-inszertet azután egy 1,7 kilobázis méretű ffagmens formájában izoláljuk ebből a vektorból, Xbal és Bglll restrikciós enzimekkel való emésztés után, majd az Xbal és BamHl restrikciós enzimekkel emésztett pACN plazmidba klónozzuk [Wills, K. N. és munkatársai: Hűm. Gén. Ther. 5, 1079-1088 (1994)]. Ebből a pACNTK jelű plazmidból 20 pg-ot linearizálunk EcRI restrikciós enzimmel, majd kotranszfektáljuk 293-as sejtekbe (ATCC CRL 1573) 5 pg Clal restrikciós enzimekkel emésztett ACBGL vektorral [Wills, K. N. és munkatársai: Hűm. Gén. Ther. 5, 1079-1088 (1994)], a CaPO₄ transzfekciós kit alkalmazásával (Stratagene, San Diego, Kalifornia). A vírustarfoltokat izoláljuk, majd a rekombinánsokat, jelük ACNTK, restrikciós enzimes emésztéssel azonosítjuk, az izolált DNS-t Xhol és BsiWI restrikciós enzimmel emésztve. A pozitív rekombinánsokat határhígítással tovább tisztítjuk, majd elszaporítjuk, és titerüket standard módszerekkel meghatározzuk [Graham, F. L. és Prevec, L.: „Manipulation of adenovírus vectors” In: „Methods in Molecular Biology 7: Gene Transfer and Expresszion Protocols”; szerk.: Murray, E. J., The Humán Press Inc., Clifton N. J., 7 109-128 (1991)].

Az AANTK adenovírusvektor: az alfa-fetoproteinpromotert (AFP-P) és fokozót (AFP-E) egy humán genomiális DNS-könyvtárból (Clontech) klónozzuk, PCR amplifikálást alkalmazva, a végeiken restrikciós hasítási helyeket tartalmazó primerekkel. A 210 bázispár méretű AFP-E izolálására használt primerek egy Nhel restrikciós hasítási helyet tartalmaznak a primer 5’ végén, és egy Xbal, Xhol, Kpnl linkért a primer 3’ végén. Az 5’ primer szekvenciája: 5’-CGC GCT ’ GC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. Az 5’ primer szekvenciája: 5’-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3’. Az 1763 bázispár méretű AFE-ffagmens izolálására használt primerek tartalmaznak egy Notl restrikciós hasítási helyet az 5’ primeren és egy Xbal hasítási helyet a 3’ primeren. Az 5’ primer szekvenciája: 5’-CGT GCG GCC GCT GGA GGA

CTT TGA GGA TGT CTG TC-3’. A 3’ primer szekvenciája: 5’-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3’. A PCR amplifikáláshoz a DNS-t 7 percig 97 °C-on denaturáljuk, ezt követi 5 amplifikációs ciklus: 97 °C 1 perc, 53 °C 1 perc, 72 °C 2 perc és egy végső, 72 °C-on végzett tízperces extenzió. Az amplifikált AFE-t Notl és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy plazmid vektor (pA/ITR/B) Notl Xbal hasítási helyére illesztjük, amely az 1-350 és 3330-5790 5-ös típusú adenovírusszekvenciákat tartalmazza, egy Notl, Xhol, Xbal, Hindlll, Kpnl, BamHl, Ncol, Smal és Bglll hasítási helyeket tartalmazó polilinkerrel elválasztva. Az amplifikált AFP-E-t Nhel és Kpnl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az előzőkben ismertetett AFP-E konstrukcióba építjük be, amelyet Xbal és Kpnl restrikciós enzimekkel emésztettünk. Ezt az új konstrukciót azután tovább emésztjük Xbal és NgoMI enzimekkel, hogy eltávolítsuk a 3330-5780-as adenovírusszekvenciákat, amelyeket azután a pACN plazmid egy Xbal, NgoMI restrikciós fragmensével helyettesítünk, amely a 2-es típusú adenovírus 4021-10457-es nukleotidjait tartalmazza, így kapjuk a pAAN plazmidot, amely mind az alfa-fetoprotein-fokozót, mind a promotert tartalmazza. Ezt a konstrukciót azután EcoRl és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük egy 2,3 kilobázis méretű fragmens izolálására, amely tartalmazza az Ad5 fordított terminális ismétlődő szekvenciát, az AFP-E-t és az AFP-P-t, amit azután az előzőkben ismertetett pACNTK plazmid EcoRI-Xbal emésztésével kapott 8,55 bázispár méretű fragmenséhez ligálunk, így kapjuk a pAANTK plazmidot, amelyben a TK-gént az alfa-fetoprotein-fokozó és promoter hajtja meg egy adenovírus háttérben. Ezt a plazmidot azután EcoRl restrikciós enzimmel linearizáljuk és az előzőek szerint kotranszfektáljuk a Clal restrikciós enzimmel emésztett ALBGL nagy fragmensével, majd rekombinánsokat (AANTK) izolálunk és tisztítunk az előzőkben ismertetett módon.

Az AANTK adenovírusvektor: A kloramfenikolacetil-transzferáz (CAT)-gént izoláljuk a pCAT-Basic Vectorból (Promega Corporation), egy Xbal-BamHI enzimes emésztéssel. Ezt az 1,64 kilobázis méretű fragmenst ligáljuk Xbal és BamHl restrikciós enzimekkel emésztett pAAN vektorba (az előzőkben ismertettük), így kapjuk a pAANCAT vektort. Ezt a plazmidot azután EcoRl restrikciós enzimmel linearizáljuk és kotranszfektáljuk a Clal restrikciós enzimmel emésztett rA/C/p-gal nagy fragmensével, így kapjuk az AANCAT vektort.

Riportergén expresszi ója: β-galaktozidáz-expresszió

Sejteket szélesztünk 1 χ 10⁵ sejt/luk sűrűségben egy 24 lukas szövettenyésztő lemezre (Costar), majd éjszakán át hagyjuk megtapadni (37 °C, 7% CO₂). ACBGLlel éjszakán át fertőzzük 30-as fertőzési multiplicitással (MOI). 24 óra elteltével a sejteket 3,7% formaldehiddel fixáljuk; PBS-t adunk hozzá, majd 1 mg/ml Xgal reagenssel festjük (USB). Az adatokat kiértékeljük (+, + + , + + + ), minden egyes MOI-nál megbecsülve a pozitívan festődött sejtek számát [+= -33%, + + = 33-67% és + + + = >67%].

HU 223 733 Β1

Riportergén-expresszió

2xl0⁶ sejtet (Hep G2, Hep 3B, HLF, Chang és MDA-MB468) oltunk három párhuzamosban 10 cm-es lemezekre, majd éjszakán át inkubáljuk (37 °C, 7% CO₂). Azután minden egyes lemezt vagy AANCAT-tal fertőzünk MOI=30 vagy 100-as értéknél, vagy fertőzetlenül hagyjuk, és 3 napig tovább inkubáljuk. A sejteket azután tripszinezzük és PBS-sel mossuk, végül 100 μΐ 0,25 mol/1 TRIS-HCl-ben (pH=7,8) szuszpendáljuk. A mintákat háromszor egymás után lefagyasztjuk és felolvasztjuk, majd a felülúszót új csövekbe tesszük át, és 10 percig 60 °C-on tartjuk. A mintákat 5 percig 4 °C-on centrifugáljuk, majd a felülúszóknak megmérjük a fehérjekoncentrációját Bradford-esszével (Bio-Rad Protein Assay Kit). A minták fehérjekoncentrációját egyformára állítjuk be 75 μΐ végtérfogatban, 0,25 mol/1 TRIS, 25 μΐ 4 mol/1 acetil-koenzim A és 1 μΐ ¹⁴C-kloramfenikol használatával, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. 500 μΐ etil-acetátot adunk minden egyes mintához, majd vortexeléssel összekeverjük, utána 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk. A felső fázist azután egy új csőbe visszük át és az etil-acetátot csökkentett nyomáson végzett centrifúgálással eltávolítjuk. A reakciótermékeket azután újraoldjuk 25 μΐ etil-acetátban és vékonyréteg-kromatográfiához (VRK) felcsöppentjük, majd a lemezeket előre egyensúlyba hozott VRK-kamrába tesszük (95% kloroform, 5% metanol). Az oldószert azután hagyjuk a lemez tetejéig vándorolni, a lemezt ekkor megszárítjuk és röntgenfilmre exponáljuk.

Sejtszaporodás: ³H-timidin-beépülés

A sejteket 5 χ 10³ sejt/luk koncentrációban szélesztjük egy 96 lukas mikrotiterlemezre (Costar), majd éjszakán át 37 °C-on, 7% CO2-ot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk. Az ACN-, ACNTK- vagy AATK-vírusok DMEM-ben; 15% FBS-ben; 1% glutaminban készült sorozathígítását használjuk sejtek transzfektálására 30-as fertőzési multiplicitás mellett, éjszakán át, ezután a sejtekhez három párhuzamosban ganciklovirt (Cytovene) adunk logaritmusos intervallumokban 0,001 és 100 mmol/1 közötti koncentrációban. A begyűjtés előtt 12-18 órával 1 pCi ³H-timidint (Amersham) adunk minden egyes lukhoz. A fertőzés után 72 órával a sejteket üvegszálas szűrőlapokra nyerjük ki, majd a beépült ³H-timidin mennyiségét folyadékszcintillációs módszerrel mérjük meg (TopCount, Packard). Az eredményeket a kezeletlen kontroll szaporodásának százalékában ábrázoljuk, és a táptalajos kontrollok szaporodásának 50%-os csökkentéséhez szükséges hatékony dózisnak (ED50 ±SD) megfelelően foglaljuk táblázatba. Az ED₅₀-értékeket úgy becsüljük meg, hogy logaritmusos egyenletet illesztünk a dózishatás görbére.

Citotoxicitás: LDH-felszabadulás

A sejteket (HLF, humán HCC) kiszélesztjük, ACNnel vagy ACNTK-val fertőzzük, majd ganciklovirrel kezeljük, amint azt a szaporodási vizsgálatban ismertettük. A ganciklovir hozzáadása után a sejteket lecentrifugáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk. A laktát dehidrogenázszintjét kolorimetriásan határozzuk meg (Promega, Cytotox 96™) Az LDH-felszabadulás átlagát (±SD.) ábrázoljuk a MOI-val szemben.

Humán hepatocelluláris karcinómasejteket (Hep 3B) injekciózunk szubkután tíz nőstény atimuszos nu/nu egérbe (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Mindegyik állat körülbelül 1 χ 10⁷ sejtet kap a bal ágyékába. A tumorokat 27 napig hagyjuk növekedni, mielőtt az egereket a tumorméret alapján randomizáljuk. Az egereket minden második nap ACNTK vagy a kontroll-ACN-vírus intratumorális és peritumorális injekciójával kezeljük (1 χ 10⁹ NE 100 μΐ-ben), összesen három dózisban. Az indító adenovírusdózis után 24 órával az egerek naponta egyszer intraperitoneálisan ganciklovirt kapnak (Cytovene 100 mg/kg), összesen 10 napig. Az egereknél hetente kétszer megfigyeljük a tumor méretét és a testsúlyt. A tumorok mérését három dimenzióban végezzük, vemier kalibert használva, majd a térfogatot a 4/3πτ³ képlet alapján számítjuk ki, ahol r az átlagos tumorméret fele.

Eredmények

A rekombináns adenovírusokat használjuk három HCC-sejtvonal (HLF, Hep3B és Hep-G2) fertőzésére. Kontrollként egy humán májsejtvonalat (Chang) és két emlőráksejtvonalat használunk (MDAMB468 és BT549). Az AFP promoter/fokozó specifitásának igazolására előállítjuk az AANCAT-vírust. Ezt a vírust használjuk olyan sejtek fertőzésére, amelyek vagy expresszálják a HCC tumormarker alfa-fetoproteint (AFP) (Hep 3B, HepG2) vagy nem expresszálják (HLE, Chang, MDA-MB468). Amint a 13. ábrán látható, az AANCAT csak azokban a HCC-sejtekben szabályozza a CAT markergén expresszióját, amelyek képesek expresszálni az AFP-t (13. ábra).

Az ACNTK és az AANTK hatékonyságát a HCC kezelésében egy ³H-timidin-beépülési vizsgálattal határozzuk meg, amellyel mérjük a HSV-TK expresszió és a ganciklovirkezelés kombinációjának hatását a sejtszaporodásra. A sejtvonalakat vagy az ACNTK- vagy az AANTK-vírussal, vagy az ACN kontrollvírussal fertőzzük [Wills, K. N. és munkatársai: Hűm. Gén. Ther. 5, 1079-1088 (1994)], amely nem hajtja meg a HSV-TK expresszióját, majd növekvő koncentrációjú ganciklovirrel kezeljük. Ennek a kezelésnek a hatását a növekvő koncentrációjú ganciklovir függvényében becsüljük meg, és meghatározzuk azt a ganciklovirkoncentrációt, ami ahhoz szükséges, hogy 50%-ban gátolja a ³H-timidin-beépülést (ED₅₀). Emellett az adenovirus által közvetített géntranszfer relatív mértékét és az egyes sejtvonalak expresszióját egy kontrollvírussal határozzuk meg, amely a β-galaktozidáz markergén expresszióját hajtja meg. A 14. ábrán és az alábbi 1. táblázatban bemutatott adatok azt mutatják, hogy az ACNTK-vírus/ganciklovir kombinációs kezelés minden vizsgált sejtvonalban képes gátolni a sejtszaporodást, a kontrollACN-adenovírus és a ganciklovirkezelés kombinációjával összehasonlítva. Ezzel szemben az AATK-vírusvektor csak azokban a HCC-sejtvonalakban hatékony, amelyekről kimutatták, hogy alfa-fetoproteint expresszálnak. Emellett az AANTK/GCV kombináció jóval hatékonyabb, ha a sejteket nagy sűrűségben szélesztjük.

HU 223 733 Β1

1. táblázat

Sejtvonal	aFP-val	β-gal-expresszió	ACN	ED50 ACNTK	AANTK
MDA-MB468	-	+ + +	>100	2	>100
BT549	-	+ + +	>100	<0,3	>100
HLF	-	+ + +	>100	0,8	>100
CHANG	-	+ + +	>100	22	>100
HEP-3B	-	+	80	8	8
HEP-G2 LOW	+	+ +	90	2	35
HEP-G2 HIGH	+	+ +	89	0,5	4

A HepB3 tumorokat (N=5/csoport) intratumorálisan és peritumorálisan kezeljük ekvivalens dózisú ACNTK-val vagy ACN-kontrollal. Huszonnégy órával a rekombináns adenovírus első beadása után minden egyes egérben napi ganciklovirkezelést kezdtünk. Minden egyes állatban hetente kétszer méljük a tumor dimenzióját kaliberekkel, majd az átlagos tumorméreteket a 16. ábrán ábrázoljuk. Az 58. napon az átlagos tumorméret kisebb az ACNTK-val kezelt állatokban, de a különbség statisztikailag nem szignifikáns (p<0,09, páratlan t-teszt). Ezek az adatok alátámasztják az ACNTK hatását a tumor növekedésére in vivő. A két csoport között nem mutatható ki szignifikáns különbség az átlagos testsúlyban.

Jóllehet a találmányt az ismertetett megvalósítási módok alapján írtuk le, az nyilvánvaló, hogy különböző módosítások tehetők anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől. Ennek megfelelően a találmányt csak az alábbi igénypontok korlátozzák.

Irodalmi jegyzék

Aiello, L. etal. (1979) Virology 94: 460-469. American Cancer Society. (1993) Cancer Facts and Figures.

Aulitzky et al. (1991) Eur. J. Cancer 27 (4): 462-467. Austin, E. A. and Huber, Β. E. (1993) Mól. Pharmaceutical43: 380-387.

Bacchetti, S. and Graham, F. (1993) Intemacional Journal of Oncology 3: 781-788.

Baker S. J., Markovitz, S., Fearon E. R., Willson, J. K. V., and Vogelstein, B. (1990) Science 249: 912-915.

Bartek, J., Bartkova, J., Vojtesek, B., Staskova, Z., Lukas, J., Rejthar, A., Kovarik, J., Midgley, C. A., Gannon, J. V., and Lane, D. P. (1991) Oncogene 6: 1699-1703.

Berkner, K. L. and Sharp (1985) Nucleic Acids Rés 13: 841-857.

Boshart, M. et al. (1985) Cell. 41: 521-530.

Bressac, B., Galvin, K. M., Liang, T. J., Isselbacher, K.

J., Wands, J. R., and Ozturk, M. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 1973-1977.

Caruso M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 7024-7028.

Challberg, M. D., Kelly, T. J. (1979) Biochemistry 76: 655-659.

Chen P. L., Chen Y., Bookstein R., and Lee W. K. (1990) Science 250: 1576-1580.

Chen. Y., Chen, P. L., Amaiz, N., Goodrich, D., and Lee, W. H. (1991) Oncogene 6: 1799-1805.

Cheng, JL, Yee, J. K., Yeargin, J., Friedmann, T., and Haas, M. (1992) Cancer Research 52: 222-225. Colby, W. W. and Shenk, T. J. (1981) Virology 39:

977-980.

Culver etal. (1991) P.N.A.S. (U.S.A.)88: 3155-3159. Culver, K. W. etal. (1992) Science 256: 1550-1552. Demetri et al. (1989) J. Clin. Onccl. 7 (10):

1545-1553.

Diller, L., et al. (1990) Mól. Cell. Biology 10: 5772-5781.

El-Deiry, W. S., etal. (1993) Cell. 75: 817-825. Ezzidine, Z. D. et al. (1991) The New Biologist 3:

608-614.

Feinstein, E., Gale, R. P., Reed, J., and Canaani, E. (1992) Oncogene 7:1853-1857.

Ghosh-Choudhury, G., Haj-Ahmad, Y., and Graham, F.L. (1987) EMBO Journal 6: 1733-1739.

Gooding, L. R., and Wold, W.S.M. (1990) Crit. Rév. Immunoi. 10: 53-71.

Graham F. L., and Van dér Erb A. J. (1973) Virology 52: 456-467.

Graham, F. L. and Prevec, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R. W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 363-390.

Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. and Naim, R. (1977) J. Gén. Virol. 36: 59-74.

Graham F. L. and Prevec L. (1991) Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Vol 7: Gene Transfer and Expression Protocols. Murray E. J. (ed.) The Humana Press Inc., CliftonN. J., Vol. 7: 109-128.

Heuvel, S. J. L., Laar, T., Kast, W. M., Melief, C. J. M., Zantema, A., and Van dér Eb, A. J. (1990) EMBO Journal 9: 2621-2629.

Hock, H., Dorsch, M., Kuzendorf, U., Qin, Z., Diamantstein, T., and Blankenstein, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 2774-2778.

HU 223 733 Bl

Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C. (1991) Science 253: 49-53.

Horowitz, M. S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology. Β. N. Fields, ed. (Raven Press, New York) pp. 1679-1721.

Horváth, J., and Weber, J. M. (1988) J. Virol. 62: 341-345.

Huangeía/. (1991) Natúré 350: 160-162.

Huber, Β. E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA,

88: 8039-8043.

Hunter, T. (1993) Cell. 75: 839-841.

Jones, N. and Shenk, T. (1979) Cell. 17: 683-689. Kamb et al. (1994) Science 264: 436-440.

Keurbitz, S. J., Plunkett, B. S., Walsh, W. V., and Kastan, Μ. B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 7491-7495.

Kreigler, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. W. H. Freeman and Company, New York (1990).

Landmann et al. (1992) J. Interferon Rés. 12 (2): 103-111.

Lane, D. P. (1992) Natúré 358: 15-15.

Lantz et al. (1990) Cytokine 2 (6): 402-406.

Larrick, J. W. and Burck, K. L. Gene Therapy: Application of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991).

Lee et al. (1987) Science 235: 1394-1399.

Lemaistre et al. (1991) Láncét 337: 1124-1125. Lemarchand, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.,

USA, 89: 6482-6486.

Levine, A. J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rév. Biochem. (1993.) 62: 623-651.

Lowe S. W., Schmitt, Ε. M., Smith, S. W., Osbome, B. A., and Jacks, J. (1993) Natúré 362: 847-852.

Lowe, S. W., Ruley, Η. E., Jacks, T., and Housman, D. E. (1993) Cell. 74: 957-967.

Martin (1975) In: Remington’s Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

Mercer, W. E., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 6166-5170.

Nakabayashi, H. et al. (1989) The Journal of Biological Chemistry 264: 266-271.

Palmer, T. D., Rosman, G. J., Osbome, W. R., and Miller, A. D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 1330-1334.

Rao, L., Debbas, M., Sabbatini, P., Hockenbery, D., Korsmeyer, S., and White, E. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 7742-7746.

Ravoet C. et al. (1993) Journal of Surgical Oncology Supplement 3: 104-111.

Rich, D. P., et al. (1993) Humán Gene Therapy 4: 460-476.

Rosenfeld, M. A., et al. (1992) Cell. 68: 143-155. Sambrook J., Fritsch E. F., and Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboracory Press, Cold Spring Harbor).

Samow, P., Ho, Y. S., Williams, J., and Levine, A. J. (1982) Cell. 28: 387-394.

Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., and Costa, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 4495-4499.

Siegfried, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101: 7-11.

Sorscher, E. J. et al. (1994) Gene Therapy 1: 233-238. Spector, D. J. (1983) Virology 130: 533-538.

Stewart, P. L. et al.. (1993) EMBO Journal 12:

2589-2559.

Straus. S.E. (1984) Adenovírus infections in humans. In: The Adenovirases, Ginsberg HS, ed., New York: Plenum Press, 451 -496.

Supersaxo et al.. (1988) Pharm. Rés. 5(8): 472-476. Takahashi, T., et al. (1989) Science 246: 491-494. Takahashi, T., et al.. (1992) Cancer Research 52:

2340-2343.

Thimmappaya, B. et al. (1982) Cell. 31: 543-551. Wang, A. M., Doyle, Μ. V., and Mark, D. F. (1989)

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 9717-9721.

Watanable, K. et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry 262: 4812-4818.

White, E„ et al. (1992) Mól. Cell. Bioi. 12: 2570-2580.

Wills, K. N. et al. (1994) Hűm. Gén. Ther. 5: 1079-1088.

Yonish-Rouach, E., et al. (1991) Natúré 352:

Claims (27)

1. Gyógyászati készítmény, amely egy rekombináns adenovírus expressziós vektort tartalmaz, amely vektor tartalmaz egy idegen fehérjét kódoló gént és a IX-es fehérjét kódoló teljes DNS-szakaszt átfogó deléciót.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely további deléciót tartalmaz az adenovírus Ela és Elb régiójában.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely további deléciót tartalmaz az adenovírus korai 3-as és/vagy 4-es régiójában.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amely további 40 nukleotidra kiterjedő deléciót tartalmaz a IX-es fehérjét kódoló szekvenciák deléciójától 3’ irányban, és tartalmaz egy poliadenilezési jelet kódoló idegen DNS-molekulát.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az adenovírus egy 1-es, 2-es, 5-ös vagy 6-os szerotípusba tartozó, C csoportbeli adenovírus.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a gén egy legfeljebb 2,6 kilobázis méretű DNS-molekula.

7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a gén egy legfeljebb 4,5 kilobázis méretű DNS-molekula.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a gén egy funkcionális

HU 223 733 BI fehérjét, egy nem funkcionális fehérjét vagy ezek fehérjefragmensét kódolja.

9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a funkcionális fehérje egy tumorszupresszorfehérje.

10. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a funkcionális fehérje egy öngyilkos fehérje.

11. Rekombináns adenovírus expressziós vektor, amely egy idegen fehérjét kódoló gént és a IX fehérjét kódoló szekvencia teljes delécióját tartalmazza.

12. A 11. igénypont szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amely további deléciót tartalmaz az adenovírus Ela és Elb régiójában

13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amely további deléciót tartalmaz az adenovírus korai 3-as és/vagy 4-es régiójában.

14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amely további 40 nukleotidra kiterjedő deléciót tartalmaz a IXes fehérjét kódoló szekvenciák deléciójától 3’ irányban, és tartalmaz egy poliadenilezési jelet kódoló idegen DNS-molekulát.

15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, ahol az adenovírus egy 1 -es, 2-es, 5-ös vagy 6-os szerotípusba tartozó, C csoportbeli adenovírus.

16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amelyben a gén egy legfeljebb 2,6 kilobázis méretű DNS-molekula.

17. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, amelyben a gén egy legfeljebb 4,5 kilobázis méretű DNS-molekula.

18. A 11-17. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, ahol a gén egy funkcionális fehérjét, egy nem funkcionális fehérjét vagy egy fehérjeffagmenst kódol.

19. A 18. igénypont szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, ahol a funkcionális fehérje egy tumorszupresszív-fehérje.

20. A 18. igénypont szerinti rekombináns adenovírus expressziós vektor, ahol a funkcionális fehérje egy öngyilkos fehérje.

21. A 11-20. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása gyógyszerkészítmény előállítására, ahol a készítmény egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot is tartalmaz.

22. A 11-21. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása a rák endogén vad típusú tumorszupresszív fehérjéje hiányával összefüggő betegség gyógyítására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

23. A 11-20. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása nem kissejtes tüdőrák, kissejtes tüdőrák, hepatokarcinóma, melanoma, retinoblasztóma, emlőtumor, vastagbél-karcinóma, leukémia, limfóma, agytumor, méhnyakkarcinóma, szarkóma, prosztatatumor, hólyagrák, a retikuloendoteliális szövetek tumora, Wilm-féle tumor, asztrocitóma, glioblasztóma, neuroblasztóma, petefészek-karcinóma, oszteoszarkóma vagy veserák gyógyítására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

24. A 11 -20. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása tumor szaporodásának gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, ahol a készítmény egy vagy több vivőanyagot is tartalmaz.

25. A 11-20. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása tumor szaporodásának gátlására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a gyógyszer terápiás szerként ganciklovir, 6-metoxi-purin-arabinonukleozid, 5-fluor-uracil, 6-metil-purin-2’-dezoxiribonukleozid közül valamelyikének vagy ezek kombinációjának hatásos mennyiségét is tartalmazza egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyag mellett.

26. A 11-20. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása a hepatocelluláris karcinóma kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

27. Kit tumorsejtek szaporodásának gátlására, amely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény komponenseit, terápiás szerként ganciklovir, 6-metoxi-purin-arabinonukleozid, 5-fluoruracil, 6-metil-purin-2’-dezoxiribonukleozid közül valamelyikének vagy ezek kombinációjának hatásos mennyiségét is tartalmazza egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyag mellett.