PL186073B1 - Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej - Google Patents
Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowejInfo
- Publication number
- PL186073B1 PL186073B1 PL94314239A PL31423994A PL186073B1 PL 186073 B1 PL186073 B1 PL 186073B1 PL 94314239 A PL94314239 A PL 94314239A PL 31423994 A PL31423994 A PL 31423994A PL 186073 B1 PL186073 B1 PL 186073B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formulation according
- protein
- leu
- tumor
- cheese
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Abstract
1. Preparat farmaceutyczny, zwlaszcza do terapii genowej, zasadniczo zawierajacy co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nosnik oraz zrekombinowany adenowiruso- wy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawke egzogennego DNA z ge- nem kodujacym obce bialko oraz adenowirus DNA z delecja wszystkich kodujacych sekwencji E la, E lb i bialka IX, a takze z najmniej czesciowaE3. 2. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze delecje sekwencji genowej bialka IX stanowi przedzial od okolo 3500 do okolo 4000 par zasad z 5’ wirusowego konca. 3. Preparat wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze delecja obejmuje takze nieistotna sek- wencje DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4. 6. Preparat wedlug zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, ze delecja obejmuje takze nie wie- cej niz czterdziesci nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ wzgledem E la i E lb oraz bialko IX i obca czasteczke DNA, kodujaca sygnal poliadenylacji. 7. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zrekombinowany adenowirusowy we- ktor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji bialka IX. 8. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 1, 2, 5 lub 6. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej różnych rodzajów i odmian nowotworów.
Wiadomym jest, że dla uzyskania rekombinowanych adenowirusów do terapii genowej wymagane jest użycie linii komórek zdolnych do dostarczania „w trans” genowych produktów regionu El, usuwanych w tych rekombinowanych wirusach. Obecnie, jedyną użyteczną linią przyswajalną jest linia komórkowa 293, pierwotnie opisana przez Grahama i in. w 1977 r. Komórki 293 zawierają w przybliżeniu - po lewej stronie -12% (4.3 kb) genomu adenowirusa typu 5 [Aiello (1979) i Spector (1983)].
Znane adenowirusowe wektory, badane obecnie pod kątem zastosowania w preparatach do terapii genowej, są typowo usuwane na Ad2 lub Ad5 DNA, w przedziale od około 400 par zasad na końcu 5’ genomu wirusowego do około 3,3 kb na końcu 5’, dla całkowitej delecji El 2,9 kb. Zatem, istnieje ograniczony region homologii - około 1 kb - pomiędzy sekwencją DNA wirusa rekombinowanego i Ad5 DNA w linii komórek. Ta homologia wyznacza region potencjalnej rekombinacji między sekwencjami - wirusową a komórkową adenowirusa. W takiej rekombinacji uzyskuje się fenotypowy wirus dziki, posiadający ADS regionu El z komórek 293.
Ten przypadek rekombinacji, prawdopodobnie umożliwiający częste wykrywanie typu adenowirusa dzikiego podczas preparowania rekombinowanych wirusów, był wprost demonstrowany jako przyczyna zanieczyszczenia Ad2 dzikim typem opartym na rekombinowanym wirusie Ad2/CFTR-1 (Rich i in. (1993).
Z powodu wysokiego stopnia homologii sekwencji w typie C podgrupy adenowirusów nowotworu, rekombinacja jest prawdopodobna jeśli wektor jest oparty na każdej grupie C adenowirusów (typy 1, 2, 5, 6).
W produkcji rekombinowanych wirusów na małą skalę, pokolenia wirusów zanieczyszczonych dzikim typem mogą być sterowane przez program skriningowy, który odrzuca preparaty mogące być zamęczyszczone. W miarę wzrostu skali produkcji dla zaspokojenia potrzeb terapii genowej, wzrasta możliwość zanieczyszczenia typem dzikim, podobnie jak zwiększa się trudność dostarczenia nie skażonych rekombinowanych preparatów.
Istnieje duże prawdopodobieństwo milionów nowych przypadków nowotworu rocznie, przy czym potowa z tej liczby to zejścia śmiertelne. (American Cancer Society, 1993). Mutacje p53 są najbardziej powszechnymi zmianami genetycznymi związanymi z rakiem u ludzi, występującymi w 50-60% przypadków nowotworu ludzkiego (Hollstein i in. (1991); Bartek i in. (1991); Levine (1993)]. Celem terapii genowej w traktowaniu guzów wykazujących wady w p53, jest przykładowo przywrócenie normalnej, czynnej kopii genu p53 dzikiego typu wirusa, tak aby kontrola proliferacji komórek była odnowiona. p53 odgrywając główną rolę w progresji cyklu komórkowego, wstrzymuje wzrost, tak że naprawienie lub apoptoza mogą wystąpić w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Typ dziki p53 był ostatnio stwierdzony jako konieczny składnik do apoptozy wywołanej napromieniowaniem lub czynnikami chemioterapeutycznymi (Lowe in. (1993) A i B). Z uwagi na wysoką przewagę (rozpo4
186 073 wszechnienie) mutacji p53 w nowotworach ludzkich, jest możliwe, że guzy, które stają się oporne na chemioterapię i naświetlanie, mogą nie zawierać typu dzikiego p53. Przez ponowne dostarczenie czynnego p53 do tych guzów zasadnym jest oczekiwać, że są one zdolne do normalnej apoptozy, związanej z uszkodzeniem DNA - wywołanym przez promieniowanie i chemioterapię.
Jednym z krytycznych punktów w skutecznej terapii genowej człowieka jest możliwość oddziaływania na znaczącą część komórek nowotworowych. Zastosowanie do tego celu wektorów retrowirusowych było ostatnio szeroko badane na różnych rodzajach modeli nowotworów. Np. w leczeniu złośliwych nowotworów wątroby stwierdzono małą skuteczność wektorów retrowirusowych, ponieważ nie są one w stanie osiągnąćwysokiego poziomu transferu niezbędnego w terapii genowej in vivo [Huber, B.E. i in. (1991); Caruso M. i in. (1993)].
Dla otrzymania bardziej trwałych źródeł produkcji wirusów, próbowano rozwiązać problem, związany z niskim poziomem transferu genów, poprzez bezpośrednie iniekcje do guzów linii komórkowych przenoszących retrowirusa [Caruso, M i in. (1993); Ezzidine, Z.D. i in. (1991); Culver, K.W. i in. (1992)]. Jednak metoda ta jest niezadowalająca w stosowaniu na ludziach, ponieważ jest kłopotliwa w stosowaniu i wywołuje stany zapalne u pacjenta w odpowiedzi na linie przenoszące. Inną niedogodnością wektorów wirusowych jest to, że wymagają one dzielących się komórek do skutecznego integrowania i przekazania rekombinowanego genu [Huber, B.E. (1991)]. Trwała integracja w podstawowym genie gospodarza, może prowadzić do rozwoju lub dziedziczenia stanów chorobowych.
Istotę wynalazku stanowi skład preparatu farmaceutycznego, który zasadniczo zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nośnik oraz zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawkę egzogennego DNA z genem kodującym obce białko oraz adenowirus DNA z delecją wszystkich kodujących sekwencji Ela, Elb i białka IX, a także z najmniej częściowąE3.
Ponadto, precyzując istotę preparatu według wynalazku, korzystnym jest gdy:
• delecję sekwencji genowej białka IX stanowi przedział od około 3500 do około 4000 par zasad z 5’ wirusowego końca;
• delecja obejmuje także nieistotną sekwencję DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4;
• delecja obejmuje także sekwencję DNA określonąjako adenowirus Ela i Elb;
• delecja obejmuje także wczesny region 3 i/lub 4 sekwencji DNA określonej jako adenowirus Ela i Elb;
• delecja obejmuje także nie więcej niż czterdzieści nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ względem Ela i Elb oraz białko IX i obcą cząsteczkę DNA, kodującą sygnał poliadenylacji;
• zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji białka IX;
• adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 1, 2, 5 lub 6;
• wstawka egzogennego DNA ma do 2,6 kilozasad (KB);
• wstawka egzogennego DNA ma do 4,5 kilozasad (KB);
• obce białko jest białkiem funkcjonalnym lub jego biologicznie aktywnym fragmentem;
• obce oiałko jest białkiem supresora nowotworu bib jego biologicznie aktywa nym fragmentem;
• białkiem supresora nowotworu jest p53;
• białkiem supresora nowotworu jest RB56;
• obce białko jest białkiem samobójczym lub jego funkcjonalnym równoważnikiem;
• zawiera metabolit kinazy tymidynowej lub jej funkcjonalny równoważnik;
186 073 • metabolit kinazy tymidynowej stanowi ganciclovir lub 6-metoksypuryna arabinukleozydu lub ich funkcjonalny równoważnik;
• gen kodujący obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą cytomegalowirusowego promotora CMV;
• promotor CMV jest najbliższym wczesnym promotorem CMV;
• gen kodujący obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą adenowirusowego promotora;
• adenowirusowy promotor jest głównym późnym promotorem adenowirusa typu 2;
• egzogenne DNA stanowi ponadto miejsca poliadenylacji;
• zrekombłnowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/C/N/53;
• zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/M/N/53;
• ponadto zawiera komórkę gospodarza transformowaną za pośrednictwem adenowirusowego wektora;
• farmaceutycznie akceptowalny nośnik zawiera fizjologicznie akceptowalny związek.
Zastosowanie zrekombinowanego adenowirusowego wektora ekspresyjnego w składzie preparatu farmaceutycznego do terapii genowej zapewnia wysoki poziom skuteczności transferu genów i ekspresji białek, a te zapewniają bezpieczne i skuteczne leczenie terapią genową. Prezentowany wynalazek odpowiada tym potrzebom i zapewnia także związane z tym korzyści.
Rekombinowane adenowirusy mają wyraźną przewagę nad metodami dostarczającymi retrowirusy lub metodami dostarczania genu [przegląd - patrz Siegfried (1993)]. Adenowirusy były bezpieczne stosowane jako żywe szczepionki i nigdy dotąd nie stwierdzono, aby wywoływały one powstawanie nowotworów u człowieka [Straus (1984)].
Wadliwa replikacja rekombinowanych adenowirusów może być spowodowana przez zastąpienie regionu El, koniecznego do replikacji z genem celowym. Adenowirus nie może być integrowany do genomu ludzkiego jako normalna konsekwencja infekcji, dlatego znacznie zmniejsza się ryzyko mutagenezy przez insercje, możliwej w przypadku retrowirusów lub wektorów adeno-pochodnych wirusów. Brak trwałej integracji prowadzi także do dodatkowej korzystnej sytuacji, w której wpływ transferowanego genu będzie krótkotrwały, gdyż ekstrachromosomalny DNA będzie stopniowo zanikać, w miarę trwających podziałów komórek. Trwały, wysoki poziom aktywnego rekombinowanego adenowirusa może być produkowany na poziomie nieosiągalnym dla retrowirusa lub AAV, zapewniającym wystarczająco dużą produkcję materiału do traktowania dużej liczby pacjentów. Dodatkowo, wektory adenowirusa są zdolne do wysoko wydajnego transferu genów in vivo w szerokim spektrum tkanek i komórek nowotworowych. Na przykład wykazano, że adenowirusy pośredniczące w przenoszeniu genów mają duży potencjał w terapii genowej chorób, takich jak muskowiscydoza [Rosenfeld i in. (1992); Rich I in. (1993)] i niedoboru α,-tmtytrypsyny [Lemarchand i in. (1992)]. Chociaż badane są inne możliwości przenoszenia genów, takie jak kompleksy kationowych liposomów i DNA, żadna z nich nie okazała się dotąd tak skuteczna jak adenowirusowy czynnik regulacji wprowadzania genów.
Tak jak w leczeniu nowotworów z niedoborem p53, celem terapii genowej w przypadku innych nowotworów jest przywrócenie kontroli proliferacji komórek. W przypadku p53, wprowadzenie funkcjonalnego genu przywraca kontrolę cyklu komórkowego poprzez śmierć komórek przez apoptozę wywołaną czynnikami terapeutycznymi. Podobnie terapia genowa w równej mierze jest wykorzystywana do innych supresorowych genów, które mogą być stosowane pojedynczo lub w mieszaninie z innymi czynnikami terapeutycznymi do kontroli przebiegu cyklu komórkowego i/lub do indukowania śmierci komórek. Co więcej geny, które nie kodują białek regulatorowych w cyklu komórkowym, ale bezpośrednio wywołują śmierć komórki np. geny samobójcze lub geny, które są bezpośrednio toksyczne dla komórki, mogą być użyte w procedurze terapii genowej do bezpośredniego usuwania progresji cyklu komórek guza.
186 073
Niezależnie od tego, który gen jest zastosowany do kontroli progresji cyklu komórkowego, podstawy i praktyczne zastosowanie tej metody jest identyczne.
Mianowicie, aby osiągnąć wysoką skuteczność transferu genów, należy przenieść terapeutyczną wielkość rekombinowanego produktu. Wybór wektora, który będzie zastosowany dla osiągnięcia wysokiej skuteczności transferu genu przy minimalnym ryzyku dla pacjenta jest zatem ważnym dla poziomu sukcesu leczeniu terapią genową.
Przedmiot wynalazku zobrazowano w kolejnych przykładach oraz na rysunku, którego poszczególne figury przedstawiają:
Figura 1 - rekombinowany adenowirusowy wektor; powstały wirus posiada 5’ sekwencję adenowirusowego usuwania rozciągające się od nukleotydów 356 do 4020 i eliminuje geny Ela i Elb, a także całą sekwencję kodującą białko IX, pozostawiając region poliadenylacji uwspólniony przez geny Elb i p IX nietknięte dla wykorzystania w terminacji transkrypcji dla każdego pożądanego genu;
Figura 2 - sekwencję aminokwasów pl 10 R13;
Figura 3 - sekwencję DNA kodującą białko supresorowe guza retinoblastomy;
Figura 4 - schemat rekombinanta p53/adenowirusa, który jest oparte na AD5, a jego region El nukleotydów 360-3325 jest zastąpiony przez 1,4 kb pełnej długości p53 cDNA, kierowany przez Ad2 MLP (A/M/53) lub ludzki CMV (A/C/53) promotor, po którym następuje Ad2 trójdzielny lider cDNA; wirus centralny A/M ma taką samą AD5 delecje jak wirus A/M/53 ale brak jest wstawki 1,4 kb p53 cDNA; pozostała sekwencja Elb (705 nukleotydów) usunięto w celu stworzenia białka IX deletowanych konstruktów A/M/N/53 i A/C/N53; konstrukty te mają także 19 kb Xba I delecję wewnątrz regionu E3 adenowirusa typu 5;
Figura 5A i 5B - ekspresję w komórkach guza infekowanych A/M/53 i A/C/53;
Figura 5A - komórki Saos-2 (osteosarcosoma) infekowane we wskazanych wielokrotnych infekcjach (MOI) zarówno AM53 jak i A/C/53 oczyszczonym wirusem i zbierane po 24 godzinach; gen p53 przeciwciała przeciw pAb 1801 użyto do barwienia immunoblotów próbek dodawanych w równych, całkowitych stężeniach białka przy czym jednakowe stężenia białka z ekstraktu komórek SW480, który nadal produkował białko mutanta p53, było użyte jako marker dia określenia miejsca p53. „O” poniżej nagłówka A/C/53, oznaczając pozorną infekcję zawierającą nietraktowany lizat Saos-2;
Figura 5B - komórki Hep 313 (hepatocellular carcinoma) infekowane wirusem A/M/53 lub A/C/53 w oznaczonej wielkości infekcji (MOI) i analizowane jak w części A); strzałka oznacza pozycję białka p53;
Figura 6A do 6C - zmiany morfologiczne Saos-2 zależne od p53;
Figura A - komórki Saos-2 podziewające się (lxl05 komórek/IOcm płytka) były nieinfekowane;
Figura B - infekowane przy M01=50 (13), wirusem kontrolnym A/M;
Figura C - infekowane wirusem A/C/53; przy czym zdjęcia komórek wykonywano po upływie 72 godzin od infekcji;
Figura 7 przedstawia inhibicję syntezy DNA zależną od p53 w liniach komórek guza ludzkiego przez A/M/N/53 i A/C/N/53. Dziewięć różnych linii komórek guza było infekowanych kontrolnym wirusem A/M (-x-x-) lub p53 ekspresujący A/M/N/53 (-Δ-Δ-) lub wirusem A/C/N/53 (-O-O-) przy wzrastającej wartości MOI jak zaznaczono. Typ guza i charakter p53 były zapisywane dla każdej linii komórek (wt = typ dziki, zero = brak ekspresji białka, mut = wytwarzane białko mutanta). Synteza DNA była mierzona po 72 godzinach od infekcji jak opisano poniżej w przykładzie nr II. Wyniki pochodzą z trzech pomiarów w każdej dawce ( średnia ± SD), i są wykreślone jako % średnich wartości z kontroli względem MOI. * Komórki H69 były testowane tylko z wirusami A/M i A/M/N/53.
Figura 8 przedstawia tumorogenność p53 po zainfekowaniu komórek Saos-2 u nagich myszy/. Komórki Saos -2 były infekowane zarówno przez wirusy kontrolne A/M jak i przez rekombinanta p53 A/M/N/53 przy wartości MO1=30. Traktowane komórki były wstrzykiwane podskórnie do łojówki, w bok nagich myszy i mierzono rozmiary guza (jak opisano
186 073 w przykładzie nr II) dwa razy w tygodniu przez okres 8 tygodni. Wyniki przedstawiono jako zależność wielkość guza do czasu (dni) po implantacji guza dla kontroli (-x-x-) i A/M/N/53 (-Δ-Δ-) w traktowanych komórkach. Przedziały błędu repezentują średni rozmiar guza =/- SEM dla każdej grupy zwierząt w każdym punkcie czasu.
Figura 9 wyraża ekspresję RNA w rAd/p53 w ustalonych guzach. Komórki H69 (SCLC) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i pozostawiane dla rozwoju guza przez 32 dni aż jego wielkość wynosiła około 25-50 mm3. Myszy wybierano do badań losowo i wstrzykiwano im peritumorally 2xl09 pfu wirusa kontrolnego A/C/p-gal oraz A/C/53. Guzy były wycinane 2 i 7 dni po iniekcji i z każdej próbki guza preparowano polyA RNA. RT-PCR przeprowadzono przy użyciu równych stężeń RNA i specyficznych primerów dla przenoszenia rekombinanta p53. Amplifikacja PCR była 30 cykli w 94°C-1 min, 55 °C- 1.5 min, 72°C-2 min, i 10 min, 72°C okres końcowego rozwinęcia w Omnigen termpcyklerze (Hybaid). Użyte primery PCR były 5’ trójdzielnym liderowym cDNA (5' -CGCCACCGaGgGACCTGAGCGAGTC - 3’) i 3’ primerem p53 (5’ -TTCTGGGAAGGGACAGAAA - 3’). Ścieżki 1,2,4 i 5 sąp53 traktowanymi próbami usuniętymi w 2 lub 7 dniu jak zaznaczono. Ścieżki 3 i 6 to guzy traktowane β-gal. Ścieżki 7, 8 i 9 to odpowiednio powtórzenia ścieżek 4, 5 i 6, amplifikowane z primerem aktyny dla sprawdzenia równego obciążenia. Ścieżka 10 jest pozytywną kontrolą używającą plazmidu z trójdzielnego p53.
Figura 10A i 10B przedstawiają supresję guza in vivo i zwiększony czas przeżycia z A/M/N/53. Komórki guza H69 (SCLC) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i pozostawione do rozwoju przez 2 tygodnie. Peritumoralne wstrzykiwanie samego buforu (—), kontrolnego adenowirusa (-x-x-), lub A/M/N/53 (-Δ-Δ), obydwoma wirusami (2x109 pfu/iniekcję) były stosowane dwa razy w tygodniu dla ogółem 8 dawek. Rozmiary guza były mierzone 2 razy w tygodniu a objętość guza ustalano jak poprzednio (przykład nr 2). A) Wielkość guza jest wykreślona w stosunku do czasu (dni) po inokulacji komórek H69. W słupkach przedziały błędu oznaczają średni rozmiar guza ± SEM dla każdej grupy 5 zwierząt. Strzałki oznaczją dni iniekcji wirusa. B) Sprawdzano przeżywalność myszy i część myszy przeżywająca w grupie eksperyment w czasie po inokulacji buforem (—), kontrolne Am (.........) lub komórkami H69 traktowanymi wirusem A/M/N/53 (—) była nanoszona na wykres.
Figury 11A do 11C przedstawiają mapy konstruktów rekombinowanych plazmidów. Plazmidy konstruowano jak wyszczegółowiono poniżej. Ciągłe linie w konstruktach oznaczają omawiane geny podczas gdy druk wytłuszczony oznacza miejsce restrykcyjne używane do generowania fragmentów, które muszą być powiązane ze sobą aby uformować dalszy plazmid, jak oznaczono strzałkami. Na figurze 11 A, plazmid pACNTK skonstruowano przez podklonowanie genu HSV-TK z pMLBKTK (ATCC nr 39369) w polilinker wektora klonującego, po którym następuje izolacja genu TK z pożądanymi końcami dla klonowania w wektor pACN. Wektor pACN zawiera sekwencje adenowirusa konieczne dla rekombinacji in vivo aby otrzymać formę rekombinanta adenowirusowego (patrz figura 12). Na figurze 11B, konstrukcja plazmidu pAANTK jest pokazana poczynając od fragmentów wzmocnionych PCR kodujących a-fetoprotein enhancer (AFP-E) i regiony promotora (AFP-P) podklonowane przez kilka stopni do końcowego plazmidu gdzie AFP enhancer i promotor są w górę od genu HSV-TK, po którym następują sekwencje adenowirusa typu 2 konieczne do rekombinacji in vivo aby otrzymać formę rekombinanta wirusowego. Na figurze 11C konstrukcja plazmidu pAANCAT jest pokazana poczynając od izolacji genu acetyltransferazy chloramfenikolowej (CAT) z dostępnego w handlu plazmidu i jego podklonowanie w plazmid pAAN (patrz wyżej), generujące plazmid końcowy pAANCAT gdzie enhancer/promotor AFP kieruje transkrypcjągenu CAT w podstawowej sekwencji adenowirusa.
Figura 12 jest schematyczną mapą rekombinantów wirusowych ACNTK, AANTK i AANCAT. Dla skonstruowania rekombinantów wirusowych z plazmidów opisanych w figurze 11, 4 części (20 pg), którego bądź plazmidu pACNTK, pAANTK lub pAANCAT były wydłużane z Eco R1 i współtransfekowane z 1 częścią (5 |ig) dużego fragmentu rekombinan8
186 073 tów adenowirusowych (rAC3-gal) zawierający region delecji E3 (Wills et al.,1994). W otrzymanych wirusach, Ad5 nukleotydy 360-4021 są zastąpione przez CMV promotor i trójdzielny lider cDNA (TPL) lub przez enhancer a-fetoprotein i promotor (AFP), kierujące ekspresją HSV-1 TK lub gen CAT jak zaznaczono. Otrzymane rekombinanty adenowirusowe są oznaczone odpowiednio ACNTK, AANTK i AANCAT.
Figura 13 przedstawia specyficzność promotora ekpresji CAT w wektorach rekombinantów wirusowych. 2xl06 wyznaczonych linii komórkowych było infekowanych M01’s=30 lub 100 rekombinantem wirusowym AANCAT jak zaznaczono lub pozostały nieinfekowane (UN). Komórki Hep G2 i Hep3B produkowały a-fetoprotein podczs gdy inne linie komórek nie. Po trzech dniach, komórki były zbierane, a objętości ekstraktów były regulowane do równych ogólnych stężeń białka, mierzono aktywność CAT jak opisano poniżej w sekcji Metody. Równa liczba nieinfekowanych komórek służyła jako indywidualna kontrola dla podstawowej aktywności CAT, kiedy 14C znakowany chloramfenikol (tylko - UC) i ekstrakt ze stabilnej linii komórkowej (B21) ujawniającej aktywność CAT służył odpowiednio jako negatywna i pozytywna kontrola. Procent konwersji acetylo Coa jest zaznaczony, i przedstawia, że ekspresja jest limitowana do komórek produkujących a-fetoproteiny.
Figura 14 przedstawia efekt traktowania TK/GVC linii komórkowych raka wątroby i efekt specyficzności promotora. Linie komórkowe Hep-G2 (pozytywny AFP) i HLF (negatywny AFP) infekowano przez noc z ACNTK [-Δ-] AANTK [-Δ-] lub kontrolą [-□-] wirusa przy trzydziestokrotnej infekcji i następnie traktowanych z pojedynczą dawką gancyklowiru we wskazanym stężeniu. Proliferacja komórek była oszacowana przez dodanie 3H-tymidyny do komórek około 18 godzin przed zebraniem. Wprowadzenie 3H-tymidyny do komórkowego kwasu nukleinowego było mierzone 72 godziny po infekcji (Top Count, Packard i przedstawione jako procent (średniej +/- S.D.) nie traktowanej kontroli. Wyniki przedstawiają selektywną, zależną od dawki inhibicję proliferacji z konstruktem kierowanym przez CMV, kiedy AFP selektywnie regulowany selektywnie hamował Hep-G2
Figura 15 przedstawia cytotoksyczność ACNTK z gancyklowirem w HCC. Komórki HLF infekowano przy MOI 30 zarówno ACNTK [-0-] lub kontrolnym [-□-] i traktowano z gancyklowirem w zaznaczonych dawkach. Siedemdziesiąt dwie godziny (72) po traktowaniu gancyklowirem poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwolnionej do supematantu komórkowego był mierzony kolorometrycznie i wykreślany (średnia +/- SEM) w odniesieniu do stężenia gancyklowiru dla dwóch grup traktowanych wirusem.
Figury 16A i 16B - pokazują efekt ACNTK i gancyklowiru na ustalonych guzów raka wątroby w nagich myszach. Jeden (1) x 10’ Hep 3B komórek wstrzykiwano podskórnie do boku nagiej samicy myszy i pozwalano im rosnąć przez 27 dni. Myszy wtedy otrzymywały wewnątrz guzowy i wokół guzowy (peritumoral) zastrzyk zarówno ACNTK [-0-] lub kontroli ACN [-0-] wirusa (1 x 109 iu w 100 pi objętości) każdego dnia do trzech dawek całkowicie (zaznaczono strzałką). Wstrzykiwanie gencyklowiru (100 mg/kg ip) rozpoczęto 24 godziny po inicjalnej dawce wirusa i kontynuowano przez 10 dni. Na figurze 6A, wykreślono rozmiary guza jako średnia +/- SEM w odniesieniu do dni po infekcji. Na figurze 6B, wykreślono ciężar ciała zwierzęcia traktowanego każdym wirusem jako średnią +/- SEM w stosunku do dni po infekcji.
Dla zredukowania częstych zanieczyszczeń dzikim typem adenowirusa, jest pożądane polepszenie wirusa lub linii komórkowej, tak aby zmniejszyć prawdopodobieństwo rekombinacji. Na przykład, adenowirusa z grupy z niską homologią do grupy C wirusów stosuje się do uzyskiwania rekombinacyjnych wirusów z małą skłonnością do rekombinacji z Ad5 sekwencją w komórkach 293. Jednakże, alternatywnie, prostszym sposobem redukcji rekombinacji pomiędzy wirusową i komórkową sekwencją jest wzrost rozmiaru delecji w rekombinowanym wirusie i przez to redukcja nadmiaru wspólnej sekwencji pomiędzy genami Ad5 w komórkach 293. Delecje, które są poza 3,5 kb z końca 5’ genomu adenowirusa oddziaływuj ą na adenowiruse białko IX i nie były korzystne w wektorach adenowirusowych (patrz poniżej).
186 073
Gen białka IX adenowirusa koduje druoorzędowy składnik zewnętrznego kapsydu wirusa, który stabilizuje grupę dziewięciu hexonów, wchodzących w skład większości kapsydów wirusowych (Sterwart (1993)). Bazując na badaniach mutanów delecji adenowirusowych, białko IX początkowo nie uważano za zasadniczy składnik adenowirusa, chociaż jego brak był związany z większą nietrwałością termiczną niż obserwowane u typu dzikiego wirusa (Colby i 1981). Ostatnio odkryto, że białko IX jest niezbędne do upakowania pełnej długości wirusowego DNA w kapsyd, i że przy braku tego białka, tylko genomy co najmniej o 1 kb mniejsze niż typ dziki, mogą być przekazywane jako rekombinowane wirusy [Ghosh - Choundry i in. (1987)]. Mając to ograniczenie w pakowaniu, delecje białka IX świadomie nie mogą być brane pod uwagę przy projektowaniu wektorów adenowirusów.
W tym zgłoszeniu, odnośnik jest sporządzony do standardowych podręczników szkolnych biologii molekularnej, które zawierają definicje, metody, i sposób do przeprowadzenia podstawowych technik zawartych w niniejszym wynalazku. Patrz dla przykładu w Sambrook et al. (1989) i różnych referencjach tutaj cytowanych. Te referencje i cytowane publikacje są celowo włączone poprzez referencje do tego odkrycia.
Przeciwnie do tego co jest znane fachowcom, ten wynalazek, żąda użycia rekumbinuwanych adenowirusów noszących delecje genu białka IX, jako sposób redukcji ryzyka zanieczyszczenia adenowirusem typu dzikiego w przygotowaniach wirusa do użycia w diagnostycznych i terapeutycznych zastosowaniach takich jak terapia genowa. Jak użyto tutaj, termin „rekombinowany” jest przeznaczony dla oznaczenia potomstwa utworzonego jako rezultat inżynierii genetycznej. Te delecje mogą usuwać dodatkowo 500 do 700 par zasad sekwencji DNA, która jest obecna w tradycyjnych El wirusach z delecją (niniejsze, mniej pożądane delecje części genu pIX są możliwe i są włączone w zakres tego wynalazku) i są osiągalne dla rekombinacji z Ad5 sekwencjami zcalonymi z komórkami 293. Rekombinowane adenowirusy oparte na jakimkolwiek wirusie grupy C, serotyp 1, 2, 5 i 6, są włączone w ten wynalazek. Również objęty przez ten wynalazek jest hybryd Ad2/Ad5 oparty na rekombinowanym wirusie zdolnym do ekspresji ludzkiego p53 cDNA zadenowirusa typu 2, większego ostatniego promotora. Ta konstrukcja była złożona jak pokazano na fig. 1. Powstały wirus nosi 5’ delecję adenowirusowej sekwencji rozciągającą się od około 357 nukleotydu do 4020 i usuwa geny Ela i Elb jak również sekwencję kodującą całe białko IX, pozostawiając miejsce aoliadenylacji wspólne dla genu Elb i genu białka IX, nietknięte dla użycia w terminacji transkrypcji jakiegokolwiek pożądanego białka. Odrębne zastosowanie jest pokazane na fig. 4. Alternatywnie, delecja może być rozciągnięta dodatkowo o 30 do 40 par zasad bez naruszenia przyległego genu dla białka IVa2, chociaż w tym przypadku egzogenny sygnał poliadenylacji jest dostarczony w celu zakończenia transkrypcji genów umieszczonych w rekombinowanym wirusie. Wyjściowy wirus zbudowany z tą delecją jest łatwo przekazany do komórek 293 z brakiem dowodu zanieczyszczenia wirusem dzikiego typu i kieruje wydajną ekspresją p53 od transkrypcyjnej części wstawionej w miejscu delecji.
Pojemność wstawki rekombinowanych wirusów noszących delecje białka IX opisaną powyżej jest w przybliżeniu 2.6 kb. To jest wystarczające dla wielu genów włączając p53 cDNA. Pojemność wstawki może być zwiększona przez wprowadzenie innych delecji do adenowiruszwegu kręgosłupa, na przykład delecje we wczesnych regionach 3 lub 4 (dla przeglądu patrz: Graham i Prevec (1991)). Na przykład zastosowanie adenowirusowego szkieletu zawierającego delecje 1.9 kb nieistotnej sekwencji we wczesnym regionie 3. Z tą dodatkową delecją, pojemność wstawki wektora jest zwiększona do w przybliżeniu 4.5 kb, wystarczająco dużo dla wielu większych cDNAs, włączając gen supresorowy nowotworu retinoWastoma.
Rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny opisany przez całkowitą lub częściową delecję DNA adenowirusowego białka IX i posiadający gen kodujący obce białko lub funkcjonalny fragment lub jego mutant jest przedstawiony przez ten wynalazek. Te wektory są użyteczne dla bezpiecznej rekombinowanej produkcji diagnostycznych i terapeutycznych aoliaeatydów i białek, i co istotniejsze, w celu wprowadzenia genów w terapii genowej.
186 073
W ten sposób, na przykład, adenowirusowy wektor tego wynalazku może zawierać obcy gen dla ekspresji białka efektywnego w regulacji cyklu komórkowego, takiego jak p53, Rb lub mitozyny lub w indukowaniu śmierci komórki, takiego jak gen warunkowego samobójstwa kinazy tymidynowej. (Ten ostatni musi być użyty w połączeniu z metabolitem kinazy tymidynowej w celu bycia skutecznym). Każda kaseta ekspresyjna może być użyta z wektorem tego wynalazku. „Kaseta ekspresyjna” oznacza cząsteczkę dNa posiadającą promotor/enhancer (wzmacniacz) transkrypcji taki jak CMV promotor enhancer, etc., obcy gen i w pewnych wypadkach zdefiniowany poniżej sygnał poliadenylacji. Jak użyto tutaj, termin „obcy gen” jest użyty do oznaczenia cząsteczki DNA nie obecnej w dokładnej orientacji i pozycji w odpowiedniej cząsteczce DNA znalezionej w adenowirusie dzikiego typu. Obcy gen jest cząsteczką DNA do 4.5 kb. „Wektor ekspresji” oznacza wektor, który daje w wyniku ekspresję wstawionej sekwencji DNA gdy przeniesiony do stosownej komórki gospodarza, białko lub polipeptyd kodowany przez ten DNA jest syntezowane przez system gospodarza. Rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może zawierać część genu kodującego adenowirusowe białko DC, pod warunkiem, że biologicznie aktywnie białko IX lub jego fragment nie jest produkowany. Przykładem tego wektora jest wektor ekspresji mający mapę enzymu restrykcyjnego fig. 1 lub 4.
Indukowane promotory również mogą być użyte w adenowirusowym wektorze tego wynalazku. Te promotory będą inicjowały transkrypcję tylko w obecności dodatkowych cząsteczek. Przykłady indukowanych promotorów obejmują te osiągalne z genu (i-i^t<uirferonu, genu szoku termicznego, genu metallotioniny lub te osiągalne z genów steroidowych hormono-wrażliwych. Ekspresja tkankowo specyficzna jest dobrze opisana w dziedzinie ekspresji genowej i tkankowej specyficzności i indukowane promotory takie jak te są bardzo dobrze znane ekspertom. Geny te są używane do regulacji ekspresji obcego białka po wprowadzeniu do docelowej komórki.
Również dostarczony przez ten wynalazek jest rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, jak opisano powyżej, posiadający mniej rozległe delecje sekwencji genu białka IX rozciągające się od 3500 bp od wirusowego końca 5’do w przybliżeniu 4000 bp w jednym zastosowaniu. W odrębnym zastosowaniu rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może mieć ponadto delecje nieistotnej sekwencji DNA w adenowirusowym wczesnym regionie 3 i/lub 4 i/lub delecje sekwencji DNA oznaczonych adenowirusowy Ela i Elb. W tym zastosowaniu, obcym genem jest cząsteczka DNA wielkości do 4.5 kb.
Poza tym zastosowanie ma delecja do czterdziestu nukleotydów usytuowana po stronie 3’ do delecji Ela i Elb i pIX i obcej cząsteczki DNA kodującej sygnał poliadenylacji wprowadzonej do rekombinowanego wektora w pozycji odpowiadającej obcemu genowi w celu regulacji ekspresji obcego genu.
Dla celów tego wynalazku rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może być wyprowadzony z grupy adenowirusów dzikiego typu, serotyp 1, 2, 5 lub 6.
W jednym zastosowaniu rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny posiada gen kodujący funkcjonalne guz-supresorowe białko lub biologicznie aktywny jego fragment. Jak użyto tutaj, termin „funkcjonalny” kiedy odnosi się to do guz-supresorowego genu, nawiązuje do guz-supresorowych genów, które kodują guz-supresorowe białka, które skutecznie hamują zachowanie komórki, podobne do zachowania komórki guzowej. Funkcjonalne geny mogą zawierać, na przykład, dziki typ normalnych genów i modyfikacje normalnych genów, które zachowują swoją zdolność do, kodowania skutecznych guz-supresorowych białek i inne antyguzowe geny taicie jak gen białka warunkującego samobójstwo lub toksyny.
Podobnie „nie-funkcjonalny”, jak użyto tutaj jest równoznaczny z „nieaktywny”. Niefunkcjonalne lub wadliwe geny mogą być spowodowane przez bogactwo przyczyn, włączając na przykład punktowe mutacje, delecje, metylacje i inne znane specjalistom przyczyny.
186 073
Jak użyto tutaj „aktywny fragment” genu, zawiera mniejsze porcje genu, które zachowują zdolność do kodowania białek posiadających guz-supresującą aktywność. p56RJ, opisane pełniej poniżej, jest jednym przykładem aktywnego fragmentu funkcjonalnego guz-supresorowego genu. Modyfikacje guz-supresorowych genów są również rozważane w znaczeniu aktywnego fragmentu, takie jak addycje, delecje lub substytucje, tak długo jak funkcjonalna aktywność niemodyfikowanego genu jest zachowana.
Innym przykładem guz-supresorowego genu jest retinoblastoma (RB). Pełne nukleotydowe sekwencje RB cDNA i przewidywane sekwencje aminokwasowe wynikającego Rb białka (oznaczonego p 1101®) są pokazane w Lee et al. (1987) i na fig. 3. Również użyteczna w celu ekspresji retinoblastoma guz-supresorowego białka jest cząsteczka DNA kodująca sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 2 lub posiadającą sekwencję DNA pokazaną na fig. 3. Skrócona wersja pllO®, nazywana p56R® jest również użyteczna. Dla sekwencji p5ó®® zobacz Huang et al. (1991). Dodatkowe guz-supresorowe geny mogą być używane w wektorach tego wynalazku. Tylko dla celów ilustracji tylko mogą to być białko p21 (Kamb et al. (1994)), białko p21, białko WT1 Wilm’s tumor WT1 protein, mitozyna, h-NUC, lub białko grubego jelita karcinoma DCC. Mitozyna jest opisana w X. Zhu i W- H Lee, U.S. numer seryjny aplikacji 08/141,239, oddany do rejestru w 22 października 1993 r. i następnie w części kontynuacja przez tych samych wynalazców numer rejestru prawnego P-CJ 1191, oddany do rejestru październik 24, 1994, obie z nich są tutaj włączone przez cytowanie literatury. Podobnie, h-NUC jest opisane przez W-H Lee i P-L Chen, U.S. numer seryjny aplikacji 08/170,586, oddany do rejestru 20 grudnia 1993, tutaj włączony przez cytowanie literatury.
Jak jest znane ekspertom, termin „białko” oznacza liniowy polimer aminokwasów połączonych w specyficzną sekwencję poprzez wiązania peptydowe. Jak użyto tutaj, termin „aminokwas” odnosi się do obu D lub L stereoizomerowych form aminokwasu, chyba, że z innych powodów konkretnie oznaczono. Również objęte w zakres tego wynalazku są ekwiwalent białek i ekwiwalent polipeptydów, dla przykładu mające aktywność biologiczną oczyszczone dzikiego typu białka guz-supresorowe. „Ekwiwalent białek” i „ekwiwalent polipeptydów” odnoszą się do związków, które odbiegają od liniowej sekwencji naturalnie występujących białek lub polipeptydów, ale które mają aminokwasowe zastępstwa, które nie zmieniają ich biologicznej aktywności. Te ekwiwalenty mogą różnić się od natywnych sekwencji zastąpieniem jednego lub więcej aminokwasów pokrewnymi aminokwasami, na przykład, podobnie naładowanymi aminokwasami lub zastąpieniem lub modyfikacją bocznych łańcuchów lub grup funkcjonalnych.
Również objęte definicją funkcjonalne guz-supresorowe białko jest każde białko, którego obecność redukuje guzotwórczość, złośliwość lub hiperproliferacyjny fenotyp komórki gospodarza. Przykłady guz-supresorowych białek wg tej definicji obejmują, ale nie są ograniczone do pllO1*0, p56R*, mitozyny, h-NUC i p53. Termin „guzotwórczość jest przeznaczony do oznaczenia posiadania zdolności do tworzenia guzów lub zdolności powodowania tworzenia guza i jest równoznaczny z neoplastycznym rozwojem. Termin „złośliwość” jest przeznaczony do opisu gózotwórczej komórki posiadającej zdolność do metastazowania i zagrażającej życiu organizmu gospodarza. „Hiperproliferacyjny fenotyp” jest przeznaczony do opisu rosnącej komórki i dzielącej się z szybkością powyżej normalnych ograniczeń wzrostu dla komórek tego typu. „Neoplastyczny” również jest przeznaczony do włączenia komórek nie posiadających endogennego funkcjonalnego guz-supresorowego białka lub niezdolność komórki do ekspresji endogennych kwasów nukleinowych kodujących funkcjonalne guz-supresorowe białko.
Przykładem wektora z tego wynalazku jest rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny posiadający obcy gen kodujący białko p53 lub aktywny jego fragment jest przedstawiony przez ten wynalazek. Sekwencja kodująca gen p53 jest przedstawiona poniżej w tabeli 1.
186 073
Tabela 1
V*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD TLPEIGSQTA FRVTA MEEPQ SDPSY EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL PSQAM DDLML SPDDI EQWFT EDPGP DEAPR MPEAA PPVAP APAAP TPAAP APAPS WPLSS SVPSQ KTYQG SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC QLAKT CPVQL WVDST PPPGT RVRAM AIYKQ SQHMT EWRR CPHHE RCSDS DGLAP PQHLI RVEGN LRVEY LDDRN TFRHS VVVPY EPPEV GSDCT TIHYN YMCNS SCMGG MNRRP ILTII TLEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE EENLR KKGEP HHELP PGSTK RALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ERFEM FRELN EALEL KDAQA GKEPG GSRAH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF KTEGP DSD* *= kodon stop
Każdy z wektorów ekspresyjnych opisanych tutaj jest użyteczny jako układy dla diagnozy lub terapii. Wektory mogą być użyte do skriningu, który z wielu guz-supresorowych genów byłby użyteczny w terapii genowej. Na przykład, próba komórek podejrzewanych o neoplastyczność może być usunięta z obiektu i ssaka. Komórki mogą następnie być połączone, w odpowiednich warunkach z efektywną ilością rekombinowanego wektora tego wynalazku posiadającego wstawiony obcy gen kodujący jeden z kilku funkcjonalnych guzsupresorowych genów. Czy wprowadzenie tego genu będzie odwracać złośliwy fenotyp może być mierzone przy pomocy tworzenia kolonii na miękkim agarze lub tworzenia guza u gołych myszy. Jeśli złośliwy fenotyp jest odwrotny wówczas obcy gen jest określony jako pozytywny kandydat dla udanej terapii genowej dla obiektu lub ssaka. Gdy używane do celów farmaceutycznych, one mogą być połączone z jednym lub większą ilością farmaceutycznie możliwych do przyjęcia nośników. Farmaceutycznie możliwe do przyjęcia nośniki są dobrze znane ekspertom i obejmują wodne roztwory takie jak buforowana sól fizjologiczna lub inne roztwory lub środki takie jak glikole, gliceryna, oleje roślinne (na przykład olej z oliwek) lub dające się wstrzyknąć organiczne estry. Farmaceutycznie możliwy do przyjęcia nośnik może być użyty do podania bieżących mieszanin do komórki in vitro lub do osobnika in vivo.
Farmaceutycznie możliwy do przyjęcia nośnik może zawierać fizjologicznie akceptowany związek, który powoduje, na przykład, stabilizowanie mieszaniny lub zwiększanie albo zmniejszanie absorbcji czynnika. Fizjologicznie możliwy do przyjęcia związek może obejmować, na przykład, węglowodany, takie jak glukoza, sukroza lub dekstrany, antyoksydanty, takie jak kwas askorbinowy lub glutation, czynniki chelatujące, białka o niskiej masie cząsteczkowej lub inne stabilizatory lub obojętne dodatki. Inne fizjologicznie akceptowalne związki obejmują czynniki zwilżające, czynniki emulgujące, czynniki rozpraszające lub środki konserwujące, które są szczególnie użyteczne w celu powstrzymywania wzrostu i działania mikroorganizmów. Różne środki konserwujące są znane i obejmują np. fenol i kwas askorbinowy. Każdy ekspert wiedziałby, że wybór farmaceutycznie możliwego do przyjęcia nośnika, zawierającego fizjologicznie akceptowalny związek, zależy, np. od drogi podawania polipeptydu i od szczególnych właściwości fizyko-chemicznych specyficznego polipeptydu. Na przykład, fizjologicznie akceptowalny związek taki jak monosterynian glinu lub żelatyna jest szczególnie użyteczna jako czynnik opóźniający, który przedłuża szybkość absorbcji farmaceutycznej mieszaniny podanej obiektowi. Dalsze przykłady nośników, stabilizatorów lub pomocników mogą być znalezione w Martin, Remington’s Pharm. Sci. 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975), włączone tutaj przez cytowanie literatury. Farmaceutyczna mieszanina również może być włączona, jeśli jest to pożądane do liposomów, mikrosfer lub innych matryc polimerowych (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida 1984) włączone tutaj przez cytowanie literatury). Liposomy, np., które składają się z fosfolipidów lub innych lipidów, są nietoksyczne, fizjologicznie akceptowalne i ulegają metabolizmowi nośniki, które są stosunkowo łatwe do otrzymania i podania.
186 073
Jak użyto tutaj, „fermaceutyczna mieszanina” odnosi się do jakichkolwiek mieszanin substancji opisanych tutaj w kombinacji z jednym lub więcej wspomnianym powyżej farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami. Mieszaniny mogą być następnie podawane terapeutycznie lub profilaktycznie. Mogą one być zetknięte z komórką gospodarza in vivo, ex vivo lub in vitro, w efektywnych ilościach. In vitro i ex vivo sposób zetknięcia z komórkami gospodarza są podane poniżej. Gdy praktykowane in vivo, metody podawania farmaceutyku zawierającego wektor tego wynalazku, są dobrze znane specjalistom i obejmują, ale nie są ograniczone, do podawania doustnego, doguzowego, dożylniego, domięśniowego lub dootrzewnego. Podawanie może być dokonane w sposób ciągły lub nieciągły i będzie zmieniać się w zależności od osobnika i stosowanych warunków, np. jak w przypadku innych terapeutycznych mieszanin (Landmann et al. (1992); Aulitzky et al. (1991); Lantz et al. (1990); Supersaxo et al. (1988); Demetri et al. (1989); i LeMaistre et al. (1991)).
Dalej ten wynalazek przedstawia transformowaną prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę gospodarza, na przykład zwierzęcą komórkę lub ssaczą komórkę, posiadającą wstawiony rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny opisany powyżej. Odpowiednie komórki prokariotyczne obejmują, ale nie są ograniczone, do bakteryjnych komórek takich jak komórki E. coli.. Metody transformowania komórek gospodarza retrowirusowmi wektoprami są znane ekspertom, patrz Sambrook et al. (1989) i obejmują ale nie są ograniczone do transfekcji, elektroporacji i mikroiniekcji.
Jak użyto od początku do końca tego podania termin zwierzęcy jest równoznaczny z terminem ssaczy i obejmuje, ale nie jest ograniczony do wołowy, wieprzowy, koci, małpi, psi, koński, gryzonia, szczurzy i ludzki. Dodatkowe komórki gospodarza obejmują ale nie są ograniczone do neoplastycznej i guzowej komórki, takiej jak mięsak kości, rak jajników, rak piersi, czerniak, rak wątroby, rak płuc, rak mózgu, colorectal rak, hematopoietyczna komórka, rak prostaty, rak karku, retinoblastoma, rak przełyku, rak pęcherza, neuroblastoma, lub rak nerek.
Dodatkowo, każda eukariotyczna linia komórkowa zdolna do ekspresji Ela i Elb lub Ela, Elb i pIX jest stosownym gospodarzem dla tego wektora. W jednym zastosowaniu stosowną eukariotyczną komórką gospodarza jest linia komórkowa 293 dostępna od American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. 20231.
Wszystkie transformowane komórki gospodarza opisane tutaj są użyteczne jako układy dla diagnozy lub terapii. Gdy użyte farmaceutycznie, one mogą być połączone z różnymi farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami. Dogodne farmaceutycznie akceptowane nośniki są dobrze znane specjalistom i np. są opisane powyżej. Mieszaniny mogą następnie być podawane terapeutycznie lub profilaktycznie, w efektywnych ilościach, co opisano w większych detalach poniżej.
Metoda transformacji komórki gospodarza jest również dostarczona przez ten wynalazek. Ta metoda dostarcza sposób kontaktu komórki gospodarza np. prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, z jakimikolwiek wektorami ekspresji opisanymi tutaj i w dogodnych warunkach. Komórki gospodarza transformowane przy pomocy tej metody również są ujęte w zakres tego wynalazku. Zetknięcie może być wykonane in vitro, in vivo, lub ex vivo, używając metody dobrze znanej ekspertom (Sambrook et al. (1989)) i używając efektywne ilości wektorów ekspresyjnych. Również dostarczona w tym wynalazku jest metoda produkcji rekombinowanych białek lub polipeptydów przez hodowlę transformowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach faworyzujących transkrypcję i translację wprowadzonego obcego genu. Metody ekspresji rekombinanta w różnych komórkach gospodarza, takich jak ssaczych, drożdżowych, owadzich lub bakteryjnych komórkach są szeroko znane, włączając te opisane w Sambrook et al., supra. Produkt translacji obcego genu może być następnie wyizolowany w standardowy sposób, taki jak oczyszczanie kolumnowe lub oczyszczanie używając przeciwciało anty-białkowe. Wyizolowane białko lub polipeptyd również jest ujęte w zakres tego wynalazku. Jak użyto tutaj, oczyszczone lub wyizolowane oznacza faktycznie uwolnione od natywnych białek lub aminokwasów normalnie zasocjowane z białkami lub polipeptydami w natywnym lub komórki gospodarza środowisku.
186 073
Również dostarczone przez ten wynalazek są nie-ludzkie zwierzęta posiadające wprowadzone do wnętrza wektory ekspresji lub transformowane komórki gospodarza tego wynalazku. Te „transgeniczne” zwierzęta są wyprodukowane używając metod dobrze znanych ekspertom, np. opisanych w U.S. Patent No. 5,175,384 lub przez standardowe ex vivo terapeutyczne techniki, jaki opisano w Culver et al. (1991).
Jak pokazano w szczegółowo poniżej, ekspresja rekombinowanych adenowirusów guzdzikiego typu p53, jak opisano powyżej, może wydajnie inhibować syntezę DNA i zatrzymywać wzrost szerokiej grupy ludzkich guzowych komórek, wliczając kliniczne cele. Ponadto, rekombinowane adenowirusy mogą prowadzić do ekspresji guz-supresorowych genów takich jak p53 w in vivo utworzonym guzie bez polegania na bezpośrednim wstrzyknięciu do guza lub wcześniejszym traktowaniu ex vivo komórek rakowych. Białko p53, wynik ekspresji, jest funkcjonalne i efektywnie zatrzymuje wzrost guza in vivo i znacznie powiększa czas przeżycia modelowej nagiej myszy z ludzkim rakiem płuca.
Tak więc wynalazki oparte na wektorach są szczególnie stosowane do terapi genowej. Zgodnie z tym metody terapi genowych wykorzystujące te wektory znajdują się w obrębie tego wynalazku. Oczyszczony wektor podawany jest następnie w odpowiedniej ilości in vivo lub ex vivo do obiektu. Metody terapii genowej znane są doskonale w sztuce, patrz np. Larrick, J. W. i Burek, K.L. (1991) i Kreigler, M. (1990). Termin „obiekt” odnosi się do każdego zwierzęcego, ssaczego, szczurzego, gryzonia, wołowego, wieprzowego, końskiego, psiego, kociego, lub ludzkiego pacjenta. Gdy obcy gen koduje gen hamujący guz lub inne białko anty-guzowe, wektory stanowią użyteczne narzędzie leczenia lub redukcji szybko namnażających się komórek w obiekcie, inhibując proliferację guza lub poprawiając ten szczególny rodzaj patologii. Patologiczne hiperproliferujące komórki charakteryzują następujące stany chorobowe: przerost tarczycy - choroba Grave’sa, łuszczyca, przerost gruczołu krokowego, choroba Lifraumeni w tym rak piersi, mięsaki i inne nowotwory, rak pęcherza, rak jelita, rak płuc, wiele białaczek i chłoniaków. Przykłady niepatogennych hiperproliferujących komórek znaleziono : w komórkach epitelialnych przewodów mlecznych w czasie laktacji jak również w komórkach związanych z procesem gojenia ran. Patologicznie hiperproliferujące komórki wykazują charakterystyczny brak zahamowania kontaktowego zgodnie z ich zdolnością do selektywnej adhezji, która wywołuje zmianę właściwości powierzchniowych komórki i dalszą degradację łączności międzykomórkowej. Do zmian tych zaliczyć można również stymulację do podziałów i zdolność wydzielania enzymów proteolitycznych.
Co więcej obecny wynalazek wiąże się z metodą usuwania odpowiednich próbek ludzkich komórek hiperproliferujących zakażających prekursory komórek krwiotwórczych podczas rekonstrukcji szpiku kostnego poprzez wprowadzenie odmiany dzikiej genu supresorowego guza do preparatu komórkowego z użyciem wynalezionego wektora (wprowadzanego bądź z autologowych komórek peryferalnych krwi lub szpiku kostnego). Tak jak określono w tej pracy „stosowne próbki” zdefiniowano jako heterogenne preparaty komórkowe pobrane od pacjenta np: zmieszaną populację komórek zawierającą zarówno fenotypowo normalne jak i patogenne komórki. Termin „podawanie” zawiera, ale nie ogranicza się do wprowadzania do komórki lub obiektu dożylnie, poprzez bezpośrednią iniekcję do guza, śródguzową iniekcję, podawanie wewnątrzotrzewnowe, podawanie w areozolu do płuc lub miejscowo. Podawanie tego typu może być połączone z farmakologicznie zaakceptowanym nośnikiem, opisanym powyżej.
Termin „zredukowana tumorogenność” oznacza komórki, które zostały przekształcone na mniej guzotwórcze lub nie guzotwórcze. Komórki o zredukowanej guzowatości albo nie wytwarzają guza in vitro albo wykazują opóźnienie od tygodni do miesięcy przed pojawieniem się in vivo wzrost guza i/lub słabszy wzrost masy guza w porównaniu do guzów majach w pełni nie aktywny lub nie funkcjonalny gen supresorowy guza.
Jak użyto tutaj, terminem „efektywna ilość” określa się ilość wektora lub antyrakowego białka, które daje pozytywny efekt kontroli wzrostu komórki. Na przykład: jedna dawka zawiera od 108 do 1013 jednostek iniekcyjnych. Typowym przebiegiem podawania może być
186 073 jedna taka dawka dziennie powtarzana przez okres pięciu dni. Efektywna ilość może się zmieniać w zależności od rodzaju nieprawidłowości lub warunków, pacjenta i jego stanu, i inych czynników dobrze znanych biegłym w sztuce. Efektywna ilość jest łatwa do określenia dla biegłych w sztuce.
Również w zakres tego wynalazku włączono metodę polepszającą scharakteryzowanie patologii hiperproliferujących komórkek lub defektu genetycznego w obiekcie przez podawanie do obiektu efektywnej liczby wektora opisanego powyżej zawierającego obcy gen kodujący produkt genu posiadający zdolność polepszania patologi w odpowiednich warunkach. W znaczeniu użytym tytaj „defekt genetyczny” oznacza każdą chorobę lub odstępstwo do stanu normalnego dającego efekt czynnika dziedzicznego, takiego jak anemia sierpowata czy choroba Tay-Sacha.
Wynalazek ten dostarcza również metodę redukcji proliferacji komórek guza w obiekcie przez wprowadzenie do masy guza efektywnej ilości adenowirusowego wektora ekspresyjnego zawierającego gen antyguzowy inny niż gen supresorowy guza. Gen antyguzowy może kodować np. kinazę tymidynową (TK). Efektywna ilość czynnika terapetycznego jest następnie wprowadzana do obiektu, który w obecności genu antyguzowego jest toksyczny dla komórki. W specyficznym przykładzie kinazy tymidynowej czynnikiem terapeutycznym jest metabolit kinazyn tymidynowej taki jak gancyklowir (GCV), arabinonukleozyd 6-metoksypurynowy (araM) lub jego funkcjonalny ekwiwalent. Zrówno gen kinazy tymidynowej jak i metabolit kinazy tymidynowej użyte muszą być jednocześnie aby być toksyczne dla komórki gospodarza. Jednakże w jego obecności GCV jest fosforylowany i staje się potencjalnym inhibitorem syntezy DNA gdzie araM przekształca się do cytotoksycznego anabolitu araATP. Inne geny antyguzowe mogą być używane równie dobrze w kombinacji z odowiednim czynnikiem terapeutycznym do redukcji proliferacji komórek guza. Tego typu kombinacje innych genów i czynników terapeutycznych są doskonale znane specjalistom. Innym przykładem mógłby być wektor z tego wynalazku ekspresujący enzym deaminazę cytozynową. Taki wektor może być użyty w połączeniu lekiem ó-fluorouracylu (Austin i Huber, 1993) lub niedawno opisanym A gen z E. coli Deo w kombinacji z 6-metylo-puryno-2’-deuksyrybunuklozydem (Sorscher et al. 1994).
Tak jak w przypadku użycia genu suareszroweou guza opisanego wcześniej użycie innych genów antyguzowych zarówno pojedynczo jak i w kombinacji z właściwym czynnikiem terapeutycznym wprowadza traktowanie dla niekontrolowanego wzrostu komórki i proliferacji charakterystycznej dla guzów i nowotworów złośliwych. Choć ten wynalazek dostarcza terapię powstrzymującą niekontrolowany wzrost komórkowy u pacjenta przez złagodzenie symptomów choroby lub jej zniszczenie u pacjenta. Efekt takiego traktowania zawiera ale nie jest ograniczony do przedłużenia czasu przeżycia pacjenta, redukcji masy albo ciężaru guza, apoptozy komórek guza lub ograniczenia liczby krążących komórek guza. Znaczenia ważności korzystnego efektu tej terapii są dobrze znane specjalistom.
Wynalazek przedstawia wektory ekspresyjne rekombinowanych adenowirusów charakteryzujących się częściową lub całkowitą delecją adenowirusowego DNA białka IX i zawierającego obcy gen kodujący obce białko, gdzie obce białko jest genem samobójczym lub jego funkcjonalnym ekwiwalentem. Gen anty-rakowy TK, opisany powyżej, jest przykładem genu samobójczego, ponieważ podczas ekspresji produkt tego genu jest lub może zostać wytworzony jako gen letalny dla komórki. Dla TK letalność jest indukowana obecnością GCV. Gen TK pochodzi z wirusa opryszczki i jest znany doskonale biegłym w sztuce. Plazmid pMLBKTK z E.coli (ATTC #39369) jest źródłem genu kinazy tymidynowej (TK) wirusa opryszczki (HSV-1) wykorzystanym w tym wynalazku. Jakkolwiek wiele innych źródeł również istnieje.
Gen TK może być wprowadzany do masy guza przez połączenie wektora ekspresyjnego adenowirusa z odpowiednim farmakologicznie zaakceptowanym nośnikiem. Wprowadzenie może być dokonane poprzez np.: bezpośrednie wstrzyknięcie rekombinzwaneoo adenowirusa do masy guza. W szczególnym przypadku raka takiego jak rak wątroby (HCC), bezpośrednie wstrzyknięcie do przewodów wątrobowych może być wykorzystane do rozprowadzenia
186 073 ponieważ większość HCC pochodzi z tych arterii. Do kontroli proliferacji guza indukowana jest śmierć komórki przez traktowanie pacjenta metabolitem TK takim jak gancyklowir osiągając zmniejszenie masy guza. TK metabolit może być podawany np.: systematycznie przez lokalne inokulacje w obrębie guza lub w szczególnym przypadku jak HCC, przez wstrzyknięcie do przewodu wątrobowego. Metabolit TK jest podawany co najmniej raz dziennie lecz może być zwiększany lub zmniejszany zależnie od potrzeb. Metabolit TK może być podawany jednocześnie bądź niezależnie od podawania TK zawierającego wektor. Biegli w sztuce znają lub mogą określać dawkę i czas podawania, który jest efektywny terapeutycznie.
Metoda guzo - specyficznego dostarczania genu supresorowego do guza realizowana jest przez kontakt docelowej komórki zwierzęcia z efektywną ilością wynalezionych rekombinowanych adenowirusowych wektorów ekspresyjnych. Zadaniem genu jest kodowanie czynnika anty-guzowego, takiego jak funkcjonalny gen supresorowy guza lub gen samobójczy. Termin „kontaktowanie” zawiera każdą metodę prowadzącą do skutecznego przenoszenia wektora, taką jak wstrzykiwanie wewnątrzguzowe.
Użycie wektora adenowirusowego z tego wynalazku do przygotowania lekarstw, leczenia chorób i w terapii jest przedstawiane w dalszej kolejności przez ten wynalazek. Do ilustracji użyto następujących przykładów, nie ograniczając zakresu tego wynalazku.
Przykład 1
Plazmid pAd/MLP/p53/Elb został użyty do manipulacji jako materiał startowy. Plazmid ten opiera się na pBR322 pochodnej pML2 (dęlecji pBR322 dla par zasad 1140 do 2490) zawiera sekwencje adenowirusa typu 5 rozciągającj się od pary zasad numer 1 do pary zasad 5788 oprócz dęlecji dla adenowirusa typu 5 od pary zasad 357 do 3327. Od strony Ad5 357/3327 delecji wprowadzona jest jednostka transkrypcyjna zawierająca późny promotor adenowirusa typu 2, potrójny lider cDNA adenowirusa typu 2 i ludzki p53 cDNA. Jest to typowe podstawienie El wektora usuniętego dla Ad5 Ela i Elb genu ale zawierającego gen białka IX Ad5 (patrz przegląd wektorów adenowirusowych. Graham i Prevec (1992)). Ad2 DNA pozyskano z Gibco BRL. Restrykcyjne endonukleazy i T4 DNA ligazę otrzymano z Gibco BRL i komórki 293 z American Type Culture Collection (ATCC). Prep-A-gen DNA żywicę do oczyszczania pozyskano z BioRad. Bulion LB wzrostowy bakterii otrzymano z Difco. Kolumny Qiagen do oczyszczania DNA pochodziły z Oiagen Inc. Ad5 dl 327 pozyskano od RJ. Schneider, NYU. MBS DNA kit transfekcyjny zakupiono od Stratagene.
Jeden (1) ng pAd/MLP/p53/EQlb- trawiono z 20 jednostkami każdego z enzymów restrykcyjnych Ecl 136II i NgoMI zgodnie z zaleceniami producenta. Pięć (5) (ig Ad2 DNA trawiono 20 jednostkami każdej z restrykcyjnych endonukleaz Dral i NgoMI zgodnie z zaleceniem producenta. Trawione fragmenty restrykcyjne nakładano na osobne ścieżki 0,8 % żelu agarozowego i wykonano elektroforezę przy 100 woltach przez 2 godziny. Fragment restrykcyjny 4268 bp z próbki Pad/MLP/p53/EQlb oraz fragment 6437 bp próbki Ad2 rozdzielano na żelu z użyciem Prep-A-gen DNA żywicy ekstrakcyjnej zgodnie ze specyfikacją dostarczoną przez producenta. Fragmenty restrykcyjne zmieszano i traktowano T4 DNA ligazą w całkowitej objętości 50 μ1 w 16°C przez 16 godzin zgodnie z zaleceniami producenta. Po ligacji 5 |il mieszaniny reakcynej użyto do transformacji komórek DH5a E. coli odpornością na ampicylinę zgodnie z procedurą producenta. Sześć kolonii bakteryjnych otrzymanych poprzez tą procedurę użyto do zaszczepienia oddzielnych 2 ml kultur wzrostowych LB i inkubowano przez noc w 37°C wytrząsając. DNA przygotowane było z każdej kultury bakteryjnej używając standardowej procedury (Sambrook et al. (1989)). Jedną czwartą plazmidu DNA z każdej izolacji trawiono 20 jednostkami endonukleazy XhoI w celu wyszukania właściwych rekombinantów zawierające fragmenty restrykcyjne wielkości 3627, 3167, 2466 i 1445 par zasad. Pięć z sześciu przeszukanych izolantów zawierało właściwy plazmid. Jeden z nich został użyty następnie do inokulacji 1 litra medium LB w celu izolacji większej ilości plazmidu DNA. Po całonocnej inkubacji plazmid DNA izolowano z 1 litra kultury przy użyciu kolumienek do oczyszczania DNA Qiagen, zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymany plazmid oznaczono jako Pad/MLP/p53/PIX-. Próbki tego plazmidu zdeponowano w American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A., 12301, 22 października 1993. Depozyt został zrobiony na zasadach Traktatu Budapesztańskiego Międzynarodowych Depozytów Mikroorganizmów dla celów procedury patentowej. Depozyt ma numer rejestru ATCC No 75576.
Do konstrukcji rekombinowanego adenowirusa użyto 10 |_jg Pad/MLP/p53/PIX, które traktowano 40 jednostkami restrykcyjnej endonukleazy EcoRI do liniowego wydłużenia plazmidu. Adenowirus typu 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982)) trawiono endonukleazą Ciał i duży fragment (około 33 kilo par zasad)oczyszczano przez wirowanie w gradiencie sacharozy. Dziesięć (10) fig EcoRI traktowane Pad/MLP/p53/Elb i 2,5 pg Ciał traktowane Ad5 dl 327 zmieszano i użyto do transfekcji około 106 komórek 293 używając MBS ssaczy kit transfekcyjny jak zaleca dostawca. Osiem (8) dni po transekcji komórki 293 rozdzielono 1 do 3 na świeże podłoże i dwa dni później efekt cytopatyczny adenowirusa stał się widoczny na transfekowane komórki. W 13 dniu przygotowano potransfekcyjne DNA z zainfekowanych komórek używając standardowych procedur (Grahm i Prevec (1991)) i analizowano poprzez trawienia restrykcyjne używając endonukleazy Xhol. Bezpośrednią ekspresję wirusa p35 weryfikowano po infekcji komórek raka kości SaoS2 lizatem wirusowym i immunoblotingu z przeciwciałami monoklonalnymi anty-p53 opisanymi jako 1801 (Novocasta Lab. Ltd., U.K.).
Przykład 2
Materiały i metody
Linie komórkowe
Rekombinowane adenowirusy były hodowane i propagowane w linii komórkowej 293 (ATCC CRL 1579) komórek embrionalnych nerki ludzkiej utrzymywane w podłożu DME zawierającym 10% zdefiniowaną surowicę cielęcą (Hyclone). Komórki Saos-2 utrzymywano w podłożu Kaighin’a z dodatkiem 15% zarodkowej surowicy cielęcej. Wszystkie inne linie komórkowe rosły na podłożu Kaighin’a z dodatkiem 150% zarodkowej surowicy cielęcej. Komórki Saos-2 zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. Erie Stanbridge. Wszystkie inne linie komórkowe uzyskano z ATCC.
Konstrukcja rekombinowanych adenowirusów
Do konstrukcji wirusów Ad5/p53 użyto 1,4 kb fragment Hindlll-Smal zawierającego pełnej długości cDNA dla p53 izolowano z pGEMl-p53-B-T (uprzejmie dostarczony przez Dr. Wen Hwa Lee) i wprowadzony do miejsca wielokrotnego klonowania wektora ekspresyjnego psP72 (Promega) używając standardowych procedur klonowania (Sambrook et al 1989). Insert p53 został odzyskany z tego wektora po trawieniu z XhoI-BglII i elektroforezie żelowej. Sekwencję kodującą p53 następnie wprowadzono do pNL3C lub pNL3CMV wektorów adenowirusa genów transferowych (dostarczonych przez Dr. Robert Schneider) zawierające Ad5 5’ odwrócone końcowe powtórzenia, wirusowe sygnały pakujące i Ela wzbogacenia w górę albo od Ad2 późnego promotora (MLP) albo bezpośredniego wczesnego genu promotorowego cytomegalowirusa ludzkiego (CMV), po której następowała trój częściowa liderowa cDNA i Ad5 sekwencja 3325-5525 bp osadzona w PMLZ. Ten nowy konstrukt zastąpił region El (bp 360 - 3325) z Ad 5, wprowadzony albo z Ad2 MLP (A/M/53) albo z ludzkiego promotora (A/C/53), po których występował trójczęściowy liderowy cDNA (patrz figura 4). Inserty p53 wykorzystały pozostałego w dół Elb miejsca poliadenylacji. Dodatkowo generowano MLP i CMV wprowadzone z rekombinantów p53 (a/M.N/53, A/C/N/53), które posiadały dalszą 705 nukleotydową delecję sekwencji Ad5 do usunięcia regionu kodującego białko IX (PIX). Jako kontrolę utworzono rekombinowanego adenowirusa z plazmidu ojcowskiego PNL3C bez insertu p53 (A/M). Druga kontrola składała się z rekombinowanego adenowirusa kodującego gen β galaktozydazy pod kontrolą promotora CMV (A/C/13-gal). Plazmidy wydłużano albo z Nru I albo Eco RI i kotransfekowano z dużym fragmentem Ciał trawionym Ad 5 mutantami dl309 lub dl327 (Jones i Shenk (1979)) z użyciem Ca/PO4 kitu transfekcyjnego (Stratagene). Płytki wiralne izolowano i identyfikowano rekombinanty przez jednoczesną analizę trawień restrykcyjnych i PCR z użyciem primerów specyficznych rekombinantom przeciwko potrójnej sekwencji liderowej CDNA z sekwencją w dół p53
186 073
CDNA. Rekombinowane adenowirusy poddane były dalszemu oczyszczaniu przez ograniczone rozpuszczanie i cząstki wirusa oczyszczono i miareczkowano (aktywność) standardowymi metodami (Graham i van der Erb 1973; Graham i Prevec 1991).
Wykrywanie białka P53
Komórki Saos-2 lub Hep 3B (5x105) infekowano oznaczonymi rekombinantami adenowirusowymi przez okres 24 godzin przy wzrastających wielokrotnościach infekcji (MOI) jednostek tworzących płytki wirusowe/komórkę. Komórki były następnie jednorazowo wymywane PBS i zbierane buforem lizującym buforem (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 0,1% NP4O, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 10 pg/ml aprotinina, 10 ug/ml leueptina, i 1 mM PMSF). Białka komórkowe (około 10 pg) rozdzielano na 10 % PAGE-SDS i przenoszono na nitrocelulozę. Membrany inkubowano z a-p53 przeciwciałem Pab 1801 (Novocastro) po której następowała koniugacja owczej anty-mysiej IgG z peroksydazą chrzanową. Białko p53 wizualizowano przez chemiluminescencję (ECL kit, Amersham) na filmie XAR-5 Kodaka.
Pomiar szybkości syntezy DNA
Komórki (5x103) umieszczono na płytce immunologicznej i pozwolono na związanie przez noc (37°C, 7% C02). Komórki były następnie infekowane przez 24 godziny częściami oczyszczonych rekombinantów wirusowych w zakresie MOI od 0,3 do 100. Podłoże było zmieniane 24 godziny po infekcji i dalej kontynuowano inkubacje do całkowitego czasu 72 godziny. 3H-tymidyna (Amersham, lp Ci/próbę) dodana w 18 godzin przed zbiorem. Komórki zbierano na filtrach z włókna szklanego i poziom wprowadzanej radioaktywności mierzono w liczniku scyntylacyjnym beta. Wprowadzana 3H- tymidyna wyrażana była jako średni % (+/- SD) podłoża kontrolnego i określana w stosunku do MOI.
Rakotwórczość u nagich myszy
Około 2,4x108 komórek Saos -2 umieszczonych w kolbach T225 traktowano buforem do suspendowania (1% sacharoza w PBS) zawierającym albo A/M/N/53 albo A/m oczyszczone wirusy przy MOI 3 lub 30. Po całonocnej infekcji komórki wprowadzano podskórnie do lewego lub prawego boku BALB/c athymic nagich myszy (4 myszy na grupę). Jeden bok wstrzykiwany był A/M/N/53 traktowanymi komórkami, podczs gdy przeciwny bok zaszczepiany był kontrolnymi komórkami A/M, każda mysz służyła jako swoja własna próba kontrolna.
Zwierzęta otrzymujące obustronne zastrzyki z komórek traktowanych buforem służyły jako kontrole dodatkowe. Rozmiar guza (długość, szerokość, wysokość) i ciężar ciała były następnie mierzone dwa razy w tygodniu przez okres 8 tygodni. Objętość guza oszacowano dla każdego zwierzęcia na podstawie geometri kulistej z promieniem równym jednej drugiej przeciętnej miary wielkości guza.
Wewnątrz-guzowa analiza RNA
BALB/c athymic nagie myszy (w wieku około 5 tygodni) były nastrzykiwane 1x107 małymi komórkami raka płuc (SCLC) w prawe boki. Guzom pozwalano rosnąć przez 32 dni aż do osiągnięcia około 25-50 mm3. Myszy otrzymywały okołoguzowe zastrzyki z albo A/C/53 bądź A/C/B-gal rekombinowanych wirusów (2x109 (pfu)) w przestrzenie podskórne poniżej masy guza. Guzy wycinano od zwierząt 2 i 7 dniowych po traktowaniu adenowirusem i przemywano PBS. Próbki guza były homogenizowane i izolowano totalny RNA używając Trireagent Kit (Molecular Research Center, Inc.). PolyA RNA izolowano używając PolyATract system izolacyjny RNA (Promega) i około 10 ng próbki użyto do reakcji RT-PCR określenie ekspresji mRNA rekombinantów p53 (Wang et al. (1989). Oznaczono primery do amplifikacji sekwencji pomiędzy potrójnym adenowirusowym liderem CDNA i regionem w dół p53 CDNA, upewniając się, że tylko rekombinant a nie endogenne p53 może być amplifikowane.
Terapia genowa P53 ustabilizowanych guzów nagich myszy
Około 1x107 komórek guzowych H69 (SCLC) wstrzykiwano podskórnie samicom BALB/c athymic nagich myszy. Pozwalano rozwijać się guzom przez okres 2 tygodni w których poszczególne zwierzęta były z uśrednioną wielkością guza (N=5/grupę). Okołoguzowe
186 073 wstrzyknięcia albo A/M/N/53 albo kontrolnego adenowirusa A/M (2xl09pfu/iniekcję) lub samym buforem (1% sacharoza w PBS) wprowadzano dwa razy w tygodniu w ilości całkowitej 8 dawek/grupę. Wielkość guza i ciężar ciała mierzono dwa razy na tydzień przez 7 tygodni, a objętość guza oszacowano tak jak opisano wcześniej. Zwierzęta były następnie obserwowane pod kontem efektu dawkowania i przeżywalności.
Rezultaty
Konstrukcja p53 rekombinowanego adenowirusa
Konstrukcja adenowirusa p53 polegała na zamianie części regionu Ela i Elb adenowirusa typu 5, p53 CDNA znajdującego się pod kontrolą bądź promotora Ad2 MLP (A/M/53) lub CMV (A/C/53) (schemat w fig. 4). Taka podstawienie El poważnie osłabia zdolność rekombinowanych adenowirusów do replikacji, ograniczając ich propagację do komórek 293, które dostarczają produkty genu Ad5 El w trans (Graham et al. (1977)). Po identyfikacji rekombinowanego adenowirusa p53 przez zarówno trawienia restrykcyjne jak i analię PCR kompletną sekwencję p53 cDNA jednego z rekombinowanych adenowirusów sekwencjonowano w celu weryfikacji braku (w niej) mutacji. Następnie oczyszczone preparaty rekombinantów p53 użyto do infekcji komórek HeLa w doświadczeniu na obecność fenotypowo dzikiego typu adenowirusa.
Komórki HeLa, które nie są dostępne dla replikacji delecji El adenowirusów zostały zainfekowane 1-4x109 jednostkami infekcyjnymi rekombinowanego adenowirusa, hodowanego przez 3 tygodnie i obserwowanego na pojawienie się efektu cytopatycznego (CPE). Używając tego testu replikacja rekombinowanego adenowirusa lub zanieczyszczeniem szczepem dzikim nie było wykrywane, łatwo natomiast stwierdzane przez obserwację CPE w komórkach kontrolnych infekowanych dzikim typem adenowirusa na poziomie czułości około lw 109.
Ekspresja P53 zrekombinowanego adenowirusa
Dla oznaczenia czy p53 rekombinowane adenowirusy produkują białko p53, guzowate linie komórkowe, które nie produkowały endogennego białka p53, były infekowane. Ludzkie guzowate linie komórkowe Saos -2 (rak kości) i Hep 3b (rak wątroby) (hepatocellular carcinoma) infekowano przez 24 godziny p53 rekombinowanym adenowirusem A/M/53 lub A/C/53 przy przedziale MOI 0,1 -200 pfu/komórkę. Analiza Western lizatów otrzymanych z infekowanych komórek pokazuje dawkowo-zależną ekspresję białka p53 w obydwu typach komórek (figura 5). Obie linie komórkowe produkujące wyższy poziom białka p53 po infekcji A/C/53 niż z A/M/53 (figura 3). Nie wykryto żadnego białka p53 w nie infekowanych komórkach. Poziomy endogennych p53 typu dzikiego są w warunkach normalnych niskie i prawie nie wykrywalne przez analizę Western ekstraktów komórkowych (Bartek et al. (1991)). Jest jednakże jasne, że poziomy białka p53 typu dzikiego są łatwo wykrywalne po infekcji każdym A/M/53 lub A/C/53 w niskim MOI (figura 5), sugerując że nawet niska dawka p53 rekombinowanego adenowirusa może produkować potencjalnie skuteczny poziom p53.
Powtórne wprowadzenie dzikiego szczepu p53 do ujemnych linii komórkowych p53 osteosarcomy, Saos-2, spowodowało charakterystyczne powiększenie i spłaszczenie tych prawidłowo wrzecionowato ukształtowanych komórek (Chen et al. (1990)). Sub-zlewające się komórki Saos-2 (lxl05 komórek/10 cm płytki) zostały zainfekowane MOI 50 z drugim A/C/53 lub kontrolowanym wirusem A/M i inkubowane w 37°C przez 72 godziny aż do momentu gdy nie zarażone płytki kontrolne zlewały się. W tym punkcie oczekiwana zmiana morfologiczna była ewidentna na płytce poddanej działaniu A/C/53 (fig. 6, panel C), ale nie w niezainfekowanej (fig. 6, panel A) lub płytkach kontrolowanego zarażenia wirusem (fig. 6, panel B). Ten efekt nie był funkcją gęstości komórek dlatego, że płytki kontrolne były wstępnie obsiane niższej gęstości komórkami normalnymi morfologicznie na 72 godziny, kiedy ich płynność zbliżyła się do płytek potraktowanych A/C/53. Wcześniejsze wyniki demonstrowały wysoki poziom ekspresji p53 na MOI 50 w komórkach Saos-2 (fig. 5A) i wyniki te dostarczyły ewidentnych danych, że białko p53 ekspresowane przez te rekombinowane adenowirusy było biologicznie aktywne.
186 073
Inhibicja p53 syntezy komórkowej DNA
Dla pełniejszego testowania aktywności rekombinowanych adenowirusów p53, ich zdolność do inhibicji proliferacji ludzkich komórek nowotworowych była analizowana jako pomiar wbudowania 3H-tymidyny. Wcześniej zostało pokazane, że wprowadzenie dzikiego szczepu p53 do komórek, które nie ekspresują endogenicznego dzikiego szczepu p53 może wstrzymywać komórki w przejściu (tranzycie) Gl/S, prowadząc do inhibicji wbudowania oznakowanej tymidyny do nowo zsyntezowanego DNA (Baker et al. (1990)). Różnorodność wadliwych (niekompletnych) nowotworowych linii komórkowych p53 była zainfekowana innym A/M/N/53, A/C/N/53 lub nie-p53 ekspresującym kontrolnym rekombinowanym adenowirusem (A/M). Silna, zależna od dawki inhibicja syntezy DNA przez oba A/M/N/53 i A/C/N/53 rekombinanty w 7 z 9 nowotworowych linii komórkowych (fig. 7) była zaobserwowana. Obie konstrukcje były zdolne do inhibicji syntezy DNA w tych ludzkich komórkach nowotworowych, niezależnie czy one ekspresowały mutant p53 lub wykazywały brak ekspresji białka. Zostało także odkryte, że w tej analizie konstrukcja A/C/N/53 została bardziej skuteczna niż A/M/N/53. W komórkach Saos-2 (osteosarcoma) i MDA-MB468 (rak piersi), blisko 100% inhibicji syntezy DNA zostało osiągnięte przez konstrukcję A/C/N/53 przy MOI tak niskim jak
10. W dawkach, gdzie zaszła iifinbicca przez adenowirus tylko w 10-30%,
50-100% redukcji zostało zaobserwowane w syntezie DNA używając również rekombinowany adenowirus p53. Dla kontrastu, istotny specyficzny efekt p53 nie został zaobserwowany w żadnej konstrukcji jako porównanie do kontroli wirusa w komórkach HEP G2 (linia komórkowa hepatocarcinoma ekspresująca endogeniczny dziki szczep p53, Bressac et al. (1990)), jak i w białaczkowych liniach komórkowych K562 (bez p53).
Tumorogeniczność u nagich myszy
W bardziej przekonujących testach funkcji rekombinowanych adenowirusów, komórki nowotworowe zostały zainfekowane ex vivo i następnie komórki zostały wstrzyknięte nagim myszom dla oszacowania zdolności rekombinantów do powstrzymania wzrostu nowotworu in vivo. Komórki Saos-2 zainfekowane A/M/N/53 lub kontrolowanym wirusem A/M w MOI 3 lub 30, zostały wstrzyknięte do przeciwnych pachwin nagich myszy. Rozmiary nowotworu były mierzone dwa razy w tygodniu przez 8 tygodni. W MOI 30, nie został zaobserwowany żaden wzrost nowotworu w traktowanych p53 pachwinach żadnego ze zwierząt, podczas gdy w próbach kontrolnych obserwowano dalej wzrost nowotworów (fig. 8). Stopniowy wzrost kontrolowanego nowotworu traktowanego wirusem były podobne do tego obserwowanego u kontrolnych zwierząt traktowanych buforem. Wyraźna różnica we wzroście nowotworu pomiędzy kontrolowanym adenowirusem i rekombinowanym p53 w MOI 3, pomimo dwóch nowotworów z czterech traktowanych p53 myszy zaczęły wykazywać pewien wzrost w przybliżeniu po 6 tygodniach. W ten sposób rekombinant A/M/N/53 adenowirusa jest zdolny do pośrednictwa w supresji specyficznego nowotworu p53 w środowisku in vivo.
Ekspresja in vivo Ad/p53
Pomimo traktowania ex vivo komórek nowotworowych i późniejszego wstrzykiwania ich zwierzętom umożliwiającego krytyczny test supresji nowotworu, bardziej istotnym klinicznie eksperymentem jest ustalenie czy wstrzyknięty rekombinant adenowirusa p53 może infekować i ekspresować p53 w ustalonych nowotworach in vivo. Dla wyjaśnienia tego, komórki H69 (SCLC, p53 nuli) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i nowotwory mogły się rozwijać przez 32 dni. W tym czasie pojedynczy zastrzyk 2xl09pfu A/C/53 lub A/C/beta-gal adenowirusa został wstrzyknięty w przestrzeń otaczającą nowotwór. Następnie nowotwory były usuwane drugiego lub siódmego dnia po wstrzyknięciu adenowirusa i z każdego nowotworu izolowany był polyA RNA RT-PCR, specyficzne primery rekombinantów p53, były następnie używane do detekcji p53 MRNA w traktowanych nowotworach p53 (fig. 9, ścieżka 1, 2, 4, 5). Żaden sygnał p53 nie był widoczny w usuniętych nowotworach z traktowanych beta-gal'em zwierząt (fig. 9, ścieżka 3 i 6). Amplifikacja z primerami aktyny służy jako kontrola reakcji RT-PCR (fig. 9, ścieżka 7-9), gdy plazmid zawierający sekwencję rekombinantu p53 służącą jako pozytywna kontrola dla specyficznego wiązania rekombinantu p53
186 073 (fig. 9, ścieżka 10). Ten eksperyment pokazuje, że rekombinant p53 adenowirusa może specyficznie kierować ekspresją p53 mRNA wewnątrz ustabilizowanych nowotworów po pojedynczym wstrzyknięciu do przestrzeni okzłznowotworowej. Wykazano także trwałość wirusa in vivo po tygodniu od zainfekowania rekombinantem p53 adenowirusa.
Skuteczność in vivo
Do zaadresowania możliwości przeprowadzenia terapii genowej ustabilizowanych nowotworowych, był używany wytrzymały nowotworowe model nagich myszy. Komórki H69 były wstrzykiwane w przestrzeń podskórną prawej pachwiny myszy i nowotwór wzrastał przez 2 tygodnie. Następnie myszy przyjęły iniekcje buforu lub rekombinowanego wirusa dwa razy w tygodniu, łącznie 8 dawek. W myszach traktowanych buforem lub kontrolowanym wirusem A/M, nowotwór dalej szybko wzrastał w trakcie prac, podczas gdy te traktowane wirusem A/M/N/53 wzrastały w bardzo ograniczonym tempie (Fig. 10A). Po przerwaniu zastrzyków kontrolowane, traktowane nowotwory kontynuowały swój wzrost podczas gdy traktowane p53 nowotwory wykazywały niewielki lub brak wzrostu przez tydzień w obecności związków zastępczych egzogenicznego p53 (Fig. 10A). Pomimo traktowania zwierząt kontrolnych samym buforem przyspieszającym wzrost nowotworu w porównaniu do innych traktowanych grup wirusa, nie zostały znalezione żadne istotne zmiany w wadze ciała pomiędzy trzema grupami w czasie okresu traktowania. Owrzodzenie nowotworowe u niektórych zwierząt limitowało związki pomiaru wielkości nowotworu po 42 dniach. Jakkolwiek kontynuując obserwację (monitorowanie) zwierząt by ustalić czas przeżycia dowiedziono przewagę przeżycia dla zwierząt traktowanych p53 (fig. 10B). W końcu zwierzęta kontrolne traktowane adenowirusem zdechły 83 dnia, w czasie gdy traktowane były samym buforem wszystkie zdechły 56 dnia. Dla kontrastu, wszystkie 5 zwierząt traktowanych A/M/N/53 dalej żyły (130 dni po zaszczepieniu) (fig. 10B). Razem te dane ustaliły specyficzny efekt p53 zarówno dla wzrostu nowotworu, jak i czasu przeżycia z ustalonym nowotworem pozbawionym p53.
Wektory adenowirusa ekspresujące p53
Skonstruowano rekombinowane ludzkie wektory adenowirusa, które są zdolne do eksprełzwania wysokich poziomów białka p53 dzikich szczepów w sposób zależny od dawek. Każdy wektor zawiera usunięcia (delecje) w regionach El A i E1B, które zwracają niecałkowitą replikację wirusa (Challberg and Kelly (1979); Harowitz, (1991)). Następnie ważne jest to, że te delecje obejmują opuszczenie tych sekwencji, które kodują Elb 19 i białko 55kd. Białko 19 kd omówione jako włączone w inhibicję apoptozy (White et al. (1992); Rao et al. (1992)), podczas gdy białko 55kd jest zdolne do wiązania białka p53 dzikiego szczepu (Sarnów et al. (1982); Heuvel et al. (1990)). Przez usunięcie tych sekwencji adenowirusa, potencjalne inhibitory funkcji p53 zostały usunięte przez bezpośrednie wiązanie z p53 lub potencjalną inhibicję p53 pośredniczącą w apoptozie. Dalsze konstrukcje, które zostały stworzone miały pozostałość 3’ sekwencji Elb, włączając całą kodującą sekwencję białka IX, którą również usunięto. Pomimo że było to donoszone dla zredukowania pojemności upakowania adenowirusa w przybliżeniu do 3kb mniej niż dziki szczep wirusa (Ghosh-Choudkury et al. (1987)), te konstrukty są usunięte w regionie E3 tak, że konstrukty A/M/N/53 i A/C/N/53 są ujęte w tym przedziale wielkości. Przez usunięcie regionu pIX, sekwencja adenowirusa homologiczna do tych zawierających komórki 293 są zredukowane do w przybliżeniu 300 par zasad, obniżając szansę regeneracji konkurencyjnej replikacji, dzikiego szczepu adenowirusa przez rekombinację. Konstrukty z brakującą pIX kodującą sekwencją okazują się równie wydajne jak te z pIX.
Skuteczność adenowirusa p53 in vitro
W zgodzie z zależną od silnej dawki ekspresją białka p53 w zainfekowanych komórkach, została przedstawiona zależna od dawki inhibicja wzrostu komórek nowotworowych. Podział komórkowy był inhibowany i przedstawiany przez inhibicję syntezy DNA, w szerokiej różnorodności typów komórek nowotworowych znanych z braku ekspresji białka p53 dzikiego szczepu. Bacchetti i Graham (1993) ostatnio donosili o specyficznej inhibicji p53 syntezy DNA w liniach komórkowych raka jajników SKOV-3 przez rekombinant adenowirusa
186 073 p53 w podobnych eksperymentach. Ponadto oprócz raka jajników, dodatkowo ludzkie nowotworowe linie komórkowe zostały przedstawione, reprezentatywnie ważnych klinicznie ludzkich nowotworów i włączając ścieżki nad-ekspresujące mutantu białka p53, może także być wzrost inhibowany przez rekombinanty p53 tego wynalazku. W MOIs gdzie rekombinant A/C/N/53 jest efektywny w 90-100% w inhibicji syntezy DNA w tych typach nowotworu, kontrolowana supresja adenowirusa jest mniejsza niż 20%.
Pomimo, że Feinstein et al. (1992) donosił, że reintrodukcja dzikiego szczepu p53 może wywołać (spowodować) różnicowanie i wzrost proporcji komórek w G1 kontra S+G2 dla komórek leukemicznych K562, żadnego specyficznego efektu p53 nie znaleziono na tej drodze. Horvath i Weber (1988) donieśli, że limfocyty ludzkiej krwi obwodowej są wysoce niedozwolone w infekcji adenowirusa. W oddzielnych eksperymentach, rekombinanty istotnie infekowały nie reagujące komórki K562 z rekombinantem A/C/beta-gal adenowirusa, w czasie gdy inne linie komórkowe, włączając kontrolne linie komórkowe i te wykazujące silny efekt p53, łatwo było zainfekować. W ten sposób przynajmniej część zmiennej skuteczności okazała się właściwa do zmienności infekcji, pomimo, że inne parametry mogą być również zaangażowane.
Obserwowane wyniki z wirusem A/M/N/53 w fig. 8 przedstawiają, że kompletna supresja jest możliwa w środowisku in vivo. Wznowienie wzrostu nowotworu w dwóch na cztery zwierząt traktowanych p53 przy niższym MOI najprawdopodobniej wynikała z małego procentu komórek wstępnie nie zainfekowanych rekombinantem p53 w tej dawce. Kompletna supresja zaobserwowana z A/M/N/53 w wyższej dawce, pokazuje, że zdolność nowotworu do odrostu może być opanowana.
Skuteczność adenowirusa p53 in vivo
Przedstawiona tu praca i innych grup (Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992) pokazuje, że ludzkie komórki nowotworowe wykazujące brak ekspresji dzikiego szczepu p53 mogą być traktowane ex vivo z p53 i wynikiem jest supresja wzrostu nowotworu kiedy traktowane komórki są przeniesione do modelu zwierzęcego. Zgłaszający zaprezentowali pierwszy oczywisty dowód terapii genowej „poskramiacza” nowotworu w ustalonym nowotworze in vivo, dający w wyniku zarówno supresję wzrostu guza jak i wydłużony okres przeżycia. W systemie zgłaszających, dostarczenie do komórek nowotworu nie polegało na bezpośrednim wstrzyknięciu do masy nowotworu. Raczej, rekombinant adenowirusa p53 był wstrzykiwany do przestrzeni okołonowotworowej, a ekspresja p53 mRNA została odkryta w nowotworze. Ekspresja p53 przez rekombinanty była funkcjonalna i silnie tłumiła wzrost nowotworu porównywalny do tego kontrolowanego, guza traktowanego adenowirusem na ekspresującym p53. Jakkolwiek oba p53 i kontrolowany wirus traktujący grupy nowotworowe wykazał supresję nowotworu w porównaniu do prób traktowanych buforem. Zostało zademonstrowane, że lokalna ekspresja nowotworowego faktora necrosis (TNF), interferonu-gama, interleucyny (EL)-2, IL-4 lub EL-7 mogą prowadzić do komórek-T niezależnej supresji nowotworu w nagich myszach (Hoch et al. (1992)). Wystawienie monocytów na wiriony adenowirusa, wykazały, że są one też słabymi induktorami IFN-alfa/beta (omówione w Gooding and Wold (1990)).
Dlatego, nie zaskakuje, że supresja niektórych nowotworów u nagich myszy była obserwowana nawet w kontrolowanych adenowirusach. Pośrednictwo tego wirusa w supresji tego nowotworu nie zostało zaobserwowane w ex vivo kontrolowanym wirusie traktującym komórki nowotworowe Saos-2 opisanych wcześniej. Specyficzne p53 in vivo supresja nowotworu było przedstawione przez kontynuację monitorowania zwierząt w fig. 10. Czas przeżycia traktowanych p53 myszy istotnie wzrastał, z pięciu na pięć zwierząt ciągle żyło więcej niż 130 dni po zaszczepieniu komórek porównane do zera na pięć traktowanych adenowirusem zwierząt kontrolnych. Przeżywające zwierzęta nadal miały wzrastające nowotwory, które mogą odzwierciedlać komórki początkowo nie zainfekowane przez rekombinanty adenowirusa p53. Wyższe lub częstsze dozowanie wykaże możliwość odnotowania tego. W dodatku odizolowanie promotora (Palmer et al. (1991)) lub dodatkowe mutacje mogą zwrócić komórki
186 073 odporne do traktowania rekombinantem adenowirusa p53. Na przykład, mutacje w ostatnio opisanym genie WAF1, genie wzbudzonym przez dziki szczep p53, który następnie inhibuje progresję cyklu komórkowego do S fazy, (El-Deiry et al. (1993); Hunter (1993)) mogą spowodować odpomość-p53 nowotworową.
Przykład 3
Ten przykład pokazuje wykorzystanie genów samobójczych i specyficznej ekspresji tkanek takich genów metodach terapii genowej tu opisanych. Nowotwór wątroby został wybrany jako cel jest to jeden z najbardziej popularnych ludzkich nowotworów złośliwych dotykających mężczyzn, przyczyniających się szacunkowo do 1.250.000 śmierci rocznie na świecie. Zasięg tego raka jest bardzo duży w Południowowschodniej Azji i Afryce, gdzie jest połączony z infekcją Hepatitis B i C i ekspozycją na aflatoksyny. Jedynym sposobem leczenia HCC dające szansę wyleczenia jest obecnie tylko operacja. Mniej niż 20% pacjentów to kandydaci do podjęcia przemyślanej decyzji wycięcia nowotworu (Ravoet C. et al., 1993). Jakkolwiek, nowotwory inne niż nowotwór wątroby są tak samo odpowiednie do metod redukujących ich proliferację w sposób tu opisany.
Linie komórkowe
Wszystkie linie komórkowe ale dla linii komórkowych HLF, były otrzymane z American Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Numery rejestru ATCC są zapisywane w nawiasach. Ludzkie linie komórkowe embrionalne nerek 293 (CRL 1573) zostały użyte do wywołania i rozmnożenia opisanych tu rekombinantów adenowirusa. Były one utrzymywane w medium DME zawierającym zdefiniowane, uzupełniające serum cielęce (Hyclone). Linie komórkowe hepatocellular carcinoma Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065), i HLF zostały zachowane w medium DME/F12 uzupełnionym 10% zarodkowego wołowego serum, linie komórkowe raka piersi MDA-MB468 (HTB 132) i BT-549 (HTB 122). Zmienione komórki wątroby (CCL 13) rosły w medium MeM uzupełnionym zarodkowym wołowym serum. Linie komórkowe HLF zostały uzyskane od dr T. Morsaki i H. Kitsuki z Kyushu University School of Medicine w Japonii.
Rekombinowana konstrukcja wirusa
Dwa wektory ekspresji adenowirusa zostały tu oznaczone jako ACNTK i AANTK i pozbawione białka funkcyjnego IX (przedstawione na fig. 11) są zdolne do kierowania ekspresją samobójczych genów TK w komórkach nowotworowych. Trzeci oznaczony wektor ekspresji adenowirusa AANCAT był skonstruowany do dalszego zademonstrowania możliwości przeprowadzenia wyraźnej ekspresji genu celowego do specyficznych typów komórek używających wektory adenowirusa. Te konstrukcje adenowirusa zostały zebrane, opisane w fig. 11 i 12 i są pochodnymi tych wcześniej opisanych dla ekspresji genów tłumiących nowotwór.
Dla ekspresji obcego genu, kaseta ekspresji została wprowadzona wykorzystując ludzki cytomegalovirus bezpośrednio za wczesnym promotorem/wzmacniaczem (CMV) (Boshart, M. et al., 1985) lub przez system ludzkiej fetoproteiny (AFP) wzmacniacz/promotor (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H. et al., 1989) do przeprowadzenia transkrypcji genu TK lub genu chloroamphenicol acetyltransferazy (CAT). CMV wzmacniacz promotor jest zdolny do przeprowadzenia silnej ekspresji genu w szerokiej różnorodności typów komórek, podczas gdy konstrukt AFP wzmacniacz/promotor ogranicza ekspresję do komórek nowotworu wątroby (HCC), które ekspresują AFP w około 70-80% populacji pacjentów HCC. W konstrukcie wykorzystuje się CMV promotor/wzmacniacz, typ adenowirusa z potrójną sekwencją liderową, która także była wbudowana dla wzmocnienia translacji transkryptu TK (Berkner, K. L. and Sharp, 1985). W dodatku do usunięcia El oba wektory adenowirusa są dodatkowo usunięte dla 1.9 kb DNA w regionie E3 wirusa. Usunięte DNA w regionie E3 jest nieistotne dla rozmnażania wirusa, a jego usunięcie zwiększa zdolność wbudowywania rekombinantu wirusa dla obcych DNA przez równoważne ilości (1.9 kb) (Graham and Prevec, 1991).
186 073
Dla zaprezentowania specyficzności AFP promotor/wzmacniacz, wirus AANCAT został także skonstruowany gdzie marker genu acetylotransferazy chloramfenikonowej (CAT) jest pod kontrolą AFP wzmacniacz/promotor. W konstrukcie wirusa ACNTK, sekwencja liderowa została umieszczona pomiędzy CMV promotor/wzmacniacz i genem TK. Donoszono, że potrójna sekwencja liderowa wzmacnia translację powiązanych genów. Substytucja El osłabia zdolność zrekombinowanych wirusów do replikacji, ogranicza ich rozmnażanie do komórek 293, który dostarcza produkty genu Ad5 El w układzie trans (Graham et al., 1977).
Wektor adenowirusa ACNTK: plazmid pMLBKTK w E.Coli HB101 (z ATCC #39369) był użyty jako źródło kinazy tymidynowej (TK) z wirusa opryszczki. TK był usunięty z tego plazmidu jako fragment genu 1.7 kb przez trawienie z enzymami Bgl II i Pvu II i subklonowane do Bam HI, EcoR V miejsc restrykcyjnych plazmidu pSP72 (Promega) używając standardowych technik klonowania (Sambrook et al., 1989). Wprowadzone TK było następnie wyizolowane jako fragment 1.7 kb z tego wektora przez trawienie z Xba I i Bgl II i sklonowane do Xba I, BamHI trawionego plazmidu pACN (Wills et al., 1994). 20 mikrogramów tego plazmidu oznaczonego pACNTK była wydłużana liniowo z Eco RI i kotransfektowana do komórek 293 (ATCC CRL 1573) z 5 mikrog Cla I trawionych ACBGL (Wills et al.,1994 supra) z zastosowaniem zestawu transfekcyjnego CaP04 (Stratagene, San Diego, Califomia). Łysinki wirusowe były izolowane i rekombinanty, oznaczone ACNTK, były identyfikowane i analizowane przez restrykcyjne trawienie izolowanego DNA z Xho I i BsiWI. Pozytywne rekombinanty były dalej oczyszczane przez rozpuszczenie, rozwiniecie i określenie aktywności standardowymi metodami (Graham and Prevec, 1991).
Wektor adenowirusa AANTK: promotor alfa-fetoproteiny (AFP-P) i wzmacniacz (AFP-E) były klonowane z ludzkiego genomu DNA (Clontech) używając wzmocnienia PCR z primerami zawierającymi miejsca restrykcyjne na ich końcach. Primery używane do izolowania 210 bp AFP-E zawierały Nhe I miejsca restrykcyjne na primerze 5’ i Xba I, Xho I, Kpn I połączony z primerem 3’. Sekwencja primeru 5’ była 5’-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. Sekwencja primeru 5’ była 5’-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3’. Primery używane do izolowania fragmentu 1763 bp AFE zawiera Not I miejsca restrykcyjne na primerze 5’ i XBAI położenie na primerze 3’. Sekwencja primeru 5’ była 5’ -CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3’. Sekwencja primeru 3’ była: 5’-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3’. Dla reakcji amplifikacji PCR, DNA było denaturowane w 97° przez 7 minut, poprzedzone 5 cyklami wzmacniania w 97°, 1 minuta, 53°, 1 minuta, 12°, 2 minuty, i wreszcie 72°, 10 minut dla rozwinięcia. Amplifikowany AFE był trawiony z Not I i Xba I i wbudowany do miejsc wektora plazmidu Not I, Xba I (pA/ITRŻB) zawierających adenowirus typ 5 sekwencje 1- 350 i 3330-5790 oddzielone przez polilinker zawierający miejsca Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I, i Bgl II. Amplifikacja AFP-E była trawiona z Nhe I i Kpn I i wbudowana w AFP-E zawierająca konstrukt opisany powyżej, który był trawiony z Xba I i Kpn I. Ten nowy konstrukt został następnie trawiony z Xba I i NgoMI by usunąć sekwencję adenowirusa 3330-5780, które były następnie zastępowane Xba I, NgoMI przez restrykcyjny fragment plazmidu pACN zawierający nukleotydy 4021-10457 adenowirusa typu 2 do skonstruowania plazmidu pAAN zawierającego oba wzmacniacz alfa-fetoproteinę i promotor. Ten konstrukt został następnie trawiony z Eco RI i Xba I by wyizolować fragment 2.3 kb zawierający Ad5 inwertowane powtórzenie terminalne, AFP-E i AFP-P, które następnie były ligowane z fragmentem 8.55 kb Eco RI, Xba I trawiony opisany powyżej pACNTK by wytworzyć pAANTK, gdzie gen TK jest kierowany przez wzmacniacz alfa-fetoproteiny i promotor w podstawie adenowirusa. Plazmid ten jest następnie wydłużany liniowo z Eco RI i kotransfektowany z dużym fragmentem Cla I przyswajającym ALBGL jak wyżej i rekombinanty, oznaczone AANTK, były izolowane i oczyszczane jak zostało opisane powyżej.
186 073
Wektor adenowirusa AANCAT: gen acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT) był izolowany z pCAT-wektora podstawowego (Promega Corporation) przez trawienie Xba I, Bam HI. Ten fragment 1.64 kb był ligowany do Xba I, Barn HI trawiącego pAAN (opisany powyżej) do stworzenia pAANCAT. Plazmid ten został następnie wydłużony liniowo z Eco RI i kotransfektowany z dużym fragmentem Cla I trawiącym rA/C/beta-gal by stworzyć AANCAT.
Ekspresja genu reporterowego: ekspresja (3-galaktozydazy:
Komórki nałożono w ilości 1x105 komórek na test w płytkach w 24 (pozycjach) testowych i spowodowano związanie przez noc (37°C, 7% CO2). Całonocna infekcja ACbGl była dokonana przy wielokrotnej infekcji (MOI) 30. Po 24 godzinach komórki były utrwalone 3.7% Formaldehydem; PBS; i wybarwione z 1 mg/ml reagentem Xgal (USB). Dane były oceniane (+, ++, +++) przez procentowe oszacowanie pozytywnego wybawienia komórek w każdym MOI. [+ - 1- 33%, ++ = 33 - 67%, +++ = 67%].
Ekspresja genu reporterowego: ekspresja cat:
Dwa (2) x 104 komórek (Hep G2, Hep 3B, HLF, Chang i MDA-MB468) było posianych na potrójnych 10 cm płytkach inkubowanych całą noc (37°C, 7% CO2). Każda płytka była zakażana AANCAT w MOI = 30 lub 100 lub nie zakażana i inkubowana przez 3 dni. Komórki były trypsynizowane i przemywane z PBS rozpuszczane w 100 μ1 0,25 M Tris pH 7,8. Próby były zamrożone i rozmrażane 3 krotnic i supematant był przeniesiony do nowych probówek i inkubowany 10 minut w 60°C. Próby były wirowane przez 5 minut w 4°C i oznaczano w supematantach stężenia białka używając testu Bradforda (Bio-Rad Protein Assay Kit). Próby były doprowadzone do jednakowej koncentracji białka do końcowej objętości 75 fil używając 0,25 M Tris, 25 (il 4 mM acetylo CoA i 1 fil 14C-Chloramfenikol i inkubowane przez noc w 37°C. Do każdej próbki dodano 500 f.1 octanu etylu i mieszano vortexem a następnie poprzez 5 minut wirowano w temperaturze pokojowej. Górna faza jest przeniesiona do nowej probówki i octan etylu jest odparowywany przez żwirowanie pod próżnią. Produkty reakcji są powtórnie rozpuszczone w 25 (j.1 octanu etylu i punktowo nakładane na płytkę chromatografii cienkowarstwowej (TLC), płytka następnie jest umiejscowiona w wewnątrz pola zrównoważonej komory TLC (95% chloroformu, 5% metanolu). Rozpuszczalnik migruje do szczytu płytki, płytka jest wysuszona i naświetlano film promieniowaniem X.
Proliferacja komórkowa: wbudowywanie -H-tymldyny.
5x103 komórek naniesiono na płytkę immunologiczną 96 pozycjach testowych i inkubowano całą noc (37°C, 7% CO?). Seryjnie rozcieńczone ACN, aCnTK lub AATK wirus w DMEM; 15% FBS; 1% glutamina była użyta do transfekcji komórek w wielokrotnej 30-krotnej infekcji 30 trwającej całą noc, po której komórki były dawkowane potrójnie z ganciklovirem (Cytovene) w logarytmicznym odstępie 0.001 i 100 mM (micro molar). IjaCi 3H-tymidyny (Amersham) było dodawane do każdego testu 12-18 godzin przed zbieranie 72 godziny po infekcji komórki były zbierane na filtrach z bibuły szklanej i znakowana 3H tymidyna była liczona używając płynnego scyntylatora (TopCount, Packard). Rezultaty są naniesione jako procentowa niekontrolowana kontrola proliferacji i zestawione jako skuteczna dawka (ED50±SD) dla 50 procent obniżenia w proliferacji powyżej średnich kontroli. Wartość ED50 była oceniana przez odpowiednie logistyczne równanie do dawki dającej odpowiedź.
Cytotoksyczność: uwalnianie LDH
Komórki (HLF, ludzkie HCC) były pokrywane, infekowane ACN lub ACNTK i traktowane gancyklowirem jak opisano dla testu proliferacji. 72 godziny po podaniu gancyklowiru, komórki były wirowane, supematant był usunięty. Poziomy dehydrogenazy laktonowej mierzono kolorymetrycznie (Promega, Cytotox 96™). Średnia (+/-S.D) uwolnionego LDH jest wykreślona względem M.O.I.
Terapia in vivo
Komórki ludzkiego nowotworu wątroby (Hep 3B) były wstrzykiwane podskórnie 10 samicom (10) athymic nu/nu myszy (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Każde zwierze otrzymywało w przybliżeniu 1x107 komórek w lewy bok. Guzowi pozwolono rosnąć przez 27 dni
186 073 przed pogrupowaniem myszy wg. średniego rozmiaru guza. Myszy były traktowane wewnątrzguzowymi i wokół-guzowymi wstrzyknięciami ACNTK lub kontrolnym wirusem ACN (1x109 iu w 100 μ1) co drugi dzień łącznie trzy dawki. Rozpoczynając 24 godzinny cykl po inicjującej dawce adenovirusa myszom dawkowano dootrzewnowo gancyklowir (Cytovene 100 mg/kg) dziennie, razem przez 10 dni. Myszy były kontrolowane pod kątem rozmiaru guza i ciężaru ciała dwa razy w tygodniu. Pomiary guza były robione w trzech wymiarach używając noniusza cyrkla i objętości były kalkulowane przy użyciu równania 4/3itr3, gdzie r jest 1/2 średniego rozmiaru guza.
Wyniki
Rekombinowane adenowirusy były użyte do infekcji trzech linii komórek HCC (HLF, Hep3B i Hep-G2). Jedna linia ludzkich komórek wątroby (Chang) i dwie linie komórek nowotworu piersi były użyte jako kontrole (MDAMB468 i BT549). Do pokazania specyficzności AFP promotor, był konstruowany wirus AANCAT. Ten wirus był użyty do infekcji komórek, że obie ekspresj onowały (Hep 3B, HepG2) lub nie ekspresj onowały (HLE, Chang, MDAMB468) HCC markera guza alfa-fetoproteiny (AFP). Jak pokazano na figurze 13, AANCAT kieruje ekspresją genu markera CAT tylko w tych komórkach HCC, które są zdolne do ekspresji AFP (fig. 13).
Skuteczność ACNTK i AANTK dla leczenia HCC była mierzona przez test wbudowania 3H-tymidyny do pomiaru efektu połączenia ekspresji HSV-TK, i traktowania podawanym gancyklowirem podczs proliferacji komórkowej. Linie komórek były infekowane obydwoma ACNTK lub AANTK lub dla kontroli wirusa ACN (Wills et al,. 1994 supra), która nie kieruje ekspresją HSV-TK, i leczona była wzrastającymi stężeniami gancyklowira. Efekt tego leczenia był mierzony jako funkcja wzrostu stężenia gancyklowira, do takiego stężenia gancyklowira które powodowało inhibicję 50% inkorporacji 3H-tymidyny (ED50). Dodatkowo, względny pomiar adenowirusa regulującego transfer genu i ekspresje każdej linii komórek był określony przez użycie kontrolnego wirusa, który określa ekspresję markeru genu p-galaktozydazy. Dane prezentowane na figurze 14 i tabeli I poniżej pokazują, że podawana kombinacja wirus ACNTK/gancyklowir była zdolna do zahamowania proliferacji komórkowej we wszystkich badanych liniach komórek w porównaniu z linią kontrolną adenowirusa ACN w kombinacji z gancykiowirem. W przeciwieństwie, wirusowy wektor AANTK był skuteczny tylko w tych liniach komórek HCC, w których wykazano ekspresję a-fetoproteiny. W dodatku kombinacja AANTK/GCV była bardziej efektywna, kiedy komórki były nakładane w dużej gęstości.
Tabela 1
Komórki linii | aFP | Ekspresja β-gal | ACN | EDjo ACNTK | AANTK |
MDAMB468 | - | +++ | > 100 | 2 | > 100 |
BT549 | - | +++ | > 100 | <0.3 | > 100 |
HLF | - | +++ | > 100 | 0.8 | > 100 |
CHANG | - | +++ | > 100 | 22 | >100 |
HEP-3B | - | + | 80 | 8 | 8 |
HEP-2G niski | + | ++ | 90 | 2 | 35 |
HEP-G2 wysoki | + | ++ | 89 | 0.5 | 4 |
„Nagie” (nude) myszy zakażone nowotworem Hep3B (N=5/grupa) były leczone doguzowo i wokół-guzowo w równoważnych dawkach ACNTK lub ACN kontroli. Dwadzieścia cztery godziny po pierwszym dawkowaniu rekombinanta adenowirusa, rozpoczynano dzienne podawanie gancyklowira u wszystkich myszy. Pomiary guza u każdego zwierzęcia były mierzone dwa razy w tygodniu cyrklami, średnie rozmiary guza przedstawiono na fig. 16. Średni rozmiar guza w 58 dniu był mniejszy w leczeniu zwierząt ACNTK ale różnice nie były
186 073 wysoko znaczące (p < 0.09, nieparzysty t-test). Te dane utrzymują specyficzny efekt ACNTK na wzrost guza in vivo. Nie wykryto znaczących różnic statystycznych w średniej masie ciała pomiędzy grupami.
BIBLIOGRAFIA
AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.
AMERICAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.
AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27(4):462-467.
AUSTIN, E.A. and HUBER, B.E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.
BACCHETTI, S. AND GRAHAM, F. (1993) International Journal of Oncology 3:781-788. BAKER S.J., MARKOWITZ, S FEARON E.R., WILLSON, J.K.V.,
AND VOGELSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.
BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B„ STASKOVA, Z, LUKAS, J., REJTHAR,
A., KOVARIK, J., MIDGLEY, C.A., GANNON, J.V., AND LANE, D.P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.
BERKNER, K.L. and SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:84115 857.
BOSHART, M. et al. (1985) Celi 41:521-530.
BRESSAC, B., GALVIN, K.M., LIANG, T.J., ISSELBACHER, K.J., WANDS, J.R.,
AND OZTURK, M. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.
CARUSO M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:70247028.
CHALLBERG, M.D., KELLY, TJ. (1979) Biochemistry 76:655-659.
CHEN P.L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., AND LEE W.H. (1990) 25 Science 250:1576-1580. CHEN, Y., CHEN, P.L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D„ AND LEE,
W.H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.
CHENG, JL, YEE, J.K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T„ AND HAAAS, M. (1992)
Cancer Research 52:222-226.
COLBY, W.W. AND SHENK, T. J. (1981) Yirology 39:977-980. CULVER ET AL.
(1991) P.N.A.S. (U.S.A.) 88:3155-3159. CULVER, K.W. et al. (1992) Science 256:1550-1552. DEMETRI et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7(10): 1545-1553. DILLER, L., et al. (1990) Mol.
Cell Biology 10:5772-5781.
EL-DEIRY, W.S., et al. (1993) Cell 75:817-825.
EZZIDINE, Z.D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.
FEINSTEIN, E„ GALE, R.P., REED, J., AND CANAANI, E. (1992) Oncogene 7:1853-1857. GHOSH-CHOUDHURY, G., RAJ-AHMAD, Y„ AND GRAHAM, F.L. (1987) EMBO Journal 6:1733-1739.
GOODING, L.R., AND WOLD, W.S.M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.
GRAHAM F.L., AND VAN DER ERB AJ. (1973) Virology 52:456-467.
GRAHAM, F.L. AND PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 363-390.
GRAHAM, F.L., SMILEY, J., RUSSELL, W.C. AND NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74. GRAHAM F.L. AND PREVEC L. (1991) Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Vol 5 .7: Gene Transfer and Expression Protocols. Murray E. J. (ed.) The Humana Press Inc., Clifton N.j., Vol 7:109-128.
HEUVEL, S.J.L , LAAR, T„ KAST, W.M, MELIEF, C.J.M., ZANTEMA, A., AND VAN DEREB, AJ. (1990) EMBO Journal 9:2621-2629.
HOCK, H., DORSCH, M, KUZENDORF, U„ QIN, Z, DIAMANTSTEIN, T„ AND BLANKENSTEIN, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2774-2778.
HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGELSTEIN, B., AND IS,C. (1991) Science 253:49-53.
186 073
HOROWITZ, M.S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology B.N. Fields, ed. (Raven Press, New York) pp. 1679-1721.
HORVATH, J., AND WEBER, J.M. (1988) J. Virol. 62:341-345.
HUANG et al. (1991) Nature 350:160-162.
HUBER, B.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043.
HUNTER, T. (1993) Cell 75:839-841.
JONES, N. AND SHENK, T. (1979) Cell 17:683-689.
KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.
KEURBITZ, S.J., PLUNKETT, B.S., WALSH, W.V., AND KASTAN, M.B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 7491-7495.
KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. W.H. Freeman and Company, New York (1990).
LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12(2): 103-111. LANE, D.P. (1992) Nature 358:15-16.
LANTZ et al. (1990) Cytokine 2(6):402-406.
LARRICK, J.W. and BURCK, K.L. Gen Therapy Application of Molecular Biology.
Elsevier Science Publishing Co., Inc. 10 New York, New York (1991).
LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.
LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.
LEMARC P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6482-6486.
LEVINE, A.J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. (1993) 62:623-651. LOWE S.W., SCHMITT, E.M., SMITH, S.W., OSBORNE, B.A., AND JACKS, J. (1993) Nature 362:847-852.
LOWE, S.W., RULEY, H.E., JACKS, T„ AND HOUSMAN, D.E.
(1993) Cell 74:957-967.
MARTIN (1975) In: Remington’s Pharm. Sei.. 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).
MERCER, W.E., et: al. (1990) Ptoc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6166-6170.
NAKABAYASHI, H. et: al. (1989) The Journal of Biological Chemistry 264:266-271. PALMER, T.D., ROSMAN, G.J., OSBORNE, W.R., AND MELLER, A.D. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 88:1330-1334.
RAO, L., DEBBAS, M., SABBATINI, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S., AND WHITE, E. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7742-7746.
RAVOET C. et al. (1993) Journal of Surgical oncology Supplement 3:104-111.
RICH, D.P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.
ROSENFELD, M. A, et al. (1992) Cell 68:143-155.
SAMBROOK J., FRITSCH E.F., AND MANIATIS T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
SARNOW, P., HO, Y.S., WILLIAMS, J., AND LEVINE, A.J. (1982) Cell 28:387-394. SHAW, P., BOVEY, R., TARDY, S , SAHLI, R., SORDAT, B„ AND COSTA, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4495-4499.
SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.
SORSCHER, EJ. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.
SPECTOR, D.J. (1983) Virology 130:533-538.
STEWART, P.L. et al. (1993) EMBO Journal 12:2589-2599.
STRAUS. S.E. (1984) Adenovirus infections in humans. In: The Adenoviruses - Ginsberg HS, ed. New York: Plenum Press, 451-496.
SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5(8) :472-476.
TAKARASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.
TAKAHASHI, T., et al.’(1992) Cancer Research 52:2340-2343.
THIMMAPPAYA, B. et al. (1982) Cell 31:543-551.
WANG, A.M., DOYLE, M.V., AND MARK, D.F. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:9717-9721,
186 073
WATANABLE, K. et: al. (1987) The Journal of Biolog^al Chemistry 262:4812-4818. WHITE, E., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580.
WILLS, K.N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088.
YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Nature 352:345-347.
186 073
NgoMI
a
LD
ΣΕ
Q
O
O ki o
E σ
o σ
CD
186 073
e\J Μ O 'T OJ ω ττ o
CO in
3:
o o
oo m
o o
ou-i
O o
oo o
o
Cr m
O
O oo o
o.
o m
ΡΊ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
/
7= /
/ /
/ /
/ /
CO
LII
Wycięte Ad5 pary zasad 357 do 4020 . D
Wstawka MPL/p53 cDNA riU. Id
186 073
Met 1 | Pro | Pro | Lys | Thr 5 | Pro | Arg | Lys | Thr | Ala 10 | Ala | Thr | Ala | Ala | Ala 15 | Ala |
Ala | Ala | Glu | Pro 20 | Pro | Ala | Pro | Pro | Pro 25 | Pro | Pro | Pro | Pro | Glu 30 | Glu | Asp |
Pro | Glu | Gln 35 | Asp | Ser | Gly | Pro | Glu 40 | Asp | Leu | Pro | Leu | val 45 | Arg | Leu | Glu |
Phe | Glu 50 | Glu | Thr | Glu | Glu | Pro 55 | Asp | Phe | Thr | Ala | Leu 60 | cys | Gln | Lys | Leu |
Lyg 65 | Ile | Pro | Asp | His | Val 70 | Arg | Glu | Arg | Ala | Trp 75 | Leu | Thr | Trp | GlU | Lye 80 |
Val | Ser | ser | Val | Asp 85 | Gly | Val | Leu | Gly | Gly 90 | Tyr | Ile | Gln | Lys | Lys 95 | Lye |
Glu | Leu | Trp | Gly 100 | Ile | Cys | Ile | Phe | Ile 105 | Ala | Ala | Val | Asp | Leu 110 | A3p | Glu |
Met | Ser | Phe 115 | Thr | Phe | Thr | Glu | Leu 120 | Gln | Lys | Asn | Ile | Glu 125 | Ile | Ser | Val |
His | Lys 130 | Phe | Phe | Asn | Leu | Leu 135 | Lys | Glu | Ile | Asp | Thr 140 | ser | Thr | Lys | Val |
Aap 145 | Asn | Ala | Met | ser | Arg 150 | Leu | Leu | Lys | Lys | Tyr 155 | Asp | Val | Leu | Phe | Ala 160 |
Leu | Phe | ser | Lys | Leu 165 | Glu | Arg | Thr | cys | Glu 170 | Leu | Ile | Tyr | Leu | Thr 175 | Gln |
Pro | Ser | Ser | Ser 180 | Ile | Ser | Thr | Glu | Ile 185 | Asn | ser | Ala | Leu | Val 190 | Leu | Ly3 |
Val | Ser | Trp 195 | Ile | Thr | Phe | Leu | Leu 200 | Ala | Lys | Gly | Glu | val 205 | Leu | Gln | Met |
Glu | Asp 210 | Asp | Leu | Val | Ile | ser 215 | Phe | Gln | Leu | Met | Leu 220 | cys | val | Leu | Asp |
Tyr 225 | Phe | ile | Lys | Leu | Ser 230 | Pro | Pro | Met | Leu | Leu 235 | Lys | Glu | Pro | Tyr | Lys 240 |
Thr | Ala | Val | Ile | Pro 245 | Ile | Asn | Gly | Ser | Pro 250 | Arg | Thr | Pro | Arg | Arg 255 | Gly |
FIG. 2A
186 073
Gln | Asn Arg ser 260 | Ala | Arg | Ile Ala | Ly3 Gln Leu Glu Asn Asp Thr Arg | ||||||||||
265 | 270 | ||||||||||||||
Ile | Ile | Glu | val | Leu | cys | Lys | Glu | His | Glu | cys | Asn | ile | Asp | Glu | Val |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Lys | Asn | Val | Tyr | Phe | Lys | Asn | Phe | Ile | Pro | Phe | Met | Asn | ser | Leu | Gly |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | val | Thr | Ser | Asn | Gly | Leu | Pro | Glu | Val | Glu | Asn | Leu | ser | Lys | Arg |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Tyr | Glu | Glu | Ile | Tyr | Leu | Lys | Asn | Lys | Asp | Leu | Asp | Ala | Arg | Leu | Phe |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Leu | Asp | His | Asp | Lys | Thr | Leu | Gln | Thr | Asp | Ser | Ile | Asp | ser | Phe | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Thr | Gln | Arg | Thr | Pro | Arg | Lys | Ser | Asn | Leu | Asp | Glu | Glu | Val | Asn | Val |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ile | Pro | pro | His | Thr | Pro | val | Arg | Thr | Val | Met | Asn | Thr | ile | Gln | Gln |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Met | Met | Ile | Leu | Asn | Ser | Ala | ser | Asp | Gln | pro | ser | GlU | Asn | Leu |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ile | ser | Tyr | Phe | Asn | Asn | cys | Thr | val | Asn | Pro | Lys | Glu | Ser | Ile | Leu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Lys | Arg | val | Lye | Asp | ile | Gly | Tyr | ile | Phe | Lys | Glu | Lys | Phe | Ala | Lys |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ala | Val | Gly | Gln | Gly | cys | Val | GlU | Ile | Gly | Ser | Gln | Arg | Tyr | Lys | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gly | Val | Arg | Leu | Tyr | Tyr | Arg | Val | Met | Glu | ser | Met | Leu | Lys | ser | Glu |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Glu | GlU | Arg | Leu | ser | Ile | Gln | Asn | Phe | Ser | Lys | Leu | Leu | Asn | Asp | Asn |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ile | Phe | His | Met | ser | Leu | Leu | Ala | cys | Ala | Leu | Glu | Val | Val | Met | Ala |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Thr | Tyr | ser | Arg | ser | Thr | Ser | Gln | Asn | Leu | Asp | ser | Gly | Thr | Asp | Leu |
500 | 505 | 510 |
FIG. 2B
186 073
ser | Phe Pro 515 | Trp | Ile Leu Asn Val Leu Asn 520 | Leu Lys | Ala Phe 525 | Asp Phe | |||||||||
Tyr | Ly3 | val | Ile | Glu | ser | Phe | Ile | Lys | Ala | Glu | Gly | Asn | Leu | Thr | Arg |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Glu | Met | Ile | Lys | His | Leu | Glu | Arg | cys | Glu | His | Arg | Ile | Met | Glu | ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Leu | Ala | Trp | Leu | Ser | Asp | Ser | Pro | Leu | Phe | Asp | Leu | Ile | Lys | Gln | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Lys | Asp | Arg | Glu | Gly | Pro | Thr | Asp | His | Leu | Glu | ser | Ala | cys | Pro | Leu |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asn | Leu | Pro | Leu | Gln | Asn | Asn | His | Thr | Ala | Ala | ASO | Met | Tyr | Leu | Ser |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Pro | Val | Arg | Ser | Pro | Lys | Lys | Lys | Gly | Ser | Thr | Thr | Arg | val | Asn | ser |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Thr | Ala | Asn | Ala | Glu | Thr | Gln | Ala | Thr | ser | Ala | Phe | Gln | Thr | Gln | Lys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Pro | Leu | Lys | ser | Thr | Ser | Leu | Ser | Leu | Phe | Tyr | Lys | Lys | val | Tyr | Arg |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Ala | Tyr | Leu | Arg | Leu | Asn | Thr | Leu | cys | Glu | Arg | Leu | Leu | Ser | Glu |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
His | Pro | Glu | Leu | Glu | His | ile | Ile | Trp | Thr | Leu | Phe | Gln | His | Thr | Leu |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Gln | Asn | Glu | Tyr | Glu | Leu | Met | Arg | Asp | Arg | His | Leu | Asp | Gln | Ile | Met |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Met | Cys | Ser | Met | Tyr | Gly | Ile | cys | Lys | val | Lys | Asn | Ile | Asp | Leu | Lys |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Phe | Lys | Ile | Ile | val | Thr | Ala | Tyr | Lys | Asp | Leu | Pro | His | Ala | val | Gln |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
GlU | Thr | Phe | Ly3 | Arg | Val | Leu | Ile | Lys | Glu | Glu | Glu | Tyr | Asp | ser | Ile |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Ile | i Val | Phe | Tyr | Asn | ser | Val | Phe | Met | Gln | Arg | Leu | Lys | Thr | Asn | Ile |
755 | 760 | 765 |
FIG. 2C
186 073
Leu | Gln 770 | Tyr | Ala | ser | Thr | Arg 775 | Pro | Pro | Thr | Leu | Ser 780 | Pro | Ile | Pro | His |
Ile 785 | Pro | Arg | ser | Pro | Tyr 790 | Lys | Phe | Pro | ser | ser 795 | Pro | Leu | Arg | Ile | Pro 800 |
Gly | Gly | Asn | Ile | Tyr 805 | Ile | Ser | Pro | Leu | Lys 810 | ser | Pro | Tyr | Lys | Ile 815 | Ser |
Glu | Gly | Leu | Pro 820 | Thr | Pro | Thr | Lys | Met 825 | Thr | Pro | Arg | ser | Arg 830 | Ile | Leu |
Val | ser | ile 835 | Gly | Glu | ser | Phe | Gly 840 | Thr | ser | Glu | Lys | Phe 845 | Gln | Lys | Ile |
Asn | Gln 850 | Met | Val | Cys | Asn | ser 855 | Asp | Arg | Val | Leu | Lys 860 | Arg | ser | Ala | Glu |
Gly 865 | ser | Asn | Pro | Pro | Lys 870 | Pro | Leu | Lys | Lys | Leu 875 | Arg | Phe | Asp | Ile | GlU 880 |
Gly | ser | Asp | Glu | Ala 885 | Asp | Gly | ser | Lys | His 890 | Leu | Pro | Gly | GlU | Ser 895 | Lys |
Phe | Gln | Gln | Lys 900 | Leu | Ala | Glu | Met | Thr 905 | ser | Thr | Arg | Thr | Arg 910 | Met | Gln |
Lys | Gln | Lys | Met | Asn | Asp | Ser | Met | Asp | Thr | ser | Asn | Lys | Glu | Glu | Lys |
915 920 925
FIG. 2D
186 073
TTCCGGTTTT TCTCAGGGGA CGTTGAAATT ATTTTTGTAA CGGGAGTCGG GAGAGGACGG 60
GGCGTGCCCC GCGTGCGCGC GCGTCGTCCT CCCCGGCGCT CCTCCACAGC TCGCTGGCTC 120
CCGCCGCGGA AAGGCGTC ATG | CCG Pro | CCC AAA ACC | CCC Pro | CGA AAA | ACG GCC Thr Ala 10 | GCC Ala | 171 | ||||
Met 1 | Pro | Lys | Thr 5 | Arg | Lys | ||||||
ACC GCC | GCC GCT GCC GCC | GCG | GAA | CCC | CCG | GCA | CCG | CCG | CCG CCG | CCC | 219 |
Thr Ala | Ala Ala Ala Ala 15 | Ala | Glu | Pro 20 | Pro | Ala | Pro | Pro | Pro Pro 25 | Pro | |
CCT CCT | GAG GAG GAC CCA | GAG | CAG | GAC | AGC | GGC | CCG | GAG | GAC CTG | CCT | 267 |
Pro Pro | Glu Glu Asp Pro 30 | GlU | Gln 35 | Asp | Ser | Gly | Pro | Glu 40 | Asp Leu | Pro | |
CTC GTC | AGG CTT GAG TTT | GAA | GAA | ACA | GAA | GAA | CCT | GAT | TTT ACT | GCA | 315 |
Leu Val 45 | Arg Leu Glu Phe | Glu 50 | Glu | Thr | Glu | Glu | Pro 55 | Asp | Phe Thr | Ala | |
TTA TGT | CAG AAA TTA AAG | ATA | CCA | GAT | CAT | GTC | AGA | GAG | AGA GCT | TGG | 363 |
Leu Cys 60 | Gln Ly3 Leu Lys 65 | Ile | Pro | Asp | His | Val 70 | Arg | Glu | Arg Ala | Trp 75 | |
TTA ACT | TGG GAG AAA GTT | TCA | TCT | GTG | GAT | GGA | GTA | TTG | GGA GGT | TAT | 411 |
Leu Thr | Trp Glu Lys Val 80 | Ser | Ser | Val | Asp 85 | Gly | Val | Leu | Gly Gly 90 | Tyr | |
ATT CAA | AAG AAA AAG GAA | CTG | TGG | GGA | ATC | TGT | ATC | TTT | ATT GCA | GCA | 459 |
Ile Gln | Lys Lys Lys Glu 95 | Leu | Trp | Gly 100 | Ile | cys | Ile | Phe | Ile Ala 105 | Ala | |
GTT GAC | CTA GAT GAG ATG | TCG | TTC | ACT | TTT | ACT | GAG | CTA | CAG AAA | AAC | 507 |
Val Asp | Leu Asp Glu Met 110 | ser | Phe 115 | Thr | Phe | Thr | Glu | Leu 120 | Gln Lys | Asn | |
ATA GAA | ATC AGT GTC CAT | AAA | TTC | TTT | AAC | TTA | CTA | AAA | GAA ATT | GAT | 555 |
Ile Glu 125 | Ile ser val His | Lys 130 | Phe | Phe | Asn | Leu | Leu 135 | Lya | Glu Ile | Asp | |
ACC AGT | ACC AAA GTT GAT | AAT | GCT | ATG | TCA | AGA | CTG | TTG | AAG AAG | TAT | 603 |
Thr ser 140 | Thr Lys val Asp 145 | Asn | Ala | Met | Ser | Arg 150 | Leu | Leu | Lys Lys | Tyr 155 | |
GAT GTA | TTG TTT GCA CTC | TTC | AGC | AAA | TTG | GAA | AGG | ACA | TGT GAA | CTT | 651 |
Asp Val | Leu Phe Ala Leu 160 | Phe | ser | Lys | Leu 165 | Glu | Arg | Thr | Cys Glu 170 | Leu | |
ATA TAT | TTG ACA CAA CCC | AGC | AGT | TCG | ATA | TCT | ACT | GAA | ATA AAT | TCT | 699 |
Ile Tyr | Leu Thr Gln Pro 175 | Ser | Ser | Ser 180 | Ile | Ser | Thr | Glu | Ile Asn 185 | ser | |
GCA TTG | GTG CTA AAA GTT | TCT | TGG | ATC | ACA | TTT | TTA | TTA | GCT AAA | GGG | 747 |
Ala Leu | Val Leu Lys Val 190 | Ser | Trp 195 | Ile | Thr | Phe | Leu | Leu 200 | Ala Lys | Gly | |
GAA GTA | . TTA CAA ATG GAA | GAT | GAT | CTG | GTG | ATT | TCA | TTT | CAG TTA | ATG | 795 |
Glu Val | Leu Gln Met Glu | Asp | Asp | Leu | Val | Ile | ser | Phe | Gln Leu | Met |
205 210 215
FIG. 3A
186 073
CTA TGT GTC | Leu | GAC TAT | TTT ATT | AAA Lya | CTC TCA | CCT Pro | CCC ATG | TTG Leu | CTC Leu 235 | 843 | ||||||
Leu 220 | cya | Val | Aap | Tyr 225 | Phe | Ile | Leu | ser 230 | Pro | Met | ||||||
AAA | GAA | CCA | TAT | AAA | ACA | GCT | GTT | ATA | CCC | ATT | AAT | GGT | TCA | CCT | CGA | 891 |
Lya | Glu | Pro | Tyr | Ly3 240 | Thr | Ala | Val | Ile | Pro 245 | Ile | Asn | Gly | ser | Pro 250 | Arg | |
ACA | CCC | AGG | CGA | GGT | CAG | AAC | AGG | AGT | GCA | CGG | ATA | GCA | AAA | CAA | CTA | 939 |
Thr | Pro | Arg | Ara 255 | Gly | Gln | Aan | Arg | ser 260 | Ala | Arg | Ile | Ala | Lys 265 | Gln | Leu | |
GAA | AAT | GAT | ACA | AGA | ATT | ATT | GAA | GTT | CTC | TGT | AAA | GAA | CAT | GAA | TGT | 987 |
Glu | Aan | Asp 270 | Thr | Arg | Ile | Ile | GlU 275 | Val | Leu | Cys | Lys | Glu 280 | His | Glu | cys | |
AAT | ATA | GAT | GAG | GTG | AAA | AAT | GTT | TAT | TTC | AAA | AAT | TTT | ATA | CCT | TTT | 1035 |
Asn | Ile 285 | Aap | Glu | Val | Lya | Aan 290 | Val | Tyr | Phe | Lys | Aan 295 | Phe | Ile | Pro | Phe | |
ATG | AAT | TCT | CTT | GGA | CTT | GTA | ACA | TCT | AAT | GGA | CTT | CCA | GAG | GTT | GAA | 1083 |
Met 300 | Asn | Ser | Leu | Gly | Leu 305 | Val | Thr | ser | Asn | Gly 310 | Leu | Pro | Glu | Val | GlU 315 | |
AAT | CTT | TCT | AAA | CGA | TAC | GAA | GAA | ATT | TAT | CTT | AAA | AAT | AAA | GAT | CTA | 1131 |
Aan | Leu | ser | Lya | Arg 320 | Tyr | Glu | Glu | Ile | Tyr 325 | Leu | Lys | Asn | Lye | Asp 330 | Leu | |
GAT | GCA | AGA | TTA | TTT | TTG | GAT | CAT | GAT | AAA | ACT | CTT | CAG | ACT | GAT | TCT | 1179 |
Aap | Ala | Arg | Leu 335 | Phe | Leu | Asp | His | Aap 340 | Lys | Thr | Leu | Gln | Thr 345 | Asp | ser | |
ATA | GAC | AGT | TTT | GAA | ACA | CAG | AGA | ACA | CCA | CGA | AAA | AGT | AAC | CTT | GAT | 1227 |
Ile | Asp | Ser 350 | Phe | Glu | Thr | Gln | Arg 355 | Thr | Pro | Arg | Lys | Ser 360 | Asn | Leu | A3D | |
GAA | GAG | GTG | AAT | GTA | ATT | CCT | CCA | CAC | ACT | CCA | GTT | AGG | ACT | GTT | ATG | 1275 |
Glu | Glu 365 | Val | Α3Π | Val | Ile | pro 370 | Pro | His | Thr | Pro | Val 375 | Arg | Thr | Val | Met | |
AAC | ACT | ATC | CAA | CAA | TTA | ATG | ATG | ATT | TTA | AAT | TCA | GCA | AGT | GAT | CAA | 1323 |
Asn 380 | Thr | Ile | Gln | Gln | Leu 385 | Met | Met | Ile | Leu | Asn 390 | Ser | Ala | Ser | Asp | Gln 395 | |
CCT | TCA | GAA | AAT | CTG | ATT | TCC | TAT | TTT | AAC | AAC | TGC | ACA | GTG | AAT | CCA | 1371 |
Pro | Ser | GlU | Asn | Leu 400 | Ile | ser | Tyr | Phe | Asn 405 | Asn | Cys | Thr | Val | Asn 410 | Pro | |
AAA | GAA | AGT | ATA | CTG | AAA | AGA | GTG | AAG | GAT | ATA | GGA | TAC | ATC | TTT | AAA | 1419 |
Lya | GlU | Ser | Ile 415 | Leu | Lya | Arg | Val | Lya 420 | Asp | Ile | Gly | Tyr | Ile 425 | Phe | Lys | |
GAG | AAA | TTT | GCT | AAA | GCT | GTG | GGA | CAG | GGT | TGT | GTC | GAA | ATT | GGA | TCA | 1467 |
Glu | Lya | Phe 430 | Ala | Lya | Ala | val | Gly 435 | Gln | Gly | cys | Val | Glu 440 | Ile | Gly | ser | |
CAG | CGA | TAC | AAA | CTT | GGA | GTT | CGC | TTG | TAT | TAC | CGA | GTA | ATG | GAA | TCC | 1515 |
Gln | Arg 445 | Tyr | Lys | Leu | Gly | val 450 | Arg | Leu | Tyr | Tyr | Arg 455 | Val | Met | Glu | ser |
FIG. 3B
186 073
ATG | CTT AAA | TCA | GAA | GAA | GAA | CGA | TTA | TCC | ATT | CAA | AAT | TTT | AGC | AAA | 1563 |
Mat 460 | Leu Lya | Ser | Glu | GlU 465 | Glu | Arg | Leu | Ser | Ile 470 | Gln | Asn | Phe | Ser | Lys 475 | |
CTT | CTG AAT | GAC | AAC | ATT | TTT | CAT | ATG | TCT | TTA | TTG | GCG | TGC | GCT | CTT | 1611 |
Leu | Leu Asn | ASO | Asn 480 | Ile | Phe | His | Met | ser 485 | Leu | Leu | Ala | cya | Ala 490 | Leu | |
GAG | GTT GTA | ATG | GCC | ACA | TAT | AGC | AGA | AGT | ACA | TCT | CAG | AAT | CTT | GAT | 1659 |
Glu | val Val | Met 495 | Ala | Thr | Tyr | ser | Arg 500 | Ser | Thr | ser | Gln | Aan 505 | Leu | Asp | |
TCT | GGA ACA | GAT | TTG | TCT | TTC | CCA | TGG | ATT | CTG | AAT | GTG | CTT | AAT | TTA | 1707 |
Ser | Gly Thr 510 | Asp | Leu | Ser | Phe | Pro 515 | Trp | Ile | Leu | Aan | val 520 | Leu | Aan | Leu | |
AAA | GCC TTT | GAT | TTT | TAC | AAA | GTG | ATC | GAA | AGT | TTT | ATC | AAA | GCA | GAA | 1755 |
Lys | Ala Phe 525 | ASD | Phe | Tyr | Lya 530 | Val | Ile | Glu | ser | Phe 535 | Ile | Lya | Ala | Glu | |
GGC | AAC TTG | ACA | AGA | GAA | ATG | ATA | AAA | CAT | TTA | GAA | CGA | TGT | GAA | CAT | 1803 |
Gly 540 | Aan Leu | Thr | Arg | Glu 545 | Met | Ile | Lya | Hia | Leu 550 | Glu | Arg | cya | GlU | His 555 | |
CGA | ATC ATG | GAA | TCC | CTT | GCA | TGG | CTC | TCA | GAT | TCA | CCT | TTA | TTT | GAT | 1851 |
Arg | Ile Met | GlU | Ser 560 | Leu | Ala | Trp | Leu | ser 565 | Asp | Ser | Pro | Leu | Phe 570 | ASp | |
CTT | ATT AAA | CAA | TCA | AAG | GAC | CGA | GAA | GGA | CCA | ACT | GAT | CAC | CTT | GAA | 1899 |
Leu | Ile Lya | Gln 575 | Ser | Lya | Aap | Arg | Glu 5B0 | Gly | Pro | Thr | Aap | Hia 585 | Leu | Glu | |
TCT | GCT TGT | CCT | CTT | AAT | CTT | CCT | CTC | CAG | AAT | AAT | CAC | ACT | GCA | GCA | 1947 |
Ser | Ala cya 590 | pro | Leu | Aan | Leu | Pro 595 | Leu | Gln | Aan | Aan | Hia 600 | Thr | Ala | Ala | |
GAT | ATG TAT | CTT | TCT | CCT | GTA | AGA | TCT | CCA | AAG | AAA | AAA | GGT | TCA | ACT | 1995 |
Asp | Met Tyr 605 | Leu | ser | pro | Val 610 | Arg | ser | Pro | Lye | Lys 615 | Lya | Gly | ser | Thr | |
ACG | CGT GTA | AAT | TCT | ACT | GCA | AAT | GCA | GAG | ACA | CAA | GCA | ACC | TCA | GCC | 2043 |
Thr 620 | Arg val | Asn | ser | Thr 625 | Ala | Aan | Ala | GlU | Thr 630 | Gln | Ala | Thr | ser | Ala 635 | |
TTC | CAG ACC | CAG | AAG | CCA | TTG | AAA | TCT | ACC | TCT | CTT | TCA | CTG | TTT | TAT | 2091 |
Phe | Gln Thr | Gln | Lys 640 | Pro | Leu | Lya | ser | Thr 645 | ser | Leu | Ser | Leu | Phe 650 | Tyr | |
AAA | AAA GTG | TAT | CGG | CTA | GCC | TAT | CTC | CGG | CTA | AAT | ACA | CTT | TGT | GAA | 2139 |
Lya | Lya Val | Tyr 655 | Arg | Leu | Ala | Tyr | Leu 660 | Arg | Leu | Aan | Thr | Leu 665 | cya | Glu | |
CGC | CTT CTG | TCT | GAG | CAC | CCA | GAA | TTA | GAA | CAT | ATC | ATC | TGG | ACC | CTT | 2187 |
Arg | Leu Leu 670 | ser | Glu | Hia | Pro | Glu 675 | Leu | Glu | His | Ile | Ile 680 | Trp | Thr | Leu | |
TTC | : CAG CAC | ACC | CTG | CAG | AAT | GAG | TAT | GAA | CTC | ATG | AGA | GAC | AGG | CAT | 2235 |
Phe | i Gln Hia 605 | Thr | Leu | Gln | Aan 690 | Glu | Tyr | Glu | Leu | Met 695 | Arg | Aap | Arg | His |
FIG. 3C
186 073
TTG GAC Leu Asp 700 | CAA Gln | ATT ATG ATG | TGT cys | TCC ATG | TAT Tyr | GGC Gly 710 | ATA Ile | TGC AAA GTG AAG | 2283 | |||||||
Ile | Met | Met 705 | Ser | Met | Cys | Lys | Val | Lys 715 | ||||||||
AAT | ATA | GAC | CTT | AAA | TTC | AAA | ATC | ATT | GTA | ACA | GCA | TAC | AAG | GAT | CTT | 2331 |
Asn | Ile | Asp | Leu | Lys | Phe | Lys | Ile | Ile | Val | Thr | Ala | Tyr | Lys | Asp | Leu | |
720 | 725 | 730 | ||||||||||||||
CCT | CAT | GCT | GTT | CAG | GAG | ACA | TTC | AAA | CGT | GTT | TTG | ATC | AAA | GAA | GAG | 2379 |
Pro | His | Ala | Val | Gln | Glu | Thr | Phe | Lys | Arg | val | Leu | Ile | Lys | Glu | Glu | |
735 | 740 | 745 | ||||||||||||||
GAG | TAT | GAT | TCT | ATT | ATA | GTA | TTC | TAT | AAC | TCG | GTC | TTC | ATG | CAG | AGA | 2427 |
Glu | Tyr | Asp | Ser | Ile | Ile | Val | Phe | Tyr | Asn | ser | Val | Phe | Met | Gln | Arg | |
750 | 755 | 760 | ||||||||||||||
CTG | AAA | ACA | AAT | ATT | TTG | CAG | TAT | GCT | TCC | ACC | AGG | CCC | CCT | ACC | TTG | 2475 |
Leu | Lys | Thr | Asn | Ile | Leu | Gln | Tyr | Ala | Ser | Thr | Arg | Pro | Pro | Thr | Leu | |
765 | 770 | 775 | ||||||||||||||
TCA | CCA | ATA | CCT | CAC | ATT | CCT | CGA | AGC | CCT | TAC | AAG | TTT | CCT | AGT | TCA | 2523 |
Ser | pro | Ile | Pro | Hi3 | Ile | Pro | Arg | ser | Pro | Tyr | Lys | Phe | Pro | Ser | ser | |
780 | 785 | 790 | 795 | |||||||||||||
CCC | TTA | CGG | ATT | CCT | GGA | GGG | AAC | ATC | TAT | ATT | TCA | CCC | CTG | AAG | AGT | 2571 |
Pro | Leu | Arg | Ile | Pro | Gly | Gly | Asn | Ile | Tyr | Ile | Ser | pro | Leu | Lys | Ser | |
800 | 805 | 810 | ||||||||||||||
CCA | TAT | AAA | ATT | TCA | GAA | GGT | CTG | CCA | ACA | CCA | ACA | AAA | ATG | ACT | CCA | 2619 |
Pro | Tyr | Lys | Ile | ser | Glu | Gly | Leu | Pro | Thr | Pro | Thr | Lys | Met | Thr | Pro | |
815 | 820 | 825 | ||||||||||||||
AGA | TCA | AGA | ATC | TTA | GTA | TCA | ATT | GGT | GAA | TCA | TTC | GGG | ACT | TCT | GAG | 2667 |
Arg | ser | Arg | Ile | Leu | Val | Ser | Ile | Gly | Glu | ser | Phe | Gly | Thr | Ser | Glu | |
830 | 835 | 840 | ||||||||||||||
AAG | TTC | CAG | AAA | ATA | AAT | CAG | ATG | GTA | TGT | AAC | AGC | GAC | CGT | GTG | CTC | 2715 |
Lya | phe | Gln | Lys | Ile | Asn | Gln | Met | val | cys | Asn | ser | Asp | Arg | Val | Leu | |
845 | 850 | 855 | ||||||||||||||
AAA | AGA | AGT | GCT | GAA | GGA | AGC | AAC | CCT | CCT | AAA | CCA | CTG | AAA | AAA | CTA | 2763 |
Lys | Arg | Ser | Ala | GlU | Gly | Ser | Asn | Pro | Pro | Lys | Pro | Leu | Lys | Lys | Leu | |
860 | 865 | 870 | 875 | |||||||||||||
CGC | TTT | GAT | ATT | GAA | GGA | TCA | GAT | GAA | GCA | GAT | GGA | AGT | AAA | CAT | CTC | 2811 |
Arg | Phe | Asp | Ile | Glu | Gly | Ser | Asp | Glu | Ala | Asp | Gly | ser | Lya | His | Leu | |
880 | 885 | 890 | ||||||||||||||
CCA | GGA | GAG | TCC | AAA | TTT | CAG | CAG | AAA | CTG | GCA | GAA | ATG | ACT | TCT | ACT | 2859 |
Pro | Gly | Glu | ser | Lys | Phe | Gln | Gln | Lys | Leu | Ala | Glu | Met | Thr | Ser | Thr | |
895 | 900 | 905 | ||||||||||||||
CGA | ACA | CGA | ATG | CAA | AAG | CAG | AAA | ATG | AAT | GAT | AGC | ATG | GAT | ACC | TCA | 2907 |
Arg | Thr | Arg | Met | Gln | Lys | Gln | Lys | Met | Asn | Asp | Ser | Met | Asp | Thr | ser | |
910 | 915 | 920 |
AAC AAG GAA GAG AAA TGAGGATCTC AGGACCTTGG TGGACACTGT GTACACCTCT 2962 Asn Ly9 Glu Glu Lys
925
GGATTCATTG TCTCTCACAG ATGTGACTGA TAT 2995
FIG. 3D
186 073
Główna opóźniona transkryocja
Ad 5
CMV
MLP
FIG. 4
186 073 rAd/MLP/p53 rAd/CMV/p53 g p- I j i
FIG. 5A rAd/MLP/p53 rAd/CMV/p53
FIG. 5B
186 073
FIG. 6A
FIG. 6B
FIG. 6C
186 073 % średniej kontroli % średniej kontroli % średniej kontroli
FIG. 7B
FIG. 7A
186 073
FIG. 7E
186 073
186 073
FIG. 8
186 073
Dzień 2
Dzień 7
2 3B 4 5 6 7 8 9 I 10
P53 Primery Aktyna
FIG. 9
FIG. 1OA
Dni po zaszczepieniu
FIG. 10B
186 073
Xba
Bgl ll/Bam Hl Xba
I pSP72-TK lpSP72-TK IPvu ll/Eco RV
Bgl II
Ligacja
FIG. 11A
Xba
Trawienie
Bgl II
186 073
186 073
FIG. 11C
186 073
Główna późna transkrypcja
El
E3 Deleflon ^ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ^ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΓΣΥΖΖΖΖΖΖΖΖΔ Ad5
E2
E4
Ad5 1-4100 v rm
Ela
Elb ' ........► ------Wyłączenie E1a,E1 b and plX plX
ITR Promotor ^ZZZZZZ~~zzz
HSV-1 Tbymidlne Klnase
ACNTK
CMV
TPL
rm | Promotor | HSV-1 Thymfdlne Klnase |
ΓΖ77//Γ' | . u A A NTK | |
AFP | ||
ITR | Promotor | CAT |
ΪΖΖΖΖΖΣΖΣ. | AANCAT | |
AFP | ---;> |
FIG. 12
186 073
100 Un 30 100 Un 30 100 Un :MOI
186 073 % średniej kontroli średniej kontroli
CGCV)
FIG. 14A
FIG. 14B
186 073
Absorbancja przy 490 mm
FIG. 15
186 073
FIG. 16A
Wielkość guza (mni
O IO 20 30 40 50 60
Dni po zaszczepieniu
FIG. 16B
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (26)
- Zastrzeżenia patentowe1. Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej, zasadniczo zawierający co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nośnik oraz zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawkę egzogennego DNA z genem kodującym obce białko oraz adenowirus DNA z delecją wszystkich kodujących sekwencji Ela, Elb i białka IX, a także z najmniej częściową E3.
- 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że delecję sekwencji genowej białka Di stanowi przedział od około 3500 do około 4000 par zasad z 5’ wirusowego końca.
- 3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także nieistotną sekwencję DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4.
- 4. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także sekwencję DNA określonąjako adenowirus Ela i Elb.
- 5. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także wczesny region 3 i/lub 4 sekwencji DNA określonej jako adenowirus Ela i Elb.
- 6. Preparat według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że delecja obejmuje także nie więcej niż czterdzieści nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ względem Ela i Elb oraz białko IX i obcą cząsteczkę DNA, kodującą sygnał poliadenylacji.
- 7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji białka DC.
- 8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 12,5 lub 6.
- 9. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że wstawka egzogennego DNA ma do2,6 kilozasad (KB).
- 10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że wstawka egzogennego DNA ma do 4,5 kilozasad (KB).
- 11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem funkcjonalnym lub jego biologicznie aktywnym fragmentem.
- 12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem supresora nowotworu lub jego biologicznie aktywnym fragmentem.
- 13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że białkiem supresora nowotworu jest p53.
- 14. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że białkiem supresora nowotworu jest RB56.
- 15. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem samobójczym lub jego funkcjonalnym równoważnikiem.
- 16. Preparat według zastrz. 1 albo 15, znamienny tym, że zawiera dodatkowo metabolit kinazy tymidynowej lub jej funkcjonalny równoważnik.
- 17. Preparat według zastrz. 16, znamienny tym, że metabolitkinazy tymidynowej stanowi ganciclovir lub 6-metoksypuryna arabinukleozydu lub ich funkcjonalny równoważnik.
- 18. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujące obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą cytomegalowirusowego promotora CMV.
- 19. Preparat według zastrz. 18, znamienny tym, że promotor CMV jest najbliższym wczesnym promotorem CMV.
- 20. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujące obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą adenowirusowego promotora.
- 21 Preparat według zastrz. 20, znamienny tym, że adenowirusowy promotor jest głównym późnym promotorem adenowirusa typu 2.186 073
- 22. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że egzogenne DNA stanowi ponadto miejsca poliadenylacji.
- 23. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/C/N/53.
- 24. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/M/N/53.
- 25. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera komórkę gospodarza transformowaną za pośrednictwem adenowirusowego wektora.
- 26. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że farmaceutycznie akceptowalny nośnik zawiera fizjologicznie akceptowalny związek.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14266993A | 1993-10-25 | 1993-10-25 | |
US24600694A | 1994-05-19 | 1994-05-19 | |
PCT/US1994/012235 WO1995011984A2 (en) | 1993-10-25 | 1994-10-25 | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL314239A1 PL314239A1 (en) | 1996-09-02 |
PL186073B1 true PL186073B1 (pl) | 2003-10-31 |
Family
ID=26840311
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL94314239A PL186073B1 (pl) | 1993-10-25 | 1994-10-25 | Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US20080182807A1 (pl) |
EP (3) | EP2113569A1 (pl) |
JP (1) | JP3875990B2 (pl) |
CN (1) | CN1263864C (pl) |
AT (2) | ATE437232T1 (pl) |
AU (1) | AU687117B2 (pl) |
BR (1) | BR9407956A (pl) |
CA (1) | CA2173975C (pl) |
CZ (1) | CZ291372B6 (pl) |
DE (2) | DE69435223D1 (pl) |
DK (1) | DK0797676T3 (pl) |
ES (2) | ES2328585T3 (pl) |
FI (1) | FI961755A (pl) |
HU (1) | HU223733B1 (pl) |
NO (1) | NO961639L (pl) |
NZ (1) | NZ275956A (pl) |
PL (1) | PL186073B1 (pl) |
PT (1) | PT797676E (pl) |
RU (1) | RU2162342C2 (pl) |
SK (1) | SK283703B6 (pl) |
WO (1) | WO1995011984A2 (pl) |
Families Citing this family (334)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5747469A (en) | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
US6410010B1 (en) | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
EP0575518A1 (en) | 1991-03-06 | 1993-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
SK283703B6 (sk) * | 1993-10-25 | 2003-12-02 | Canji, Inc. | Rekombinantný adenovírusový vektor a jeho použitie |
US5698443A (en) * | 1995-06-27 | 1997-12-16 | Calydon, Inc. | Tissue specific viral vectors |
WO1996016676A1 (en) * | 1994-11-28 | 1996-06-06 | Genetic Therapy, Inc. | Tissue-specific treatment, diagnostic methods, and compositions using replication-deficient vectors |
US6638762B1 (en) | 1994-11-28 | 2003-10-28 | Genetic Therapy, Inc. | Tissue-vectors specific replication and gene expression |
US5998205A (en) | 1994-11-28 | 1999-12-07 | Genetic Therapy, Inc. | Vectors for tissue-specific replication |
JP3827163B2 (ja) * | 1995-03-24 | 2006-09-27 | ジェンザイム・コーポレーション | 遺伝子治療用のアデノウイルスベクター |
US5707618A (en) * | 1995-03-24 | 1998-01-13 | Genzyme Corporation | Adenovirus vectors for gene therapy |
US20030026789A1 (en) * | 1995-05-03 | 2003-02-06 | Richard J. Gregory | Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors |
US7011976B1 (en) | 1997-03-03 | 2006-03-14 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
US6197293B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-03-06 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing androgen receptor and methods of use thereof |
US6676935B2 (en) | 1995-06-27 | 2004-01-13 | Cell Genesys, Inc. | Tissue specific adenoviral vectors |
US6254862B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-07-03 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
US5801030A (en) * | 1995-09-01 | 1998-09-01 | Genvec, Inc. | Methods and vectors for site-specific recombination |
US5789244A (en) * | 1996-01-08 | 1998-08-04 | Canji, Inc. | Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems |
US6392069B2 (en) | 1996-01-08 | 2002-05-21 | Canji, Inc. | Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells |
US7002027B1 (en) | 1996-01-08 | 2006-02-21 | Canji, Inc. | Compositions and methods for therapeutic use |
US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
US5869037A (en) * | 1996-06-26 | 1999-02-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes |
ATE420182T1 (de) * | 1996-09-25 | 2009-01-15 | Scripps Research Inst | Verpackungszellinien in der verwendung zur erleichterung der entwicklung hocheffizienter adenoviraler vektoren |
US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
CZ131699A3 (cs) * | 1996-10-18 | 1999-07-14 | Canji, Inc. | Způsob a kompozice pro zavedení a expresi nukleových kysselin interferonu-alfa |
US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
IL130009A0 (en) * | 1996-11-18 | 2000-02-29 | Univ Mcgill | Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth |
US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
US6544769B1 (en) | 1996-12-13 | 2003-04-08 | Schering Corporation | Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
CA2274876A1 (en) | 1996-12-13 | 1998-06-18 | Schering Corporation | Method for purifying viruses |
WO1998032860A1 (en) * | 1997-01-28 | 1998-07-30 | Baxter International Inc. | Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors |
US6168944B1 (en) | 1997-01-31 | 2001-01-02 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
US6403370B1 (en) | 1997-02-10 | 2002-06-11 | Genstar Therapeutics Corporation | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system |
US20030060434A1 (en) | 1997-02-18 | 2003-03-27 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
US6200799B1 (en) * | 1997-06-03 | 2001-03-13 | University Of Lausanne | Somatic gene therapy to suppress secondary cataract formation following eye surgery |
DE69841807D1 (de) | 1997-11-06 | 2010-09-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
DK1047784T4 (en) | 1998-01-14 | 2015-06-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | NEISSERA meningitidis ANTIGENS |
KR100862169B1 (ko) | 1998-02-17 | 2008-10-09 | 쉐링 코포레이션 | 바이러스를 포함하는 조성물 |
EP2261351A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
AU3883299A (en) * | 1998-05-12 | 1999-11-29 | Baylor College Of Medicine | Cancer prevention by selective delivery methods |
US6900049B2 (en) | 1998-09-10 | 2005-05-31 | Cell Genesys, Inc. | Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof |
US6649158B1 (en) | 1998-10-15 | 2003-11-18 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
AU6497799A (en) * | 1998-10-15 | 2000-05-01 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
WO2000029573A2 (en) * | 1998-11-18 | 2000-05-25 | Canji, Inc. | Adenoviral vectors |
US6495130B1 (en) | 1998-12-30 | 2002-12-17 | Calydon, Inc. | Target cell-specific adenoviral vectors containing E3 and methods of use thereof |
ES2477194T3 (es) | 1999-04-30 | 2014-07-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Ant�genos neisseriales conservados |
GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
CN1796404A (zh) | 1999-10-29 | 2006-07-05 | 启龙有限公司 | 奈瑟球菌的抗原性肽 |
EP2163626A1 (en) | 1999-11-18 | 2010-03-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Human FGF-21 gene and gene expression products |
MXPA02006962A (es) | 2000-01-17 | 2002-12-13 | Chiron Spa | Vacuna de vesicula de membrana exterior que comprende proteinas de membrana exterior de neisseria meningitidis serogrupo b. |
EP1854476A3 (en) | 2000-02-09 | 2008-05-07 | Bas Medical, Inc. | Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction |
US20020082205A1 (en) | 2000-03-08 | 2002-06-27 | Nobuyuki Itoh | Human FGF-23 gene and gene expression products |
WO2001090392A1 (fr) * | 2000-05-26 | 2001-11-29 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Nouveau vecteur d'adenovirus recombinant a effets secondaires reduits |
US7700359B2 (en) | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
WO2001096523A2 (en) | 2000-06-15 | 2001-12-20 | Chiron Corporation | Polynucleotides related to colon cancer |
DE10045687B4 (de) * | 2000-09-15 | 2006-07-06 | MICROMUN Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH Biotechnikum Greifswald | Expressionskassetten und Adenovirusvektoren |
AU2002214127B2 (en) | 2000-10-27 | 2007-06-07 | J. Craig Venter Institute, Inc. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A and B |
WO2002046477A2 (en) | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Chiron Corporation | Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer |
GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
AU2002303261A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
WO2002081641A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2002258728A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
ES2345329T3 (es) | 2001-11-09 | 2010-09-21 | Georgetown University | Nueva isoforma del inhibidor del crecimiento celular endotelial vascular (vegi). |
EP2335724A1 (en) | 2001-12-12 | 2011-06-22 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Immunisation against chlamydia trachomatis |
ATE427363T1 (de) | 2002-01-08 | 2009-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | In kanzerísen mammazellen differentiell exprimierte genprodukte und ihre verwendungsverfahren |
EP1490395A4 (en) | 2002-03-15 | 2006-06-21 | Wyeth Corp | MUTANTS OF NON-TYPABLE HAEMOPHILUS INFLUENZAE P4 PROTEIN WITH REDUCED ENZYMATIC ACTIVITY |
US20040023267A1 (en) | 2002-03-21 | 2004-02-05 | Morris David W. | Novel compositions and methods in cancer |
US7244565B2 (en) | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2003276679A1 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-31 | Chiron Corporation | Vectors for expression of hml-2 polypeptides |
UA80447C2 (en) | 2002-10-08 | 2007-09-25 | Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic | |
US7569364B2 (en) | 2002-12-24 | 2009-08-04 | Pfizer Inc. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
US9498530B2 (en) | 2002-12-24 | 2016-11-22 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
NZ587852A (en) | 2002-12-24 | 2012-02-24 | Rinat Neuroscience Corp | Anti-NGF antibodies and methods using same |
US7767387B2 (en) | 2003-06-13 | 2010-08-03 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
EP1592708A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-11-09 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic gpcr targets in cancer |
AU2004213044A1 (en) | 2003-02-19 | 2004-09-02 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating pain by administering a nerve growth factor antagonist and an NSAID and compositions containing the same |
GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
US8052966B2 (en) | 2003-04-21 | 2011-11-08 | University Of Southern California | Methods and compositions for treating metastatic cancer |
US7355056B2 (en) | 2003-06-04 | 2008-04-08 | Canji, Inc. | Transfection agents |
CA2551097A1 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Rinat Neuroscience Corp. | Agonist anti-trkc antibodies and methods using same |
WO2005093064A1 (ja) | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Galpharma Co., Ltd. | 新規ガレクチン9改変体タンパク質及びその用途 |
JP5301152B2 (ja) | 2004-04-07 | 2013-09-25 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨癌の疼痛を処置するための方法 |
ES2673972T3 (es) | 2004-07-09 | 2018-06-26 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Formas solubles de la glicoproteína G de los virus hendra y nipah |
US20060024677A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Morris David W | Novel therapeutic targets in cancer |
EA016357B1 (ru) | 2004-07-30 | 2012-04-30 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Антитела, направленные против бета-амилоидного пептида, и способы их применения |
EP2251418B1 (en) | 2004-10-07 | 2021-03-17 | Argos Therapeutics, Inc. | Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same |
WO2006091517A2 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-31 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Immunogens from uropathogenic escherichia coli |
EP2062591A1 (en) | 2005-04-07 | 2009-05-27 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | CACNA1E in cancer diagnosis detection and treatment |
EP2083088A3 (en) | 2005-04-07 | 2009-10-14 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Cancer-related genes |
AU2006243776A1 (en) | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurometabolic disorders |
PL1879623T3 (pl) | 2005-05-02 | 2013-03-29 | Genzyme Corp | Terapia genowa zaburzeń rdzenia kręgowego |
EP1907425B1 (en) | 2005-07-22 | 2014-01-08 | Y's Therapeutics Co., Ltd. | Anti-cd26 antibodies and methods of use thereof |
SI3045182T1 (en) | 2005-11-14 | 2018-08-31 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | An antibody to a peptide-associated peptide antagonist to calcitonin for treating a headache in aggregates |
CA2637707A1 (en) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Rinat Neuroscience Corporation | Methods for treating obesity by administering a trkb antagonist |
MX360595B (es) | 2006-02-08 | 2018-11-09 | Genzyme Corp | Terapia génica para la enfermedad de niemann-pick de tipo a. |
ES2725552T3 (es) | 2006-06-07 | 2019-09-24 | Genzyme Corp | Terapia génica para esclerosis lateral amiotrófica y otros trastornos de la médula espinal |
NZ572561A (en) | 2006-06-07 | 2012-05-25 | Bioalliance Cv | Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same |
EP2054431B1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-31 | Novartis AG | Conformers of bacterial adhesins |
AU2007285484B2 (en) | 2006-08-16 | 2013-05-02 | Novartis Ag | Immunogens from uropathogenic Escherichia coli |
DK2066791T3 (da) | 2006-10-03 | 2012-10-15 | Genzyme Corp | Genterapi for amyotrofisk lateralsklerose og andre rygmarvssygdomme |
US20100261640A1 (en) | 2007-04-10 | 2010-10-14 | Branco Luis M | Soluble and membrane anchored forms of lassa virus subunit proteins |
DK2158319T3 (da) | 2007-05-11 | 2012-03-19 | Enobia Pharma Inc | Knoglemålrettet alkalisk fosfatase, kits og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
US8454954B2 (en) | 2007-05-16 | 2013-06-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of synucleinopathies |
PL2158322T3 (pl) | 2007-06-06 | 2017-10-31 | Genzyme Corp | Terapia genowa dla lizosomalnych chorób spichrzeniowych |
GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
CN102335424B (zh) * | 2007-08-22 | 2013-12-04 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 利用ix蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬ii型腺病毒活载体重组疫苗 |
NZ583944A (en) | 2007-09-28 | 2012-06-29 | Portola Pharm Inc | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
US20100278873A1 (en) | 2007-11-08 | 2010-11-04 | David Avigan | Stimulation of anti-tumor immunity using dendritic cell/tumor cell fusions and anti-cd3/cd28 |
RU2570559C2 (ru) | 2007-12-17 | 2015-12-10 | Пфайзер Лимитед | Лечение интерстициального цистита |
ES2550757T3 (es) | 2007-12-18 | 2015-11-12 | Bioalliance C.V. | Anticuerpos que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos en CD43 y ACE expresados en células cancerosas y métodos de uso de los mismos |
JP2011516078A (ja) | 2008-04-10 | 2011-05-26 | セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド | 癌におけるegfr突然変異を検出する組成物および方法 |
WO2009150623A1 (en) | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Pfizer Inc | Treatment of chronic prostatitis |
TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Pcsk9拮抗劑類 |
US20100180082A1 (en) * | 2009-01-12 | 2010-07-15 | Viasat, Inc. | Methods and systems for implementing url masking |
WO2010086828A2 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Rinat Neuroscience Corporation | Agonist anti-trkb monoclonal antibodies |
CA2754618A1 (en) | 2009-03-06 | 2010-09-10 | Novartis Ag | Chlamydia antigens |
WO2010111522A2 (en) | 2009-03-26 | 2010-09-30 | The Regents Of The University Of California | Mesenchymal stem cells producing inhibitory rna for disease modification |
EP3604510A1 (en) | 2009-03-30 | 2020-02-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
US20100297127A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-11-25 | Ghilardi Nico P | Use of il-27 antagonists to treat lupus |
AU2010238255B2 (en) | 2009-04-14 | 2014-10-16 | Novartis Ag | Compositions for immunising against Staphylococcus aureus |
CN101560521B (zh) * | 2009-06-01 | 2011-05-04 | 陕西师范大学 | 表达小干扰rna的va1缺失的腺病毒载体的构建方法 |
WO2010146511A1 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Pfizer Limited | Treatment of overactive bladder |
WO2011005598A1 (en) | 2009-06-24 | 2011-01-13 | University Of Southern California | Compositions and methods for the rapid biosynthesis and in vivo screening of biologically relevant peptides |
ES2605801T3 (es) | 2009-07-15 | 2017-03-16 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Formulación de dosis unitaria de antídoto para inhibidores del factor Xa para su uso en la prevención de la hemorragia |
CA2768343A1 (en) | 2009-07-16 | 2011-01-20 | Novartis Ag | Detoxified escherichia coli immunogens |
RU2443779C2 (ru) * | 2009-10-09 | 2012-02-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Способ получения препарата рекомбинантного аденовируса, характеризующегося сниженным коэффициентом соотношения физических и инфекционных вирусных частиц, и генно-терапевтический лекарственный препарат, полученный таким способом |
GB0919690D0 (en) | 2009-11-10 | 2009-12-23 | Guy S And St Thomas S Nhs Foun | compositions for immunising against staphylococcus aureus |
US8298535B2 (en) | 2010-02-24 | 2012-10-30 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-IL-7 receptor antibodies |
GB201003333D0 (en) | 2010-02-26 | 2010-04-14 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
KR20120138241A (ko) | 2010-03-11 | 2012-12-24 | 화이자 인코포레이티드 | pH 의존성 항원 결합을 갖는 항체 |
GB201005625D0 (en) | 2010-04-01 | 2010-05-19 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
WO2011133931A1 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease |
JP5988961B2 (ja) | 2010-04-28 | 2016-09-07 | ザ ジェイ. デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ | 心筋細胞を発生させるための方法 |
KR101867359B1 (ko) | 2010-05-10 | 2018-07-23 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 엔도리보뉴클레아제 조성물들 및 이들의 사용 방법들 |
US20130150256A1 (en) | 2010-06-11 | 2013-06-13 | Jane Synnergren | Novel micrornas for the detection and isolation of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types |
JP2013533286A (ja) | 2010-07-30 | 2013-08-22 | セントルイス ユニバーシティ | 疼痛を治療する方法 |
US9198975B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-12-01 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for targeting sites of neovascular growth |
WO2012072769A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations |
US20130071375A1 (en) | 2011-08-22 | 2013-03-21 | Saint Louis University | Compositions and methods for treating inflammation |
WO2013028527A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compositions and methods for treating cancer |
EP2751291B1 (en) | 2011-09-01 | 2018-08-15 | University of Southern California | Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same |
EP2776470A2 (en) | 2011-11-11 | 2014-09-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Antibodies specific for trop-2 and their uses |
WO2013090356A2 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
WO2013093707A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Rinat Neuroscience Corp. | Human growth hormone receptor antagonist antibodies and methods of use thereof |
WO2013093693A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Rinat Neuroscience Corp. | Staphylococcus aureus specific antibodies and uses thereof |
RS64622B1 (sr) | 2012-05-25 | 2023-10-31 | Univ California | Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk |
WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
RU2015105588A (ru) | 2012-07-19 | 2016-09-10 | Редвуд Байосайнс, Инк. | Антитело, специфическое к cd22, и способы его применения |
US8603470B1 (en) | 2012-08-07 | 2013-12-10 | National Cheng Kung University | Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases |
SI2885010T1 (sl) | 2012-08-16 | 2020-07-31 | Ipierian, Inc. | Metode zdravljenja tauopatije |
WO2014060848A2 (en) | 2012-10-17 | 2014-04-24 | Vascular Biogenics Ltd. | Treatment methods using adenovirus |
CA2889170C (en) | 2012-10-25 | 2021-09-07 | True North Therapeutics, Inc. | Anti-complement c1s antibodies and uses thereof |
CN108610418B (zh) | 2012-11-02 | 2022-11-01 | 美国比奥维拉迪维股份有限公司 | 抗补体C1s抗体和其用途 |
EA201590880A1 (ru) | 2012-11-05 | 2015-09-30 | Джензим Корпорейшн | Композиции и способы лечения протеинопатий |
RU2015115956A (ru) | 2012-11-09 | 2017-01-10 | Пфайзер Инк. | Антитела, специфичные в отношении фактора роста тромбоцитов в, и их композиции и применения |
US10106817B2 (en) | 2013-02-14 | 2018-10-23 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents |
LT2956175T (lt) | 2013-02-15 | 2017-12-11 | The Regents Of The University Of California | Chimerinis antigeno receptorius ir jo panaudojimo būdai |
WO2014153258A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Epeius Biotechnologies Corporation | Improved thymidine kinase gene |
WO2014152232A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Dyax Corp. | Anti-plasma kallikrein antibodies |
US20160039877A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-11 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
CN105189560A (zh) | 2013-05-07 | 2015-12-23 | 瑞纳神经科学公司 | 抗胰高血糖素受体抗体和其使用方法 |
HUE050485T2 (hu) | 2013-06-10 | 2020-12-28 | Ipierian Inc | Tauopathia kezelési módszerei |
CN105555365A (zh) | 2013-06-25 | 2016-05-04 | 堪培拉大学 | 用于调控癌症干细胞的方法和组合物 |
US10711275B2 (en) | 2013-07-12 | 2020-07-14 | Zhen Huang | Methods and compositions for interference with DNA polymerase and DNA synthesis |
US10208125B2 (en) | 2013-07-15 | 2019-02-19 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof |
ES2760902T3 (es) | 2013-07-18 | 2020-05-18 | Xalud Therapeutics Inc | Composición para el tratamiento de la enfermedad articular inflamatoria |
TWI623551B (zh) | 2013-08-02 | 2018-05-11 | 輝瑞大藥廠 | 抗cxcr4抗體及抗體-藥物結合物 |
ES2851724T3 (es) | 2013-09-18 | 2021-09-08 | Epiaxis Therapeutics Pty Ltd | Modulación de células madre |
WO2015073580A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Pfizer Inc. | Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof |
EP3760719A1 (en) | 2013-11-18 | 2021-01-06 | CRISPR Therapeutics AG | Crispr-cas system materials and methods |
WO2015087187A1 (en) | 2013-12-10 | 2015-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-sclerostin antibodies |
EP3835419A1 (en) | 2013-12-12 | 2021-06-16 | The Regents of The University of California | Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid |
WO2015109212A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Pfizer Inc. | Anti-il-2 antibodies and compositions and uses thereof |
AU2015230933B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-08-13 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
WO2015168474A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Fusion proteins for treating cancer and related methods |
WO2015175375A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Short Jay M | Conditionally active biological proteins |
ES2767259T3 (es) | 2014-06-18 | 2020-06-17 | Albert Einstein College Of Medicine | Polipéptidos syntac y usos de los mismos |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
US9546206B2 (en) | 2014-08-08 | 2017-01-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | High affinity PD-1 agents and methods of use |
AU2015309686B2 (en) | 2014-08-25 | 2020-05-14 | Epiaxis Therapeutics Pty Ltd | Compositions for modulating cancer stem cells and uses therefor |
JP7286267B2 (ja) | 2014-08-28 | 2023-06-05 | バイオアトラ インコーポレイテッド | 修飾t細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 |
US11111288B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-09-07 | Bioatla, Inc. | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
MX2017002805A (es) | 2014-09-03 | 2017-12-20 | Bioatla Llc | Descubrimiento y producción de proteínas biológicas condicionalmente activas en las mismas células hospederas eucariotas de producción. |
IL292574A (en) | 2014-09-07 | 2022-06-01 | Selecta Biosciences Inc | Methods and preparations for attenuating immune responses in an antiviral transfer system |
WO2016040441A1 (en) | 2014-09-09 | 2016-03-17 | Unum Therapeutics | Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy |
GB201417042D0 (en) * | 2014-09-29 | 2014-11-12 | Fkd Therapies Oy | Method |
CN107405390A (zh) | 2014-12-05 | 2017-11-28 | 阿雷克森制药公司 | 用重组碱性磷酸酶治疗癫痫 |
TWI595006B (zh) | 2014-12-09 | 2017-08-11 | 禮納特神經系統科學公司 | 抗pd-1抗體類和使用彼等之方法 |
EP3858992A1 (en) | 2015-03-13 | 2021-08-04 | The Jackson Laboratory | A three-component crispr/cas complex system and uses thereof |
EP3277323A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-02-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
CA2977753A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Compositions and methods of treating acute myeloid leukemia |
US20180078626A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating renal cell cancer |
US20180085398A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
US20180071340A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating multiple myeloma |
HRP20230093T1 (hr) | 2015-04-06 | 2023-03-31 | Bioverativ Usa Inc. | Humanizirana anti-c1s protutijela i postupci njihove primjene |
US9758575B2 (en) | 2015-04-06 | 2017-09-12 | Yung Shin Pharmaceutical Industrial Co. Ltd. | Antibodies which specifically bind to canine vascular endothelial growth factor and uses thereof |
AU2016246655B2 (en) | 2015-04-07 | 2021-07-22 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Methods for inducing cell division of postmitotic cells |
SI3283106T1 (sl) | 2015-04-13 | 2022-04-29 | Pfizer Inc. | Terapevtska protitelesa in njihova uporaba |
AU2016256895B2 (en) | 2015-05-07 | 2022-05-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease |
EP3303634B1 (en) | 2015-06-03 | 2023-08-30 | The Regents of The University of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
US11040094B2 (en) | 2015-07-01 | 2021-06-22 | Colleen M. O'Connor | Compositions and methods for treating immunological dysfunction |
WO2017011275A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | Nersissian Aram M | Factor viii protein compositions and methods of treating hemophilia a |
US10913802B2 (en) | 2015-07-21 | 2021-02-09 | Dyax Corp. | Monoclonal antibody inhibitor of factor XIIA |
US10877045B2 (en) | 2015-07-21 | 2020-12-29 | Saint Louis University | Compositions and methods for diagnosing and treating endometriosis-related infertility |
CA3025896A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to coagulation factor xia and uses thereof |
CA2993009A1 (en) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Peptides and antibodies for the removal of biofilms |
EP3331536A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-03-27 | The Regents of The University of California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ABHD2 ACTIVITY |
JP6664467B2 (ja) | 2015-08-19 | 2020-03-13 | ファイザー・インク | 組織因子経路インヒビター抗体およびその使用 |
JP7074341B2 (ja) | 2015-09-02 | 2022-05-24 | イムテップ エス.アー.エス. | 抗lag-3抗体 |
RS62330B1 (sr) | 2015-09-15 | 2021-10-29 | Scholar Rock Inc | Antitela pro/latentnog miostatina i njihova upotreba |
JP2018532402A (ja) | 2015-09-24 | 2018-11-08 | クリスパー セラピューティクス アーゲー | Rnaプログラム可能エンドヌクレアーゼの新規のファミリーならびにゲノム編集および他の適用におけるそれらの使用 |
WO2017066719A2 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Hu specific interfering agents |
MX2018004546A (es) | 2015-10-16 | 2019-04-15 | Univ Columbia | Composiciones y métodos para la inhibicion de antígenos específicos de linaje. |
JP7030689B2 (ja) | 2015-10-23 | 2022-03-07 | ファイザー インコーポレイティッド | 抗il-2抗体ならびにその組成物及び使用 |
WO2017075037A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Scholar Rock, Inc. | Primed growth factors and uses thereof |
CN106699889A (zh) | 2015-11-18 | 2017-05-24 | 礼进生物医药科技(上海)有限公司 | 抗pd-1抗体及其治疗用途 |
US20200323952A1 (en) | 2015-11-20 | 2020-10-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
US11066465B2 (en) | 2015-12-30 | 2021-07-20 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
EP3399991A4 (en) | 2016-01-08 | 2019-08-07 | The Regents of The University of California | REQUIRES ACTIVE HETERODIMER POLYPEPTIDES AND METHOD FOR USE THEREOF |
TW201936640A (zh) | 2016-01-21 | 2019-09-16 | 美商輝瑞股份有限公司 | 對表皮生長因子受體變異體iii具特異性之抗體類及彼等之用途 |
EP3423078A4 (en) | 2016-03-03 | 2019-11-06 | Cue Biopharma, Inc. | T CELL MODULATING MULTIPLE POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE THEREOF |
CN108884460B (zh) | 2016-03-19 | 2023-04-28 | 埃克苏马生物技术公司 | 淋巴细胞转导及其扩增调节的方法与组合物 |
US11325948B2 (en) | 2016-03-19 | 2022-05-10 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL |
WO2020047527A2 (en) | 2018-09-02 | 2020-03-05 | F1 Bioventures, Llc | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs |
US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
US20190125848A1 (en) | 2016-03-30 | 2019-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dendritic cell-extracellular vesicle fusions and methods of using same |
CN109563158B (zh) | 2016-04-04 | 2022-08-09 | 比奥贝拉蒂美国公司 | 抗补体因子bb抗体以及其用途 |
ES2930255T3 (es) | 2016-05-13 | 2022-12-09 | Bioatla Inc | Anticuerpos anti-Ror2, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos de los mismos |
CA3022331A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Variant pd-l1 polypeptides, t-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof |
EP3458096A4 (en) | 2016-05-18 | 2019-11-27 | Cue Biopharma, Inc. | T-LYMPHOCYTE MODULATOR MULTIMERIC POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE |
AU2017292936B2 (en) | 2016-07-08 | 2024-02-01 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
EP3512535A4 (en) | 2016-09-13 | 2020-05-06 | The Jackson Laboratory | TARGETED IMPROVED DNA DEMETHYLATION |
WO2018057648A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptide regulators of mitochondrial fusion and methods of use |
EP3525583A4 (en) | 2016-10-12 | 2020-06-10 | Bioverativ USA Inc. | ANTI-C1S ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
WO2018080573A1 (en) | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr/cas global regulator screening platform |
AU2017356295A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-05-23 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Compositions and methods of treating cancer |
EP3538139A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-09-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
CN110325205B (zh) | 2016-12-22 | 2023-08-15 | 库尔生物制药有限公司 | T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
AU2018206560A1 (en) | 2017-01-04 | 2019-07-18 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Antibody fragments for the treatment of biofilm-related disorders |
JP2020506890A (ja) | 2017-01-07 | 2020-03-05 | セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドSelecta Biosciences,Inc. | 合成ナノキャリアにカップリングした免疫抑制剤のパターン化された投与 |
WO2018129474A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
AU2018211081A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-07-18 | Bioatla, Inc. | Chimeric antigen receptors against Axl or Ror2 and methods of use thereof |
EP3571294A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-11-27 | F1 Oncology, Inc. | Methods of transducing and expanding immune cells and uses thereof |
WO2018148246A1 (en) | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for rna-guided genetic circuits |
JP2020510435A (ja) | 2017-03-03 | 2020-04-09 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | 抗gitr抗体およびその使用方法 |
SG10202109571PA (en) | 2017-03-03 | 2021-10-28 | Exuma Biotech Corp | Methods and compositions for transducing and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof |
EP3596206A1 (en) | 2017-03-16 | 2020-01-22 | Pfizer Inc | Tyrosine prototrophy |
MX2019011599A (es) | 2017-03-30 | 2019-12-19 | Univ Queensland | Moleculas quimericas y usos de las mismas. |
CA3059938A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof |
TWI790120B (zh) | 2017-06-02 | 2023-01-11 | 美商輝瑞大藥廠 | 對flt3具特異性之抗體及其用途 |
GB2577828A (en) | 2017-06-13 | 2020-04-08 | Bostongene Corp | Systems and methods for identifying cancer treatments from normalized biomarker scores |
WO2019016784A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Universidade De Coimbra | ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES |
CN110892064A (zh) * | 2017-07-25 | 2020-03-17 | 牛津遗传学有限公司 | 腺病毒载体 |
AU2018327224A1 (en) | 2017-09-07 | 2020-04-23 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptide with conjugation sites and methods of use thereof |
AU2018328291B2 (en) | 2017-09-08 | 2022-10-27 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Constrained conditionally activated binding proteins |
WO2019051122A2 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Maverick Therapeutics, Inc. | CONDITIONAL ACTIVATED BOND FRACTIONS CONTAINING FC REGIONS |
KR20210027230A (ko) | 2017-10-04 | 2021-03-10 | 옵코 파마슈티칼스, 엘엘씨 | 암의 개인 맞춤형 치료에 관한 물품 및 방법 |
US11192944B2 (en) | 2017-10-11 | 2021-12-07 | Bioverativ Usa Inc. | Methods of inducing complement activity |
EP3694543A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-08-19 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
WO2019118935A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership | Novel rna-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications |
CN111886241A (zh) | 2018-01-09 | 2020-11-03 | 库尔生物制药有限公司 | 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法 |
KR20200128018A (ko) | 2018-02-01 | 2020-11-11 | 화이자 인코포레이티드 | Cd70을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 |
US11377500B2 (en) | 2018-02-01 | 2022-07-05 | Pfizer Inc. | Antibodies specific for CD70 and their uses |
US11667949B2 (en) | 2018-02-15 | 2023-06-06 | The Trustees Of Princeton University | Reporter construct and biosensor for interferon second messenger 2-5A |
US20200405642A1 (en) | 2018-02-26 | 2020-12-31 | AnTolRx, Inc. | Tolerogenic liposomes and methods of use thereof |
BR112020016859A2 (pt) | 2018-02-28 | 2020-12-29 | Pfizer Inc. | Variantes de il-15 e usos da mesma |
BR112020018658A2 (pt) | 2018-03-15 | 2020-12-29 | KSQ Therapeutics, Inc. | Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada |
AU2019234926A1 (en) | 2018-03-15 | 2020-10-08 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
CN112424348A (zh) | 2018-03-19 | 2021-02-26 | 克里斯珀医疗股份公司 | 新颖的rna-可编程的内切核酸酶系统及其用途 |
WO2019224715A1 (en) | 2018-05-23 | 2019-11-28 | Pfizer Inc. | Antibodies specific for cd3 and uses thereof |
KR20230146098A (ko) | 2018-05-23 | 2023-10-18 | 화이자 인코포레이티드 | GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 |
US20210309756A1 (en) | 2018-08-09 | 2021-10-07 | Maverick Therapeutics, Inc. | Coexpression and purification method of conditionally activated binding proteins |
CA3109640A1 (en) * | 2018-08-16 | 2020-02-20 | Spacecraft Seven, Llc | Production methods for viral vectors |
BR112021003670A2 (pt) | 2018-08-28 | 2021-05-18 | Vor Biopharma, Inc. | células-tronco hematopoéticas geneticamente modificadas e seus usos |
SG11202102058UA (en) | 2018-08-30 | 2021-03-30 | Tenaya Therapeutics Inc | Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1 |
JP2022512580A (ja) | 2018-10-05 | 2022-02-07 | リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル | 細菌バイオフィルムの酵素的破壊のための組成物および方法 |
TW202039542A (zh) | 2018-12-19 | 2020-11-01 | 美商庫爾生物製藥有限公司 | 多聚體t細胞調節多肽及其使用方法 |
CA3132651A1 (en) | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Takeda Pharmaceutical Limited Company | Conditionally activated binding proteins containing fc regions and moieties targeting tumor antigens |
EP3934762A1 (en) | 2019-03-05 | 2022-01-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Constrained conditionally activated binding proteins |
JP2022522405A (ja) | 2019-03-06 | 2022-04-19 | キュー バイオファーマ, インコーポレイテッド | T細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法 |
AU2020231380A1 (en) | 2019-03-07 | 2021-09-23 | The Regents Of The University Of California | CRISPR-Cas effector polypeptides and methods of use thereof |
SG11202109741VA (en) | 2019-03-12 | 2021-10-28 | Crispr Therapeutics Ag | Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof |
JP2022527860A (ja) | 2019-04-02 | 2022-06-06 | ケンジョッケティ バイオテクノロジー,インク. | 排出ポンプ-癌抗原マルチ特異性抗体ならびにそれに関する組成物、試薬、キットおよび方法 |
KR20220004121A (ko) | 2019-04-28 | 2022-01-11 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 바이러스 전달 벡터에 대한 기존의 면역을 갖는 대상체의 치료 방법 |
BR112021023594A2 (pt) | 2019-05-28 | 2022-02-08 | Selecta Biosciences Inc | Métodos e composições para resposta imune de vetor de transferência antiviral atenuada |
EP3994696A2 (en) | 2019-07-03 | 2022-05-11 | BostonGene Corporation | Systems and methods for sample preparation, sample sequencing, and sequencing data bias correction and quality control |
BR112021026890A2 (pt) | 2019-07-08 | 2022-03-15 | Res Inst Nationwide Childrens Hospital | Composições de anticorpo para interromper biofilmes |
US20230137971A1 (en) | 2019-07-11 | 2023-05-04 | Tenaya Therapeutics Inc. | Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors |
WO2021020979A1 (en) | 2019-07-31 | 2021-02-04 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Perfusion modulated tumor dose sculpting with single dose radiotherapy |
WO2021071830A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
WO2021072265A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
WO2021072244A1 (en) | 2019-10-11 | 2021-04-15 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Anti-tn antibodies and uses thereof |
WO2021113736A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-domain antibody to chloramphenicol |
WO2021151079A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
EP4114421A1 (en) | 2020-03-02 | 2023-01-11 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas |
WO2021205325A1 (en) | 2020-04-08 | 2021-10-14 | Pfizer Inc. | Anti-gucy2c antibodies and uses thereof |
US20230181750A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-06-15 | Crispr Therapeutics Ag | Mask peptides and masked anti-ptk7 antibodies comprising such |
CN116529267A (zh) | 2020-06-04 | 2023-08-01 | 肯乔克蒂生物技术股份有限公司 | Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法 |
EP4182346A1 (en) | 2020-07-17 | 2023-05-24 | Pfizer Inc. | Therapeutic antibodies and their uses |
JP2023535604A (ja) | 2020-07-30 | 2023-08-18 | ファイザー・インク | 遺伝子複製を有する細胞およびその使用 |
EP4176058A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-05-10 | The Jackson Laboratory | Targeted sequence insertion compositions and methods |
US11781156B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-10-10 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
US20240029829A1 (en) | 2020-12-04 | 2024-01-25 | Bostongene Corporation | Hierarchical machine learning techniques for identifying molecular categories from expression data |
WO2022187289A1 (en) | 2021-03-01 | 2022-09-09 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for the delivery of retroviral particles |
EP4330969A1 (en) | 2021-04-29 | 2024-03-06 | BostonGene Corporation | Machine learning techniques for estimating tumor cell expression in complex tumor tissue |
CA3222756A1 (en) | 2021-06-10 | 2022-12-15 | Janssen Biotech, Inc. | Nucleic acid coding for klk2-gpi fusion protein, recombinant cells, and uses thereof |
BR112023023768A2 (pt) | 2021-06-11 | 2024-02-27 | Bayer Ag | Sistemas de endonucleases programáveis por rna tipo v |
EP4101928A1 (en) | 2021-06-11 | 2022-12-14 | Bayer AG | Type v rna programmable endonuclease systems |
WO2023012627A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Pfizer Inc. | Improved expression vectors and uses thereof |
EP4144841A1 (en) | 2021-09-07 | 2023-03-08 | Bayer AG | Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof |
CA3232833A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Kathleen Mcginness | Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules that re-direct glucose metabolites out of the glycolysis pathway and therapeutic uses thereof |
US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
WO2023091909A1 (en) | 2021-11-16 | 2023-05-25 | Sotio Biotech Inc. | Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients |
WO2023102388A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Sanofi Pasteur Inc. | Human metapneumovirus viral vector-based vaccines |
WO2023114658A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Anti-abcb1 antibodies |
WO2023118068A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel small type v rna programmable endonuclease systems |
WO2023147177A1 (en) | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Bostongene Corporation | Machine learning techniques for cytometry |
WO2023148598A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Pfizer Inc. | Cysteine prototrophy |
WO2023159220A1 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Anti-cd47 antibodies |
WO2023168305A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Exuma Biotech Corp. | Viral particles with membrane-bound hyaluronidase |
WO2023172624A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Selecta Biosciences, Inc. | Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing |
WO2023237587A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel small type v rna programmable endonuclease systems |
EP4299739A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
EP4299733A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005863A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005864A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
US20240029884A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-25 | Bostongene Corporation | Techniques for detecting homologous recombination deficiency (hrd) |
WO2024040208A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Sotio Biotech Inc. | Genetically engineered immune cells with chimeric receptor polypeptides in combination with multiple trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
WO2024040207A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Sotio Biotech Inc. | Genetically engineered natural killer (nk) cells with chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
WO2024044659A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Tectonic Therapeutic, Inc. | Constitutively active g protein-coupled receptor compositions and methods of use thereof |
WO2024068996A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4567253A (en) * | 1984-02-03 | 1986-01-28 | Tony Durst | 2-Substituted derivatives of podophyllotoxin and etoposide |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
EP0575518A1 (en) * | 1991-03-06 | 1993-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
US6410010B1 (en) * | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
US5747469A (en) * | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
FR2688514A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
ATE263252T1 (de) * | 1992-11-09 | 2004-04-15 | Us Health | Erzielbare vektorenpartikel |
FR2704234B1 (fr) * | 1993-04-22 | 1995-07-21 | Centre Nat Rech Scient | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique. |
AU7019494A (en) * | 1993-05-20 | 1994-12-20 | Baylor College Of Medicine | Genetic therapy for cardiovascular disease |
SK283703B6 (sk) * | 1993-10-25 | 2003-12-02 | Canji, Inc. | Rekombinantný adenovírusový vektor a jeho použitie |
TW442569B (en) * | 1993-10-25 | 2001-06-23 | Canji Inc | Recombinant adenoviral vector |
US20010006629A1 (en) * | 1993-10-25 | 2001-07-05 | Richard J. Gregory | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
US6210939B1 (en) * | 1993-10-25 | 2001-04-03 | Canji, Inc. | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
US20050031590A9 (en) * | 1993-10-25 | 2005-02-10 | Richard Gregory | Adenoviral vectors having a protein IX deletion |
EP0956052B1 (en) * | 1996-11-19 | 2005-04-13 | University Of Alabama, Birmingham Research Foundation | Chimeric retrovirus/adenovirus system |
US20030064949A1 (en) * | 1998-02-17 | 2003-04-03 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
EP0973926A1 (en) * | 1997-03-14 | 2000-01-26 | Selective Genetics, Inc. | Adenoviral vectors with modified tropism |
-
1994
- 1994-10-25 SK SK510-96A patent/SK283703B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 BR BR9407956A patent/BR9407956A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 DE DE69435223T patent/DE69435223D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HU HU9601073A patent/HU223733B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 WO PCT/US1994/012235 patent/WO1995011984A2/en active IP Right Grant
- 1994-10-25 EP EP09009448A patent/EP2113569A1/en not_active Withdrawn
- 1994-10-25 JP JP51278395A patent/JP3875990B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-25 AU AU81250/94A patent/AU687117B2/en not_active Ceased
- 1994-10-25 AT AT05020924T patent/ATE437232T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 NZ NZ275956A patent/NZ275956A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 EP EP05020924A patent/EP1637608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 ES ES05020924T patent/ES2328585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 EP EP95900422A patent/EP0797676B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 AT AT95900422T patent/ATE314482T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 DK DK95900422T patent/DK0797676T3/da active
- 1994-10-25 PL PL94314239A patent/PL186073B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 ES ES95900422T patent/ES2256842T4/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 CZ CZ19961143A patent/CZ291372B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 CN CNB941939197A patent/CN1263864C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-25 PT PT95900422T patent/PT797676E/pt unknown
- 1994-10-25 DE DE69434594T patent/DE69434594T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 RU RU96112150/14A patent/RU2162342C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 CA CA002173975A patent/CA2173975C/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-24 NO NO961639A patent/NO961639L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-04-24 FI FI961755A patent/FI961755A/fi not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-11-20 US US11/603,279 patent/US20080182807A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-04-25 US US11/739,963 patent/US20080175818A1/en not_active Abandoned
- 2007-05-02 US US11/800,036 patent/US20090082289A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-14 US US11/818,907 patent/US20080299083A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-05-27 US US12/127,756 patent/US20090088398A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL186073B1 (pl) | Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej | |
US6210939B1 (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
US5932210A (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
US20060140910A1 (en) | Recombinant adenoviral vectors and methods of use | |
US20030091534A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
KR100389526B1 (ko) | 재조합아데노바이러스벡터및사용방법 | |
US20020137212A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
US20060171925A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20091025 |