ES2851724T3 - Modulación de células madre - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor selectivo de PKC-θ y un agente de terapia antineoplásica para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer metastásico, en donde el cáncer metastásico comprende células madre cancerosas (CSC) y células tumorales no CSC, en donde el inhibidor de PKC-θ inhibe la formación, proliferación, mantenimiento o transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las CSC o estimula o induce la transición mesenquimal a epitelial (MET) de las CSC, y en donde el agente de terapia antineoplásica inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de las células tumorales no CSC.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de células madre
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de inhibidores de proteína cinasa C teta (PKC-0) para inhibir el crecimiento de células que sobreexpresan PKC-0, incluidas células madre cancerosas, para mejorar los efectos biológicos de fármacos quimioterapéuticos sobre las células cancerosas, para tratar cáncer, incluido cáncer metastásico y/o para prevenir la recurrencia del cáncer.
Antecedentes de la invención
La transición de células epiteliales a mesenquimales (EMT) es un paso clave en la progresión y la metástasis del cáncer. No obstante, solamente una pequeña subpoblación de células tumorales denominadas células madre cancerosas (CSC), o células metastásicas 'precursoras', cumple potencialmente una función importante para el inicio y la recurrencia de tumores metastásicos. Las CSC inician tumores y promueven la progresión maligna generando y dando soporte a la replicación de más descendencia de células madre no diferenciadas (véanse, por ejemplo, Kleffel et al., 2013. Adv Exp Med Biol. 734:145-79; Chen et al., 2013. Acta Pharmacologica Sinica 34:732-740; Páez et al., 2012, Clin Cancer Res. 18(3):645-53). Las CSC han demostrado ser fundamentalmente responsables de tumorigénesis, metástasis del cáncer, relapso de tumores, resistencia a los fármacos y fracaso de quimio y radioterapia. Desafortunadamente, actualmente se desconocen los mecanismos mediante los cuales las CSC causan la formación y el desarrollo de tumores y la función potencial de la plasticidad de diferenciación específica de las CSC en la tumorigenicidad.
Cabe destacar que las CSC comparten muchos rasgos similares con las células madre normales. Por ejemplo, las CSC poseen capacidad de autorrenovación, a saber, la capacidad de dar origen a células madre cancerosas tumorigénicas adicionales, típicamente a una velocidad inferior que otras células tumorales divisorias, en oposición a un número limitado de divisiones. Las CSC también tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples tipos de células (es decir, son multipotentes), lo que explicaría la evidencia histológica de que no solamente muchos tumores contienen múltiples tipos celulares naturales del órgano hospedante, sino que además la heterogeneidad se retiene comúnmente en metástasis tumorales.
Las CSC expresan determinados marcadores de la superficie celular que se enumeran, por ejemplo, en la Tabla 1 siguiente:
Figure imgf000002_0001
Las células madre somáticas normales son naturalmente resistentes a los agentes quimioterapéuticos — poseen varias bombas (como proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MDR)) que bombean los fármacos hacia afuera, y mecanismos de reparación de ADN eficientes. Además, también una lenta velocidad de recambio de células, mientras que los agentes quimioterapéuticos se dirigen rápidamente a las células replicantes. Las CSC, al ser las contrapartidas mutadas de las células madre normales, pueden tener mecanismos similares que les permiten sobrevivir a las farmacoterapias y a las radioterapias. En otros términos, las quimioterapias y las radioterapias convencionales destruyen las células diferenciadas o de diferenciación, que forman la masa del tumor y son incapaces de regenerar tumores. La población de CSC que dio origen a las células diferenciadas o de diferenciación, por otro lado, podría permanecer intacta y causar un relapso de la enfermedad. Otro riesgo de la terapia antineoplásica convencional es la posibilidad de que el tratamiento, por ejemplo, de quimioterapia, deje solamente CSC resistentes a la quimioterapia, y el tumor recurrente resultante probablemente sea también resistente a la quimioterapia.
En consecuencia, existe una necesidad apremiante de identificación de nuevos planteamientos que se dirijan a las CCS que inician el tumor y sean resistentes a los fármacos citotóxicos para prevenir y/o tratar la recurrencia de la enfermedad y la propagación de metástasis distantes.
Compendio de la invención
La presente invención se basa en parte en la determinación de que PKC-0 se sobreexpresa en células tumorales CSC y no CSC y es importante para controlar la EMT además de la formación y el mantenimiento de células CSC y células tumorales no CSC. Los presentes inventores también han descubierto que es posible inhibir la EMT, la formación y el mantenimiento de células CSC y células tumorales no CSC, además de inducir la transición de células mesenquimales a epiteliales (MET) inhibiendo la actividad de esta enzima. Se propone, por lo tanto, que los inhibidores de PKC-0 son útiles para reducir o inhibir la proliferación de células CSC y células tumorales no CSC, incluida la inhibición de EMT, la estimulación o la inducción de MET y para reducir la recurrencia del cáncer, como se describe en lo sucesivo.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un inhibidor selectivo de PKC-0 y a un agente terapéutico para el cáncer para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer metastásico, en donde el cáncer metastásico comprende células madre cancerosas (CSC) y células tumorales no CSC, en donde el inhibidor de PKC-0 inhibe la formación, proliferación, mantenimiento o transición de las CSC epiteliales a mesenquimales (EMT) o estimula o induce la transición de las CSC mesenquimales a epiteliales (MET) de las CSC, y en donde el agente o terapia antineoplásica inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de las células tumorales no CSC.
Se describen en este documento métodos para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0. Estos métodos en general comprenden, consisten en o consisten esencialmente en poner en contacto la célula que sobreexpresa PKC-0 con una cantidad moduladora de EMT o MET, formación, proliferación, mantenimiento de un inhibidor de PKC-0. Adecuadamente, la célula que sobreexpresa PKC-0 se selecciona entre una célula CSC y una célula tumoral no CSC, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen células tumorales CSC y no CSC de mama, próstata, pulmón, vejiga, páncreas, colon, melanoma, hígado o glioma. La CSC puede ser una CSC de mama (p. ej., una CSC epitelial de mama, incluida una CSC epitelial de ducto de mama). Además, la célula tumoral no CSC puede ser una célula tumoral no CSC de mama (p. ej., una célula tumoral no CSC epitelial de mama, incluida una célula tumoral no CSC epitelial de ducto de mama). Adecuadamente, la célula que sobreexpresa PKC-0 se pone en contacto con una o más de una cantidad que inhibe la formación de células que sobreexpresan PKC-0, que inhibe la proliferación, que inhibe el mantenimiento, que inhibe EMT o que estimula/induce la MET del inhibidor de PKC-0. La sobreexpresión de PKC-0 -en la célula que sobreexpresa PKC-0 puede comprender la presencia de una cantidad en aumento de PKC-0 en el núcleo de la célula que sobreexpresa PKC-0.
En el contexto de la presente invención y cuando la célula que sobreexpresa PKC-0 es una CSC, la CSC expresa uno o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) marcadores de CSC seleccionados entre actividad de ABCB5, ALDH1, ABCG2, a6 integrina, a2 p1 integrina, p-catenina, CD15, CD13, CD20, CD24, CD26, CD29, CD44, CD90, CD133, CD166, CD271, c-Met, Hedgehog-Gli, Nestina, CXCR4, LGR5, Trop2 y Nodal-Activina. La CSC puede también expresar uno o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) marcadores de CSC seleccionados entre ALDH1, CD24, CD44, CD90, CD133, Hedgehog-Gli, a6 integrina. En ejemplos ilustrativos de este tipo, la CSC expresa CD24 y CD44 (p. ej., CD44alta, CD24baja).
Los ejemplos no limitativos de inhibidores de PKC-0 adecuados incluyen ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbono) o inorgánicas. En realizaciones específicas, el inhibidor de PKC-0 se selecciona entre inhibidores de moléculas pequeñas y moléculas de ácido nucleico (p. ej., unas que inhiben la transcripción o traducción de un gen de PKC-Q o que median la interferencia de ARN). El inhibidor de PKC-0 puede reducir la expresión del gen de PKC-Q o el nivel o la actividad funcional de un producto de expresión de PKC-0 (p. ej., reduce el nivel de un polipéptido de PKC-0, puede reducir la fosforilación mediada por PKC-0, puede inhibir la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR, puede reducir la unión de PKC-0 (p. ej. PKC-0 activo) a cromatina; puede reducir la inhibición mediada por PKC-0 del factor de intercambio de guanina, GIV/Girdin, puede reducir la inhibición medida por PKC-0 de la función de las células T reguladoras, o puede reducir la EMT mediada por PKC-0) a menos de aproximadamente 9/10, 4/5, 7/10, 3/5, / , 2/5, 3/10, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 10-1, 10­ 2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-1310-14 o aproximadamente 10-15 de la expresión del gen de PKC-Q, o el nivel o la actividad funcional de un producto de expresión de PKC-0 correspondiente en ausencia del inhibidor. El inhibidor de PKC-0 que se usará en el contexto de la presente invención es un inhibidor selectivo de PKC-0.
En algunas realizaciones, en donde dicho inhibidor de PKC-0 y dicho agente o terapia antineoplásica se usan para tratar o prevenir cáncer metastásico, los métodos para alterar por lo menos uno de (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de la célula que sobreexpresa PKC-0 pueden además comprender detectar la sobreexpresión de PKC-9 (p. ej., en relación a la expresión de PKC-9 en una célula normal (p. ej., una célula de mama normal)) en la célula que sobreexpresa PKC-0 antes de poner en contacto la célula que sobreexpresa PKC-0 con el inhibidor de PKC-0. En ejemplos no limitativos de este tipo, los métodos comprenden detectar la sobreexpresión de PKC-0 en una CSC. En otros ejemplos no limitativos, los métodos comprenden detectar la sobreexpresión de PKC-0 en una célula tumoral no CSC. Incluso en otros ejemplos no limitativos, los métodos pueden comprender detectar la sobreexpresión de PKC-0 en una célula CSC y en una célula tumoral no CSC.
En algunas realizaciones, en donde dicho inhibidor de PKC-0 y dicho agente o terapia antineoplásica se usan para tratar o prevenir cáncer metastásico, los métodos para alterar al menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de la célula que sobreexpresa PKC-0 pueden además comprender detectar la presencia o un aumento en la cantidad de PKC-0 en el núcleo de la célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., en relación a la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una célula normal (p. ej., una célula de mama normal)) antes de poner en contacto la célula que sobreexpresa PKC-0 con el inhibidor de pKC-0. En ejemplos ilustrativos de este tipo, los métodos comprenden detectar la presencia o un aumento de la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una CSC. En otros ejemplos ilustrativos, los métodos comprenden detectar la presencia o un aumento de la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una célula tumoral no CSC. Incluso en otros ejemplos ilustrativos, los métodos comprenden detectar la presencia o un aumento de la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una célula CSC y una célula tumoral no CSC.
En algunas realizaciones, en donde dicho inhibidor de PKC-0 y dicho agente o terapia antineoplásica se usan para tratar o prevenir cáncer metastásico, los métodos para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de la célula que sobreexpresa PKC-0 comprenden además detectar la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR en la célula que sobreexpresa PKC-0 antes de poner en contacto la célula que sobreexpresa PKC-0 con el inhibidor de PKC-0. En ejemplos representativos de este tipo, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR en una CSC. En otros ejemplos representativos, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR en una célula tumoral no CSC. Incluso en otros ejemplos representativos, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR en una CSC y en una célula tumoral no CSC.
En algunas realizaciones, en donde dicho inhibidor de PKC-0 y dicho agente o terapia antineoplásica se usan para tratar o prevenir cáncer metastásico, los métodos para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de la célula que sobreexpresa PKC-0 comprenden además detectar la unión de PKC-0 a cromatina en la célula que sobreexpresa PKC-0 antes de poner en contacto la célula que sobreexpresa PKC-0 con el inhibidor de PKC-0. En ejemplos no limitativos de este tipo, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 a cromatina en una CSC. En otros ejemplos no limitativos, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 a cromatina en una célula tumoral no c Sc . Incluso en otros ejemplos no limitativos, los métodos comprenden detectar la unión de PKC-0 a cromatina en una CSC y en una célula tumoral no CSC.
Adecuadamente, los métodos para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de la célula que sobreexpresa PKC-0 comprenden además detectar en la célula que sobreexpresa PKC-0 uno o más marcadores de CSC, como se describió ampliamente en lo precedente.
Se describen también en este documento métodos para tratar o prevenir cáncer (p. ej., cáncer metastásico) en un sujeto, en donde el cáncer comprende por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0. Estos métodos pueden en general comprender, consistir en o consistir esencialmente en administrar al sujeto un inhibidor de PKC-0 en una cantidad eficaz para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de al menos una célula que sobreexpresa PKC-0. Adecuadamente, el inhibidor de PKC-0 se administra al sujeto en una cantidad eficaz para inhibir (i) formación, (ii) proliferación, (iii) mantenimiento o (iv) EMT de por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0, o para estimular o inducir (v) MET de por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0. En algunas realizaciones, el inhibidor de PKC-0 es un inhibidor de PKC-0 selectivo. En el contexto de los métodos descritos en la presente invención para tratar o prevenir cáncer, el inhibidor de PKC-0 puede ser un inhibidor de PKC-0 no selectivo. Dicha por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0 se puede seleccionar entre una CSC y una célula tumoral no CSC.
En algunas realizaciones de la presente invención, el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, próstata, pulmón, vejiga, páncreas, colon, melanoma, hígado o glioma. Adecuadamente, el cáncer puede ser cáncer de mama. En algunas realizaciones, las CSC dan origen a células tumorales no CSC que son resistentes a las hormonas.
En algunas realizaciones de la presente invención, el uso de dicho inhibidor de PKC-0 selectivo y dicha terapia o agente antineoplásico en el tratamiento o la prevención de cáncer metastásico puede además comprender detectar la sobreexpresión de un gen de PKC-9 en una muestra de tumor obtenida del sujeto, en donde la muestra del tumor comprende por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC y/o una célula tumoral no CSC), antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
En algunas realizaciones de la presente invención, el uso de dicho inhibidor de PKC-0 selectivo y dicho agente o terapia antineoplásica en el tratamiento o la prevención de cáncer metastásico puede además comprender detectar la expresión de uno o más marcadores de CSC como se describió ampliamente en lo precedente en una muestra de tumor obtenida del sujeto, en donde la muestra de tumor comprende por lo menos una célula que sobreexpresa PKC-0, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
Incluso otro aspecto de la presente invención proporciona dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicho agente o terapia antineoplásica para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer (p. ej., cáncer metastásico) en un sujeto, en donde el cáncer comprende una CSC y una célula tumoral no CSC. Estos usos en general comprenden, consisten en o consisten esencialmente en administrar concurrentemente al sujeto (1) un inhibidor de PKC-0 en una cantidad eficaz para inhibir por lo menos uno de: (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de la CSC y/o la célula tumoral no CSC; y/o inhibir (iv) EMT de la CSC; y/o estimular o inducir (v) MET de la CSC, y (2) una terapia o agente antineoplásico que inhibe la proliferación, la supervivencia o la viabilidad de la célula tumoral no CSC, para tratar o prevenir así el cáncer. Adecuadamente, el inhibidor de PKC-0 se puede administrar al sujeto en una cantidad eficaz para inhibir (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de la CSC y/o la célula tumoral no CSC, y/o inhibir (iv) EMT de la CSC y/o estimular o inducir (v) MET de la CSC. El inhibidor de PKC-0 es un inhibidor de PKC-0 selectivo. La terapia o el agente antineoplásico se puede seleccionar entre radioterapia, cirugía, quimioterapia, terapia de ablación hormonal, terapia pro-apoptosis e inmunoterapia. En ejemplos ilustrativos de este tipo, la terapia o el agente antineoplásico se dirigen a las células que se dividen rápidamente o altera el ciclo celular o la división celular.
Adecuadamente, el uso inventivo de dicho inhibidor de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico puede además comprender identificar que el sujeto que se ha de tratar o que conlleva riesgo de desarrollar cáncer comprende la CSC y la célula tumoral no CSC antes de la co-administración. El cáncer se puede seleccionar entre cáncer de mama, pulmón, vejiga, páncreas, colon, melanoma, hígado o glioma. Adecuadamente, el cáncer se puede seleccionar entre cáncer de mama, próstata, pulmón, vejiga, páncreas, colon, melanoma, hígado o cerebro.
En algunas realizaciones, el uso inventivo de dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico para tratar o prevenir cáncer comprende además que la sobreexpresión de PKC-9 (p. ej., en relación a la expresión de PKC-0 en una célula normal (p. ej., una célula de mama normal)) se detecta en una muestra de tumor obtenida del sujeto que se ha de tratar, en donde la muestra del tumor comprende la CSC o la célula tumoral no CSC o ambas, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
En algunas realizaciones, el uso inventivo de dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico para tratar o prevenir cáncer comprende además que la presencia o el aumento de la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC (p. ej., en relación a la cantidad de PKC-0 en el núcleo de una célula normal (p. ej., una célula de mama normal)) se detecta en una muestra de tumor obtenida del sujeto que se ha de tratar, en donde la muestra del tumor comprende la célula CSC o la célula tumoral no CSC o ambas, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
En algunas realizaciones, el uso inventivo de dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico para tratar o prevenir cáncer comprende además detectar la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR en una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC de una muestra de tumor obtenida del sujeto que se ha de tratar, en donde la muestra del tumor comprende la célula CSC o la célula tumoral no CSC o ambas, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
En algunas realizaciones, el uso inventivo de dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico para tratar o prevenir cáncer comprende además detectar la unión de PKC-0 a cromatina en una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC de una muestra de tumor obtenida del sujeto que se ha de tratar, en donde la muestra del tumor comprende la célula CSC o la célula tumoral no CSC o ambas, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
En algunas realizaciones, el uso inventivo de dicho inhibidor selectivo de PKC-0 y dicha terapia o agente antineoplásico para tratar o prevenir cáncer comprende además detectar que la CSC expresa uno o más marcadores de CSC como se describió en general en lo precedente, antes de administrar el inhibidor de PKC-0 al sujeto.
Adecuadamente, el inhibidor de PKC-0 y el agente terapéutico antineoplásico se han de administrar en cantidades eficaces desde el punto de vista sinérgico.
Típicamente, uno o ambos del inhibidor de PKC-0 y la terapia o el agente antineoplásico se han de administrar en un esquema de rutina, por ejemplo, todos los días, por lo menos dos veces por semana, por lo menos tres veces por semana, por lo menos cuatro veces por semana, por lo menos cinco veces por semana, por lo menos seis veces por semana, todas las semanas, semana por medio, cada tres semanas, cada cuatro semanas, todos los meses, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses y cada seis meses.
En algunas realizaciones, la terapia antineoplásica probablemente expondrá al sujeto a un riesgo mayor de infección con un organismo patogénico. Por consiguiente, en estas realizaciones, los usos inventivos pueden además comprender administrar simultánea, secuencial o separadamente con el inhibidor de PKC-0 y/o la terapia/agente antineoplásico por lo menos un agente anti-infectivo eficaz contra una infección que se desarrolle o que presente un riesgo mayor de desarrollarse con la administración de una terapia o agente antineoplásico, en donde el agente anti­ infectivo se selecciona entre antimicrobianos, antibióticos, antivíricos, antifúngicos, antihelmínticos, antiprotozoarios y nematicidas.
Se describen también en este documento métodos para identificar agentes que son útiles para inhibir (i) formación, (ii) proliferación o (Ni) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC), o para inhibir (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para estimular o inducir (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer en un sujeto, en donde el cáncer comprende una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula c Sc y/o una célula tumoral no CSC). Estos métodos en general pueden comprender poner en contacto una preparación con un agente de prueba, en donde la preparación comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a por lo menos un fragmento biológicamente activo de un PKC-0, o una variante o su derivado; o (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la cual se puede producir una transcripción de un gen de PKC-9 o su porción, o (iii) un polinucleótido que comprende por lo menos una porción de una secuencia genética (p. ej., un elemento de transcripción) que regula la expresión de un gen de p KC-9, que está operativamente unido a un gen indicador. Una reducción detectada en el nivel y/o la actividad funcional (p. ej., como se describió en general anteriormente) del polipéptido, transcripción o porción de la transcripción, o un producto de expresión del gen indicador, en relación a un nivel normal o de referencia y/o actividad funcional en ausencia del agente de prueba, indica que el agente es útil para inhibir (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC), o para inhibir (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para estimular o inducir (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer.
Se describen también en este documento métodos para producir un agente para inhibir (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC), o para inhibir (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para estimular o inducir (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer en un sujeto, en donde el cáncer comprende una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC), como se describió ampliamente en lo precedente. Estos métodos en general pueden comprender ensayar un agente que se sospecha que inhibe PKC-0 como se describió en general en lo precedente; y sintetizar el agente en función de que se obtenga un resultado positivo para la inhibición. Adecuadamente, el método puede además comprender derivar el agente, y opcionalmente formular el agente derivado con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable para mejorar la eficacia del agente para inhibir (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC), o para inhibir (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para estimular o inducir (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer en un sujeto, en donde el cáncer comprende una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC).
Se describen también en este documento composiciones farmacéuticas para inhibir por lo menos uno de: (i) formación, (ii) proliferación o (iii) mantenimiento de una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC; y/o para inhibir (iv) EMT de una CSC; y/o para estimular (v) MET de una CSC; y/o para tratar o prevenir cáncer que comprende una célula CSC y/o una célula tumoral no CSC, como se describió ampliamente en lo precedente. Estas composiciones pueden en general comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de PKC-0 y un agente secundario/auxiliar que inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de la célula tumoral no CSC. En algunas realizaciones, el inhibidor de PKC-0 es un inhibidor de PKC-0 selectivo. En otras realizaciones, el inhibidor de PKC-0 es un inhibidor de PKC-0 no selectivo.
Se describe también el uso de un inhibidor de PKC-0 para alterar por lo menos uno de (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 o para tratar o prevenir cáncer que comprende una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una célula CSC o una célula tumoral no CSC), como se describió en general en lo precedente.
Se describe además el uso de un inhibidor de PKC-0 para mejorar la eficacia de una terapia o agente antineoplásico que inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de una célula tumoral no CSC.
Se describe también el uso de un inhibidor de PKC-0 y una terapia o agente antineoplásico que inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de una célula tumoral no c Sc para tratar o prevenir cáncer que comprende una CSC y una célula tumoral no CSC, como se describió en general en lo precedente. El inhibidor de p KC-0 y opcionalmente la terapia o el agente antineoplásico se pueden preparar o fabricar como medicamentos para este propósito.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es una representación gráfica que muestra que la estimulación de células MCF-7 en el modelo MCF-IM con el inductor de PKC, Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA) resulta en una EMT máxima. Las células MCF-7 no fueron estimuladas (NS) o fueron estimuladas con TNF-a (20 ng/ml), EGF (50 ng/ml), IL-6 (50 ng/ml), TGF-p (2,5 ng/ml) o PMA (20 ng/ml) durante 60 h. Se capturaron tres o más imágenes de contraste de fases para cada estímulo usando un microscopio Olympus 17X1. Se contaron por lo menos 200 células en cada imagen, y se calculó el porcentaje promedio (%) de células que se sometieron a EMT y posteriormente se trazó un gráfico, los resultados se exponen como el error estándar de la media ± promedio de dos experimentos independientes.
La Figura 1B es una representación fotográfica que muestra los cambios morfológicos de la EMT y los patrones de tinción intracelular diferencial del marcador de eMt , Laminina-5 en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 no fueron estimuladas (NS) o fueron estimuladas con PMA (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas) y luego o bien se tomaron fotografías por microscopia de contraste de fases o se tiñeron con un anticuerpo anti-laminina-5 (color verde) o tinte DAPI (tinte nuclear) (color azul) respectivamente. Las imágenes de microscopia confocal de MCF-7 se capturaron usando un microscopio Leica a 60x de magnificación.
La Figura 1C es una representación fotográfica que muestra una mayor cicatrización de heridas en el modelo MCF-IM. Se estimularon células MCF-7 durante 18 horas con (i) PMA (0,65 ng/ml) o (ii) se dejaron sin tratar ni estimular (NS). Las imágenes de contraste de fases del ensayo de cicatrización de heridas se capturaron posteriormente con Olympus 17X1 usando 10x de magnificación en puntos de tiempo, 0 h (línea roja) y 18 horas (línea verde). Se realizó una superposición (líneas roja y verde juntas en una imagen) de las dos imágenes para mostrar la capacidad de cicatrización de heridas del tratamiento.
La Figura 1D es una representación gráfica que muestra actividad de cinasa PKC superior en MCF-IM y en un modelo basal/metastásico. Las células MCF-7 no fueron estimuladas (NS) o fueron estimuladas (ST) con PMA (0,65 ng/ml). Se efectuaron ensayos de cinasa PKC basados en ELISA o bien en lisado de célula completas (WCL), extracto citoplásmico (CE) o extracto nuclear (NE) de células MCF-7 NS y ST y células MDA-MD 231. La absorbancia se midió a 450 nm. Los datos se graficaron como actividad relativa de cinasa en comparación con el control negativo. Los datos son representativos del error estándar de la media ± de tres experimentos independientes, y la significación estadística se determinó con una prueba de la t de dos colas usando GraphPad Prism 5.03.
La Figura 1E es una representación gráfica que muestra las estrategias de gating FACS para clasificar una subpoblación de células madre cancerosas CD44alta/CD24baja (CSC) en un modelo MCF-IM. Las células MCF-7 fueron o bien células no tratadas, no estimuladas (NS) o estimuladas (ST) con PMA (0,65 ng/ml) durante 60 horas. Las células luego se tiñeron con Hoechst, APC-anti-CD44 y cóctel PE-anti-CD24 antes de la clasificación FACS. La población de células madre cancerosas (CSC) se definió por tinción de CD44alta/CD24baja. Las puertas para subpoblaciones de tipo CSC y NCSC se efectuaron primero en poblaciones estimuladas con PMA y estas puertas se copiaron a la población no estimulada para confirmar que la población de tipo CSC estuviese debajo de 0,1% en células no estimuladas. El gráfico FACS representativo de 10 experimentos independientes se muestra para resaltar la estrategia de gating.
La Figura 1F es una representación gráfica que muestra que el modelo MCF-IM resulta en un alto porcentaje de subpoblación CD44alta/CD24baja o de tipo CSC. Las células MCF-7 fueron o bien no tratadas, no estimuladas (Ns ) o estimuladas (ST) con PMA (0,65 ng/ml) durante 60 horas. Se llevó a cabo el análisis FACS usando las estrategias de gating descritas en la Figura 1E y luego se graficó el % de la media de la subpoblación de tipo CSC (las barras de error son los errores estándar) de diez experimentos independientes.
La Figura 1G es una representación fotográfica y gráfica que muestra que el modelo MCF-IM conduce a la generación de mamosferas. El ensayo de mamosferas se realizó con 4 x 104 células MCF-7 / pocillo en placas de 6 pocillos de unión ultra baja. Las células fueron o bien (A) no estimuladas (NS) o estimuladas con (B) PMA (0,65 ng/ml) o (C) TNF-a (10 ng/ml). Las imágenes se capturaron usando microscopia de contraste de fases para el ensayo de mamosferas después de 6 días del comienzo del ensayo, y se trazó un gráfico. El experimento se efectuó por duplicado y se contó el promedio de mamosferas de cada pocillo. Los datos representan ± SE promedio de dos experimentos independientes.
La Figura 1H es una representación gráfica que muestra que las subpoblaciones de tipo CSC inducidas tienen un perfil de transcripción distinto en el modelo MCF-IM. Los análisis de transcripción se llevaron a cabo en células MCF-7, o bien no estimuladas (NS), o estimuladas con PMA (0,65 ng/ml durante 60 horas) y las células de tipo madre cancerosas (tipo CSC) y las células de tipo madre no cancerosas (NCSC) se clasificaron con FACS, para genes CD44, laminina-5, uPAR, Fibronectina e Integrina-p. Se efectuó PCR en tiempo real TaqMan® en ADNc sintetizado de ARN total aislado de las tres poblaciones anteriormente mencionadas. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y la cantidad de veces de cambio, en comparación con células no estimuladas, se muestra encima de las barras de error. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de tres experimentos independientes.
La Figura 1I es una representación gráfica que muestra que las subpoblaciones de tipo CSC y NCSC inducidas resultan en una menor expresión de los miembros de la familia miR200 en el modelo MCF-IM. Los niveles de ADNc MicroARN para miR 200b y miR 200c se midieron por análisis en tiempo real de microARN TaqMan® de células MCF-7 o bien no tratadas, no estimuladas (NS) o estimuladas con PMA (0,65 ng/ml durante 60 horas). Células de tipo madre cancerosas de subpoblaciones clasificadas con FACS (tipo CSC) y células de tipo madre no cancerosas (NCSC). Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los niveles de referencia RNU6B. Los niveles de MicroARN se expresan en copias arbitrarias, y los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de tres experimentos independientes.
La Figura 2A es una representación gráfica que muestra que el inhibidor de PKC de amplio espectro, bisindolilmaleimida-I, inhibe la EMT en el modelo MCF-IM. Las imágenes de microscopia de contraste de fases de células MCF-7 no estimuladas (NS) y estimuladas con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas.) (ST) se capturaron o bien sin pretratamiento con inhibidor específico de PKM (ST-BIS), con 1 h de pretratamiento de bisindolilmaleimida (1 pm) antes de la estimulación con PMA (sT+BIS).
La Figura 2B es una representación gráfica que muestra que solamente una muy alta concentración de bisindolilmaleimida-I pero no de Go 6976 inhibe la subpoblación de tipo CSC CD44 alta CD24 baja en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 se pre-incubaron o bien con vehículo solo o con bisindolilmaleimida-I (100 nm y 1 pm) o Go6976 (1 pm), antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/ul durante 60 horas.) (ST). Las células después se tiñeron con Hoechst 33528, APC-anti-CD44 y PE-anti-CD24 por 20 minutos en hielo y se sometieron a análisis FACS. Los círculos en el gráfico FACS indican gating apropiado de la subpoblación de tipo CSC CD44alta/CD24baja y el % de subpoblación de tipo CSC se muestra encima de las puertas respectivamente.
La Figura 2C es una representación gráfica alternativa de los datos presentados en la Figura 2B. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2D es una representación fotográfica que muestra que 1 pm de Bisindolilmaleimida-I reduce la formación de mamosferas en el modelo MCF-IM. El ensayo de mamosferas se realizó con 4 x 104 células MCF-7/pocillo en una placa de 6 pocillos de unión ultra baja. Las células MCF-7 se pre-incubaron o bien con vehículo solo o con bisindolilmaleimida-I (1 pm durante 1 h) antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/ml durante 6 días) (ST) o se dejaron sin estimular (NS). Las imágenes microscópicas de contraste de fases se tomaron después de 6 días del ensayo, y se contaron solamente las mamosferas superiores a 60.
La Figura 2E es una representación gráfica alternativa de los datos presentados en la Figura 2B. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2F es una representación gráfica que muestra que el tratamiento con 100 nM de bisindolilmaleimida-I no puede inhibir la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM. Se dejaron células MCF-7 o bien sin tratar, sin estimular (NS), o se pre-trataron con bisindolilmaleimida-I (100 nM) durante 1 hora antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas), o se estimularon (ST). El análisis PCR en tiempo real TaqMan® para genes de EMT/CSC-laminina-5, uPAR y CD44 se realizó en ADNc sintetizado de ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los valores de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2G es una representación gráfica que muestra que el tratamiento con 1 pM de bisindolilmaleimida-I inhibe la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 o bien fueron no tratadas, no estimuladas (NS), o pretratadas con bisindolilmaleimida-I (1 pm) durante 1 hora antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas) (ST). El análisis PCR en tiempo real TaqMan® para genes de EMT/CSC-laminina-5, uPAR y CD44 se efectuó en ADNc sintetizado de ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los valores de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2H es una representación gráfica que muestra que el tratamiento con 1 pM Go6976 no pudo inhibir la transcripción de genes e Mt/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 o bien se dejaron sin tratar, no se estimularon (NS) o se pretrataron con Go6976 (1 pM) durante 1 horas antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/pl, durante 60 horas) (ST). El análisis de PCR en tiempo real TaqMan® para genes EMT/CSC-laminina-5, uPAR y CD44 se realizó en ADNc sintetizado de ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarios y se normalizaron a los valores de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2I es una representación fotográfica que muestra que el inhibidor de PKC de amplio espectro, bisindolilmaleimida-I, inhibe la EMT en un modelo basal/metastásico. Las imágenes de microscopia de contraste de fases de células MDA-MB 231 se capturaron o bien sin pretratamiento del inhibidor específico de PKC (-BIS) o con tratamiento de Bisindolilmaleimida (4 pM) (+BIS).
La Figura 2J es una representación gráfica que muestra que la bisindolilmaleimida-I inhibe la subpoblación de tipo CSC CD44 alta CD24 baja en modelo basal/metastásico. Las células MDA-MB 231 se incubaron o bien con vehículo solo o con bisindolilmaleimida-I (4 pM). Las células luego se tiñeron con Hoechst 33528, APC-anti-CD44 y PE-anti-CD24 durante 20 minutos en hielo y se sometieron a análisis FACS. El porcentaje de subpoblación de tipo CSC se muestra en el gráfico de barras. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 2K es una representación gráfica que muestra que el tratamiento con bisindolilmaleimida-I inhibe la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en un modelo basal/metastásico. Las células MDA-MB 231 se incubaron o bien con vehículo solo o con bisindolilmaleimida-I (4 pm). El análisis de PCR en tiempo real TaqMan® para genes de EMT/CSC-laminina-5, uPAR y CD44 se realizó en ADNc sintetizado de ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los niveles de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3A es una representación fotográfica que muestra que una muy baja concentración de un inhibidor del péptido PKC-0 suprime la EMT en el modelo MCF-IM. Las imágenes de microscopía de contraste de fases de células MCF-7 no estimuladas (NS) y PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas.) estimuladas (ST) se capturaron o bien sin pretratamiento del inhibidor o con 24 horas de pretratamiento del péptido específico de PKC-0 (30 pm) antes de la estimulación con PMA.
La Figura 3B es una representación gráfica que muestra que el inhibidor del péptido PKC-0 inhibe la subpoblación de tipo CSC CD44 alta c D24 baja en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 se preincubaron con vehículo solo o con péptido específico PKC-0 (30 pm), antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas) (ST). Las células luego se tiñeron con Hoechst 33528, APC-anti-CD44 y PE-anti-CD24 por 20 minutos en hielo y se sometieron a análisis FACS. Se efectuó el gating apropiado de la subpoblación de tipo CSC CD44alta/CD24baja y se trazó un gráfico de barras. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3C es una representación gráfica que muestra que el tratamiento con el inhibidor del péptido PKC-0 reduce la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 se preincubaron con vehículo solo o con el péptido específico PKC-0 (30 pm), antes de la estimulación con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas) (ST). El análisis PCR en tiempo real TaqMan® para el gen EMT/CSC-CD44 se efectuó en ADNc sintetizado con ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los valores de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3D es una representación gráfica que muestra que la atenuación de PKC-0 resulta en una supresión de la subpoblación de tipo c Sc inducida por PMA mientras que la atenuación de PKC-p potencia la subpoblación de tipo CSC inducida por PMA en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 se transfectaron o bien con ARNip control (mock), PKC-0 ARNip o PKC-p ARNip durante 48 horas y luego se dejaron sin tratar, sin estimular (NS) o se estimularon con PMA (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas.). El análisis FACS se llevó a cabo posteriormente tiñendo las células con cóctel de tinción de anticuerpos Hoechst, APC-anti-CD44 y PE-anti-CD24. Se realizó el gating apropiado de la subpoblación de tipo CSC y el % de subpoblación de tipo CSC se muestra en un gráfico de barras. Los datos representan el error estándar de la media (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3E es una representación gráfica que muestra que la atenuación de PKC-0 reduce la formación de mamosferas en el modelo MCF-IM. El ensayo de mamosferas se realizó con 4 x 104 MCF-7 células/pocillo en placas de 6 pocillos de unión ultra baja. Las células MCF-7 se transfectaron con ARNip control (mock) o PKC-0 ARNip durante 48 horas y luego se dejaron sin tratar, sin estimular (NS) o se estimularon con PMA (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas). Las imágenes microscópicas de contraste de fases de las mamosferas se tomaron después de 6 días del ensayo y se contaron solamente las mamosferas de más de 60 pm, y se trazó un gráfico de barras. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3F es una representación gráfica que muestra que la atenuación de PKC-0 resulta en la inhibición de la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM mientras que la atenuación de PKC-p no presenta esta inhibición en el modelo MCF-IM. Se transfectaron células MCF-7 o bien con ARNip control (mock), p KC-0 ARNip o PKC-p ARNip durante 48 horas y luego se dejaron sin tratar, sin estimular (NS) o se estimularon con (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas). El análisis PCR en tiempo real TaqMan® para genes de EMT/CSC uPAR y CD44 se efectuó en ADNc sintetizado de ARN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarias y se normalizaron a los valores de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en números de cambio en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3G es una representación fotográfica que muestra que la sobreexpresión de la mutación PKC-0 NLS (señal de localización nuclear) reduce la entrada de PKC-0 en el núcleo. La sobreexpresión de PKC-0 WT (tipo salvaje) o PKC-0 NLS se efectuó en el modelo MCF-IM durante 72 horas antes de la microscopia confocal.
La Figura 3H es una representación gráfica que muestra que la sobreexpresión de la mutación de PKC-0 NLS (señal de localización nuclear) reduce el % CSC el modelo MCF-IM. La sobreexpresión del vector control, PKC-0 WT (tipo salvaje) o PKC-0 NLS se realizó en el modelo MCF-IM durante 72 horas antes de estimular las células (0,65 ng/ml durante 60 horas). El análisis FACS se realizó posteriormente tiñendo las células con cóctel de tinción de anticuerpos Hoechst, APC-anti-CD44 y PE-anti-CD24. Se efectuó el gating apropiado de la subpoblación de tipo CSC y se calculó el % de incremento en la subpoblación de tipo CSC encima del control, y se muestra en un gráfico de barras. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 3I es una representación gráfica que muestra que la sobreexpresión de la mutación de PKC-0 NLS (señal de localización nuclear) resulta en la inhibición de la transcripción de genes de EMT/CSC inducibles clave en el modelo MCF-IM. La sobreexpresión del vector control, PKC-0 WT (tipo salvaje) o PKC-0 NLS se efectuó en el modelo MCF-IM durante 72 horas antes de estimular las células (0,65 ng/ml durante 60 horas). El análisis PCR en tiempo real TaqMan® para genes de EMT/CSC uPAR y CD44 se realizó en ADNc sintetizado a partir de ADN total. Los valores del ciclo umbral (Ct) generados para cada punto de tiempo se convirtieron a números de copias arbitrarios y se normalizaron a los niveles de referencia de Ciclofilina A. Los niveles de ARNm se expresan en el número de cambios en comparación con células no estimuladas. Los datos representan el error estándar de la media ± (SE) de dos experimentos independientes.
La Figura 4A es una representación gráfica que muestra que PKC-0 se asocia con cromatina en la región del promotor del gen CD44 en células madre de cáncer. Se efectuaron ensayos ChIP en ADN inmunoprecipitado con anticuerpos anti-PKC-0 en MCF-IM, EIMLE-IM y en el modelo basal metastásico. Se realizó el análisis PCR en tiempo real en estos ADN inmunoprecipitados usando los cebadores del promotor de CD44. Los datos se muestran gráficamente como el cociente de enriquecimiento de ChIP de ADN inmunoprecipitado en relación con el control de anticuerpo nil y se normalizaron contra el ADN de ingreso total. Los resultados representan el cociente de enriquecimiento de ChIP de uno de los tres experimentos independientes.
Las Figuras 4B y C son representaciones gráficas que muestran que la forma activa de PKC-0, PKC-0 (fosfo) se enriquece en gran medida con cromatina en la región del promotor de genes inducibles de CSC en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 o bien no fueron estimuladas (NS) o fueron estimuladas con PMA (ST) (0,65 ng/pl durante 60 horas). Luego se efectuaron los ensayos ChIP en ADN inmunoprecipitado con anticuerpos anti-PKC-0 (fosfo). Los análisis de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en estos ADN inmunoprecipitados usando los cebadores del promotor de (B) uPAR y (C) CD44. Los datos se muestran gráficamente como el cociente de enriquecimiento de ChIP de ADN inmunoprecipitado al control de anticuerpo nil, y se normalizaron contra el ADN de ingreso total. Los resultados representan el cociente de enriquecimiento ChIP de uno de los tres experimentos independientes.
La Figura 4D es una representación gráfica que muestra que la PKC-0 interactúa físicamente con Pol II en el gen inducible por CSC uPAR en el modelo MCF-IM. Se efectuó ChIP secuencial en células MCF-7 no estimuladas (NS) o estimuladas con PMA (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas). Se llevó a cabo inmunopreciptación con cromatina primaria y luego inmunoprecipitación con cromatina secundaria en cromatina recuperada de la inmunoprecipitación primaria. Los anticuerpos utilizados fueron: ChIP primario con anticuerpo anti Pol II y ChIP secundario con anticuerpo anti-PKC-0. El análisis PCR en tiempo real se realizó en ADN inmunoprecipitado usando cebadores dirigidos al promotor de uPAR. Los datos se exhiben gráficamente como el cociente de enriquecimiento de ChIP de ADN inmunoprecipitado en relación con el anticuerpo nil control y se normalizaron contra el ADN de ingreso total. "Anticuerpo nil" se refiere a la muestra en la que no se ha añadido ningún anticuerpo (ni primario ni secundario) al ADN reticulado. Los resultados representan el cociente de enriquecimiento de ChIP de uno de tres experimentos independientes.
La Figura 4E es una representación gráfica que muestra que la inhibición farmacológica o la atenuación de PKC-0 reduce su asociación con cromatina en el promotor de uPAR en el modelo MCF-IM. Las células MCF-7 se preincubaron primero durante 1 hora con vehículo solo o con bisindolilmaleimida-I (1 pM) y posteriormente se estimularon (ST) con PMA (0,65 ng/pl durante 60 horas). En un experimento separado, las células se transfectaron con ARNip control (mock) o PKC-0 ARNip seguido de estimulación con PMA (ST) (0,65 ng/ml durante 60 horas). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se efectuaron ensayos ChIP en ADN inmunoprecipitado con anticuerpos anti-PKC-0. El análisis PCR en tiempo real se realizó en estos a Dn inmunoprecipitados usando el cebador del promotor de uPAR. Los datos se muestran gráficamente como el cociente de enriquecimiento de ChIP de ADN inmunoprecipitado en relación con el anticuerpo nil, y se normalizaron contra el ADN de ingreso total. Los resultados representan el cociente de enriquecimiento de ChIP de uno de los tres experimentos independientes.
La Figura 5 es una representación fotográfica que muestra la tinción nuclear de PKC-0 activa en tejido de cáncer de mama invasivo y normal humano. La tinción nuclear de tejido de cáncer de mama y normal humano se llevó a cabo usando anticuerpo anti-PKC-0 (fosfo) y se tomaron fotomicrografías.
La Figura 6A es una representación gráfica que muestra ensayos de cinasa basados en ELISA de PKC para el compuesto 27 inhibidor de actividad específica de PKC-0 (C27). La actividad de la cinasa se calculó después de restar pocillos blanco.
La Figura 6B es una representación gráfica que muestra ensayos de cinasa basados en ELISA de PKC de extracto nuclear o extracto citoplásmico - de MCF-IM sin (-) o con (+) inhibidor de C27. Los ensayos se llevaron a cabo sin inmunoprecipitados específicos para actividad global de PKC.
La Figura 6C es una representación gráfica que muestra el análisis FACS de la subpoblación de CSC CD44alta/CD24baja en el modelo MCF-IM. Se estimularon células MCF-7 con PMA (0,65 ng/ml durante 60 h) o bien sin pretratamiento del compuesto 27 inhibidor de actividad específica de PKC-0 (-C27) o con pretratamiento con el compuesto 27 (+C27) (1 pm durante 24 horas).
La Figura 6D es una representación gráfica que muestra la expresión del ARN por PCR en tiempo real con muestras.
Las Figuras 6E y F son representaciones gráficas que muestran actividad de p50 nuclear o p65 nuclear después del tratamiento de MCF-IM o bien con vehículo solo o con el inhibidor específico de PKC-0, el compuesto 27 (C27).
La Figura 6G es una representación fotográfica y gráfica que muestra la inmunotransferencia de extractos nucleares de MCF-IM para NF-kB p65 fosforilado en serina 468 (p468) después del tratamiento con (+) o sin (-) el compuesto 27. Se usaron 15 pg de la proteína para inmunotransferencias western y se usó el anticuerpo histona H3 como el control nuclear.
La Figura 6H es una representación fotográfica y gráfica que muestra la inmunotransferencia de la fracción nuclear de MCF-IM para NF-kB p65 global después del tratamiento con (+) o sin (-) el compuesto 27. Los análisis densitométricos efectuados usando el software Image J proporcionaron inmunotransferencias western.
La Figura 6I es una representación fotográfica y gráfica que muestra inmunotransferencia de la fracción citoplásmica de MCF-IM para NF-kB p65 global después del tratamiento con (+) o sin (-) el compuesto 27. Los análisis densitométricos efectuados usando el software Image J proporcionaron las inmunotransferencias western.
La Figura 6J es una representación fotográfica que muestra el análisis ChIP intermedio de células MCF-IM estimuladas con anticuerpo anti-PKC-0. (WCL) es el lisado de células enteras para los experimentos de inmunoprecipitación (IP). WCL se sometió a inmunotransferencia con anticuerpo anti-PKC-0. (-Ab) es la ausencia de anticuerpo. Inmunotransferencia con anticuerpos anti-ARN -ARN Pol II, anti-p65 o anticuerpo anti-PKC-0.
Todos los resultados representan o bien el error estándar de la media ± de tres experimentos independientes o un experimento representativo de tres réplicas (N=3) **, P<0,01, *, P<0,05 y ns, no significativo.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnico-científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Si bien cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden usar en la práctica o los ensayos de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Los artículos "un" y "uno/una" se usan en este documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Las expresiones "administración concurrente" o "administrar concurrentemente" o "co-administrar" y similares se refieren a la administración de una sola composición que contiene dos o más activos, o a la administración de cada activo como composiciones separadas y/o administradas por rutas separadas o bien contemporánea o simultánea o secuencialmente dentro de un periodo de tiempo lo suficientemente breve, de forma tal que el resultado eficaz sea equivalente a aquel obtenido cuando todos esos activos se administran como una sola composición. Por "simultáneamente" se entiende que los agentes activos se administran prácticamente al mismo tiempo, y convenientemente juntos en la misma formulación. Por "contemporáneamente" se entiende que los agentes activos se administran próximos en tiempo, p. ej., un agente se administra dentro de aproximadamente un minuto hasta dentro de aproximadamente un día antes o después del otro. Cualquier tiempo contemporáneo es útil. No obstante, por lo general cuando los agentes no se administren simultáneamente, se administrarán dentro de aproximadamente un minuto hasta dentro de aproximadamente ocho horas y adecuadamente dentro de menos de aproximadamente una a aproximadamente cuatro horas. Cuando se administran contemporáneamente, los agentes se administran adecuadamente en el mismo sitio en el sujeto. La expresión "mismo sitio" incluye la ubicación exacta, pero puede ser dentro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 centímetros, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 centímetros. El término "separadamente" tal como se usa en este documento significa que los agentes se administran en un intervalo, por ejemplo en un intervalo de aproximadamente un día a varias semanas o meses. Los agentes activos se pueden administrar en cualquier orden. El término "secuencialmente", tal como se emplea en la presente memoria, significa que los agentes se administran en secuencia, por ejemplo en un intervalo o intervalos de minutos, horas, días o semanas. Si es apropiado, los agentes activos se pueden administrar en un ciclo de repetición regular.
El término "agente" o "agente modulador" incluye un compuesto que induce un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El término también abarca ingredientes farmacológicamente activos y farmacéuticamente aceptables de esos compuestos mencionados específicamente en este documento, entre otros, sales, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos activos, análogos y similares. Cuando se usa el término anterior, entonces se entiende que incluye el agente activo per se así como también sales, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos, análogos farmacéuticamente aceptables, etc. El término "agente" no se debe interpretar en su sentido limitado sino que se extiende a moléculas pequeñas, moléculas proteináceas como péptidos, polipéptidos y proteínas, además de composiciones que las comprenden, y moléculas genéticas tales como ARN, ADN y miméticos y sus análogos químicos, así como también agentes celulares. El término "agente" incluye una célula que es capaz de producir y segregar un polipéptido denominado en este documento polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ese polipéptido. Por lo tanto, el término "agente" se extiende a constructos de ácido nucleico que incluyen vectores tales como vectores víricos o no víricos, vectores de expresión y plásmidos para expresión y segregación en una gama de células.
Por "molécula de unión al antígeno" se entiende una molécula que tiene afinidad de unión hacia un antígeno diana. Se entenderá que esta expresión se extiende a inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulina y marcos de proteínas no derivadas de inmunoglobulina que exhiben actividad de unión al antígeno.
"Actividad antigénica o inmunogénica" se refiere a la capacidad de un polipéptido, fragmento, variante o derivado de acuerdo con la invención de producir una respuesta antigénica o inmunogénica en un animal, adecuadamente un mamífero, al que se le administra, en donde la respuesta incluye la producción de elementos que se unen específicamente al polipéptido o su fragmento.
"Aralquilo" significa alquilo, como se definió anteriormente, que se sustituye con un grupo arilo como se definió anteriormente, p. ej., -CH2fenilo, -(CH2)2fenilo, -(CH2)3fenilo, -H2CH(CH3)CH2fenilo y similares, y sus derivados.
Tal como se emplea en la presente memoria, "aromático" o "arilo" significa cualquier anillo de carbono estable monocíclico o bicíclico de hasta 7 átomos en cada anillo, en donde por lo menos un anillo es aromático. Los ejemplos de dichos elementos arilo incluyen, aunque sin limitarse a ello, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antrilo acenaftilo.
En ciertos casos, los sustituyentes se pueden definir con un intervalo de carbonos que incluye cero, como alquilen (C0-C6)arilo. Si se toma que el arilo es fenilo, esta definición incluiría el fenilo propiamente dicho, así como también, por ejemplo, -CH2Ph,-CH2CH2Ph, CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph.
Se ha de reconocer también que los compuestos descritos en este documento pueden poseer centros asimétricos y por lo tanto son capaces de existir en más de una forma estereoisomérica. La invención se refiere por lo tanto a compuestos en forma isomérica sustancialmente pura en uno o más centros asimétricos, p. ej., superiores a aproximadamente 90% ee, tal como 95% o 97% ee o más de 99% ee, así como también mezclas, incluidas mezclas racémicas de estos. Dichos isómeros pueden ser naturales o se pueden preparar por síntesis asimétrica, por ejemplo usando intermedios quirales, o por resolución quiral.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "se une específicamente", "específicamente inmunointeractivo" y similares, cuando hace referencia a una molécula de unión al antígeno, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Por consiguiente, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, las moléculas de unión al antígeno especificadas se unen a un antígeno particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas o antígenos presentes en la muestra. La unión específica a un antígeno bajo dichas condiciones puede requerir que una molécula de unión al antígeno se seleccione para su especificidad hacia un antígeno particular. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígenos se pueden dirigir a un antígeno de proteína seleccionado, que se une a ese antígeno pero no a otras proteínas presentes en una muestra. Se puede emplear una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar moléculas de unión a antígenos específicamente inmunointeractivas con una proteína particular. Por ejemplo, se usan habitualmente los inmunoensayos ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunointeractivos con una proteína. Véase Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden emplear para determinar inmunorreactividad específica.
La expresión "célula madre cancerosa" o CSC se refiere a una célula que exhibe capacidad de iniciar un tumor o de sostener un tumor, incluida la capacidad de proliferarse ampliamente, formar nuevos tumores y mantener el desarrollo del cáncer, es decir, células con potencial proliferativo indefinido que promueven la formación y el crecimiento de tumores. Las CSC son biológicamente distintas de las células tumorales en masa y poseen características asociadas con las células madre, concretamente la capacidad de autorrenovarse y propagarse para dar origen a todos los tipos de células que se hallan en una muestra de cáncer particular. La expresión "célula madre cancerosa" o CSC incluye tanto la alteración de genes en las células madre (SC) como la alteración de genes en una célula que se convierte en una CSC. En realizaciones específicas, las CSC de mama son adecuadamente CD24+ CD44+, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen CD44alta CD24baja.
Por "secuencia codificante" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuye al código para el producto de polipéptidos de un gen. En contraste, la expresión "secuencia no codificante" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuye al código para el producto de polipéptidos de un gen.
En toda la memoria, a menos que el contexto exija otra cosa, se entenderá que el término y la expresión "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por ende, el uso de la expresión "que comprende" y similares indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes. Por "que consiste en' se entiende que incluye, y se limita a, lo que sea que siga a la frase "que consiste en'. Por lo tanto, la frase "que consiste en' indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios y que no puede estar presente ningún otro elemento. Por "que consiste esencialmente en' se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. Por consiguiente, la frase "que consiste esencialmente en' indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes, dependiendo de si afectan o no la actividad o acción de los elementos enumerados.
Por "corresponde a" o "correspondiente a" se entiende una secuencia de ácido nucleico que exhibe identidad de secuencia sustancial con una secuencia de ácido nucleico de referencia (p. ej., por lo menos aproximadamente 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o incluso hasta 100% de identidad de secuencia con toda o con una porción de la secuencia de ácido nucleico de referencia) o una secuencia de aminoácidos que exhibe similitud o identidad de secuencia sustancial con una secuencia de aminoácidos de referencia (p. ej., por lo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o incluso hasta 100% identidad o similitud de secuencia con toda o una porción de la secuencia de aminoácidos de referencia).
El término "derivar" y similares se refieren a producir u obtener un compuesto de otra sustancia por reacción química, p. ej., añadiendo uno o más grupos reactivos al compuesto, sometiendo a reacción el compuesto con un grupo funcionalreactivo de adición, etc.
El término "derivado" se refiere a un compuesto que tiene una estructura derivada (p. ej., por transformación química) de la estructura de un compuesto precursor (p. ej., un compuesto descrito en este documento) y cuya estructura es suficientemente similar a aquellas descritas en la presente invención y, en función de esa similitud, el experto en la técnica esperaría que se exhiban las mismas actividades o similares y utilidades que en los compuestos reivindicados, o que se induzcan, como un precursor, las mismas o similares actividades y utilidades que en los compuestos reivindicados. Los derivados ilustrativos de moléculas pequeñas incluyen sales, ésteres, amidas, sales de ésteres o amidas y N-óxidos de un compuesto precursor. Con referencia a polipéptidos, el término "derivado" se refiere a un polipéptido que ha derivado de la secuencia básica por modificación, por ejemplo por conjugación o formación de complejo con otros restos químicos o por técnicas de modificación post-traducción, como se entendería en la técnica. El término "derivado" también incluye dentro de su alcance, alteraciones que se han efectuado a una secuencia precursora, incluidas adiciones o eliminaciones que proporcionan moléculas equivalentes funcionales. La preparación de derivados se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica.
El término "diferenciación" de células madre cancerosas, tal como se emplea en este documento, se refiere tanto al cambio de células madre cancerosas a progenitoras de tumores pluripotentes como al cambio de progenitoras de tumores pluripotentes a progenitoras de tumores unipotentes y/o células tumorales terminalmente diferenciadas.
Por "cantidad eficaz", en el contexto de tratar o prevenir una afección, se entiende la administración de una cantidad de un agente o composición a un individuo que necesita dicho tratamiento o profilaxis, o bien en una sola dosis o como parte de una serie, que es eficaz para la prevención de incurrir en un síntoma, mantener bajo control dichos síntomas y/o tratar síntomas existentes, de esa afección. La cantidad eficaz variará dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se ha de tratar, el grupo taxonómico del individuo que se ha de tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que se pueda determinar mediante ensayos de rutina.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "transición epitelial a mesenquimal" (EMT) se refiere a la conversión de un fenotipo epitelial a mesenquimal, que es un proceso normal del desarrollo embrionario. La EMT es también un proceso mediante el cual las células epiteliales con lesiones que funcionan como transportadores de iones y fluido se convierten en células mesenquimales que remodelan la matriz. En carcinomas, esta transformación típicamente resulta en una morfología celular alterada, expresión de proteínas mesenquimales y aumento de la capacidad de invasión. Los criterios para definir EMT in vitro implican la pérdida de polaridad celular epitelial, la separación en células individuales y la posterior dispersión después de la adquisición de motilidad celular (véase, Vincent-Salomon et al., Breast Cancer Res. 2003; 5(2): 101-106). Las clases de moléculas que cambian en expresión, distribución y/o función durante la EMT, y que están causalmente implicadas, incluyen factores de crecimiento (p. ej., factor de crecimiento transformante (TGF)-p, wnts), factores de transcripción (p. ej., Snail, SMAD, LEF y p-catenina nuclear), moléculas del eje de adhesión de una célula a otra (cadherinas, cateninas), moduladores citoesqueléticos (familia Rho) y proteasas extracelulares (metaloproteinasas de matriz, activadores de plasminógeno) (véase Thompson et al., Cancer Research 65, 5991-5995, Jul. 15, 2005).
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "transición mesenquimal a epitelial" (MET) es un proceso biológico reversible que implica la transición de células mesenquimales móviles, multipolares o con forma de huso a conjuntos planos de células polarizadas llamados epitelios. MET es el proceso inverso de EMT. Las MET ocurren en desarrollo normal, metástasis de cáncer y reprogramación inducida de células madre pluripotentes.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "epitelio" se refiere a la cubierta de superficies internas y externas del cuerpo, incluido el revestimiento de los vasos y otras cavidades pequeñas. Consiste en un conjunto de células epiteliales que forman una lámina o capa relativamente delgada debido a que las células constituyentes son mutua y extensivamente adherentes lateralmente por las uniones de una célula a otra. La capa se polariza y tiene laterales apicales y basales. A pesar del riguroso regimiento de las células epiteliales, el epitelio tiene cierta plasticidad y las células en una capa epitelial pueden alterar la forma, como cambio de plano a columnar, o perforarse en un extremo y expandirse en el otro. No obstante, esto tiende a ocurrir en grupos de células más que en forma individual (véase, Thompson et al., 2005, supra).
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "mesénquima" se refiere a la parte del mesodermo embrionario, que consiste en células no especializadas empaquetadas en forma suelta dispuestas en una sustancia triturada gelatinosa, a partir de la cual se desarrolla tejido conjuntivo, hueso, cartílago y los sistemas circulatorio y linfático. La mesénquima es un conjunto de células que forman una red de tejido relativamente difusa. La mesénquima no es una capa celular completa, y las células típicamente tienen solamente puntos en su superficie vinculados en adhesión a sus vecinas. Estas adhesiones pueden implicar asociaciones con cadherina (véase, Thompson et al., 2005, supra).
El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de una secuencia codificante, la expresión implica la transcripción de la secuencia codificante a ARNm y la traducción de ARNm a uno o más polipéptidos. A la inversa, la expresión de una secuencia no codificante implica la transcripción de la secuencia no codificante a una transcripción solamente.
Por "vector de expresión" se entiende cualquier elemento genético capaz de dirigir la transcripción de un polinucleótido contenido dentro del vector y adecuadamente la síntesis de un péptido o polipéptido codificado por el polinucleótido. Los expertos en la técnica conocen dichos vectores de expresión.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "función" se refiere a una función biológica, enzimática o terapéutica.
El término "gen", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a todas y cada una de las regiones codificantes discretas del genoma de la célula, así como también regiones no codificantes y reguladoras asociadas. El término significa el marco de lectura abierta que codifica polipéptidos específicos, intrones y secuencias de nucleótidos no codificantes adyacentes en 5' y 3' implicados en la regulación de la expresión. En este sentido, el gen puede además comprender señales de control como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o poliadenilación naturalmente asociadas con un gen determinado, o señales de control heterólogas. Las secuencias de a Dn pueden ser ADNc o ADN genómico, o un fragmento de estos. El gen puede introducirse en un vector apropiado para mantenimiento extracromosómico o para integración en el hospedante.
El término "grupo", según se aplica a especies químicas, se refiere a un conjunto de átomos que forma una porción de una molécula. En algunos casos, un grupo puede incluir dos o más átomos enlazados entre sí para formar una porción de una molécula. Un grupo puede ser monovalente o polivalente (p. ej., bivalente) para permitir el enlace a uno o más grupos adicionales de una molécula. Por ejemplo, se puede contemplar un grupo monovalente como una molécula con uno de sus átomos de hidrógeno extraído para permitir el enlace a otro grupo de una molécula. Un grupo puede estar positiva o negativamente cargado. Por ejemplo, un grupo positivamente cargado se puede contemplar como un grupo neutro con uno o más protones (es decir, H+) añadidos, y un grupo negativamente cargado se puede contemplar como un grupo neutro con uno o más protones extraídos. Los ejemplos no limitativos de grupos incluyen, aunque sin limitarse a ello, grupos alquilo, grupos alquileno, grupos alquenilo, grupos alquenileno, grupos alquinilo, grupos alquinileno, grupos arilo, grupos arileno, grupos iminilo, grupos iminileno, grupos hidruro, grupos halo, grupos hidroxi, grupos alcoxi, grupos carboxi, grupos tiol, grupos alquiltiol, grupos disulfuro, grupos ciano, grupos nitro, grupos amino, grupos alquilamino, grupos dialquilamino, grupos sililo y grupos siloxi. Los grupos tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heterociclilo, ya sea utilizados solos o en una palabra compuesta o en la definición de un grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. "Opcionalmente sustituido", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a que un grupo puede estar o no estar adicionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, halo, haloalquilo, haloalquenilo, haloalquinilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, alqueniloxi, ariloxi, benciloxi, haloalcoxi, haloalqueniloxi, haloariloxi, nitro, nitroalquilo, nitroalquenilo, nitroalquinilo, nitroarilo, nitroheterociclilo, amino, alquilamino, dialquilamino, alquenilamino, alquinilamino, arilamino, diarilamino, fenilamino, difenilamino, bencilamino, dibencilamino, hidrazino, acilo, acilamino, diacilamino, aciloxi, heterociclilo, heterocicloxi, heterociclamino, haloheterociclilo, carboxi éster, carboxi, carboxi amida, mercapto, alquiltiol, benciltiol, aciltiol y grupos que contienen fósforo. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "opcionalmente sustituido" puede también referirse al reemplazo de un grupo CH2 con un grupo carbonilo (C=O). Los ejemplos no limitativos de sustituyentes opcionales incluyen alquilo, preferiblemente alquilo C1-8 (p. ej., alquilo C1-6 como metilo, etilo, propilo, butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo), hidroxialquilo C1-8 (p. ej., hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo), alcoxialquilo (p. ej., metoximetilo, metoxietilo, metoxipropilo, etoximetilo, etoxietilo, etoxipropilo, etc.) alcoxi C1-8 (p. ej., alcoxi C1-6 como metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, ciclopropoxi, ciclobutoxi), halo (fluoro, cloro, bromo, yodo), trifluorometilo, triclorometilo, tribromometilo, hidroxi, fenilo (que puede estar en sí mismo además sustituido con un sustituyente opcional descrito en este documento, p. ej., hidroxi, halo, metilo, etilo, propilo, butilo, metoxi, etoxi, acetoxi, amino), bencilo (en donde CH2 y/o el grupo fenilo puede estar además sustituido como se describe en este documento), fenoxi (en donde CH2 y/o el grupo fenilo puede estar además sustituido como se describe en este documento), benciloxi (en donde CH2 y/o el grupo fenilo puede estar además sustituido como se describe en este documento), amino, alquilamino C1-8 (p. ej., alquilo C1-6, como metilamino, etilamino, propilamino), di-alquilamino C1-8 alquilamino (p. ej., alquilo Ci-6, como dimetilamino, dietilamino, dipropilamino), acilamino (p. ej., NHC(O)CH3), fenilamino (en donde el fenilo propiamente dicho puede estar además sustituido como se describe en este documento), nitro, formilo, -C(O)-alquilo C1-8, (p. ej., alquilo C1-6, tal como acetilo), O-C(O)-alquilo (p. ej., alquilo C1-6, como acetiloxi), benzoílo (en donde CH2 y/o el grupo fenilo propiamente dicho puede estar además sustituido), reemplazo de CH2 con C=O, CO2H, CO2 alquilo C1-8 (p. ej., alquilo C1-6 como metil éster, etil éster, propil éster, butil éster), CO2fenilo (en donde el fenilo propiamente dicho puede estar además sustituido), CONH2, CONHfenilo (en donde el fenilo propiamente dicho puede estar además sustituido como se describe en este documento), CONHbencilo (en donde CH2 y/o el grupo fenilo puede estar además sustituido como se describe en este documento), CONH alquilo C1-8 (p. ej., alquilo C1-6 tal como metil amida, etil amida, propil amida, butil amida), CONHdi-alquilo C1-8 (p. ej., alquilo C1-6).
Grupo "heteroaralquilo" significa alquilo como se definió anteriormente, sustituido con un grupo heteroarilo, p. ej., -CH2piridinilo, -(CH2)2pirimidinilo, -(CH2)3imidazolilo, y similares, y derivados de estos.
El término "heteroarilo" o "heteroaromático", tal como se emplea en la presente memoria, representa un anillo monocíclico o bicíclico estable de hasta 7 átomos en cada anillo, en donde por lo menos un anillo es aromático y contiene entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Los grupos heteroarilo dentro del alcance de esta definición incluyen, aunque sin limitarse a ello: acridinilo, carbazolilo, cinnolinilo, quinoxalinilo, pirazolilo, indolilo, benzotriazolilo, furanilo, tienilo, benzotienilo, benzofuranilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, indolilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolilo, tetrahidroquinolina. Como con la definición de heterociclo que sigue, también se entiende que "heteroarilo" incluye el derivado de N-óxido de cualquier heteroarilo que contiene nitrógeno.
Otros ejemplos de "heterociclilo" y "heteroarilo" incluyen, aunque sin limitarse a ello, los siguientes: benzoimidazolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzotiolfenilo, benzoxazolilo, carbazolilo, carbolinilo, cinnolinilo, furanilo, imidazoilo, indolinilo, indolilo, indolazinilo, indazolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, oxazolilo, oxazolina, isoxazolina, oxetanilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridopiridinilo, piridazinilo, piridilo, pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tetrahidropiranilo, tetrazolilo, tetrazolopiridilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, azetidinilo, aziridinilo, 1,4-dioxanilo, hexahidroazepinilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, dihidrobenzoimidazolilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzotiolfenilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidrofuranilo, dihidroimidazolilo, dihidroindolilo, dihidroisooxazolilo, dihidroisotiazolilo, dihidrooxadiazolilo, dihidrooxazolilo, dihidropirazinilo, dihidropirazolilo, dihidropiridinilo, dihidropirimidinilo, dihidropirrolilo, dihidroquinolinilo, dihidrotetrazolilo, dihidrotiadiazolilo, dihidrotiazolilo, dihidrotienilo, dihidrotriazolilo, dihidroazetidinilo, metilenodioxibenzoílo, tetrahidrofuranilo y tetrahidrotienilo, y sus N-óxidos. La unión de un sustituyente heterociclilo puede ocurrir mediante un átomo de carbono o mediante un heteroátomo.
Tal como se emplea en la presente memoria, "heteroarileno" se refiere a un sistema de anillos bivalente monocíclico o multicíclico, preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 miembros, en donde uno o más, más preferiblemente 1 a 3 de los átomos en el sistema de anillos es un heteroátomo, es decir, un elemento distinto de carbono, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. El grupo heteroarileno puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, adecuadamente 1 a 3, sustituyentes del grupo arilo. Los grupos heteroarileno ilustrativos incluyen, por ejemplo, 1,4-imidazolileno.
El término "heterociclo", "heteroalifático" o "heterociclilo", tal como se emplea en la presente memoria, significa un heterociclo no aromático de 5 a 10 miembros que contiene entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, e incluye grupos bicíclicos.
Grupo "heterociclilalquilo" significa alquilo, como se definió anteriormente, que está sustituido con un grupo heterociclilo, p. ej., -CH2pirrolidin-1-ilo, -(CH2)2piperi din-1-ilo, y similares, y derivados de estos.
El término "alta", tal como se emplea en este documento, se refiere a una medida mayor que la normal, mayor que un estándar, tal como una medida predeterminada o una medida de un subgrupo o que es relativamente mayor que la medida de otro subgrupo. Por ejemplo, CD44alta se refiere a una medida de CD44 que es mayor que una medida de CD44 normal. En consecuencia, "CD44alta" siempre corresponde a, al menos, CD44 detectable en una parte relevante del cuerpo de un sujeto o una muestra relevante del cuerpo de un sujeto. Una medida normal se puede determinar de conformidad con cualquier método disponible para el experto en la técnica. El término "alta" puede también hacer referencia a una medida que es igual o mayor que una medida predeterminada, como un valor de corte predeterminado. Si un sujeto no tiene un marcador particular "alto", tiene ese marcador "bajo". En general, el valor de corte utilizado para determinar si un sujeto tiene un valor "alto" o "bajo" se debe seleccionar de manera tal que la división se torne clínicamente relevante.
"Homólogo", tal como se emplea en la presente memoria, indica un gen o su producto, que se relaciona con otro gen o producto por descendencia de una secuencia de ADN ancestral común.
El término "homología" se utiliza en este documento como equivalente a "identidad de secuencia" o "similitud de secuencia" y no está destinado a requerir identidad por descendencia o relación filogenética.
La expresión "tumor negativo receptor de hormonas (HR-)" significa un tumor que no expresa un receptor para una hormona que estimula la proliferación, supervivencia o viabilidad del tumor encima de un cierto umbral determinado por métodos estándar (p. ej., tinción inmunohistoquímica de núcleos en las muestras biológicas de pacientes. El umbral se puede medir, por ejemplo, usando una puntuación Allred o expresión génica. Véanse, p. ej., Harvey et al. (1999. J Clin Oncol 17:1474-1481) y Badve et al. (2008. J Clin Oncol 26(15):2473-2481). En algunas realizaciones, el tumor no expresa un receptor de estrógenos (ER-) y/o un receptor de progesterona (PR-).
La expresión "tumor positivo del receptor de hormonas (HR+)" significa un tumor que expresa un receptor de una hormona que estimula la proliferación, supervivencia o viabilidad del tumor encima de un cierto umbral según lo determinado por métodos estándar (p. ej., tinción inmunohistoquímica de núcleos en las muestras biológicas de pacientes. El umbral se puede medir, por ejemplo, usando puntuación Allred o expresión génica. Véanse, p. ej., Harvey et al. (1999. JClin Oncol 17:1474-1481) y Badve et al. (2008. JClin Oncol 26(15):2473-2481). Un tumor que expresa o bien el receptor de estrógenos (ER) o el receptor de progesterona (PR) según lo determinado por métodos estándar (p. ej., tinción inmunohistoquímica de núcleos en muestras biológicas de pacientes).
La expresión "cáncer resistente a hormonas", tal como se emplea en este documento, se refiere a un cáncer que tiene una respuesta disminuida o suprimida a una terapia hormonal o terapia endocrina en comparación con un cáncer no resistente a hormonas. Desde el punto de vista biológico y clínico, se pueden distinguir varios patrones de resistencia: A) tumores que son inherentemente sensibles al receptor endocrino (p. ej., receptor de estrógenos) a pesar de la expresión del receptor endocrino (resistencia a la terapia pan-endocrina o resistencia de novo); B) tumores que dependen de las hormonas pero que son resistentes a una o más terapias endocrinas específicas (resistencia selectiva de agentes; por ejemplo, respondieron a tamoxifeno pero no al inhibidor de aromatasa); y C) tumores que inicialmente responden a la terapia endocrina pero subsiguientemente progresan (resistencia adquirida). Todos los tipos de resistencia se incluyen en este documento. En algunas realizaciones, el cáncer resistente a las hormonas es un cáncer que es resistente a las hormonas antes de la administración de una terapia de hormonas o endocrina (es decir, es resistente a hormonas de novo). En otras realizaciones, el cáncer resistente a hormonas es un cáncer que inicialmente no es resistente a las hormonas, pero que se torna resistente a las hormonas después de por lo menos un tratamiento con una terapia hormonal o endocrina.
La expresión "terapia hormonal" o "terapia endocrina", tal como se emplea en la presente invención, se define como un tratamiento que pertenece a bloquear o eliminar hormonas. El tratamiento puede eliminar la glándula que sintetiza la hormona o la prohormona, bloquear o inhibir la síntesis de hormonas, o prevenir o inhibir que la hormona se una a su receptor, o disminuir o degradar el receptor hormonal.
"Hibridación" se usa en este documento para indicar el apareamiento de secuencias de nucleótidos complementarias para producir un híbrido de ADN-ADN o un híbrido de ADN-ARN. Las secuencias base complementarias son aquellas secuencias que están relacionadas por reglas de apareamiento de bases. En ADN, A se aparea con T y C se aparea con G. En ARN, U se aparea con A y C se aparea con G. En este sentido, los términos "compatibilidad" e "incompatibilidad", tal como se emplean en la presente memoria, se refieren al potencial de hibridación de nucleótidos apareados en hebras de ácido nucleico complementarias. Los nucleótidos aparejados se hibridan eficientemente, como los pares de bases clásicos A-T y G-C antes mencionados. Las incompatibilidades son otras combinaciones de nucleótidos que no se hibridan eficientemente. En la presente invención, el mecanismo preferido de apareamiento implica enlace de hidrógeno, que puede ser Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarias (nucleobases) de las hebras de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases complementarias que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede ocurrir bajo circunstancias variables conocidas por el experto en la materia.
La frase "se hibrida específicamente a" y similares se refieren a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., celular total), ADN o ARN.
El término "hidrocarbilo", tal como se emplea en esta memoria, incluye cualquier radical que contenga carbono e hidrógeno, incluidos grupos saturados, insaturados, aromáticos, de cadena lineal o ramificada, o cíclicos, incluidos grupos policíclicos. El hidrocarbilo incluye, aunque sin limitarse a ello, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, cicloalquilo C3-C10, arilo tal como fenilo y naftilo, Ar-alquilo (C1-C8) tal como bencilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido.
La referencia en este documento a "inmunointeractivo" incluye la referencia a cualquier interacción, reacción u otra forma de asociación entre moléculas y en particular si una de las moléculas es, o imita, un componente del sistema inmune.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "inhibidor" significa un agente que reduce o inhibe la función o actividad biológica de un polipéptido de PKC-0, o la expresión de un gen PKC-9 (p. ej., PRKCQ — también conocido como PRKCT, PKCT, MGC 126514, MGC 141919, nPKC-teta).
Por "aislado" se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo.
El término "baja", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una medida que es menor a la normal, que un estándar tal como una medida predeterminada o una medida de un subgrupo o que es relativamente menor que la medida de otro subgrupo. Por ejemplo, CD24baja se refiere a una medida de CD24 que es menor que una medida de CD24 normal. Una medida normal se puede determinar de conformidad con cualquier método disponible para el experto en la técnica. El término "baja" puede también hacer referencia a una medida que es igual o inferior a una medida predeterminada, como un valor de corte predeterminado.
La expresión "alquilo inferior" se refiere a grupos alquilo de cadena lineal o ramificada que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, como metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, 2-metilpentilo y similares. En algunas realizaciones, el grupo alquilo inferior es metilo o etilo.
La expresión "alcoxi inferior" se refiere a grupos alcoxi de cadena lineal o ramificada que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, como metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, terc-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n- hexoxi, 2-metil-pentoxi y similares. Usualmente, el grupo alcoxi inferior es metoxi o etoxi.
Por "modular" se entiende aumentar o reducir, o bien directa o indirectamente, el nivel o la actividad funcional de una molécula diana. Por ejemplo, un agente puede modular indirectamente el nivel/actividad interactuando con una molécula distinta de la molécula diana. En este sentido, la modulación indirecta de un gen que codifica un polipéptido diana incluye dentro de su alcance la modulación de la expresión de una primera molécula de ácido nucleico, en donde un producto de expresión de la primera molécula de ácido nucleico modula la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido diana.
El término "oligonucleótido", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a un polímero compuesto por una multiplicidad de residuos (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o variantes estructurales relacionadas o sus análogos sintéticos) enlazados mediante enlaces fosfodiéster (o variantes estructurales relacionadas o sus análogos sintéticos). Por lo tanto, si bien el término "oligonucleótido" típicamente se refiere a un polímero de nucleótido en el que los residuos nucleotídicos y los enlaces entre ellos ocurren naturalmente, se ha de entender que el término incluye también dentro de su alcance diversos análogos que incluyen, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), fosforamidatos, fosforotiolatos, metil fosfonatos, ácidos 2-O-metil ribonucleicos y similares. El tamaño exacto de la molécula puede variar dependiendo de la aplicación particular. Un oligonucleótido es típicamente bastante corto, en general tiene una longitud de aproximadamente 10 a 30 residuos de nucleótidos, pero el término puede referirse a moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucleótido" o "ácido nucleico" se utiliza típicamente para oligonucleótidos grandes.
La expresión "operativamente conectado" u "operativamente enlazado", tal como se emplea en la presente memoria, significa disponer un gen estructural bajo el control regulador de un elemento regulador que incluye, aunque sin limitarse a ello, un promotor que luego controla la transcripción y opcionalmente la traducción del gen. En la construcción de combinaciones de genes estructurales/promotores heterólogos, se prefiere en general posicionar la secuencia genética o el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre la secuencia genética o el promotor y el gen que controla en su entorno natural; es decir, el gen del cual deriva la secuencia genética o el promotor. Como se conoce en la técnica, se puede alojar cierta variación en esta distancia sin pérdida de la función. De modo similar, el posicionamiento preferido de un elemento de una secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que se ha de disponer bajo su control se define mediante el posicionamiento del elemento en su entorno natural, es decir los genes de los cuales deriva.
Los términos "sobreexpresa", "sobreexpresión" o "sobreexpresado" se refieren de manera intercambiable a un gen (p. ej., un gen PKC-9) que se transcribe o traduce en un nivel detectablemente superior, usualmente en una célula cancerosa, en comparación con una célula normal. La sobreexpresión se refiere entonces tanto a la sobreexpresión de proteína y ARN (debido al aumento de la transcripción, el procesamiento post transcripción, traducción, procesamiento post traducción, estabilidad alterada y degradación de proteínas alterada), como también a la sobreexpresión local debida a patrones de tráfico de proteína alterados (mayor localización nuclear) y aumento de la actividad funcional, p. ej., como en una hidrólisis enzimática de sustrato incrementada. La sobreexpresión puede ser también de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más comparada con una célula de comparación o una célula normal (p. ej., una célula de mama).
Los términos "paciente", "sujeto", "hospedante" o "individuo", utilizados de forma intercambiable en este documento, se refieren a cualquier sujeto, particularmente un sujeto vertebrado, e incluso más particularmente a un sujeto mamífero, para el cual se desea la terapia o profilaxis. Los animales vertebrados adecuados que yacen dentro del alcance de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ello, cualquier miembro de subphilum Chordata incluidos primates (p. ej., seres humanos, monos y simios, e incluye especies de monos tales como los del género Macaca p. ej., monos cynomologus tales como Macacafascicularis, y/o monos rhesus (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus), además de titíes (especie de monos del género ardilla (especie del género Saimiri) y tamarinos (especie del género Saguinus), además de simios tales como chimpancés (Pan troglodytes)), roedores (p. ej., ratones, ratas, cobayas), lagomorfos (p. ej., conejos, liebres), bovinos (p. ej., ganado), ovinos (p. ej., ovejas), caprinos (p. ej., cabras), porcinos (p. ej., cerdos), equinos (p. ej., caballos), caninos (p. ej., perros), felinos (p. ej., gatos), aves (p. ej., pollos, pavos, patos, gansos, pájaros de compañía como canarios, periquitos, etc.), mamíferos marinos (p. ej., delfines, ballenas) reptiles (víboras, sapos, lagartijas, etc.), y peces. En realizaciones específicas, el sujeto es un primate, tal como un ser humano. No obstante, se ha de entender que los términos antes mencionados no implican que los síntomas estén presentes.
Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un vehículo farmacéutico comprendido por un material que no es biológicamente o de algún otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto junto con el agente activo seleccionado sin causar ninguna reacción adversa o reacción adversa sustancial. Los vehículos pueden incluir excipientes y otros aditivos tales como diluyentes, detergentes, colorantes, humectantes o emulsionantes, agentes tampón de pH, conservantes, agentes de transfección y similares.
De modo similar, una sal, éster, amida profármaco o derivado "farmacológicamente aceptable" de un compuesto de la presente invención es una sal, éster, amida, profármaco o derivado que no es biológicamente o de ningún otro modo indeseable.
El término "polinucleótido" y las expresiones "material genético", "formas genéticas", "ácidos nucleicos" y "secuencia de nucleótidos" incluyen ARN, ADNc, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, tanto hebras sentido como antisentido, y pueden modificarse químicamente o bioquímicamente, o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivadas, como apreciará fácilmente el experto en la técnica.
"Fenilalquilo" significa alquilo como se definió anteriormente, sustituido con fenilo, p. ej., -CH2fenilo,-(CH2)2fenilo,-(CH2)3fenilo, CH3CH(CH3)CH2fenilo y similares, y derivados de estos. Fenilalquilo es un subconjunto del grupo aralquilo.
La expresión "variante de polinucleótido" y el término variante" se refieren a polinucleótidos que exhiben identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos o polinucleótidos de referencia que se hibridan con una secuencia de referencia bajo condiciones rigurosas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1989). Estos términos también abarcan polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con nucleótidos diferentes. En este sentido, se entiende en la técnica que se pueden efectuar ciertas alteraciones inclusive de mutaciones, adiciones, eliminaciones y sustituciones a un polinucleótido de referencia, mediante lo cual el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. La expresión "variante de polinucleótido" y él término "variante" también incluyen variantes alélicas naturales.
Los términos "polipéptido", "molécula proteinácea", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. Por consiguiente, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos consisten en un aminoácido no natural sintético, como un análogo químico de un aminoácido natural correspondiente, además de polímeros de aminoácidos naturales. Estos términos no excluyen modificaciones, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Las formas solubles de las moléculas proteináceas en cuestión son particularmente útiles. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido, incluidos, por ejemplo, aminoácidos o polipéptidos no naturales con enlaces sustituidos.
La expresión "variante de polipéptido" se refiere a polipéptidos en los que uno o más aminoácidos se han reemplazado con aminoácidos diferentes. Se entiende en la técnica que algunos aminoácidos se pueden cambiar por otros con propiedades muy similares, sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido (sustituciones conservadoras) como se describe en lo sucesivo. Estos términos también abarcan polipéptidos en los que se han añadido o eliminado uno o más aminoácidos, o se han reemplazado con aminoácidos diferentes.
El término "profármaco" se emplea en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo a los compuestos de la invención. Dichos derivados se les ocurrirían fácilmente a los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo hidroxi libre se convierte a un derivado de éster.
Tal como se emplean en la presente memoria, los términos "prevenir", "previno" o "previniendo" se refieren a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a desarrollar la enfermedad o afección, o, en otros términos, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle la enfermedad o afección, además de un tratamiento después de que ha comenzado la enfermedad o afección para reducirla o eliminarla por completo, o prevenir que empeore. Estos términos también incluyen dentro de su alcance prevenir que la enfermedad o afección ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o afección pero que no se le ha diagnosticado que la padece.
Tal como se emplea en la presente memoria, "racemato" se refiere a una mezcla de enantiómeros.
Los términos "sales" y "profármacos" incluyen cualquier sal, éster, hidrato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, tras la administración al receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la invención, o su metabolito activo o residuo. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico. Las sales de base incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellas formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamino. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes tales como alquil haluros inferiores, como cloruros de metilo, etilo, propilo y butilo, bromuros y yoduros; dialquil sulfatos como dimetil y dietil sulfato; y otros. No obstante, se ha de apreciar que las sales no farmacéuticamente aceptables también están dentro del alcance de la invención, ya que pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales y profármacos se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar sales de metales por reacción de un compuesto de la invención con un hidróxido de metal. Se puede preparar una sal de ácido sometiendo a reacción un ácido apropiado con un compuesto de la invención.
El término "selectivo" se refiere a compuestos que inhibe o exhiben antagonismo hacia PKC-0 sin inhibir ni antagonizar sustancialmente la función de otra enzima PKC tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-Á, PKC-p o PKC-v. En contraste, la expresión "no selectivo" se refiere a compuestos que inhiben o exhiben antagonismo hacia PKC-0 y que además inhiben o antagonizan sustancialmente la función de por lo menos una otra enzima PKC tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v. En general, un compuesto que es selectivo para PKC-0 exhibe selectividad de PKC-0 mayor que aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o más que aproximadamente 100 veces con respecto a la inhibición o el antagonismo de otra PKC (es decir, una PKC distinta de PKC-0 tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v). En otras realizaciones, los compuestos selectivos exhiben por lo menos 50 veces más de inhibición o antagonismo hacia PKC-0 que hacia otra PKC (es decir, una PKC distinta de PKC-0 tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v). Incluso en otras realizaciones, los compuestos selectivos inhiben o exhiben por lo menos 100 veces más de inhibición o antagonismo hacia PKC-0 que otra PKC (es decir, una PKC distinta de PKC-0 tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v). Incluso en otras realizaciones, los compuestos selectivos exhiben por lo menos 500 veces más de inhibición o antagonismo hacia PKC-0 que hacia otra PKC (es decir, PKC distinta de PKC-0 tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v). Incluso en otras realizaciones, los compuestos selectivos exhiben por lo menos 1000 veces más de inhibición o antagonismo hacia PKC-0 que otra PKC (es decir, una PKC distinta de pKc-0 tal como PKC-a, PKC-p PKC-Y, PKC-6, PKC-S, PKC-Z, PKC-q, PKC-A, PKC-p o PKC-v).
La expresión "identidad de secuencia", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere al grado en que las secuencias son idénticas en una base nucleótido por nucleótido, o una base aminoácido por aminoácido en una ventana de comparación. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácidos idéntico (p. ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) ocurre en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones compatibles, dividiendo el número de posiciones compatibles por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Para los fines de la presente invención, "identidad de secuencia" se entenderá que significa el "porcentaje compatible" calculado por un método adecuado. Por ejemplo, el análisis de identidad de secuencia se puede llevar a cabo usando el programa de ordenador DNASIS (Versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE. UU.) usando parámetros estándar como en el manual de referencia que se adjunta al software.
"Similitud" se refiere al número en porcentaje de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservadoras como se define en la Tabla 2.
Tabla 2
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La similitud se puede determinar usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al.
1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De esta forma, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a aquellas citadas en este documento podrían compararse por inserción de huecos en la alineación, en donde dichos huecos se determinan, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.
Los términos utilizados para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen la "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene por lo menos 12 pero frecuentemente 15 a 18 y a menudo por lo menos 25 unidades monoméricas, inclusive de nucleótidos y residuos de aminoácidos, de longitud. Ya que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solamente una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos típicamente se realizan comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 6 posiciones contiguas, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede efectuar con implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por inspección y la mejor alineación (es decir, por inspección y la mejor alineación (es decir, resultando en la homología del mayor porcentaje en la ventana de comparación) generada por cualquiera de los distintos métodos seleccionados. Se puede hacer referencia también a la familia de programas BLAST como lo describe, por ejemplo, Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Se puede hallar un análisis detallado del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
Tal como se emplea en la presente memoria, una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de 3 kilodaltons (kDa), y típicamente menos de 1,5 kilodaltons, y más preferiblemente menos de aproximadamente 1 kilodalton. Las moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas (que contienen carbono). Como apreciarán los expertos en la técnica, en base a la presente descripción, se pueden detectar amplias bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, a menudo extractos fúngicos, bacterianos o de algas, con cualquiera de los ensayos de la invención para identificar compuestos que modulan una bioactividad. Una "molécula orgánica pequeña" es un compuesto orgánico (o compuesto orgánico que forma complejo con un compuesto inorgánico (p. ej. metal)) que tiene un peso molecular de menos de 3 kilodaltons, menos de 1,5 kilodaltons o incluso menos de aproximadamente 1 kDa.
"Rigurosidad", tal como se emplea en este documento, se refiere a las condiciones de temperatura y fuerza iónica, y a la presencia o ausencia de ciertos disolventes orgánicos, durante la hibridación. Cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor será el grado observado de complementaridad entre las secuencias. "Condiciones rigurosas", tal como se emplea en este documento, se refiere a condiciones de temperatura y fuerza iónica bajo las cuales solamente los polinucleótidos que tienen una gran proporción de bases complementarias, preferiblemente que tienen complementaridad exacta, se hibridarán. La rigurosidad requerida depende de la secuencia de nucleótidos y de diversos componentes durante la hibridación, y se cambia en gran medida cuando se usan análogos de nucleótidos. En general, se seleccionan condiciones rigurosas de aproximadamente 10° C a 20° C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Tm es la temperatura (definida en fuerza iónica y pH) a la cual 50% de una secuencia diana se hibrida a una sonda complementaria. Se ha de entender que un polinucleótido se hibridará a una secuencia diana al menos bajo condiciones de baja rigurosidad, preferiblemente al menos bajo condiciones de rigurosidad media y más preferiblemente bajo condiciones de rigurosidad alta. Se hace referencia en la presente invención a condiciones de baja rigurosidad que abarcan de por lo menos aproximadamente 1% v/v a por lo menos aproximadamente 15% v/v formamida y de por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación a 42° C, y por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M de sal para lavado a 42° C. Las condiciones de baja rigurosidad pueden también incluir 1% albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), 7% SDS para hibridación a 65° C y (i) 2xSSC, 0,1% SDS; o (ii) 0,5% BSA, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), 5% SDS para lavado a temperatura ambiente. Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan de por lo menos aproximadamente 16% v/v a por lo menos aproximadamente 30% v/v formamida y de por lo menos aproximadamente 0,5 M a por lo menos aproximadamente 0,9 M sal para hibridación a 42° C, y por lo menos aproximadamente 0,5 M a por lo menos aproximadamente 0,9 M sal para lavado a 42° C. Las condiciones de rigurosidad media pueden además incluir 1% albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), 7% SDS para hibridación a 65° C, y (i) 2 x SSC, 0,1% SDS; o (ii) 0,5% BSA, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), 5% SDS para lavado a 42° C. Las condiciones de rigurosidad alta incluyen y abarcan de por lo menos aproximadamente 31% v/v a por lo menos aproximadamente 50% v/v formamida y de por lo menos aproximadamente 0,01 M a por lo menos aproximadamente 0,15 M sal para hibridación a 42° C, y por lo menos aproximadamente 0,01 M a por lo menos aproximadamente 0,15 M sal para lavado a 42° C. Las condiciones de rigurosidad alta pueden además incluir 1% BSA, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), 7% SDS para hibridación a 65° C, y (i) 0,2 x SSC, 0,1% SDS; o (ii) 0,5% BSA, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), 1% SDS para lavado a una temperatura superior a 65° C. Una realización de las condiciones de rigurosidad alta incluye hibridar en 6 x SSC a aproximadamente 45° C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 65° C. Una realización de condiciones de rigurosidad muy alta incluye hibridar fosfato de sodio 0,5 M, 7% SDS a 65° C, seguido de uno o más lavados a 0,2 x SSC, 1% SDS a 65° C. Otras condiciones rigurosas se conocen en la técnica. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden manipular varios factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véanse CURRENT PROTOCOlS IN MOLECULAR BIOLOGY (supra), páginas 2.10.1 a 2.10.16 y MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Sambrook, et al., eds.) (Cold Spring Harbor Press 1989) en las secciones 1.101 a 1.104.
Por "sustancialmente complementario" se entiende que un oligonucleótido o su subsecuencia es suficientemente complementario para hibridarse con una secuencia diana. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido o la subsecuencia no necesita reflejar la secuencia de complementaridad exacta de la secuencia diana. En una realización preferida, el oligonucleótido no contiene incompatibilidades con la secuencia diana.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "sinérgico" significa que el efecto terapéutico de un inhibidor de PKC-0, cuando se administra en combinación con un agente terapéutico antineoplásico (o viceversa) es mayor que los efectos terapéuticos aditivos pronosticados del inhibidor de PKC-0 y el agente terapéutico antineoplásico cuando se administra solo. La expresión "cantidad eficaz desde el punto de vista sinérgico" como se aplica a un inhibidor de PKC-0 y a un agente terapéutico antineoplásico se refiere a la cantidad de cada componente en una composición (en general una composición farmacéutica), que es eficaz para inhibir (i) formación, (ii) proliferación, (iii) mantenimiento, o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para estimular o inducir (v) MET de una célula que sobreexpresa p KC-0 (p. ej., una CSC) e inhibir la proliferación, supervivencia o viabilidad de una célula tumoral no c Sc , para tratar o prevenir así el cáncer, y que produce un efecto que no se entrelaza en un gráfico de dosis y respuesta de la dosis del inhibidor de PKC-0 frente a una dosis del agente terapéutico antineoplásico inhibiendo la (i) formación, (ii) proliferación, (iii) mantenimiento o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o estimulando o induciendo (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), e inhibiendo la proliferación, supervivencia o viabilidad de una célula tumoral no CSC, o bien del eje inhibidor de la dosis de PKC-0 o el eje del agente terapéutico antineoplásico de la dosis. La curva de dosis y respuesta utilizada para determinar la sinergia en la técnica la describen, por ejemplo, Sande et al., véanse, pág. 1080-1105 en A. Goodman et al., ed., The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., Inc., Nueva York (1980)). Las cantidades sinérgicas óptimas se pueden determinar usando un límite de confianza del 95%, por factores variables tales como el nivel de dosis, el esquema y la respuesta, y usando un modelo generado por ordenador que genera isobologramas de las curvas de dosis y respuesta para varias combinaciones del inhibidor de PKC-0 y el agente terapéutico antineoplásico. La inhibición más alta de la proliferación, la supervivencia o la viabilidad de las CSC y de las células tumorales no CSC en la curva de dosis y respuesta se correlaciona con los niveles óptimos de dosis.
Tal como se emplean en la presente memoria, los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad o afección (p. ej., cáncer que incluye cáncer metastásico) y/o evento adverso atribuible a la enfermedad o afección. Estos términos también abarcan cualquier tratamiento de una afección o enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluyen: (a) inhibir la enfermedad o afección, es decir, detener su desarrollo; o (b) aliviar la enfermedad o afección, es decir, causar la regresión de la enfermedad o afección.
El término "tumor", tal como se emplea en este documento, se refiere a cualquier desarrollo y proliferación celular neoplásica, o bien maligna o benigna, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer" y "canceroso" hacen referencia o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza en parte por crecimiento celular desrregulado. Tal como se emplea en la presente memoria, el término "cáncer' se refiere a cáncer no metastásico y metastásico, incluido cáncer en estadios tempranos y tardíos. El término "precanceroso" se refiere a una afección o un crecimiento que típicamente precede o se desarrolla en un cáncer. Por "no metastásico" se entiende un cáncer benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema de vasos sanguíneos o linfático ni en los tejidos distintos del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer en Estadio 0, I o II, y ocasionalmente en Estadio III. Por "cáncer en estadio temprano" se entiende un cáncer que no es invasivo ni metastásico o se clasifica como cáncer en Estadio 0, I o II. La expresión "cáncer en estadio tardío" en general se refiere a cáncer en Estadio III o Estadio IV, pero puede también referirse a un cáncer en Estadio II o un cáncer en un subestadio del Estadio II. Un experto en la técnica apreciará que la clasificación de un cáncer en Estadio II o bien como un cáncer en estadio temprano o en estadio tardío depende del tipo de cáncer particular. Los ejemplos ilustrativos de cáncer incluyen, aunque sin limitarse a ello, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de células escamosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, mieloma múltiple, cáncer rectal y cáncer de esófago. En una realización ilustrativa, el cáncer es cáncer de mama.
La expresión "muestra de tumor", tal como se emplea en este documento, significa una muestra que comprende material tumoral obtenido de un paciente con cáncer. El término abarca muestras clínicas, por ejemplo tejido obtenido de disección quirúrgica y tejido obtenido por biopsia, como por ejemplo una biopsia del núcleo de la lesión o una biopsia con aguja fina. El término también abarca muestras que comprenden células tumorales obtenidas de sitios distintos del tumor primario, p. ej., células tumorales circulantes, así como también muestras de tumores conservadas, como muestras de tumores fijadas en formalina o embebidas en parafina o muestras de tumores congeladas. El término abarca células que son la descendencia de las células tumorales del paciente, p. ej., muestras de cultivo celular derivadas de células de tumores primarios o células de tumores circulantes. El término abarca muestras que pueden comprender material de ácido nucleico o proteína desprendido de las células tumorales in vivo, p. ej., sangre de médula ósea, plasma, suero y similares. El término también abarca muestras que se han enriquecido para células tumorales o que se han manipulado alterando su procuración y muestras que comprenden polinucleótidos y/o polipéptidos obtenidos del material tumoral de un paciente.
Por "vector" se entiende una molécula de polinucleótido, preferiblemente una molécula de ADN derivada de, por ejemplo, un plásmido, bacteriófago, levadura o virus, en la cual se puede insertar o clonar un polinucleótido. Un vector preferiblemente contiene uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en una célula hospedante definida, incluida una célula o tejido diana o una célula progenitora o su tejido, o ser integrable con el genoma del hospedante definido de forma tal que la secuencia clonada sea reproducible. Por consiguiente, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido circular lineal o clonado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedante, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma(s) en el cual se ha integrado. Un sistema vector puede comprender un solo vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula hospedante, o un transposón. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedante en la que se introduce el vector. En el presente caso, el vector es preferiblemente un vector vírico o derivado de virus, que es operativamente funcional en células animales y preferiblemente mamíferas. Dicho vector puede derivar de un virus variolovacunal, un adenovirus o levadura. El vector puede también incluir un marcador de selección tal como un gen de resistencia a los antibióticos que se puede usar para selección de transformantes adecuados. Los expertos en la técnica conocen ejemplos de dichos genes de resistencia e incluyen el gen nptlI que confiere resistencia a los antibióticos kanamicina y G418 (Geneticin®), y el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina B.
Tal como se emplea en la presente memoria, subrayar o poner en cursiva el nombre de un gen indica el gen, en contraste con su producto de proteína, que se indica con el nombre del gen en ausencia de subrayado o cursiva. Por ejemplo, "PKC-Q" significa el gen PKC-Q, mientras que "PKC-0" indica el producto o los productos de proteína generados a partir de la transcripción y traducción y/o empalme alternativo del gen PKC-Q.
Cada realización descrita en este documento se aplicará mutatis mutandis a todas y cada una de las realizaciones, a menos que se indique concretamente otra cosa.
2. Composiciones y métodos para reducir o revocar la proliferación o viabilidad de células madre cancerosas
La presente invención se basa en parte en la determinación de que el cáncer de mama es enriquecido para CSC y que la PKC-9 se sobreexpresa en aquellas CSC así como también en células tumorales no CSC. En base a estos hallazgos, los presentes inventores trataron células de mama, CSC de mama y células tumorales no CSC de mama con inhibidores de PKC-0, y hallaron que inhibieron específicamente la formación, proliferación o el mantenimiento de células CSC y células tumorales no CSC de mama, inhibieron EMT de CSC de mama y/o estimularon/indujeron MET en CSC de mama. Sin desear estar influenciados por la teoría o el modo de operación, se propone que la PKC-0 es importante al nivel de su señalización y roles epigenéticos para el funcionamiento de CSC de mama, y que la sobreexpresión de esta enzima estimula no solamente la producción y el mantenimiento de células CSC y células tumorales no CSC de mama sino también la producción de CSC y células tumorales no CSC en general.
En base a las observaciones anteriores, los presentes inventores proponen que la inhibición de PKC-0 resultará en la formación reducida, la proliferación o el mantenimiento de células CSC y/o células tumorales no CSC, y/o en la reducción de EMT de c Sc y/o el aumento en MET de CSC, que a su vez resulta en menos células tumorales no CSC que se diferencien a partir de allí y en tratamientos más eficaces de células tumorales no CSC con una terapia o agente antineoplásico.
Por lo tanto, se describen en este documento métodos y composiciones que aprovechan el inhibidor de PKC-0 para reducir o revocar la formación, proliferación o mantenimiento de células c Sc y/o células tumorales no CSC, y/o para reducir o revocar la EMT de CSC, y/o estimular o inducir MET de CSC para el tratamiento o la profilaxis de cáncer (p. ej., cáncer metastásico). De acuerdo con la invención, el inhibidor de PKC-0 se usará en combinación con una terapia o agente antineoplásico que reduce la proliferación, la supervivencia o la viabilidad de la descendencia de células tumorales no CSC de esas células. Los métodos y composiciones descritos en este documento son, por lo tanto, particularmente útiles en el tratamiento o la profilaxis de distintos tipos de cáncer, incluidos cáncer metastásico, como se describe en lo sucesivo.
2.1 Inhibidores de PKC-0
El inhibidor de PKC-0 incluye y abarca cualquier agente activo que reduce la acumulación, el funcionamiento y la estabilidad de PKC-0; o disminuye la expresión de un gen PKC-9, y dichos inhibidores incluyen, sin limitación, moléculas pequeñas y macromoléculas tales como ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, polisacáridos, lipopolisacáridos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbono) o inorgánicas.
El inhibidor de PKC-0 puede ser una molécula de ácido nucleico antagonista que funcione para inhibir la transcripción o traducción de transcripciones de PKC-9. Las transcripciones representativas de este tipo incluyen secuencias de nucleótidos correspondientes a una cualquiera de las siguientes secuencias: (1 ) secuencias de nucleótidos humanas PKC-9 expuestas, por ejemplo, con los núm. de acceso en GenBank XM_005252496, XM_005252497, XM_005252498 y XM_005252499, (2) secuencias de nucleótidos que comparten por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en (1); (3) secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones de rigurosidad, por lo menos baja, media o alta a las secuencias a las que se hace referencia en (1); (4) secuencias de nucleótidos que codifican una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: secuencias de aminoácidos humanas PKC-0 como se expone en los núm. de acceso en GenPept XP_005252553, XP_005252554, XP_005252555 y XP_005252556; (5) secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en (4); y secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en (4).
Las moléculas de ácido nucleico antagonistas ilustrativas incluyen moléculas antisentido, aptámeros, ribozimas y moléculas que forman triples, ARNi y secuencias guía externas. Las moléculas de ácido nucleico pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica de una molécula diana, o las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden poseer actividad de novo independiente de cualquiera de las moléculas.
Las moléculas de ácido nucleico antagonistas pueden interactuar con cualquier macromolécula, tal como cadenas de ADN, ARN, polipéptidos o carbohidratos. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico antagonistas pueden interactuar con ARNm de PKC-9 o el ADN genómico de PKC-9 o pueden interactuar con un polipéptido de PKC-0. A menudo, las moléculas de ácido nucleico antagonistas se diseñan para interactuar con otros ácidos nucleicos en base a la homología de secuencias entre la molécula diana y la molécula de ácido nucleico antagonista. En otras situaciones, el reconocimiento específico entre la molécula de ácido nucleico antagonista y la molécula diana no se basa en la homología de secuencias entre la molécula de ácido nucleico antagonista y la molécula diana, sino en la formación de estructura terciaria que permite que tenga lugar el reconocimiento específico.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido se pueden usar directamente para bloquear la transición de PKC-9 al unirse a ARNm y previniendo la traducción de proteínas. Las moléculas antisentido están diseñadas para interactuar con una molécula de ácido nucleico a través de apareamiento de bases canónico o no canónico. La interacción de la molécula antisentido y la molécula diana se puede diseñar para promover la destrucción de la molécula diana a través de, por ejemplo, degradación de híbridos de ARN-ADN mediada por RNAseH. Alternativamente, la molécula antisentido se puede diseñar para interrumpir una función de procesamiento que normalmente tendría lugar en la molécula diana, como transcripción o replicación. Las moléculas antisentido se pueden diseñar en base a la secuencia de la molécula diana. Existen numerosos métodos para la optimización de la eficiencia antisentido encontrando las regiones más accesibles de la molécula diana. Los métodos no limitativos incluyen experimentos de selección in vitro y estudios de modificación de ADN que usan DMS y DEPC. En ejemplos específicos, las moléculas antisentido se unen a la molécula diana con una constante de disociación (Kd) inferior o igual a 10-6, 10-8, 10-10 o 10-12. Se pueden emplear oligodeosxirribonucleótidos antisentido derivados del sitio de inicio de la traducción, p. ej., entre regiones -10 y 10.
Los aptámeros son moléculas que interactúan con una molécula diana, adecuadamente en una forma específica. Los aptámeros son en general ácidos nucleicos pequeños que oscilan entre 15-50 bases de longitud que se pliegan en estructuras secundarias y terciarias definidas, como tallos-bucles o G-cuartetos. Los aptámeros se pueden unir a moléculas pequeñas, como ATP y teofilina, además de moléculas grandes, como transcriptasa inversa y trombina. Los aptámeros se pueden unir muy firmemente con Kds de la molécula diana de menos de 10'12 M. Adecuadamente, los aptámeros se unen a la molécula diana con una a Kd inferior a 10'6, 10'8, 10'10 o 10'12 Los aptámeros se pueden unir a la molécula diana con un grado muy alto de especificidad. Por ejemplo, se han aislado aptámeros que tienen más de 10.000 veces de diferencia en las afinidades de unión entre la molécula diana y otra molécula que difieren en solamente una posición en la molécula. Es conveniente que un aptámero tenga una Kd con la molécula diana por lo menos 10-, 100-, 1000-, 10,000- o 100.000 veces inferior a la Kd con una molécula de unión de fondo. Un método adecuado para generar un aptámero a una diana de interés (p. ej., PKC-0) es el método "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment" (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (SELEXTM). El método SELEXTM se describe en la patente de EE. UU. núm. 5.475.096 y en la patente de EE. UU. núm. 5.270.163 (véase también el documento WO 91/19813). En síntesis, se pone en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con la molécula diana bajo condiciones favorables para la unión. Los ácidos nucleicos no unidos se reparan entre los ácidos nucleicos unidos, y los complejos de ácido nucleico-diana se disocian. Luego los ácidos nucleicos disociados se amplían para dar una mezcla enriquecida con ligando de ácidos nucleicos, que se somete a ciclos repetidos de unión, partición, disociación y ampliación según se desee para dar ligandos de ácido nucleico de gran afinidad específicos de la molécula diana.
Las ribozimas anti-PKC-0 se pueden usar para catalizar la escisión específica de ARN de PKC-O. El mecanismo de acción de las ribozimas implica hibridación específica de las secuencias de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguida de escisión endonucleolítica. Hay varios tipos distintos de ribozimas que catalizan las reacciones de tipo polimerasa de ácido nucleico o nucleasa, que se basan en ribozimas hallados en sistemas naturales, como ribozimas cabeza de martillo, ribozimas horquilla y ribozimas tetrahymena. Existe también un número de ribozimas que no se hallan en sistemas naturales, pero que se han modificado para catalizar reacciones específicas de novo. Las ribozimas representativas escinden sustratos de ARN o ADN. Se pueden emplear las ribozimas que escinden sustratos de ARN. Los sitios de escisión de ribozimas específicas dentro de dianas de ARN potenciales se identifican inicialmente explorando la molécula diana para sitios de escisión de ribozimas, que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión se pueden evaluar para rasgos estructurales pronóstico como estructura secundaria que puede tornar la secuencia de oligonucleótidos inadecuada. La adecuación de dianas candidatas se puede evaluar también ensayando su capacidad de acceso a hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de ribonucleasas.
Las moléculas de ácido nucleico funcionales que forman tríplex son moléculas que pueden interactuar con ácido nucleico o bien bicatenario o monocatenario. Cuando las moléculas tríplex interactúan con una región diana, se forma una estructura llamada tríplex, en donde hay tres hebras de ADN que forman un complejo dependiente del apareamiento de las bases Watson-Crick y Hoogsteen. Las moléculas tríplex se prefieren porque pueden unirse a regiones diana con gran afinidad y especificidad. En general es conveniente que las moléculas que forman tríplex se unan a la molécula diana con una Kd inferior a 10'6, 10'8, 10'10 o 10'12
Las secuencias guía externas (EGS) son moléculas que se unen a una molécula de ácido nucleico diana formando un complejo, y este complejo es reconocido por RNAse P, que escinde la molécula diana. Las EGS se pueden diseñar para dirigirse específicamente una molécula de ARN de elección. RNAse P ayuda a procesar el ARN de transferencia (ARNt) dentro de una célula. RNAse P bacteriano se puede incorporar para escindir prácticamente cualquier secuencia de ARN usando una EGS que cause que el complejo ARN:EGS diana imite el sustrato de ARNt natural. De modo similar, la escisión de ARN dirigida a RNAse P se puede utilizar para escindir dianas deseadas dentro de células eucariotas.
Las moléculas de ARN que median la interferencia de ARN (ARNi) de un gen PKC-9 o transcripción de PKC-9 se pueden usar para reducir o revocar la expresión génica. ARNi se refiere a la interferencia o a la destrucción del producto de un gen diana introduciendo un ARN monocatenario o usualmente bicatenario (ARNbc) que es homólogo a la transcripción de un gen diana. Los métodos de ARNi, incluida interferencia de ARN bicatenario (ARNibc), interferente pequeño (ARNip), se han documentado ampliamente en una serie de organismos, incluidas células mamíferas y el nematodo C. elegans (Fire et al., 1998. Nature 391, 806-811). En células mamíferas, el ARNi puede ser desencadenado por dúplex de 21 a 23 nucleótidos (nt) de ARN interferente pequeño (ARNip) (Chiu et al., 2002 Mol. Cell. 10:549-561; Elbashir et al., 2001. Nature 411:494-498), o por micro-ARN (ARNmi), ARN horquilla pequeño funcional (ARNhc), u otros ARNbc que se expresan in vivo usando moldes de ADN con promotores de ARN polimerasa III (Zeng et al., 2002. Mol. Cell 9:1327-1333 ; Paddison et al., 2002. Genes Dev. 16:948-958; Lee et al., 2002. Nature Biotechnol. 20:500-505; Paul et al., 2002. Nature Biotechnol. 20:505-508; Tuschl, T., 2002. Nature Biotechnol. 20:440-448; Yu et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052; McManus et al., 2002. RNA 8:842-850; Sui et al, 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520).
El ARNbc per se y especialmente los constructos que producen ARNbc correspondientes a por lo menos una porción de un gen de PKC-9 se pueden utilizar para reducir o suprimir su expresión. La inhibición mediada por ARNi de la expresión génica se puede lograr usando cualquiera de las técnicas descritas en el campo, por ejemplo transfectando un constructo de ácido nucleico que codifica una estructura de ARN de tallo-bucle u horquilla en el genoma de la célula diana, o expresando un constructo de ácido nucleico transfectado que tiene homología para un gen PKC-9 entre promotores convergentes, o como una duplicación de cabeza a cabeza o de extremo a extremo desde atrás de un promotor sencillo. Se puede usar cualquier constructo similar siempre y cuando produzca un ARN sencillo que tenga la capacidad de replegarse en sí mismo y producir ARNbc, o siempre y cuando produzca dos transcripciones de ARN separadas, que luego se anillen para formar un ARNbc que tenga homología a un gen diana.
No se requiere homología absoluta para el ARNi, en donde se describe un umbral inferior en aproximadamente 85% homología para un ARNbc de aproximadamente 200 pares de bases (Plasterk y Ketting, 2000, Current Opinion in Genetics and Dev.10: 562-67). En consecuencia, dependiendo de la longitud del ARNbc, los ácidos nucleicos que codifican ARNi pueden variar en el nivel de homología que contienen hacia la transcripción del gen diana, es decir con ARNbc de 100 a 200 pares de bases, por lo menos aproximadamente 85% homología con el gen diana, y ARNbc más largos, es decir 300 a 100 pares de bases, que tienen por lo menos aproximadamente 75% homología con el gen diana. Los constructos que codifican ARN que expresan una sola transcripción de ADN diseñados para anillarse a un ARN que se expresa por separado, o los constructos sencillos que expresan transcripciones separadas de promotores convergentes tienen adecuadamente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los constructos que codifican ARN que expresan un ARN sencillo diseñados para formar un ARNbc mediante plegado interno usualmente tienen aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.
El promotor utilizado para expresar el constructo que forma ARNbc puede ser cualquier tipo de promotor si el ARNbc resultante es específico de un producto génico en el linaje celular dirigido para destrucción. Alternativamente, el promotor puede ser específico del linaje en el sentido que se expresa solamente en células de un linaje de desarrollo particular. Esto podría ser ventajoso si se observa cierta superposición en homología con un gen que se expresa en un linaje celular no dirigido. El promotor puede ser también inducible por factores controlados externos, o por factores ambientales intracelulares.
Las moléculas de ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos, que dirigen la escisión de ARNm específico al que corresponden, como por ejemplo como lo describen Tuschl et al. en el documento U.S. 2002/0086356, se pueden utilizar para mediar ARNi. Dichas moléculas de ARN de 21 a 23 nt pueden comprender un grupo 3' hidroxilo, pueden ser monocatenarias o bicatenarias (como ARN de 21 a 23 nt) en donde las moléculas de ARNbc pueden tener un extremo romo o comprender extremos colgantes (p. ej., 5', 3').
La molécula de ácido nucleico antagonista puede ser un ARNip. Los ARNip se pueden preparar con cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede hacer referencia a la publicación internacional WO 02/44321, que describe ARNip capaces de degradación específica de secuencias de ARNm diana cuando se aparean las bases con extremos colgantes 3'. Se puede lograr la silenciación de genes específica de las secuencias en células mamíferas que usan ARN sintéticos bicatenarios cortos que imitan a los ARNip producidos por la enzima Dicer. El ARNip se puede sintetizar químicamente o in vitro, o puede ser el resultado de ARN de tipo horquilla bicatenarios cortos (ARNhc) que se procesan en ARNip dentro de las células. Los ARNip sintéticos en general se diseñan usando algoritmos y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores incluyen Ambion (Austin, Tex.), ChemGenes (Ashland, Mass.), Dharmacon (Lafayette, Colo.), Glen Research (Sterling, Va.), MWB Biotech (Esbersberg, Alemania), Proligo (Boulder, Colo.) y Qiagen (Vento, Países Bajos). Los ARNip también se pueden sintetizar in vitro usando kits tales como el kit de construcción de ARNip de Ambion, SILENCERTM.
La producción de ARNip a partir de un vector se realiza más comúnmente a través de la transcripción de los ARN de horquilla corta (ARNhc). Existen kits para la producción de vectores que comprenden ARNhc, como por ejemplo los kits de construcción GENESUPPRESSORTM de Imgenex y los vectores de lentivirus y plásmidos inducibles de ARNi BLOCK-ITTM de Invitrogen. Además, los métodos para la formulación y administración de ARNip a un sujeto también se conocen en la técnica. Véanse, p. ej., los documentos US 2005/0282188; US 2005/0239731; US 2005/0234232; US 2005/0176018; US 2005/0059817; US 2005/0020525; US 2004/0192626; US 2003/0073640; US 2002/0150936; US 2002/0142980; y US 2002/0120129.
Las moléculas de ARNi ilustrativas (p. ej., ARNip y ARNhc de PKC-9) se describen en la técnica (p. ej., Ma et al., 2013. BMC Biochem. 14: 20; y Kim et al., 2013. Immune Netw. 13(2):55-62) o están disponibles comercialmente de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE. UU.), OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD, EE. UU.), Sigma-Aldrich Pty Ltd (Castle Hill, NSW, Australia).
La presente invención contempla además compuestos inhibidores basados en péptidos o polipéptidos para uso en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, se conocen distintos péptidos específicos de regiones variables e isozimas de PKC-0, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen:
(a) péptidos derivados de 0 V1 0 V1-1 y 0 V1-2, que tienen la secuencia de aminoácidos GLSNFDCG [SEQ ID NO:1] (residuos de PKC-0 8-15) o YVESENGQMYI [SEQ ID NO:2] (residuos de PKC-0 36-46), respectivamente, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. núm. 5.783.405;
(b) péptidos derivados de 0 V5 que tienen la secuencia de aminoácidos VKSPFDCS [SEQ ID NO:3] (residuos de PKC-0 655-662) o DRALINS [SEQ ID NO:4], o el péptido modificado VrSPFDCS [SEQ ID NO:5], como se describe, por ejemplo, en el documento US 2004/0009922; y
(c) péptidos derivados de ^0 RACK que tienen la secuencia de aminoácidos KGDNVDLI [SEQ ID NO:6], KGENVDLI [SEQ ID NO:7], KGKEVDLI [SEQ ID NO:8], KGKNVDLI [SEQ ID NO:9], RGKNVELA [SEQ ID NO:10], RGENVELA [SEQ ID NO:11], KGKQVNLI [SEQ ID NO:12], KGKQVNLI [SEQ ID NO:13], KGDQVNLI [SEQ ID NO:14], o KGEQVNLI [SEQ ID NO:15] como se describe, por ejemplo, en el documento US 2010/0311644.
Los péptidos inhibidores de PKC-0, como se describió, por ejemplo, anteriormente, se pueden modificar formando parte de una proteína de fusión. La proteína de fusión puede incluir una proteína de transporte o péptido que funciona para aumentar la absorción celular de los inhibidores de péptidos, tiene otros efectos biológicos deseados, como un efecto terapéutico, o puede tener ambas de estas funciones. La proteína de fusión se puede producir por métodos conocidos por el experto en la materia. El péptido inhibidor se puede unir, o conjugar, a otro péptido en una diversidad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el péptido inhibidor se puede unir a un péptido vehículo u otro péptido descrito en este documento por reticulación, en donde ambos péptidos de la proteína de fusión retienen su actividad. Como otro ejemplo, los péptidos se pueden enlazar o conjugar entre sí mediante un enlace amida desde el C-terminal de un péptido al N-terminal del otro péptido. El enlace entre el péptido inhibidor y el otro miembro de la proteína de fusión puede ser no escindible, con un enlace peptídico, o escindible por ejemplo con un éster u otro enlace escindible conocido en la técnica.
La proteína o péptido de transporte puede ser, por ejemplo, una secuencia derivada de un homeodominio Drosophila Antennapedia que comprende la secuencia de aminoácidos CRQIKIWFQNRRMKWKK [SEQ ID NO:16], y se puede acoplar al inhibidor reticulando mediante un enlace Cys-Cys N-terminal (como se analiza, por ejemplo, en Theodore et al., 1995. J. Neurosci. 15:7158-7167; Johnson et al., 1996. Circ. Res 79:1086). Alternativamente, el inhibidor se puede modificar mediante un polipéptido de transporte derivado de una proteína reguladora de transactivación (Tat) (como de los aminoácidos 47-57 de Tat que se muestran en SEQ ID NO:17; YGRKKRRQRRR) del virus de inmunodeficiencia humana, tipo 1, como se describe en Vives et al., 1997. J. Biol. Chem, 272:16010-16017, patente de EE. UU. núm.
5.804.604 y núm. de acceso en GenBank AAT48070; o con poliarginina como se describe en Mitchell et al., 2000. J. Peptide Res. 56:318-325 y Rolhbard et al., 2000. Nature Med. 6:1253-1257). Los inhibidores se pueden modificar por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica con el fin de aumentar la absorción celular de los inhibidores.
Un péptido inhibidor de PKC-0 se puede introducir también en una célula, introduciendo en la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido inhibidor de PKC-0. El ácido nucleico puede adoptar la forma de un vector de expresión recombinante. La secuencia que codifica el péptido inhibidor de PKC-0 puede estar operativamente enlazada a un elemento(s) de control de la transcripción, p. ej., un promotor, en el vector de expresión. Los vectores adecuados incluyen, p. ej., retrovirus, lentivirus y adenovirus recombinantes; vectores de expresión retrovírica, vectores de expresión lentivírica, vectores de expresión de ácido nucleico y vectores de expresión de plásmidos. En algunos casos, el vector de expresión se integra en el genoma de una célula. En otros casos, el vector de expresión persiste en un estado episomal en una célula.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ello, vectores víricos (p. ej., vectores víricos basados en virus variolovacunal; poliovirus; adenovirus (véanse, p. ej., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PnAs 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociados (véanse, p. ej., Ali et al., Hum Gene Ther 9:8186, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet. 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. 63:3822-3828, 1989; Mendelson et al., Virol. 166:154-165, 1988; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véanse, p. ej., Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); un vector retrovírico (p. ej., virus de leucemia murino, virus de necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como sarcoma virus Rous, sarcoma virus Harvey, virus de leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, sarcoma virus mieloproliferativo y virus de tumores mamarios); y similares.
La presente invención también contempla agentes de moléculas pequeñas que reducen la actividad funcional de la PKC-0 (p. ej., reducen la fosforilación mediada por PKC-0, inhiben la unión de PKC-0 al promotor de CD44 o uPAR, reducen la unión de PKC-0 (p. ej., PKC-0 activa) a cromatina; reducen la inhibición mediada por PKC-0 del factor de intercambio de guanina, GIV/Girdin, reducen la inhibición mediada por PKC-0 de la función de las células T reguladoras, reducen EMT mediada por PKC-0, etc.) para el uso inventivo, es decir, dicho inhibidor selectivo de PKC-0 es para uso con dichas terapias de cáncer para tratar o prevenir cáncer metastásico.
Los agentes de moléculas pequeñas que reducen la actividad funcional de PKC-0 que son adecuados para uso en el contexto de la presente invención incluyen derivados de piridina que inhiben la actividad funcional de PKC-0; compuestos de purina que inhiben la actividad funcional de PKC-0, derivados de pirimidina que inhiben la actividad funcional de PKC-0; compuestos anilina que inhiben la actividad funcional de PKC-0, derivados de indol que inhiben la actividad funcional de PKC-0, y similares.
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre los derivados de indol sustituidos se describen, por ejemplo, por Cooke et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2013/0157980. Los derivados ilustrativos de este tipo incluyen compuesto de acuerdo con la fórmula (I):
Figure imgf000027_0001
o su sal farmacéuticamente aceptable, o su hidrato.
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (I):
X puede ser CH o N;
R puede ser H o PO3H2;
R1 puede ser H; o alquilo C1-4; R2 puede ser H; o alquilo C1-4; R3 puede ser H; alquilo C1-4; CN; Hal; o OH; y R4 y R5 pueden ser, en forma independiente uno del otro, H o alquilo C1-4; o R4 y R5 forman, junto con el átomo de carbono al que están unidos, un grupo cicloalquilo de 3-6 miembros.
Se describen también compuestos de acuerdo con la fórmula (I) en donde:
X puede ser CH;
R puede ser PO3H2;
R1 puede ser H;
R2 puede ser H; o alquilo C1-4; R3 puede ser H; o alquilo C1-4; y R4 y R5 pueden ser, en forma independiente uno del otro, H; o R4 y R5 forman, junto con el átomo de carbono al que están unidos, un grupo cicloalquilo de 3-6 miembros. Se describen también en este documento compuestos de acuerdo con la fórmula (I) en donde:
X puede ser CH;
R puede ser H;
R1 puede ser H;
R2 puede ser H; o alquilo C1-4; R3 puede ser H; o alquilo C1-4; y R4 y R5 pueden ser, en forma independiente uno del otro, H; o R4 y R5 forman, junto con el átomo de carbono al que están unidos, un grupo cicloalquilo de 3-6 miembros. Se describen también en este documento compuestos de acuerdo con la fórmula (I) en donde:
X puede ser N;
R puede ser PO3H2;
R1 puede ser H;
R2 puede ser H; o alquilo C1-4;
R3 puede ser H; y
R4 y R5 pueden ser, en forma independiente uno del otro, H; o R4 y R5 forman, junto con el átomo de carbono al que están unidos, un grupo cicloalquilo de 3-6 miembros.
Se describen también en este documento compuestos de acuerdo con la fórmula (I) en donde:
X puede ser N;
R puede ser PO3H2;
R1 puede ser H;
R2 puede ser H; o alquilo C1-4;
R3 puede ser H; y
R4 y R5 pueden ser, en forma independiente uno del otro, H; o alquilo C1-4.
Los derivados indol sustituidos que inhiben la actividad funcional de PKC-0 pueden incluir compuestos de acuerdo con la fórmula (II):
Figure imgf000028_0001
o su sal farmacéuticamente aceptable.
Los derivados de indol sustituidos que inhiben la actividad funcional de PKC-0 pueden incluir compuestos de acuerdo con la fórmula (III):
Figure imgf000029_0001
o su sal o hidrato farmacéuticamente aceptable.
Los derivados de indol sustituidos que inhiben la actividad funcional de PKC-0 pueden incluir compuestos de acuerdo con la fórmula (IV):
Figure imgf000029_0002
o su sal farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos representativos de los compuestos de fórmula (I) incluyen: mono-[3-[3-(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-1-il]-4-(7-metil-1-H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-ilmetil]éster de ácido fosfórico, mono-hidrato; 3-[3-(4,7-d iaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-1 -il]-1 -hidroximetil-4-(-7-metil-1 H-indol-3-M)-pirrol-2,5-diona o su sal farmacéuticamente aceptable; y mono-{3-(1H-indol-3-il)-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-quinazolin-4-il]-2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1 -ilmetil}ester de ácido fosfórico o su sal farmacéuticamente aceptable.
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre derivados de pirimidina diamina como lo describen, por ejemplo, Zhao et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2013/0143875. Los derivados representativos de este tipo incluyen compuestos de acuerdo con la fórmula (V):
Figure imgf000030_0001
en donde:
R1 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, - C(O)OR1a, -S(O)R1b y -S(O)2R1c; en donde cada uno de R1a R1b y R1c es en forma independiente hidrógeno, alquilo o fenil-alquilo;
Ra, Rb, Rc y Rd se seleccionan, en forma independiente, entre hidrógeno y alquilo;
m es un número entero entre uno y cinco;
p es un número entero entre cero y seis;
R2 se selecciona entre aciloxi, hidroxi, tiol, acilo, alquil, alcoxi, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, acilamino, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halógeno, nitro, aminoaciloxi, oxiacilamino, tiolalcoxi, tiolalcoxi sustituido, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo, -SO2-heteroarilo y trihalometilo;
X1, X2 y X3 son CR5 o uno de X1, X2 y X3 es N y el resto son CR5;
R5 se selecciona entre hidrógeno, halógeno, alquilo y alquilo sustituido;
R3 y R4 se seleccionan, en forma independiente en cada caso, entre hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tiolceto, carboxilo, carboxilalquilo, tiol, tiolalcoxi, tiolalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo; o R3 y R4, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de 4 a 8 miembros;
n es un número entero entre uno y tres;
Z1, Z2 y Z3 se seleccionan entre CR6R6a, N, O y S;
Z4 y Z5 se seleccionan entre N, C y CR6;
R6 se selecciona entre hidrógeno, halógeno, alquilo y alquilo sustituido;
R6a se selecciona entre hidrógeno, halógeno, alquilo y alquilo sustituido o está ausente para satisfacer los requerimientos de valencia; y
las líneas discontinuas representan un enlace sencillo o un doble enlace;
o su sal o solvato o estereoisómero.
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), Ra, Rb, Rc y Rd pueden representar grupos alquilo inferior. Los ejemplos ilustrativos de dichos compuestos incluyen aquellos en los que Ra, Rb, Rc y Rd son grupos metilo y tienen la fórmula (VI):
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X1, X2 y X3 pueden ser cada uno CH. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula (VII):
Figure imgf000031_0001
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X1, X2 y X3 pueden ser cada uno CH; y m es 2. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula (VIII):
Figure imgf000031_0002
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X1, X2 y X3 pueden ser cada uno CH; m es uno; estos compuestos tienen la siguiente fórmula (IX):
Figure imgf000031_0003
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X1, X2 y X3 pueden ser cada uno CH; n es 2; y un conjunto de R3 y R4 es hidrógeno. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula (X):
Figure imgf000031_0004
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X2 puede ser N, y X1 y X3 pueden ser cada uno CH. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula (XI):
Figure imgf000031_0005
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), X3 puede ser N, y X1 y X2 pueden ser cada uno CH. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula (XII):
Figure imgf000032_0001
En los compuestos de acuerdo con la fórmula (V), Z4 puede ser C, y Z5 puede ser N. Dichos compuestos tienen la siguiente fórmula (XIII):
Figure imgf000032_0002
Los compuestos ilustrativos de la fórmula V incluyen: N2-(4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(1,2,2,6,6-p- entametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4H-benzo[b]pirrolo[1,2-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(2,2,6,6-tetra- metilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4H-benzo[b]pirrolo[1,2-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-difluoro-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4--(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-difluoro-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4--(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(5,5-dimetil-5H-benzo[e]tetrazolo[1,5-c][1,3]oxazin-9-il)-5-fluoro-N4- -(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(5,5-dimetil-5H-benzo[e]tetrazolo[1,5-c][1,3]oxazin-9-il)-5-fluoro-N4-(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(8,9-dihidrospiro[benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-4,1'-ciclobutano]-8-il)-5-fluoro-N4-(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(8,9-dihidroespiro[benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-4,1'-ciclobutano]-8-il)-5-fluoro-N4-(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; 5-fluoro-N2-(4-metil-8,9-dihidro-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-N4-(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; 5-fluoro-N2-(4-metil-8,9-dihidro-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-N4-(1,2,2,6,6-pentametilpiperidin-4-il)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-((1,2-,2,5,5-pentametilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-((1,2,2,5,5-pentametilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina; N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-((2,2,5,5-tetra metilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina-; N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(((3S)-2,2,5-trimetilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina y N2-(4,4-dimetil-4H-benzo[b]tetrazolo[1,5-d][1,4]oxazin-8-il)-5-fluoro-N4-(((3R)-2,2,5-trimetilpirrolidin-3-il)metil)pirimidina-2,4-diamina,
o sus sales, solvatos o estereoisómeros
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas alternativos se pueden seleccionar entre compuestos aminopiridina como aquellos descritos, por ejemplo, por Maltais et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2013/0137703. Los compuestos no limitativos de este tipo pueden tener la fórmula (XIV):
Figure imgf000032_0003
o su sal farmacéuticamente aceptable
en donde:
Ri es -H, un grupo alifático C1-C3, F o Cl. El anillo B es un anillo heteroaromático monocíclico de 5 o 6 miembros. X es -CH-, -S- o -NR2-. R2 está ausente o es -H. Y es -Y1 o -Q1. Y1 es un grupo alifático C1-10 opcional e independientemente sustituido con uno o más F.
Q1 es fenilo o un anillo heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre, y Q1 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja. D es el anillo C o -Q-R3.
El anillo C es un anillo monocíclico no aromático de 6-8 miembros que tiene 1-2 átomos de nitrógeno, o un sistema de anillos bicíclico en puente no aromático de 8-12 miembros que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno y oxígeno; y el anillo C está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb.
Q es -NH- o -O-.
R3 es un alquilo C1-10 sustituido con -OH, o -NH2; en donde tres a seis unidades de metileno en R3 pueden opcionalmente formar un anillo cicloalquilo de C3-C6 miembros; y R3 está además opcional e independientemente sustituido con uno o más Je.
Cada Ja es en forma independiente F o alquilo C1-C6.
Jb es alquilo C1-C10 en donde hasta tres unidades de metileno se reemplazan opcionalmente con -O-; y en donde el alquilo C1-C10 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jc; o Jb es cicloalquilo C3-C6, o heteroarilo C5-C6; o Jb fenilo opcional e independientemente sustituido con Jd; o dos Jb en el mismo átomo de carbono forman =O o espiro cicloalquilo C3-C6.
Cada Jc es independientemente F, -OH o cicloalquilo C3-C6.
Cada Jd es en forma independientemente F o Cl.
Cada Je es en forma independiente fenilo, un anillo aromático o no aromático monocíclico de 5-6 miembros que tiene 1­ 3 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre, o dos Je en el mismo átomo de carbono forman un espiro cicloalquilo C3-C6.
u es 0 o 1.
El anillo B puede ser piridilo; el anillo C se puede seleccionar del grupo que consiste en piperidinilo, piperizinilo, diazepanilo, triazepanilo, azocanilo, diazocanilo, triazocanilo, indolilo, indazolilo o diazabiciclooctilo; y el anillo C puede estar opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb y el resto de las variables son como se describió anteriormente.
Los compuestos representativos de acuerdo con la fórmula (XIV) incluyen:
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
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Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
La descripción también contempla compuestos de pirazolopiridina como lo describen, por ejemplo, Jimenez et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2013/0053395. Los derivados ilustrativos de este tipo incluyen compuestos de acuerdo con la fórmula (XV):
Figure imgf000050_0002
o su sal farmacéuticamente aceptable,
en donde:
T es -NH- o está ausente;
cada Jc1 y Jc2 es en forma independiente -CN, -F, -Cl, -OR, -CH2OR o -CF3;
cada U1, U2 y U3 es en forma independiente -H, Z o Jb en donde uno o más de U1, U2 y U3 es -H; o dos de U1, U2 y U3 se unen para formar un anillo cicloalquilo C1-6 que tiene 0-1 heteroátomos opcional e independientemente sustituidos con uno o más Je;
Z es Y2-Q2;
Y2 está ausente o es alquilo C1-6 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jd.
Q2 está ausente o es cicloalquilo C3-8 que tiene 0-1 heteroátomos opcional e independientemente sustituidos con uno o más Je, en donde Y2 y Q2 no están ambos ausentes;
cada Jb es en forma independiente -F, -OR, -CN, -CF3, -N(R)2, -C(O)N(R)2, alquilo C1-6 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja;
cada Ja es en forma independiente -F, -OR, -N(R)2 o -C(O)N(R)2;
cada Jd es en forma independiente -OR, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)2 o F;
cada Je es en forma independiente alquilo Ci-6, -OR, -N(R)2, -CF3 o F; y
cada R es -H o alquilo C1-6.
Puede haber un centro aquiral en el carbono indicado con un *
Los ejemplos de compuestos de acuerdo con la fórmula (XV) incluyen compuestos representados por las siguientes estructuras:
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar también entre compuestos de pirazolopiridina como lo describen, por ejemplo, Boyall et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2012/0071494. Los compuestos de este tipo se representan con la fórmula (XVa):
Figure imgf000053_0002
o su sal farmacéuticamente aceptable,
en donde:
t es 0, 1 o 2;
w es 0 o 1;
cada Jc es en forma independiente -CN, -F, -Cl, -OR, -CH2OR o -CF3;
U es Z o Jb;
Z es Y2-Q2;
Y2 está ausente o es alquilo C1-6 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jd;
Q2 está ausente o es cicloalquilo C3-8 que tiene 0-1 heteroátomos opcional e independientemente sustituidos con uno o más Je, en donde Y2 y Q2 no están ambos ausentes;
cada Jb es en forma independiente -F, -OR, -CN, -CF3, -N(R)2, -C(O)N(R)2, alquilo C1-6 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja;
cada Ja es en forma independiente -F, -OR, -N(R)2 o -C(O)N(R)2;
cada Jd es en forma independiente -OR, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)2 o F;
cada Je es en forma independiente -OR, -CF3, -N(R)2 o F;
T es -CH2-, -CH(Jb)-, -C(Jb)2-, -NH- o -N(Jb)-; y
cada R es -H o alquilo C1-6.
Los compuestos de acuerdo con la fórmula XVa se pueden representar con la fórmula XVa1, como lo describen, por ejemplo, Jimenez et al. (2013, J. Med. Chem. 561799-180):
Figure imgf000054_0001
en donde:
R1 es en forma independiente F, Cl o CF3; y
R2 es en forma independiente H, F, Cl, OH, CN o CH2OH.
El compuesto pirazolopiridina puede estar representado por la fórmula (XVa2)
Figure imgf000054_0002
Este compuesto se designa en Jimenez et al. (2013, J. Med. Chem. 56 1799-180) como (R)-2-(S)-4-(3-cloro-5-fluoro-6-(1H-pirazolo[3,4-ó]piridin-3-ilpiridin-2-il)piperazin-2-il)-3-metilbutan-2-ol o Compuesto 27 (también denominado "C27" en la presente invención).
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre compuestos pirazolopiridina tricíclicos como lo describen, por ejemplo, Brenchley et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2012/0184534. Los compuestos de este tipo se pueden representar con la fórmula (XVI):
Figure imgf000054_0003
o su sal farmacéuticamente aceptable,
en donde:
Ri es -H, halógeno, -OR', -N(R')2, -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NR,C(O)R', NR'C(O)OR', -CN, -NO2, un grupo alifático C1-10 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja, o un grupo alifático C3-8 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb.
R2 es -H, halógeno, -CN, -NO2, -OR', -N(R')2, -C(O)OR', - C(O)N(R')2, -NR'C(O)R', -NR'C(O)OR', un grupo alifático C1-10 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja, o un grupo cicloalifático C3-8 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb.
X es -C- o -N-.
Rx está ausente o es -H.
El anillo B es un anillo heteroaromático monocíclico de 5 miembros opcionalmente condensado a un anillo aromático o no aromático; y el anillo B está opcionalmente sustituido con un Y e independientemente además sustituido en forma opcional e independiente con uno o más Jc.
Y es -Y1-Q1.
Y1 está ausente, o es un grupo alifático C1-10, en donde hasta tres unidades de metileno de
Y1 se reemplazan opcional e independientemente con G' en donde G es -O-, -C(O)-, - N(R')- o -S(O)p-, y Y1 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jd.
Q1 está ausente o es un anillo monocíclico de C3-8 miembros, saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado, que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre; y Q1 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb; en donde Y1 y Q1 no están ambos ausentes.
El anillo C es un anillo de 3-8 miembros saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado monocíclico que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre, o un anillo bicíclico de 8-12 miembros saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado bicíclico que tiene 0-5 heteroátomos seleccionados en forma independientemente entre nitrógeno, oxígeno y azufre; y el anillo C está opcionalmente sustituido con un Z y está además independientemente sustituido en forma opcional e independientemente con uno o más Jb.
Z es -Y2-Q2.
Y2 está ausente, o es un grupo alifático C1-10, en donde hasta tres unidades de metileno de Y2 se reemplazan opcional e independientemente con G' en donde G' es -O-, -C(O)-, - N(R')- o -S(O)p-, y Y2 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jd.
Q2 está ausente, es un anillo monocíclico de C3-8 miembros saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre, o un sistema de anillos bicíclico de 8-12 miembros saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado que tiene 0-5 heteroátomos seleccionados en forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre; y Q2 está opcional e independientemente sustituido con uno o más Je; en donde Y2 y Q2 no están ambos ausentes.
Cada R' es en forma independiente -H o alquilo C1-6 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja.
Cada Ja es en forma independiente halógeno, -OR, -N(R)2, -C(O)OR, -C(O)N(R)2, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -CN, -NO2 u oxo.
Cada Jb es en forma independiente halógeno, -OR, -N(R)2, -C(O)OR, -C(O)N(R)2, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -CN, -NO2, oxo o alquilo C1-C6 opcional e independientemente sustituido con Ja.
Cada Jc es en forma independiente halógeno, -OR', -N(R')2, -C(O)OR', - C(O)N(R')2, -NR'C(O)R', -NR'C(O)OR', -CN, -NO2 o un grupo alifático C1-C10 opcional e independientemente sustituido con uno o más Ja, o un grupo cicloalifático C3-C8 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb.
Cada Jd es en forma independiente halógeno, -CN o -NO2. Cada Je es en forma independiente halógeno, -CN, -NO2, oxo, un grupo alifático C1-10, en donde hasta tres unidades de metileno se reemplazan opcional e independientemente con G' en donde G' es -O-, - C(O)-, -N(R')- o -S(O)p- y el grupo alifático está opcional e independientemente sustituido con uno o más Jd, o Je es un grupo alifático C3-8 opcional e independientemente sustituido con uno o más Jb.
Cada R es en forma independiente -H o alquilo C1-6.
Cada p es en forma independiente 0, 1 o 2.
Los ejemplos representativos de los compuestos de acuerdo con la fórmula (XVI) incluyen:
Figure imgf000056_0001
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas pueden incluir compuestos 2-(amino-sustituidos)-4-aril pirimidina como lo describen, por ejemplo, Fleming et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2011/0071134. Los compuestos representativos de este tipo se representan con la fórmula (XVII):
Figure imgf000057_0001
o su sal farmacéuticamente aceptable,
en donde:
R1 y R2 son cada uno en forma independiente H, alquilo C1-3 o cicloalquilo C3-5;
R3 es H o F;
R4 es H, F, -ORa, -C(O)Ra, -C(O)ORa o -N(Ra)2; o R3 y R4, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo carbonilo; en donde cada caso de Ra es en forma independiente H, alquilo C1-3 o cicloalquilo C3-5;
El anillo A está opcionalmente sustituido con 1 o 2 casos independientes de R5, en donde cada R5 se selecciona en forma independiente entre halo, un grupo alifático C1-4, -CN, -ORb, -SRC-N(Rb)2, -NRbC(O)Rb -NRbC(O)N(Rb)2, -NRbCO2RC, -CO2Rb -C(O)Rb, -C(O)N(Rb)2, -OC(O)N(Rb)2, -S(O)2Rc, -SO2N(Rb)2, -S(O)Rc, -NRbSO2N(Rb)2, -NRbSO2Rc, o un grupo alifático C1-4 opcionalmente sustituido con halo, -c N, -ORb, -SRC, -N(Rb)2, -NRbC(O)Rb, -NRbC(O)N(Rb)2, -NRbCO2RC -CO2Rb, -C(O)Rb, -C(O)N(Rb)2, -OC(O)N(Rb)2, -S(O)2Rc -SO2N(Rb)2, -S(O)Rc, -NRbSO2N(Rb)2 o -NRbSO2Rc, en donde cada caso de Rb es en forma independiente H o un grupo alifático C1-4; o dos Rb en el mismo átomo de nitrógeno tomados juntos con el átomo de nitrógeno forman un anillo aromático o no aromático de 5-8 miembros que tiene, además del átomo de nitrógeno, 0-2 heteroátomos del anillo seleccionados entre N, O o S; y cada caso de RC es en forma independiente un grupo alifático C1-4;
Cy1 se selecciona entre: a) un anillo arilo o heteroarilo de 6 miembros sustituido con un caso de W en la posición meta o para del anillo; o b) un anillo heteroarilo de 5 miembros sustituido con un caso de W;
en donde Cy1 está además opcionalmente sustituido con uno a tres casos independientes de R6, en donde cada caso de R6 se selecciona en forma independiente entre -halo, un grupo alifático C1-8, -CN, -ORb, -SRC, -N(RE)2, -NREC(O)Rb, -NREC(0)N(RE)2, -NReCO2Rd, -CO2Rb, -C(O)Rb, -C(O)N(RE)2, -OC(O)N(RE)2, -S(O)2RD, -SO2N(RE)2, -S(0)RD, -NRes O2N(Re)2, -NReSO2Rd, -C(=NH)-N(Re)2 o un grupo alifático C1-8 opcionalmente sustituido con halo, -CN, -ORb, -SRC, -N(Re)2, -NREC(O)Rb, - NReC(O)N(Re)2, -NReCO2Rd, -CO2Rb, -C(O)Rb, -C(O)N(RE)2, -0C(O)N(RE)2, - S(O)2RD, -SO2N(Re)2, -S(O)Rd, -NReSO2N(Re)2, -NReSO2Rd o -C(=NH)-N(RE)2, en donde cada caso de RD es un grupo alifático
C1-6 y cada caso de RE es en forma independiente H, un grupo alifático C1-6, -C(=O)Rb, -C(O)ORb o -SO2Rb; o dos RE en el mismo átomo de nitrógeno tomados junto con el átomo de nitrógeno forman un anillo aromático o no aromático de 5-8 miembros que tiene, además del átomo de nitrógeno, 0-2 heteroátomos del anillo seleccionados entre N, O o S;
W es -R8, V-R8, L1-R7, V-L1-R7, L1-V-R8 o Ü-V-L2-R7; en donde: L1 y L2 son cada uno en forma independiente una cadena de alquileno C1-6 opcionalmente sustituido; V es -CH2 , O, S, S(O)-, -S(O)2-, -C(O)-, -CO2-, -n Re-NReC(O)-, -NReCO2-, - NReSO2-, -C(O)N(Rb)-, -SO2N(Rb)-, -NREC(O)N(Rb)- o -OC(O)-; R7 es H, halo, -OH, -N(RF)2, -CN, -ORG, -C(O)RG, -CO2H, -CO2Rg, -SRg, -S(O)Rg, -S(O)2Rg, -N(Re)C(O)Rg, -N(Re)CO2Rg, -N(Re)SO2Rg, -C(O)N(Rf)2, -SO2N(RF)2, -N(Re)C(O)N(Rf)2, -OC(O)Rf o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre un grupo alifático C1-10, arilo C6-10, heterociclilo de 3-14 miembros o heteroarilo de 5-14 miembros, en donde cada caso de RF es en forma independiente H, un grupo alifático C1-6, arilo C6-10, heterociclilo de 3-14 miembros, heteroarilo de 5-14 miembros, -C(=O)Rb, -C(O)ORb o -SO2Rb; o dos RF en el mismo átomo de nitrógeno, tomados junto con el átomo de nitrógeno, forman un anillo aromático o no aromático de 5-8 miembros opcionalmente sustituido que tiene, además del átomo de nitrógeno, 0-2 heteroátomos del anillo seleccionados entre N, O o S; y cada caso de RG es un grupo alifático C1-6, arilo
C6-10, heterociclilo de 3-14 miembros o heteroarilo de 5-14 miembros; R8 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre un grupo alifático C1-10, arilo C6-10, heterociclilo de 3-14 miembros o heteroarilo de 5-14 miembros;
Q es un enlace, CH2 o C(=O);
Cy2 es un arilo C6-10, un anillo heteroarilo de 5-10 miembros o un anillo heterociclilo de 5-10 miembros, en donde cada anillo está opcionalmente sustituido con uno a tres casos independientes de R9 y un caso de R10,
en donde cada caso de R9 se selecciona en forma independiente entre un grupo alifático C1-4, -N(Rb)2, halo, NO2, -CN, -ORb, -C(0)1e, -OO21e, -SRC, -S(O)Rc, - S(O)2Rc, -OS(O)2Rc-, N(Rb)C(O)Ra, -N(Rb)CO2 Ra, -N(Rb)SO2Ra, SO2N(Rb)2, -N(Rb)C(O)N(Rb)2, -Oc(O)Ra o un grupo alifático C1-4 opcionalmente sustituido con - N(Rb)2, halo, NO2, -Cn , -ORb, -C(O)Ra, -CO2Ra, -SRC, -S(O)Rc, -OS(O)2Rc, - S(O)2Rc, -N(Rb)C(0)1e, -N(Rb)CO2Ra, -N(Rb)S02Ra, -C(O)N(Rb)2, -SO2N(Rb)2, - N(Rb)C(O)N(Rb)2 o -OC(O)Ra, y
R10 se selecciona entre fenilo o un anillo heterociclilo o heteroarilo de 5-6 miembros.
Los compuestos de fórmula XVII se pueden someter a uno o más, o todas las siguientes limitaciones:
1) cuando Cy1 es fenilo sustituido en la posición meta con W entonces:
a) cuando W es -OMe, R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, y Q es un enlace, entonces el anillo A se sustituye además con R5, R5 es un grupo distinto de -CF3 o - C(O)N(Rb)2; y
b) cuando W es -OMe, R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, y Q es - CH2-, entonces Cy2 es distinto de 1H-benzimidazol-1-ilo;
2) cuando Cy1 es fenilo sustituido en la posición para con W, y R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, entonces: a) cuando Q es un enlace, W es distinto de: i) -CONH2; ii) -CONHR8, en donde R8 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre fenilo, -alquilfenilo, alquilo o -alquilheterociclo; iii) -CF3; iv) -SO2Me; v) -NH2; vi) -tBu; vii) -CO2H cuando Cy2 es morfolina; viii) -O(fenilo) cuando Cy2 es indol; y ix) -OMe;
b) cuando Q es -CH2-, W es distinto de: i) -CONH2, cuando Cy2 es imidazol o bencimidazol opcionalmente sustituido; ii) -CONHR8, en donde R8 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre fenilo, -alquilfenilo o -alquilheterociclo; iii) -CF3; iv) -SO2Me; v) -OH, en donde Cy2 es un anillo heterociclilo de 5-10 miembros; vi) tBu, cuando Cy2 es un anillo heterociclilo de 5-10 miembros; y vii) -OMe; y 3) cuando Cy1 es un anillo heteroarilo de 5 miembros, entonces:
a) cuando Cy1 es isoxazol, R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, Q es un enlace y W es p-fluoro-fenilo, entonces Cy2 es un grupo distinto de piridilo o N-pirrolidinilo;
b) cuando Cy1 es triazolilo, R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, Q es un enlace y W es -(CH2)2N(ciclopentil)C(O)CH2(naftilo), entonces Cy2 es un grupo distinto de N-piperidinilo;
c) cuando Cy1 es imidazolilo, R1, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, Q es un enlace y W es meta-CF3-fenilo, entonces R6 es un grupo distinto de C(O)OCH2CH3; y
d) cuando Cy1 es imidazol-5-ilo y W es para-fluoro-fenilo, entonces R6 es un grupo distinto de ciclohexilo.
Los compuestos de este tipo se pueden representar con las siguientes estructuras:
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Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas pueden incluir derivados de pirimidina como lo describen, por ejemplo, Cardozo et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2005/0124640. Los compuestos representativos de este tipo se representan con la fórmula (XVIII):
Figure imgf000107_0002
en donde:
R1 es alquilo C1-C8, cicloalquilo C3-7, cicloalquil C3-7-alquilo C1-8, naftilo, quinolinilo, aril-alquilo C1-C8, o heteroaril-alquilo C1-C8, en donde en cada uno de los grupos alquilo C1-C8 un grupo metileno puede opcionalmente reemplazarse con -NHC(O)- o -C(O)NH-, y en donde cada uno de los grupos alquilo C1-C8 está opcionalmente sustituido con un grupo oxo o uno o más grupos alquilo C1-C3 en donde dos sustituyentes alquilo en el mismo átomo de carbono de un grupo alquilo C1-C8 pueden opcionalmente combinarse para formar un puente alquileno C2-5, y en donde el grupo arilo está opcionalmente sustituido en átomos de carbono adyacentes por un grupo puente alquileno C3-6 en donde un grupo metileno se reemplaza opcionalmente con un oxígeno, -S- - S(O)-, -SO2- o -N(R6)-;
O R1 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000107_0003
en donde x e y son en forma independiente 0, 1, 2, 3 o 4, siempre que x+y sea 2 a 4, z es 0, 1 o 2, y uno o dos grupos CH2 en el anillo pueden opcionalmente reemplazarse con -O , S , S(O)-, -SO2- o -N(R6);
en donde cada grupo R1 está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, halógeno, nitro, hidroxi, alquiloxi C1-6, alquiltiol C1-6, arilo, arilalquilo C1-6, ariloxi, ariltiol, aminosulfonilo o amino opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-6, en donde cada grupo arilo está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-6, y en donde en cada uno de los grupos alquilo C1-6, un grupo metileno se puede reemplazar con -NHC(O)- o -C(O)NH-, y en donde cada uno de los grupos alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos;
R2 se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000108_0001
en donde:
n es un número entero entre 3 y 8;
p es un número entero entre 1 y 3;
q es un número entero entre 0 y 3;
R4 y R5 se seleccionan cada uno en forma independiente entre hidrógeno, alquilo C1-6, aril-alquilo C1-6 o amidino, en donde cada grupo arilo está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-6, y en donde cada uno de los grupos alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, y en donde el amidino está opcionalmente sustituido con uno a tres alquilo C1-6;
R6 es hidrógeno o alquilo C1-6;
en donde cada grupo R2 está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C1-6, alcoxi C1-6, CN, -OH, -NH2 o halógeno;
R3 es halógeno, ciano, nitro, alquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6 o aminocarbonilo, en donde cada uno de los grupos alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos;
o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino,
En algunos compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII):
R1 puede ser alquilo C1-4 o heteroaril-alquilo C1-4, en donde en cada uno de los grupos alquilo C1-4 un grupo metileno puede opcionalmente reemplazarse con -NHC(O)- o - C(O)NH-, y en donde cada uno de los grupos alquilo C1-4 puede opcionalmente sustituirse con un grupo oxo o uno o más grupos alquilo C1-3 en donde dos sustituyentes alquilo en el mismo átomo de carbono de un grupo alquilo C1-4 pueden opcionalmente combinarse para formar un puente alquileno C2-5, y en donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con átomos de carbono adyacentes por un grupo puente alquileno C3-6 en donde un grupo metileno puede opcionalmente reemplazarse con un oxígeno, azufre o -N(R6)-; o R1 puede tener la siguiente estructura:
Figure imgf000109_0001
en donde x e y pueden ser en forma independiente 0, 1, 2 o 3, siempre que x+y sea 2 a 3, y z sea 0 o 1;
en donde "heteroarilo" se define como piridilo, furilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo o indolilo;
en donde cada grupo R1 puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo C1-6, Cl, Br, F, nitro, hidroxi, CF3, -OCF3, -OCF2H, - SCF3, alquiloxi C1-4, alquiltiol C1-4, fenilo, bencilo, feniloxi, feniltiol, aminosulfonilo o amino opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-3;
R2 se puede seleccionar de los siguientes grupos:
Figure imgf000109_0002
en donde:
n es un número entero entre 5 y 7;
p es un número entero entre 1 y 2;
q es un número entero entre 1 y 2;
R4 y R5 se seleccionan cada uno en forma independiente entre hidrógeno, alquilo C1-6, aril-alquilo C1-6 o amidino;
R6 es hidrógeno;
R3 es Br, Cl, F, ciano o nitro;
o su tautómeromero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino;
En otros compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII):
R1 puede ser fenil-alquilo C1-4 o naftil-alquilo C1-C2,
en donde cada grupo Ri puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: metilo, Cl, Br, F, nitro, hidroxi, CF3, -OCF3, -SCF3, alquiloxi C1-4 o alquiltiol C1-4;
R2 se puede seleccionar de los siguientes grupos:
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En donde:
R4 y R5 se pueden seleccionar en forma independiente entre hidrógeno, alquilo C1-3 o amidino;
R3 puede ser Br, Cl, ciano o nitro;
o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino;
Incluso en otros compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII):
R1 puede ser feniloCH2-en donde el grupo fenilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: metilo, Cl, Br, F, nitro, hidroxi, CF3, -OCF3, -SCF3, alquiloxi C1-4 o alquiltiol C1-4;
R2 se puede seleccionar entre los siguientes grupos:
Figure imgf000110_0002
R3 puede ser nitro;
R4 y R5 se pueden seleccionar cada uno en forma independiente entre hidrógeno, metilo o amidino;
o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amina.
Los ejemplos no limitativos de los compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII) se pueden seleccionar entre: 4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-2-[(2-clorobencil)amino]pirimidina-5-carboxilato de etilo; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-5-nitro-N2-[(2R)-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(2S)-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il]pirimidina-2,4-diamina, N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(1 R)-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-1-il]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-5-nitro-N2-[(1S)-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-1-il]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-(4-clorofenil)etil]-5-nitropinmidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[-(2-metilfenil)etil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2]-(3-metilfenil)etil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2]-(4-metilfenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2[2--(2-fluorofenilpentil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-N2[-(3-fluorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2[-(4-fluorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-(2-aminobencil)-N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3,5-dimetoxibencil)-5-nitropirimidina-2-,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-3,5-bis(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; {3-[({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropinmidin-4-il}amino)metil]fenil}metanoamina; 2-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5--nitropirimidin-2-ilamino}metil)fenol; N2-(5-amino-2-clorobencil)-N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitropinmidina-2,4-diamina; 4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-2-[(2-clorobencilamino]pirimidina-5-carboxamida; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-clorobencil)-5-fluoropirimidina-2,4-diamina; 3-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2 illamino}metil)-N2-(2-metilfenil)etil]benzamida; (1S,2R)-2-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-ilamino} metil)ciclohexanol; (1R,2R)-2-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-il]amino}metil)ciclohexanol; 4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-2-[(2-clorobencilamino]pirimidina-5-carboxilato de metilo; 4-{[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-il]amino}-N[2-(2-metilfenil)etil]butanamida; 5-{[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-illamino}-N[2-(2-metilfenil)etil]pentanamida, 6-{[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-illamino}-N[2-(2-metilfenil)etil]hexanamida; (1R,3R)-3-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-il]amino}metil)-4,4-dimetilciclohexanol; N4-({4-cis-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; 5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N2-(1-naftilmetil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[(dimetilamino)metil]bencil}-N2[(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[(dimetilamino)metil]bencil}-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[(dimetilamino)metilbencil}-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-N2-](metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2-,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-ilmetil]-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropinmidine-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-5-nitropinmidina-2,4-diamina; N2-(2-metoxibencil)-N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-metoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil} -5-nitro-N2{[4-(trifluorometil)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(-2,4-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-N2-(3-metoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[4-fluoro-2-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil} -N2-(3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4- { [4-(aminometil)ciclohexil]metil } -5-nitro-N2-(piridin-2-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)-ciclohexil]metil}-N2-(3-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N-(4-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil} -N2-(2,4-dimetoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N-[2-cloro-5-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2-(trifluorometoxi)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-6-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-N2-(2-furilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(tien-2-ilmetilpirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-N2-(2-clorobencil)-5-metilpirimidina-2,4-diamina; N4-(6-aminohexil)-N2-(2-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4{[(aminometibencil-N2-(2-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-(7-aminoheptil)-N2-(2-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[3-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(1-metil-1-feniletil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; 4-(4,4'-bipiperidin-1-il)-N-(2-clorobencil)-5-nitropirimidin-2-amina; N2-(2-clorobencil)-N4-(14-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitropiridin; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,5-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,-4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-[4-(difluorometoxi)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-etoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(1S)-1-feniletil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}- N4-{[4-2-(2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2.4- dia mina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(4-pentilbencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-butoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-dimetoxibencil)-5-nitropinmidina-2.4- diamina; N4-{[4-(aminometil)-ciclohexil]metil}-N2-(2,5-dimetoxibencil)-5-nitro-pirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-N4-[7-(dimetilamino)heptil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(1,1'-bifenil-2-ilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(-4-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,4-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(3-fluoro-4-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2-clorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]- metil}-N2-(2,6-dimetoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-N2-(2,6-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2[2-fluoro-3-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(1-fenilciclopropil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[1-(2-clorofenil)-1-metiletil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-dihidro-1-benzofuran-5-ilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(1,5-dimetil-1H-pirrol-2-il)metil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-dimetilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,4-dimetilbencil)-5-nitropirimidina-2-,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,5-dimetilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; 2 N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-fluoro-5-(trifluorometil)bencil[-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2-(metiltio)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5--nitro-N2-{2-(trifluorometil)tiol-bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometiciclohexil]metil}-N2-(3-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(6-cloro-2-fluoro-3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometiciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-6-fluoro-3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2-naftil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-NN2-[2-fluoro-4-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(5-cloro-2-)metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexillmetil}-N2-(3-cloro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-N2-[5-fluoro-2-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-N2+5-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-difluoro-4-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(5-fluoro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-1-naftill-5-nitropirimidina-2,4-diamina; {4-trans-[({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]ciclohexil}metanol; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2,5-diclorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2,4-diclorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2-bromobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N.su-p.2-(ciclohexilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-[(trifluorometoxi)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-[(trifluorometil)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(difluorometoxi)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N243-(difluorometoxi)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2[2-cloro-4-fluorobencil)-5-nitropirimidina--2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)-ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-3,6-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2,3,5-trifluorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2,3,4,5-tetrafluorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(1R)-1-feniletil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2,3-dihidro-1H-inden-2-il-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(1S)-2,3-dihidro-1H-inden-1-il]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(1R)-2,3-dihidro-1H-inden-1-il]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-1-naftil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-metoxi-2-naftil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-quinolin-6-ilpirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-trans-(aminometilciclohexil]metil}-N2-(2,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-trans-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-(2-clorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2{[-(3-clorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro--6-fenoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-2-naftilpirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(1-naftilmetil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5 -nitro-N2-(piridin-3-ilmetil)pirimidina-2.4- diamina; 4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-2-[(2-clorobenzilamino]pirimidina-5-carbonitrilo; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2{[-(dimetilamino)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-trans-(aminometiciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-(7-aminoheptil)-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-(7-aminoheptil)-N2-(2,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N-({4-[({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]ciclohexil}metil-)guanidina, N2-(3-aminobencil)-M-{-[4(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2-nitrobenzil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[-2-(2-bromofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-cloropirimidina-2,4-diamina; cloruro de (4-{[(2-{[2-(1H-indol-3-iletil]amino}-5-nitropirimidin-)4-il)aminolmetil}ciclohexil)metanaminio; N-({3-({2-[(2-clorobencil)-amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]ciclohexil}metil)guanidina; 3-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5- nitropirimidin-2-illamino}metil)fenol; cloruro de (4-{[(2-{[2-(1 H-imidazol-4-il)etil]amino}-5-nitropirimidin-4-il-aminolmetil}ciclohexil)-metanaminio; N2-(2-clorobencil)-M-({4-cis-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-cloro-N2-(2-clorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2.4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2-feniletil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(3-fenilpropil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(4-fenilbutil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil-lmetil}-5-nitro-N2-(2-fenilpropil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2{[-(4-metoxifenil)etil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-metoxifenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-(2-metoxifenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; 4-[({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]piperidina-1-carboximidamida; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2.4- diamina; N4-(5-aminopentil)-N2-(2-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; 2-(bencilamino)-4-(1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)-5-trifluorometil-pirimidina; 2-(4-clorobencilamino)-4-(1,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-5-nitro-pirimidina; 2-(2-clorobencilamino)-4-(1,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-5-nitro-pirimidina; 2-(bencilamino)-4-(1,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-5-nitro-pirimidina; o N4-{[trans-4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2[2-(trifluorometoxi)bencil]pirimidina-2,4-diamina.
Los compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII) se pueden seleccionar entre:
N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(2R)-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-(4-clorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(3-metilfenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-[2-(4-metilfenil)eti]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2[-(3-fluorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2]2-(4-fluorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; (1R,3R)-3-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-illamino}metil)-4,4-dimetilciclohexanol; N4-({4-cis[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftilmetil)-5- nitropirimidina-2,4-diamina; N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-n itro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; 5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)-N2-{-2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N2-(1-naftilmetil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetilpirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil-)-N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftil-metil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[dimetilamino)meti]lbencil}-N2-[(metiltiol)bencil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[dimetilamino)metil]bencil}-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-ilmetil]-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol] bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-metoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(trifluorometil)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,- 4-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2(4-fluoro-2-(trifluorometil) bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-bromobencil-)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[cloro-5-(trifluorometil) bencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(trifluorometoxi)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-6-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[3-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2--clorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitropirimidina-2.4- diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,5-difluorobencil)-5-nitropirimidina- 2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexillmetil}-N2{2-etoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-metilbencil)-5-ni-tropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(1, 1 '-bifenil-2-ilmetil)-5- nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,4-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2(2,3-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,6-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[fluoro-3-(trifluorometil)bencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-dimetilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometiltiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(6-cloro-2-fluoro-3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-6-fluoro-3-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2-naftil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina- 2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-2-metilbencil)-5- nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(5-cloro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(3-cloro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[5-fluoro-2-(trifluorometil)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(5-cloro-2-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-difluoro-4-metilbencil)-5- nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(5-fluoro-2-metilbencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2,-5-diclorobencil)pirimidina-2.4- diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-5-bromo-N2-(2-bromobencil) pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(ciclohexilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4- [4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-[2- (trifluorometil)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(difluorometoxi)bencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-4-fluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil-)ciclohexil]metil}-N2-(2-cloro-3,6-difluorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2,3,5-trifluorobencil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2,-3-dihidro-1H-inden-2-il-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-cloro-1-naftil)- -5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(4-metoxi-2-naftil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-quinolin-6-ilpirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-trans-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[2-(2-clorofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-2-(3-clorofenil)etil-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-bromo-N2-2-naftilpirimidina-2,4-diamina; 4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-2-[(2-clorobencil)amino]pirimidina-5-carbonitrilo; N4-{[4-trans-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-brom-obencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-(7-aminoheptil)-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-(7-aminoheptil)-N2-(2,5-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N-({4-[({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]ciclohexil}metil)guanidina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2-nitrobencil)pirimidina-2,4-diamina; -4-[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-[(2-bromofenil)etil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-cloropirimidina-2,4-diamina; N-({3-({2-[(2-clorobencil)amino]-5-nitropirimidin-4-il}amino)metil]ciclohexil}metil)guanidina 3-({[4-({[4-(aminometil)ciclohexil]metil}amino)-5-nitropirimidin-2-il]amino }metil)fenol; N2-(2-clorobencil)-N4-({4-cis-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(2-feniletil)pirimidina-2,4-diamina; N4-{ [4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-(4-fenilbutil)pirimidina-2,4-diamina; o N4-{[trans-4-(aminometil)ciclohexilmetil}-5-nitro-N2-[2-(trifluorometoxi)-bencil]pirimidina-2,4-diamina.
Otros compuestos derivados de pirimidina de fórmula (XVIII) se pueden seleccionar entre:
N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftilmetil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; 5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)-N2-{-2-[(trifluorometil)tiol] bencil}pirimidina-2.4- diamina; N2-(1-naftilmetil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil-)-N2-(2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-N2-(1-naftil-metil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[(dimetilamino)metil]bencil}-N2-[2-(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{4-[dimetilamino)metil]bencil}-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol] bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-il)metil]-N2-[(metiltiol)bencil]-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-[(1-metilpiperidin-4-ilmetil]-5-nitro-N2-{2-[(trifluorometil)tiol]bencil}pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-metoxibencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[2-(trifluorometoxi)bencil]pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]-metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2.4- diamina; N4-{[3-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-clorobencil 1)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-N-4-({4-[(dimetilamino)metil]ciclohexil}metil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexillmetil}-N2[2-(metiltiol)bencil-1-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil} -5-nitro-N2-{2-[trifluorometil)tiol]bencil}-pirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometilciclohexil]metil}-N2-(1-naftilmetií)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2,3-diclorobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N4-{[4-(aminometil)ciclohexil]metil}-N2-(2-bromobencil)-5-nitropirimidina-2,4-diamina; N2-(2-clorobencil)-5-nitro-N4-(piperidin-4-ilmetil)pirimidina-2,4-diamina; o N4-{[trans-4-(aminometil)ciclohexil]metil}-5-nitro-N2-[(trifluorometoxi)-benci]lpirimidina-2,4-diamina.
Los derivados de pirimidina inhibidores de PKC-0 alternativos pueden incluir los compuestos descritos por Barbosa et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2010/0318929. Estos compuestos se representan con la fórmula (XIX):
Figure imgf000114_0001
R1 se puede seleccionar entre los siguientes grupos:
Figure imgf000115_0001
en donde: p es 1, 2 o 3; q es 0 o 1, R5, R6 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (A) hidrógeno, (B) alquilo C1-6, o donde R5 y R6 juntos constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cuatro a seis miembros en el que uno de los grupos metileno se reemplaza opcionalmente con un átomo de oxígeno o nitrógeno, y en donde el anillo está opcional e independientemente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: (i) alquilo C1-6 (ii) COR7, en donde R7 es: (a) alquilo C1-6, (b) alquiloxi C1-6, (C) alquilcarbonilo C1-6, (D) alquilsulfonilo C1-6, (E) -CONR8R9, en donde R8 y R9 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (i) hidrógeno (ii) alquilo C1-6; R2 se selecciona de los siguientes grupos: (F) CF3, (G) ciano, (H) CONH2 (I) halógeno o (J) nitro; R3 se selecciona de los siguientes grupos: (A) hidrógeno, (B) alquilo C1-6, opcionalmente sustituido con halógeno, (C) alquiloxi C1-6, opcionalmente sustituido con halógeno, (D) halógeno, R4 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) heteroarilo, que está opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; (B) arilo o heteroarilo, que está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: (i) alquilo C1-6, que está sustituido con hidroxilo, oxo o NR10R11, en donde R10 y R11 se seleccionan cada uno en forma independiente de los siguientes grupos: (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6, que está opcionalmente sustituido con hidroxilo o CONH2, (c) alquilcarbonilo C1-6, que está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, (d) alquilsulfonilo C1-6, (e) o en donde R10 y R11 constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cuatro a seis miembros, (ii) CONR12R13, en donde R12 y R13 se seleccionan, cada uno en forma independiente, entre hidrógeno o alquilo C1-6, (iii) SO2NR12R13, en donde R12 y R13 se seleccionan cada uno en forma independiente entre hidrógeno o alquilo C1-6, (C)-NR14R15, en donde R14 y R15 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (i) alquilcarbonilo C1-6, que está sustituido con amino, (ii) o en donde R14 y R15 constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cuatro a siete miembros, en donde uno de los grupos metileno está sustituido con alquilo C1-6, y en donde cada alquilo C1-6 está opcionalmente sustituido con hidroxilo o NR10R11, en donde R10 y R11 son como se definió previamente, (D)-CONR16R17, en donde R16 y R17 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (i) alquilo C1-6, que está sustituido con hidroxilo o NR18R19, en donde R18 y R19 se seleccionan cada uno en forma independiente entre hidrógeno o alquilo C1-6, o en donde R18 y R19 constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cuatro a seis miembros, en donde uno de los grupos metileno se reemplaza opcionalmente con un oxígeno; (E) grupo alquinilo C1-6 opcionalmente sustituido con amino, C1-3, o di-(alquilC1-3)amino y A se selecciona en forma independiente entre carbono o nitrógeno, o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino.
En ejemplos ilustrativos de este tipo, R1 se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000116_0001
hidrógeno, (B) o en donde R5 y R6 juntos constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cinco a seis miembros en el que uno de los grupos metileno se reemplaza opcionalmente con un átomo de nitrógeno, y en donde el anillo está opcional e independientemente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: (iv) alquilo C1-6 (v) COR7, en donde R7 es alquiloxi C1-6, (C) alquilcarbonilo C1-6 (D) alquil C1-6sulfonilo; R2 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) ciano o (B) nitro; R3 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) alquilo C1-3, (B) alquiloxi C1-3 que está opcionalmente sustituido con flúor, (C) halógeno; R4 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) arilo, que está sustituido con uno o más de los siguientes grupos: (i) alquilo C1-3, que está sustituido con hidroxilo o NR20R21, en donde R20 y R21 se seleccionan cada uno en forma independiente entre los siguientes grupos: (f) hidrógeno, (g) alquilo C1-3, que está opcionalmente sustituido con hidroxilo o CONH2, (h) o en donde R20 y R21 constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cinco a seis miembros, (ii) CONH2 (iii) SO2NH2, (B) 3-piridilo, que está opcionalmente sustituido con alquilo C1-3, en donde cada grupo alquilo está opcionalmente sustituido con amino, (C) -NR22R23, en donde R22 y R23 constituyen un puente metileno que, junto con el átomo de nitrógeno entre ellos, forma un anillo de cinco a seis miembros, en donde uno de los grupos metileno se sustituye con alquilo C1-3, y en donde cada alquilo C1-3 está opcionalmente sustituido con OH o NR20R21, en donde R20 y R21 son como se definió previamente, (D) -CONR24R25, en donde R24 y R25 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (i) alquilo C1-3, que está sustituido con alquilamino C1-3; y A se selecciona en forma independiente entre carbono o nitrógeno; o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino.
En otros ejemplos ilustrativos, los compuestos de fórmula (XIX) se representan con la fórmula (XIXa):
Figure imgf000116_0002
en donde
R1 se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000117_0001
en donde: q es 0 o 1, R5, R6 se seleccionan cada uno en forma independiente entre: (A) hidrógeno, (B) alquilcarbonilo C1-6, (C) alquilsulfonilo C1-6; R2 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) ciano o (B) nitro; R3 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) CH3, (B) OCF3, (C) Cl; R4 se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000117_0002
en donde: R26 se selecciona entre los siguientes grupos: (A) alquilo C1-3, que está sustituido con hidroxilo o NR27R28, en donde R27 y R28 se seleccionan cada uno en forma independiente entre los siguientes grupos: (i) hidrógeno, (ii) alquilo C1-3 que está opcionalmente sustituido con hidroxilo o CONH2, (B) CONH2 (C) SO2NH2; y A es carbono o nitrógeno; o su tautómero, sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado protegido con amino.
También se contemplan como inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas los compuestos anilina descritos, por ejemplo, por Ajioka et al. en la publicación de EE. UU. núm. 2010/0120869. Los compuestos representativos de este tipo se representan con la fórmula (XX):
Figure imgf000117_0003
en donde X de fórmula XX es arilo o heteroarilo, cada uno sustituido con 1-5 grupos R1. Y de fórmula XX es -O-, S(O)n-, -N(R4)- y -C(R4)2,-, en donde el subíndice n es 0-2. Z de fórmula XX es -N= o -CH=. Cada R1 de la fórmula XX se selecciona en forma independiente del grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C1-8, heteroalquilo C1-6, haloalquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalcoxi C1-6, -OR1a, -C(O)R1a, -C(O)OR1a, - C(O)NR1aR1b, NR1aR1b, SR1a, N(R1a)C(O)R1b, K )C(O)OR1b, -N(R1a)C(O)NR1aR1b, OP(O)(OR1a)2, -S(O)2OR1a, -S(O)2NRS(O)2-haloalquilo C1-6, -CN, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo. Cada uno de R1a y R1b de fórmula XX es independientemente H o alquilo C1-6. Cada R2 de fórmula XX es en forma independiente H, halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -NR1aR1b, NR1aC(O) alquilo C1-6, -NR1aC(O)-haloalquilo C1-6, -NR1a (CH2) NR1aR1b, NR1aC(O)NR1aR1b o NR1a C(O)OR1a, alternativamente, grupos R1 adyacentes y grupos adyacentes R2 se pueden combinar para formar un cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo. R3 de fórmula XX es -NR3aR3b o -NCO. Cada uno de R3a y R3b de fórmula XX son en forma independiente H, alquilo C1-6, -C(O)-alquilo C1-6, -C(O)-haloalquilo C1-6, -(CH2)-NR1aR1b, C(O)NR1aR1b, C(O)OR1a, -C(S)CN, un residuo de aminoácido, un péptido o un oligopéptido. Cada R4 de fórmula XX es en forma independiente H o alquilo C1-6, o cuando más de un grupo R4 se une al mismo átomo, los grupos R4 se combinan opcionalmente para formar un cicloalquilo C5-8. Los compuestos de fórmula XX también incluyen sus sales, hidratos y profármacos.
Algunos compuestos anilina de fórmula XX se pueden representar con la fórmula XXa:
Figure imgf000118_0001
en donde cada R1 de fórmula XXa es en forma independiente H, halógeno, alquilo Ci-8, heteroalquilo Ci-6, haloalquilo Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalcoxi C1-6, -OR1a, -CN, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, y cada uno de R3a y R3b de fórmula XXa es independientemente H, -C(O)-alquilo C1-6, un residuo de aminoácido, un péptido o un oligopéptido.
Cada uno de R1 de fórmula XXa puede ser también en forma independiente H, halógeno, alquilo C1-8, haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6, -C(O)OR1a, cicloalquilo o heteroarilo. Asimismo, cada R2 de fórmula XXa puede ser en forma independiente H, halógeno o -NR1aC(O) alquilo C1-6. Cada R1 de fórmula XXa puede ser en forma independiente H, metilo, n-propilo, isopropilo, t-butilo, t-pentilo, Cl, Br, CF3, OCF3, ciclopentilo, pirrolilo o CO2H, y cada R2 puede ser en forma independiente H o Cl. R3a de fórmula XX puede ser un residuo de aminoácido, y R3b puede ser H. Adecuadamente, el residuo de aminoácido puede ser un residuo arginina.
Los compuestos anilina de fórmula XX pueden tener la fórmula XXb:
Figure imgf000118_0002
Y de fórmula XXb puede ser S. Y de fórmula XXb puede ser O. Cada R1 de fórmula XXb puede ser en forma independiente H, metilo, n-propilo, isopropilo, t-butilo, t-pentilo, Cl, Br, CF3, OCF3, ciclopentilo, pirrolilo o CO2H. R1 de fórmula XXb puede ser en forma independiente alquilo C1-8 o cicloalquilo. Cada R1 de fórmula XXb puede ser en forma independiente 4-t-butilo, 4-ciclopentilo o 4-t-pentilo.
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre rottlerin (también conocido como mallotoxin o 1-[6-[(3-acetil-2,4,6-trihidroxi-5-metilfenil)metil]-5,7-dihidroxi-2,2--dimetil-2H-1-benzopiran-8-il]-3-fenil-2-propen-1-ona, disponible de Calbiochem, San Diego, Calif.) que tiene la fórmula (XXI), o su derivado o análogo.
Figure imgf000118_0003
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas pueden incluir diaminopirimidinas sustituidas como lo describe, por ejemplo Baudler en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2005/0222186 Al. Estos compuestos se pueden representar con la fórmula (XXII):
Figure imgf000119_0001
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan en forma independiente del grupo que consiste en fenilo, naftilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, 1,2,3-triazolilo, indolilo, bencimidazolilo, furanil(furilo), benzofuranil(benzofurilo), tiolfenil(tienilo), benzotiolfenil(benzotienilo), tiazolilo, isoxazolilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo e isoquinolinilo sustituido o insustituido; R4 es hidrógeno o metilo; R5 es hidrógeno o metilo; A1 es alquileno C1-3 o etilenoxi (-CH2-CH2-O-); y A2 es alquileno C1-3 o etilenoxi (-CH2-CH2-O-); y sus hidratos, solvatos, sales o ésteres.
Los ejemplos no limitativos de dichos compuestos incluyen [1-bencil(4-piperidil)]{2-[(2-piridilmetilamino]-5-(3-tienil)pirimidin-4-il}amina; {5-(4-metoxifenil)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1-bencil-(-4-piperidil)] amina; {5-fenil-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1-bencil(4-piperidil-1-)]amina; {5-(4-clorofenil)-2-[(4-piridilmetilamino)pirimidin-4-il}[1-bencil(4-piperidil)]amina; {5-(4-(N,N-dimetilamino)fenil)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il-}[1-bencil(4-piperidil)]amina; {5-(fenil-4-carboxamido)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1-bencil(4-piperidil)]-amina; {5-(4-carboxifenil)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1-bencil-(-4-piperidil)]amina; {5-(2-tienil)-2-[(4-piridilmetilamino)pirimidin-4-il}[1-bencil(4-piperidil)]amina; {5-(2-fu ranil)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1 -bencil(4-piperidil)]amina; {5-(3-furanil)-2-[(4-piridilmetil)amino)pirimidin-4-il}[1-bencil(4-piperidil)]amina; N(4)-(1-bencil-piperidin-4-il)-5-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-N(2)-piridin-2-ilmetil-pirimidina-2,4-diamina; N-(3-[4-(1-bencil-piperidin-4-ilamino)-2-[(piridin-2-ilmetil)-amino]-pirimidin-5-il}fenil)-acetamida; 3-[4-(1-bencil-piperidin-4-ilamino)-2-[(piridin-2-ilmetil)-amino]-pirimidin-5-il]-fenol; y 4-{4-(1-bencilpiperidin-4-ilamino)-2-[(piridin-2-ilmetil)-amino]-pirimidin-5-il}N,N-di- metil-benzamida.
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre compuestos piridina sustituidos como lo describe, por ejemplo, Brunette en la publicación de solicitud de patente estadounidense US 2006/0217417. Estos compuestos se pueden representar con la fórmula (XXIII):
Figure imgf000119_0002
en donde X es un enlace o alquilo C1-6 sustituido o insustituido, en donde una o dos de las unidades metileno se pueden reemplazar con un átomo de oxígeno o azufre; Y es - NH-, -O- o -S-; R1 es un cicloalquilo sustituido o insustituido C3-6, arilo sustituido o insustituido o heteroarilo sustituido o insustituido; R2 se selecciona del siguiente grupo que consiste en trifluorometilo, ciano, -CONH2, halógeno y nitro; y R3 es
donde p es un número entero entre 1 y 3, inclusive; q es un número entero entre 0 y 3, inclusive; n es un número entero entre 0 y 5, inclusive; R4 y R5 se seleccionan cada uno en forma independiente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-6 sustituido o insustituido, o en donde R4 y R5 juntos constituyen puentes metileno que junto con el átomo de nitrógeno entre ellos forman un anillo sustituido o insustituido de cuatro a seis miembros, en donde uno de los grupos metileno se reemplaza opcionalmente con un oxígeno, azufre o grupo NR, en donde R es hidrógeno o alquilo C1-6 sustituido o insustituido; sus tautómeros; y sus sales, solvatos o derivados protegidos con amino farmacéuticamente aceptables.
Los ejemplos no limitativos de los compuestos que tienen la fórmula (XXIII) incluyen 5-nitro-N4-piperidin-4-ilmetil-N2-(2-trifluorometoxi-bencil)-piridina-2-,4-diamina; N2-(2,3-dicloro-bencil)-5-nitro-N4-piperidin-4-ilmetil-piridina-2,4-diamina; N2-[2-(3-cloro-fenil)-etil]-5-nitro-N4-piperidin-4-ilmetil-piridina-2,4-diamina; 5-nitro-N2-fenetil-N4-piperidin-4-ilmetil-piridina-2,4-diamina; N4-(4-aminometil-ciclohexilmetil)-5-nitro-N2-(2-trifluorometoxi-bencilpiridina-2,4-diamina; N4-(4-aminometilciclohexilmetil)-N2-(2,3-dicloro-bencil)-5-nitro-piridina-2,4-diamina; N4-(4-aminometil-ciclohexilmetil)-5-nitro-N2-fenetilpiridina-2,4-diaminamina; N4-(4-aminometil-ciclohexilmetil)-N2-[2-(3-cloro-fenil)-etil]-5-nitro-1-piridina-2,4-diamina; N4-(4-aminometil-ciclohexilmetil)-5-nitro-N2-(2-cloro-bencil)-piridina--2,4-diamina; N4-(4-trans-aminometil-ciclohexilmetil)-5-nitro-N-2-(2-trifluorometoxi-bencil)-piridina-2,4-diamina; N4-(4-trans-amino-ciclohexilmetil)-5-nitro-N2-(2-trifluorometoxibencil-)-piridina-2,4-diamina; 4-[(4-aminometil-ciclohexilmetil)-amino]-6-(2-cloro-bencilamino)-nicotinamida; y 4-[(4-aminometil-ciclohexilmetil)-amino]-6-(2-cloro-bencilamino)-nicotinonitrilo.
Los inhibidores de PKC-0 de moléculas pequeñas se pueden seleccionar entre derivados indolil-pirroldiona como lo describen, por ejemplo, Auberson en la publicación de solicitud de patente estadounidense US 2007/0142401. Estos compuestos se pueden representar con la fórmula (XXIV):
Figure imgf000120_0001
en donde
Ra es H; alquilo C1-4; o alquilo C1-4 sustituido con OH, NH2, NH-alquilo C1-4 o N(di-alquilo C1-4)2;
Rb es H; o alquilo C1-4;
R es un radical de fórmula (a), (b), (c), (d), (e) o (f)
Figure imgf000121_0001
en donde cada uno de Ri, R4, R7, Rs, R11 y R14 es OH; SH; un residuo heterocíclico; NR16R17 en donde cada uno de Ría y R17, en forma independiente, es H o alquilo C1-4 o Ría y R17 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un residuo heterocíclico; o un radical de fórmula a -X-Rc,-Y (a) en donde X es un enlace directo, O, S o NR18 en donde R18 es H o alquilo C1-4, Rc es alquileno C1-4 o alquileno C1-4 en donde un CH2 se reemplaza con CRxRy en donde uno de Rx y Ry es H y el otro CH3, cada uno de Rx y Ry es CH3 o Rx y Ry forman juntos -CH2-CH2- e Y está unido al átomo de carbono terminal y se selecciona entre OH, un residuo heterocíclico y -NR19R20 en donde cada uno de R19 y
R20 es en forma independiente H, cicloalquilo C3-a, cicloalquil C3-a-alquilo C1-4, aril-alquilo C1-4 o alquilo C1-4 opcionalmente sustituido en el átomo de carbono terminal por OH, o R10 y R20 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un residuo heterocíclico;
cada uno de R2, R3, R5, Ra, R9, R10,
Figure imgf000121_0002
y R'15, es en forma independiente H, halógeno, SH, NH2, alcoxi C1-4, alquiltiol C1-4 NH-alquilo C1-4, N(di-alquil C1-4)2 o CN;
0 bien E es -N= y G es -CH= o E es -CH= y G es -N=; y
el anillo A está opcionalmente sustituido,
o su sal.
En ejemplos ilustrativos, el residuo heterocíclico es R1, R4, R7, Rs, R11, R14 o Y, o está formado, respectivamente, por NR1aR17, o NR19R20 es un anillo heterocíclico saturado, insaturado o aromático de tres a ocho miembros que comprende
1 o 2 heteroátomos, y está opcionalmente sustituido en uno o más átomos de carbono del anillo y/o en un átomo de nitrógeno del anillo, si está presente.
El residuo heterocíclico puede ser R1, R4, R7, Rs, R11, R14 o Y o estar formado, respectivamente, por NR16R17, o NR19R20, es un residuo de fórmula ( vy 1)J
Figure imgf000121_0003
en donde
el anillo D es un anillo saturado, insaturado o aromático de 5, 6 o 7 miembros;
Xb es -N-, -C- o -CH-;
Xc es -N=,-NRf -CRf= o CHRf donde Rf es un sustituyente para un átomo de nitrógeno del anillo y se selecciona entre alquilo C1-6, acilo; cicloalquilo C3-6; cicloalquil C3-6-alquilo C1-4; fenilo; fenil-alquilo C1-4;
un residuo heterocíclico; y un residuo de fórmula P-R21-Y' (p)
en donde R21 es alquileno C1-4 o alquileno C2-4 interrumpido por O, y Y' es OH, NH2, NH(alquilo C1-4) o N(alquilo C1-4)2; y Rf' es un sustituyente para un átomo de carbono del anillo y se selecciona entre alquilo C1-4; cicloalquilo C3 opcionalmente además sustituido con alquilo C1-4;
Figure imgf000122_0001
en donde p es 1, 2 o 3; CF3;
halógeno; OH; NH2; -CH2-NH2; -CH2-OH; piperidin-1-ilo; y pirrolidinilo;
el enlace entre C1 y C2 es o bien saturado o insaturado;
cada uno de C1 y C2, en forma independiente, es un átomo de carbono que está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados entre aquellos indicados anteriormente para un átomo de carbono del anillo; y
la línea entre C3 y Xb y entre C1 y Xb, respectivamente, representa el número de átomos de carbono según se requiere para obtener un anillo D de 5, 6 o 7 miembros.
En otros ejemplos no limitativos de los compuestos de acuerdo con la fórmula (XXIV)
Ra es H; CH3; CH2-CH3; o isopropilo,
Rb es H; halógeno; alcoxi C1-6 o alquilo C1-6, y o bien
I. R es un radical de fórmula (a)
Figure imgf000122_0002
en donde R1 es piperazin-1-ilo opcionalmente sustituido con CH3 en la posición 3 o 4; o 4,7-diaza-espiro (2,5] oct-7-ilo; R2 es Cl, Br; CF3, o CH3; y R3 es H; CH3 o CF3; siendo R3 distinto de H cuando Ra es H o CH3, Rb es H y R1 es 4-metil-1-piperazinilo; o
II: R es un radical de fórmula (b)
Figure imgf000122_0003
en donde R4 es piperazin-1-ilo sustituido en las posiciones 3 y/o 4 por CH3; o 4,7-diaza-espiro [2.5] oct-7-ilo; en donde Ra es distinto de H o CH3 cuando R4 es 4-metil-1-piperazinilo; o
III. R es un residuo de fórmula (c)
Figure imgf000123_0001
en donde R14 es piperazin-1-ilo opcionalmente sustituido con CH3 en la posición 3 y/o 4 o en la posición 3 con etilo, fenilalquilo C1-4, alcoxi C1-4-alquilo C1-4 o halógeno-alquilo C1-4; o 4,7-diaza-espiro [2.5] oct-7-ilo; R15 es halógeno; CF3; o CH3; en donde R15 es distinto de CH3 cuando Ra es H o CH3, Rb es H y R14 es 4-metil-1 -piperazinilo; y R16 es H; CH3; o CF3; en donde R16 es distinto de H cuando R15 es Cl, Ra es H o CH3, Rb es H y R14 es 4-metil-1 -piperazinilo; o IV. R es un radical de fórmula (d)
Figure imgf000123_0002
en donde R8 es piperazin-1-ilo, 3-metil-piperazin-1-ilo o 4-bencil-piperazin-1-ilo; o
V. R es un radical de fórmula (e)
Figure imgf000123_0003
en donde R9 es 4,7-diaza-espiro [2.5] oct-7-ilo; o piperazin-1-ilo sustituido en la posición 3 con metilo o etilo y opcionalmente en la posición 4 con metilo.
En algunos compuestos de acuerdo con la fórmula (XXIV)
Cuando R es de fórmula (a)
R1 puede ser-(4-metil-piperazin-1-ilo), 1-piperazinil, 3-metil-piperazin-1-ilo o -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo)
R2 puede ser 2-Cl o 2-CH3
R3 puede ser 3-CH3, 3-CF3 o H
Ra puede ser H o CH3
y cuando,
R es de fórmula (b)
R4 puede ser -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il), 3-metil-piperazin-1-ilo o 4-metil-3-metil-piperazin-1-ilo
Ra puede ser H o CH3 y cuando
R es de fórmula (c)
R14 puede ser -4-metil-piperazin-l-ilo, 3-metil-piperazin-1-ilo, -4,7-diazaespiro[2.5]oct-7-ilo, 1-piperazinilo, 4-metil-3-metilpiperazin-ilo, 3-metoxietil-piperazin-1-ilo, 3-etil-piperazin-1-ilo, 3-bencil-piperazin-1-ilo o 3-CH2F-piperazin-1-ilo
R15 puede ser Cl, Br, CF3, F
R16 puede ser CH3, H, CH2-CH3
Ra puede ser H o CH3
Rb puede ser H, CH2-CH2-CH3, F, CH(CH3)2, Cl, OCH3, CH3 o CH2-CH3
y cuando
R es de fórmula (d)
R8 puede ser 3-metil-piperazin-1-ilo, 4-bencil-1 -piperazinilo o 1-piperazinilo
Ra puede ser CH3 o H y cuando
R es de fórmula (e)
R9 puede ser -4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo, 3-etil-piperazin-1-ilo, 3-metil-piperazin-1-ilo, 4-metil-3 -metil-piperazin-1-ilo o 3-etil-piperazin-1-ilo
Ra puede ser H, CH2-CH3 o CH(CH3)2
Rb puede ser CH3, F, CH(CH3)2, OCH3, CH2-CH3 o Cl.
Los compuestos específicos de acuerdo con la fórmula (XXIV) pueden incluir 3-[2-Cloro-5-(4-metil-piperazin-1-il)-3-trifluorometil-fenil]-4-(1H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona que tiene la fórmula
Figure imgf000124_0001
3-(1H-Indol-3-il)-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-quinazolin-4-il]-pirrol-2,5-diona que tiene la fórmula
Figure imgf000124_0002
Los inhibidores de PKC-0 se pueden seleccionar entre los compuestos selectivos de moléculas pequeñas de PKC-0 descritos por Ajioka en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. US 2013/0225687. Estos compuestos se representan con la fórmula (XXV):
Figure imgf000125_0001
en donde:
Y se selecciona del grupo que consiste en -O-, y -S-; y
cada R1 se selecciona en forma independiente del grupo que consiste en n-propilo, isopropilo, t-butilo, t-pentilo, CF3, OCF3, ciclopentilo, pirrolilo y CO2H, y sus sales, hidratos y profármacos, inhibiendo así selectivamente la PKC-0.
El inhibidor selectivo de PKC-0 que se ha de utilizar en el contexto de la presente invención abarca no solamente inhibidores de PKC-0 conocidos, sino también inhibidores de PKC-0 identificados por cualquier ensayo de detección adecuado. Por consiguiente, se describen también en este documento métodos para detectar agentes moduladores que son útiles para inhibir una PKC-0 y, a su vez, para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer (p. ej., cáncer metastásico). Los métodos de detección pueden comprender (1) poner en contacto una preparación con un agente de prueba, en donde la preparación comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a por lo menos un fragmento biológicamente activo de una PKC-0 , o su variante o derivado; o (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la cual se puede producir una transcripción de un gen PKC-Q o su porción, o (iii) un polinucleótido que comprende por lo menos una porción de una secuencia genética (p. ej., un elemento de transcripción) que regula la expresión de un gen PKC-0, operativamente unido a un gen indicador; y (2) detectar un cambio en el nivel o la actividad funcional del polipéptido, el polinucleótido o un producto de expresión del gen indicador, en relación a un nivel de referencia o actividad funcional en ausencia del agente de prueba. Una reducción detectada en el nivel y/o la actividad funcional del polipéptido, transcripción o porción de la transcripción o de un producto de expresión del gen indicador, en relación a un nivel y/o actividad funcional normal o de referencia en ausencia del agente de prueba, indica que el agente puede ser útil para alterar por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer (p. ej., cáncer metastásico). Adecuadamente, esto se puede confirmar analizando o determinando si el agente de prueba altera por lo menos uno de: (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; (iv) EMT; o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0, o trata o previene el cáncer.
Los moduladores pueden incluir inhibidores del nivel o la actividad funcional de una PKC-0, incluidas moléculas de unión a antígenos antagonistas, y fragmentos peptídicos inhibidores, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas ARNi y moléculas de co-supresión, además de inhibidores de polisacáridos y lipopolisacáridos de una PKC-0.
Los agentes candidatos abarcan numerosas clases de químicos, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2.500 Dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carbonilo, convenientemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. El agente candidato a menudo comprende carbono cíclico o estructuras heterocíclicas o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre biomoléculas que incluyen, aunque sin limitarse a ello: péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o sus combinaciones.
Los moduladores de moléculas pequeñas (no peptídicas) de una PKC-0 son particularmente ventajosos en el contexto de la presente invención. En este sentido, las moléculas pequeñas son convenientes, ya que dichas moléculas se absorben más fácilmente después de la administración oral, tienen menos determinantes antigénicos potenciales o es más posible que atraviesen la membrana celular que los productos farmacéuticos más grandes a base de proteínas. Las moléculas orgánicas pequeñas pueden también tener la capacidad de obtener el ingreso en una célula apropiada y afectar la expresión de un gen (p. ej., interactuando con la región reguladora o los factores de transcripción implicados en la expresión del gen); o afectan la actividad de un gen inhibiendo o potenciando la unión de moléculas accesorias. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Además, las bibliotecas y los compuestos producidos en forma natural o sintética se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden usar para producir bibliotecas combinatorias. Se pueden someter agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales.
La detección también se puede dirigir a compuestos farmacológicamente activos conocidos y a sus análogos bioquímicos.
La detección de agentes moduladores que se ha de utilizar de acuerdo con la presente invención se puede obtener por cualquier método adecuado. Por ejemplo, el método puede incluir poner en contacto una célula que expresa un polinucleótido correspondiente a un gen que codifica una PKC-0 con un agente que se sospecha que tiene actividad moduladora, y detectar la modulación del nivel o la actividad funcional de la PKC-0, o la modulación del nivel de una transcripción codificada por el polinucleótido, o la modulación de la actividad o la expresión de una diana celular en dirección 3' del polipéptido o de la transcripción (denominadas en este documento moléculas diana). Detectar dicha modulación se puede lograr utilizando técnicas que incluyen, aunque sin limitarse a ello, ensayos ELISA, ELISA basado en células, ELISA de inhibición, Western blots, inmunoprecipitación, slot o dot blot, inmunotinción, centelleo RIA, ensayos de proximidad de centelleos, inmunoensayos fluorescentes que usan conjugados de moléculas de unión a antígenos o conjugados de antígenos de sustancias fluorescentes tales como fluoresceína o rodamina, análisis de difusión doble Ouchterlony, inmunoensayos que emplean avidina-biotina o un sistema de detección de estreptavidinabiotina, y ensayos de detección de ácido nucleico que incluyen reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Se ha de entender que un polinucleótido a partir del cual se regula o expresa una PKC-0 puede ocurrir naturalmente en la célula que es objeto de las pruebas, o puede haber sido introducido en la célula hospedante para el propósito de las pruebas. Además, el polinucleótido que ocurre naturalmente o introducido se puede expresar constitutivamente -proporcionando de este modo un modelo útil para detectar agentes que reducen la expresión de un producto codificado de la secuencia, en donde la disminución puede ocurrir a nivel del ácido nucleico o el producto de expresión. A su vez, en la medida que un polinucleótido se introduce en una célula, ese polinucleótido puede comprender toda la secuencia codificante que codifica la PKC-0 o puede comprender una porción de esa secuencia codificante (p. ej., el sitio activo de la PKC-0) o una porción que regula la expresión del gen correspondiente que codifica la PKC-0 (p. ej., un promotor de PKC-Q). Por ejemplo, el promotor que se asocia naturalmente con el polinucleótido se puede introducir en la célula que es objeto de las pruebas. En este caso, si se utiliza solamente un promotor, la detección de la actividad del promotor se puede lograr, por ejemplo, enlazando operativamente el promotor a un polinucleótido indicador adecuado como por ejemplo, entre otros, proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa, p-galactosidasa y catecolamina acetil transferasa (CAT). La modulación de expresión se puede determinar midiendo la actividad asociada con el polinucleótido indicador.
Estos métodos proporcionan un mecanismo para efectuar detección de alto rendimiento de agentes moduladores putativos como agentes proteináceos o no proteináceos que comprenden bibliotecas sintéticas, combinatorias, químicas y naturales. Estos métodos también facilitarán la detección de agentes que se unen o bien al polinucleótido que codifica la molécula diana o que modula la expresión de una molécula en dirección 5', que posteriormente modula la expresión del polinucleótido que codifica la molécula diana. Por consiguiente, estos métodos proporcionan un mecanismo para detectar genes que modulan directa o indirectamente la expresión o actividad de una molécula diana de acuerdo con la invención.
Los agentes de prueba se pueden detectar usando ensayos de PKC-0 comerciales, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen el ensayo ADP-GloTM de PKC-0 cinasa (Promega Corporation, Madison, WI), el ensayo PkC Theta KinEASETM FP Fluoresceína verde (EMD Millipore, Billerica, MA) y/o usando el ensayo de PKC-0 descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense US2008/0318929
Los compuestos pueden también ensayarse en modelos animales para identificar aquellos compuestos que tienen los efectos in vivo más potentes. Estas moléculas pueden servir como "moléculas de partida" para posterior desarrollo de productos farmacéuticos, por ejemplo, sometiendo los compuestos a modificaciones secuenciales, modelado molecular y otros procedimientos de rutina empleados en el diseño de fármacos racional.
3. Usos terapéuticos y profilácticos
De acuerdo con la presente invención, se propone que los agentes que inhiben la función de PKC-0 son útiles como activos para alterar por lo menos uno de: (i)
formación; (ii) proliferación; o (iii) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC o una célula tumoral no CSC); (iv) EMT de una célula que sobreexpresa p KC-0 (p. ej., una CSC); o (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o para tratar o prevenir cáncer (p. ej., cáncer metastásico). Por lo tanto, los compuestos inhibidores de PKC-0 son útiles, adecuadamente en composiciones farmacéuticas, para tratar o prevenir cáncer, incluido cáncer metastásico, en el contexto de la presente invención.
Cualquier inhibidor de PKC-0 se puede usar en el contexto de la presente invención, siempre que el inhibidor sea farmacéuticamente activo. El inhibidor de PKC-0 es un inhibidor de PKC-0 selectivo. Un inhibidor de PKC-0 "farmacéuticamente activo" está en una forma que resulta en una reducción, supresión, anulación o prevención de (i) formación; (ii) proliferación; o (iii) mantenimiento de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC o una célula tumoral no CSC); o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), y/o en la potenciación de (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), y/o en el tratamiento y/o la prevención de una malignidad, particularmente cáncer metastásico, incluida la prevención de incurrir en un síntoma, refrenar dichos síntomas o tratar síntomas existentes asociados con el cáncer metastásico, cuando se administra a un individuo que lo necesita.
Los modos de administración, las cantidades del inhibidor de PKC-0 administradas y las formulaciones del inhibidor de PKC-0, para uso en el contexto de la presente invención, son habituales y están dentro de la experiencia de los expertos en la técnica. Si se ha tratado una malignidad, particularmente un cáncer metastásico, se determina midiendo uno o más parámetros de diagnóstico indicativos del curso de la enfermedad, en comparación con un control adecuado. En el caso de un experimento animal, un "control adecuado" es un animal no tratado con el inhibidor de PKC-0, o tratado con la composición farmacéutica sin el inhibidor de PKC-0. En el caso de un sujeto humano, un "control adecuado" puede ser el individuo antes del tratamiento, o puede ser un ser humano (p. ej., un control de edad compatible o similar) tratado con placebo. El tratamiento del cáncer metastásico puede incluir y abarcar sin limitación: (1) alterar, suprimir, reducir, prevenir o detener el desarrollo de (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), o potenciar MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), en un paciente; (2) tratar un cáncer (p. ej., cáncer metastásico) en un sujeto; (3) prevenir un cáncer (p. ej., cáncer metastásico) en un sujeto que tiene predisposición al cáncer pero que todavía no se le ha diagnosticado y, en consecuencia, el tratamiento constituye el tratamiento profiláctico del cáncer; o (iii) causar la regresión de un cáncer (p. ej., cáncer metastásico).
La presente invención es por lo tanto adecuada para tratar a un individuo que ha sido diagnosticado con cáncer (p. ej., cáncer metastásico), que se sospecha que tiene cáncer (p. ej., cáncer metastásico), que se sabe que es susceptible y que se lo considera propenso a desarrollar cáncer (p. ej., cáncer metastásico) o que se considera propenso a desarrollar una recurrencia de un cáncer previamente tratado (p. ej., cáncer metastásico). El cáncer (p. ej., cáncer metastásico) puede ser positivo al receptor de hormonas o negativo al receptor de hormonas. El cáncer (p. ej., cáncer metastásico) puede también ser negativo al receptor de hormonas y por lo tanto ser resistente a una terapia hormonal o endocrina. El cáncer puede ser cáncer de mama, el cáncer de mama (p. ej., las células tumorales de CMC no de mama) puede ser negativo al receptor de hormonas (p. ej., receptor de estrógenos (ER) y/o negativo al receptor de progesterona (PR)).
Dependiendo del modo de administración que se tenga como propósito, las composiciones que contienen el inhibidor de PKC-0 pueden en general comprender 0,000001% a 90%, aproximadamente 0,0001% a 50%, o aproximadamente 0,01% a aproximadamente 25%, en peso del inhibidor de PKC-0, en donde el resto son vehículos o diluyentes farmacéuticos adecuados, etc. La dosis del inhibidor de PKC-0 puede depender de una diversidad de factores, tales como modo de administración, la especie del sujeto afectado, la edad, el sexo, el peso y el estado de salud general, y el experto en la técnica la puede determinar fácilmente usando protocolos convencionales. La dosis también tendrá en cuenta la afinidad de unión del inhibidor de PKC-0 a su molécula diana, su biodisponibilidad y sus propiedades de farmacocinética in vivo. En este sentido, las cantidades precisas de los agentes para administración pueden también depender del criterio del profesional. Para determinar la cantidad eficaz de los agentes que se han de administrar en el tratamiento o la prevención de un cáncer (p. ej., cáncer metastásico), el médico o el veterinario puede evaluar la progresión de la enfermedad o la afección durante el transcurso del tiempo. En cualquier caso, los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las dosis adecuadas del inhibidor de PKC-0 sin experimentación indebida. La dosis de los activos administrados a un paciente debe ser suficiente para ejercer una respuesta beneficiosa en el paciente con el transcurso del tiempo, como reducción, alteración, supresión o prevención de (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), y/o en la potenciación de (v) MET de una a célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), y/o en el tratamiento y/o la prevención de cáncer (p. ej., cáncer metastásico). La dosis se puede administrar en intervalos adecuados para aliviar los síntomas de la malignidad hematológica. Dichos intervalos se pueden establecer usando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la técnica y pueden variar dependiendo del tipo de agente activo empleado y su formulación. Por ejemplo, el intervalo puede ser diario, día por medio, semanal, quincenal, mensual, bimestral, trimestral, semestral o anual.
La cantidad de administración y el intervalo se pueden ajustar en forma individual para proporcionar niveles en el plasma del agente activo que sean suficientes para mantener los efectos inhibidores de PKC-0. Las dosis usuales en pacientes para administración sistémica oscilan de 1-2000 mg/día, comúnmente 1-250 mg/día y típicamente 10-150 mg/día. En términos del peso corporal del paciente, las dosis usuales oscilan de 0,02-25 mg/kg/día, comúnmente 0,02-3 mg/kg/día, típicamente 0,2-1,5 mg/kg/día. En términos de las áreas de la superficie corporal del paciente, las dosis usuales oscilan de 0,5-1200 mg/m2/día, comúnmente de 0,5-150 mg/m2/día, típicamente de 5-100 mg/m2/día.
La inhibición de PKC-0 por el inhibidor de PKC-0 puede resultar en la reducción de formación, proliferación, mantenimiento o EMT de CSC (p. ej., CSC de cáncer de mama) o en la potenciación de MET de CSC (p. ej., CSC de cáncer de mama), que a su vez resulta en menos células tumorales no CSC que se diferencian de la CSC, y en el tratamiento más eficaz de células no CSC con una terapia o agente antineoplásico. Por lo tanto, el inhibidor de PKC-0 se puede administrar concurrentemente con por lo menos una terapia antineoplásica que inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de células tumorales no CMC. El inhibidor de PKC-0 se puede utilizar terapéuticamente después de la terapia antineoplásica o se puede usar antes de la terapia o junto con la terapia. Por consiguiente, la presente invención contempla terapias combinadas, que emplean un inhibidor de PKC-0 y la administración concurrente de una terapia antineoplásica, cuyos ejemplos no limitativos incluyen radioterapia, cirugía, quimioterapia, terapia de ablación de hormonas, terapia pro-apoptosis e inmunoterapia.
3.1 Radioterapia
Las radioterapias incluyen radiación y ondas que induce daño al ADN, por ejemplo, y-radiación, rayos X, radiación UV, microondas, emisiones electrónicas, radioisótopos y similares. La terapia se puede lograr irradiando el sitio del tumor localizado con las formas anteriormente descritas de radiación. Lo más probablemente, todos estos factores efectúan un amplio grado de daño al ADN, en los precursores del ADN, la replicación y la reparación del ADN y el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas.
Los intervalos de dosis para rayos X oscilan entre dosis diarias de 50 a 200 roentgens para periodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), a dosis individuales de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosis para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la semivida del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitida y la captación por las células neoplásicas.
Los ejemplos no limitativos de radioterapias incluyen radioterapia de haz externo conformacional 50-100 Grey administrados como fracciones durante 4-8 semanas), en una sola aplicación o fraccionada, braquiterapia de alta dosis, braquiterapia intersticial permanente, radioisótopos sistémicos (p. ej., estroncio 89). La radioterapia se puede administrar en combinación con un agente radiosensibilizante. Los ejemplos ilustrativos de agentes radiosensibilzantes incluyen, aunque sin limitarse a ello, efaproxiral, etanidazol, fluosol, misonidazol, nimorazol, temoporfin y tirapazamina.
3.2 Quimioterapia
Los agentes quimioterapéuticos se pueden seleccionar entre una o más de las siguientes categorías:
(i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y sus combinaciones, como se usan en oncología médica, como agentes alquilantes (por ejemplo cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, nitrógeno mostaza, melfalán, clorambucilo, busulfán y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo antifolatos tales como fluoropiridinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinósido e hidroxiurea; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimicóticos (por ejemplo Vinca alcaloides como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina, y taxoides como paclitaxel y docetaxel; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecán y camptotecina);
(ii) agentes citostáticos como antiestrógenos (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y idoxifeno), reguladores que disminuyen los receptores de estrógenos (por ejemplo, fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y ciproterona acetato), antagonistas de UH o agonistas de LHRH (por ejemplo, goserelina, leuprorelina y buserelina), progestágenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, vorozol y exemestano) e inhibidores de 5a-reductasa, como finasterida;
(iii) agentes que inhiben la invasión celular del cáncer (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasa como marimastat e inhibidores de la función del receptor del activador del plasminógeno urocinasa);
(iv) inhibidores de la función de los factores de crecimiento, por ejemplo, dichos inhibidores incluyen anticuerpos de factores de crecimiento, anticuerpos de receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] y anticuerpo anti-erbb I Cetuximab [C225]), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de MEK, inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa, por ejemplo otros inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, otros inhibidores de la familia de tirosina cinasa EGFR como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (Gefitinib, AZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (Erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazoli-n-4-amina (CI 1033)), por ejemplo, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos;
(v) agentes antiangiogénicos tales como aquellos que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, el anticuerpo del factor de crecimiento celular endotelial antivascular bevacizumab [Avastin™], compuestos tales como aquellos descritos en las solicitudes de patentes internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354) y compuestos que funcionan mediante otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de integrina avp3 y angiostatina);
(vi) agente de daño vascular como Combretastatina A4 y los compuestos descritos en las solicitudes de patentes internacionales WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213;
(vii) terapias antisentido, por ejemplo aquellas que se dirigen a las dianas anteriormente mencionadas, como ISIS 2503, un antisentido anti-ras; y
(viii) planteamientos de terapias génicas, incluidos por ejemplo planteamientos para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o GDEPT aberrante (terapia de profármacos de enzimas dirigidas a genes) como aquellos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima bacteriana nitrorreductasa, y planteamientos para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o la radioterapia, como terapia génica de resistencia a múltiples fármacos. 3.3 Inmunoterapia
Los planteamientos de inmunoterapia incluyen, por ejemplo, planteamientos ex-vivo e in-vivo para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales de pacientes, como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, planteamientos para reducir la anergia de las células T, planteamientos que emplean células inmunes transfectadas como células dendríticas transfectadas con citocinas, planteamientos que emplean líneas celulares de tumores transfectadas con citocinas y planteamientos que emplean anticuerpos anti-idiotípicos. Estos planteamientos en general se basan en el uso de células efectoras inmunes y moléculas para dirigirse a y destruir células cancerosas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador en la superficie de una célula maligna. El anticuerpo solo puede servir como efector de terapia o puede reclutar otras células para realmente facilitar la inactivación de las células. El anticuerpo también se puede conjugar a un fármaco o toxina (quimioterapéutico, radionúclido, cadena de ricina A, toxina de cólera, toxina de tos ferina, etc.) y servir exclusivamente como un agente de direccionamiento. De manera alternativa, el efector puede ser un linfocito que porta una molécula superficial que interactúa, directa o indirectamente, con una diana celular maligna. Las distintas células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK.
3.4 Otras terapias
Los ejemplos de otras terapias antineoplásicas incluyen fototerapia, crioterapia, terapia de toxinas o terapia proapoptosis. El experto en la técnica sabrá que esta lista no es exhaustiva de los tipos de modalidades de tratamiento para cáncer ni otras lesiones hiperplásicas.
Se sabe que la quimioterapia y la radioterapia se dirigen rápidamente a las células divisorias y/o alteran el ciclo celular o la división celular. Estos tratamientos se ofrecen como parte de las varias formas de tratar el cáncer, intentando ralentizar su progresión o revertir los síntomas de enfermedad mediante un tratamiento curativo. No obstante, estos tratamientos para el cáncer pueden conducir a un estado inmunocomprometido y resultar en infecciones patogénicas, y por lo tanto la presente invención también se extiende a terapias combinadas, que emplean un inhibidor de PKC-0, una terapia antineoplásica y un agente anti-infectivo eficaz contra una infección que se desarrolla o que presenta mayor riesgo de desarrollarse a partir de un estado inmunocomprometido resultante de la terapia antineoplásica. El fármaco anti-infectivo se selecciona adecuadamente entre antimicrobianos, que incluyen sin limitación compuestos que inactivan o inhiben el crecimiento de microorganismos tales como virus, bacterias, levaduras, hongos, protozoos, etc. y que por tanto incluyen antibióticos, amebicidas, antifúngicos, antiprotozoarios, agentes antimalaria, agentes antituberculosis y antivíricos. Los fármacos anti-infectivos también incluyen dentro de su alcance antihelmínticos y nematocidas. Los antibióticos ilustrativos incluyen quinolonas (p. ej., amifloxacina, cinoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, fleroxacina, flumequina, lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, ácido oxolínico, pefloxacina, rosoxacina, temafloxacina, tosufloxacina, esparfloxacina, clinafloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina; gemifloxacina; y garenoxacina), tetraciclinas, glicilciclinas y oxazolidinonas (p. ej., clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, tigeciclina; linezolid, eperezolid), glicopéptidos, aminoglicósidos (p. ej., amikacin, arbekacin, butirosin, dibekacin, fortimicinas, gentamicina, kanamicina, menomicina, netilmicin, ribostamicina, sisomicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina), p-lactamas (p. ej., imipenem, meropenem, biapenem, cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefazolin, cefixima, cefmenoxima, cefodizima cefonicid, cefoperazona, ceforanida, cefotaxima, cefotiam, cefpimizol, cefpiramida, cefpodoxima, cefsulodin, ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cepfacetrilo, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefradina, cefinetazol, cefoxitin, cefotetan, aztreonam, carumonam, flomoxef, moxalactam, amdinocilina, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, bencilpenicilina, carfecilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, piperacilina, sulbenicilina, temocilina, ticarcillina, cefditoren, SC004, KY-020, cefdinir, ceftibuten, FK-312, S-1090, CP-0467, BK-218, FK-037, DQ-2556, FK-518, cefozopran, ME1228, KP-736, CP-6232, Ro 09-1227, OPC-20000, LY206763), rifamicinas, macrólidos (p. ej., azitromicina, claritromicina, eritromicina, oleandomicina, rokitamicina, rosaramicina, roxitromicina, troleandomicina), cetólidos (p. ej., telitromicina, cetromicina), cumermicinas, lincosamidas (p. ej., clindamicina, lincomicina) y cloranfenicol.
Los antivíricos ilustrativos incluyen sulfato de abacavir, aciclovir sódico, hidrocloruro de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirsen sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, hidrocloruro de amantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, estavudina, hidrocloruro de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir y zidovudina.
Los ejemplos no limitativos de amebicidas o antiprotozoarios incluyen atovacuona, hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, hidrocloruro de metronidazol e isetionato de pentamidina. Los agentes antihelmínticos pueden al menos seleccionarse entre mebendazol, pirantel pamoato, albendazol, ivermectina y tiabendazol. Los antifúngicos ilustrativos se pueden seleccionar entre anfotericina B, complejo de colesteril sulfato y anfotericina B, complejo de anfotericina B y lípidos, anfotericina B liposomal, fluconazol, flucitosina, griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol, cetoconazol, nistatina e hidrocloruro de terbinafina. Los ejemplos no limitativos de agentes antimalaria incluyen hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina, hidrocloruro de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina y pirimetamina con sulfadoxina. Los agentes antituberculosis incluyen, aunque sin limitarse a ello, clofazimina, cicloserina, dapsona, hidrocloruro de etambutol, isoniazid, pirazinamida, rifabutin, rifampin, rifapentina y sulfato de estreptomicina.
La coadministración de un inhibidor de PKC-0 junto con un agente adicional se describe en este documento. Se ha de entender que, en administraciones del inhibidor de PKC-0 con otros agentes, las dosis de los activos en la combinación pueden por sí misma comprender una cantidad eficaz y el agente(s) adicional puede además aumentar el beneficio terapéutico o profiláctico para el paciente. Alternativamente, el inhibidor de PKC-0 y el agente(s) adicional pueden además comprender una cantidad eficaz para prevenir o tratar el cáncer (p. ej., cáncer metastásico). Se entenderá también que las cantidades eficaces se pueden definir en el contexto de esquemas de tratamiento particulares, incluidos, p. ej., el tiempo y las cantidades de administraciones, los modos de administración, las formulaciones, etc. El inhibidor de PKC-0 y la terapia antineoplásica se pueden administrar en un cronograma de rutina. Alternativamente, la terapia antineoplásica se puede administrar a medida que surgen los síntomas. Un "cronograma de rutina", tal como se emplea en este documento, se refiere a un período de tiempo designado predeterminado. El cronograma de rutina puede abarcar periodos de tiempo que son idénticos o que difieren en longitud, siempre y cuando el cronograma esté predeterminado. Por ejemplo, el cronograma de rutina puede implicar la administración del inhibidor de PKC-0 a diario, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanalmente, mensualmente o cualquier conjunto de número de días o semanas entremedio, cada dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, etc. Alternativamente, el cronograma de rutina predeterminado puede implicar la administración concurrente del inhibidor de PKC-0 y la terapia antineoplásica todos los días durante la primera semana, y luego mensualmente durante varios meses, y luego cada tres meses. Cualquier combinación particular estaría cubierta por el cronograma de rutina siempre y cuando se determine con antelación que el cronograma apropiado implica la administración en un día determinado.
Adicionalmente, se describen en este documento composiciones farmacéuticas para reducir, deteriorar, suprimir o prevenir (i) formación; (ii) proliferación; (iii) mantenimiento; o (iv) EMT de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC) y/o para potenciar (v) MET de una célula que sobreexpresa PKC-0 (p. ej., una CSC), y para prevenir o tratar malignidades, particularmente cáncer metastásico, que comprenden un inhibidor de PKC-0 y opcionalmente un agente o terapia antineoplásica útil para tratar malignidades. Las formulaciones de la invención se administran en disoluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tampón, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Dependiendo de las condiciones específicas que se han de tratar, las formulaciones se pueden administrar en forma sistémica o local. Las técnicas para formulación y administración se pueden hallar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición. Las rutas adecuadas pueden, por ejemplo, incluir la administración oral, rectal, transmucosa o intestinal; la administración parenteral, incluidas inyecciones intramuscular, subcutánea, intramedular, además de inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Para inyección, los agentes activos o fármacos de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, adecuadamente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón de saliva fisiológica. Para administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes en general se conocen en la técnica.
Los fármacos se pueden formular fácilmente usando vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica y dosis adecuadas para administración oral. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen en presentaciones tales como comprimidos, pastillas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, lechadas y similares, para ingesta oral de un paciente que se ha de tratar. Estos vehículos se pueden seleccionar entre azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, disoluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, saliva isotónica, agua libre de pirógenos.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Además, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones apropiadas para inyección oleosa. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintético, tales como etil oleato o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetil celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede además contener estabilizantes o agentes adecuados, que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, como lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, como por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico, o su sal, tal como alginato sódico. Dichas composiciones se pueden preparar por cualquiera de los métodos de farmacia pero todos los métodos incluyen el paso de asociar uno o más de los fármacos descritos anteriormente con el vehículo, que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar en un modo que es conocido por sí mismo, p. ej., mediante procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, trituración, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Los núcleos de grageas se proveen con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar disoluciones de azúcar concentradas que opcionalmente contienen goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir tintes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para identificación o para caracterizar distintas combinaciones de las dosis del compuesto activo.
Los productos farmacéuticos que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con carga como lactosa, aglutinantes como almidones, o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes.
Las presentaciones de los fármacos descritos en este documento y que se usan en el contexto de la presente invención pueden incluir inyectar o implantar dispositivos de liberación controlada específicamente diseñados para este propósito u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente en este modo. La liberación controlada de un agente de la invención se puede alcanzar recubriendo el mismo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos que incluyen resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos polilácticos y poliglicólicos y ciertos derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetil celulosa. Además, la liberación controlada se puede lograr usando otras matrices poliméricas, liposomas o microesferas.
Los fármacos descritos en este documento y que se utilizan en el contexto de la presente invención se pueden proveer como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles se pueden formar con muchos ácidos, incluidos entre otros, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que son las correspondientes formas de la base libre.
Para cualquier compuesto utilizado en el contexto de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluya la CI50 determinada en el cultivo celular (p. ej., la concentración de un agente activo, que logra una inhibición media máxima en la actividad de un polipéptido de PKC-0). Dicha información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos fármacos se puede determinar con procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar para formular un intervalo de administración para uso en seres humanos. La dosis de dichos compuestos yace preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la presentación empleada y de la ruta de administración utilizada. El médico individual puede seleccionar la formulación exacta, la ruta de administración y la dosis, en vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1).
Alternativamente, se puede administrar el compuesto en un modo local en lugar de sistémico, por ejemplo, mediante una inyección del compuesto directamente en un tejido, que preferiblemente es tejido subcutáneo o epiploico, a menudo en una formulación de depósito o de liberación sostenida.
Asimismo, se puede administrar el fármaco en un sistema de administración de fármacos dirigido, por ejemplo, en una partícula, que es adecuadamente dirigida y absorbida selectivamente por una célula o tejido. El inhibidor de PKC-0 puede estar contenido o de otro modo asociado con un vehículo seleccionado del grupo que consiste en liposomas, micelas, dendrímeros, partículas biodegradables, nanoestructura de ADN artificial, nanopartículas basadas en lípidos y nanopartículas de carbono u oro. En ejemplos ilustrativos de este tipo, el vehículo se selecciona del grupo que consiste en ácido poliláctico) (PLA), ácido poliglicólico (PGA); ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA); polietilenglicol (PEG) y copolímeros PLA-PEG, o cualquiera de sus combinaciones.
En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local eficaz del agente puede no relacionarse con la concentración en el plasma.
La presente invención se ilustra también mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Vía de PKC: EMT y CSC
La vía de PKC se asocia por EMT y CSC utilizando una diversidad de ensayos celulares. Primero, el inductor de la vía de PKC, PMA, causó los cambios de EMT más elevados según lo observado por cambios morfológicos (Figura 1 A y B), tinción intracelular del marcador de EMT Laminina-5 (Figura 1 B) y cicatrización de heridas (ensayos de migración) (Figura 1 C) en el modelo MCF-IM. En segundo lugar, la PKC está activa tanto en el citoplasma como en el núcleo en el modelo MCF-IM y basal/metastásico (Figura 1 D). Tercero, la inducción de la vía de PKC por PMA resulta en la generación de células de tipo CSC CD44alta/CD24baja según se observa por análisis de citometría de flujo (FACS) (Figura 1 E y F), ensayo de mamosferas (Figura 1 G) y análisis de transcripción de genes inducibles de c Sc (Figura 1 H) y microARN (Figura 1 I).
En términos generales, estos resultados muestran que la vía de PKC es importante para la formación de EMT y CSC. Ejemplo 2
La inhibición de la actividad de PKC reduce la formación de EMT y CSC
El inhibidor de la vía de PKC de amplio espectro resulta en la inhibición de la formación de EMT y CSC en el modelo MCF-IM según lo monitoreado por morfología (Figura 2 A), FACS (Figura 2 B y C), ensayo de mamosferas (Figura2 D y E) y análisis de transcripción de genes inducibles de CSC (Figura 2 F y G), y también en el modelo basal metastásico (Figura 2I, J y K). En contraste, la pre-incubación con Go6976, un inhibidor de PKC convencional, no previno cambios morfológicos de tipo EMT inducida por PMA o formación de CSC (Figura 2 C y H).
En términos generales, estos resultados muestran que la actividad de PKC es esencial para la formación de EMT y CSC.
Ejemplo 3
Inhibición de señalización de PKC-0 y efectos nucleares en la supresión de EMT y CSC
El inhibidor del péptido específico de PKC-0 suprime EMT y CSC según lo monitoreado por morfología (Figura 3 A), análisis FACS (Figura 3 B) y de transcripción (Figura 3 C) en el modelo MCF-IM. La inactivación de PKC-0 pero no de PKC-p resulta en la inhibición de EMT y CSC en el modelo MCF-IM (Figura 3 D, E y F). La sobreexpresión de la mutación NLS de PKC-0 NLS (señal de localización nuclear) reduce el ingreso de PKC-0 en el núcleo y por lo tanto resulta en la reducción de los efectos de EMT y CSC en comparación con el efecto del vector de tipo salvaje de PKC-0 en el modelo MCF-IM (Figura 3 G, H y I).
En términos generales, estos resultados muestran que la PKC-0 es el regulador principal de la formación de EMT y CSC. Además, la PKC-0 nuclear es importante para la formación de EMT y CSC.
Ejemplo 4
Unión directa de PKC-0 nuclear en promotores de genes inducibles en CSC
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) La PKC-0 demostró que PKC-0 se une directamente al promotor de genes inducibles de CSC, CD44, en varios modelos de CSC (Figura 4 A). La forma activa de PKC-0 (PKC-0-fosfo) se asocia con cromatina en los genes inducibles de uPAR y CD44 en el modelo MCF-IM (Figura 4 B y C) y esta forma activa está presente en el ARN de transcripción activa Polimerasa-II (Pol II) (Figura 4 D). El inhibidor de PKC y la inactivación de PKC-0 producen la reducción de la unión de PKC-0 en el promotor del gen CD44.
En términos generales, estos resultados muestran que la PKC-0 activa es el regulador epigenético de la formación de EMT y CSC.
Ejemplo 5
PKC-0 activa nuclear: un marcador de cáncer de mama invasivo
La relevancia clínica de la PKC-0 en la progresión del cáncer de mama se analizó investigando la expresión de la proteína PKC-0 en tejido de mama normal y en tumores de mama invasivos de pacientes. Se observó la expresión citoplásmica fuerte de PKC-0 en el subtipo de cáncer invasivo ER/PR+/ Her-2- cuando se comparó con tejido de mama de individuos sanos. Asimismo, el subtipo de cáncer invasivo ER/PR+/ Her-2' presentó tinción nuclear tenue de PKC-0 activa (Figura 5). Todos los tipos de cáncer de mama exhibieron inmunorreactividad citoplásmica débil para PKC-0 activa, observándose una tinción nuclear fuerte en las células de cáncer de mama sometidas a mitosis más allá del estado del receptor.
En términos generales, estos resultados muestran que la PKC-0 activa en los núcleos es un marcador diagnóstico de cáncer de mama agresivo/invasivo.
Ejemplo 6
El inhibidor específico de PKC-0 ATP-competitivo, el compuesto 27, previene la formación de CSC en MCF-IM y la señalización vía PKC-0 es un pre-requisito para la actividad de NF-KB.
Un nuevo inhibidor altamente selectivo, específico de PKC-0, ATP-competitivo, el compuesto 27, (C27) (Jimenez, J.-M. et al., 2013. Design and optimization of selective protein kinase C theta (PKCtheta) inhibitors for the treatment of autoimmune diseases. Journal of Medicinal Chemistry 56:1799-1810) suprimió la actividad de PKC-0 tanto en un ensayo de actividad de PKC-0 in-vitro (Figura 6A) como en extractos nucleares y celulares generados a partir de MCF-IM pre­ tratados con C27 (Figura 6B y C). C27 también suprimió la formación de CSC según lo medido por FACS (Figura 6C) y transcripción de genes inducibles de CSC (Figura 6D). Asimismo, C27 redujo significativamente la actividad nuclear de p50 y p65 (Figura 6E y F), sugiriendo que PKC-0 también señaliza proteínas NF-KB en el estado mesenquimal.
Los análisis de inmunotransferencia de extractos nucleares de MCF-IM se llevaron a cabo con anticuerpos anti-fosfo p65 (serina-468). Se indujo p65-fosforilado en serina 468 (p65-P-468) siguiendo estimulación, y esta fosforilación se inhibió en presencia de C27 (Figura 6G). No obstante, la inmunotransferencia con el anticuerpo pan-p65 reveló que C27 también inhibía la abundancia de p65 en los núcleos de estado epitelial y mesenquimal (Figura 6H). Por otra parte, se observó la acumulación global de p65 en la fracción citoplásmica de células epiteliales y mesenquimales tratadas con C27 derivadas de MCF-IM (Figura 6l). Colectivamente, esto sugiere que la actividad de PKC-0 posiblemente se requiera para mantener p65 en el núcleo y también para su fosforilación en un sitio activo clave (serina 468) de este factor de transcripción.
La vía de PKC-0 ChIP en extractos nucleares de MCF-IM demostró una asociación entre PKC-0 endógena y p65 o ARN Pol II (Figura 5J). En consecuencia, la PKC-0 existe en la proximidad de NF-KB y el complejo de transcripción activo en un estado mesenquimal.
En términos generales, estos datos sugieren que el inhibidor específico de PKC-0 ATP-competitivo, el compuesto 27, previene la formación de CSC y que la PKC-0 activa colabora con los miembros activos de la familia NF-KB.
Procedimientos experimentales
Cultivo celular y separación de CSC de NCSC
Se cultivaron células de adenocarcinoma mamario humano adherente MCF-7 y MDA-MB-231 en DMEM de baja glucosa (Gibco) y se enriquecieron con 10% FCS, L-glutamina 2mM y 0,1% antibiótico PSN. Las células se estimularon con 0,65 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich) o 20 ng/ml de TGF-p (R&D systems) por los tiempos indicados. Para Bisindolilmaleimida-I (Calbiochem) o estudios del inhibidor de péptidos PKC-0 (Calbiochem), las células se pre-trataron con 1 pM o 30 pM de inhibidor respectivamente durante 1 h, antes de la estimulación en células MCF-7. En caso de MDA-MB-231, las células se trataron con 4 pM o 30 pM de Bisindolilmaleimida-I o con el inhibidor del péptido de PKC-0 respectivamente.
Para separar CSC de no CSC (NCSC), la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se realizó en suspensiones unicelulares que se tiñeron con anticuerpos anti-CD44-APC (559942, BD Biosciences) y anti-CD24-PE (555428, BD Biosciences) junto con Hoechst 33258 para monitorear la viabilidad celular. Como se utiliza en este trabajo, las CSC se definen por minoría de CD44alta/CD24baja, mientras que las NCSC se definen por el resto de las poblaciones celulares.
Se adquirieron componentes de medio de cultivo de mamosferas de StemCell Technologies y se efectuaron ensayos de mamosferas según lo recomendado por las pautas del fabricante. En síntesis, se prepararon luego diluciones celulares de 40.000 células/2 ml, y se sembraron 2 ml de células en placas de fondo plano adherentes ultrabajas de 6 pocillos (Costar). Las mamosferas de más de 60 pm por pocillo se contaron el día 7 y se tomaron imágenes.
Microscopia de contraste de fases
Se efectuó microscopia de contraste de fases en donde las células se visualizaron con una magnificación x 4 (ensayo de cicatrización de heridas) o x 10 magnificación (EMT) usando una microscopia de fluorescencia Olympus IX71 (Olympus), se capturaron imágenes usando el software DPController (2002 Olympus Optical Co. LTD) y se analizaron usando Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc.). Se tomaron barridos con una barra de escala de 10 pm.
Ensayo de cicatrización de heridas
Se creó una herida de una sola capa de células MCF-7 con una punta plástica estéril. Las células se lavaron dos veces con PBS y una vez con DMEM. Se crearon marcas de referencia en la placa para cada pocillo y se adquirió una imagen de tiempo cero por microscopia. Las células se trataron con PMA (0,65 ng/ml) durante 60 h y se tomó una segunda imagen en la región compatibilizada. Los bordes de dos laterales de la monocapa se dibujaron y superpusieron utilizando Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc.).
Plásmidos
Dentro de la secuencia del gen de tipo salvaje de PKC-0 de longitud total, se mutó el sitio de localización nuclear (NLS) y se clonó en el vector pTracer-CMV en marco con una etiqueta HA C-terminal descrita anteriormente (Sutcliffe et al., 2012. Front Immunol. 3:260).
Cebadores
Se usaron conjuntos de cebadores TaqManTm humanos: CD44, Hs00153304, CD24, Hs00273561, uPAR, Hs00182181, Laminina-5, Hs00194333, Zeb-1, Hs00611018, Fibronectina, Hs00415006 e Integrina-p, Hs00168458 (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados para PCR en tiempo real SYBR Green son: Zeb1 (sentido: 5'-GTGCTGTAAGTGCCATTTCTCAGTA-3' y antisentido: 5'-CAAGAGACAAATCAACAAATGCTAGTT-3') y Ciclofilina A (sentido: 5'-CTCCTTTGAGCTGTTTGCAG-3' y antisentido: 5'-CACCACATGCTTGCCATCC-3').
Condiciones de transfección
Se adquirieron ARNip de PKC-0 humana (sc-36252), p50 ARNip (sc-44211) y p65 ARNip (sc-44212) de Santa Cruz Biotechnologies y se realizaron transfecciones directas con ARNip 10nM usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen).
Análisis de aislamiento de ARN y PCR en tiempo real cuantitativo
Se extrajo ARN total usando el reactivo TRIzol® (Invitrogen) y se sintetizó ADNc de primera cadena usando el kit de transcriptasa inversa SuperscriptTM III RNasa H (Invitrogen). Los ensayos de expresión génica TaqMan® y PR en tiempo real SYBR se efectuaron como se describió previamente (Sutcliffe et al., 2009. Molecular and Cellular Biology.
29: 1972-86). Se llevaron a cabo ensayos de MicroARN con el kit de transcripción inversa TagMan® MicroARN (a Bi 4366596) y los datos se normalizaron a RNU6B como se describió previamente en Sutcliffe et al. (2010, Molecular Cell.
41: 704-719).
Ensayos de chip y chip secuencial
Se adquirieron tampones ChIP de Upstate Biotechnology y se efectuaron ensayos ChIP de conformidad con el protocolo provisto por Upstate Biotechnology como se describió previamente (Sutcliffe et al., 2011. Molecular Cell. 41: 704-719). Los anticuerpos utilizados fueron: Anti-PKC-0 (Santa Cruz, sc-212), Anti-PKC-0 Fosfo s695 (Abcam, ab76568) y Pol II c-21 (Abcam, ab817). Los cebadores de promotores utilizados para RT-PCR fueron CD44 humano (directo: TGAGCTCTCCCTCTTTCCAC, inverso: TTGGATATCCTGGGAGAGGA), uPAR (directo: GGGAAGCAAAGCAAGGGTTA, inverso: GTTTT GT CAGGAGGGATACTGG) y IL-6 (directo: CTCACCCTCCAACAAAGATTT, inverso: CAGAATGAGCCTCAGACATC).
Los ensayos ChIP secuenciales se realizaron como lo describieron previamente Sutcliffe et al. (2011. Molecular Cell. 41: 704-719).
Ensayo de actividad de PKC
El ensayo de actividad de PKC se adquirió de Enzo Life Sciences (DI-EKS-420A), y los ensayos se llevaron a cabo de conformidad con el protocolo del fabricante, como se describió previamente (Sutcliffe, 2012. supra).
Inmunofluorescencia
La inmunohistoquímica se realizó en un sistema automático Bond (Vision Biosystems), siguiendo un protocolo estándar. En síntesis, se desparafinaron cortes de tejido de 5 pm, se rehidrataron con alcohol graduado y se tiñeron por separado con anticuerpos anti-PKC-0 o anti-PKC-0 fosfo (como se describe en 0539). Se empleó recuperación térmica durante 28 min a pH 8. Se usaron el cromógeno rojo rápido (Chromogen Fast Red) (Leica Biosystems) y el kit DAKO Envision para visualizar las señales. Se empleó contratinción con hematoxilina para visualizar los núcleos. En cada pasada se incluyeron controles compatibilizados de isotopos positivos y negativos en cada portaobjetos para asegurar que no hubiese una tinción falso-positiva.
La tinción intracelular se realizó como se describió previamente en Sutcliffe et al., 2011. Molecular Cell. 41: 704-719. Análisis de datos
Los datos se analizaron usando Microsoft Excel (Microsoft) y se generaron gráficos usando Prism (versión 5.0, software GraphPad).
Ensayos de actividad de PKC para el ejemplo 6
Se llevaron a cabo ensayos de actividad de PKC-0 y PKC-p (Enzo Life Sciences; DI-EKS-420A) de conformidad con el protocolo del fabricante y como se describió previamente (Sutcliffe et. Al., 2012. Chromatinized Protein Kinase C-theta: Can It Escape the Clutches of NF-kappaB? Front Immunol 3:260.).
Ensayo de actividad de NF-kB para el ejemplo 6
Se usó el kit TransAM NF-kB Family para los ensayos de actividad de NF-kB (43296, motivo activo). Los ensayos se efectuaron de conformidad con los lincamientos del fabricante. 5 |jg de proteína de MDA-MB231 o células enteras derivadas de MCF-IM, extractos nuclear y citoplásmico por triplicado para los ensayos. Se usó extracto nuclear Raji como control positivo. Se usaron también oligonucleótidos de consenso de tipo salvaje y mutados como controles negativos y positivos, respectivamente.
Análisis de inmunotransferencia para el ejemplo 6
Se efectuaron análisis de inmunotransferencia de conformidad con el protocolo del fabricante y como se describió previamente (Rao et. al., 2003. c-Rel is required for chromatin remodeling across the IL-2 gene promoter. Journal of immunology 170:3724-3731.) con anticuerpos anti-PKC-0 (sc-212, SantaCruz), anti-p65 (ab7970, Abcam), anti-p65 fosfo (ser-468) (3039, Cell Signaling), anti-p65 fosfo (ser-536) (3031, Cell Signaling) y Ar N Pol II(c-21) (ab817, Abcam).

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor selectivo de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer metastásico, en donde el cáncer metastásico comprende células madre cancerosas (CSC) y células tumorales no CSC, en donde el inhibidor de PKC-0 inhibe la formación, proliferación, mantenimiento o transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las CSC o estimula o induce la transición mesenquimal a epitelial (MET) de las CSC, y en donde el agente de terapia antineoplásica inhibe la proliferación, supervivencia o viabilidad de las células tumorales no CSC.
2. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente de terapia antineoplásica se selecciona entre un agente radiosensibilizante, un agente quimioterapéutico, un agente de terapia de ablación de hormonas y un agente inmunoterapéutico.
3. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de terapia antineoplásica se dirige rápidamente a las células divisorias o altera el ciclo celular o la división celular.
4. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de terapia antineoplásica es un fármaco quimioterapéutico.
5. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 4, en donde el cáncer metastásico es cáncer de mama metastásico.
6. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la CSC es CSC CD44alta, CD24baja.
7. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la CSC tiene expresión deteriorada o suprimida de los marcadores de células madre pluripotentes Oct4 o Sox2.
8. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la CSC es una CSC de mama.
9. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la CSC de mama es una CSC epitelial de mama.
10. Un inhibidor de PKC-0 y un agente de terapia antineoplásica para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la CSC epitelial de mama es una CSC epitelial ductal.
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