ES2767259T3

ES2767259T3 - Polipéptidos syntac y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2767259T3
Application number: ES15809277T
Authority: ES
Inventors: Ronald Seidel; Rodolfo Chaparro; Brandan Hillerich; Scott Garforth; Steven Almo
Original assignee: Albert Einstein College Medicine; Albert Einstein College of Medicine
Current assignee: Albert Einstein College Medicine; Albert Einstein College of Medicine
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: TWI795740B; AU2021204594A1; TW201613966A; IL275307B; CN106456733B; US20210047384A1; ES2770330T3; IL248979A0; SG10202006338UA; US20180282392A1; WO2015195531A3; DK3157552T3; HUE048076T2; JP2020022491A; JP6652932B2; CN113248623A; EP3480213A1; EP3157552B1; TWI722576B; PT3480213T

Abstract

Un polipéptido multimérico que comprende: un polipéptido heterodimérico que comprende a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo peptídico; y ii) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHC); b) un segundo polipéptido que comprende un segundo polipéptido del MHC, y c) al menos un polipéptido inmunomodulador, donde el primer y/o el segundo polipéptido comprenden el al menos un polipéptido inmunomodulador, donde el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de β2-microglobulina, y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I, donde el epítopo peptídico es un epítopo asociado al cáncer, y opcionalmente, donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no de Ig.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos syntac y usos de los mismos

INTRODUCCIÓN

A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones entre corchetes. Las citas completas de estas referencias se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva.

El rápido progreso durante la última década en el desarrollo de tecnologías de alto rendimiento para el descubrimiento de biomarcadores clínicamente relevantes ha sido paralelo al desarrollo gradual y la aplicación de productos biológicos, fármacos en los que el principio activo es producido o extraído de una fuente biológica (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, proteínas terapéuticas y péptidos), y ha revolucionado el tratamiento de afecciones inmunes. Sin embargo, las terapias biológicas actuales están impulsando acciones reguladoras de seguridad al doble de la tasa de sus homólogos sintéticos (17 % para productos biológicos, 8,5 % sintéticos) [1]. Se cree que esto se manifiesta a partir del modo de acción de estos productos biológicos inmunomoduladores: inmunosupresión global en el caso de autoinmunidad (por ejemplo, Humira [2]) e inmunoestimulación global para el tratamiento de cánceres (por ejemplo, Yervoy [3]). Estos tratamientos no restringen adecuadamente la inmunomodulación a las células patógenamente relevantes y, como resultado, predisponen a los pacientes a infecciones potencialmente mortales y a una serie de efectos secundarios problemáticos [4-6]. Además, la eficacia moderada y los perfiles de seguridad de estos fármacos [7] han provocado una tendencia reciente hacia los productos terapéuticos dirigidos. Los productos biológicos "dirigidos" de primera generación dirigen sus efectos sobre subconjuntos de linfocitos T más restringidos (por ejemplo, anticuerpos y proteínas terapéuticas tales como anti-4-1BB, anti-CD27, LAG-3 y TIM-3) [8-11]. Sin embargo, al igual que las terapias anteriores, estos esfuerzos de "1a generación" siguen siendo incapaces de atacar solo las células relevantes para la enfermedad.

En el núcleo de los eventos moleculares que comprenden una respuesta inmunológica adaptativa está el acoplamiento del receptor de linfocitos T (TCR) con un pequeño antígeno peptídico presentado de forma no covalente por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Esto representa el mecanismo de direccionamiento del sistema inmunitario y es una interacción molecular necesaria para la activación de los linfocitos T y la función efectora. Después del direccionamiento de células específicas de epítopo, los linfocitos T reclutados se activan a través de la participación general de moléculas coestimuladoras que se encuentran en la célula presentadora de antígeno. Ambas señales son necesarias para impulsar la especificidad de los linfocitos T y la activación o la inhibición. Es importante destacar que durante el desarrollo de los linfocitos T, un proceso de edición genómica da como resultado la expresión de un TCR único en cada linfocito T [12], mientras que la molécula coestimuladora generalmente se expresa en todos los linfocitos T (o grandes "subconjuntos" de linfocitos T). Los enfoques actuales dependen casi exclusivamente del acoplamiento general de la molécula coestimuladora, dando como resultado "terapias globales". Estas inmunoterapias globales son increíblemente potentes pero se dirigen indiscriminadamente a los linfocitos T, lo que conduce a una toxicidad significativa. Si las moléculas coestimuladoras pudieran unirse preferentemente a los linfocitos T portadores de TCR relevantes para la enfermedad, su potencia avanzaría de un compromiso a una resistencia.

Existen varios enfoques para la modulación de linfocitos T, que incluyen el uso de moléculas coestimuladoras solubles generalmente expresadas como fusiones de Fc o anticuerpos dirigidos a moléculas coestimuladoras capaces de bloquear la función coestimuladora [13, 14], conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) [15], anticuerpos biespecíficos (BsAbs) [16, 17] y antígenos peptídicos libres [18]. En particular, los ADC (a menudo denominados balas mágicas) prometen la administración dirigida de toxinas (u otras cargas útiles de fármacos) directamente a las células patológicas. Sin embargo, los ADC actualmente adolecen de una falta de biomarcadores preferidos para el direccionamiento de anticuerpos y tasas de internalización deficientes, ya que solo ~1,5 % de la dosis administrada se encuentra dentro de las células tumorales, y a menudo se requiere internalización para la destrucción celular. Los anticuerpos biespecíficos proporcionan una oportunidad atractiva para combinar los efectos aditivos y sinérgicos de múltiples mAb, y pueden usarse para puentear las células tumorales con los linfocitos T [17] y, por lo tanto, no requieren internalización para generar una respuesta. Aunque los anticuerpos biespecíficos se han desarrollado para tener interacciones bivalentes con dos antígenos diferentes [19], estas construcciones aún carecen de modularidad y padecen una afinidad reducida en comparación con el mAb parental [20]. La terapia de linfocitos T adoptivos (CAR-T) aborda parcialmente estos problemas y es una alternativa atractiva a las terapias tradicionales descritas anteriormente [21]. c AR-T utiliza linfocitos T primarios genéticamente modificados que llevan receptores de antígeno quimérico (CAR) en su superficie: los linfocitos T del paciente se extraen, se purifican y se modifican genéticamente para dirigirse a antígenos específicos de tumor a través del uso de CAR. El CAR generalmente tiene un dominio variable externo monocatenario (un fragmento de anticuerpo) que se dirige a las células patológicas pero alberga dominios citoplasmáticos de moléculas coestimuladoras tradicionales. Una vez que los linfocitos T manipulados se unen al antígeno diana, los dominios estimuladores internos proporcionan las señales necesarias para que los linfocitos T se vuelvan completamente activos. En este estado completamente activo, los linfocitos T pueden proliferar y atacar con mayor eficacia a las células cancerosas. La moderación de esta respuesta para evitar el síndrome de liberación de citocinas y los efectos secundarios asociados, junto con problemas de escalabilidad (por ejemplo, el gasto significativo y la dificultad asociada con la extracción y modificación de linfocitos T) actualmente evitan que esta tecnología entre en el uso convencional [22].

Los productos biológicos, también conocidos como productos biofarmacéuticos, son fármacos en los que el principio activo es producido o extraído de una fuente biológica (en contraste con los fármacos de "molécula pequeña"). Los productos biológicos son adiciones relativamente recientes al mercado terapéutico global, siendo en su mayor parte proteínas recombinantes producidas mediante ingeniería genética; estos incluyen anticuerpos monoclonales, proteínas terapéuticas y péptidos. La mayoría de los fármacos biológicos actualmente comercializados se usan para aliviar a los pacientes que padecen enfermedades crónicas, tales como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, infertilidad y fibrosis quística. El mercado mundial de productos biológicos se valoró en 163.000 millones de dólares en 2012 y se espera que alcance 252.000 millones de dólares en 2017, lo que respaldará una tasa de crecimiento anual del compuesto de cinco años del 9 %. Impulsar este crecimiento es la necesidad de una cartera de fármacos más extensa, la identificación de dianas atractivas contra enfermedades desafiantes y un impulso para buscar productos biológicos de seguimiento (biosimilares, biologías genéricas) ilustrados por la reciente introducción de una ruta abreviada de aprobación de la FDA.

La presente invención aborda la necesidad de terapias de precisión para productos terapéuticos personalizados de autoinmunidad e inmuno-oncología que se dirigen clonalmente solo a los linfocitos T relacionados con la enfermedad para la regulación positiva (por ejemplo, en el caso del cáncer) o la supresión (por ejemplo, en el caso de autoinmunidad) en oposición a los moduladores globales y "pseudodirigidos" actualmente en el mercado o en desarrollo.

RESUMEN

La presente invención proporciona un polipéptido multimérico que comprende un polipéptido heterodimérico que comprende

(a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHC);

b) un segundo polipéptido que comprende un segundo polipéptido del MHC, y

c) al menos un polipéptido inmunomodulador,

donde el primer y/o el segundo polipéptido comprende el al menos un polipéptido inmunomodulador,

donde el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina, y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I,

donde el epítopo peptídico es un epítopo asociado al cáncer, y opcionalmente, donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no Ig.

La invención proporciona además un método de modulación selectiva de la actividad de un linfocito T que se une a un epítopo asociado al cáncer, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T in vitro con el polipéptido multimérico de la invención, donde dicho contacto modula selectivamente la actividad del linfocito T.

La invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido multimérico de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación también proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una primera secuencia líder de b2m contigua a un epítopo peptídico candidato contiguo a una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos con una segunda secuencia líder de B2M contigua a una secuencia peptídica del dominio modulador de linfocitos T contigua a un tercer enlazador de aminoácidos contiguo a una secuencia de aminoácidos idéntica a una cadena pesada del MHC contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina.

También se proporciona un método para inhibir un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante como se describe en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio inhibidor, en una cantidad eficaz para inhibir un clon de linfocitos T.

También se proporciona un método para tratar un trastorno autoinmune inhibiendo un clon de linfocitos T autorreactivo que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante como se describe en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio inhibidor, en una cantidad eficaz para tratar un trastorno autoinmune.

También se proporciona un método para estimular un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante como se describe en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio estimulador, en una cantidad eficaz para estimular un clon de linfocitos T.

También se proporciona un método para tratar un cáncer estimulando un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico en un cáncer que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante como se describe en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio estimulador, en una cantidad eficaz para tratar el cáncer.

También se proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a un péptido del dominio modulador de linfocitos T, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada de MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina.

También se proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) un péptido del dominio modulador de linfocitos T contiguo a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada del MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina.

También se proporciona una proteína que comprende dos de las construcciones polipeptídicas recombinantes descritas en el presente documento unidas por uno o más enlaces disulfuro entre los dominios Fc de inmunoglobulina respectivos de los mismos.

La presente divulgación proporciona una célula adaptada a la suspensión aislada transducida por o transfectada con un ácido nucleico heterólogo que comprende, en orden de 5' a 3', una secuencia que codifica un polipéptido recombinante como se describe en el presente documento.

La presente divulgación proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una primera secuencia líder de B2M contigua a un péptido de epítopo candidato contiguo a una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia peptídica del dominio modulador de linfocitos T contigua a un tercer enlazador de aminoácidos contiguo a una segunda secuencia líder de B2M contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una cadena pesada de MHC contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. En algunos casos, el epítopo candidato comprende 7-20 aminoácidos. En algunos casos, el tercer enlazador de aminoácidos es autoescindible. En algunos casos, el segundo enlazador de aminoácidos es autoescindible. En algunos casos, el péptido de autoescisión es un péptido vírico 2A o tiene la secuencia del mismo. En algunos casos, la primera y/o segunda secuencia líder de B2M tiene la secuencia de la secuencia líder de B2M humana. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una cadena pesada del MHC humana. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una molécula MHC I. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es un HLA-A02:01. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una molécula MHC II. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgA. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgM. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de inmunoglobulina humano. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende un marcador His-8 contiguo al extremo C-terminal del mismo. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio inhibidor. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio estimulador. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un anticuerpo, y un fragmento de anticuerpo, un ligando peptídico, un péptido coestimulador de linfocitos T, una citocina o una toxina. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T comprende un péptido PD-L1, el dominio variable de Ig de un péptido PD-L1, el dominio modulador de linfocitos T comprende 4-1BBL, el dominio modulador de linfocitos T comprende B 7 -1 W88A, o el dominio modulador de linfocitos T comprende Fv monocatenario anti-CD28. En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende una mutación en una secuencia de péptido B2M natural humana del mismo, y en la secuencia de cadena pesada del mismo, para realizar un enlace disulfuro entre la secuencia del péptido B2M y la secuencia de cadena pesada.

La presente divulgación proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una primera secuencia líder de B2M contigua a un péptido de epítopo candidato contiguo a una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una segunda secuencia líder de B2M contigua a una secuencia peptídica del dominio modulador de linfocitos T contigua a un tercer enlazador de aminoácidos contiguo a una secuencia de aminoácidos idéntica a una cadena pesada del MHC contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. En algunos casos, el epítopo candidato comprende 7-20 aminoácidos. En algunos casos, el tercer enlazador de aminoácidos es autoescindible. En algunos casos, el segundo enlazador de aminoácidos es autoescindible. En algunos casos, el péptido de autoescisión es un péptido vírico 2A o tiene la secuencia del mismo. En algunos casos, la primera y/o segunda secuencia líder de B2M tiene la secuencia de la secuencia líder de B2M humana. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una cadena pesada del MHC humana. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una molécula MHC I. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es un HLA-A02:01. En algunos casos, la cadena pesada del MHC es una molécula MHC II. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgA. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgM. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de inmunoglobulina humano. En algunos casos, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende un marcador His-8 contiguo al extremo C-terminal del mismo. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio inhibidor. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio estimulador. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un anticuerpo, y un fragmento de anticuerpo, un ligando peptídico, un péptido coestimulador de linfocitos T, una citocina o una toxina. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T comprende un péptido PD-L1, el dominio variable de Ig de un péptido PD-L1, el dominio modulador de linfocitos T comprende 4-1BBL, el dominio modulador de linfocitos T comprende B 7 -1 W88A, o el dominio modulador de linfocitos T comprende Fv monocatenario anti-CD28. En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende una mutación en una secuencia de péptido B2M natural humana del mismo, y en la secuencia de cadena pesada del mismo, para realizar un enlace disulfuro entre la secuencia del péptido B2M y la secuencia de cadena pesada.

En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende una mutación en una secuencia de péptido B2M natural humana del mismo, y en la secuencia de cadena pesada del mismo, para realizar un enlace disulfuro entre la secuencia del péptido B2M y la secuencia de cadena pesada. En algunos casos, la secuencia de cadena pesada es un HLA, y donde el enlace disulfuro se une a uno de los siguientes pares de restos: resto 12 de B2M, resto 236 de HLA; resto 12 de B2M, resto 237 de HLA; resto 8 de B2M, resto 234 de HLA; resto 10 de B2M, resto 235 de HLA; resto 24 de B2M, resto 236 de HLA; resto 28 de B2M, resto 232 de HLA; resto 98 de B2M, resto 192 de HLA; resto 99 de B2M, resto 234 de HLA; resto 3 de B2M, resto 120 de HLA; resto 31 de B2M, resto 96 de HLA; resto 53 de B2M, resto 35 de HLA; resto 60 de B2M, resto 96 de HLA; resto 60 de B2M, resto 122 de HLA; resto 63 de B2M, resto 27 de HLA; resto Arg3 de B2M, resto Gly120 de HLA; resto His31 de B2M, resto Gln96 de HLA; resto Asp53 de B2M, resto Arg35 de HLA; resto Trp60 de b2m , resto Gln96 de HLA; resto Trp60 de B2M, resto Asp122 de HLA; resto Tyr63 de B2M, resto Tyr27 de HlA; resto Lys6 de B2M, resto Glu232 de h La ; resto Gln8 de B2M, resto Arg234 de HLA; resto Tyr10 de B2M, resto Pro235 de HLA; resto Ser11 de B2M, resto Gln242 de HLA; resto Asn24 de B2M, resto Ala236 de HLA; resto Ser28 de B2M, resto Glu 232 de HLA; resto Asp98 de B2M, resto His92 de HLA; y resto Met99 de B2M, resto Arg234 de HLA.

En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende una mutación en una secuencia de péptido B2M natural humana del mismo, y en la secuencia de cadena pesada del mismo, para realizar un enlace disulfuro entre la secuencia del péptido B2M y la secuencia de cadena pesada. En algunos casos, la secuencia de cadena pesada es un HLA y donde el enlace disulfuro se une a uno de los siguientes pares de restos: primera posición del enlazador Gly 2, posición de la cadena pesada (HLA) Tyr 84; posición de la cadena ligera (B2M) Arg 12, HLA Ala236; y/o resto B2M Arg12, resto HLA Gly237.

En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio inhibidor. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio estimulador. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T es un anticuerpo, y un fragmento de anticuerpo, un ligando peptídico, un péptido coestimulador de linfocitos T, una citocina o una toxina. En algunos casos, el dominio modulador de linfocitos T comprende un péptido PD-L1, el dominio variable de Ig de un péptido PD-L1, el dominio modulador de linfocitos T comprende 4-1BBL, el dominio modulador de linfocitos T comprende B 7 -1 W88A, o el dominio modulador de linfocitos T comprende Fv monocatenario anti-CD28.

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos recombinantes descritos anteriormente, o en otra parte en el presente documento. La presente divulgación proporciona una célula transformada con un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos recombinantes descritos anteriormente, o en otra parte en el presente documento.

La presente divulgación proporciona un método para inhibir un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante de cualquiera de los descritos anteriormente, o en otra parte en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio inhibidor, en una cantidad eficaz para inhibir un clon de linfocitos T.

La presente divulgación proporciona un método para tratar un trastorno autoinmune inhibiendo un clon de linfocitos T autorreactivo que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante descrito anteriormente, o en otra parte en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio inhibidor, en una cantidad eficaz para tratar un trastorno autoinmune.

La presente divulgación proporciona un método para estimular un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante descrito anteriormente, o en otra parte en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio estimulador, en una cantidad eficaz para estimular un clon de linfocitos T.

La presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer estimulando un clon de linfocitos T que reconoce un epítopo peptídico en un cáncer que comprende poner en contacto un linfocito T del clon con un péptido recombinante descrito anteriormente, o en otra parte en el presente documento, donde el péptido recombinante comprende el epítopo peptídico y comprende un dominio modulador de linfocitos T que es un dominio estimulador, en una cantidad eficaz para tratar el cáncer.

La presente divulgación proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a un péptido del dominio modulador de linfocitos T, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada del MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. La presente divulgación proporciona una proteína que comprende dos de las construcciones polipeptídicas recombinantes unidas por uno o más enlaces disulfuro entre los dominios Fc de inmunoglobulina respectivos de los mismos.

La presente divulgación proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) un péptido del dominio modulador de linfocitos T contiguo a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada del MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. La presente divulgación proporciona una proteína que comprende dos de las construcciones polipeptídicas recombinantes unidas por uno o más enlaces disulfuro entre los dominios Fc de inmunoglobulina respectivos de los mismos.

La presente divulgación proporciona polipéptidos multiméricos que comprenden al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHC); y donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig), donde el polipéptido multimérico comprende un dominio inmunomodulador en el extremo C-terminal del primer polipéptido o en el extremo N-terminal del segundo polipéptido. La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico. La presente divulgación proporciona vectores de expresión recombinante que comprenden los ácidos nucleicos. La presente divulgación proporciona células huésped genéticamente modificadas, donde las células huésped genéticamente modificadas están genéticamente modificadas con un ácido nucleico de la presente divulgación o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden los polipéptidos multiméricos. La presente divulgación proporciona métodos para modular una actividad de un linfocito T, implicando los métodos poner en contacto el linfocito T con un polipéptido multimérico de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona métodos de tratamiento que implican administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona un recipiente que comprende un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio inmunomodulador; iii) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un polipéptido Fc de Ig. La presente divulgación proporciona un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y iii) un dominio inmunomodulador; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del Mh C; y ii) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig). En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de clase I. En algunos casos, el polipéptido de p2-microglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:4. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I es una cadena pesada HLA-A, HLA-B, o HLA-C. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena alfa del MHC de Clase II; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena beta del MHC de Clase II. En algunos casos, el epítopo es un epítopo de linfocitos T. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1, un polipéptido Fc de IgG2, un polipéptido Fc de IgG3, un polipéptido Fc de IgG4, un polipéptido Fc de IgA, o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos representada en las figuras 24A-24C. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se asocian de forma no covalente. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos covalentemente. En algunos casos, la unión covalente es a través de un enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC o un enlazador entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un primer resto Cys, y el segundo polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un segundo resto Cys, y donde el enlace disulfuro está entre el primer y el segundo restos Cys. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende un primer enlazador interpuesto entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL, un polipéptido B7-1; un polipéptido B7-2, un polipéptido ICOS-L, un polipéptido OX-40L, un polipéptido CD80, un polipéptido CD86, un polipéptido PD-L1, un polipéptido FasL, y un polipéptido PD-L2. En algunos casos, el primer polipéptido o el segundo polipéptido comprende 2 o más péptidos inmunomoduladores. En algunos casos, los 2 o más péptidos inmunomoduladores están en tándem. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende un tercer polipéptido, donde el tercer polipéptido comprende un polipéptido inmunomodulador que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido inmunomodulador del primer polipéptido. En algunos casos, el tercer polipéptido está unido covalentemente al primer polipéptido. En algunos casos, donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) el segundo polipéptido del MHC; ii) el polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig); y iii) un marcador de afinidad.

La presente divulgación proporciona un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del Mh C; y ii) opcionalmente un polipéptido Fc de Ig o un andamiaje no Ig, donde el polipéptido multimérico comprende opcionalmente un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no Ig, donde el polipéptido multimérico comprende uno o más dominios inmunoestimuladores, donde el uno o más dominios inmunoestimuladores es: A) en el extremo C-terminal del primer polipéptido; B) en el extremo N-terminal del segundo polipéptido; C) en el extremo C-terminal del segundo polipéptido; o D) en el extremo C-terminal del primer polipéptido y en el extremo N-terminal del segundo polipéptido. En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende un único polipéptido inmunomodulador. En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende dos polipéptidos inmunoestimuladores (por ejemplo, dos copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende tres polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, tres copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende cuatro polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, cuatro copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende un único polipéptido inmunomodulador. En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende dos polipéptidos inmunoestimuladores (por ejemplo, dos copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende tres polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, tres copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, un polipéptido multimérico comprende cuatro polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, cuatro copias del mismo polipéptido inmunoestimulador). En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y iii) un dominio inmunomodulador; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del m HC; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio inmunomodulador; iii) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig). En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y iii) un dominio inmunomodulador. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un dominio inmunomodulador. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio inmunomodulador; y ii) un segundo polipéptido del MHC. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y iii) un dominio inmunomodulador; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC. En algunos casos, el andamiaje no Ig es un polipéptido XTEN, un polipéptido de transferrina, un polipéptido del receptor Fc, un polipéptido de tipo elastina, un polipéptido de tipo seda, o un polipéptido de tipo seda-elastina. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de clase I. En algunos casos, el polipéptido de p2-microglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:4. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I es una cadena pesada de HLA-A, HLA-B, o HLA-C. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena alfa del MHC de Clase II; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena beta del MHC de Clase II. En algunos casos, el epítopo es un epítopo de linfocitos T. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende un polipéptido Fc, y donde el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1, un polipéptido Fc de IgG2, un polipéptido Fc de IgG3, un polipéptido Fc de IgG4, un polipéptido Fc de IgA, o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos representada en las figuras 24A-24C. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se asocian de forma no covalente. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos covalentemente. En algunos casos, la unión covalente es a través de un enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC o un enlazador entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un primer resto Cys, y el segundo polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un segundo resto Cys, y donde el enlace disulfuro está entre el primer y el segundo restos Cys. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende un primer enlazador interpuesto entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL, un polipéptido B7-1; un polipéptido B7-2, un polipéptido ICOS-L, un polipéptido OX-40L, un polipéptido CD80, un polipéptido c D86, un polipéptido PD-L1, un polipéptido FasL, y un polipéptido PD-L2. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende 2 o más péptidos inmunomoduladores. En algunos casos, los 2 o más péptidos inmunomoduladores están en tándem. En algunos casos, el polipéptido multimérico comprende un tercer polipéptido, donde el tercer polipéptido comprende un polipéptido inmunomodulador que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido inmunomodulador del primer polipéptido o el segundo polipéptido. En algunos casos, el tercer polipéptido está unido covalentemente al primer polipéptido. En algunos casos, el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) el segundo polipéptido del MHC; ii) el polipéptido Fc de Ig; y iii) un marcador de afinidad.

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; en algunos casos, el ácido nucleico está presente en un vector de expresión recombinante. La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido recombinante, i) donde el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo; b) un primer polipéptido del MHC; c) un polipéptido inmunomodulador; d) un enlazador proteolíticamente escindible o una señal de ausencia del ribosoma; e) un segundo polipéptido del MHC; y f) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no basado en Ig; o ii) donde el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo; b) un primer polipéptido del MHC; c) un enlazador proteolíticamente escindible o una señal de ausencia del ribosoma; d) un polipéptido inmunomodulador; e) un segundo polipéptido del MHC; y f) un polipéptido Fc de Ig o un andamiaje no basado en Ig. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido de p2-microglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:4. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I es una cadena pesada de HLA-A, HLA-B, o HLA-C. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena alfa del MHC de Clase II; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena beta del MHC de Clase II. En algunos casos, el epítopo es un epítopo de linfocitos T. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1, un polipéptido Fc de IgG2, un polipéptido Fc de IgG3, un polipéptido Fc de IgG4, un polipéptido Fc de IgA, o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos representada en las figuras 24A-24C. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL, un polipéptido B7-1; un polipéptido B7-2, un polipéptido ICOS-L, un polipéptido OX-40L, un polipéptido CD80, un polipéptido CD86, un polipéptido PD-L1, un polipéptido FasL, y un polipéptido PD-L2. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de un CD7, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, beta receptora de linfotoxina, 3'TR6, ILT3, ILT4, y HVEM. En algunos casos, el enlazador proteolíticamente escindible o señal de ausencia del ribosoma comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) LEVLFQGP (SEQ ID NO:37); b) ENLYTQS (SEQ ID NO:34); c) un sitio de escisión de furina; d) LVPR (SEQ ID NO:36); e) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64); f) GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:65); g) GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:66); y h) GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:67). En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un primer péptido líder; b) el epítopo; c) el primer polipéptido del MHC; d) el polipéptido inmunomodulador; e) el enlazador proteolíticamente escindible o señal de ausencia del ribosoma; f) un segundo péptido líder; g) el segundo polipéptido del MHC; y h) el polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig). En algunos casos, el primer péptido líder y el segundo péptido líder es un péptido líder p2-M. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunos casos, el elemento de control transcripcional es un promotor que es funcional en una célula eucariota. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC o un enlazador entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un primer resto Cys, y el segundo polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un segundo resto Cys, y donde el primer y el segundo restos Cys proporcionan un enlace disulfuro entre el primer polipéptido del MHC y el segundo polipéptido del MHC. La presente divulgación proporciona un vector de expresión recombinante que comprende uno cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente o en otra parte en el presente documento. En algunos casos, el vector de expresión recombinante es un vector viral. En algunos casos, el vector de expresión recombinante es un vector no viral. La presente divulgación proporciona una célula hospedadora modificada genéticamente con un vector de expresión recombinante como se ha descrito anteriormente y en otra parte en el presente documento. En algunos casos, la célula hospedadora es in vitro. En algunos casos, la célula hospedadora está modificada genéticamente de tal forma que la célula no produzca un polipéptido de p2-microglobulina MHC endógeno. En algunos casos, la célula hospedadora es un linfocito T.

La presente divulgación proporciona una composición que comprende: a) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y iii) un dominio inmunomodulador; y b) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un polipéptido Fc de Ig o un andamiaje no basado en Ig. La presente divulgación proporciona una composición que comprende: a) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio inmunomodulador ii) un segundo polipéptido del MHC; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer y/o el segundo ácido nucleico está presente en un vector de expresión recombinante. La presente divulgación proporciona una célula hospedadora modificada genéticamente con una composición de ácido nucleico descrita anteriormente o en otra parte en el presente documento.

La presente divulgación proporciona un método para producir un polipéptido multimérico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento, comprendiendo el método: a) cultivar una célula hospedadora como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento in vitro en un medio de cultivo en condiciones de tal forma que la célula hospedadora sintetice el polipéptido multimérico; y b) aislar el polipéptido multimérico de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo. En algunos casos, el segundo polipéptido comprende un marcadorun marcador de afinidad, y donde dicho aislamiento comprende poner en contacto el polipéptido multimérico producido por la célula con un compañero de unión para el marcador de afinidad, donde el compañero de unión está inmovilizado, inmovilizando así el polipéptido multimérico. En algunos casos, el método comprende eluir el polipéptido multimérico inmovilizado.

La presente divulgación proporciona un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T con un polipéptido multimérico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento, donde dicho contacto modula selectivamente la actividad del linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido activador, y donde el polipéptido multimérico activa el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido inhibidor, y donde el polipéptido multimérico inhibe el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el contacto se realiza in vitro. En algunos casos, el contacto se realiza in vivo.

La presente divulgación proporciona un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento eficaz para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo en un individuo. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido activador, y donde el polipéptido multimérico activa el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el epítopo es un epítopo asociado al cáncer, y donde dicha administración aumenta selectivamente la actividad de un linfocito T específico para el epítopo asociado al cáncer. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido inhibidor, y donde el polipéptido multimérico inhibe la actividad del linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el epítopo es un autoepítopo, y donde dicha administración inhibe selectivamente la actividad de un linfocito T específico para el autoepítopo.

La presente divulgación proporciona un método para tratar una infección en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de a) un polipéptido multimérico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento; o b) uno o más vectores de expresión recombinante que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico; o c) uno o más ARNm que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el epítopo es un epítopo asociado a un patógeno, donde el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido activador, y donde dicha administración es eficaz para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo asociado a un patógeno en un individuo. En algunos casos, el patógeno es un virus, una bacteria, o un protozoo. En algunos casos, la administración es subcutánea (es decir, la administración se realiza a través de administración subcutánea). En algunos casos, la administración es intravenosa (es decir, la administración se realiza a través de administración intravenosa). En algunos casos, la administración es intramuscular (es decir, la administración se realiza a través de administración intramuscular). En algunos casos, la administración es sistémica. En algunos casos, la administración es distal a un sitio de tratamiento (es decir, la administración se realiza a través de administración subcutánea), la administración es local (es decir, la administración se realiza a través de administración subcutánea), la administración es en o cerca de un sitio de tratamiento.

La presente divulgación proporciona una composición que comprende: a) un polipéptido multimérico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación proporciona una composición que comprende: a) un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento, o un vector de expresión recombinante como se ha descrito anteriormente o en otra parte en el presente documento; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: SynTac: una sinapsis inmunológica artificial para la activación de linfocitos T. El panel de la izquierda muestra la hipótesis tradicional de dos señales para la activación de linfocitos T. Es decir, el acoplamiento de linfocitos T dirigido a través de interacciones de TCR único:epítopo del MHC entre el linfocito T y la célula presentadora de antígeno (APC), seguido de estimulación o inhibición a través del compromiso de la molécula coestimuladora. El panel central es una representación esquemática de la molécula synTac seguida de un modo de acción para synTac (derecha). De forma análoga a la respuesta natural (izquierda), la proteína de fusión synTac permite un direccionamiento celular altamente específico a través del epítopo del MHC. Después de esto, se encuentra un dominio modulador de linfocitos T ("MOD") que actúa a través del acoplamiento coestimulador de la molécula y puede proporcionar activación o inhibición. Esto provoca una respuesta de linfocitos T clonal y no global. En particular, el MOD puede ser cualquier anticuerpo conocido o aprobado, fragmento de anticuerpo, molécula coestimuladora u otra carga útil validada por la bibliografía (citocinas, toxinas, etc.), así como nuevas entradas.

FIG. 2A-2C: La construcción de fusión Fc synTac. Una estrategia explota una construcción de fusión Fc para aumentar la valencia, la estabilidad y la ventana terapéutica de los productos asociados. Brevemente, la región Fc es un homodímero covalente natural, formado a través de la interacción de dos dominios CH2-CH3 de inmunoglobulina idénticos (denominados Fc) y estabilizado a través de dos enlaces disulfuro entre los dominios CH2, ilustrados como dos líneas finas. La figura 2A muestra una proteína MHC peptídica monocatenaria unida en su extremo carboxi a una región Fc de IgG. Para introducir enlaces proteicos alternativos (tal como un MOD), la construcción se dividió en cadenas pesadas y ligeras respectivas y fusionó tanto péptidos como proteínas a diversos extremos. Una construcción, la FIG. 2B, da como resultado una asociación amino-terminal del péptido con la cadena ligera (beta 2 microglobulina, B2M) seguida de una extensión carboxilo terminal de la cadena ligera a la molécula efectora MOD. En este escenario, la cadena pesada (molécula HLA, HC) se fusiona con la región Fc. Las construcciones se mantienen juntas covalentemente a través de puentes disulfuro (etiquetados como S-S). Una orientación alternativa, la figura 2C, coloca el extremo amino terminal MOD de la cadena pesada fusionada al Fc con el péptido aún unido a la cadena ligera de B2M.

FIG. 3A-3B: El diseño general de las dos moléculas synTac base. Esta construcción utiliza una secuencia líder de B2M humana natural (LÍDER) para permitir la secreción eficiente y el procesamiento ER inmediatamente seguido de un epítopo candidato (etiquetado como PÉPTIDO). Para el enlace de cadena ligera (LC, FIG. 3A), esto se acopla a la molécula B2M natural a través del enlazador L1 y al MOD a través del enlazador L2. Este casete en su totalidad está unido a otra secuencia líder de B2M, la cadena pesada del MHC y un dominio Fc de IgG1 por un péptido de "autoescisión" de teschovirus-1 (P2A) porcino viral para permitir la expresión estequiométrica de cada cadena. El enlace de cadena pesada (HC, figura 3b ) es similar, sin embargo, el péptido vírico P2A ahora sigue al B2M y el MOD sigue al segundo péptido líder. Ambas construcciones terminan en un marcador 8x His.

FIG. 4: Desactivación mediada por CRISPR/CAS de Beta-2-Microglobulina endógena. El ARN guía se diseñó contra B2M endógeno, se transfectó junto con un plásmido que codifica CRISPR/CAS y se dejó cultivar durante tres días. Las células cultivadas se tiñeron en la superficie para B2M y se contraseleccionaron (clasificadas por pérdida de fluorescencia) mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se permitió que las células clasificadas se recuperaran y se sometieran a dos rondas más de tinción, contraclasificación y recuperación (3 rondas en total) para garantizar una eliminación eficaz. Se comprobó la calidad del grupo final controlando la expresión superficial de B2M a través de FACS, como se ha mostrado anteriormente.

FIG. 5A-5B: Pruebas de producción y actividad de construcciones synTac con enlaces disulfuro diseñados. Se demostró una expresión de alto nivel para una construcción (H236-L12, marcada como synTac 18) con expresión modesta para una segunda (H237-L12, synTac 17). El esquema de disulfuro de dt-SCT se utiliza como control positivo (etiquetado como synTac 2). El pAg E no reductor sugiere que el resto de alto peso molecular, unido por disulfuro, se formó como se esperaba (FIG. 5A). Todas las construcciones de expresión se ampliaron a la escala de 100 ml, se purificaron y se probó la actividad a través de la unión de TCR afín expresado sobre la superficie de las células HEK (denominadas A6), como se controló por fluorescencia FACS, lo que sugiere un plegamiento y actividad adecuados (FIG. 5B). Las células que expresan TCR no afines (denominadas AS01) se usaron como control negativo.

FIG. 6A-6B: Expresión de diversas fusiones de proteínas synTac. Expresión exitosa de (FIG. 6A) fusiones synTac unidas a una cadena ligera con diversos péptidos de direccionamiento e isotipos HLA con un dominio PD-L1 MOD, específicamente 1) HTLV-HLA-A02 humano, 2) IGRP-H2-Kd murino, y 3) TUM-H2-Kd murino, (FIG. 6B) fusión SynTac basada en IGRP que lleva diversos dominios MOD, 4) el dominio variable Ig de PD-L1, 5) 4-1BBL, 6) Fv monocatenario anti-CD28, y 7) B7-1W88A, (FIG. 6C) fusiones synTac basadas en IGRP expresadas como un enlace de cadena pesada, que llevan diversos MODS, 8) PD-L1 y 9) Fv monocatenario anti-CD28.

FIG. 7A-7B: Puenteo de TCR-synTac-PD1: Validación de la integridad de los componentes de proteína synTac. Las células HEK que expresan un TCR afín (A6) se usaron como control positivo y las células que expresaban un TCR no afín (AS01) se generaron y se usaron como control negativo junto con las células parentales no transducidas. Las células se expusieron a variantes synTac HTLV-PD-L1 purificadas no fluorescentes y se incubaron con su receptor afín PD1 fusionado a IgG2a murina. La fusión PD1-Fc se detectó usando un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con FITC. Un esquema de la reacción se ilustra en la figura 7A, los resultados de FAC mostrados en la figura 7B. Como se esperaba, la fluorescencia colocalizada solo se observó cuando synTac presentado por HTLV CON un PD-L1 MOD se expuso a líneas celulares HEK afines (A6). Cabe destacar que esto no se observó cuando se expuso contra células HEK portadoras de TCR no afines o células parentales, cuando se expuso a FITC-PD1-Fc o cuando MOD estaba ausente.

FIG. 8A-8D: SynTac en acción: Ensayos de linfocitos T in vitro. Los linfocitos T CD8+ de 8.3 ratones NOD transgénicos eran cultivos en presencia de anticuerpo anti-CD3 inmovilizado para estimular la activación de linfocitos T policlonales. Los cultivos estimulados se trataron con versiones solubles de synTac TUM-PD-L1 (figura 8A) o synTac IGRP-PD-L1 (FIG. 8C) para examinar la especificidad antigénica de cualquier efecto supresor. Una versión de synTac IGRP sin PD-L1 (FIG. 8B) sirvió como control efector para el dominio MOD. Antes de la siembra, las células se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para controlar el grado de proliferación celular inducida por activación de linfocitos T. Las células se cosecharon a los 5 días y se examinaron usando citometría de flujo para determinar su viabilidad y proliferación. Los sobrenadantes también se examinaron para la expresión de las citocinas efectoras de linfocitos T CD8+ IFNy y TNFa utilizando un ensayo de perlas citométricas de flujo multiplexado. Todos los parámetros de activación de linfocitos T CD8+ examinados se suprimieron de una manera específica del antígeno y dependiente del dominio efector (es decir, MOD) (FIG. 8D). Las FIG. 9A-9F proporcionan secuencias de aminoácidos y una estructura de dominio de polipéptidos synTac. Las FIG. 10A-10C representan construcciones para la expresión trimérica de 4-1BBL. Representación en dibujos (FIG. 10A) de la forma monomérica del ectodominio 4-1BBL natural (restos 50-254), que muestra los dominios de homología proximal de membrana (Memb Prox, MP) y TNF (TNF-H), (FIG. 10B) synTac dimérica 4 -1BBL, y (FIG.

10C) forma trimérica dual totalmente activa de 4-1BBL synTac generada a través de la coexpresión de construcciones synTac tradicionales con una forma "libre" del ecto-dominio 4-1BBL (restos 50-254, FIG. 10A) sin marcador de afinidad. Todas las construcciones se ensamblan cuando se expresan juntas en células de mamífero. La purificación se realiza a través de la región Fc (proteína A/G) seguida de exclusión por tamaño, lo que permite la separación de synTac trimérico 4-1BBL de BBL libre.

FIG. 11A-11B. Análisis de dispersión de luz multiangulo (MALS) de trímeros 4-1BBL con proteínas synTac. (FIG.

11A) Peso molecular de las principales especies identificadas a través de MALS, que muestran ejemplos de múltiples mediciones independientes. (FIG. 11B) Trazas representativas de MALS de synTac 40 51, con niveles relativamente altos de dispersión de luz y baja absorción de UV, lo que refleja la presencia de una pequeña cantidad de proteína con un alto peso molecular. Los componentes de tampón de bajo peso molecular dan como resultado grandes cambios en el índice de refracción (ya sea positivo o negativo) sin un cambio asociado en la absorbancia UV.

FIG. 12. Unión del receptor SynTac 4-1BBL. Las microperlas de proteína A se recubrieron hasta la saturación con proteína de fusión 4-1BB-Fc humana o de ratón recombinante y se usaron para unir construcciones synTac que portan ligando 4-1BB (dímero y trímero) como el dominio comodulador, seguido de un anticuerpo de detección fluorescente específico para el isotipo de cadena pesada synTac. El grado de unión específica de synTac 4-1BBL a 4-1BB transmitido por perlas se midió entonces mediante citometría de flujo de alto rendimiento. Usando este sistema, se exploró el grado de reactividad cruzada y las afinidades relativas de 4-1BBL tanto para 4-1BB humano como murino en el contexto del andamiaje synTac. Se demostró que los synTacs portadores de 4-1BBL se unen al receptor afín, pero no a microperlas unidas a Fc "sin receptor" (denominado sin MOD), lo que sugiere un reactivo de proteína bien plegado y activo. En particular, el trímero se unió en un rango de afinidad esperado para el acoplamiento trimérico dual con el dímero original que muestra una reducción de 10 veces en la afinidad de unión y todas las construcciones reaccionan de forma cruzada entre los receptores murinos y humanos.

FIG. 13. Los linfocitos T CD8+ de 8.3 ratones NOD transgénicos eran cultivos en presencia de anticuerpo anti-CD3 inmovilizado para estimular la activación de linfocitos T policlonales. Los cultivos estimulados se trataron con versiones solubles de synTac TUM-41BBL (A) o synTac IGRP-41BBL (B y C) para examinar la especificidad antigénica de cualquier efecto estimulante. Los tratamientos de control fueron medio en solitario (- CNTRL) o anti-CD3 inmovilizado (+ CNTRL) para determinar la magnitud de la respuesta. Las células se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para controlar el grado de proliferación celular inducida por activación de linfocitos T. Después de 4 días, las células se cosecharon y se examinaron usando citometría de flujo para determinar su viabilidad y proliferación. Los sobrenadantes también se examinaron para la expresión de las citocinas efectoras de linfocitos T CD8+ IFNy y TNFa utilizando un ensayo de perlas citométricas de flujo multiplexado. Todos los parámetros de activación de linfocitos T CD8+ examinados se activaron de una manera específica del antígeno y dependiente del dominio efector (es decir, MOD).

FIG. 14. Ensayos de estimulación de linfocitos T in vivo de dosis única. Los ratones NOD fueron inyectados por vía intraperitoneal con synTac IGRP-41BBL, synTac TUM-41BBL o PBS. Seis días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se examinaron los esplenocitos mediante citometría de flujo para detectar frecuencias relativas de linfocitos T CD8 específicos de IGRp usando una tinción de pentámero de péptido-MHC apropiada. El tratamiento con IGRP-41BBL se asoció con una frecuencia mucho mayor de linfocitos T CD8 específicos de IGRP en comparación con los controles, lo que respalda una expansión significativa in vivo de una sola dosis.

FIG. 15. Ensayos de estimulación de linfocitos T in vivo de dosis múltiple. Los ratones NOD se inyectaron por vía intraperitoneal con synTac IGRP-41BBL, synTac TUM-41BBL o PBS para tres dosis durante dos semanas. Siete días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y los PBMC (de sangre) se examinaron mediante citometría de flujo para detectar frecuencias relativas de linfocitos T CD8 específicos de IGRP usando una tinción de pentámero de péptido-MHC apropiada. El tratamiento con IGRP-41BBL se asoció con una frecuencia mayor de linfocitos T CD8 específicos de IGRP en comparación con los controles, lo que respalda una expansión significativa in vivo de dosis múltiples, incluyendo linfocitos T específicos de tumor raro (TUM).

FIG. 16A-16B. Esquemas de construcciones optimizadas para la expresión trimérica de 4-1BBL. Bloqueo de disulfuro (FIG. 16A, DL) y trímeros tricatenarios (FIG. 16B, SCT).

FIG. 17. Unión del receptor SynTac 4-1BBL. Las microperlas de proteína A se recubrieron hasta la saturación con proteína de fusión 4-1BB-Fc humana o de ratón recombinante y se usaron para unir construcciones synTac que portan ligando 4-1BB (trímeros bloqueados por disulfuro (69, 7o y 71) y trímero monocatenario (SCT) como el dominio comodulador, seguido de un anticuerpo de detección fluorescente específico para el isotipo de cadena pesada synTac. El trímero natural que se muestra es un control de unión (Trímero). El grado de unión específica de synTac 4-1BBL a 4-1BB transmitido por perlas se midió entonces mediante citometría de flujo de alto rendimiento. Se demostró que los synTacs portadores de 4-1BBL se unen al receptor afín, pero no a microperlas unidas a Fc "sin receptor" (denominado sin MOD), lo que sugiere un reactivo de proteína bien plegado y activo. Todas las construcciones reaccionan de forma cruzada entre receptores murinos y humanos.

FIG. 18. Validación de la expresión de construcciones 4-1BBL optimizadas. SynTac's producido por coexpresión, con el modulador original 4-1BBL (synTac 40/51, sin bloqueo de disulfuro, etiquetado como "O" (para el original)) y tres construcciones optimizadas que contienen bloqueos de disulfuro diseñados que restringen la conformación del trímero. Se reemplazaron dos restos naturales en cada construcción por restos de cisteína (Q94C:P245C (etiquetado como "DL1" en gel), Q94C:P242C "DL2", y Q89C:L115C "d L3", denominado synTac 69, 70 y 71, respectivamente), coexpresados en células humanas con una versión "libre" no etiquetada que albergaba las mismas mutaciones (denominadas 98, 99, 100 respectivamente) para permitir el bloqueo covalente en la célula. El grado de enlace disulfuro se observó por la cantidad de 4-1BBL "libre" liberado (unido de forma no covalente) en el análisis de SDS PAGE no reducido. BBL libre migrará a ~20 kDa (BOX), confirmando el bloqueo de disulfuro de las construcciones diseñadas. SynTac que lleva una versión de trímero monocatenario (SCT) de 4-1BBL también se muestra después de la purificación por afinidad y filtración en gel (etiquetada como "SCT"). Masa precisa confirmada por dispersión de luz multiángulo (MALS).

FIG. 19A-19I. Representaciones esquemáticas de realizaciones de construcciones synTac de la presente divulgación. Las FIG. 19A-19C representan construcciones descritas en relación con las FIG. 2A-2C respectivamente; en la FIG. 19B y 19C, se representa el polipéptido sin escindir P2A (arriba) y se representa el polipéptido escindido (a través de la autoescisión mediada por P2A) (abajo) con enlace disulfuro (SS), mediado por sustitución de cisteína (*), ilustrado. Las FIG. 19D-19F representan construcciones descritas anteriormente en relación con las figuras 8A-8C respectivamente; en cada una de las FIG. 19D-19F, la forma no escindida de P2A se representa por encima (arriba) del polipéptido autoescindido mediado por P2A (abajo) con el enlace disulfuro (SS), mediado por sustitución de cisteína (*), ilustrado. La FIG. 19G representa una versión generalizada de la construcción synTac40 en relación con la FIG. 9B con los polipéptidos sin escindir (arriba) y autoescindidos/unidos por disulfuro (abajo) ilustrados. La FIG. 19H representa una versión generalizada de synTac69, synTac70 y synTac71 en relación con la figura 9C-9E, se ilustran los polipéptidos no escindidos (arriba) y autoescindidos/unidos por disulfuro (abajo) y también se indican sustituciones de cisteína adicionales en el dominio 4-1BBL (*). La FIG. 19I representa una versión generalizada del trímero monocatenario synTac 4-1BBL (SCT) en relación con la FIG. 9F, se ilustran los polipéptidos no escindidos (arriba) y autoescindidos/unidos por disulfuro (abajo).

La FIG. 20 proporciona un alineamiento de secuencias de aminoácidos múltiple de precursores de beta-2 microglobulina (B2M) (es decir, incluyendo la secuencia líder) de Homo sapiens (NP 004039.1; SEQ ID NO:78), Pan troglodytes (NP 001009066.1; SEQ ID NO:79), Macaca mulatto (NP 001040602.1; SEQ ID NO:80), Bos Taurus (NP 776318.1; SEQ ID NO:81) y Mus musculus (NP 033865.2; SEQ ID NO:82).

La FIG. 21 proporciona la estructura de dominio de la construcción de SEQ ID NO:6.

La FIG. 22 proporciona la estructura de dominio de la construcción de SEQ ID NO:7.

La FIG. 23 representa el efecto de la administración in vivo de synTac IGRP-PDL1, synTac TUM-PDL1, o una solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de IGRP. Las FIG. 24A-24C proporcionan secuencias de aminoácidos de polipéptidos Fc de inmunoglobulina.

Las FIG. 25A-25C proporcionan secuencias de aminoácidos de polipéptidos de cadena pesada de Clase I de antígeno leucocitario humano (HLA).

Las FIG. 26A-26B proporcionan secuencias de aminoácidos de polipéptidos PD-L1.

La FIG. 27 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido 4-1BBL.

La FIG. 28 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido ICOS-L.

La FIG. 29 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido OX40L.

La FIG. 30 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido PD-L2.

La FIG. 31 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido CD80 (B7-1).

La FIG. 32 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido CD86 (B7-2).

La FIG. 33 proporciona una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del ligando Fas (FAS-L).

Las FIG. 34A-34H proporcionan representaciones esquemáticas de realizaciones de construcciones synTac de la presente divulgación, donde se ilustra el enlace disulfuro (SS), mediado por la sustitución de cisteína (*). En estas realizaciones, se forman enlaces disulfuro entre polipéptidos del MHC (por ejemplo, HLA) presentes en polipéptidos separados.

DEFINICIONES

Una "secuencia líder" como se usa en el presente documento incluye cualquier péptido señal que pueda procesarse por una célula de mamífero, incluido el líder de B2M humano. Dichas secuencias se conocen bien en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "contiguo a" con respecto a, por ejemplo, el elemento A y el elemento B, significa que el elemento A es adyacente al elemento B y está unido al elemento B, preferentemente, a menos que se especifique de otro modo, a través de un enlace covalente. Por ejemplo, para una primera secuencia de aminoácidos contigua a una segunda secuencia de aminoácidos, el extremo C-terminal de la primera secuencia de aminoácidos se puede unir mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, modificados química o bioquímicamente o aminoácidos derivatizados, y polipéptidos que tienen esqueletos de péptidos modificados. Los términos también incluyen polipéptidos que tienen cotraducción (por ejemplo, escisión del péptido señal) y modificaciones postraduccionales del polipéptido, tales como, por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, acetilación, fosforilación, escisión proteolítica y similares. Además, como se usa en el presente documento, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa como sabrá un experto en la materia) con respecto a la secuencia natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de sitio dirigido, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospedadores que producen las proteínas, o errores debidos a la amplificación por PCR u otros métodos de ADN recombinante.

El término "recombinante", como se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, vírico, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con ninguna o una parte de las secuencias de polinucleótidos con las que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante", como se usa con respecto a una proteína o polipéptido, se refiere a un polipéptido producido por expresión a partir de un polinucleótido recombinante. El término "recombinante", como se usa con respecto a una célula hospedadora o un virus, se refiere a una célula hospedadora o virus en el que se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se usa en el presente documento para referirse, con referencia al material (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector) a que el material ha sido modificado por la introducción de un material heterólogo (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector).

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento para incluir una forma polimérica de nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, los términos incluyen ADN tricatenario, bicatenario y monocatenario, así como ARN tricatenario, bicatenario y monocatenario. Los términos también incluyen dichas moléculas con modificaciones, tales como por metilación y/o por protección terminal, y formas no modificadas de un polinucleótido. Más particularmente, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N-glucósido o un C-glucósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen esqueletos no nucleotídicos, polímeros y otros polímeros de ácido nucleico específicos de secuencia sintética, con la condición de que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el emparejamiento de bases y apilamiento de bases, como el que se encuentra en el ADN y el ARN.

El término "vector" como se usa en el presente documento se refiere a un vehículo capaz de transferir secuencias de ácido nucleico a células diana. Por ejemplo, un vector puede comprender una secuencia codificante capaz de expresarse en una célula diana. Como se usa en el presente documento, "construcción de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" generalmente se refieren a cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que es útil para transferir el gen de interés a las células diana. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores integradores y vectores no integradores. Por lo tanto, los vectores son capaces de transferir secuencias de ácido nucleico a células diana y, en algunos casos, se usan para manipular secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico recombinantes (es decir, para hacer secuencias de ácido nucleico recombinantes) y similares. Para los propósitos de esta divulgación, los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, virus y similares.

Un "casete de expresión", como se usa en el presente documento, comprende cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de cualquier transcrito de ARN, incluida la secuencia génica/codificante de interés, así como los ARN no traducidos. Dichos casetes pueden construirse en un "vector", "construcción de vector", "vector de expresión" o "vector de transferencia génica", para transferir el casete de expresión a las células diana. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales. Un transcrito de un casete de expresión puede expresarse de manera estable o transitoria y puede expresarse desde un casete que se integra en el genoma del huésped (de manera dirigida o no dirigida) o puede permanecer no integrado según se desee.

"Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión. Como se usa en el presente documento, los términos promotores heterólogos y regiones de control heterólogas se refieren a promotores y otras regiones de control que normalmente no están asociadas con un ácido nucleico particular en la naturaleza. Por ejemplo, una "región de control de la transcripción heteróloga a una región codificante" es una región de control de la transcripción que normalmente no está asociada con la región codificante en la naturaleza.

El término "sinapsis inmunológica" o "sinapsis inmune", como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a la superficie de interaccón natural entre dos células inmunológicas de interacción de una respuesta inmune adaptativa que incluye, por ejemplo, la superficie de interacción entre una célula presentadora de antígeno (APC) o diana célula y una célula efectora, por ejemplo, un linfocito, un linfocito T efector, una célula citolítica natural, y similares. Una sinapsis inmunológica entre un APC y un linfocito T generalmente se inicia por la interacción de un receptor de antígeno de linfocitos T y moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, por ejemplo, como se describe en Bromley et al., Annu Rev Immunol. 2001;19:375-96;

Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" usado en referencia a secuencias de ácido nucleico, proteínas o polipéptidos, significa que estas moléculas no se producen de forma natural en la célula de la que se deriva la secuencia de ácido nucleico heteróloga, proteína o polipéptido. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido humano que se inserta en una célula que no es una célula humana es una secuencia de ácido nucleico heterólogo en ese contexto particular. Mientras que los ácidos nucleicos heterólogos pueden derivarse de diferentes organismos o especies animales, dicho ácido nucleico no necesita derivarse de especies de organismos separados para ser heterólogo. Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de ácido nucleico sintético o un polipéptido codificado a partir de la misma puede ser heterólogo a una célula en la que se introduce, ya que la célula no contenía previamente el ácido nucleico sintético. Como tal, una secuencia de ácido nucleico sintética o un polipéptido codificado a partir de la misma, puede considerarse heteróloga a una célula humana, por ejemplo, incluso si uno o más componentes de la secuencia de ácido nucleico sintético o un polipéptido codificado a partir de la misma se derivaron originalmente de una célula humana.

Una "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, representa una célula eucariota in vivo o in vitro o una célula de un organismo pluricelular (por ejemplo, una línea celular) cultivada como una entidad unicelular, cuyas células eucariotas pueden utilizarse, o haberse utilizado como receptores de un ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido multimérico de la presente divulgación), e incluyen la progenie de la célula original que se ha modificado genéticamente por el ácido nucleico. Se entiende que la progenie de una sola célula puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en el complemento del ADN genómico o total como el precursor original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una "célula hospedadora recombinante" (también denominada "célula hospedadora genéticamente modificada") es una célula hospedadora en la que se ha introducido un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un vector de expresión. Por ejemplo, una célula hospedadora eucariota modificada genéticamente se modifica genéticamente en virtud de la introducción en una célula hospedadora eucariota adecuada de un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que es externo a la célula hospedadora eucariota, o un ácido nucleico recombinante que no se encuentra normalmente en la célula hospedadora eucariota.

En algunos casos, se hace referencia a las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, incluyendo polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, basándose en "similitud de secuencia" o "identidad de secuencia", por ejemplo, en comparación con una o más secuencias de referencia. En otros casos, se puede hacer referencia a una secuencia mutante o variante basándose en la comparación con una o más secuencias de referencia. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordenadas de la subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

Cuando sea necesario o se desee, el alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988), mediante implementaciones por ordenador de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección visual. (Véase, generalmente Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., John Wiley y Sons, Nueva York (1999)).

El "linfocito T" incluye todos los tipos de células inmunes que expresan CD3, incluyendo los linfocitos T colaboradores (células CD4+), los linfocitos T citotóxicos (células CD8+), los linfocitos T reguladores (Treg) y las células NK-T.

El "ligando coestimulador", como se usa el término en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una APC, célula dendrítica, linfocito B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en un linfocito T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, b 7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando Fas (FasL), ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, beta receptor de linfotoxina, 3TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitación, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocitaria-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente a CD83.

Los términos "purificar", "aislar", y similares, se refieren a la eliminación de una sustancia deseada, por ejemplo, una proteína recombinante, de una solución que contiene sustancias no deseadas, por ejemplo, contaminantes, o la eliminación de sustancias no deseadas de una solución que contiene las sustancias deseadas, dejando esencialmente solo la sustancia deseada. En algunos casos, una sustancia purificada puede estar esencialmente libre de otras sustancias, por ejemplo, contaminantes. La purificación, como se usa en el presente documento, puede referirse a un intervalo de diferentes purezas resultantes, por ejemplo, donde la sustancia purificada constituye hasta más del 80 % de toda la sustancia en la solución, incluyendo más del 85 %, más del 90 %, más del 91 %, más del 92 %, más del 93 %, más del 94 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 %, más del 99 %, más del 99,5 %, más del 99,9 %, y similares. Como se entenderá por los expertos en la técnica, generalmente, los componentes de la propia solución, por ejemplo, agua o tampón, o sales no se consideran al determinar la pureza de una sustancia.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento" como se usa en el presente documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar una regresión de la enfermedad.

Los términos "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", usados indistintamente en el presente documento, se refieren a un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, murinos (por ejemplo, ratas, ratones), lagomorfos (por ejemplo, conejos), primates no humanos, seres humanos, caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, caprinos), etc.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente, o cantidades combinadas de dos agentes, que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para realizar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará según el agente o agentes, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto a tratar.

Antes de que la presente invención se describa adicionalmente, debe entenderse que la presente invención no está limitada a realizaciones particulares descritas, sino que se define por las reivindicaciones adjuntas. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, se abarca dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se abarcan dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.

Debe observarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido multimérico" incluye una pluralidad de dichos polipéptidos y la referencia al "polipéptido inmunomodulador" incluye la referencia a uno o más polipéptidos inmunomoduladores y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, etc. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración tiene la intención de servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".

Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones pertenecientes a la invención se abarcan específicamente por la presente invención y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de las combinaciones se revelaran individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también están incluidas específicamente por la presente invención y se divulgan en el presente documento como si cada una de estas subcombinaciones se revelara individual y explícitamente en el presente documento.

Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación por virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicación reales, lo que podría necesitar ser confirmado de manera independiente.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describe una nueva plataforma terapéutica a base de proteínas que recapitula una respuesta inmune tradicional; una sinapsis inmunológica artificial para la activación de linfocitos T (synTac). Una nueva proteína de fusión que une una molécula coestimuladora a un epítopo del MHC para permitir el acoplamiento preciso de los linfocitos T y la activación o inhibición clonal de los linfocitos T, dependiendo de la porción de la molécula MOD.

POLIPÉPTIDOS MULTIMÉRICOS

La presente divulgación proporciona polipéptidos multiméricos (por ejemplo, heterodiméricos, heterotriméricos). La presente divulgación proporciona precursores de poliproteínas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona productos génicos precursores, por ejemplo, precursores de poliproteínas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, y productos génicos de ARNm que codifican dos o más cadenas polipeptídicas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

También se proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a un péptido del dominio modulador de linfocitos T, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada del MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. En una realización, la construcción polipeptídica recombinante comprende

_ LLFGYPVYVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF

HPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQP

KIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERE

LDLLALVYYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKL

QDAGVY CCIISY GGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWT

NSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPE

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RYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGET

RKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDG

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKE

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AGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPAAAGGDKTHTCPPCPAP

ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRVV SVLTVLHQD WLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGSHHHHHHHH (SEQ ID

NO:6).

También se proporciona una construcción de polipéptido recombinante que comprende (i) un péptido de epítopo candidato unido por una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana, donde (i) está unida por un, o más de un, enlace disulfuro a (ii) un péptido del dominio modulador de linfocitos T contiguo a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de una cadena pesada del MHC contigua a una tercera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina. En una realización, la construcción polipeptídica recombinante comprende

LLFGYPVYVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF

HPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQP

KIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSRSV

ALAVLALLSLSGLEAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDE

QVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVY CCIIS Y GGA

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SRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGG

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LTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTL

RWEPAAAGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP

EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQD WLNGKEYKCKV SNKA

LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

GGSHHHHHHHH (SEQ ID N0:7).

La presente invención proporciona una plataforma synTac: una sinapsis inmunológica artificial para la activación de linfocitos T dirigida como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, la beta 2 microglobulina tiene la misma secuencia que una beta 2 microglobulina humana. En una realización, la secuencia de cadena pesada del complejo de histocompatibilidad tiene la misma secuencia que una secuencia de HLA-A humana. En una realización, el dominio transmembrana de cadena pesada del complejo de histocompatibilidad tiene la misma secuencia que un dominio transmembrana de cadena pesada del complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I) humano. En una realización, el dominio transmembrana de cadena pesada del complejo de histocompatibilidad tiene la misma secuencia que un dominio transmembrana de cadena pesada del complejo principal de histocompatibilidad II (MHC II) humano.

También se proporciona una composición que comprende una pluralidad de las construcciones.

En una realización, el epítopo peptídico candidato es un péptido de 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos. En una realización, el epítopo peptídico candidato es un péptido de 13, 14, 15, 16, o 17 aminoácidos. En una realización, el epítopo peptídico candidato es un nonámero (9 aminoácidos de longitud).

La presente divulgación proporciona polipéptidos multiméricos que comprenden dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) cadenas polipeptídicas. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHC); y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) opcionalmente un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no Ig, donde el polipéptido multimérico comprende uno o más dominios inmunoestimuladores, donde el uno o más dominios inmunomoduladores son: A) en el extremo C-terminal del primer polipéptido; B) en el extremo N-terminal del segundo polipéptido; C) en el extremo C-terminal del segundo polipéptido; o D) en el extremo C-terminal del primer polipéptido y en el extremo N-terminal del segundo polipéptido.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende, en orden del extremo amino (extremo N-terminal) al extremo carboxilo (extremo C-terminal): a) un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocitos T); b) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (m Hc ) y c) un polipéptido inmunomodulador; y donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un segundo polipéptido del MHC; y b) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig). En otros casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocitos T); y b) un primer polipéptido del MHC; y donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un polipéptido inmunomodulador; b) un segundo polipéptido del MHC; y c) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer y el segundo polipéptidos del MHC son polipéptidos del m Hc de Clase I; por ejemplo, en algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina (B2M) MHC de Clase I, y el segundo polipéptido del Mh C es una cadena pesada (cadena H) MHC de Clase I. En otros casos, el primer y el segundo polipéptidos del MHC son polipéptidos del MHC de Clase II; por ejemplo, en algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena a MHC de Clase II, y el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena p MHC de Clase II. En otros casos, el primer polipéptido es un polipéptido de cadena p MHC de Clase II, y el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena a MHC de Clase II. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye dos o más polipéptidos inmunomoduladores. Cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye dos o más polipéptidos inmunomoduladores, en algunos casos, los dos o más polipéptidos inmunomoduladores están presentes en la misma cadena polipeptídica, y puede estar en tándem. Cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye dos o más polipéptidos inmunomoduladores, en algunos casos, los dos o más polipéptidos inmunomoduladores están presentes en polipéptidos separados. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un heterodímero. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido trimérico.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del m Hc ; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del m Hc ; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y iii) un dominio inmunomodulador. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del MHC; y ii) un dominio inmunomodulador. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; y ii) un primer polipéptido del MHC; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio inmunomodulador; y ii) un segundo polipéptido del MHC. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo; ii) un primer polipéptido del MHC; y iii) un dominio inmunomodulador; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un segundo polipéptido del Mh C. En algunos casos, cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende un andamiaje no Ig, el andamiaje no Ig es un péptido x Te N, un polipéptido de transferrina, un polipéptido del receptor Fc, un polipéptido de tipo elastina, un polipéptido de tipo seda, o un polipéptido de tipo seda-elastina.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación es monovalente. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación es multivalente. Por ejemplo, dependiendo del polipéptido Fc presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación, el polipéptido multimérico puede ser un homodímero, donde dos moléculas del polipéptido multimérico están presentes en el homodímero, donde las dos moléculas del polipéptido multimérico pueden estar unidas por disulfuro entre sí, por ejemplo, a través del polipéptido Fc presente en las dos moléculas. Como otro ejemplo, un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender tres, cuatro o cinco moléculas del polipéptido multimérico, donde las moléculas del polipéptido multimérico pueden estar unidas por disulfuro entre sí, por ejemplo, a través del polipéptido Fc presente en las moléculas.

Enlazadores

Un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede incluir péptidos enlazadores interpuestos entre, por ejemplo, un epítopo y un polipéptido del MHC, entre un polipéptido del MHC y un polipéptido inmunomodulador, o entre un polipéptido del MHC y un polipéptido Fc de Ig.

Los enlazadores adecuados (también denominados "espaciadores") pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener cualquiera de varias longitudes adecuadas, tal como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, o de 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, o 7 aminoácidos.

Los enlazadores a modo de ejemplo incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:8) y (GGGS)n(SEQ ID NO:9), donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Se pueden usar polímeros de glicina y glicina-serina; tanto Gly como Ser están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una conexión neutra entre los componentes. Se pueden usar polímeros de glicina; la glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los restos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173- 142 (1992)). Los enlazadores a modo de ejemplo pueden comprender secuencias de aminoácidos que incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO: 10), GGSGG (SEQ ID NO: 11), GSGSG (SEQ ID NO: 12), GSGGG (SEQ ID NO: 13), GGGSG (SEQ ID NO: 14), GSSSG (SEQ ID NO: 15), y similares.

En algunos casos, un polipéptido enlazador, presente en un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, incluye un resto de cisteína que puede formar un enlace disulfuro con un resto de cisteína presente en un segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, por ejemplo, un enlazador adecuado comprende la secuencia de aminoácidos GCGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16).

Epítopos

Un epítopo presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede tener una longitud de aproximadamente 4 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos, por ejemplo, el epítopo puede tener una longitud de 4 aminoácidos (aa) a 10 aa, de 10 aa a 15 aa, de 15 aa a 20 aa, o de 20 aa a 25 aa. Por ejemplo, un epítopo presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede tener una longitud de 4 aminoácidos (aa), 5 aa, 6 aa, 7, aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, 20 aa, 21 aa, 22 aa, 23 aa, 24 aa, o 25 aa. En algunos casos, un epítopo presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación tiene una longitud de 5 aminoácidos a 10 aminoácidos, por ejemplo, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, o 10 aa.

Un epítopo presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación está unido específicamente por un linfocito T, es decir, el epítopo está unido específicamente por un linfocito T específico de epítopo. Un linfocito T específico de epítopo se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos de referencia, pero no se une sustancialmente a un epítopo que difiere de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, un linfocito T específico de epítopo se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos de referencia, y se une a un epítopo que difiere de la secuencia de aminoácidos de referencia, en todo caso, con una afinidad menor de 10'6 M, menos de 10'5 M, o menos de 10'4 M. Un linfocito T específico de epítopo puede unirse a un epítopo para el cual es específico con una afinidad de al menos 10'7 M, al menos 10'8 M, al menos 10'9 M, o al menos 10_l° M.

Los ejemplos no limitantes de epítopos incluyen, por ejemplo, el epítopo del virus 1 linfotrófico T humano LLFGYPVYV (SEQ ID NO: 17); el epítopo tumoral KYQAVTTt L (SEQ iD NO: 18); y el epítopo (IGRP) de la proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica de islote VYl KTNv Fl (SEQ ID NO: 19) o TYLKTNLFL (SEQ ID NO:20). Yang et al. (2006) J. Immunol. 176:2781.

Polipéptidos del MHC

Como se ha indicado anteriormente, un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye polipéptidos del MHC. Para los fines de la presente divulgación, el término "polipéptidos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)" incluye polipéptidos del MHC de diversas especies, incluidos los polipéptidos del MHC humanos (también conocidos como antígeno leucocitario humano (HLA)), polipéptidos del MHC de roedor (por ejemplo, ratón, rata, etc.), y polipéptidos del MHC de otras especies de mamíferos (por ejemplo, lagomorfos, primates no humanos, caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, etc.), y similares. El término "polipéptido del MHC" pretende incluir polipéptidos del MHC de Clase I (por ejemplo, p-2 microglobulina y cadena pesada del MHC de Clase I) y polipéptidos del MHC de Clase II (por ejemplo, polipéptido a MHC de Clase II y polipéptido p MHC de Clase II).

Como se ha apreciado anteriormente, en algunas realizaciones de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, el primer y el segundo polipéptidos del MHC son polipéptidos del MHC de Clase I; por ejemplo, en algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina (B2M) MHC de Clase I, y el segundo polipéptido del MHC es una cadena pesada (cadena H) MHC de Clase I. En otros casos, el primer y el segundo polipéptidos del MHC son polipéptidos del MHC de Clase II; por ejemplo, en algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena a MHC de Clase II, y el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena p MHC de Clase II. En otros casos, el primer polipéptido es un polipéptido de cadena p MHC de Clase II, y el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena a MHC de Clase II.

En algunos casos, un polipéptido del MHC de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido del MHC humano, donde los polipéptidos del Mh C humanos también se denominan polipéptidos "de antígeno leucocitario humano" ("HLA"). En algunos casos, un polipéptido del MHC de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido HLA de Clase I, por ejemplo, un polipéptido p2-microglobulina, o un polipéptido de cadena pesada HLA de Clase I. Los polipéptidos de cadena pesada HLA de Clase I incluyen polipéptidos de cadena pesada HLA-A, polipéptidos de cadena pesada HLA-B, polipéptidos de cadena pesada HLA-C, polipéptidos de cadena pesada HLA-E, polipéptidos de cadena pesada HLA-F, y polipéptidos de cadena pesada HLA-G. En algunos casos, un polipéptido del Mh C de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido HLA de Clase II, por ejemplo, una cadena a HLA de Clase II o una cadena p HLA de Clase II. Los polipéptidos del MHC de Clase II incluyen polipéptidos DP a y p MCH de Clase II, polipéptidos DM a y p, polipéptidos DOA a y p, polipéptidos DOB a y p, polipéptidos DQ a y p, y polipéptidos DR a y p.

Como un ejemplo, un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 25-365 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada HLA-A humana representado en la figura 25A.

Como un ejemplo, un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 25-365 de la secuencia de aminoácidos de la siguiente secuencia de aminoácidos de cadena pesada HLA-A humana:

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEY

WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQ

YAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTE

LVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:5).

Como otro ejemplo, un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 25-362 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada HLA-B humana representado en la figura 25B.

Como otro ejemplo, un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 25-362 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada HLA-C humana representado en la figura 25C.

Como otro ejemplo, un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con la siguiente secuencia de aminoácidos:

GPHSLRYFVTAVSRFGLGEFRFIAVGYVDDTQFVRFDSDADNPREEPRAPWMEQ

EGPEYWEEQTQRAKSDEQWFRVSLRTAQRYYNQSKGGSHTFQRMFGCDVGSDWRLLR

GYQQFAYDGRDYIALNEDLKTWTAADTAALITRRKWEQAGDAEYYRAYLEGECVEWL

RRYLELGNETLLRTD SPKAHVTYHPRS Q VD VTLRC WALGF YPADITLT W QLN GEDLT QD

MELVETRPAGDGTF QKWAAVVVPLGKEQNYT CHVHHKGLPEPLTLRW (SEQ ID NO:22).

Un polipéptido de p2-microglobulina (B2M) de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede ser un polipéptido B2M humano, un polipéptido B2M de primate no humano, un polipéptido B2M murino, y similares. En algunos casos, un polipéptido B2M comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos B2M representada en la figura 20.

En algunos casos, un polipéptido del MHC comprende una única sustitución de aminoácidos con respecto a un polipéptido del MHC de referencia (donde un polipéptido del MHC de referencia puede ser un polipéptido del MHC de tipo silvestre), donde la sustitución de un solo aminoácido sustituye un aminoácido con un resto de cisteína (Cys). Dichos restos de cisteína, cuando están presentes en un polipéptido del MHC de un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, pueden formar un enlace disulfuro con un resto de cisteína presente en una segunda cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

En algunos casos, un primer polipéptido del MHC en un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, y/o el segundo polipéptido del MHC en el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, incluye una sustitución de aminoácidos para sustituir un aminoácido con una cisteína, donde la cisteína sustituida en el primer polipéptido del MHC forma un enlace disulfuro con una cisteína en el segundo polipéptido del MHC, donde una cisteína en el primer polipéptido del MHC forma un enlace disulfuro con la cisteína sustituida en el segundo polipéptido del MHC, o donde la cisteína sustituida en el primer polipéptido del MHC forma un enlace disulfuro con la cisteína sustituida en el segundo polipéptido del MHC.

Por ejemplo, en algunos casos, uno de los siguientes pares de restos en una p2-microglobulina de HLA y una cadena pesada de HLA de Clase I se sustituye con cisteínas: 1) resto 12 del B2M, resto 236 de cadena pesada de HLA de Clase I; 2) resto 12 del B2M, resto 237 de cadena pesada de HLA de Clase I; 3) resto 8 del B2M, resto 234 de cadena pesada de HLA de Clase I; 4) resto 10 del B2M, resto 235 de cadena pesada de HLA de Clase I; 5) resto 24 del B2M, resto 236 de cadena pesada de HLA de Clase I; 6) resto 28 B2M, resto 232 de cadena pesada de HLA de Clase I; 7) resto 98 de B2M, resto 192 de cadena pesada de HLA de Clase I; 8) resto 99 del B2M, resto 234 de cadena pesada de HLA de Clase I; 9) resto 3 del B2M, resto 120 de cadena pesada de HLA de Clase I; 10) resto 31 de B2M, resto 96 de cadena pesada de HLA de Clase I; 11) resto 53 del B2M, resto 35 de cadena pesada de HLA de Clase I; 12) resto 60 del B2M, resto 96 de cadena pesada de HLA de Clase I; 13) resto 60 del B2M, resto 122 de cadena pesada de HLA de Clase I; 14) resto 63 del B2M, resto 27 de cadena pesada de HLA de Clase I; 15) resto Arg3 del B2M, resto Gly120 de cadena pesada de HLA de Clase I; 16) resto His31 del B2M, resto Gln96 de cadena pesada de HLA de Clase I; 17) resto Asp53 del B2M, resto Arg35 de cadena pesada de HLA de Clase I; 18) resto Trp60 del B2M, resto Gln96 de cadena pesada de HLA de Clase I; 19) resto Trp60 del B2M, resto Asp122 de cadena pesada de HLA de Clase I; 20) resto Tyr63 del B2M, resto Tyr27 de cadena pesada de HLA de Clase I; 21) resto Lys6 del B2M, resto Glu232 de cadena pesada de HLA de Clase I; 22) resto Gln8 del B2M, resto Arg234 de cadena pesada de HLA de Clase I; 23) resto Tyr10 del B2M, resto Pro235 de cadena pesada de HLA de Clase I; 24) resto Ser11 del B2M, resto Gln242 de cadena pesada de HLA de Clase I; 25) resto Asn24 del B2M, resto Ala236 de cadena pesada de HLA de Clase I; 26) resto Ser28 del B2M, resto Glu232 de cadena pesada de HLA de Clase I; 27) resto Asp98 del B2M, resto His192 de cadena pesada de HLA de Clase I; y 28) resto Met99 del B2M, resto Arg234 de cadena pesada de HLA de Clase I. La numeración de aminoácidos de la cadena pesada del MHC/HLA de Clase I es en referencia a la cadena pesada del MHC/HLA de Clase I madura, sin un péptido señal. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos representada en la figura 25A, que incluye un péptido señal, Gly120 es Gly144; Gln96 es Gln120; etc.

Polipéptidos inmunomoduladores

Un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede ser un polipéptido inmunomodulador activador o un polipéptido inmunomodulador inhibidor. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye un único polipéptido inmunomodulador. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye dos polipéptidos inmunomoduladores. En algunos casos, los dos polipéptidos inmunomoduladores están en tándem en una cadena polipeptídica. En algunos casos, los dos polipéptidos inmunomoduladores están en cadenas polipeptídicas separadas. En algunos casos, los dos polipéptidos inmunomoduladores están en cadenas polipeptídicas separadas y están unidos por disulfuro entre sí.

Un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es, en algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T. En algunos casos, el polipéptido modulador de linfocitos T es un polipéptido modulador de linfocitos T estimulador (de activación). En algunos casos, el polipéptido modulador de linfocitos T es un polipéptido modulador de linfocitos T inhibidor. Un polipéptido modulador de linfocitos T puede ser un anticuerpo, un ligando peptídico, un polipéptido coestimulador de linfocitos T, una citocina, o una toxina.

En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un resto de reconocimiento basado en anticuerpos o no basado en anticuerpos que se une específicamente a un polipéptido coestimulador que se expresa sobre la superficie de un linfocito T específico de epítopo. Los restos de reconocimiento basados en anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos; fragmentos de anticuerpos que conservan la unión específica al antígeno, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fv, Fv monocatenario (scFv) y Fd; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanizados; anticuerpos monocatenarios (scAb), anticuerpos de dominio único (dAb); anticuerpos de cadena pesada de dominio único; anticuerpos de cadena ligera de dominio único; y similares. Los restos de reconocimiento no basados en anticuerpos adecuados incluyen, por ejemplo, aficuerpos; dominios de Kunitz modificados; monocuerpos (adnectinas); anticalinas; aptámeros; dominios de repetición de anquirina diseñados (DARPins); un sitio de unión de un polipéptido rico en cisteína (por ejemplo, péptidos de tipo knottin ricos en cisteína); avímeros; aflinas; y similares. Un resto de reconocimiento basado en anticuerpos o no basado en anticuerpos se une específicamente a un polipéptido coestimulador que se expresa en la superficie de un linfocito T específico de epítopo, donde dichos polipéptidos coestimuladores incluyen, pero sin limitación, CTLA4, PD1, ICOS, OX40, CD20, y 4-1BB. Los polipéptidos coestimuladores que se expresan en la superficie de un linfocito T específico de epítopo se conocen en la técnica.

En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido coestimulador de linfocitos T. En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido coestimulador de linfocitos T y es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF); por ejemplo, un polipéptido FasL, un polipéptido 41BBL, un polipéptido CD40, un polipéptido OX40L, un polipéptido CD30L, un polipéptido CD70, etc. En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido coestimulador de linfocitos T y es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig); por ejemplo, un polipéptido CD7, un polipéptido CD86, un polipéptido ICAM, etc.

Los polipéptidos inmunomoduladores adecuados de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, PD-L1, FasL, y PD-L2. Los polipéptidos inmunomoduladores adecuados de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, CD7, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, beta receptora de linfotoxina, 3TR6, ILT3, ILT4, y HVEM.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido PD-L1. En algunos casos, un polipéptido PD-L1 de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 19-290 de una secuencia de aminoácidos PD-L1 representada en la figura 26A o 26B.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido 4-1BBL. En algunos casos, un polipéptido 4-lBBL de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 50-254 de la secuencia de aminoácidos 4-1BBL representada en la figura 27.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido ICOS-L. En algunos casos, un polipéptido ICOS-L de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 19-302 de la secuencia de aminoácidos ICOS-L representada en la figura 28.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido OX40L. En algunos casos, un polipéptido OX40L de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1-183 de la secuencia de aminoácidos OX40L representada en la figura 29.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido PD-L2. En algunos casos, un polipéptido PD-L2 de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 20-273 de la secuencia de aminoácidos PD-L2 representada en la figura 30.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido CD80 (B7-1). En algunos casos, un polipéptido Cd 80 de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 35-288 de la secuencia de aminoácidos CD80 representada en la figura 31.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido CD86. En algunos casos, un polipéptido CD86 de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 31-329 de la secuencia de aminoácidos CD86 representada en la figura 32.

En algunos casos, un polipéptido modulador de linfocitos T de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es un polipéptido FasL. En algunos casos, un polipéptido FasL de un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1-281 de la secuencia de aminoácidos FasL representada en la figura 33.

Los dominios moduladores de linfocitos T (MOD) adicionales que se pueden emplear en la invención incluyen productos génicos humanos (proteínas) de origen natural o sintéticos, reactivos de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, Fv monocatenarios, aptámeros, nanocuerpo) dirigidos a un producto génico humano, incluyendo, pero sin limitación, todas las proteínas secretadas que surgen de los mecanismos de secreción habituales y no habituales (por ejemplo, FGF2, IL1, S100A4), y ectodominios de todas las proteínas de superficie celular ancladas por segmentos de proteínas genéticamente codificados de origen natural (tramos de membrana simples o múltiples) o modificaciones postraduccionales tales como enlaces GPI). Cualquier reactivo de afinidad de origen natural o sintético (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, Fv monocatenarios, aptámero, nanocuerpo, lectina, etc.) dirigido a un glicano de superficie celular u otra modificación postraduccional (por ejemplo, sulfatación). Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, miembros de la familia TNF/TNFR (OX40L, ICOSL, FASL, LTA, LTB TRAIL, CD 153, TNFSF9, RANKL, TWEAK, TNFSF13, TNFSF13b, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, CD40LG, CD70) o reactivos de afinidad dirigidos a los miembros de la familia TNF/TNFR; miembros de la superfamilia de inmunoglobulina (VISTA, PD 1, PD-L1, PD-L2, B71, B72, CTLA4, CD28, TIM3, CD4, CD8, CD 19, cadenas del receptor de linfocitos T, ICOS, ligando ICOS, HHLA2, butirofilinas, BTLA, B7-H3, B7-H4, CD3, CD79a, CD79b, IgSF CAMS (incluyendo CD2, CD58, CD48, CD150, CD229, CD244, ICAM-1), receptores de tipo inmunoglobulina leucocitaria (LILR), receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR)), miembros de la superfamilia de lectina, selectinas, citocinas/quimiocina y receptores de citocina/quimiocina, factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento), moléculas de adhesión (integrinas, fibronectinas, cadherinas), o ecto-dominios de proteína de membrana integral multi-segmento, o reactivos de afinidad dirigidos a la superfamilia de inmunoglobulina y productos génicos enumerados. Además, los homólogos/ortólogos activos de estos productos génicos, incluyendo, pero sin limitación, secuencias virales (por ejemplo, CMV, EBV), secuencias bacterianas, secuencias fúngicas, patógenos eucariotas (por ejemplo, Schistosoma, Plasmodium, Babesia, Eimeria, Theileria, Toxoplasma, Entamoeba,Leishmania, y Trypanosoma), y regiones codificantes derivadas de mamíferos. Además, un MOD puede comprender un fármaco de moléculas pequeñas dirigido a un producto génico humano.

Polipéptidos Fc

Un polipéptido multimérico de la presente divulgación comprende un polipéptido Fc, u otro polipéptido de andamiaje adecuado.

Los polipéptidos de andamiaje adecuados incluyen polipéptidos de andamiaje basados en anticuerpos y andamiajes no basados en anticuerpos. Los andamiajes no basados en anticuerpos incluyen, por ejemplo, albúmina, un polipéptido XTEN (recombinante extendido), transferrina, un polipéptido del receptor Fc, un polipéptido de tipo elastina (véase, por ejemplo, Hassouneh et al. (2012) Methods Enzymol. 502:215; por ejemplo, un polipéptido que comprende una unidad de repetición de pentapéptido (Val-Pro-Gly-X-Gly), donde X es cualquier aminoácido distinto de prolina), un polipéptido de unión a albúmina, un polipéptido de tipo seda (véase, por ejemplo, Valluzzi et al. (2002) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 357:165), un polipéptido de tipo seda-elastina (SELP; véase, por ejemplo, Megeed et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54:1075), y similares. Los polipéptidos XTEN adecuados incluyen, por ejemplo, los divulgados en los documentos WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682, y US 2009/0092582; véase, también, Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol. 27:1186). Los polipéptidos de albúmina adecuados incluyen, por ejemplo, albúmina sérica humana.

Los polipéptidos de andamiaje adecuados serán en algunos casos polipéptidos que prolongan la semivida. Por lo tanto, en algunos casos, un polipéptido de andamiaje adecuado aumenta la semivida in vivo (por ejemplo, la semivida en suero) del polipéptido multimérico, en comparación con un polipéptido multimérico de control que carece del polipéptido de andamiaje. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido de andamiaje aumenta la semivida in vivo (por ejemplo, la semivida en suero) del polipéptido multimérico, en comparación con un polipéptido multimérico de control que carece del polipéptido de andamiaje, en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, o más de 100 veces. Como un ejemplo, en algunos casos, un polipéptido Fc aumenta la semivida in vivo (por ejemplo, la semivida en suero) del polipéptido multimérico, en comparación con un polipéptido multimérico de control que carece del polipéptido Fc, en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, o más de 100 veces.

El polipéptido Fc de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede ser un Fc de IgG1 humana, un Fc de IgG2 humana, un Fc de IgG3 humana, un Fc de IgG4 humana, etc. En algunos casos, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de una región Fc representada en las figuras 24A-C. En algunos casos, la región Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o un 100%, de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido Fc de IgG1 humana representado en la figura 24A. En algunos casos, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido Fc de IgG2 humana representado en la figura 24A; por ejemplo, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 99-325 del polipéptido Fc de IgG2 humana representado en la figura 24A. En algunos casos, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido Fc de IgG3 humana representado en la figura 24A; por ejemplo, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 19-246 del polipéptido Fc de IgG3 humana representado en la figura 24A. En algunos casos, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido Fc de IgM humana representado en la figura 24B; por ejemplo, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1-276 con el polipéptido Fc de IgM humana representado en la figura 24B. En algunos casos, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido Fc de IgA humana representado en la figura 24C; por ejemplo, el polipéptido Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o un 100%, de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1-234 con el polipéptido Fc de IgA humana representado en la figura 24C.

Polipéptidos adicionales

Una cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede incluir uno o más polipéptidos además de los descritos anteriormente. Los polipéptidos adicionales adecuados incluyen marcadores de epítopo y dominios de afinidad. Los uno o más polipéptidos adicionales pueden incluirse en el extremo N-terminal de una cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, en el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o internamente en una cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

Marcador de epítopo

Los marcadores de epítopo adecuados incluyen, pero sin limitación, hemaglutinina (HA; por ejemplo, YPYDVPDYA (SEQ ID NO:23); FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK (SEQ ID NO:24); c-myc (por ejemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO:25), y similares.

Dominio de afinidad

Los dominios de afinidad incluyen secuencias peptídicas que pueden interactuar con un compañero de unión, por ejemplo, tal como uno inmovilizado en un soporte sólido, útil para identificación o purificación. Las secuencias de ADN que codifican múltiples aminoácidos individuales consecutivos, tales como histidina, cuando se fusionan con la proteína expresada, pueden usarse para la purificación en una sola etapa de la proteína recombinante mediante la unión de alta afinidad a una columna de resina, tal como níquel-sepharose. Los dominios de afinidad a modo de ejemplo incluyen His5 (HHHHH) (SEQ ID NO:26), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:27), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:25), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:24), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:28), hemaglutinina, por ejemplo, marcador HA (YPYDVPd YA) (SEQ ID n O:23), glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina, dominio de unión a celulosa, RYIr S (SEQ ID NO:30), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:31), dominio de unión a quitina, péptido S, péptido T7, dominio SH2, marcador de Ar N de extremo C, W eAAAREACc Re CCARA (SEQ ID NO:32), dominios de unión a metales, por ejemplo, dominios de unión a cinc o dominios de unión a calcio tales como los de proteínas de unión a calcio, por ejemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadena ligera de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frequenina, caltractina, subunidad grande de calpaína, proteínas S100, parvalbúmina, calbindina D9K, calbindina D28K y calretinina, inteínas, biotina, estreptavidina, MyoD, Id, secuencias de cremallera de leucina y proteína de unión a maltosa.

Modificaciones

Un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede incluir uno o más restos no polipeptídicos unidos covalentemente al polipéptido multimérico. Los restos no polipeptídicos adecuados incluyen, por ejemplo, ácidos grasos biocompatibles y derivados de los mismos; hidroxialquil almidón (HAS), por ejemplo, hidroxietilalmidón (HES); poli(etilenglicol); ácido hialurónico (HA); polímeros de heparosano (HEP); polímeros a base de fosforilcolina; dextrano; ácidos polisálicos (PSA); y similares. En algunos casos, el resto no polipeptídico aumenta la semivida in vivo del polipéptido multimérico, en comparación con un polipéptido multimérico de control que no comprende el resto no polipeptídico.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados incluyen radioisótopos tales como 1231I (yodo), 18F (flúor), 99Tc (tecnecio), 111In (indio), 67Ga (galio), isótopos radiactivos de Gd (153Gd); agentes de contraste tales como gadolinio (Gd), disprosio y hierro; una enzima que genera un producto detectable (por ejemplo, luciferasa, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares); una proteína fluorescente; una proteína cromogénica, colorante (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y similares); metales emisores de fluorescencia, por ejemplo, 152Eu u otros de la serie de los lantánidos; compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo, luminol, isoluminol, sales de acridinio y similares; compuestos bioluminiscentes; y similares.

Actividad

Dependiendo de la naturaleza del polipéptido inmunomodulador ("MOD") presente en un polipéptido multimérico de la presente divulgación, el polipéptido multimérico puede activar o inhibir un linfocito T diana. Un polipéptido multimérico de la presente divulgación activa o inhibe selectivamente un linfocito T diana que es específico para el epítopo presente en el polipéptido multimérico. Los "linfocitos T diana" incluyen linfocitos T CD4+ específicos de epítopo, linfocitos T CD8+ específicos de epítopo. En algunos casos, el linfocito T CD4+ diana es un linfocito T colaborador (por ejemplo, una célula Th1, Th2, o Th17). En algunos casos, el linfocito T CD4+ diana es un linfocito T regulador CD4+CD25+FoxP3+ (Treg). En algunos casos, el linfocito T diana es un linfocito T CD8+ y es un linfocito T citotóxico. En algunos casos, el linfocito T diana es un linfocito T de memoria, que puede ser un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+, donde los linfocitos T son generalmente CD45RO+. En algunos casos, el linfocito T diana es una célula NK-T.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación mejora la localización y el tráfico de linfocitos T. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la extravasación del linfocito T diana a un sitio de tratamiento. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la extravasación del linfocito T diana a un sitio de tratamiento en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, o más de 100 veces, en comparación con el nivel de extravasación del linfocito T diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico. El aumento de la extravasación puede aumentar el número de linfocitos T en un sitio de tratamiento. En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta el número de linfocitos T en un sitio de tratamiento.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación aumenta la expresión por un linfocito T diana de una o más proteínas que median o regulan el tráfico de linfocitos por el linfocito T diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta el nivel de una o más moléculas de adhesión y/o moléculas del receptor de quimiocina en el linfocito T diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la expresión de una o más moléculas de adhesión y/o moléculas del receptor de quimiocina por el linfocito T diana en al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, o más de 100 veces, en comparación con el nivel de la molécula de adhesión y/o la molécula del receptor de quimiocinas producida por el linfocito T diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico. Los ejemplos de moléculas de adhesión incluyen moléculas de adhesión producidas por linfocitos T CD8, donde los ejemplos de dichas moléculas de adhesión incluyen, pero sin limitación, CD44, LFA-1 y VLA-4. Los ejemplos de receptores de quimiocinas incluyen los receptores de quimiocinas producidos por los linfocitos T CD8, donde los ejemplos de dichos receptores de quimiocinas incluyen, pero sin limitación, CCR5, CCR7 y CXCR3.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación da como resultado la generación de linfocitos T de memoria capaces de respuestas citotóxicas rápidas contra un epítopo previamente experimentado. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, da como resultado la generación de linfocitos T de memoria que comprende 0,5 % o más del grupo de linfocitos T específicos de antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, da como resultado la generación de linfocitos T de memoria que comprende el 0,5 % o más, el 1 % o más, el 2 % o más, el 3 % o más, el 4 % o más, el 5 % o más, el 10 % o más, el 15 % o más, o el 20 % o más, del grupo de linfocitos T específicos de antígeno. Un ejemplo de un marcador de superficie celular de linfocitos T de memoria es CD45RO.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación aumenta la proliferación de un linfocito T diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la proliferación del linfocito T diana en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, o más de 100 veces, en comparación con la proliferación del linfocito T diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación aumenta la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la actividad citotóxica del linfocito T hacia una célula diana en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, o más de 100 veces, en comparación con la actividad citotóxica del linfocito T hacia la célula diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico. Las dianas de los linfocitos T incluyen células infectadas por virus, células cancerosas y similares.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación aumenta la producción de citocinas por un linfocito T diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, aumenta la producción de citocinas por el linfocito T en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, o más de 100 veces, en comparación con el nivel de citocina producido por el linfocito T diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico. Los ejemplos de citocinas incluyen citocinas producidas por células Th1, por ejemplo, IL-2, IFN-y, y TNF-a; citocinas producidas por células Th17, por ejemplo, IL-17, IL-21, e IL-22; citocinas producidas por células Treg, por ejemplo, TGF-p, IL-35, e IL-10.

En algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación inhibe la producción de citocinas por un linfocito T diana. Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, cuando se pone en contacto con un linfocito T diana, inhibe la producción de citocinas por un linfocito T diana en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o más del 90 %, en comparación con el nivel de citocina producido por el linfocito T diana que no está en contacto con el polipéptido multimérico. Los ejemplos de citocinas incluyen citocinas producidas por células Th2, por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, e IL-13.

Realizaciones a modo de ejemplo

Los ejemplos no limitantes de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen:

1) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido 4-BBL; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

2) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido PD-L1; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

3) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido ICOS-L; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

4) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido OX40L; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

5) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido CD80; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

6) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido CD86; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

7) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido PD-L2; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

8) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido 4-BBL; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

9) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido PD-L1; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

10) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido ICOS-L; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

11) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido OX40L; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

12) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido CD80; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

13) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido CD86; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

14) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido PD-L2; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

15) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; y ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) i) un polipéptido FasL; ii) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y iii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

16) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos 4-BBL en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

17) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos PD-L1 en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

18) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos ICOS-L en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

19) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos OX40L en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

20) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos CD80 en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

21) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos CD86 en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

22) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos PD-L2 en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

23) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) dos polipéptidos FasL en tándem; y b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

24) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido 4-1BBL; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido 4-1BBL. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos 4-1BBL. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

25) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido PD-L1; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido PD-L1. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos PD-L1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

26) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido ICOS-L; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido ICOS-L. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos ICOS-L. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

27) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido OX40L; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido OX40L. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos OX40L. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

28) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido CD80; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido CD80. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos CD80. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

29) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido CD86; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido CD86. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos CD86. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc;

30) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un polipéptido CD80; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un polipéptido CD86. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el polipéptido CD80 y los polipéptidos CD86. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc; y

31) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido PD-L2; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido PD-L2. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos PD-L2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc; y

32) un polipéptido multimérico que comprende: a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo de linfocitos T; ii) un polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I; y iii) un primer polipéptido FasL; b) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; y ii) un polipéptido Fc de Ig; y c) un tercer polipéptido que comprende un segundo polipéptido FasL. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí; y el primer y el tercer polipéptidos están unidos por disulfuro entre sí. En algunos casos, el primer polipéptido comprende un polipéptido enlazador entre el epítopo y el polipéptido de p2-microglobulina. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido enlazador, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I, y un resto de cisteína presente en el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I; en algunas de estas realizaciones, el polipéptido de p2-microglobulina MHC de Clase I y/o el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I incluyen una sustitución de aminoácidos para proporcionar una cisteína que participa en el enlace disulfuro. En algunos casos, el primer polipéptido y el tercer polipéptido están unidos por disulfuro entre sí a través de un resto de cisteína presente en (o sustituido en) el primer y el segundo polipéptidos FasL. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG2. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG3. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgA o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, se usan polipéptidos del MHC de Clase II en lugar de los polipéptidos del m Hc de Clase I. En algunos casos, el polipéptido multimérico incluye un marcador de epítopo y/o un dominio de afinidad C-terminal al polipéptido Fc.

Precursores de poliproteína

La presente divulgación proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una primera secuencia líder de B2M contigua a un péptido de epítopo candidato contiguo a una primera secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de péptido B2M natural humana contigua a una segunda secuencia de enlazador de aminoácidos contigua a una secuencia peptídica del dominio modulador de linfocitos T contigua a un tercer enlazador de aminoácidos contiguo a una segunda secuencia líder de B2M contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a una cadena pesada del MHC contigua a una secuencia de aminoácidos idéntica a un dominio Fc de inmunoglobulina.

El primer aminoácido puede ser cualquier secuencia de aminoácidos de 50 aminoácidos o menos a un mínimo de 5 aminoácidos. El segundo enlazador de aminoácidos puede ser cualquier secuencia de aminoácidos de 70 aminoácidos o menos a un mínimo de 5 aminoácidos. El tercer enlazador de aminoácidos puede ser un péptido vírico 2A o un péptido con capacidad conocida de escisión de proteasa (por ejemplo, un sitio de escisión de furina, secuencia del virus del grabado del tabaco [TEV], sitio de proteasa de precisión o proteasa de trombina). Por ejemplo, el primer aminoácido comprende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:1). En otro ejemplo, el segundo enlazador de aminoácidos comprende GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:2). En otro ejemplo, el tercer enlazador de aminoácidos comprende SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:3).

Enlazadores

El primer aminoácido puede ser cualquier secuencia de aminoácidos de 50 aminoácidos o menos a un mínimo de 5 aminoácidos. El segundo enlazador de aminoácidos puede ser cualquier secuencia de aminoácidos de 70 aminoácidos o menos a un mínimo de 5 aminoácidos. El tercer enlazador de aminoácidos puede ser un péptido vírico 2A o un péptido con capacidad conocida de escisión de proteasa (por ejemplo, un sitio de escisión de furina, secuencia del virus del grabado del tabaco [TEV], sitio de proteasa de precisión o proteasa de trombina). Por ejemplo, el primer aminoácido comprende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:1). En otro ejemplo, el segundo enlazador de aminoácidos comprende GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:2). En un ejemplo adicional, el tercer enlazador de aminoácidos comprende SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (s Eq ID NO:3).

En un ejemplo de los polipéptidos recombinantes, el tercer enlazador de aminoácidos es autoescindible. En un ejemplo de los polipéptidos recombinantes, el segundo enlazador de aminoácidos es autoescindible. En un ejemplo de los polipéptidos recombinantes, el péptido de autoescisión es un péptido vírico 2A o tiene la secuencia del mismo. En una realización, el péptido vírico 2A es un teschovirus-1 porcino (P2A), virus de la fiebre aftosa (F2A), virus de Thosea asigna (T2A), virus de la rinitis equina A (E2A) o teschovirus-1 viral porcino (P2A), o tiene la secuencia de uno de los mismos. Como alternativa, esto también puede administrarse como dos plásmidos (o virus) separados, eliminando la secuencia 2A por completo.

El enlazador proteolíticamente escindible puede incluir una secuencia de reconocimiento de proteasa reconocida por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en alanina carboxipeptidasa, astacina de Armillaria mellea, leucil aminopeptidasa bacteriana, procoagulante de cáncer, catepsina B, clostripaína, citosol alanil aminopeptidasa, elastasa, endoproteinasa Arg-C, enterocinasa, gastricsina, gelatinasa, Gly-X carboxipeptidasa, glicil endopeptidasa, proteasa de rinovirus 3C humana, hipodermina C, serina endopeptidasa específica de IgA, leucil aminopeptidasa, leucil endopeptidasa, lysC, pro-X carboxipeptidasa lisosomal, lisil aminopeptidasa, metionil aminopeptidasa, myxobacter, nardilisina, endopeptidasa E pancreática, picomain 2A, picomain 3C, proendopeptidasa, prolil aminopeptidasa, proproteína convertasa I, proproteína convertasa II, ruselisina, sacaropepsina, seminogelasa, activador de plasminógeno T, trombina, calicreína tisular, virus del grabado del tabaco (TEV), togavirina, triptofanil aminopeptidasa, activador del plasminógeno U, V8, venombina A, venombina AB y Xaa-pro aminopeptidasa. En algunos casos, el enlazador proteolíticamente escindible puede incluir una secuencia de reconocimiento de proteasa reconocida por una enzima del hospedador, por ejemplo, una enzima producida naturalmente por la célula hospedadora.

Por ejemplo, el enlazador proteolíticamente escindible puede comprender un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz, por ejemplo, un sitio de escisión para una MMP seleccionada de colagenasa-1, -2, y -3 (MMP-1, -8, y -13), gelatinasa A y B (MMP-2 y -9), estromelisina 1, 2, y 3 (MMP-3, -10, y -11), matrilisina (MMP-7), y metaloproteinasas de membrana (MT1-MMP y MT2-MMP). Por ejemplo, la secuencia de escisión de MMP-9 es Pro-X-X-Hy (donde, X representa un resto arbitrario; Hy, un resto hidrófobo), por ejemplo, Pro-X-X-Hy-(SerThr), por ejemplo, Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr- Ser (SEQ ID NO:33) o Pro-LeuGln-Gly-Met-Thr (SEQ ID NO:21). Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión activador de plasminógeno, por ejemplo, un sitio de escisión uPA o un sitio de escisión de activador de plasminógeno tisular (tPA). Los ejemplos específicos de secuencias de escisión de uPA y tPA incluyen secuencias que comprenden Val-Gly-Arg. Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa que puede incluirse en un enlazador proteolíticamente escindible es un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV), por ejemplo, ENLYTQS (SEQ ID NO:34), donde la proteasa se escinde entre la glutamina y la serina. Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa que puede incluirse en un enlazador proteolíticamente escindible es un sitio de escisión de enterocinasa, por ejemplo, DDDDK (SEQ ID NO:35), donde la escisión tiene lugar después del resto de lisina. Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa que puede incluirse en un enlazador proteolíticamente escindible es un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, LVPR (s Eq ID NO:36). Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa que puede incluirse en un enlazador proteolíticamente escindible es un sitio de escisión de furina, por ejemplo, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg, donde X es cualquier aminoácido. Los enlazadores adecuados adicionales que comprenden sitios de escisión de proteasa incluyen enlazadores que comprenden una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: LEVLFQGP (SEQ ID NO:37), escindida por la proteasa PreScission (una proteína de fusión que comprende proteasa de rinovirus 3C humana y glutatión-S-transferasa; Walker et al. (1994) Biotechnol.

12:601); un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, CGLVPAGSGP (SEQ ID NO:38); SLLKSRMVPNFN (SEQ ID NO:39) o SLLIARRMPNFN (SEQ ID NO:40), escindida por catepsina B; SKLVQASASGVN (SEQ ID NO:41) o SSYl Ka SDAPDN (SEQ ID NO:42), escindida por una proteasa del virus Epstein-Barr; RPKPq Qf FGLMN (SEQ ID NO:43) escindida por MMP-3 (estromelisina); SLRPLALWRSFN (SEQ ID NO:44) escindida por MMP-7 (matrilisina); SPQGIAGQRNFN (SEQ ID NO:45) escindida por MMP-9; DVDERDVRGFASFL SEQ ID NO:46) escindida por una MMP de tipo termolisina; SLPLGlWa PNFN (SEQ ID NO:47) escindida por metaloproteinasa 2 de matriz (Mm P-2); SLLIFRSWANFN (SEQ ID NO:48) escindida por catepsina L; SGVVIATVIVIT (SEQ ID NO:49) escindida por catepsina D; SLGPQGIWGQFN (SEQ ID NO:50) escindida por metaloproteinasa 1 de matriz (MMP-1); KKSPGRVVGGSV (SEQ ID NO:51) escindida por activador del plasminógeno de tipo urocinasa; PQGLLGAPGILG (SEQ ID NO:52) escindida por metaloproteinasa de matriz 1 de tipo membrana (MT-MMP); HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT (SEQ ID n O:53) escindida por estromelisina 3 (o MMP-11), termolisina, colagenasa de fibroblastos y estromelisina-1; GPQGLAGQRGIV (SEQ ID NO:54) escindida por metaloproteinasa de matriz 13 (colagenasa-3); GGSGQRGRKALE (SEQ ID NO:55) escindida por activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA); SLSALLSSDIFN (SEQ ID NO:56) escindida por antígeno específico de próstata humano; SLPRFKIIGGFN (SEQ ID NO:57) escindida por calicreína (hK3); SLLGIAVPGNFN (SEQ ID NO:58) escindida por elastasa de neutrófilos; y FFKNIVTPRTPP (SEQ ID NO:59) escindida por calpaína (proteasa neutra activada por calcio). Ejemplos adicionales de enlazadores proteolíticamente escindibles adecuados incluyen: 1) ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:60); 2) EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:61); 3) QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:62); y 4) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:63). Ejemplos adicionales de enlazadores proteolíticamente escindibles adecuados incluyen: 1) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64); 2) GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:65); 3) GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:66); y 4) GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:67).

Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen enlazadores 2A (por ejemplo, T2A), enlazadores de tipo 2A o equivalentes funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los enlazadores incluyen el enlazador picornaviral de tipo 2A, secuencias CHYSEL de teschovirus porcino (P2A), virus de Thosea asigna (T2A) y combinaciones, variantes y equivalentes funcionales de los mismos. En otras realizaciones, las secuencias enlazadoras pueden comprender el motivo Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly2A-Pro2B, que da como resultado la escisión entre la glicina 2A y la prolina 2B. Para los fines de la presente divulgación, P2A (GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64)), T2A (GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:65)), E2A (GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:66)), y F2A (GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:67)) pueden considerarse como "sitios de escisión proteolítica" o "señales de omisión de ribosomas" (CHYSEL). Véase, por ejemplo, Kim et al. (2011) PLoS ONE 6:e 18556. El mecanismo por el cual los polipéptidos codificados se generan como dos cadenas de polipéptidos puede ser por autoescisión del enlazador, por omisión de ribosomas, o derivación traslacional. Independientemente del mecanismo, las al menos dos cadenas polipeptídicas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación pueden producirse usando una secuencia p2a , T2A, E2A o F2A. Los enlazadores adecuados incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos tal como GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64), GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:65), GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:66), GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:67), o una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOs: 64- 67 (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 5 sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 64-67). Los enlazadores adecuados incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos tal como GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64), GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:65), GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:66), GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:67), o una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 64-67 (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 64-67).

Epítopos

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el epítopo candidato comprende 7-20 aminoácidos. En una realización de los polipéptidos recombinantes, el epítopo peptídico tiene 5-20 aminoácidos para el MHC de Clase I. En una realización, el epítopo peptídico tiene 8-11 aminoácidos para el MHC de Clase I. En una realización, el epítopo peptídico tiene 5-40 aminoácidos para el MHC de Clase II. En una realización, el epítopo peptídico tiene 13-17 aminoácidos para el MHC de Clase II. En una realización, el epítopo peptídico es cualquier secuencia de origen natural o humana mutante, o cualquier secuencia derivada de un patógeno.

Polipéptidos del MHC

En una realización de los polipéptidos recombinantes, la primera y/o segunda secuencia líder de B2M tiene la secuencia de la secuencia líder de B2M humana.

En algunos casos, un péptido líder comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con la siguiente secuencia líder de B2M humana: MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:68).

En algunos casos, una secuencia líder de B2M como se describe en el presente documento puede ser una secuencia líder de B2M de mamífero incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, una secuencia líder de B2M humana, una secuencia líder de B2M de primate, una secuencia líder de B2M de roedor, y similares. En algunos casos, un líder de B2M como se describe en el presente documento, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una de las secuencias líder de B2M representadas en la figura 20.

En una realización, el B2M comprende la secuencia:

1QRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGER1EK.VEHSDLSF

SKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:4).

En algunos casos, un polipéptido B2M comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencias de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de B2M representada en la figura 20.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, la cadena pesada del MHC es una cadena pesada del MHC humana. En una realización de los polipéptidos recombinantes, la cadena pesada del MHC es una molécula del MHC I. Las cadenas pesadas del MHC I a modo de ejemplo incluyen la cadena alfa de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K y HLA-L. En una realización de los polipéptidos recombinantes, la cadena pesada del MHC es un HLA-A02:01. En una realización, el HLA es HLA-A02. En una realización, e1HLA-A02 comprende la secuencia: GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQE

GPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLR

GYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEW

LRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQT

QDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID

N0:5).

En una realización de los polipéptidos recombinantes, la cadena pesada del MHC es una molécula MHC II. Las cadenas pesadas MHC II a modo de ejemplo incluyen las de HLA-D.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el polipéptido recombinante comprende además una mutación en una secuencia de péptido b2m natural humana del mismo, y en la secuencia de cadena pesada del mismo, para realizar un enlace disulfuro entre la secuencia del péptido B2M y la secuencia de cadena pesada.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el polipéptido recombinante de la secuencia de cadena pesada es un HLA y el enlace disulfuro se une a uno de los siguientes pares de restos:

resto 12 de B2M, resto 236 de HLA;

resto 12 de B2M, resto 237 de HLA;

resto 8 de B2M, resto 234 de HLA;

resto 10 de B2M, resto 235 de HLA;

resto 24 de B2M, resto 236 de HLA;

resto 28 de B2M, resto 232 de HLA;

resto 98 de B2M, resto 192 de HLA;

resto 99 de B2M, resto 234 de HLA;

resto3 de B2M, resto 120 de HLA;

resto31 de B2M, resto 96 de HLA;

resto 53 de B2M, resto 35 de HLA;

resto 60 de B2M, resto 96 de HLA;

resto 60 de B2M, resto 122 de HLA;

resto 63 de B2M, resto 27 de HLA;

resto Arg3 de B2M, resto Gly120 de HLA;

resto His31 de B2M, resto Gln96 de HLA;

resto Asp53 de B2M, resto Arg35 de HLA;

resto Trp60 de B2M, resto Gln96 de HLA;

resto Trp60 de B2M, resto Asp122 de HLA;

resto Tyr63 de B2M, resto Tyr27 de HLA;

resto Lys6 de B2M, restoGlu232 de HLA;

resto Gln8 de B2M, resto Arg234 de HLA;

resto Tyr10 de B2M, resto Pro235 de HLA;

resto Ser11 de B2M, resto Gln242 de HLA;

resto Asn24 de B2M, resto Ala236 de HLA;

resto Ser28 de B2M, resto Glu232 de HLA;

resto Asp98 de B2M, resto His192 de HLA; y

resto Met99 de B2M, resto Arg234 de HLA

(Véanse las SEQ ID NO:4 y 5 para las secuencias de B2M y HLA).

En una realización de los polipéptidos recombinantes, la secuencia de cadena pesada es un HLA y donde el enlace disulfuro se une a uno de los siguientes pares de restos:

posición de Gly 2 del primer enlazador, posición de Tyr 84 de la cadena pesada (HLA);

posición Arg 12 de la cadena ligera (B2M), Ala236 de HLA; y/o

resto Arg12 de B2M, resto Gly237 de HlA.

Polipéptidos Fc

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG. En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgA. En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgM. En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de inmunoglobulina humano. En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio Fc de IgG1.

Polipéptidos inmunomoduladores

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio inhibidor.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio modulador de linfocitos T es un dominio estimulador.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio modulador de linfocitos T es un anticuerpo, y un fragmento de anticuerpo, un ligando peptídico, un péptido coestimulador de linfocitos T, una citocina o una toxina.

En una realización de los polipéptidos recombinantes, el dominio modulador de linfocitos T comprende un péptido PD-L1, el dominio variable de Ig de un péptido PD-L1, el dominio modulador de linfocitos T comprende 4-1BBL, el dominio modulador de linfocitos T comprende B7-1W88A, o el dominio modulador de linfocitos T comprende Fv monocatenario anti-CD28.

Los dominios moduladores (MOD) de linfocitos T adicionales que se pueden emplear en la invención incluyen productos génicos humanos (proteínas) de origen natural o sintéticos, reactivos de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, Fv monocatenarios, aptámeros, nanocuerpo) dirigidos a un producto génico humano, incluyendo, pero sin limitación, todas las proteínas secretadas que surgen de los mecanismos de secreción habituales y no habituales (por ejemplo, FGF2, IL1, S100A4), y ectodominios de todas las proteínas de superficie celular ancladas por segmentos de proteínas genéticamente codificados de origen natural (tramos de membrana simples o múltiples) o modificaciones postraduccionales tales como enlaces GPI). Cualquier reactivo de afinidad de origen natural o sintético (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, Fv monocatenarios, aptámero, nanocuerpo, lectina, etc.) dirigido a un glicano de superficie celular u otra modificación postraduccional (por ejemplo, sulfatación). Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, miembros de la familia TNF/TNFR (OX40L, ICOSL, FASL, LTA, LTB TRAIL, CD 153, TNFSF9, RANKL, TWEAK, TNFSF13, TNFSF13b, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, CD40LG, CD70) o reactivos de afinidad dirigidos a los miembros de la familia TNF/TNFR; miembros de la superfamilia de inmunoglobulina (VISTA, PD1, PD-L1, PD-L2, B71, B72, CTLA4, CD28, TIM3, CD4, CD8, CD 19, cadenas del receptor de linfocitos T, ICOS, ligando ICOS, HHLA2, butirofilinas, BTLA, B7-H3, B7-H4, CD3, CD79a, CD79b, IgSF CAMS (incluyendo CD2, CD58, CD48, CD150, CD229, CD244, ICAM-1), receptores de tipo inmunoglobulina leucocitaria (LILR), receptores de tipo inmunoglobulina de células citolíticas (KIR)), miembros de la superfamilia de lectina, selectinas, citocinas/quimiocina y receptores de citocina/quimiocina, factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento), moléculas de adhesión (integrinas, fibronectinas, cadherinas), o ecto-dominios de proteína de membrana integral multi-segmento, o reactivos de afinidad dirigidos a la superfamilia de inmunoglobulina y productos génicos enumerados. Además, los homólogos/ortólogos activos de estos productos génicos, incluyendo, pero sin limitación, secuencias víricas (por ejemplo, CMV, EBV), secuencias bacterianas, secuencias fúngicas, patógenos eucariotas (por ejemplo, Schistosoma, Plasmodium, Babesia, Eimeria, Theileria, Toxoplasma, Entamoeba, Leishmania, y Trypanosoma), y resiones codificantes derivadas de mamífero. Además, un MOD puede comprender un fármaco de moléculas pequeñas dirigido a un producto génico humano.

Polipéptidos adicionales

En una realización de los polipéptidos recombinantes, comprenden adicionalmente un marcador His-8 contiguo al extremo C-terminal de los mismos.

Ácidos nucleicos

Se proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos recombinantes descritos en el presente documento. En una realización, el ácido nucleico es un ADN. En una realización, el ácido nucleico es un ADNc. En una realización, el ácido nucleico es un ARN. En una realización, el ácido nucleico es un ARNm.

En una realización, el ácido nucleico recombinante es un vector. En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización, el vector vírico es un vector de lentivirus.

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, las cadenas polipeptídicas individuales de un polipéptido multimérico de la presente divulgación se codifican en ácidos nucleicos separados. En algunos casos, todas las cadenas polipeptídicas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación se codifican en un solo ácido nucleico. En algunos casos, un primer ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y un segundo ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, un ácido nucleico individual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación y un segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un precursor de poliproteína, como se ha descrito anteriormente.

Ácidos nucleicos separados que codifican cadenas polipeptídicas individuales de un polipéptido multimérico

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido multimérico de la presente divulgación. Como se ha apreciado anteriormente, en algunos casos, las cadenas polipeptídicas individuales de un polipéptido multimérico de la presente divulgación se codifican en ácidos nucleicos separados. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas separadas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación están unidas operativamente a elementos de control transcripcional, por ejemplo, promotores, tales como promotores que son funcionales en una célula eucariota, donde el promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible.

La presente divulgación proporciona un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, donde el primer ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, donde el primer polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocitos T); b) un primer polipéptido del MHC; y c) un polipéptido inmunomodulador; y donde el segundo ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un segundo polipéptido del MHC; y b) un polipéptido Fc de Ig. Los epítopos de linfocitos T adecuados, los polipéptidos del MHC, los polipéptidos inmunomoduladores y los polipéptidos Fc de Ig se han descrito anteriormente. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican el primer y el segundo polipéptidos están unidas operativamente a elementos de control transcripcionales. En algunos casos, el elemento de control transcripcional es un promotor que es funcional en una célula eucariota. En algunos casos, los ácidos nucleicos están presentes en vectores de expresión separados.

La presente divulgación proporciona un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, donde el primer ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, donde el primer polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocitos T); y b) un primer polipéptido del MHC; y donde el segundo ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, donde el segundo polipéptido comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un polipéptido inmunomodulador; b) un segundo polipéptido del MHC; y c) un polipéptido Fc de Ig. Los epítopos de linfocitos T adecuados, los polipéptidos del MHC, los polipéptidos inmunomoduladores y los polipéptidos Fc de Ig se han descrito anteriormente. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican el primer y el segundo polipéptidos están unidas operativamente a elementos de control transcripcionales. En algunos casos, el elemento de control transcripcional es un promotor que es funcional en una célula eucariota. En algunos casos, los ácidos nucleicos están presentes en vectores de expresión separados.

Ácido nucleico que codifica dos o más polipéptidos presentes en un polipéptido multimérico

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican al menos el primer polipéptido y el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye un primer, segundo y tercer polipéptido, el ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el primer, segundo y tercer polipéptidos. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican el primer polipéptido y el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen un enlazador proteolíticamente escindible interpuesto entre la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido y la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican el primer polipéptido y el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen un sitio de entrada interna al ribosoma (IRES) interpuesto entre la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido y la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos que codifican el primer polipéptido y el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluyen una señal de ausencia del ribosoma (o un elemento hidrolasa de actuación en cis, CHYSEL) interpuesto entre la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido y la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido. A continuación se describen ejemplos de ácidos nucleicos, donde se proporciona un enlazador proteolíticamente escindible entre las secuencias de nucleótidos que codifican el primer polipéptido y el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; en cualquiera de estas realizaciones, puede usarse IRES o una señal de ausencia del ribosoma en lugar de la secuencia de nucleótidos que codifica el enlazador proteolíticamente escindible.

En algunos casos, un primer ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión recombinante, un ARNm, un ARN vírico, etc.) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una primera cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y un segundo ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión recombinante, un ARNm, un ARN vírico, etc.) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda cadena polipeptídica de un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido, y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido, están unidas cada una operativamente a elementos de control transcripcional, por ejemplo, promotores, tales como promotores que son funcionales en una célula eucariota, donde el promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible.

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido recombinante, donde el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo (por ejemplo, un epítopo de linfocitos T); b) un primer polipéptido del MHC; c) un polipéptido inmunomodulador; d) un enlazador proteolíticamente escindible; e) un segundo polipéptido del MHC; y f) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig). La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido recombinante, donde el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un primer péptido líder; b) el epítopo; c) el primer polipéptido del MHC; d) el polipéptido inmunomodulador; e) el enlazador proteolíticamente escindible; f) un segundo péptido líder; g) el segundo polipéptido del MHC; y h) el polipéptido Fc de Ig. La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido recombinante, donde el polipéptido recombinante comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: a) un epítopo; b) un primer polipéptido del MHC; c) un enlazador proteolíticamente escindible; d) un polipéptido inmunomodulador; e) un segundo polipéptido del MHC; y f) un polipéptido Fc de Ig. En algunos casos, el primer péptido líder y el segundo péptido líder es un péptido líder p2-M. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunos casos, el elemento de control transcripcional es un promotor que es funcional en una célula eucariota.

Los polipéptidos del MHC adecuados se han descrito anteriormente. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I. En algunos casos, el polipéptido de p2-microglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:4. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de Clase I es una cadena pesada HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, o HLA-L. En algunos casos, el polipéptido de cadena pesada del MHC de clase I comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena alfa del MHC de Clase II; y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena beta del MHC de Clase II.

Los polipéptidos Fc adecuados se han descrito anteriormente. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig es un polipéptido Fc de IgG1, un polipéptido Fc de IgG2, un polipéptido Fc de IgG3, un polipéptido Fc de IgG4, un polipéptido Fc de IgA, o un polipéptido Fc de IgM. En algunos casos, el polipéptido Fc de Ig comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos representada en las figuras 24A-24C.

Los polipéptidos inmunomoduladores adecuados se han descrito anteriormente. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL, un polipéptido B7-1; un polipéptido B7-2, un polipéptido ICOS-L, un polipéptido OX-40L, un polipéptido CD80, un polipéptido CD86, un polipéptido PD-L1, un polipéptido FasL, y un polipéptido PD-L2. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se selecciona de CD7, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, beta receptora de linfotoxina, 3TR6, ILT3, ILT4, y HVEM.

Los enlazadores proteolíticamente escindibles adecuados se han descrito anteriormente. En algunos casos, el enlazador proteolíticamente escindible comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) LEVLFQGP (SEQ ID NO:37); b) ENLYTQS (SEQ ID NO:34); c) DDDDK (SEQ ID NO:35); d) LVPR (SEQ ID NO:36); y e) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:64).

En algunos casos, un enlazador entre el epítopo y el primer polipéptido del MHC comprende un primer resto de Cys, y el segundo polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un segundo resto de Cys, de tal forma que el primer y el segundo restos de Cys proporcionan un enlace disulfuro entre el enlazador y el segundo polipéptido del MHC. En algunos casos, el primer polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un primer resto de Cys, y el segundo polipéptido del MHC comprende una sustitución de aminoácidos para proporcionar un segundo resto de Cys, de tal forma que el primer resto de Cys y el segundo resto de Cys proporcionan un enlace disulfuro entre el primer polipéptido del MHC y el segundo polipéptido del MHC.

Vectores de expresión recombinante

La presente divulgación proporciona vectores de expresión recombinante que comprenden ácidos nucleicos de la presente divulgación. En algunos casos, el vector de expresión recombinante es un vector no vírico. En algunas realizaciones, el vector de expresión recombinante es una construcción vírica, por ejemplo, una construcción de virus adenoasociado recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 7.078.387), una construcción adenovírica recombinante, una construcción lentivírica recombinante, una construcción retrovírica recombinante, un vector vírico no integrante, etc.

Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véanse, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véanse, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véanse, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retrovírico (por ejemplo, virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus del tumor mamario); y similares.

Se conocen numerosos vectores de expresión por los expertos en la técnica, y muchos están disponibles comercialmente. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; para células huésped eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.

Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, puede usarse en el vector de expresión cualquiera de una serie de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).

En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador de sitio dirigido se une operativamente a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional en una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero; o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o arqueal). En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido al ADN y/o un polipéptido modificador de sitio dirigido, se une operativamente a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido al ADN y/o un polipéptido modificador de sitio dirigido tanto en células procariotas como eucariotas.

Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen los de citomegalovirus (CMV), virus del herpes simple (HSV) inmediato temprano, timidina cinasa, SV40 temprano y tardío, repeticiones terminales largos (LTR) de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está dentro del nivel de habilidad ordinaria en la técnica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Células hospedadoras modificadas genéticamente

Se proporciona una célula transformada con un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos recombinantes descritos en el presente documento. Los ejemplos de células que pueden transformarse con un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos recombinantes incluyen células de mamífero aisladas, incluyendo, pero sin limitación, riñón embrionario humano (HEK), ovario de hámster chino (CHO), células NS0 (mieloma murino), células amniocíticas humanas (CAP, CAP-T), células de levadura (incluyendo, pero sin limitación, S. cerevisiae, Pichia pastoris), células vegetales (incluyendo, pero sin limitación, NT1 del tabaco, BY-2), células de insecto (incluyendo, pero sin limitación, SF9, S2, SF21, Tni (por ejemplo, High 5)) o células bacterianas (incluyendo, pero sin limitación, E. coli).

La presente divulgación proporciona una célula hospedadora modificada genéticamente, donde la célula hospedadora está modificada genéticamente con un ácido nucleico de la presente divulgación.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen células eucariotas, tales como células de levadura, células de insecto y células de mamífero. En algunos casos, la célula hospedadora es una célula de una línea celular de mamífero. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primates no humanos, líneas celulares de roedores (por ejemplo, ratones, ratas) y similares. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células HeLa (por ejemplo, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) N.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC N.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células b Hk (por ejemplo, ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC N.° CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC N.° CRL1573), células HLHepG2, y similares.

En algunos casos, la célula hospedadora es una célula de mamífero que se ha modificado genéticamente de modo que no sintetiza la p2-M MHC endógena.

Métodos para producir un polipéptido multimérico

La presente divulgación proporciona métodos para producir un polipéptido multimérico de la presente divulgación. Los métodos implican generalmente cultivar, en un medio de cultivo, una célula hospedadora que está modificada genéticamente con un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido multimérico; y aislar el polipéptido multimérico de la célula hospedadora modificada genéticamente y/o el medio de cultivo. Una célula hospedadora que está modificada genéticamente con un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido multimérico también se denomina "huésped de expresión". Como se ha apreciado anteriormente, en algunos casos, las cadenas polipeptídicas individuales de un polipéptido multimérico de la presente divulgación se codifican en vectores recombinantes separados. En algunos casos, todas las cadenas polipeptídicas de un polipéptido multimérico de la presente divulgación se codifican en un solo vector de expresión recombinante.

El aislamiento del polipéptido multimérico de la célula hospedadora de expresión (por ejemplo, de un lisado de la célula hospedadora de expresión) y/o el medio de cultivo en el que se cultiva la célula hospedadora, se puede realizar usando métodos convencionales de purificación de proteínas.

Por ejemplo, se puede preparar un lisado del huésped de expresión y se purifica el lisado usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. Como alternativa, cuando el polipéptido multimérico se secreta desde la célula hospedadora de expresión al medio de cultivo, el polipéptido multimérico se puede purificar del medio de cultivo usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En algunos casos, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 80 % en peso del producto deseado, al menos aproximadamente el 85 % en peso, al menos aproximadamente el 95 % en peso, o al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Los porcentajes pueden basarse en la proteína total.

En algunos casos, por ejemplo, cuando el polipéptido multimérico comprende un marcadorun marcador de afinidad, el polipéptido multimérico puede purificarse usando un compañero de unión inmovilizado de el marcador de afinidad.

Composiciones

La presente divulgación proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido multimérico de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación.

Composiciones que comprenden un polipéptido multimérico

Una composición de la presente divulgación puede comprender, además de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl, KCl, MgSO4, etc.; un agente tamponante, por ejemplo, un tampón Tris, N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N- tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; glicerol; y similares.

La composición puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, varios de los cuales se conoce en la técnica y no ha de analizarse en detalle en el presente documento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en varias publicaciones, incluyendo, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19a Ed. (1995), o la última edición, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

Una composición farmacéutica puede comprender un polipéptido multimérico de la presente divulgación, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una composición farmacéutica objeto será adecuada para la administración a un sujeto, por ejemplo, será estéril. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición farmacéutica objeto será adecuada para la administración a un sujeto humano, por ejemplo, cuando la composición es estéril y está libre de pirógenos detectables y/u otras toxinas.

Las composiciones de proteínas pueden comprender otros componentes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera, para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, clorhidrato, sales de sulfato, solvatos (por ejemplo, sales iónicas mixtas, agua, productos orgánicos), hidratos (por ejemplo, agua), y similares.

Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una solución acuosa, forma de polvo, gránulos, comprimidos, píldoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, aerosoles y similares. La composición puede formularse según las diversas vías de administración descritas a continuación.

Cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra como un inyectable (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal y/o intravenosa) directamente en un tejido, se puede proporcionar una formulación como una forma de dosificación lista para usar, o como una forma no acuosa (por ejemplo, un polvo reconstituible estable al almacenamiento), o una forma acuosa, tal como un líquido compuesto por vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones que contienen proteínas también se pueden proporcionar para mejorar la semivida en suero de la proteína objeto después de la administración. Por ejemplo, la proteína se puede proporcionar en una formulación de liposoma, preparada como un coloide, u otras técnicas convencionales para extender la semivida en suero. Hay varios métodos disponibles para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, Pat. de EE.UU. N.° 4.235.871, 4.501.728 y 4.837.028. Las preparaciones también se pueden proporcionar en forma de liberación controlada o de liberación lenta.

Otros ejemplos de formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección isotónicas estériles, antioxidantes, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. Por ejemplo, una composición farmacéutica objetivo puede estar presente en un recipiente, por ejemplo, un recipiente estéril, tal como una jeringa. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada (secada por congelación) que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

La concentración de un polipéptido multimérico de la presente descripción en una formulación puede variar ampliamente (por ejemplo, de menos de aproximadamente el 0,1 %, usualmente de al menos aproximadamente el 2 % a tanto como del 20 % al 50 % o más en peso) y usualmente se seleccionarán principalmente en función de los volúmenes de fluido, las viscosidades y los factores basados en el paciente según el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente.

La presente divulgación proporciona un recipiente que comprende una composición de la presente divulgación, por ejemplo, una composición líquida. El recipiente puede ser, por ejemplo, una jeringa, una ampolla y similares. En algunos casos, el recipiente es estéril. En algunos casos, tanto el recipiente como la composición son estériles.

Composiciones que comprenden un ácido nucleico o un vector de expresión recombinante

La presente divulgación proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden un ácido nucleico o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación. Se conoce una amplia diversidad de excipientes farmacéuticamente aceptables en la técnica y no es necesario analizarlos en detalle en el presente documento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en diversas publicaciones, incluyendo, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

Una composición de la presente divulgación puede incluir: a) un ácido nucleico objeto o un vector de expresión recombinante; y b) uno o más de: un tampón, un tensioactivo, un antioxidante, un polímero hidrófilo, una dextrina, un agente quelante, un agente de suspensión, un solubilizante, un agente espesante, un estabilizador, un agente bacteriostático, un agente humectante, y un conservante. Los tampones adecuados incluyen, pero sin limitación, (tales como ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano (BIS-Tris), ácido N-(2- hidroxietil)piperazin-N'3-propanosulfónico (EPPS o HEPPS), glicilglicina, ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), piperazin-N,N'-bis(ácido 2-etano-sulfónico) (PIPES), bicarbonato de sodio, ácido 3-(N-tris(hidroximetil)-metil-amino)-2-hidroxi-propanosulfónico) TAPSO, ácido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico (TES), N-tris(hidroximetil)metil-glicina (Tricina), tris(hidroximetil)-aminometano (Tris), etc.). Las sales adecuadas incluyen, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.

Una formulación farmacéutica de la presente divulgación puede incluir un ácido nucleico o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación en una cantidad de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 90 % (p/p). En la descripción de las formulaciones, a continuación, se entenderá que "ácido nucleico objeto o vector de expresión recombinante" incluye un ácido nucleico o vector de expresión recombinante de la presente divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una formulación objeto comprende un ácido nucleico o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación.

Un ácido nucleico objeto o vector de expresión de recombinante sujeto puede mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otros compuestos o mezclas de compuestos; dichos compuestos pueden incluir, por ejemplo, liposomas o moléculas dirigidas al receptor. Un ácido nucleico objeto o vector de expresión recombinante se puede combinar en una formulación con uno o más componentes que ayudan en la captación, distribución y/o absorción.

Un ácido nucleico objeto o vector de expresión recombinante puede formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Un ácido nucleico objeto o vector de expresión recombinante también se puede formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

Una formulación que comprende un ácido nucleico objeto o vector de expresión recombinante puede ser una formulación liposomal. Como se usa en el presente documento, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o en bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que va a administrarse. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que pueden interactuar con moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan el ADN en vez de formar complejos con él. Pueden usarse liposomas tanto catiónicos como no catiónicos para administrar un ácido nucleico objeto o un vector de expresión recombinante.

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", un término que, como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado una vida útil en circulación mejorada en relación con los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los que parte de la porción de lípido que forma la vesícula del liposoma comprende uno o más glicolípidos o se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. de EE.UU. N.° 6.287.860.

Las formulaciones y composiciones de la presente divulgación también pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones es muy conocido en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. de EE.UU. N.° 6.287.860.

En una realización, se incluyen diversos potenciadores de la penetración, para realizar la administración eficiente de ácidos nucleicos. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos. Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de la penetración y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. de EE.UU. N.° 6.287.860.

Las composiciones y formulaciones para administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes saporíferos, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispensación o aglutinantes. Las formulaciones orales adecuadas incluyen aquellas en las que se administra un ácido nucleico antisentido objeto junto con uno o más potenciadores de la penetración, tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares y los ácidos grasos adecuados y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. de EE.UU. N.° 6.287.860. También se adecuadas combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación adecuada a modo de ejemplo es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen, pero sin limitación, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter. Los potenciadores de la penetración adecuados también incluyen propilenglicol, dimetilsulfóxido, trietanoiamina, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 2-pirrolidona y derivados de los mismos, alcohol tetrahidrofurfurílico y AZONE™.

Métodos para modular la actividad de los linfocitos T

La presente divulgación proporciona un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T con un polipéptido multimérico de la presente divulgación, donde el contacto del linfocito T con un polipéptido multimérico de la presente divulgación modula selectivamente la actividad del linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el contacto tiene lugar in vitro. En algunos casos, el contacto tiene lugar in vivo. En algunos casos, el contacto tiene lugar ex vivo.

En algunos casos, por ejemplo, cuando el linfocito T diana es un linfocito T CD8+, el polipéptido multimérico comprende polipéptidos del MHC de Clase I (por ejemplo, cadena pesada de p2-microglobulina y MHC de Clase I). En algunos casos, por ejemplo, cuando el linfocito T diana es un linfocito T CD4+, el polipéptido multimérico comprende polipéptidos del MHC de Clase II (por ejemplo, cadena a MHC de Clase II; cadena p MHC de Clase II).

Cuando un polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye un polipéptido inmunomodulador que es un polipéptido activador, el contacto del linfocito T con el polipéptido multimérico activa el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el linfocito T específico de epítopo es un linfocito T que es específico para un epítopo presente en una célula cancerosa, y el contacto del linfocito T específico de epítopo con el polipéptido multimérico aumenta la actividad citotóxica del linfocito T hacia la célula cancerosa. En algunos casos, el linfocito T específico de epítopo es un linfocito T que es específico para un epítopo presente en una célula cancerosa, y el contacto del linfocito T específico de epítopo con el polipéptido multimérico aumenta el número de los linfocitos T específicos de epítopo.

En algunos casos, el linfocito T específico de epítopo es un linfocito T que es específico para un epítopo presente en una célula infectada por virus, y el contacto del linfocito T específico de epítopo con el polipéptido multimérico aumenta la actividad citotóxica del linfocito T hacia la célula infectada por virus. En algunos casos, el linfocito T específico de epítopo es un linfocito T que es específico para un epítopo presente en una célula infectada por virus, y el contacto del linfocito T específico de epítopo con el polipéptido multimérico aumenta el número de linfocitos T específicos de epítopo.

Cuando polipéptido multimérico de la presente divulgación incluye un polipéptido inmunomodulador que es un polipéptido inhibidor, el contacto del linfocito T con el multimérico inhibe el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el linfocito T específico de epítopo es un linfocito T autorreactivo que es específico para un epítopo presente en un autoantígeno, y el contacto reduce el número de linfocitos T autorreactivos.

Métodos de tratamiento

En una realización, las células transformadas para expresar un polipéptido recombinante de la invención son células aisladas adaptadas a la suspensión. En una realización de la pluralidad de dichas células aisladas adaptadas a la suspensión, o del ácido nucleico recombinante, el ácido nucleico comprende ADN.

En una realización, los linfocitos T comprenden linfocitos T periféricos obtenidos de un sujeto. En una realización, los linfocitos T comprenden linfocitos T en un sujeto. En una realización, los linfocitos T comprenden linfocitos T periféricos en un sujeto. En una realización de los métodos en el presente documento, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación proporciona un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad del polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido multimérico, eficaz para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo en un individuo. En algunos casos, un método de tratamiento de la presente divulgación comprende administrar a un individuo que lo necesite uno o más vectores de expresión recombinante que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, un método de tratamiento de la presente divulgación comprende administrar a un individuo que lo necesite una o más moléculas de ARNm que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido multimérico de la presente divulgación. En algunos casos, un método de tratamiento de la presente divulgación comprende administrar a un individuo que lo necesite un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T específico de epítopo en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores de expresión; ARNm; etc.) que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el polipéptido multimérico modula selectivamente la actividad del linfocito T específico de epítopo en el individuo. La modulación selectiva de la actividad de un linfocito T específico de epítopo puede tratar una enfermedad o trastorno en el individuo. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación.

En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido activador, y el polipéptido multimérico activa el linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el epítopo es un epítopo asociado al cáncer, y el polipéptido multimérico aumenta la actividad de un linfocito T específico para el epítopo asociado al cáncer.

La presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores de expresión; ARNm; etc.) que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el polipéptido multimérico comprende un epítopo de linfocitos T que es un epítopo de cáncer, y donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido inmunomodulador estimulador. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células de cáncer en el individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células cancerosas en el individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, en comparación con el número de células cancerosas en el individuo antes de la administración del polipéptido multimérico, o en ausencia de administración con el polipéptido multimérico. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células cancerosas en el individuo a niveles indetectables. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce la masa tumoral en el individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce la masa tumoral en el individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, en comparación con la masa tumoral en el individuo antes de la administración del polipéptido multimérico, o en ausencia de administración con el polipéptido multimérico. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, aumenta el tiempo de supervivencia del individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, aumenta el tiempo de supervivencia del individuo en al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, de 3 meses a 6 meses, de 6 meses a 1 año, de 1 año a 2 años, de 2 años a 5 años, de 5 años a 10 años, o más de 10 años, en comparación con el tiempo de supervivencia del individuo en ausencia de administración con el polipéptido multimérico.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método para tratar una infección por virus en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el polipéptido multimérico comprende un epítopo de linfocitos T que es un epítopo viral, y donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido inmunomodulador estimulador. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células infectadas por virus en el individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células infectadas por virus en el individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, en comparación con el número de células infectadas por virus en el individuo antes de la administración del polipéptido multimérico, o en ausencia de administración con el polipéptido multimérico. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de células infectadas por virus en el individuo a niveles indetectables.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método para tratar una infección en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el polipéptido multimérico comprende un epítopo de linfocitos T que es un epítopo asociado a patógeno, y donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido inmunomodulador estimulador. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de patógenos en el individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de patógenos en el individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, en comparación con el número de patógenos en el individuo antes de la administración del polipéptido multimérico, o en ausencia de administración con el polipéptido multimérico. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de patógenos en el individuo a niveles indetectables. Los patógenos incluyen virus, bacterias, protozoos y similares.

En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido inhibidor, y el polipéptido multimérico inhibe la actividad del linfocito T específico de epítopo. En algunos casos, el epítopo es un autoepítopo, y el polipéptido multimérico inhibe selectivamente la actividad de un linfocito T específico para el autoepítopo.

La presente divulgación proporciona un método para tratar un trastorno autoinmune en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico, donde el polipéptido multimérico comprende un epítopo de linfocitos T que es un autoepítopo, y donde el polipéptido multimérico comprende un péptido inmunomodulador inhibidor. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce el número de linfocitos T autorreactivos en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, en comparación con el número de linfocitos T autorreactivos en el individuo antes de la administración del polipéptido multimérico, o en ausencia de administración con el polipéptido multimérico. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, reduce la producción de citocinas Th2 en el individuo. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido multimérico es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesita, mejora uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmune en el individuo.

Como se ha apreciado anteriormente, en algunos casos, en la realización de un método de tratamiento en el sujeto, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra a un individuo que lo necesite, como el polipéptido per se. En otros casos, en la realización de un método de tratamiento en el sujeto, uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administran a un individuo que lo necesite. Por lo tanto, en otros casos, uno o más ácidos nucleicos de la presente divulgación, por ejemplo, uno o más vectores de expresión recombinantes de la presente divulgación, se administran a un individuo que lo necesite.

Formulaciones

Las formulaciones adecuadas se han descrito anteriormente, donde las formulaciones adecuadas incluyen un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una formulación adecuada comprende: a) un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una formulación adecuada comprende: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable; en algunos casos, el ácido nucleico es un ARNm. En algunos casos, una formulación adecuada comprende: a) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; b) un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y c) un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una formulación adecuada comprende: a) un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una formulación adecuada comprende: a) un primer vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; b) un segundo vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido de un polipéptido multimérico de la presente divulgación; y c) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados se han descrito anteriormente.

Dosificaciones

Una dosificación adecuada puede determinarse por un médico tratante u otro personal médico cualificado, basándose en diversos factores clínicos. Como se conoce bien en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el polipéptido o ácido nucleico particular a administrar, sexo del paciente, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos administrados simultáneamente. Un polipéptido multimérico de la presente divulgación puede administrarse en cantidades entre 1 ng/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; sin embargo, se contemplan dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, considerando especialmente los factores mencionados anteriormente. Si el régimen es una infusión continua, también puede estar en el intervalo de 1 |jg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto.

En algunos casos, una dosis adecuada de un polipéptido multimérico de la presente divulgación es de 0,01 jg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 jg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 jg a 1 g por kg de peso corporal, de 10 jg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 jg a 10 mg por kg de peso corporal, o de 100 jg a 1 mg por kg de peso corporal. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente tasas de repetición para la dosificación basándose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del agente administrado en los fluidos o tejidos corporales. Después del éxito del tratamiento, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la reaparición de la patología, donde un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 jg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 jg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 jg a 1 g por kg de peso corporal, de 10 jg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 jg a 10 mg por kg de peso corporal, o de 100 jg a 1 mg por kg de peso corporal.

Los expertos en la técnica apreciarán que los niveles de las dosis pueden variar en función del polipéptido multimérico específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del paciente a los efectos secundarios. Las dosis preferidas para un determinado compuesto pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica mediante diversos medios.

En algunas realizaciones, se administran dosis múltiples de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación. La frecuencia de administración de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación puede variar dependiendo de cualquiera de diversos factores, por ejemplo, gravedad de los síntomas, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas (qow), una vez por semana (qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada dos días (qod), diariamente (qd), dos veces al día (qid), o tres veces al día (tid).

La duración de administración de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación, por ejemplo, el periodo de tiempo durante el cual se administra un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación, puede variar, dependiendo de cualquiera de diversos factores, por ejemplo, respuesta del paciente, etc. Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente un día a aproximadamente una semana, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas, de aproximadamente un mes a aproximadamente dos meses, de aproximadamente dos meses a aproximadamente cuatro meses, de aproximadamente cuatro meses a aproximadamente seis meses, de aproximadamente seis meses a aproximadamente ocho meses, de aproximadamente ocho meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 2 años, o de aproximadamente 2 años a aproximadamente 4 años, o más.

Vías de administración

Un agente activo (un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación) se administra a un individuo usando cualquier método y ruta disponibles adecuados para la administración del fármaco, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas.

Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen la administración intratumoral, peritumoral, intramuscular, intratraqueal, intracraneal, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, intravenosa, intraarterial, rectal, nasal, oral y otras vías de administración enteral y parenteral. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del polipéptido multimérico y/o el efecto deseado. Un polipéptido multimérico de la presente divulgación, o un ácido nucleico o vector de expresión recombinante de la presente divulgación, puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis.

En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía intramuscular. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía local. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía intratumoral. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía peritumoral. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía intracranial. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación se administra por vía subcutánea.

En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía intramuscular. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía local. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía intratumoral. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía peritumoral. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico de la presente divulgación se administra por vía intracraneal. En algunas realizaciones, un polipéptido multimérico se administra por vía subcutánea.

Un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación puede administrarse a un huésped usando cualquier método convencional disponible y vías adecuadas para la administración de fármacos convencionales, incluyendo vías sistémica o localizada. En general, las vías de administración contempladas por la divulgación incluyen, pero sin limitación, vías enterales, parenterales o de inhalación.

Las vías de administración parenterales distintas de la administración por inhalación incluyen, pero sin limitación, vías tópicas, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intratumoral, peritumoral e intravenosa, es decir, cualquier vía de administración distinta de a través del canal alimentario. La administración parenteral se puede llevar a cabo para realizar la administración sistémica o local de un polipéptido multimérico de la presente divulgación, un ácido nucleico de la presente divulgación, o un vector de expresión recombinante de la presente divulgación. Cuando se desea la administración sistémica, la administración normalmente implica la administración tópica o mucosa invasiva o absorbida sistémicamente de preparaciones farmacéuticas.

Sujetos adecuados para el tratamiento

Los sujetos adecuados para el tratamiento con un método de la presente divulgación incluyen individuos que tienen cáncer, incluyendo individuos que han sido diagnosticados con cáncer, individuos que han sido tratados por cáncer pero que no respondieron al tratamiento, e individuos que han recibido tratamiento por cáncer y que respondieron inicialmente, pero después se volvieron refractarios al tratamiento. Los sujetos adecuados para el tratamiento con un método de la presente divulgación incluyen individuos que tienen una infección (por ejemplo, una infección con un patógeno tal como una bacteria, un virus, un protozoo, etc.), incluyendo individuos que han sido diagnosticados con una infección, e individuos que han sido tratados por una infección pero que no respondieron al tratamiento. Los sujetos adecuados para el tratamiento con un método de la presente divulgación incluyen individuos que tienen infección bacteriana, incluyendo individuos que han sido diagnosticados con una infección bacteriana, e individuos que han sido tratados por una infección bacteriana pero que no respondieron al tratamiento. Los sujetos adecuados para el tratamiento con un método de la presente divulgación incluyen individuos que tienen infección vírica, incluyendo individuos que han sido diagnosticados con una infección vírica, e individuos que han sido tratados por una infección vírica pero que no respondieron al tratamiento. Los sujetos adecuados para el tratamiento con un método de la presente divulgación incluyen individuos que tienen una enfermedad autoinmune, incluyendo los individuos que han sido diagnosticados con una enfermedad autoinmune, e individuos que han sido tratados por una enfermedad autoinmune pero que no respondieron al tratamiento.

Todas las combinaciones de los diversos elementos descritos en el presente documento están dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.

La presente invención se entenderá mejor a partir de los Detalles Experimentales, que se indican a continuación. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos analizados son meramente ilustrativos de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas sobre cómo preparar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados Celsius, y la presión es igual o cercana a la atmosférica. Se pueden usar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, pares de bases; nt, nucleótido(s); i.m., por vía intramuscular; i.p., por vía intraperitoneal; s.c., por vía subcutánea; y similares.

Ejemplo 1: Generación heterodímeros SynTac

Los aspectos de la presente divulgación pertenecen a una nueva plataforma terapéutica a base de proteínas, "synTac", que imita la especificidad de interacción y las señales reguladoras de la sinapsis inmunológica. SynTac es una proteína de fusión que une una molécula coestimuladora a un epítopo del MHC que permite el acoplamiento preciso de los linfocitos T y la activación o inhibición clonal de los linfocitos T (figura 1), una versión soluble de la respuesta natural del cuerpo. De esta manera, synTac combina los mejores epítopos, anticuerpos biespecíficos, moléculas coestimuladoras solubles y ADC. SynTac permite el direccionamiento celular altamente específico a través del epítopo del MHC, con un diseño de "fusión monocatenaria" que no permite la presentación cruzada del epítopo libre (figuras 2A-2C). Un dominio modulador de linfocitos T (como alternativa, descrito en el presente documento como "MOD") también está unido covalentemente, lo que provoca la activación o inhibición dependiendo de la naturaleza del acoplamiento coestimulador. Esto provoca una respuesta de linfocitos T específica de antígeno, no global. Notablemente, el MOD puede incluir cualquier anticuerpo conocido, fragmento de anticuerpo, molécula coestimuladora, u otra carga útil validada por la bibliografía (citocinas, toxinas, etc.), y no necesita internalizarse para ejercer un efecto sobre el linfocito T. Además, ambas dianas están presentes en la superficie de la misma célula, eliminando el "problema de espacio" de los anticuerpos biespecíficos tradicionales.

En un ejemplo, la estrategia explota una construcción de fusión Fc (un ejemplo no limitativo se expone en las Figuras 2A-2C) para aumentar la valencia, la estabilidad y la ventana terapéutica de los productos asociados. Brevemente, la región Fc es un homodímero covalente natural y se estabiliza a través de dos enlaces disulfuro ilustrados como dos líneas finas en las figuras 2A-2C. Se sabe que la presencia del dominio Fc prolonga la actividad terapéutica al aumentar la semivida plasmática, debido a su interacción con el receptor Fc neonatal, así como a la depuración renal más lenta para moléculas bivalentes de mayor tamaño [23, 24]. Desde una perspectiva biofísica, el dominio Fc se pliega de forma independiente y puede mejorar la solubilidad y la estabilidad de la molécula asociada tanto in vitro como in vivo [25], y la región Fc permite una purificación fácil y rentable por cromatografía de afinidad de proteína A/G durante la producción [26]. La figura 2A muestra una proteína MHC peptídica monocatenaria (trímero monocatenario [27]) unida en su extremo carboxi a una región Fc de IgG. Como se muestra, estas construcciones monocatenarias están limitadas con respecto a la capacidad de extender el sistema a través de enlaces de proteínas alternativas (tal como el MOD). Específicamente, los enlaces están restringidos preferentemente a una región C-terminal del MHC, representada por líneas discontinuas en la figura 2A (que en el presente documento se denomina enlace directo). Se pueden usar moléculas MHC I o MHC II. La expresión de construcciones que utilizan un enfoque de enlace directo depende en gran medida del MOD que se utilice. Una solución a esto, divulgada en el presente documento, es dividir la construcción en cadenas pesadas y ligeras respectivas y fusionar tanto los péptidos como las proteínas con diversos extremos (figura 2B y figura 2C). Una construcción da como resultado una asociación amino-terminal del péptido con la cadena ligera (beta 2 microglobulina) seguida de una extensión carboxilo terminal de la cadena ligera a la molécula efectora MOD (figura 2B). En este escenario, la cadena pesada (molécula HLA) se fusiona con la región Fc. Todos los componentes se asocian durante la producción dentro de las células eucariotas (por ejemplo, HEK, CHO) y se autoensamblan. Las construcciones se mantienen juntas covalentemente a través de puentes disulfuro. Una orientación alternativa (figura 2C) coloca el extremo amino terminal MOD de la cadena pesada fusionada al Fc con el péptido aún unido a la cadena ligera de B2M. De nuevo, todos los componentes se autoensamblan y forman interacciones covalentes estables a través de enlaces disulfuro. Los anticuerpos biespecíficos tradicionales a menudo intentan puentear dos células dimerizando una carga útil Fc amino terminal con una carga útil Fc carboxilo terminal. Por el contrario, una construcción divulgada en el presente documento orienta dos cargas útiles de proteínas diferentes, un mecanismo de direccionamiento del epítopo del MHC y un efector MOD, a la superficie de la misma célula, similar a una interacción de cadena ligera CH1 encontrada dentro de los anticuerpos tradicionales. Además, el uso de fusiones Fc permite el acoplamiento personalizado de funciones efectoras asociadas, tal como la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la fagocitosis, mediante la modulación de las afinidades de unión a los receptores Fc a través de mutaciones [28].

Se presenta un diseño para dos moléculas base synTac en la figura 3A-3B. Brevemente, esta construcción utiliza una secuencia líder de B2M humana natural para permitir la secreción eficiente y el procesamiento ER inmediatamente seguido de un epítopo candidato (etiquetado como péptido). Una vez en el ER, la secuencia líder se elimina por completo y permite la presentación del péptido en el bolsillo de unión a MHC. Para un enlace de "cadena ligera" (Lc , figura 3A), esto se acopla a la molécula B2M natural a través del enlazador L1 y al MOD a través del enlazador L2. Todo este casete está unido a otra secuencia líder de B2M, la cadena pesada del MHC (por ejemplo, HLA-A02:01 humano o H-2Kd murino en los ejemplos), y un dominio Fc (IgG1 humano o IgG2a murino) por un péptido de "autoescisión" de teschovirus-1 porcino viral (P2A) para permitir la expresión estequiométrica de cada cadena. Se eligió el péptido P2A ya que tiene la mayor eficacia de "escisión" informada de todos los péptidos 2A virales expresados en células de mamífero [29]. El enlace de "cadena pesada" (HC, figura 3B) es similar, sin embargo, el péptido P2A viral ahora sigue a la b2m y el MOD sigue al segundo péptido líder, lo que conduce a la construcción proteica mostrada en la figura 2C. Ambas construcciones pueden terminar en un marcador 8x His para facilitar la purificación.

Células de expresión especializadas: Aunque ambas cadenas se expresan y se colocalizan en el ER, debido al enlace P2A, había cierta preocupación de que la B2M endógena del huésped de expresión (células HEK293 adaptadas a la suspensión) pudiera competir con la versión recombinante ya que las células HEK293 expresan de forma natural las moléculas HLA y B2M. Esto daría como resultado una estabilidad disminuida (por ejemplo, que se manifiesta en rendimientos globales disminuidos) o una muestra de proteína heterogénea altamente indeseable. Para evitar esta complicación, se aprovechó el sistema CRISPR/CAS para desactivar la B2M natural del grupo de células HEK [30]. Brevemente, el a Rn guía se diseñó contra B2M endógeno, se transfectó junto con un plásmido que codifica CRISPR/CAS y se dejó cultivar durante tres días. Las células cultivadas se tiñeron en la superficie contra anti-B2M y se contraseleccionaron (clasificadas por pérdida de fluorescencia) mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se permitió que las células clasificadas se recuperaran y se sometieran a dos rondas más de tinción, contraclasificación y recuperación (3 rondas en total) para garantizar una eliminación eficaz (~100 %). Como se ilustra en la figura 4, se comprobó la calidad del grupo final mediante el control de la expresión superficial de B2M a través de FACS, lo que sugiere la eliminación completa de la proteína B2M endógena. Después, se realizan experimentos que aprovechan la secuenciación de la próxima generación para cuantificar los porcentajes de desactivación a nivel genómico. La línea HEK-293-B2M-KO resultante (denominada HEK-KO) se usó para todos los experimentos posteriores.

Enlaces disulfuro diseñados: Para aumentar la estabilidad proteica y evitar las complicaciones asociadas con la posible transferencia de péptidos a las moléculas MHC celulares (presentación cruzada) y la liberación de B2M, generalmente se emplean construcciones monocatenarias [27, 31]. Sin embargo, estas construcciones monocatenarias (mostradas en la figura 2A) están limitadas con respecto a la capacidad de extender el sistema a través de enlaces de proteínas alternativas (tal como el MOD). Una solución es dividir la construcción en las respectivas cadenas pesadas y ligeras de forma análoga a los esfuerzos anteriores [32], pero ahora fusiona tanto los péptidos como las proteínas en diversos extremos como se describe (figura 2B y 2C). Sin embargo, en la construcción final, para consertar la estabilidad proporcionada por los sistemas tradicionales monocatenarios, se investigó la opción de diseñar puentes de disulfuro entre las cadenas pesadas y ligeras (que se ilustra como S-S en la figura 2), como se ve en los trímeros monocatenarios atrapados con disulfuro [dt-SCT] [33]. En particular, dado que los intentos iniciales de producción de synTac que utilizan el esquema de disulfuro de dt-SCT dieron como resultado bajos niveles de expresión, y esto depende adicionalmente del péptido que se presenta, la configuración de disulfuro de dt-SCT se consideró no ideal para su uso en sistemas de proteínas divididas. Por lo tanto, se buscó identificar posiciones alternativas para diseñar puentes disulfuro más adecuados para sistemas de proteínas divididas, tal como synTac. Se eligieron dos posiciones de la cadena ligera (2, 12), cada una con un potencial de enlace disulfuro para dos posiciones en la cadena pesada (119, 120 y 236, 237 respectivamente, del análisis de PDB 2X4R). En particular, estas posiciones son restos altamente conservados que no se sabe que interactúan con el surco de unión al péptido [34], el complejo TCR [35] o el correceptor CD8 [36]. Se demostró una expresión de alto nivel para una construcción (H236-L12, haciendo referencia H a la posición de cadena pesada y haciendo referencia L a la ligera, marcada como synTac 18 en la figura 5A-5B) con expresión modesta para una segunda (H237-L12, synTac 17 figura 5A-5B). El esquema de disulfuro de dt-SCT se utilizó como control positivo (marcado como synTac 2). Se formó un resto de alto peso molecular como se ve por geles PAGE no reductores que sugieren la formación de enlaces disulfuro estables (figura 5A). Todas las construcciones de expresión se ampliaron a la escala de 100 ml, se purificaron y se probó la actividad a través de la unión de TCR afín expresado sobre la superficie de las células HEK (denominadas HEK-A6), como se controló por fluorescencia FACS, lo que sugiere un plegamiento y actividad adecuados (figura 5B). Las células que expresan TCR no afines (denominadas HEK-AS01) se usaron como control negativo. Se han generado construcciones adicionales con solo un marcador 8X His C-terminal (monovalente).

Controles synTac: El trabajo previo se ha centrado en la diabetes autoinmune [37], y se ha utilizado un sistema modelo relevante para la enfermedad, específicamente linfocitos T CD8+ 8.3 autorreactivas aisladas de los islotes pancreáticos de un ratón diabético no obeso (NOD). Sobre la base de este trabajo, se generaron construcciones synTac con un péptido compuesto por los restos 206 a 214 de la proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP206-214) presentada por el alelo murino de clase 1H-2Kd (denominado IGRP) que se sabe que interactúa con los linfocitos T 8.3. Se preparó un synTac de control que presentaba el péptido derivado del tumor (KYQAVTTTL, SEQ ID NO:18), que no es reconocido por los linfocitos T 8.3, de manera idéntica (por ejemplo, presentación murina H-2Kd) y designado TUM. Para determinar el grado al que el sistema puede tolerar múltiples alelos HLA (por ejemplo, H2-Kd murino, HLA-A02 humano, etc.), se construyó una tercera variante synTac que portaba un epítopo restringido HLA-A02 humano previamente validado (virus T-linfotrópico humano, Tax. 11-19) y denominada HTLV. Para permitir el agotamiento de linfocitos T dirigido, las construcciones synTac iniciales usaron un formato de enlace de cadena ligera y llevaron un dominio PD-L1 MOD (ilustrado esquemáticamente en la figura 2B). Cada variante synTac (IGRP, TUM y HTLV) mostró perfiles de expresión positivos en células HEK-KO, resultados de la página SDS no reductores mostrados en la figura 6A. Para examinar la generalidad del sistema de expresión, se exploraron construcciones synTac a base de IGRP con dominios MOD variantes, incluyendo dos MOD para la estimulación de linfocitos T (es decir, Fv monocatenario anti-CD28 humanizado y el dominio extracelular del ligando TNF 4-1BBL), y otros dos MOD que permiten la inhibición de linfocitos T (un mutante de un solo punto de B7-1 [W88A], que se sabe que se une solo a CTLA4 [38] y una variante truncada de PD-L1 [dominio variable de Ig solamente]). Todas las construcciones se expresaron bien en células HEK-KO, figura 6B. La capacidad de expresar proteínas synTac que aprovechan un formato de enlace de cadena pesada se exploró adicionalmente (ilustrado esquemáticamente en la figura 2C). Para esto, se utilizó un epítopo IGRP como péptido de direccionamiento y PD-L1 o scFv anti CD28 humanizado como MOD, mostrando de nuevo perfiles de expresión positivos en células HEK-KO (figura 6C). Posteriormente, se produjeron a una escala de 1L o más y se purificaron hasta homogeneidad a través de tanto Ni2+ IMAC y exclusión por tamaño en un entorno libre de endotoxinas. Todas las construcciones IGRP y TUM se utilizaron en ensayos de proliferación de linfocitos T y construcciones HTLV para los experimentos de puenteo de TCR-synTac-PD1 a continuación.

Puenteo de TCR-synTac-PD1. Si bien el perfil de la solución después de la exclusión por tamaño es indicativo de una proteína bien plegada, es deseable validar la integridad de cada componente synTac (tanto el mecanismo de direccionamiento del epítopo del MHC como el MOD) antes de emplear estos reactivos en ensayos de actividad. Las células HEK-A6 descritas previamente se usaron como control positivo y las células que expresan un TCR no afín (AS01, sensible a un epítopo del virus Epstein-Bar restringido a HLA-A0201) se generaron y se usaron como control negativo junto con células precursoras no transducidas, denominadas HEK-AS01 y PARENTAL, respectivamente. La expresión de TCR se confirmó mediante fluorescencia de mCerulean (indicador de fusión de TCR) y tinción de superficie para el complejo de señalización de TCR (proxy de expresión de CD3e). Las células HEK-A6 se expusieron a variantes synTac h TlV-PD-L1 purificadas no fluorescentes y se incubaron con su receptor afín PD1 fusionado a IgG2a murina. La fusión PD-1-Fc se detectó usando un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con FITC. La fluorescencia de FITC (es decir, "puenteo") dependía de la expresión de superficie de TCR afín como se muestra en las figuras 7A-7B. En particular, no se observó fluorescencia de FITC cuando se expuso contra células HEK portadoras de TCR no afines o células parentales (HEK-AS01, PARENTAL), cuando se expuso contra FITC-PD1-Fc solamente o cuando el MOD estaba ausente.

SynTac en acción: Ensayos de linfocitos T. Como prueba de concepto del poder de direccionamiento de la plataforma synTac, se probó una construcción inhibidora synTac en un ensayo de supresión de linfocitos T. Se planteó la hipótesis de que una versión de cadena ligera de synTac IGRP fusionada con PD-L1 suprimiría específicamente los linfocitos T específicos de IGRP206-214. Los esplenocitos CD8+ se purificaron a partir de un ratón diabético no obeso transgénico para el receptor de linfocitos T 8.3. Este subconjunto de esplenocitos contiene principalmente linfocitos T CD8+ que son específicos para el péptido IGRP206-214 en el contexto de H-2Kd. Estos linfocitos T CD8+ se cultivaron entonces en presencia de anticuerpo anti-CD3 inmovilizado, un tratamiento conocido por estimular la activación de linfocitos T policlonales, y cultivos estimulados tratados con versiones solubles de synTac IGRP-PD-L1 o synTac TUM-PD-L1 para examinar la especificidad antigénica de cualquier efecto supresor. Una versión de synTac IGRp sin PD-L1 sirvió como control efector para el dominio MOD. Antes de la siembra, las células se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), un colorante citosólico fluorescente cuya intensidad se reduce a la mitad con cada división celular, con el fin de controlar el grado de proliferación celular inducida por la activación de los linfocitos T. Después de un periodo de cultivo de 5 días, las células se cosecharon y se examinaron usando citometría de flujo para determinar su viabilidad y proliferación. Los sobrenadantes también se examinaron para la expresión de las citocinas efectoras de linfocitos T CD8+ IFNy y TNFa utilizando un ensayo de perlas citométricas de flujo multiplexado. Todos los parámetros de activación de linfocitos T CD8+ examinados se suprimieron de una manera específica del antígeno y dependiente del dominio efector (es decir, MOD), que se muestra en la figura 8A-8D. Es decir, IGRP-PD-L1 synTac era altamente supresor con respecto a TUM-PD-L1 synTac o IGRP-(sin PD-L1), lo que indica que la actividad de synTac dependía tanto de los dominios péptido-MHC como MOD (figura 8D). SynTac pudo suprimir la secreción de IFNy en aproximadamente 100 veces y dio como resultado la muerte de la gran mayoría de las células, lo que sugiere que synTac con PDL1 como dominio MOD es capaz de suprimir funcionalmente, así como eliminar especificidades dirigidas.

Atenuación de la afinidad. Un posible problema con el uso del sistema PD-1/PDL-1 como dominio de modulación es que PD-L1 tiene el potencial de unirse a más de un receptor, con diferencias concomitantes en la señalización aguas abajo. Se ha demostrado que PD-L1 se une a B7-1 y PD-1. Para evitar la complicación de la unión inespecífica, se pueden usar mutantes de un solo punto que se unen solo a la diana deseada, PD-1 (por ejemplo, específicamente G119D y G119R, y otros como se analiza en el presente documento) conservando al mismo tiempo su potencial inhibidor de linfocitos T cuando se prueban como fusiones Fc independientes. En particular, las fusiones Fc mutantes de PD-L1 en solitario pueden ser reactivos útiles para la inmunomodulación. En el contexto de synTac, estos mutantes ofrecen una gama de afinidades de unión a PD-1. Se han producido proteínas de fusión synTac basadas en IGRP que portan los mutantes G119D y G119R.

Diseñado modular: Las moléculas MHC monovalentes solubles tienen una afinidad intrínsecamente baja por sus receptores de linfocitos T afines y, por lo tanto, no han sido reactivos útiles para fines de diagnóstico o terapéuticos. Si bien los complejos MHC diméricos se han utilizado en diversos sistemas para visualizar linfocitos T específicos de antígeno [39], los tetrámeros MHC de mayor avidez y los multímeros de orden superior se usan más comúnmente [40]. Resulta evidente a partir del presente trabajo que la construcción synTac dimérica actual proporciona una expresión de alto nivel de proteínas bien plegadas y provoca respuestas de linfocitos T dirigidas, sin embargo, en casos seleccionados puede ser conveniente extender la tecnología synTac aumentando la valencia para mejorar el potencial de direccionamiento de linfocitos T. Con ese fin, las variantes synTac se diseñaron de nuevo con un mecanismo de direccionamiento IGRP, con el PD-L1 MOD como un enlace de cadena ligera en el contexto de una región Fc de IgA e IgM. A través de la asociación covalente con la cadena J a través de puentes disulfuro, el esqueleto de IgA e IgM permite la presentación basada en tetrámero y decámero, respectivamente. Se generó lentivirus, se transdujeron células HEK-KO y se probó la expresión, lo que respalda una capacidad inicial de expresar estos reactivos. Si se desea, se puede unir el MOD directamente a la cadena J, como una fusión N-terminal, C-terminal o dual para cambiar la valencia de MOD a la molécula de direccionamiento. Además, debido a la flexibilidad de la configuración synTac, se pueden presentar múltiples epítopos peptídicos o MOD simultáneamente (por ejemplo, triespecificidad) mediante el uso de un enlace dual de cadena pesada/cadena ligera. Además, otros m Od incluyen, pero sin limitación, 4-1BBL y anti-CD28 para la activación y B7W para la inhibición. Las construcciones seleccionadas pueden aprovechar epítopos de direccionamiento adicionales. Además, se pueden usar variantes synTac con niveles más altos de valencia (IgA e IgM), así como MOD unidos no estequiométricamente (por ejemplo, enlaces de cadena J) como se describe.

Ejemplo 2: GENERACIÓN DE POLIPÉPTIDOS SYNTAC TRIMÉRICOS

Expresión trimérica del receptor estimulador MOD (4-1BBL): Los esfuerzos iniciales para generar synTacs con 4-1BBL aprovecharon la variante de enlace de cadena ligera (figura 3A). Esto se expresó como una transfección única (todas las piezas codificadas en un solo plásmido), dividida por una secuencia viral P2A y dio como resultado una proteína bien plegada altamente expresada (figura 6B, carril 5). Los perfiles de filtración en gel junto con los datos de dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) sugirieron que la versión inicial es un dímero bien plegado (como se ilustra en la figura 10B, figura 9B). Se ha observado que 4-1BBL, un ligando de la familia TNF, requiere trimerización (por ejemplo, tres copias de la misma proteína, homo-trímero) para determinar la actividad completa. Para lograr la trimerización, la construcción synTac con 4-1BBL junto con 4-1BBL "libre" (4-1BBL solo que no tiene etiqueta de afinidad [restos 50-254, incluyendo los dominios de homología proximal de membrana y TNF, figura 10A; figura 9A]) se expresaron ambos en la misma célula (por ejemplo, coexpresión) para permitir el ensamblaje natural y la trimerización, como se ilustra en la figura 10C (construcción synTac original en NEGRO, BBL libre en GRIS) (coexpresión de las construcciones de la figura 9A y la figura 9B). La cromatografía de filtración en gel junto con los datos de dispersión de luz multiángulo (MALS) respalda que la nueva versión es el trímero deseado (figuras 11A-11B, etiquetado como synTac número 40 51). Como se describe a continuación (optimización de MOD), las construcciones 4-1BBL pueden optimizarse adicionalmente para mejorar aún más los perfiles de expresión y purificación y aumentar la estabilidad y la reproducibilidad.

Unión al receptor estimulador MOD y reactividad cruzada humana/de ratón: Si bien el perfil de la solución después de la exclusión por tamaño es indicativo de una proteína bien plegada, es deseable validar la integridad de cada componente synTac (tanto el mecanismo de direccionamiento del epítopo del MHC como el MOD) antes de emplear estos reactivos en ensayos de actividad. Este mecanismo de direccionamiento particular (péptido IGRP en el contexto de Kd murino) se ha validado a fondo (figura 7A-7B), por lo tanto, se investigó adicionalmente el grado de unión al receptor 4-1BBL. Con ese fin, las microperlas de proteína A se recubrieron hasta la saturación con proteína de fusión Fc 4-1BB-Fc recombinante humana o de ratón (de fuentes comerciales). Después, se usaron microperlas recubiertas con 4-1BB para unir construcciones synTac portadoras de ligando 4-1BB (versiones diméricas y triméricas) como dominio comodulador, seguido de un anticuerpo de detección fluorescente específico para el isotipo de cadena pesada synTac. El grado de unión específica de synTac 4-1BBL a 4-1BB transmitido por perlas se midió entonces mediante citometría de flujo de alto rendimiento. Usando este sistema, se exploró el grado de reactividad cruzada y las afinidades relativas de 4-1BBL tanto para 4-1BB humano como murino en el contexto del andamiaje synTac. Se demostró que los synTacs portadores de 4-1BBL (denominados Trímero, Dímero) se unen al receptor afín, pero no a microperlas unidas a Fc "sin receptor" (denominado sin MOD), lo que sugiere un reactivo de proteína bien plegado y activo (figura 12). Además, el trímero se unió en un rango de afinidad esperado para el acoplamiento trimérico dual con el dímero original, mostrando una reducción de 10 veces en la afinidad de unión, una vez más apoyando la presentación dimérica. Se usó synTac sin MOD (marcado como sin MOD) como control negativo, que no mostró unión para los receptores 4-1BBL. En particular, todas las construcciones se unen tanto a los receptores murinos como a los humanos (reacción cruzada) y, por lo tanto, permitirán la extensión directa a los ensayos murinos in vivo.

Ensayos de estimulación de linfocitos Tin vitro: Para probar la actividad de los 4-1BBL synTacs, los esplenocitos CD8 se purificaron primero de ratones NOD transgénicos 8.3 TCR y se marcaron por fluorescencia con CFSE para rastrear la proliferación antes de tratarse in vitro con cualquier IGRP-41BBL synTac soluble (dímero y trímero) o TUM-41BBL synTac soluble (figura 13). Los tratamientos de control fueron medios en solitario o anti-CD3 inmovilizado. Después de 4 días en cultivo, las células se examinaron por FACS para determinar su viabilidad (exclusión de DAPI) y proliferación (dilución de CFSE). Los sobrenadantes se examinaron para determinar los niveles de IFNy y TNFa mediante un ELISA de citometría de flujo. Como en el caso de syntac-PDL1 (figuras 8A-8D), la actividad in vitro de syntac-41BBL fue altamente específica de antígeno, lo que dio como resultado una viabilidad, proliferación y liberación de citocinas mucho mayor en el caso de syntac IGRP-41BBL frente a TUM-41BBL. Como se esperaba, 4-1BBL trimérico era necesario para la actividad completa (por ejemplo, proliferación, viabilidad y liberación de citocinas). Además, las respuestas a IGRP-41BBL se compararon favorablemente con el punto de referencia anti-CD3 inmovilizado, lo que sugiere que syntac-41BBL soluble puede mediar altos niveles de activación de linfocitos T. Todos los experimentos relacionados adicionales descritos en el presente documento utilizaron syntac-41BBL trimérico.

Estimulación de linfocitos Tin vivo - dosis única: Se examinó adicionalmente si synTac-41BBL podría ejercer efectos similares sobre la activación de linfocitos T in vivo. Los ratones NOD se trataron con synTac IGRP-41BBL frente a synTac TUM-41BBL y se determinaron las frecuencias de linfocitos T CD8+ específicos de IGRP en el bazo. A diferencia de los ratones NOD transgénicos TCR, en los que la mayor parte de los linfocitos T son de un clonotipo definido, los ratones NOD estándar tienen repertorios TCR muy diversos y son una mejor aproximación de un repertorio inmune "natural". Los ratones NOD se inyectaron por vía intraperitoneal con synTac IGRP-41 BBL, synTac TUM-41BBL o PBS y se sacrificaron 6 días después de la inyección. Después, los esplenocitos se examinaron mediante citometría de flujo para determinar las frecuencias relativas de linfocitos T CD8 específicos de IGRP usando una tinción de pentámero de péptido-MHC apropiada. El tratamiento con IGRP-41BBL se asoció con una frecuencia mucho mayor de linfocitos T CD8 específicos de IGRP frente a los controles. Además, las células específicas de IGRP expandidas in-vivo fueron capaces de producir IFNy cuando se reestimularon in vitro. Estos resultados apoyan la capacidad de syntac-41BBL de expandir los linfocitos T efectores CD8 funcionales de una manera específica de antígeno (figura 14).

Estimulación de linfocitos Tin vivo - dosis múltiple: Se examinó el efecto del régimen de tratamiento alterado sobre la activación de linfocitos T in vivo, con especial atención a un antígeno tumoral establecido, el péptido nonámero "TUM". Los ratones NOD se trataron con synTac IGRP-41BBL frente a synTac TUM-41BBL usando tres dosis (en comparación con la dosis única anterior) durante un periodo de dos semanas. Se determinaron las frecuencias de linfocitos T CD8 específicos de IGRP o TUM. Los ratones NOD se inyectaron por vía intraperitoneal con synTac IGRP-41BBL, synTac TUM-41BBL o PBS y se sacrificaron 7 días después de la inyección. La sangre (PBMC) y los esplenocitos se examinaron entonces a través de citometría de flujo para determinar las frecuencias relativas de linfocitos T CD8 específicos de IGRP o TUM usando una tinción de pentámero de péptido-MHC apropiada. De nuevo, el tratamiento con IGRP-41BBL se asoció con una frecuencia mucho mayor de linfocitos T CD8 específicos de IGRP, mientras que el tratamiento con TUM-41BBL se asoció con una frecuencia mucho mayor de linfocitos T CD8 específicos de TUM, frente a controles de antígeno y PBS irrelevantes (figura 15). Se observó un patrón similar en el bazo. Estos resultados apoyan la capacidad de un régimen multidosis de syntac-41BBL de expandir los linfocitos T efectores CD8 funcionales de una manera específica de antígeno, incluida la expansión específica de antígeno de linfocitos T específicos de tumor raro.

Inhibición de linfocitos T in vivo. Se inyectó por vía intraperitoneal a ratones diabéticos no obesos (NOD) synTac IGRP-PDL1, synTac TUM-PDL1 o p Bs . Seis días después de la inyección, se disociaron los páncreas y se examinaron las células pancreáticas mediante citometría de flujo para determinar las frecuencias relativas de linfocitos T CD8+ específicos de IGRP, usando una tinción de pentámero de péptido-MHC apropiada. Como se muestra en la figura 23, el tratamiento con IGRP-PDL1 se asoció con una frecuencia mucho menor de linfocitos T CD8+ específicos de IGRP, en comparación con los ratones tratados con synTac TUM-PDL1- y PBS de control. Estos datos demuestran un agotamiento in vivo específico de antígeno después de una dosis única de synTac.

Optimización de MOD: Durante el transcurso de la experimentación, se observó que la mayoría de la proteína diana (synTac trimérico 4-1BBL) presentaba características de multímeros de orden superior en la cromatografía de exclusión por tamaño y se degradaría con el tiempo, probablemente a través de la liberación/intercambio de BBL "libre". Por lo tanto, se buscó un esqueleto 4-1BBL con mayor estabilidad y facilidad de producción con énfasis en el ensamblaje covalente de 4-1BBL. Con ese fin, se exploró el uso de enlaces disulfuro diseñados dentro del dominio de homología TNF de 4-1BBL (figura 16A; disulfuros indicados con flechas; figura 9C-9E). A partir del análisis de la estructura de rayos X (PDB 2X29), se eligieron tres pares potenciales de restos que probablemente tienen un potencial de enlace disulfuro y es poco probable que interfieran con la unión del receptor. Dos restos naturales en cada construcción se reemplazaron por restos de cisteína ((Q94C:P245C), Q94C:P242C, y Q89C:L115C, denominados synTac 69, 70 y 71 respectivamente), expresados en células humanas con una versión "libre" no etiquetada que alberga las mismas mutaciones (denominadas 98, 99, 100 respectivamente) para permitir el bloqueo covalente, y el grado de enlace disulfuro se observó mediante análisis SDS PAGE no reducido (figura 18; las siguientes construcciones de coexpresión se denominan DL1 (bloqueo disulfuro-1, synTac 69/98), DL2 (70/99) y DL3 (71/100)). Las tres construcciones también se expresaron, permitieron el bloqueo de disulfuro (figura 18) y se unieron al receptor (figura 17). Si bien estas variantes covalentes "bloqueadas por disulfuro" de synTac-4-1BBL abordan los problemas de estabilidad analizados, aún se requiere la coexpresión de BBL (coexpresión) "libre" para permitir la trimerización que puede complicar la producción y la biofabricación de synTacs estimuladores. Se encontró que una solución a este obstáculo era la expresión del dominio de homología de TNF 4-1BBL como una construcción contigua única, denominada trímero monocatenario (4-1BBL-SCT, figura 16B; figura 9F). Específicamente, tres copias de restos

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido multimérico que comprende:

un polipéptido heterodimérico que comprende

a) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHC);

b) un segundo polipéptido que comprende un segundo polipéptido del MHC, y

c) al menos un polipéptido inmunomodulador,

donde el primer y/o el segundo polipéptido comprenden el al menos un polipéptido inmunomodulador,

donde el primer polipéptido del MHC es un polipéptido de p2-microglobulina, y donde el segundo polipéptido del MHC es un polipéptido de cadena pesada del m Hc de Clase I,

donde el epítopo peptídico es un epítopo asociado al cáncer, y

opcionalmente, donde el polipéptido multimérico comprende un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig) o un andamiaje no de Ig.

2. El polipéptido multimérico de la reivindicación 1, donde el polipéptido multimérico comprende:

a1) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

b1) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) al menos un polipéptido inmunomodulador;

ii) un segundo polipéptido del MHC; y

iii) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig); o

a2) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico;

ii) un primer polipéptido del MHC; y

iii) al menos un polipéptido inmunomodulador; y

b2) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un segundo polipéptido del MHC; y

ii) un polipéptido Fc de Ig; o

a3) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

b3) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un segundo polipéptido del MHC; y

ii) un polipéptido Fc de Ig; y

iii) al menos un polipéptido inmunomodulador; o

a4) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

b4) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un segundo polipéptido del MHC; y

ii) al menos un polipéptido inmunomodulador; o

a5) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

b5) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) al menos un polipéptido inmunomodulador; y

ii) un segundo polipéptido del MHC; o

a6) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico;

ii) un primer polipéptido del MHC; y

iii) al menos un polipéptido inmunomodulador; y

b6) un segundo polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un segundo polipéptido del MHC.

3. El polipéptido multimérico de la reivindicación 1, donde el andamiaje no de Ig es un polipéptido XTEN, un polipéptido de transferrina, un polipéptido del receptor Fc, un polipéptido de tipo elastina, un polipéptido de tipo seda, o un polipéptido de tipo seda-elastina.

4. El polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el al menos un polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL, un polipéptido B7-1; un polipéptido B7-2, un polipéptido ICOS-L, un polipéptido OX-40L, un polipéptido CD80, un polipéptido CD86, un polipéptido PD-L1, un polipéptido FasL, una citocina y un polipéptido PD-L2.

5. El polipéptido multimérico de la reivindicación 4, donde el al menos un polipéptido inmunomodulador es una citocina.

6. El polipéptido multimérico de la reivindicación 4, donde el al menos un polipéptido inmunomodulador se selecciona de un polipéptido 4-1BBL y un polipéptido CD80.

7. El polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende 2 o más péptidos inmunomoduladores.

8. El polipéptido multimérico de la reivindicación 7, donde los 2 o más péptidos inmunomoduladores están en tándem.

9. El polipéptido multimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el polipéptido multimérico comprende: a1) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

i) al menos un polipéptido inmunomodulador;

ii) un segundo polipéptido del MHC; y

iii) un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig).

10. El polipéptido multimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el polipéptido multimérico comprende: a3) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

i) un segundo polipéptido del MHC; y

ii) un polipéptido Fc de Ig; y

iii) al menos un polipéptido inmunomodulador.

11. El polipéptido multimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el polipéptido multimérico comprende: a4) un primer polipéptido que comprende, en orden del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

i) un epítopo peptídico; y

ii) un primer polipéptido del MHC; y

i) un segundo polipéptido del MHC; y

ii) al menos un polipéptido inmunomodulador.

12. El polipéptido multimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido están unidos entre sí por un enlace disulfuro.

13. El polipéptido multimérico de la reivindicación 12, donde el polipéptido p2M y el polipéptido de cadena pesada del MHC están unidos por un enlace disulfuro que se une a un resto de Cys en el polipéptido p2M y un resto de Cys en el polipéptido de cadena pesada del MHC.

14. El polipéptido multimérico de la reivindicación 13, donde una Cys en un resto aminoacídico 12 del polipéptido p2M está unido por disulfuro a una Cys en un resto aminoacídico 236 del polipéptido de cadena pesada del MHC.

15. El polipéptido multimérico de la reivindicación 13, donde la primera cadena polipeptídica comprende un enlazador entre el epítopo peptídico y el polipéptido p2M, y donde el enlace disulfuro se une a una Cys presente en el enlazador con una Cys del polipéptido de cadena pesada del MHC.

16. El polipéptido multimérico de la reivindicación 15, donde la primera cadena polipeptídica comprende un enlazador entre el epítopo peptídico y el polipéptido p2M, y donde el enlace disulfuro se une a una Cys sustituida por Gly2 en el enlazador con una Cys sustituida por Tyr84 del polipéptido de cadena pesada del MHC.

17. Un polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde el polipéptido inmunomodulador es un polipéptido activador.

18. Una proteína que comprende dos de los polipéptidos multiméricos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde cada uno de los dos polipéptidos multiméricos comprende un polipéptido Fc de inmunoglobulina (Ig), y donde los dos polipéptidos multiméricos están unidos por uno o más enlaces disulfuro entre los respectivos polipéptidos Fc de Ig.

19. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer y/o un segundo polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el primer o el segundo polipéptido comprenden al menos un polipéptido inmunomodulador.

20. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula hospedadora genéticamente modificada con el vector de expresión de la reivindicación 20.

22. Un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T que se une a un epítopo asociado al cáncer, comprendiendo el método poner en contacto in vitro el linfocito T con el polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, o la proteína de la reivindicación 18, donde dicho contacto modula selectivamente la actividad del linfocito T.

23. El polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o la proteína de la reivindicación 18, o el ácido nucleico de la reivindicación 19, o el vector de expresión de la reivindicación 20, para su uso en un método para modular selectivamente la actividad de un linfocito T que se une a un epítopo asociado al cáncer en un individuo, donde dicho polipéptido multimérico, o la proteína, o el ácido nucleico, o el vector de expresión se administran para modular selectivamente la actividad del linfocito T en el individuo.

24. El polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o la proteína de la reivindicación 18, o el ácido nucleico de la reivindicación 19, o el vector de expresión recombinante según la reivindicación 20, o uno o más ARNm que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o la proteína de la reivindicación 18, para su uso en un método para tratar un cáncer en un individuo.

25. Una composición que comprende:

a) el polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o la proteína de la reivindicación 18; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

26. Un polipéptido multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, o la proteína de la reivindicación 18, o el ácido nucleico de la reivindicación 19, o el vector de expresión de la reivindicación 20, para su uso según las reivindicaciones 22 o 23, donde el linfocito T es un linfocito T CD8+, un linfocito T CD4+, o un linfocito T regulador.