CN117730151A - 单链三聚体mhcⅰ类核酸和蛋白质以及使用方法 - Google Patents

单链三聚体mhcⅰ类核酸和蛋白质以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了肽‑主要组织相容性(MHC)I类核酸和蛋白质。还提供了它们的使用方法，例如用于鉴定抗原特异性T细胞和过继细胞疗法的方法中。

Description

单链三聚体MHCⅠ类核酸和蛋白质以及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月7日提交的美国临时申请号63/185,942的权益，该申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及肽-主要组织相容性(MHC)I类核酸和蛋白质，以及它们的使用方法，例如用在过继细胞治疗的方法中。
政府支持的承认
本发明是在美国卫生与公众服务部生物医学高级研究与发展局授予的合同编号为HHSO10020160031C的政府支持下完成的。政府对这项发明拥有某些权利。
背景技术
新型致病性病毒株的出现(以及预测的此类事件的加速)推动了对基于表位的试剂生产的高通量方法的需求。具体地，使用肽-MHC(pMHC)试剂捕获抗原特异性T细胞可以鉴定相关的T细胞受体(TCR)序列，并阐明免疫显性表位在宿主免疫反应中发挥的作用。为此目的，疫苗疗法必须涉及评估人白细胞抗原(HLA)单倍型和基于HLA的表位特色，以预测和鉴定最显著的免疫原性病毒肽。基于所需的包含范围、每个HLA等位基因的结合口袋对肽基序的自然接受性以及现有肽结合预测算法的准确性，每个HLA等位基因的相容表位的数量可能有很大不同，从几个到数百或数千不等。为了适应这种规模，必须以高通量的方式在每个肽、每个HLA的基础上生产可溶的pMHC试剂，以鉴定和排序来自外周血单核细胞(PBMC)的免疫应答性TCR。可溶的pMHC通常是通过在大肠杆菌中单独表达MHC亚单位，然后在靶肽的存在下体外重折叠HLA重链和β2-微球蛋白(β2m)亚单位包涵体来产生。产生重折叠pMHC复合体的修饰形式在反应过程中利用紫外线可切割肽。该肽充当占位肽(placeholder)，使得能够快速产生UV交换的pMHC(UV-pMHC)，其中紫外线暴露促进可裂解肽与靶肽的交换。然而，重折叠pMHC和UV-pMHC的生产容易出现几个技术问题。来自重折叠的总蛋白质产量是HLA依赖的，紫外线交换的成功高度取决于单个肽的化学物理性质。
单链三聚体(single-chain trimer，SCT)是构建pMHC的一种备选方法，可以解决重折叠和紫外线交换带来的问题。简言之，SCT形式由一个包含肽、β2m和HLA的构建体组成。这三个初级单元连接在一起形成单链，作为一个单一的蛋白质单元分泌。SCT最初在细菌细胞中表达，现已被采用于哺乳动物的表达系统中。
发明内容
本文提供了MHC I类SCT和可用于从多种肽中快速发现多种TCR的测定法，例如高通量测定法。
在一些实施方案中，本公开提供了核酸片段对，所述核酸片段对包括第一核酸片段和第二核酸片段，所述第一核酸片段和第二核酸片段当组装后编码主要组织相容性复合体(MHC)I类单链三聚体(SCT)蛋白，所述SCT包括作为效连接的亚单位的肽、β2微球蛋白(β2m)蛋白和人白细胞抗原(HLA)重链蛋白，并且其中所述第一核酸片段和所述第二核酸片段各自包含β2微球蛋白中的一部分组装位点。在一些实例中，组装位点是Gibson组装位点。
在一些实施方案中，当组装后，核酸片段按以下顺序(N末端至C末端)编码蛋白亚单位：分泌信号、肽、肽-β2m接头(L1)、β2m、β2m-HLA接头(L2)、HLA重链，和任选地，一个或多个纯化标签，并且其中所述组装位点位于β2m的不变区域内。在一些实例中，分泌信号选自HLA分泌信号、干扰素-α2分泌信号和干扰素-γ分泌信号。
在一些实例中，核酸片段对还编码一个或多个纯化标签。在具体实例中，所述一种或多种纯化标签选自可被生物素化的肽(例如，SEQ ID NO:136)和多聚组氨酸肽。
在一些实例中，核酸片段对编码HLA蛋白，所述HLA蛋白包含选自H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V的一个或多个氨基酸替换(编号对应于SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，由核酸片段对编码的肽是抗原肽、自身肽或占位肽(例如，SEQID NO:135)。抗原肽可以选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
在一些实施方案中，核酸片段对是针对哺乳动物表达例如针对人细胞中的表达而密码子优化的。
本文还提供了核酸分子，其包括公开的经组装的核酸片段对。经组装的核酸片段对包括有效连接到第二核酸片段的第一核酸片段。在额外的实施方案中，经组装的核酸包含在载体中，例如哺乳动物表达载体中。在一个实例中，哺乳动物表达载体是质粒pcDNA3.1。
本文公开了用包含本文所述的经组装核酸分子的载体转化的人细胞系。在一个实例中，人细胞系是HEK293细胞系，例如Expi293FTM细胞。
本文还提供了文库，所述文库包括多个公开的核酸片段对或多个经组装的核酸片段对。
本文公开了人糖基化MHC I类SCT蛋白。在一些实例中，人糖基化MHC I类SCT蛋白是可溶性的。
在一些实施方案中，人糖基化MHC I类SCT蛋白包括肽，例如抗原肽、自身肽或占位肽。在一个实例中，占位肽包括SEQ ID NO:135的氨基酸序列。抗原肽可以选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
在一些实施方案中，可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白按N端至C端顺序包含肽、肽-β2微球蛋白(β2m)蛋白接头(L1)、β2m蛋白、β2m-HLA接头(L2)和HLA重链蛋白。在一些实例中，人糖基化MHC I类SCT蛋白包括HLA蛋白，所述HLA蛋白包括选自H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V的一个或多个氨基酸替换。在其他实例中，可溶性人糖基化MHCI类SCT蛋白还包括一个或多个纯化标签。在特定实例中，纯化标签是可被生物素化的肽(例如，SEQ ID NO:136)。在其他实例中，纯化标签是多聚组氨酸肽。
在一些实施方案中，可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白组装为稳定的多聚体，例如稳定的四聚体。在额外的实施方案中，可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白连接到表面、聚合物(例如珠)或纳米粒子支架上。
本文还提供了包括多个可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的文库或包括可溶性人糖基化MHCⅠ类SCT蛋白质的多个稳定多聚体的文库。
本文进一步公开了鉴定抗原特异性CD8+T细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：将T细胞群体与一种或多种公开的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白(例如可溶性人糖基化MHCⅠ类SCT蛋白质的一种或多种稳定的多聚体)接触，并鉴定对其具有反应的CD8+T细胞。在一些实例中，所述方法进一步包括确定所鉴定的抗原特异性T细胞受体(TCR)的身份，例如，通过对TCR测序和产生表达所鉴定的TCR的T细胞群体(例如，CD8+T细胞)。
在一些实施方案中，所述方法还包括将表达抗原特异性TCR的T细胞群体施用于有需要的受试者。在一些实例中，受试者患有癌症(例如肿瘤)，并且TCR对来自从该受试者获得的肿瘤样品的抗原是反应的。
本公开的上述和其他特征将从以下参考附图进行的详细描述中变得更加明显。
附图说明
图1A-图1C示出了用于I类pMHC构建体的SCT设计。图1A显示了编码通过Gibson组装从两个片段构建的I类pMHC分子的SCT，使得能够模块化插入任何目的I类HLA亚单位以设计用于肽插入的模板质粒。图1B示出了通过限制性消化和连接将模板SCT构建体连接到pcDNA3.1载体中。图1C显示含有各种肽元件的SCT文库可以通过反向PCR和连接从初始模板质粒构建。
图2A-图2C显示了SCT的设计和测试。图2A是HLA-A*02:01SCT(RDB ID:6APN)的晶体结构的轴向视图。突出的目的区域：H74、Y84、A139、L1接头的前三个氨基酸。肽以N到C的方向(从左到右)装载在口袋中。图2B是所测试的9个SCT模板中的每一SCT模板的L1-GS部分(GGGGS；SEQ ID NO:141；GCGGS,SEQ ID NO:142；GGCGS,SEQ ID NO:143；或GCGAS,SEQ IDNO:144)和HLA氨基酸修饰的总结。热图：每一SCT组合的相对表达，由模板(行)和肽(列)指定。通过自动测量蛋白质条带强度来量化相对表达，如使用设计模板D9构建的18个SCT的还原SDS-PAGE图像(底部)所例示。肽对应于SEQ ID NO:6-20、22、21和2(从左到右)。先前表达和纯化的WT1(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:1)SCT的等分试样用作带强度定量的阳性对照(+)。图2C显示了SCT的热位移测定测量。描述了使用九个SCT模板设计的两个肽的Tm测量(左)。在散点图(右)中绘制它们的Tm值，以显示基于模板和肽的稳定性的相对变化。肽对应于SEQID NO:6-20、22、21和2(从左到右)。各个热位移曲线(左)代表了生物学的三次测量，绘制了所有的单个Tm(右)。
图3A和图3B示出了SCT转染效率是均一的并且表达是肽依赖性的。图3A是用SCT文库转染的Expi293细胞的图，所述SCT文库由具有或不具有IRES-GFP指示物的15种不同肽元件(x轴)组成，在转染4天后测量存活力和GFP荧光。图3B是显示在使用相同质粒文库元件转染后进行的SDS-PAGE中SCT蛋白带强度的测量的图。阴性对照(“空的”)由用除SCT质粒外的所有标准化试剂转染的Expi293细胞组成。对于两个组，肽对应于SEQ ID NO:6、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22和21(从左到右)。
图4显示了优化WT1 SCT-TCR捕获的流式细胞术测定法。将根据图2B中所示的六个模板设计中的每一个设计构建的WT1(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:1)SCT与MART-1(ELAGIGILTV；SEQ ID NO:2)SCT(D3模板)配对，以在C4 TCR转导的原代T细胞和MART-1Jurkat T细胞的95/5混合物中鉴定它们的相对应TCR转导细胞。每个小图右上角的数字表示在该测定法中用于WT1 SCT的SCT模板。百分数表示六个WT1 SCT设计中的每一个设计在WT1 SCT阳性象限中捕获的总细胞群体的比例。
图5是一系列SDS-PAGE凝胶，显示了每一所示肽元件的SCT表达(编号如表2和表3所示)。
图6显示了CMV pMHC试剂的功能比较。左，使用SCT或重折叠形式制备的四聚体的流式细胞术测定。右，饼图描绘了通过四聚体阳性细胞的10X单细胞测序鉴定的独特克隆型。CDR3α/β序列如表4所示，且其顺序从最大分数开始，逆时针进行。饼图中的偏移楔形对应于一对已公开的CMV特异性CDR3α和CDR3β链，表明完全匹配(LD＝0)。NLVPMVATV:SEQ IDNO:44。
图7显示了用衍生自SARS-CoV-2结构蛋白的肽池刺激的来自COVID-19参与者和健康供者的PBMC的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的ELISpot测定。
图8A-图8D显示了针对A*02:01SARS-CoV-2刺突蛋白表位的SCT的表达。图8A是刺突蛋白结构域的示意图。S：信号序列；NTD：N-末端结构域；RBD：受体结合结构域；FP：融合肽；HR1：七肽重复序列1；CH：中心螺旋；CD：连接子结构域；HR2：5个七肽重复序列2；TM：跨膜结构域；CT：细胞质尾；S1和S2表示亚单位。阴影框表示SCT蛋白的相对位置和表达产量。肽ID编号按照预测的结合亲和力的降序进行索引。图8B显示了来自图8A的刺突表位SCT的子集的还原SDS-PAGE。泳道数表示肽ID，具有结构域匹配的背景色。+，纯化的WT1-SCT。图8C显示了比较相对SCT产量(相对于WT1 SCT泳道定量)的柱状图和来自图8B中的子集的每个肽的预测亲和力的柱状图。图8D显示了刺突蛋白单体的晶体结构。结构域颜色与图8A中的区域的颜色相匹配；S1和S2亚单位骨架用白色表示。含有图8A中30个A*02:01测试表位的氨基酸用红色表示。
图9A-图9C显示了通过NP-NACS确定的来自COVID-19参与者的刺突蛋白特异性T细胞群体。根据刺突蛋白上的位置绘制肽，虚线指向沿着结构域图的位置。在每个图中，计数是来自两名COVID-19参与者和一个HLA匹配的供者样品(顶部：A*02:01，中间：B*07:02，底部：A*24:02)。图9A，SEQ ID NO:145-174；图9B，SEQ ID NO:175-196；图9C，SEQ ID NO:197-232。
图10A和图10B示出了SARS-CoV-2刺突蛋白表位在HLA匹配的PBMC中诱导细胞因子分泌。合成自NP-NACS测定法鉴定为免疫原性的肽，并用于刺激针对HLA-A*02:01(图10A)和HLA-B*07:02(图10B)的来自InCoV参与者和健康供者的HLA匹配的PBMC。KLPDDFTGCV(SEQID NO:114),RLDKVEAEV(SEQ ID NO:113),SIIAYTMSL(SEQ ID NO:188),MIAQYTSAL(SEQ IDNO:192)。
图11是通过NP-NACS确定的来自A*02:01COVID-19参与者的PLpro特异性T细胞群体的图。根据nsp3蛋白的相对位置沿x轴绘制肽，并由nsp3亚单位进行颜色编码(UBL：泛素样结构域，Ac：富含Glu的酸性结构域，ADRP：ADP-核糖-1'-磷酸酶结构域，SUD：SARS独特结构域，PLpro：木瓜蛋白酶样蛋白酶，NAB：核酸结合结构域，G2M：标志物结构域，TM：跨膜结构域，ZF：锌指结构域，Y1-Y2-Y3：在PLpro切割位点之前的Y结构域。肽是SEQ ID NO:233-307(从左到右)
图12A-图12C显示了通过单独的四聚体从三个HLA等位基因(顶部，A*02:01；中部，B*07:02；底部，A*24:02)的COVID-19参与者的扩增T细胞(y轴)中分选而鉴定的抗原特异性T细胞群体的频率。图12A，SEQ ID NO:146-149、151-152、155-166、168、170-174和357；图12B，SEQ ID NO:175-188、190-196和358；图12C，SEQ ID NO:197-232。
图13显示了前20种最常见的检测到的克隆型中的抗原特异性T细胞群体的频率，其通过从COVID-19参与者的扩增T细胞中进行多重dextramer分选而鉴定。“Dextramer”是指表5中所示的dextramer的ID。CDR3α序列为SEQ ID NO:308-327(从左至右)，且CDR3β序列为SEQ ID NO:328-347(从左至右)。
图14显示了转导的TCR是SARS-CoV-2抗原特异的。将通过10X或批量测序方法从健康供者或COVID-19参与者来源的T细胞获得的TCR转导入HLA匹配的CD8+T细胞，并在SCT四聚体结合后选择性扩增以产生细胞系。这里显示的是扩增细胞的四聚体结合结果，表明了SCT特异性和细胞系的纯度。
图15显示了用分别对应于肽1和肽2的TCR 001和TCR 002转导的T细胞，其在16小时过夜肽刺激后进行功能评估。顶部：ELISA测定法测定细胞因子释放。中间：ELISpot测定法计数颗粒酶B表达的细胞。底部：流式细胞术测定法测定活化的细胞(CD137+)和细胞毒性细胞(颗粒酶B+)的百分数。肽1：SEQ ID NO:131；肽2：SEQ ID NO:121。
图16A和图16B示出了D227K和T228A突变抑制CD8与pMHC的相互作用。图16A是表达的A*02:01SCT的SDS-PAGE，其中对各模板使用WT1表位(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:1)。每个括号上方的标签表示应用于每组SCT的CD8抑制突变(“野生型”是指没有针对CD8相互作用的突变)。+，纯化的WT1 SCT。发现泳道8的细胞是低存活力的，因此没有进行转染，导致该质粒没有可检测的SCT输出。图16B是表达的WT1 SCT和TCR转导的T细胞之间的四聚体结合相互作用的流式细胞术强度图。Y轴表示SCT类型(颜色对应于图16A中的图注)。用CD8+T细胞(左列)和CD4+T细胞(右列)进行结合实验。在每个图中，虚线表示103个平均荧光强度单位的阳性信号阈值(线的右边＝阳性)。
图17A和图17B显示了A245V突变抑制CD8与负载有新抗原的pMHC的相互作用。图17A是与来自黑素瘤患者的PBMC孵育的载有新抗原的A*03:01SCT四聚体的流式细胞术图谱。左下象限表示不结合。图17B显示了图17A中的实验，将其扩展以覆盖SCT四聚体的各种其它组合。左下象限表示不结合。SLHAHGLSYK(SEQ ID NO:134)；RLFPYALHK(SEQ ID NO:348)；ALLPPPPLAK(SEQ ID NO:349)；KIYTGEKPYK(SEQ ID NO:350)；LLFKAGEMRK(SEQ IDNO:351)；RLFSALNSHK(SEQ ID NO:352)。
图18显示了与编码阳性对照肽(来自EBV、CMV和流感病毒)和阴性对照肽(来自结核分枝杆菌)的SCT四聚体孵育的来自A*02:01阳性健康供者的PBMC的流式细胞术。YVLDHLIVV(SEQ ID NO:27)；NLVPMVATV(SEQ ID NO:44)；FMYSDFHFI(SEQ ID NO:45)；GILTVSVAV(SEQ ID NO:353)。
图19显示了用各种肽长度(8-14mer：从YMLDLQPE(SEQ ID NO:4)至YMLDLQPETTDLYC(SEQ ID NO:5))和各种模板设计的组合修饰的转染SCT质粒的SDS-PAGE分析，+,纯化的WT1 SCT.L1 GS部分:GGGGS,SEQ ID NO:141；GCGGS,SEQ ID NO:142；GGCGS,SEQ ID NO:143；或GCGAS,SEQ ID NO:144。
图20是YML SCT的Tm值的散点图，其通过设计模板进行颜色编码并且通过肽长度从左到右排列。对每个肽/模板SCT组合进行生物学一式三份测量。由于人为错误，一个质粒在转染期间未能表达(加载10mer的D4 SCT)，因此无法对该样品进行测量。YMLDLQPE(SEQID NO:4)；YMLDLQPET(SEQ ID NO:6)；YMLDLQPETT(SEQ ID NO:354)；YMLDLQPETTD(SEQ IDNO:355)；YMLDLQPETTDL(SEQ ID NO:7)；YMLDLQPETTDLY(SEQ ID NO:356)；YMLDLQPETTDLYC(SEQ ID NO:5)。
图21是过继细胞治疗(ACT)的示例性实施方案的示意图。如果受试者患有肿瘤，这种免疫治疗方法从提取组织(1)开始，以鉴定抗原(2)，如新抗原。进行肽-MHC结合亲和力预测(3)以鉴定用于产生pMHC的最佳候选肽(4)。然后将稳定的pMHC四聚体化并用于捕获抗原特异性T细胞(5)，随后对其TCR进行测序(6)，在质粒构建体中合成(7)，转化入健康T细胞(8)，和施用于受试者(9)。备选地，受试者可以接种候选肽(非ACT途径)。
序列
本文所列的任何核酸和氨基酸序列均使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写显示，如37C.F.R.§1.822所定义。在至少一些情况下，每个核酸序列仅显示一条链，但任何对所显示的链的谈及均包括互补链。
SEQ ID NO:1是肾母细胞瘤1(WT1)肽。
SEQ ID NO:2是MART-1肽。
SEQ ID NO:3是示例性HLA蛋白(A*02:01)氨基酸序列的细胞外结构域(缺乏信号序列、跨膜结构域和细胞内部分)的氨基酸序列。下划线的残基是本文讨论的示例性氨基酸替换的位置：
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHV
QHEGLPKPLTLRWEPSSQPT
SEQ ID NO:4和5是HPV E7肽。
SEQ ID NO:6-21是用于SCT文库模板优化研究的额外的肽。
SEQ ID NO:22是额外的WT1肽。
SEQ ID NO:23-58是A*02:01病毒抗原。
SEQ ID NO:59-88是A*24:02病毒抗原。
SEQ ID NO:89-100是TCR CDR3α序列。
SEQ ID NO:101-112是TCR CDR3β序列。
SEQ ID NO:113-133是CoV-2肽。
SEQ ID NO:134是额外的抗原肽。
SEQ ID NO:135是示例性占位肽：SALSEGATPQDLNTML
SEQ ID NO:136是可以被生物素连接酶生物素化的纯化标签的氨基酸序列：
GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO:137-144是示例性的甘氨酸-丝氨酸肽接头序列或GS部分：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:137)
GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:138)
GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:139)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:140)
GGGGS(SEQ ID NO:141)
GCGGS(SEQ ID NO:142)
GGCGS(SEQ ID NO:143)
GCGAS(SEQ ID NO:144)
SEQ ID NO:145-307是额外的SARS-CoV-2肽。
SEQ ID NO:308-327是额外的CDR3α序列。
SEQ ID NO:328-347是额外的CDR3β序列。
SEQ ID NO:348-352是新抗原(neoantigen)肽。
SEQ ID NO:353是结核分枝杆菌(M.tuberculosis)肽。
SEQ ID NO:354-356是额外的YML肽。
SEQ ID NO:357-358是额外的SARS-CoV-2肽。
具体实施方式
本文提供了一种高通量SCT表达平台，其能够产生肽和I类HLA等位基因的任何配对的SCT。而对于传统的pMHC折叠，分别通过肽合成和重折叠的MHC亚单位确定表位和HLA模块性(modularity)，本文所述的SCT平台利用引物和PCR模板质粒来确定这两个变量。处理和放大这些PCR试剂的简单性使得混合匹配(mix-and-match)方法成为可能，所述混合匹配方法允许在肽库和HLA模板变体列表中进行快速筛选，以优化pMHC。
该系统最初应用于HLA-A*02:01的18种肿瘤相关抗原(TAA)的测试案例，其使用9种不同的L1/HLA模板，以二维评估肽身份和L1/HLA模板对SCT蛋白表达和热稳定性的影响。接下来，通过组装负载有衍生自常见病毒株的表位的HLA-A*02:01和A*24:02SCT来评估这些SCT在疾病情形中的功能性，证明它们可以与针对这些表位的合成形式刺激的健康供者T细胞结合。
I.术语
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以见Lewin’s Genes X，Krebs等人编辑，Jones and Bartlett出版社，2009(ISBN0763766321)；Kendrew等人(编辑)，分子生物学百科全书(The Encyclopedia ofMolecular Biology)，由Blackwell出版社出版，1994年(ISBN 0632021829)；RobertA.Meyers(编辑)，分子生物学和生物技术：综合案头参考(Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference)，由Wiley,John&Sons,Inc.出版，1995年(ISBN 0471186341)；George P.Rédei，遗传学、基因组学、蛋白质组学和信息学百科全书(Encyclopedic Dictionary of Genetics,Genomics,Proteomics and Informatics)，第3版，Springer，2008年(ISBN:1402067534)；以及其他类似的参考文献。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指称，除非上下文另有明确指示。“包含A或B”是指包括A、或B、或A和B。还应理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并提供所述近似值用于描述。
尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述了合适的方法和物质。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全部并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释在内)为准。此外，所述材料、方法和实例仅为说明性的，而不用于限制。
为了便于阅读本公开的各种实施方案，提供了对特定术语的以下解释：
自体的(Autologous)：指从个体自身组织中获取的组织、细胞或核酸。例如，在T细胞的自体转移或移植中，供者和接受者是同一个人。自体的(或“autogeneic”或“autogenous”)与自我有关，或起源于生物体本身。
人白细胞抗原(HLA)：由MHC基因复合体编码的蛋白质。来自MHC I类的HLA包括HLA-A、HLA-B和HLA-C基因，并且是高度可变的，在一些基因座上有多达数百个变体等位基因。HLA基因座用以下命名：HLA后面是基因座(例如，A)和指定该基因座上特定等位基因的数字(例如01:01)，(例如，HLA-A*01:01或HLA-B*07:02)。
接头：连接(例如共价连接)两个核酸或氨基酸片段的核酸或氨基酸序列。在一些实例中，可包括接头序列以向连接的多肽结构域提供旋转自由度，从而促进合适的结构域折叠以及结构域间和结构域内结合。接头可以是天然序列(例如，在天然存在的MHC I类蛋白质中发现的那些)，或者可以是重组序列或人工序列。在一个非限制性实例中，接头序列包括甘氨酸-丝氨酸氨基酸序列(或编码该氨基酸序列的核酸序列)，其包括不同数量的甘氨酸和丝氨酸残基(例如，甘氨酸(4)-丝氨酸)。
主要组织相容性复合体(MHC)I类：MHC I类分子是由两种非共价相关蛋白——HLA重链(本文中也称为HLAα链)和β2-微球蛋白——形成的异二聚体。HLA重链包括三个不同的结构域，为α1、α2和α3。α1和α2结构域的三维结构形成凹槽，凹槽中的抗原适合呈递给T细胞。α3结构域是Ig折叠样结构域，其包含锚定α链于APC的细胞膜的跨膜序列。当MHC I类复合体与抗原结合时(并且在适当的共刺激信号存在的情况下)刺激CD8细胞毒性T细胞，其发挥杀死它们特异性识别的任何细胞的功能。
核酸片段：任何长度的核酸序列(如线性序列)，当与至少一个其他核酸片段组装(例如，有效连接)时，产生完整的核酸分子。在一些实施方案中，至少两个核酸片段的组装产生编码本公开的MHC I类SCT的核酸。
有效连接的(Operably linked)：当第一核酸与第二核酸处于功能关系放置时，第一核酸和第二个核苷酸是有效连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接至该编码序列。在需要连接两个蛋白质编码区时，可读框是对齐的(aligned)。类似地，当蛋白质(包括蛋白质亚单位、结构域和/或肽)彼此处于功能关系放置时，则它们是有效连接的。在一些实例中，有效连接的节段处于自然界中不存在的排布中。核酸或蛋白质节段之间可以包括接头。
重组的：重组的核酸分子是指具有非天然存在的序列，或具有由两个分离的序列片段人工组合而成的序列。这种人工组合可以通过化学合成或通过人工操作核酸分子的分离片段来实现，例如通过基因工程技术。
单链三聚体(SCT)：一种重组MHC I类分子，其包括复合体的所有部分(HLA重链、β2m和肽)作为单一连接分子。在一些实例中，SCT是指编码HLA重链、β2m、肽抗原和一个或多个接头的核酸。在其他实例中，SCT指蛋白质。
受试者：一种活的多细胞脊椎动物，类别包括人类和兽医上的受试者，包括人类和非人类哺乳动物。
T细胞：一种白细胞(淋巴细胞)，是免疫反应的重要介质。T细胞包括但不限于CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞是一种免疫细胞，其表面携带一种称为“分化簇4”(CD4)的标志物。这些细胞也称为辅助性T细胞，有助于协调免疫反应，包括抗体反应和杀伤性T细胞反应。CD8+T细胞携带“分化簇8”(CD8)标志物。在一个实施方案中，CD8+T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在另一个实施方案中，CD8+细胞是抑制性T细胞。
活化的T细胞可以通过细胞增殖和/或一种或多种细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ或TNFα)的表达或分泌的增加来检测。CD8+T细胞的活化也可以通过响应抗原的细胞溶解活性的增加来检测。
T细胞受体(TCR)：与抗原(如，例如在抗原呈递细胞上的与MHC分子结合的抗原)结合的T细胞表面的一种异二聚体蛋白。TCRs包括α链和β链，每一链都是跨膜糖蛋白。每条链都具有与免疫球蛋白可变和恒定结构域同源的可变区和恒定区、铰链区、跨膜结构域和细胞质尾部。与免疫球蛋白类似地，TCR基因节段在发育期间重排，以产生完整的可变结构域。
T细胞通过它们的TCR和共刺激分子分别与抗原呈递细胞上的肽结合的主要组织相容性复合体和补充的共刺激分子同时结合而激活。例如，CD8+T细胞携带T细胞受体，当特定表位被特定的HLA分子呈递在细胞上时，该T细胞受体识别该特定表位。当CTL前体已经被抗原呈递细胞刺激成为细胞毒性T淋巴细胞，该细胞毒性T淋巴细胞接触携带这种HLA肽复合体的细胞时，CTL与该细胞形成缀合物并将该细胞破坏。
转导和转化：当载体将核酸转移到细胞中时，则载体“转导”细胞。当通过将核酸掺入细胞基因组或通过附加体复制时，DNA被细胞稳定复制，则该细胞被转导到该细胞中的核酸“转化”。如本文所用，术语转化包含将核酸分子引入细胞的所有技术，包括用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速引入裸DNA。
治疗或抑制疾病：“治疗”疾病是指在疾病或病理状况开始发展后，对其体征或症状进行改善的治疗性干预。“抑制”是指抑制疾病或病状的充分发展。对一种疾病的抑制可以跨从对该疾病的部分抑制到基本上完全抑制的范围。在一些实例中，术语“抑制”是指减少或延迟疾病的发作或进展。可以通过这种病症的标准诊断技术来鉴定待治疗的受试者，例如，基于体征和症状、家族史和/或发展疾病或病症的风险因素。
载体：一种核酸分子，其允许插入外源核酸，而不会破坏该载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是一种包含必要的调控序列以允许插入的一个或多个基因转录和翻译的载体。在一些非限制性实例中，所述载体是哺乳动物表达载体。
II.MHC I类SCT核酸和文库
本文公开了编码MHC I类SCT的核酸和包括所述核酸的文库。在一些实施方案中，该核酸作为两个或多个核酸片段提供，当所述两个或多个核酸片段组装时编码MHC I类SCT。在特定实例中，SCT由一对核酸片段组装而成；然而，也可以使用两个以上的核酸片段(例如3个、4个或更多个)，通过使用多个组装位点以产生编码SCT的最终核酸。
在实施方案中，提供了包括第一核酸片段和第二核酸片段的核酸片段对，当组装时，所述核酸片段对编码主要组织相容性复合体(MHC)I类单链三聚体(SCT)蛋白。由组装的核酸片段对编码的SCT包括肽(如肽抗原)、β2m蛋白和HLA重链作为有效连接的亚单位。第一核酸片段和第二核酸片段各自包括在一个位置的组装位点的一部分，当第一核酸片段和第二核酸片段组装时，该位置编码所编码的MHC I类SCT蛋白的β2m中的不变区。在特定实例中，组装位点是Gibson组装位点(参见，例如，Gibson等人，Nature Methods 6:343-345,2009)。在其他实例中，组装位点是限制性酶位点。
在一些实施方案中，核酸片段对还包括编码纯化标签的核酸序列。在一些实例中，纯化标签是多聚组氨酸标签(例如6XHis标签)。在其他实例中，纯化标签是可以通过生物素连接酶生物素化的氨基酸序列。在一个实例中，纯化标签编码氨基酸序列GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:136)。在一些实例中，核酸片段对包括编码两个或多个纯化标签(例如6XHis标签和可被生物素化的肽)的核酸序列。
所公开的核酸片段(例如核酸片段对)提供了不同肽(例如不同抗原肽)与不同HLA重链的模块化组合。在一些实例中，肽替换是通过基于PCR的方法例如反向PCR实现的。例如，编码目的肽的反向互补物的反向引物与通用正向引物(例如与接头L1中的序列结合的通用正向引物)组合使用。这在图1C中示意性地示出。在其他实例中，使用编码目的肽的重叠引物来组装双链构建体，所述双链构建体包括在5’和3’端的限制性酶识别位点，所述限制性酶识别位点对应于SCT模板中肽侧翼的限制性酶位点。双链构建体和SCT模板用限制性酶消化并连接以产生全长构建体。
在一些实施方案中，组装的核酸片段对编码SCT，其蛋白质亚单位的顺序为(N末端至C末端)：分泌信号、肽(如肽抗原或占位肽)、第一接头(L1)、β2m蛋白质、第二接头(L2)和HLA重链。在一些实施方案中，分泌信号是HLA分泌信号(例如HLAα分泌信号)。然而，也可以使用其他分泌信号，包括但不限于来自人β2m、人干扰素(IFN)-α2、人IFNγ、人白细胞介素-2、人血清白蛋白、人IgG重链或Gaussia princeps萤光素酶的分泌信号。根据需要，本领域普通技术人员可以测试一种或多种分泌信号，以鉴定一种或多种提供SCT的增加或优化的表达水平的分泌信号。.
在一些实例中，L1编码甘氨酸-丝氨酸接头，例如SEQ ID NO:137-139任一的氨基酸序列。在一些实例中，L2也编码甘氨酸-丝氨酸接头，例如SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:100。在额外的实例中，在HLAα链和纯化标签(如果包括的话)之间可以包括第三接头(L3)。在一些实例中，L3编码氨基酸序列GG。
在一些实施方案中，所公开的核酸片段对在组装时编码可溶性SCT。在一些实施方案中，HLA重链是HLA重链蛋白的细胞外结构域。因此，在一些实例中，HLA重链的跨膜结构域和细胞内结构域不包括在内。可以去除HLAα分泌信号(例如，如果HLAα链在SCT内部)。在其他实施方案中，所公开的核酸片段对在组装时编码膜结合的SCT。在这样的实施方案中，核酸片段对编码HLA重链细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。
在一些实施方案中，HLA重链是人HLA重链或小鼠HLA重链。在一些实例中，人HLA重链选自HLA-A、HLA-B或HLA-C重链。在其他实例中，小鼠HLA重链是H-2K、H-2D或H-2L重链。每个基因座的HLA重链等位基因的氨基酸和核酸序列是公开可获得的，例如可从EMBL-EBI(例如，ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/fasta/)获得。本领域普通技术人员可以确定其他来源或序列数据库以及更新。在一些实例中，HLA重链包含在HLA重链编码片段文库中。
在一些实施方案中，与野生型HLA重链相比，由本文公开的核酸片段编码的HLA重链包括一个或多个氨基酸替换。可以选择氨基酸替换来改善由组装的核酸片段对编码的SCT的性质或功能，例如增加稳定性、肽结合槽中的肽负载、免疫原性和/或实现二硫醇连接。示例性氨基酸替换包括在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸74的氨基酸位置处的亮氨酸(例如H74L或D74L)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸84的氨基酸位置处的半胱氨酸或亮氨酸(例如Y84C或Y84L)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸139的氨基酸位置处的半胱氨酸(例如A139C)，或其两种或多种的任意组合。氨基酸替换的示例性组合包括图2B中SCT模板1-9所示的那些。在其他实施方案中，包括减少pMHC与T细胞上的CD8共受体相互作用的氨基酸替换。具有一个或多个这样的氨基酸替换的SCT可用于将成功的结合相互作用向对pMHC具有高亲和力的TCR倾斜，例如，作为从抗原特异性T细胞群体中去除低亲和力TCR的过滤器。在一些实例中，氨基酸替换包括在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸227的氨基酸位置处的赖氨酸(例如D227K)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸228的氨基酸位置处的丙氨酸(例如T228A)、在对应SEQ ID NO:3的氨基酸245的氨基酸位置处的缬氨酸(例如A245V)，或其两种或多种的任意组合。在一些实施方案中，HLAα链包括H74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A254V中的一种或多种，其氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置。
在一些实施方案中，包括在所公开的SCT中的肽是肽抗原、占位肽、自身肽(例如存在于健康组织中且未突变的肽)、阴性对照肽或阳性对照肽。在一些实施方案中，占位肽为反向引物的肽编码区提供“空间”以覆盖(例如，如图1C所示)或以用作在肽替换期间去除的片段。对于通过限制性酶消化的肽替换，占位肽可以提供酶切位点之间的间隔，以防止或最小化切割期间限制性酶之间的空间干扰。因此，在一些实例中，占位肽可以是至少四个氨基酸长。在利用反向PCR的实例中，占位肽可能不是必需的，并且是任选的。因此，在一些实例中，占位肽的长度为约4-25个氨基酸。在其他实例中，不存在占位肽(即，在这种情况下，占位肽为0个氨基酸)。在一个实例中，占位肽是HIVGAG氨基酸173-188，并且具有氨基酸序列SALSEGATPQDLNTML(SEQ ID NO:135)。然而，如上所讨论的那样，可以使用其他占位肽序列，或者在一些情况下甚至可以省略占位肽序列。
在一些实施方案中，所述肽是肽抗原。肽抗原是适合于MHC I类蛋白复合体的结合口袋中或适合于MHC I类SCT蛋白并且被CD8+T细胞识别的肽。在一些实施方案中，肽长约8-14个氨基酸(例如，8、9、10、11、12、13、14个氨基酸长)。然而，也可以使用更长或更短的肽抗原。通常，阳性对照和/或阴性对照肽的长度与靶肽(如肽抗原)相同，或约8-14个氨基酸长。在一些实例中，肽抗原是肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽(例如自反应的自身肽)、真菌肽、细菌肽或病毒肽(例如流感病毒肽、冠状病毒肽、人类免疫缺陷病毒(HIV)肽、人乳头瘤病毒(HPV)肽、巨细胞病毒(CMV)肽、肝炎病毒肽(例如HBV或HCV肽)、EB病毒(EBV)或轮状病毒肽)。在一些实例中，肽抗原选自SEQ ID NO:23-88和115-132的任一个。
本文还提供了包括本文公开的多个核酸片段对的文库。在一些实施方案中，文库包括2个或多个核酸片段对，例如2-500个(例如2-50、10-100、20-200、75-150、200-400或300-500个)核酸片段对。在一些实例中，所述文库包括编码多个HLAα链和多个肽的核酸片段。因此，在一些实例中，核酸片段对的文库可用于编码本文公开的多个SCT的核酸的模块化构建。
在一些实施方案中，所述文库包括两个子集，其中第一个子集包括所述核酸片段对的多个第一核酸片段，第二个子集包括所述核酸片段对的多个第二核酸片段。在一些实例中，每一第一核酸片段至少包括编码肽和部分β2m的核酸，每一第二核酸片段至少包括编码部分β2m和HLAα链的核酸。
在一些实施方案中，编码本文公开的核酸片段的SCT组分中的一种或多种组分的核酸序列可以通过利用遗传密码的简并性而改变，使得在改变核苷酸序列的同时，它仍然编码具有与该肽序列相同的氨基酸序列的肽。基于遗传密码的简并性，可以使用标准DNA诱变技术或通过合成DNA序列从本文公开的或本领域技术人员已知的核酸序列衍生变体DNA分子。因此，本公开还包括编码受试者SCT的核酸序列，但由于遗传密码的简并性而与所公开的核酸序列不同。
本文提供的核酸片段可以进一步经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，核酸片段经密码子优化用于在人细胞中表达。密码子优化的核酸是指已经改变的核酸序列，使得密码子对于在特定系统(例如特定物种或物种的组)中表达是最优的。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。在一些实例中，密码子优化是指用在特定目的生物体(例如人)中更频繁使用(优选)的同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)替换核酸序列中的至少一个密码子(例如至少5个密码子、至少10个密码子，至少25个密码子、至少50个密码子、至少75个密码子、至少100个密码子或更多)。每种生物体对每种氨基酸都具有特定的密码子使用偏好，这可以例如从公开可获得的密码子用法表中确定(例如参见Nakamura等人，Nucleic Acids Res.28:292,2000)。例如，密码子使用数据库可在万维网kazusa.or.jp/codon上获得。本领域技术人员可以修改编码特定氨基酸序列的核酸，使其编码相同的氨基酸序列，同时对其在特定细胞类型(如人细胞)中的表达进行优化。可用于密码子优化的额外标准包括GC含量(例如，约50％的平均总GC含量，或在给定的窗口长度(例如，约30-60个碱基)上约50％ GC含量)和避免不必包括的序列(例如特定的限制性酶识别位点)。在一些实例中，使用软件生成密码子优化序列，例如可从Integrated DNATechnologies(Coralville，IA，可在万维网idtdna.com/CodonOpt上获得)、GenScript(Piscataway，NJ)或Entelechon(Eurofins Genomics，Ebersberg，德国，可在万维网entelechon.com/2008/10/backtranslation-tool/上获得)获得的密码子优化工具。
还提供了由本文公开的核酸片段(例如核酸片段对)组装的核酸分子。使用核酸片段中存在的组装位点来制备组装的核酸。因此，在一些实例中，核酸分子是通过Gibson组装来组装的。在其他实例中，核酸分子通过限制性酶消化和连接消化的片段来组装的。组装的核酸片段是有效连接的，使得第一核酸片段和第二核酸片段是连续的，并且蛋白质编码序列在读框中。
在额外的实施方案中，还提供了包括多个组装的核酸分子的文库。在一些实施方案中，文库包括2个或更多个，例如2-2500个(例如，2-25个、5-50个、10-100个、20-200个、75-150个、200-400个、300-500个、400-600个、500-750个、600-800个、700-1000个、1000-1500个、1250-1750个、1500-2000个或2000-2500个)组装的核酸。在一些实例中，组装的核酸文库编码多个SCT，所述SCT在一个或多个编码的HLAα链和/或肽中不同。根据需要，可以将目的肽插入HLAα链和β2m的每个组合中。在一些实例中，缩小HLAα链的文库大小，例如，使用算法对肽-HLA对的结合亲和力进行排序。备选地，选择单个SCT HLAα链，并制备组装的核酸的文库，其中每个成员具有相同的HLA，但具有不同的肽。
在一些实施方案中，由核酸片段组装的核酸分子(例如组装的核酸片段对)包含在载体中。在一些实例中，载体还包含一个或多个与组装的核酸有效连接的表达控制序列，使得组装的核酸的表达在与表达控制序列相容的条件下实现。表达控制序列可以包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、核糖体结合序列、编码蛋白质的核酸的起始密码子(例如ATG)5'、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译以及终止密码子。在一些实例中，表达控制序列是异源表达控制序列，例如来自编码蛋白质的核酸来源以外的来源。因此，与异源表达控制序列(如启动子)有效连接的编码蛋白质的核酸包含非天然存在的核酸。载体可以进一步包括一个或多个额外的元件，例如复制起点、一个或多个选择标志基因(例如一个或多个抗生素抗性基因)或本领域普通技术人员已知的其他元件。
用于克隆、复制和/或表达组装的核酸分子的载体包括细菌质粒，例如细菌克隆或表达质粒(其中一些质粒可用于在细菌和/或哺乳动物细胞中表达)。可以将核酸克隆到其中的示例性细菌质粒包括大肠杆菌质粒，例如pBR322、pUC质粒(例如pUC18或pUC19)、pBluescript、pACYC184、pCD1、质粒(例如/>-3、/>-4、pGEM-/>质粒；Promega，Madison，WI)、TA克隆载体，例如/>质粒(例如，/>II、/>2.1,或/>4质粒；Life Technologies,Grand Island,NY)或pcDNA质粒(例如pcDNATM3.1或pcDNATM3.3质粒；Life Technologies)。在一些实例中，载体包括允许蛋白质在细菌中表达的异源启动子。示例性载体包括pET载体(例如，pET-21b)、pDESTTM载体(Life Technologies)、pRSET载体(Life Technology)、pBAD载体和pQE载体(Qiagen)。
在其他实施方案中，载体是哺乳动物表达载体。在一些实例中，哺乳动物表达载体包括组成型启动子，例如CMV启动子。在其他实例中，载体包括允许质粒在转化的哺乳动物细胞中复制的病毒复制起点(例如EB病毒或SV40复制起点)。在一个非限制性实例中，哺乳动物表达载体是pcDNATM3载体，例如pcDNATM3.1载体(ThermoFisher Scientific)。然而，应当认识到，许多哺乳动物表达载体是可获得的，并且本领域普通技术人员可以选择合适的替代品。
还提供了用包括编码MHC I类SCT的组装核酸分子的载体转化的宿主细胞，例如哺乳动物细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”还包括受试宿主细胞的任何子代。瞬时表达或稳定转移的方法，即，外源DNA持续保持在宿主中，是本领域已知的。通过培养繁殖哺乳动物细胞的技术是本领域普通技术人员已知的。常用的哺乳动物宿主细胞系的例子是HEK293细胞、VERO细胞、HeLa细胞、CHO细胞、WI38细胞、BHK细胞和COS细胞系，尽管可以使用其他细胞系，例如设计以提供改善的表达、所需的糖基化模式或其他特征的细胞。在一些非限制性实例中，哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞，例如Expi293FTM细胞(ThermoFisher Scientific)。
可以通过本领域技术人员已知的技术实施用重组DNA转化宿主细胞。当宿主是真核生物时，可以使用包括以磷酸钙共沉淀物的形式转染DNA、机械程序如显微注射、电穿孔、插入脂质体包封的质粒或病毒载体的方法。
III.人SCT蛋白质
本文公开了人MHC I类单链三聚体蛋白，例如由上述核酸片段对和组装的核酸编码的那些。如第II节所述，在一些实施方案中，提供用编码所公开SCT的核酸转化的哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，人MHC I类SCT是可溶的。此外，作为在哺乳动物细胞中表达的结果(例如，与细菌或昆虫细胞相反)，SCT可以包括代表在人细胞中表达和/或被适当折叠并产生功能蛋白的pMHC的翻译后修饰，例如以比在非哺乳动物系统中产生的那些更高的效率进行。在特定实施方案中，SCT是糖基化的。
由第II节中描述的核酸片段对或组装的核酸编码的任何SCT都可以作为可溶性人糖基化MHC I类SCT产生。因此，在一些实施方案中，可溶性人糖基化MHC I类SCT按N-末端到C-末端的顺序具有分泌信号、肽(如肽抗原或占位肽)、第一接头(L1)、β2m蛋白、第二接头(L2)和HLA重链的排布。SCT也可以包括纯化标签。
在一些实施方案中，与野生型HLA重链相比，可溶性人糖基化MHC I类SCT包括一个或多个氨基酸替换。示例性氨基酸替换包括在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸74的氨基酸位置处的亮氨酸(例如H74L或D74L)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸84的氨基酸位置处的半胱氨酸或亮氨酸(例如Y84C或Y84L)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸139的氨基酸位置处的半胱氨酸(例如A139C)，或其两种或多种的任意组合。氨基酸替换的示例性组合包括图2B中SCT模板1-9所示的那些。在其他实例中，氨基酸替换包括在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸227的氨基酸位置处的赖氨酸(例如D227K)、在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸228的氨基酸位置处的丙氨酸(例如T228A)、在对应SEQ ID NO:3的氨基酸245的氨基酸位置处的缬氨酸(例如A245V)，或其两种或多种的任意组合。在一些实施方案中，HLAα链包括H74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A254V中的一种或多种，其氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置。
在一些实例中，肽是抗原肽或占位肽。在一些实例中，抗原肽选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽(例如，“自身”肽)、真菌肽、细菌肽和病毒肽。示例性肽在第II节中进行了讨论。
在一些实施方案中，将可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白组装为稳定的多聚体。在特定实例中，将可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白组装为稳定的四聚体。在一些实施方案中，使用生物素化SCT实施稳定多聚体(例如四聚体)的组装。
在一个实例中，生物素化SCT单体用荧光团标记的链亲和素(例如链亲和素藻红蛋白)四聚化。在其他实例中，使用定制的链亲和素-DNA缀合物将生物素化的SCT单体四聚化，该缀合物允许随后结合到互补的ssDNA生物素分子，例如粘附到链亲和素包被的珠上。在另一个实例中，SCT单体缀合到10X相容的DNA条形码标记的dextramer上。这些dextramer也可以用荧光团标记，因此可以在SCT缀合后以与上述SCT四聚体相同的方式用于流式细胞术。
还提供了作为单体或稳定的多聚体(如四聚体)的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的文库。在一些实施方案中，文库包括2个或更多个，例如2-2500个(例如，2-25个、5-50个、10-100个、20-200个、75-150个、200-400个、300-500个、400-600个、500-750个、600-800个、700-1000个、1000-1500个、1250-1750个、1500-2000个或2000-2500个)可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白。在一些实例中，可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的文库包括在HLA重链、肽或两者上不同的多个SCT。
在额外的实施方案中，将稳定的多聚体连接到固体支持物，例如聚合物、平坦表面、珠或纳米粒子支架。在一个非限制性实例中，固体支持物是磁珠(例如Dynabeads)。在一些实例中，提供了包括多个固体支持物(例如珠或纳米粒子)的文库，每个固体支持物包括附着或连接到支持物的不同SCT多聚体。在一些实施方案中，将生物素化的SCT单体或四聚体掺入到含有链亲和素的支架上，例如链亲和素包被的珠或纳米粒子或链亲和素包被的表面(例如多孔板)。
IV.使用方法
本文还公开了使用所公开的MHC I类SCT的方法。所述方法包括鉴定抗原特异性CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定抗原特异性T细胞的T细胞受体(TCR)，并且在一些实例中，产生表达所鉴定的TCR的T细胞群体。在进一步的实施方案中，可以将T细胞群体施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，所述方法包括用本文公开的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的一种或多种稳定多聚体筛选T细胞群体(例如，接触T细胞群体)。在一些实例中，将T细胞群体与稳定多聚体的文库接触，所述稳定多聚体的文库例如包括多个不同的SCT多聚体，其中每个SCT多聚体包括不同的肽序列(例如多个不同的肽抗原和/或多个HLAα链)。这允许检测群体中对特定肽有反应的一个或多个T细胞，在一些实例中称为“抗原特异性T细胞”。在一些实例中，用SCT筛选的T细胞是由多个SCT中包含的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)产生的。
群体中的反应性T细胞可以例如使用流式细胞术进行分选和捕获。在一些实例中，使用本领域技术人员已知的细胞培养方法体外扩增反应性T细胞。在一些实施方案中，分析T细胞以鉴定反应性细胞中表达的TCR。在一个实例中，例如使用下一代测序方法(例如，批量测序(bulk sequencing)或10X单细胞测序)对TCR进行测序。
将鉴定的TCR克隆到表达载体中，并用编码该TCR的表达载体转化T细胞群体，以产生表达该TCR的T细胞群体(例如CD8 T细胞)。转化T细胞以表达异源蛋白(如所鉴定的TCR)的方法是本领域普通技术人员已知的。可以将这种经转化的T细胞群体施用于有需要的受试者。过继细胞转移的方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实例中，表达TCR的T细胞对肿瘤相关抗原或新抗原具有反应性，并施用于患有癌症的受试者。在其他实例中，表达TCR的T细胞对病毒或细菌抗原具有反应性，并施用于感染病毒或细菌的受试者。
在一些实例中，用于产生SCT和筛选T细胞群体的肽来自受试者，例如患有癌症的受试者。在一些实例中，表达所鉴定的TCR的T细胞群体也来自该受试者(例如，是自体T细胞)。该方法的具体实施方案在图21中示出，并在实施例8中描述。然而，本领域普通技术人员将认识到，对这些方法的修改是可能的。
实施例
提供以下实施例以阐述某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应构成将本公开限制于所描述的特定特征或实施方案。
实施例1
材料和方法
SCT模板产生：使用Gibson组装和限制性酶消化法的组合用于插入pcDNA3.1 Zeo(+)质粒(Thermo Fisher Scientific)，构建编码I类SCT的质粒(图1A)。简言之，将SCT插入物设计为模块化的，以允许L1的任何选择与HLA等位基因的任何选择配对。由于β2m在人类物种中没有等位基因变异，将SCT在该区域分拆为两个Gibson组装片段，以使L1与HLA去偶联。片段购自Twist Bioscience，用KOD HotStart Hi-Fi聚合酶(MilliporeSigma)进行PCR扩增，并使用NEBuilder HiFi DNA组装Master Mix(New England Biolabs)通过Gibson组装连接在一起。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR扩增的Gibson产物的侧翼区域，以在相同的酶识别位点处连接到pcDNA3.1的MCS区域中(图1B)。将密码子优化应用于设计的片段，有三个考虑：1)仅选择人类物种中高度普遍存在的密码子，2)避免GC含量超过60％的连续基因片段(24+bp)(以避免合成过程中的错误率)，以及3)避免片段内存在关键识别切割位点，所述关键识别切割位点必须仅存在于Gibson产物的侧翼以插入pcDNA载体中。该策略最初成功地用于三个HLA等位基因(A*01:01,A*02:01,A*03:01)。随后，用Python脚本自动设计(编码HLA等位基因的)第二片段，这包括所有上述设计标准，并考虑来自I类HLA-A、B、C基因座的所有等位基因。每个HLA等位基因的蛋白质序列获自The ImmunoPolymorphism Database(ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/fasta/)托管的FTP服务器。迄今为止，来自IMGT数据库的所有现有的I类HLA序列都已以这种方式转换为可订购(ready-to-order)的DNA序列。从这些序列中，已经构建了包含24个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的至少40个独特的质粒模板。
SCT肽文库产生：实施了一种PCR促进的方法，使肽能够高通量替换到SCT编码的质粒中。在考虑了成本、易用性和与质粒相接偶联的各种L1选择的灵活性后，在其他潜在方法中选择了延伸PCR方法(图1C)。简言之，对于任何给定的肽替换，需要肽编码的反向引物(与肽区域上游的信号序列结合)和需要正向引物(与肽区域下游的L1结合)。肽编码的引物不同于任何给定的肽，而正向引物在所有肽元件上保持固定(除非选择使用不同的L1/HLA模板质粒)。以这种方式，包含n个肽和m个模板的SCT质粒文库需要购买n+m个总引物。用KOD热启动聚合酶(MilliporeSigma)进行延伸PCR。将产物磷酸化并用T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶的混合物连接，然后用DpnI(New England Biolabs)消化模板DNA。然后将经肽替换的质粒转化到One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌(Thermo Fisher Scientific)中。质粒在用于转染前使用Python脚本通过Sanger测序进行验证。
SCT表达：将纯化的SCT质粒转染到24孔(2.5ml容量)板内的Expi293细胞(ThermoFisher Scientific)中。简言之，将1.25μg质粒与75μl Opti-MEM还原的血清培养基混合。将7.5μl ExpiFectamine试剂与70μl Opti-MEM还原的血清培养基混合，在室温孵育5分钟，并与质粒混合物混合。室温孵育15分钟后，将溶液以300万个细胞/ml加入1.25ml Expi293细胞，加入24孔板中，然后在37℃、225RPM、8％ CO2中振荡过夜。20小时后，将含有7.5μlExpiFectamine转染增强剂1和75μl ExpiFectamine转导增强剂2的溶液添加到每个孔中。使用上述设置将板在摇床上保持总共4天，从转染开始算。在通过SDS-PAGE进行产量分析之前，收集转染溶液的上清液并通过0.22μm PVFD膜注射器滤器(MilliporeSigma)过滤。使用30kDa离心过滤单元(Amicon)将高产量表达的SCT的上清液浓缩至200μlPBS，随后用BirA酶试剂盒(Avidity)生物素化过夜。然后用HisTag树脂尖(Phynexus)纯化生物素化的SCT，并用Zeba 7KMWCO旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)脱盐回到PBS缓冲液中。对于长期储存，将SCT重新悬浮在20％甘油w/v中，然后-20℃储存。
SCT产量表征：转染4天后，将含有3:1转染上清液和含10％β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液的混合物的15μl溶液在100℃变性10分钟，随后上样于Bio-Rad无染色凝胶中进行SDSPAGE(200V，30分钟)。在每个凝胶中运行在20％甘油PBS溶液中的还原的、纯化的WT1(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:1)A*02:01SCT样品(含有约2μg)，作为阳性对照和相对蛋白质产量计算的强度参考。使用Bio-Rad ChemiDoc MPgel成像系统获得图像(手动设置：45秒紫外线激活，0.5秒曝光)。为了确定分析SCT表达的一致方法，专门开发了一个自定义Python脚本，用于分析在无染色凝胶(Bio-Rad)上运行的SCT蛋白。该脚本允许用户定义的选择目的蛋白质条带，并在一致使用对照蛋白质泳道的情况下，在所有凝胶中提供背景减少和SCT产量的一致归一化。该方法的准确性通过纯化SCT的滴定、预定量样品的SDS-PAGE进行测量，以显示真实蛋白质A280浓度(通过NanoDrop 8000分光光度计测量)与定量的相对条带强度之间99％的相关性。选择表达高于已建立的产量截止值的SCT用于随后的生物素化和纯化步骤。
热稳定性表征：SYPROTMOrange Protein Gel Stain购自ThermoFisherScientific，用水稀释得到100X工作溶液。向每19μl等份I类SCT蛋白溶液(如果可能，稀释至10μM)中加入1μl 100X染料溶液。配备有CFX96实时PCR检测系统的Bio-Rad热循环仪与Precision Melt Analysis软件结合使用，以获得每个SCT样品的熔融曲线。热斜坡设置为25℃至95℃，每30秒0.2℃。
肽刺激：通过加入1μM肽和抗CD40抗体(1μg/mL)，将解冻的PBMC在完全R10培养基(500ml RPMI 1640；50mL热灭活的FBS；5ml Pen/strep(100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)；1x GlutaMAX)中孵育16小时。第二天，洗涤PBMC，并用膜联蛋白V-BV421(1μg/mL)、CD8-FITC抗体(1μg/mL)和CD137-PE抗体(1μg/mL)在4℃染色PBMC 10分钟。通过肽刺激激活诱导的CD137表达允许使用FACS分选设备将抗原特异性T细胞分选到管中。
SCT多聚体形成：生物素化的SCT单体已成功用于至少三种不同的形式。首先，它们已经用链亲和素-藻红蛋白(PE)(BioLegend)四聚化，所述链亲和素-藻红蛋白(PE)用作常规的流式细胞术染色试剂。第二，它们已经用定制的链亲和素-DNA缀合物四聚化，以允许随后结合到附着在链亲和素包被的磁性Dynabeads上的互补ssDNA生物素分子上(ThermoFisher Scientific)。这些试剂可用于纳米粒子核酸细胞分选平台(NP-NACS)(Peng等人，Cell Reports28:2728-2738,2019)，其允许增强的pMHC-TCR亲合力以及抗原特异性T细胞的微流体引导的提取和分析。SCT单体已经缀合到10X兼容的DNA条形码化的dextramers(Immudex)上。这些试剂能够偶联捕获的CD8 T细胞的抗原特异性身份(在dextramers上的DNA条形码)及其相应的TCRα和β链序列(单细胞mRNA测序)。
实施例2
SCT文库的表达
最初的SCT文库由来自各种来源的18种HLA-A*02:01抗原组成(表1)。为了确定引入SCT的候选L1/HLA突变，对SCT设计的工程化改进进行了文献调查。先前已开发了三代L1-HLA组合(闭合槽(野生型HLA Y84)、开放槽(HLA Y84A)和硫醇连接子(HLA Y84 C))并显示出表现为pMHC稳定性的逐渐改善。这三代实现为五个独特的设计，所述五个独特的设计缩写为D1(L1＝(GGGGS)3(SEQ ID NO:137)；闭合槽)、D2(L1＝(GGGGS)3(SEQ ID NO:137)；开放槽)、D3(L1＝GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:138)；硫醇连接子)、D4(L1＝GGCGS(GGGGS)2(SEQID NO:138)；硫醇连接子)和D5(L1＝GCGAS(GGGGS)2(SEQ ID NO:139)；硫醇连接子)(图2A和2B)。在连接子(D3-D5)中含有半胱氨酸的设计也在HLA亚单位中引入Y84C突变以实现二硫醇连接。接下来，在三个模板(D6-D8)中实施正交HLA突变H74L。H74L突变在HLA亚单位的肽结合槽中形成C口袋的一部分，据报道有助于肽负载和pMHC免疫原性，因此包含其可能提高pMHC的整体稳定性和功能。最终设计(D9，称为DS-SCT)包括HLA结合口袋的配对Y84C-A139C突变，所述突变可以为重折叠的pMHC构建体引入进一步的稳定性。
表1.用于SCT文库模板优化研究的肽
将包含9个HLA模板和18个肽的162个元件的质粒文库转染到Expi293细胞中(图2B)。SCT蛋白带的还原SDS-PAGE分析揭示了依赖于肽和模板的蛋白质产量的显著变化(图2B)。为了使转染效率对SCT产量的影响解偶联，进一步修饰在设计D3下的文库的一个子集以掺入IRES-GFP序列，使得无论肽身份或SCT表达的程度如何，转染的细胞都将被诱导表达细胞内GFP。GFP阳性细胞的基于流式细胞术的检测表明，在所有测试的SCT构建体中，转染效率的程度大体一致(70％)(图3A)。进行具有和不具有IRES-GFP插入物的生物学一式三份的该子集，以显示肽依赖性SCT产量变化是一致的(图3B)。文库中的三个H74L突变模板相对于其野生型对应物通常显示出改进的蛋白质表达，并且使用硫醇连接子的模板产生最高的SCT总产量(图2B)。在一些情况下，例如肽AIQDLCLAV(SEQ ID NO:18)，只能用D8模板或D9模板获得SCT表达，这可能是由于二硫醇突变赋予的F口袋处的稳定性，所述D8模板结合了H74L和硫醇连接子这两个特征。VLQELNVTV(SEQ ID NO:11)的SCT带轻微向上移动，表明由于肽区域中的NXT糖基化共有序列而增加的质量(图2B)。这种现象在需要外源性引入肽的组装方法中是不存在的，并且显示SCT在分泌之前经历生物蛋白质加工途径。因此，该文库的SDS-PAGE分析显示，SCT表达取决于肽和骨架模板的选择，并产生含有翻译后修饰的蛋白质。
随后将表达高于产量阈值的SCT进行HisTag纯化到pH 7.4的PBS缓冲液中用于热位移测定。与天然pMHC对应物相比，测得的Tm值在所报道的SCT的预期值内，提供了相同肽从野生型槽(D1和D6)到开放槽(D2和D7)到巯基化连接子/槽(D3、D4、D5、D8、D9)的增加的稳定性趋势(图2C)。对于H74L变体，每种肽的SCT热稳定性也高于野生型对应物。对于其中SCT仅对某些模板表达的一些肽(如AIQDLCLAV(SEQ ID NO:18)或FLKANLPLL(SEQ ID NO:11))，检测到两个不同的Tm值，其中较低的Tm值可能表明不正确折叠的SCT种类。
实施例3
针对肿瘤相关抗原的SCT功能测定法
为了验证SCT构建体的功能，针对已知的TCR对各种设计评估了SCT结合功效。对于Wilms肿瘤1(WT1)肽(RMFNAPYL；SEQ ID NO:22)，针对WT1特异性C4 TCR评估该系列六个SCT(D1、D2和D7的产量太低而不能使用)的结合，其他人已经对其在体内对肽的反应性进行了表征(图4)。纯化表达的WT1-SCT，并将它们用于针对经C4 TCR转导的和经MART-1-特异性F5TCR转导的Jurkat细胞的95/5混合群体的结合测定法中。观察到WT1SCT与WT1特异性Jurkat细胞结合程度的显著差异。H74L SCT变体(D6和D8)表现出最差的性能，与野生型H74对应物相比，在门内捕获大约两倍更少的细胞。WT1的DS-SCT变体在针对C4 TCR转导的Jurkat细胞的相同测定法中显示出最佳的结合效率，捕获了97.3％的WT1特异性细胞群体。针对F5 TCR转导的TCR Jurkat细胞的纯群体对MART-1表位进行类似的测定法以产生类似的结果。因此，将DS-SCT模板在未来的实验中用于肽文库。
实施例4
针对病毒抗原的SCT功能测定法
为了将该平台扩展到传染病的应用例，表达了一个靶向常见病毒表位的小型SCT文库。构建了针对文献中常见报导的66个总A*02:01或A*24:02病毒表位的质粒模板(表2和表3)。类似于先前的文库，所有质粒都显示出肽依赖性SCT表达(图5)。根据蛋白质表达对SCT进行排序，并从两个HLA类型中的每一个HLA类型的常见病毒株(CMV、EBV、流感病毒和轮状病毒)中选择10个表位，并选择产生的最高SCT表达，以进一步用于鉴定抗原特异性T细胞。用含有这些表位的相应肽库刺激从HLA匹配的健康供者获得的PBMC约一个月，其中每周再刺激以诱导肽特异性克隆型的扩增。对于每个供者，在这些条件下刺激来自相同PBMC的10个细胞系。肽刺激的和扩增的T细胞系用SCT四聚体分选，并且对大多数肽而言，与它们的未刺激对应物相比，肽刺激的和扩增的T细胞系显示出显著更高量的四聚体结合群体。这表明SCT可以捕获相应的TCR，所述TCR识别与天然的、表面结合的MHC复合物结合的相同表位。
表2.A*02:01病毒抗原
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表3.A*24:02病毒抗原
ID 肽 抗原来源 SEQ ID NO:
1 TYFNLGNKF AdV 11六邻体(37-45) 59
2 VYSGSIPYL AdV 11六邻体(696-704) 60
3 TYFSLNNKF AdV 5六邻体(37-45) 61
4 DYNFVKQLF EBV BMLF1(320-328) 62
5 TYPVLEEMF EBV BRLF1(198-206) 63
6 RYSIFFDYM EBV EBNA3A(246-254) 64
7 TYSAGIVQI EBV EBMA3B(217-225) 65
8 IYVLVMLVL EBV LMP2(222-230) 66
9 PYLFWLAAI EBV LMP2(131-139) 67
10 TYGPVFMSL EBV LMP2(419-427) 68
11 TYGPVFMCL EBV LMP2(419-427) 69
12 EYLVSFGVW HBV core(117-125) 70
13 KYTSFPWLL HBV pol(756-764) 71
14 QYDPVAALF HCMV pp65(341-349) 72
15 EYVLLLFLL HCV E2(717-725) 73
16 PFHCSFHTI HHV-6B U54(267-275) 74
17 RYLRDQQLL HIV env gp160(584-592) 75
18 RYLKDQQLL HIV env(67-75) 76
19 RYPLTFGW HIV nef(134-141) 77
20 VYDFAFRDL HPV16 E6(49-57) 78
21 FFQFCPLIF HTLV-1Env(43788) 79
22 LFGYPVYVF HTLV-1Tax(43819) 80
23 PYKRIEELL HTLV-1Tax(187-195) 81
24 SFHSLHLLF HTLV-1Tax(301-309) 82
25 YYLEKANKI 流感病毒PA(130-138) 83
26 SYLIRALTL 流感病毒PB1(216-224) 84
27 RYTKTTYWW 流感病毒PB1(430-438) 85
28 SYINRTGTF 流感病毒PB1(482-490) 86
29 RYGFVANF 流感病毒PB1(498-505) 87
30 TYQWIIRNW 流感病毒PB2(549-557) 88
为了进一步评估SCT的功能能力，对SCT dextramers捕获的TCRα和β链的CDR3区的序列进行了查询。鉴定了A*02:01健康供者对肽NLVPMVATV(SEQ ID NO:44)具有阳性反应性，该肽衍生自人巨细胞病毒(CMV)pp65蛋白。该SCT元件及其折叠的pMHC对应物用于从供者PBMC中分选CMV特异性T细胞(图6)。对分选的群体进行10X单细胞测序，结果显示两种试剂捕获的抗原特异性克隆的相似分布。如表4所示，CDR3α链和CDR3β链相对于公共数据库(VDJdb)的莱文斯坦距离(Levenshtein distances；LD)较低，表明检测的CMV特异性TCR链与先前报道的TCR链之间的高度相似性。两个配对的克隆(图6中的红色和浅橙色楔形)包含与文献结果完全匹配的CDR3α链(LD＝0)。一个额外的克隆(图6中的浅绿色楔形)包含一个α/β对，其两条链都被报道为CMV特异的，并且被SCT以十倍更高的频率捕获。这些结果表明SCT四聚体具有与折叠的pMHC的金标准至少相似的流式细胞术性能。
表4.来自SCT四聚体的12个最频繁捕获的克隆型(clonotype)的TCR CDR3α和CDR3β序列
LD＝至来自VDJdb的公开报导的CMV特异的克隆型的莱文斯坦距离
实施例5
针对SARS-CoV-2的抗原特异性T细胞的计数
该实施例先前于2020年5月8日由Chour等人,medRxiv,doi.org/10.1101/2020.05.04.20085779(以修改后的形式)发表，通过引用将其全文并入本文。
方法
pMHC设计为质粒编码的单链三聚体的形式，该单链三聚体包含候选的SARS-CoV-2衍生的刺突蛋白或Nsp3表位、MHC的β-2微球蛋白亚单位和MHC的人白细胞抗原(HLA)亚单位。利用优化的平台表达了大约118个针对刺突蛋白的可行的SCT构建体和75个针对Nsp3的可行的SCT构建体。将88个刺突SCT和75个Nsp3 SCT以四聚体掺入纳米粒子核酸细胞分选(NP-NACS)系统中以产生高亲合力TCR捕获剂。最后，将NP-NACS应用于抗原特异性T细胞的鉴定和分析，所述T细胞来源于8名COVID-19参与者(覆盖3个目的HLA等位基因)的抽出血液，以及来源于4个HLA匹配的健康供者的PBMC样品。
样品收集：作为瑞典研究所研究COVID-19参与者的INCOV试验的一部分，在机构批准和参与者书面知情同意后，获得所有的人样品(血液)。分离并冷藏保存外周血单个核细胞(PBMC)。它们是在三个时间点从参与者中收集的：T1(诊断)、T2(诊断后4-5天)和T3(恢复期)。提交186个独特的参与者样品用于HLA单倍型分型(Cisco Genetics)。在所有样品中，我们鉴定了A*02:01,A*24:02和B*07:02等位基因是最普遍的，因此筛选出具有这些等位基因的参与者，用于使用SCT构建体进一步分析。
SCT质粒构建和蛋白质表达：为了构建SARS-CoV-2SCT文库，将已鉴定的肽编码到引物中，用于插入模板SCT质粒中(如实施例1中所述)。随后将肽替换的SCT质粒文库转染入Expi293细胞约4天。从上清液收集分泌的SCT蛋白，生物素化，并通过HisTag柱纯化。
SCT多聚体测定法：可以生物素化SCT单体文库并并入到标准的四聚体支架中，用于各种下游测定法。然后可以将SCT四聚体组装到磁性纳米粒子的表面上，以形成用于血液细胞术荧光显微镜测定的pMHC纳米粒子(pNP)文库。此外，这些SCT可以与ImmudexKlickmer试剂一起使用，以形成用于10X单细胞测序实验的dextramer。pNP文库的优势在于，所有分析都是在溶液中进行的，从而避免了来自气溶胶化的COVID-19患者生物样品的风险。先前使用NP-NACS系统的工作强调了该平台增强的灵敏性，这允许其使用直接从PBMC中提取的非扩增CD8+T细胞。然而，从捕获的细胞中计数TCR序列是困难的，并且需要进一步的微流体适应以实现单细胞测序。与NP-NACS相比较，使用SCT四聚体的流式细胞术测定法是更高通量的，并且可以与混合测序(bulk sequencing)测定法相结合来鉴定抗原特异性TCR序列，但是四聚体特异性结合的程度更难解决，因为不能在显微镜水平上观察到四聚体染色。Dextramer/10X测定法以与四聚体类似的方式用于流式细胞术，并允许TCR序列的抗原配对，但与其他方法相比较，其相对更昂贵且通量更低，每次运行仅能分析多达10000个细胞。为了最大化确信测序的TCR衍生自抗原特异性T细胞，后两种测定法对在SCT捕获或肽刺激后扩增的CD8+T细胞是可工作的。
半胱氨酸修饰的链亲和素DNA(SAC-DNA)缀合物的制备：SAC-DNA缀合物如下制备。简言之，首先自含有SAC基因的pTSA-C质粒(Addgene)表达SAC。在与DNA缀合之前，使用Zeba脱盐柱(Pierce)将SAC(1mg/ml)缓冲液交换为含有Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，5mM)的PBS。然后将在DMF中的3-N-马来酰亚胺-6-肼吡啶盐酸盐(MHPH，100mM，Solulink)以300:1的摩尔过量添加到SAC中。同时，将在DMF中的4-甲酰基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SFB，100mM，Solulink)以40:1的摩尔比加入到5’-胺修饰的ssDNA(500μM)中。在室温(RT)反应4小时后，将MHPH标记的SAC和SFB标记的DNA缓冲液交换为柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸钠，150mMNaCl，pH 6.0)，然后以DNA与SAC的20:1比例混合以在RT反应过夜。使用Superdex 200凝胶过滤柱(GE health)纯化SAC-DNA缀合物，并用10K MWCO超离心过滤器(Millipore)浓缩。
COVID SCT pNP文库构建：根据制造商推荐的生物素化核酸连接方案制备链亲和素包被的NP(500nm半径，Invitrogen Dynabeads MyOne T1)。将这些NP与条形码化的生物素ssDNA(100μM)以1:20的体积比混合以获得NP-DNA。通过洗涤NP三次来去除过量的DNA。平行地，将SCT单体文库以4:1的比例添加到SACDNA中以形成SCT四聚体DNA。为了产生荧光pNP，将等摩尔量(根据DNA比例)的NP-DNA和pMHC四聚体DNA，以及与AlexaFluor 750、AlexaFluor 488或Cy5(IDT-DNA)结合的0.25μl 100μMssDNA在37℃杂交20分钟，并用缓冲液(0.1％BSA，2mM MgCl2-PBS)洗涤一次。使用这三种染料允许每次分析复用多达三种独特的抗原pNP。通常，<100000个细胞的每个NP条形码NACS分析使用2.5μL储备NP(总共2820万个颗粒)每个文库元件。
从PBMC悬浮液中制备和分离CD8+T细胞：将PBMC解冻并在补充有10％FBS和IL2(100U/mL)的RPMI 1640培养基中在37℃、5％CO2过夜孵育复苏。对于所有样品，测定复苏的细胞的存活力>95％。使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)阴性选择CD8+T细胞群体。简言之，将复苏的细胞与捕获PBMC中CD8细胞的生物素化抗体混合物孵育，然后与链亲和素包被的微珠孵育。使用LS柱在15mL Falcon管中分离未接触的CD8+T细胞。然后将含有CD8+T细胞的管以500g离心5分钟，并将沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中。对于多重细胞标记，用Calcein Blue、AM(Thermo Fisher Scientific)或CellTrackerTMOrange CMRA Dye(Thermo Fisher Scientific)以浓度4μM和400nM对CD8+T细胞分别染色。在37℃、5％CO2孵育10分钟后，用PBS洗涤细胞两次，并将其重新悬浮在细胞悬浮缓冲液(在PBS中的0.1％ BSA,2mM MgCl2)中。
通过NP-NACS鉴定抗原特异性CD8+T细胞：将pNP文库组合成三个pNP的组，组中的每个pNP元件用三种条形码染料中的一种染色。从每个pNP组中，将7.5μl与经染色的CD8+T细胞的每个等分试样在RT孵育30分钟。通过磁性下拉富集抗原特异性细胞，并将其重新悬浮于6μl 0.1％ BSA 2mM MgCl2 PBS缓冲液中。然后将捕获的细胞上样到4芯片一次性血细胞计数器(Bulldog-Bio)中。对血细胞计数器芯片中的整个区域进行成像，以获得下拉细胞总数。使用cellSens Olympus软件和R编程语言进行抗原特异性T细胞的鉴定(包括非特异性结合事件的检测和排除)。
四聚体结合流式测定法：关于四聚体形式的SCT用于流式测定法，参见实施例1。使用dextramer形式的SCT用于10X也遵循类似的方案，其中用Immudex dextramer/Klickmer试剂代替链亲和素，并且用于染色和洗涤的下游方案是相同的。对于10X单细胞样品提交，采用了制造商的建议和方案。
结果
为了广泛调查针对SARS-CoV-2的抗原特异性CD8+T细胞反应，从诊断(T1)到诊断后4-5天(T2)再到恢复期(T3)的三个时间点自住院COVID参与者抽出血液收集PBMC样品。基于用SARS-CoV-2结构蛋白的肽库刺激的ELISpot测定法显示，与健康供者对照相比，来自两个COVID参与者PBMC样品的IFN-γ产生显著增加(图7)。在INCOV参与者中，增加的IFN-特征主要在T2检测到，这表明在感染后随时间产生了针对SARS-CoV-2的表位特异性应答。
最近的报告表明，住院COVID患者的SARS-CoV-2特异性T细胞库由很大比例的衰竭表型和与疾病严重程度相关的总体低CD8+T细胞计数组成。为了列举SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞的表位景观，包括那些潜在罕见或耗竭的细胞，直接探测PBMC，而不是依赖于基于刺激/扩增的方法。这种方法防止了对具有不可扩增表型的抗原特异性T细胞的任何潜在的偏差，所述偏差可能会扭曲检测到的表位的分布。由于没有扩增步骤，使用NP-NACS平台最大化捕获灵敏度，该平台将数千个四聚体固定在磁性颗粒上，能够以低至0.001％的频率对克隆性CD8+T细胞进行高度灵敏的磁分离和检测。为了在未扩增的CD8+T细胞中捕获尽可能多的抗原特异性，使用SCT平台拓宽捕获广度以产生数百个pMHC。将来自目的蛋白质的9至11聚体肽序列输入到NetMHC4.0结合预测算法中。对于刺突蛋白，鉴定了96个、33个和51个肽分别用于HLA-A*02:01、B*07:02和A*24:02等位基因，具有500nM或更强的结合亲和力(未显示)。
该过滤的肽列表用于使用SCT平台开发pMHC编码的质粒。对于沿着刺突蛋白结构域图的表位，SCT蛋白表达的分布对于每个单倍型是独特的。A*02:01SCT在除TM(弱表达)之外的所有结构域中显示出表位的相对异质性表达水平(图8A-8D)。B*07:02SCT表达显示出对NTD、S1/S2切割位点和部分S2亚单位的偏好，而高表达的A*24:02SCT似乎集中在NTD、RBD和TM区域周围。由于在SCT产生之前使用NetMHC4.0作为过滤步骤，这些分布因人工选择偏差而部分扭曲。因此，这些SCT的表达在一定程度上反映了算法的预测强度。额外地，可以将这些结果视为对HLA等位基因之间存在的生物学差异的解释。每个HLA结合中亲水/疏水偏好的差异将使每个pMHC构建体对刺突结构域中发现的某些肽基序的稳定性产生偏差。
SCT多聚体可以鉴定来自健康和COVID-19供者的抗原特异性T细胞：将三个文库中每一个文库的最高表达SCT用作NP-NACS试剂，以鉴定来自两个参与者和每个单倍型至少一个健康对照的COVID PBMC中的抗原特异性T细胞(图9)。对于每个HLA单倍型，NP-NACS测定法能够针对每个文库的共享表位子集鉴定抗原特异性T细胞，而与样品的疾病状态无关。然而，与健康对照组相比，COVID参与者含有针对每个顶级表位的抗原特异性T细胞的频率明显更高。在COVID参与者的两个样品采集时间点都检测到了这些共享的免疫显性表位，每个表位的相对频率都有变化，这表明可能在整个免疫反应中，针对每个表位的克隆型扩增的波动。这些发现表明，免疫显性表位存在于相同HLA单倍型的个体中，甚至在健康对照中也是如此，并且检测程度在整个疾病状态过程中演变。
尽管NP-NACS检测到抗原特异性T细胞，但这些细胞能被这些表位诱导产生实际免疫反应的程度仍然存在疑问。合成了包含从A*02:01或B*07:02测定中检测到的表位的五种肽，并将其用于ELISpot测定法以刺激HLA匹配的PBMC。在A*02:01测定法中(图10A)，在疾病和健康PBMC中，暴露于肽后IFN-γ分泌上调。然而，每种肽的IFN-γ上调程度存在差异。RLDKVEAEV(SEQ ID NO:113)在INCOV PBMC中诱导最强反应，而对于健康PBMC，KLPDDFTGCV(SEQ ID NO:114)引发最强反应，并且与INCOV样品中看到的其他肽反应相比在更大程度上引发最强反应。KLPDDFTGCV(SEQ ID NO:114)SCT捕获了NP-NACS中最高频率的细胞，但在INCOV样品中产生了显著降低的IFN-g反应，而健康供者产生了相反的结果，这一事实表明该肽可能是免疫原性的，但在疾病状态下可能导致T细胞耗竭。使用另一组肽对B*07:02PBMC进行类似的测定(图10B)。在这里，健康的B*07:02供者PBMC对任何肽的刺激都没有反应，而INCOV PBMC仅在肽刺激下就分泌IFN-γ。然而，预计KLPDDFTGCV(SEQ ID NO:114)不会诱导这些PBMC分泌IFN-γ，因为它是仅与A*02:01HLA等位基因的预测结合物。对INCOV-004样品进行的更深入的HLA分析显示，该参与者的A*02:01也呈阳性，因此预计被该肽激活。然而，INCOV-006不具有A*02:01单倍型。可能是KLPDDFTGCV(SEQ ID NO:114)肽可以由该参与者的其他HLA等位基因呈递。
正如在其他病毒研究中报道的那样，非结构蛋白倾向于优先激活CD8+T细胞。这一发现，如果适用于SARS-CoV-2的情况，将为有针对性的疫苗开发提供高度信息。一个此种目的结构域Nsp3编码木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)，该蛋白酶已在其他冠状病毒株中被鉴定为在感染周期的早期阶段发挥重要作用，加工负责感染和结构病毒元件组装的其他非结构元件。由此，表达Nsp3远早于例如刺突蛋白的结构元件。因此，Nsp3表位也可能比衍生自结构蛋白的表位更早被免疫系统调查。产生了191个Nsp3肽编码的HLA-A*02:01SCT质粒，其中约100个表达到足以进行生物素化和四聚化的程度，并且在NP-NACS中利用前75个表达的SCT来鉴定两名COVID参与者和两名健康对照中的抗原特异性T细胞(图11)。同样，健康和COVID PBMC都显示出对相同表位的反应性。然而，PLpro表位的相对计数远高于刺突蛋白表位。令人惊讶的是，对于一些表位，健康的PBMC给出了同样高的反应。这一发现可能意味着先前已暴露于携带相似表位的冠状病毒株。
SCT能够高通量发现SARS-CoV-2特异性TCR序列：虽然NP-NACS平台允许从原代CD8+T细胞快速鉴定免疫原性抗原，但需要TCR序列用于额外的功能验证。在没有NP-NACS纳米粒子支架所赋予的额外亲合力的情况下，预期四聚体/dextramer结合测定法具有某种固有程度的非特异性结合。这将使得当使用原代CD8+T细胞工作时，抗原特异性的鉴定是困难的，因为原代CD8+T细胞的频率低并且通常细胞质量低。因此，对每位患者首先使用SCT四聚体池对细胞进行原代CD8+T细胞分选(四聚体池由与参与者的HLA单倍型匹配的合成的所有SARS-CoV-2SCT组成)。然后将每一经分选的群体扩增大约两周，以提高数量和存活力。随后通过个体SCT四聚体在它们各自的文库中对细胞进行分选，使得相关的每一分选的TCR克隆型群体可以与靶向抗原相关联。样品的NGS批量测序揭示了大多数患者中针对刺突和PLpro抗原子集的抗原特异性群体(图12)。在21种具有可检测T细胞群体的独特肽中，有8种是在多个患者中发现的。两个患者样品在扩增过程后没有通过批量测序捕获到细胞，这可能是由于在合并的四聚体分选步骤期间收集了低计数的四聚体结合细胞后，非特异性T细胞的存活力差或扩增有偏差。
为了补充批量测序方法，对扩增的T细胞群体进行了单细胞测序，以鉴定可能遗漏的任何普遍存在的克隆型。用DNA标签(hashtag)对扩增的细胞进行染色，以编码患者身份。然后，用一组指定的SCT dextramer对它们进行染色，其中每个SCT dextramer都含有抗原编码的DNA条形码。洗涤过量的dextramer后，将来自多个患者的经染色T细胞组合在一起，并进行10X单细胞测序。为了评估SCT捕获的质量，对dextramer结合频率和异质性进行了定量。首先对10X数据进行分选，以鉴定具有最高频率的同质dextramer结合(仅来自一个独特的dextramer条形码的信号/细胞)的前20个克隆型，包含针对显性dextramer检测到的24个至959个抗原特异性细胞/克隆型的频率范围(图13和表5)。这20个克隆型的dextramer ID可追溯到它们相关的SCT身份，以揭示对A*02:01和B*07:02的六个独特表位的特异性。六个表位中有五个表位衍生自刺突蛋白，一个表位衍生自PLpro。对于每个克隆型，具有异质结合的dextramer(非特异性)的细胞显示出源自与同质结合的细胞相同的SCT的显性dextramer信号(未显示)，但该信号在总的dextramer信号中包含显著较小的部分。这表明扩增步骤、然后是dextramer信号过滤，允许成功地减少由非特异dextramer结合引起的背景噪声。单细胞测序捕获的TCR数据与批量测序捕获的TCR数据的比较揭示了六种TCR克隆型的重叠。这六种克隆型中的五种克隆型，无论是四聚体形式(批量测序)还是dextramer形式(10X单细胞测序)，鉴定的SCT特异性都是一致的。
表5.每个患者样品使用的dextramer
已鉴定的TCR对SARS-CoV-2肽是功能反应性的：为了在功能上验证TCR，根据普遍性对批量方法和10X单细胞方法的测序结果进行分选，并选择86个独特的SARS-CoV-2特异性TCR，用于通过CRISPR/Cas9转导克隆到原代CD8+T细胞中。为了彻底扫描最普遍的克隆型的肽特异性，几个选定的TCR克隆型由检测到双重TCR受体的细胞的a/b对的不同组合组成(例如，TCR 087和092共享相同的TCRβ链)。用相应抗原特异性的SCT四聚体对转导的T细胞进行分选，并扩增至少两周以产生细胞系。在86个TCR序列中，至少13个可以在扩增后特异性结合SCT四聚体(图14)。其他T细胞系缺乏强的四聚体结合可以由以下原因解释：1)衍生自具有双重TCR的细胞的非生产性TCR对；2)来自通过10X或批量方法从PBMC中初始分选的T细胞，收集了背景细胞；3)非生产性T细胞的偏向性扩增。由于单细胞测序方法的精度提高，与批量衍生的TCR序列相比，更大比例的10X衍生的TCR序列是生产性的。
从健康供者获得的TCR 001和TCR 002的初步功能验证表明肽刺激可以诱导CD137表达(图15)。这表明所鉴定的TCR确实能够与生物学pMHC结合并诱导下游激活信号。此外，ELISA、ELISpot和流式细胞术测定法表明，可以诱导肽刺激的T细胞，以释放细胞因子(特别是观察到TNF-α，但没有观察到IFN-γ)和蛋白酶(颗粒酶B)，这是CD8+T细胞在激活时的细胞毒性反应的特征(图15)。
实施例6
CD8抑制突变对SCT功能的影响
将先前报道的阻断CD8与pMHC相互作用的两个突变(D227K和D227K+T2238A)实施到SCT平台中，以产生负载WT1肽(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:1)的A*02:01SCT变体小文库。WT1SCT仅能够表达某些模板变异(图2B和图16A)。随后突变成功导致表达的质粒模板以将D227K或D227K+T228A一起引入所有模板。实施该文库的标准转染四天，该文库包括跨三种CD8相互作用变体(野生型(无HLA突变)、D227K或D227K+T228A)的七个核心模板，并进行SDS-PAGE以表征产量(图16A)。将WT1特异性A*02:01限制性TCR(CD4ba)转导到CD8+或CD4+细胞系中，以评估各HLA突变对它们与CD8共受体相互作用能力的影响。
这些SCT的转染导致每个HLA突变类型的模板依赖性产量。模板D6和D7不包含半胱氨酸修饰的L1接头，并且也不具有D9中所见的口袋稳定化的二硫醇突变，相对于其他模板，一致地给出较低的产量。在非还原SDS-PAGE环境中观察到SCT的双条带模式。因为这种模式仅在实施半胱氨酸接头的模板中观察到，所以认为这是双条带的原因，但预计不会对功能具有任何影响(见图16B的左上小图)。
针对TCR转导的细胞系的四聚体结合测定法显示出每个HLA变体的独特结合模式。当用于对TCR转导的CD8+T细胞染色时，野生型SCT显示出不同程度的与相应TCR的成功结合(图16B和图4)。在该野生型子集中，D3和D9模板显示出显著高的结合功效，捕获了至少90％的所有细胞。当引入D227K或D227K_T228A突变时，出现了所有SCT变体间的TCR结合基本上完全消除(图16B，左中小图和左下小图)，除了D227K_T228A D9变体之外，其仍然显示出某种程度的结合能力。
还测试TCR转导的CD4+T细胞，以观察这些T细胞上CD8的缺失是否仍可能导致被任何SCT变体结合。如图16B的顶行小图所示，与针对CD8+T细胞的结合相比，野生型SCT显示针对CD4+T细胞结合的显著减少，表明这些SCT变体中的大多数依赖于CD8共受体来促进pMHC-TCR亲和力。对于所有含有CD8抑制突变的SCT变体，针对CD8+或CD4+T细胞的结合功效几乎没有变化。
在所有细胞系和HLA突变中，在信号保留超过103MFI阈值方面，D9 SCT模板似乎是最佳结合物。事实上，正如在去除CD8相互作用的所有情况下所看到的那样(通过引入CD8抑制突变或用CD4替换CD8)，D9四聚体仍然能够产生一些超出噪声的信号。D9 SCT对其它肽和其它HLA不非特异性结合(未显示)。因此，将这些结果解释为表明与其他设计相比，D9模板在表位呈递以增强对TCR的亲和力方面可能被改进。
先前已证明另一HLA突变A245V在TCR激活期间减少CD8与pMHC的相互作用。这种突变是在SCT的私有新抗原编码文库中实现的，显示出其显著降低非特异性T细胞结合的背景噪声的能力。针对黑素瘤患者的A*03:01限制性肽产生具有A245V突变的A*03:01SCT(D3模板)。该文库的表达结果(数据未显示)在每个肽编码的SCT相对于其野生型(无A245V突变)变体的表达蛋白条带强度方面匹配，表明该突变对转染细胞的蛋白表达能力没有显著影响。随后，将生物素化的纯化的SCT四聚化，用于针对来自黑素瘤患者的PBMC样品来检测抗原特异性T细胞。四聚体以三个一组的方式用于评估每个流式实验的三种抗原特异性，其中一种抗原特异性是用链亲和素PE四聚化，而另外两种特异性是用链亲和素APC四聚化。以这种方式，双阳性荧光信号的检测指示SCT四聚体的非特异性交叉结合。表现出显著PE信号但不表现出APC信号的细胞将是真正特异性的T细胞。
当在不使用A245V突变的情况下对一组三个SCT进行该实验时(图17A)，观察到显著的交叉结合，强烈将四聚体结合的群体在流式图上歪曲成对角线。然而，当A245V突变实施用于具有相同抗原特异性的SCT时，基本上去除了这种交叉结合的群体。此外，基于PE特异性信号的SLHAHGLSYK(SEQ ID NO:134)特异性T细胞的计数(多边形结合区)增加。这表明，在没有A245V突变的情况下，非特异性结合的细胞压倒性地多过四聚体阳性群体，本质上掩盖了真阳性读数，使其无法被正确检测到。一旦插入A245V突变以抑制CD8相互作用，一些真正的PE特异性群体(存在于图17A中左侧的椭圆形结合区域中)将仅与肽相关的PE四聚体结合，从而增加PE特异性结合计数。
该实验设置另外重复三次(图17B)，每种情况都具有一个用链亲和素PE四聚化的SCT和两个用链亲和素APC四聚化的SCT的独特安排。在所有情况下，当比较野生型SCT与A245V SCT的结合结果时，有两个主要观察结果。首先，总体信号强度降低，使得大多数细胞给出低于103MFI(建立特异性结合的截止阈值)。其次，对于A245V SCT四聚体染色，产生超过103MFI的信号的细胞倾向于只在一个轴上如此，这表明它可能只对所评估的三个SCT四聚体中的一个具有特异性。这与用野生型SCT观察到的情况形成了强烈对比，在野生型SCT中，再一次地类似于图17A，显然存在发生非特异性结合事件以产生歪曲的对角线的强烈倾向。
类似于A*03:01新抗原的SCT文库产生设计，产生含有A245V突变的A*02:01SCT文库(D8设计)以编码各种A*02:01病毒肽和细菌肽。选择这些元素中的四种用于针对从健康A*02:01供者样品获得的PBMC的四聚体结合测定法，其中对于每种测定法，在染色之前将三种病毒肽SCT元件中的一种(用链亲和素PE四聚化)与细菌SCT元件(用链亲和素APC四聚化)混合。病毒SCT编码衍生自EBV、CMV和流感病毒的肽，这些肽已在文献中报道在几乎所有A*02:01个体中具有相应TCR，而细菌SCT编码来自结核分枝杆菌的肽，鉴于该疾病的低流行率，预计对其没有太多反应性。因此，前者元件在染色测定法中基本上用作阳性对照，而后者元件用作阴性对照。
如图18所示，这些A245V SCT的流式细胞术结果显示出与A*03:01A245V SCT(图17B)显著相似的图谱，其中大部分染色信号包含在左下象限内，并且不存在对角线歪曲。这高度提示与野生型SCT相比，非特异性结合强烈减少。此外，对于在本实验中确实产生阳性信号的细胞，在所有三种测定法中，这仅在四聚体PE中观察到，表明仅被设计用于呈递共同病毒表位的四聚体特异性结合。缺乏被结核分枝杆菌抗原SCT四聚体的任何结合与阴性对照结果的预期一致。
实施例7
肽长度对SCT表达的影响
在跨各种模板的SCT表达的初始分析期间(图2)，令人惊讶地发现12mer YML肽能够表达。将HPV E7蛋白的肽序列(YMLDLQPETTDLYC；SEQ ID NO:5)调整为8-14个氨基酸的长度。在反向PCR反应中使用编码这些肽的引物，以将这些密码子插入A*02:01SCT模板的肽区(总共八个设计)。将质粒转染到Expi293细胞中，孵育4天，并通过SDS-PAGE分析测量SCT表达。通过进行热位移测定进一步评估SCT的热稳定性。
所有含有YML 8mer的SCT通常产生最弱的表达(图19)。8mer肽的所有设计模板间的最高表达产量是那些使用没有半胱氨酸接头的模板设计的(D1、D2、D6、D7)。一种假设是，半胱氨酸接头迫使8mer成为HLA结合口袋内的一种不适合稳定和表达的构型。在具有高产量的8mer SCT中，D1变体产生高于D2的表达，表明Y84A突变可能在稳定性上稍差。当添加H74L突变时(D6 vs D7)，这两个模板之间的表达差异适度减少，其中产量看起来相当。
具有9mer至13mer肽的SCT在所有模板中显示出一致的表达水平。与其他肽相比，9mer、10mer、11mer SCT对D1具有相对较差的表达，而9mer对D2的表达相对较差。与8mer类似，当使用半胱氨酸接头模板时，14mer似乎经历了显著降低的表达。对于D3、D4、D5、D8，与相同模板的9-13mer相比，14mer显示出显著更低的表达。然而，对于非半胱氨酸接头模板(D1、D2、D6、D7)，与相同模板的肽相比，14mer在高表达SCT中排名。14mer可能受到半胱氨酸接头存在的限制。通过迫使半胱氨酸接头上游的所有氨基酸装配在C末端口袋围栏之前的结合凹槽中，引入的空间位阻很可能不会使表位保持与凹槽稳定结合。随着肽长度的增加，这个问题变得更加明显，这解释了14mer与其他长度的表达差异。
所有具有半胱氨酸接头的模板在非还原SDS-PAGE中显示出双条带模式。这是一种模板依赖性现象，类似于先前在表达WT1 SCT时观察到的现象。
为了进一步评估这些SCT的稳定性，进行了蛋白质的熔化温度。如图20所示，肽系列的Tm值显示出对SCT模板和肽长度的依赖性。在所有肽中，最稳定的构建体由使用半胱氨酸接头模板的模板组成。没有半胱氨酸突变的模板的熔化温度经历了急剧降低，下降了约6℃。
H74L突变也是提高蛋白质稳定性的另一个重要因素。当比较除了存在该突变之外其他方面相同的模板时(D1 vs.D6,D2 vs.D7,D3 vs.D8)，具有H74L突变的模板通常更稳定。当基于肽长度检查Tm值时，8-mer SCT的稳定性明显下降。超过这个长度后，所有SCT的稳定性都经历了实质的改善，但每个模板对9mer至14mer，Tm没有明显差异，例外的是9mer，对于9mer，D1和D2似乎提供的稳定性略低于D1和D2预期对于10mer或更长聚合体的稳定性。所有模板中最稳定的模板总是D8模板。H74L突变很可能解释了改善的稳定性，因为D3 SCT(不包含H74L突变)总是不如D8稳定。
实施例8
过继性转移细胞疗法
本实施例描述了可用于产生表达抗原特异性T细胞受体的T细胞群体并将细胞施用于受试者的方法。虽然提供了特定的方法，但本领域技术人员将认识到，也可以使用偏离这些特定方法的方法，包括添加或省略一个或多个步骤。
图21示意性地示出了用于鉴定来自受试者(例如患有肿瘤的受试者)的抗原特异性T细胞受体并向受试者施用表达TCR的T细胞群体的示例性方法。提取健康(非肿瘤)组织和肿瘤组织，并通过转录组测序分析来鉴定新抗原以及受试者的HLA单倍型。进行肽-MHC结合亲和力预测以鉴定用于pMHC生成的新抗原的最佳候选肽。然后产生稳定的pMHC并如本文所述四聚化。这些用于捕获抗原特异性T细胞。测序来自捕获的T细胞的TCR并在质粒表达构建体中合成。将它们转化入健康的T细胞，并通过过继细胞疗法方案施用于受试者。在一些实例中，抗原特异性T细胞、转化的T细胞或这两者都来自正在接受治疗的受试者，但在其他实例中，原特异性T细胞、转化的T细胞中的一个或两者可以来自另一受试者。
本公开的实施方案
实施方案1包括核酸片段对，所述核酸片段对包含第一核酸片段和第二核酸片段，所述第一核酸片段和第二核酸片段当组装后编码主要组织相容性复合体(MHC)I类单链三聚体(SCT)蛋白，所述SCT包含作为有效连接的亚单位的肽、β2微球蛋白(β2m)蛋白和人白细胞抗原(HLA)蛋白，并且其中所述第一核酸片段和所述第二核酸片段各自包含β2微球蛋白中的一部分组装位点。
实施方案2包括实施方案1的核酸片段对，其中所述组装位点是Gibson组装位点。
实施方案3包括实施方案1或2的核酸片段对，其中由经组装的核酸片段对编码的MHC I类SCT蛋白包含按以下顺序编码的蛋白亚单位：分泌信号、肽、肽-β2m接头(L1)、β2m、β2m-HLA接头(L2)、HLA，和任选地，一个或多个纯化标签，并且其中所述组装位点位于β2m的不变区域内。
实施方案4包括实施方案3的核酸片段对，其中分泌信号选自HLA分泌信号、干扰素-α2分泌信号和干扰素-γ分泌信号。
实施方案5包括实施方案3或4的核酸片段对，其中所述MHC I类SCT蛋白包含一个或多个纯化标签，并且所述一个或多个纯化标签选自可被生物素化的肽和多聚组氨酸肽。
实施方案6包括实施方案1至5中任一项所述的核酸片段对，其中所述第二核酸片段编码HLA蛋白，所述HLA蛋白包含选自H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V的一个或多个氨基酸替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3。
实施方案7包括实施方案1至6中任一项所述的核酸片段对，其中所述肽是抗原肽、自身肽(self peptide)或占位肽(placeholder peptide)。
实施方案8包括实施方案7所述的核酸片段对，其中所述抗原肽选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
实施方案9包括实施方案1-8中任一项所述的核酸片段对，其中所述核酸片段对是针对哺乳动物表达而密码子优化的。
实施方案10包括核酸分子，所述核酸分子包含实施方案1至9中任一项所述的经组装的核酸片段对，其中所述经组装的核酸片段对包含与第二核酸片段有效连接的第一核酸片段。
实施方案11包括包含实施方案10的核酸分子的载体。
实施方案12包括实施方案11的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体。
实施方案13包括实施方案12的载体，其中所述哺乳动物表达载体是质粒pcDNA3.1。
实施方案14包括用实施方案11至13中任一项所述的载体转化的人细胞系。
实施方案15包括实施方案14的人细胞系，其中所述细胞系是HEK293细胞系。
实施方案16包括实施方案15的人细胞系，其中所述细胞系为Expi293FTM细胞系。
实施方案17包括文库，所述文库包含多个实施方案1至9中任一项所述的核酸片段对。
实施方案18包括文库，所述文库包含多个实施方案17所述的经组装的核酸片段对。
实施方案19包括人糖基化MHC I类单链三聚体(SCT)蛋白。
实施方案20包括实施方案19所述的人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述SCT蛋白是可溶性的。
实施方案21包括实施方案20所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其包含抗原肽、自身肽或占位肽。
实施方案22包括实施方案21的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述抗原肽选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
实施方案23包括实施方案20至22中任一项所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其按N端至C端顺序包含肽、肽-β2微球蛋白(β2m)蛋白接头(L1)、β2m蛋白、β2m-HLA接头(L2)和HLA蛋白。
实施方案24包括实施方案23所述的人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述HLA蛋白包含一个或多个选自H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V的氨基酸替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3。
实施方案25包括实施方案23或24的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其进一步包含一个或多个纯化标签。
实施方案26包括实施方案25的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述一个或多个纯化标签选自可被生物素化的肽和多聚组氨酸肽。
实施方案27包括实施方案20至26中任一项所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述SCT蛋白组装为稳定的多聚体。
实施方案28包括实施方案27的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述稳定的多聚体是四聚体。
实施方案29包括实施方案27或28的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述稳定的多聚体连接到聚合物或纳米粒子支架上。
实施方案30包括文库，所述文库包含实多个施方案20至26中任一项所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白。
实施方案31包括文库，所述文库包含多个实施方案27至29中任一项所述的稳定的多聚体。
实施方案32包括鉴定抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括：
将T细胞群体与实施方案27-29的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的一个或多个稳定的多聚体接触；和
鉴定对其反应的CD8+T细胞。
实施方案33包括实施方案32的方法，其进一步包括：
对鉴定的抗原特异性CD8+T细胞的T细胞受体(TCR)测序；和
产生表达所述抗原特异性TCR的T细胞群体。
实施方案34包括实施方案33的方法，其进一步包括将表达所述抗原特异性TCR的T细胞群体施用于需要其的受试者。
实施方案35包括实施方案34的方法，其中所述受试者患有癌症，并且所述抗原特异性TCR对来自从该受试者获得的肿瘤样品的抗原是反应的。
鉴于本公开的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当认识到所示出的实施方案仅仅是实例，不应当被视为限制本发明的范围。相反地，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求所有落入这些权利要求的范围和精神的内容作为我们的发明。
序列表
<110> Institute for Systems Biology
California Institute of Technology
<120> 单链三聚体MHC Ⅰ类核酸和蛋白质以及使用方法
<130> 9929-105776-02
<150> US 63/185,942
<151> 2021-05-07
<160> 358
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肾母细胞瘤1（WT1）肽
<400> 1
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MART-1肽
<400> 2
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA*02:01 细胞外结构域
<400> 3
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val
260
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 4
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 5
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 6
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 7
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 8
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E7肽
<400> 9
Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MART肽
<400> 10
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成髓细胞素肽
<400> 11
Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LB-ADIR-1F肽
<400> 12
Ser Val Ala Pro Ala Leu Ala Leu Phe Pro Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MTG8b肽
<400> 13
Phe Leu Lys Ala Asn Leu Pro Leu Leu
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxp3肽
<400> 14
Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxp3肽
<400> 15
Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-1/A2肽
<400> 16
Val Leu His Asp Asp Leu Leu Glu Ala
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxp3肽
<400> 17
Val Phe Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核仁磷蛋白肽
<400> 18
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核仁磷蛋白肽
<400> 19
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Val Ala Val
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRAME肽
<400> 20
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NY-ESO-1肽
<400> 21
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1肽
<400> 22
Arg Met Phe Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTLV-1 Tax肽
<400> 23
Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCV肽
<400> 24
Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val
1 5 10
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-BLMF1肽
<400> 25
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-SAg肽
<400> 26
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-BRLF1
<400> 27
Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人多瘤病毒 2肽
<400> 28
Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV肽
<400> 29
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flu-M1肽
<400> 30
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV gag肽
<400> 31
Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV11 六邻体肽
<400> 32
Tyr Leu Leu Phe Glu Val Phe Asp Val
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV11 六邻体肽
<400> 33
Leu Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV11 六邻体肽
<400> 34
Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV BALF4肽
<400> 35
Phe Leu Asp Lys Gly Thr Tyr Thr Leu
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-LMP1-2肽
<400> 36
Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-LMP1-1肽
<400> 37
Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-LMP1-2肽
<400> 38
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-IE1肽
<400> 39
Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV gag肽
<400> 40
Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒NS1肽
<400> 41
Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结核分枝杆菌 Ag85A肽
<400> 42
Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 水痘带状疱疹病毒 IE62 593-601肽
<400> 43
Ala Leu Trp Ala Leu Pro His Ala Ala
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-pp65肽
<400> 44
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲型流感病毒肽
<400> 45
Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe Ile
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-VP3肽
<400> 46
Tyr Leu Leu Pro Gly Trp Lys Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flu-PB1肽
<400> 47
Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-VP1肽
<400> 48
Ser Leu Met Asp Pro Ala Ile Leu Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-VP6肽
<400> 49
Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val
1 5
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-IE1-2肽
<400> 50
Phe Met Asp Ile Leu Thr Thr Cys Val Glu Thr
1 5 10
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-pp65-2肽
<400> 51
Gln Met Trp Gln Ala Arg Leu Thr Val
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-VP2-1肽
<400> 52
Ser Leu Ile Ser Gly Met Trp Leu Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-VP7-1肽
<400> 53
Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-pp65-3肽
<400> 54
Leu Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rota-NSP1肽
<400> 55
Phe Leu Asp Ser Glu Pro His Leu Leu
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素原前体15-24肽
<400> 56
Ala Leu Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV BMRF1肽
<400> 57
Thr Leu Asp Tyr Lys Pro Leu Ser Val
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV-LMP2A肽
<400> 58
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV 11 六邻体 (37-45)肽
<400> 59
Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV 11 六邻体 (696-704)肽
<400> 60
Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AdV 5 六邻体 (37-45)肽
<400> 61
Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV BMLF1 (320-328)肽
<400> 62
Asp Tyr Asn Phe Val Lys Gln Leu Phe
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV BRLF1 (198-206)
<400> 63
Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV EBNA3A (246-254)肽
<400> 64
Arg Tyr Ser Ile Phe Phe Asp Tyr Met
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV EBMA3B (217-225)肽
<400> 65
Thr Tyr Ser Ala Gly Ile Val Gln Ile
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV LMP2 (222-230)肽
<400> 66
Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV LMP2 (131-139)肽
<400> 67
Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV LMP2 (419-427)肽
<400> 68
Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV LMP2 (419-427)肽
<400> 69
Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV核心(117-125)肽
<400> 70
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV pol (756-764)肽
<400> 71
Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCMV pp65 (341-349)肽
<400> 72
Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCV E2 (717-725)肽
<400> 73
Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HHV-6B U54 (267-275)肽
<400> 74
Pro Phe His Cys Ser Phe His Thr Ile
1 5
<210> 75
<400> 75
000
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV env (67-75)肽
<400> 76
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV nef (134-141)肽
<400> 77
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6 (49-57)肽
<400> 78
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTLV-1 Env (43788)肽
<400> 79
Phe Phe Gln Phe Cys Pro Leu Ile Phe
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTLV-1 Tax (43819)肽
<400> 80
Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val Phe
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTLV-1 Tax (187-195)肽
<400> 81
Pro Tyr Lys Arg Ile Glu Glu Leu Leu
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTLV-1 Tax (301-309)肽
<400> 82
Ser Phe His Ser Leu His Leu Leu Phe
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PA (130-138)肽
<400> 83
Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PB1 (216-224)
<400> 84
Ser Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Thr Leu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PB1 (430-438)肽
<400> 85
Arg Tyr Thr Lys Thr Thr Tyr Trp Trp
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PB1 (482-490)肽
<400> 86
Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PB1 (498-505)肽
<400> 87
Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感病毒PB2 (549-557)肽
<400> 88
Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp
1 5
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 89
Cys Ala Thr Val Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 90
Cys Ala Arg Asn Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 91
Cys Val Val Gly Tyr Gly Gln Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 92
Cys Ala Gly Pro Met Lys Thr Ser Tyr Asp Lys Val Ile Phe
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 93
Cys Ala Ala Ser Arg Lys Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 94
Cys Ala Val Arg Trp Gly Gly Lys Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 95
Cys Ala Glu Ile Pro Asn Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 96
Cys Ala Glu Ser Ser Ala Ser Lys Ile Ile Phe
1 5 10
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 97
Cys Ala Val Arg Asp Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe
1 5 10 15
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 98
Cys Ala Val Arg Val Ser Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 99
Cys Ala Val Thr Leu Asn Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 100
Cys Ala Leu Ser Pro Arg Thr Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe
1 5 10 15
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 101
Cys Ala Ser Ser Leu Trp Leu Asn Glu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 102
Cys Ala Ser Ser Pro Lys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 103
Cys Ala Ser Ser Phe Val Ser Phe Asp Glu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 104
Cys Ala Ser Ser Ser Ala Tyr Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 105
Cys Ala Ser Ser Ala Asp Ser Tyr Gly Ala Asn Val Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 106
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 106
Cys Ser Val Asp Pro Gly His Thr Gly Glu Lys Leu Phe Phe
1 5 10
<210> 107
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 107
Cys Ala Ser Ser Leu Val Gly Gly Arg His Gly Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 108
Cys Ala Ser Ser His Asp Pro Thr Trp Gly Pro Gly Asn Thr Ile Tyr
1 5 10 15
Phe
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 109
Cys Ala Ser Ser Phe Gly Gln Gly Ser Ser Pro Leu His Phe
1 5 10
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 110
Cys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Val Asn Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 111
Cys Ala Ser Ser Ser Phe Tyr Asp Ser Asn Glu Lys Leu Phe Phe
1 5 10 15
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 112
Cys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Pro Gly His Phe Thr Gly Glu Leu Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 113
Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
1 5
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 114
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 115
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 116
Phe Cys Leu Glu Ala Ser Phe Asn Tyr Leu
1 5 10
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 117
Met Leu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Val
1 5
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 118
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 119
Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 120
Met Leu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Val
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 121
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 122
Met Leu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Val
1 5
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 123
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 124
Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile
1 5
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 125
Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe
1 5 10
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 126
Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
1 5
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 127
Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 128
Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
1 5 10
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 129
Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 130
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 131
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
1 5
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 132
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 133
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
1 5
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原肽
<400> 134
Ser Leu His Ala His Gly Leu Ser Tyr Lys
1 5 10
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 占位肽
<400> 135
Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu
1 5 10 15
<210> 136
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纯化标签
<400> 136
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 137
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 138
Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 139
Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 140
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GS部分
<400> 141
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 142
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GS部分
<400> 142
Gly Cys Gly Gly Ser
1 5
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GS部分
<400> 143
Gly Gly Cys Gly Ser
1 5
<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GS部分
<400> 144
Gly Cys Gly Ala Ser
1 5
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2 刺突蛋白肽
<400> 145
Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 146
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 147
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
1 5 10
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 148
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly
1 5 10
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 149
Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile
1 5
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 150
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu
1 5 10
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 151
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
1 5
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 152
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 153
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
1 5 10
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 154
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
1 5
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 155
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 156
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 157
Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 158
Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 159
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile
1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 160
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu
1 5 10
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 161
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 162
Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 163
Leu Phe Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 164
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
1 5
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 165
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 166
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met
1 5 10
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 167
Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
1 5 10
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 168
Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala
1 5 10
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 169
Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 170
Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
1 5
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 171
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 172
His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1 5
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 173
Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala
1 5
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 174
Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1 5 10
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 175
Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
1 5
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 176
Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
1 5 10
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 177
Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
1 5 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 178
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu
1 5
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 179
Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu
1 5 10
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 180
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
1 5
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 181
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
1 5 10
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 182
Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val
1 5 10
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 183
Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu
1 5 10
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 184
Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
1 5
<210> 185
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 185
Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser
1 5 10
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 186
Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln
1 5 10
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 187
Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
1 5 10
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 188
Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu
1 5
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 189
Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val
1 5 10
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 190
Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val
1 5
<210> 191
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 191
Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
1 5 10
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 192
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
1 5
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 193
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu
1 5 10
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 194
Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val
1 5 10
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 195
Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val
1 5
<210> 196
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 196
Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe
1 5 10
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-Co-V-2肽
<400> 197
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp
1 5
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AARS-CoV-2肽
<400> 198
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe
1 5 10
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 199
Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe
1 5 10
<210> 200
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 200
Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu
1 5 10
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 201
Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 202
Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
1 5
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 203
Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
1 5 10
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 204
Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 205
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
1 5
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 206
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
1 5 10
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 207
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
1 5 10
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 208
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
1 5
<210> 209
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 209
Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
1 5 10
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 210
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
1 5 10
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 211
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
1 5
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 212
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
1 5 10
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 213
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
1 5 10
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 214
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
1 5 10
<210> 215
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 215
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
1 5 10
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 216
Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln
1 5 10
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 217
Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
1 5
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 218
Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln
1 5 10
<210> 219
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 219
Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
1 5 10
<210> 220
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 220
Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
1 5 10
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 221
Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
1 5
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 222
Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe
1 5 10
<210> 223
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 223
Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe
1 5 10
<210> 224
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 224
Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp
1 5 10
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 225
Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1 5 10
<210> 226
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 226
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1 5 10
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 227
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp
1 5 10
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 228
Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1 5
<210> 229
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 229
Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1 5 10
<210> 230
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 230
Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 231
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 231
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 232
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 232
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile
1 5 10
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 233
Phe Gly Asp Asp Thr Val Ile Glu Val
1 5
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 234
Lys Ser Val Asn Ile Thr Phe Glu Leu
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 235
Tyr Thr Val Glu Leu Gly Thr Glu Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 236
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 237
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 238
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 239
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 240
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 241
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 242
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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Thr Ile Val Glu Val Gln Pro Gln Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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Met Gln Val Glu Ser Asp Asp Tyr Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 247
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 248
Leu Leu Ser Ala Gly Ile Phe Gly Ala Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 250
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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Lys Leu Val Ser Ser Phe Leu Glu Met
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 252
Lys Ile Ala Glu Ile Pro Lys Glu Glu Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 255
Phe Leu Thr Glu Asn Leu Leu Leu Tyr Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 256
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 257
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 259
Phe Leu Lys Lys Asp Ala Pro Tyr Ile Val
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
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<220>
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 269
Leu Leu Thr Leu Gln Gln Ile Glu Leu
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 270
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 271
Tyr Leu Val Gln Gln Glu Ser Pro Phe Val Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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Pro Phe Val Met Met Ser Ala Pro Pro Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 274
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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Gly Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Ala Ala Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 284
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 285
Ser Leu Glu Thr Ile Gln Ile Thr Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 286
Phe Gly Leu Val Ala Glu Trp Phe Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 287
Gly Leu Val Ala Glu Trp Phe Leu Ala
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 288
Gly Leu Val Ala Glu Trp Phe Leu Ala Tyr Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 289
Tyr Ile Leu Phe Thr Arg Phe Phe Tyr Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 290
Met Gln Leu Phe Phe Ser Tyr Phe Ala Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 291
Met Gln Leu Phe Phe Ser Tyr Phe Ala
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 292
Leu Val Gln Met Ala Pro Ile Ser Ala Met Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 293
Val Gln Met Ala Pro Ile Ser Ala Met Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 294
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1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 295
Tyr Val Trp Lys Ser Tyr Val His Val Val
1 5 10
<210> 296
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 296
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 297
Gln Leu Met Cys Gln Pro Ile Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 298
Gln Leu Met Cys Gln Pro Ile Leu Leu Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 299
Leu Met Cys Gln Pro Ile Leu Leu Leu
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 300
Ile Leu Leu Leu Asp Gln Ala Leu Val
1 5
<210> 301
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 301
Leu Leu Leu Asp Gln Ala Leu Val Ser Asp Val
1 5 10
<210> 302
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 302
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Val Ser Asp Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 303
Lys Met Phe Asp Ala Tyr Val Asn Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 304
Tyr Val Asn Thr Phe Ser Ser Thr Phe Asn Val
1 5 10
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 305
Asn Thr Phe Ser Ser Thr Phe Asn Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 306
Ser Leu Asp Asn Val Leu Ser Thr Phe Ile
1 5 10
<210> 307
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 307
Lys Leu Ser His Gln Ser Asp Ile Glu Val
1 5 10
<210> 308
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 308
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1 5 10
<210> 309
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 309
Cys Ala Val Ser Asp Asp Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 310
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 310
Cys Ala Val Gln Ala Ala Arg Glu Tyr Asn Phe Asn Lys Phe Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 311
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 311
Cys Leu Val Asp Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 312
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 312
Cys Ala Ala Gln Ser Asn Met Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe
1 5 10 15
<210> 313
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 313
Cys Ala Val Asn Ala Asp Arg Asp Asp Lys Ile Ile Phe
1 5 10
<210> 314
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 314
Cys Ala Gly His Pro Lys Thr Ser Tyr Asp Lys Val Ile Phe
1 5 10
<210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 315
Cys Ala Leu Lys Thr Ile Lys Ala Ala Gly Asn Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 316
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 316
Cys Val Val Arg Asp Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 317
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 317
Cys Ala Ala Ser Asp Asp Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe
1 5 10
<210> 318
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 318
Cys Ala Val Leu Asn Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 319
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 319
Cys Ala Gly Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe
1 5 10
<210> 320
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 320
Cys Ala Ala Ser Ala Gly Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe
1 5 10
<210> 321
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 321
Cys Ala Val Ser Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe
1 5 10
<210> 322
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 322
Cys Ala Phe Ser Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe
1 5 10
<210> 323
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 323
Cys Ala Pro Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 324
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 324
Cys Ala Gly Leu Asn Gln Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe
1 5 10
<210> 325
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 325
Cys Ala Phe Met Glu Val Glu Gly Val Met Asn Arg Asp Asp Lys Ile
1 5 10 15
Ile Phe
<210> 326
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 326
Cys Ala Gly Pro Ile Gly Thr Ser Tyr Asp Lys Val Ile Phe
1 5 10
<210> 327
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 α肽
<400> 327
Cys Ala Phe Met Lys Leu Trp Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 328
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 328
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Glu Pro Gln His Phe
1 5 10
<210> 329
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 329
Cys Ala Ser Gly Gln Gly Gly Gly Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 330
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 330
Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Asp Arg Val Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10 15
<210> 331
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 331
Cys Ala Ser Ser Leu Arg Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 332
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 332
Cys Ala Ser Ser Ser Pro Asp Arg Gly Gly Arg Asn Glu Lys Leu Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 333
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 333
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Thr Ser Gly Gly Ala Pro Glu Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Phe
<210> 334
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 334
Cys Ser Ala Arg Asp Pro Gly Leu Glu Gln Asn Ile Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 335
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 335
Cys Ala Ser Ser Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gly Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 336
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 336
Cys Ala Thr Phe Thr Gly Asn Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 337
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 337
Cys Ala Ser Ser Pro Asp Asp Arg Glu Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 338
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 338
Cys Ala Ser Ile Arg Leu Ala Gly Ser Pro Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 339
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 339
Cys Ala Ser Ser Ser Gly Leu Ala Gly Arg Trp Ala Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 340
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 340
Cys Ala Thr Glu Ala Phe Phe
1 5
<210> 341
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 341
Cys Ala Ser Ser Pro Asp Gly Gly Asn Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 342
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 342
Cys Ala Ser Ser Leu Val Leu Asn Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 343
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 343
Cys Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Gly Glu Glu Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 344
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 344
Cys Ala Ser Ser Pro Asp Asp Arg Glu Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 345
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 345
Cys Ala Ser Ser Leu Glu Gly Trp Asp Leu Pro Leu His Phe
1 5 10
<210> 346
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 346
Cys Ala Ser Ser Ser Ala His Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 347
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3 β肽
<400> 347
Cys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Glu Lys Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 348
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原肽
<400> 348
Arg Leu Phe Pro Tyr Ala Leu His Lys
1 5
<210> 349
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原肽
<400> 349
Ala Leu Leu Pro Pro Pro Pro Leu Ala Lys
1 5 10
<210> 350
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原肽
<400> 350
Lys Ile Tyr Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys
1 5 10
<210> 351
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原肽
<400> 351
Leu Leu Phe Lys Ala Gly Glu Met Arg Lys
1 5 10
<210> 352
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原肽
<400> 352
Arg Leu Phe Ser Ala Leu Asn Ser His Lys
1 5 10
<210> 353
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结核分枝杆菌肽
<400> 353
Gly Ile Leu Thr Val Ser Val Ala Val
1 5
<210> 354
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YML肽
<400> 354
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 355
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YML肽
<400> 355
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp
1 5 10
<210> 356
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YML肽
<400> 356
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr
1 5 10
<210> 357
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARC-CoV-2肽
<400> 357
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2肽
<400> 358
Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser
1 5 10

Claims (35)

1.一种核酸片段对，所述核酸片段对包含第一核酸片段和第二核酸片段，所述第一核酸片段和第二核酸片段当组装后编码主要组织相容性复合体(MHC)I类单链三聚体(SCT)蛋白，所述SCT包含作为有效连接的亚单位的肽、β2微球蛋白(β2m)和人白细胞抗原(HLA)蛋白，并且其中所述第一核酸片段和所述第二核酸片段各自包含β2微球蛋白中的一部分组装位点。
2.根据权利要求1所述的核酸片段对，其中所述组装位点是Gibson组装位点。
3.根据权利要求1所述的核酸片段对，其中由经组装的核酸片段对编码的MHC I类SCT蛋白包含按以下顺序编码的蛋白亚单位：分泌信号、肽、肽-β2m接头(L1)、β2m、β2m-HLA接头(L2)、HLA，和任选地，一个或多个纯化标签，并且其中所述组装位点位于β2m的不变区域内。
4.根据权利要求3所述的核酸片段对，其中所述分泌信号选自HLA分泌信号、干扰素-α2分泌信号和干扰素-γ分泌信号。
5.根据权利要求3所述的核酸片段对，其中所述MHC I类SCT蛋白包含一个或多个纯化标签，并且所述一个或多个纯化标签选自可被生物素化的肽和多聚组氨酸肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸片段对，其中所述第二核酸片段编码HLA蛋白，所述HLA蛋白包含选自由H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V构成的组的一个或多个氨基酸替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸片段对，其中所述肽是抗原肽、自身肽或占位肽。
8.根据权利要求7所述的核酸片段对，其中所述抗原肽选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸片段对，其中所述核酸片段对是针对哺乳动物表达而密码子优化的。
10.一种核酸分子，所述核酸分子包含权利要求1至5中任一项所述的经组装的核酸片段对，其中所述经组装的核酸片段对包含与第二核酸片段有效连接的第一核酸片段。
11.一种载体，其包含权利要求10的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述哺乳动物表达载体是质粒pcDNA3.1。
14.用权利要求11的载体转化的人细胞系。
15.根据权利要求14所述的人细胞系，其中所述细胞系是HEK293细胞系。
16.根据权利要求15所述的人细胞系，其中所述细胞系是Expi293FTM细胞系。
17.一种文库，所述文库包含多个权利要求1至5中任一项所述的核酸片段对。
18.一种文库，所述文库包含多个权利要求17所述的经组装的核酸片段对。
19.人糖基化MHC I类单链三聚体(SCT)蛋白。
20.根据权利要求19所述的人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述SCT蛋白是可溶性的。
21.根据权利要求20所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其包含抗原肽、自身肽或占位肽。
22.根据权利要求21所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述抗原肽选自肿瘤相关肽、新抗原肽、自身免疫肽、真菌肽、细菌肽和病毒肽。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其按N端至C端顺序包含肽、肽-β2微球蛋白(β2m)蛋白接头(L1)、β2m蛋白、β2m-HLA接头(L2)和HLA蛋白。
24.权利要求23所述的人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述HLA蛋白包含一个或多个选自由H74L、D74L、Y84C、Y84A、A139C、D227K、T228A和A245V构成的组的氨基酸替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3。
25.根据权利要求23所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其进一步包含一个或多个纯化标签。
26.根据权利要求25所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述一个或多个纯化标签选自可被生物素化的肽和多聚组氨酸肽。
27.根据权利要求20至22中任一项所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述SCT蛋白被组装为稳定的多聚体。
28.根据权利要求27所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述稳定的多聚体是四聚体。
29.根据权利要求27所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白，其中所述稳定的多聚体连接到聚合物或纳米粒子支架上。
30.一种文库，所述文库包含多个权利要求20至22中任一项所述的可溶性人糖基化MHCI类SCT蛋白。
31.一种文库，所述文库包含多个权利要求27所述的稳定的多聚体。
32.一种鉴定抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括：
将T细胞群体与一个或多个权利要求27所述的可溶性人糖基化MHC I类SCT蛋白的稳定的多聚体接触；和
鉴定对其反应的CD8+T细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括：
对鉴定的抗原特异性CD8+T细胞的T细胞受体(TCR)测序；和
产生表达所述抗原特异性TCR的T细胞群体。
34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括将表达所述抗原特异性TCR的T细胞群体施用于需要其的受试者。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者患有癌症，并且所述抗原特异性TCR对来自从该受试者获得的肿瘤样品的抗原是反应性的。
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