JP2024519500A - 単鎖三量体ｍｈｃクラスｉ核酸およびタンパク質ならびに使用方法 - Google Patents

Abstract

ペプチド主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ核酸およびタンパク質が提供される。例えば、抗原特異的Ｔ細胞を同定する方法および養子細胞療法におけるそれらの使用方法も提供される。本開示は、アセンブリされると、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質をコードする第１の核酸断片および第２の核酸断片を含む核酸断片対を提供し、ＳＣＴは、作動可能に連結されたサブユニットとして、ペプチド、β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖タンパク質を含み、第１の核酸断片および第２の核酸断片は各々、β２ミクログロブリンタンパク質のアセンブリ部位の一部を含み得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年５月７日に出願された米国仮出願第６３／１８５，９４２号に基づく利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本開示は、ペプチド主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ核酸およびタンパク質、ならびに例えば養子細胞療法の方法におけるそれらの使用方法に関する。

政府支援の承認
本発明は、米国保健福祉省の機関であるＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙによって授与された契約番号ＨＨＳＯ１００２０１６００３１Ｃの下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

背景
新規の病原性ウイルス株の出現（およびそのような事象の予測される加速）により、エピトープベースの試薬生産へのハイスループットアプローチの必要性が高まっている。特に、抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するためのペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）試薬の使用は、関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列の同定を可能にし得、宿主免疫応答において免疫優性エピトープによって果たされる役割を明らかにすることができる。この目的のために、ワクチン療法は、最も顕著な免疫原性ウイルスペプチドを予測および同定するためのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプおよびＨＬＡベースのエピトープランドスケープの評価を伴わなければならない。ＨＬＡ対立遺伝子当たりの適合性エピトープの数は、所望の包含範囲、各ＨＬＡ対立遺伝子のペプチドモチーフへの結合ポケットの天然の受容性、および既存のペプチド結合予測アルゴリズムの精度に基づいて、ほんの一握りから数百または数千にまで及んで、非常に異なる可能性がある。この規模に対応するために、可溶性ｐＭＨＣ試薬は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの免疫応答性ＴＣＲを同定およびランク付けするために、ハイスループット様式でペプチドごと、ＨＬＡごとに生産されなければならない。可溶性ｐＭＨＣは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）内でＭＨＣのサブユニットを個々に発現させた後、標的ペプチドの存在下でＨＬＡ重鎖およびβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）サブユニット封入体をインビトロでリフォールディングすることによって産生される。リフォールディングされたｐＭＨＣ複合体を産生するための改良型では、反応中にＵＶ切断可能ペプチドが使用される。このペプチドはプレースホルダーとして機能し、ＵＶ光曝露が切断可能ペプチドの標的ペプチドへの交換を促進するＵＶ交換ｐＭＨＣ（ＵＶ－ｐＭＨＣ）の迅速な産生を可能にする。しかしながら、リフォールディングされたｐＭＨＣおよびＵＶ－ｐＭＨＣの産生は、いくつかの技術的問題を生じやすい。リフォールディングからの全体的なタンパク質収率はＨＬＡ依存性であり、ＵＶ交換の成功は個々のペプチドの化学的・物理的特性に大きく依存する。

単鎖三量体（ＳＣＴ）は、リフォールディングおよびＵＶ交換によって提起される問題に対処し得るｐＭＨＣを構築するための代替的なアプローチである。簡潔には、ＳＣＴフォーマットは、ペプチド、β２ｍおよびＨＬＡを含むコンストラクトからなる。連結して単鎖を与えるこれらの３つの主要単位は、単一のタンパク質単位として分泌される。最初に細菌細胞で発現されるＳＣＴは、哺乳動物発現系に採用されている。

要旨
複数のペプチドからの、複数のＴＣＲの迅速な発見のために使用することができるＭＨＣクラスＩ ＳＣＴおよびアッセイ、例えばハイスループットアッセイが本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、本開示は、アセンブリされると、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質をコードする第１の核酸断片および第２の核酸断片を含む核酸断片対を提供し、ＳＣＴは、作動可能に連結されたサブユニットとして、ペプチド、β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖タンパク質を含み、第１の核酸断片および第２の核酸断片は各々、β２ミクログロブリンタンパク質のアセンブリ部位の一部を含む。いくつかの例では、アセンブリ部位はギブソンアセンブリ部位である。

いくつかの実施形態では、核酸断片は、アセンブリされると、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端）でタンパク質サブユニットをコードする：分泌シグナル、ペプチド、ペプチド－β２ｍリンカー（Ｌ１）、β２ｍ、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、ＨＬＡ重鎖、および必要に応じて１つまたはそれを超える精製タグであって、アセンブリ部位がβ２ｍの不変領域内に位置決めされているもの。いくつかの例では、分泌シグナルは、ＨＬＡ分泌シグナル、インターフェロン－α２分泌シグナル、およびインターフェロン－γ分泌シグナルから選択される。

いくつかの例では、核酸断片対はまた、１つまたはそれを超える精製タグをコードする。特定の例では、１つまたはそれを超える精製タグは、ビオチン化可能なペプチド（例えば、配列番号１３６）およびポリヒスチジンペプチドから選択される。

いくつかの例では、核酸断片対は、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖ（配列番号３に対応するナンバリング）からなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むＨＬＡタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、核酸断片対によってコードされるペプチドは、抗原ペプチド、自己ペプチド、またはプレースホルダーペプチド（例えば、配列番号１３５）である。抗原ペプチドは、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択され得る。

いくつかの実施形態では、核酸断片対は、ヒト細胞における発現などの哺乳動物発現のためにコドン最適化されている。

開示されるアセンブリされた核酸断片対を含む核酸分子も提供される。アセンブリされた核酸断片対は、第２の核酸断片に作動可能に連結された第１の核酸断片を含む。更なる実施形態では、アセンブリされた核酸は、哺乳動物発現ベクターなどのベクターに含まれる。一例では、哺乳動物発現ベクターはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１である。

本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されるアセンブリされた核酸分子を含むベクターで形質転換されたヒト細胞株である。一例では、ヒト細胞株は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞などのＨＥＫ２９３細胞株である。

複数の開示された核酸断片対または複数のアセンブリされた核酸断片対を含むライブラリも提供される。

本明細書に開示されるのは、ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質である。いくつかの例では、ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は可溶性である。

いくつかの実施形態では、ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、抗原ペプチド、自己ペプチド、またはプレースホルダーペプチドなどのペプチドを含む。一例では、プレースホルダーペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。抗原ペプチドは、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択され得る。

いくつかの実施形態では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ペプチド、ペプチド－β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質リンカー（Ｌ１）、β２ｍタンパク質、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、およびＨＬＡ重鎖タンパク質を含む。いくつかの例では、ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖからなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むＨＬＡタンパク質を含む。他の例では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質はまた、１つまたはそれを超える精製タグを含む。特定の例では、精製タグは、ビオチン化可能なペプチド（例えば、配列番号１３６）である。他の例では、精製タグはポリヒスチジンペプチドである。

いくつかの実施形態では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、安定な多量体、例えば安定な四量体としてアセンブリされる。更なる実施形態では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、表面、ポリマー（例えばビーズ）、またはナノ粒子足場に結合している

複数の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含むライブラリ、または可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の複数の安定な多量体を含むライブラリも提供される。

抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定する方法がさらに開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｔ細胞集団を開示される可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の１つまたはそれを超えるもの（例えば可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の１つまたはそれを超える安定な多量体）と接触させることと、それに対して反応性のＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定することとを含む。いくつかの例では、本方法はさらに、例えば、ＴＣＲを配列決定することによって、同定された抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の同一性を決定することと、同定されたＴＣＲを発現するＴ細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）の集団を産生することとを含む。

いくつかの実施形態では、本方法はまた、抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を、その投与を必要とする対象に投与するステップを含む。いくつかの例では、対象は癌（例えば腫瘍）を有し、ＴＣＲは対象から得られた腫瘍サンプルからの抗原に対して反応性である。

本開示の上記および他の特徴は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

図１Ａ～図１Ｃは、クラスＩ ｐＭＨＣコンストラクトのＳＣＴ設計を示す。図１Ａは、ペプチド挿入のためのテンプレートプラスミドを設計するための任意の所望のクラスＩ ＨＬＡサブユニットのモジュール式挿入を可能にする、２つの断片からのギブソンアセンブリによって構築されたクラスＩ ｐＭＨＣ分子をコードするＳＣＴを示す。図１Ｂは、制限消化およびライゲーションによってテンプレートＳＣＴコンストラクトをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲーションすることを示す。図１Ｃは、様々なペプチドエレメントを含有するＳＣＴライブラリが、逆ＰＣＲおよびライゲーションによって初期テンプレートプラスミドから構築され得ることを示す。

図２Ａ～図２Ｃは、ＳＣＴの設計および試験を示す。図２Ａは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＳＣＴ（ＲＤＢ ＩＤ：６ＡＰＮ）の結晶構造を示す軸方向図である。強調された関心領域：Ｈ７４、Ｙ８４、Ａ１３９、Ｌ１リンカーの最初の３つのアミノ酸。ペプチドは、Ｎ－Ｃ方向（左から右）にポケット内に負荷される。図２Ｂは、試験した９つのＳＣＴテンプレートの各々についてのＬ１ ＧＳ部分（ＧＧＧＧＳ；配列番号１４１；ＧＣＧＧＳ、配列番号１４２；ＧＧＣＧＳ、配列番号１４３；またはＧＣＧＡＳ、配列番号１４４）およびＨＬＡアミノ酸修飾の要約である。ヒートマップ：テンプレート（行）およびペプチド（列）によって指定されるような、各ＳＣＴの組み合わせの相対的発現。設計テンプレートＤ９を使用して構築された１８個のＳＣＴの縮小ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（下）によって例示されるように、タンパク質バンド強度の自動測定によって相対的発現を定量化する。ペプチドは、配列番号６～２０、２２、２１および２（左から右）に対応する。ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）ＳＣＴの予め発現させ、精製したアリコートを、バンド強度定量化のための陽性対照（＋）として使用した。図２Ｃは、ＳＣＴの熱シフトアッセイ測定値を示す。９つのＳＣＴテンプレートを使用して設計された２つのペプチドのＴ_ｍ測定値を示す（左）。それらのＴ_ｍ値を散布図（右）にプロットして、テンプレートおよびペプチドに基づく安定性の相対的変化を示す。ペプチドは、配列番号６～２０、２２、２１および２（左から右）に対応する。個々の熱シフト曲線（左）は、生物学的三連測定の代表的なものであり、個々のＴ_ｍはすべてプロットされている（右）。 図２Ａ～図２Ｃは、ＳＣＴの設計および試験を示す。図２Ａは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＳＣＴ（ＲＤＢ ＩＤ：６ＡＰＮ）の結晶構造を示す軸方向図である。強調された関心領域：Ｈ７４、Ｙ８４、Ａ１３９、Ｌ１リンカーの最初の３つのアミノ酸。ペプチドは、Ｎ－Ｃ方向（左から右）にポケット内に負荷される。図２Ｂは、試験した９つのＳＣＴテンプレートの各々についてのＬ１ ＧＳ部分（ＧＧＧＧＳ；配列番号１４１；ＧＣＧＧＳ、配列番号１４２；ＧＧＣＧＳ、配列番号１４３；またはＧＣＧＡＳ、配列番号１４４）およびＨＬＡアミノ酸修飾の要約である。ヒートマップ：テンプレート（行）およびペプチド（列）によって指定されるような、各ＳＣＴの組み合わせの相対的発現。設計テンプレートＤ９を使用して構築された１８個のＳＣＴの縮小ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（下）によって例示されるように、タンパク質バンド強度の自動測定によって相対的発現を定量化する。ペプチドは、配列番号６～２０、２２、２１および２（左から右）に対応する。ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）ＳＣＴの予め発現させ、精製したアリコートを、バンド強度定量化のための陽性対照（＋）として使用した。図２Ｃは、ＳＣＴの熱シフトアッセイ測定値を示す。９つのＳＣＴテンプレートを使用して設計された２つのペプチドのＴ_ｍ測定値を示す（左）。それらのＴ_ｍ値を散布図（右）にプロットして、テンプレートおよびペプチドに基づく安定性の相対的変化を示す。ペプチドは、配列番号６～２０、２２、２１および２（左から右）に対応する。個々の熱シフト曲線（左）は、生物学的三連測定の代表的なものであり、個々のＴ_ｍはすべてプロットされている（右）。

図３Ａおよび図３Ｂは、ＳＣＴトランスフェクション効率が均一であり、発現がペプチド依存性であることを示す。図３Ａは、トランスフェクションの４日後に生存率およびＧＦＰ蛍光について測定された、ＩＲＥＳ－ＧＦＰ指示薬を含むまたは含まない１５個の異なるペプチドエレメント（ｘ軸）からなるＳＣＴライブラリでトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞のグラフである。図３Ｂは、同じプラスミドライブラリエレメントを使用してトランスフェクション後に行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるＳＣＴタンパク質バンド強度の測定を示すグラフである。陰性対照（「空」）は、ＳＣＴプラスミドを除くすべての標準化試薬でトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞からなる。両方のパネルについて、ペプチドは、配列番号６、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２および２１（左から右）に対応する。

図４は、ＷＴ１ ＳＣＴ－ＴＣＲ捕捉を最適化するためのフローサイトメトリーアッセイを示す図である。図２Ｂに示される６つのテンプレート設計の各々に従って構築されたＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）ＳＣＴをＭＡＲＴ－１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号２）ＳＣＴ（Ｄ３テンプレート）と対にして、Ｃ４ ＴＣＲ形質導入初代Ｔ細胞とＭＡＲＴ－１Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞との９５／５混合物において、それらの同族ＴＣＲ形質導入細胞を同定した。各プロットの右上の数字は、アッセイにおいてＷＴ１ ＳＣＴに使用されるＳＣＴテンプレートを示す。パーセンテージは、６つのＷＴ１ ＳＣＴ設計の各々によってＷＴ１ ＳＣＴ陽性象限で捕捉された全総細胞集団の割合を示す。

図５は、示されたペプチド要素（表２および３のナンバリング）の各々についてのＳＣＴ発現を示す一連のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

図６は、ＣＭＶ ｐＭＨＣ試薬の機能比較を示す。左：ＳＣＴまたはリフォールディング形式を使用して調製した四量体のフローサイトメトリーアッセイ。右：四量体陽性細胞の１０倍単一細胞シーケンシングによって同定されたユニークなクローン型を示す円グラフ。ＣＤＲ３α／β配列が表４に示されており、最も大きい画分から始まって反時計回りに進む順序である。円グラフのオフセットウェッジは、ＣＭＶ特異的ＣＤＲ３α鎖およびＣＤＲ３β鎖の完全一致（ＬＤ＝０）を示す公開された対に対応する。ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ：配列番号：４４。

図７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質由来のペプチドプールで刺激したＣＯＶＩＤ－１９参加者および健常ドナーのＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示す。

図８Ａ～図８Ｄは、Ａ＊０２：０１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質エピトープに対するＳＣＴの発現を示す。図８Ａは、スパイクタンパク質ドメインの概略図である。Ｓ：シグナル配列；ＮＴＤ：Ｎ末端ドメイン；ＲＢＤ：受容体結合ドメイン；ＦＰ：融合ペプチド；ＨＲ１：ヘプタッドリピート１；ＣＨ：セントラルヘリックス；ＣＤ：コネクタドメイン；ＨＲ２：５ヘプタッドリピート２；ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＣＴ：細胞質尾部；Ｓ１およびＳ２で示されるサブユニット。影付きのボックスは、相対的な位置およびＳＣＴタンパク質の発現収率を示す。ペプチドＩＤ番号は、予測された結合親和性の降順にインデックス付けされる。図８Ｂは、図８ＡからのスパイクエピトープＳＣＴのサブセットの還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン番号はペプチドＩＤを示し、ドメインが一致した背景色を有する。＋：精製されたＷＴ１ ＳＣＴ。図８Ｃは、相対的なＳＣＴ収率（ＷＴ１ ＳＣＴレーンに対して定量化）と、図８Ｂのサブセットからの各ペプチドについての予測された親和性とを比較する棒グラフを示す。図８Ｄは、スパイクモノマーの結晶構造を示す。ドメインの色は、図８Ａの領域の色と一致する；白色のＳ１およびＳ２サブユニット骨格。赤色の図８Ａの３０ Ａ＊０２：０１試験エピトープを含有するアミノ酸。

図９Ａ～図９Ｃは、ＮＰ－ＮＡＣＳを介したＣＯＶＩＤ－１９参加者からのスパイクタンパク質特異的Ｔ細胞集団を示す。ペプチドは、スパイクタンパク質上の位置に従ってプロットされ、破線はドメインマップに沿った位置を指す。各プロットにおいて、カウントは２名のＣＯＶＩＤ－１９参加者および１名のＨＬＡ一致ドナーサンプル（上：Ａ＊０２：０１、中：Ｂ＊０７：０２、下：Ａ＊２４：０２）からのものである。図９Ａ、配列番号１４５～１７４；図９Ｂ、配列番号１７５～１９６；図９Ｃ 配列番号１９７～２３２。 図９Ａ～図９Ｃは、ＮＰ－ＮＡＣＳを介したＣＯＶＩＤ－１９参加者からのスパイクタンパク質特異的Ｔ細胞集団を示す。ペプチドは、スパイクタンパク質上の位置に従ってプロットされ、破線はドメインマップに沿った位置を指す。各プロットにおいて、カウントは２名のＣＯＶＩＤ－１９参加者および１名のＨＬＡ一致ドナーサンプル（上：Ａ＊０２：０１、中：Ｂ＊０７：０２、下：Ａ＊２４：０２）からのものである。図９Ａ、配列番号１４５～１７４；図９Ｂ、配列番号１７５～１９６；図９Ｃ 配列番号１９７～２３２。 図９Ａ～図９Ｃは、ＮＰ－ＮＡＣＳを介したＣＯＶＩＤ－１９参加者からのスパイクタンパク質特異的Ｔ細胞集団を示す。ペプチドは、スパイクタンパク質上の位置に従ってプロットされ、破線はドメインマップに沿った位置を指す。各プロットにおいて、カウントは２名のＣＯＶＩＤ－１９参加者および１名のＨＬＡ一致ドナーサンプル（上：Ａ＊０２：０１、中：Ｂ＊０７：０２、下：Ａ＊２４：０２）からのものである。図９Ａ、配列番号１４５～１７４；図９Ｂ、配列番号１７５～１９６；図９Ｃ 配列番号１９７～２３２。

図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクエピトープがＨＬＡ一致ＰＢＭＣにおいてサイトカイン分泌を誘導することを示す。ＮＰ－ＮＡＣＳアッセイから免疫原性であると同定されたペプチドを合成し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（図１０Ａ）およびＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２（図１０Ｂ）についてＩｎＣｏＶ参加者および健常ドナーからのＨＬＡ適合ＰＢＭＣを刺激するために使用した。ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号：１１４）、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ（配列番号：１１３）、ＳＩＩＡＹＴＭＳＬ（配列番号：１８８）、ＭＩＡＱＹＴＳＡＬ（配列番号：１９２）。

図１１は、ＮＰ－ＮＡＣＳを介したＡ＊０２：０１ＣＯＶＩＤ－１９参加者からのＰＬｐｒｏ特異的Ｔ細胞集団のプロットである。ペプチドを、ｎｓｐ３タンパク質上の相対位置に従ってｘ軸に沿ってプロットし、ｎｓｐ３サブユニットによって色分けする（ＵＢＬ：ユビキチン様ドメイン、Ａｃ：Ｇｌｕリッチ酸性ドメイン、ＡＤＲＰ：ＡＤＰ－リボース－１’－ホスファターゼドメイン、ＳＵＤ：ＳＡＲＳ固有ドメイン、ＰＬｐｒｏ：パパイン様プロテアーゼ、ＮＡＢ：核酸結合ドメイン、Ｇ２Ｍ：マーカードメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＺＦ：ジンクフィンガードメイン、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３：ＰＬｐｒｏ切断部位に先行するＹドメイン）。ペプチドは、配列番号２３３～３０７（左から右）である。

図１２～図１２Ｃは、３つのＨＬＡ対立遺伝子（上部、Ａ＊０２：０１；中央、Ｂ＊０７：０２；下部、Ａ＊２４：０２）のＣＯＶＩＤ－１９参加者について増殖Ｔ細胞からの個々の四量体選別によって同定された抗原特異的Ｔ細胞集団の頻度（ｙ軸）を示す。図１２Ａ、配列番号１４６～１４９、１５１～１５２、１５５～１６６、１６８、１７０～１７４および３５７；図１２Ｂ、配列番号１７５～１８８、１９０～１９６および３５８；図１２Ｃ、配列番号１９７～２３２。 図１２～図１２Ｃは、３つのＨＬＡ対立遺伝子（上部、Ａ＊０２：０１；中央、Ｂ＊０７：０２；下部、Ａ＊２４：０２）のＣＯＶＩＤ－１９参加者について増殖Ｔ細胞からの個々の四量体選別によって同定された抗原特異的Ｔ細胞集団の頻度（ｙ軸）を示す。図１２Ａ、配列番号１４６～１４９、１５１～１５２、１５５～１６６、１６８、１７０～１７４および３５７；図１２Ｂ、配列番号１７５～１８８、１９０～１９６および３５８；図１２Ｃ、配列番号１９７～２３２。 図１２～図１２Ｃは、３つのＨＬＡ対立遺伝子（上部、Ａ＊０２：０１；中央、Ｂ＊０７：０２；下部、Ａ＊２４：０２）のＣＯＶＩＤ－１９参加者について増殖Ｔ細胞からの個々の四量体選別によって同定された抗原特異的Ｔ細胞集団の頻度（ｙ軸）を示す。図１２Ａ、配列番号１４６～１４９、１５１～１５２、１５５～１６６、１６８、１７０～１７４および３５７；図１２Ｂ、配列番号１７５～１８８、１９０～１９６および３５８；図１２Ｃ、配列番号１９７～２３２。

図１３は、ＣＯＶＩＤ－１９参加者について増殖Ｔ細胞からの多重化デキストラマー選別によって同定された、上位２０個の最も一般的な検出されたクローン型の中の抗原特異的Ｔ細胞集団の頻度を示す。「デキストラマー」は、表５に示されるデキストラマーのＩＤを指す。ＣＤＲ３α配列は配列番号３０８～３２７（左から右）であり、ＣＤＲ３β配列は配列番号３２８～３４７（左から右）である。

図１４は、形質導入されたＴＣＲがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に特異的であることを示す。健常ドナーまたはＣＯＶＩＤ－１９参加者に由来するＴ細胞から１０倍またはバルクシーケンシング法によって得られたＴＣＲをＨＬＡ一致ＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入し、ＳＣＴ四量体結合後に選択的に増殖させて細胞株を生成した。増殖した細胞の四量体結合の結果をここに示し、細胞株のＳＣＴ特異性および純度を実証する。

図１５は、１６時間の一晩のペプチド刺激後に機能的に評価された、それぞれペプチド１および２に対応するＴＣＲ００１および００２で形質導入されたＴ細胞を示す。上部：サイトカイン放出を測定するＥＬＩＳＡアッセイ。中央：グランザイムＢ発現を有する細胞を計数するＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。下部：活性化細胞（ＣＤ１３７＋）および細胞傷害性細胞（グランザイムＢ＋）のパーセンテージを測定するフローサイトメトリーアッセイ。ペプチド１：配列番号１３１；ペプチド２：配列番号１２１。

図１６Ａおよび図１６Ｂは、Ｄ２２７ＫおよびＴ２２８Ａ突然変異がｐＭＨＣとのＣＤ８相互作用を阻害することを実証する。図１６Ａは、様々なテンプレートに対するＷＴ１エピトープ（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）で発現されたＡ＊０２：０１ＳＣＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。各括弧の上の標識は、ＳＣＴの各セットに適用されるＣＤ８阻害突然変異を示す（「野生型」はＣＤ８相互作用に対する突然変異がないことを指す）。＋：精製されたＷＴ１ ＳＣＴ。レーン８の細胞は、低い生存率であることが見出されたので、トランスフェクションは起こらず、このプラスミドに対する検出可能なＳＣＴアウトプットをもたらさなかった。図１６Ｂは、発現されたＷＴ１ ＳＣＴとＴＣＲ形質導入Ｔ細胞との間の四量体結合相互作用のフローサイトメトリー強度プロットである。Ｙ軸は、ＳＣＴタイプ（色は図１６Ａの凡例に対応する）を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞（左の行）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右の行）を用いて結合実験を行った。各プロットにおいて、破線は、１０^３平均蛍光強度単位の正のシグナル閾値を示す（線の右＝正）。

図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ａ２４５Ｖ突然変異がネオアンチゲンを負荷したｐＭＨＣとのＣＤ８相互作用を阻害することを示す。図１７Ａは、メラノーマ患者からのＰＢＭＣとインキュベートしたネオアンチゲン負荷Ａ＊０３：０１ＳＣＴ四量体のフローサイトメトリープロファイルである。左下象限は非結合を示す。図１７Ｂは、ＳＣＴ四量体の様々な他の組み合わせをカバーするように拡大された、図１７Ａの実験を示す。左下象限は非結合を示す。ＳＬＨＡＨＧＬＳＹＫ（配列番号：１３４）；ＲＬＦＰＹＡＬＨＫ（配列番号：３４８）；ＡＬＬＰＰＰＰＬＡＫ（配列番号：３４９）；ＫＩＹＴＧＥＫＰＹＫ（配列番号：３５０）；ＬＬＦＫＡＧＥＭＲＫ（配列番号：３５１）；ＲＬＦＳＡＬＮＳＨＫ（配列番号：３５２）。

図１８は、陽性対照ペプチド（ＥＢＶ、ＣＭＶおよびインフルエンザ由来）および陰性対照ペプチド（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）由来）をコードするＳＣＴ四量体とインキュベートしたＡ＊０２：０１陽性健常ドナーからのＰＢＭＣのフローサイトメトリーを示す。ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号：２７）；ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号：４４）；ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ（配列番号：４５）；ＧＩＬＴＶＳＶＡＶ（配列番号：３５３）。

図１９は、様々なペプチド長（８～１４量体：ＹＭＬＤＬＱＰＥ（配列番号４）からＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣ（配列番号５））と様々なテンプレート設計との組み合わせで改変されたトランスフェクトＳＣＴプラスミドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。＋：精製されたＷＴ１ ＳＣＴ。Ｌ１ ＧＳ部分：ＧＧＧＧＳ、配列番号１４１；ＧＣＧＧＳ、配列番号１４２；ＧＧＣＧＳ、配列番号１４３；またはＧＣＧＡＳ、配列番号１４４。

図２０は、設計テンプレートによって色分けされ、ペプチド長によって左から右に配置された、ＹＭＬ ＳＣＴのＴｍ値の散布図である。生物学的三連測定を、各ペプチド／テンプレートＳＣＴの組み合わせについて行った。１つのプラスミドは、ヒトエラー（１０量体を負荷したＤ４ ＳＣＴ）のためにトランスフェクション中に発現できなかったので、そのサンプルについては測定を行うことができなかった。ＹＭＬＤＬＱＰＥ（配列番号：４）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号：６）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号：３５４）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤ（配列番号：３５５）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬ（配列番号：７）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹ（配列番号：３５６）；ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣ（配列番号：５）。

図２１は、養子細胞療法（ＡＣＴ）の例示的な実施形態の概略図である。この免疫療法方法は、対象が腫瘍を有する場合、ネオアンチゲンなどの抗原（２）を同定するための組織（１）の抽出から始まる。ペプチド－ＭＨＣ結合親和性予測を行い（３）、ｐＭＨＣ生成のための最良のペプチド候補を同定する（４）。次いで、安定なｐＭＨＣを四量体化し、抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するために使用し（５）、そのＴＣＲをその後に配列決定し（６）、プラスミドコンストラクト中で合成し（７）、健常なＴ細胞に形質転換し（８）、対象に投与する（９）。あるいは、対象にペプチド候補（非ＡＣＴ経路）をワクチン接種することもできる。

配列
本明細書に列挙される任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字の略語を使用して示されている。少なくともいくつかの場合、各核酸配列の一本鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。

配列番号１は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）ペプチドである。
配列番号２は、ＭＡＲＴ－１ペプチドである。
配列番号３は、例示的なＨＬＡタンパク質（Ａ＊０２：０１）のアミノ酸配列（シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内部分を欠く）の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。下線が引かれた残基は、本明細書で考察される例示的なアミノ酸置換の位置である：

配列番号４および５は、ＨＰＶ Ｅ７ペプチドである。
配列番号６～２１は、ＳＣＴライブラリテンプレート最適化研究に使用される更なるペプチドである。
配列番号２２は、更なるＷＴ１ペプチドである。
配列番号２３～５８は、Ａ＊０２：０１ウイルス抗原である。
配列番号５９～８８は、Ａ＊２４：０２ウイルス抗原である。
配列番号８９～１００は、ＴＣＲ ＣＤＲ３α配列である。
配列番号１０１～１１２は、ＴＣＲ ＣＤＲ３β配列である。
配列番号１１３～１３３は、ＣｏＶ－２ペプチドである。
配列番号１３４は、更なる抗原ペプチドである。
配列番号１３５は、例示的なプレースホルダーペプチドである：ＳＡＬＳＥＧＡＴＰＱＤＬＮＴＭＬ
配列番号１３６は、ビオチンリガーゼによってビオチン化可能な精製タグのアミノ酸配列である：ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
配列番号１３７～１４４は、例示的なグリシン－セリンペプチドリンカー配列またはＧＳ部分である：

配列番号１４５～３０７は、更なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドである。
配列番号３０８～３２７は、更なるＣＤＲ３アルファ配列である。
配列番号３２８～３４７は、更なるＣＤＲ３ベータ配列である。
配列番号３４８～３５２は、ネオアンチゲンペプチドである。
配列番号３５３は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）ペプチドである。
配列番号３５４～３５６は、更なるＹＭＬペプチドである。
配列番号３５７～３５８は、更なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドである

詳細な説明
本明細書で提供されるのは、ペプチドとクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子との任意の対合のためのＳＣＴの産生を可能にするハイスループットＳＣＴ発現プラットフォームである。従来のｐＭＨＣフォールディングでは、エピトープおよびＨＬＡモジュラリティは、それぞれペプチド合成およびリフォールディングされたＭＨＣサブユニットによって決定されるが、本明細書に記されるＳＣＴプラットフォームは、プライマーおよびＰＣＲテンプレートプラスミドを利用してこれら２つの変数を決定する。これらのＰＣＲ試薬の取り扱いおよびスケールアップの容易な性質は、ｐＭＨＣを最適化するためのペプチドライブラリおよびＨＬＡテンプレートバリアントのリストにわたる迅速なスクリーニングを可能にするミックスアンドマッチアプローチを可能にする。

ＳＣＴタンパク質発現および熱安定性に対するペプチド同一性およびＬ１／ＨＬＡテンプレートの影響を二次元的に評価するために、９つの異なるＬ１／ＨＬＡテンプレートを利用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する１８個の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の試験症例にこのシステムを最初に適用した。次に、疾患状況におけるこれらのＳＣＴの機能性を、一般的なウイルス株に由来するエピトープを負荷したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＡ＊２４：０２ ＳＣＴをアセンブリすることによって評価し、これらのエピトープの合成形態に対して刺激された健常ドナーＴ細胞に結合できることを実証した。

Ｉ．用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘ，ｅｄ．Ｋｒｅｂｓら、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００９（ＩＳＢＮ ０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；Ｇｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｒｅｄｅｉ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８（ＩＳＢＮ：１４０２０６７５３４）；および他の同様の参考文献に見出すことができる。

別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、ＡもしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。

本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。

自家：個体自身の組織から採取された組織、細胞または核酸のことを指す。例えば、Ｔ細胞の自家移植または移植では、ドナーおよびレシピエントは同一人物である。自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）（または「自家（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）」または「自家（ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ）」）は、自己に関連しているか、または生物自体の中で生じる。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）：ＭＨＣ遺伝子複合体によってコードされるタンパク質。ＭＨＣクラスＩからのＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子を含み、高度に可変であり、いくつかの遺伝子座に最大数百のバリアント対立遺伝子を有する。ＨＬＡ遺伝子座は、ＨＬＡと命名され、その後に遺伝子座（例えば、Ａ）と、遺伝子座における特異的対立遺伝子を示す番号（例えば、０１：０１）が続く（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１またはＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２）。

リンカー：２つの核酸またはアミノ酸セグメントを連結する（例えば、共有結合的に連結する）核酸またはアミノ酸配列。いくつかの例では、連結されたポリペプチドドメインに回転自由度を提供し、それによって適切なドメインフォールディングならびにドメイン間およびドメイン内結合を促進するために、リンカー配列を含めることができる。リンカーは、天然配列（例えば、天然に存在するＭＨＣクラスＩタンパク質に見出されるもの）であってもよく、組換え配列または人工配列であってもよい。１つの非限定的な例では、リンカー配列は、様々な数のグリシンおよびセリン残基（例えば、グリシン（４）－セリン）を含む、グリシン－セリンアミノ酸配列（またはアミノ酸配列をコードする核酸配列）を含む。

主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ：ＭＨＣクラスＩ分子は、２つの非共有結合的に会合したタンパク質、ＨＬＡ重鎖（本明細書ではＨＬＡα鎖とも呼ばれる）およびβ２－ミクログロブリンから形成されるヘテロ二量体である。ＨＬＡ重鎖は、３つの異なるドメインであるα１、α２およびα３を含む。α１およびα２ドメインの三次元構造は、抗原がＴ細胞への提示に適合する溝を形成する。α３ドメインは、α鎖をＡＰＣの細胞膜に固定する膜貫通配列を含むＩｇフォールド様ドメインである。ＭＨＣクラスＩ複合体は、抗原と会合すると（および適切な共刺激シグナルの存在下で）、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞を刺激し、これは、特異的に認識する任意の細胞を死滅させるように機能する。

核酸断片：少なくとも１つの他の核酸断片とアセンブリ（例えば、動作可能に連結）されると、完全な核酸分子を産生する任意の長さの核酸配列（例えば線状配列）。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの核酸断片のアセンブリが、本開示のＭＨＣクラスＩ ＳＣＴをコードする核酸を産生する。

動作可能に連結：第１の核酸が第２の核酸と機能的関係にある場合、第１の核酸は第２の核酸と動作可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に動作可能に連結されている。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、オープンリーディングフレームがアライメントされる。同様に、タンパク質（タンパク質サブユニット、ドメイン、および／またはペプチドを含む）は、互いに機能的関係に置かれたときに作動可能に連結される。いくつかの例では、動作可能に連結されたセグメントは、自然界では起こらない配置である。リンカーは、核酸セグメントまたはタンパク質セグメントの間に含まれ得る。

組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、そうでなければ分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または遺伝子工学技術などによる核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。

単鎖三量体（ＳＣＴ）：複合体のすべての部分（ＨＬＡ重鎖、β２ｍ、およびペプチド）を単一の連結分子として含む組換えＭＨＣクラスＩ分子。いくつかの例では、ＳＣＴは、ＨＬＡ重鎖、β２ｍ、ペプチド抗原、および１つまたはそれを超えるリンカーをコードする核酸を指す。他の例では、ＳＣＴはタンパク質を指す。

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む、ヒトおよび獣医学的対象の両方を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物。

Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）。Ｔ細胞には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、「分化抗原群４」（ＣＤ４）として知られる、その表面にマーカーを有する免疫細胞である。ヘルパーＴ細胞としても知られるこれらの細胞は、抗体応答の他にキラーＴ細胞応答も含む免疫応答を調整するのに役立つ。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、「分化抗原群８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。別の実施形態では、ＣＤ８^＋細胞は、サプレッサーＴ細胞である。

活性化Ｔ細胞は、細胞増殖および／または１つもしくはそれを超えるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、もしくはＴＮＦα）の発現もしくは分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は、抗原に応答した細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：抗原（ＭＨＣ分子に結合した抗原、例えば、抗原提示細胞上の抗原など）に結合するＴ細胞の表面上のヘテロ二量体タンパク質。ＴＣＲにはα鎖およびβ鎖が含まれ、各々が膜貫通糖タンパク質である。各鎖は、免疫グロブリン可変ドメインおよび定常ドメインと相同性を有する可変領域および定常領域、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質尾部を有する。免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ遺伝子セグメントが、発生中に再編成して完全な可変ドメインを産生する。

Ｔ細胞は、それぞれ抗原提示細胞上のペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体および相補的共刺激分子へのそれらのＴＣＲおよび共刺激分子の同時結合によって活性化される。例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞上の特定のＨＬＡ分子によって提示された場合に特定のエピトープを認識するＴ細胞受容体を有する。抗原提示細胞によって刺激されて細胞傷害性Ｔリンパ球になったＣＴＬ前駆体が、そのようなＨＬＡ－ペプチド複合体を有する細胞と接触すると、ＣＴＬは細胞とコンジュゲートを形成し、それを破壊する。

形質導入および形質転換：ベクターは、核酸を細胞に移入するときに細胞を「形質導入」する。細胞は、ＤＮＡが細胞ゲノムへの核酸の組み込み、またはエピソーム複製のいずれかによって、細胞により安定に複製されるようになると、細胞に形質導入された核酸によって「形質転換」される。本明細書で使用される場合、形質転換という用語は、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速法による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子を細胞に導入するすべての技術を包含する。

症状の処置または阻害：症状の「処置」とは、疾患または病的症状が発症し始めた後にその徴候または症候を改善する治療的介入を指す。「阻害」とは、疾患または症状の完全な発症を阻害することを指す。ある症状の阻害は、その症状の部分的な阻害から実質的に完全な阻害までの範囲に及ぶことができる。いくつかの例では、「阻害」という用語は、疾患の発症または進行を軽減または遅延させることを指す。処置される対象は、例えば、疾患または障害を発症する徴候および症候、家族歴、ならびに／または危険因子に基づいて、そのような障害の標準的な診断技術によって同定されることができる。

ベクター：宿主細胞内で複製および／または統合するベクターの能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、１つまたはそれを超える選択マーカー遺伝子および他の遺伝要素を含み得る。発現ベクターは、挿入された１つまたはそれを超える遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。いくつかの非限定的な例では、ベクターは哺乳動物発現ベクターである。

ＩＩ．ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴ核酸およびライブラリ
本明細書に開示されるのは、ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴをコードする核酸およびその核酸を含むライブラリである。いくつかの実施形態では、核酸は、アセンブリされたときにＭＨＣクラスＩ ＳＣＴをコードする２つまたはそれを超える核酸断片として提供される。特定の例では、ＳＣＴは一対の核酸断片から構築される。しかしながら、複数のアセンブリ部位を使用してＳＣＴをコードする最終核酸を生成することによって、３つ以上の核酸断片（例えば、３つ、４つ、またはそれを超える）を利用することもできる。

諸実施形態では、アセンブリされたときに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質をコードする第１の核酸断片および第２の核酸断片を含む核酸断片対が提供される。アセンブリされた核酸断片対によってコードされるＳＣＴは、作動可能に連結されたサブユニットとして、ペプチド（例えばペプチド抗原）、β２ｍタンパク質およびＨＬＡ重鎖を含む。第１の核酸断片および第２の核酸断片は各々、第１の核酸断片および第２の核酸断片がアセンブリされたときに、コードされたＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質のβ２ｍ内の不変領域をコードする位置にアセンブリ部位の一部を含む。特定の例では、アセンブリ部位は、ギブソンアセンブリ部位（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：３４３－３４５，２００９を参照されたい）である。他の例では、アセンブリ部位は制限酵素部位である。

いくつかの実施形態では、核酸断片対は、精製タグをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの例では、精製タグはポリヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓタグ）である。他の例では、精製タグは、ビオチンリガーゼによってビオチン化可能なアミノ酸配列である。一例では、精製タグは、アミノ酸配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１３６）をコードする。いくつかの例では、核酸断片対は、２つまたはそれを超える精製タグ（例えば６×Ｈｉｓタグおよびビオチン化可能なペプチド）をコードする核酸配列を含む。

開示される核酸断片（例えば核酸断片対）は、異なるＨＬＡ重鎖を有する異なるペプチド（例えば異なる抗原ペプチド）のモジュール式の組み合わせを提供する。いくつかの例では、ペプチド置換は、逆ＰＣＲなどのＰＣＲに基づく方法によって達成される。例えば、所望のペプチドの逆相補体をコードするリバースプライマーを、ユニバーサルフォワードプライマー（リンカーＬ１中の配列に結合するユニバーサルフォワードプライマーなど）と組み合わせて使用する。これを図１Ｃに概略的に示す。他の例では、所望のペプチドをコードする重複プライマーを使用して、ＳＣＴテンプレート中のペプチドに隣接する制限酵素部位に対応する５’および３’末端に制限酵素認識部位を含む二本鎖アセンブリする。二本鎖コンストラクトおよびＳＣＴテンプレートを制限酵素で消化し、ライゲーションして全長コンストラクトを産生する。

いくつかの実施形態では、アセンブリされた核酸断片対は、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端）でタンパク質サブユニットを有するＳＣＴをコードする：分泌シグナル、ペプチド（例えばペプチド抗原またはプレースホルダーペプチド）、第１のリンカー（Ｌ１）、β２ｍタンパク質、第２のリンカー（Ｌ２）、およびＨＬＡ重鎖。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ＨＬＡ分泌シグナル（例えばＨＬＡα分泌シグナル）である。しかしながら、ヒトβ２ｍ、ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）－α２、ヒトＩＦＮγ、ヒトインターロイキン－２、ヒト血清アルブミン、ヒトＩｇＧ重鎖またはＧａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ（カイアシ類）ルシフェラーゼからの分泌シグナルを含むがこれらに限定されない他の分泌シグナルを使用することができる。所望される場合、当業者であれば、１つもしくはそれを超える分泌シグナルを試験して、増加したまたは最適化されたＳＣＴの発現レベルを提供する１つもしくはそれを超えるものを同定することができる。

いくつかの例では、Ｌ１は、配列番号１３７～１３９のいずれか１つのアミノ酸配列などのグリシン－セリンリンカーをコードする。いくつかの例では、Ｌ２は、グリシン－セリンリンカー、例えば配列番号１３７または配列番号１４０もコードする。更なる例では、第３のリンカー（Ｌ３）がＨＬＡα鎖と精製タグ（含まれる場合）との間に含まれ得る。いくつかの例では、Ｌ３は、アミノ酸配列ＧＧをコードする。

いくつかの実施形態では、開示される核酸断片対は、アセンブリされると、可溶性ＳＣＴをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ重鎖タンパク質の細胞外ドメインである。したがって、いくつかの例では、ＨＬＡ重鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは含まれない。ＨＬＡα分泌シグナルを除去することができる（例えば、ＨＬＡα鎖がＳＣＴの内部にある場合）。他の実施形態では、開示される核酸断片対は、アセンブリされると、膜結合ＳＣＴをコードする。そのような実施形態では、核酸断片対は、ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする。

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ重鎖は、ヒトＨＬＡ重鎖またはマウスＨＬＡ重鎖である。いくつかの例では、ヒトＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ重鎖から選択される。他の例では、マウスＨＬＡ重鎖は、Ｈ－２Ｋ、Ｈ－２Ｄ、またはＨ－２Ｌ重鎖である。各遺伝子座についてのＨＬＡ重鎖対立遺伝子のアミノ酸および核酸配列は、例えばＥＭＢＬ－ＥＢＩ（例えば、ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｆａｓｔａ／）から公的に入手可能である。当業者は、更新情報とともに、他の情報源または配列データベースを同定することができる。いくつかの例では、ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ重鎖コード断片ライブラリに含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸断片によってコードされるＨＬＡ重鎖は、野生型ＨＬＡ重鎖と比較して１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。アミノ酸置換は、安定性の増加、ペプチド結合溝へのペプチド負荷、免疫原性、および／またはジチオール結合の可能化など、アセンブリされた核酸断片対によってコードされるＳＣＴの特性または機能を改善するように選択され得る。例示的なアミノ酸置換には、配列番号３のアミノ酸７４に対応するアミノ酸位置のロイシン（例えば、Ｈ７４ＬもしくはＤ７４Ｌ）、配列番号３のアミノ酸８４に対応するアミノ酸位置のシステインもしくはロイシン（例えば、Ｙ８４ＣもしくはＹ８４Ｌ）、配列番号３のアミノ酸１３９に対応するアミノ酸位置のシステイン（例えば、Ａ１３９Ｃ）、またはそれらの２つもしくはそれを超える任意の組み合わせが含まれる。アミノ酸置換の例示的な組み合わせには、図２ＢのＳＣＴテンプレート１～９について示されるものが含まれる。他の実施形態では、Ｔ細胞上のＣＤ８補助受容体とのｐＭＨＣ相互作用を減少させるアミノ酸置換が含まれる。そのようなアミノ酸置換の１つまたはそれを超えるものを有するＳＣＴは、例えば、抗原特異的Ｔ細胞集団から低親和性ＴＣＲを除去するためのフィルタとして、ｐＭＨＣに対する高親和性を有するＴＣＲに対して成功した結合相互作用をゆがめるのに有用であり得る。いくつかの例では、アミノ酸置換には、配列番号３のアミノ酸２２７に対応するアミノ酸位置のリジン（例えば、Ｄ２２７Ｋ）、配列番号３のアミノ酸２２８に対応するアミノ酸位置のアラニン（例えば、Ｔ２２８Ａ）、配列番号３のアミノ酸２４５に対応するアミノ酸位置のバリン（例えば、Ａ２４５Ｖ）、またはそれらの２つもしくはそれを超える任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡα鎖は、Ｈ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２５４Ｖの１つまたはそれを超えるものを含み、アミノ酸位置は配列番号３のものに対応する。

いくつかの実施形態では、開示されるＳＣＴに含まれるペプチドは、ペプチド抗原、プレースホルダーペプチド、自己ペプチド（例えば、健常な組織に存在し、突然変異していないペプチド）、陰性対照ペプチド、または陽性対照ペプチドである。いくつかの実施形態では、プレースホルダーペプチドは、リバースプライマーのペプチドコード化領域がオーバーレイするための「空間」を提供するか（例えば、図１Ｃに示すように）、またはペプチド置換中に除去される断片として機能する。制限酵素消化によるペプチド置換の場合、プレースホルダーペプチドは、切断中の制限酵素間の空間的干渉を防止または最小化するために、酵素切断部位間の間隔を提供し得る。したがって、いくつかの例では、プレースホルダーペプチドは、少なくとも４アミノ酸長であり得る。逆ＰＣＲを利用する例では、プレースホルダーペプチドは必要とされない場合があり、任意である。したがって、いくつかの例では、プレースホルダーペプチドは、約４～２５アミノ酸長である。他の例では、プレースホルダーペプチドは存在しない（すなわち、ペプチドは、この状況では０アミノ酸である）。一例では、プレースホルダーペプチドはＨＩＶ ＧＡＧアミノ酸１７３～１８８であり、アミノ酸配列ＳＡＬＳＥＧＡＴＰＱＤＬＮＴＭＬ（配列番号１３５）を有する。しかしながら、上で考察したように、他のプレースホルダーペプチド配列を利用することもできるし、場合によっては省略することさえもできる。

いくつかの実施形態では、ペプチドはペプチド抗原である。ペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体またはＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の結合ポケットに適合し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって認識されるペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約８～１４アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸長）である。しかしながら、より長いまたはより短いペプチド抗原も利用することができる。典型的には、陽性対照および／または陰性対照ペプチドは、標的ペプチド（例えばペプチド抗原）と同じ長さ、または約８～１４アミノ酸長である。いくつかの例では、ペプチド抗原は、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド（例えば自己反応性の自己ペプチド）、真菌ペプチド、細菌ペプチド、またはウイルスペプチド（例えばインフルエンザウイルスペプチド、コロナウイルスペプチド、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ペプチド、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ペプチド、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ペプチド、肝炎ウイルスペプチド（例えば、ＨＢＶもしくはＨＣＶペプチド）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、またはロタウイルスペプチド）である。いくつかの例では、ペプチド抗原は、配列番号２３～８８および１１５～１３２のいずれか１つから選択される。

本明細書に開示される複数の核酸断片対を含むライブラリも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、２つもしくはそれを超える核酸断片対、例えば２～５００（例えば、２～５０、１０～１００、２０～２００、７５～１５０、２００～４００、または３００～５００）の核酸断片対を含む。ライブラリは、いくつかの例では、複数のＨＬＡα鎖および複数のペプチドをコードする核酸断片を含む。したがって、いくつかの例では、核酸断片対のライブラリは、本明細書に開示される複数のＳＣＴをコードする核酸のモジュール式構築に使用することができる。

いくつかの実施形態では、ライブラリは２つのサブセットを含み、第１のサブセットは対の複数の第１の核酸断片を含み、第２のサブセットは対の複数の第２の核酸断片を含む。いくつかの例では、第１の核酸断片は各々、ペプチドおよびβ２ｍの一部をコードする少なくとも核酸を含み、第２の核酸断片は各々、β２ｍおよびＨＬＡα鎖の一部をコードする少なくとも核酸を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸断片のＳＣＴ成分の１つまたはそれを超えるものをコードする核酸配列は、ヌクレオチド配列が変更されているが、それにもかかわらずペプチド配列と同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするように、遺伝暗号の縮重を利用することによって変更され得る。遺伝暗号の縮重に基づいて、バリアントＤＮＡ分子は、標準的なＤＮＡ突然変異誘発技術を使用して、またはＤＮＡ配列の合成によって、本明細書に開示されるかまたは当業者に公知の核酸配列から誘導され得る。したがって、本開示はまた、対象ＳＣＴをコードするが、遺伝暗号の縮重のために開示された核酸配列とは異なる核酸配列も包含する。

本明細書で提供される核酸断片はさらに、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸断片は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化」核酸とは、コドンが特定の系（特定の種または種の群など）における発現に最適であるように変更された核酸配列を指す。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更させない。いくつかの例では、コドン最適化とは、核酸配列中の少なくとも１つのコドン（例えば、少なくとも５個のコドン、少なくとも１０個のコドン、少なくとも２５個のコドン、少なくとも５０個のコドン、少なくとも７５個のコドン、少なくとも１００個のコドンまたはそれを超える）を、目的の特定の生物（例えばヒト）においてより頻繁に使用される（好ましい）同義コドン（同じアミノ酸をコードするもの）で置き換えることを指す。各生物は、アミノ酸ごとに特定のコドン使用頻度バイアスを有し、これは、例えば、公的に入手可能なコドン使用頻度表（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２９２，２０００を参照されたい）から決定することができる。例えば、コドン使用頻度データベースは、ワールド・ワイド・ウェブ上のｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎで利用可能である。当業者は、特定のアミノ酸配列をコードする核酸を、特定の細胞型（例えばヒト細胞）での発現に最適化しながら、同じアミノ酸配列をコードするように改変することができる。コドン最適化のために適用され得る更なる基準には、ＧＣ含有量（例えば、所与のウィンドウ長（例えば約３０～６０塩基）にわたって、全体の平均ＧＣ含量が約５０％またはＧＣ含量が約５０％など）および含まれてはならない配列（例えば、特定の制限酵素認識部位）の回避が含まれる。いくつかの例では、コドン最適化配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル、ワールド・ワイド・ウェブ上のｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔで入手可能）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ、）またはＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ドイツ国エーバースベルク、ワールド・ワイド・ウェブ上のｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／２００８／１０／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｔｏｏｌ／で入手可能）から入手可能なコドン最適化ツールなどのソフトウェアを使用して生成される。

本明細書に開示される核酸断片（例えば核酸断片対）からアセンブリされた核酸分子も提供される。アセンブリされた核酸は、核酸断片中に存在するアセンブリ部位を使用して調製される。したがって、いくつかの例では、核酸分子はギブソンアセンブリによってアセンブリされる。他の例では、核酸分子は、制限酵素消化および消化された断片のライゲーションによってアセンブリされる。アセンブリされた核酸断片は、第１の核酸断片および第２の核酸断片が連続しており、タンパク質コード配列がインフレームであるように、作動可能に連結される。

更なる実施形態では、複数のアセンブリされた核酸分子を含むライブラリも提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、２個またはそれを超える、例えば２～２５００個（例えば、２～２５、５～５０、１０～１００、２０～２００、７５～１５０、２００～４００、３００～５００、４００～６００、５００～７５０、６００～８００、７００～１０００、１０００～１５００、１２５０～１７５０、１５００～２０００、または２０００～２５００個）のアセンブリされた核酸を含む。いくつかの例では、アセンブリされた核酸のライブラリは、コードされたＨＬＡα鎖および／またはペプチドの１つもしくはそれを超えるものが異なる複数のＳＣＴをコードする。所望に応じて、目的のペプチドをＨＬＡα鎖とβ２ｍとの各組み合わせに挿入することができる。いくつかの例では、例えば、結合親和性についてペプチド－ＨＬＡ対をランク付けするアルゴリズムを使用して、ＨＬＡα鎖のライブラリサイズを狭める。あるいは、単一のＳＣＴ ＨＬＡα鎖が選択され、アセンブリされた核酸のライブラリが調製され、各メンバーは同じＨＬＡを有するが異なるペプチドを有する。

いくつかの実施形態では、核酸断片からアセンブリされた核酸分子（例えばアセンブリされた核酸断片対）は、ベクターに含まれる。いくつかの例では、ベクターは、アセンブリされた核酸の発現が発現制御配列と適合する条件下で達成されるように、アセンブリされた核酸に作動可能に連結された１つまたはそれを超える発現制御配列をさらに含む。発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合配列、タンパク質コード核酸の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）５’、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの例における発現制御配列は、例えばタンパク質コード核酸以外の供給源からの異種発現制御配列である。したがって、異種発現制御配列（例えばプロモーター）に作動可能に連結されたタンパク質コード核酸は、天然に存在しない核酸を含む。ベクターは、複製起点、１つもしくはそれを超える選択マーカー遺伝子（例えば１つもしくはそれを超える抗生物質耐性遺伝子）、または当業者に公知の他の要素などの１つもしくはそれを超える追加の要素をさらに含み得る。

アセンブリされた核酸分子のクローニング、複製および／または発現のためのベクターには、細菌プラスミド、例えば細菌クローニングまたは発現プラスミド（その一部は細菌および／または哺乳動物細胞における発現のために使用することができる）が含まれる。核酸をクローニングすることができる例示的な細菌プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミド（例えばｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＤ１、ｐＧＥＭ（登録商標）プラスミド（例えばｐＧＥＭ（登録商標）－３、ｐＧＥＭ（登録商標）－４、ｐＧＥＭ－Ｔ（登録商標）プラスミド；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）、ＴＡクローニングベクター、例えばｐＣＲ（登録商標）プラスミド（例えば、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ、ｐＣＲ（登録商標）２．１、もしくはｐＣＲ（登録商標）４プラスミド；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）またはｐｃＤＮＡプラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１もしくはｐｃＤＮＡ（商標）３．３プラスミド；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。いくつかの例では、ベクターは、細菌におけるタンパク質発現を可能にする異種プロモーターを含む。例示的なベクターとしては、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ－２１ｂ）、ｐＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＲＳＥＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＢＡＤベクター、およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。

他の実施形態では、ベクターは哺乳動物発現ベクターである。いくつかの例では、哺乳動物発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターを含む。他の例では、ベクターは、形質転換された哺乳動物細胞におけるプラスミドの複製を可能にするウイルス複製起点（例えば、エプスタイン・バーウイルスまたはＳＶ４０複製起点）を含む。１つの非限定的な例では、哺乳動物発現ベクターはｐｃＤＮＡ（商標）３ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。しかしながら、多くの哺乳動物発現ベクターが利用可能であり、適切な代替物が当業者によって選択され得ることが認識されるべきである。

ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴをコードするアセンブリされた核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主細胞、例えば哺乳動物細胞も提供される。本明細書で利用される場合、「宿主細胞」という用語はまた、対象宿主細胞の任意の子孫も含む。外来ＤＮＡが宿主内で連続的に維持されることを意味する、一過性発現または安定な移入の方法は、当該技術分野で公知である。培養中の哺乳動物細胞の増殖のための技術は、当業者に公知である。一般的に使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、ＨＥＫ２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＯＳ細胞株であるが、改善された発現、望ましいグリコシル化パターン、または他の特徴を提供するように設計された細胞などの他の細胞株を使用してもよい。いくつかの非限定的な例では、哺乳動物宿主細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのＨＥＫ２９３細胞である。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の技術によって行うことができる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈物としてのＤＮＡのトランスフェクション、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの機械的手順を含む方法、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターを使用することができる。

ＩＩＩ．ヒトＳＣＴタンパク質
本明細書に開示されるのは、ヒトＭＨＣクラスＩ単鎖三量体タンパク質、例えば上記の核酸断片対およびアセンブリされた核酸によってコードされるものである。セクションＩＩで考察されるように、いくつかの実施形態では、開示されるＳＣＴをコードする核酸で形質転換された哺乳動物宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ヒトＭＨＣクラスＩ ＳＣＴは可溶性である。加えて、哺乳動物細胞（例えば、細菌または昆虫細胞とは対照的に）での発現の結果として、ＳＣＴは、ヒト細胞で発現されるｐＭＨＣを表す翻訳後修飾を含み得、および／または適切にフォールディングされ、例えば非哺乳動物系で産生されるものよりも高い効率で機能性タンパク質を生成する。特定の実施形態では、ＳＣＴはグリコシル化される。

セクションＩＩに記載される核酸断片対またはアセンブリされた核酸によってコードされるＳＣＴのいずれも、可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴとして産生されることができる。したがって、いくつかの実施形態では、可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、分泌シグナル、ペプチド（例えばペプチド抗原またはプレースホルダーペプチド）、第１のリンカー（Ｌ１）、β２ｍタンパク質、第２のリンカー（Ｌ２）、およびＨＬＡ重鎖の構成を有する。ＳＣＴは、精製タグも含み得る。

いくつかの実施形態では、可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴは、野生型ＨＬＡ重鎖と比較して１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。例示的なアミノ酸置換には、配列番号３のアミノ酸７４に対応するアミノ酸位置のロイシン（例えば、Ｈ７４ＬもしくはＤ７４Ｌ）、配列番号３のアミノ酸８４に対応するアミノ酸位置のシステインもしくはロイシン（例えば、Ｙ８４ＣもしくはＹ８４Ｌ）、配列番号３のアミノ酸１３９に対応するアミノ酸位置のシステイン（例えば、Ａ１３９Ｃ）、またはそれらの２つもしくはそれを超える任意の組み合わせが含まれる。アミノ酸置換の例示的な組み合わせには、図２ＢのＳＣＴテンプレート１～９について示されるものが含まれる。他の例では、アミノ酸置換には、配列番号３のアミノ酸２２７に対応するアミノ酸位置のリジン（例えば、Ｄ２２７Ｋ）、配列番号３のアミノ酸２２８に対応するアミノ酸位置のアラニン（例えば、Ｔ２２８Ａ）、配列番号３のアミノ酸２４５に対応するアミノ酸位置のバリン（例えば、Ａ２４５Ｖ）、またはそれらの２つもしくはそれを超える任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡα鎖は、Ｈ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２５４Ｖの１つまたはそれを超えるものを含み、アミノ酸位置は配列番号３のものに対応する。

いくつかの例では、ペプチドは、抗原ペプチドまたはプレースホルダーペプチドである。いくつかの例では、抗原ペプチドは、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド（例えば、「自己」ペプチド）、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択される。例示的なペプチドは、セクションＩＩで考察される。

いくつかの実施形態では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、安定な多量体としてアセンブリされる。特定の例では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質は、安定な四量体としてアセンブリされる。いくつかの実施形態では、安定な多量体（例えば四量体）のアセンブリは、ビオチン化ＳＣＴを使用して行われる。

一例では、ビオチン化ＳＣＴモノマーが、フルオロフォア標識化ストレプトアビジン（例えばストレプトアビジン－フィコエリトリン）で四量体化される。他の例では、ビオチン化ＳＣＴモノマーが、相補的なｓｓＤＮＡ－ビオチン分子へのその後の結合を可能にする、例えばストレプトアビジン被覆ビーズに固定されたカスタムストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートを使用して四量体化される。更なる例では、ＳＣＴモノマーが１０倍適合性ＤＮＡバーコード化デキストラマーにコンジュゲートさせる。これらのデキストラマーはまた、フルオロフォアで標識されてもよく、したがって、上記のＳＣＴ－四量体と同様にフローサイトメトリーのために、ＳＣＴコンジュゲーション後に使用され得る。

単量体または安定な多量体（例えば四量体）としての可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質のライブラリも提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、２個またはそれを超える、例えば２～２５００個（例えば、２～２５、５～５０、１０～１００、２０～２００、７５～１５０、２００～４００、３００～５００、４００～６００、５００～７５０、６００～８００、７００～１０００、１０００～１５００、１２５０～１７５０、１５００～２０００、または２０００～２５００個）の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。いくつかの例では、可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質のライブラリは、ＨＬＡ重鎖、ペプチド、またはその両方が異なる複数のＳＣＴを含む。

更なる実施形態では、安定な多量体は、ポリマー、平坦表面、ビーズ、またはナノ粒子足場などの固体支持体に結合している。１つの非限定的な例では、固体支持体は、磁気ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ）である。いくつかの例では、複数の固体支持体（例えばビーズまたはナノ粒子）を含むライブラリが提供され、各々が支持体に結合または連結された異なるＳＣＴ多量体を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン化ＳＣＴモノマーまたは四量体が、ストレプトアビジンを含む足場、例えばストレプトアビジン被覆ビーズもしくはナノ粒子またはストレプトアビジン被覆表面（例えばマルチウェルプレート）上に組み込まれる。

ＩＶ．使用方法
開示されたＭＨＣクラスＩ ＳＣＴを使用する方法も本明細書に開示される。この方法は、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することと、いくつかの例では、同定されたＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を産生することとを含む。更なる実施形態では、Ｔ細胞の集団は、その投与を必要とする対象に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の１つまたはそれを超える安定な多量体でＴ細胞の集団をスクリーニングすること（例えば、Ｔ細胞の集団を接触させること）を含む。いくつかの例では、Ｔ細胞の集団を、例えば複数の異なるＳＣＴ多量体を含む安定な多量体のライブラリと接触させ、各ＳＣＴ多量体は、異なるペプチド配列（例えば複数の異なるペプチド抗原および／または複数のＨＬＡα鎖）を含む。これにより、いくつかの例では「抗原特異的Ｔ細胞」と呼ばれる特定のペプチドに反応性である集団中の１つまたはそれを超えるＴ細胞の検出が可能になる。いくつかの例では、ＳＣＴでスクリーニングされたＴ細胞は、複数のＳＣＴに含まれるペプチドで刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から産生される。

集団中の反応性Ｔ細胞は、例えばフローサイトメトリーを使用して選別および捕捉することができる。いくつかの例では、反応性Ｔ細胞は、当業者に公知の細胞培養方法を使用してインビトロで増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、反応性細胞に発現されるＴＣＲを同定するために分析される。一例では、ＴＣＲは、例えば次世代シーケンシング法（例えば、バルクシーケンシングまたは１０倍単一細胞シーケンシング）を使用して配列決定される。

同定されたＴＣＲを発現ベクターにクローニングし、ＴＣＲをコードする発現ベクターでＴ細胞の集団を形質転換して、ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞）を産生する。異種タンパク質（例えば同定されたＴＣＲ）を発現するようにＴ細胞を形質転換する方法は、当業者に公知である。形質転換されたＴ細胞のこの集団は、その投与を必要とする対象に投与され得る。養子細胞移入の方法は、当業者に公知である。いくつかの例では、ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍関連抗原またはネオアンチゲンに対して反応性であり、癌を有する対象に投与される。他の例では、ＴＣＲを発現するＴ細胞は、ウイルスまたは細菌抗原に対して反応性であり、ウイルスまたは細菌に感染した対象に投与される。

いくつかの例では、ＳＣＴを生成し、Ｔ細胞の集団をスクリーニングするために使用されるペプチドは、癌を有する対象などの対象からのものである。いくつかの例では、同定されたＴＣＲを発現するＴ細胞の集団も対象からのものである（例えば、自家Ｔ細胞）。方法の具体的な実施形態を図２１に示し、実施例８に記載する。しかしながら、当業者は、これらの方法に対する修正が可能であることを認識するであろう。

以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を説明するために提供される。これらの例は、本開示を記載された特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

実施例１
材料および方法
ＳＣＴテンプレートの作製：クラスＩのＳＣＴコード化プラスミドを、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏ（＋）プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入するためのギブソンアセンブリ法と制限酵素消化法との組み合わせを使用して構築した（図１Ａ）。簡潔には、Ｌ１の任意の選択をＨＬＡ対立遺伝子の任意の選択と対にすることができるように、ＳＣＴインサートをモジュール式に設計した。β２ｍはヒト種において対立遺伝子変異を有しないので、ＨＬＡからのＬ１の分離を可能にするために、ＳＣＴをこの領域内で２つのギブソンアセンブリ断片に分割した。断片をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、ＫＯＤ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｈｉ－Ｆｉポリメラーゼ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）でＰＣＲ増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してギブソンアセンブリによって結合した。ＰＣＲ増幅ギブソン産物の隣接領域をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって消化して、同じ酵素認識部位（図１Ｂ）でｐｃＤＮＡ３．１のＭＣＳ領域にライゲーションした。コドン最適化は、以下の３つの考慮の下で設計された断片に適用された：１）ヒト種において非常に一般的なコドンのみの選択、２）ＧＣ含有量が６０％を超える連続遺伝子セグメント（２４＋ｂｐ）の回避（合成中のエラー率を回避するため）、および３）断片内の主要な認識切断部位の回避（ｐｃＤＮＡベクターへの挿入のためには、Ｇｉｂｓｏｎ産物の側面にのみ存在しなければならない）。この戦略は、最初に３つのＨＬＡ対立遺伝子にわたって首尾よく使用された（Ａ＊０１：０１、Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１）。その後、第２の断片（ＨＬＡ対立遺伝子をコードする）の設計を、すべての前述の設計基準を包含し、クラスＩ ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ遺伝子座からのすべての対立遺伝子を考慮して、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて自動化した。各ＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質配列は、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｆａｓｔａ／）がホストするＦＴＰサーバから得た。今日まで、ＩＭＧＴデータベースからのすべての既存のクラスＩ ＨＬＡ配列は、このようにしてレディ・トゥ・オーダー（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｏｒｄｅｒ）のＤＮＡ配列に変換されている。これらの配列から、２４のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を包含する少なくとも４０のユニークなプラスミドテンプレートが構築されている。

ＳＣＴペプチドライブラリの作製：ＰＣＲ促進アプローチを、ペプチドのＳＣＴコード化プラスミドへのハイスループット置換を可能にするために実施した。プラスミドの隣に結合された様々なＬ１選択のためのコスト、使いやすさ、および柔軟性を考慮した後、他の可能性のあるアプローチの中から伸長ＰＣＲ法を選択した（図１Ｃ）。簡潔には、任意の所与のペプチド置換のために、ペプチドにコードされたリバースプライマー（ペプチド領域の上流のシグナル配列に結合する）およびフォワードプライマー（ペプチド領域の下流のＬ１に結合する）が必要とされる。ペプチドにコードされたプライマーは任意の所与のペプチドについて変化するが、フォワードプライマーはすべてのペプチドエレメントにわたって固定されたままである（異なるＬ１／ＨＬＡテンプレートプラスミドを使用することを選択しない限り）。この様式では、ｎ個のペプチドおよびｍ個のテンプレートを包含するＳＣＴプラスミドライブラリは、ｎ＋ｍ個の全プライマーの購入を必要とする。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を用いて伸長ＰＣＲを行った。産物をリン酸化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ ＤＮＡリガーゼとの混合物でライゲーションした後、テンプレートＤＮＡをＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。次いで、ペプチド置換プラスミドをＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。トランスフェクションに使用する前に、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してサンガーシーケンシングによってプラスミドを検証した。

ＳＣＴ発現：精製ＳＣＴプラスミドを２４ウェル（２．５ｍｌ容量）プレート内のＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトした。簡潔には、１．２５μｇのプラスミドを７５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地と混合した。７．５μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を７０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地と混合し、室温で５分間インキュベートし、プラスミド混合物と合わせた。１５分間の室温インキュベーション後、溶液を１．２５ｍｌのＥｘｐｉ２９３細胞に３００万細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに添加し、次いでこれを２２５ＲＰＭ、３７℃、８％ＣＯ２で一晩振盪した。２０時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １を７．５μｌ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を７５μｌ含有する溶液を各ウェルに添加した。プレートを、トランスフェクションの開始から合計４日間、上述の設定を使用してシェーカー上に保持した。トランスフェクション溶液の上清を回収し、０．２２μｍ ＰＶＦＤ膜シリンジフィルタ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）に通して濾過した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる収率分析を行った。高収率で発現したＳＣＴの上清溶液を、３０ｋＤａ遠心フィルタユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して２００μｌのＰＢＳまで濃縮し、続いてＢｉｒＡ酵素キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）で一晩ビオチン化した。次いで、ビオチン化ＳＣＴをＨｉｓＴａｇ樹脂チップ（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）で精製し、Ｚｅｂａ ７ＫＭＷＣＯスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰＢＳ緩衝液に戻して脱塩した。長期保存のために、ＳＣＴを２０％グリセロールｗ／ｖに再懸濁した後、－２０℃で保存した。

ＳＣＴ収率特性評価：トランスフェクションの４日後、トランスフェクション上清と１０％β－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液との３：１混合物を含有する１５μｌ溶液を１００℃で１０分間変性させ、続いてＳＤＳＰＡＧＥ用Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅゲル（２００Ｖ、３０分）にロードした。２０％グリセロールＰＢＳ溶液（約２μｇを含有する）中の還元精製ＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）Ａ＊０２：０１ＳＣＴサンプルを各ゲルに泳動して、相対タンパク質収率計算のための陽性対照および強度基準として用いた。画像は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰｇｅｌイメージングシステム（手動設定：４５秒のＵＶ活性化、０．５秒の露光）を使用して得た。ＳＣＴ発現を分析するための一貫したアプローチを特定するために、Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で実行されるＳＣＴタンパク質の分析のためのカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを特に開発した。スクリプトは、目的のタンパク質バンドのユーザ定義の選択を可能にし、対照タンパク質レーンの一貫した使用を考えると、バックグラウンド低減およびすべてのゲルにわたるＳＣＴ収率の均一な正規化を提供する。このアプローチの精度は、真のタンパク質Ａ２８０濃度（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計によって測定）と定量化された相対バンド強度との間の９９％の相関を実証するために、精製ＳＣＴの滴定された予備定量化サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定された。確立された収率カットオフ値を超えて発現したＳＣＴを、その後のビオチン化および精製ステップのために選択した。

熱安定性特性評価：ＳＹＰＲＯ（商標）Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ ＳｔａｉｎをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、水で希釈して１００倍の作業溶液を得た。クラスＩ ＳＣＴタンパク質溶液（可能であれば１０μＭに希釈）の各１９μｌアリコートに、１μｌの１００倍の色素溶液を添加した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを備えたＢｉｏ－ＲａｄサーマルサイクラーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｌｔ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアと組み合わせて使用して、各ＳＣＴサンプルの融解曲線を得た。熱勾配設定は、２５℃～９５℃、３０秒当たり０．２℃であった。

ペプチド刺激：解凍したＰＢＭＣを、１μＭのペプチドおよび抗ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍＬ）を添加することによって完全Ｒ１０培地（５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０；５０ｍＬの熱不活性化ＦＢＳ；５ｍｌのＰｅｎ／ｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン）；１×ＧｌｕｔａＭＡＸ）中で１６時間インキュベートした。翌日、ＰＢＭＣを洗浄し、アネキシンＶ－ＢＶ４２１（１μｇ／ｍＬ）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ抗体（１μｇ／ｍＬ）およびＣＤ１３７－ＰＥ抗体（１μｇ／ｍＬ）で４℃にて１０分間染色した。ペプチド刺激によるＣＤ１３７の活性化誘導発現は、ＦＡＣＳソーター装置を使用した抗原特異的Ｔ細胞のチューブへの選別を可能にする。

ＳＣＴ多量体形成：ビオチン化ＳＣＴモノマーは、少なくとも３つの異なるフォーマットでの使用に成功している。まず、従来のフローサイトメトリー染色試薬として使用するために、ストレプトアビジン－フィコエリチン（ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で四量体化した。第２に、それらを特注のストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートで四量体化して、ストレプトアビジン被覆磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に固定された相補的なｓｓＤＮＡ－ビオチン分子へのその後の結合を可能にした。これらの試薬は、ナノ粒子－核酸細胞選別プラットフォーム（ＮＰ－ＮＡＣＳ）（Ｐｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２８：２７２８－２７３８，２０１９）で利用することができ、これにより、ｐＭＨＣ－ＴＣＲアビディティーの増強ならびに抗原特異的Ｔ細胞のマイクロ流体誘導抽出および分析が可能になる。ＳＣＴモノマーは、１０倍適合性ＤＮＡバーコード化デキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）上にコンジュゲートされている。これらの試薬は、捕捉されたＣＤ８ Ｔ細胞ならびにその対応するＴＣＲαおよびβ鎖配列の抗原特異的同一性（デキストラマー上にバーコード化されたＤＮＡ）のカップリングを可能にする（単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）。

実施例２
ＳＣＴライブラリの発現
初期ＳＣＴライブラリは、様々な供給源に由来する１８のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１抗原からなっていた（表１）。ＳＣＴに導入する候補Ｌ１／ＨＬＡ突然変異を同定するために、ＳＣＴ設計に対して行われた工学的改良について文献調査を行った。３世代のＬ１－ＨＬＡの組み合わせ（閉じた溝（野生型ＨＬＡ Ｙ８４）、開いた溝（ＨＬＡ Ｙ８４Ａ）、およびチオールリンカー（ＨＬＡ Ｙ８４Ｃ））が以前に調査されており、ｐＭＨＣ安定性の漸進的な改善を実証することが示されている。これらの３つの世代は、Ｄ１（Ｌ１＝（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１３７）；閉じた溝）、Ｄ２（Ｌ１＝（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１３７）；開いた溝）、Ｄ３（Ｌ１＝ＧＣＧＧＳ（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号１３８）チオールリンカー）、Ｄ４（Ｌ１＝ＧＧＣＧＳ（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号１３８）；チオールリンカー）、およびＤ５（Ｌ１＝ＧＣＧＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号１３９）；チオールリンカー）と略される５つのユニークな設計に実装された（図２Ａおよび図２Ｂ）。リンカーにシステインを含有する設計（Ｄ３～Ｄ５）はまた、ＨＬＡサブユニットにＹ８４Ｃ突然変異を組み込んでジチオール結合を可能にした。次に、直交ＨＬＡ突然変異Ｈ７４Ｌを３つのテンプレート（Ｄ６～Ｄ８）に導入した。Ｈ７４Ｌ突然変異は、ＨＬＡサブユニットのペプチド結合溝内のＣポケットの一部を形成し、ペプチド負荷およびｐＭＨＣ免疫原性を促進することが報告されているので、それが包含されていると全体的なｐＭＨＣ安定性および機能が改善され得る。最終的な設計（Ｄ９、ＤＳ－ＳＣＴと呼ばれる）には、ＨＬＡ結合ポケットに対合したＹ８４Ｃ－Ａ１３９Ｃ突然変異が含まれており、リフォールディングされたｐＭＨＣコンストラクトに更なる安定化をもたらす可能性がある。

９個のＨＬＡテンプレートおよび１８個のペプチドを含むこの１６２エレメントプラスミドライブラリをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした（図２Ｂ）。ＳＣＴタンパク質バンドの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、ペプチドおよびテンプレートに依存するタンパク質収率の有意な変動が明らかになった（図２Ｂ）。ＳＣＴ収率に対するトランスフェクション効率の影響を切り離すために、設計Ｄ３下のライブラリのサブセットをさらに改変してＩＲＥＳ－ＧＦＰ配列を組み込んで、ペプチド同一性またはＳＣＴ発現の程度にかかわらず、トランスフェクト細胞を誘導して細胞内ＧＦＰを発現させた。ＧＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリーに基づく検出は、トランスフェクション効率の程度が、試験したすべてのＳＣＴコンストラクトにわたってほぼ均一（７０％）であることを示した（図３Ａ）。ＩＲＥＳ－ＧＦＰインサートの有無にかかわらず、このサブセットの生物学的三連を実施して、ペプチド依存性ＳＣＴ収率変動が一貫していることを実証した（図３Ｂ）。ライブラリの中の３つのＨ７４Ｌ突然変異テンプレートは、一般に、それらの野生型対応物と比較して改善されたタンパク質発現を示し、チオールリンカーを使用するテンプレートは、ＳＣＴの総収率が最も高かった（図２Ｂ）。ペプチドＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１８）などのいくつかの場合では、おそらくジチオール突然変異によって付与されるＦポケットでの安定性のために、Ｈ７４Ｌおよびチオールリンカーの両方の特徴を組み込んだＤ８テンプレート、またはＤ９テンプレートでのみＳＣＴ発現を得ることができた。ＶＬＱＥＬＮＶＴＶについてのＳＣＴバンドのわずかな上方シフトがあり（配列番号１１）、ペプチド領域におけるＮＸＴグリコシル化コンセンサス配列に起因する質量の増加を示している（図２Ｂ）。この現象は、ペプチドの外因性導入を必要とするアセンブリ方法には存在せず、ＳＣＴが分泌前に生物学的タンパク質プロセシング経路を経ることを示している。したがって、このライブラリのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＳＣＴ発現がペプチドおよび骨格テンプレートの選択に依存し、翻訳後修飾を含むタンパク質を産生することを明らかにした。

その後、収率閾値を超えて発現したＳＣＴを、熱シフトアッセイのためにｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中でＨｉｓＴａｇ精製した。測定されたＴｍ値は、ネイティブなｐＭＨＣ対応物と比較して報告されたＳＣＴの予想値内であり、野生型溝（Ｄ１およびＤ６）から開溝（Ｄ２およびＤ７）からチオール化リンカー／溝（Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ９）までの同じペプチドの安定性が増加する傾向を提供した（図２Ｃ）。各ペプチドのＳＣＴ熱安定性もまた、Ｈ７４Ｌバリアントについて野生型対応物よりも高かった。ＳＣＴがいくつかのテンプレートについてのみ発現するいくつかのペプチド（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１８）またはＦＬＫＡＮＬＰＬＬ（配列番号１１））については、２つの異なるＴｍ値が検出され、そのうちの低い方が不適切にフォールディングされたＳＣＴ種を示している可能性がある。

実施例３
腫瘍関連抗原に対するＳＣＴ機能アッセイ
ＳＣＴコンストラクトの機能性を検証するために、公知のＴＣＲに対して様々な設計にわたってＳＣＴ結合効率を評価した。ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）ペプチド（ＲＭＦＮＡＰＹＬ；配列番号２２）について、この一連の６つのＳＣＴ（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ７収率は、使用するには低すぎた）の結合を、インビボでの該ペプチドに対する反応性について他のものによって特徴付けられているＷＴ１特異的Ｃ４ ＴＣＲ（図４）に対して評価した。発現ＷＴ１ ＳＣＴを精製し、Ｃ４ ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞とＭＡＲＴ－１特異的Ｆ５ ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞との９５／５混合集団に対する結合アッセイに使用した。ＷＴ１特異的Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＷＴ１ ＳＣＴによる結合の程度の有意差が観察された。Ｈ７４Ｌ ＳＣＴバリアント（Ｄ６およびＤ８）は、最も低い性能を示し、野生型Ｈ７４対応物と比較して、ゲート内でおよそ２倍少ない細胞を捕捉した。ＷＴ１のＤＳ－ＳＣＴバリアントは、Ｃ４ ＴＣＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する同じアッセイで最良の結合効率を示し、ＷＴ１特異的細胞集団の９７．３％を捕捉した。同様のアッセイを、Ｆ５ ＴＣＲ形質導入ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞の純粋な集団に対するＭＡＲＴ－１エピトープについて実施して、同様の結果を得た。その結果、ＤＳ－ＳＣＴテンプレートを、将来の実験におけるペプチドライブラリのために使用した。

実施例４
ウイルス抗原に対するＳＣＴ機能アッセイ
感染症における使用事例に向けてプラットフォームを拡張するために、一般的なウイルスエピトープを標的とする小さなＳＣＴライブラリを発現させた。文献に一般的に報告されている合計６６個のＡ＊０２：０１またはＡ＊２４：０２ウイルスエピトープに対するプラスミドテンプレートを構築した（表２および３）。以前のライブラリと同様に、すべてのプラスミドはペプチド依存性ＳＣＴ発現を示した（図５）。ＳＣＴをタンパク質発現によってランク付けし、２つのＨＬＡ型の各々からの一般的なウイルス株（ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、およびロタウイルス）に由来し、最も高いＳＣＴ発現をもたらす１０個のエピトープを、抗原特異的特異的Ｔ細胞の同定における更なる使用のために選択した。ＨＬＡ一致健常ドナーから得たＰＢＭＣを、これらのエピトープを含有する対応するペプチドプールでおよそ１ヶ月にわたって毎週再刺激して、ペプチド特異的クローン型の増殖を誘導した。各ドナーについて、同じＰＢＭＣ由来の１０株の細胞をこれらの条件下で刺激した。ペプチドで刺激され、増殖したＴ細胞株を、ＳＣＴ四量体で選別し、ほとんどのペプチドについて、刺激されていない対応物と比較して、有意に多い量の四量体結合集団を示した。これは、ＳＣＴが、ネイティブな表面結合ＭＨＣ複合体に結合した同じエピトープを認識する同族ＴＣＲを捕捉できることを実証している。

ＳＣＴの機能的能力をさらに評価するために、ＳＣＴデキストラマーによって捕捉されたＴＣＲα鎖およびβ鎖由来のＣＤＲ３領域の配列を照会した。健常Ａ＊０２：０１ドナーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５タンパク質に由来するペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号４４）に対して陽性反応性を有すると同定された。このＳＣＴ要素およびそのフォールディングされたｐＭＨＣ対応物を使用して、ドナーＰＢＭＣ（図６）からＣＭＶ特異的Ｔ細胞を選別した。選別された集団の１０倍の単一細胞シーケンシングにより、２つの試薬によって捕捉された抗原特異的クローンの同様の分布が明らかになった。表４に見られるように、公開データベース（ＶＤＪｄｂ）に対するＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３β鎖のレーベンシュタイン距離（ＬＤ）は低く、検出されたＣＭＶ特異的ＴＣＲ鎖と以前に報告されたものとの間の高い類似性を示している。２対のクローン（図６の赤色および薄オレンジ色のウェッジ）は、文献の結果と正確に一致するＣＤＲ３α鎖を含んでいた（ＬＤ＝０）。更なるクローン（図６の薄緑色のウェッジ）は、両方の鎖がＣＭＶ特異的であると報告されているα／β対を含み、１０倍高い頻度でＳＣＴによって捕捉された。これらの結果は、ＳＣＴ四量体が、フォールディングされたｐＭＨＣのゴールドスタンダードと少なくとも同様のフローサイトメトリー性能を有することを示している。

実施例５
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原特異的Ｔ細胞の計数
この実施例は、２０２０年５月８日にＣｈｏｕｒら、ｍｅｄＲｘｉｖ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．０４．２００８５７７９として（修正された形式で）以前に公開されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

方法
ｐＭＨＣは、候補ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来スパイクタンパク質またはＮｓｐ３エピトープ、ＭＨＣのβ－２ミクログロブリンサブユニット、およびＭＨＣのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）サブユニットを含むプラスミドにコードされた単鎖三量体の形態で設計された。最適化されたプラットフォームを利用して、スパイクタンパク質に対して約１１８個、Ｎｓｐ３に対して７５個の生存ＳＣＴコンストラクトを発現させた。８８個のスパイクＳＣＴおよび７５個のＮｓｐ３ ＳＣＴを四量体としてナノ粒子核酸細胞選別（ＮＰ－ＮＡＣＳ）システムに組み込み、高アビディティーＴＣＲ捕捉剤を生成した。最後に、ＮＰ－ＮＡＣＳを、目的の３つのＨＬＡ対立遺伝子をカバーする８名のＣＯＶＩＤ－１９参加者、ならびに４つのＨＬＡ適合健常ドナーＰＢＭＣサンプルの採血から得られた抗原特異的Ｔ細胞の同定および分析に適用した。

サンプル採取：すべてのヒトサンプル（血液）を、ＣＯＶＩＤ－１９参加者を試験するためのＳｗｅｄｉｓｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩＮＣＯＶ試験の一環として、研究機関の承認および参加者の書面によるインフォームドコンセントの後に得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、凍結保存した。それらは、３つの時点までの参加者から採取された：Ｔ１（診断）、Ｔ２（診断後４～５日）、およびＴ３（回復期）。１８６個のユニークな参加者サンプルをＨＬＡハプロタイピング（Ｃｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のために提出した。すべてのサンプルの中で、本発明者らは、Ａ＊０２：０１、Ａ＊２４：０２、およびＢ＊０７：０２対立遺伝子が最も一般的であると同定し、したがって、ＳＣＴコンストラクトを使用した更なる分析のために、これらの対立遺伝子を有する参加者についてフィルタリングした。

ＳＣＴプラスミド構築およびタンパク質発現：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＣＴライブラリを構築するために、同定されたペプチドをテンプレートＳＣＴプラスミドへの挿入のためのプライマーにコード化した（実施例１で考察）。その後、ペプチド置換ＳＣＴプラスミドライブラリをＥｘｐｉ２９３細胞に約４日間トランスフェクトした。分泌されたＳＣＴタンパク質を上清から回収し、ビオチン化し、ＨｉｓＴａｇカラムによって精製した。

ＳＣＴ多量体アッセイ：ＳＣＴ単量体ライブラリをビオチン化し、種々の下流アッセイのための標準的な四量体足場に組み込むことができる。次いで、ＳＣＴ四量体を磁性ナノ粒子の表面上に集合させて、血球計算蛍光顕微鏡アッセイのためのｐＭＨＣ－ナノ粒子（ｐＮＰ）ライブラリを形成することができる。さらに、これらのＳＣＴは、１０倍単一細胞シーケンシング実験で使用するためのデキストラマーを形成するためにＩｍｍｕｄｅｘ Ｋｌｉｃｋｍｅｒ試薬とともに使用することができる。ｐＮＰライブラリは、すべての分析が溶液中で行われるので、エアロゾル化されたＣＯＶＩＤ－１９患者の生体サンプルからのリスクを回避するという点で有利である。ＮＰ－ＮＡＣＳシステムを使用する以前の研究は、このプラットフォームの感度の向上を強調しており、ＰＢＭＣから直接抽出された非増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞でのその使用を可能にする。しかしながら、捕捉された細胞からのＴＣＲ配列の計数は困難であり、単一細胞シーケンシングを可能にするために更なるマイクロ流体適合を必要とする。ＮＰ－ＮＡＣＳと比較して、ＳＣＴ四量体を使用するフローサイトメトリーアッセイはスループットが高く、バルクシーケンシングアッセイと組み合わせて抗原特異的ＴＣＲ配列を同定することができるが、四量体による特異的結合の程度は、顕微鏡レベルで四量体染色を視覚化することができないため、解決がより困難である。デキストラマー／１０倍アッセイは、フローサイトメトリーのための四量体と同様の様式で利用され、ＴＣＲ配列の抗原対合を可能にするが、他のアプローチと比較して、比較的高価であり、スループットが低く、１回のランで最大１０，０００個の細胞の分析しか可能でない。配列決定されたＴＣＲが抗原特異的Ｔ細胞に由来するという信頼性を最大化するために、後者の２つのアッセイは、ＳＣＴ捕捉またはペプチド刺激のいずれかの後に増殖させたＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて行った。

システイン修飾ストレプトアビジン－ＤＮＡ（ＳＡＣ－ＤＮＡ）コンジュゲートの作製：以下のようにしてＳＡＣ－ＤＮＡコンジュゲートを作製した。簡潔には、ＳＡＣ遺伝子（Ａｄｄｇｅｎｅ）を含有するｐＴＳＡ－ＣプラスミドからＳＡＣを最初に発現させた。ＤＮＡへのコンジュゲーションの前に、ＳＡＣ（１ｍｇ／ｍｌ）を、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、５ｍＭ）を含有するＰＢＳに緩衝液交換した。次いで、ＤＭＦ中３－Ｎ－マレイミド－６－ヒドラジニウムピリジン塩酸塩（ＭＨＰＨ、１００ｍＭ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を３００：１のモル過剰でＳＡＣに添加した。一方、ＤＭＦ中の４－ホルミル安息香酸スクシンイミジル（ＳＦＢ、１００ｍＭ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を、５’－アミン修飾ｓｓＤＮＡ（５００μＭ）に４０：１のモル比で添加した。室温（ＲＴ）で４時間反応させた後、ＭＨＰＨ標識ＳＡＣとＳＦＢ標識ＤＮＡとをクエン酸緩衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＤＮＡ：ＳＡＣ＝２０：１の割合で混合し、ＲＴで一晩反応させた。ＳＡＣ－ＤＮＡコンジュゲートを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ）を使用して精製し、１０Ｋ ＭＷＣＯ超遠心フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。

ＣＯＶＩＤ ＳＣＴ ｐＮＰライブラリの構築：ストレプトアビジン被覆ＮＰ（半径５００ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｔ１）を、ビオチン化核酸結合のための製造業者の推奨プロトコルに従って調製した。これらのＮＰをバーコード化ビオチン－ｓｓＤＮＡ（１００μＭ）と１：２０の体積比で混合してＮＰ－ＤＮＡを得た。過剰なＤＮＡを、ＮＰを３回洗浄することによって除去した。並行して、ＳＣＴモノマーライブラリを４：１の比でＳＡＣＤＮＡに添加して、ＳＣＴ四量体－ＤＮＡを形成した。蛍光ｐＮＰを生成するために、等モル量（ＤＮＡ比に関して）のＮＰ－ＤＮＡおよびｐＭＨＣ四量体－ＤＮＡを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８またはＣｙ５に結合した０．２５μｌの１００μＭ ｓｓＤＮＡ（ＩＤＴ－ＤＮＡ）とともに３７℃で２０分間ハイブリダイズさせ、緩衝液（０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＢＳ）で１回洗浄した。３つの色素の使用は、分析ごとに最大３つのユニークな抗原ｐＮＰの多重化を可能にする。典型的には、１００，０００個未満の細胞の各ＮＰバーコード化ＮＡＣＳ分析は、ライブラリ要素当たり２．５μＬのストックＮＰ（合計２８２０万粒子）を使用する。

ＰＢＭＣ懸濁液からのＣＤ８^＋Ｔ細胞の調製および単離：ＰＢＭＣを解凍し、１０％ＦＢＳおよびＩＬ２（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートして、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩回収した。回収された細胞生存率は、すべてのサンプルについて＞９５％で測定された。ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ国ベルギッシュグラートバハ）を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団をネガティブ選択した。簡潔には、回収した細胞を、ＰＢＭＣ中のＣＤ８－細胞を捕捉するビオチン化抗体カクテル、続いてストレプトアビジン被覆マイクロビーズとともにインキュベートした。触れていないＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＬＳカラムを使用して１５ｍＬファルコンチューブで分離した。次いで、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むチューブを５００ｇで５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。多重細胞標識のために、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｃａｌｃｅｉｎ Ｂｌｕｅ、ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＲＡ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、それぞれ４μＭおよび４００ｎＭの濃度で個々に染色した。５％ＣＯ_２下、３７℃で１０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞懸濁緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁した。

ＮＰ－ＮＡＣＳによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の同定：ｐＮＰライブラリを３つのｐＮＰの群に合わせ、３つのバーコード色素のうちの１つで染色した群の各ｐＮＰ要素を用いた。各ｐＮＰ群から、７．５μｌを染色ＣＤ８^＋Ｔ細胞の各アリコートとともに室温で３０分間インキュベートした。抗原特異的細胞を磁気プルダウンによって濃縮し、６μｌの０．１％ＢＳＡ ２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。次いで、捕捉した細胞を４チップ使い捨て血球計（Ｂｕｌｌｄｏｇ－Ｂｉｏ）にロードした。血球計チップ内の全領域を撮像して、総プルダウン細胞数を得た。非特異的結合事象の検出および排除を含む抗原特異的Ｔ細胞の同定を、ｃｅｌｌＳｅｎｓ ＯｌｙｍｐｕｓソフトウェアおよびＲプログラミング言語を用いて行った。

四量体結合フローアッセイ：フローアッセイのための四量体フォーマットのＳＣＴの使用については、実施例１を参照されたい。１０倍用のデキストラマーフォーマットのＳＣＴの使用も同様のプロトコルに従い、ストレプトアビジンをＩｍｍｕｄｅｘデキストラマー／Ｋｌｉｃｋｍｅｒ試薬で置き換え、染色および洗浄のための下流プロトコルは同一であった。１０倍単一細胞サンプル提出のために、製造業者の推奨およびプロトコルを利用した。

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を広く調査するために、診断（Ｔ１）から診断後４～５日（Ｔ２）～回復期（Ｔ３）までの３つの時点にわたって、入院ＣＯＶＩＤ参加者のＰＢＭＣサンプルを採血から収集した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質のペプチドプールによる刺激に基づくＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、２つのＣＯＶＩＤ参加者ＰＢＭＣサンプルからのＩＦＮ－γ産生の有意な増加を健常ドナー対照に対して示した（図７）。ＩＮＣＯＶ参加者の中では、ＩＦＮ－シグネチャーの増加が主にＴ２で検出され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するエピトープ特異的応答が感染後に経時的に発症したことが示された。

最近の報告では、入院しているＣＯＶＩＤ患者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞レパートリーが、疲弊した表現型の大部分と、疾患重症度と相関する全体的に低いＣＤ８^＋Ｔ細胞数とからなることが示されている。潜在的に希少なものまたは枯渇したものを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のエピトープランドスケープを列挙するために、ＰＢＭＣを、刺激／拡大に基づく方法に頼るのではなく、直接プローブした。このアプローチは、検出されたエピトープの分布をゆがめる可能性がある、拡大不可能な表現型を有する抗原特異的Ｔ細胞に対する潜在的なバイアスを防止する。増殖ステップが存在しないことを説明するために、磁性粒子上に数千の四量体を付着させるＮＰ－ＮＡＣＳプラットフォームを使用して捕捉感度を最大化し、０．００１％という低い周波数でクローンＣＤ８^＋Ｔ細胞の高感度の磁気単離および検出を可能にした。未増殖ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中で可能な限り多くの抗原特異性を捕捉するために、ＳＣＴプラットフォームを使用して捕捉幅を広げ、数百のｐＭＨＣを作製した。目的のタンパク質由来の９～１１量体のペプチド配列を、ＮｅｔＭＨＣ４．０結合予測アルゴリズムに登録した。スパイクタンパク質については、５００ｎＭまたはより強い結合親和性を有する、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、Ｂ＊０７：０２およびＡ＊２４：０２対立遺伝子についてそれぞれ９６、３３および５１のペプチドを同定した（図示せず）。

このフィルタリングされたペプチドリストを使用して、ＳＣＴプラットフォームを使用してｐＭＨＣコード化プラスミドを開発した。スパイクタンパク質ドメインマップに沿ったエピトープに対するＳＣＴタンパク質発現の分布は、各ハプロタイプに固有であった。Ａ＊０２：０１ＳＣＴは、ＴＭ（弱い発現）を除くすべてのドメインにわたってエピトープについて比較的不均一なレベルの発現を示した（図８Ａ～図８Ｄ）。Ｂ＊０７：０２ ＳＣＴ発現は、ＮＴＤ、Ｓ１／Ｓ２切断部位およびＳ２サブユニットの一部に対する優先性を示したが、高度に発現したＡ＊２４：０２ ＳＣＴは、ＮＴＤ、ＲＢＤおよびＴＭ領域の周りに集中しているようであった。これらの分布は、ＳＣＴ産生前のフィルタリングステップとしてのＮｅｔＭＨＣ４．０の使用に起因する人工的な選択バイアスによって部分的にゆがんでいる。したがって、これらのＳＣＴのある程度の表現は、アルゴリズムの予測強度を反映したものである。さらに、結果は、ＨＬＡ対立遺伝子にわたって存在する生物学的差異の解釈とみなすことができる。各ＨＬＡの結合内の親水性／疎水性の優先性の差は、スパイクドメインに見られる特定のペプチドモチーフについての各ｐＭＨＣコンストラクトの安定性を偏らせる。

ＳＣＴ多量体は、健常ドナーおよびＣＯＶＩＤ－１９ドナーからの抗原特異的Ｔ細胞を同定することができる：３つのライブラリの各々からの最も高発現のＳＣＴをＮＰ－ＮＡＣＳ試薬として利用して、ハプロタイプ当たり２名の参加者および少なくとも１名の健常対照からのＣＯＶＩＤ ＰＢＭＣ中の抗原特異的Ｔ細胞を同定した（図９）。各ＨＬＡハプロタイプについて、ＮＰ ＮＡＣＳアッセイは、サンプルの疾患状態にかかわらず、ライブラリごとにエピトープの共有サブセットに対して抗原特異的Ｔ細胞を同定することができた。しかしながら、ＣＯＶＩＤ参加者は、健常対照と比較して、各上位エピトープに対して有意に高い頻度の抗原特異的Ｔ細胞を含んでいた。これらの共有免疫優性エピトープは、ＣＯＶＩＤ参加者のサンプル採取の両方の時点で検出され、各々の相対頻度の変動があり、おそらく免疫応答全体にわたる各エピトープに対するクローン型拡張の変動を示している。これらの知見は、免疫優性エピトープが、健常な対照の間でさえ、同じＨＬＡハプロタイプの個体の間に存在すること、および検出の程度が疾患状態の経過を通して進化することを示唆している。

抗原特異的Ｔ細胞はＮＰ－ＮＡＣＳによって検出されたが、これらの細胞がそれらのエピトープによって誘導されて実際の免疫応答を起こすことができるのかについては疑問が残った。Ａ＊０２：０１アッセイまたはＢ＊０７：０２アッセイのいずれかから検出されたエピトープを含む５つのペプチドを合成し、ＨＬＡ適合ＰＢＭＣを刺激するためにＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用した。Ａ＊０２：０１アッセイ（図１０Ａ）では、疾患および健常なＰＢＭＣの両方において、ペプチドへの曝露時にＩＦＮ－γ分泌が上方制御された。しかし、ペプチドごとにＩＦＮ－γのアップレギュレーションの程度にばらつきがあった。ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ（配列番号１１３）は、ＩＮＣＯＶ ＰＢＭＣにおいて最も強い応答を誘導したが、健常なＰＢＭＣについては、ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号１１４）は、ＩＮＣＯＶサンプルで見られる他のペプチド応答と比較した場合、最も強い応答を、より大きな程度まで誘導した。ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号１１４）ＳＣＴがＮＰ－ＮＡＣＳにおいて最も高い頻度の細胞を捕捉したが、ＩＮＣＯＶサンプルにおいて有意に低下したＩＦＮ－ｇ応答をもたらした一方で、健常ドナーは反対の結果をもたらしたという事実は、このペプチドがおそらく免疫原性であるが、疾患状態においてＴ細胞疲弊を引き起こし得ることを示している。別のペプチドのセット（図１０Ｂ）を使用して、Ｂ＊０７：０２ ＰＢＭＣについて同様のアッセイを行った。ここで、健常Ｂ＊０７：０２ドナーＰＢＭＣは、いかなるペプチドによる刺激にも応答しなかったが、ＩＮＣＯＶ ＰＢＭＣは、ペプチド刺激のみでＩＦＮ－γを分泌した。しかしながら、ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号１１４）は、Ａ＊０２：０１ＨＬＡ対立遺伝子のみに対する予測されたバインダーであったので、これらのＰＢＭＣに対するＩＦＮ－γ分泌を誘導すると予想されなかった。ＩＮＣＯＶ－００４サンプルのより深いＨＬＡ分析により、この参加者もＡ＊０２：０１に対して陽性であることが明らかになったので、このペプチドによる活性化が予想された。しかしながら、ＩＮＣＯＶ－００６は、Ａ＊０２：０１ハプロタイプを保有しなかった。ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号１１４）ペプチドは、この参加者の他のＨＬＡ対立遺伝子によって提示され得ることであり得る。

他のウイルス研究で報告されているように、非構造タンパク質はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に優先的である傾向がある。この知見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の文脈に適用可能であれば、標的ワクチン開発に非常に有益であろう。そのような目的のドメインの１つであるＮｓｐ３は、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）をコードし、これは、感染サイクルの初期段階で重要な役割を果たすことが他のコロナウイルス株において同定されており、感染および構造ウイルス要素の構築を担う他の非構造要素を処理する。したがって、Ｎｓｐ３は、スパイクタンパク質などの構造要素よりもはるかに早く発現される。したがって、Ｎｓｐ３エピトープはまた、構造タンパク質に由来するエピトープよりも早く免疫系によって調査される可能性がある。１９１個のＮｓｐ３ペプチドにコードされたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＳＣＴプラスミドを作製し、それらのおよそ１００個をビオチン化および四量体化に十分な程度まで発現させ、上位７５個の発現されたＳＣＴをＮＰ－ＮＡＣＳにおいて利用して、２名のＣＯＶＩＤ参加者および２名の健常対照において抗原特異的Ｔ細胞を同定した（図１１）。ここでも、健常なＰＢＭＣとＣＯＶＩＤ ＰＢＭＣとの両方が、同じエピトープに対する反応性を示した。しかしながら、ＰＬｐｒｏエピトープについての相対カウントは、スパイクエピトープについての相対カウントよりもはるかに高かった。驚くべきことに、いくつかのエピトープについて、健常なＰＢＭＣは、ちょうど高い応答を与えた。この知見は、類似のエピトープを有するコロナウイルス株に以前から曝露されていたことを暗示している可能性がある。

ＳＣＴは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的な高スループット発見を可能にする
ＴＣＲ配列：ＮＰ－ＮＡＣＳプラットフォームは、初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞からの免疫原性抗原の迅速な同定を可能にしたが、ＴＣＲ配列は更なる機能的検証に必要であった。ＮＰ－ＮＡＣＳナノ粒子骨格によって付与される更なる結合活性がなければ、四量体／デキストラマー結合アッセイは、ある程度のユニークな非特異的結合を有すると予想される。これは、初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて作業する場合、それらの頻度が低く、一般に細胞の質が低いため、抗原特異性の同定を困難にするであろう。したがって、各患者のＳＣＴ四量体プールを使用して、細胞を最初に初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞について選別した（四量体プールは、参加者のＨＬＡハプロタイプと一致する合成されたすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＣＴからなっていた）。次いで、選別された各集団を約２週間増殖させて、量および生存率を改善した。その後、細胞を、それぞれのライブラリ内の個々のＳＣＴ四量体によって選別し、ＴＣＲクローン型の選別された各集団を標的抗原と会合させることができるようにした。サンプルのＮＧＳバルクシーケンシングにより、ほとんどの患者にわたってスパイク抗原およびＰＬｐｒｏ抗原のサブセットに対する抗原特異的集団が明らかにされた（図１２）。検出可能なＴ細胞集団を有する２１個のユニークなペプチドのうち、８つが複数の患者にわたって見出された。患者サンプルのうちの２つは、おそらく、プールされた四量体選別ステップ中に低計数の四量体結合細胞を採取した後の非特異的Ｔ細胞の生存率の低下または偏った増殖のために、増殖プロセス後にバルクシーケンシングによって捕捉された細胞を有していなかった。

バルクシーケンシングアプローチを補完するために、拡大されたＴ細胞集団に対する単一細胞シーケンシングを行って、見逃された可能性がある任意の一般的なクローン型を同定した。増殖させた細胞をＤＮＡハッシュタグで染色して、患者の身元をコード化した。次いで、各々が抗原コードＤＮＡバーコードを含有する指定された組のＳＣＴデキストラマーで染色した。過剰なデキストラマーを洗浄した後、複数の患者からの染色されたＴ細胞を一緒に組み合わせ、１０倍単一細胞シーケンシングにかけた。ＳＣＴ捕捉の質を評価するために、デキストラマー結合頻度および不均一性を定量化した。１０倍データを最初に選別して、クローン型当たりの優勢なデキストラマーに対して検出された２４～９５９個の抗原特異的細胞の頻度範囲を包含する、最も高い頻度の均質なデキストラマー結合（細胞当たり１つのユニークなデキストラマーバーコードからのみのシグナル）を有する上位２０個のクローン型を同定した（図１３および表５）。これらの２０個のクローン型のデキストラマーＩＤを、Ａ＊０２：０１およびＢ＊０７：０２にわたる６つのユニークなエピトープに対する特異性を明らかにするためにそれらの関連するＳＣＴ同一性まで遡った。６つのエピトープのうち５つはスパイクタンパク質に由来し、１つはＰＬｐｒｏに由来した。各クローン型について、不均一に結合したデキストラマーを有する細胞（非特異的）は、均一に結合した細胞のものと同じＳＣＴに由来する支配的なデキストラマーシグナルを示したが（図示せず）、このシグナルは総デキストラマーシグナルの有意に小さい割合を含んでいた。これは、拡大ステップとそれに続くデキストラマーシグナルフィルタリングが、非特異的なデキストラマー結合によって引き起こされるバックグラウンドノイズの良好な低減を可能にすることを示している。単一細胞からの捕捉されたＴＣＲデータとバルクシーケンシングとの比較により、６つのＴＣＲクローン型の重複が明らかになった。四量体フォーマット（バルクシーケンシング）またはデキストラマーフォーマット（１０倍単一細胞）のいずれであっても、これらの６つのクローン型のうちの５つから同定されたＳＣＴ特異性は一致していた。

同定されたＴＣＲはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して機能的に応答性である
ペプチド：ＴＣＲを機能的に検証するために、バルクおよび１０倍単一細胞法からの配列決定結果を有病率によって選別し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９形質導入による初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞へのクローニングのために８６個のユニークなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを選択した。ペプチド特異性について最も一般的なクローン型を完全にスキャンするために、選択されたＴＣＲクローン型のいくつかは、二重ＴＣＲ受容体が検出された細胞についてａ／ｂ対の異なる組み合わせからなる（例えば、ＴＣＲ０８７および０９２は同じＴＣＲβ鎖を共有する）。形質導入されたＴ細胞を、対応する抗原特異性のＳＣＴ四量体で選別し、少なくとも２週間増殖させて細胞株を作製した。８６個のＴＣＲ配列のうち、少なくとも１３個は、増殖後にＳＣＴ四量体に特異的に結合することができた（図１４）。他のＴ細胞株による強力な四量体結合の欠如は、以下の原因によって説明することができた：１）二重ＴＣＲを有する細胞に由来する非産生ＴＣＲ対；２）１０倍またはバルク法によるＰＢＭＣからのＴ細胞の初期選別からのバックグラウンド細胞の採取；３）非産生Ｔ細胞の偏った増殖。１０倍由来ＴＣＲ配列のより大きな割合は、単一細胞シーケンシングアプローチの精度が向上したため、バルク由来ＴＣＲ配列と比較して生産的であった。

健常ドナーから得られたＴＣＲ００１および００２の初期機能検証により、ペプチド刺激がＣＤ１３７発現を誘導し得ることが実証された（図１５）。これは、同定されたＴＣＲが実際に生物学的ｐＭＨＣに結合し、下流活性化シグナルを誘導することができることを示す。さらに、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリーアッセイは、ペプチド刺激Ｔ細胞が、活性化時のＣＤ８^＋Ｔ細胞からの細胞傷害性応答に特徴的なサイトカイン（具体的には、ＴＮＦ－αは観察されたが、ＩＦＮ－γは観察されなかった）およびプロテアーゼ（グランザイムＢ）を放出するように誘導され得ることを実証した（図１５）。

実施例６
ＣＤ８阻害突然変異がＳＣＴ機能に及ぼす影響
ｐＭＨＣとのＣＤ８相互作用を遮断することが以前に報告されている２つの突然変異（Ｄ２２７ＫおよびＤ２２７Ｋ＋Ｔ２２３８Ａ）をＳＣＴプラットフォームに導入して、ＷＴ１ペプチドをロードしたＡ＊０２：０１ＳＣＴバリアントの小さなライブラリを作製した（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１）。ＷＴ１ ＳＣＴは、特定のテンプレート変異（図２Ｂおよび図１６Ａ）についてのみ発現することができた。その後、発現に成功したプラスミドテンプレートを、すべてのテンプレートにわたってＤ２２７ＫまたはＤ２２７Ｋ＋Ｔ２２８Ａのいずれかを一緒に導入するように突然変異させた。３つのＣＤ８相互作用バリアント（野生型（ＨＬＡ変異なし）、Ｄ２２７ＫまたはＤ２２７Ｋ＋Ｔ２２８Ａ）にわたる７つのコアテンプレートを含むこのライブラリの標準的なトランスフェクションを４日間にわたって実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して収率を特徴付けた（図１６Ａ）。ＷＴ１特異的Ａ＊０２：０１拘束性ＴＣＲ（ＣＤ４ｂａ）をＣＤ８＋細胞株またはＣＤ４^＋細胞株のいずれかに形質導入して、ＣＤ８補助受容体と相互作用するそれらの能力に対する様々なＨＬＡ突然変異の影響を評価した。

これらのＳＣＴのトランスフェクションは、各ＨＬＡ突然変異型にわたってテンプレート依存性収率をもたらした。システイン修飾Ｌ１リンカーを含有せず、Ｄ９に見られるポケット安定化ジチオール突然変異も有しないテンプレートＤ６およびＤ７は、他のテンプレートと比較して一貫して低い収率を与えた。非還元性のＳＤＳ－ＰＡＧＥ環境では、ＳＣＴの二重バンドパターンが観察された。このパターンはシステインリンカーを実装したテンプレートでのみ観察されたため、これは二重バンド化の原因であると考えられるが、機能に影響を与えることは予想されない（図１６Ｂの左上のプロットを参照されたい）。

ＴＣＲを形質導入された細胞株に対する四量体結合アッセイは、各ＨＬＡバリアントについて特徴的な結合パターンを示した。野生型ＳＣＴは、ＴＣＲを形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を染色するために使用された場合、同族ＴＣＲへの結合の成功度合いが様々であった（図１６Ｂおよび図４）。この野生型サブセットの中で、Ｄ３およびＤ９テンプレートは著しく高い結合効率を示し、全細胞の少なくとも９０％を捕捉した。Ｄ２２７ＫまたはＤ２２７Ｋ＿Ｔ２２８Ａ突然変異のいずれかが導入されると、依然としてある程度の結合能力を示したＤ２２７Ｋ＿Ｔ２２８Ａ Ｄ９バリアントを除いて、すべてのＳＣＴバリアントにわたるＴＣＲ結合の本質的に完全な消失が起こった（図１６Ｂ、左中および左下のプロット）。

ＴＣＲを形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞も試験して、これらのＴ細胞上にＣＤ８が存在しない場合でも、いずれかのＳＣＴバリアントによる結合をもたらし得るかどうかを調べた。図１６Ｂの上段のプロットに見られるように、野生型ＳＣＴは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する結合と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合の劇的な減少を示し、これらのＳＣＴバリアントのほとんどが、ｐＭＨＣ－ＴＣＲ親和性を促進するためにＣＤ８補助受容体に依存していたことを示している。ＣＤ８阻害変異を含むすべてのＳＣＴバリアントについて、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合効率は実質的に変化しなかった。

すべての細胞株およびＨＬＡ突然変異にわたって、Ｄ９ ＳＣＴテンプレートは、１０^３ＭＦＩ閾値を超えるシグナル保持に関して最良のバインダーであるようであった。実際、ＣＤ８相互作用が（ＣＤ８阻害性突然変異の導入またはＣＤ４によるＣＤ８の置換のいずれかによって）除去されるすべての場合にわたって見られるように、Ｄ９四量体は、ノイズを超えていくらかのシグナルを依然として生成することができた。他のペプチドおよび他のＨＬＡのためのＤ９ ＳＣＴは非特異的に結合しない（図示せず）。したがって、これらの結果は、ＴＣＲに対する親和性を高めるためのエピトープ提示に関して、Ｄ９テンプレートが他の設計と比較して改善され得ることを示すと解釈される。

別のＨＬＡ突然変異Ａ２４５Ｖは、ＴＣＲ活性化中にｐＭＨＣとのＣＤ８相互作用を減少させることが以前に実証されている。この突然変異は、非特異的Ｔ細胞の結合からバックグラウンドノイズを有意に減少させるその能力を示す、ＳＣＴのプライベートネオアンチゲンコード化ライブラリに対して実施された。メラノーマ患者のＡ＊０３：０１拘束性ペプチドについて、Ａ２４５Ｖ突然変異を有するＡ＊０３：０１ＳＣＴ（Ｄ３テンプレート）を作製した。このライブラリの発現結果（データは示さず）は、その野生型（Ａ２４５Ｖ突然変異なし）バリアントに対するペプチドにコードされたＳＣＴ当たりの発現タンパク質バンド強度に関して一致し、変異がトランスフェクト細胞のタンパク質発現能力に有意な影響を及ぼさなかったことを示した。続いて、ビオチン化精製ＳＣＴを、抗原特異的Ｔ細胞を検出するためにメラノーマ患者由来のＰＢＭＣサンプルに対して使用するために四量体化した。四量体を３つの群で利用して、フロー実験ごとに３つの抗原特異性を評価し、１つの抗原特異性をストレプトアビジン－ＰＥで四量体化し、他の２つの特異性をストレプトアビジン－ＡＰＣで四量体化した。この様式では、二重陽性蛍光シグナルの検出は、ＳＣＴ四量体の非特異的交差結合を示すであろう。ＡＰＣではなく有意なＰＥシグナルを示す細胞は、真に特異的なＴ細胞である。

Ａ２４５Ｖ突然変異を使用せずに３つのＳＣＴのセットに対してこの実験を行った場合（図１７Ａ）、有意な交差結合が観察され、四量体結合集団をフロープロット上の対角線で強くゆがんだ。

しかしながら、同じ抗原特異性のＳＣＴに対してＡ２４５Ｖ突然変異を実施した場合、この交差結合集団は本質的に除去された。さらに、ＰＥ特異的シグナル（多角形に結合した領域）に基づくＳＬＨＡＨＧＬＳＹＫ（配列番号１３４）特異的Ｔ細胞のカウントが増加した。これは、Ａ２４５Ｖ突然変異がなければ、非特異的に結合した細胞が四量体陽性集団を圧倒し、本質的に真の陽性リードが適切に検出されないことを隠すことを示唆する。ＣＤ８相互作用を阻害するためにＡ２４５Ｖ突然変異が挿入されると、真にＰＥ特異的集団の一部（図１７Ａの左側の楕円結合領域に見出される）は、ペプチド関連ＰＥ四量体にのみ結合し、したがってＰＥ特異的結合数を増加させる。

この実験設定をさらに３回繰り返し（図１７Ｂ）、各場合はストレプトアビジン－ＰＥで四量化された１つのＳＣＴと、ストレプトアビジン－ＡＰＣで四量化された２つのＳＣＴとのユニークな配置を有した。すべての場合において、野生型ＳＣＴ対Ａ２４５Ｖ ＳＣＴの結合結果を比較すると、２つの主要な観察があった。まず、ほとんどの細胞が１０^３ＭＦＩ（特異的結合を確立するためのカットオフ閾値）未満を示すように、全体的なシグナル強度が減少した。第２に、Ａ２４５Ｖ ＳＣＴ四量体染色の場合、１０^３ＭＦＩを超えるシグナルを生成した細胞は、一軸にのみ生じる傾向があり、これは、評価された３つのＳＣＴ四量体のうちの１つに対してのみ特異性を有し得ることを示している。これは、野生型ＳＣＴで観察されるものとは強く対照的であり、ここでも図１７Ａと同様に、非特異的結合事象が発生して斜めの対角線を生成する傾向が明らかにあった。

Ａ＊０３：０１ネオアンチゲンのためのＳＣＴライブラリ産生設計と同様に、Ａ２４５Ｖ突然変異を含有するＡ＊０２：０１ＳＣＴライブラリ（Ｄ８設計）を作製して、様々なＡ＊０２：０１ウイルスペプチドおよび細菌ペプチドをコードした。これらの要素のうちの４つを選択して、健常Ａ＊０２：０１ドナーサンプルから得られたＰＢＭＣに対する四量体結合アッセイに利用し、各アッセイについて、３つのウイルスペプチドＳＣＴ要素（ストレプトアビジン－ＰＥで四量体化）のうちの１つを染色前に細菌ＳＣＴ要素（ストレプトアビジン－ＡＰＣで四量体化）と混合した。ウイルス性ＳＣＴは、実質的にすべてのＡ＊０２：０１個体において同族ＴＣＲを有することが文献で報告されているＥＢＶ、ＣＭＶ、およびインフルエンザウイルスに由来するペプチドをコードするが、細菌性ＳＣＴは、この疾患の低い有病率を考慮すると、たいして反応性が予想されなかったＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）由来のペプチドをコードする。したがって、前者の要素は染色アッセイにおいて本質的に陽性対照として機能し、後者の要素は陰性対照として機能する。

図１８に見られるように、これらのＡ２４５Ｖ ＳＣＴのフローサイトメトリー結果は、Ａ＊０３：０１Ａ２４５Ｖ ＳＣＴ（図１７Ｂ）のプロファイルと著しく類似したプロファイルを示し、染色シグナルの大部分は左下象限内に含まれ、対角のゆがみは存在しなかった。これは、野生型ＳＣＴと比較して非特異的結合の強い減少を非常に示唆している。さらに、この実験において陽性シグナルを生成する細胞については、３つすべてのアッセイにおいて、これは四量体－ＰＥについてのみ観察され、共通のウイルスエピトープを提示するように設計された四量体によってのみ特異的結合が示された。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）抗原ＳＣＴ四量体による結合の欠如は、陰性対照結果の予想と一致している。

実施例７
ペプチド長がＳＣＴ発現に及ぼす影響
様々なテンプレート（図２）にわたるＳＣＴ発現の初期分析中に、驚くべきことに、１２量体のＹＭＬペプチドが発現可能であることが見出された。ＨＰＶ Ｅ７タンパク質（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣ；配列番号５）のペプチド配列を８～１４アミノ酸の長さに適合させた。これらのペプチドをコードするプライマーを逆ＰＣＲ反応で利用して、これらのコドンをＡ＊０２：０１ＳＣＴテンプレートのペプチド領域に挿入した（合計８設計）。プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトし、４日間インキュベートし、ＳＣＴ発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって測定した。熱シフトアッセイを行うことによって、ＳＣＴの熱安定性をさらに評価した。

ＹＭＬ ８量体を含有するすべてのＳＣＴは、一般に最も弱い発現を生じた（図１９）。８量体ペプチドのすべての設計テンプレートにわたる最も高い発現収率は、システインリンカーを含まないテンプレート設計を使用したものであった（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ６、Ｄ７）。１つの仮説は、システインリンカーが８量体を、安定化および発現に適していないＨＬＡの結合ポケット内の構成にすることである。高収率を有した８量体ＳＣＴの中で、Ｄ１バリアントはＤ２よりも高い発現をもたらし、Ｙ８４Ａ突然変異が安定化においてわずかに悪化し得ることを示した。これらの２つのテンプレート間の発現差は、Ｈ７４Ｌ突然変異が加えられたときに中程度に減少し（Ｄ６対Ｄ７）、収率は同等に見える。

９量体～１３量体のペプチドを有するＳＣＴは、すべてのテンプレートにわたって一貫した発現レベルを示した。９量体、１０量体、１１量体のＳＣＴは、Ｄ１では他のペプチドよりも相対的に発現が悪かったが、９量体はＤ２では相対的に悪かった。８量体と同様に、１４量体は、システインリンカーテンプレートを使用した場合、発現が著しく低下するようであった。Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ８について、１４量体は、同じテンプレートの９～１３量体と比較して著しく低い発現を示した。しかしながら、非システインリンカーテンプレート（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ６、Ｄ７）の場合、１４量体は、同じテンプレートのペプチドと比較して高発現ＳＣＴの中にランク付けされた。１４量体は、システインリンカーの存在によって拘束され得る。システイン連結の上流のすべてのアミノ酸をＣ末端ポケットエンクロージャの前方の結合溝に収まるようにすることで、導入された立体障害によりエピトープが溝に安定に結合したままにならない可能性が高くなる。この問題は、ペプチド長が増加するにつれてより明らかになり、他の長さに対する１４量体の発現差を説明する。

システインリンカーを有するすべてのテンプレートは、非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて二重バンドパターンを示した。これは、ＷＴ１ ＳＣＴを発現するときに以前に観察されたものと同様のテンプレート依存性現象である。

これらのＳＣＴの安定性をさらに評価するために、タンパク質の融解温度を実施した。図２０に見られるように、ペプチド系列にわたるＴｍ値は、ＳＣＴテンプレートおよびペプチド長に対する依存性を示した。すべてのペプチドにわたって、最も安定なコンストラクトは、システインリンカーテンプレートを使用したテンプレートからなっていた。システイン突然変異のないテンプレートは融解温度の劇的な低下を経て、およそ６℃低下した。

Ｈ７４Ｌ突然変異もまた、タンパク質安定性を増加させる別の重要な因子であった。この突然変異の存在を除いて同一であるテンプレート（Ｄ１対Ｄ６、Ｄ２対Ｄ７、Ｄ３対Ｄ８）を比較すると、Ｈ７４Ｌ突然変異を有するテンプレートは典型的にはより安定であった。ペプチド長に基づいてＴｍ値を調べると、８量体ＳＣＴの安定性が明らかに低下した。この長さを超えると、すべてのＳＣＴは安定性の実質的な改善を経験したが、９量体を除いて、９量体～１４量体についてテンプレート当たりの明確なＴｍ差はなく、Ｄ１およびＤ２は、１０量体またはそれよりも長いものについてそれらの対応物の予想される安定性よりもわずかに低い安定性を与えるようである。すべてのテンプレートにわたって最も安定なテンプレートは、一貫してＤ８テンプレートであった。Ｄ３ ＳＣＴ（Ｈ７４Ｌ突然変異を含まない）が常にＤ８よりも安定性が低かったことを考えると、Ｈ７４Ｌ突然変異は安定性の改善を説明する可能性が最も高い。

実施例８
養子移入細胞療法
この実施例は、抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞の集団を産生し、細胞を対象に投与するために使用することができる方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１つまたはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。

腫瘍を有する対象などの対象から抗原特異的Ｔ細胞受容体を同定し、ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を対象に投与するための例示的な方法を図２１に概略的に示す。健常な（非腫瘍）組織および腫瘍組織を抽出し、トランスクリプトームの配列決定によって分析して、対象のネオアンチゲンおよびＨＬＡハプロタイプも同定する。ペプチド－ＭＨＣ結合親和性予測を行って、ｐＭＨＣ生成のためのネオアンチゲンの最良のペプチド候補を同定する。次いで、本明細書に記載されるように、安定なｐＭＨＣを作製し、四量化する。これらは、抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するために使用される。捕捉されたＴ細胞由来のＴＣＲを配列決定し、プラスミド発現コンストラクト中で合成する。これらを健常なＴ細胞に形質転換し、養子細胞療法プロトコルによって対象に投与する。いくつかの例では、抗原特異的Ｔ細胞、形質転換Ｔ細胞、またはその両方は、処置中の対象に由来するが、他の例では、一方または両方が別の対象に由来し得る。

本開示の実施形態
実施形態１は、第１の核酸断片および第２の核酸断片を含む核酸断片対であって、アセンブリされると、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質をコードし、前記ＳＣＴは、作動可能に連結されたサブユニットとして、ペプチド、β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を含み、前記第１の核酸断片および前記第２の核酸断片は各々、前記β２ミクログロブリンタンパク質のアセンブリ部位の一部を含む、核酸断片対を含む。
実施形態２は、前記アセンブリ部位がギブソンアセンブリ部位である、実施形態１に記載の核酸断片対を含む。
実施形態３は、前記アセンブリされた核酸断片対によってコードされる前記ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質が、以下の順序：分泌シグナル、ペプチド、ペプチド－β２ｍリンカー（Ｌ１）、β２ｍ、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、ＨＬＡ、および必要に応じて１つまたはそれを超える精製タグ、でコードされるタンパク質サブユニットを含み、前記アセンブリ部位がβ２ｍの不変領域内に位置決めされている、実施形態１または２に記載の核酸断片対を含む。
実施形態４は、前記分泌シグナルが、ＨＬＡ分泌シグナル、インターフェロン－α２分泌シグナル、およびインターフェロン－γ分泌シグナルから選択される、実施形態３に記載の核酸断片対を含む。
実施形態５は、前記ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質が１つまたはそれを超える精製タグを含み、前記１つまたはそれを超える精製タグが、ビオチン化可能なペプチドおよびポリヒスチジンペプチドから選択される、実施形態３または４に記載の核酸断片対を含む。
実施形態６は、前記第２の核酸断片が、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖからなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むＨＬＡタンパク質をコードし、前記アミノ酸位置が配列番号３に対応する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の核酸断片対を含む。
実施形態７は、前記ペプチドが、抗原ペプチド、自己ペプチドまたはプレースホルダーペプチドである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸断片対を含む。
実施形態８は、前記抗原ペプチドが、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択される、実施形態７に記載の核酸断片対を含む。
実施形態９は、前記核酸断片対が、哺乳動物の発現のためにコドン最適化されている、実施形態１～８のいずれか１つに記載の核酸断片対を含む。
実施形態１０は、実施形態１～９のいずれか１つに記載のアセンブリされた核酸断片対を含む核酸分子であって、前記アセンブリされた核酸断片対が、前記第２の核酸断片に作動可能に連結された前記第１の核酸断片を含む、核酸分子を含む。
実施形態１１は、実施形態１０に記載の核酸分子を含むベクターを含む。
実施形態１２は、前記ベクターが、哺乳動物発現ベクターである、実施形態１１に記載のベクターを含む。
実施形態１１は、前記哺乳動物発現ベクターがプラスミドｐｃＤＮＡ３．１である、実施形態１２に記載のベクターを含む。
実施形態１４は、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載のベクターで形質転換されたヒト細胞株を含む。
実施形態１５は、前記細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、実施形態１４に記載のヒト細胞株を含む。
実施形態１６は、前記細胞株がＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株である、実施形態１５に記載のヒト細胞株を含む。
実施形態１７は、実施形態１～９のいずれか１つに記載の核酸断片対を複数含むライブラリを含む。
実施形態１８は、実施形態１７に記載のアセンブリされた核酸断片対を複数含むライブラリを含む。
実施形態１９は、ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質を含む。
実施形態２０は、前記ＳＣＴタンパク質が可溶性である、実施形態１９に記載のヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２１は、抗原ペプチド、自己ペプチド、またはプレースホルダーペプチドを含む、実施形態２０に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２２は、前記抗原ペプチドが、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択される、実施形態２１に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２３は、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ペプチド、ペプチド－β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質リンカー（Ｌ１）、β２ｍタンパク質、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、およびＨＬＡタンパク質を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２４は、前記ＨＬＡタンパク質が、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖからなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸位置が配列番号３に対応する、実施形態２３に記載のヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２５は、１つまたはそれを超える精製タグをさらに含む、実施形態２３または２４に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２６は、前記１つまたはそれを超える精製タグが、ビオチン化可能なペプチドおよびポリヒスチジンペプチドから選択される、実施形態２５に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２７は、前記ＳＣＴタンパク質が、安定な多量体としてアセンブリされる、実施形態２０～２６のいずれか１つに記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２８は、前記安定な多量体が四量体である、実施形態２７に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態２９は、前記安定な多量体がポリマーまたはナノ粒子足場に結合している、実施形態２７または２８に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を含む。
実施形態３０は、実施形態２０～２６のいずれか１つに記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を複数含むライブラリを含む。
実施形態３１は、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の安定な多量体を複数含むライブラリを含む。
実施形態３２は、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定する方法であって、
Ｔ細胞集団を、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の前記安定な多量体のうちの１つまたはそれを超えるものと接触させることと、
それに対して反応性のＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定することと
を含む、方法を含む。
実施形態３３は、前記同定された抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定することと、
前記抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を産生することと
をさらに含む、実施形態３２に記載の方法を含む。
実施形態３４は、前記抗原特異的ＴＣＲを発現する前記Ｔ細胞の集団を、前記Ｔ細胞の集団の投与を必要とする対象に投与することをさらに含む、実施形態３３に記載の方法を含む。
実施形態３５は、前記対象が癌を有し、前記抗原特異的ＴＣＲが前記対象から得られた腫瘍サンプルからの抗原に対して反応性である、実施形態３４に記載の方法を含む。

本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は単なる例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の範囲に含まれるすべてのものを本発明として主張する。

Claims (35)

1. 第１の核酸断片および第２の核酸断片を含む核酸断片対であって、アセンブリされると、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質をコードし、前記ＳＣＴは、作動可能に連結されたサブユニットとして、ペプチド、β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を含み、前記第１の核酸断片および前記第２の核酸断片は各々、前記β２ミクログロブリンタンパク質のアセンブリ部位の一部を含む、核酸断片対。
2. 前記アセンブリ部位がギブソンアセンブリ部位である、請求項１に記載の核酸断片対。
3. 前記アセンブリされた核酸断片対によってコードされる前記ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質が、以下の順序：分泌シグナル、ペプチド、ペプチド－β２ｍリンカー（Ｌ１）、β２ｍ、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、ＨＬＡ、および必要に応じて１つまたはそれを超える精製タグ、でコードされるタンパク質サブユニットを含み、前記アセンブリ部位がβ２ｍの不変領域内に位置決めされている、請求項１に記載の核酸断片対。
4. 前記分泌シグナルが、ＨＬＡ分泌シグナル、インターフェロン－α２分泌シグナル、およびインターフェロン－γ分泌シグナルから選択される、請求項３に記載の核酸断片対。
5. 前記ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質が１つまたはそれを超える精製タグを含み、前記１つまたはそれを超える精製タグが、ビオチン化可能なペプチドおよびポリヒスチジンペプチドから選択される、請求項３に記載の核酸断片対。
6. 前記第２の核酸断片が、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖからなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むＨＬＡタンパク質をコードし、前記アミノ酸位置が配列番号３に対応する、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸断片対。
7. 前記ペプチドが、抗原ペプチド、自己ペプチドまたはプレースホルダーペプチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸断片対。
8. 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択される、請求項７に記載の核酸断片対。
9. 前記核酸断片対が、哺乳動物の発現のためにコドン最適化されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸断片対。
10. 請求項１～５のいずれか１項に記載のアセンブリされた核酸断片対を含む核酸分子であって、前記アセンブリされた核酸断片対が、前記第２の核酸断片に作動可能に連結された前記第１の核酸断片を含む、核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
12. 前記ベクターが、哺乳動物発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
13. 前記哺乳動物発現ベクターがプラスミドｐｃＤＮＡ３．１である、請求項１２に記載のベクター。
14. 請求項１１に記載のベクターで形質転換されたヒト細胞株。
15. 前記細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１４に記載のヒト細胞株。
16. 前記細胞株がＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株である、請求項１５に記載のヒト細胞株。
17. 請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸断片対を複数含むライブラリ。
18. 請求項１７に記載のアセンブリされた核酸断片対を複数含むライブラリ。
19. ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ単鎖三量体（ＳＣＴ）タンパク質。
20. 前記ＳＣＴタンパク質が可溶性である、請求項１９に記載のヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
21. 抗原ペプチド、自己ペプチド、またはプレースホルダーペプチドを含む、請求項２０に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
22. 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連ペプチド、ネオアンチゲンペプチド、自己免疫ペプチド、真菌ペプチド、細菌ペプチド、およびウイルスペプチドから選択される、請求項２１に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
23. Ｎ末端からＣ末端の順序で、ペプチド、ペプチド－β２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質リンカー（Ｌ１）、β２ｍタンパク質、β２ｍ－ＨＬＡリンカー（Ｌ２）、およびＨＬＡタンパク質を含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
24. 前記ＨＬＡタンパク質が、Ｈ７４Ｌ、Ｄ７４Ｌ、Ｙ８４Ｃ、Ｙ８４Ａ、Ａ１３９Ｃ、Ｄ２２７Ｋ、Ｔ２２８Ａ、およびＡ２４５Ｖからなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸位置が配列番号３に対応する、請求項２３に記載のヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
25. １つまたはそれを超える精製タグをさらに含む、請求項２３に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
26. 前記１つまたはそれを超える精製タグが、ビオチン化可能なペプチドおよびポリヒスチジンペプチドから選択される、請求項２５に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
27. 前記ＳＣＴタンパク質が、安定な多量体としてアセンブリされる、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
28. 前記安定な多量体が四量体である、請求項２７に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
29. 前記安定な多量体がポリマーまたはナノ粒子足場に結合している、請求項２７に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質。
30. 請求項２０～２２のいずれか１項に記載の可溶性ヒト－グリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質を複数含むライブラリ。
31. 請求項２７に記載の安定な多量体を複数含むライブラリ。
32. 抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定する方法であって、
    Ｔ細胞集団を、請求項２７に記載の可溶性ヒトグリコシル化ＭＨＣクラスＩ ＳＣＴタンパク質の前記安定な多量体のうちの１つまたはそれを超えるものと接触させることと、
    それに対して反応性のＣＤ８^＋Ｔ細胞を同定することと
    を含む、方法。
33. 前記同定された抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定することと、
    前記抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を産生することと
    をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記抗原特異的ＴＣＲを発現する前記Ｔ細胞の集団を、前記Ｔ細胞の集団の投与を必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記対象が癌を有し、前記抗原特異的ＴＣＲが前記対象から得られた腫瘍サンプルからの抗原に対して反応性である、請求項３４に記載の方法。

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