JP2022513705A - Ｈｌａ－ｅおよびｈｌａ－ｇ分子を含む人工抗原提示細胞、ならびに使用の方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ある特定の免疫細胞を活性化または抑制するために使用され得る、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、特に、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのいずれかを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように操作された、操作された赤血球細胞および除核細胞（例えば、除核赤血球細胞および血小板）に関する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合している外因性抗原ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、操作された除核赤血球細胞、例えば、網状赤血球または赤血球である。本開示の一部の実施形態では、除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、網状赤血球、赤血球または血小板である。
Description
関連出願
本出願は、２０１８年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７７４，８５７号に対する優先権の利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０１８年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７７４，８５７号に対する優先権の利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１９年１２月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、１２９２６７－０１０２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３７，４３３バイトのサイズである。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、自然免疫応答および適応免疫応答の間のリンクとしての役割を果たす。抗原の内部移行の際に、ＡＰＣは、共刺激シグナルと一緒に、細胞膜上のクラスＩおよびＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）において抗原（またはそれに由来するペプチド）を提示して、免疫細胞を制御することができる（例えば、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する）。抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化および／または増大は、がんなどの一部の疾患を処置するために望ましくあり得る。例えば、抗原特異的Ｔ細胞の集団を、プライミングして、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅して、対象への移植のための多数の腫瘍特異的Ｔ細胞を得ることができる。所望の抗原特異的免疫細胞の活性化および／または増大は、ｅｘ ｖｉｖｏで生じるＡＰＣを投与することによって達成し得る。例えば、樹状細胞（ＤＣ）は、ｅｘ ｖｉｖｏでのＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ））の刺激を最大化するために使用されている。しかしながら、臨床使用のためのｅｘ ｖｉｖｏでのＤＣの調製は、課題のままである（Ｋｉｍ ＪＶ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００４； ２２： ４０３－１０）。
合成生体材料を含む複数の系が、所望の免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞）を活性化および／または増大させるために操作により作製されている。これらの系は、ＤＣおよびＴ細胞の間の相互作用を模倣することによって作用し得る。例えば、ラテックスマイクロビーズ、ポリスチレンでコーティングされた磁気マイクロビーズおよび生分解性ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）微小粒子などのいくつかの細胞サイズの硬質ビーズが開発されている。免疫細胞の活性化および／または増大の誘導におけるこれらのビーズの有効性は、使用される材料の性質に非常に依存するように思われる。例えば、２００ｎｍより大きいビーズは、典型的には、接種の部位に保持されるが、より小さい粒子は、ＤＣによって取り込まれ得る（例えば、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ Ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ １１２： ２６－３４を参照されたい）。対照的に、天然ＡＰＣの膜は、これらのビーズの外面よりもはるかに動的である。したがって、治療目的で所望の免疫細胞を刺激するための改善された組成物および方法に対する必要性が残されている。好ましくは、これらの組成物は、それらが投与されて、所望の免疫細胞集団が活性化および／または誘導される対象において、自家であり、かつ長期のクリアランス速度を示す。
Ｋｉｍ ＪＶ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００４； ２２： ４０３－１０
Ｒｅｄｄｙ ｅｔ Ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ １１２： ２６－３４
本開示は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含むように操作されている、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、特に、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）に関する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合している外因性抗原ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、操作された除核赤血球細胞、例えば、網状赤血球または赤血球である。本開示の一部の実施形態では、除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、網状赤血球、赤血球または血小板である。
第１の態様では、本開示は、細胞表面に外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、外因性抗原提示ポリペプチドが、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチド、および外因性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している外因性抗原ポリペプチドを含む人工抗原提示細胞を特徴とする。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、Ｅ＊０１：０１：０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０１：０１：０３、Ｅ＊０１：０１：０１：０４、Ｅ＊０１：０１：０１：０５、Ｅ＊０１：０１：０１：０６、Ｅ＊０１：０１：０１：０７、Ｅ＊０１：０１：０１：０８、Ｅ＊０１：０１：０１：０９、Ｅ＊０１：０１：０１：１０、Ｅ＊０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０１、Ｅ＊０１：０３：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０４、Ｅ＊０１：０３：０２：０１、Ｅ＊０１：０３：０２：０２、Ｅ＊０１：０３：０３、Ｅ＊０１：０３：０４、Ｅ＊０１：０３：０５、Ｅ＊０１：０４、Ｅ＊０１：０５、Ｅ＊０１：０６、Ｅ＊０１：０７、Ｅ＊０１：０８Ｎ、Ｅ＊０１：０９およびＥ＊０１：１０からなる群から選択される対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１またはＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３対立遺伝子を含む。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、自己ペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、寛容原性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、自己免疫疾患抗原を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ＨＳＰ６０のリーダー配列（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）（配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、表１に列挙されたポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｅαドメインおよびβ２Ｍポリペプチド、またはそれらの断片を含む。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、膜アンカーに連結されている。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドにリンカーを介して連結された外因性抗原ポリペプチドを含む一本鎖融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、一本鎖融合タンパク質は、膜アンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。一部の実施形態では、膜アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質もしくはその膜貫通ドメイン、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）もしくはその膜貫通ドメインを含む。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に結合している。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに非共有結合的に結合している。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、約８アミノ酸長～約２４アミノ酸長の間である。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、細胞表面に外因性制御性Ｔ共刺激ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、外因性制御性Ｔ共刺激ポリペプチドは、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１５、ＴＮＦα、抗ＤＲ３アゴニスト、４－１ＢＢＬまたはＴＧＦβである。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、細胞表面に外因性共刺激ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、細胞表面に外因性共阻害ポリペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、赤血球である。
別の態様では、本開示は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を活性化するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによりＴｒｅｇ細胞を活性化する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、免疫細胞を阻害する方法であって、免疫細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより免疫細胞を阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞である。
別の態様では、本開示は、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、対象の免疫細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによりモジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する方法を特徴とする。一部の実施形態では、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
一態様では、本記載は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する対象を処置する方法であって、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップであって、ａＡＰＣが、抗原提示ポリペプチド、および抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞であり、抗原提示ポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む、ステップ、ならびにａＡＰＣを対象に投与するステップを含み、それにより自己免疫疾患または炎症性疾患を有する対象を処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、Ｔｆｈ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞によって媒介される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎炎、多発性硬化症、混合性結合組織障害、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、膜性糸球体腎炎、視神経脊髄炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、皮膚筋炎、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症、川崎病、ループス腎炎、結節性多発動脈炎、壊疽性膿皮症、脊椎関節炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎からなる群から選択される。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ＨＳＰ６０のリーダー配列（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）（配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、対象は、アレルギー性障害を有する。一部の実施形態では、アレルギー性障害は、Ｔｈ２細胞によって媒介される。
一部の実施形態では、対象は、炎症性疾患を有する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、心臓の炎症性疾患、肝臓の炎症性疾患、膵臓の炎症性疾患、皮膚の炎症性疾患、および／または胃腸（ＧＩ）管の炎症性疾患である。例えば、炎症性疾患は、限定されるものではないが、心筋炎、心筋症、心内膜炎、心膜炎、肝硬変、喘息（好酸球性または非好酸球性）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ、アレルギー反応、慢性気管支炎、肺気腫、過敏性肺炎、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープを伴うかまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、回腸炎、慢性炎症性腸疾患、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグストラウス症候群および炎症性疼痛を含む。
別の態様では、本開示は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を増大させる方法であって、対象から細胞の集団を入手するステップであって、集団が、Ｔｒｅｇ細胞を含む、ステップ、集団を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、集団をａＡＰＣと接触させるステップが、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップを含み、それによりＴｒｅｇ細胞の集団を増大させる方法を特徴とする。一部の実施形態では、本方法は、Ｔｒｅｇ細胞を細胞の集団から単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｔｒｅｇ細胞を対象に投与するステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド）をコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに除核および外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それによりａＡＰＣを作製するステップを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、本明細書に記載の外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、赤血球前駆有核細胞に導入するステップ、ならびに除核ならびに外因性抗原提示ポリペプチドおよび外因性抗原ポリペプチドの産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それによりａＡＰＣを作製するステップを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核細胞に導入するステップ、除核および外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ、ならびに操作された除核赤血球細胞を少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドが、操作された除核赤血球細胞の細胞表面に存在する外因性抗原提示ポリペプチドと結合している、ステップを含み、それによりａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
一部の実施形態では、外因性核酸は、ＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、外因性核酸は、ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、電気穿孔を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクションおよびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。
別の態様では、本開示は、細胞表面に外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、外因性抗原提示ポリペプチドが、ヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）ポリペプチド、および外因性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している外因性抗原ポリペプチドを含む人工抗原提示細胞を特徴とする。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６およびＨＬＡ－Ｇ７からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ５およびＨＬＡ－Ｇ６からなる群から選択される。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドが、モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を含む、本明細書に記載のａＡＰＣ。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｇαドメインおよびβ２Ｍポリペプチド、またはそれらの断片を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、膜アンカーに連結されている。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドにリンカーを介して連結された外因性抗原ポリペプチドを含む一本鎖融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、一本鎖融合タンパク質は、膜アンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。
一部の実施形態では、膜アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質もしくはその膜貫通ドメイン、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）もしくはその膜貫通ドメインを含む。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に結合している。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに非共有結合的に結合している。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、約８アミノ酸長～約２４アミノ酸長の間である。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる。一部の実施形態では、抑制することは、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、少なくとも１種の外因性共阻害ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ－１０である。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＢ細胞を抑制することができる。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＮＫ細胞を抑制することができる。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するマクロファージ細胞を抑制することができる。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用する樹状細胞を抑制することができる。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、細胞表面にチェックポイント分子をさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２およびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、赤血球である。
一態様では、本記載は、免疫細胞の活性を抑制する方法であって、免疫細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより免疫細胞の活性を抑制する方法を提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、マクロファージである。一部の実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。
別の態様では、本開示は、低減された免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、対象の免疫細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより低減された免疫応答の必要がある対象を処置する方法を特徴とする。
一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、ＧＶＨＤ、腎炎および多発性硬化症からなる群から選択される。
一部の実施形態では、対象は、炎症性疾患を有する。
一部の実施形態では、対象は、アレルギー性疾患を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、移植（例えば、臓器移植）の必要があるか、または移植（例えば、臓器移植）を受けている。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに除核および外因性抗原ポリペプチドの産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップを含み、それによりａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに除核および外因性抗原提示ポリペプチドと外因性抗原ポリペプチドとの両方の産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップを含み、それによりａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、除核および外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ、ならびに操作された除核赤血球細胞を少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドが、操作された除核赤血球細胞の細胞表面に存在する外因性抗原提示ポリペプチドと結合している、ステップを含み、それによりａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
一部の実施形態では、外因性核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、外因性核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、電気穿孔を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクションおよびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。
上記態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、赤血球細胞は、除核赤血球細胞である。
図面は、本開示の１つまたは複数の特色、態様または実施形態を説明することを目的とし、限定を意図するものではない。
本開示は、それらの表面（例えば、細胞膜）に、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の開発に基づく。一実施形態では、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドに結合している。
特に、本開示は、少なくとも一部分では、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）が、とりわけ、特異的免疫細胞をモジュレートすることができるという驚くべき知見に基づく。
一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣ細胞は、ＨＬＡ－Ｅを含み、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激または活性化することができる。Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、自己反応性をもたらすことが公知のＴ細胞である、濾胞ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）、Ｔｈ１細胞およびヘルパーＴ１７（Ｔｈ１７）を含む、他の免疫細胞の抑制または死滅をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣ細胞は、ＨＬＡ－Ｅを含み、例えば、ＮＫ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞などの他の免疫細胞を阻害または抑制することができる。
他の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣ細胞は、ＨＬＡ－Ｇを含み、ある特定の免疫細胞集団、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）などを阻害または抑制することができる。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＧおよびＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能を阻害すること、ＮＫ細胞およびＴ細胞の増殖を阻害すること、ＣＤ８およびＣＤ４制御性Ｔ細胞の生成を促進すること、ならびに／またはＤＣの成熟および抗原提示を阻害することができる。
したがって、本明細書に記載のａＡＰＣ細胞は、ＨＬＡ－Ｅおよび／もしくはＨＬＡ－Ｇを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、炎症性疾患または自己免疫疾患の処置において使用することができる。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、自己抗原またはそれらの部分、例えば、ＨＳＰ６０のリーダー配列などの抗原性外因性ペプチドに連結されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む一本鎖融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、ベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）ポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）を含むか、またはこれらからなる一本鎖融合ポリペプチドであり、一本鎖融合ポリペプチドは、必要に応じて、抗原性外因性ポリペプチドに連結されている。ＨＬＡ－ＥおよびＨＳＰ６０のリーダー配列を含むＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、制御性Ｔ細胞の活性化を促進し、限定されるものではないが、１型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症および腎炎などの自己免疫疾患における病状からの保護をもたらすことが示されている（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １２０（１０）：３６４１－３６５０；Ｌｅａｖｅｎｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１３；１２３（３）：１３８２－１３８９を参照されたい）。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性ポリペプチド、例えば、モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有する外因性ペプチドに連結されたＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む一本鎖融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの外部ドメイン（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１またはＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ２またはＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；またはＨＬＡ－Ｇ３もしくはＨＬＡ－Ｇ７ポリペプチドのアルファ１ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）を含むか、またはこれらからなる一本鎖融合ポリペプチドであり、一本鎖融合ポリペプチドは、必要に応じて、抗原性外因性ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｇアルファ鎖のアルファドメイン（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１またはＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２および／またはアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ２またはＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；またはＨＬＡ－Ｇ３もしくはＨＬＡ－Ｇ７ポリペプチドのアルファ１ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）を含むか、またはこれらからなる一本鎖融合ポリペプチドであり、一本鎖融合ポリペプチドは、必要に応じて、抗原性外因性ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｇアルファ鎖のアルファドメイン（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１またはＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２および／またはアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ２またはＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン；またはＨＬＡ－Ｇ３またはＨＬＡ－Ｇ７ポリペプチドのアルファ１ドメイン）、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）を含むか、またはこれらからなる一本鎖融合ポリペプチドであり、一本鎖融合ポリペプチドは、必要に応じて、抗原性外因性ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性ポリペプチドに連結されていない。ＨＬＡ－Ｇは、さまざまな免疫細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞など）において阻害性受容体と相互作用する。３つのＨＬＡ－Ｇ受容体が、記載されている：ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ／ＬＩＬＲＢ１（ＩＬＴ２）、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ／ＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４）およびＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ２ＤＬ４）。ＩＬＴ２は、Ｂ細胞、一部のＴ細胞、一部のＮＫ細胞およびすべての単球／樹状細胞によって発現されるが、ＩＬＴ４は、骨髄特異的であり、単球／樹状細胞によってのみ発現される。ＫＩＲ２ＤＬ４は、主に、ＮＫ細胞のＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔサブセットに制限される。ＩＬＴ２およびＩＬＴ４は、阻害性受容体であり、ＫＩＲ２ＤＬ４は、同様に阻害シグナルを送ることができる可能性もある。これらの受容体との相互作用により、ＨＬＡ－Ｇは、ＮＫ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能を阻害すること、ＮＫ細胞およびＴ細胞の増殖を阻害すること、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の生成を促進すること、ならびにＤＣの成熟および抗原提示を阻害することが示されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチドは、ＩＬＴ４、ＩＬＴ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ４などの１つまたは複数のＨＬＡ－Ｇ受容体（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および／または樹状細胞の表面に存在する）に結合することができる。
したがって、本明細書に記載のａＡＰＣは、ある特定の免疫細胞集団を阻害することができ、これらの免疫細胞集団、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の活性を抑制することができる。別の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、他の免疫細胞集団、例えば、制御性Ｔ細胞を活性化または刺激することができる。
したがって、本開示は、特に、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドである少なくとも１種の外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含むａＡＰＣに関する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、自己ペプチド、例えば、ＨＳＰ６０ペプチドのリーダー配列である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ融合ポリペプチドなどの少なくとも１種のＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドをさらに含む。他の実施形態では、ａＡＰＣは、１種または複数の共刺激ポリペプチドをさらに含む。他の実施形態では、ａＡＰＣは、１種または複数の共阻害ポリペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、およびその特異的集団、例えば、ＣＤ８＋、ＣＤ１２２＋、Ｌｙ４９＋制御性Ｔ細胞の活性をモジュレートする（例えば、活性化する）ように操作されている。他の実施形態では、ａＡＰＣは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／またはＤＣの活性をモジュレートする（例えば、抑制する）ように操作されている。
本開示の一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、操作された除核赤血球細胞、例えば、網状赤血球または赤血球である。本開示の一部の実施形態では、除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、網状赤血球、赤血球または血小板である。
本明細書において説明されるａＡＰＣの多くの改変および他の実施形態は、本開示が、先述の説明および関連する図面において提示された教示の利益を有することに関連することが当業者には、容易に思い浮かぶだろう。したがって、本明細書における本開示が、開示される特定の実施形態に限定されないこと、ならびに改変および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において用いられるが、それらは、単に一般的かつ説明的な意味で使用され、限定を目的として用いられるものではない。
定義
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
代替物（例えば「または」）の使用は、代替物のいずれか１つ、両方、またはそれらの任意の組合せを意味することが理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、量、経時的な時間などのような測定可能な値に言及する場合の「約」という用語は、特定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、よりいっそう好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。変動が開示される方法を行うために適しているからである。
本明細書で使用される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、他に指示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」ならびに「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であることを意味し、それに続く、例えば、構成成分の存在を特定する、および当技術分野において公知またはそこで開示される追加の列挙されていない構成成分、特徴、要素、メンバー、ステップの存在を排除も除外もしない、包括的またはオープンエンドの用語である。
本明細書で使用される場合、「など」、「例えば」などの用語は、例示的な実施形態を指すこと、および本開示の範囲を限定しないことを意図する。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を本開示の試験の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」という用語は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物（例えば、ヒト赤血球細胞）の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域中のコドンの改変を指す。そのような最適化は、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンを、宿主生物の遺伝子中でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることを含む。コドン最適化は、コード配列から転写される転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善し得るか、またはコード配列の転写を改善するためであり得る。コドン最適化は、限定されるものではないが、発現宿主生物のコドン優先選択に適したコード配列に対するコドンを選択することを含むプロセスを含む。多くの生物は、成長するポリペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入のために、コードするための特定のコドンを使用についてのバイアスまたは優先選択を示す。生物間のコドン使用頻度における相違であるコドン優先選択またはコドンバイアスは、遺伝コードの縮重によって許容され、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と関連があり、これは、次に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性、および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために合わせることができる。
本明細書で使用される場合、「用量」とは、所与の時間、対象への投与のための薬理学的活性物質の特定の量を指す。他に規定されない限り、列挙された用量は、本明細書に記載のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、複数の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）を指す。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）の用量は、操作された赤血球細胞の有効量を指す。投与のための用量を指す場合、本明細書において提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの実施形態では、本明細書において提供される用量のいずれか１つが、ラベル／ラベル用量において明らかであるような用量である。
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」という用語は、その表面において主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に関連する外来抗原をプロセシングし、提示することができる細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）」という用語は、１種または複数のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを導入するように操作された細胞を指す。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドに特異的に結合している外因性抗原ポリペプチドをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」という用語は、一般に、慢性もしくは急性の炎症によって特徴付けられる疾患または障害を指す。さまざまな実施形態では、炎症性疾患は、心臓の炎症性疾患、肝臓の炎症性疾患、膵臓の炎症性疾患、皮膚の炎症性疾患、および／または胃腸（ＧＩ）管の炎症性疾患である。例えば、炎症性疾患は、限定されるものではないが、心筋炎、心筋症、心内膜炎、心膜炎、肝硬変、喘息（好酸球性または非好酸球性）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ、アレルギー反応、慢性気管支炎、肺気腫、過敏性肺炎、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープを伴うかまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、回腸炎、慢性炎症性腸疾患、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグストラウス症候群および炎症性疼痛を含む。
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、一般に、対象の免疫系が身体の自らの細胞を攻撃し、組織の破壊もしくは損傷を引き起こす、疾患または状態を指す。特に、一部の実施形態では、「自己免疫疾患」という用語は、濾胞ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）、Ｔｈ１細胞および／またはヘルパーＴ１７（Ｔｈ１７）Ｔ細胞によってモジュレートされる任意の自己免疫疾患を含む（例えば、その内容が、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７， １９８ （１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ） ５５．１３；Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗ． ２０１６， １６（４）： ２１９－２３２；およびＮｏａｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １３；６， ２０１４： ６６８－６７７）を参照されたい）。例えば、自己免疫疾患としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、変形性関節症、痛風関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、混合結合組織障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性ぶどう膜炎、腎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヘルペス性間質性角膜炎（ＨＳＫ）、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎、脊椎関節炎、活動性体軸性脊椎関節炎（活動性ａｘＳｐＡ）および、Ｘ線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎（ｎｒ－ａｘＳｐＡ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、膜性糸球体腎炎、視神経脊髄炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、皮膚筋炎、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症、川崎病、ループス腎炎、結節性多発動脈炎、壊疽性膿皮症および高安動脈炎を含む。
自己免疫疾患は、血液検査、脳脊髄液分析、筋電図（筋機能を測定する）、および脳の磁気共鳴画像法を使用して診断され得るが、血液中の自己抗体（または自家抗体）についての抗体検査が特に有用である。通常、ＩｇＧクラス抗体は、自己免疫疾患と関連付けられる。
本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物およびタンパク質を含む、対象から単離された生体起源の任意の種類の物質を指す。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞および生体液を含む。生体試料は、例えば、限定されるものではないが、全血、血漿、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋生検材料、臓器組織、または当業者に公知の生体起源の他の物質を含む。生体試料は、診断もしくは研究のために対象から入手することができるか、または対照として、もしくは基礎研究のために、健康な対象から入手することができる。
本明細書で使用される場合、「クリック反応」という用語は、連結された生成物の簡便な生成のための、第１および第２の部分を共有結合的に連結させるために使用されるさまざまな反応を指す。これは、典型的には、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：これは、迅速である、特異的である、高収率である、効率的である、自発的である、連結されている実体の生体適合性を著しく変更しない、高い反応速度を有する、安定した生成物を生成する、単一の反応生成物の生成に都合がよい、高い原子経済を有する、化学選択的である、モジュール式である、立体選択的である、酸素に対して非感受性である、水に対して非感受性である、高純度である、非クロマトグラフ方法（例えば、結晶化または蒸留）により除去することができる無害もしくは比較的非毒性の副生成物のみが発生する、溶媒を必要としない、または生理条件下で安定した、安全もしくは生理学的に適合する溶媒、例えば水の中で行うことができる。例としては、アルキン／アジド反応、ジエン／ジエノフィル反応、またはチオール／アルケン反応が挙げられる。他の反応を使用することができる。一部の実施形態では、クリック反応は、迅速、特異的、かつ高収率である。
本明細書で使用される場合、「クリックハンドル」という用語は、クリック反応において第２のクリックハンドルと反応して、クリックシグネチャーを生成することができる化学的部分を指す。一部の実施形態では、クリックハンドルは、カップリング試薬によって構成され、カップリング試薬は、基質反応性部分をさらに含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、他の細胞に対して種々の効果を有する、細胞によって分泌される小さな可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、成長、発達、創傷の治癒および免疫応答を含む、多くの重要な生理的機能を媒介する。それらは、細胞膜に位置するそれらの細胞特異的受容体に結合することによって作用し、これは、標的細胞における生化学的および表現型変化を最終的にもたらす、明確に異なるシグナル伝達カスケードが細胞内での開始するのを可能にする。サイトカインは、局所的、および放出の部位から遠位の両方で作用することができる。それらは、多くのインターロイキン、およびいくつかの造血成長因子を包含する、Ｉ型サイトカイン；インターフェロンおよびインターロイキン－１０を含む、ＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦαおよびリンホトキシンを含む、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ－１」）を含む、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー；ならびに幅広い種類の免疫および炎症機能において重大な役割を果たす分子のファミリーのケモカインを含む。同じサイトカインは、細胞の状態に応じて、細胞に対して異なる効果を有し得る。サイトカインは、多くの場合、他のサイトカインの発現を制御し、他のサイトカインのカスケードを引き起こす。サイトカインの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ Ｐ４０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇｒｏα、ＭＣＰ－１およびＴＮＦ－αが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、１種または複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）を含む。一部の実施形態では、サイトカインは、膜アンカードメインを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、細胞の表面に存在する。
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、化合物（例えば、低分子）またはプロセスのネイティブな形態を指すことを意味する。例えば、一部の実施形態では、「内因性」という用語は、生物中または生物のゲノム中のその天然の位置の核酸またはポリペプチドのネイティブな形態を指す。
本明細書で使用される場合、「操作された細胞」という用語は、遺伝子改変された細胞またはその子孫を指す。
本明細書で使用される場合、「操作された細胞」という用語は、遺伝子改変された細胞またはその子孫を指す。
本明細書で使用される場合、「除核細胞」という用語は、（例えば、赤血球生成などの分化プロセスに起因して）核を欠く細胞を指す。一部の実施形態では、除核細胞は、ポリペプチドを発現することができない。一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球、網状赤血球または血小板である。
本明細書で使用される場合、「操作された除核細胞」は、遺伝子改変された有核細胞またはその子孫が起源であり、（例えば、分化に起因して）核を欠く、細胞を指す。一部の実施形態では、操作された除核細胞は、操作された除核細胞が起源の遺伝子改変された有核細胞またはその子孫（例えば、除核の前）によって産生される外因性ポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「操作された赤血球細胞」という用語は、遺伝子改変された赤血球細胞またはその子孫を指す。操作された赤血球細胞は、操作された有核赤血球細胞（例えば、遺伝子改変された赤血球前駆細胞）および操作された除核赤血球細胞（例えば、遺伝子改変された赤血球前駆細胞が起源の網状赤血球および赤血球）を含む。
本明細書で使用される場合、「操作された除核赤血球細胞」は、遺伝子改変された有核赤血球細胞またはその子孫が起源であり、（例えば、分化に起因して）核を欠く、赤血球細胞を指す。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、遺伝子改変された有核赤血球細胞もしくはその子孫が起源の赤血球または網状赤血球を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞は、不死化有核赤血球細胞またはその子孫が起源ではない。
「赤血球前駆細胞」は、本明細書で使用される場合、網状赤血球または赤血球に分化することができる細胞を指す。一般に、赤血球前駆細胞は、有核である。赤血球前駆細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）細胞、骨髄球性共通プロジェニター（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）、巨核球－赤血球プロジェニター（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球を含む。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、不死または不死化細胞である。例えば、不死化赤芽細胞は、ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞のレトロウイルス形質導入により生じさせて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現させ、かつＴＰ５３を抑制することができる（例えば、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれるＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２２（２）： ４５１－６３を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「外因性核酸」という用語は、細胞に生来のものでないが、細胞または細胞のプロジェニターに導入される、核酸（例えば、遺伝子）を指す。外因性核酸は、細胞に生来の内因性核酸と相同もしくは同一である領域またはオープンリーディングフレーム（例えば、遺伝子）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、外因性核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、外因性核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、外因性核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、外因性核酸は、外因性ポリペプチドを産生するように細胞機構によってプロセシングされる。一部の実施形態では、外因性核酸は、外因性核酸が導入された細胞によっても、またはそのような細胞の子孫である細胞によっても保持されない。
本明細書で使用される場合、「外因性ポリペプチド」という用語は、細胞内もしくは細胞上に導入されるポリペプチド、または外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸の細胞内に、もしくはその細胞のプロジェニター内に導入することによって細胞により発現が引き起こされるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞または細胞のプロジェニターに導入された外因性核酸によってコードされるポリペプチドであり、その核酸は、必要に応じて、細胞によって保持されない。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、化学的または酵素的手段によって、細胞の表面にコンジュゲートされたポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「発現する」または「発現」という用語は、転写および翻訳を含む、細胞がポリペプチドを産生するプロセスを指す。細胞における特定のポリペプチドの発現は、限定されるものではないが、ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の転写を増加させること、およびポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を増加させることを含む、いくつかの異なるアプローチを使用して増加させることができる。
本明細書で使用される場合、外因性ポリペプチドまたは核酸に関して、「第１の」、「第２の」および「第３の」など用語は、１種より多くの種類の外因性ポリペプチドまたは核酸が存在する場合に、区別する便宜上、使用される。これらの用語の使用は、明白にそのように言及しない限り、外因性ポリペプチドもしくは核酸の特定の順序または配向を付与することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、所与のＲＮＡまたはタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。そのため、遺伝子は、発現されるＲＮＡ（典型的には、ポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、および多くの場合、それらの発現のために必要とされる制御配列を含む。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすること、または公知もしくは予測配列情報から合成することを含め、種々の供給源から得ることができ、特に、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよび／もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。これは、限定されるものではないが、組換えられていてもよく、核酸が細胞に導入されるときに外因性ポリペプチドを発現してもよい、染色体ＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、用いられる投薬量および／または濃度でそれに曝露される哺乳動物に対して毒性または有害ではない、標準的な医薬賦形剤、担体または安定剤のいずれかを含む。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換可能に使用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、限定されるものではないが、グリコシル化、リン酸化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化を含む、修飾を含む。周知であるように、および上述のように、ポリペプチドが全体に線状でない場合があることが理解される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐状であってもよく、それらは、天然のプロセシング事象、および天然には起こらないヒトの操作によって引き起こされる事象を含む、一般に翻訳後事象の結果として、分岐を伴うかまたは伴わない、環状であってもよい。
本明細書で使用される場合、本明細書において「組換え」と称されるポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使用するベクターへのクローニングなどの人工組換えの方法に依拠する手順よって生じるものを含む、組換えＤＮＡ方法論によって産生されたポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、診断、処置または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特に、ヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療および獣医学的適用の両方に適用可能である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト対象）である。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「有効量」という用語は、意図された利益（状態、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患もしくはアレルギー性疾患の防止、予防、症状の発症の遅延、または症状の改善）を提供するのに十分である活性薬剤（例えば、本明細書に記載の操作された赤血球細胞または除核細胞）の量を指すために互換可能に使用される。予防的または防止的適用では、有効量は、疾患、障害もしくは状態の生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症、ならびに中間的な病理学的表現型を含む、疾患、障害または状態の危険性を除去もしくは低減させるため、それらの重症度を下げるため、またはそれらの発生を遅延させるために、疾患、障害または状態（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患またはアレルギー性疾患）に影響されやすいか、またはそうでなければそれらを発生する危険性がある対象に投与され得る。「用量」および「投薬量」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、その結果が望ましく、かつ有益であると判断される、処置の結果を指す。治療効果は、直接的または間接的な、疾患の兆候の抑止、低減または消失を含み得る。治療効果はまた、直接的または間接的な、疾患の兆候の進行の抑止、低減または消失を含み得る。
本明細書に記載の任意の治療剤のために、治療有効量は、最初に、予備的なｉｎ ｖｉｔｒｏ研究および／または動物モデルを使用して決定されたてもよい。治療有効量はまた、ヒトの臨床データから決定されてもよい。適用される用量は、投与される薬剤の相対的な生物学的利用率および効力に基づいて調整してもよい。上記に記載の方法および他の周知の方法に基づいて最大の有効性を達成する用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。治療有効性を決定するための一般原則は、参照によって本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） （２００１）の第１章に見ることができる。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」および／または「処置」という用語は、障害、疾患もしくは状態（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患またはアレルギー性疾患）の進行を無効にすること、実質的に阻害すること、遅らせること、または逆転させること、障害、疾患もしくは状態の臨床症状を実質的に改善すること、あるいは障害、疾患もしくは状態の臨床症状の出現を実質的に防止すること、有益な臨床結果または所望の臨床結果を得ることを含む。処置することとは、以下の１つまたは複数を達成することをさらに指す：（ａ）障害、疾患または状態（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患またはアレルギー性疾患）の重症度を低減すること；（ｂ）処置される障害、疾患または状態の特徴的な症状の発生を制限すること；（ｃ）処置される障害、疾患または状態に特徴的な症状の悪化を制限すること；（ｄ）以前に障害、疾患または状態を有していた対象における障害、疾患または状態の再発を制限すること；および（ｅ）障害、疾患または状態について以前は無症状であった対象における症状の再発を制限すること。
薬理学的および／または生理的効果などの有益な臨床結果または所望の臨床結果は、限定されるものではないが、疾患、障害もしくは状態になりやすくあり得るが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示していない対象において、疾患、障害もしくは状態が起こるのを防止すること（予防的処置）、疾患、障害もしくは状態の症状の緩和、疾患、障害もしくは状態の程度の低下、疾患、障害もしくは状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害もしくは状態の拡散を予防すること、疾患、障害もしくは状態の進行を遅延させるか、または遅らせること、疾患、障害もしくは状態の改善または軽減、およびこれらの組合せ、ならびに処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを含む。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ポリペプチドと比較した、少なくとも１つのアミノ酸残基の相違、例えば、１つもしくは複数の置換、挿入または欠失を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、バリアントは、そのポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。バリアントは、断片（例えば、ポリペプチド（例えば、酵素）の酵素活性断片）を含み得る。一部の実施形態では、断片は、全長ポリペプチドと比較して、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または両方の末端（それぞれ独立して）において、最大で約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸残基を欠いていてもよい。バリアントは、天然に存在していてもよく、または天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野において公知の突然変異誘発方法を使用して、生じさせてもよい。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、核酸およびアミノ酸配列に関して、配列を整列させ、必要によりギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後、参照配列中のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指し、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない。比較のための配列の最適な整列は、手作業以外に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｓ Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２， ４８２のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８， ４４３のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４の類似サーチ法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、生成させてもよい。
「抗原ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、外因性抗原提示ポリペプチドに結合することができる外因性ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドと一緒に、免疫応答を誘導することができる。
「寛容原性ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫寛容を促進することができる任意のペプチドである。これらの寛容効果は、限定されるものではないが、Ｔ細胞のアネルギーを誘導すること、Ｔ細胞のアポトーシスおよびＴｒｅｇの誘導などのＴ細胞の制御を含む。例示的な寛容原性ポリペプチドは、表１に明記される。
「外因性抗原提示ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することができ、適した免疫細胞による認識のために細胞表面にそれらを提示することができる、細胞表面タンパク質のＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇを指す。
「ＨＬＡ－Ｅポリペプチド」、「ＨＬＡ－Ｅ分子」または「ＨＬＡ－Ｅ」（ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅとしても公知）という用語は、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数を含む重α鎖を含む非古典的ＭＨＣクラスＩ分子を指す。ＨＬＡ－Ｅの全長α重鎖は、およそ４５ｋＤａであり、その遺伝子は、８つのエクソンを含有する。エクソン１は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は、両方ともペプチドに結合するアルファ１およびアルファ２ドメインをコードし、エクソン４は、アルファ３ドメインをコードし、エクソン５は、膜貫通領域をコードし、エクソン６および７は、細胞質尾部をコードする。本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、全部で３つ未満の内因性アルファドメインを含むことができる（すなわち、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、１つ、２つまたは３つのアルファドメインを含むことができ、本明細書においてアルファ重ドメインとも称される）。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｅポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含み、天然に存在するＨＬＡ－Ｅポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が除かれている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｅポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含み、膜アンカー（例えば、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）膜貫通ドメイン）に融合している。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｅポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含み、ＨＬＡ－Ｅ細胞質ドメインを含む膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）に融合している。本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドはまた、ヘテロ二量体（例えば、一本鎖融合ポリペプチドとして）を形成するように、軽鎖（すなわち、ベータ２ミクログロブリンまたはβ２Ｍポリペプチド）に結合または連結された重アルファ鎖も含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドに結合するか、もしくは結合されており、および／または膜アンカーに連結されているか、もしくは融合されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、「ＨＬＡ－Ｅ一本鎖融合ポリペプチド」を含み、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、β２Ｍポリペプチドに連結されたＨＬＡ－Ｅ重鎖の１つまたは複数のアルファドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含み、β２Ｍポリペプチドは、必要に応じて、外因性抗原ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。
ＨＬＡ－Ｅは、すべてのＭＨＣクラスＩ遺伝子の中で最も多型が少なく、３つの明確に異なるタンパク質をコードする１１の対立遺伝子のみを提示する（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、バージョン３．１２．０）。全体的に見て、３つの対立遺伝子グループ（ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３およびＨＬＡ－Ｅ＊０１：０４）が、多様な集団において記載されている。しかしながら、２つの対立遺伝子グループ（ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１およびＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３）のみが、世界中の集団において見られる。コドン１０７のＡ／Ｇバリエーションは、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１およびＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３を定義し（例えば、ワールドワイドウェブｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ｔｘｔ／ｅ＿ｎｕｃ．ｔｘｔを参照されたい）、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３（ＨＬＡ－Ｅ１０７Ｇ）中のグリシンによって置き換えられたＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１（ＨＬＡ－Ｅ１０７Ｒ）において１０７位のアルギニンをもたらす（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． ２０１５ Ｍａｙ； １０６（５）： ５２２－５２８を参照されたい）。細胞表面のＨＬＡ－Ｅペプチド複合体は、ＣＤ８制御性Ｔ細胞を活性化することができる。制御性Ｔ細胞は、Ｔｆｈ、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞を含む他の免疫細胞の抑制に寄与し、これは、自己免疫を引き起こすことが公知である（Ｗｉｅｔｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ， ２０１４， ８４， ５２３－５３５を参照されたい）。
「ＨＬＡ－Ｇポリペプチド」、「ＨＬＡ－Ｇ分子」または「ＨＬＡ－Ｇ」（ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｇとしても公知）という用語は、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数を含む重α鎖を含む非古典的ＭＨＣクラスＩ分子を指す。ＨＬＡ－Ｇの全長α重鎖は、およそ４５ｋＤａであり、その遺伝子は、８つのエクソンを含有する。エクソン１は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は、両方ともペプチドに結合するアルファ１およびアルファ２ドメインをコードし、エクソン４は、アルファ３ドメインをコードし、エクソン５は、膜貫通領域をコードし、エクソン６は、細胞質尾部をコードする。本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、全部で３つ未満の内因性アルファドメインを含むことができる（すなわち、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、１つ、２つまたは３つのアルファドメインを含むことができ、本明細書においてアルファ重ドメインとも称される）。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｇポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数）を含み、天然に存在するＨＬＡ－Ｇポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が除かれている。例えば、一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１またはＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２またはＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ２ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３またはＨＬＡ－Ｇ７ポリペプチドのアルファ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｇポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数）を含み、膜アンカー（例えば、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）膜貫通ドメイン）に融合されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｇポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数）を含み、ＨＬＡ－Ｇ細胞質ドメインを含む膜アンカー（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン）に融合されている。本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドはまた、ヘテロ二量体（例えば、一本鎖融合ポリペプチド）を形成するように、軽鎖（すなわち、ベータ２ミクログロブリンまたはβ２Ｍポリペプチド）に結合されているか、または連結されているＨＬＡ－Ｇ重鎖も含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、軽鎖（すなわち、β２Ｍポリペプチド）に結合されておらず、連結もされていない。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドに結合するか、もしくは結合されており、および／または膜アンカーに連結されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、「ＨＬＡ－Ｇ一本鎖融合ポリペプチド」を含み、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、β２Ｍポリペプチドに連結されたＨＬＡ－Ｇ重鎖の１つまたは複数のアルファドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインのうちの１つまたは複数）を含み、β２Ｍポリペプチドは、必要に応じて、外因性抗原ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。
ＨＬＡ－Ｇは、通常、胎児由来の胎盤細胞において発現する。ＨＬＡ－Ｇは、１６の異なる全長タンパク質、２つの切断型、ならびにＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６およびＨＬＡ－Ｇ７を含む７つのアイソフォームをコードする約５０の対立遺伝子を含む（Ｃａｒｏｓｅｌｌａ， Ｂｌｏｏｄ ２００８， １１；１０， ４８６２）。膜結合ＨＬＡ－Ｇ１分子およびその可溶性の対応物ＨＬＡ－Ｇ５は、同一の細胞外構造を有し、これは、古典的ＨＬＡクラスＩ様：β２Ｍポリペプチドに非共有的に結合した３つの球状ドメインの重鎖である。他のアイソフォームは、より単純な構造のものである：１つまたは２つの球状ドメインを欠き、それらは、より小さく、β２Ｍポリペプチドにも結合せず、ペプチドも提示しない。一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣに含まれるＨＬＡ－Ｇアイソフォームは、ＨＬＡ－Ｇ１またはＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームである。一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣに含まれるＨＬＡ－Ｇアイソフォームは、分子を細胞膜に固定するためにＧＰＡに融合された、可溶性のＨＬＡ－Ｇ５またはＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームである。ＨＬＡ－Ｇ多量体、例えば、二量体はまた、本明細書に記載のａＡＰＣ細胞に含まれていてもよい。最も一般的なＨＬＡ－Ｇ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇ１＊０１：０１：０１：０１対立遺伝子である。
外因性抗原提示ポリペプチドのＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇを、本明細書においてより詳細に記載する。
「共刺激ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫細胞（例えば、ＭＨＣ分子、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＣＤ２７２）およびＴｏｌｌ様受容体）において同族共刺激分子と特異的に結合し、それにより外因性抗原ポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されるものではないが、免疫細胞の増殖、活性化、分化などを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）上の任意のポリペプチドを指す。共刺激ポリペプチドは、とりわけ、Ｔ細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合している抗体も包含する。例示的な外因性共刺激ポリペプチドを、より詳細に下記に記載する。
「外因性共阻害ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫細胞の活性の阻害、免疫細胞の増殖の阻害、免疫細胞のアネルギー化、または免疫細胞のアポトーシスの誘導を含む、免疫細胞を抑制する任意のポリペプチドを指す。例示的な外因性共阻害ポリペプチドを、より詳細に下記に記載する。
「Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増大させる外因性ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の発生に関与する３つのシグナルの少なくとも１つを刺激することによって、Ｔｒｅｇ細胞を刺激する。例示的な外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを、より詳細に下記に記載する。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞を刺激するのに十分な」という用語は、例えば、免疫細胞の細胞応答を促進する外因性刺激ポリペプチドのシグナル伝達事象もしくは刺激の量またはレベルを指す。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞を活性化すること」または「免疫細胞活性化」という用語は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、免疫細胞の１つもしくは複数の細胞応答を引き起こすか、またはそれをもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。本明細書で使用される場合、活性化シグナルを受けた免疫細胞は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される１つまたは複数の細胞応答を実証する。免疫細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞を増大させること」または「免疫細胞増大」という用語は、免疫細胞が、一連の細胞分裂を受け、それにより細胞数を増大させるプロセスを指す。免疫細胞増大を測定するための適切なアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「活性化する」、「刺激する」、「増強する」、「増加させる」および／または「誘導する」という用語（および同様の用語）は、直接的または間接的のいずれかで、天然、予想もしくは平均と比べて、または対照条件と比べて、濃度、レベル、機能、活性もしくは挙動を改善するか、または増加させる作用を一般に指すために互換可能に使用される。「活性化する」とは、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈では、そのような刺激は、受容体のライゲーション、およびその後のシグナル伝達事象を伴なう。Ｔ細胞の刺激に関して、そのような刺激は、一部の実施形態では、その後に、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合などのシグナル伝達事象を誘導する、Ｔ細胞表面部分のライゲーションを指す。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し、分子の発現もしくは分泌を上方制御または下方制御し得る。そのため、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達事象の非存在下でさえ、細胞骨格構造の再構成、または細胞表面部分の合体をもたらし得、これらのそれぞれは、その後の細胞応答を増強、改変または変更するように機能することができる。「活性化」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、検出可能なエフェクター機能、Ｔ細胞の分化状態の改変（例えば、増大およびエフェクターＴ細胞からメモリーＴ細胞への分化を促進する）、および／またはそれらの任意の組合せを含む。「活性化Ｔ細胞」という用語は、何よりも、細胞分裂しているＴ細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少させる」、「妨げる」、「阻害する」および／または「低減させる」という用語（および同様の用語）、直接的または間接的のいずれかで、天然、予想もしくは平均と比べて、または対照条件と比べて、濃度、レベル、機能、活性もしくは挙動を低減させる作用を一般に指す。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞を抑制すること」または「免疫細胞を阻害すること」という用語は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、免疫細胞の１つもしくは複数の細胞応答または活性の阻害または抑制を引き起こすか、またはそれをもたらすか、あるいは免疫細胞のアネルギー化、または免疫細胞のアポトーシスの誘導をもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。免疫細胞の阻害または抑制を測定するための適切なアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「モジュレートされた免疫応答」とは、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（細胞性免疫応答）、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色アッセイ）、および測定可能な量で、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の血液集団を定量化する、または抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の血液集団を定量化する、抗原特異的Ｔ細胞を検出および定量化するための主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）四量体アッセイによって測定される、または増加が、適切な対照と比較した場合に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％である、免疫応答の形態または特徴の変化、例えば免疫応答の刺激または阻害を指す。
Ｉ．免疫系の細胞
Ｉ．免疫系の細胞
免疫系を構成する多数の細胞相互作用がある。これらの相互作用は、両方向にシグナルを伝達する特異的受容体－リガンドの対によって起こり、その結果、それぞれの細胞は、それらのシグナルの時間および空間分布に基づいて指示を受ける。
免疫系の細胞は、リンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、密接に関連するランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、肥満細胞、好塩基球、および骨髄系列の細胞の他のメンバーを含む。加えて、一連の特殊化した上皮および間質細胞は、多くの場合、応答の誘導およびエフェクター相において直接的な役割も果たす、免疫系の細胞の成長および／または遺伝子の活性化を制御する重要な因子を分泌することによって、免疫が生じる解剖学的環境を提供する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９）， ａｔ ｐ． １０２）。
免疫系の細胞は、脾臓、リンパ節、腸のパイエル板および扁桃腺などの末梢器官化組織において見られる。リンパ球は、中枢リンパ器官の胸腺および骨髄においても見られ、それらは、成熟免疫系の無数の応答を媒介する能力をそれらに備えさせる発達段階を受ける。リンパ球およびマクロファージのかなりの部分は、血液およびリンパ液において見られる細胞の再循環プールを構成し、免疫担当細胞をそれらが必要とされる部位に送達するための手段、および局所的に生じる免疫が全身性になることを可能にするための手段を提供する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９）， ａｔ ｐ． １０２）。
「リンパ球」という用語は、身体全体のリンパ組織において形成される小さな白血球を指し、正常な成体では、循環血液中の白血球の総数の約２２～２８％を構成し、これは、疾患に対する身体の防御において大きな役割を果たす。個々のリンパ球は、それらが、それらの遺伝物質の組換えにより構造的に関連する抗原の限定的なセットに応答するように（例えば、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体を作り出すように）深く関与するという点で、特殊化される。免疫系と所与の抗原との最初の接触前に存在するこの関与は、リンパ球の表面膜上の抗原の決定基（エピトープ）に特異的な受容体の存在によって発現される。それぞれのリンパ球は、固有の受容体の集団を持ち、それらのすべてが同一の結合部位を有する。リンパ球のあるセット、またはクローンは、その受容体の結合領域の構造において別のクローンと異なり、そのため、それが認識することができるエピトープにおいて異なる。リンパ球は、それらの受容体の特異性だけでなく、それらの機能においても互いに異なる（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９）， ａｔ ｐ． １０２）。
リンパ球の２つの広義のクラスが認識されている：抗体分泌細胞の前駆体であるＴリンパ球（Ｔ細胞）、およびＢリンパ球（Ｂ細胞）。
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞
免疫恒常性は、免疫応答の開始および下方制御の間の調節されたバランスによって維持される。アポトーシスおよびＴ細胞アネルギー（Ｔ細胞が抗原遭遇後に本質的に機能的に不活性化される寛容機構（Ｓｃｗａｒｔｚ， Ｒ． Ｈ．， ”Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ”， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ． ２１： ３０５－３３４ （２００３））の両方の機構が、免疫応答の下方制御に寄与する。第３の機構は、抑制性または制御性ＣＤ４＋Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による活性化Ｔ細胞の能動的な抑制によって提供される（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ”， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ． ４３５： ５９８－６０４ （２００５）において概説されている）。ＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）鎖を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）は、アネルギー性および抑制性の天然に存在するＴ細胞のサブセットである（Ｔａａｍｓ， Ｌ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｕｍａｎ ａｎｅｒｇｉｃ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ａ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｐｒｏｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ． ３１： １１２２－１１３１ （２００１））。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの枯渇は、マウスにおいて全身性自己免疫疾患をもたらす。さらにまた、これらのＴｒｅｇの移入は、自己免疫疾患の発生を防止する。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、それらのマウス対応物と同様に、胸腺において生じ、細胞間接触依存性機構によりレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制する能力、ＩＬ－２を産生することができないこと、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのアネルギー性表現型によって特徴付けられる。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現のレベルに従って、抑制性（ＣＤ２５ｈｉｇｈ）および非抑制性（ＣＤ２５ｌｏｗ）細胞に分けることができる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、マウスおよびヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇにおいて発現されることが示されており、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの発生を調節するマスター遺伝子であると思われる（Ｂａｔｔａｇｌｉａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ． １７７： ８３３８－８３４７， （２００６））。
Ｔリンパ球
Ｔリンパ球
造血組織において前駆体から誘導されたＴリンパ球は、胸腺において分化を受け、次いで、末梢リンパ系組織およびリンパ球の再循環プールに播種される。Ｔリンパ球またはＴ細胞は、広範囲の免疫学的機能を媒介する。これらは、Ｂ細胞が、抗体産生細胞に発達するのを助ける能力、単球／マクロファージの殺菌作用を増加させる能力、ある特定の種類の免疫応答の阻害、標的細胞の直接的に死滅させること、および炎症反応の動員を含む。これらの効果は、特異的細胞表面分子のＴ細胞発現、およびサイトカインの分泌に依存する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
Ｔ細胞は、それらの抗原認識機構においてＢ細胞と異なる。Ｂ細胞の受容体である免疫グロブリンは、可溶性分子上または微粒子表面上の個々のエピトープに結合する。Ｂ細胞受容体は、ネイティブ分子の表面において発現したエピトープが分かる。抗体およびＢ細胞受容体は、細胞外液中の微生物に結合するように、および微生物から保護するように進化したが、Ｔ細胞は、他の細胞の表面の抗原を認識し、それらの機能を、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の挙動と相互作用し、それを変更することによって媒介する。Ｔ細胞を活性化することができる末梢リンパ系器官には、主要な３つの種類のＡＰＣが存在する：樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞。これらのうち最も強力なものが樹状細胞であり、その唯一の機能は、外来抗原をＴ細胞に提示することである。未成熟樹状細胞は、皮膚、消化管および気道を含む、身体全体の組織に位置する。それらが、これらの部位で侵入する微生物に遭遇すると、それらは、病原体およびそれらの産物を取り込み、それらをリンパ液によって局所リンパ節または消化管関連リンパ系器官に運ぶ。病原体との遭遇は、樹状細胞を、抗原捕捉細胞からＴ細胞を活性化することができるＡＰＣに成熟するように誘導する。ＡＰＣは、エフェクター細胞になるようにＴ細胞を活性化する役割を有する、それらの表面上の３種類のタンパク質分子を提示する：（１）外来抗原をＴ細胞受容体に提示するＭＨＣタンパク質、（２）Ｔ細胞表面の相補的受容体に結合する共刺激タンパク質、および（３）Ｔ細胞が、活性化されるのに十分な長さで、ＡＰＣに結合することを可能にする、細胞間接着分子（”Ｃｈａｐｔｅｒ ２４： Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ， （２００２））。
Ｔ細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて、２つの明確に異なるクラスに細分される。Ｔ細胞の大多数は、αおよびβ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Ｔ細胞の小さなグループは、γおよびδ鎖で構成された受容体を発現する。α／β Ｔ細胞には、２つの下位系列がある：共受容体分子ＣＤ４を発現するもの（ＣＤ４＋Ｔ細胞）およびＣＤ８を発現するもの（ＣＤ８＋Ｔ細胞）。これらの細胞は、それらが抗原を認識する方法、ならびにそれらのエフェクターおよび調節機能において異なる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系の主な制御細胞である。それらの制御機能は、Ｔ細胞が活性化されたときにその発現が誘導されるＣＤ４０リガンドなどのそれらの細胞表面分子の発現、および活性化されたときにそれらが分泌する幅広いアレイのサイトカインの両方に依存する。
Ｔ細胞は、重要なエフェクター機能も媒介し、その一部は、それらが分泌するサイトカインのパターンによって決定される。サイトカインは、標的細胞に対して直接毒性であり得、強力な炎症機構を動員することができる。
加えて、Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原を発現する標的細胞を効率的に溶解することができるＣＴＬに発達することができる（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、クラスＩＩまたはクラスＩ ＭＨＣタンパク質の特殊化された溝に結合した抗原のタンパク質分解に由来するペプチドからなる複合体を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩＩ複合体のみを認識するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩ複合体を認識する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
ＴＣＲのリガンド（すなわち、ペプチド／ＭＨＣタンパク質複合体）は、ＡＰＣ内で作出される。一般に、クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、エンドサイトーシスプロセスによってＡＰＣにより取り込まれたタンパク質に由来するペプチドに結合する。これらのペプチドがロードされたクラスＩＩ分子は、次いで、細胞の表面において発現し、それらは、発現された細胞表面複合体を認識することができるＴＣＲを有するＣＤ４＋Ｔ細胞による結合に利用可能である。このようにして、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞外供給源に由来する抗原と反応するように特殊化される（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
対照的に、クラスＩ ＭＨＣ分子に、主に、ウイルスタンパク質などの内部で合成されたタンパク質に由来するペプチドがロードされる。これらのペプチドは、プロテオソームによるタンパク質分解によりサイトゾルタンパク質から産生され、粗面小胞体に転位置される。９アミノ酸長で一般に構成されるそのようなペプチドは、クラスＩ ＭＨＣ分子に結合し、細胞表面に提供され、それらは、適した受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され得る。これは、Ｔ細胞系、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞に、それらの無傷の形態のこれらのタンパク質が細胞表面で発現もされず、分泌もされない場合であっても、生物の残部の細胞のもの（例えば、ウイルス抗原）もしくは突然変異抗原（活性癌遺伝子産物など）とは異なるか、またはそれらよりはるかに大量に産生される、タンパク質を発現する細胞を検出する能力を与える（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
Ｔ細胞を、それらの機能に基づいて、ヘルパーＴ細胞、細胞免疫の誘導に関与するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞として分類することもできる。
ヘルパーＴ細胞
ヘルパーＴ細胞
ヘルパーＴ細胞は、タンパク質および他のＴ細胞依存性抗原に対する抗体応答を行うようにＢ細胞を刺激するＴ細胞である。Ｔ細胞依存性抗原は、それらが、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）を架橋させることができないか、または効率的に架橋させないように、個々のエピトープが１回のみまたは限られた回数現れる免疫原である。Ｂ細胞は、それらの膜のＩｇにより抗原に結合し、その複合体は、エンドサイトーシスを受ける。エンドソームおよびリソソーム区画内で、抗原は、タンパク質分解酵素によってペプチドに断片化され、１つまたは複数の生じたペプチドは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子内にロードされ、これは、この小胞区画を通って輸送される。得られたペプチド／クラスＩＩ ＭＨＣ複合体は、次いで、Ｂ細胞表面膜に排出される。ペプチド／クラスＩＩ分子複合体に対して特異的な受容体を有するＴ細胞は、Ｂ細胞表面でこの複合体を認識する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９９９））。
Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞のそのＴＣＲによる結合、およびＴ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用の両方に依存する。Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現しない。むしろ、ＣＤ４０Ｌ発現は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識される同族抗原およびＣＤ８０またはＣＤ８６の両方を発現するＡＰＣとの相互作用の結果として誘導される。ＣＤ８０／ＣＤ８６は、一般に、静止しているＢ細胞ではなく、活性化されたＢ細胞によって発現され、その結果、活性化Ｂ細胞およびＴ細胞が関与するヘルパー相互作用は、効率的な抗体産生をもたらすことができる。しかしながら、多くの場合では、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの初期誘導は、樹状細胞などのＣＤ８０／８６を構成的に発現するＡＰＣの表面での抗原のそれらの認識に依存する。そのような活性化ヘルパーＴ細胞は、次いで、Ｂ細胞と効率的に相互作用し、Ｂ細胞を助けることができる。Ｂ細胞上の膜Ｉｇの架橋は、非効率的であっても、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用と相乗効果を与えて、活発なＢ細胞活性化を生じさせ得る。増殖、Ｉｇ分泌、および発現されるＩｇクラスのクラススイッチを含む、Ｂ細胞応答におけるその後の事象は、Ｔ細胞由来のサイトカインの作用に依存するか、またはそのような作用により増強されるかのいずれかである（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６およびＩＬ－１０を主に分泌する細胞（ＴＨ２細胞）に、またはＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびリンホトキシンを主に産生する細胞（ＴＨ１細胞）に分化する傾向がある。ＴＨ２細胞は、Ｂ細胞が抗体産生細胞への発達の助けにおいて非常に有効であるが、ＴＨ１細胞は、単球およびマクロファージの殺菌活性の増強、ならびに結果として生じる細胞内小胞区画での微生物溶解における効率の増加を含む、細胞免疫応答の有効なインデューサーである。ＴＨ２細胞の表現型（すなわち、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６およびＩＬ－１０）を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、効率的なヘルパー細胞であるが、ＴＨ１細胞もヘルパーの能力を有する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
細胞免疫誘導におけるＴ細胞の関与
細胞免疫誘導におけるＴ細胞の関与
Ｔ細胞はまた、細胞内微生物を破壊する単球およびマクロファージの能力を増強するように作用し得る。特に、ヘルパーＴ細胞によって産生されるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、一酸化窒素の発生および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の誘導を含む、単核食細胞が細胞内細菌および寄生生物を破壊するいくつかの機構を増強する。ＴＨ１細胞は、それらがＩＦＮ－γを産生するので、殺菌作用の増強において有効である。対照的に、ＴＨ２細胞によって産生される２つの主なサイトカインであるＩＬ－４およびＩＬ－１０は、これらの活性を遮断する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
細胞傷害性Ｔリンパ球
細胞傷害性Ｔリンパ球
標的細胞内で産生されたタンパク質由来のペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらが標的細胞の溶解をもたらす点で、細胞傷害性特性を有する。ＣＴＬ誘導溶解の機構は、標的細胞の膜に挿入し、その細胞の溶解を促進することができる分子であるパーフォリンのＣＴＬによる産生を含む。パーフォリン媒介溶解は、活性化ＣＴＬによって産生される一連の酵素であるグランザイムにより増強される。多くの活性ＣＴＬも、それらの表面に大量のｆａｓリガンドを発現する。ＣＴＬの表面のｆａｓリガンドと標的細胞の表面のｆａｓとの相互作用は、標的細胞においてアポトーシスを開始し、これらの細胞の死をもたらす。ＣＴＬ媒介溶解は、ウイルス感染細胞の破壊についての主な機構であると思われる。
リンパ球の活性化
リンパ球の活性化
「活性化」または「リンパ球の活性化」という用語は、ＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡの合成、ならびにリンホカインの産生をもたらす特異的抗原、非特異的マイトジェン、または同種異系細胞によるリンパ球の刺激を指し、これは、さまざまなエフェクターおよびメモリー細胞の増殖および分化に続く。Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子の溝において結合したペプチドである、その同族リガンドとの相互作用に依存する。受容体の関与によって発動する分子事象は複雑である。最も初期のステップは、いくつかのシグナル伝達経路を調節する一連の基質のチロシンリン酸化をもたらす、チロシンキナーゼの活性化であると思われる。これらは、ＴＣＲをｒａｓ経路に連結する一連のアダプタータンパク質であるホスホリパーゼＣγ１を含み、そのチロシンリン酸化は、その触媒活性を増加させ、イノシトールリン脂質代謝経路を関与させて、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇およびプロテインキナーゼＣの活性化、ならびに細胞成長および分化を調節する一連の他の酵素をもたらす。Ｔ細胞の完全な応答性は、受容体の関与に加えて、アクセサリー細胞送達共刺激活性、例えば、ＡＰＣ上のＣＤ８０および／またはＣＤ８６によるＴ細胞上のＣＤ２８の関与を必要とする。
メモリーＴ細胞
メモリーＴ細胞
適応免疫応答による病原体の認識および根絶後、Ｔ細胞の圧倒的多数（９０～９５％）は、アポトーシスを受け、残りの細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）およびレジデントメモリーＴ細胞（ＴＲＭ）と名付けられた、メモリーＴ細胞のプールを形成する（Ｃｌａｒｋ， Ｒ．Ａ．， ”Ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．， ７， ２６９ｒｖ１， （２０１５））。ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブＴ細胞において発現され、エフェクター細胞のＣＤ４とＣＤ８の両方においても発現される。抗原経験後、セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯの発現を獲得し、ＣＤ４５ＲＡの発現を喪失する。そのため、ＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ４５ＲＯのいずれかが、メモリー集団からナイーブ集団を一般に分化させるために使用される。ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌは、セントラルとエフェクターメモリーＴ細胞とを区別するために使用することができる２つの他のマーカーである。ナイーブおよびセントラルメモリー細胞は、二次リンパ系器官に遊走するために、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌを発現する。そのため、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ６２Ｌ－である。
標準的なＴ細胞と比較して、これらのメモリーＴ細胞は、特異的表面マーカーの発現、異なるサイトカインプロファイルの迅速な生成、エフェクター細胞機能を方向付ける能力、および固有のホーミング分布パターンなどの明確に異なる表現型をと伴って、長寿命である。メモリーＴ細胞は、オフェンダーの再感染を除去するために、それらのそれぞれの抗原に再曝露されると迅速な反応を示して、それにより免疫系のバランスを迅速に回復させる。自己免疫メモリーＴ細胞が自己免疫疾患を処置または治癒しようとするほとんどの試みを妨げることを立証する証拠が増えている（Ｃｌａｒｋ， Ｒ．Ａ．， ”Ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．， Ｖｏｌ． ７， ２６９ｒｖ１， （２０１５））。
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球は、骨髄の造血細胞に由来する。成熟Ｂ細胞は、その細胞表面によって認識されるエピトープを発現する抗原で活性化され得る。活性化プロセスは、抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存して、直接的（架橋依存性Ｂ細胞活性化）であってもよく、または同族ヘルプと称されるプロセスにおけるヘルパーＴ細胞との相互作用とを介した間接的であってもよい。多くの生理的状況では、受容体架橋刺激および同族ヘルプは、相乗効果を示して、より活発なＢ細胞応答を生じさせる（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
架橋依存性Ｂ細胞活性化は、それぞれのＢ細胞が、同一の可変領域を有するＩｇ分子を発現するので、抗原が細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを発現することを必要とする。そのような要件は、微生物の莢膜多糖またはウイルスエンベロープタンパク質などの反復エピトープを有する他の抗原によって満たされる。架橋依存性Ｂ細胞活性化は、これらの微生物に対して開始される主な防御免疫応答である（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
同族ヘルプは、Ｂ細胞が、受容体を架橋することができない抗原に対する応答を開始するのを可能にし、同時に、それらが弱い架橋事象によって刺激された場合にＢ細胞を不活性化からレスキューする共刺激シグナルを提供する。同族ヘルプは、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）による抗原の結合、抗原のエンドサイトーシス、および細胞のエンドソーム／リソソーム区画内でのペプチドへのその断片化に依存する。生じたペプチドの一部は、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子として公知の特殊化された一連の細胞表面タンパク質の溝にロードされる。生じたクラスＩＩ／ペプチド複合体は、細胞表面において発現され、ＣＤ４＋Ｔ細胞と名付けられた一連のＴ細胞の抗原特異的受容体に対するリガンドとして作用する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞のクラスＩＩ／ペプチド複合体に特異的な受容体をそれらの表面に有する。Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞のそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による結合に依存するのみではなく、この相互作用は、Ｔ細胞上の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞上のその受容体（ＣＤ４０）に結合し、Ｂ細胞活性化をシグナル伝達することも可能にする。加えて、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞上のサイトカイン受容体への結合によって刺激されたＢ細胞の成長および分化を制御するいくつかのサイトカインを分泌する（Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， ”Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， （１９９９））。
抗体産生のための同族ヘルプの間、ＣＤ４０リガンドは、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞において一過的に発現し、抗原特異的Ｂ細胞上のＣＤ４０に結合し、それにより第２の共刺激シグナルを伝達する。後者のシグナルは、Ｂ細胞の成長および分化、ならびに抗原と遭遇した胚中心Ｂ細胞のアポトーシスを防止することによるメモリーＢ細胞の生成のために必須である。Ｂ細胞およびＴ細胞の両方におけるＣＤ４０リガンドの高発現は、ヒトＳＬＥ患者における病原性の自家抗体産生に関与する（Ｄｅｓａｉ－Ｍｅｈｔａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ Ｂ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｐｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｖｏｌ． ９７（９）， ２０６３－２０７３， （１９９６））。
ＩＩ．人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
ＩＩ．人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
本開示は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、ならびに免疫細胞の特異的集団を活性化または抑制するように操作された、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含むａＡＰＣを特徴とする。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、および制御性Ｔ細胞を活性化するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、およびある特定の免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞または細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、ならびにある特定の免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／または樹状細胞（ＤＣ）を抑制するように操作されている。
一態様では、本開示は、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのいずれかを含む抗原提示ポリペプチドを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を提供する。
当業者には、本明細書において提供される開示に基づいて、本明細書において提供される教示を装備するとすぐに、多数の免疫制御性分子を、ａＡＰＣを生成するために使用することができることを理解するだろう。すなわち、免疫細胞の活性化および誘導、例えば、制御性Ｔ細胞の活性化、または免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／もしくは樹状細胞（ＤＣ）の抑制の阻害に関与する事象ならびに分子に関する当技術分野における幅広い知識が存在する。
一部の態様では、本開示は、１種または複数の外因性ポリペプチドを含む、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含むａＡＰＣを提供する。本開示の外因性ポリペプチドは、限定されるものではないが、外因性抗原ポリペプチド、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカイン、および外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを含む。
外因性抗原ポリペプチド
外因性抗原ポリペプチド
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、外因性抗原ポリペプチドに結合している（例えば、特異的に結合している）抗原提示ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む）を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含み、外因性抗原ポリペプチドは、表１に提供されるアミノ酸配列、またはその断片もしくはバリアントから選択されるか、またはそれらを含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、寛容原性ポリペプチドである。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ＨＳＰ６０（例えば、ＨＳＰ６０のリーダー配列）に由来する。
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含み、外因性抗原ポリペプチドに結合している（例えば、特異的に結合している）。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含み、外因性抗原ポリペプチドは、モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有する。
当業者は、限定されるものではないが、ワールドワイドウェブｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／２４０４７８７／ｔａｂｌｅｓ／１でＮａｔｕｒｅを介して利用可能なＴ細胞エピトープ予測ツールなどの当技術分野において公知の検索ツールを使用して、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ結合ペプチドを特定することができる。その内容が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１８／００５５５９は、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇに対する結合ペプチドを特定する方法を記載している。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、約８～約２４アミノ酸長の間である。
他の実施形態では、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ抗原提示ポリペプチドにおいて提示される外因性抗原ポリペプチドは、本明細書に開示される抗原のいずれか１つから選択される抗原ポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、表１に開示される抗原から選択される抗原由来の抗原ポリペプチドであるか、またはモチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有する。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、感染性疾患病原体（例えば、ウイルス、寄生生物（例えば、細胞内寄生生物）、プリオン、細菌（例えば、細胞内病原性細菌）に由来する。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ウイルス（例えば、エプスタインバーウイルスまたはＨＩＶ）に由来する。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、８アミノ酸長～２４アミノ酸長、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸長である。さらなる実施形態では、切断可能な部位が、外因性抗原ポリペプチドに導入されている。
一部の実施形態では、本明細書において提供される操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、少なくとも２種類の外因性ポリペプチド：ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのいずれかを含む少なくとも１つ（１、２、３またはそれよりも多く）のロード可能な外因性抗原提示ポリペプチド、および少なくとも１つ（１、２、３またはそれよりも多く）の外因性抗原ポリペプチド（例えば、第１および／または第２の外因性抗原ポリペプチド）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドの一部は、外因性抗原提示ポリペプチドの抗原結合間隙に結合することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの外因性抗原ポリペプチドは、Ｉ型膜タンパク質膜貫通ドメイン（例えば、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）膜貫通ドメイン）またはＩＩ型膜タンパク質膜貫通ドメイン（例えば、小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）膜貫通ドメイン）などの膜貫通ドメインを、Ｎ末端またはＣ末端融合のいずれかとして含み、例えば、その結果、本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチドに結合することができる抗原ポリペプチドの部分は、操作された赤血球細胞または除核細胞の表面の外側に存在する。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、リンカー、および外因性抗原提示ポリペプチドの抗原結合間隙に結合することができるアミノ酸配列（例えば、抗原）を含む。本明細書において提供されるリンカーのいずれかは、膜貫通ドメイン、および外因性抗原提示ポリペプチドの抗原結合間隙に結合することができるアミノ酸配列の間に配置され得る。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、フレキシブルなリンカー（例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカー）である。一部の実施形態では、リンカーは、約３０～約１００アミノ酸残基長である。他の実施形態では、リンカーは、約４０アミノ酸残基長～７０アミノ酸残基長の間である。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー（例えば、酵素的切断部位を含む）である。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に連結されていてもよい。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に連結されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、３つまたはそれよりも多く、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、５００または１０００の外因性抗原ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の集団は、３つまたはそれよりも多く、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００の外因性抗原ポリペプチドを含み、例えば、集団中の異なる操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、異なる外因性抗原ポリペプチドを含むか、または集団中の異なる赤血球細胞は、異なる複数の外因性抗原ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、対応する野生型外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の外因性抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸（例えば、外因性核酸）も提供される。一部の実施形態では、核酸は、外因性抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームまたは遺伝子に作動可能に連結した少なくとも１種のプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導プロモーター）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、野生型外因性抗原ポリペプチドをコードする核酸配列と、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸（例えば、外因性核酸）によってコードされる。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、野生型外因性抗原ポリペプチドをコードする核酸配列と、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸（例えば、外因性核酸）によってコードされ、外因性抗原ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。一部の実施形態では、核酸は、コドン最適化されている（例えば、ヒト細胞における発現のため）。一部の実施形態では、核酸は、コドン最適化されていない。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、野生型の天然に存在する外因性抗原ポリペプチドのホモログまたはバリアントである。例えば、一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸残基で、野生型外因性抗原ポリペプチド参照のアミノ酸配列と異なり得る。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は、野生型外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、保存的（例えば、構造的に類似の）アミノ酸置換を含むように、改変される。例えば、構造的に類似のアミノ酸としては、（イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ））；（フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ））；（リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ））；（グルタミン（Ｑ）およびアスパラギン（Ｎ））；（アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ））；ならびに（グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ））が挙げられる。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は、野生型外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、非保存的アミノ酸置換を含むように、改変される。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、野生型外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含む。本明細書に記載される通り使用され得る野生型外因性抗原ポリペプチドのホモログおよびバリアントは、多形バリアント、天然または人工突然変異体、および１つまたは複数の残基が改変される改変ポリペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、野生型外因性抗原ポリペプチドと、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は、最大で１、２、３、４、５、８、１０、２０または５０残基だけ野生型外因性抗原ポリペプチドのアミノ酸配列と（例えば、切断、欠失、置換または付加によって）異なり、それが由来する野生型外因性抗原ポリペプチドの機能を保持している。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドの断片またはバリアントは、断片またはバリアントが由来する野生型外因性抗原ポリペプチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８５３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の外因性抗原ポリペプチドの活性を含む。
外因性抗原提示ポリペプチド
外因性抗原提示ポリペプチド
本開示の外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのいずれかを含む。一部の実施形態では、本開示の外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む細胞表面複合体のサブユニットを含み、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドが結合するために機能する。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇのサブユニット（例えば、αドメイン）であり、機能は、外因性抗原ポリペプチドに結合することである。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチドのＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドにロードされ（例えば、抗原結合間隙に）、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドの機能は、外因性抗原ポリペプチドに提示することである。
外因性抗原ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチドに、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合してもよい。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、機能的ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含み、外因性抗原提示ポリペプチドは、アルファドメイン１～３（アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）のうちの１つもしくは複数、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）ポリペプチド、またはその断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、１つもしくは複数のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇαサブユニット（例えば、１つまたは複数のαドメイン）は、β２Ｍポリペプチドに、結合、例えば、共有結合的に結合または非共有結合的に結合している。一部の実施形態では、１つもしくは複数のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇαサブユニット（例えば、１つまたは複数のαドメイン）は、β２Ｍポリペプチドに、結合しておらず、例えば、共有結合的に結合または非共有結合的に結合していない。
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、Ｅ＊０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０１：０１：０３、Ｅ＊０１：０１：０１：０４、Ｅ＊０１：０１：０１：０５、Ｅ＊０１：０１：０１：０６、Ｅ＊０１：０１：０１：０７、Ｅ＊０１：０１：０１：０８、Ｅ＊０１：０１：０１：０９、Ｅ＊０１：０１：０１：１０、Ｅ＊０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０１、Ｅ＊０１：０３：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０４、Ｅ＊０１：０３：０２：０１、Ｅ＊０１：０３：０２：０２、Ｅ＊０１：０３：０３、Ｅ＊０１：０３：０４、Ｅ＊０１：０３：０５、Ｅ＊０１：０４、Ｅ＊０１：０５、Ｅ＊０１：０６、Ｅ＊０１：０７、Ｅ＊０１：０８Ｎ、Ｅ＊０１：０９、およびＥ＊０１：１０対立遺伝子、またはそれらの断片（例えば、１つまたは複数のそのαドメイン）から選択されるＨＬＡ－Ｅ対立遺伝子のものである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドに連結されている（例えば、融合されている）。例えば、一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドに連結したＨＬＡ－Ｅ分子を含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図１において説明される構造を有する。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ＨＳＰ６０またはＨＳＰ６０に由来するペプチド（例えば、ＨＳＰ６０のリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、表１に列挙されたペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、Ｅ＊０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０１：０１：０３、Ｅ＊０１：０１：０１：０４、Ｅ＊０１：０１：０１：０５、Ｅ＊０１：０１：０１：０６、Ｅ＊０１：０１：０１：０７、Ｅ＊０１：０１：０１：０８、Ｅ＊０１：０１：０１：０９、Ｅ＊０１：０１：０１：１０、Ｅ＊０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０１、Ｅ＊０１：０３：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０４、Ｅ＊０１：０３：０２：０１、Ｅ＊０１：０３：０２：０２、Ｅ＊０１：０３：０３、Ｅ＊０１：０３：０４、Ｅ＊０１：０３：０５、Ｅ＊０１：０４、Ｅ＊０１：０５、Ｅ＊０１：０６、Ｅ＊０１：０７、Ｅ＊０１：０８Ｎ、Ｅ＊０１：０９またはＥ＊０１：１０対立遺伝子のＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含み、外因性抗原ポリペプチドは、表１に列挙されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、およびβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６もしくはＨＬＡ－Ｇ７アイソフォーム、またはその断片（例えば、１つまたは複数のそのαドメイン）である。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ多量体、例えば、二量体である。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１＊０１：０１：０１：０１対立遺伝子のものである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、残基４２に対になっていないシステインを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、外因性抗原ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有し、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。例えば、一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドに連結したＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図２Ａにおいて説明される構造を有する。他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図２Ｂにおいて説明される構造を有する。他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図２Ｃにおいて説明される構造を有する。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、およびβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、ならびにβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、ならびにβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、およびβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ３アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、ならびにβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、β２Ｍポリペプチド、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ４アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ２ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、ならびにβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ５アイソフォームポリペプチドのアルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、ならびにβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、ならびに膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームポリペプチドのアルファ１およびアルファ３ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、ならびに１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメインを含み、β２Ｍポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、およびβ２Ｍポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇ７アイソフォームポリペプチドのアルファ１ドメイン、β２Ｍポリペプチド、膜アンカー（例えば、ＧＰＡタンパク質またはその膜貫通ドメイン）、および１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルなリンカー）を含み、外因性抗原ポリペプチドに（例えば、リンカーを介して）連結されている。
操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含むａＡＰＣは、本明細書に記載のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように操作され、一部の実施形態では、免疫のモジュレーション、例えば、１種もしくは複数の免疫細胞集団の活性化または抑制のために使用される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドおよび外因性抗原ポリペプチドの間で融合された単一タンパク質を含む。一部の実施形態では、複合体の非膜性の繋がれた構成成分、例えば、抗原ポリペプチドまたはβ２ミクログロブリンは、表面に輸送される前に細胞内で別の薬剤とアセンブルされ、細胞によって分泌され、次いで、多量体の膜性の繋がれた成分構成によって表面に捕捉されるか、または精製形態でａＡＰＣに添加される。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、膜アンカー、α鎖（例えば、ＨＬＡ－Ｅのα鎖またはＨＬＡ－Ｇのα鎖）、およびβ２Ｍポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇを含む外因性抗原提示ポリペプチドにリンカーを介して接続されている。関連する実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。別の実施形態では、膜アンカーは、グリコホリンアンカー、特に、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）であるか、または膜アンカーは、小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）である。一部の実施形態では、膜アンカーは、全長ＧＰＡを含む。他の実施形態では、膜アンカーは、ＳＭＩＭ１の膜貫通ドメイン、またはＧＰＡの膜貫通ドメインを含む。
他の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含み、成熟ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドの保存されたアルファ鎖の８４位に対応するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）へのアミノ酸置換（例えば、Ｙ８４Ａ）を含む。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、一本鎖融合ポリペプチドとして外因性抗原ポリペプチドに融合されており、一本鎖融合ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端に）：外因性抗原ポリペプチド、リンカー、β２Ｍポリペプチド、必要に応じてリンカー、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、必要に応じてリンカー、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡまたはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、成熟ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの保存されたアルファ鎖の８４位に対応するアミノ酸残基のシステインへのアミノ酸置換（例えば、Ｙ８４Ｃ）を含み、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、成熟ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの保存されたアルファ鎖の８４位に対応するアミノ酸残基のシステインとジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、外因性抗原ポリペプチドの末端（例えば、ＮまたはＣ末端）に続いて１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目または１２番目の残基に、少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、外因性抗原ポリペプチドの末端（例えば、ＮまたはＣ末端）に続いて２番目の残基に、システイン残基を含む。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、一本鎖融合ポリペプチドとして外因性抗原ポリペプチドに融合されており、一本鎖融合ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端に）：外因性抗原ポリペプチド、リンカー、β２Ｍポリペプチド、必要に応じてリンカー、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン１～３（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）、必要に応じてリンカー、および膜アンカー（例えば、ＧＰＡまたはその膜貫通ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドは、成熟ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの保存されたアルファ鎖の８４位に対応するアミノ酸残基のシステインへのアミノ酸置換（例えば、Ｙ８４Ｃ）を含み、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、成熟ＨＬＡ－Ｇポリペプチドの保存されたアルファ鎖の８４位に対応するアミノ酸残基のシステインとジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、外因性抗原ポリペプチドの末端（例えば、ＮまたはＣ末端）に続いて１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目または１２番目の残基に、少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドおよびβ２Ｍポリペプチドの間に配置されたリンカーは、外因性抗原ポリペプチドの末端（例えば、ＮまたはＣ末端）に続いて２番目の残基に、システイン残基を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図１において説明される構造を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図２Ａ～２Ｃのいずれか１つにおいて説明される構造を含む。
本開示は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇの多形体を含む外因性抗原提示ポリペプチドも包含する。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外因性抗原提示ポリペプチドである。
外因性共刺激ポリペプチド
外因性共刺激ポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、外因性共刺激ポリペプチドを含む。外因性共刺激ポリペプチドは、免疫細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）上のポリペプチドを含み、それにより限定されるものではないが、増殖、活性化、分化などを含む、免疫細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激ポリペプチドは、とりわけ、免疫細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含する。そのような抗体は、好ましくは、免疫細胞上の共刺激分子に結合し、それに対するアゴニストとして作用する。
一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、免疫、例えば、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激または活性化する。一部の実施形態では、とりわけ、共刺激ポリペプチドを含むａＡＰＣは、免疫細胞の増殖を促進する。一部の実施形態では、１種または複数（例えば、２、３、４もしくは５、またはそれよりも多く）の共刺激ポリペプチドは、下記の表２の活性化ポリペプチド、またはその免疫細胞の活性化バリアント（例えば、断片）を含む。一部の実施形態では、１種または複数（例えば、２、３、４もしくは５、またはそれよりも多く）の共刺激ポリペプチドは、表２の標的受容体に結合する抗体分子（例えば、アゴニスト性抗体）、またはその免疫細胞の活性化バリアント（例えば、断片）を含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激または活性化するために、異なる免疫細胞活性化リガンド、例えば、表２の１つまたは複数の活性化ポリペプチドをそれらの任意の組合せで含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ、またはそれらの断片もしくはバリアントを提示する操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含む。一部の実施形態では、これらのタンパク質は、相補的活性化経路を通してシグナルを送る。共刺激ポリペプチドは、内因性免疫細胞活性化リガンド、または標的受容体に対する抗体分子に由来し得る。
一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、例えば、外因性または内因性タンパク質の膜貫通ドメインに連結されている。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の細胞表面に存在する。
一部の実施形態では、１種または複数の共刺激ポリペプチドは、活性化サイトカイン、インターフェロン、Ｉｇスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦスーパーファミリー受容体、またはＴＮＦファミリーメンバー、例えば、ＩＦＮα、ＩＬ２、ＩＬ６、またはそれらの任意の組合せを含む。
本開示において有用な活性化サイトカイン、インターフェロン、Ｉｇスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦスーパーファミリー受容体、またはＴＮＦファミリーメンバーは、下記でさらに議論する。一部の実施形態では、１種または複数の共刺激ポリペプチドは、１種または複数の活性化サイトカイン、インターフェロンまたはＴＮＦファミリーメンバーを含み、１種もしくは複数の活性化ポリペプチドまたはリガンド（例えば、表２のもの）またはその免疫細胞活性化バリアント（例えば、断片）、あるいは標的共刺激免疫細胞受容体（例えば、表２のもの）に結合する１種もしくは複数の抗体分子（例えば、アゴニスト性抗体）、またはその免疫細胞活性化バリアント（例えば、断片）を含む。
免疫細胞の増大
免疫細胞の増大
ある特定の実施形態では、本開示は、免疫細胞、例えば、公知の共刺激分子を含むＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を特異的に誘導するために使用することができるａＡＰＣを特徴とする。本方法は、増大される免疫細胞を、免疫細胞によって発現された共刺激分子と特異的に結合する外因性ポリペプチドを提示するａＡＰＣと接触させるステップを含む。そのため、免疫細胞を、特に、免疫細胞表面で発現する同族共刺激分子と特異的に結合する共刺激リガンドを含むａＡＰＣと接触させるステップは、多数の特異的免疫細胞が容易に生成することができるように、免疫細胞を刺激し、免疫細胞の増殖を誘導する。ａＡＰＣは、特定の共刺激分子を発現する免疫細胞のみがａＡＰＣによって増大されるという点で「特異的に」免疫細胞を増大させる。そのため、増大される免疫細胞が、細胞の混合物中に存在する場合、その一部またはほとんどは、共刺激分子を発現せず、目的の免疫細胞のみが、増殖するように誘導され、細胞数を増大させる。免疫細胞は、当技術分野において公知の技法および／または本明細書の他の場所に記載の技法などの幅広い種類の細胞の分離ならびに精製技法を使用して、さらに精製することができる。
当業者に理解されるであろうように、本明細書において提供される開示に基づいて、目的の免疫細胞は、ａＡＰＣを使用する増大の前に、特定または単離する必要はない。これは、ａＡＰＣが、選択的であり、同族共刺激分子を発現する免疫細胞のみを増大させるためである。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外因性共刺激ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ａＡＰＣ細胞は、例えば、ａＡＰＣ上で共存在するリガンドもしくは抗体分子、またはその両方を使用して、複数の免疫細胞活性化経路を組み合わせて（例えば、上記の表２に記載の通り）標的にする。
一部の実施形態では、少なくとも１種の外因性共刺激ポリペプチドは、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＬ－１５、４－１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ－１５に融合したＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＣＡＭ－１に対するリガンド、ＬＦＡ－１に対するリガンド、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１種の外因性共刺激ポリペプチドは、同族共刺激リガンド受容体に対するアゴニスト抗体である。例えば、ある特定の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４－１－ＢＢ、ＬＩＧＨＴ受容体（ＨＶＥＭ）、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ４受容体（ＴＩＭ１）、ＳＬＡＭ受容体、ＣＤ４８受容体（ＣＤ２）、ＣＤ５８受容体（ＣＤ２）、ＣＤ８３受容体、ＣＤ１５５受容体（ＣＤ２２６）、ＣＤ１１２受容体（ＣＤ２２６）、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２）、ＩＬ－２１受容体、ＩＣＡＭ、およびそれらの組合せに対するアゴニスト抗体である。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の外因性共刺激ポリペプチドは、ＩＬ－１５である。ある特定の実施形態において、少なくとも１種の外因性共刺激ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３８抗体、およびそれらの組合せである。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の外因性共刺激ポリペプチドを提示する。一部の実施形態では、共刺激タンパク質は、互いに融合し、例えば、ＩＬ－２に融合したＩＬ－２１である。
外因性共阻害ポリペプチド
外因性共阻害ポリペプチド
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、外因性共阻害ポリペプチドを含む。外因性共阻害ポリペプチドは、免疫細胞の活性の阻害、免疫細胞の増殖の阻害、免疫細胞のアネルギー化、または免疫細胞のアポトーシスの誘導を含む、免疫細胞を抑制する任意のポリペプチドである。
一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、免疫細胞上の同族共阻害分子に特異的に結合する、抗原提示細胞上の阻害ポリペプチドリガンドである。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドリガンドは、表３に示される阻害ポリペプチドである。
一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、例えば、外因性または内因性タンパク質の膜貫通ドメインに連結されている。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の細胞表面に存在する。
一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＤＣまたはＮＫにおける共阻害受容体に特異的に結合するアゴニスト（例えば、抗体）である。一部の実施形態では、アゴニストは、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＧＦβ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０および２Ｂ４からなる群から選択される受容体に結合する抗体である。他の実施形態では、アゴニストは、表３に示される、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＤＣまたはＮＫ細胞上の標的受容体に結合する抗体である。
一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、細胞表面のチェックポイント分子である。一部の実施形態では、チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２およびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３またはＬＡＧ３のアゴニストである。
一部の実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、共刺激ポリペプチドのその同族共刺激受容体への結合を遮断する抗体である。さまざまな実施形態では、外因性共阻害ポリペプチドは、４－１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ－１５に融合したＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１に対するリガンド、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体のその受容体への結合を遮断する抗体である。
他の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＩＬ－３５、ＩＬ－１０またはＶＳＩＧ－３から選択される。
他の実施形態では、ａＡＰＣ細胞は、例えば、ａＡＰＣ上のリガンドもしくは抗体分子、またはその両方を使用して、複数の免疫細胞阻害経路を組み合わせて（例えば、上記の表３に記載の通り）標的にする。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外因性共阻害ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の外因性共阻害ポリペプチドを提示する。
Ｔｒｅｇ共刺激および共阻害ポリペプチド
Ｔｒｅｇ共刺激および共阻害ポリペプチド
制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、免疫系の活性化を抑制し、それにより自己抗原に対する寛容を維持する、Ｔ細胞の特殊化下位集団である。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトおよびげっ歯類においてＣＤ４＋Ｔ細胞の５～１０％を占める。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトおよびげっ歯類においてＣＤ４＋Ｔ細胞の５～１０％を占め、ＣＤ４およびＣＤ２５、ならびにそれらの発達および機能に関与する転写因子ＦｏｘＰ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を構成的に発現する。ＩＬ－２はまた、ＩＬ－２またはその受容体の構成成分が不十分な動物が、ナイーブな動物からのＴｒｅｇ細胞の養子移入によって修正することができるＴ細胞の過剰増殖および自己免疫疾患を発生するので、Ｔｒｅｇ細胞の発達および恒常性において重要な役割を果たすと思われる。同様に、ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用によるシグナル伝達の欠如は、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能性の低減に関連し、この受容体／リガンド系がＴｒｅｇ細胞の発達および機能において重要な役割を果たすことを示唆する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞を増大することができるＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドを含むａＡＰＣを特徴とする。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の発達に関与する３つのシグナルの少なくとも１つを刺激することによって、Ｔｒｅｇ細胞を増大させる。シグナル１は、ＴＣＲを含み、抗ＣＤ３抗体などの抗体で、またはＴＣＲを通してシグナルを送る抗原で刺激され得る。シグナル２は、ＣＤ８０および４－１ＢＢＬなどの免疫共刺激分子を含むいくつかの異なる分子によって媒介され得る。シグナル３は、ＩＬ－２またはＴＧＦβなどのサイトカインを介して伝達される。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルの１つを刺激する。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルの２つを刺激する。さらに別の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルの３つを刺激する。
シグナル１
シグナル１を刺激するためのＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとして有用な抗原は、標的の疾患または状態に関連する抗原を含む。例えば、自己抗原およびインスリン（特に、１型糖尿病を処置するために適切なもの）、コラーゲン（特に、関節リウマチを処置するために適切なもの）、ミエリン塩基性タンパク質（特に、多発性硬化症を処置するために適切なもの）、およびＭＨＣ（外来性移植片拒絶を処置および防止するため）。抗原は、コンジュゲートの一部として投与されてもよい。必要に応じて、抗原は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ／抗原複合体の一部として提供される。この実施形態では、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇおよび抗原は、独立して、外来性または同質遺伝子的であり得る。例えば、ドナーＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、および同種異系または同質遺伝子的抗原を使用することができる。
シグナル１を刺激するためのＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとして有用な抗原は、標的の疾患または状態に関連する抗原を含む。例えば、自己抗原およびインスリン（特に、１型糖尿病を処置するために適切なもの）、コラーゲン（特に、関節リウマチを処置するために適切なもの）、ミエリン塩基性タンパク質（特に、多発性硬化症を処置するために適切なもの）、およびＭＨＣ（外来性移植片拒絶を処置および防止するため）。抗原は、コンジュゲートの一部として投与されてもよい。必要に応じて、抗原は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ／抗原複合体の一部として提供される。この実施形態では、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇおよび抗原は、独立して、外来性または同質遺伝子的であり得る。例えば、ドナーＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、および同種異系または同質遺伝子的抗原を使用することができる。
シグナル２
シグナル２を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｂ７およびＴＮＦファミリーのメンバー、例えば、下記の表４に示されるＢ７およびＣＤ２８ファミリーメンバー、および表５に示されるＴＮＦファミリーメンバーを含む。
シグナル２を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｂ７およびＴＮＦファミリーのメンバー、例えば、下記の表４に示されるＢ７およびＣＤ２８ファミリーメンバー、および表５に示されるＴＮＦファミリーメンバーを含む。
シグナル３
シグナル３を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、サイトカイン、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＧＦ－β（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を含む）などのシグナル３を刺激する成長因子を含む。免疫療法の方法において有用なＩＬ－２およびＩＬ－４部分は、当技術分野において公知である。例えば、 Ｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， 上記；Ｔｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２： ６５１９－２３；Ｔｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４： ３６６－７６を参照されたい。一部の実施形態によれば、サイトカインの成熟部分が使用される。
シグナル３を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、サイトカイン、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＧＦ－β（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を含む）などのシグナル３を刺激する成長因子を含む。免疫療法の方法において有用なＩＬ－２およびＩＬ－４部分は、当技術分野において公知である。例えば、 Ｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， 上記；Ｔｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２： ６５１９－２３；Ｔｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４： ３６６－７６を参照されたい。一部の実施形態によれば、サイトカインの成熟部分が使用される。
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ＩＬ－２、例えば、ＣＤ２５特異的ＩＬ－２である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦである。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ペプチドは、４１ＢＢＬである。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ペプチドは、ＴＧＦベータである。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ペプチドは、ＣＤ８０である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ペプチドは、ＣＤ８６である。
他の実施形態では、本開示は、Ｔｒｅｇ細胞を阻害する外因性ポリペプチドであるＴｒｅｇ共阻害ポリペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ阻害は、例えば、Ｔｒｅｇ輸送に関与するケモカインを標的にすることによる、がんの処置において有用である。他のＴｒｅｇ阻害剤は、表４または５に列挙された受容体のいずれか、例えば、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲもしくは抗ＣＴＬＡ４、またはＴＬＲリガンドを標的にし得る。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを提示する。
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドまたはＴｒｅｇ共阻害ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、例えば、内因性タンパク質の膜貫通ドメインに連結されている。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドまたはＴｒｅｇ共阻害ポリペプチドは、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の細胞表面に存在する。
サイトカイン／ケモカイン
サイトカイン／ケモカイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、サイトカイン、ケモカインまたはその両方を含む、少なくとも１種の外因性ポリペプチドを含む。加えて、本開示は、少なくとも１種のサイトカイン、少なくとも１種のケモカインまたはその両方をコードする核酸で形質導入されたａＡＰＣを包含する。そのため、本開示は、サイトカインの全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含む、サイトカインを含む外因性ポリペプチドを含むａＡＰＣを提供する。サイトカインは、別の細胞の生物学的機能に影響を及ぼすことができるタンパク質を含む。サイトカインによって影響を及ぼされる生物学的機能としては、限定されるものではないが、細胞成長、細胞分化または細胞死が挙げられ得る。好ましくは、本開示のサイトカインは、細胞の表面の特異的受容体に結合することができ、それにより細胞の生物学的機能に影響を及ぼす。
好ましいサイトカインとしては、中でも、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子および／またはケモカインが挙げられる。本開示のより好ましいサイトカインとしては、数ある中でも、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン３５（ＩＬ－３５）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、およびＩＧＩＦが挙げられる。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、抗原提示ポリペプチドのＨＬＡ－Ｅを含み、ＩＬ－１５で形質導入される。
一部の実施形態では、本開示は、そのホモログ、バリアント、突然変異体または断片を含むケモカイン、例えば、限定されるものではないが、Ｃ５ａ、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、単球走化性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１α）、単球走化性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１β）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ－３）、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）、Ｎ－ホルミル－メチオニル－ロイシル－［３Ｈ］フェニルアラニン（ＦＭＬＰＲ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、リンホタクチン、ＩＰ１０、１－３０９、ＥＮＡ７８、ＧＣＰ－２、ＮＡＰ－２および／またはＭＧＳＡ／ｇｒｏを含む、アルファ－ケモカインまたはベータ－ケモカインを含む外因性ポリペプチドを含むａＡＰＣを提供する。当業者は、本明細書において提供される教示を装備するとすぐに、本開示が、ケモカインおよび／またはサイトカインを含む外因性ポリペプチドを含むＡＰＣ、例えば、当技術分野において周知のもの、および将来発見される任意のものを包含することを理解するだろう。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、表６からの１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多く）のサイトカイン受容体サブユニット、またはそのサイトカイン結合バリアントもしくは断片を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、表４の単列からの２つまたは３つ（例えば、すべて）のサイトカイン受容体サブユニット、またはそのサイトカイン結合バリアントもしくは機能的断片を含む。サイトカイン受容体は、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の表面に存在し得る。発現した受容体は、典型的には、その標的リガンドに結合し、隔絶することができる、野生型ヒト受容体配列、またはそのバリアントもしくは断片を有する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのサイトカイン受容体サブユニットは、例えば、融合タンパク質として、互いに連結されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数（例えば、２つまたはすべて）のサイトカインは、例えば、サイトカインが操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の表面に存在するように、膜貫通ドメイン（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン、または本明細書に記載の他の膜貫通ドメイン）に融合されている。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、標的化部分、例えば、ＷＯ２００７０３０７０８、例えば、その３４～４５頁に記載のアドレス部分または標的化部分をさらに含み、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＴｒｅｇ共刺激ポリペプチド、共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチドもしくはサイトカイン、またはそれらの活性断片は、本開示による使用のための結合対メンバーと連結され得るか、または融合タンパク質として発現し得る。例示的な結合対は、ビオチン、およびストレプトアビジン（ＳＡ）またはアビジンである。
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド、共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチドもしくはサイトカイン、またはそれらの活性断片は、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド、共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチドもしくはサイトカイン、およびＣＳＡなどの結合対メンバーを含む融合タンパク質の一部である。融合タンパク質は、当技術分野において公知のいくつかの異なる方法のいずれかによって作製することができる。例えば、融合タンパク質の１つまたは複数の構成成分のポリペプチドは、化学的に合成することができるか、または周知の組換え核酸技術を使用して生じさせることができる。
コンジュゲートは、結合対メンバーおよび共刺激部分の間に、ペプチドリンカーなどのリンカーを含んでいてもよい。リンカーの長さおよび組成は、その部分のいずれかの機能的末端の活性を増強するために選択することができる。リンカーは、２０アミノ酸長よりも長くてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、一般に、約３～約３０アミノ酸長、例えば、約５～約２０アミノ酸長、約５～約１５アミノ酸長、約１～約１０アミノ酸長である。しかしながら、より長いリンカーもしくはより短いリンカーを使用してもよく、またはリンカーは、全体的になしで済ませてもよい。例えば、一本鎖抗体の重鎖および軽鎖に接続するために使用されているフレキシブルなリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）を、これに関連して使用してもよい。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５： ５８７９－５８８３；米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、同第４，９５６，７７８号、同第５，２５８，４９８号および同第５，４８２，８５８号を参照されたい。他のリンカーは、ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ（配列番号９）またはＬＱＮＤＡＱＡＰＫＳ（配列番号１０）である。免疫グロブリンＦｃ領域の１つまたは複数のドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）もリンカーとして使用してもよい。
操作された赤血球細胞
操作された赤血球細胞
一部の態様では、本開示は、ある特定の免疫細胞集団を活性化または阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、ならびに免疫細胞の特異的集団を活性化または抑制するように操作された、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含む人工抗原提示細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、およびある特定の免疫細胞、例えば、制御性Ｔ細胞を活性化するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、およびある特定の免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように、ならびにある特定の免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／または樹状細胞（ＤＣ）を抑制するように操作されている。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含み、これは、表１に開示される外因性抗原ポリペプチド、またはモチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有する外因性抗原ポリペプチドを提示する。
一部の実施形態では、除核細胞は、（例えば、赤血球生成などの分化プロセスに起因して）核を欠く細胞である。一部の実施形態では、除核細胞は、ポリペプチドを発現することができない。一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球、網状赤血球または血小板である。操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患またはアレルギー性疾患の処置のために有利に使用され得る。詳細には、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、非自家（例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を実質的に欠く）であり得、対象中で長期間循環し（例えば、３０日よりも長く）、大量に生成され得る。また、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、高度に変形可能であり得、他の治療手段ではアクセスできない場合がある対象内の部位に細胞がアクセスすることができるようにする。
操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第２の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、第２および第３の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、第２、第３および第４の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、第２、第３、第４および第５の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くの異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、１～１００、１～２００の間の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。
ある特定の実施形態では、抗原を含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの文脈で、抗原をプロセシングおよび／または提示し得、それにより抗原特異的Ｔ細胞を生成し、その集団を増大させる。したがって、目的の抗原は、本開示のａＡＰＣに導入され得、ａＡＰＣは、次いで、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの文脈において、抗原を提示し、すなわち、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、抗原を「ロード」されるか、または抗原に結合し、ａＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞を生成するために使用することができる。そのため、一部の態様では、本開示は、免疫細胞をモジュレートするように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、細胞が、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、および外因性抗原ポリペプチドを提示する人工抗原提示細胞を提供する。
他の態様では、本開示は、制御性Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）が、外因性抗原ポリペプチドおよび外因性共刺激ポリペプチドを提示する人工抗原提示細胞を提供する。
一部の態様では、本開示は、制御性Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、および外因性抗原ポリペプチドを提示し、外因性抗原提示ポリペプチドが、一本鎖融合ポリペプチドであるａＡＰＣを提供する。
他の態様では、本開示は、制御性Ｔ細胞を活性化および増大させるように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、および外因性共刺激ポリペプチド、外因性制御性Ｔ細胞共刺激ポリペプチド、ならびに／またはサイトカインを含む外因性ポリペプチドを含む人工抗原提示細胞を提供する。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触した免疫細胞を刺激することができる。他の実施形態では、刺激することには、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはそれらの任意の組合せを含む。
他の態様では、本開示は、ある特定の免疫細胞集団、例えば、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）などを阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、外因性抗原ポリペプチドおよび外因性共阻害ポリペプチドを提示する人工抗原提示細胞を提供する。
一部の態様では、本開示は、ある特定の免疫細胞集団、例えば、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）などを阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、および外因性抗原ポリペプチドを含み、外因性抗原提示ポリペプチドが、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ一本鎖融合ポリペプチドである人工抗原提示細胞を提供する。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドに連結された外因性抗原ポリペプチドを含む。
他の態様では、本開示は、ある特定の免疫細胞集団を阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－ＧポリペプチドもしくはＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、および／またはサイトカインを含む外因性ポリペプチドを提示する人工抗原提示細胞を提供する。
一部の実施形態では、目的は、Ｔ細胞を活性化または阻害することである。Ｔ細胞が、本明細書に記載の活性化または阻害受容体のいずれかを同様に発現し得る他の免疫細胞全体にわたって優先的に標的にされるのを確実にするために、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）上の外因性ポリペプチドの１つは、標的化部分、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または別のＴ細胞マーカーに結合する抗体分子を含み得る。標的化部分は、本明細書の下記において、より詳細に記載する。一部の実施形態では、特異的Ｔ細胞サブタイプまたはクローンは、増強または阻害されてもよい。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞上の外因性ポリペプチドの１種または複数は、抗原特異的な様式でＴ細胞受容体に選択的に結合する抗原ペプチドを「ロード」された、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性ポリペプチドである。
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞の活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、赤血球細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、および表３に開示される外因性共阻害ポリペプチド、またはＩＬ１０、ＰＤＬ１もしくは４－１ＢＢＬを含む外因性ポリペプチドのうちの少なくとも１種を含む人工抗原提示細胞を提供する。
他の態様では、本開示は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞の活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、赤血球細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、およびＩＬ１０、ＰＤＬ１または４－１ＢＢＬから選択される少なくとも１種の外因性共阻害ポリペプチドを含む人工抗原提示細胞を提供する。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞を抑制することができる。他の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用する、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞を抑制することができる。さらなる実施形態では、抑制することは、細胞のアポトーシスの阻害、アネルギー化または誘導を含む。
一部の態様では、本開示は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含み、赤血球細胞が、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド、および外因性抗原ポリペプチドを含む人工抗原提示細胞を提供する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外因性Ｔｒｅｇ増大ポリペプチド、またはサイトカイン、例えば、ＩＬ－１５を含む外因性ポリペプチドをさらに提示する。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインまたは外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を含み、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、必要に応じて、第２の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をさらに含み、第２の外因性ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の外因性ポリペプチドである。
本開示はまた、本明細書に記載の外因性ポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」および「バリアント」を包含すると解釈されるべきであり、この突然変異体、誘導体およびバリアントは、ペプチドが、本開示の共刺激リガンド、サイトカイン、抗原などの生物学的／生化学的特性を有するという点で（例えば、タンパク質を含むａＡＰＣをＴ細胞と接触させる場合、Ｔ細胞の増殖を媒介するか、そうでなければ影響を及ぼすａＡＰＣに包含される）、得られたペプチド（またはＤＮＡ）が、本明細書において列挙される配列と同一ではないが、本明細書に開示されるペプチドと同じ生物学的特性を有するように、１つまたは複数のアミノ酸が変更された（またはそれをコードするヌクレオチド配列を称する場合、１つまたは複数の塩基対が変更された）、共刺激リガンド、サイトカイン、抗原（例えば、腫瘍細胞、ウイルスおよび他の抗原）である。任意の数の手順を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ）に記載されるものなどの当技術分野において周知の組換えＤＮＡ方法論を使用して、本開示のタンパク質の突然変異体、誘導体またはバリアント形態を生じさせるために使用し得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更することによるタンパク質またはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は、当技術分野において周知であり、これらおよび他の論文にも記載されている。
当業者は、本明細書において提供される教示を装備するとすぐに、本開示のａＡＰＣが、任意の特定の外因性抗原ポリペプチド、サイトカイン、共刺激ポリペプチド、共刺激分子などを特異的に結合する抗体には決して限定されないことを理解するだろう。むしろ、本開示は、すべて単一のプロモーター／制御配列の調節下、または２つ以上のそのような配列の調節下のいずれかにある、多数の分子を含むａＡＰＣを包含する。また、本開示は、さまざまなａＡＰＣが、異なる分子を含む場合、本開示の１つまたは複数のａＡＰＣの投与を包含する。すなわち、さまざまな分子（例えば、共刺激ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、サイトカインなど）は、シス（すなわち、同じａＡＰＣ中、および／または同じａＡＰＣ内の同じ近接した核酸または別々の核酸分子によってコードされる）またはトランス（すなわち、さまざまな分子が異なるａＡＰＣに含まれる）で働き得る。
循環時間
循環時間
一部の実施形態では、本開示の操作された赤血球細胞または除核細胞（例えば、除核赤血球細胞）は、対象への投与後、少なくとも約１日～約２４０日間（例えば、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６１日間、６２日間、６３日間、６４日間、６５日間、６６日間、６７日間、６８日間、６９日間、７０日間、７１日間、７２日間、７３日間、７４日間、７５日間、７６日間、７７日間、７８日間、７９日間、８０日間、８１日間、８２日間、８３日間、８４日間、８５日間、８６日間、８７日間、８８日間、８９日間、９０日間、９１日間、９２日間、９３日間、９４日間、９５日間、９６日間、９７日間、９８日間、９９日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１１日間、１１２日間、１１３日間、１１４日間、１１５日間、１１６日間、１１７日間、１１８日間、１１９日間、１２０日間、１２１日間、１２２日間、１２３日間、１２４日間、１２５日間、１２６日間、１２７日間、１２８日間、１２９日間、１３０日間、１３１日間、１３２日間、１３３日間、１３４日間、１３５日間、１３６日間、１３７日間、１３８日間、１３９日間、１４０日間、１４１日間、１４２日間、１４３日間、１４４日間、１４５日間、１４６日間、１４７日間、１４８日間、１４９日間、１５０日間、１５１日間、１５２日間、１５３日間、１５４日間、１５５日間、１５６日間、１５７日間、１５８日間、１５９日間、１６０日間、１６１日間、１６２日間、１６３日間、１６４日間、１６５日間、１６６日間、１６７日間、１６８日間、１６９日間、１７０日間、１７１日間、１７２日間、１７３日間、１７４日間、１７５日間、１７６日間、１７７日間、１７８日間、１７９日間、１８０日間、１８１日間、１８２日間、１８３日間、１８４日間、１８５日間、１８６日間、１８７日間、１８８日間、１８９日間、１９０日間、１９１日間、１９２日間、１９３日間、１９４日間、１９５日間、１９６日間、１９７日間、１９８日間、１９９日間、２００日間、２０１日間、２０２日間、２０３日間、２０４日間、２０５日間、２０６日間、２０７日間、２０８日間、２０９日間、２１０日間、２１１日間、２１２日間、２１３日間、２１４日間、２１５日間、２１６日間、２１７日間、２１８日間、２１９日間、２２０日間、２２１日間、２２２日間、２２３日間、２２４日間、２２５日間、２２６日間、２２７日間、２２８日間、２２９日間、２３０日間、２３１日間、２３２日間、２３３日間、２３４日間、２３５日間、２３６日間、２３７日間、２３８日間、２３９日間または２４０日間）、循環中に存在する。
修飾
修飾
１種または複数の外因性タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に特徴的な翻訳後修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、外因性タンパク質のうちの１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）は、グリコシル化され、リン酸化され、またはその両方である。糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）法の改変を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットで達成することができる。糖タンパク質の細胞局在化は、当技術分野において公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成することができる。リン酸化は、リン特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによって評価してもよい。
翻訳後修飾は、疎水性基へのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化またはグリピエーション）、補因子へのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮまたはＦＡＤ）、ヘムＣ付着、ホスホパンテテイニル化、またはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ハイプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ－アシル化、Ｎ－アシル化またはＳ－アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化またはエチル化）、アミド化、ブチリル化、ガンマ－カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、例えばＡＤＰ－リボシル化、酸化、リン酸エステル（Ｏ連結）もしくはホスホルアミデート（Ｎ連結）形成（例えば、リン酸化またはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタメート形成、Ｓ－グルタチオニル化、Ｓ－ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、脱離化またはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニンまたはメチオニンの）も含む。実施形態では、グリコシル化は、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、チロシンまたはトリプトファンへのグリコシル基の付加を含み、糖タンパク質が生じる。実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ連結グリコシル化またはＮ連結グリコシル化を含む。
コピー数
コピー数
一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、重量またはコピー数で、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の存在量比を有する。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドのそれぞれの少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、５，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピーまたは１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドのコピー数は、第２の外因性ポリペプチドのコピー数よりも最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％多いか、または最大で２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは１０００倍多い。一部の実施形態では、第２の外因性ポリペプチドのコピー数は、第１の外因性ポリペプチドのコピー数よりも最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％多いか、または最大で２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは１０００倍多い。
一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、第１の外因性ポリペプチドの約５０，０００～約６００，０００コピーの間、例えば、第１のポリペプチドの約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第１の外因性ポリペプチドの約５０，０００～６００，０００コピーの間、約１００，０００～６００，０００コピーの間、約１００，０００～５００，０００コピーの間、約１００，０００～４００，０００コピーの間、約１００，０００～１５０，０００コピーの間、約１５０，０００～３００，０００コピーの間、または１５０，０００～２００，０００コピーの間を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約１２５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約１５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約１７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約２００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約２５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約３００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約４００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第１の外因性ポリペプチドの少なくとも約５００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、第２の外来性ポリペプチドは、第２の外因性ポリペプチドの約５０，０００～約６００，０００コピーの間、例えば、第２のポリペプチドの約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの約５０，０００～６００，０００コピーの間、約１００，０００～６００，０００コピーの間、約１００，０００～５００，０００コピーの間、約１００，０００～４００，０００コピーの間、約１００，０００～１５０，０００コピーの間、約１５０，０００～３００，０００コピーの間、または１５０，０００～２００，０００コピーの間を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約１２５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約１５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約１７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約２００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約２５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約３００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約４００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、第２の外因性ポリペプチドの少なくとも約５００，０００コピーを含む。
遺伝子編集
遺伝子編集
一部の態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、適切な細胞、例えば、有核赤血球細胞、赤血球前駆細胞、または有核血小板前駆細胞が、外因性抗原ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド）を発現し、細胞を、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドをコードする内因性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡとａＡＰＣを接触させるステップを含み、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドをコードする内因性核酸が、遺伝子編集経路によって改変され、内因性ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのレベルの減少をもたらし、それにより免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
一部の実施形態では、適切な細胞、例えば、有核赤血球細胞、赤血球前駆細胞、または有核血小板前駆細胞は、１つまたは複数の選択されたＤＮＡ配列を標的にするヌクレアーゼを使用して、遺伝子改変される。そのような方法を使用して、内因性ゲノム遺伝子座における選択部位での正確な切断を誘導し得る。ＤＮＡが、標的化可能なヌクレアーゼを使用して、例えば、目的の定義された位置で、挿入される、置き換えられる、またはゲノムから除去される遺伝子操作を、「ゲノム編集」と称する場合がある。そのようなヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたメガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、および例えば、ＩＩ型細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃａｓ９）に由来するＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連（Ｃａｓ）ヌクレーゼなどのＲＮＡ指向性ヌクレアーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、変更は、最初に、ＣＲＩＳＰＲを使用して導入される（すなわち、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇの内因性発現を増加させる）。次いで、提示用の抗原も、ＣＲＩＳＰＲによって導入され、内部でプロセシングされる。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断ドメイン、およびヌクレアーゼを特定のＤＮＡ配列に標的化し、それによりヌクレアーゼを配列特異的な様式でのゲノム変更を操作するために使用することを可能にするＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせてもよく、またはそれが標的化される配列もしくはその配列の近くに切れ目を入れてもよい。ＺＦＮは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質のＤＢＤに基づいて、選択または設計されたＤＢＤを含む。ＺＦタンパク質のＤＢＤは、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化されるアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーによって、配列特異的な様式でＤＮＡに結合する。ＴＡＬＥＮは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．ＺＦＮの転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＢＤに基づいて、選択もしくは設計されたＤＢＤを含み、またはＴＡＬＥＮ二量体は、ＤＮＡ損傷応答経路を刺激する標的化ＤＮＡ ＤＳＢを誘導する。設計されたジンクフィンガードメインの結合特異性は、ＺＦＮを特異的ゲノム部位に方向付ける。ＴＡＬＥは、複数の３３～３５アミノ酸の反復ドメインを含有し、そのそれぞれが、単一の塩基対を認識する。ＺＦＮのように、ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化し、カスタム変更を可能にする、標的化ＤＳＢを誘導する。操作された部位特異的ヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼまたはそのバリアントなどの天然に存在するエンドヌクレアーゼ由来の触媒ドメインを含み得る。一部の実施形態では、切断特異性および／または切断活性を改善させるために設計された突然変異を有するＦｏｋｌ切断ドメインバリアントを使用してもよい（例えば、Ｇｕｏ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４００ （１）： ９６ － １０７；Ｄｏｙｏｎ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８： ７４－７９を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（１２～約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられる、配列特異的エンドヌクレアーゼである。この部位は、一般に、所与のゲノム中に１回しか出現しない。メガヌクレアーゼの特異性は、ヌクレアーゼの配列の変化を（例えば、ＤＮＡ結合ドメインに）導入すること、および次いで、天然認識部位のバリアントを切断することができる機能的酵素を選択することによって、または異なるヌクレアーゼ由来のタンパク質ドメインと会合もしくは融合することによって、変化させることができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡ指向性ヌクレアーゼを使用して、ゲノム編集を行ってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく系の使用が企図される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓもしくはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓのＣａｓ９、またはそれらのバリアント）などのＣａｓヌクレアーゼは、目的の配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡと称される場合がある）と一緒に、細胞に導入される。相補性領域は、例えば、約２０ヌクレオチド長であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡによって、目的の特定のＤＮＡ配列に導かれる。ガイドＲＮＡは、ゲノム中の目的の標的配列、例えば、目的の任意の遺伝子または遺伝子間領域中の配列に対する相補性を有するように、操作されてもよい。Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性は、遺伝子を無効にし得るＤＮＡを切断するか、またはそれを切り離すことができ、異なるＤＮＡ配列が挿入されるのを可能にする。一部の実施形態では、異なる遺伝子、例えば、２、３、４、５またはそれよりも多くの遺伝子に相補的な配列を含む複数のｓｇＲＮＡは、同じ細胞に連続的して、またはそれと一緒に導入される。一部の実施形態では、複数の遺伝子の変更は、それにより同じステップで発生し得る。
一般に、遺伝子操作、例えば、ゲノム編集のためのヌクレアーゼに基づく系の使用は、ヌクレアーゼを細胞に導入すること、およびヌクレアーゼが細胞のＤＮＡを切断するために適した条件下、および適した時間の間、細胞を維持することを伴う。
ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ系について、ガイドＲＮＡも導入される。ヌクレアーゼは、典型的には、ヌクレアーゼをコードする核酸を導入することによって、細胞に導入される。核酸は、細胞における発現を方向付けることができるプロモーターに作動可能に連結されていてもよく、プラスミドまたは他のベクターで細胞に導入されてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが導入されてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼそれ自体が導入されてもよい。ｓｇＲＮＡは、直接的に（トランスフェクションなどの方法により）導入されてもよく、または発現ベクターなどの核酸構築物からそれを発現させることによって、導入されてもよい。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、細胞に導入された単一の発現ベクターから発現されるか、または一部の実施形態では、異なる発現ベクターから発現される。一部の実施形態では、異なる遺伝子、例えば、２、３、４、５またはそれよりも多くの遺伝子に相補的な配列を含む複数のｓｇＲＮＡは、同じ細胞に、個々にもしくは一緒に、ＲＮＡとして導入されるか、またはｓｇＲＮＡをコードする１つもしくは複数の核酸構築物を細胞内転写のために細胞に導入することによって、導入される。
ヌクレアーゼによる切断の際に、標的遺伝子座（例えば、細胞のゲノム中）は、ＤＮＡ損傷修復のための２つの主要経路、すなわち、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）の一方を受けてもよい。ＨＤＲを刺激するために切断部位に隣接する配列（下記議論を参照されたい）との十分な相同性を含む適切な修復鋳型の非存在下では、ＤＳＢは、ＮＨＥＪによって再ライゲーションされ、挿入または欠失が生じ得る。ＮＨＥＪは、例えば、遺伝子ノックアウトを操作するため、または変更された活性を有するタンパク質を発生させるために、使用することができる。例えば、エクソン中の挿入または欠失は、フレームシフト突然変異または未成熟終止コドンをもたらし得る。ゲノムにより大きい欠失を生じさせるために、２つまたはそれよりも多くのＤＳＢを発生させることができる。
一部の実施形態では、切断の位置でゲノムに挿入される目的の配列を含む核酸（例えば、プラスミドまたは線状ＤＮＡ）は、ヌクレアーゼに加えて、細胞に導入される。一部の実施形態では、目的の配列は、遺伝子に挿入される。目的の配列は、遺伝子を少なくとも部分的に置き換え得る。一部の実施形態では、核酸は、相同組換え修復を刺激するように、切断部位に隣接する配列と相同である配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、切断の部位またはその近くで細胞のゲノム中に存在する配列と比較して、所望の変更を含有する。ゲノムに少なくとも部分的に導入される配列を含む核酸、例えば、相同配列および所望の変更を含む核酸配列は、「ドナー配列」と称され得る。ドナー配列は、破壊の部位でゲノムを少なくとも部分的に物理的に組み込むことができ、または破壊の修復のために鋳型として使用することができ、ドナー中に存在するヌクレオチド配列のすべてもしくは一部の細胞のゲノムへの導入をもたらす。このようにして、細胞のゲノムの配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナー核酸中に存在する配列に変換することができる。一部の実施形態では、ドナー配列は、環状ＤＮＡ（例えば、プラスミド）、線状二本鎖ＤＮＡ（例えば、直線化プラスミドまたはＰＣＲ産物）、または一本鎖ＤＮＡ、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドに含有されていてもよい。一部の実施形態では、ドナー配列は、ゲノム中の標的部位のいずれかの側またはそれぞれの側と、約１０～２５ｂｐおよび約５０～１００ｂｐの間の相同性を有する。一部の実施形態では、より長い相同配列、例えば、約１００～５００ｂｐから約１～２ｋＢまでの間、またはそれを超える配列を使用してもよい。一部の実施形態では、変更は、遺伝子の一方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、第１の変更は、遺伝子の一方の対立遺伝子に導入され、異なる変更が、他方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、同じ変更が、両方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、２つの対立遺伝子または標的部位（またはそれより多く）は、単一のステップで遺伝子改変されてもよい。一部の実施形態では、２つの対立遺伝子または標的部位（またはそれより多く）は、別々のステップで遺伝子改変されてもよい。
ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮを設計し、それらを生じさせ、ならびに使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１１０９７０３６；Ｕｒｎｏｖ， ＦＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０１０）， １１： ６３６－６４６；Ｍｉｌｌｅｒ ＪＣ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１１） ２９（２）： １４３－８；Ｃｅｒｍａｋ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１１） ３９ （１２）： ｅ８２， Ｓａｎｊａｎａ， Ｎ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ７， １７１－１９２ （２０１２）、および前述のいずれかにおける参照文献に記載されている。ゲノム操作のためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく方法は、Ｇａｊ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｊｕｌ； ３１（７）：３９７－４０５． Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｙ ９において概説されている。ゲノム操作におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用は、例えば、Ｃｏｎｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３； ３３９（６１２１）：８１９－２３；Ｍａｌｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３； ３３９（６１２１）：８２３－６；Ｗａｎｇ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｃｅｌｌ １５３， ９１０－９１８ （２０１３）；Ｒａｎ， Ｆ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｃｅｌｌ １５４， １３８０－１３８９ （２０１３）；Ｍａｌｉ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１３； １０（１０）：９５７－６３； Ｒａｎ， ＦＡ， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１３；８（１１）：２２８１－３０８）に記載されている。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡの１本の鎖のみを切断するヌクレアーゼ（ニッカーゼ）を使用して、ＮＨＥＪ修復経路を活性化することなく、ＨＤＲを刺激し得る。ニッカーゼは、二本鎖切断に必要なＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ二量体中の１つのヌクレアーゼモノマーの触媒活性を不活性化することによって、またはＣａｓタンパク質の触媒ドメインの不活性化することによって、作出され得る。例えば、触媒残基の１つ（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインのＤ１０、およびＨＮＨヌクレアーゼドメインのＨ８４０）の、例えば、アラニンへの突然変異（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）は、Ｃａｓ９をＤＮＡニッカーゼに変換する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓに基づく系を使用して、遺伝子発現をモジュレートし得る。例えば、ガイドＲＮＡとエンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒不活性Ｃａｓ９との共発現は、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転写因子結合を特異的に干渉することができるＤＮＡ認識複合体を生じさせる。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と称される場合があるこの系は、哺乳動物細胞における標的遺伝子の発現を効率的に抑制することができる（Ｑｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０１３；１５２（５）： １１７３－８３；Ｌａｒｓｏｎ， ＭＨ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１３；８（ｌ ｌ）：２１８０－９６）。種々のエフェクタードメインのいずれかを触媒不活性Ｃａｓ９に付着させることによって、遺伝子発現および／またはＤＮＡ改変に対する配列特異的調節を達成するために使用することができるキメラＣａｓ９タンパク質を作出することができる。適切なエフェクタードメインとしては、例えば、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを含むもの、例えば、ＶＰ６４）、転写共活性化ドメイン、転写阻害または共阻害ドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、酵素ドメインなどが挙げられる。ガイドＲＮＡは、ゲノム中（例えば、プロモーターなどの発現調節エレメント中またはその近く）の目的の部位にキメラＣａｓ９タンパク質を導き、それによって、エフェクタードメインは、転写活性の活性化または阻害などの効果を発揮する（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＬＡ， ｅｔ ａｌ．． Ｃｅｌｌ． ２０１３；１５４（２）：４４２－５１； Ｍａｅｄｅｒ ＭＬ， ｅｔ ａ．．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１３； １０（１０）：９７７－９を参照されたい）。適したエフェクタードメインは、目的の機能（例えば、転写の阻害または活性化）を行うことができる天然に存在するタンパク質中に存在するもののいずれかであり得る。
遺伝子操作プロセスに付された細胞を選択または分析して、所望の組換え遺伝子産物を発現するもの、または遺伝子操作によって無効にされた内在性遺伝子の発現を欠くもの、または任意の所望の遺伝的変更を有するものを、同定または単離し得る。例えば、一部の実施形態では、ドナー配列、またはドナー配列を送達するために使用されるベクターは、選択マーカーを含むことができ、これを使用して、選択マーカーを含むドナー配列の少なくとも一部がそれらのゲノムに組み込まれた細胞を選択することができる。一部の実施形態では、選択は使用されない。一部の実施形態では、細胞は、例えば、サザンブロットによってスクリーニングして、所望の遺伝的変更を有する細胞またはクローンを特定し得る。所望により、細胞は、組換え遺伝子産物または内因性遺伝子産物の発現レベルまたは活性について、あるいは組換えもしくは内在性遺伝子産物に関連するか、またはそれらによって付与された１つもしくは複数の機能的特性、あるいは目的の任意の他の基準について、試験され得る。適切な分析方法は、当業者に公知であり、例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＦＡＧＳ、免疫蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡアッセイ、タンパク質を発現する細胞を標識または保持する目的のタンパク質に結合することができる薬剤と細胞を接触させる親和性に基づく方法などを含む。機能的アッセイは、組換え遺伝子産物、内在性遺伝子産物および／または目的の機能もしくは特性の正体に基づいて、選択し得る。例えば、機能的特性は、目的の抗原に結合する能力、または目的の抗原を発現する標的細胞に対して細胞傷害性を発揮する能力であり得る。細胞は、例えば、ＰＧＲ、サザンブロットまたはシークエンシングによって分析して、挿入されたＤＮＡ配列の数、それらの位置を決定するか、および／または所望のゲノム変更が生じたか否かを決定し得る。所望の変更、発現レベルおよび／もしくは機能的特性を有する１つまたは複数の細胞は、同定、増殖、増大され得る。細胞またはそれらの末裔は、細胞系を発生させるために使用されてもよく、ソルタグ化に付されてもよい、および／または将来の使用のために保管されてもよい。
操作された赤血球細胞の集団
操作された赤血球細胞の集団
一態様では、本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球細胞または除核細胞の集団、例えば、複数の操作された除核赤血球細胞、または操作された除核赤血球細胞の集団を特徴とする。「複数」および「集団」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、主に、除核細胞（例えば、７０％より多く）、主に、有核細胞（例えば、７０％より多く）、または除核細胞および有核細胞の任意の混合物を含み得る。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、網状赤血球、赤血球、または網状赤血球および赤血球の混合物を含み得る。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、主に、網状赤血球を含み得る。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、主に、赤血球（例えば、未成熟または成熟赤血球）を含み得る。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、除核細胞から本質的になる。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、主にまたは実質的に除核細胞を含む。例えば、一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、少なくとも約７０％またはそれより多くの除核細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される集団は、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の除核細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される集団は、約７０％より多くの除核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％より多くの除核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約８０％～約１００％の間の除核細胞、例えば、約８０％～約９５％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約１００％、約８５％～約９５％、約８５％～約９０％、約９０％～約１００％、約９０％～約９５％または約９５％～約１００％の間の除核細胞を含む。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約３０％未満の有核細胞を含む。例えば、実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約１％、約２％、約３％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％未満、または約３０％未満の有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％または約１９％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％または約３０％未満の有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、０％～２０３０％の間の有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、約０％～２０％の間の有核細胞、例えば、約０％～１９％の間、約０％～１５％の間、約０％～１０％の間、約０％～５％の間、約０％～４％の間、約０％～３％の間、約０％～２％の間の有核細胞、または約５％～２０％、約１０％～２０％の間もしくは約１５％～２０％の間の有核細胞を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球細胞の集団であって、３０％未満の有核細胞および少なくとも７０％の除核細胞を含む、または２０％未満の有核細胞および少なくとも８０％の除核細胞を含む、または１５％未満の有核細胞および少なくとも８５％の有核細胞を含む、または１０％未満の有核細胞および少なくとも９０％の除核細胞を含む、または５％未満の有核細胞および少なくとも９５％の除核細胞を含む操作された赤血球細胞の集団を特徴とする。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球細胞の集団であって、約０％の有核細胞および約１００％の除核細胞、約１％の有核細胞および約９９％の除核細胞、約２％の有核細胞および約９８％の除核細胞、約３％の有核細胞および約９７％の除核細胞、約４％の有核細胞および約９６％の除核細胞、約５％の有核細胞および約９５％の除核細胞、約６％の有核細胞および約９４％の除核細胞、約７％の有核細胞および約９３％の除核細胞、約８％の有核細胞および約９２％の除核細胞、約９％の有核細胞および約９１％の除核細胞、約１０％の有核細胞および約９０％の除核細胞、約１１％の有核細胞および約８９％の除核細胞、約１２％の有核細胞および約８８％の除核細胞、約１３％の有核細胞および約８７％の除核細胞、約１４％の有核細胞および約８６％の除核細胞、約８５％の有核細胞および約８５％の除核細胞、約１６％の有核細胞および約８４％の除核細胞、約１７％の有核細胞および約８３％の除核細胞、約１８％の有核細胞および約８２％の除核細胞、約１９％の有核細胞および約８１％の除核細胞、または約２０％の有核細胞および約８０％の除核細胞を含む操作された赤血球細胞の集団を特徴とする。
別の実施形態では、操作された赤血球細胞集団は、主にまたは実質的に有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞集団は、有核細胞から本質的になる。さまざまな実施形態では、操作された赤血球細胞集団中の有核細胞は、赤血球前駆細胞である。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）、複能性骨髄プロジェニター細胞、ＣＦＵ－Ｓ細胞、ＢＦＵ－Ｅ細胞、ＣＦＵ－Ｅ細胞、前正赤芽球、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、操作された赤血球細胞の集団は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の有核細胞を含む。
本明細書に記載の操作された赤血球細胞または除核細胞の調製の間に、細胞の一部分が、（例えば、外因性核酸の発現の欠如、その形質導入またはそれとのコンジュゲーションに起因して）外因性ポリペプチドを含まなくてもよいことが理解される。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、操作された赤血球細胞および未改変赤血球細胞の混合物、または改変除核細胞および未改変除核細胞の混合物を含み、すなわち、集団中の細胞の一部分は、外因性ポリペプチドを含まない（例えば、発現しない）。例えば、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、さまざまな実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の、外因性ポリペプチドを含む赤血球細胞または除核細胞を含むことができ、集団中の残りの赤血球細胞または除核細胞は、外因性ポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞の単一単位用量は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の、外因性ポリペプチドを含む赤血球細胞または除核細胞を含み、用量中の残りの赤血球細胞または除核細胞は、外因性ポリペプチドを含まない。
ＩＩＩ．人工抗原提示細胞を作製する方法
ＩＩＩ．人工抗原提示細胞を作製する方法
ａＡＰＣを作製するさまざまな方法が本開示により企図される。一態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外因性抗原ポリペプチドを提示する操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）を含む、方法が、有核細胞を、内因性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させて、内因性抗原提示ポリペプチド、内因性膜アンカーポリペプチドまたは内因性共刺激もしくは共阻害ポリペプチドの発現をもたらすステップ、外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核細胞に導入するステップ、ならびに内因性抗原提示ポリペプチドによる外因性抗原ポリペプチドの発現および提示、ならびに除核に適切な条件下で有核細胞を培養し、それにより除核細胞を作製するステップを含み、それにより免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。ａＡＰＣを作製する方法を本明細書に記載するが、しかしながら、これらの方法が非限定的であることが理解されるべきである。
操作された赤血球細胞および除核細胞を作製するプロセスを、より詳細に下記に記載する。
除核赤血球細胞を製造する方法
除核赤血球細胞を製造する方法
外来性薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む除核赤血球細胞を製造する方法は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０７３５８７および同ＷＯ２０１５／１５３１０２に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
一部の実施形態では、造血プロジェニター細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞（例えば、ヒト（例えば、成体ヒト）またはマウス細胞）を、１種または複数の外因性ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸と接触させ、細胞を培養下で増大および分化させる。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、不死化されており、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；例えば、ＨＰＶ１６型）Ｅ６および／またはＥ７遺伝子を含む。一部の実施形態では、不死化ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞は、ＢＥＬ－Ａ細胞系細胞である（Ｔｒａｋａｒｎａｓａｎｇａ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８： １４７５０を参照されたい）。さらなる不死化ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞は、米国特許第９，９５１，３５０号および同第８，９７５，０７２号に記載されている。一部の実施形態では、不死化ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞を、１つまたは複数の外来性ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸と接触させ、細胞を培養下で増大および分化させる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球細胞は、有核赤血球細胞（例えば、赤血球前駆細胞）を外因性核酸と接触させるステップを含む方法によって、作製される。一部の実施形態では、外因性核酸は、コドン最適化されている。例えば、外因性核酸は、そのコドンによってコードされるアミノ酸を変化させないが、例えば、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、赤血球細胞によるコドン優先選択を使用することによって核酸の翻訳を増加させるかたちで野生型コドンと異なる１つまたは複数のコドンを含んでいてもよい。
外因性核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。例えば、レトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどスプーマウイルスを含むいくつかのウイルスを、遺伝子移入ビヒクルとして使用してもよい。
一部の実施形態では、外因性核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、標的化部分の発現を駆動するために使用される。
一部の実施形態では、外因性核酸は、例えば、アミノ酸分解酵素の発現を駆動する、誘導性または抑制性プロモーターに作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、ドキシサイクリン誘導性、例えば、Ｐ－ＴＲＥ３ＧＳプロモーター、またはその活性断片もしくはバリアントであり得る。誘導性プロモーターの例としては、限定されるものではないが、メタロチオネイン誘導性プロモーター、グルココルチコイド誘導性プロモーター、プロゲステロン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン誘導性プロモーター（ドキシサイクリン誘導性でもあり得る）が挙げられる。一部の実施形態では、インデューサーが、例えば、細胞分化の特異的段階で、誘導性プロモーターを含む細胞を含む培養培地に添加される。一部の実施形態では、インデューサー（例えば、ドキシサイクリン）は、約１～５、２～４または３μｇ／ｍＬの量で添加される。一部の実施形態では、リプレッサーが、例えば、細胞分化の特異的段階で、抑制性プロモーターを含む細胞を含む培養培地から取り除かれる。一部の実施形態では、成熟段階の間、例えば、１～１０、２～９、３～８、４～６日目の間、または約５日目の成熟段階で、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。一部の実施形態では、成熟および除核の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日目の間、インデューサーが存在するか、またはリプレッサーが非存在である。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、インデューサーが存在するか、またはリプレッサーが非存在である。一部の実施形態では、５日目の成熟から分化の終了まで、インデューサーが存在するか、またはリプレッサーが非存在である。実施形態では、９日目の成熟で、インデューサーが存在するか、またはリプレッサーが非存在である。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団が複数の正赤芽球（例えば、好塩基球、多染性もしくは正染性正赤芽球、またはそれらの組合せ）を含む場合、例えば、集団中の細胞の１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％または７０～８０％が正赤芽球である場合、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団が、複数の前赤芽球を含む場合、例えば、集団中の細胞の１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％または７０～８０％が前赤芽球である場合、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団が、分化の終わりに複数の赤芽球を含む場合、例えば、集団中の細胞の１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％または７０～８０％が、分化の終わりに赤芽球である場合、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。一部の実施形態では、赤血球細胞または赤血球細胞の集団は、追加の外因性タンパク質、例えば、トランス活性化因子、例えば、Ｔｅｔ誘導性トランス活性化因子（例えば、Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇトランス活性化因子）を含む。
一部の実施形態では、赤血球細胞の集団が、１つまたは複数の（例えば、すべての）内因性ＧＰＡ、ｂａｎｄ３またはアルファ４インテグリンを含む場合、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。一部の実施形態では、集団中の細胞の約８４～１００％、８５～１００％、９０～１００％もしくは９５～１００％がＧＰＡ陽性である（例えば、集団が最初にそのレベルに達する）時間の間、集団中の細胞の５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％、９５～１００％もしくは９８～１００％がｂａｎｄ３陽性である（例えば、集団が最初にそのレベルに達する）時間の間、および／または集団中の細胞の約７０～１００％、８０～９０％もしくは約８５％がアルファ４インテグリン陽性である（例えば、集団が最初にそのレベルに達する）の時間の間、インデューサーが添加されるか、またはリプレッサーが取り除かれる。
ＧＰＡ、ｂａｎｄ３およびアルファ４インテグリンは、例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号２０１８／００９８３８の実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって、検出することができる。
一部の実施形態では、細胞は、コンジュゲーション、例えば、ソルタグ化またはソルターゼ媒介コンジュゲーション、例えば、そのそれぞれが、その全体が参照によって組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１８３０７１および同ＷＯ２０１４／１８３０６６に記載のコンジュゲーションを使用して、生成させることができる。一部の実施形態では、細胞は、ソルターゼ媒介コンジュゲーションを含まない方法によって作製される。
一部の実施形態では、細胞は、低張負荷を含まない方法によって作製される。一部の実施形態では、細胞は、低張透析ステップを含まない方法によって作製される。一部の実施形態では、細胞は、調節された細胞変形を含まない方法によって作製される。
一部の実施形態では、赤血球細胞は、少なくとも１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００または１００，０００倍（および必要に応じて、１００，０００、２００，０００または５００，０００倍まで）、増大される。細胞の数は、一部の実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
一部の実施形態では、赤血球細胞の集団は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％または９８％（および必要に応じて、約８０、９０または１００％まで）の除核赤血球細胞を含む。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団は、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％または９０％～１００％の除核細胞を含む。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団は、１％未満の生有核細胞を含有し、例えば、検出可能な生有核細胞を含有しない。除核は、一部の実施形態では、核染色を使用してＦＡＣＳによって測定される。一部の実施形態では、集団中の赤血球細胞の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％または９８％（および必要に応じて、約７０、８０、９０または１００％まで）は、１種または複数（例えば、２、３、４種またはそれよりも多く）の外因性ポリペプチドを含む。ポリペプチドのレベルは、一部の実施形態では、ポリペプチドに対する標識抗体を使用して、赤血球細胞によって測定される。一部の実施形態では、集団中の赤血球細胞の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％または９８％（および必要に応じて、約７０、８０、９０または１００％まで）は、除核されており、１種または複数（例えば、２、３、４種またはそれよりも多く）の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、赤血球細胞の集団は、約１×１０９～２×１０９、２×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～５×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～２×１０１２、２×１０１２～５×１０１２または５×１０１２～１×１０１３個の細胞を含む。
操作された赤血球細胞の物理的特徴
操作された赤血球細胞の物理的特徴
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２、３、４つまたはそれよりも多く）の物理的特徴、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量を有する。理論によって拘束されることは望まないが、一部の実施形態では、本明細書に記載の外因性ポリペプチドを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、野生型の未処理の赤血球細胞または除核細胞と似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧負荷赤血球細胞は、浸透圧脆弱性の増加、細胞サイズの変更、ヘモグロビン濃度の低減または細胞膜の外葉におけるホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す場合があり得る。
浸透圧脆弱性
浸透圧脆弱性
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞は、外因性ポリペプチドを含まない単離された無培養の赤血球細胞と実質的に同じ浸透膜脆弱性を示す。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞または除核細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％または０．５％のＮａＣｌで５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５９の方法を使用して、アッセイすることができる。
細胞サイズ
細胞サイズ
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、野生型の未処理の除核赤血球細胞とおよそ同じ直径または体積を有する。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の集団は、約４、５、６、７または８ミクロンの平均直径を有し、必要に応じて、集団の標準偏差は、１、２または３ミクロン未満である。一部の実施形態では、１つもしくは複数の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、約４～８、５～７、または約６ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、赤血球細胞の直径は、約１ミクロン未満、約２０ミクロンよりも大きく、約１ミクロン～約２０ミクロンの間、約２ミクロン～約２０ミクロンの間、約３ミクロン～約２０ミクロンの間、約４ミクロン～約２０ミクロンの間、約５ミクロン～約２０ミクロンの間、約６ミクロン～約２０ミクロンの間、約５ミクロン～約１５ミクロンの間、または約１０ミクロン～約３０ミクロンの間である。細胞の直径は、一部の実施形態では、Ａｄｖｉａ １２０血液学システムを使用して測定される。
一部の実施形態では、赤血球細胞の平均血球体積である体積は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬより大きく、または１５０ｆＬより大きい。一部の実施形態では、赤血球細胞の平均血球体積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満、または２００ｆＬ未満である。一部の実施形態では、赤血球細胞の平均血球体積は、８０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００または４００～５００フェムトリットル（ｆＬ）の間である。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の集団は、この段落で説明された平均血球体積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５または２ｆＬ未満である。平均血球体積は、一部の実施形態では、血液学的分析装置、例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒを使用して測定される。
ヘモグロビン濃度
ヘモグロビン濃度
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、野生型の未処理の除核赤血球細胞または除核細胞と同様のヘモグロビン含有量を有する。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８または３０ｐｇ、および必要に応じて最大で約３０ｐｇの総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、一部の実施形態では、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例３３のＤｒａｂｋｉｎ試薬法を使用して決定される。
ホスファチジルセリン含有量
ホスファチジルセリン含有量
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）は、野生型の未処理赤血球細胞または除核細胞と、その細胞膜の外葉におけるおよそ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理の赤血球細胞の細胞膜の小葉の内部に存在し、低浸透圧負荷は、免疫応答の引き金になり得るホスファチジルセリンの外葉への分布を引き起こすことができる。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の集団は、アネキシンＶ染色について陽性の約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、または１％未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、一部の実施形態では、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５４の方法を使用して、ＰＳに優先的に結合するアネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣで染色すること、およびＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリーにより測定することによって、評価される。
他の特徴
他の特徴
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）もしくは除核細胞、または操作された赤血球細胞もしくは除核細胞の集団は、内因性ＧＰＡ（Ｃ２３５ａ）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、またはインテグリンアルファ４（Ｃ４９ｄ）のうちの１つまたは複数（例えば、すべて）を含む。これらのタンパク質は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１８／００９８３８の実施例１０に記載の通り、測定することができる。ＧＰＡ陽性細胞およびＢａｎｄ３陽性細胞のパーセンテージは、典型的には、赤血球細胞の成熟の間に増加し、インテグリンアルファ４陽性のパーセンテージは、典型的には、成熟全体を通して高いままである。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＧＰＡ＋（すなわち、ＣＤ２３５ａ＋）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約５０％～約１００％の間（例えば、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＧＰＡ＋細胞を含む。ＧＰＡの存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ７１＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ７１＋細胞を含む。ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３３＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ２３３＋細胞を含む。ＣＤ２３３（Ｂａｎｄ３）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ４７＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ４７＋細胞を含む。ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ３６－（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ３６－（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。Ｃ３６の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ３４－（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ３４－（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。Ｃ３４の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋細胞を含む。
一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋／Ｃ３４－／Ｃ３６－細胞を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約７０％～約１００％の間（例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９８％）のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋／Ｃ３４－／Ｃ３６－細胞を含む。
一部の実施形態では、赤血球細胞を含む操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の棘状赤血球を含む。一部の実施形態では、操作された除核赤血球細胞または除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満のピレノサイトを含む。
万能ドナー赤血球細胞
万能ドナー赤血球細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球細胞または除核細胞は、細胞が投与される対象と自家および／または同種異系である。例えば、対象と同種異系の赤血球細胞は、１つもしくは複数の血液タイプ特異的赤血球細胞（例えば、細胞が対象と同じ血液タイプの細胞であり得る）、または１つもしくは複数の万能ドナー赤血球細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球細胞は、参照細胞と比較して、免疫原性が低減されており、例えば、１つまたは複数の血液型抗原のレベルが低下している。
同種異系細胞が、輸血のために使用される場合、適合性のＡＢＯ血液型を選択して、急性血管内溶血性輸血反応を防止することができる。ＡＢＯ血液タイプは、血液タイプ抗原ＡおよびＢの存在または非存在、赤血球の表面上の糖タンパク質および糖脂質に関連するオリゴ糖鎖の末端に見られる単糖の糖構造に基づいて定義される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５：４５４－４６４ （２００７）において概説される）。Ｏ型赤血球は、Ａ抗原もＢ抗原も含有しないので、それらは、任意のＡＢＯ血液型のレシピエント、例えば、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型またはＯ型レシピエントに対して安全に輸血することができる。Ｏ型赤血球は、万能と考えられ、すべての輸血において使用され得る。そのため、一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球細胞は、Ｏ型である。対照的に、Ａ型赤血球細胞は、Ａ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、Ｂ型赤血球細胞は、Ｂ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、ＡＢ型赤血球細胞は、ＡＢ型レシピエントに与えられてもよい。
一部の例では、非Ｏ型赤血球細胞を万能血液タイプに変換することが有益であり得る。Ａ型およびＢ型赤血球の表面上の免疫優性単糖の酵素的除去を使用して、Ｏ型様赤血球細胞の集団を発生させ得る（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５：４５４－４６４ （２００７）を参照されたい）。Ｂ型赤血球細胞は、生コーヒー豆由来のα－ガラクトシダーゼを使用して変換され得る。あるいは、または加えて、赤血球細胞上に存在する場合、Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ菌由来のα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼおよびα－ガラクトシダーゼ酵素活性を使用して、免疫優性Ａ抗原およびＢ抗原をそれぞれ除去し得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５：４５４－４６４ （２００７））。一例では、本明細書に記載の単離された濃厚赤血球細胞を、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼおよびα－ガラクトシダーゼのいずれか（約３００μｇ／ｍｌの濃厚赤血球細胞）の存在下、２００ｍＭのグリシン（ｐＨ６．８）および３ｍＭのＮａＣｌ中、２６℃で６０分間インキュベートする。処理後、赤血球細胞を、生理食塩水中で遠心分離により３～４回すすぐことによって洗浄し、標準的な血液バンキング技法に従って、ＡＢＯ型を決定する。
ＡＢＯ血液型システムは、輸血および移植において最も重要であるが、一部の実施形態では、投与される赤血球細胞およびレシピエントの間で他の血液型を一致させること、あるいは１つもしくは複数の他の（例えばマイナー）血液型に対して万能な赤血球細胞を選択または作製することが有用であり得る。第２の血液型は、Ｒｈシステムであり、個体は、Ｒｈ＋またはＲｈ－であり得る。そのため、一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球細胞は、Ｒｈ－である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、Ｏ型およびＲｈ－である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球細胞は、１つまたは複数のマイナー血液型抗原、例えば、Ｌｅ（ａ－ｂ－）（ルイス抗原システム）、Ｆｙ（ａ－ｂ－）（Ｄｕｆｆｙシステム）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）（Ｋｉｄｄシステム）、Ｍ－Ｎ－（ＭＮＳシステム）、Ｋ－ｋ－（Ｋｅｌｌシステム）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）（Ｌｕｔｈｅｒａｎシステム）およびＨ抗原陰性（Ｂｏｍｂａｙ表現型）またはそれらの任意の組合せについて陰性である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、Ｏ型および／またはＲｈ－でもある。マイナー血液型は、そのそれぞれが、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ ”Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ ｆｒｏｍ ａ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｃａｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ ｎｏｒｔｈ Ｉｎｄｉａ” Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｒ； ４８（１）： ５１－５４およびＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ ”Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ ｓｙｓｔｅｍｓ” Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ． ２０１４ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ； ５８（５）： ５２４－５２８に記載されている。
赤血球の単離
赤血球の単離
成熟赤血球は、例えば、細胞洗浄器、連続流細胞分離器、密度勾配分離、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫磁気枯渇（ＭＡＣＳ）、またはこれらの方法の組合せなどのさまざまな方法を使用して単離され得る（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３３：１０８１－１０８２ （１９８７）；Ｂａｒ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１７７１９－１７７２３ （１９８７）；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２３２：１４７０－１４７６ （２００７）を参照されたい）。
赤血球は、全血から、単純な遠心分離によって単離してもよい（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３３：１０８１－１０８２ （１９８７）を参照されたい）。例えば、ＥＤＴＡ抗凝固処理された全血を、４℃で、８００×ｇで１０分間遠心分離してもよい。多血小板血漿および軟膜を除去し、赤血球を等張食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）で３回洗浄する。
あるいは、赤血球は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌまたはそれらの組合せなどのさまざまな分離媒体を用いる密度勾配遠心分離を使用して、単離してもよい。例えば、ある体積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を、等体積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１１１９の上面に層状にする。等体積の等張食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）中で１：１に希釈されたＥＤＴＡ抗凝固処理された全血を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの上面に層状にし、試料を室温で、７００×ｇで３０分間遠心分離する。これらの条件下、顆粒細胞は、１０７７／１１１９境界面に移動し、リンパ球、他の単核細胞および血小板は、血漿／１０７７境界面に残り、赤血球は、ペレット化する。赤血球を、等張食塩水溶液で２回洗浄する。
あるいは、赤血球は、Ｐｅｒｃｏｌｌ段階勾配を使用する遠心分離によって、単離してもよい（例えば、Ｂａｒ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１７７１９－１７７２３ （１９８７）を参照されたい）。例えば、新鮮な血液を、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび３８ｍＭのクエン酸を含有する抗凝固溶液と混合し、細胞を、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水で簡単に洗浄する。白血球および血小板を、α－セルロースおよびＳｉｇｍａｃｅｌｌの混合物（１：１）を用いる吸着によって除去する。赤血球を、４５／７５％のＰｅｒｃｏｌｌ段階勾配でＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターにおける２５００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって、網状赤血球および残りの白血球からさらに単離する。赤血球は、ペレット中に回収されるが、網状赤血球バンドは、４５／７５％の境界面にあり、残りの白血球バンドは、０／４５％の境界面にある。Ｐｅｒｃｏｌｌを、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水で数回洗浄することによって、赤血球から除去する。赤血球の単離のための密度勾配を生じさせるために使用され得る他の材料としては、水中のイオジキサノールの６０％溶液であるＯＰＴＩＰＲＥＰ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ製、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）が挙げられる。
赤血球は、例えば、フローサイトメトリーを使用して、網状赤血球から分離されてもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２３２： １４７０－１４７６（２００７）を参照されたい）。この例では、全血を、遠心分離して（５５０×ｇ、２０分間、２５℃）、細胞を血漿から分離する。細胞ペレットを、リン酸緩衝食塩水溶液に再懸濁させ、例えば、遠心分離（４００×ｇ、３０分間、２５℃）によって、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（１．０７７密度）でさらに分画して、赤血球を白血球から分離する。得られた細胞ペレットを、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁させ、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）などのＦＡＣＳ装置で、サイズおよび粒度に基づいて、選別する。
赤血球は、免疫磁気枯渇によって単離されてもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ， ｅｌ ａｌ．， （２００７） Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２３２：１４７０－１４７６を参照されたい）。この例では、細胞型特異的抗体を有する磁気ビーズを使用して、非赤血球を排除する。例えば、赤血球を、本明細書に記載の密度勾配、続いて任意の残った網状赤血球の免疫磁気枯渇を使用して、大多数の他の血液構成成分から単離する。細胞を、ヒト抗体血清で、２５℃で２０分前処理し、次いで、例えば、ＣＤ７１およびＣＤ３６などの網状赤血球特異的抗原に対する抗体で処理する。抗体は、磁気ビーズに直接付着させてもよく、または例えば、抗ＰＥ抗体を有する磁気ビーズが反応するＰＥとコンジュゲートされてもよい。抗体－磁気ビーズ複合体により、残った網状赤血球を、例えば、赤血球集団から選択的に抽出することが可能である。
赤血球はまた、アフェレーシスを使用して単離されてもよい。アフェレーシスのプロセスは、対象またはドナーから全血の取り出し、遠心分離または細胞選別を使用する血液構成成分の分離、１つまたは複数の分離された部分の採取、および残りの構成成分を対象またはドナーに戻す輸血を含む。例えば、Ｂａｘｔｅｒ製（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）のＡｍｉｃｕｓ ａｎｄ Ａｌｙｘ装置、Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ製（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）のＴｒｉｍａ Ａｃｃｅｌ装置、およびＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ製（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）のＭＣＳ＋９０００装置などのいくつかの装置が、現在、この目的のために使用されている。追加の精製方法が、適した程度の細胞純度を達成するために必要であり得る。
網状赤血球は、未成熟の赤血球であり、ヒト身体の赤血球のおよそ１％を構成する。網状赤血球は、骨髄において発達および成熟する。循環中に放出されたら、網状赤血球は、迅速に、成熟赤血球への最終分化を受ける。成熟赤血球のように、網状赤血球は、細胞核を有さない。成熟赤血球とは異なって、網状赤血球は、タンパク質合成を行う能力を維持している。一部の実施形態では、操作された赤血球細胞は、除核網状赤血球を含む。
さまざまな熟成の網状赤血球は、網状赤血球が成熟するにつれての細胞密度の相違に基づいて、末梢血から単離され得る。網状赤血球は、さまざまな密度勾配による分画遠心分離を使用して、末梢血から単離され得る。例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して、網状赤血球を単離してもよい（例えば、Ｎｏｂｌｅ ｅｌ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７４：４７５－４８１ （１９８９）を参照されたい）。１．０９６ｇ／ｍｌおよび１．０５８ｇ／ｍｌの密度の滅菌等張Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を１０ｍＭのトリエタノールアミン、１１７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコースおよび１．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の最終濃度に希釈することによって、作製する。これらの溶液は、２９５～３１０ｍＯｓｍの間のオスモル濃度を有する。例えば、５ミリリットルの第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０９６）を、滅菌１５ｍｌ円錐状遠心管に添加する。例えば、２ミリリットルの第２のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０５８）を、より高密度の第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液の上に層状にする。２～４ミリリットルの全血を、管の上部に層状にする。管を、スイングアウトチューブホルダーを備えた冷却遠心分離機において、２５０×ｇで３０分間遠心分離する。網状赤血球および一部の白血球は、２つのＰｅｒｃｏｌｌ層の間の境界面に移動する。境界面の細胞を、新しい管に移し、５ｍＭのグルコース、０．０３ｍＭのアジ化ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。残留白血球を、サイズ排除カラム上でＰＢＳのクロマトグラフィーによって除去する。
あるいは、網状赤血球は、免疫磁気分離アプローチを使用する正の選択によって単離されてもよい（例えば、Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：２３９７－２４０３ （１９９０）を参照されたい）。このアプローチは、成熟前の赤血球と比べて、網状赤血球の表面において発現される多数のトランスフェリン受容体を活用する。トランスフェリン受容体に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して、網状赤血球を混合血液細胞集団から選択的に単離し得る。ヒトを含む種々の哺乳動物種のトランスフェリン受容体に対する抗体は、商業的供給源（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）から入手可能である。トランスフェリン抗体は、磁気ビーズに直接連結されていてもよい。あるいは、トランスフェリン抗体は、二次抗体を介して磁気ビーズに間接的に連結されていてもよい。例えば、ヒトトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体１０Ｄ２（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）でコーティングされた免疫磁気ビーズと混合し得る。次いで、免疫磁気ビーズを、白血球が枯渇した赤血球分画とともにインキュベートする。ビーズおよび赤血球を、２２℃で穏やかに混合しながら６０～９０分間インキュベートし、続いて網状赤血球が付着したビーズを、磁場を使用して単離する。単離された網状赤血球を、例えば、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して、磁気ビーズから除去し得る。あるいは、網状赤血球を、本明細書に記載の方法を使用して、ＣＤ３４＋造血幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長および成熟から単離してもよい。
最終分化した除核赤血球は、それらのＤＮＡ含有量に基づいて、他の細胞から分離することができる。非限定的な例では、細胞を、最初にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）などの生体ＤＮＡ色素で標識する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、二本鎖ＤＮＡに結合すると、青色蛍光を放出する細胞透過性核対比染色である。培養物中の未分化前駆細胞、マクロファージまたは他の有核細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２によって染色されるが、除核赤血球は、Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性である。Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞を、蛍光活性化細胞選別器または他の細胞選別技法を使用することによって、除核赤血球から分離することができる。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素は、透析または他の適切な方法によって、単離された赤血球から除去することができる。
本明細書に記載のポリペプチドのためのビヒクル
本明細書に記載のポリペプチドのためのビヒクル
本明細書における多くの実施形態では、１種または複数（例えば、２種またはそれよりも多く）の外因性ポリペプチドは、赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変除核細胞）の上もしくはその中に位置するが、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの組合せを、別のビヒクル上またはその中に位置させることもできることが理解される。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはエキソソームを含み得る。例えば、一部の態様では、本開示は、例えば、その表面に本明細書に記載の１つまたは複数の薬剤を含むビヒクル（例えば、細胞、赤血球細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはエキソソーム）を提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、本明細書に記載の外因性ポリペプチド、またはその断片もしくはバリアントから選択される薬剤を含む。一部の実施形態では、ビヒクルは、本明細書に記載の２種またはそれよりも多くの薬剤、例えば、本明細書に記載の薬剤の任意の対を含む。
一部の実施形態では、ビヒクルは、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞を含む。
不均一な細胞の集団
不均一な細胞の集団
本明細書における多くの実施形態では、１種または複数（例えば、２種またはそれよりも多く）の外因性ポリペプチドを、単一の細胞上またはその中に位置させるが、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを複数の細胞上に位置させることもできることが理解される。例えば、一部の態様では、本開示は、複数の赤血球細胞または除核細胞であって、複数のうちの第１の細胞が、第１の外因性ポリペプチド（例えば、第１の外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド、またはそれらの組合せを含む）を含み、複数のうちの第２の細胞が、第２の外因性ポリペプチド（例えば、第２の外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド、またはそれらの組合せを含む）を含む複数の細胞を提供する。一部の実施形態では、複数の細胞は、本明細書に記載の２種またはそれよりも多くのポリペプチド、例えば、本明細書に記載のポリペプチドの任意の対を含む。一部の実施形態では、複数のうちの細胞の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％または１％未満が、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドの両方を含む。
膜に包まれた細胞
膜に包まれた細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）もしくは除核細胞（例えば、改変除核細胞）または他のビヒクルは、膜、例えば、半透膜に包まれている。一部の実施形態では、膜は、多糖、例えば、アニオン性多糖のアルギン酸を含む。一部の実施形態では、半透膜は、細胞の通過は許容しないが、低分子または巨大分子、例えば、代謝産物、タンパク質またはＤＮＡの通過は許容する。一部の実施形態では、膜は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬｉｅｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ： ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５， ９５－１０７ （２０１４）に記載されているものである。
赤血球前駆細胞
赤血球前駆細胞
本明細書において、操作された赤血球前駆細胞、および操作された赤血球前駆細胞を作製する方法が提供される。
多能性幹細胞は、赤血球生成のプロセスによって赤血球を生じさせる。幹細胞は、小さなリンパ球のように見え、赤血球の機能的能力を欠く。幹細胞は、成熟細胞にはない無限分裂の能力を有する。幹細胞から生じる一部の娘細胞は、世代および時間を超えて、赤血球特性を獲得する。骨髄中の赤血球細胞のほとんどは、明確に異なる形態を有するが、赤血球成熟への関与は、赤血球系列の示差的な形態学的特徴を獲得していない細胞においてさえも見られる。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれらが形成するコロニーの種類によって認識される。そのような２種の細胞が認識されている。赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）は、幹細胞から生じ、赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）を生じさせる。ＣＦＵ－Ｅは、明確に異なる形態を有する最も未成熟の赤血球細胞である前正赤芽球を生じさせる。ＢＦＵ－ＥおよびＣＦＵ－Ｅは、骨髄細胞の非常に小さな分画を形成する。形態学的に、５種の赤血球前駆体が、ロマノフスキー染色で染色した骨髄において特定可能である。最も未成熟から最も成熟までの５段階は、前赤芽球、好塩基性正赤芽球（初期赤芽球）、多染性正赤芽球（中期赤芽球）、正染性正赤芽球（後期赤芽球）および網状赤血球である。ＢＦＵ－Ｅ（赤芽球バースト形成細胞）、ＣＦＵ－Ｅ（赤芽球コロニー形成単位）、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球は、系列制限されている。
下記の表７は、赤血球前駆細胞の形態学的特徴をまとめる。
下記の表７は、赤血球前駆細胞の形態学的特徴をまとめる。
正常なヒト赤血球は、単球、血小板および内皮細胞の接着分子であるＣＤ３６を発現する（ｖａｎ Ｓｃｈｒａｖｅｎｄｉｊｋ ＭＲ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． １９９２ Ｏｃｔ １５；８０（８）：２１０５－１４）。したがって、一部の実施形態では、抗ＣＤ３６抗体を使用して、ヒト赤血球を特定することができる。
赤血球に分化することができる当技術分野において公知の任意の細胞型、すなわち、任意の赤血球前駆細胞を、本明細書に記載の方法に従って改変して、操作された赤血球前駆細胞を作製することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って改変される赤血球前駆細胞は、赤血球に分化するプロセス中にある細胞であり、すなわち、その細胞は、哺乳動物の赤血球生成の間に存在することが公知の種類である。例えば、細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）またはＣＤ３４＋細胞、多分化能骨髄系プロジェニター細胞、ＣＦＵ－Ｓ細胞、ＢＦＵ－Ｅ細胞、ＣＦＵ－Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球または正染性正赤芽球であり得る。本明細書において提供される改変赤血球前駆細胞は、当技術分野において公知の方法を使用して、すなわち、本明細書において以下に記載の赤血球生成を促進することが公知の分子、例えば、ＳＣＦ、エリスロポエチン、ＩＬ－３および／またはＧＭ－ＣＳＦを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された除核赤血球細胞（例えば、網状赤血球または赤血球）に分化させることができる。あるいは、改変赤血球前駆細胞は、本明細書に記載の組成物中に提供され、対象へのｉｎ ｖｉｖｏでの投与の際に、赤血球に分化することができる。
培養
培養
本明細書に記載の操作された赤血球細胞を発生させるための供給源は、循環赤血球細胞を含む。適切な細胞供給源は、本明細書に記載の対象から、対象由来の造血または赤血球プロジェニター細胞から単離してもよく、不死化赤血球細胞系から誘導されてもよく、または誘導多能性幹細胞から誘導されてもよく、必要に応じて、培養および分化させてもよい。細胞培養技法を使用して赤血球を発生させるための方法は、当技術分野で周知である、例えば、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２０１１， １１８：５０７１， Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２２（２）： ４５１－６３、またはＫｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３， ８：ｅ５９８９０。プロトコールは、成長因子、出発細胞系、培養期間、および得られた細胞を特徴付ける形態学的形質により変わる。ドナー輸血の代わりになり得る血液生成のための培養系も確立されている（Ｆｉｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． １９８９ Ｂｌｏｏｄ ７３：１００）。最近、ＣＤ３４＋細胞を、網状赤血球の段階に分化させ、続いてヒト対象に輸血することに成功した（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２０１１， １１８：５０７１）。
本明細書において、赤血球細胞および操作された赤血球細胞のための培養方法が提供される。赤血球細胞は、例えば、ＣＤ３４＋造血プロジェニター細胞を含む造血プロジェニター細胞（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２０１１， １１８：５０７１）、誘導多能性幹細胞（Ｋｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３， ８：ｅ５９８９０）、および胚性幹細胞（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １：４９９）から培養することができる。プロジェニター細胞の増大および分化に適切な成長および分化因子のカクテルは、当技術分野において公知である。適切な増大および分化因子の例としては、限定されるものではないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２などのインターロイキン（ＩＬ）、ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ－ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ２、ＰＩＸＹ ３２１および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が挙げられる。
赤血球細胞は、ＣＤ３４＋細胞などの造血プロジェニター細胞から、多ステップ培養プロセスにおいて、プロジェニター細胞を定義された因子と接触させることによって培養することができる。例えば、一部の実施形態では、赤血球細胞を、造血プロジェニター細胞から、下記に概要を述べる３ステップのプロセスで培養することができる。
第１のステップは、培養物中の細胞を、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）および０．１～１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－３（ＩＬ－３）と接触させることを含んでいてもよい。第１のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体またはプレグナンｘ受容体などの核ホルモン受容体に結合し、それを活性化するリガンドと接触させることを含む。これらの受容体のリガンドとしては、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのデキサメタゾンもしくは１０ｎＭ～１００μＭのヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイド；例えば、１０ｎＭ～１００μＭのベータ－エストラジオールなどのエストロゲン；例えば、１０ｎＭ～１００μＭのプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭのヒドロキシプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭの５ａ－ジヒドロプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭの１１－デオキシコルチコステロン、もしくは例えば、１０ｎＭ～１００μＭの酢酸クロルマジノンなどの合成プロゲスチンなどのプロゲストゲン；例えば、１０ｎＭ～１００μＭのテストステロン、１０ｎＭ～１００μＭのジヒドロテストステロンもしくは１０ｎＭ～１００μＭのアンドロステンジオンなどのアンドロゲン；または例えば、１０ｎＭ～１００μＭのリファンピシン、１０ｎＭ～１００のハイパーフォリン、１０ｎＭ～１００μＭのセイヨウオトギリソウ（ヒペリシン）などのプレグナンｘ受容体リガンド、もしくは例えば、１０ｎＭ～１００のトコフェロールなどのビタミンＥ様分子が挙げられる。第１のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）または１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子などのインスリン様分子と接触させることを含んでいてもよい。第１のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含んでいてもよい。
第１のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、トロンボポエチン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－Ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－Ａ）、巨核球成長分化因子（ＭＧＤＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）およびＦｌｔ３リガンドなどの１つまたは複数のインターロイキン（ＩＬ）または成長因子と接触させることを含んでいてもよい。それぞれのインターロイキンまたは成長因子は、典型的には、０．１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給されてもよい。第１のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）もしくはヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）などの血清タンパク質または非タンパク質分子と接触させることを含んでいてもよい。
第２のステップは、培養物中の細胞を、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）および１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含んでいてもよい。第２のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）または１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子などのインスリン様分子と接触させることを含んでいてもよい。第２のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含んでいてもよい。第２のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）もしくはヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）などの血清タンパク質または非タンパク質分子と接触させることを含んでいてもよい。
第３のステップは、培養物中の細胞を、１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含んでいてもよい。第３のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）と接触させることを含んでいてもよい。第３のステップは、必要に応じて、培養物中の細胞を、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）または１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子などのインスリン様分子と接触させることをさらに含んでいてもよい。第３のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることを含んでいてもよい。第３のステップはまた、必要に応じて、培養物中の細胞を、例えば、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）もしくはヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）などの血清タンパク質または非タンパク質分子と接触させることを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、１種または複数の外因性ポリペプチドを提示する操作された赤血球細胞の増大および分化の方法は、操作された赤血球細胞を、骨髄増殖性受容体（ｍｐｌ）リガンドを含む培地中で培養するステップを含まない。
培養プロセスは、必要に応じて、細胞を、１つまたは複数の遺伝子を活性化またはノックダウンする分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ホルモンまたは低分子と、当技術分野において公知の方法によって接触させることを含んでいてもよい。標的遺伝子としては、例えば、限定されるものではないが、例えば、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＭｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３、ＥＰＯ、ＳＣＦ、インスリン、ＥＰＯ－Ｒ、ＳＣＦ－Ｒ、トランスフェリン－Ｒ、インスリン－Ｒを含む、転写因子、成長因子または成長因子受容体をコードする遺伝子が挙げられ得る。
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、合計で２２日間にわたる３つの別々の分化段階において、さまざまな量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦおよびエリスロポエチンを含有する培養物中に置かれる。
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、合計で１４日間にわたる３つの別々の分化段階において、さまざまな量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦおよびトロンボポエチンを含有する培養物中に置かれる。
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、合計で１５日間にわたる３つの別々の分化段階において、さまざまな量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦおよびＧＣＳＦを含有する培養物中に置かれる。
一部の実施形態では、赤血球細胞は、少なくとも１００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００または１００，０００倍（および必要に応じて、１００，０００、２００，０００または５００，０００倍まで）、増大される。細胞の数は、一部の実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
一部の実施形態では、培養する間、赤血球プロジェニター細胞、例えば、造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで部分的にのみ分化させ、対象へのｉｎ ｖｉｖｏでの導入の際に、さらなる分化、例えば、網状赤血球または完全に成熟した赤血球への分化が起こるのを可能にすることが望ましい場合がある（例えば、Ｎｅｉｌｄｅｚ－Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０：４６７－４７２ （２００２）を参照されたい）。本明細書に記載されるように、さまざまな実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの成熟および／または分化を、任意の所望の段階で停止させることができることが理解される。例えば、単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞を、例えば、インターロイキン３、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、トランスフェリンおよびインスリン成長因子を含むさまざまな因子を含有する培地中、分化の所望の段階に達するまで、本明細書の他の場所に記載の通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることができる。得られた操作された赤血球細胞は、ＣＤ３６およびＧＰＡの表面発現、ならびに特定の所望の細胞型に特異的な他の特徴によって特徴付けられ得、対象に輸血され、そこで成熟赤血球への最終分化が起きるのを可能にし得る。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞を、赤血球プロジェニター細胞から、除核は含まないがその前の成熟の任意の段階まで部分的に増大させ、このようにして、有核細胞、例えば赤血球前駆細胞のままにする。ある特定の実施形態では、得られた細胞は有核であり、赤血球系列に制限される。ある特定の実施形態では、得られた細胞は、多分化能骨髄系プロジェニター細胞、ＣＦＵ－Ｓ細胞、ＢＦＵ－Ｅ細胞、ＣＦＵ－Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球から選択される。除核を含む最終の分化ステップは、操作された赤血球細胞の対象への投与後にのみ起こり、すなわち、そのような実施形態では、除核ステップはｉｎ ｖｉｖｏで起こる。別の実施形態では、操作された赤血球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで除核の段階に増大および分化させて、例えば、網状赤血球にする。操作された赤血球細胞を網状赤血球の段階に分化させるそのような実施形態では、赤血球になる最終の分化ステップは、操作された赤血球細胞の対象への投与後にのみ起こり、すなわち、最終分化ステップはｉｎ ｖｉｖｏで起こる。別の実施形態では、操作された赤血球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最終分化段階を通して増大および分化させて、赤血球にする。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞を、赤血球プロジェニター細胞、例えば、造血幹細胞から増大および分化させて、異なる系列の造血細胞にしてもよいこと、例えば、血小板にしてもよいことなどがさらに認識される。血小板などのさまざまな系列の造血細胞を成熟および分化させるための方法は、当技術分野において当業者に周知である。本明細書に記載の外因性ポリペプチドを発現するそのような操作された血小板は、本開示に包含されるものとみなされる。
外因性ポリペプチドの発現
外因性ポリペプチドの発現
一部の実施形態では、本明細書に記載されている操作された赤血球細胞は、適した単離された細胞、例えば、有核赤血球細胞、赤血球前駆体細胞または有核血小板前駆細胞を、本開示のポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド、またはこれらの組合せ）をコードする外因性核酸と接触させることにより生成される。
一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、有核赤血球前駆細胞または有核血小板前駆細胞と接触されるＤＮＡによってコードされる。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、有核赤血球細胞、赤血球前駆細胞、有核血小板前駆細胞と接触されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされる。
一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、血小板、有核赤血球細胞、赤血球前駆細胞、有核血小板前駆細胞、網状赤血球または赤血球と接触される。
一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、次のうちの１種または組合せであり得るエピトープタグ配列を含む；ＨＡ－タグ、緑色蛍光タンパク質タグ、Ｍｙｃ－タグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧ－タグ、Ｖ５－タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタメート－タグ、Ｅ－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ－１、Ｓｏｆｔａｇ－３、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＴＣ－タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓ－タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、Ｎｕｓ－タグ、Ｆｃ－タグまたはＴｙ－タグ。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸は、次のうちの１種または組合せとであり得るエピトープタグ配列に融合された（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）、外因性ポリペプチドの遺伝子配列の３’末端を含む；ＨＡ－タグ、ｇ緑色（ｇＧｒｅｅｎ）蛍光タンパク質タグ、Ｍｙｃ－タグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧ－タグ、Ｖ５－タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタメート－タグ、Ｅ－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ－１、Ｓｏｆｔａｇ－３、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＴＣ－タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓ－タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、Ｎｕｓ－タグ、Ｆｃ－タグまたはＴｙ－タグ。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＨＡエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１））、ｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２））またはＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３））等のエピトープタグを含む。エピトープタグは、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットまたは免疫沈降により、エピトープタグに対する抗体を使用して、発現の容易な検出および定量化に使用することができる。
外因性ポリペプチドは、電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊または他の方法によって赤血球細胞に導入された導入遺伝子から発現させることができる；電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊または他の方法によって細胞に導入されたｍＲＮＡから発現される外因性ポリペプチド；外部の因子、例えば、転写活性化因子、転写抑制因子または分泌経路エンハンサーの導入によってネイティブ遺伝子座から過剰発現された外因性ポリペプチド；および／あるいは産生細胞または他の外部の系から合成、抽出または産生され、赤血球細胞に取り込まれたポリペプチド。
ある特定の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、電気穿孔を含む。別の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介性移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクションおよびレンチウイルスベクターのうち１つまたは複数の利用を含む。
一部の実施形態では、導入するステップは、レンチウイルスベクターのトランスフェクションによる、第１の外因性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸の導入を含む。
外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む）は、単一もしくは複数コピーの遺伝子のトランスフェクション、ウイルスの形質導入、または電気穿孔によって導入することができる。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の発現のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、造血細胞における外因性第ＩＸ因子の発現は、ＣＤ３４＋プロジェニター細胞のウイルス形質導入によって誘導される。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６， ２４：１０１７を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡは、コドン最適化される。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、単一の核酸、例えば、単一のベクターにおいてコードされる。一部の実施形態では、単一のベクターは、遺伝子毎に別々のプロモーターを有する、または中央にプロテアーゼ切断部位を有する単一のポリペプチドへと初期に転写される２つのタンパク質を有し、その後のタンパク質分解性プロセシングにより２つのタンパク質が生じるようになっている、または他のいずれかの適した立体配置を有する。一部の実施形態では、２つ以上のポリペプチド（例えば、２つまたはそれよりも多い）が存在する場合、ポリペプチドは、単一の核酸、例えば、単一のベクターにおいてコードされ得る。外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび／または外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドが、同じ外因性核酸（例えば、ベクター）によってコードされる場合、ポリペプチドの同時発現に有用な複数の可能な副次戦略（ｓｕｂ－ｓｔｒａｔｅｇｙ）がある。一部の実施形態では、単一の外因性核酸（例えば、ベクター）は、外因性核酸をコードする遺伝子毎に別々のプロモーターを有する。一部の実施形態では、外因性核酸は、２つ（またはそれよりも多い）外因性ポリペプチドをコードし、それによって、「自己切断型」２Ａエレメントは、外因性ポリペプチドをコードするシストロンの間に配置される。２Ａエレメントは、リボソームに、２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせ、２Ａ配列の末端と下流にある次のポリペプチドとの間に分離をもたらすことにより、機能すると考えられる（例えば、Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：６５８－６６を参照）。一部の実施形態では、組換え核酸は、抗原提示ポリペプチドまたはそのバリアントである、第１の外因性ポリペプチドをコードする遺伝子と、外因性抗原ポリペプチドまたはそのバリアントである、第２の外因性ポリペプチドをコードする遺伝子とを含み、第２の遺伝子は、ウイルス由来２Ａエレメント（ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号４）によって、第１の外因性ポリペプチドをコードする遺伝子から分離されている。複数の２Ａエレメントは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている通りに使用することができ、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａを含む（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ７（１）： ２１９３を参照）。
２つのプロモーターによる二重発現のため、ＭＳＣＶプロモーターを第１のプロモーターとして使用し、ＥＦ１プロモーターを第２のプロモーターとして使用することができるが、本開示は、これらの２つの例示的なプロモーターによって限定されるべきではない。別の戦略は、ポリペプチドをコードする２つの遺伝子の間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を挿入することにより、２つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドの両方を発現させることである。また別の戦略は、リンカーによって分離された直接的なペプチド融合体として、２つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドを発現させることである。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、２つまたはそれよりも多い外因性核酸によってコードされ、例えば、各ベクターは、外因性ポリペプチドのうち１つをコードする。
２つのプロモーターによる二重発現のため、ＭＳＣＶプロモーターを第１のプロモーターとして使用し、ＥＦ１プロモーターを第２のプロモーターとして使用することができるが、本開示は、これらの２つの例示的なプロモーターによって限定されるべきではない。別の戦略は、ポリペプチドをコードする２つの遺伝子の間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を挿入することにより、２つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドの両方を発現させることである。また別の戦略は、リンカーによって分離された直接的なペプチド融合体として、２つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドを発現させることである。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、２つまたはそれよりも多い外因性核酸によってコードされ、例えば、各ベクターは、外因性ポリペプチドのうち１つをコードする。
ある特定の実施形態では、ベータ－グロビンプロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター、ＣＡＧ ＣＭＶ最初期エンハンサーおよびニワトリベータ－アクチン（ＣＡＧ）およびヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むレンチウイルスベクターが使用される。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、２つまたはそれよりも多い核酸においてコードされ、例えば、各ベクターは、ポリペプチドのうち１つをコードする。
外因性ポリペプチドを産生するためのＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡ等の核酸は、本明細書に記載されている外因性ポリペプチドの産生に適したプロジェニター細胞（例えば、赤血球細胞プロジェニターまたは血小板プロジェニターその他）に導入することができる。プロジェニター細胞は、本来の供給源から単離する、または本明細書に提供されるルーチン組換え技術により増大されたプロジェニター細胞集団から得ることができる。一部の例では、発現ベクターは、当技術分野で公知の方法による相同または非相同組換えによって細胞のゲノムに取り込まれ得るように、設計することができる。
一部の実施形態では、造血プロジェニター細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸（単数または複数）と接触され、細胞は、培養下で増大され分化させられる。
一部の例では、例えば、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、外因性制御性Ｔ細胞増大ポリペプチド、サイトカインおよび外因性プレースホルダー（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｅｒ）ポリペプチド）を含む赤血球細胞であるａＡＰＣの場合、ゲノムを選択的に標的化しカットすることができるポリペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸を使用して、外因性ポリペプチドをコードする発現ベクターの外因性核酸の、特定のゲノム位置、例えば、ＣＲ１遺伝子座（１ｑ３２．２）、ヘモグロビン遺伝子座（１１ｐ１５．４）への挿入を方向付ける。よって、一態様では、本開示は、免疫学的に適合性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外因性抗原ポリペプチドを含む操作された赤血球細胞を含み、方法が、有核赤血球細胞、赤血球前駆細胞または有核血小板前駆細胞を、内因性ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させるステップを含み、内因性ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ核酸が、遺伝子編集経路によって修復され、内因性ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ核酸の発現のレベルの減少をもたらす、方法を特色とする。
一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、トランスフェクションのためのプラスミド構築物にクローニングすることができる。本明細書に記載されているａＡＰＣの産生に適した細胞に発現ベクターを移入するための方法は、ウイルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性移入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルス等のＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターの使用等のウイルス媒介性遺伝子移入を含むがこれらに限定されない。遺伝子移入の機序の例は、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび細胞マイクロインジェクションを含む。
一部の実施形態では、各外因性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡは、赤血球細胞への組込みのためのレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングすることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球細胞への組込みのための単一の外因性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球細胞への組込みのための本明細書に記載されている２、３、４つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡは、抗生物質抵抗性遺伝子等、選択可能な形質をコードするプラスミドＤＮＡ構築物にクローニングすることができる。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡは、赤血球細胞において各組換えタンパク質を安定に発現するように適応されたプラスミド構築物にクローニングすることができる。
一部の実施形態では、レンチウイルス系を用いることができ、それによると、外因性ポリペプチド配列（例えば、１、２、３、４つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチド配列）を有する移入ベクター、エンベロープベクターおよび／または１つもしくは複数のパッケージングベクターがそれぞれ、ウイルス産生のために宿主細胞にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、脂質に基づくトランスフェクションまたは電気穿孔のいずれかによって宿主細胞にトランスフェクトし、一晩インキュベートすることができる。外因性ポリペプチド配列が蛍光レポーターを伴うことができる実施形態のため、一晩インキュベーション後に蛍光に関する宿主細胞の点検をチェックすることができる。ウイルス粒子を含む宿主細胞の培養培地を、８～１２時間毎に２または３回収集し、遠心分離して、脱離した細胞およびデブリを沈降させることができる。次に、培養培地は、必要に応じて直接使用すること、凍結することまたは濃縮することができる。
外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸の移入に付されたプロジェニター細胞は、分化および除核を可能にする適した条件下で、例えば、本明細書に記載されているｉｎ ｖｉｔｒｏ培養プロセスにより培養することができる。
単離された赤血球前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）に、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトして、ａＡＰＣを生成することができる。メッセンジャーＲＮＡは、１つまたは複数の外因性ポリペプチドに対応するコード配列を含有するｃＤＮＡプラスミド構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に由来することができる。例えば、外因性ポリペプチドに対応するｃＤＮＡ配列は、特異的ＲＮＡポリメラーゼと適合性のプロモーター配列を含有するクローニングベクターに挿入することができる。例えば、クローニングベクターＺＡＰ ＥＸＰＲＥＳＳ ｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）は、それぞれＴ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと適合性のＴ３およびＴ７プロモーター配列を含有する。センスｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、プラスミドは、外因性ポリペプチドのコード配列の末端に対応する停止コドン（複数可）の下流にある制限部位で線状化される。ｍＲＮＡは、例えば、ＲＮＡＭＡＸＸ高収率転写キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡの）等の市販のキットを使用して、線状状ＤＮＡ鋳型から転写される。一部の例では、５’－ｍ７ＧｐｐｐＧキャッピングｍＲＮＡを生成することが望ましい場合がある。したがって、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）からのｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ高収率キャッピングＲＮＡ転写キットを使用して、線状化されたｃＤＮＡ鋳型の転写を実行することができる。転写は、３７℃にて３０分間～４時間、２０～１００μｌの反応体積で実行することができる。線状化されたＤＮＡ鋳型を排除するためのＤＮａｓｅ Ｉによる短時間の処置と、続く塩化リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムの存在下での７０％エタノールにおける沈殿によって、転写されたｍＲＮＡが反応ミックスから精製される。転写されたｍＲＮＡの統合性は、アガロース－ホルムアルデヒドゲルまたは市販のＮｏｖｅｘプレキャストＴＢＥゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）による電気泳動を使用して評価することができる。
１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするメッセンジャーＲＮＡは、例えば、リポフェクションおよび電気穿孔を含む種々のアプローチを使用して、赤血球前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）に導入することができる（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６ （２００１））。リポフェクションのため、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）における５μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡは、１：４比で、カチオン性脂質ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に５～１５分間インキュベートされる。あるいは、種々の他のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを使用して、細胞に、例えば、ＤＯＴＡＰ、様々な形態のポリエチレンイミンおよびポリＬ－リシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ；例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９：３８８２－３８９１ （２００１）を参照）を含むｍＲＮＡをトランスフェクトすることができる。その結果得られるｍＲＮＡ／脂質複合体は、細胞（１～２×１０６個の細胞／ｍｌ）と共に２時間３７℃でインキュベートされ、洗浄され、培養に戻される。電気穿孔のため、例えば、５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）における約５～２０×１０６個の細胞は、約２０μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡと混合され、例えば、Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓデバイス（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して０．４ｃｍキュベットにおいて電気穿孔される。一部の例では、様々な電圧、キャパシタンスおよび電気穿孔体積を検査して、細胞への特定のｍＲＮＡのトランスフェクションに有用な条件を決定することが必要となる場合がある。一般に、細胞にｍＲＮＡを効率的にトランスフェクトするために要求される電気穿孔パラメーターは、細胞にとって、ＤＮＡの電気穿孔に要求されるパラメーターよりも低い有害性であると思われる（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６ （２００１））。
あるいは、ｍＲＮＡは、ペプチド媒介性ＲＮＡ送達戦略を使用して、赤血球前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９：３８８２－３８９１ （２００１）を参照）。例えば、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）をメリチンペプチド（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）と組み合わせて、特に、有糸分裂後の初代細胞におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率を増加させることができる。メリチンペプチドは、例えば、ヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート等のジスルフィド架橋剤を使用して、ＰＥＩにコンジュゲートすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡは、メリチン－ＰＥＩと共に５～１５分間プレインキュベートされて、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体を形成する。次に、この複合体は、２～４時間３７℃にて５％ＣＯ２加湿環境下で、無血清培養培地における細胞に添加され、次いで除去され、トランスフェクトされた細胞は、培養における成長を継続させる。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、適した単離された赤血球前駆細胞または血小板前駆細胞を、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外因性核酸と接触させることにより生成される。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、有核赤血球前駆細胞または有核血小板前駆細胞と接触されるＤＮＡによってコードされる。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、血小板、有核赤血球細胞または有核血小板前駆細胞と接触されるＲＮＡによってコードされる。
１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、一過性または安定したトランスフェクションおよび遺伝子療法アプローチを含む種々のＤＮＡ技法を使用して、終分化に先立ち赤血球前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球細胞に遺伝学的に導入することができる。外因性ポリペプチドは、赤血球細胞または血小板の表面におよび／またはその細胞質中に発現させることができる。
ウイルス遺伝子移入を使用して、細胞に、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ １）等のレンチウイルス、および泡沫状ウイルス等のスプーマウイルスを含む、いくつものウイルスを遺伝子移入媒体として使用することができる（例えば、Ｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＨＥＰ １７８：１７７－２０２ （２００７）を参照）。レトロウイルスは、例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞を効率的に形質導入し、染色体に組み込み、安定した遺伝子移入を付与する。
１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、赤血球前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球細胞にトランスフェクトされ、発現され、その後、本明細書に記載されている通り、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）において保持および表示され得る。適したベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター骨格（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１：２６６４－２６７１ （１９９８））である。発癌性レトロウイルスであるＭＭＬＶに基づくベクターは、遺伝子療法臨床試験において現在使用されている（Ｈｏｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃｉ． １７：８７－９２ （２００２））。例えば、外因性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ構築物は、標準分子生物学技法を使用して、ＭＭＬＶベクター骨格において生成することができる。構築物は、例えば、ＰＡ３１７細胞等のパッケージング細胞系にトランスフェクトされ、ウイルス上清が使用して、例えば、ＰＧ１３細胞等の産生株細胞にトランスフェクトする。ＰＧ１３ウイルス上清は、本明細書に記載されている通り、単離されて培養された、または新鮮に単離された、赤血球前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球細胞と共にインキュベートされる。外因性ポリペプチドの発現は、ａＡＰＣの表面に位置する場合、例えば、外因性ポリペプチドに対する蛍光標識された抗体によるＦＡＣＳ解析（蛍光標識細胞分取）を使用してモニターすることができる。同様の方法を使用して、ａＡＰＣの内側に位置する外因性ポリペプチドを発現させることができる。
必要に応じて、ウイルスに基づくアプローチを使用して、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光追跡用分子をトランスフェクトすることができる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：６７０－６７８ （２００７））。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含有する異所性レトロウイルスベクターは、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞系（Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．によって流通）等のパッケージング細胞を使用してパッケージングされる。パッケージング細胞系は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む、適切なウイルスパッケージングに必要とされるウイルスタンパク質を安定に発現する。ウイルス粒子が脱落したＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞由来の上清を使用して、例えば、赤血球前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球細胞を形質導入する。一部の例では、形質導入は、例えば、組換えフィブロネクチンの断片等により、特別にコーティングされた表面において行って、レトロウイルス媒介性遺伝子移入の効率を改善することができる（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。細胞は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティングされたプレートにおいて、レトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ上清プラス適した補因子と共にインキュベートされる。形質導入は、翌日に反復することができる。この例では、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する細胞のパーセンテージは、ＦＡＣＳによって評価することができる。形質導入効率の評価に使用することができる他のレポーター遺伝子は、例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼと共に、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）およびヒト細胞表面ＣＤ２４抗原（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６０５－６１３ （１９９９））を含む。
非ウイルスベクターを使用して、遺伝材料を適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に導入して、ａＡＰＣを生成することができる。非ウイルス媒介性遺伝子移入は、プラスミドベクターが、タンパク質を含有せず、毒性が低くスケールアップがより容易であり、宿主細胞優先傾向がないという点において、ウイルス媒介性遺伝子移入とは異なる。プラスミドベクターの「ネイキッドＤＮＡ」は、それだけでは、ポリペプチドをコードする遺伝材料の細胞への送達において非効率的であり、したがって、細胞への進入を可能にする遺伝子送達方法と組み合わされる。非ウイルスベクターを適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に移入するために、化学的および物理的方法を含む、いくつもの送達方法を使用することができる。
１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする非ウイルスベクターは、カチオン性脂質およびポリマー等の合成巨大分子を使用して、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０ （２００５））。カチオン性リポソームは、例えば、電荷相互作用によりＤＮＡと複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／脂質複合体は、負荷電の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスにより細胞によって取り入れられる。このアプローチを使用して、例えば、造血細胞にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９３１－９３８ （１９９９）を参照）。赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体のため、プラスミドＤＮＡ（例えば、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）等の２５～１００μＬの無血清培地におけるおよそ０．５μｇ）は、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）等のカチオン性リポソーム（２５μ．Ｌの無血清培地におけるおよそ４μ．ｇ）と混合され、少なくとも２０分間インキュベートされ、複合体を形成させる。ＤＮＡ／リポソーム複合体は、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に添加され、５～２４時間インキュベートされ、その時間の後、ポリペプチドの導入遺伝子発現をアッセイすることができる。あるいは、他の市販のリポソームトランスフェクション剤を使用することができる（例えば、Ｉｎ ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ．、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）。
必要に応じて、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオン性ポリマーを使用して、赤血球細胞プロジェニター細胞、例えば、造血および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞に効率的にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７２５：３７７－３８４ （２００５）を参照）。ヒトＣＤ３４＋細胞は、ヒト臍帯血から単離され、２００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子および２０％熱失活ウシ胎仔血清を補充したイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地において培養される。外因性ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡは、０．８Ｋ～７５０Ｋにサイズが変動する分枝状または直鎖状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ；Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）と共にインキュベートされる。ＰＥＩは、４．２ｍｇ／ｍｌ蒸留水のストック溶液として調製され、ＨＣｌを使用してｐＨ５．０へと僅かに酸性化される。３０分間室温で、１μｇのＤＮＡが３ｎｍｏｌのリン酸塩を含有し、１μｌのＰＥＩストック溶液が１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含有することの計算に基づく様々な窒素／リン酸塩比にて、ＤＮＡをＰＥＩと組み合わせることができる。単離されたＣＤ３４＋細胞は、ＤＮＡ／カチオン性複合体と共に播種され、２８０×ｇで５分間遠心分離され、ポリペプチドの遺伝子発現が評価されるまで４時間またはそれよりも長く培養培地においてインキュベートされる。
プラスミドベクターは、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃またはパーティクルボンバードメント技術等の物理的方法を使用して、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ， ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０）。この例では、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、金粒子表面に吸着され、パーティクルガンによって細胞に投与される。このアプローチを使用して、例えば、赤血球プロジェニター細胞、例えば、臍帯血に由来する造血幹細胞にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：６９２－６９９ （１９９８）を参照）。したがって、臍帯血が単離され、リン酸緩衝食塩水において３倍に希釈される。ＣＤ３４＋細胞は、二次抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズと組み合わせた抗ＣＤ３４モノクローナル抗体、および磁気単離システム（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｉｎｉＭａｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して精製される。ＣＤ３４＋濃縮細胞は、本明細書に記載されている通りに培養することができる。トランスフェクションのため、ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡは、塩化カルシウムおよびスペルミジンによる処置により、粒子、例えば、金ビーズ表面に沈殿される。エタノールによるＤＮＡコーティングビーズの洗浄後に、ビーズは、例えば、微粒子銃ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して、培養細胞中に送達することができる。例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子を使用して、トランスフェクションの効率を評価することができる。
必要に応じて、電気穿孔方法を使用して、プラスミドベクターを、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に導入することができる。電気穿孔は、細胞膜に一過性のポアを作製し、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡと共に抗体および薬物を含む様々な分子の細胞への導入を可能にする。したがって、本明細書に記載されている通りにＣＤ３４＋細胞が単離および培養される。電気穿孔の直前に、細胞は、１０分間、２５０×ｇ、室温での遠心分離によって単離され、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ １０等の電気穿孔緩衝剤に０．２～１０×１０６個の生細胞／ｍｌで再懸濁される。プラスミドＤＮＡ（１～５０μｇ）は、５００μｌの細胞懸濁液と共に適切な電気穿孔キュベットに添加される。電気穿孔は、例えば、２００Ｖ～２８０Ｖに及ぶ電圧および２５～７０ミリ秒に及ぶパルス長により、ＥＣＭ ６００電気穿孔装置（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して行うことができる。いくつもの代替電気穿孔機器が市販されており、この目的のために使用することができる（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸＣＥＬＬ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃｅｌｌｊｅｃｔ Ｄｕｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。あるいは、単離されたＣＤ３４＋細胞の効率的な電気穿孔は、次のパラメーターを使用して行うことができる：４ｍｍキュベット、１６００μＦ、５５０Ｖ／ｃｍおよび１×１０５個の細胞／ｍｌの５００μｌの細胞につき１０μｇのＤＮＡ（Ｏｌｄａｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ４９：６２５－６３２ （２００２））。
電気穿孔の一形態であるヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）を使用して、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体にトランスフェクトすることもできる。この例では、トランスフェクションは、ＤＮＡ（または他の試薬）が核に直接輸送されることを可能にする細胞型特異的溶液における電気的パラメーターを使用して行われ、よって、細胞質における分解の可能性のリスクを低減する。例えば、ヒトＣＤ３４ ＣＥＬＬ ＮＹＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲキット（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．の）を使用して、適した赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体にトランスフェクトすることができる。この例では、ヒトＣＤ３４細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液における１～５×１０６個の細胞は、１～５μｇのＤＮＡと混合され、製造業者によって決定された予めプログラムされた設定を使用したＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ機器においてトランスフェクトされる。
赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に、ゲノムに組み込まれない限り哺乳動物細胞において自己複製することができない従来の発現ベクターを非ウイルス的にトランスフェクトすることができる。あるいは、赤血球細胞、血小板またはそれらの前駆体に、染色体に組み込まれることなく自律的に複製する遺伝単位として宿主核において存続することができるエピソームベクターをトランスフェクトすることができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０ （２００５））。これらのベクターは、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシパピローマウイルス－１（ＢＰＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ）およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等、潜伏感染後に細胞において正常に染色体外で複製するウイルスに由来する遺伝的エレメントを活用する。非ウイルス遺伝子移入のために哺乳動物人工染色体を使用することもできる（Ｖａｎｄｅｒｂｙｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３３：１４７０－１４７６ （２００５））。
１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外因性核酸は、当技術分野で公知の標準分子生物学方法、例えば、制限酵素消化、重複伸長ＰＣＲおよびギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）アセンブリによって、発現ベクターへとアセンブルすることができる。
外因性核酸は、外因性ポリペプチドが細胞表面に発現されるように、内因性またはネイティブの膜タンパク質をコードする遺伝子に融合された、例えば、赤血球細胞の細胞表面に正常であれば発現されない１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする遺伝子を含むことができる。例えば、外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性遺伝子は、１型膜タンパク質のリーダー配列に続くＮ末端において、２型膜タンパク質のＣ末端において、またはＧＰＩ連結膜タンパク質のＧＰＩ取り付け部位の上流にクローニングすることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される膜局在化外因性ポリペプチド（例えば、Ｉ型膜タンパク質膜貫通ドメインを含むポリペプチド）をコードする外因性核酸は、細胞の膜に外因性ポリペプチドを標的化するためのリーダー配列（シグナルペプチドとしても公知、例えば、β２Ｍリーダー配列またはＧＰＡリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、細胞シグナルペプチダーゼによって成熟外因性ポリペプチドから切断される。
標準クローニング方法を使用して、２つの融合された遺伝子の間に可動性アミノ酸リンカーを導入することができる。例えば、可動性リンカーは、全長抗体からの一本鎖抗体断片の生成において一般的に使用される［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３（配列番号５）等のポリグリシン・ポリセリンリンカー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｌｏ ２００４）、または一本鎖Ａｒｃ抑制因子の生成に使用されるポリペプチド等のａｌａ－ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｔｈｒポリペプチド（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ， ＰＮＡＳ １９９８）である。一部の実施形態では、可動性リンカーは、可動性リンカーを持たない同等な構築物よりも可動性および立体上の自由を有するポリペプチドをもたらす。
例えば、ＨＡエピトープタグ－－アミノ酸ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１）、ＣＭｙｃタグ－－アミノ酸ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２）またはＦｌａｇタグ－－アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３）をコードする核酸配列等、エピトープタグは、２つの融合された遺伝子の間に設置することができる。エピトープタグは、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットまたは免疫沈降によるエピトープタグに対する抗体を使用した発現の手軽な検出および定量化のために使用することができる。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）および少なくとも１つの他の異種ポリペプチドを含む。少なくとも１つの他の異種ポリペプチドは、蛍光タンパク質であり得る。蛍光タンパク質は、形質導入効率を評価するためのレポーターとして使用することができる。一部の実施形態では、蛍光タンパク質および外因性ポリペプチドが、両者共に同じ転写物から作製されるのであれば、蛍光タンパク質は、外因性ポリペプチドの発現レベルを評価するためのレポーターとして使用される。一部の実施形態では、少なくとも１つの他のポリペプチドは、異種であり、例えば、複数の抗原、複数の捕捉標的、酵素カスケード等の機能をもたらす。一部の実施形態では、組換え核酸は、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子および第２の遺伝子を含み、第２の遺伝子は、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子から、ウイルス由来Ｔ２Ａ配列（ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号４））によって分離され、この配列は、翻訳後に切断されて、２つの成熟タンパク質を生じる。
一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸は、Ｋｅｌｌの配列の３’末端に融合され、ＰＣＲを使用して増幅された、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドの遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ポリグリシン／セリンリンカーとそれに続くＫｅｌｌの配列の３’末端に融合され、ＰＣＲを使用して増幅された、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドの遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸は、エピトープタグ配列に融合された、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドの遺伝子配列の３’末端を含み、エピトープタグ配列は、ＨＡ－タグ、緑色蛍光タンパク質タグ、Ｍｙｃ－タグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧ－タグ、Ｖ５－タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタメート－タグ、Ｅ－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ－１、Ｓｏｆｔａｇ－３、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＴＣ－タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓ－タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、Ｎｕｓ－タグ、Ｆｃ－タグまたはＴｙ－タグのうち１種または組合せであり得る。構築物全体が、Ｋｅｌｌの配列の３’末端に融合され、次いでＰＣＲを使用して増幅される。様々な外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性遺伝子構築物は、例えば、その後、レンチウイルスベクター中にロードされ、細胞集団の形質導入に使用される。
一部の実施形態では、赤血球細胞の集団は、その特異的プラスミドを、ｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏ、ＰＬＫＯ．１－－ＴＲＣクローニングベクター、ｐＳｉｃｏ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＪＭ１、ｐＬｉｏｎ１１、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＶＳＶＧ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．２ ｄｖｐｒ、ｐｓＰＡＸ２、ｐＲＳＶ－ＲｅｖおよびｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥを含むことができる、１つまたは複数の外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外因性核酸を含むレンチウイルスベクターと共にインキュベートして、ａＡＰＣを生成する。ベクターは、１０、１００、１，０００、１０，０００ｐｆｕで投与し、１２時間インキュベートすることができる。
ある特定の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドにコンジュゲートされた外因性抗原提示ポリペプチドを提示する赤血球細胞である。他の実施形態では、ａＡＰＣは、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、およびコンジュゲートペアの一部である少なくとも１つの外因性共刺激ポリペプチドを含む赤血球細胞である。他の実施形態では、ａＡＰＣは、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性抗原ポリペプチド、およびコンジュゲートペアの一部である少なくとも１つの外因性共阻害ポリペプチドを含む赤血球細胞である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、有核細胞である。
コンジュゲーションは、化学的にまたは酵素により成就することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用ありまたはなしで、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドへの外因性抗原提示ポリペプチドの共有結合的結合によって達成することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用ありまたはなしで、共刺激ポリペプチドおよび結合ペアメンバーの共有結合的結合によって達成することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用ありまたはなしで、共阻害ポリペプチドおよび結合ペアメンバーの共有結合的結合によって達成することができる。斯かるコンジュゲートの形成は、当業者の技能範囲内であり、コンジュゲートされるべき材料によって導かれる特定の技法の選択により、コンジュゲーションを達成するための様々な技法が公知である。イオン化できる側鎖、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシンを含有し、ポリペプチド配列の活性部分に含有されない、ポリペプチド（ＣまたはＮ末端）へのアミノ酸の付加は、その非プロトン化状態で、ポリマーに取り付けられた反応基、例えば、ホモまたはヘテロ二官能性ＰＥＧとの様々なバイオコンジュゲーション反応に関与するための強力な求核剤として働く（例えば、Ｌｕｔｏｌｆ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３； ４：７１３－２２， Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｌｏｎｄｏｎ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ； １９９６）。
ある実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドは、ビオチン－ストレプトアビジン架橋により１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドに結合され得る。他の実施形態では、共刺激ポリペプチドおよび結合ペアメンバーは、ビオチン－ストレプトアビジン架橋により結合される。他の実施形態では、共阻害ポリペプチドおよび結合ペアメンバーは、ビオチン－ストレプトアビジン架橋により結合される。
例えば、ビオチン化された抗原ポリペプチドは、ストレプトアビジン架橋により外因性抗原提示ポリペプチドの非特異的にビオチン化された表面に連結することができる。ビオチンコンジュゲーションは、いくつもの化学的手段によって生じ得る（例えば、Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９５： １３５－１５４ （２００４）を参照）。外因性抗原提示ポリペプチドは、例えば、ＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－－ＳＳ－ビオチン（スルホスクシンイミジル２－（ビオチンアミド）－エチル－１，３－ジチオプロピオネート；Ｐｉｅｒｃｅ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ；例えば、Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２１：４７－５１ （２００３）を参照）等のアミン反応性ビオチン化試薬を使用してビオチン化することができる。例えば、単離された赤血球細胞は、１ｍｇ／ｍｌのスルホ－ＮＨＳ－ＳＳのリン酸緩衝食塩水中溶液において３０分間４℃でインキュベートすることができる。過剰なビオチン試薬は、細胞をＴｒｉｓ緩衝食塩水で洗浄することにより除去される。次に、ビオチン化された細胞を、ストレプトアビジンの存在下でビオチン化された外因性抗原ポリペプチドと反応させて、ビオチン－ストレプトアビジン架橋により１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドに結合された外因性抗原提示ポリペプチドを提示するａＡＰＣを形成させる。
本明細書に記載されている赤血球細胞は、外因性ポリペプチドを細胞に連結するためのカップリング試薬を使用して産生することもできる。例えば、クリックケミストリーを使用することができる。例えば、外因性ポリペプチドが、複合体である場合、またはポリペプチドの発現が困難である場合、例えば、ポリペプチド、例えば、多量体ポリペプチド；大型のポリペプチド；ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導体化されるポリペプチド；赤血球細胞に対して毒性を有し得るもしくは赤血球細胞において効率的に発現されない外因性ポリペプチドである場合、カップリング試薬を使用して、外因性ポリペプチドを細胞にカップリングすることができる。赤血球細胞を官能化するためのクリックケミストリーおよび他のコンジュゲーション方法は、２０１７年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されており、これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
よって、一部の実施形態では、本明細書に記載されている赤血球細胞は、細胞１個当たり５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００種もの数の、少なくともその数の、その数を超えるまたは約その数のカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、赤血球細胞は、ａ）第１のカップリング試薬を赤血球細胞にカップリングし、それにより、医薬品調製物、製品または中間体を作製するステップを含む方法によって作製される。ある実施形態では、本方法は、ｂ）例えば、第２のカップリング試薬と第１のカップリング試薬との反応に適した条件下で、この細胞を、第２のカップリング試薬にカップリングされた外因性ポリペプチドと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い外因性ポリペプチドが、細胞にカップリングされる（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、細胞にカップリングされ（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外因性ポリペプチドは、外因性核酸から発現されたポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カップリング試薬は、アジドカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、アジドカップリング試薬は、アジドアルキル部分、アジドアリール部分またはアジドヘテロアリール部分を含む。例示的なアジドカップリング試薬は、３－アジドプロピオン酸スルホ－ＮＨＳエステル、アジド酢酸ＮＨＳエステル、アジド－ＰＥＧ－ＮＨＳエステル、アジドプロピルアミン、アジド－ＰＥＧ－アミン、アジド－ＰＥＧ－マレイミド、ビス－スルホン－ＰＥＧ－アジド、またはこれらの誘導体を含む。カップリング試薬は、アルケン部分、例えば、トランスシクロアルケン部分、オキサノルボルナジエン（ｏｘａｎｏｒｂｏｒｎａｄｉｅｎｅ）部分またはテトラジン部分を含むこともできる。追加的なカップリング試薬は、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ（ｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｏｏｌｓ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可）またはＬａｈａｎｎ， Ｊ （ｅｄ） （２００９） Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅに見出すことができ、これらのそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、外因性抗原ポリペプチドを、共有結合による取り付けにより、細胞、例えば、赤血球細胞に取り付けて、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチド（例えば、第１の外因性抗原ポリペプチド、または第１の抗原ポリペプチドおよび第２の外因性抗原ポリペプチド）を提示する赤血球細胞を含むａＡＰＣを生成する。例えば、赤血球細胞または血小板表面の求核剤と反応して、結合された（ｉｎｔｅｒｂｏｎｄｅｄ）関係性を形成するであろう求電子基を含有するカップリング化合物を使用して、抗原ポリペプチドを誘導体化し、赤血球細胞または血小板に結合することができる。このような求電子基の代表は、αβ不飽和カルボニル、ハロゲン化アルキルおよび置換されたマレイミド等のチオール試薬である。加えて、カップリング化合物は、アミノ、カルボキシルおよびチロシン（ｔｒｙｏｓｉｎｅ）基等のポリペプチドにおける官能基のうち１つまたは複数を介して、抗原ポリペプチドにカップリングすることができる。この目的のため、カップリング化合物は、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、芳香族アミノ基、および酵素官能基との反応が可能な他の基を含有するべきである。高度に荷電した抗原ポリペプチドは、静電結合により、例えば、赤血球細胞または血小板表面への固定化のために調製して、改変された除核細胞を生成することもできる。このような誘導体の例は、ポリリシルおよびポリグルタミル酵素を含むであろう。
誘導体において具体化された反応基の選択は、固定化のための赤血球細胞または血小板表面の求核基による求電子剤のカップリングに用いられる反応条件に依存する。制御因子は、赤血球細胞または血小板への取り付けによって固定化された外因性ポリペプチドのカップリングに先立ちカップリング剤を不活性化したくないと所望することである。斯かるカップリング固定化反応は、いくつもの仕方で進めることができる。典型的には、カップリング剤を使用して、外因性ポリペプチドと赤血球細胞または血小板との間に架橋を形成することができる。この場合、カップリング剤は、外因性ポリペプチドとの反応を引き起こし得るカルボキシル基等の官能基を所有するべきである。コンジュゲーションのために外因性ポリペプチドを調製する１つの仕方は、外因性ポリペプチドと反応する混合無水物を形成するための、カップリング剤におけるカルボキシル基の利用を含み、混合無水物を形成することができる活性化因子が使用される。斯かる活性化因子の代表は、クロロギ酸イソブチルまたは他のクロロギ酸エステルであり、これは、５，５’－（ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｐ－クロロ第二水銀安息香酸塩（ＣＭＢ）またはｍ－マレイミド安息香酸（ＭＢＡ）等のカップリング剤により混合無水物を生じる。カップリング剤の混合無水物は、外因性ポリペプチドと反応して反応性誘導体を生じ、次いで反応性誘導体は、赤血球細胞または血小板表面の求核基と反応して、外因性ポリペプチドを固定化することができる。
カルボキシル基等、外因性抗原ポリペプチドにおける官能基は、カルボジイミドおよび同様の活性化因子により活性化することができる。その後、アミノ基等、架橋試薬における官能基は、外因性ポリペプチドにおける活性化された基と反応して、反応性誘導体を形成するであろう。加えて、カップリング剤は、赤血球細胞または血小板表面の適切な求核基と反応して、架橋を形成するであろう第２の反応基を所有するべきである。斯かる反応基の典型は、ヨード酢酸等のアルキル化剤、アクリル酸その他等のαβ不飽和カルボニル化合物、水銀剤、置換されたマレイミドその他等のチオール試薬である。
あるいは、外因性抗原ポリペプチドにおける官能基は、例えば、赤血球細胞または血小板表面の求核剤と直接的に反応することができるように活性化させて、架橋形成化合物の必要をなくすことができる。この目的のため、混合無水物から区別される通り、エノールエステルへの外因性ポリペプチドにおけるカルボキシル基の形成をもたらすウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）試薬Ｋまたは同様の試薬等の活性化因子が使用される。外因性ポリペプチドのエノールエステル誘導体はその後、例えば赤血球細胞または血小板表面の求核基と反応して、抗原ポリペプチドの固定化をもたらし、それにより、改変された除核細胞を作製する。
一部の実施形態では、例えば、外因性ポリペプチドが、除核細胞（例えば、改変された除核細胞）の表面に存在するように、外因性ポリペプチド（例えば、第１および／または第２の外因性ポリペプチド）は、Ｎ末端またはＣ末端融合として、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）等の膜アンカーに連結される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドを提示する赤血球細胞または除核細胞を含むａＡＰＣは、赤血球細胞または除核細胞を、抗原ポリペプチドおよび必要に応じてペイロードと接触させることにより生成され、接触は、Ｂａｎｄ ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン－１、Ｇｌｕｔ－１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒ１ｉ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｌｉ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、ダッフィ（Ｄｕｆｆｙ）／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ－４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ－ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロテリン（ｎｅｕｒｏｔｈｅｌｉｎ）（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）、ドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、シアンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ－１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９またはＨ抗原（ＣＤ１７３）を含む、取り付け部位を使用した赤血球細胞への抗原ポリペプチドのコンジュゲートを含まない。
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドを提示する操作された赤血球細胞または除核細胞を含み、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドは、細胞表面におよび／または外因性抗原提示ポリペプチドに酵素によりコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドを提示し、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドは、外因性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチド）に酵素によりコンジュゲートされる。
特異的な実施形態では、外因性抗原ポリペプチドは、例えば、一級アミン基を還元型チオール基と接続するためのＮＨＳエステル－マレイミドヘテロ二官能性架橋剤等、二官能性架橋薬剤による化学的コンジュゲーションを含むがこれに限定されない、本明細書に提供される様々な化学的および酵素による手段によって、外因性抗原提示ポリペプチドにコンジュゲートすることができる。これらの方法は、例えば、アクセプター配列（例えば、ＬＰＸＴＧ（配列番号６）またはＬＰＸＴＡ（配列番号７））を含有するある１つのポリペプチドを、Ｎ末端ドナー配列（例えば、ＧＧまたはＧＧＧ）を含有するポリペプチドと接続するためのソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応等、酵素による戦略も含み、例えば、その内容がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｗｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０ （４） １４２８－１４３３ ２０１３を参照されたい。ソルターゼ媒介性コンジュゲーション反応に使用することができる追加的なアクセプター配列およびドナー配列、ならびにソルタグ化を利用する方法は、その内容がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． ３８；１１１－１１８に記載されている。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドのＮ末端は、Ｎ末端ドナー配列ＧＧまたはＧＧＧを含む。一部の実施形態では、外因性抗原提示ポリペプチドにおけるＮ末端ドナー配列ＧＧまたはＧＧＧは、ソルターゼ媒介性反応（例えば、ソルターゼＡ媒介性反応）により、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ（配列番号６）またはＬＰＸＴＡ（配列番号７）を含有する外因性抗原ポリペプチドに接続される。
一部の実施形態では、例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １１： １９７７－８８に記載されている通り、外因性抗原ポリペプチドは、ブテラーゼ（Ｂｕｔｅｌａｓｅ）１を使用して外因性抗原提示ポリペプチドにコンジュゲートすることができる。ブテラーゼ１は、Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ由来のリガーゼである（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ａ０Ａ０６０Ｄ９Ｚ７を参照）。ブテラーゼ１媒介性環化は、コンジュゲートされているポリペプチドのうち１つのＣ末端にトリペプチド認識配列Ａｓｘ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ（式中、ＡｓｘはＡｓｐまたはＡｓｎである）を要求する。ブテラーゼ１は、コンジュゲートされている第２のポリペプチドのＮ末端に対し非常に緩い特異性を呈し、第２のポリペプチドのＮ末端は、Ｘ１Ｘ２（式中、Ｘ１は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｉ、Ｌ、ＶまたはＣである）を含む。
外因性抗原提示ポリペプチドに外因性抗原ポリペプチドをコンジュゲートするための本明細書に提供される方法は、例えば、それぞれ抗原および細胞におけるクリックケミストリーハンドル（ｈａｎｄｌｅ）（アジドおよびアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーションと、それに続く外因性抗原ポリペプチドを抗原提示ポリペプチドに化学的に結合させるための環化付加反応等、組合せ方法も含み、例えば、Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２４ （６）， ｐｐ ９３４－９４１ ２０１３を参照されたい。タンパク質のソルターゼ媒介性改変は、両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５４５および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５５４に記載されている。
一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系等の触媒結合形成ポリペプチドを使用して、外因性抗原ポリペプチドを外因性抗原提示ポリペプチドに取り付けることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、操作された赤血球細胞または除核細胞の細胞外表面に含まれ得る。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、外因性抗原提示ポリペプチドのＮ末端に融合され得る。抗原ポリペプチドは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合され得る。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの反応後に、外因性抗原ポリペプチドを外因性抗原提示ポリペプチドに取り付ける共有結合的結合が形成されるであろう。
本明細書に記載されている操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、例えば、クリックケミストリーのための本明細書に記載されているカップリング試薬のうち１つまたは複数を使用して、外因性抗原ポリペプチドを外因性抗原提示ポリペプチドに取り付けて、産生することもできる。一部の実施形態では、例えば、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションおよびフコシル化媒介性コンジュゲーションのためのカップリング試薬を使用して、外因性抗原ポリペプチドを外因性抗原提示ポリペプチドにカップリングすることができ、その後に、例えば、クリックケミストリーのための本明細書に記載されているカップリング試薬のうち１つを使用して、外因性抗原ポリペプチドに結合された抗原提示ポリペプチドの複合体を細胞の表面に取り付けることができる。
特異的な実施形態では、例えば、一級アミン基を還元型チオール基と接続するためのＮＨＳエステル－マレイミドヘテロ二官能性架橋剤等の二官能性架橋薬剤による化学的コンジュゲーションを含むがこれらに限定されない、様々な化学的および酵素による手段によって、本明細書に記載されている外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド）のいずれかを例えば、操作された赤血球細胞または除核細胞の表面にコンジュゲートすることができる。これらの方法は、例えば、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ（配列番号６）またはＬＰＸＴＡ（配列番号７）を含有するある１つのポリペプチドを、Ｎ末端ドナー配列ＧＧＧを含有するポリペプチドと接続するためのソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応等の酵素による戦略も含み、例えば、Ｓｗｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２０１３を参照されたい。本方法は、例えば、それぞれ抗原および細胞におけるクリックケミストリーハンドル（アジドおよびアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーションと、それに続く抗原を細胞に化学的に結合するための環化付加反応等の組合せ方法も含み、例えば、Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３を参照されたい。タンパク質のソルターゼ媒介性改変は、両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５４５および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５５４に記載されている。
一部の実施形態では、タンパク質は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識エレメント、小分子、脂質、リンカー、標識、エピトープ、抗原、治療剤、毒素、放射性同位体、粒子または反応性化学基を含む部分、例えば、クリックケミストリーハンドルを含むソルターゼ基質のコンジュゲーションによって改変される。
所望に応じて、触媒結合形成ポリペプチドドメインは、例えば、赤血球細胞または血小板の表面またはその中で、細胞内または細胞外のいずれかに発現させることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８に由来するものを含む、トランスペプチダーゼ、ソルターゼおよびイソペプチダーゼを含む、多くの触媒結合形成ポリペプチドが存在する。
Ｓｐｙ０１２８の自己触媒イソペプチド結合形成サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）の分割が、互いに対して特異性を有する触媒活性を保持する２つの別個のポリペプチドをもたらすことが実証された。この系におけるポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと命名される。混合後に、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ＳｐｙＴａｇにおけるＡｓｐ１１７およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにおけるＬｙｓ３１の間にイソペプチド結合形成を起こす（Ｚａｋｅｒｉ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｔｈ， ＪＡＣＳ ２０１０， １３２：４５２６）。反応は、細胞環境と適合性であり、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに対して高度に特異的である（Ｚａｋｅｒｉ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．； Ｆｉｅｒｅｒ， Ｊ． Ｏ．； Ｃｅｌｉｋ， Ｅ．； Ｃｈｉｔｔｏｃｋ， Ｅ． Ｃ．； Ｓｃｈｗａｒｚ－Ｌｉｎｅｋ， Ｕ．； Ｍｏｙ， Ｖ． Ｔ．； Ｈｏｗａｒｔｈ， Ｍ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０１２， １０９， Ｅ６９０－Ｅ６９７）。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、エラスチン様タンパク質における翻訳後トポロジカル改変を方向付けることが示された。例えば、Ｎ末端におけるＳｐｙＴａｇおよびＣ末端におけるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの設置は、環状エラスチン様タンパク質の形成を方向付ける（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２０１３）。
構成成分ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、相互変換することができ、分子ＡがＳｐｙＴａｇに融合され、分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合された系が、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合され、分子ＢがＳｐｙＴａｇに融合された系と機能的に同等である、というような具合である。本文書の目的のため、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが使用される場合、その位置に相補的分子が置換され得ることを理解されたい。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系等の触媒結合形成ポリペプチドを使用して、外因性ポリペプチド（例えば、抗原ポリペプチド）を、例えば、操作された赤血球細胞等の赤血球細胞の表面に取り付けて、ａＡＰＣを生成することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、赤血球細胞の細胞外表面に発現させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、１型もしくは３型膜貫通タンパク質、例えば、グリコホリンＡのＮ末端に融合する、２型膜貫通タンパク質、例えば、ＫｅｌｌのＣ末端に融合する、複数回貫通型膜貫通タンパク質、例えば、Ｂａｎｄ ３の細胞外末端にもしくは細胞外ループにおいてインフレームで挿入する、ＧＰＩアクセプターポリペプチド、例えば、ＣＤ５５もしくはＣＤ５９に融合する、脂質鎖アンカーポリペプチドに融合する、または末梢膜タンパク質に融合することができる。ＳｐｙＴａｇ融合をコードする核酸配列は、ａＡＰＣ内で発現させることができる。抗原ポリペプチドは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合を発現する同じ赤血球細胞から発現および分泌させることができる。あるいは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合をコードする核酸配列は、外因性に、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳動物または無細胞産生系において産生することができる。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの反応後に、抗原ポリペプチドを赤血球細胞の表面に取り付けて、ａＡＰＣを形成する共有結合的結合が形成されるであろう。抗原ポリペプチド融合を含む操作された赤血球細胞または除核細胞は、コンジュゲートされた抗原ポリペプチドを含むａＡＰＣの例である。
一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、操作された赤血球細胞または除核細胞において、Ｇａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端への融合として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、外因性抗原提示ポリペプチド、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチド、サイトカインおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、同じ赤血球細胞において、Ｇａｔａｌプロモーターの制御下で発現させることができる。両方の融合ポリペプチドの発現後に、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、赤血球細胞表面および外因性ポリペプチドの間に共有結合的結合を形成するであろう。
一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、赤血球細胞において、Ｇａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端への融合として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性ポリペプチド（例えば、外因性抗原ポリペプチド、サイトカイン、外因性共刺激ポリペプチド、外因性共阻害ポリペプチドおよび外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、適した哺乳動物細胞発現系、例えば、ＨＥＫ２９３細胞において発現させることができる。赤血球細胞表面におけるＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドの発現後に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドを細胞と接触させることができる。適した反応条件下で、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、赤血球細胞表面および外因性ポリペプチドの間に共有結合的結合を形成するであろう。抗原ポリペプチド融合を含む操作された赤血球細胞または除核細胞は、コンジュゲートされた抗原ポリペプチドを含むａＡＰＣの例である。
ＩＶ．人工抗原提示細胞を使用する方法
ＩＶ．人工抗原提示細胞を使用する方法
本開示は、本明細書に記載されているａＡＰＣを使用する様々な方法を企図する。当業者には理解できるであろうが、本明細書に提供される開示に基づき、ａＡＰＣの投与の用量およびタイミングは、本明細書に記載されている適用毎に特異的に調整することができる。より具体的には、ある１つのａＡＰＣまたはいくつかのａＡＰＣの表面に含まれるある特定の分子を使用して免疫モジュレーションを提供することが望ましい場合、本明細書に提供される教示および当技術分野で利用できる知識を備えた当業者は、所望のアプローチを容易に決定することができる。
一態様では、本開示は、免疫細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、細胞を、免疫細胞、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を活性化するように操作されたａＡＰＣと接触させ、それにより、免疫細胞を活性化するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドと、外因性抗原ポリペプチド、例えば、表１に列挙されるものから選択されるポリペプチド、例えば、ＨＳＰ６０ペプチドまたはＨＳＰ６０に由来するペプチド（例えば、ＨＳＰ６０のリーダー配列）とを含む。
別の態様では、本開示は、免疫細胞を抑制する方法であって、免疫細胞を、免疫細胞活性を抑制するように操作されたａＡＰＣと接触させ、それにより、免疫細胞を抑制するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドと、外因性抗原ポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドと、外因性抗原ポリペプチドとを含む。
本開示は、公知の共刺激分子を発現する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の増殖を特異的に誘導するための方法も包含する。本方法は、例えば、公知の共刺激分子を発現する少なくとも１つの免疫細胞を含む免疫細胞の集団を、共刺激分子のリガンドを提示するように操作されたａＡＰＣと接触させるステップを含む。本明細書の他の箇所に開示されている通り、ａＡＰＣが、免疫細胞表面の共刺激分子と特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドを発現する場合、共刺激分子とその同族共刺激リガンドとの結合は、免疫細胞の増殖を誘導する。よって、細胞の集団から細胞を先ず精製する必要もなく、目的の免疫細胞は、増殖するように誘導される。また、細胞をａＡＰＣと接触させることにより、増殖、および成長細胞の検出が誘導され、それにより、目的の共刺激分子を発現している免疫細胞が、試料中に存在していたことが同定されるので、本方法は、集団におけるいずれかの細胞が、目的の特定の共刺激分子を発現しているか決定するための迅速なアッセイを提供する。このようにして、細胞の表面における少なくとも１つの共刺激分子が公知である場合、目的のいずれかの免疫細胞を増大させ、単離することができる。
本開示は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、集団サブセットを特異的に増大させるための方法も含む。より詳細には、本方法は、目的のサブセットの少なくとも１つの免疫細胞を含む免疫細胞の集団を、当該免疫細胞を増大させることができるａＡＰＣと、または免疫細胞の表面における同族共刺激分子と特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドを発現する少なくとも１つのａＡＰＣと接触させるステップを含む。共刺激分子とその結合パートナー共刺激リガンドとの結合は、免疫細胞の増殖を誘導し、それにより、免疫細胞集団サブセット、例えば、Ｔ細胞集団サブセットを特異的に増大させる。当業者であれば、本明細書に提供される開示に基づき、Ｔ細胞サブセットが、Ｔヘルパー（ＴＨ１およびＴＨ２）ＣＤ４発現、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（Ｔｃ１またはＴｃ２）、Ｔ制御性（ＴＲｅｇ）、ＴＣ／Ｓ、ナイーブ、メモリー、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよびγΔＴ細胞を含むことを理解するであろう。一部の実施形態では、免疫細胞集団は、Ｔ細胞集団、例えば、Ｔ制御性細胞集団である。したがって、特定の免疫細胞サブセットが濃縮された細胞集団は、本開示の方法を使用して容易に産生することができる。
ある特定の実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、約１００～約１，０００，０００倍の間、または約１，０００～約１，０００，０００倍の間、例えば、１，０００～約１００，０００倍の間に増大される。
本開示は、免疫細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する、共刺激リガンドまたはその組合せを同定するための方法も含む。手短に説明すると、本方法は、免疫細胞の集団を、少なくとも１つの共刺激リガンドを提示するａＡＰＣと接触させるステップ、およびａＡＰＣと接触された免疫細胞サブセットの増殖のレベルを、ａＡＰＣと接触されていないそれ以外の点では同一の免疫細胞サブセットの増殖のレベルと比較するステップを含む。ａＡＰＣと接触されなかったそれ以外の点では同一の免疫細胞サブセットの増殖のレベルと比較して、ａＡＰＣと接触された免疫細胞サブセットの増殖のレベルがより大きいことは、共刺激リガンドが、当該免疫細胞が属する免疫細胞サブセットの活性化を特異的に誘導することの指標である。
いずれの因子（複数可）が、当該免疫細胞サブセットを増大させるか以前に分かっていない場合、本方法は、免疫細胞サブセットを特異的に増大させる共刺激リガンドの同定を可能にする。当業者であれば、スクリーニングの数を最小化するために、アッセイの数を低減することができるように、可能な限り多くの、共刺激リガンドをコードする核酸を形質導入することが好ましいことを認めるであろう。さらに、本方法は、様々なタンパク質（例えば、刺激リガンド、共刺激リガンド、抗原、サイトカインその他）を組み合わせることにより、いずれの因子組合せ（複数可）が、免疫細胞サブセットを増大させるために最も有効なａＡＰＣまたはａＡＰＣの組合せとなるか評価することを可能にする。このようにして、免疫細胞サブセット毎に成長および活性化のための様々な要件を試験することができる。さらに、免疫細胞増大を評定するために、ＣＦＳＥ染色を使用することができる。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、自己免疫疾患、感染性疾患、例えば、ウイルス感染性疾患、例えば、ヘルペス間質性角膜炎、エプスタイン・バーウイルスもしくはＨＩＶ、またはアレルギー性疾患等の疾患を患う対象由来の）と混合される。細胞増大の初速度を比較するために、細胞を、ＣＦＳＥ染色に付して、各ａＡＰＣが、どの程度良好に全免疫細胞の増殖を誘導したかを決定する。ＣＦＳＥ染色は、はるかにより定量的なエンドポイントを提供し、増大された細胞の同時表現型決定を可能にする。刺激後毎日、各培養物から細胞のアリコートを取り出し、フローサイトメトリーによって解析する。ＣＦＳＥ染色は、細胞に高度に蛍光を発生させる。細胞分裂後に蛍光は半減するため、細胞がより多くの回数分裂するにつれて、その蛍光は弱くなる。免疫細胞、例えば、Ｔ細胞増殖を誘導する各ａＡＰＣの能力は、１回、２回、３回等々分裂した細胞の数を測定することにより定量化される。特定の時点で最も多くの回数の細胞分裂を誘導するａＡＰＣは、最も強力なエキスパンダ（ｅｘｐａｎｄｅｒ）として考慮される。
これらのａＡＰＣが、どの程度良好に免疫細胞の長期成長を促進するか決定するために、細胞成長曲線を作成する。これらの実験は、ＣＦＳＥ実験として厳密にセットアップされるが、ＣＦＳＥは使用されない。培養２～３日毎に、免疫細胞は、それぞれの培養物から取り出され、存在する細胞の数および細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用して計数される。平均細胞体積は、いつ細胞を再刺激するべきかについての最良の予測因子である。一般に、免疫細胞は、適切に刺激されると、その細胞体積を３倍にする。この体積が、初期芽球の約半分超に低減される場合、対数線形増大を維持するように免疫細胞を再刺激する必要がある場合がある（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９－１９４３；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５９２１－５９３０）。各ａＡＰＣが、２０倍の集団倍加を誘導するのに要する時間が計算される。このレベルの免疫細胞増大を誘導する各ａＡＰＣの相対的な差は、臨床試験へと進むためにそれに基づいて特定のａＡＰＣが使用される重要な判断基準である。
各ａＡＰＣによって増大された細胞の表現型を特徴付けて、特定のサブセットが優先的に増大されているか決定する。各再刺激に先立ち、増大している免疫細胞集団の表現型解析を行って、Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ． （２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ８， ３７９－３８５）によって提唱されたＣＤ２７およびＣＤ２８定義、ならびにＳａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９， Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７０８－７１２）によって提唱されたＣＣＲ７定義を使用して、増大された免疫細胞の分化状態を定義する。パーフォリンおよびグランザイムＢ細胞内染色を使用して、細胞溶解潜在力を推定するための肉眼的測定（ｇｒｏｓｓ ｍｅａｓｕｒｅ）を行う。
一態様では、本方法は、先ず免疫細胞サブセットの表面における共刺激分子を特徴付けるのではなく、様々なａＡＰＣを免疫細胞サブセットと接触させるステップを含む。また、本開示は、ａＡＰＣを細胞と接触させるステップに先立ち、免疫細胞サブセットの表面に存在する共刺激分子（複数可）が試験される、方法を包含する。よって、本開示は、様々な免疫細胞サブセット、例えば、Ｔ細胞サブセットのための成長要件を決定するための新規アッセイを提供する。
別の態様では、本開示は、モジュレートまたは変更された免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、対象の免疫細胞を、本明細書に記載されているａＡＰＣと接触させ流ステップを含み、それにより、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する、方法を特色とする。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏである。
別の態様では、本開示は、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、ａ）対象のＨＬＡ状況を決定するステップ、ｂ）対象と免疫学的に適合性である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップであって、ａＡＰＣが、第１の外因性抗原ポリペプチドを発現する操作された赤血球細胞である、ステップ、およびｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップを含み、それにより、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する、方法を特色とする。
別の態様では、本開示は、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、ａ）対象における抗原の発現プロファイルを決定するステップ、ｂ）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップであって、ａＡＰＣが、外因性抗原提示ポリペプチドおよび第１の外因性抗原ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞または除核細胞である、ステップ、ならびにｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップを含み、それにより、モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する、方法を特色とする。
さらなる態様では、本開示は、細胞表面部分ライゲーションにより、免疫細胞の集団を増大させるための方法も提供する。加えて、対象から免疫細胞の集団を誘導して、研究目的に十分な数となるまで長期にわたり指数関数的に迅速に増殖させる方法であって、対象から免疫細胞の集団を単離し、免疫細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、免疫細胞に一次活性化シグナルをもたらす少なくとも１つの外因性ポリペプチドと接触させることにより、免疫細胞の集団を活性化させるステップ、および一次活性化シグナルを受けた免疫細胞が迅速に増殖するように刺激されるように、共刺激シグナルをもたらす少なくとも１つの第２の外因性ポリペプチドで、活性化された免疫細胞を刺激するステップを含む方法を提供することを目標とする。特に、対象がヒトである場合の斯かる方法であって、活性化された免疫細胞を使用して、対象における抗原を同定するステップをさらに含む方法を提供することを目標とする。さらに、対象が、疾患または状態に感染し、それらに関する少なくとも１つの抗原を有する場合、提供される方法は、活性化された免疫細胞を使用して、少なくとも１つの抗原を同定するステップをさらに含む。抗原は、例えばであって、限定することなく、腫瘍抗原、自己免疫疾患または感染性疾患もしくは病原体に関する抗原を含むことができる。本方法は、研究目的のための、または少なくとも１つの抗原に基づきワクチンを開発するための標的分子として、少なくとも１つの抗原をスクリーニングするステップをさらに含む。
外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、提示する）、操作された除核赤血球細胞および除核細胞を投与する方法は、例えば、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０７３５８７およびＷＯ２０１５／１５３１０２に記載されている。
本明細書に記載されている方法は、本明細書に記載されている複数の操作された除核赤血球細胞または除核細胞を含む医薬組成物を調製するステップを含むことができる。
免疫細胞応答のモジュレーションから利益を得るであろう状態の処置
免疫細胞応答のモジュレーションから利益を得るであろう状態の処置
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、１、２、３、４、５または６ヶ月毎に患者に投与される。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）の用量は、約１×１０９～２×１０９、２×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～５×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～２×１０１２、２×１０１２～５×１０１２または５×１０１２～１×１０１３個の細胞を含む。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、２週間～１年間、例えば、１ヶ月間～１年間またはそれよりも長い、例えば、少なくとも２週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間の期間にわたり、患者の血流における投与された赤血球細胞の機能の維持に十分な投薬レジメン（投与の用量および周期性）で患者に投与される。
一部の実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、２用量またはそれよりも多い用量（例えば、２、３、４またはそれよりも多い用量）で患者に投与される。さらなる実施形態では、操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）は、２用量またはそれよりも多い用量で患者に投与され、第２の用量は、Ｔ細胞増殖がピークに達すると決定されるときに、第１の用量の後の時点で投与される。ピークＴ細胞増殖は、当業者にとって公知の方法を使用して決定することができる。例えば、ピークＴ細胞増殖は、増殖するＴ細胞による３Ｈ－チミジン取込みによって、または蛍光色素５，６－カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で増殖するＴ細胞を標識することによって決定することができる。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されている疾患または状態を処置する方法であって、その必要がある対象に、本明細書に記載されている組成物、例えば、本明細書に記載されているａＡＰＣを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、炎症性疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、感染性疾患である。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されている疾患または状態、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患または感染性疾患を処置するための、本明細書に記載されているａＡＰＣの使用を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されている疾患または状態、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患または感染性疾患を処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載されているａＡＰＣの使用を提供する。
自己免疫疾患
自己免疫疾患
過去二十年間にわたり、様々な自己免疫疾患の処置において相当な進歩が為され、多くの患者が、結果としてクオリティ・オブ・ライフにおける改善を享受している。その成功にもかかわらず、自己免疫疾患に対する現在の治療アプローチは、全般的または特異的のいずれかで免疫抑制性であり、ＪＡＫ阻害剤、抗ＴＮＦ抗体および抗ＣＤ２０標的化抗体と同様に、日和見感染および血液学的ながんの増加したリスクに患者を曝露する。症例の最大で３分の１において、自己免疫疾患を有する患者は、処置に応答することができず、大部分の応答患者は、最終的に時間と共に応答を失う。
大部分の自己免疫疾患の引き金は、依然として不明であるが、臨床疾患は、自身の細胞に対するトレランスの損失の結果であることが一般に理解される。疾患の受け入れられたモデルは、Ｔ細胞媒介性免疫抑制の崩壊をもたらす、環境事象によって引き金を引かれた遺伝的感受性を仮定する。原則として、末梢性トレランスの回復は、患者に完全または部分的な治癒をもたらすべきである。
末梢性トレランス回復に対する様々な競合的アプローチが何年にもわたって調査されてきた。これらのアプローチは、免疫抑制ありまたはなしのタンパク質またはペプチドの経口投与および直接的注射、ペプチドを有するナノ粒子の作製、ならびに操作された制御性Ｔ細胞の養子移入を含む。現在までのところ、これらのアプローチは、後期臨床試験における成功を立証していないが、この分野は、進歩し続けている。ペプチドおよびナノ粒子の直接的投与は、細胞間シグナル伝達の有効性を限定する、体内分布、安定性、提示および配向性の課題に悩まされる。現在まで、養子移入アプローチは、全て自家であり、他の細胞療法の適用を限定する、同じ取り扱いおよびスケーラビリティの問題のいくつかによって妨害される。
よって、ある特定の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、自己免疫疾患を処置する新規のかつ改善された方法を提供する。自己免疫疾患を処置するために提供された方法は、例えば、外因性抗原ポリペプチドをロードされた抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの有効な提示、および循環におけるａＡＰＣの極めて長い半減期、よって、適切に提示された抗原への延長された曝露の提供を含む、多数の利点を有する。
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、細胞表面にＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドのいずれかを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むように遺伝子操作された赤血球細胞（例えば、除核赤血球細胞）を含むａＡＰＣを提供する。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドに結合されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含み、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドのうち１つは、表１に示す抗原ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドのうち１つは、ＨＳＰ６０自己抗原またはその部分、例えば、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドに結合されたＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含み、１つまたは複数の外因性抗原ポリペプチドのうち１つは、アミノ酸配列モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有するペプチドを含む。
別の態様では、ａＡＰＣは、Ｔ制御性細胞を刺激し、それにより、より寛容原性な状態に戻るように免疫系を偏向させるように設計される。よって、一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に記載されている少なくとも１つの共刺激ポリペプチドをさらに含む。本態様では、好まれる実施形態では、少なくとも１つの外因性共刺激ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増大させ、例えば、本明細書に記載されている外因性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドである。
さらに別の態様では、ａＡＰＣは、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させかつ刺激するように設計される。本態様では、自己免疫疾患は、好ましくは、Ｔｆｈ、Ｔｈ１およびＴｈ１７ ＣＤ４細胞によってモジュレートされたまたは引き金を引かれた自己免疫疾患である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に記載されている少なくとも１つの外因性共刺激ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの外因性共刺激ポリペプチドは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させる。
一部の態様では、本開示は、自己免疫疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載されている有効な数の赤血球細胞を対象に投与するステップを含み、それにより、自己免疫疾患を処置する、方法を提供する。斯かる方法において、自己免疫疾患の処置に有用なａＡＰＣは、外因性抗原提示ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドを含み、抗原ポリペプチドは、表１に列挙されている抗原ポリペプチド、もしくはその抗原性部分、またはアミノ酸配列モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を有するペプチドであり得る。
免疫活性化の疾患は、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病または他の特発性炎症性腸疾患等の炎症性疾患も含む。免疫活性化の疾患は、例えば、喘息、ピーナッツアレルギー、甲殻類アレルギー、花粉アレルギー、ミルクプロテインアレルギー、虫刺されアレルギーおよびラテックスアレルギー、動物鱗屑アレルギー、クログルミおよびペルシャグルミ（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｗａｌｎｕｔ）アレルギー、ブラジルナッツアレルギー、カシューナッツアレルギー、クリアレルギー、イエダニアレルギー、卵アレルギー、魚類アレルギー、ヘーゼルナッツアレルギー、カビアレルギー、花粉アレルギー、イネ科草本（ｇｒａｓｓ）アレルギー、甲殻類アレルギー、ダイズアレルギー、木の実アレルギーならびにコムギアレルギー、またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞によって媒介されるアレルギー性疾患等のアレルギー性疾患も含む。
免疫活性化の疾患は、例えば、血友病Ａにおける凝固因子ＶＩＩＩ、血友病Ｂにおける凝固因子ＩＸ、関節リウマチおよび他の炎症性疾患における抗腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）抗体、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、酵素補充療法に使用されるいずれかの組換えタンパク質、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるアスパラギナーゼ等の治療タンパク質の有効性を減らす、原発性状態を処置するために投与された治療タンパク質に応答した免疫活性化も含む。
一部の実施形態では、患者は、免疫系が、内因性分子を攻撃し、炎症を誘導し、組織を損傷し、自己免疫性または自己抗体性（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）疾患または状態の症状を他の仕方で引き起こすような、患者の免疫系が、内因性（自己）分子、例えば、タンパク質抗原に対して活性となる、自己免疫疾患もしくは状態または自己抗体媒介性疾患もしくは状態を患う。免疫応答は、内因性分子に結合する抗体によって駆動され得る、または内因性分子を発現する細胞を攻撃する過活動性Ｔ細胞によって駆動され得る、または制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞もしくはＢ細胞等の他の免疫細胞によって駆動され得る。これらの実施形態では、内因性（自己）分子に対応する抗原性タンパク質またはその断片は、本明細書に記載されている１つまたは複数の外因性ポリペプチドを提示する赤血球細胞を含むａＡＰＣ表面に発現され得る。ａＡＰＣは、疾患または状態を患う患者に１回またはそれよりも多く投与される場合、免疫系の活性化をもはや誘導しなくなるような、抗原性タンパク質に対するトレランスの誘導に十分となり、よって、根底にある疾患または状態の症状を処置または改善するであろう。ある特定の実施形態では、ａＡＰＣは、Ｔ制御性細胞の刺激に使用され、それにより、内因性（自己）分子に対してより寛容原性な状態に戻るように免疫系を偏向させるであろう。
他の実施形態では、患者は、アレルギー性疾患、例えば、動物鱗屑、クログルミ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、イエダニ、卵、ペルシャグルミ、魚類、ヘーゼルナッツ、昆虫毒、ラテックス、ミルク、カビ、ピーナッツ、花粉、イネ科草本、甲殻類、ダイズ、木の実またはコムギに対するアレルギーを患う。アレルギーを患う患者は、例えば、食事、皮膚接触、注射または環境曝露を介したアレルゲンの抗原性断片との接触後に、免疫応答を開始することができる。免疫応答には、ＩｇＥ抗体、感作されたマスト細胞、脱顆粒、ヒスタミン放出およびアナフィラキシー、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、Ｔ制御性細胞、ＮＫ細胞、好中球およびＮＫＴ細胞等の正準の免疫細胞が関与し得る。アレルギー性反応は、不快感を引き起こし得る、または死に至るほど十分に重度となり得、よって、病人ならびにその家族および介護者の側が、常に警戒することが必要となる。これらの実施形態では、抗原性タンパク質またはその断片は、本開示のａＡＰＣの赤血球細胞表面に提示され得る。これらの細胞の集団は、アレルギー性疾患または状態を患う患者に１回またはそれよりも多く投与される場合、曝露後に免疫系の活性化をもはや誘導しなくなるような、抗原性タンパク質に対するトレランスの誘導に十分となり、よって、根底にあるアレルギー性疾患または状態の症状を処置または改善するであろう。
一部の実施形態では、患者は、感染性疾患、例えば、ウイルス感染性疾患を患う。
対象
対象
本明細書に記載されている方法は、これらの方法の利益を経験し得るいずれかの対象による使用を意図する。よって、「対象」、「患者」および「個体」（互換的に使用される）は、ヒトと共に、非ヒト対象、特に、飼い慣らされた動物を含む。
一部の実施形態では、対象および／または動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはサル、チンパンジーもしくはヒヒ等の非ヒト霊長類である。他の実施形態では、対象および／または動物は、非哺乳動物である。一部の実施形態では、対象および／または動物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、小児のヒトである。他の実施形態では、ヒトは、成体のヒトである。他の実施形態では、ヒトは、老齢期のヒトである。他の実施形態では、ヒトは、患者と称することができる。
ある特定の実施形態では、ヒトは、約０月齢～約６月齢、約６～約１２月齢、約６～約１８月齢、約１８～約３６月齢、約１～約５歳、約５～約１０歳、約１０～約１５歳、約１５～約２０歳、約２０～約２５歳、約２５～約３０歳、約３０～約３５歳、約３５～約４０歳、約４０～約４５歳、約４５～約５０歳、約５０～約５５歳、約５５～約６０歳、約６０～約６５歳、約６５～約７０歳、約７０～約７５歳、約７５～約８０歳、約８０～約８５歳、約８５～約９０歳、約９０～約９５歳または約９５～約１００歳の範囲内の年齢である。
他の実施形態では、対象は、非ヒト動物であり、したがって、本開示は、獣医学用途に関係する。特異的な実施形態では、非ヒト動物は、家で飼うペットである。別の特異的な実施形態では、非ヒト動物は、家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、化学療法を受けることができないヒトがん患者であり、例えば、患者は、化学療法に対して無応答性である、または不健康過ぎて、化学療法に適した治療域を持たない（例えば、多過ぎる用量またはレジメン規制性の副作用を経験する）。ある特定の実施形態では、対象は、進行型および／または転移性疾患を有するヒトがん患者である。
一部の実施形態では、対象は、本開示の１つまたは複数の外因性ポリペプチド、例えば、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）を含むａＡＰＣによる処置のために選択される。一部の実施形態では、対象は、本開示の１つまたは複数の外因性ポリペプチド、例えば、外因性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－ＥポリペプチドまたはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された赤血球細胞（例えば、操作された除核赤血球細胞）または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）を含むａＡＰＣによる自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患または感染性疾患の処置のために選択される。
Ｖ．医薬組成物
Ｖ．医薬組成物
本開示は、活性成分として本開示のａＡＰＣを含む医薬組成物の調製および使用を包含する。斯かる医薬組成物は、活性成分単独で、対象への投与に適した形態の少なくとも１つの活性成分（例えば、有効用量のａＡＰＣ）の組合せとしてからなることができる、あるいは医薬組成物は、活性成分と、１つもしくは複数の薬学的に許容される担体、１つもしくは複数の追加的な（活性および／または不活性）成分、またはこれらのいくつかの組合せとを含むことができる。
一部の実施形態では、本開示は、複数の本明細書に記載されているａＡＰＣと、医薬品担体とを含む医薬組成物を特色とする。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているａＡＰＣの集団と、医薬品担体とを含む医薬組成物を特色とする。本明細書の他の箇所に記載されているいずれか単一のａＡＰＣ、複数のａＡＰＣ、またはａＡＰＣの集団が、本明細書に記載されている医薬組成物中に存在し得ることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、操作されたまたは改変された赤血球細胞、および操作されていないまたは改変されていない赤血球細胞を含む。例えば、ａＡＰＣの単一の単位用量は、様々な実施形態では、約、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の操作された赤血球細胞または改変された赤血球細胞（ｅｌｌｓ）を含むことができ、組成物中の残りの赤血球細胞は、操作されていないまたは改変されていない。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、有核赤血球細胞と共に操作された除核赤血球細胞または除核細胞（例えば、改変された除核細胞）を含むａＡＰＣを含む。例えば、操作された赤血球細胞（例えば、除核および有核赤血球細胞）の単一の単位用量は、様々な実施形態では、約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の除核赤血球細胞を含むことができ、組成物中の残りの赤血球細胞は、有核である。
本開示の医薬組成物は、処置される（または予防される）べき疾患に適切な様式で投与することができる。投与の含量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度等の因子によって決定されるであろうが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定することができる。
医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、植え込みまたは移植による様式を含むいずれか簡便な様式で実行することができる。本開示の組成物は、患者に皮下に、皮内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与することができる。医薬組成物は、腫瘍またはリンパ節へと直接的に注射することができる。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合わせることができ、組み合わせた後に、対象への活性成分の投与に使用することができる、化学的組成物を意味する。
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知のまたは今後開発される、いずれかの方法によって調製することができる。一般に、斯かる調製方法は、活性成分を、担体または１つもしくは複数の他のアクセサリー成分と会合させ、次いで、必要な場合または望ましい場合、所望の単一または複数用量単位へと製品を成形または包装するステップを含む。
本明細書に提供される医薬組成物の記載は主に、ヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物を対象にするが、当業者であれば、斯かる組成物が一般に、あらゆる種類の動物への投与に適することが理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は、十分に理解されており、当業者である獣医学の薬理学者であれば、行うとしても単に通常の実験法により、斯かる改変を設計および実行することができる。本開示の医薬組成物の投与が企図される対象は、ヒトおよび他の霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌ等の商業的に関連性がある哺乳動物を含む哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウ等の商業的に関連性がある鳥類を含む鳥類、養殖魚類および水族館魚類を含む魚類、ならびに養殖甲殻類等の甲殻生物（ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ）を含むがこれらに限定されない。
本開示の方法において有用な医薬組成物は、経口、直腸、腟、非経口的、外用、肺、鼻腔内、病巣内、頬側、眼、静脈内、臓器内または別の投与経路に適した製剤において調製、包装または販売することができる。他の企図される製剤は、計画された（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再シール形成された（ｒｅｓｅａｌｅｄ）赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。
本開示の医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、または複数の単一の単位用量として調製、包装または販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の別々の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、または斯かる投薬量の例えば２分の１もしくは３分の１等、斯かる投薬量の簡便な分数に等しい。
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体およびいずれか追加的な成分の相対量は、処置されている対象の身元、サイズおよび状態に応じて、さらには、組成物が投与されるべき経路に応じて変動するであろう。例として、組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含むことができる。
活性成分に加えて、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の追加的な薬学的に活性がある薬剤をさらに含むことができる。特に企図される追加的な薬剤は、制吐薬、ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャー等のスカベンジャー、ならびにＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン－２、インターフェロン、サイトカインその他を含む。
本開示の医薬組成物の制御放出または徐放製剤は、従来の技術を使用して作製することができる。
本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口的投与」は、対象の組織の物理的突破によって特徴付けられるいずれかの投与経路、および組織における突破による医薬組成物の投与を含む。よって、非経口的投与は、組成物の注射による、外科的切開を介した組成物の適用による、組織浸透性非外科的創傷を介した組成物の適用その他による、医薬組成物の投与を含むがこれらに限定されない。特に、非経口的投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射および腎臓透析注入技法を含むがこれらに限定されないことが企図される。
非経口的投与に適した医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張性生理食塩水等、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。斯かる製剤は、ボーラス投与または継続的投与に適した形態で調製、包装または販売することができる。注射用製剤は、保存料を含有するアンプル内または複数用量容器内等、単位剤形で調製、包装または販売することができる。非経口的投与のための製剤は、油性または水性媒体における懸濁液、溶液、エマルション、ペースト、および植え込み型徐放または生分解性製剤を含むがこれらに限定されない。斯かる製剤は、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加的な成分をさらに含むことができる。
医薬組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製、包装または販売することができる。この懸濁液または溶液は、公知技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載されている分散剤、湿潤剤または懸濁剤等の追加的な成分を含むことができる。斯かる滅菌注射用製剤は、例えば、水または１，３－ブタンジオール等の無毒性非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容される希釈剤および溶媒は、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノまたはジ－グリセリド等の固定油を含むがこれらに限定されない。有用な他の非経口的に投与可能な製剤は、微結晶性形態で、リポソーム調製物中にまたは生分解性ポリマー系の構成成分として活性成分を含む製剤を含む。徐放または植え込みのための組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩等、薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含むことができる。
本開示のａＡＰＣおよび／またはａＡＰＣを使用して増大されたＴ細胞は、動物、好ましくは、ヒトに投与することができる。本開示のａＡＰＣを使用して増大されたＴ細胞が投与される場合、投与される細胞の量は、約百万個の細胞～約３千億個に及び得る。ａＡＰＣそれ自体は、それにより増大されたＴ細胞ありまたはなしのいずれかで投与される場合、約１００，０００個～約十億個の細胞に及ぶ量で投与することができ、細胞は、その必要がある動物、好ましくは、ヒト患者に注入される。投与される的確な投薬量は、動物の種類および処置されている疾患状態の種類、動物の年齢および投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の数の因子に応じて変動するであろう。
ａＡＰＣは、毎日数回もの高頻度で動物に投与することができる、あるいは１日に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回等、より低頻度で、あるいは数ヶ月毎に１回もしくはさらには１年に１回またはそれ未満等、さらにより低頻度で投与することができる。用量の頻度は、当業者には容易に明らかであり、処置されている疾患の種類および重症度、動物の種類および年齢等が挙げられるがこれらに限定されない、任意の数の因子に依存するであろう。
ａＡＰＣ（またはそれにより増大された細胞）は、様々な他の化合物（他の多くのものの中でもとりわけ、サイトカイン、化学療法薬および／または抗ウイルス薬）と同時投与することができる。あるいは、化合物（複数可）は、ａＡＰＣ（またはそれにより増大された細胞）に１時間、１日、１週間、１ヶ月もしくはさらにより長く先立って、またはそのいずれかの並べ替えで投与することができる。さらに、化合物（複数可）は、ａＡＰＣ（またはそれにより増大された細胞）の投与の１時間、１日、１週間もしくはさらにより長く後に、またはそのいずれかの並べ替えで投与することができる。頻度および投与レジメンは、当業者には容易に明らかとなり、処置されている疾患の種類および重症度、動物の年齢および健康状態、投与されている化合物（単数または複数）がどれか、様々な化合物およびａＡＰＣ（またはそれにより増大された細胞）の投与経路、その他等が挙げられるがこれらに限定されない、任意の数の因子に依存するであろう。
さらに、当業者によって、本明細書に提供される開示に基づき、ａＡＰＣが、哺乳動物に投与されるべきである場合、細胞は、「成長なし状態」となるように処置される；すなわち、細胞は、哺乳動物に投与されると、分裂することができないことが認められるであろう。本明細書の他の箇所に開示されている通り、細胞に放射線照射して、哺乳動物に投与されたら成長または分裂できないようにすることができる。特にヒトに投与されるべき細胞を成長できないようにするための、ハプテン化（ｈａｐｔｅｎｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、ジニトロフェニルおよび他の化合物を使用した）を含む他の方法が、当技術分野で公知であり、これらの方法は、本明細書ではこれ以上記述されない。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで分裂できないようにしたａＡＰＣの投与の安全性は、本明細書に記述されている分子のいくつかをコードするプラスミドベクターをトランスフェクトしたａＡＰＣを使用した第Ｉ相臨床試験において確立された。
併用療法
併用療法
一部の実施形態では、本開示は、追加的な薬剤を対象に投与するステップをさらに含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、同時投与および／または同時製剤化（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に関係する。
一部の実施形態では、ａＡＰＣの投与は、別の薬剤と同時投与された場合に相乗作用し、斯かる薬剤が単独療法として使用される場合に一般的に用いられる用量よりも低い用量で投与される。
上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、赤血球細胞は、除核赤血球細胞である。上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、赤血球細胞は、有核赤血球細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、複数の本明細書に記載されている操作された赤血球細胞と、医薬品担体とを含む医薬組成物を特色とする。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている操作された赤血球細胞の集団と、医薬品担体とを含む医薬組成物を特色とする。本明細書の他の箇所に記載されているいずれか単一の操作された赤血球細胞、複数の操作された赤血球細胞、または操作された赤血球細胞の集団が、本明細書に記載されている医薬組成物中に存在し得ることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、操作された（すなわち、改変された）赤血球細胞および改変されていない赤血球細胞を含む。例えば、赤血球細胞（例えば、改変されたおよび改変されていない赤血球細胞）の単一の単位用量は、様々な実施形態では、約、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の操作された赤血球細胞を含むことができ、組成物中の残りの赤血球細胞は、操作されていない。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、操作された除核赤血球細胞および有核赤血球細胞を含む。例えば、操作された赤血球細胞（例えば、除核および有核赤血球細胞）の単一の単位用量は、様々な実施形態では、約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の除核赤血球細胞を含むことができ、組成物中の残りの赤血球細胞は、有核である。
ＶＩ．キット
ＶＩ．キット
本開示は、本開示のａＡＰＣと、アプリケーターと、本開示の方法を行うためのキットの使用について記載する使用説明資料とを含む様々なキットを含む。例示的なキットについて後述するが、他の有用なキットの内容は、本開示を踏まえて、当業者には明らかとなるであろう。これらのキットのそれぞれは、本開示内に含まれる。
本開示は、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むａＡＰＣを使用して、Ｔ制御性細胞の活性化を、またはＨＬＡ－ＥポリペプチドもしくはＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含むａＡＰＣを使用して、他の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／もしくは樹状細胞の阻害を特異的に誘導するためのキットを含む。本キットは、本開示に開示されている方法に従って使用される。手短に説明すると、本キットを使用して、本開示のａＡＰＣを、免疫細胞、例えば、Ｔ制御性細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または樹状細胞に投与することができる。さらに、本キットを使用して産生された免疫細胞を動物に投与して、治療結果を成就することができる。
本キットは、免疫細胞へのａＡＰＣの投与に有用なアプリケーターをさらに含む。本キットに含まれる特定のアプリケーターは、例えば、ａＡＰＣの投与に使用される方法と共に、ａＡＰＣによって増大される細胞に依存し、斯かるアプリケーターは、当技術分野で周知であり、とりわけ、ピペット、シリンジ、スポイト（ｄｒｏｐｐｅｒ）その他を含むことができる。さらに、本キットは、本キットの使用のための使用説明資料を含む。このような使用説明書は、本明細書に提供される開示を単純に具体化する。
本キットは、薬学的に許容される担体を含む。組成物は、本明細書の他の箇所に示す適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は、本明細書の他の箇所に以前に示した通りである。
本キットは、本明細書に示す分子等が挙げられるがこれらに限定されない、過多の分子を含むａＡＰＣを包含する。しかし、本明細書に提供される教示を備えた当業者であれば、本開示が、上述のまたは他のいずれかの分子組合せに決して限定されないことを容易に認めるであろう。むしろ、本明細書に示す組合せは、説明を目的としており、本開示によって包含される組合せを決して限定するものではない。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれると特にかつ個々に示されているかのように、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記述されている刊行物は、単に、本出願の出願日に先立つその開示のために提示されている。本明細書におけるいかなる記述も、本明細書に記載されている発明者らに、以前の開示または他のいずれかの理由に基づいて、斯かる開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
（実施例１）
ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
赤血球細胞は、膜アンカーとして機能する全長グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質に融合された外因性抗原提示ポリペプチド、特に、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含む融合タンパク質（ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質）を含むように形質導入される。例えば、ＧＰＡに融合されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図１に描写される通りに配置することができ、これは、β２ＭポリペプチドおよびＧＰＡ膜アンカーに連結されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含むための例示的な設計を提示する。
細胞培養および形質導入は、下の「方法」セクションに記載される通りに行って、ＧＰＡにより繋留されて細胞表面にＨＬＡ－Ｅを含む赤血球細胞を得る。
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｅ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。
方法
レンチウイルスベクターの産生
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。レンチウイルスは、細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質をコードする核酸を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞において産生される。次に、細胞は、新鮮培養培地に置かれる。ウイルス上清は、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって、培地交換の４８時間後に収集される。上清を収集し、アリコートにして－８０℃で凍結する。
赤血球細胞の増大および分化
赤血球細胞の増大および分化
正常なヒトドナーの動員された末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｉｎｃ．から凍結した状態で購入する。増大／分化手順は、３つのステージを含む。第１のステージにおいて、解凍されたＣＤ３４＋赤血球前駆体は、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子および組換えヒトインターロイキン３を含むイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第２のステージにおいて、赤血球細胞は、血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチンおよびＬ－グルタミンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第３のステージにおいて、赤血球細胞は、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチンおよびヘパリンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。培養物は、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持される。
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞は、上述の培養プロセスのステップ１において形質導入される。培養培地における赤血球細胞は、レンチウイルス上清およびポリブレンと組み合わされる。感染は、スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）によって成就され、プレートを２０００ｒｐｍで９０分間、室温にてスピンする。スピノキュレーション後に、細胞を３７℃で一晩インキュベートする。
抗体結合
抗体結合
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｅ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。抗体の結合は、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光のためのフローサイトメトリーによって測定される。ゲートは、染色された非形質導入細胞に基づき設定される。
（実施例２）
ＨＬＡ－Ｇ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
結果
（実施例２）
ＨＬＡ－Ｇ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
結果
赤血球細胞は、膜アンカーとして機能するＧＰＡタンパク質に融合された外因性抗原提示ポリペプチド、特に、ＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含む融合タンパク質（ＨＬＡ－Ｇ－ＧＰＡ融合タンパク質）を含むように形質導入される。例えば、ＧＰＡに融合されたＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドは、図２Ｂに描写されている通りに配置することができ、これは、ＧＰＡ膜アンカーおよびβ２Ｍポリペプチドに連結されたＨＬＡ－Ｇポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）を含むための例示的な設計を提示する。
細胞培養および形質導入は、下の「方法」セクションに記載される通りに行って、ＧＰＡ膜貫通ドメインにより繋留されて細胞表面にＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドを含む赤血球細胞を得る。
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。
方法
レンチウイルスベクターの産生
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＨＬＡ－Ｇ－ＧＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。レンチウイルスは、細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＨＬＡ－Ｇ－ＧＰＡ融合タンパク質をコードする核酸を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞において産生される。次に、細胞は、新鮮培養培地に置かれる。ウイルス上清は、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって、培地交換の４８時間後に収集される。上清を収集し、アリコートにして－８０℃で凍結する。
赤血球細胞の増大および分化
赤血球細胞の増大および分化
正常なヒトドナーの動員された末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｉｎｃ．から凍結した状態で購入する。増大／分化手順は、３つのステージを含む。第１のステージにおいて、解凍されたＣＤ３４＋赤血球前駆体は、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子および組換えヒトインターロイキン３を含むイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第２のステージにおいて、赤血球細胞は、血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチンおよびＬ－グルタミンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第３のステージにおいて、赤血球細胞は、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチンおよびヘパリンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。培養物は、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持される。
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞は、上述の培養プロセスのステップ１において形質導入される。培養培地における赤血球細胞は、レンチウイルス上清およびポリブレンと組み合わされる。感染は、スピノキュレーションによって成就され、プレートを２０００ｒｐｍで９０分間、室温にてスピンする。スピノキュレーション後に、細胞を３７℃で一晩インキュベートする。
抗体結合
抗体結合
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。抗体の結合は、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光のためのフローサイトメトリーによって測定される。ゲートは、染色された非形質導入細胞に基づき設定される。
（実施例３）
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
結果
（実施例３）
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の生成
結果
赤血球細胞は、膜アンカーとして機能するＧＰＡに融合された外因性抗原提示ポリペプチド、特に、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドに融合された外因性抗原ポリペプチド、ＨＳＰ６０のリーダー配列を含む融合タンパク質（ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質）を含むように形質導入される。図１は、一本鎖融合としての、抗原ポリペプチド、例えば、ＨＳＰ６０リーダー配列ペプチド、およびＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドのための例示的な設計の概略図を示し、外因性ペプチド（ＨＳＰ６０リーダー配列）は、β２Ｍポリペプチドに連結され、β２Ｍポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドの１つまたは複数のアルファドメイン（例えば、アルファ１、アルファ２およびアルファ３ドメイン）に連結され、アルファドメインは、ＧＰＡ膜アンカーに連結される。細胞培養および形質導入は、下の「方法」セクションに記載される通りに行って、ＧＰＡ膜貫通ドメインにより繋留された、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドによって細胞表面に提示されたＨＳＰ６０のリーダー配列を含む赤血球細胞を得る。
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｅ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。
方法
レンチウイルスベクターの産生
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。レンチウイルスは、細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞において産生される。次に、細胞は、新鮮培養培地に置かれる。ウイルス上清は、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって、培地交換の４８時間後に収集される。上清を収集し、アリコートにして－８０℃で凍結する。
赤血球細胞の増大および分化
赤血球細胞の増大および分化
正常なヒトドナーの動員された末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｉｎｃ．から凍結した状態で購入する。増大／分化手順は、３つのステージを含む。第１のステージにおいて、解凍されたＣＤ３４＋赤血球前駆体は、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子および組換えヒトインターロイキン３を含むイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第２のステージにおいて、赤血球細胞は、血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチンおよびＬ－グルタミンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。第３のステージにおいて、赤血球細胞は、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチンおよびヘパリンを補充したイスコフのＭＤＭ培地において培養される。培養物は、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持される。
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞の形質導入
赤血球前駆細胞は、上述の培養プロセスのステップ１において形質導入される。培養培地における赤血球細胞は、レンチウイルス上清およびポリブレンと組み合わされる。感染は、スピノキュレーションによって成就され、プレートを２０００ｒｐｍで９０分間、室温にてスピンする。スピノキュレーション後に、細胞を３７℃で一晩インキュベートする。
抗体結合
抗体結合
ＡＰＣ標識またはＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｅ抗体の結合は、操作された赤血球細胞におけるＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドの包含の検証に使用される。抗体の結合は、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光のためのフローサイトメトリーによって測定される。ゲートは、染色された非形質導入細胞に基づき設定される。
（実施例４）
ＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０融合タンパク質を含む赤血球細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の活性化
（実施例４）
ＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０融合タンパク質を含む赤血球細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の活性化
赤血球細胞は、実施例３に記載されている通り、ＧＰＡ膜貫通ドメインに融合されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドに融合された、外因性抗原ポリペプチド、ＨＳＰ６０のリーダー配列を含む融合タンパク質（ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質）を含むように形質導入される。
機能活性は、ヒトＣＤ８＋Ｔ制御性細胞に基づく増殖アッセイを使用して評価される。細胞は、蛍光色素５，６－カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識される。操作された赤血球に応答して増殖する細胞は、フローサイトメトリーによって直接的に測定される、ＣＦＳＥ蛍光強度の低減を示す。あるいは、放射性チミジン取込みを使用して、ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように操作された赤血球細胞により刺激されたＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の成長の速度を評価することができる。
機能活性は、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒｅｇ抑制アッセイを使用して評価される。斯かるアッセイは、Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｖｉｇｎａｌｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１１； ７０７： ２１－３７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
（実施例５）
１型糖尿病のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の検査
（実施例５）
１型糖尿病のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように遺伝子操作された赤血球細胞の検査
赤血球細胞は、実施例３に記載されている通り、ＧＰＡ膜貫通ドメインに融合されたＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドに融合された、外因性抗原ポリペプチド、ＨＳＰ６０のリーダー配列を含む融合タンパク質（ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質）を含むように形質導入される。
機能活性は、そのＣＤ８＋Ｔ制御性細胞に欠損がある１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者由来の細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｔｒｏ自己／非自己識別アッセイを使用して評価され、ＨＳＰ６０をロードされたＨＬＡ－Ｅを含む標的を特異的に阻害するその能力に関して正常対照群と比較される。アッセイは、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．， ２０１０， １２０（１０）：３６４１－３６５０、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。手短に説明すると、Ｔ１Ｄ患者由来のＣＤ８＋Ｔ制御性細胞は、ＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質、または外因性抗原ポリペプチドを欠く同様の構築物（対照）を含む赤血球細胞によるプライミングによってｉｎ ｖｉｔｒｏでブーストされる。ブーストされたＣＤ８＋Ｔ制御性細胞系は、ＣＤ８＋Ｔ細胞阻害アッセイにおけるその特異性について検査される。
（実施例６）
マウスＣＩＡモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように操作された赤血球細胞の検査
（実施例６）
マウスＣＩＡモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように操作された赤血球細胞の検査
関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の炎症およびびらんによって主に特徴付けられる自己免疫疾患である。ＲＡに対するより有効なアプローチは、自己反応性Ｔ細胞の排除を要求し得、これは次いで、疾患を誘導する病原性Ｔ細胞サブセットを標的化および排除し得るＴ制御性細胞の的確な定義に依存する。自己免疫性関節炎に対するＴ制御性およびエフェクター細胞の寄与は、十分に確立されたコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて試験することができる。このマウス疾患モデルは、自己トレランスの突破、自己抗体の生成、複数の関節の炎症性変化、ならびにパンヌス形成を伴う骨および軟骨のびらんを含む、いくつかの類似性をヒトＲＡと共有する。
マウス赤血球細胞は、クリック方法論（赤血球細胞の官能化のためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）を使用して、ＨＳＰ６０ペプチドのリーダー配列を提示する外因性抗原提示ポリペプチドＨＬＡ－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質）とコンジュゲートされる。
機能活性は、Ｌｅａｖｅｎｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１３；１２３（３）：１３８２－１３８９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているマウスＣＩＡモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで評価される。手短に説明すると、ＣＩＡは、ＣＦＡにおいて乳化された１５０μｇのｃＣＩＩの皮内注射と、続くＩＦＡにおいて乳化された１００μｇのｃＣＩＩによる２１日後のブーストにより、８～１２週齢のＢ６マウスにおいて誘導されるであろう。ＨＰＳ６０ペプチドのリーダー配列を提示するＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む外因性抗原提示ポリペプチドとコンジュゲートされた赤血球細胞による投薬は、尾静脈の静脈内投与により、２７日目に（ブーストの７日後）開始するであろう。用量は、投薬間に２～１４日間に及び得る試験のスパンにわたり、１回または複数回投与される。ＣＩＡ関節炎スコアリングおよび自己抗体産生は、疾患進行の測定値として使用される。ＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の数および表現型のｅｘ ｖｉｖｏ解析も行われる。ＣＤ８＋Ｔ制御性細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋およびＨＳＰ６０四量体陽性によってプロファイルされた。
評定の代替方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大されたＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の養子移入によるであろう。手短に説明すると、ＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含む赤血球細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＰ６０特異的ＣＤ８＋Ｔ制御性細胞を増大させる。ＣＩＡマウスへの少数（５×１０４／マウス）のＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ制御性細胞の養子移入を使用して、自己抗体産生および自己免疫性関節炎の進行をモニターする。
次のスコアリングシステムにより、ＣＩＡスコアリングを１週間に２～３回行う：０、正常；１、足の中央または足首関節の軽度腫脹および／または紅斑、２、足首から中足骨関節へと拡張する中等度浮腫状腫脹；ならびに３、足首、足および指を包含する顕著な腫脹。マウス１匹当たり最大スコア１２により、各肢をグレード分類する。
（実施例７）
マウスＥＡＥモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように操作された赤血球細胞の検査
（実施例７）
マウスＥＡＥモデルにおけるＨＬＡ－Ｅ－ＨＳＰ６０－ＧＰＡ融合タンパク質を含むように操作された赤血球細胞の検査
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の処置のための潜在的薬物の有効性の試験に最も一般的に使用されるモデルである。それとＭＳとの多くの類似性のため、ＥＡＥは、自己免疫の病態形成、ＣＮＳ炎症、脱髄、細胞輸送およびトレランス誘導の試験に使用される。ＥＡＥは、麻痺（一部のモデルでは、麻痺は再発寛解型である）、ＣＮＳ炎症および脱髄によって特徴付けられる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥ誘導のためのＨｏｏｋｅ Ｋｉｔｓ（商標）（Ｈｏｏｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥの誘導に使用される。この方法を使用して、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）におけるＭＯＧ３５－５５またはＭＯＧ１－１２５のエマルションによる免疫化と、続く先ず免疫化当日、次いで再度翌日のＰＢＳにおける百日咳毒素の投与によって、ＥＡＥは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導される。典型的なＥＡＥ開始は、免疫化の９～１４日後であり、疾患のピークは、マウス毎に開始の３～５日後である。ピークは、１～３日間持続し、それに続いて部分的回復が為される。２５％前後のマウスが、初期部分的回復後に、ＥＡＥ重症度の増加（再発）を示すであろう。これは通常、免疫化の２０～２７日後に生じる。ケージ１つ当たり４～６匹のマウスによる、１０～１２匹のマウスの群が使用される。
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含む赤血球細胞は、実施例６に記載されている通りに作製され、赤血球細胞に適切な緩衝剤中に製剤化される。除核赤血球細胞による処置は、ＥＡＥ開始時から始まる。赤血球細胞が、慢性ＥＡＥの経過を反転するその能力について検査されている場合、処置は、疾患開始の７～１４日後に開始される。マウスは、ＥＡＥを発症したときに（ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）登録）または免疫化後の固定された時間に処置群に割り当てられるが、常に、ＥＡＥ開始の同様の時間および同様のＥＡＥ開始スコアを有する群を成就するためにバランスを保った様式である。登録がＥＡＥ開始後の場合、マウスはまた、登録前に最大スコアのためにバランスを保つ。
投薬は、下の表８に示す通り、臨床スコア＝１で生じる。
動物の投薬は、総計１～３回実行することができる（例えば、用量間２～１４日間）。
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡを含む操作された除核赤血球細胞の効果の評価は、詳細に後述する通り、（１）ＥＡＥスコアリング；（２）体重の変化および（３）組織学的解析のうち１つまたは複数を使用して決定される。
ＥＡＥスコアリング
ＥＡＥスコアリング
典型的には、ＥＡＥは、臨床像が、２つの定義されたスコアの間に位置する場合の「中間の（ｉｎ－ｂｅｔｗｅｅｎ）」スコア（すなわち、０．５、１．５、２．５、３．５）を含む、０～５のスケールでスコアリングされる。スコアリング方法は、個々のマウス毎に、疾患のステージ（開始／ピークｖｓ．回復）に応じて僅かに異なる。スコアリングにおける無意識の偏向を回避するために、マウスは、いずれのマウスがいずれの処置を受けたか気付いていない人物により、盲検法でスコアリングされる。
ＥＡＥの回復ステージにおいて、大部分のマウスは、もはやぐったりとしていないが正常でもない尾を有するであろう；これは、硬く感じ、「かぎ状」である。後肢は、動き（ペダリングし（ｐｅｄａｌｉｎｇ））始めることができるが、マウスは歩行できない。いずれの変化もスコアリングを困難なものとする。したがって、上記の場合、上述のスコアリング判断基準に対する次の改変がこれらのマウスに使用される：
体重
ＥＡＥの経過において、体重の変化は、疾患重症度を反映する。マウスは多くの場合、免疫化の翌日に少量の体重を失う。これは、投与されたアジュバントおよび百日咳毒素の効果によるものと思われる。次に、マウスは、疾患開始までその体重を着実に増加させる。ＥＡＥ開始の当日に、マウスは、その体重の１～２ｇ（体重の５～１０％）を一貫して失う。体重減少は、ＥＡＥ重症度の進行と共に続き、減少は、疾患のピークにおいてその開始前体重の２０％前後に達する。体重減少は、麻痺および食物摂取低減の両方、ならびに炎症急性期におけるＴＮＦ等の炎症促進性サイトカインの高度な産生が原因である可能性が最も高い。疾患のピークに達した後に、その臨床スコアが改善しない場合であっても、マウスは、体重をゆっくり増す。この体重増加は、血液中により低いレベルの炎症促進性サイトカインをもたらす炎症の下方制御が原因である可能性がある。無処置または媒体処置マウスは通常、免疫化の２８日後にその免疫化前体重の９０％前後を有する。
組織学
組織学
試験の終わり（通常、免疫化の２８日後前後）または媒体群が疾患のピークに達した時点（通常、免疫化の１４～１８日後）のいずれかに、組織学的解析を行う。ＥＡＥにおける炎症は通常、脊髄の腰部において始まり、疾患のピークまでに脊髄全体へと拡散する。
疾患開始時に、炎症性病巣の数は、疾患重症度と強く相関する。病巣の数は、疾患のピークまで若干増加し、ピーク時に、脊髄全体を通して６～１５個の炎症性病巣／区画が典型的に見出される。ＥＡＥの慢性ステージにおいて（疾患のピークの数日後に始まる）、多くの炎症性病巣が消散し、典型的に、免疫化のおよそ２８日後までに、各脊髄区画における３～４個の炎症性病巣をもたらす。
最大数の炎症性病巣は、疾患の経過の初期に存在するため、試験の終わりに組織学的解析が行われる場合、後期ＥＡＥ開始を有するマウスは多くの場合、その脊髄に、その臨床スコアから予想され得るよりも多くの炎症性病巣を有する。例えば、２８日間の試験において、免疫化の２７日後のＥＡＥ開始および２の最終臨床スコアを有するマウスは、免疫化の９日後のＥＡＥ開始および３．５の最終スコアを有するマウスよりも多くの炎症性病巣を有する可能性があるであろう。同様に、両者が試験の終わりに同じ臨床スコアを有する場合であっても、試験の終わりの少し前に再発するマウス（再発は、１またはそれよりも大きいポイントの臨床スコア増加として定義される）は通常、試験の終わりに、安定した慢性疾患を有するマウスよりも多くの炎症性病巣を有するであろう。
脱髄は通常、疾患開始後最初の２日間において見出されないが、疾患のピーク（ＥＡＥ開始の４～５日後）において見出され、ＥＡＥの慢性期において続く。脱髄スコアは、ピークおよび免疫化の２８日後の間で大きく変化せず、通常、１．２～２．５の間の平均である。
脱髄は、ルクソールファストブルー（Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ）染色切片（ＬＦＢ）およびＨ＆Ｅ切片の両方においてスコアリングされる。ＬＦＢ切片において、脊髄白質は、濃い青色に染色し、脱髄区域は、より淡い青色となり、大型液胞に関連する。Ｈ＆Ｅ染色切片において、大型液胞による正常構造の破壊は、脱髄を示す。
アポトーシス細胞は、Ｈ＆Ｅ切片において同定され、通常、疾患発症の最初の２日間において見出されない。アポトーシス細胞は、ピーク時およびＥＡＥの慢性ステージにおいて見出される。アポトーシス細胞の平均数は通常、切片１つ当たり２～４個の間である。
ＨＳＰ６０－ＨＬＡ－Ｅ－ＧＰＡ融合タンパク質を含む赤血球細胞の投与は、媒体処置対照マウスと比較して、ＥＡＥスコアリングにおける改善または炎症性病巣の数の低減のうち１つまたは複数をもたらすであろう。
Claims (95)
- 細胞表面に外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記外因性抗原提示ポリペプチドが、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチド、および前記外因性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している外因性抗原ポリペプチドを含む、人工抗原提示細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドが、Ｅ＊０１：０１：０１：０１、Ｅ＊０１：０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０１：０１：０３、Ｅ＊０１：０１：０１：０４、Ｅ＊０１：０１：０１：０５、Ｅ＊０１：０１：０１：０６、Ｅ＊０１：０１：０１：０７、Ｅ＊０１：０１：０１：０８、Ｅ＊０１：０１：０１：０９、Ｅ＊０１：０１：０１：１０、Ｅ＊０１：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０１、Ｅ＊０１：０３：０１：０２、Ｅ＊０１：０３：０１：０３、Ｅ＊０１：０３：０１：０４、Ｅ＊０１：０３：０２：０１、Ｅ＊０１：０３：０２：０２、Ｅ＊０１：０３：０３、Ｅ＊０１：０３：０４、Ｅ＊０１：０３：０５、Ｅ＊０１：０４、Ｅ＊０１：０５、Ｅ＊０１：０６、Ｅ＊０１：０７、Ｅ＊０１：０８Ｎ、Ｅ＊０１：０９およびＥ＊０１：１０からなる群から選択される対立遺伝子を含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１またはＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３対立遺伝子を含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、自己ペプチドを含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、寛容原性ポリペプチドを含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、自己免疫疾患抗原を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、ＨＳＰ６０のリーダー配列（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）（配列番号１７）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、表１に列挙されたポリペプチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドが、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｅαドメインおよびβ２Ｍポリペプチド、またはそれらの断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドが、膜アンカーに連結されている、請求項９に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドが、前記ＨＬＡ－Ｅポリペプチドにリンカーを介して連結された外因性抗原ポリペプチドを含む一本鎖融合タンパク質を含む、請求項９に記載のａＡＰＣ。
- 前記一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、請求項１１に記載のａＡＰＣ。
- 前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、請求項１１に記載のａＡＰＣ。
- 前記膜アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質もしくはその膜貫通ドメイン、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）もしくはその膜貫通ドメインを含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、前記外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に結合している、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、前記外因性抗原提示ポリペプチドに非共有結合的に結合している、請求項１に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、約８アミノ酸長～約２４アミノ酸長の間である、請求項１から１６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、細胞表面に外因性制御性Ｔ共刺激ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性制御性Ｔ共刺激ポリペプチドが、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１５、ＴＮＦα、抗ＤＲ３アゴニスト、４－１ＢＢＬまたはＴＧＦβである、請求項１８に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、細胞表面に外因性共刺激ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、細胞表面に外因性共阻害ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、網状赤血球である、先行する請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、赤血球である、先行する請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を活性化するための方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を請求項１から２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化する、方法。
- 免疫細胞を阻害する方法であって、前記免疫細胞を請求項１から２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより前記免疫細胞を阻害する、方法。
- 前記免疫細胞が、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項２５に記載の方法。
- モジュレートされた免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、前記対象の免疫細胞を請求項１から２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによりモジュレートされた免疫応答の必要がある前記対象を処置する、方法。
- 前記免疫細胞が、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項２７に記載の方法。
- 前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
- 自己免疫疾患または炎症性疾患を有する対象を処置する方法であって、
ａ）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップであって、前記ａＡＰＣが、抗原提示ポリペプチド、および前記抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞であり、前記抗原提示ポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む、ステップ、ならびに
ｂ）前記ａＡＰＣを前記対象に投与するステップ
を含み、
それにより自己免疫疾患または炎症性疾患を有する前記対象を処置する、方法。 - 前記対象が、自己免疫疾患を有する、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、Ｔｆｈ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞によって媒介される、請求項３０に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎炎、多発性硬化症、混合性結合組織障害、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、膜性糸球体腎炎、視神経脊髄炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、皮膚筋炎、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症、川崎病、ループス腎炎、結節性多発動脈炎、壊疽性膿皮症、脊椎関節炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、ＨＳＰ６０のリーダー配列（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）（配列番号１７）を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、アレルギー性障害を有する、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、炎症性疾患を有する、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、心臓の炎症性疾患、肝臓の炎症性疾患、膵臓の炎症性疾患、皮膚の炎症性疾患、および／または胃腸（ＧＩ）管の炎症性疾患であり、例えば、炎症性疾患が、限定されるものではないが、心筋炎、心筋症、心内膜炎、心膜炎、肝硬変、喘息（好酸球性または非好酸球性）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ、アレルギー反応、慢性気管支炎、肺気腫、過敏性肺炎、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープを伴うかまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、回腸炎、慢性炎症性腸疾患、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグストラウス症候群および炎症性疼痛を含む、請求項３３に記載の方法。
- 制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を増大させる方法であって、
対象から細胞の集団を入手するステップであって、前記集団が、Ｔｒｅｇ細胞を含む、ステップ、
前記集団を、請求項１から２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップ
を含み、
それによりＴｒｅｇ細胞の前記集団を増大させる、
方法。 - 前記Ｔｒｅｇ細胞を細胞の前記集団から単離するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記Ｔｒｅｇ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。
- 請求項１から９のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに
除核および前記外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより前記ａＡＰＣを作製するステップ
を含む、方法。 - 請求項１から９のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、
前記外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、前記赤血球前駆有核細胞に導入するステップ、ならびに
除核ならびに前記外因性抗原提示ポリペプチドおよび前記外因性抗原ポリペプチドの産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより前記ａＡＰＣを作製するステップ
を含む、方法。 - 請求項１から９のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核細胞に導入するステップ、
除核および前記外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ、ならびに
前記操作された除核赤血球細胞を少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、前記少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドが、前記操作された除核赤血球細胞の細胞表面に存在する前記外因性抗原提示ポリペプチドと結合する、ステップ
を含み、それにより前記ａＡＰＣを作製する、方法。 - 前記外因性核酸が、ＤＮＡを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性核酸が、ＲＮＡを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、ウイルス形質導入を含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、電気穿孔を含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクションおよびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞表面に外因性抗原提示ポリペプチドを含む操作された除核赤血球細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記外因性抗原提示ポリペプチドが、ヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）ポリペプチド、および前記外因性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合している外因性抗原ポリペプチドを含む、人工抗原提示細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６およびＨＬＡ－Ｇ７からなる群から選択される、請求項４９に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ５およびＨＬＡ－Ｇ６からなる群から選択される、請求項４９に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、モチーフＸＩ／ＬＰＸＸＸＸＸＬ（配列番号８）を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドが、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｇαドメインおよびβ２Ｍポリペプチド、またはそれらの断片を含む、請求項４９から５２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドが、膜アンカーに連結されている、請求項５３に記載のａＡＰＣ。
- 前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドが、前記ＨＬＡ－Ｇポリペプチドにリンカーを介して連結された外因性抗原ポリペプチドを含む一本鎖融合タンパク質を含む、請求項５３に記載のａＡＰＣ。
- 前記一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、請求項５５に記載のａＡＰＣ。
- 前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、請求項５５に記載のａＡＰＣ。
- 前記膜アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質もしくはその膜貫通ドメイン、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）もしくはその膜貫通ドメインを含む、請求項５３から５７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、前記外因性抗原提示ポリペプチドに共有結合的に結合している、請求項４９に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、前記外因性抗原提示ポリペプチドに非共有結合的に結合している、請求項４９に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性抗原ポリペプチドが、約８アミノ酸長～約２４アミノ酸長の間である、請求項４９から６０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる、請求項４９から６０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記抑制することが、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの導入を含む、請求項６２に記載のａＡＰＣ。
- 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項６３に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、少なくとも１種の外因性共阻害ポリペプチドをさらに含む、請求項４９から６４のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記外因性共阻害ポリペプチドが、ＩＬ－１０である、請求項６５に記載のａＡＰＣ。
- 前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣと相互作用するＢ細胞を抑制することができる、請求項４９から６６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣと相互作用するＮＫ細胞を抑制することができる、請求項４９から６６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣと相互作用するマクロファージ細胞を抑制することができる、請求項４９から６６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣと相互作用する樹状細胞を抑制することができる、請求項４９から６６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、前記細胞表面にチェックポイント分子をさらに含む、請求項４９から７０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２およびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される、請求項７１に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、網状赤血球である、請求項４９から７２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 前記操作された除核赤血球細胞が、赤血球である、請求項４９から７２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
- 免疫細胞の活性を抑制する方法であって、前記免疫細胞を請求項４９から７４のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより前記免疫細胞の活性を抑制する、方法。
- 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項７６に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、Ｂ細胞である、請求項７６に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項７６に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、マクロファージである、請求項７６に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、樹状細胞である、請求項７６に記載の方法。
- 低減された免疫応答の必要がある対象を処置する方法であって、前記対象の免疫細胞を請求項４９から７４のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それにより低減された免疫応答の必要がある前記対象を処置する、方法。
- 前記対象が、自己免疫疾患を有する、請求項８２に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、ＧＶＨＤ、腎炎および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
- 前記対象が、炎症性疾患を有する、請求項８２に記載の方法。
- 前記対象が、アレルギー性疾患を有する、請求項８２に記載の方法。
- 前記対象が、移植の必要があるか、または移植を受けている、請求項８２に記載の方法。
- 請求項４９から７４のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに
除核および前記外因性抗原ポリペプチドの産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ
を含み、それにより前記ａＡＰＣを作製する、方法。 - 請求項４９から５３、５８から５９および６１から７４のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、
前記外因性抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を、前記有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、ならびに
除核ならびに前記外因性抗原提示ポリペプチドおよび外因性抗原ポリペプチドの両方の産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ
を含み、それにより前記ａＡＰＣを作製する、方法。 - 請求項４９から５３のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外因性抗原提示ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球前駆細胞に導入するステップ、
除核および前記外因性抗原提示ポリペプチドの産生に適切な条件下で前記有核赤血球前駆細胞を培養し、それにより操作された除核赤血球細胞を作製するステップ、ならびに
前記操作された除核赤血球細胞を少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、前記少なくとも１種の外因性抗原ポリペプチドが、前記操作された除核赤血球細胞の細胞表面に存在する前記外因性抗原提示ポリペプチドと結合する、ステップ
を含み、それにより前記ａＡＰＣを作製する、方法。 - 前記外因性核酸が、ＤＮＡを含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性核酸が、ＲＮＡを含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、ウイルス形質導入を含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、電気穿孔を含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクションおよびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
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