BR112020004535A2 - peptídeos moduladores de células t multiméricos e métodos de uso destes - Google Patents

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Abstract

A presente divulgação fornece polipeptídeos multiméricos moduladores de células T que compreendem um polipeptídeo imunomodulador que exibe afinidade de ligação reduzida a um polipeptídeo co-imunomodulador cognato. Um polipeptídeo multimérico modulador de células T é útil para modular a atividade de uma célula T e para modular uma resposta imune em um indivíduo.

Description

POLIPEPTÍDEOS MODULADORES DE CÉLULAS T MULTIMÉRICOS E MÉTODOS DE USO DESTES REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US Nº 62/555.499, depositado em 7 de setembro de 2017, pedido que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
INTRODUÇÃO
[0002] Uma resposta imune adaptativa envolve o engajamento do receptor de célula T (TCR), presente na superfície de uma célula T, com um pequeno antígeno peptídico não covalentemente apresentado na superfície de uma célula apresentadora de antígeno (APC) por um complexo principal de histocompatibilidade (MHC; também referido em humanos como um complexo de antígeno leucocitário humano (HLA)). Esse engajamento representa o mecanismo de direcionamento do sistema imunológico e é uma interação molecular necessária para a modulação de células T (ativação ou inibição) e função efetora. Após o direcionamento das células específicas do epítopo, as células T direcionadas são ativadas através do envolvimento de proteínas coestimuladoras encontradas na APC com proteínas coestimuladoras de contrapartida nas células T. Ambos os sinais – ligação de epítopo/TCR e engajamento de proteínas coestimuladoras de APC com proteínas coestimuladoras de células T – são necessários para acionar a especificidade e ativação ou inibição das células T. O TCR é específico para um determinado epítopo; no entanto, a proteína coestimuladora não é específica do epítopo e, em vez disso, é geralmente expressa em todas as células T ou em grandes subconjuntos de células T.
SUMÁRIO
[0003] A presente divulgação fornece polipeptídeos multiméricos moduladores de células T (TMMPs) que compreendem um polipeptídeo imunomodulador que exibe afinidade de ligação reduzida com um polipeptídeo co- imunomodulador cognato. Um TMMP é útil para modular a atividade de uma célula T e para modular uma resposta imune em um indivíduo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0004] A FIG. 1 representa a ativação preferencial de uma célula T específica do epítopo a uma célula T não específica do epítopo por um polipeptídeo multimérico modulador de células T da presente divulgação.
[0005] As FIG. 2A-2G fornecem sequências de aminoácidos de polipeptídeos Fc de imunoglobulina.
[0006] As FIG. 3A-3C fornecem sequências de aminoácidos de polipeptídeos de antígeno leucocitário humano (HLA) de cadeia pesada de Classe I. Sequências de sinais estão sublinhadas.
[0007] As FIG. 4 fornece um alinhamento múltiplo de precursores de sequência de aminoácidos de beta-2 microglobulina (β2M) (isto é, incluindo a sequência principal) de Homo sapiens (NP_004039.1; SEQ ID NO:49), Pan trogloditas (NP_001009066.1; SEQ ID NO:49), Macaca mulatta (NP_001040602.1; SEQ ID NO:50), Bos taurus (NP_776318.1; SEQ ID NO:51) e de Mus musculus (NP_033865.2; SEQ ID NO:52). Os aminoácidos 1-20 são um peptídeo sinal.
[0008] As FIG. 5A-5K fornecem sequências de aminoácidos de exemplos de cadeias pesadas de HLA adequadas.
[0009] As FIG. 6A-6D são representações esquemáticas de vários polipeptídeos multiméricos moduladores de células T da presente divulgação.
[0010] As FIG. 7A-7D são representações esquemáticas de vários polipeptídeos multiméricos moduladores de células T ligados por dissulfeto da presente divulgação.
[0011] A FIG. 8 fornece um alinhamento de onze sequências peptídicas maduras da cadeia pesada classe I de MHC sem suas sequências líderes ou domínios transmembranares.
DEFINIÇÕES
[0012] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados neste documento de forma intercambiável, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, esse termo inclui, mas não se limita a, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA- RNA ou um polímero compreendendo purina e bases de pirimidina ou outras bases naturais, modificadas quimicamente ou bioquimicamente, não naturais ou derivatizadas.
[0013] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados de forma intercambiável neste documento e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos quimicamente ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e cadeias principais peptídicas modificadas.
[0014] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa porcentagem de "identidade de sequência" com outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhados, essa porcentagem de bases ou aminoácidos é a mesma e na mesma posição relativa quando se comparam as duas sequências. A identidade de sequência pode ser determinada de várias maneiras diferentes. Para determinar a identidade de sequência, as sequências podem ser alinhadas usando vários métodos e programas de computador convenientes (por exemplo, BLAST, T- CAFFEE, MUSCLE, MAFFT etc.), disponíveis na Internet em sites como ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi. 215:403-10.
[0015] O termo "substituição de aminoácido conservativo" refere-se à permutabilidade em proteínas de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas-hidroxila consiste em serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida consistindo em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais ácidas consiste em glutamato e aspartato, e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre consiste em cisteína e metionina. Grupos de aminoácidos de substituição de aminoácidos conservativa exemplares são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina-glicina e asparagina-glutamina.
[0016] O termo "sinapse imunológica" ou "sinapse imune" como utilizado neste documento refere-se geralmente à interface natural entre duas células imunológicas interagindo de uma resposta imune adaptativa, incluindo, por exemplo, a interface entre uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou célula alvo e uma célula efetora, por exemplo, um linfócito, uma célula T efetora, uma célula exterminadora natural, e semelhantes. Uma sinapse imunológica entre uma APC e uma célula T é geralmente iniciada pela interação de um receptor de antígenos de células T e grandes moléculas de complexo de histocompatibilidade, por exemplo, como descrito em Bromley et al., Annu Rev Immunol. 2001; 19:375- 96; a divulgação da qual é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.
[0017] "Célula T" inclui todos os tipos de células do sistema imune que expressam CD3, incluindo as células T-helper (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células T reguladoras (Treg) e células NK-T.
[0018] O termo "polipeptídeo imunomodulador" (também referido como "polipeptídeo coestimulador"), como utilizado neste documento, inclui um polipeptídeo em uma célula apresentadora de antígeno (APC) (por exemplo, uma célula dendrítica, uma célula B e similares) que liga especificamente um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em uma célula T, fornecendo um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, a ligação de um complexo TCR/CD3 com um polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) carregado com peptídeo, media uma resposta de células T, incluindo, mas não se limitando a, proliferação, ativação, diferenciação e similares. Um polipeptídeo imunomodulador pode incluir, mas não está limitado a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligante Fas (FasL), ligante coestimulador induzível (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, um agonista ou um anticorpo que liga um receptor de ligante Toll e um ligante que se liga especificamente com B7-H3.
[0019] Como observado acima, um "polipeptídeo imunomodulador" (também referido aqui como "MOD") liga especificamente um polipeptídeo co- imunomodulador cognato em uma célula T.
[0020] Um "domínio imunomodulador" ("MOD") de um polipeptídeo multimérico modulador de células T da presente divulgação liga um polipeptídeo co-imunomodulador cognato, que pode estar presente em uma célula T alvo.
[0021] "Heterólogo", como utilizado neste documento, significa um nucleotídeo ou polipeptídeo que não é encontrado no ácido nucleico ou proteína nativos, respectivamente.
[0022] "Recombinante", como utilizado neste documento, significa que um determinado ácido nucleico (DNA ou RNA) é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição, reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou ligação resultando em uma construção com uma sequência codificadora ou não codificadora estrutural distinguível de ácidos nucleicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Sequências de DNA que codificam polipeptídeos podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA ou a partir de uma série de oligonucleotídeos sintéticos para fornecer um ácido nucleico sintético que é capaz de ser expresso a partir de uma unidade transcricional recombinante contida em uma célula ou em um sistema de transcrição e tradução sem células.
[0023] Os termos "vetor de expressão recombinante" ou "construção de DNA" são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a uma molécula de DNA que compreende um vetor e uma inserção. Os vetores de expressão recombinantes são geralmente gerados com a finalidade de expressar e/ou propagar a(s) inserção(ões) ou para a construção de outras sequências nucleotídicas recombinantes. As inserções podem ou não estar operacionalmente ligadas a uma sequência promotora e podem ou não estar operacionalmente ligadas a sequências reguladoras de DNA.
[0024] Tal como usado neste documento, o termo "afinidade" refere-se à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes (por exemplo, um anticorpo e um antígeno) e é expresso como uma constante de dissociação (K D). Afinidade pode ser pelo menos uma vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior ou pelo menos 1000 vezes maior, ou mais, do que a afinidade de um anticorpo para sequências de aminoácidos não relacionados. A afinidade de um anticorpo por uma proteína-alvo pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM), ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 femtomolar (fM) ou mais. Como usado neste documento, o termo "avidez" se refere à resistência de um complexo de dois ou mais agentes à dissociação após a diluição. Os termos "imunorreativo" e "preferencialmente se liga" são usados de forma intercambiável neste documento em relação a fragmentos de anticorpos e/ou de ligação ao antígeno.
[0025] O termo "ligação", conforme usado neste documento (por exemplo, com referência à ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T a um polipeptídeo (por exemplo, um receptor de células T) em uma célula T), refere- se a uma interação não covalente entre dois moléculas. Ligação não covalente refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações eletrostáticas, hidrofóbicas, iônicas e/ou de ligação de hidrogênio, incluindo interações tais como pontes de sal e pontes de água. As interações de ligação não covalentes são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (KD) menor que 10-6 M, menor que 10-7 M, menor que 10-8 M, menor que 10-9 M, menor que 10-10 M, menor que 10-11 M, menor que 10-12 M, menor que 10-13 M, menor que 10-14 M ou menor que 10-15 M. "Afinidade" refere-se à força da ligação não covalente, afinidade de ligação aumentada sendo correlacionada com uma menor KD. "Ligação específica" geralmente refere-se à ligação com uma afinidade de pelo menos cerca de 10-7 M ou superior, por exemplo, 5x 10-7 M, 10-8 M, 5 x 10-8 M, 10-9 M e superior. "Ligação não específica" geralmente se refere à ligação (por exemplo, a ligação de um ligante a uma fração que não seja o sítio ou receptor de ligação designado) com uma afinidade menor que cerca de 10 -7 M (por exemplo, ligação com uma afinidade de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M). No entanto, em alguns contextos, por exemplo, ligação entre um TCR e um complexo de peptídeo/MHC, a "ligação específica" pode estar na faixa de 1 μM a 100 μM ou de 100 μM a 1 mM. "Ligação covalente" ou "vínculo covalente", como utilizado neste documento, refere-se à formação de uma ou mais ligações químicas covalentes entre duas moléculas diferentes.
[0026] Os termos "tratamento", "tratar" e semelhantes são utilizados neste documento para significar geralmente a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma desta e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença. "Tratamento", conforme utilizado neste documento, abrange qualquer tratamento de uma doença ou sintoma em um mamífero, e inclui: (a) prevenir que a doença ou sintoma ocorra em um sujeito que possa estar predisposto a contrair a doença ou sintoma, mas que ainda não tenha sido diagnosticado como a tendo; (b) inibir a doença ou sintoma, isto é, interromper o seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após o início da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, em que o tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular interesse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da completa perda de função nos tecidos afetados. A terapia da invenção pode ser administrada durante a fase sintomática da doença e, em alguns casos, após a fase sintomática da doença.
[0027] O termos "indivíduo", "sujeito", "hospedeiro" e "paciente", são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a qualquer sujeito mamífero para quem o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejada. Os mamíferos incluem, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, ratos; camundongos), lagomorfos (por exemplo, coelhos), ungulados (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos, cabras e afins), etc.
[0028] Antes da presente invenção ser descrita mais detalhadamente, deve- se entender que esta invenção não é limitada às modalidades particulares descritas, visto que tais podem, claro, variar. Também se deve entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever somente modalidades em particular, e não se destina a ser limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.
[0029] Sempre que um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor interveniente ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior deste intervalo e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nesse intervalo estabelecido está englobado na invenção. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser independentemente incluídos nos intervalos menores e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido incluir um ou ambos os limites, os intervalos que excluem qualquer um ou ambos dos limites incluídos também são incluídos na invenção.
[0030] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos serão agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas neste documento a título de referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas.
[0031] Deve-se observar que conforme usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "polipeptídeo modulador de células T multimérico" inclui uma pluralidade desses polipeptídeos e a referência a "o polipeptídeo imunomodulador" inclui referência a um ou mais polipeptídeos imunomoduladores e seus equivalentes conhecidos dos versados na técnica, e assim por diante. Observa-se, adicionalmente, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para a utilização de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou utilização de uma limitação "negativa".
[0032] Aprecia-se que certas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção que são, por concisão, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das modalidades relacionadas com a invenção são especificamente abrangidas pela presente invenção e são aqui divulgadas como se cada uma e todas as combinações tivessem sido individual e explicitamente divulgadas. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e dos seus elementos também são especificamente abrangidas pela presente invenção e são divulgadas neste documento como se cada uma e toda subcombinação tivesse sido individual e explicitamente divulgada neste documento.
[0033] As publicações discutidas neste documento são fornecidas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para preceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Adicionalmente, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar ser confirmadas de forma independente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0034] A presente divulgação fornece polipeptídeos multiméricos moduladores de células T (TMMPs) que compreendem um polipeptídeo imunomodulador que exibe afinidade de ligação reduzida com um polipeptídeo co- imunomodulador cognato. Um polipeptídeo multimérico modulador de células T é útil para modular a atividade de uma célula T e para modular uma resposta imune em um indivíduo.
POLIPEPTÍDEOS MULTIMÉRICOS MODULADORES DE CÉLULAS T
[0035] A presente divulgação fornece um polipeptídeo multimérico modulador de células T (TMMP) compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo; e b) um segundo polipeptídeo, em que o polipeptídeo multimérico compreende um epítopo; um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); um segundo polipeptídeo de MHC; um ou mais polipeptídeos imunomoduladores; e opcionalmente um polipeptídeo Fc de imunoglobulina (Ig) ou um suporte não Ig. A presente divulgação fornece um TMMP, em que o polipeptídeo multimérico é um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo de MHC, em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo compreende um epítopo; em que o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo compreendem um ou mais polipeptídeos imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes; e opcionalmente um polipeptídeo Fc de Ig ou um suporte não Ig. Um TMMP da presente divulgação também é referido neste documento como um "polipeptídeo multimérico da presente divulgação" ou um "synTac."
[0036] A presente divulgação fornece um TMMP compreendendo um polipeptídeo heterodimérico compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo peptídico; e ii) um primeiro polipeptídeo de MHC; b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo de MHC; e c) pelo menos um polipeptídeo imunomodulador, onde o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreendem pelo menos um (isto é, um ou mais) polipeptídeo imunomodulador. Opcionalmente, o primeiro ou o segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo Fc de Ig ou um suporte não Ig. Pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato. O epítopo presente em um TMMP da presente divulgação se liga a um receptor de células T (TCR) em uma célula T com uma afinidade de pelo menos 100 μM (por exemplo, pelo menos 10 μM, pelo menos 1 μM, pelo menos 100 nM, pelo menos 10 nM ou pelo menos 1 nM). Um TMMP da presente divulgação se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o TMMP se liga a uma segunda célula T, onde a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 100 μM e onde a segunda célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 100 μM (por exemplo, pelo menos 10 μM, pelo menos 1 μM, pelo menos 100 nM, pelo menos 10 nM ou pelo menos 1 nM).
[0037] A presente divulgação fornece um TMMP, em que o polipeptídeo multimérico é:
[0038] A) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo de MHC, em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo compreende um epítopo; em que o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes e em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores pode ser um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ou uma variante de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos comparadas com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente; e em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo opcionalmente compreende um polipeptídeo Fc de Ig ou uma estrutura não Ig; ou
[0039] B) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo de MHC, em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo compreende um epítopo; em que o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes,
[0040] em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores é uma variante de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do correspondente polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem,
[0041] em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e em que o epítopo se liga a um TCR em uma célula
T com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, de modo que: i) o polipeptídeo TMMP se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o TMMP liga uma segunda célula T, em que a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M e em que a segunda célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M; e/ou ii) a razão da afinidade de ligação de um TMMP de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do TMMP compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem com o polipeptídeo co- imunomodulador cognato, quando medida por interferometria de bio-camada, está na faixa de 1,5:1 a 106:1; e em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente; e
[0042] em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo opcionalmente compreende um polipeptídeo Fc de Ig ou um suporte não Ig; ou
[0043] C) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo, desde o N-terminal até o C-terminal: i) um epítopo; ii) um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo, desde terminal N ao terminal C: i) um segundo polipeptídeo MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo Fc de imunoglobulina (Ig) ou um suporte não Ig, em que o polipeptídeo multimérico compreende um ou mais domínios imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes, em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores está: A) no C-terminal do primeiro polipeptídeo; B) no N- terminal do segundo polipeptídeo; C) no C-terminal do segundo polipeptídeo; ou D) no C-terminal do primeiro polipeptídeo e no N-terminal do segundo polipeptídeo e em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores pode ser um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ou uma variante de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente; e
[0044] opcionalmente em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e em que o epítopo se liga a um TCR em uma célula T com uma afinidade de pelo menos 10 -7 M, tal que: i) o TMMP se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o TMMP liga uma segunda célula T, em que a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co- imunomodulador cognato e um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M e em que a segunda célula T se expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10 -7 M; e/ou ii) a razão da afinidade de ligação de um TMMP de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, com um polipeptídeo co- imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do TMMP compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medida por interferometria de bio-camada, está na faixa de 1,5:1 a 106:1; e em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente.
[0045] A presente divulgação fornece um TMMP compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo, desde o N-terminal até o C-terminal: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo que compreende, desde o N-terminal até o C-terminal: i) um segundo polipeptídeo de MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo Fc de Ig ou um suporte não-Ig. Um TMMP da presente divulgação compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores, em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores está: A) no C-terminal do primeiro polipeptídeo; B) no N- terminal do segundo polipeptídeo; C) no C-terminal do segundo polipeptídeo; ou D) no C-terminal do primeiro polipeptídeo e no N-terminal do segundo polipeptídeo. Pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato. O epítopo presente em um TMMP da presente divulgação se liga a um receptor de células T (TCR) em uma célula T com uma afinidade de pelo menos 100 μM (por exemplo, pelo menos 10 μM, pelo menos 1 μM, pelo menos 100 nM, pelo menos 10 nM ou pelo menos 1 nM). Um TMMP da presente divulgação se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o TMMP se liga a uma segunda célula T, onde a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co- imunomodulador cognato e um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 100 μM e onde a segunda célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 100 μM (por exemplo, pelo menos 10 μM, pelo menos 1 μM, pelo menos 100 nM, pelo menos 10 nM ou pelo menos 1 nM).
[0046] Em alguns casos, o epítopo presente em um TMMP da presente divulgação se liga a um TCR em uma célula T com uma afinidade de cerca de 10 -4 M a cerca de 5 x 10-4 M, de cerca de 5 x 10-4 M a cerca de 10-5 M, de cerca de 10-5 M a 5 x 10-5 M, de cerca de 5 x 10-5 M a 10-6 M, de cerca de 10-6 M a cerca de 5 x 10-6 M, de cerca de 5 x 10-6 M a cerca de 10-7 M, de cerca de 10-7 M a cerca de 5 x 10-7 M, de cerca de 5 x 10-7 M a cerca de 10-8 M ou de cerca de 10-8 M a cerca de 10-9 M. Expressado de outra maneira, em alguns casos, o epítopo presente em um TMMP da presente divulgação se liga a um TCR em uma célula T com uma afinidade de cerca de 1 nM a cerca de 5 nM, de cerca de 5 nM a cerca de 10 nM, de cerca de 10 nM a cerca de 50 nM, de cerca de 50 nM a cerca de 100 nM, de cerca de 0,1 μM a cerca de 0,5 μM, de cerca de 0,5 μM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0047] Um polipeptídeo imunomodulador presente em um TMMP da presente divulgação se liga ao seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato com uma afinidade que é pelo menos 10% menor, pelo menos 15% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 25% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 35% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 45% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 55% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 65% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 75% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 85% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato.
[0048] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação tem uma afinidade de ligação para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato que é de 1 nM a 100 nM ou de 100 nM a 100 μM. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação tem uma afinidade de ligação a um polipeptídeo co-imunomodulador cognato que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM. Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação tem uma afinidade de ligação com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato que é de cerca de 1 nM a cerca de 5 nM, de cerca de 5 nM a cerca de 10 nM, de cerca de 10 nM a cerca de 50 nM, de cerca de 50 nM a cerca de 100 nM.
[0049] A combinação da afinidade reduzida do polipeptídeo imunomodulador com seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato e a afinidade do epítopo com um TCR, fornece seletividade aprimorada de um TMMP da presente divulgação. Por exemplo, um TMMP da presente divulgação se liga seletivamente a uma primeira célula T que exibe ambos: i) um TCR específico para o epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP, em comparação com a ligação a uma segunda célula T que exibe: i) um TCR específico para um epítopo diferente do epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP. Por exemplo, um TMMP da presente divulgação se liga à primeira célula T com uma afinidade de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes ou mais de 100 vezes maior que a afinidade com a qual se liga a segunda célula T.
[0050] Em alguns casos, um polipeptídeo modulador de célula T da presente divulgação, quando administrado a um indivíduo em necessidade, induz uma resposta de célula T específica de epítopo e uma resposta de célula T não específica de epítopo. Em outras palavras, em alguns casos, um polipeptídeo modulador de célula T da presente divulgação, quando administrado a um indivíduo em necessidade, induz uma resposta de célula T específica do epítopo, modulando a atividade de uma primeira célula T que exibe ambos: i) um TCR específico para o epítopo presente no TMMP; ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP; e induz uma resposta de célula T não específica do epítopo ao modular a atividade de uma segunda célula T que exibe: i) um TCR específico para um epítopo diferente do epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP. A razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 2:1,
pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1 ou pelo menos 100:1. A proporção da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de cerca de 2:1 a cerca de 5:1, de cerca de 5:1 a cerca de 10:1, de cerca de 10:1 a cerca de 15:1, de cerca de 15:1 a cerca de 20:1, de cerca de 20:1 a cerca de 25:1, de cerca de 25:1 a cerca de 50:1 ou de cerca de 50:1 a cerca de 100:1 ou mais de 100:1. "Modular a atividade" de uma célula T pode incluir um ou mais dos seguintes: i) ativar uma célula T citotóxica (por exemplo, CD8+); ii) induzir a atividade citotóxica de uma célula T citotóxica (por exemplo, CD8+); iii) induzir a produção e liberação de uma citotoxina (por exemplo, uma perforina; uma granzima; uma granulisina) por uma célula T citotóxica (por exemplo, CD8+); iv) inibir da atividade de uma célula T autorreativa; e similares.
[0051] A combinação da afinidade reduzida do polipeptídeo imunomodulador com seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato e a afinidade do epítopo com um TCR, fornece seletividade aprimorada de um TMMP da presente divulgação. Por exemplo, um TMMP da presente divulgação se liga seletivamente a uma primeira célula T que exibe ambos: i) um TCR específico para o epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP, em comparação com a ligação a uma segunda célula T que exibe: i) um TCR específico para um epítopo diferente do epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP.
[0052] A afinidade de ligação entre um polipeptídeo imunomodulador e seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato pode ser determinada por interferometria de biocamada (BLI) usando polipeptídeo imunomodulador purificado e polipeptídeo co-imunomodulador cognato purificado. A afinidade de ligação entre um TMMP e seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato pode ser determinada por BLI usando TMMP purificado e o polipeptídeo co-imunomodulador cognato. Métodos de BLI são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4):498-507; e Shah e Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383.
[0053] Um ensaio de BLI pode ser realizado usando um instrumento Octet
RED 96 (Pal FortéBio) ou um instrumento semelhante, como a seguir. Um TMMP (por exemplo, um TMMP da presente divulgação; um TMMP de controle (onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem)) é imobilizado em um suporte insolúvel (um "biosensor"). O TMMP imobilizado é o "alvo." A imobilização pode ser efetuada imobilizando um anticorpo de captura no suporte insolúvel, onde o anticorpo de captura imobiliza o TMMP. Por exemplo, a imobilização pode ser efetuada pela imobilização de anticorpos anti-Fc (por exemplo, IgG Fc anti-humano) no suporte insolúvel, onde os anticorpos anti- Fc imobilizados se ligam e imobilizam o TMMP (onde o TMMP compreende um polipeptídeo IgFc). Um polipeptídeo co-imunomodulador é aplicado, em várias concentrações diferentes, ao TMMP imobilizado e a resposta do instrumento é registrada. Os ensaios são realizados em um meio líquido compreendendo HEPES 25 mM pH 6,8, poli (etileno glicol) 6000 a 5%, KCl 50 mM, albumina sérica bovina a 0,1% e detergente não iônico Tween 20 a 0,02%. A ligação do polipeptídeo co- imunomodulador ao TMMP imobilizado é realizada a 30 °C. Como um controle positivo para a afinidade de ligação, um anticorpo monoclonal anti-MHC de Classe I pode ser usado. Por exemplo, anticorpo monoclonal anti-HLA Classe I W6/32 (American Type Culture Collection No. HB-95; Parham et al. (1979) J. Immunol. 123:342), que tem um KD de 7 nM, pode ser usado. Uma curva padrão pode ser gerada usando diluições em série do anticorpo monoclonal anti-MHC de Classe I. O polipeptídeo co-imunomodulador, ou o mAb anti-MHC de Classe I, é o "analito." O BLI analisa o padrão de interferência da luz branca refletida em duas superfícies: i) do polipeptídeo imobilizado ("alvo"); e ii) uma camada de referência interna. Uma mudança no número de moléculas ("analito"; por exemplo, polipeptídeo co- imunomodulador; anticorpo anti-HLA) ligadas à ponta do biossensor causa uma mudança no padrão de interferência; essa mudança no padrão de interferência pode ser medida em tempo real. Os dois termos cinéticos que descrevem a afinidade da interação alvo/analito são a constante de associação (ka) e a constante de dissociação (kd). A proporção desses dois termos (kd/a) dá origem à constante de afinidade KD.
[0054] O ensaio de BLI é realizado em uma placa de vários poços. Para executar o ensaio, o esquema layout da placa é definido, as etapas do ensaio são definidas e os biossensores são atribuídos no software Octet Data Acquisition. O conjunto do biossensor é hidratado. O conjunto do biossensor hidratado e a placa de ensaio são equilibrados por 10 minutos no instrumento Octet. Depois que os dados são adquiridos, os dados adquiridos são carregados no software Octet Data Analysis. Os dados são processados na janela Processamento, especificando o método para subtração de referência, alinhamento do eixo y, correção entre etapas e filtragem Savitzky-Golay. Os dados são analisados na janela Análise pela especificação das etapas a serem analisadas (Associação e Dissociação), selecionando o modelo de ajuste de curva (1:1), o método de ajuste (global) e a janela de interesse (em segundos). A qualidade do ajuste é avaliada. Os valores de KD para cada rastreamento de dados (concentração de analito) podem ter a média calculada se estiver dentro de uma faixa de três vezes. Os valores de erro de K D devem estar dentro de uma ordem de magnitude dos valores constantes de afinidade; os valores de R2 devem estar acima de 0,95. Ver, por exemplo, Abdiche et al. (2008) J. Anal. Biochem. 377:209.
[0055] A menos que indicado de outra forma neste documento, a afinidade de um TMMP da presente divulgação com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato ou a afinidade de um TMMP de controle (onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem) com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato é determinada usando BLI conforme descrito acima.
[0056] Em alguns casos, a razão da: i) afinidade de ligação de um TMMP de controle (em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem) para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato para ii) a afinidade de ligação de um TMMP da presente divulgação compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem para o polipeptídeo co- imunomodulador cognato, quando medida por BLI (como descrito acima), é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1. Em alguns casos, a razão da: i) afinidade de ligação de um TMMP de controle (em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem) com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato para ii) a afinidade de ligação de um TMMP da presente divulgação compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medida por BLI, está na faixa de 1,5:1 a 106:1, por exemplo, de 1,5:1 a 10:1, de 10:1 a 50:1, de 50:1 a 102:1, de 102:1 a 103:1, de 103:1 a 104:1, de 104:1 a 105:1 ou de 105:1 a 106:1.
[0057] Como um exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de IL-2 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo IL-2 do tipo selvagem) como o polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um receptor de IL-2 (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o receptor de IL-2, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1. Em alguns casos, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de IL-2 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo IL-2 do tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um receptor de IL-2 (ou seja, o polipeptídeo co- imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o receptor de IL-2, quando medida por BLI, está na faixa de 1,5:1 a 106:1, por exemplo, de 1,5:1 a 10:1, de 10:1 a 50:1, de 50:1 a 10 2:1, de 102:1 a 103:1, de 103:1 a 104:1, de 104:1 a 105:1 ou de 105:1 a 106:1.
[0058] Como outro exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de PD-L1 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de PD-L1 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de PD-L1 do tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um receptor de PD-1 (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o receptor de PD-1, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1.
[0059] Como outro exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de CD80 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de CD80 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de CD80 de tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um polipeptídeo de CTLA4 (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o polipeptídeo de CTLA4, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1.
[0060] Como outro exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de CD80 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de CD80 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de CD80 do tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um polipeptídeo de CD28 (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o receptor de CD28, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1,
pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1.
[0061] Como outro exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de 4-1BBL variante do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de 4-1BBL variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de 4-1BBL do tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um polipeptídeo de 4- 1BB (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o polipeptídeo de 4-1BBL, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1.
[0062] Como outro exemplo, onde um TMMP de controle compreende um polipeptídeo de CD86 do tipo selvagem e onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo de CD86 variante (compreendendo de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de CD86 do tipo selvagem) como polipeptídeo imunomodulador, a razão da: i) afinidade de ligação do TMMP de controle com um polipeptídeo de CD28 (ou seja, o polipeptídeo co-imunomodulador cognato) para ii) a afinidade de ligação do TMMP da presente divulgação com o receptor de CD28, quando medida por BLI, é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1.
[0063] A afinidade de ligação de um TMMP da presente divulgação com uma célula T alvo pode ser medida da seguinte maneira: A) colocando um TMMP da presente divulgação em contato com uma célula T alvo que expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo co-imunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga ao epítopo, onde o TMMP compreende um marcador de epítopo, de modo que o TMMP se liga à célula T alvo; B) colocando o TMMP ligado à célula T alvo em contato com um agente de ligação marcado com fluorescência (por exemplo, um anticorpo marcado com fluorescência) que se liga ao marcador do epítopo, gerando um complexo TMMP/célula T alvo/agente de ligação; C) medindo a intensidade média de fluorescência (MFI) do complexo TMMP/célula T alvo/agente de ligação usando citometria de fluxo. O marcador do epítopo pode ser, por exemplo, um marcador FLAG, um marcador de hemaglutinina, um marcador de c-myc, um marcador de poli(histidina), etc. A IMF medida em uma faixa de concentrações do membro da biblioteca de TMMP fornece uma medida da afinidade. A IMF medida em uma faixa de concentrações do membro da biblioteca de TMMP fornece uma concentração que induz metade do efeito máximo (EC50) do TMMP. Em alguns casos, a EC50 de um TMMP da presente divulgação para uma célula T alvo está na faixa de nM; e a EC50 do TMMP para uma célula T de controle (onde uma célula T de controle expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo co- imunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem parental; e ii) um receptor de células T que não se liga ao epítopo presente no TMMP) está na faixa de μM. Em alguns casos, a razão entre a EC 50 de um TMMP da presente divulgação para uma célula T de controle e a EC50 do TMMP para uma célula T alvo é de pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10: 1, pelo menos 15: 1, pelo menos 20: 1, pelo menos 25: 1, pelo menos 50: 1, pelo menos 100: 1, pelo menos 500:1, pelo menos 10 2:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1. A razão entre a EC50 de um TMMP da presente divulgação para uma célula T de controle e o EC50 do TMMP para uma célula T alvo é uma expressão da seletividade do TMMP.
[0064] Em alguns casos, quando medido como descrito no parágrafo anterior, um TMMP da presente divulgação exibe ligação seletiva com a célula T alvo, em comparação com a ligação do membro da biblioteca de TMMP com uma célula T de controle que compreende: i) o polipeptídeo cmo-imunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem parental; e ii) um receptor de células T que se liga a um epítopo diferente do epítopo presente no membro da biblioteca de TMMP. Polipeptídeos moduladores de células T multiméricos dimerizados
[0065] Um polipeptídeo modulador de células T multimérico da presente divulgação pode ser dimerizado; isto é, a presente divulgação fornece um polipeptídeo multimérico compreendendo um dímero de um polipeptídeo modulador de células T multimérico da presente divulgação. Assim, a presente divulgação fornece um polipeptídeo modulador de células T multimérico compreendendo: A) um primeiro heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo peptídico; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo i) um segundo polipeptídeo de MHC, em que o primeiro heterodímero compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores; e B) um segundo heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo peptídico; e ii) um primeiro polipeptídeo de MHC; e b) um segundo polipeptídeo i) um segundo polipeptídeo de MHC, em que o segundo heterodímero compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores e em que o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão covalentemente ligados um ao outro. Em alguns casos, os dois polipeptídeos moduladores de células T multiméricos são idênticos um ao outro na sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão ligados covalentemente um ao outro através de uma região C-terminal do segundo polipeptídeo do primeiro heterodímero e uma região C-terminal do segundo polipeptídeo do segundo heterodímero. Em alguns casos, o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão ligados covalentemente um ao outro através do aminoácido C- terminal do segundo polipeptídeo do primeiro heterodímero e da região C-terminal do segundo polipeptídeo do segundo heterodímero; por exemplo, em alguns casos, o aminoácido C-terminal do segundo polipeptídeo do primeiro heterodímero e a região C-terminal do segundo polipeptídeo do segundo heterodímero estão ligados um ao outro, diretamente ou através de um ligante. O ligante pode ser um ligante peptídico. O ligante peptídico pode ter um comprimento de 1 aminoácido a 200 aminoácidos (por exemplo, de 1 aminoácido (aa) a 5 aa, de 5 aa a 10 aa, de 10 aa a 25 aa, de 25 aa a 50 aa, de 50 aa a 100 aa, de 100 aa a 150 aa ou de 150 aa a 200 aa). Em alguns casos, o epítopo peptídico do primeiro heterodímero e o epítopo peptídico do segundo heterodímero compreendem a mesma sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo de MHC do primeiro e do segundo heterodímero é uma β2-microglobulina de MHC de Classe I e em que o segundo polipeptídeo de MHC do primeiro e do segundo heterodímero é uma cadeia pesada de MHC de Classe I. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador do primeiro heterodímero e o polipeptídeo imunomodulador do segundo heterodímero compreendem a mesma sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador do primeiro heterodímero e o polipeptídeo imunomodulador do segundo heterodímero são polipeptídeos imunomoduladores variantes que compreendem de 1 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem parental correspondente e em que as de 1 a 10 as substituições de aminoácidos resultam na ligação de afinidade reduzida do polipeptídeo imunomodulador variante com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador do primeiro heterodímero e o polipeptídeo imunomodulador do segundo heterodímero são ambos selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1 (CD339), TGFβ, CD70 e ICAM. Exemplos de polipeptídeos de MHC, polipeptídeos imunomoduladores e epítopos peptídicos adequados são descritos abaixo. Polipeptídeos de MHC
[0066] Como observado acima, um polipeptídeo multimérico inclui polipeptídeos de MHC. Para os fins da presente divulgação, o termo "polipeptídeos de complexo de histocompatibilidade principal (MHC)" destina-se a incluir polipeptídeos de MHC de várias espécies, incluindo de MHC humano (também referidos como polipeptídeos de antígeno leucocitário humano (HLA)), de roedor (por exemplo, camundongo, rato, etc.) Polipeptídeos de MHC e polipeptídeos de MHC de outras espécies de mamíferos (por exemplo, lagomorfos, primatas não humanos, caninos, felinos, ungulados (por exemplo, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, etc.), e semelhantes. O termo "polipeptídeo de MHC" significa que inclui polipeptídeos de MHC de Classe I (por exemplo, β-2 microglobulina e cadeia pesada de MHC de Classe I) e polipeptídeos de MHC de Classe I (por exemplo, polipeptídeo α de MHC de Classe II e polipeptídeo β de MHC de Classe II).
[0067] Como notado acima, em algumas modalidades de um polipeptídeo multimérico, o primeiro e o segundo polipeptídeos de MHC são polipeptídeos de MHC de Classe I; por exemplo, em alguns casos, o primeiro polipeptídeo de MHC é um polipeptídeo de MHC de Classe I de β2-microglobulina (β2M), e o segundo polipeptídeo de MHC é um polipeptídeo de MHC de Classe I de cadeia pesada (cadeia H). Em outros casos, o primeiro e o segundo polipeptídeos de MHC são polipeptídeos de MHC de Classe II; por exemplo, em alguns casos, o primeiro polipeptídeo de MHC é um polipeptídeo de MHC de Classe II de cadeia α e o segundo polipeptídeo de MHC é um polipeptídeo de MHC de Classe II de cadeia β. Em outros casos, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo de MHC de Classe II de cadeia β e o segundo polipeptídeo de MHC é um polipeptídeo de MHC de Classe II de cadeia α.
[0068] Em alguns casos, um polipeptídeo de MHC de um polipeptídeo multimérico é um polipeptídeo de MHC humano, em que os polipeptídeos de MHC humanos são também referidos como polipeptídeos de "antígeno leucocitário humano" ("HLA"). Em alguns casos, um polipeptídeo de MHC de um polipeptídeo multimérico é um polipeptídeo de HLA Classe I, por exemplo, um polipeptídeo de β2-microglobulina, ou um polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I. Polipeptídeos de cadeia pesada de HLA Classe I incluem polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-A, os polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-B, polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-C, polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-E, polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-F e polipeptídeos de cadeia pesada de HLA-G. Em alguns casos, um polipeptídeo de MHC de um polipeptídeo multimérico é um polipeptídeo de HLA Classe II, por exemplo, uma cadeia α de HLA Classe II ou uma cadeia β de HLA Classe II. Polipeptídeos de MHC de Classe II incluem polipeptídeos α e β de DP de MHC de Classe II, polipeptídeos α e β de DM, polipeptídeos α e β de DOA, polipeptídeos α e β de DOB, polipeptídeos α e β de
DQ e polipeptídeos α e β de DR.
[0069] A FIG. 8 fornece um alinhamento de onze sequências peptídicas de cadeia pesada de MHC de Classe I maduras sem suas sequências líderes ou domínios transmembranares. As sequências alinhadas são HLA-A, HLA-B e HLA- C humanos, uma sequência de proteínas H2K de camundongo, três variantes de HLA-A (var.1, var. 2C e var.2CP) e 3 variantes de HLA-A humano (HLA-A*1101; HLA-A*2402; e HLA-A*3303). Indicadas no alinhamento estão os locais (84 e 139 das proteínas maduras) onde os resíduos de cisteína podem ser inseridos para a formação de uma ligação dissulfeto para estabilizar o complexo MHC-β2M na ausência de um peptídeo de epítopo ligado. Também é mostrada no alinhamento a posição 236 (do polipeptídeo maduro), que pode ser substituído por um resíduo de cisteína que pode formar uma ligação dissulfeto intra-cadeia com β2M (por exemplo, no aa 12). Uma seta aparece acima de cada um desses locais e os resíduos estão em negrito. A sétima sequência de HLA-A mostrada no alinhamento (var. 2c), mostra a sequência da variante 2 substituída com resíduos C nas posições 84, 139 e 236. As caixas que flanqueiam os resíduos 84, 139 e 236 mostram os grupos de cinco aminoácidos em ambos os lados desses seis conjuntos de cinco resíduos, designados aac1 (para "cluster de aminoácidos 1"), aac2 (para "cluster de aminoácidos 2"), aac3 (para "cluster de aminoácidos 3"), aac4 (para "cluster de aminoácidos 4"), aac5 (para "cluster de aminoácidos 5") e aac6 (para "cluster de aminoácidos 6"), que podem ser substituídos por 1 a 5 aminoácidos selecionados independentemente de (i) qualquer aminoácido que ocorre naturalmente ou (ii) qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, exceto prolina ou glicina.
[0070] Em alguns casos: i) aa1 (cluster de aminoácidos 1) pode ser a sequência de aminoácidos GTLRG (SEQ ID NO: 219) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, L substituído por I, V, A ou F); ii) aa2 (cluster de aminoácidos 2) pode ser a sequência de aminoácidos YNQSE (SEQ ID NO: 220) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, N substituído por Q, Q substituído por N e/ou E substituído por D); iii) aa3 (cluster de aminoácidos 3) pode ser a sequência de aminoácidos TAADM (SEQ ID NO: 221) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, T substituído por S, A substituído por G, D substituído por E e/ou M substituído por L, V ou I); iv) aa4 (cluster de aminoácidos 4) pode ser a sequência de aminoácidos AQTTK (SEQ ID NO: 222) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, A substituído por G, Q substituído por N ou T substituído por S e ou K substituído por R ou Q); v) aa5 (cluster de aminoácidos 5) pode ser a sequência de aminoácidos VETRP (SEQ ID NO: 223) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, V substituído por I ou L, E substituído por D, T substituído por S e/ou R substituído por K); e/ou vi) aa6 (cluster de aminoácidos 6) pode ser a sequência de aminoácidos GDGTF (SEQ ID NO: 224) ou aquela sequência com um ou dois aminoácidos excluídos ou substituídos por outros aminoácidos que ocorrem naturalmente (por exemplo, D substituído por E, T substituído por S ou F substituído por L, W ou Y).
[0071] A Tabela 1 fornece exemplos de Cadeias Pesadas de HLA que podem ser incorporadas a um TMMP da presente divulgação. Tabela 1 Sequência SEQ Faixa da Identidade Substituições Substituições Base ID de Sequência específicas de nas posições Entrada (da Fig. 8) NO. das posições 115 e/ou 167 de aa 84, 139 e/ou 236 1 HLA-A 242 100% Nenhuma Nenhuma 2 HLA-A 242 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C
Sequência SEQ Faixa da Identidade Substituições Substituições Base ID de Sequência específicas de nas posições Entrada
(da Fig. 8) NO. das posições 115 e/ou 167 de aa 84, 139 e/ou 236 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 3 HLA-B 243 100% Nenhuma Nenhuma 4 HLA-B 243 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 5 HLA-C 244 100% Nenhuma Nenhuma 6 HLA-C 244 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 7 HLA-A (var. 1) 53 100% Nenhuma Nenhuma 8 HLA-A (var. 1) 53 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma;
Sequência SEQ Faixa da Identidade Substituições Substituições Base ID de Sequência específicas de nas posições Entrada
(da Fig. 8) NO. das posições 115 e/ou 167 de aa 84, 139 e/ou 236 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 9 MOUSE H2K 54 100% Nenhuma Nenhuma 10 MOUSE H2K 54 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 11 HLA-A*1101 248 100% Nenhuma Nenhuma 12 HLA-A*1101 248 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C);
Sequência SEQ Faixa da Identidade Substituições Substituições Base ID de Sequência específicas de nas posições Entrada
(da Fig. 8) NO. das posições 115 e/ou 167 de aa 84, 139 e/ou 236 e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 13 HLA-A*2402 249 100% Nenhuma Nenhuma 14 HLA-A*2402 249 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) 15 HLA-A*3303 250 100% Nenhuma Nenhuma 16 HLA-A*3303 250 75%-99,8%; 80%- Nenhuma; Nenhuma; 99,8%; 85%--99,8%; Y84C; A139C; W115C; 90%-99,8%; 95%- A236C; (Y84A W167A; ou 99,8%; 98%--99,8%; & A236C); W167C ou 99%-99,8%; (ou (Y84C & inserções, deleções, A139C); e/ou substituições de (Y84C, A139C 1-25, 1-5, 5-10, 10- & A236C) 15, 15-20, ou 20-25 aa) HLA-A
[0072] Como um exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-A humana seguinte:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGS DWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA
EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHE GLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:53). HLA-A (Y84A; A236C)
[0073] Em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende substituições Y84A e A236C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84A; A236C) de HLA-A seguinte:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGS DWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA
EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQH EGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:225), onde o aminoácido 84 é Ala e o aminoácido 236 é Cys. Em alguns casos, o Cys-236 forma uma ligação dissulfeto inter-cadeia com Cys-12 de um polipeptídeo de β2M variante que compreende uma substituição R12C. HLA-A (Y84C; A139C)
[0074] Em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende substituições Y84A e A139C. Por exemplo, em alguns casos,
o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84C; A139C) de HLA-A seguinte:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGS DWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMCAQTTKHKWEAAHVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA
EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHE GLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:226), onde o aminoácido 84 é Cys e o aminoácido 139 é Cys. Em alguns casos, o Cys-84 forma uma ligação dissulfeto intra-cadeia com o Cys-139. HLA-A A11 (HLA-A*1101)
[0075] Como um exemplo não limitativo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-A A11 humana seguinte:
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPD GRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAY LEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEI
TLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEG LPKPLTLRWE (SEQ ID NO:227). Essa cadeia pesada de MHC de Classe I pode ser proeminente nas populações Asiáticas, incluindo populações de indivíduos de ascendência Asiática. HLA-A A11 (Y84A; A236C)
[0076] Como um exemplo não limitativo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I é um alelo HLA-A A11 que compreende substituições Y84A e A236C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84A; A236C) de HLA-A A11 seguinte:
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGAYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGP DGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAE
ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHE GLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:228), onde o aminoácido 84 é Ala e o aminoácido 236 é Cys. Em alguns casos, o Cys-236 forma uma ligação dissulfeto inter-cadeia com Cys-12 de um polipeptídeo de β2M variante que compreende uma substituição R12C. HLA-A24 (HLA-A*2402)
[0077] Como um exemplo não limitativo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-A A24 humana seguinte:
GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGS DGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRA YLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEI TLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEG
LPKPLTLRWEPSSQPTVPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRNSSDRKGGSY SQAASSDSAQGSDVSLTACKV (SEQ ID NO:240). Essa cadeia pesada de MHC de Classe I pode ser proeminente nas populações Asiáticas, incluindo populações de indivíduos de ascendência Asiática. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Ala. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 236 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Ala e o aminoácido 236 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Cys e o aminoácido 236 é um Cys. HLA-A33 (HLA-A*3303)
[0078] Como um exemplo não limitativo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-A A33 humana seguinte:
GSHSMRYFTTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDRNTRNVKAHSQIDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQMMYGCDVGS DGRFLRGYQQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWASVVVPSGQEQRYTCHVQHE
GLPKPLTLRWEPSSQPTIPIVGIIAGLVLFGAVFAGAVVAAVRWRRKSSDRKGGS YSQAASSDSAQGSDMSLTACKV (SEQ ID NO:241). Essa cadeia pesada de MHC de Classe I pode ser proeminente nas populações Asiáticas, incluindo populações de indivíduos de ascendência Asiática. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Ala. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 236 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Ala e o aminoácido 236 é um Cys. Em alguns casos, o aminoácido 84 é um Cys e o aminoácido 236 é um Cys. HLA-B
[0079] Como outro exemplo, um polipeptídio de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-B humana:
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIE QEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGP DGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRA YLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAE
ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEG LPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:229). HLA-B (Y84A; A236C)
[0080] Como um exemplo não limitativo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I é um polipeptídeo de HLA-B que compreende substituições Y84A e A236C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84A; A236C) de HLA-B seguinte:
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIE QEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGAYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGP DGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRA YLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAE
ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEG LPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:230), , onde o aminoácido 84 é Ala e o aminoácido 236 é Cys. Em alguns casos, o Cys-236 forma uma ligação dissulfeto inter-cadeia com Cys-12 de um polipeptídeo de β2M variante que compreende uma substituição R12C. HLA-B (Y84C; A139C)
[0081] Em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende substituições Y84A e A139C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84C; A139C) de HLA-B seguinte:
GSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIE QEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGCYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGP DGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKWEAAREAEQRRA YLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAE
ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEG LPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:231), onde o aminoácido 84 é Cys e o aminoácido 139 é Cys. Em alguns casos, o Cys-84 forma uma ligação dissulfeto intra-cadeia com o Cys-139. HLA-C
[0082] Como outro exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos de cadeia pesada de HLA-C humana:
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVE QEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHTLQRMYGCDLGP DGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRAY LEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEI
TLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHEG LQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:232). HLA-C (Y84A; A236C)
[0083] Como um exemplo não limitativo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I é um polipeptídeo de HLA-C que compreende substituições Y84A e A236C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84A; A236C) de HLA-C seguinte:
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVE QEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGAYNQSEDGSHTLQRMYGCDLG PDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAE ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHE
GLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:233), , onde o aminoácido 84 é Ala e o aminoácido 236 é Cys. Em alguns casos, o Cys-236 forma uma ligação dissulfeto inter-cadeia com Cys-12 de um polipeptídeo de β2M variante que compreende uma substituição R12C. HLA-C (Y84C; A139C)
[0084] Em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende substituições Y84A e A139C. Por exemplo, em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Y84C; A139C) de HLA-C seguinte:
CSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVE QEGPEYWDRETQNYKRQAQADRVSLRNLRGCYNQSEDGSHTLQRMYGCDLG PDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTCAQITQRKLEAARAAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAE
ITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHMQHE GLQEPLTLSWEP (SEQ ID NO:234),, onde o aminoácido 84 é Cys e o aminoácido 139 é Cys. Em alguns casos, o Cys-84 forma uma ligação dissulfeto intra-cadeia com o Cys-139.
[0085] Um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma das sequências de aminoácidos representadas na FIG. 5A-5K.
[0086] Como um exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos de 25-365 aminoácidos da sequência de aminoácidos de polipeptídeo de cadeia pesada de HLA-A humana representada na
FIG. 3A.
[0087] Como um exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos de 25-362 aminoácidos da sequência de aminoácidos de polipeptídeo de cadeia pesada de HLA-B humana representada na FIG. 3B.
[0088] Como um exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos de 25-362 aminoácidos da sequência de aminoácidos de polipeptídeo de cadeia pesada de HLA-C humana representada na FIG. 3C.
[0089] Como outro exemplo, um polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de Classe I de um polipeptídeo multimérico pode compreender uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos:
[0090] GPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDADNPRF
EPRAPWMEQEGPEYWEEQTQRAKSDEQWFRVSLRTAQRYYNQSKGGSHTFQ RMFGCDVGSDWRLLRGYQQFAYDGRDYIALNEDLKTWTAADTAALITRRKWEQ AGDAEYYRAYLEGECVEWLRRYLELGNETLLRTDSPKAHVTYHPRSQVDVTLRC
WALGFYPADITLTWQLNGEDLTQDMELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPLGKEQN YTCHVHHKGLPEPLTLRW (SEQ ID NO:54).
[0091] Um polipeptídeo de β2-microglobulina (β2M) de um polipeptídeo multimérico pode ser um polipeptídeo de β2M humano, um polipeptídeo de β2M de primata não humano, um polipeptídeo de β2M murino e semelhantes. Em alguns casos, um polipeptídeo de β2M compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos β2M representada na FIG. 4. Em alguns casos, um polipeptídeo de β2M compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com os aminoácidos 21 a 119 de uma sequência de aminoácidos β2M representada na FIG. 4.
[0092] Em alguns casos, o polipeptídeo da cadeia pesada de MHC de Classe I compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDL(aa1){C}(aa2)AGSHTVQRMYGCDVGSD WRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSW(aa3){C}(aa4)HKWEAAHVAEQLRAYLE
GTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITL
TWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLP KPLTLRWEP (SEQ ID NO: 238), em que os resíduos de cisteína indicados como {C} formam uma ligação dissulfeto entre as hélices α1 e α2-1. Na sequência acima, "aa1" é "cluster de aminoácidos 1"; "aa2" é "cluster de aminoácidos 2"; "aa3" é "cluster de aminoácidos 3"; e "aa4" é "cluster de aminoácidos 4"; ver, por exemplo, a FIG. 8. Um "cluster de aminoácidos" é um cluster de 5 aminoácidos contíguos, como representado na FIG. 8.
[0093] Em alguns casos, um polipeptídeo de β2M adequado compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
[0094] IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF
HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:56); e o polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
[0095] GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQR MEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDL(aa1){C}(aa2)AGSHTVQRM YGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSW(aa3){C}(aa4))HKWEAAHV
AEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWA LSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL(aa5)(C)(aa6)QKWAAVVVPSGQEQRYTCH VQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:239), onde os resíduos de cisteína indicados como {C} formam uma ligação dissulfeto entre as hélices α1 e α2-1 e o resíduo (C) forma uma ligação dissulfeto com o cisteína de polipeptídeo de β2M na posição 12. Na sequência acima, "aa1" é "cluster de aminoácidos 1"; "aa2" é "cluster de aminoácidos 2"; "aa3" é "cluster de aminoácidos 3"; "aa4" é "cluster de aminoácidos 4"; "aa5" é "cluster de aminoácidos 5"; e "aa6" é "cluster de aminoácidos 6"; ver, por exemplo, a FIG. 8. Cada ocorrência de aa1, aa2, aa3, aa4, aa5 e aa6 é e independentemente selecionada para ser de 1 a 5 resíduos de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos são i) selecionados independentemente de qualquer aminoácido de ocorrência natural (por exemplo, codificados) ou ii) qualquer aminoácido de ocorrência natural, exceto prolina ou glicina.
[0096] Em alguns casos, um polipeptídeo de MHC compreende uma única substituição de aminoácido em relação a uma referência de polipeptídeo de MHC (onde uma referência de polipeptídeo de MHC pode ser um polipeptídeo de MHC do tipo selvagem), em que a única substituição de aminoácidos substitui um aminoácido com um resíduo de cisteína (Cys). Tais resíduos de cisteína, quando presentes em um polipeptídeo de MHC de um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, podem formar uma ligação dissulfeto com um resíduo de cisteína presente em uma segunda cadeia de polipeptídeos de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação.
[0097] Em alguns casos, um primeiro polipeptídeo de MHC em um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico e/ou o segundo polipeptídeo de MHC no segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico inclui uma substituição de aminoácido para substituir um aminoácido com uma cisteína, em que a cisteína substituída no primeiro polipeptídeo de MHC forma uma ligação dissulfeto com um resíduo de cisteína no segundo polipeptídeo de MHC, onde uma cisteína no primeiro polipeptídeo de MHC forma uma ponte dissulfeto com a cisteína substituída no segundo polipeptídeo de MHC ou onde a cisteína substituída no primeiro polipeptídeo de MHC forma uma ponte dissulfeto com a cisteína substituída no segundo polipeptídeo de MHC.
[0098] Por exemplo, em alguns casos, um dos seguintes pares de resíduos em uma β2-microglobulina de HLA e uma cadeia pesada de HLA Classe I está substituída com cisteínas (onde números de resíduos são aqueles de polipeptídeos maduros): 1) resíduo 12 resíduo de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 236; 2) resíduo 12 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 237; 3) resíduo 8 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 234; 4) resíduo 10 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 235; 5) resíduos 24 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 236; 6) resíduo 28 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 232; 7) resíduo 98 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 192; 8) resíduo 99 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 234; 9) resíduo 3de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 120; 10) resíduo 31de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 96; 11) resíduo 53 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 35; 12) resíduo 60 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 96; 13) resíduo 60 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 122; 14) resíduo 63 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I 27; 15) resíduo Arg3 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Gly120; 16) resíduo His31 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Gln96; 17) resíduo Asp53 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Arg35; 18) resíduo TRP60 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Gln96; 19) resíduo TRP60de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Asp122; 20) resíduo Tyr63 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Tyr27; 21) resíduo Lys6 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Glu232; 22) resíduo Gln8 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Arg234; 23) resíduo Tyr10 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Pro235; 24) resíduo Ser11 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Gln242; 25) resíduo Asn24 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Ala236; 26) resíduo Ser28 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Glu232; 27) resíduo Asp98 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I His192; e 28) resíduo Met99 de β2M, resíduo de cadeia pesada de HLA Classe I Arg234. A numeração de aminoácidos da cadeia pesada de MHC/HLA Classe I refere-se à cadeia pesada madura de MHC/HLA Classe I, sem um peptídeo sinal.
Por exemplo, na sequência de aminoácidos representada na FIG. 3A, que inclui um peptídeo sinal, Gly120 é Gly144; Gln96 é Gln120; etc.
Em alguns casos, o polipeptídeo de β2M compreende uma substituição R12C e a cadeia pesada de HLA Classe I compreende uma substituição A236C; nesses casos, forma-se uma ligação dissulfeto entre Cys-12 do polipeptídeo de β2M e Cys-236 da cadeia pesada de HLA Classe I. Por exemplo, em alguns casos, o resíduo 236 da sequência de aminoácidos de HLA-A madura (isto é, o resíduo 260 da sequência de aminoácidos representada na FIG. 3A) é substituído por um Cys. Em alguns casos, o resíduo 236 da sequência de aminoácidos HLA-B madura (isto é, o resíduo 260 da sequência de aminoácidos representada na FIG. 3B) é substituído por um Cys. Em alguns casos, o resíduo 236 da sequência de aminoácidos de HLA-C madura (isto é, o resíduo 260 da sequência de aminoácidos representada na FIG. 3C) é substituído por um Cys. Em alguns casos, o resíduo 32 (correspondente a Arg-12 de β2M maduro) de uma sequência de aminoácidos representada na FIG. 4 é substituído por um Cys.
[0099] Em alguns casos, um polipeptídeo de β2M compreende a sequência de aminoácidos: IQRTPKIQVY SRHPAENGKS NFLNCYVSGF
HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:55). Em alguns casos, um polipeptídeo de β2M compreende a sequência de aminoácidos: IQRTPKIQVY SCHPAENGKS
NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:56).
[0100] Em alguns casos, um polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I compreende a sequência de aminoácidos:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGS DWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA
EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQH EGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:53).
[0101] Em alguns casos, um polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I compreende a sequência de aminoácidos:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRA PWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGC DVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAE QLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALS
FYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCH VQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:57).
[0102] Em alguns casos, um polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I compreende a sequência de aminoácidos:
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIE QEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGS DWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRA YLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPA
EITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQH EGLPKPLTLRWE (SEQ ID NO:58).
[0103] Em alguns casos, o polipeptídeo de β2M adequado compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
[0104] IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF
HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:56); e o polipeptídeo de cadeia pesada de HLA Classe I de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
[0105] GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQR
MEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQ RMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWE AAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATL
RCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQE QRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:57), onde os resíduos Cys sublinhados e em negrito formam uma ligação dissulfeto um com o outro no polipeptídeo multimérico.
[0106] Em alguns casos, o polipeptídeo de β2M adequado compreende a sequência de aminoácidos:
IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSF SKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:56).
[0107] Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo de um TMMP da presente divulgação são ligados por dissulfeto um ao outro através de: i) um resíduo Cys presente em um ligante peptídico que liga o epítopo peptídico e um polipeptídeo de β2M na primeira cadeia polipeptídica; e ii) um resíduo Cys presente em uma cadeia pesada de MHC de Classe I na segunda cadeia polipeptídica. Em alguns casos, o resíduo Cys presente na cadeia pesada de MHC de Classe I é um Cys introduzido como uma substituição Y84C. Em alguns casos, o ligante que conecta o epítopo peptídico e o polipeptídeo de β2M na primeira cadeia polipeptídica é GCGGS(G4S)n (SEQ ID NO: 235), onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Por exemplo, em alguns casos, o ligante compreende a sequência de aminoácidos GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 236). Como outro exemplo, o ligante compreende a sequência de aminoácidos GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 237). Exemplos de primeiro e segundo polipeptídeos ligados por dissulfeto de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação são representados esquematicamente na FIG. 7A-7D. Polipeptídeos de Suporte
[0108] Um TMMP pode compreender um polipeptídeo Fc, ou pode compreender outro polipeptídeo de suporte adequado.
[0109] Polipeptídeos de suporte adequados incluem polipeptídeos de suporte baseados em anticorpos e suportes não baseados em anticorpo. Suportes não baseados em anticorpos incluem, por exemplo, albumina, um polipeptídeo de XTEN (recombinante estendido), transferrina, um polipeptídio receptor de Fc, um polipeptídio semelhante a elastina (ver, por exemplo, Hassouneh et al. (2012) Methods Enzymol. 502:215; por exemplo, um polipeptídio que compreende uma unidade de repetição de pentapeptídio de (Val-Pro-Gly-X-Gly; SEQ ID NO: 59), onde X é qualquer aminoácido exceto prolina), um polipeptídio de ligação a albumina, um polipeptídio semelhante a seda (ver, por exemplo, Valluzzi et al. (2002) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 357: 165), um polipeptídeo semelhante a seda-elastina (SELP; ver, por exemplo, Megeed et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54:1075) e semelhantes. Polipeptídio de XTen adequados incluem, por exemplo, aqueles divulgados nos documentos WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682 e US 2009/0092582; ver também Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol. 27:1186). Polipeptídio de albumina adequados incluem, por exemplo, albumina do soro humano.
[0110] Polipeptídios de suporte adequados irão, em alguns casos, ser polipeptídios que estendem meia-vida. Assim, em alguns casos, um polipeptídio de suporte adequado aumenta a meia-vida in vivo (por exemplo, a meia-vida sérica) do polipeptídeo multimérico, em comparação com um polipeptídeo multimérico de controle ao qual falta o polipeptídio de suporte. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídio de suporte aumenta a meia-vida in vivo (por exemplo, a meia-vida sérica) do polipeptídio multimérico, em comparação com um polipeptídio multimérico de controle ao qual falta o polipeptídio de suporte, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes ou mais do que 100 vezes. Como um exemplo, em alguns casos, um polipeptídio Fc aumenta meia-vida in vivo (por exemplo, a meia-vida sérica) do polipeptídio multimérico, em comparação com um polipeptídeo multimérico de controle ao qual falta o polipeptídeo Fc, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes ou mais do que 100 vezes. Polipeptídeos Fc
[0111] Em alguns casos, a primeira e/ou a segunda cadeia polipeptídica de um polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo Fc. O polipeptídio Fc de um polipeptídio multimérico pode ser um Fc de IgG1 humana, um Fc de IgG2 humana, um Fc de IgG3 humana, um Fc de IgG4 humana, etc. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade da sequência com aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de uma região Fc representada na FIG. 2A-2G. Em alguns casos, a região Fc compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de
75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos com o polipeptídeo IgG1 Fc humano representado na FIG. 2A.
Em alguns casos, a região Fc compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% da identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo Fc IgG1 humano representado na FIG. 2A; e compreende uma substituição de N77; por exemplo, o polipeptídeo Fc compreende uma substituição de N77A.
Em alguns casos, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos com o polipeptídeo Fc IgG2 humano representado na FIG. 2A; por exemplo, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%, de identidade de sequência de aminoácidos com os aminoácidos 99-325 do polipeptídeo Fc IgG2 humano representado na FIG. 2A.
Em alguns casos, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo Fc IgG3 humano representado na FIG. 2A; por exemplo, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%, da identidade de sequência de aminoácidos com os aminoácidos 19-246 do polipeptídeo Fc IgG3 humano representado na FIG. 2A.
Em alguns casos, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo Fc IgM humano representado na FIG. 2B; por exemplo, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com os aminoácidos 1-276 do polipeptídeo Fc IgM humano representado na FIG. 2B. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo Fc IgA humano representado na FIG. 2C; por exemplo, o polipeptídeo Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-234 com o polipeptídeo Fc IgA humano representado na FIG. 2C.
[0112] Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano). Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto pela substituição de N297 por um aminoácido diferente de asparagina. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2C (Fc IgG1 humano compreendendo uma substituição de N297A). Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto pela substituição de L234 por um aminoácido diferente de leucina. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto pela substituição de L235 por um aminoácido diferente de leucina.
[0113] Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2E. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2F. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2G (Fc IgG1 humano compreendendo uma substituição de L234A e uma substituição de L235A). Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto para uma substituição de P331 por um aminoácido diferente de prolina; em alguns casos, a substituição é uma substituição de P331S. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto pela substituição de L234 e L235 por aminoácidos diferentes de leucina. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2A (Fc IgG1 humano), exceto para substituições em L234 e L235 com aminoácidos que não sejam leucina e uma substituição de P331 com um aminoácido que não seja prolina. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico compreende a sequência de aminoácidos representada na FIG. 2B (Fc IgG1 humano compreendendo substituições de L234F, L235E e P331S). Em alguns casos, o polipeptídeo Fc presente em um polipeptídeo multimérico é um polipeptídeo Fc IgG1 que compreende substituições de L234A e L235A. Ligantes
[0114] Um TMMP da presente divulgação pode incluir um ou mais ligantes, onde o um ou mais ligantes estão entre um ou mais dentre: i) um polipeptídeo de MHC de Classe I ou Classe II e um polipeptídeo Fc Ig , onde esse ligante é referido neste documento como "L1"; ii) um polipeptídeo imunomodulador e um polipeptídeo de MHC de Classe I ou Classe II, onde esse ligante é aqui referido neste documento como "L2"; iii) um primeiro polipeptídeo imunomodulador e um segundo polipeptídeo imunomodulador, onde esse ligante é referido neste documento como "L3"; iv) um antígeno peptídico ("epítopo") e um polipeptídeo de MHC de Classe I ou Classe II; v) um polipeptídeo de MHC de Classe I ou Classe II e um polipeptídeo de dimerização (por exemplo, um primeiro ou um segundo membro de um par dimerizante); e vi) um polipeptídeo de dimerização (por exemplo, um primeiro ou um segundo membro de um par dimerizante) e um polipeptídeo Fc Ig.
[0115] Ligantes adequados (também referidos como "espaçadores") podem ser prontamente selecionados e podem ser de qualquer de um número de comprimentos adequados, tais como de 1 aminoácido a 25 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos. Um ligante adequado pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento. Em alguns casos, um ligante tem um comprimento de 25 aminoácidos a 50 aminoácidos, por exemplo, de 25 a 30, de 30 a 35, de 35 a 40, de 40 a 45 ou de 45 a 50 aminoácidos de comprimento.
[0116] Ligantes exemplificativos incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 60) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 61), onde n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Podem ser usados polímeros de glicina e glicina-serina; Gly e Ser são relativamente desestruturados e, portanto, podem servir como uma cadeia neutra entre os componentes. Podem ser usados polímeros de glicina; a glicina ocupa significativamente mais espaço phi-psi do que a alanina uniforme e é muito menos restrita do que os resíduos com cadeias laterais mais longas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Ligantes exemplificativos podem compreender sequências de aminoácidos incluindo, mas não se limitando a, GGSG (SEQ ID NO: 62), GGSGG (SEQ ID NO: 63), GSGSG (SEQ ID NO: 64), GSGGG (SEQ ID NO: 65), GGGSG (SEQ ID NO: 66), GSSSG (SEQ ID NO: 67) e similares. Ligantes exemplificativos podem incluir, por exemplo, Gly(Ser4)n (SEQ ID NO: 251), onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GSSSS)n (SEQ ID NO: 68), onde n é 4. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GSSSS)n (SEQ ID NO: 68), onde n é 5. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 1. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 2. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 3. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 4. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 5. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 6. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é
7. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 8, em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 9, em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 69), onde n é 10. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos AAAGG (SEQ ID NO: 70).
[0117] Em alguns casos, um polipeptídeo ligante, presente em um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, inclui um resíduo de cisteína que podem formar uma ponte de dissulfureto com um resíduo de cisteína presente em um segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Em alguns casos, por exemplo, um ligante adequado compreende a sequência de aminoácidos LCGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71). Como outro exemplo, um ligante adequado pode compreender a sequência de aminoácidos GCGGS(G4S)n (SEQ ID NO: 235), em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou
9. Por exemplo, em alguns casos, o ligante compreende a sequência de aminoácidos GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 236). Como outro exemplo, o ligante compreende a sequência de aminoácidos GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 237).
Epítopos
[0118] Um epítopo presente num polipeptídeo multimérico pode ter um comprimento de cerca de 4 aminoácidos e cerca de 25 aminoácidos, por exemplo, o epítopo pode ter um comprimento de 4 aminoácidos (aa) a 10 aa, de 10 aa a 15 aa, a partir de 15 aa a 20 aa, ou a partir de 20 aa a 25 aa. Por exemplo, um epítopo presente num polipeptídeo multimérico da presente divulgação pode ter um comprimento de 4 aminoácidos (aa), 5 aa, 6 aa, 7, aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 AA, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, 20 aa, 21 aa, 22 aa, 23 aa, 24 aa ou 25 aa. Em alguns casos, um epítopo presente num polipeptídeo multimérico tem um comprimento de 5 aminoácidos a 10 aminoácidos, por exemplo, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, ou 10 aa.
[0119] Um epítopo presente em um polipeptídeo multimérico é um peptídeo especificamente ligado a uma célula T, isto é, o epítopo é especificamente ligado a uma célula T específica do epítopo. Uma célula T específica de epítopo se liga a um epítopo que possui uma sequência de aminoácidos de referência, mas não se liga substancialmente a um epítopo que difere da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, uma célula T específica do epítopo se liga a um epítopo que possui uma sequência de aminoácidos de referência e se liga a um epítopo que difere da sequência de aminoácidos de referência, se isso sequer ocorrer, com uma afinidade que é menos do que 10-6 M, menos do que 10-5 M, ou menos do que 10-4 M. Uma célula T específica do epítopo pode se ligar a um epítopo para o qual é determinada com uma afinidade de pelo menos 10 -7 M, pelo menos 10-8 M, pelo menos 10-9 M, ou pelo menos 10-10 M.
[0120] Epítopos adequados incluem, mas não estão limitados a epítopos presentes em um antígeno associado ao câncer. Os antígenos associados ao câncer são conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15: 5323. Os antígenos associados ao câncer incluem, mas não estão limitados a receptor de α-folato; anidrase carbônica IX (CAIX); CD19; CD20; CD22; CD30; CD33; CD44v7 / 8; antígeno carcinoembrionário (CEA); glicoproteína-2 epitelial (EGP-2); glicoproteína-40 epitelial (EGP-40); proteína de ligação ao folato (FBP); receptor de acetilcolina fetal; antígeno gangliosídeo GD2; Her2/neu; IL-13R- a2; cadeia leve kappa; LeY; molécula de adesão de células L1; antígeno associado ao melanoma (MAGE); MAGE-A1; mesotelina; MUC1; ligantes de NKG2D; antígeno oncofetal (h5T4); antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA); antígeno de membrana específico da próstata (PSMA); glicoproteína-72 associada ao tumor (TAG-72); receptor de fator de crescimento endotelial vascular-2 (VEGF-R2). Veja, por exemplo, Vigneron et al. (2013) Cancer Immunity 13:15; e Vigneron (2015) BioMed Res. Int’l Artigo ID 948501; e polipeptídeo do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) vIII (Veja, por exemplo, Wong et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2965; e Miao et al. (2014) PLoSOne 9:e94281). Em alguns casos, o epítopo é um epítopo do antígeno E7 do vírus do papiloma humano; veja, por exemplo, Ramos et al. (2013) J. Immunother. 36:66.
[0121] Em alguns casos, um epítopo de peptídeo adequado é um fragmento peptídico de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos (por exemplo, 4 aminoácidos (aa), 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa ou 20 aa) de comprimento de um polipeptídeo MUC1, um polipeptídeo E6 de papiloma humano (HPV) E6, um polipeptídeo LMP2, um polipeptídeo HPV E7, um polipeptídeo do receptor epidérmico do fator de crescimento (EGFR) vIII, um polipeptídeo HER-2/neu, um antígeno do melanoma da família A, polipeptídeo 3 da família MAGE A3, um polipeptídeo p53, um polipeptídeo mutante p53 e um polipeptídeo NY-ESO-1, um polipeptídeo de folato hidrolase (antígeno de membrana específico da próstata; PSMA), um polipeptídeo de antígeno carcinoembrionário (CEA), um antígeno de melanoma reconhecido pelo polipeptídeo de células T (melanA/MART1),um polipeptídeo Ras, um polipeptídeo gp100, um polipeptídeo de proteinase3 (PR1), um polipeptídeo bcr- abl, um polipeptídeo de tirosinase, um polipeptídeo de survivina, um polipeptídeo de antígeno prostático específico (PSA), um polipeptídeo hTERT, um polipeptídeo de pontos de quebra de translocação de sarcoma, um sarcoma sinovial X (SSX), um polipeptídeo de ponto de quebra, um polipeptídeo EphA2, uma fosfatase ácida, um polipeptídeo da próstata (PAP), um polipeptídeo inibidor de melanoma da apoptose (ML-IAP), um polipeptídeo de alfa-fetoproteína (AFP), uma molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), um polipeptídeo ERG (fusão TMPRSS2 ETS), um polipeptídeo NA17, um polipeptídeo "paired-box-3" (PAX3), um polipeptídeo anaplásico de linfoma quinase (ALK), um polipeptídeo de receptor de androgênio,
um polipeptídeo de ciclina B1, um polipeptídeo de proto-oncogene N-myc (MYCN), um polipeptídeo de membro C da família do gene homólogo Ras (RhoC), um polipeptídeo da proteína 2 relacionado à tirosinase (TRP-2), um polipeptídeo da mesotelina, um polipeptídeo da célula-tronco prostática (PSCA), um polipeptídeo de antígeno-1 associado a melanoma (MAGE A1), polipeptídeo do citocromo P450 1B1 (CYP1B1), polipeptídeo da proteína 1 específica da placenta (PLAC1), um polipeptídeo BORIS (também conhecido como fator de ligação a CCCTC ou CTCF), polipeptídeo ETV6-AML, polipeptídeo NY-BR-1 do antígeno do câncer de mama (também conhecido como proteína 30A contendo domínio de repetição de anquirina), um regulador do polipeptídeo de sinalização da proteína G (RGS5), um polipeptídeo de antígeno de carcinoma espinocelular por células T (SART3), um polipeptídeo de anidrase carbônica IX, um polipeptídeo "paired box-5" (PAX5), um OY-TES1 (antígeno testicular; também conhecido como polipeptídeo de proteína de ligação à acrosina), um polipeptídeo de proteína 17 do esperma, um polipeptídeo de proteína-tirosina quinase (LCK) específico de célula de linfócito, um antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), uma proteína-4 de ancoragem de A-quinase (AKAP-4), um polipeptídeo do ponto de quebra 2 do sarcoma sinovial X (SSX2), um polipeptídeo do membro da família 1 de antígeno X (XAGE1), um polipeptídeo B7 homólogo 3 (B7H3; também conhecido como CD276), um polipeptídeo legumaina (LGMN1; também conhecido como asparaginil endopeptidase), um polipeptídeo de tirosina-quinase com os domínios 2 de homologia de Ig e EGF (Tie-2; também conhecido como receptor da angiopoietina- 1), um polipeptídeo do membro da família 4 do antígeno P (PAGE4), um receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF2), um polipeptídeo MAD-CT-1, um polipeptídeo de proteína de ativação de fibroblastos (FAP), um polipeptídeo de receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFβ), um polipeptídeo MAD-CT-2, um polipeptídeo de antígeno-1 relacionado a Fos (FOSL) ou um polipeptídeo de tumor-1 de Wilms (WT-1).
[0122] As sequências de aminoácidos de antígenos associados ao câncer são conhecidas na técnica; ver, por exemplo, MUC1 (GenBank CAA56734); LMP2 (GenBank CAA47024); HPV E6 (GenBank AAD33252); HPV E7 (GenBank AHG99480); EGFRvIII (GenBank NP_001333870); HER-2 / neu (GenBank
AAI67147); MAGE-A3 (GenBank AAH11744); p53 (GenBank BAC16799); NY- ESO-1 (GenBank CAA05908); PSMA (GenBank AAH25672); CEA (GenBank AAA51967); melan / MART1 (GenBank NP_005502); Ras (GenBank NP_001123914); gp100 (GenBank AAC60634); bcr-abl (GenBank AAB60388); tirosinase (GenBank AAB60319); survivina (GenBank AAC51660); PSA (GenBank CAD54617); hTERT (GenBank BAC11010); SSX (GenBank NP_001265620); Eph2A (GenBank NP_004422); PAP (GenBank AAH16344); ML-IAP (GenBank AAH14475); AFP (GenBank NP_001125); EpCAM (GenBank NP_002345); ERG (fusão TMPRSS2 ETS) (GenBank ACA81385); PAX3 (GenBank AAI01301); ALK (GenBank NP_004295); receptor de androgênio (GenBank NP_000035); ciclina B1 (GenBank CAO99273); MYCN (GenBank NP_001280157); RhoC (GenBank AAH52808); TRP-2 (GenBank AAC60627); mesotelina (GenBank AAH09272); PSCA (GenBank AAH65183); MAGE A1 (GenBank NP_004979); CYP1B1 (GenBank AAM50512); PLAC1 (GenBank AAG22596); BORIS (GenBank NP_001255969); ETV6 (GenBank NP_001978); NY-BR1 (GenBank NP_443723); SART3 (GenBank NP_055521); anidrase carbônica IX (GenBank EAW58359); PAX5 (GenBank NP_057953); OY-TES1 (GenBank NP_115878); proteína 17 do esperma (GenBank AAK20878); LCK (GenBank NP_001036236); HMW-MAA (GenBank NP_001888); AKAP-4 (GenBank NP_003877); SSX2 (GenBank CAA60111); XAGE1 (GenBank NP_001091073; XP_001125834; XP_001125856; e XP_001125872); B7H3 (GenBank NP_001019907; XP_947368; XP_950958; XP_950960; XP_950962; XP_950963; XP_950965; e XP_950967); LGMN1 (GenBank NP_001008530); TIE-2 (GenBank NP_000450); PAGE4 (GenBank NP_001305806); VEGFR2 (GenBank NP_002244); MAD-CT-1 (GenBank NP_005893 NP_056215); FAP (GenBank NP_004451); PDGFβ (GenBank NP_002600); MAD-CT-2 (GenBank NP_001138574); FOSL (GenBank NP_005429); e WT-1 (GenBank NP_000369). Esses polipeptídeos também são discutidos em, por exemplo, Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15: 5323 e referências citadas no documento em questão; Wagner et al. (2003) J. Cell. Sci. 116:1653; Matsui et al. (1990) Oncogene 5:249; Zhang et al. (1996) Nature 383:168;
[0123] Em alguns casos, o epítopo é HPV16E7/82-90 (LLMGTLGIV; SEQ ID NO: 72). Em alguns casos, o epítopo é HPV16E7/86-93 (TLGIVCPI; SEQ ID NO:
73). Em alguns casos, o epítopo é HPV16E7/11-20 (YMLDLQPETT; SEQ ID NO: 74). Em alguns casos, o epítopo é HPV16E7/11-19 (YMLDLQPET; SEQ ID NO: 75). Veja, por exemplo, Ressing et al. ((1995) J. Immunol. 154: 5934) para epítopos de HPV adequados adicionais. Polipeptídeos imunomoduladores
[0124] Os domínios imunomoduladores adequados que exibem afinidade reduzida para um domínio coimunomodulador podem ter de 1 aminoácido (aa) a 20 aa de diferenças em relação a um domínio imunomodulador do tipo selvagem. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação difere na sequência de aminoácidos por 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, ou 10 aa de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação difere na sequência de aminoácidos por 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, ou 20 aa de um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem correspondente. Como um exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos, em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui uma única substituição de aminoácidos em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 2 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 2 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 3 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 3 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 4 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 4 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 5 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 5 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 6 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 6 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 7 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 7 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 8 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 8 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 9 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 9 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 10 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 10 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0125] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 11 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 11 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0126] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 12 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 12 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0127] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 13 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 13 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0128] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 14 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 14 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0129] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 15 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 15 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0130] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 16 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 16 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0131] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 17 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 17 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0132] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 18 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 18 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0133] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 19 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 19 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0134] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação inclui 20 substituições de aminoácidos (por exemplo, não mais que 20 substituições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo imunomodulador de referência correspondente (por exemplo, do tipo selvagem).
[0135] Como discutido acima, um polipeptídeo imunomodulador variante adequado para inclusão em um TMMP da presente divulgação exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo coimunomodulador cognato, em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo coimunomodulador cognato.
[0136] Exemplos de pares de polipeptídeo imunomodulador e polipeptídeo coimunomodulador cognato incluem, mas não estão limitados a:
[0137] a) 4-1BBL (polipeptídeo imunomodulador) e 4-1BB (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0138] b) PD-L1 (polipeptídeo imunomodulador) e PD1 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0139] c) IL-2 (polipeptídeo imunomodulador) e receptor de IL-2 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0140] d) CD80 (polipeptídeo imunomodulador) e CD86 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0141] e) CD86 (polipeptídeo imunomodulador) e CD28 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0142] f) OX40L (CD252) (polipeptídeo imunomodulador) e OX40 (CD134) (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0143] g) ligando Fas (polipeptídeo imunomodulador) e Fas (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0144] h) ICOS-L (polipeptídeo imunomodulador) e ICOS (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0145] i) ICAM (polipeptídeo imunomodulador) e LFA-1 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0146] j) CD30L (polipeptídeo imunomodulador) e CD30 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0147] k) CD40 (polipeptídeo imunomodulador) e CD40L (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0148] l) CD83 (polipeptídeo imunomodulador) e CD83L (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0149] m) HVEM (CD270) (polipeptídeo imunomodulador) e CD160 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0150] n) JAG1 (CD339) (polipeptídeo imunomodulador) e Notch (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0151] o) JAG1 (polipeptídeo imunomodulador) e CD46 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0152] p) CD80 (polipeptídeo imunomodulador) e CTLA4 (polipeptídeo coimunomodulador cognato);
[0153] q) CD86 (polipeptídeo imunomodulador) e CTLA4 (polipeptídeo coimunomodulador cognato); e
[0154] r) CD70 (polipeptídeo imunomodulador) e CD27 (polipeptídeo coimunomodulador cognato).
[0155] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação tem uma afinidade de ligação para um polipeptídeo coimunomodulador cognato que é de 100 nM a 100 μM. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação tem uma afinidade de ligação a um polipeptídeo coimunomodulador cognato que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0156] Um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo coimunomodulador cognato. Da mesma forma, um TMMP da presente divulgação que compreende um polipeptídeo imunomodulador variante exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo coimunomodulador cognato. Assim, por exemplo, um TMMP da presente divulgação que compreende um polipeptídeo imunomodulador variante tem uma afinidade de ligação a um polipeptídeo coimunomodulador cognato que é de 100 nM a 100 μM. Por exemplo, em alguns casos, um TMMP da presente divulgação que compreende um polipeptídeo imunomodulador variante tem uma afinidade de ligação a um polipeptídeo coimunomodulador cognato que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM. Variantes PD-L1
[0157] Como um exemplo não limitativo, em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação é um polipeptídeo PD-L1 variante. PD-L1 de tipo selvagem se liga a PD1.
[0158] Um polipeptídeo PD-L1 humano de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT
VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS
DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKICLT LSPST (SEQ ID NO:1).
[0159] Um ectodomínio de PD-L1 humano de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: FT VTVPKDLYVV
EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT
TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:2).
[0160] Um polipeptídeo PD-1 do tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA
LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV
ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL (SEQ ID NO:3). Em alguns casos, onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo variante PD-L1, um "polipeptídeo coimunomodulador cognato" é um polipeptídeo PD-1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
3.
[0161] Em alguns casos, um polipeptídeo variante PD-L1 exibe afinidade de ligação reduzida a PD-1 (por exemplo, um polipeptídeo de PD-1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo PD-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante da presente divulgação liga-se a PD- 1 (por exemplo, um polipeptídeo PD-1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3) com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% menos, pelo menos 55% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 65% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 85% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais que 95% menor que a afinidade de ligação de um polipeptídeo PD-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[0162] Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem uma afinidade de ligação a PD-1 que é de 1nM a 1mM. Em alguns casos, um polipeptídeo variante PD-L1 da presente divulgação tem uma afinidade de ligação a PD-1 que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante PD- L1 tem uma afinidade de ligação a PD1 (por exemplo, um polipeptídeo PD1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3) que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, para cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0163] Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD- L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[0164] Uma variante PD-L1 adequada inclui um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos:
[0165] FT VTVPKXLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME
DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY
PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:76), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala. Em alguns casos, X é Arg.
[0166] Uma variante PD-L1 adequada inclui um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos:
[0167] FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALXVYWEME
DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY
PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:77), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ile. Em alguns casos, X é Asp.
[0168] Uma variante PD-L1 adequada inclui um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos:
[0169] FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME
DKNIIQFVHG EXDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY
PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:78), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Arg. Variantes de CD80
[0170] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação é um polipeptídeo CD80 variante. O CD80 do tipo selvagem se liga a CD28. O CD80 do tipo selvagem também se liga a CD86.
[0171] Uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem do ectodomínio de CD80 humano pode ser a seguinte:
[0172] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:4).
[0173] Uma sequência de aminoácidos de CD28 do tipo selvagem pode ser a seguinte: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC
KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL
CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (SEQ ID NO:5). Em alguns casos, onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo variante CD80, um "polipeptídeo coimunomodulador cognato" é um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0174] Uma sequência de aminoácidos CD28 de tipo selvagem pode ser a seguinte: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSW
KHLCPSPLFP GPSKPFWVLV VVGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR RPGPTRKHYQ PYAPPRDFAA YRS (SEQ ID NO:6)
[0175] Uma sequência de aminoácidos CD28 do tipo selvagem pode ser a seguinte: MLRLLLALNL FPSIQVTGKH LCPSPLFPGP SKPFWVLVVV
GGVLACYSLL VTVAFIIFWV RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S (SEQ ID NO:7).
[0176] Em alguns casos, um polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação reduzida a CD28, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo CD80 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 para CD28. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo CD80 variante liga CD28 com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% menos, pelo menos 55% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 65% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 85% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo CD80 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 para CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em uma das SEQ ID NO: 5, 6 ou 7).
[0177] Em alguns casos, um polipeptídeo variante de CD80 possui uma afinidade de ligação a CD28 que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo CD80 variante da presente divulgação tem uma afinidade de ligação a CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7) que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, para cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0178] Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO:
4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO:
4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD80 possui 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD80 estabelecida na SEQ ID NO: 4.
[0179] As variantes CD80 adequadas incluem um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[0180] VIHVTK EVKEVATLSC GHXVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:79), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0181] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITXNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:80), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0182] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS XVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:81), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ile. Em alguns casos, X é Ala;
[0183] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLX YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY
GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:82), em que X é qualquer aminoácido que não seja Lys. Em alguns casos, X é Ala;
[0184] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS XDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:83), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0185] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QXPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:84), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0186] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEEXA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:85), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0187] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIXWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:86), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0188] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWXKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:87), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0189] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KXVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:88), em que X é qualquer aminoácido que não seja Met. Em alguns casos, X é Ala;
[0190] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMXLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:89), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0191] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNXWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:90), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ile. Em alguns casos, X é Ala;
[0192] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEXKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:91), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0193] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFXITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:92), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0194] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DXPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:93), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0195] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVX QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:94), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala; e
[0196] VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK
KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTXSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE
PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:95), em que X é qualquer aminoácido que não seja Pro. Em alguns casos, X é Ala. Variantes CD86
[0197] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação é um polipeptídeo CD86 variante. O CD86 do tipo selvagem se liga a CD28. Em alguns casos, onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo variante CD86, um "polipeptídeo coimunomodulador cognato" é um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0198] A sequência de aminoácidos do ectodomínio completo de um CD86 humano do tipo selvagem pode ser a seguinte:
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSV LANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKS
QDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:8).
[0199] A sequência de aminoácidos do domínio IgV de um CD86 humano de tipo selvagem pode ser a seguinte:
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS
VHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSV L (SEQ ID NO:9).
[0200] Em alguns casos, um polipeptídeo CD86 variante exibe afinidade de ligação reduzida a CD28, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo CD86 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 para CD28. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo CD86 variante liga CD28 com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% menos, pelo menos 55% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 65% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 85% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo CD86 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 para CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em uma das SEQ ID NO: 5, 6 ou 7).
[0201] Em alguns casos, um polipeptídeo variante de CD86 possui uma afinidade de ligação a CD28 que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo CD86 variante da presente divulgação tem uma afinidade de ligação a CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NO: 5, 6 ou 7) que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, para cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0202] Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO:
8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO:
8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 8.
[0203] Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO:
9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO:
9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo variante CD86 possui 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos CD86 estabelecida na SEQ ID NO: 9.
[0204] As variantes CD86 adequadas incluem um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[0205] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:96), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0206] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFXSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:97), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0207] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSXTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:98), em que X é qualquer aminoácido que não seja Trp. Em alguns casos, X é Ala;
[0208] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:99), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0209] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:100), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0210] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFXSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:101), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0211] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSXTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:102), em que X é qualquer aminoácido que não seja Trp. Em alguns casos, X é Ala;
[0212] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:103), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0213] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLXLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:104), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0214] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLXLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:105), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0215] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWXDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:106), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0216] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWXDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:107), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0217] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVXWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:108), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0218] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVXWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:109), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0219] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTXRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRI HQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTI
EYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELE DPQPPPDHIP (SEQ ID NO:110), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0220] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTXRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRI HQMNSELSVL (SEQ ID NO:111), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0221] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKXMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:112), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0222] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKXMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:113), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0223] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIH QMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIE
YDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELED PQPPPDHIP (SEQ ID NO:114), em que o primeiro X é qualquer aminoácido que não seja Asn e o segundo X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, o primeiro e o segundo X são ambos Ala;
[0224] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV
YLGKEKFDSVHSKYMXRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHXKKPTGMIRIH QMNSELSVL (SEQ ID NO:115), em que o primeiro X é qualquer aminoácido que não seja Asn e o segundo X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, o primeiro e o segundo X são ambos Ala;
[0225] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFX1SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX2KKPTGMIRI
HQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTI
EYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELE DPQPPPDHIP (SEQ ID NO:116), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asp e X2 é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X 1 é Ala e X2 é Ala;
[0226] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV YLGKEKFDSVHSKYMNRTSFX1SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX2KKPTGMIRI HQMNSELSVL (SEQ ID NO:117), em que o primeiro X é qualquer aminoácido que não seja Asn e o segundo X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, o primeiro e o segundo X são ambos Ala;
[0227] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV YLGKEKFDSVHSKYMX1RTSFX2SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX3KKPTGMIR
IHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTI
EYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELE DPQPPPDHIP (SEQ ID NO:118), onde X1 é qualquer aminoácido que não seja Asn, X2 é qualquer aminoácido que não seja Asp e X3 é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala; e
[0228] APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEV YLGKEKFDSVHSKYMX1RTSFX2SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHX3KKPTGMIR IHQMNSELSVL (SEQ ID NO:119), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asn, X2 é qualquer aminoácido que não seja Asp e X3 é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala. Variantes 4-1BBL
[0229] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação é um polipeptídeo 4-1BBL variante. 4-1BBL do tipo selvagem liga-se a 4-1BB (CD137).
[0230] Uma sequência de aminoácidos 4-1BBL do tipo selvagem pode ser a seguinte: MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL
LAAACAVFLA CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS
EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:10).
[0231] Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante é uma variante do domínio de homologia (THD) do fator de necrose tumoral (TNF) do 4-1BBL humano.
[0232] Uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem de THD do 4-1BBL humano pode ser, por exemplo, uma das SEQ ID NOs: 11-13, como a seguir:
[0233] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:11).
[0234] D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:12).
[0235] D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY
SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS
VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPA (SEQ ID NO:13).
[0236] Uma sequência de aminoácidos 4-1BB do tipo selvagem pode ser a seguinte: MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN
RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF
FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL (SEQ ID NO:14). Em alguns casos, em que um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo variante 4-1BBL, um "polipeptídeo coimunomodulador cognato" é um polipeptídeo 4-1BB compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
[0237] Em alguns casos, um polipeptídeo variante 4-1BBL exibe afinidade de ligação reduzida a 4-1BB, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo 4-1BBL compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante 4-1BBL da presente divulgação liga 4-1BB com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 15% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 25%, pelo menos 30% menos, pelo menos 35% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 45% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 55% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 65% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 85% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo 4-1BBL compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13 para um polipeptídeo 4-1BB (por exemplo, um polipeptídeo 4-1BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14), quando ensaiada sob as mesmas condições.
[0238] Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante tem uma afinidade de ligação a 4-1BB que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante 4-1BBL tem uma afinidade de ligação a 4- 1BB (por exemplo, um polipeptídeo PD1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14) que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, para cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0239] Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo variante 4-1BBL possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos 4- 1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13. Em alguns casos, um polipeptídeo 4-1BBL variante possui 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de 4-1BBL estabelecida em uma das SEQ ID NOs: 10-13.
[0240] As variantes 4-1BBL adequadas incluem um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[0241] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYXEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA
RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:120), em que X é qualquer aminoácido que não seja Lys. Em alguns casos, X é Ala;
[0242] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWXLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:121), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0243] PAGLLDLRQG XFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:122), em que X é qualquer aminoácido que não seja Met. Em alguns casos, X é Ala;
[0244] PAGLLDLRQG MXAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:123), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0245] PAGLLDLRQG MFAXLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:124), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0246] PAGLLDLRQG MFAQXVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:125), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0247] PAGLLDLRQG MFAQLXAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:126), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0248] PAGLLDLRQG MFAQLVAXNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:127), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0249] PAGLLDLRQG MFAQLVAQXV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:128), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0250] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNX LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:129), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0251] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV XLIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:130), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0252] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LXIDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:131), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0253] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLXDGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:132), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ile. Em alguns casos, X é Ala;
[0254] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIXGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:133), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0255] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDXPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:134), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0256] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGXLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:135), em que X é qualquer aminoácido que não seja Pro. Em alguns casos, X é Ala;
[0257] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPXSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:136), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0258] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLXWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:137), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0259] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSXY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:138), em que X é qualquer aminoácido que não seja Trp. Em alguns casos, X é Ala;
[0260] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWX SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA
RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:139), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0261] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY XDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:140), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0262] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SXPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:141), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0263] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDXGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:142), em que X é qualquer aminoácido que não seja Pro. Em alguns casos, X é Ala;
[0264] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPXLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:143), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0265] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGXAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:144), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0266] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAXVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:145), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ile. Em alguns casos, X é Ala;
[0267] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGXSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:146), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0268] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVXL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:147), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0269] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSX
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:148), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0270] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
XGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:149), em que X é qualquer aminoácido que não seja Thr. Em alguns casos, X é Ala;
[0271] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TXGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:150), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0272] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGXLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:151), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0273] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGXSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:152), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0274] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLXYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:153), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0275] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSXKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:154), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0276] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKXDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:155), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0277] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEXT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:156), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0278] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDX KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:157), em que X é qualquer aminoácido que não seja Thr. Em alguns casos, X é Ala;
[0279] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT XELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA
RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:158), em que X é qualquer aminoácido que não seja Lys. Em alguns casos, X é Ala;
[0280] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KXLVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:159), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0281] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVXFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:160), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0282] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFXQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:161), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0283] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFXLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:162), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0284] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQXELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:163), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0285] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLXLR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:164), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0286] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLEXR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:165), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0287] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELX RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:166), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0288] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR XVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:167), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0289] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RXVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:168), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0290] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVXAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:169), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0291] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAXEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:170), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0292] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGXGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:171), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0293] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEXSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:172), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0294] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGXGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:173), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0295] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVXLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:174), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0296] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDXPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:175), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0297] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLXPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:176), em que X é qualquer aminoácido que não seja Pro. Em alguns casos, X é Ala;
[0298] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPAXS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA
RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:177), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0299] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASX EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:178), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0300] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS XARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:179), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0301] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EAXNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:180), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0302] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARXSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:181), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asn. Em alguns casos, X é Ala;
[0303] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNXAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:182), em que X é qualquer aminoácido que não seja Ser. Em alguns casos, X é Ala;
[0304] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAXGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:183), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0305] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGX RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:184), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0306] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ XLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:185), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0307] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RXGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:186), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0308] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLXVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:187), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0309] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGXHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:188), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala;
[0310] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVXLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:189), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0311] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHXHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:190), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0312] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLXTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:191), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0313] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHXEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:192), em que X é qualquer aminoácido que não seja Thr. Em alguns casos, X é Ala;
[0314] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTXA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:193), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0315] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA XARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:194), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0316] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RAXHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:195), em que X é qualquer aminoácido que não seja Arg. Em alguns casos, X é Ala;
[0317] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA
RARXAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:196), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0318] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAXQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:197), em que X é qualquer aminoácido que não seja Trp. Em alguns casos, X é Ala;
[0319] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQXTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:198), em que X é qualquer aminoácido que não seja Leu. Em alguns casos, X é Ala;
[0320] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLXQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:199), em que X é qualquer aminoácido que não seja Thr. Em alguns casos, X é Ala;
[0321] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTX GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:200), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0322] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ XATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:201), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gly. Em alguns casos, X é Ala;
[0323] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GAXVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:202), em que X é qualquer aminoácido que não seja Thr. Em alguns casos, X é Ala; e
[0324] PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL
RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATXLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:203), em que X é qualquer aminoácido que não seja Val. Em alguns casos, X é Ala. Variantes IL-2
[0325] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador variante presente em um TMMP da presente divulgação é um polipeptídeo IL-2 variante. IL- 2 do tipo selvagem se liga ao receptor de IL-2 (IL-2R), isto é, um polipeptídeo heterotrimérico compreendendo IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ.
[0326] Uma sequência de aminoácidos de IL-2 do tipo selvagem pode ser a seguinte: APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:15).
[0327] IL2 do tipo selvagem se liga a um receptor de IL2 (IL2R) na superfície de uma célula. Um receptor de IL2 é, em alguns casos, um polipeptídeo heterotrimérico compreendendo uma cadeia alfa (IL-2Rα; também referida como CD25), uma cadeia beta (IL-2Rβ; também referida como CD122: e uma cadeia gama (IL-2Rγ; também referida como CD132). As sequências de aminoácidos de IL-2Rα, IL2Rβ e IL-2Rγ humanas podem ser as seguintes.
[0328] IL-2Rα Humano: ELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE
CKRGFRRIKS GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY HFVVGQMVYY QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET SQFPGEEKPQ
ASPEGRPESE TSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ VAVAGCVFLL ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI (SEQ ID NO:16).
[0329] IL-2Rβ Humano: VNG TSQFTCFYNS RANISCVWSQ
DGALQDTSCQ VHAWPDRRRW NQTCELLPVS QASWACNLIL GAPDSQKLTT VDIVTLRVLC REGVRWRVMA IQDFKPFENL RLMAPISLQV VHVETHRCNI SWEISQASHY FERHLEFEAR TLSPGHTWEE APLLTLKQKQ EWICLETLTP DTQYEFQVRV KPLQGEFTTW SPWSQPLAFR TKPAALGKDT IPWLGHLLVG LSGAFGFIIL VYLLINCRNT GPWLKKVLKC NTPDPSKFFS QLSSEHGGDV QKWLSSPFPS SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ DKVPEPASLS SNHSLTSCFT NQGYFFFHLP DALEIEACQV YFTYDPYSEE DPDEGVAGAP TGSSPQPLQP LSGEDDAYCT FPSRDDLLLF SPSLLGGPSP PSTAPGGSGA GEERMPPSLQ ERVPRDWDPQ PLGPPTPGVP DLVDFQPPPE LVLREAGEEV
PDAGPREGVS FPWSRPPGQG EFRALNARLP LNTDAYLSLQ ELQGQDPTHL V (SEQ ID NO:17).
[0330] IL-2Rγ Humano: LNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL
SVSTLPLPEV QCFVFNVEYM NCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW SHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV
TEYHGNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASP CNQHSPYWAP PCYTLKPET (SEQ ID NO:18).
[0331] Em alguns casos, onde um TMMP da presente divulgação compreende um polipeptídeo variante de IL-2, um "polipeptídeo coimunomodulador cognato" é um IL-2R compreendendo polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 e 18.
[0332] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-2 variante exibe afinidade de ligação reduzida a IL-2R, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-2 variante liga IL-2R com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 15% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 25%, pelo menos 30% menos, pelo menos 35% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 45% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 55% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 65% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 85% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15 para um IL-2R (por exemplo, um IL-2R compreendendo polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 16-18), quando analisada sob as mesmas condições.
[0333] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-2 variante tem uma afinidade de ligação a 4IL-2R que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 tem uma afinidade de ligação a IL-2R (por exemplo, um polipeptídeo IL-2R compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NOs: 16-18) que é de cerca de 100 nM a 150 nM, de cerca de 150 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 250 nM, de cerca de 250 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 350 nM, de cerca de 350 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, para cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 15 μM, de cerca de 15 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 25 μM, de cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.
[0334] Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui uma única substituição de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL- 2 estabelecida na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui de 2 a 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 3 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO:
15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 4 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 5 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL- 2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 6 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 7 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 8 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 9 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, um polipeptídeo variante IL-2 possui 10 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos IL- 2 estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[0335] As variantes IL-2adequadas incluem um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[0336] APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TXKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:19), em que X é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X é Ala;
[0337] APTSSSTKKT QLQLEHLLLX LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:20), em que X é qualquer aminoácido que não seja Asp. Em alguns casos, X é Ala;
[0338] APTSSSTKKT QLQLXHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:21), em que X é qualquer aminoácido que não seja Glu. Em alguns casos, X é Ala;
[0339] APTSSSTKKT QLQLEXLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:22), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala;
[0340] APTSSSTKKT QLQLEXLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN
VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:22), em que X é qualquer aminoácido que não seja His. Em alguns casos, X é Ala. Em alguns casos, X é Arg. Em alguns casos, X é Asn. Em alguns casos, X é Asp. Em alguns casos, X é Cys. Em alguns casos, X é Glu. Em alguns casos, X é Gln. Em alguns casos, X é Gly. Em alguns casos, X é Ile. Em alguns casos, X é Lys. Em alguns casos, X é Leu. Em alguns casos, X é Met. Em alguns casos, X é Phe. Em alguns casos, X é Pro. Em alguns casos, X é Ser. Em alguns casos, X é Thr. Em alguns casos, X é Tyr. Em alguns casos, X é Trp. Em alguns casos, X é Val;
[0341] APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFXMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:23), em que X é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X é Ala;
[0342] APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCXSIIS TLT (SEQ ID NO:24), em que X é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X é Ala;
[0343] APTSSSTKKT QLQLEX1LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:25), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja His e onde X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Ala;
[0344] APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:26), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asp; e em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Ala;
[0345] APTSSSTKKT QLQLX1HLLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Glu; em que X 2 é qualquer aminoácido diferente de Asp; e em que X3 é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala;
[0346] APTSSSTKKT QLQLEX1LLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:28), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja His; em que X2 qualquer aminoácido que não seja Asp; e em que X3 é qualquer aminoácido que não seja Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala;
[0347] APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX3SIIS TLT (SEQ ID NO:29), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asp; em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe; e em que X 3 é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala;
[0348] APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFX3MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:30), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asp; em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe; e em que X 3 é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala;
[0349] APTSSSTKKT QLQLEX1LLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFX4MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:31), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja His; em que X2 é qualquer aminoácido que não seja Asp; em que X3 é qualquer aminoácido que não seja Phe; e em que X4 é qualquer aminoácido que não seja Tyr. Em alguns casos, X 1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; e X4 é Ala;
[0350] APTSSSTKKT QLQLEHLLLX1 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFX3MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX4SIIS TLT (SEQ ID NO:32), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja Asp; em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe; em que X3 é qualquer aminoácido que não seja Tyr; e em que X4 é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X 1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; e X4 é Ala;
[0351] APTSSSTKKT QLQLEX1LLLX2 LQMILNGINN YKNPKLTRML TX3KFX4MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX5SIIS TLT (SEQ ID NO:33), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja His; em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Asp; em que X3 é qualquer aminoácido que não seja Phe; em que X4 é qualquer aminoácido que não seja Tyr; e em que X 5 é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X 1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X5 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; X4 é Ala; X5 é Ala; e
[0352] APTSSSTKKT QLQLEX1LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TX2KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCX3SIIS TLT (SEQ ID NO:34), em que X1 é qualquer aminoácido que não seja His; em que X 2 é qualquer aminoácido que não seja Phe; e em que X 3 é qualquer aminoácido que não seja Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala, X2 é Ala, e X3 é Ala. Polipeptídeos adicionais
[0353] Uma cadeia de polipeptídeo multimérico de um polipeptídeo da presente invenção pode incluir um ou mais polipeptídeos em adição aos descritos acima. Polipeptídeos adicionais adequados incluem marcadores de epítopo e domínios de afinidade. Um ou mais polipeptídeo adicional pode ser incluído no terminal N de uma cadeia de polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico na extremidade C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico, ou internamente dentro de uma cadeia de polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico. Marcador de epítopo
[0354] Marcadores de epítopo adequados incluem, mas não estão limitados a hemaglutinina (HA; por exemplo, YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 35); FLAG (por exemplo, DYKDDDDK (SEQ ID NO: 36); c-myc (por exemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 37), e semelhantes. Domínio de afinidade
[0355] Os domínios de afinidade incluem sequências peptídicas que podem interagir com um parceiro de ligação, por exemplo, como um imobilizado em um suporte sólido, úteis para a identificação ou purificação. As sequências de DNA que codificam diversos aminoácidos simples consecutivos, como histidina, quando fundidas à proteína expressa, podem ser usados para a purificação de uma etapa da proteína recombinante por ligação de alta afinidade a uma coluna de resina, como sacarose de níquel. Exemplos de domínios de afinidade incluem His5 (HHHHH) (SEQ ID No:38), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID No:39), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID No:37), Flat (DYKDDDDK) (SEQ ID No:36), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID No:40), hemaglutinina, por exemplo, marcador HA (YPYDVPDYA; SEQ ID No:35), glutationa-S-transferase (GST), tioredoxina, domínio de vinculação de celulose, RYIRS (SEQ ID No:41), Phe-His-His-Thr (SEQ ID No:42), domínio de vinculação de quitina, S-peptídeo, peptídeo T7, domínio SH2, etiqueta do RNA de extremidade C, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID No:43), domínios de vinculação de metal, por exemplo, domínios de vinculação de zinco ou domínios de vinculação de cálcio tais como aqueles das proteínas de vinculação de cálcio, por exemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadeia leve de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frequenina, caltractina, subunidade grande da calpaína, proteínas S100, parvalbumina, calbindina D9K, calbindina D28K e calretinina, inteins, biotina, estreptavidina, MyoD, sequências de zíper de leucina e proteína de ligação de maltose. Conjugados de fármaco
[0356] Uma cadeia polipeptídica de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação pode compreender um fármaco de molécula pequena ligado (por exemplo, covalentemente ligado) à cadeia polipeptídica. Por exemplo, onde um polipeptídeo multimérico da presente divulgação compreende um polipeptídeo Fc, o polipeptídeo Fc pode compreender um fármaco de molécula pequena ligado covalentemente. Em alguns casos, o fármaco de molécula pequena é um agente quimioterápico do câncer, por exemplo, um agente citotóxico. Uma cadeia polipeptídica de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação pode compreender um agente citotóxico ligado (por exemplo, covalentemente ligado) à cadeia polipeptídica. Por exemplo, onde um polipeptídeo multimérico da presente divulgação compreende um polipeptídeo Fc, o polipeptídeo Fc pode compreender um agente citotóxico ligado covalentemente. Agentes citotóxicos incluem pró- fármacos.
[0357] Um fármaco (por exemplo, um agente quimioterápico do câncer) pode ser ligado direta ou indiretamente a uma cadeia polipeptídica de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Por exemplo, onde um polipeptídeo multimérico da presente divulgação compreende um polipeptídeo Fc, um fármaco (por exemplo, um agente quimioterápico do câncer) pode ser ligado direta ou indiretamente ao polipeptídeo Fc. A ligação direta pode envolver a ligação direta a uma cadeia lateral de aminoácidos. A ligação indireta pode ser feita através de um ligante. Um fármaco (por exemplo, um agente quimioterápico do câncer) pode ser ligado a uma cadeia polipeptídica (por exemplo, um polipeptídeo Fc) de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação via uma ligação tioéter, uma ligação amida, uma ligação carbamato, uma ligação dissulfeto ou uma ligação éter.
[0358] Os ligantes incluem ligantes cliváveis e ligantes não cliváveis. Em alguns casos, o ligante é um ligante clivável por protease. Os ligantes adequados incluem, por exemplo, peptídeos (por exemplo, de 2 a 10 aminoácidos de comprimento; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento), cadeias alquílicas, poli(etileno glicol), grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis a ácidos, grupos fotolábeis, grupos lábeis a peptidase e grupos lábeis a esterase. Exemplos não limitativos de ligantes adequados são: i) éster N- succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] (NHS-PEG4-
maleimida); ii) 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidil (SPDB); 4-(2- piridilditio)2-sulfobutanoato de N-succinimidil (sulfo-SPDB); 4-(2- piridilditio)pentanoato de N-succinimidil (SPP); N-succinimidil-4-(N- maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC); éster N- succinimidílico do ácido κ-maleimidoundecanoico (KMUA); éster N-succinimidílico do ácido y-maleimida butírico (GMBS); éster N-hidroxissuccinimida do ácido ε- maleimidocaproico (EMCS); éster de m-maleimida-benzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS); éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS); 6-(p- maleimidopropionamida)hexanoato de succinimidil (SMPH); 4-(p- maleimidofenil)butirato de N-succinimidil (SMPB); isocianato de N-(p- maleimidofenil) (PMPI); 4(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidil (SPP); (4-iodo- acetil)aminobenzoato de N-succinimidil (SIAB); 6-maleimidocaproil (MC); maleimidopropanoil (MP); p-aminobenziloxicarbonil (PAB); 4-(maleimidometil)ciclo- hexanocarboxilato de N-succinimidil (SMCC); N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)- ciclo-hexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), um análogo de "cadeia longa" do SMCC (LC-SMCC); éster N-succinimidílico do ácido 3-maleimidopropanoico (BMPS); iodoacetato de N-succinimidil (SIA); bromoacetato de N-succinimidil (SBA); e 3- (bromoacetamido)propionato de N-succinimidil (SBAP).
[0359] Um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo Fc) pode ser modificado com reagentes de reticulação, como 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano- 1-carboxilato de succinimidil (SMCC), sulfo-SMCC, éster de sulimeno-SMCC, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS), sulfo-MBS ou succinimidil- iodoacetato, como descrito na literatura, para introduzir 1-10 grupos reativos. O polipeptídeo Fc modificado é então reagido com um agente citotóxico contendo tiol para produzir um conjugado.
[0360] Por exemplo, onde um polipeptídeo multimérico da presente divulgação compreende um polipeptídeo Fc, a cadeia polipeptídica compreendendo o polipeptídeo Fc pode ser da fórmula (A)-(L)-(C), em que (A) é a cadeia polipeptídica compreendendo Polipeptídeo Fc; onde (L), se presente, é um ligante; e onde (C) é um agente citotóxico. (L), se presente, liga (A) a (C). Em alguns casos, a cadeia polipeptídica compreendendo o polipeptídeo Fc pode compreender mais de um agente citotóxico (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais de 5 agentes citotóxicos).
[0361] Fármacos adequados incluem, por exemplo, rapamicina. Os fármacos adequados incluem, por exemplo, retinoides, como ácido all-trans retinoico (ATRA); vitamina D3; um análogo da vitamina D3; e similares. Como observado acima, em alguns casos, um fármaco é um agente citotóxico. Agentes citotóxicos são conhecidos na técnica. Um agente citotóxico adequado pode ser qualquer composto que resulte na morte de uma célula, ou induza a morte celular, ou de alguma maneira diminua a viabilidade celular, e inclui, por exemplo, maitansinoides e análogos de maitansinoides, benzodiazepínicos, taxoides, análogos CC-1065 e CC -1065, duocarmicinas e análogos de duocarmicina, enedinas, como caliqueamicina, análogos de dolastatina e dolastatina, incluindo auristatinas, derivados de tomaimicina, derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatina, carboplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucil e morfolino doxorrubicina
[0362] Por exemplo, em alguns casos, o agente citotóxico é um composto que inibe a formação de microtúbulos em células eucarióticas. Tais agentes incluem, por exemplo, maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, duocarmicina, um análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, um análogo de dolastatina, auristatina, tomaimicina e leptomicina, ou um pró-fármaco de qualquer um dos anteriores. Os compostos maitansinoides incluem, por exemplo, N(2')-desacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1); N(2')- desacetil-N(2')-(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM3); e N(2')-desacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina (DM4). Benzodiazepinas incluem, por exemplo, indolinobenzodiazepinas e oxazolidinobenzodiazepinas.
[0363] Agentes citotóxicos incluem taxol; citocalasina B; gramicidina D; brometo de etídio; emetina; mitomicina; etoposídeo; tenoposídeo; vincristina; vinblastina; colchicina; doxorrubicina; daunorrubicina; di-hidroxi antracina diona; maitansina ou um seu análogo ou derivado; uma auristatina ou um análogo peptídico funcional ou seu derivado; dolastatina 10 ou 15 ou um análogo dela; irinotecano ou um seu análogo; mitoxantrona; mitramicina; actinomicina D; 1- desidrotestosterona; um glicocorticoide; procaína; tetracaína; lidocaína; propranolol; puromicina; caliqueamicina ou um seu análogo ou derivado; um antimetabólito; 6 mercaptopurina; 6 tioguanina; citarabina; fludarabina; 5 fluorouracil; decarbazina; hidroxiureia; asparaginase; gencitabina; cladribina; um agente alquilante; um derivado de platina; duocarmicina A; duocarmicina SA; raquelmicina (CC-1065) ou um seu análogo ou derivado; um antibiótico; pirrolo[2,1- c][1,4]-benzodiazepinas (PDB); toxina da difteria; toxina da ricina; toxina do cólera; uma toxina semelhante a Shiga; Toxina LT; Toxina C3; Toxina Shiga; toxina pertussis; toxina tetânica; inibidor de protease Bowman-Birk de soja; exotoxina de Pseudomonas; alorina; saporina; modeccina; gelanina; cadeia A de abrina; cadeia A de modeccina; alfa-sarcino; Proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina; proteínas de Phytolacca americana; inibidor de momordica charantia; curcina; crotina; inibidor de sapaonaria officinalis; gelonina; mitogelina; restrinocina; fenomicina; toxinas de enomicina; ribonuclease (RNase); DNase I; enterotoxina estafilocócica A; proteína antiviral de Phytolacca americana; toxina da difterina; e endotoxina de Pseudomonas.
MÉTODOS PARA GERAR UM POLIPEPTÍDEO MODULADOR DE CÉLULAS T MULTIMÉRICO
[0364] A presente divulgação fornece um método para obter um TMMP compreendendo um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem menor afinidade por um polipeptídeo coimunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo coimunomodulador, o método compreendendo: A) gerar uma biblioteca de TMMPs compreendendo uma pluralidade de membros, em que cada membro compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo principal de MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo MHC; e ii) opcionalmente um polipeptídeo Ig Fc ou um andaime não Ig, em que cada membro compreende um polipeptídeo imunomodulador variante diferente no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo; B) determinar a afinidade de cada membro da biblioteca com um polipeptídeo coimunomodulador cognato; e C) selecionar um membro que exibe afinidade reduzida pelo polipeptídeo coimunomodulador cognato. Em alguns casos, a afinidade é determinada por interferometria de biocamada (BLI) usando membros da biblioteca TMMP purificados e o polipeptídeo coimunomodulador cognato.
Métodos de BLI são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Um ensaio BLI é descrito acima. Ver, por exemplo, Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4): 498-507; e Shah e Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383.
[0365] A presente divulgação fornece um método para obter um TMMP que exibe ligação seletiva a uma célula T, o método compreendendo: A) gerar uma biblioteca de TMMPs compreendendo uma pluralidade de membros, em que cada membro compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um andaime não Ig, em que cada membro compreende um polipeptídeo imunomodulador variante diferente no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo, em que o polipeptídeo imunomodulador variante difere na sequência de aminoácidos de 1 aminoácido para 10 aminoácidos de um polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; B) pôr em contato um membro da biblioteca TMMP com uma célula T alvo que expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo coimunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga ao epítopo, em que o membro da biblioteca TMMP compreende um marcador de epítopo, de modo que o membro da biblioteca TMMP se ligue à célula T alvo; C) pôr em contato com o membro da biblioteca TMMP ligado à célula T alvo um agente de ligação marcado com fluorescência que se liga ao marcador do epítopo, gerando um complexo de membro da biblioteca TMMP / célula T alvo / agente de ligação; D) medir a intensidade média de fluorescência (MFI) do complexo de membro da biblioteca TMMP / célula T alvo / agente de ligação usando citometria de fluxo, em que o MFI medido em uma faixa de concentrações do membro da biblioteca TMMP fornece uma medida da afinidade e avidez aparente ; e E) selecionar um membro da biblioteca TMMP que se liga seletivamente à célula T alvo, em comparação com a ligação do membro da biblioteca TMMP a uma célula T de controle que compreende: i) o polipeptídeo coimunomodulador cognato que liga o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga a um epítopo diferente do epítopo presente no membro da biblioteca TMMP. Em alguns casos, um membro da biblioteca TMMP identificado como ligado seletivamente a uma célula T alvo é isolado da biblioteca.
[0366] Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem e pares de polipeptídeo imunomodulador cognato são selecionados a partir de:
[0367] Receptor de IL-2 e IL-2;
[0368] 4-1BBL e 4-1BB;
[0369] PD-L1 e PD-1;
[0370] CD70 e CD27;
[0371] TGFβ e receptor de TGFβ;
[0372] CD80 e CD28;
[0373] CD86 e CD28;
[0374] OX40L e OX40;
[0375] FasL e Fas;
[0376] ICOS-L e ICOS;
[0377] ICAM e LFA-1;
[0378] JAG1 e Notch;
[0379] JAG1 e CD46;
[0380] CD80 e CTLA4; e
[0381] CD86 e CTLA4.
[0382] A presente divulgação fornece um método para obter um TMMP compreendendo um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo coimunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo do polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem parental correspondente para o polipeptídeo coimunomodulador, o método compreendendo selecionar, a partir de uma biblioteca de TMMPs compreendendo uma pluralidade de membros um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo coimunomodulador cognato, em que a pluralidade de membros compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de Ig Fc ou um andaime não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo. Em alguns casos, a etapa de seleção compreende determinar a afinidade, usando interferometria de biocamada, da ligação entre os membros da biblioteca TMMP e o polipeptídeo coimunomodulador cognato. Em alguns casos, o TMMP é como descrito acima.
[0383] Em alguns casos, o método compreende ainda: a) o contato do membro da biblioteca TMMP selecionado com uma célula T alvo que expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo coimunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga ao epítopo, em que o membro da biblioteca TMMP compreende um marcador de epítopo, de modo que o membro da biblioteca TMMP se ligue à célula T alvo; b) pôr em contato com o membro da biblioteca TMMP selecionado ligado à célula T alvo um agente de ligação marcado com fluorescência que se liga ao marcador epitópico, gerando um complexo de membro da biblioteca TMMP / célula T alvo / agente de ligação selecionado; e c) medir a intensidade média de fluorescência (MFI) do complexo de membro da biblioteca TMMP / célula T alvo / agente de ligação selecionado usando citometria de fluxo, em que a MFI medida ao longo de uma faixa de concentrações do membro da biblioteca TMMP selecionado fornece uma medida de afinidade e avidez aparente. Um membro da biblioteca TMMP selecionado que se liga seletivamente à célula T alvo, em comparação com a ligação do membro da biblioteca TMMP a uma célula T de controle que compreende: i) o polipeptídeo coimunomodulador cognato que liga o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga a um epítopo diferente do epítopo presente no membro da biblioteca TMMP, é identificado se ligando seletivamente à célula T alvo. Em alguns casos, o agente de ligação é um anticorpo específico para o marcador epitópico. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante compreende de 1 a 20 substituições de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos) em comparação com o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente. Em alguns casos, o TMMP compreende dois polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes compreendem a mesma sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo compreende um dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes e em que o segundo polipeptídeo compreende o segundo dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão na mesma cadeia polipeptídica do TMMP. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no primeiro polipeptídeo do TMMP. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no segundo polipeptídeo do TMMP.
[0384] Em alguns casos, o método compreende ainda o isolamento do membro selecionado da biblioteca TMMP da biblioteca. Em alguns casos, o método compreende ainda o fornecimento de um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o membro da biblioteca TMMP selecionado. Em alguns casos, o ácido nucleico está presente em um vetor de expressão recombinante. Em alguns casos, a sequência nucleotídica está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional que é funcional em uma célula eucariótica. Em alguns casos, o método compreende ainda a introdução do ácido nucleico em uma célula hospedeira eucariótica e a cultura da célula em meio líquido para sintetizar o membro da biblioteca TMMP selecionado codificado na célula. Em alguns casos, o método compreende ainda o isolamento do membro da biblioteca TMMP selecionado sintetizado da célula ou do meio de cultura líquido que compreende a célula. Em alguns casos, o membro da biblioteca TMMP selecionado compreende um polipeptídeo Ig Fc. Em alguns casos, o método compreende ainda a conjugação de um fármaco ao polipeptídeo Ig Fc. Em alguns casos, o fármaco é um agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, duocarmicina, um análogo da duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, um análogo da dolastatina, auristatina, tomaimicina e leptomicina ou um pró-fármaco de qualquer um dos anteriores. Em alguns casos, o fármaco é um retinoide. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem e os polipeptídeos imunomoduladores cognatos são selecionados a partir de: receptor de IL-2 e IL-2; 4-1BBL e 4-1BB; PD-L1 e PD-1; CD70 e CD27; TGFβ e receptor de TGFβ; CD80 e CD28; CD86 e CD28; OX40L e OX40; FasL e Fas; ICOS-L e ICOS; ICAM e LFA-1; JAG1 e Notch; JAG1 e CD46; CD80 e CTLA4; e CD86 e CTLA4.
[0385] A presente divulgação proporciona um método para se obter um TMMP compreendendo um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo coimunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem parental correspondente para o polipeptídeo coimunomodulador, o método compreendendo: A) fornecer uma biblioteca de TMMPs compreendendo uma pluralidade de membros, em que a pluralidade de membro compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo Ig Fc ou um suporte não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo; e B) selecionar da biblioteca um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo coimunomodulador cognato. Em alguns casos, a etapa de seleção compreende determinar a afinidade, usando interferometria de biocamada, da ligação entre os membros da biblioteca TMMP e o polipeptídeo coimunomodulador cognato. Em alguns casos, o TMMP é como descrito acima.
[0386] Em alguns casos, o método compreende ainda: a) o contato do membro da biblioteca TMMP selecionado com uma célula T alvo que expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo coimunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga ao epítopo, em que o membro da biblioteca TMMP compreende um marcador de epítopo, de modo que o membro da biblioteca TMMP se ligue à célula T alvo; b) pôr em contato com o membro da biblioteca TMMP selecionado ligado à célula T alvo um agente de ligação marcado com fluorescência que se liga ao marcador epitópico, gerando um complexo de membro da biblioteca TMMP / célula T alvo / agente de ligação selecionado; e c) medir a intensidade média de fluorescência (MFI) do complexo de membro da biblioteca TMMP / célula
T alvo / agente de ligação selecionado usando citometria de fluxo, em que a MFI medida ao longo de uma faixa de concentrações do membro da biblioteca TMMP selecionado fornece uma medida de afinidade e avidez aparente. Um membro da biblioteca TMMP selecionado que se liga seletivamente à célula T alvo, em comparação com a ligação do membro da biblioteca TMMP a uma célula T de controle que compreende: i) o polipeptídeo coimunomodulador cognato que liga o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga a um epítopo diferente do epítopo presente no membro da biblioteca TMMP, é identificado se ligando seletivamente à célula T alvo. Em alguns casos, o agente de ligação é um anticorpo específico para o marcador epitópico. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador variante compreende de 1 a 20 substituições de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos) em comparação com o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente. Em alguns casos, o TMMP compreende dois polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes compreendem a mesma sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo compreende um dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes e em que o segundo polipeptídeo compreende o segundo dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão na mesma cadeia polipeptídica do TMMP. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no primeiro polipeptídeo do TMMP. Em alguns casos, os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no segundo polipeptídeo do TMMP.
[0387] Em alguns casos, o método compreende ainda o isolamento do membro selecionado da biblioteca TMMP da biblioteca. Em alguns casos, o método compreende ainda o fornecimento de um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o membro da biblioteca TMMP selecionado. Em alguns casos, o ácido nucleico está presente em um vetor de expressão recombinante. Em alguns casos, a sequência nucleotídica está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional que é funcional em uma célula eucariótica. Em alguns casos, o método compreende ainda a introdução do ácido nucleico em uma célula hospedeira eucariótica e a cultura da célula em meio líquido para sintetizar o membro da biblioteca TMMP selecionado codificado na célula. Em alguns casos, o método compreende ainda o isolamento do membro da biblioteca TMMP selecionado sintetizado da célula ou do meio de cultura líquido que compreende a célula. Em alguns casos, o membro da biblioteca TMMP selecionado compreende um polipeptídeo Ig Fc. Em alguns casos, o método compreende ainda a conjugação de um fármaco ao polipeptídeo Ig Fc. Em alguns casos, o fármaco é um agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, duocarmicina, um análogo da duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, um análogo da dolastatina, auristatina, tomaimicina e leptomicina ou um pró-fármaco de qualquer um dos anteriores. Em alguns casos, o fármaco é um retinoide. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem e os polipeptídeos imunomoduladores cognatos são selecionados a partir de: receptor de IL-2 e IL-2; 4-1BBL e 4-1BB; PD-L1 e PD-1; TGFβ e receptor de TGFβ; CD80 e CD28; CD86 e CD28; OX40L e OX40; FasL e Fas; ICOS-L e ICOS; CD70 e CD27; ICAM e LFA-1; JAG1 e Notch; JAG1 e CD46; CD80 e CTLA4; e CD86 e CTLA4.
ÁCIDOS NUCLEICOS
[0388] A presente divulgação proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um TMMP da presente divulgação. A presente divulgação proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um TMMP da presente divulgação.
[0389] A presente divulgação fornece ácidos nucleicos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Em alguns casos, as cadeias polipeptídicas individuais de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação são codificadas em ácidos nucleicos separados. Em alguns casos, todas as cadeias polipeptídicas de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação são codificadas num único ácido nucleico. Em alguns casos, um primeiro ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente descrição; e um segundo ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Em alguns casos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação e um segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Ácidos nucleicos separados que codificam cadeias polipeptídicas individuais de um polipeptídeo multimérico
[0390] A presente divulgação fornece ácidos nucleicos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Como observado acima, em alguns casos, as cadeias polipeptídicas individuais de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação são codificadas em ácidos nucleicos separados. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam as cadeias polipeptídicas separadas de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação são operativamente ligados a elementos de controle transcricional, por exemplo, promotores, tais como promotores que são funcionais numa célula eucariótica, em que o promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível.
[0391] A presente revelação proporciona um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico, em que o primeiro ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, em que o primeiro polipeptídeo compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um epítopo (p.ex., um epítopo de células T); b) um primeiro polipeptídeo de MHC; e c) um polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma variante de afinidade reduzida, como descrito acima); e onde o segundo ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, em que o segundo polipeptídeo compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um segundo polipeptídeo de MHC; e b) um polipeptídeo Fc de Ig. Epítopos apropriados de células T, polipeptídeos MHC imunomoduladores, polipeptídeos e polipeptídeos Fc de Ig, são descritos acima. Em alguns casos, as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos estão ligadas operativamente a elementos de controle da transcrição. Em alguns casos, o elemento de controle de transcrição é um promotor que é funcional numa célula eucariótica. Em alguns casos, os ácidos nucleicos que estão presentes em vetores de expressão separados.
[0392] A presente revelação proporciona um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico, em que o primeiro ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, em que o primeiro polipeptídeo compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um epítopo (p.ex., um epítopo de células T); e b) um primeiro polipeptídeo de MHC e onde o segundo ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, em que o segundo polipeptídeo compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma variante de afinidade reduzida como descrito acima); b) um segundo polipeptídeo de MHC; e c) um polipeptídeo Fc de Ig. Epítopos apropriados de células T, polipeptídeos MHC imunomoduladores, polipeptídeos e polipeptídeos Fc de Ig, são descritos acima. Em alguns casos, as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos estão ligadas operativamente a elementos de controle da transcrição. Em alguns casos, o elemento de controle de transcrição é um promotor que é funcional numa célula eucariótica. Em alguns casos, os ácidos nucleicos que estão presentes em vetores de expressão separados. Ácido nucleico que codifica dois ou mais polipeptídeos presentes num polipeptídeo multimérico
[0393] A presente invenção proporciona um ácido nucleico que compreende sequências de nucleotídeos que codificam, pelo menos, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo multimérico de um polipeptídeo da presente divulgação. Em alguns casos, em que um polipeptídeo multimérico da presente divulgação inclui um primeiro, segundo, e terceiro polipeptídeo, o ácido nucleico inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro, segundo, e terceiro polipeptídeos. Em alguns casos, as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo multimérico de um polipeptídeo da presente invenção inclui um agente de ligação clivável proteoliticamente interposta entre a sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo e a sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo. Em alguns casos, as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação inclui um sítio de entrada interna de ribossoma (IRES) interposta entre a sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo e a sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo. Em alguns casos, as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo multimérico de um polipeptídeo da presente invenção inclui um sinal de salto de ribossoma (ou elemento de hidrolase de atuação cis, CHYSEL) interposto entre a sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo e a sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo. Exemplos de ácidos nucleicos são descritos abaixo, em que um ligante clivável proteoliticamente é fornecido entre as sequências de nucleotídeos que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo multimérico de um polipeptídeo da presente invenção; em qualquer uma destas modalidade, um IRES ou um sinal de salto ribossoma pode ser usado no lugar da sequência de nucleotídeos que codifica o ligante clivável proteoliticamente.
[0394] Em alguns casos, um primeiro ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão recombinante, um mRNA, um RNA viral, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma primeira cadeia de polipeptídeos de um polipeptídeo multimérico da presente descrição; e um segundo ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão recombinante, um mRNA, um RNA viral, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma segunda cadeia de polipeptídeos de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo, e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo, são, cada um ligado operacionalmente a elementos de controle transcricional, por exemplo, promotores, tais como promotores que são funcionais numa célula eucariótica, em que o promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível.
[0395] A presente invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeo recombinante,
em que o polipeptídeo recombinante compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um epítopo (p.ex., um epítopo de células T); b) um primeiro polipeptídeo de MHC; c) um polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma variante de afinidade reduzida como descrito acima); d) um ligante clivável proteoliticamente; e) um segundo polipeptídeo de MHC; e f) um polipeptídeo de imunoglobulina Fc (Ig). A presente invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo recombinante, em que o polipeptídeo recombinante compreende, por ordem a partir do terminal N para terminal C: a) um primeiro peptídeo líder; b) o epítopo; c) o primeiro polipeptídeo de MHC; d) o polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma variante de afinidade reduzida como descrito acima); e) o ligante clivável proteoliticamente; f) um segundo peptídeo líder; g) o segundo polipeptídeo de MHC; e h) o polipeptídeo Fc de Ig. A presente divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo recombinante, em que o polipeptídeo recombinante compreende, na ordem do N- terminal ao C-terminal: a) um epítopo; b) um primeiro polipeptídeo MHC; c) um ligante proteoliticamente clivável; d) um polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma variante de afinidade reduzida como descrito acima); e) um segundo polipeptídeo MHC; e f) um polipeptídeo Ig Fc. Em alguns casos, o primeiro peptídeo principal e o segundo peptídeo principal são um peptídeo principal β2-M. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional. Em alguns casos, o elemento de controle transcricional é um promotor que é funcional numa célula eucariótica.
[0396] Polipeptídeos de MHC adequados estão descritos acima. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo de MHC de β2-microglobulina; e em que o segundo polipeptídeo de MHC de classe I é um polipeptídeo de cadeia pesada MHC. Em alguns casos, o polipeptídeo de β2-microglobulina compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos β2M representada na FIG. 4. Em alguns casos, o MHC do polipeptídeo de cadeia pesada de classe I é uma molécula de cadeia pesada HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, ou HLA-L. Em alguns casos, o polipeptídeo de cadeia pesada de MHC de
Classe I compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das FIG. 3A-3C. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo MHC é um polipeptídeo MHC de cadeia alfa de Classe II; e em que o segundo polipeptídeo MHC de classe II é um polipeptídeo de cadeia beta MHC.
[0397] Polipeptídeos Fc adequados estão descritos acima. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc de Ig é um polipeptídeo Fc de IgG1, um polipeptídeo Fc de IgG2, um polipeptídeo Fc de IgG3, um polipeptídeo Fc de IgG4, um polipeptídeo Fc de IgA ou um polipeptídeo Fc de IgM. Em alguns casos, o polipeptídeo Fc de Ig compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácido de uma sequência de aminoácidos representada nas Figuras 2A-2G.
[0398] Polipeptídeos imunomoduladores adequados estão descritos acima.
[0399] Os ligantes cliváveis proteoliticamente adequados estão descritos acima. Em alguns casos, o ligante clivável proteoliticamente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: a) LEVLFQGP (SEQ ID NO: 44); b) ENLYTQS (SEQ ID NO: 45); c) DDDDK (SEQ ID NO: 46); d) LVPR (SEQ ID NO: 47); e e) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48).
[0400] Em alguns casos, um ligante entre o epítopo e o primeiro polipeptídeo MHC compreende um primeiro resíduo Cys, e o segundo polipeptídeo MHC compreende uma substituição de aminoácidos para fornecer um segundo resíduo Cys, e tal que o primeiro e o segundo resíduos Cys fornecem uma ligação dissulfureto entre o ligante e o segundo polipeptídeo MHC. Em alguns casos, o primeiro polipeptídeo MHC compreende uma substituição de aminoácidos para fornecer um primeiro resíduo Cys, e o segundo polipeptídeo MHC compreende uma substituição de aminoácidos para fornecer um segundo resíduo Cys, e tal que o primeiro resíduo Cys e o segundo resíduo Cys fornecem uma ligação dissulfureto entre o primeiro polipeptídeo MHC e o segundo polipeptídeo MHC. Vetores de Expressão Recombinantes
[0401] A presente invenção proporciona vetores de expressão recombinantes que compreendem os ácidos nucleicos da presente invenção. Em alguns casos, o vetor de expressão recombinante é um vetor não viral. Em alguns casos, o vetor de expressão é um construto recombinante viral, por exemplo, um construto de vírus recombinante adenoassociado (ver, por exemplo, Patente US Nº 7078387), um construto recombinante adenoviral, um construto recombinante lentiviral, um construto recombinante retroviral, um vetor viral não integrante, etc.
[0402] Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, vetores virais (por exemplo, vetores virais com base no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li e Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno associados (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; e Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus da herpes simples; vírus da imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, Vírus da Leucemia Murina, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, tais como Vírus do Sarcoma de Rous, Vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário); e semelhantes.
[0403] Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidos dos versados na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis. Os vetores que se seguem são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro vetor pode ser utilizado desde que seja compatível com a célula hospedeira.
[0404] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número de elementos de transcrição e de controle de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, elementos estimuladores da transcrição, terminadores da transcrição, etc., podem ser utilizados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516- 544).
[0405] Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA direcionado ao DNA e/ou um polipeptídeo modificador sítio-direcionado é operacionalmente ligado a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle da transcrição, tal como um promotor. O elemento de controle da transcrição pode ser funcional em uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero; ou uma célula procariótica (por exemplo, bacteriana ou célula de Archaea). Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA direcionado ao DNA e/ou um polipeptídeo modificador sítio direcionado está operativamente ligado a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um RNA-DNA alvo e/ou um polipeptídeo modificando o sítio direcionado em ambas as células procarióticas e eucarióticas.
[0406] Exemplos não limitantes de promotores eucarióticos adequados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles de citomegalovírus (CMV) imediato precoce, timidina quinase do vírus de herpes simples (HSV), SV40 precoce e tardia, repetições terminais longas (LTRs) do retrovírus, e metalotioneína-I de camundongo. A seleção do vetor e promotor adequado é bem dentro do nível dos versados na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação de ribossomo para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
[0407] A presente invenção fornece uma célula hospedeira geneticamente modificada, em que a célula hospedeira é geneticamente modificada com um ácido nucleico da presente divulgação.
[0408] As células hospedeiras adequadas incluem células eucarióticas, tais como células de levedura, células de insetos e células de mamíferos. Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula de uma linhagem celular de mamífero. Linhagens celulares de mamíferos adequadas incluem linhagens celulares humanas, linhagens celulares de primatas não humanos, linhagens celulares de roedores (por exemplo, camundongo, rato) e afins. Linhas celulares de mamíferos adequados incluem, mas não estão limitadas às células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por exemplo, ATCC Nos. CRL-1573), células VERO, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC Nos. CRL-1658), Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC Nos. CCL10), células PC12 (ATCC No. CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC No. CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC No. CCLI.3), células embrionárias de rim humano (HEK) (ATCC No. CRL1573), células HLHepG2 e semelhantes.
[0409] Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula de mamífero que tenha sido geneticamente modificada de tal forma que ela não sintetiza MHC β2-M endógeno.
[0410] Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula de mamífero que tenha sido geneticamente modificada de tal forma que ela não sintetiza MHC Classe I de cadeia pesada endógeno.
COMPOSIÇÕES
[0411] A presente divulgação fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo TMMP (synTac) da presente divulgação. A presente divulgação fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. A presente divulgação fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Composições compreendendo um polipeptídeo multimérico
[0412] Uma composição da presente divulgação pode compreender, além de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ou mais de: um sal, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 etc.; um agente tamponador, por exemplo, um tampão Tris, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanossulfônico) (HEPES), ácido 2-(N-Morfolino) etanossulfônico (MES), sal de sódio do ácido 2-(N-Morfolino) etanossulfônico (MES), ácido 3-(N-Morfolino) propanossulfônico (MOPS), ácido N- tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanossulfônico (TAPS), etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iônico tal como Tween-20, etc.; um inibidor da protease; glicerol; e afins.
[0413] A composição pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, uma variedade dos quais são conhecidos na técnica e não necessitam de ser discutidos em detalhe neste documento. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, têm sido amplamente descritos em várias publicações, incluindo, por exemplo,“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 19 a Ed. (1995), ou última edição, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20ª edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
[0414] Uma composição farmacêutica pode compreender um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma composição farmacêutica em questão será adequada para administração a um sujeito, por exemplo, será estéril. Por exemplo, em alguns casos, uma composição farmacêutica em questão será adequada para administração a um sujeito humano, por exemplo, em que a composição é estéril e é livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas.
[0415] As composições de proteínas podem compreender outros componentes, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, magnésio, carbonato, e semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, cloridrato, sais de sulfato, solvatos (por exemplo, sais iônicos mistos, água, orgânicos), hidratos (por exemplo, água), e semelhantes.
[0416] Por exemplo, as composições podem incluir solução aquosa, forma em pó, grânulos, comprimidos, pílulas, supositórios, cápsulas, suspensões, sprays,
e semelhantes. A composição pode ser formulada de acordo com as várias vias de administração descritas abaixo.
[0417] Quando um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado como um injetável (por exemplo, de forma subcutânea, intraperitoneal, intramuscular e/ou intravenosa) diretamente em um tecido, uma formulação pode ser fornecida como uma forma de dosagem pronta-para- utilização, ou como forma não-aquosa (por exemplo, um pó estável à armazenagem reconstituível) ou na forma aquosa, tal como um líquido composto de carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formulações contendo proteínas também podem ser fornecidas de modo a aumentar a meia-vida sérica da proteína em questão após a administração. Por exemplo, a proteína pode ser fornecida em uma formulação de lipossomas, preparada como um coloide, ou outras técnicas convencionais para prolongar a meia-vida sérica. Variedades de métodos estão disponíveis para preparar lipossomas, conforme descrito em, por exemplo, Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, U.S. Pat. Nºs. 4,235,871, 4,501,728 e 4,837,028. As preparações também podem ser fornecidas em formas de libertação lenta ou de libertação controlada.
[0418] Outros exemplos de formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções para injeção estéreis isotônicas, anti-oxidantes, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. Por exemplo, uma composição farmacêutica em questão pode estar presente em um recipiente, por exemplo, num recipiente estéril, tal como uma seringa. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de doses única ou de doses múltiplas, tais como, ampolas e frascos e podem ser armazenadas em uma condição de congelamento a seco (liofilizada), exigindo apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes da utilização. Soluções de injeção e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de talcos, grânulos e comprimidos estéreis.
[0419] A concentração de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação em uma formulação pode variar amplamente (por exemplo, de menos de cerca de 0,1%, normalmente a ou, pelo menos, cerca de 2% para tanto como 20% a 50% ou mais, em peso) e vai geralmente ser selecionada principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidades, e fatores baseados no paciente de acordo com o modo de administração particular selecionado e as necessidades do paciente.
[0420] A presente divulgação fornece um recipiente compreendendo uma composição da presente divulgação, por exemplo, uma composição líquida. O recipiente pode ser, por exemplo, uma seringa, uma ampola, e semelhantes. Em alguns casos, o recipiente é estéril. Em alguns casos, tanto o recipiente como a composição é estéril.
[0421] A presente divulgação fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um TMMP da presente divulgação. Uma composição pode compreender: a) um TMMP da presente divulgação; e b) um excipiente, conforme descrito acima para os polipeptídeos multiméricos. Em alguns casos, o excipiente é um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0422] Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico de célula T da presente divulgação está presente em uma composição líquida. Assim, a presente divulgação fornece composições (por exemplo, composições líquidas, incluindo composições farmacêuticas) compreendendo um polipeptídeo multimérico de células T da presente divulgação. Em alguns casos, uma composição da presente divulgação compreende: a) um polipeptídeo multimérico de células T da presente divulgação; e b) solução salina (por exemplo, NaCl a 0,9%). Em alguns casos, a composição é estéril. Por exemplo, em alguns casos, uma composição é adequada para administração a um sujeito humano, por exemplo, em que a composição é estéril e é livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas. Assim, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo: a) um polipeptídeo multimérico de células T da presente divulgação; e b) solução salina (por exemplo, NaCl a 0,9%), em que a composição é estéril e livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas. Composições compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante
[0423] A presente divulgação fornece composições, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Uma ampla variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica e não necessita de ser discutida em detalhe neste documento. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis, têm sido amplamente descritos em várias publicações, incluindo, por exemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20ª edição, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
[0424] Uma composição da presente invenção pode incluir: a) um ou mais ácidoa nucleicos ou um ou mais vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas codificando um TMMP; e b) um ou mais dos seguintes: um tampão, um surfactante, um antioxidante, um polímero hidrofílico, uma dextrina, um agente quelante, um agente de suspensão, um solubilizante, um agente espessante, um estabilizador, um agente bacteriostático, um agente molhante, e um conservante. Os tampões adequados incluem, mas não estão limitados a, (tal como ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES), bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano (BIS -Tris), ácido N-(2- hidroxietil)piperazina-N'3-propanosulfônico (EPPS ou HEPPS), glicilglicins, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfônico (HEPES), ácido 3-(N- morfolino)propano sulfônico (MOPS), piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES), bicarbonato de sódio, 3-(N-tris(hidroximetil)-metil-amino)-2-ácido hidroxipropanosulfônico) TAPSO, (N-tris(hidroximetil)metil-2-ácido aminoetanosulfônico (TES), N-tris(hidroximetil)metil-glicina (Tricine), tris(hidroximetil)-aminometano (Tris), etc.). Os sais adequados incluem, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.
[0425] Uma formulação farmacêutica da presente divulgação pode incluir um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da presente divulgação em uma quantidade de desde cerca de 0,001% a cerca de 90% (p/p). Na descrição de formulações, a seguir, "ácido nucleico em questão ou um vetor de expressão recombinante" será entendido como incluindo um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Por exemplo, em algumas modalidades, uma formulação em questão compreende um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da presente divulgação.
[0426] Um ácido nucleico em questão ou um vetor de expressão recombinante podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou associados de outra forma com outros compostos ou misturas de compostos; tais compostos podem incluir, por exemplo, lipossomas ou moléculas direcionadas ao receptor. Um ácido nucleico da invenção ou vetor de expressão recombinante pode ser combinado em uma formulação com um ou mais componentes que auxiliam na assimilação, distribuição e/ou a absorção.
[0427] Um ácido nucleico da invenção ou uma composição do vetor de expressão recombinante pode ser formulado em qualquer uma das muitas possíveis formas de dosagem, tais como, mas, não se limitando a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. Um ácido nucleico da invenção ou uma composição do vetor de expressão recombinante também pode ser formulado como suspensões em meios aquosos, não-aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizadores.
[0428] Uma formulação compreendendo um ácido nucleico da invenção ou um vetor de expressão recombinante pode ser uma formulação lipossomal. Conforme usado neste documento, o termo "lipossoma" significa uma vesícula composta de lipídios anfifílicos dispostos em uma bicamada ou bicamadas esféricas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso que contém a composição a ser distribuída. Os lipossomas catiônicos são lipossomas positivamente carregados que podem interagir com moléculas de DNA carregadas negativamente para formar um complexo estável. Acredita-se que os lipossomas que são sensíveis ao pH ou negativamente carregados aprisionam o DNA ao invés de se complexar a ele. Tanto lipossomas catiônicos e não catiônicos podem ser utilizados para distribuir um ácido nucleico da invenção ou um vetor de expressão recombinante.
[0429] Os lipossomas também incluem os lipossomas "estericamente estabilizados", um termo que, conforme usado neste documento, refere-se aos lipossomas compreendendo um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de vida de circulação aumentado em relação aos lipossomas em que não possuem esses lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção de lipídio formadora de vesícula do lipossoma compreende um ou mais glicolipídios ou é derivatizada com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma porção de polietileno glicol (PEG). Os lipossomas e seus usos são descritos ainda na Pat. U.S. Nº 6,287,860, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[0430] As formulações e composições da presente divulgação podem também incluir surfactantes. O uso de surfactantes em produtos de fármacos, formulações e em emulsões é bem conhecido na técnica. Os surfactantes e seus usos são descritos ainda na Pat. U.S. Nº 6,287,860.
[0431] Em uma modalidade, vários potenciadores de penetração são incluídos, para efetuar a distribuição eficiente de ácidos nucleicos. Além de ajudar a difusão de fármacos não-lipofílicos através das membranas celulares, os potenciadores de penetração também aumentam a permeabilidade de fármacos lipofílicos. Os potenciadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco grandes categorias, isto é, surfactantes, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não-surfactantes não-quelantes. Os potenciadores de penetração e seus usos são descritos ainda na Pat. U.S. Nº 6,287,860, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[0432] As composições e formulações para a administração oral incluem pós ou grânulos, micropartículas, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas em gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificadores, auxiliadores dispersantes ou ligantes podem ser desejáveis. As formulações orais adequadas incluem aquelas em que um ácido nucleico anti-sense da invenção é administrado em conjunção com surfactantes e quelantes potenciadores de penetração. Os surfactantes adequados incluem, mas não estão limitados aos ácidos graxos e/ou seus ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Os ácidos/sais biliares e ácidos graxos adequados e seus usos são descritos ainda na Pat. U.S. Nº 6,287,860. Também são adequadas combinações de potenciadores de penetração, por exemplo, sais/ácidos graxos em combinação com saia/ácidos biliares. Uma combinação adequada exemplar é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros potenciadores de penetração incluem, mas não estão limitados ao éter polioxietileno-9-lauril e éter polioxietileno-20-cetil. Potenciadores de penetração adequados incluem propileno glicol, dimetilsulfóxido, trietanoiamina, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 2-pirrolidona e seus derivados, álcool tetra-hidrofurfurílico, e AZONE™.
MÉTODOS DE MODULAR A ATIVIDADE DAS CÉLULAS T
[0433] A presente divulgação fornece um método de modular seletivamente a atividade de uma célula T específica do epítopo, o método compreende o contato da célula T com um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, em que o contato da célula T com um polipeptídeo multimérico da presente divulgação modula seletivamente a atividade da célula T específica do epítopo. Em alguns casos, o contato ocorre in vitro. Em alguns casos, o contato ocorre in vivo. Em alguns casos, o contato ocorre ex vivo.
[0434] Em alguns casos, por exemplo, onde a célula-alvo T é uma célula T CD8+, o polipeptídeo multimérico compreende polipeptídeos classe I do MHC (por exemplo, β2-microglobulina e MHC Classe I de cadeia pesada). Em alguns casos, por exemplo, onde a célula-alvo T é uma célula T CD4+, o polipeptídeo multimérico compreende polipeptídeos Classe II do MHC (por exemplo, cadeia α de MHC de Classe II; cadeia β de MHC de Classe II).
[0435] Quando um polipeptídeo multimérico da presente divulgação inclui um polipeptídeo imunomodulador que é um polipeptídeo de ativação, o contato da célula T com polipeptídeo multimérico ativa a célula T específica do epítopo. Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula cancerosa, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta a atividade citotóxica da célula
T em direção à célula cancerosa. Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula cancerosa, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta o número das células T específicas do epítopo.
[0436] Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula infectada por vírus, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta a atividade citotóxica da célula T em direção à célula infectada por vírus. Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula infectada por vírus, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta o número das células T específicas do epítopo.
[0437] Quando um polipeptídeo multimérico da presente divulgação inclui um polipeptídeo imunomodulador que é um polipeptídeo de inibição, o contato da célula T com o multimérico inibe a célula T específica do epítopo. Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T auto-reativa que é específica para um epítopo presente em um auto-antígeno, e o contato reduz o número de células T auto-reativas.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0438] A presente divulgação fornece um método de tratamento de um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade de um TMMP da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o TMMP, eficazes para tratar o indivíduo. Também é fornecido um TMMP da presente divulgação para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal. Em alguns casos, um método de tratamento da presente divulgação compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo uma ou mais vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um polipeptídeo multimérico da presente divulgação. Em alguns casos, um método de tratamento da presente divulgação compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo uma ou mais moléculas de mRNA compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um TMMP da presente divulgação. Em alguns casos, um método de tratamento da presente divulgação compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo um TMMP da presente divulgação. As condições que podem ser tratadas incluem, por exemplo, câncer e distúrbios autoimunes, conforme descrito abaixo.
[0439] Em alguns casos, um TMMP de célula T da presente divulgação, quando administrado a um indivíduo em necessidade, induz uma resposta de célula T específica do epítopo e uma resposta de célula T não específica do epítopo. Em outras palavras, em alguns casos, um TMMP de célula T da presente divulgação, quando administrado a um indivíduo em necessidade, induz uma resposta de célula T específica do epítopo, modulando a atividade de uma primeira célula T que exibe ambos: i) um TCR específico para o epítopo presente no TMMP; ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP; e induz uma resposta de célula T não específica do epítopo ao modular a atividade de uma segunda célula T que exibe: i) um TCR específico para um epítopo diferente do epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP. A razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1 ou pelo menos 100:1. A razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de cerca de 2:1 a cerca de 5:1, de cerca de 5:1 a cerca de 10:1, de cerca de 10:1 a cerca de 15:1, de cerca de 15:1 a cerca de 20:1, de cerca de 20:1 a cerca de 25:1, de cerca de 25:1 a cerca de 50:1 ou de cerca de 50:1 a cerca de 100:1 ou mais de 100:1. "Modular a atividade" de uma célula T pode incluir um ou mais dentre: i) ativar uma célula T citotóxica (por exemplo, célula CD8+); ii) induzir a atividade citotóxica de uma célula T citotóxica (por exemplo, CD8+); iii) induzir a produção e liberação de uma citotoxina (por exemplo, uma perforina; uma granzima; uma granulisina) por uma célula T citotóxica (por exemplo, CD8+); iv) inibir da atividade de uma célula T autorreativa; e similares.
[0440] A combinação da afinidade reduzida do polipeptídeo imunomodulador com seu polipeptídeo co-imunomodulador cognato e a afinidade do epítopo com um TCR, fornece seletividade aprimorada de um TMMP da presente divulgação. Por exemplo, um TMMP da presente divulgação se liga com maior avidez a uma primeira célula T que exibe ambos: i) um TCR específico para o epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co-imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP, em comparação com a avidez a qual se liga a uma segunda célula T que exibe: i) um TCR específico para um epítopo diferente do epítopo presente no TMMP; e ii) um polipeptídeo co- imunomodulador que se liga ao polipeptídeo imunomodulador presente no TMMP.
[0441] A presente divulgação fornece um método de modular seletivamente a atividade de uma célula T específica do epítopo em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão; mRNA, etc.) compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo multimérico, em que o polipeptídeo multimérico modula seletivamente a atividade da célula T específica do epítopo no indivíduo. Modular seletivamente a atividade de uma célula T específica do epítopo pode tratar uma doença ou distúrbio no indivíduo. Assim, a presente divulgação fornece um método de tratamento compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação.
[0442] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador é um polipeptídeo de ativação, e o polipeptídeo multimérico ativa a células T específicas do epítopo. Em alguns casos, o epítopo é um epítopo associado a câncer, e o polipeptídeo multimérico aumenta a atividade de uma célula T específica do epítopo para o epítopo associado a câncer.
[0443] A presente divulgação fornece um método de tratamento de câncer num indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão; mRNA, etc.), que compreende sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo multimérico, em que o polipeptídeo multimérico compreende um epítopo de célula T que é um epítopo de câncer, e em que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo imunomodulador estimulador. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células de câncer no indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células de câncer no indivíduo por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em comparação com o número de células de câncer no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células de câncer no indivíduo para níveis indetectáveis.
[0444] Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz a massa tumoral no indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo (um indivíduo com um tumor), reduz a massa tumoral no indivíduo por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em comparação com a massa tumoral no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo (um indivíduo com um tumor), reduz a massa tumoral no indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo (um indivíduo com um tumor), reduz a massa tumoral no indivíduo por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em comparação com a massa tumoral no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, aumenta o tempo de sobrevivência do indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, aumenta o tempo de sobrevivência do indivíduo por, pelo menos, um mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, de 3 meses a 6 meses, de 6 meses a 1 ano, de 1 ano a 2 anos, de 2 anos a 5 anos, de 5 anos a 10 anos, ou mais de 10 ano, em comparação com o tempo de sobrevivência esperado do indivíduo na ausência de administração do polipeptídeo multimérico.
[0445] Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula infectada por vírus, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta a atividade citotóxica da célula T em direção à célula infectada por vírus. Em alguns casos, a célula T específica do epítopo é uma célula T que é específica para um epítopo presente em uma célula infectada por vírus, e o contato da célula T específica do epítopo com o polipeptídeo multimérico aumenta o número das células T específicas do epítopo.
[0446] Assim, a presente divulgação fornece um método de tratamento de uma infecção por vírus em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo multimérico, em que o polipeptídeo multimérico compreende um epítopo de célula T que é um epítopo de vírus, e em que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo imunomodulador estimulador. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células infectadas por vírus no indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células infectadas por vírus no indivíduo em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em comparação com o número de células infectadas por vírus no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade do mesmo, reduz o número de células infectadas por vírus no indivíduo para níveis indetectáveis.
[0447] Assim, a presente divulgação fornece um método de tratamento da infecção em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um TMMP da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo multimérico, em que o polipeptídeo multimérico compreende um epítopo de célula T que é um epítopo associado ao patógeno, e em que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo imunomodulador estimulador. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um TMMP da presente divulgação é um quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, reduz o número de patógenos no indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um TMMP da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, reduz o número de patógenos no indivíduo em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%,
em comparação com o número de patógenos no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, reduz o número de patógenos no indivíduo para níveis indetectáveis. Os patógenos incluem vírus, bactérias, protozoários e semelhantes.
[0448] Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador é um polipeptídeo inibidor, e o polipeptídeo multimérico inibe a atividade de célula T específica do epítopo. Em alguns casos, o epítopo é um auto-epítopo, e o polipeptídeo multimérico inibe seletivamente a atividade de uma célula T específica para o auto- epítopo.
[0449] Assim, a presente divulgação fornece um método de tratamento de um distúrbio autoimune em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, ou um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo multimérico, em que o polipeptídeo multimérico compreende um epítopo de célula T que é um auto-epítopo, e em que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo imunomodulador inibidor. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um TMMP da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, reduz o número de células T auto-reativas por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em comparação ao número de células T auto-reativas no indivíduo antes da administração do polipeptídeo multimérico, ou na ausência de administração do polipeptídeo multimérico. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo multimérico é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, reduz a produção de citocinas Th2 no indivíduo. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" de um TMMP da presente divulgação é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo em necessidade da mesma, melhora um ou mais sintomas associados com uma doença autoimune no indivíduo.
[0450] Conforme mencionado acima, em alguns casos, na realização de um método de tratamento da invenção, um TMMP da presente divulgação é administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo, como o polipeptídeo multimérico per se. Em outros casos, na realização de um método de tratamento da invenção, um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam um TMMP da presente divulgação é/são administrados a um indivíduo em necessidade do(s) mesmo(s). Deste modo, em outros casos, um ou mais ácidos nucleicos da presente divulgação, por exemplo, um ou mais vetores de expressão recombinantes da presente divulgação, é/são administrados a um indivíduo em necessidade do(s) mesmo(s). Formulações
[0451] As formulações adequadas são descrias acima, em que as formulações adequadas incluem um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um polipeptídeo multimérico modulador de uma célula T da presente divulgação; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo multimérico da presente divulgação; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável; em alguns casos, o ácido nucleico é um mRNA. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um primeiro ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo de um TMMP da presente divulgação; b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação; e c) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um TMMP da presente divulgação; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um primeiro vetor de expressão recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídeo de um TMMP da presente divulgação; b) um segundo vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o segundo polipeptídeo de um polipeptídeo de um TMMP da presente divulgação; e c) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0452] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados estão descritos acima. Dosagens
[0453] Uma dosagem adequada pode ser determinada por um médico assistente ou outro pessoal médico qualificado, com base em diversos fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o ácido nucleico ou polipeptídeo específico a ser administrado, sexo do paciente, tempo e via de administração, saúde geral, e outros fármacos sendo administradas concomitantemente. Um polipeptídeo multimérico da presente divulgação pode ser administrado em quantidades entre 1 ng/kg de peso corporal e 20 mg/kg de peso corporal por dose, por exemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; entretanto, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplar são vislumbradas, especialmente considerando-se os fatores acima mencionados. Se o regime for uma infusão contínua, também pode ser na faixa de 1 μg a 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto. Um polipeptídeo multimérico da presente divulgação pode ser administrado em uma quantidade de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, por exemplo, de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal, de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, de cerca de 10 mg/kg de peso corporal a cerca de 15 mg/kg de peso corporal, de cerca de 15 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, de cerca de 20 mg/kg de peso corporal a cerca de 25 mg/kg de peso corporal, de cerca de 25 mg/kg de peso corporal a cerca de 30 mg/kg de peso corporal, de cerca de 30 mg/kg de peso corporal a cerca de 35 mg/kg de peso corporal, de cerca de 35 mg/kg de peso corporal a cerca de 40 mg/kg de peso corporal, ou de cerca de 40 mg/kg de peso corporal a cerca de 50 mg/kg de peso corporal.
[0454] Em alguns casos, uma dose adequada de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 μg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 μg a 1 g por kg de peso corporal, de 10 μg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 μg a 10 mg por kg de peso corporal, ou a partir de 100 μg a 1 mg por kg de peso corporal. As pessoas versadas na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para a dosagem com base nos tempos de permanência medidos e nas concentrações do agente administrado nos fluidos corporais ou tecidos. A seguir ao tratamento bem sucedido, pode ser desejável submeter o paciente à terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, em que um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado em doses de manutenção, variando desde 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 μg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 μg a 1 g por kg de peso corporal, de 10 μg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 μg a 10 mg por kg de peso corporal, ou de 100 μg a 1 mg por kg de peso corporal.
[0455] Aqueles versados compreenderão prontamente que níveis de dose podem variar como uma função do polipeptídeo multimérico específico, a severidade dos sintomas e a suscetibilidade do sujeito a efeitos colaterais. Dosagens preferenciais para um determinado composto são prontamente determináveis por aqueles versados na técnica por uma variedade de meios.
[0456] Em alguns casos, são administradas múltiplas doses de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação. A frequência de administração de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação pode variar dependendo em qualquer de uma variedade de fatores, por exemplo, a gravidade dos sintomas, etc. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado uma vez por mês, duas vezes por mês, três vezes por mês, cada duas semanas (qow), uma vez por semana (qw), duas vezes por semana (biw), três vezes por semana (tiw), quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, em dias alternados (qod), diariamente (qd), duas vezes por dia (qid), ou três vezes por dia (tid).
[0457] A duração da administração de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação, por exemplo, o período de tempo durante o qual um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado, pode variar, dependendo de qualquer um de uma variedade de fatores, por exemplo, resposta do paciente, etc. Por exemplo, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação pode ser administrado ao longo de um período de tempo que varia desde cerca de um dia a cerca de uma semana, de cerca de duas semanas a cerca de quatro semanas, entre cerca de um mês a cerca de dois meses, de cerca de dois meses a cerca de quatro meses, a partir de cerca de quatro meses a cerca de seis meses, de cerca de seis meses a cerca de oito meses, a partir de cerca de oito meses a cerca de 1 ano, desde cerca de 1 ano a cerca de 2 anos, ou de cerca de 2 anos e cerca de 4 anos, ou mais. Vias de administração
[0458] Um agente ativo (de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação) é administrado a um indivíduo utilizando qualquer método disponível e via adequada para distribuição do fármaco, incluindo métodos in vivo e ex vivo, bem como vias sistêmicas e de administração localizadas.
[0459] Vias convencionais e farmaceuticamente aceitáveis de administração incluem intratumoral, peritumoral, intramuscular, intralinfática, intratraqueal, intracraniana, subcutânea, intradérmica, aplicação tópica, intravenosa, intra-arterial, retal, nasal, oral e outras vias de administração entéricas e parentéricas. Vias de administração podem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do polipeptídeo multimérico e/ou do efeito desejado. Um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, ou um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da presente divulgação, pode ser administrado em uma dose única ou em doses múltiplas.
[0460] Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado intravenosamente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado intramuscularmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado por via intralinfática. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado localmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado intratumoralmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado peritumoralmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado por via intracraniana. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação é administrado subcutaneamente.
[0461] Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado por via intravenosa. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado intramuscularmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado localmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado intratumoralmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado peritumoralmente. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado por via intracraniana. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico é administrado por via subcutânea. Em alguns casos, um polipeptídeo multimérico da presente divulgação é administrado por via intralinfática.
[0462] Um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação pode ser administrado a um hospedeiro utilizando quaisquer métodos convencionais disponíveis e as vias adequadas para a distribuição de fármacos convencionais, incluindo as vias sistêmicas ou localizadas. Em geral, as vias de administração contempladas para uso em um método da presente divulgação incluem, mas não estão necessariamente limitadas a vias entéricas, parentéricas e inalatórias.
[0463] Vias parentéricas de administração diferentes de administração por inalação incluem, mas não são necessariamente limitadas a vias tópicas, transdérmicas, subcutâneas, intramusculares, intraorbitais, intracapsulares, intraespinais, intraesternais, intratumorais, intralinfáticas, peritumorais e intravenosas, ou seja, qualquer via de administração diferente daquela através do canal alimentar. A administração parentérica pode ser levada a efetuar a distribuição sistêmica ou local de um polipeptídeo multimérico da presente divulgação, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Onde distribuição sistêmica for desejada, a administração tipicamente envolve administração tópica ou através da mucosa, invasiva ou absorvida sistemicamente de preparações farmacêuticas. Sujeitos adequados para tratamento
[0464] Sujeitos adequados para tratamento com um método da presente invenção incluem indivíduos que têm câncer, incluindo indivíduos que tenham sido diagnosticados como tendo câncer, indivíduos que foram tratados para o câncer, mas que não respondem ao tratamento, e os indivíduos que foram tratados para o câncer e que inicialmente responderam mas posteriormente tornaram-se refratários ao tratamento. Sujeitos adequados para tratamento com um método da presente divulgação incluem indivíduos que têm uma infecção (por exemplo, uma infecção com um agente patogênico, tal como uma bactéria, um vírus, um protozoário, etc.), incluindo indivíduos que tenham sido diagnosticados como tendo uma infecção e os indivíduos que foram tratados para uma infecção, mas que não responderam ao tratamento. Sujeitos adequados para tratamento com um método da presente divulgação incluem indivíduos que têm infecção bacteriana, incluindo indivíduos que tenham sido diagnosticados como tendo uma infecção bacteriana, e os indivíduos que foram tratados para uma infecção bacteriana, mas que não responderam ao tratamento. Sujeitos adequados para tratamento com um método da presente divulgação incluem indivíduos que têm uma infecção viral, incluindo indivíduos que tenham sido diagnosticados como tendo uma infecção viral, e os indivíduos que foram tratados para uma infecção viral, mas que não responderam ao tratamento. Sujeitos adequados para tratamento com um método da presente divulgação incluem indivíduos que têm uma doença autoimune, incluindo indivíduos que tenham sido diagnosticados como tendo uma doença autoimune, e os indivíduos que foram tratados para uma doença autoimune, mas que não responderam ao tratamento. Exemplos de Aspectos Não Limitantes da Divulgação
[0465] Aspectos, incluindo modalidades, da questão da presente invenção descritos acima podem ser benéficos individualmente ou em combinação, com um ou mais outros aspectos ou modalidades. Sem se limitar a descrição anterior, são fornecidos abaixo alguns aspectos não limitativos da divulgação numerada de 1-
134. Conforme será evidente àqueles versados na técnica ao lerem esta divulgação, cada um dos aspectos numerados individualmente pode ser usado ou combinado com qualquer um dos aspectos numerados, precedentes ou seguintes. O objetivo é fornecer suporte para todas essas combinações de aspectos e não se limita a combinações de aspectos explicitamente providos abaixo:
[0466] Aspecto 1. Um polipeptídeo multimérico modulador de células T, em que o polipeptídeo multimérico é:
[0467] A) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo do MHC, em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo compreende um epítopo; em que o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes e em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores pode ser um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem ou uma variante de um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos comparadas com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem correspondente; e em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo opcionalmente compreende um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou uma suporte não Ig; ou
[0468] B) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo do MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo polipeptídeo do MHC, em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo compreende um epítopo; em que o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes,
[0469] em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos imunomoduladores é uma variante de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente,
[0470] em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, e em que o epítopo se liga a um receptor de célula T (TCR) com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, de modo que: i) o polipeptídeo multimérico modulador de célula T se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o polipeptídeo multimérico modulador de célula T se liga uma segunda célula T, em que a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e um TCR que se liga ao epítopo com uma afinidade de pelo menos 10 -7 M, e em que a segunda célula T se expressa em sua superfície o polipeptídeo co- imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que se liga ao epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M; e/ou ii) a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de célula T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de célula T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem para o polipeptídeo co- imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, está na faixa de 1,5:1 a 106:1; e em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos comparado com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente; e
[0471] em que o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo opcionalmente compreende um polipeptídeo Ig Fc ou um suporte não Ig; ou
[0472] C) um heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo, desde o terminal N até o terminal C: i) um epítopo; ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo, desde terminal N ao terminal C: i) um segundo polipeptídeo MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que o polipeptídeo multimérico compreende um ou mais domínios imunomoduladores que podem ser iguais ou diferentes, em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores está: A) no terminal C do primeiro polipeptídeo; B) no terminal N do segundo polipeptídeo; C) no terminal C do segundo polipeptídeo; ou D) no terminal C do primeiro polipeptídeo e no terminal N do segundo polipeptídeo e em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores pode ser um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ou uma variante de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente; e
[0473] opcionalmente em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, e em que o epítopo se liga a um receptor de célula T (TCR) em uma célula T com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, de modo que: i) o polipeptídeo multimérico modulador de célula T se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o polipeptídeo multimérico modulador de célula T se liga uma segunda célula T, em que a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato e um TCR que se liga ao epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, e em que a segunda célula T se expressa em sua superfície o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que se liga ao epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M; e/ou ii) a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de célula T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem, com um polipeptídeo co- imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de célula T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, está na faixa de 1,5:1 a 106:1; e em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos comparado com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente.
[0474] Aspecto 2. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga à primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 50% maior que a afinidade com a qual se liga à segunda célula T.
[0475] Aspecto 3. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga à primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 2 vezes maior que a afinidade com a qual se liga à segunda célula T.
[0476] Aspecto 4. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga à primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 5 vezes maior que a afinidade com a qual se liga à segunda célula T.
[0477] Aspecto 5. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga à primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 10 vezes maior que a afinidade com a qual se liga à segunda célula T.
[0478] Aspecto 6. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo imunomodulador variante se liga ao polipeptídeo co-imunomodulador com uma afinidade de cerca de 10-4 M a cerca de 10-7 M.
[0479] Aspecto 7. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo imunomodulador variante se liga ao polipeptídeo co-imunomodulador com uma afinidade de cerca de 10-4 M a cerca de 10-6 M.
[0480] Aspecto 8. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que o polipeptídeo imunomodulador variante se liga ao polipeptídeo co-imunomodulador com uma afinidade de cerca de 10-4 M a cerca de 10-5 M.
[0481] Aspecto 9. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação a afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, é de pelo menos 10:1.
[0482] Aspecto 10. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação a afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, é de pelo menos 50:1.
[0483] Aspecto 11. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação a afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T da presente divulgação compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, é de pelo menos 102:1.
[0484] Aspecto 12. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 1, em que a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação a afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de bio-camada, é de pelo menos 103:1.
[0485] Aspecto 13. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-12, em que o segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo Ig Fc.
[0486] Aspecto 14. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 13, em que o polipeptídeo IgFc é um polipeptídeo IgG1 Fc.
[0487] Aspecto 15. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 14, em que o polipeptídeo IgG1 Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre N297A, L234A, L235A, L234F, L235E e P331S.
[0488] Aspecto 16. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 14, em que o polipeptídeo IgG1 Fc compreende substituições L234A e L235A.
[0489] Aspecto 17. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-16, em que o primeiro polipeptídeo compreende um ligante peptídico entre o epítopo e o primeiro polipeptídeo do MHC.
[0490] Aspecto 18. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 17, em que o ligante tem um comprimento de 20 aminoácidos a 40 aminoácidos.
[0491] Aspecto 19. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 17, em que o ligante é um peptídeo da fórmula (GGGGS) n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[0492] Aspecto 20. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-19, em que o primeiro polipeptídeo compreende um ligante peptídico entre o polipeptídeo imunomodulador variante e o segundo polipeptídeo do MHC.
[0493] Aspecto 21. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 18, em que o ligante tem um comprimento de 20 aminoácidos a 40 aminoácidos.
[0494] Aspecto 22. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 20, em que o ligante é um peptídeo da fórmula (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[0495] Aspecto 23. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-22, compreendendo duas ou mais cópias do polipeptídeo imunomodulador variante.
[0496] Aspecto 24. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 23, em que as duas ou mais cópias do polipeptídeo imunomodulador variante compreendem a mesma sequência de aminoácidos.
[0497] Aspecto 25. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 23 ou aspecto 24, compreendendo um ligante peptídico entre as cópias.
[0498] Aspecto 26. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 25, em que o ligante tem um comprimento de 20 aminoácidos a 40 aminoácidos.
[0499] Aspecto 27. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 25, em que o ligante é um peptídeo da fórmula (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[0500] Aspecto 28. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-27, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende de 1 a 10 substituições de aminoácidos em relação a um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem correspondente.
[0501] Aspecto 29. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 28, em que o polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem é selecionado a partir do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX- 40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM.
[0502] Aspecto 30. O polipeptídeo multimérico modulador de célula T de acordo com os aspectos 1-29, em que o primeiro polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo β2-microglobulina; e em que o segundo polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia pesada classe I do MHC.
[0503] Aspecto 31. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 30, em que o polipeptídeo β2-microglobulina compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com uma das sequências de aminoácidos estabelecida na FIGURA 4.
[0504] Aspecto 32. O polipeptídeo multimérico modulador de célula T de acordo com o aspecto 30, em que o polipeptídeo de cadeia pesada classe I do MHC é uma cadeia pesada HLA-A, HLA-B ou HLA-C.
[0505] Aspecto 33. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 32, em que o polipeptídeo de cadeia pesada classe I do MHC compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida em uma das FIGURAS 3A-3C.
[0506] Aspecto 34. O polipeptídeo multimérico modulador de célula T, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-29, em que o primeiro polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia alfa classe II do MHC; e em que o segundo polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia beta classe II do MHC.
[0507] Aspecto 35. O polipeptídeo multimérico modulador de célula T de acordo com qualquer um dos aspectos de 1-34, em que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo Fc, e em que o polipeptídeo Ig Fc é um polipeptídeo IgG1 Fc, um polipeptídeo IgG2 Fc, um polipeptídeo IgG3 Fc, um polipeptídeo IgG4 Fc, um polipeptídeo IgA Fc, ou um polipeptídeo IgM Fc.
[0508] Aspecto 36. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 26, em que o polipeptídeo Ig Fc compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos representada em uma das FIGURAS 2A-2D.
[0509] Aspecto 37. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 35 ou 36, em que o segundo polipeptídeo compreende um ligante peptídico entre o segundo polipeptídeo do MHC e o polipeptídeo Fc.
[0510] Aspecto 38. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 37, em que o ligante tem um comprimento de 20 aminoácidos a 4 aminoácidos.
[0511] Aspecto 39. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 37, em que o ligante é um peptídeo da fórmula (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[0512] Aspecto 40. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-39, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão associados não covalentemente.
[0513] Aspecto 41. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-39, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados covalentemente um ao outro.
[0514] Aspecto 42. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 41, em que a ligação covalente é através de uma ligação dissulfeto.
[0515] Aspecto 43. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 42, em que a ligação dissulfeto liga um resíduo de cisteína no primeiro polipeptídeo do MHC com um resíduo de cisteína no segundo polipeptídeo do MHC.
[0516] Aspecto 44. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-43, em que o epítopo é um epítopo de câncer.
[0517] Aspecto 45. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 44, em que o epítopo de câncer é um fragmento peptídico de cerca de 4 aminoácidos (aa), 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa ou 20 aa de comprimento de um polipeptídeo MUC1, um polipeptídeo E6 de papiloma humano (HPV), um polipeptídeo LMP2, um polipeptídeo E7 de HPV, um polipeptídeo do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) vIII, um polipeptídeo HER-2/neu, um antígeno do melanoma da família A, polipeptídeo 3 (MAGE A3), um polipeptídeo p53, um polipeptídeo mutante p53 e um polipeptídeo NY-ESO-1, um polipeptídeo de folato hidrolase (antígeno de membrana específico da próstata; PSMA), um polipeptídeo de antígeno carcinoembrionário (CEA), um polipeptídeo de antígeno de melanoma reconhecido por células T (melanA/MART1),um polipeptídeo Ras, um polipeptídeo gp100, um polipeptídeo de proteinase3 (PR1), um polipeptídeo bcr-abl, um polipeptídeo de tirosinase, um polipeptídeo de survivina, um polipeptídeo de antígeno específico da próstata (PSA), um polipeptídeo hTERT, um polipeptídeo de pontos de quebra de translocação de sarcoma, um polipeptídeo de ponto de quebra de sarcoma sinovial X (SSX), um polipeptídeo EphA2, uma fosfatase ácida, um polipeptídeo da próstata (PAP), um polipeptídeo de melanoma inibidor da apoptose (ML-IAP), um polipeptídeo de alfa-fetoproteína (AFP), um polipeptídeo da molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), um polipeptídeo ERG (fusão TMPRSS2 ETS), um polipeptídeo NA17, um polipeptídeo "paired-box-3" (PAX3), um polipeptídeo anaplásico de linfoma quinase (ALK), um polipeptídeo de receptor de androgênio, um polipeptídeo de ciclina B1, um polipeptídeo de proto-oncogene N-myc (MYCN), um polipeptídeo membro da família C do homólogo do gene Ras (RhoC), um polipeptídeo da proteína 2 relacionado à tirosinase (TRP-2), um polipeptídeo da mesotelina, um polipeptídeo de antígeno da célula-tronco prostática (PSCA), um polipeptídeo de antígeno-1 associado a melanoma (MAGE A1), polipeptídeo do citocromo P450 1B1 (CYP1B1), polipeptídeo da proteína 1 específica da placenta (PLAC1), um polipeptídeo BORIS (também conhecido como fator de ligação a CCCTC ou CTCF), polipeptídeo ETV6-AML, polipeptídeo de antígeno do câncer de mama NY-BR-1 (também conhecido como proteína 30A contendo domínio de repetição de anquirina), um polipeptídeo do regulador de sinalização da proteína G
(RGS5), um polipeptídeo de antígeno de carcinoma espinocelular reconhecido por células T (SART3), um polipeptídeo de anidrase carbônica IX, um polipeptídeo "paired box-5" (PAX5), um polipeptídeo OY-TES1 (antígeno testicular; também conhecido como proteína de ligação à acrosina), um polipeptídeo de proteína 17 do esperma, um polipeptídeo de proteína-tirosina quinase (LCK) específico de célula de linfócito, um antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW- MAA), uma proteína-4 de ancoragem de A-quinase (AKAP-4), um polipeptídeo do ponto de quebra 2 do sarcoma sinovial X (SSX2), um polipeptídeo do membro da família 1 de antígeno X (XAGE1), um polipeptídeo B7 homólogo 3 (B7H3; também conhecido como CD276), um polipeptídeo legumaína (LGMN1; também conhecido como asparaginil endopeptidase), um polipeptídeo de tirosina-quinase com os domínios 2 de homologia de Ig e EGF (Tie-2; também conhecido como receptor da angiopoietina-1), um polipeptídeo do membro da família 4 do antígeno P (PAGE4), um polipeptídeo do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF2), um polipeptídeo MAD-CT-1, um polipeptídeo de proteína de ativação de fibroblastos (FAP), um polipeptídeo de receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFβ), um polipeptídeo MAD-CT-2, um polipeptídeo de antígeno-1 relacionado a Fos (FOSL) ou um polipeptídeo de tumor-1 de Wilms (WT- 1).
[0518] Aspecto 46. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-45, em que um do primeiro e do segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo Ig Fc, em que um fármaco é conjugado ao polipeptídeo Ig Fc.
[0519] Aspecto 47. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 46, em que o fármaco é um agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinóide, benzodiazepina, taxóide, CC-1065, duocarmicina, um análogo da duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, um análogo da dolastatina, auristatina, tomaimicina e leptomicina ou um pró-fármaco de qualquer um dos anteriores.
[0520] Aspecto 48. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 46, em que o fármaco é um retinóide.
[0521] Aspecto 49. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-48, em que a afinidade de ligação é determinada por interferometria de bio-camada.
[0522] Aspecto 50. Um método para modular uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-49, em que a referida administração induz uma resposta de célula T específica para epítopo e uma resposta de célula T não específica do epítopo, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 2:1.
[0523] Aspecto 51. O método do aspecto 50, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 5:1.
[0524] Aspecto 52. O método do aspecto 50, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 10:1.
[0525] Aspecto 53. O método do aspecto 50, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 25:1.
[0526] Aspecto 54. O método do aspecto 50, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 50:1.
[0527] Aspecto 55. O método do aspecto 50, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 100:1.
[0528] Aspecto 56. O método de qualquer um dos aspectos 50-55, em que o indivíduo é um humano.
[0529] Aspecto 57. O método de qualquer um dos aspectos 50-56, em que a referida modulação compreende aumentar uma resposta de células T citotóxicas a uma célula cancerígena.
[0530] Aspecto 58. O método de qualquer um dos aspectos 50-57, em que a referida modulação compreende reduzir uma resposta de células T a um auto- antígeno.
[0531] Aspecto 59. O método de qualquer um dos aspectos 50-58, em que a referida administração é intravenosa, subcutânea, intramuscular, sistêmica, intralinfática, distal a um sítio de tratamento, local ou em um sítio de tratamento ou próximo a ele.
[0532] Aspecto 60. O método de qualquer um dos aspectos 50-59, em que a resposta de célula T não específica do epítopo é menor que a resposta de célula T não específica do epítopo que seria induzida por um polipeptídeo multimérico modulador de célula T de controle compreendendo um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem correspondente.
[0533] Aspecto 61. Um método de tratamento de câncer em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-49.
[0534] Aspecto 62. Um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleotídicas que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeo do polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-
49.
[0535] Aspecto 63. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 62, em que o primeiro polipeptídeo é codificado por uma primeira sequência de nucleotídeos, o segundo polipeptídeo é codificado por uma segunda sequência de nucleotídeos e em que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos estão presentes em um único ácido nucleico.
[0536] Aspecto 64. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 62, em que o primeiro polipeptídeo é codificado por uma primeira sequência de nucleotídeos presente em um primeiro ácido nucleico, e o segundo polipeptídeo é codificado por uma segunda sequência de nucleotídeos presente em um segundo ácido nucleico.
[0537] Aspecto 65. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 63, em que a primeira sequência nucleotídica e a segunda sequência nucleotídica estão operacionalmente ligadas a um elemento de controle transcricional.
[0538] Aspecto 66. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 64, em que a primeira sequência nucleotídica está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional e a segunda sequência nucleotídica está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[0539] Aspecto 67. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 63, em que o ácido nucleico único está presente em um vetor de expressão recombinante.
[0540] Aspecto 68. O um ou mais ácidos nucleicos do aspecto 67, em que o primeiro ácido nucleico está presente em um primeiro vetor de expressão recombinante e o segundo ácido nucleico está presente em um segundo vetor de expressão recombinante.
[0541] Aspecto 69. Uma composição compreendendo: a) o polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-49; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0542] Aspecto 70. Uma composição compreendendo: a) o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer um dos aspectos 62-68; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0543] Aspecto 71. Uma composição compreendendo: a) o polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 1-49; e b) solução salina
[0544] Aspecto 72. A composição do aspecto 71, em que a solução salina é NaCl a 0,9%.
[0545] Aspecto 73. A composição do aspecto 71 ou 72, em que a composição é estéril.
[0546] Aspecto 74. Um método para obter um polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem parental correspondente para o polipeptídeo co- imunomodulador, o método compreendendo selecionar, a partir de uma biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T, compreendendo uma pluralidade de membros, um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, em que a pluralidade de membros compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo.
[0547] Aspecto 75. Um método para obter um polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem parental correspondente para o polipeptídeo co- imunomodulador, o método compreendendo: A) fornecer uma biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T compreendendo uma pluralidade de membros, em que a pluralidade de membro compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo ou no primeiro e no segundo polipeptídeo; e B) selecionar da biblioteca um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato.
[0548] Aspecto 76. O método dos aspectos 74 ou 75, em que a referida seleção compreende determinar a afinidade, usando interferometria de bio- camada, de ligação entre os membros da biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T e o polipeptídeo cognato co-imunomodulador.
[0549] Aspecto 77. O método de qualquer um dos aspectos 74-76, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T é como definido em qualquer um dos aspectos 1-49.
[0550] Aspecto 78. O método de qualquer um dos aspectos 74-77, compreendendo ainda: a) o contato do membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de células T selecionado com uma célula T alvo que expressa em sua superfície: i) um polipeptídeo co-imunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem parental; e ii) um receptor de célula T que se liga ao epítopo, em que o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de células T compreende um marcador de epítopo, de modo que o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T se ligue à célula T alvo; b) o contato com o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado ligado à célula T alvo com um agente de ligação marcado com fluorescência que se liga ao marcador do epítopo, gerando um complexo membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado/célula T alvo/agente de ligação; e c) medir a intensidade média de fluorescência (MFI) do complexo membro da biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de célula T selecionado/célula T alvo/agente de ligação usando citometria de fluxo, em que a MFI medida em uma faixa de concentrações dos membro da biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores fornece uma medida da afinidade e avidez aparente; em que um membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado que se liga seletivamente à célula T alvo, em comparação com a ligação do membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T a uma célula T de controle que compreende: i) o polipeptídeo co-imunomodulador cognato que se liga ao polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem; e ii) um receptor de células T que se liga a um epítopo diferente do epítopo presente no membro da biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T, é identificado como ligando-se seletivamente à célula T alvo.
[0551] Aspecto 79. O método do aspecto 78, em que o agente de ligação é um anticorpo específico para o marcador de epítopo.
[0552] Aspecto 80. O método de qualquer um dos aspectos 74-79, em que o polipeptídeo imunomodulador variante compreende de 1 a 20 substituições de aminoácidos em comparação com o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente.
[0553] Aspecto 81. O método de qualquer um dos aspectos 74-80, em que o polipeptídeo multimérico modulador de células T compreende dois polipeptídeos imunomoduladores variantes.
[0554] Aspecto 82. O método do aspecto 81, em que os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes compreendem a mesma sequência de aminoácidos.
[0555] Aspecto 83. O método dos aspectos 81 ou 82, em que o primeiro polipeptídeo compreende um dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes e em que o segundo polipeptídeo compreende o segundo dos dois polipeptídeos imunomoduladores variantes.
[0556] Aspecto 84. O método dos aspectos 81 ou 82, em que os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão na mesma cadeia polipeptídica do polipeptídeo multimérico modulador de células T.
[0557] Aspecto 85. O método do aspecto 84, em que os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no primeiro polipeptídeo do polipeptídeo multimérico modulador de células T.
[0558] Aspecto 86. O método do aspecto 84, em que os dois polipeptídeos imunomoduladores variantes estão no segundo polipeptídeo do polipeptídeo multimérico modulador de células T.
[0559] Aspecto 87. O método de qualquer um dos aspectos 74-86, compreendendo ainda o isolamento do membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de células T selecionado da biblioteca.
[0560] Aspecto 88. O método de qualquer um dos aspectos 74-87, compreendendo ainda o fornecimento de um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de células T selecionado.
[0561] Aspecto 89. O método do aspecto 88, em que o ácido nucleico está presente em um vetor de expressão recombinante.
[0562] Aspecto 90. O método dos aspectos 88 ou 89, em que a sequência nucleotídica está operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional que é funcional em uma célula eucariótica.
[0563] Aspecto 91. O método de qualquer um dos aspectos 88-90, compreendendo ainda a introdução do ácido nucleico em uma célula hospedeira eucariótica e a cultura da célula em um meio líquido para sintetizar o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado codificado na célula.
[0564] Aspecto 92. O método do aspecto 91, compreendendo ainda o isolamento do membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado sintetizado a partir da célula ou do meio de cultura líquido que compreende a célula.
[0565] Aspecto 93. O método de qualquer um dos aspectos 74-92, em que o membro da biblioteca de polipeptídeo multimérico modulador de célula T selecionado compreende um polipeptídeo Ig Fc.
[0566] Aspecto 94. O método do aspecto 93, compreendendo ainda a conjugação de um fármaco com o polipeptídeo Ig Fc.
[0567] Aspecto 95. O método do aspecto 94, em que o fármaco é um agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinóide, benzodiazepina, taxóide, CC- 1065, duocarmicina, um análogo da duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, um análogo da dolastatina, auristatina, tomaimicina e leptomicina ou um pró-fármaco de qualquer um dos anteriores.
[0568] Aspecto 96. O método do aspecto 94, em que o fármaco é um retinóide.
[0569] Aspecto 97. O método de qualquer um dos aspectos 74-96, em que o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem e os polipeptídeos imunomoduladores cognatos são selecionados a partir de: receptor de IL-2 e IL-2; 4-1BBL e 4-1BB; PD-L1 e PD-1; FasL e Fas; TGFβ e receptor de TGFβ; CD80 e CD28; CD86 e CD28; OX40L e OX40; CD70 e CD27; ICOS-L e ICOS; ICAM e LFA- 1; JAG1 e Notch; JAG1 e CD46; CD80 e CTLA4; e CD86 e CTLA4.
[0570] Aspecto 98. Um polipeptídeo multimérico modulador de células T, compreendendo: A) um primeiro heterodímero de polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos aspectos 1-49 e B) um segundo heterodímero de polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos aspectos 1-49 e em que o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão ligados covalentemente um ao outro.
[0571] Aspecto 99. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 98, em que o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão ligados covalentemente um ao outro através de uma região terminal C do segundo polipeptídeo do primeiro heterodímero e uma região terminal C do segundo polipeptídeo do segundo heterodímero.
[0572] Aspecto 100. O polipeptídeo modulador de células T multimérico do aspecto 98 ou 99, em que o epítopo peptídico do primeiro heterodímero e o epítopo peptídico do segundo heterodímero compreendem a mesma sequência de aminoácidos.
[0573] Aspecto 101. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-100, em que o primeiro polipeptídeo do MHC do primeiro e do segundo heterodímero é um β2-microglobulina Classe I do MHC e em que o segundo polipeptídeo do MHC do primeiro e do segundo heterodímero é uma cadeia pesada Classe I do MHC.
[0574] Aspecto 102. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-101, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero compreendem a mesma sequência de aminoácidos ou compreendem diferentes sequências de aminoácidos.
[0575] Aspecto 103. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-102, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero são polipeptídeos imunomoduladores variantes que compreendem de 1 a 10 substituições de aminoácidos comparadas com um polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente, e em que as de 1 a 10 substituições de aminoácidos resultam em ligação de afinidade reduzida do polipeptídeo imunomodulador variante com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato.
[0576] Aspecto 104. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-103, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em IL-2, 4 -1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70, ICAM, variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX- 40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, e suas combinações.
[0577] Aspecto 105. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 104, em que o polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem e os polipeptídeos imunomoduladores cognatos são selecionados a partir de: receptor de IL-2 e IL-2; 4-1BBL e 4-1BB; PD-L1 e PD-1; FasL e Fas; TGFβ e receptor de TGFβ; CD80 e CD28; CD86 e CD28; OX40L e OX40; CD70 e CD27; ICOS-L e ICOS; ICAM e LFA-1; JAG1 e Notch; JAG1 e CD46; CD80 e CTLA4; e CD86 e CTLA4.
[0578] Aspecto 106. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-105, em que o epítopo peptídico é um epítopo de câncer.
[0579] Aspecto 107. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 106, em que o epítopo de câncer é um fragmento peptídico de 4 aminoácidos (aa), 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa ou 20 aa de comprimento de um polipeptídeo MUC1, um polipeptídeo E6 de papiloma humano (HPV), um polipeptídeo LMP2, um polipeptídeo E7 de HPV, um polipeptídeo do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) vIII, um polipeptídeo HER-2/neu, um polipeptídeo de antígeno do melanoma da família A, polipeptídeo 3 (MAGE A3), um polipeptídeo p53, um polipeptídeo p53 mutante, um polipeptídeo NY-ESO-1, um polipeptídeo de folato hidrolase (antígeno de membrana específico da próstata; PSMA), um polipeptídeo de antígeno carcinoembrionário (CEA), um polipeptídeo de antígeno de melanoma reconhecido por células T (melanA/MART1), um polipeptídeo Ras, um polipeptídeo gp100, um polipeptídeo de proteinase3 (PR1), um polipeptídeo bcr-abl, um polipeptídeo de tirosinase, um polipeptídeo de survivina, um polipeptídeo de antígeno específico da próstata (PSA), um polipeptídeo hTERT, um polipeptídeo de pontos de quebra de translocação de sarcoma, um polipeptídeo de ponto de quebra de sarcoma sinovial X (SSX), um polipeptídeo EphA2, uma fosfatase ácida, um polipeptídeo da próstata (PAP), um polipeptídeo de melanoma inibidor da apoptose (ML-IAP), um polipeptídeo de alfa-fetoproteína (AFP), um polipeptídeo da molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), um polipeptídeo ERG (fusão TMPRSS2 ETS), um polipeptídeo NA17, um polipeptídeo "paired-box-3" (PAX3), um polipeptídeo anaplásico de linfoma quinase (ALK), um polipeptídeo de receptor de androgênio, um polipeptídeo de ciclina B1, um polipeptídeo de proto-oncogene N-myc (MYCN), um polipeptídeo membro da família C do homólogo do gene Ras (RhoC), um polipeptídeo da proteína 2 relacionado à tirosinase (TRP-2), um polipeptídeo da mesotelina, um polipeptídeo de antígeno da célula-tronco prostática (PSCA), um polipeptídeo de antígeno-1 associado a melanoma (MAGE A1), polipeptídeo do citocromo P450 1B1 (CYP1B1), polipeptídeo da proteína 1 específica da placenta (PLAC1), um polipeptídeo BORIS (também conhecido como fator de ligação a CCCTC ou CTCF), polipeptídeo ETV6-AML, polipeptídeo de antígeno do câncer de mama NY-BR-1 (também conhecido como proteína 30A contendo domínio de repetição à anquirina), um polipeptídeo do regulador de sinalização da proteína G (RGS5), um polipeptídeo de antígeno de carcinoma espinocelular reconhecido por células T (SART3), um polipeptídeo de anidrase carbônica IX, um polipeptídeo "paired box-5" (PAX5), um polipeptídeo OY-TES1 (antígeno testicular; também conhecido como proteína de ligação à acrosina), um polipeptídeo de proteína 17 do esperma, um polipeptídeo de proteína-tirosina quinase (LCK) específico de célula de linfócito, um antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW- MAA), uma proteína-4 de ancoragem de A-quinase (AKAP-4), um polipeptídeo do ponto de quebra 2 do sarcoma sinovial X (SSX2), um polipeptídeo do membro da família 1 de antígeno X (XAGE1), um polipeptídeo B7 homólogo 3 (B7H3; também conhecido como CD276), um polipeptídeo legumaína (LGMN1; também conhecido como asparaginil endopeptidase), um polipeptídeo de tirosina-quinase com os domínios 2 de homologia de Ig e EGF (Tie-2; também conhecido como receptor da angiopoietina-1), um polipeptídeo do membro da família 4 do antígeno P (PAGE4), um polipeptídeo do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF2), um polipeptídeo MAD-CT-1, um polipeptídeo de proteína de ativação de fibroblastos (FAP), um polipeptídeo de receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFβ), um polipeptídeo MAD-CT-2, um polipeptídeo de antígeno-1 relacionado a Fos (FOSL) ou um polipeptídeo de tumor-1 de Wilms (WT- 1).
[0580] Aspecto 108. Método para distribuir um polipeptídeo co-estimulatório (isto é, imunomodulador) seletivamente para atingir a célula T, o método compreendendo o contato de uma população mista de células T com um polipeptídeo multimérico de qualquer um dos aspectos 1-49 e 98-107, em que a população mista de células T compreendem a célula T alvo e as células T não alvo, em que a célula T alvo é específica para o epítopo presente no polipeptídeo multimérico e em que o referido contato distribui o um ou mais polipeptídeos co- estimulatórios presentes no polipeptídeo multimérico à célula T alvo.
[0581] Aspecto 109. O método do aspecto 108, em que a população de células T é in vitro.
[0582] Aspecto 110. O método do aspecto 108, em que a população de células T é in vivo em um indivíduo.
[0583] Aspecto 111. O método do aspecto 110, compreendendo a administração do polipeptídeo multimérico ao indivíduo.
[0584] Aspecto 112. O método de qualquer um dos aspectos 108-111, em que a célula T alvo é uma célula T reguladora.
[0585] Aspecto 113. O método de qualquer um dos aspectos 108-111, em que a célula T alvo é uma célula T citotóxica.
[0586] Aspecto 114. O método do aspecto 108, em que a população mista de células T é uma população in vitro de células T misturadas obtidas de um indivíduo, e em que o referido contato resulta na ativação e/ou proliferação da célula T alvo, gerando uma população de células T alvo ativadas e/ou proliferadas.
[0587] Aspecto 115. O método do aspecto 114, compreendendo ainda administrar a população de células T alvo ativadas e/ou proliferadas ao indivíduo.
[0588] Aspecto 116. Método para detectar, em uma população mista de células T obtida de um indivíduo, a presença de uma célula T alvo que se liga a um epítopo de interesse, o método compreendendo: a) o contato in vitro da população mista de células T com o polipeptídeo multimérico de qualquer um dos aspectos 1- 49 e 98-107, em que o polipeptídeo multimérico compreende o epítopo de interesse; e b) detectar a ativação e/ou proliferação de células T em resposta ao referido contato, em que células T ativadas e/ou proliferadas indicam a presença da célula T alvo.
[0589] Aspecto 117. O método dos aspectos 108-115, em que o um ou mais polipeptídeos co-estimuladores do primeiro heterodímero são selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70, ICAM, variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS- L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, e combinações dos mesmos e
[0590] em que o um ou mais polipeptídeos co-estimulatórios do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70, ICAM, variantes de IL- 2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, e combinações dos mesmos.
[0591] Aspecto 118. O método do aspecto 117, em que o um ou mais polipeptídeos co-estimulatórios do primeiro heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em IL-2, uma variante de IL-2 e suas combinações, e o um ou mais polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em IL-2, uma variante de IL-2, e combinações dos mesmos.
[0592] Aspecto 119. O método do aspecto 117, em que o um ou mais polipeptídeos co-estimuladores do primeiro heterodímero são selecionados do grupo que consiste em 4-1BBL, uma variante do 4-1BBL, e combinações dos mesmos, e o um ou mais polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em 4-1BBL, uma variante de 4-1BBL, e combinações dos mesmos.
[0593] Aspecto 120. O método do aspecto 117, em que o um ou mais polipeptídeos co-estimulatórios do primeiro heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em CD80, uma variante de CD80 e suas combinações, e o um ou mais polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em CD80, uma variante de CD80, e suas combinações.
[0594] Aspecto 121. O método do aspecto 117, em que o primeiro heterodímero compreende pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores que são selecionados independentemente do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD- L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e
[0595] em que o segundo heterodímero compreende pelo menos dois polipeptídeos co-estimulatórios que são selecionados independentemente do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM.
[0596] Aspecto 122. O método do aspecto 121, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimulatórios do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em IL-2 e variantes da IL-2 e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em IL-2 e variantes de IL-
2.
[0597] Aspecto 123. O método do aspecto 121, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimulatórios do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em 4-1BBL e variantes de 4-1BBL, e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em 4-1BBL e variantes de 4-1BBL.
[0598] Aspecto 124. O método do aspecto 121, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimulatórios do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em CD80 e variantes de CD80 e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em CD80 e variantes de CD80.
[0599] Aspecto 125. O método do aspecto 121, em que pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores do primeiro heterodímero é CD80 ou uma variante de CD80 e pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos co- estimuladores do primeiro heterodímero é 4-1BBL ou uma variante de 4-1BBL, e
[0600] em que pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos co- estimuladores do segundo heterodímero é CD80 ou uma variante de CD80 e pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos co-estimuladores do segundo heterodímero é 4-1BBL ou uma variante de 4-1BBL.
[0601] Aspecto 126. O polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer um dos aspectos 98-107, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (isto é, co-estimulatórios) do primeiro heterodímero são selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS- L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, e suas combinações, e
[0602] em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (isto é, co- estimulatórios) do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70, ICAM, variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM, e combinações dos mesmos.
[0603] Aspecto 127. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 126, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em IL-2, uma variante de IL-2 e suas combinações, e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em IL-2, uma variante de IL-2, e combinações dos mesmos.
[0604] Aspecto 128. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 126, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero são selecionados do grupo que consiste em 4-1BBL, uma variante do 4-1BBL, e combinações dos mesmos, e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero são selecionados do grupo que consiste em 4-1BBL, uma variante de 4-1BBL, e combinações dos mesmos.
[0605] Aspecto 129. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 126, em que o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em CD80, uma variante de CD80 e suas combinações, e o um ou mais polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero são selecionados a partir do grupo que consiste em CD80, uma variante de CD80, e combinações dos mesmos.
[0606] Aspecto 130. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 126, em que o primeiro heterodímero compreende pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores que é cada um selecionado independentemente do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e
[0607] em que o segundo heterodímero compreende pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores que são cada um selecionados independentemente do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM e variantes de IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM.
[0608] Aspecto 131. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 130, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em IL-2 e variantes da IL-2 e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em IL-2 e variantes de IL-2.
[0609] Aspecto 132. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 130, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em 4-1BBL e variantes de 4-1BBL, e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em 4-1BBL e variantes de 4-1BBL.
[0610] Aspecto 133. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 130, em que cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em CD80 e variantes da CD80 e cada um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero é selecionado independentemente do grupo que consiste em CD80 e variantes de CD80.
[0611] Aspecto 134. O polipeptídeo multimérico modulador de células T do aspecto 130, em que pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero é CD80 ou uma variante de CD80 e pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do primeiro heterodímero é 4-1BBL ou uma variante de 4-1BBL, e em que pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero é CD80 ou uma variante de CD80 e pelo menos um dos pelo menos dois polipeptídeos imunomoduladores do segundo heterodímero é 4-1BBL ou uma variante de 4-1BBL.
Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas desta, deve ser compreendido pelos versados na técnica que diversas alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem que se desvie do verdadeiro espírito e âmbito da invenção.
Além disso, muitas modificações podem ser feitas para que adaptem uma situação, material, composição da matéria, processo ou etapa ou etapas do processo particular ao objetivo, essência e âmbito da presente invenção.
Todas as tais modificações são destinadas a estarem dentro do âmbito das reivindicações anexas a este documento

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo, a partir de terminal N até terminal C: i) um epitopo; ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo, a partir de terminal N até terminal C: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que o polipeptídeo multimérico compreende um ou mais domínios imunomoduladores, em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é: A) no terminal C do primeiro polipeptídeo; B) no terminal N do segundo polipeptídeo; C) no terminal C do segundo polipeptídeo; ou D) no terminal C do primeiro polipeptídeo e no terminal N do segundo polipeptídeo, em que pelo menos um dos um ou mais domínios imunomoduladores é um polipeptídeo imunomodulador variante que exibe afinidade reduzida com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade de um polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem correspondente com o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, e em que o epítopo se liga a um receptor de células T (TCR) em uma célula T com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, de tal modo que: i) o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga a uma primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 25% maior que a afinidade com a qual o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga a uma segunda célula T, em que a primeira célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co- imunomodulador cognato e um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, e em que a segunda célula T expressa em sua superfície o polipeptídeo co- imunomodulador cognato, mas não expressa em sua superfície um TCR que liga o epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M; e/ou ii) a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medida por interferometria de bio-camada, está na faixa de 1,5:1 a 106:1.
2. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a) o polipeptídeo multimérico modulador de células T se liga à primeira célula T com uma afinidade que é pelo menos 50%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes maior que a afinidade com a qual se liga à segunda célula T; e/ou b) o polipeptídeo imunomodulador variante se liga ao polipeptídeo co- imunomodulador com uma afinidade de cerca de 10-4 M a cerca de 10-7 M, de cerca de 10-4 M a cerca de 10-6 M, de cerca de 10-4 M a cerca de 10-5 M; e/ou c) em que a razão da afinidade de ligação de um polipeptídeo multimérico modulador de células T de controle, em que o controle compreende um polipeptídeo imunomodulador de tipo selvagem, com um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em relação à afinidade de ligação do polipeptídeo multimérico modulador de células T compreendendo uma variante do polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem ao polipeptídeo co-imunomodulador cognato, quando medido por interferometria de biocamada , é de pelo menos 10:1, pelo menos 50:1, pelo menos 102:1 ou pelo menos 103:1 .
3. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo Ig Fc, opcionalmente em que o polipeptídeo Ig Fc, opcionalmente em que o polipeptídeo IgG1 Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de N297A, L234A, L235A, L234F, L235E e P331S.
4. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende um ligante peptídico entre o epítopo e o primeiro polipeptídeo MHC e/ou em que o primeiro polipeptídeo compreende um ligante peptídico entre o polipeptídeo imunomodulador variante e o segundo polipeptídeo do MHC.
5. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende duas ou mais cópias do polipeptídeo imunomodulador variante.
6. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo imunomodulador do tipo selvagem é selecionado a partir do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM.
7. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o primeiro polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de β2-microglobulina; e em que o segundo polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia pesada classe I do MHC; ou b) o primeiro polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia alfa Classe II do MHC; e em que o segundo polipeptídeo do MHC é um polipeptídeo de cadeia beta classe II do MHC.
8. Polipeptídeo multimérico modulador de célula T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo multimérico compreende um polipeptídeo Fc, e em que o polipeptídeo Ig Fc é um polipeptídeo IgG1 Fc, um polipeptídeo IgG2 Fc, um polipeptídeo IgG3 Fc, um polipeptídeo IgG4 Fc, um polipeptídeo IgA Fc, ou um polipeptídeo IgM Fc.
9. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: a) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão associados não covalentemente; ou b) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados covalentemente um ao outro, opcionalmente em que a ligação covalente é através de uma ligação dissulfeto.
10. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo de câncer.
11. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um do primeiro e do segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo Ig Fc, em que um fármaco é conjugado ao polipeptídeo Ig Fc.
12. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é determinada por interferometria de bio-camada.
13. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, caracterizado pelo fato de que compreende: A) um primeiro heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo peptídico; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC, em que o primeiro heterodímero compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores; e B) um segundo heterodímero compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epítopo peptídico; e ii) um primeiro polipeptídeo do MHC; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC, em que o segundo heterodímero compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores; e em que o primeiro heterodímero e o segundo heterodímero estão covalentemente ligados um ao outro.
14. Polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo imunomodulador do primeiro heterodímero e o polipeptídeo imunomodulador do segundo heterodímero são ambos selecionados do grupo que consiste em IL-2, 4-1BBL, PD- L1, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, CD70 e ICAM.
15. Um ou mais ácidos nucleicos caracterizados pelo fato de que compreendem sequências nucleotídicas que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeo do polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a1) o polipeptídeo multimérico modulador de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14; e b1) um excipiente farmaceuticamente aceitável; ou a2) um ou mais ácidos nucleicos da reivindicação 15; e b2) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
17. Método para modular uma resposta imune em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do polipeptídeo multimérico modulador de células T de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a referida administração induz uma resposta de célula T específica do epítopo e uma resposta de célula T não específica do epítopo, em que a razão da resposta da célula T específica do epítopo para a resposta da célula T não específica do epítopo é de pelo menos 2:1.
18. Método para distribuir um polipeptídeo co-estimulatório seletivamente para a célula T-alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma população mista de células T com um polipeptídeo multimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a população mista de células T compreende a célula T-alvo e células T não alvo, em que a célula T alvo é específica para o epítopo presente no polipeptídeo multimérico, e em que o referido contato distribui o polipeptídeo co-estimulatório presente dentro do polipeptídeo multimérico para a célula T alvo.
19. Método para detectar, em uma população mista de células T obtidas de um indivíduo, a presença de uma célula T alvo que se liga a um epítopo de interesse, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) o contato in vitro da população mista de células T com o polipeptídeo multimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o polipeptídeo multimérico compreende o epítopo de interesse; e b) detectar a ativação e/ou proliferação de células T em resposta ao referido contato, em que células T ativadas e/ou proliferadas indicam a presença da célula T alvo.
20. Método para obter um polipeptídeo multimérico modulador de células T caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato comparado com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador parental de tipo selvagem correspondente para o polipeptídeo co- imunomodulador, o método compreendendo selecionar, a partir de uma biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T, compreendendo uma pluralidade de membros, um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato, em que a pluralidade de membros compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epitopo; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo, ou no primeiro e no segundo polipeptídeos.
21. Método para obter um polipeptídeo multimérico modulador de células T caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polipeptídeos imunomoduladores variantes que exibem afinidade reduzida para um polipeptídeo co-imunomodulador cognato em comparação com a afinidade do polipeptídeo imunomodulador parental do tipo selvagem correspondente para o polipeptídeo co- imunomodulador, o método compreendendo: A) fornecer uma biblioteca de polipeptídeos multiméricos moduladores de células T compreendendo uma pluralidade de membros, em que a pluralidade de membros compreende: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um epitopo; e ii) um primeiro polipeptídeo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC); e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo polipeptídeo do MHC; e ii) opcionalmente, um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig) Fc ou um suporte não Ig, em que os membros da biblioteca compreendem uma pluralidade de polipeptídeos imunomoduladores variantes presentes no primeiro polipeptídeo, no segundo polipeptídeo, ou no primeiro e no segundo polipeptídeos. B) selecionar da biblioteca um membro que exibe afinidade reduzida para o polipeptídeo co-imunomodulador cognato.
epítopo
Petição 870200030436, de 06/03/2020, pág. 186/212 MOD* = variante de afinidade de MOD reduzido ligação fraca com co-MOD 1ª epítopo Célula T se liga ao TCR 1/16 ativação
2ª ligação fraca com co-MOD Célula T epítopo sem ligação com TCR
Figura 2A
Petição 870200030436, de 06/03/2020, pág. 187/212 Homo sapiens IgG2 Fc (aminoácidos 99-235) (SEQ ID NO: 205) 2/16
Homo sapiens IgG3 Fc (aminoácidos 19-246) (SEQ ID NO: 206)
Figura 2B
Homo sapiens IgD Fc (aminoácidos 162-383) (SEQ ID NO: 207)
Petição 870200030436, de 06/03/2020, pág. 188/212 3/16
Homo sapiens IgM Fc (SEQ ID NO: 208)
Figura 2C
Homo sapiens IgA Fc (aminoácidos 120-353) (SEQ ID NO: 209)
Petição 870200030436, de 06/03/2020, pág. 189/212 Homo sapiens IgE Fc (aminoácidos 6-222) (SEQ ID NO: 210) 4/16
Homo sapiens IgG4 Fc (aminoácidos 100-327) (SEQ ID NO: 211)
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