SK283703B6 - Rekombinantný adenovírusový vektor a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Farmaceutická kompozícia obsahuje rekombinantný adenovírusový expresný vektor charakterizovaný parciálnou alebo úplnou deléciou fragmentu DNA pre proteín IX a génom kódujúcim cudzí proteín alebo jeho funkčný fragment alebo mutant. Napríklad adenovírusový vektor môže obsahovať cudzí gén na expresiu proteínu účinného v regulácii bunkového cyklu, ako je p53, Rb alebo mitozín, alebo v indukcii bunkovej smrti, ako je podmienený samovražedný gén tymidín kinázy. Opísaná farmaceutická kompozícia je využiteľná v oblasti génovej a protirakovinovej terapie. ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka rekombinantného adenovirusového vektora a spôsobov jeho použitia.

Doterajší stav techniky

V tomto opise sú rôzne publikácie uvádzané citáciami v zátvorkách a v zozname literatúry, ktorý je uvedený pred patentovými nárokmi. Tieto publikácie sú tu zahrnuté do opisu, aby bol plne opísaný stav techniky v odbore, ktorého sa predložený vynález týka.

Produkcia rekombinantných adenovírusov vhodných na génovú terapiu vyžaduje použitie bunkovej línie schopnej nahradiť v transgénových produktoch vírusových E1 regiónov, ktoré sú v týchto rekombinantných vírusoch deletované. V súčasnosti je použiteľnou dostupnou bunkovou líniou iba 293 bunková línia pôvodne opísaná Grahamom a spol. 1977. 293 bunky obsahujú približne 12 % zľava (4,3 kb) adenovírusný genóm typu 5 (Aiello (1979) a Spector (1983)).

Adenovírusové vektory v súčasnosti testované pre aplikácie v génovej terapii sú typicky zbavené Ad2 alebo Ad5 DNA zasahujúcej približne od 400 párov báz od 5' konca vírusového genómu do približne 3,3 kb od 5' konca, pre celkovú E1 deléciu 2,9 kb. Existuje tu tak obmedzená oblasť homológie približne 1 kb medzi DNA sekvenciou rekombinantného vírusu a Ad5 DNA v bunkovej línii. Táto homológia definuje oblasť potenciálnej rekombinácie medzi vírusovými a bunkovými adenovírusovými sekvenciami. Taká rekombinácia vedie k fenotypovo štandardnému typu vírusu, nesúcemu Ad5 E1 región z 293 buniek. Táto rekombinácia je pričítaná prevažne častej detekcii štandardného typu adenovírusu v prípravkoch rekombinantného vírusu a bolo priamo demonštrované, že vyvoláva štandardný typ kontaminácie Ad2 na báze rekombinantného vírusu Ad2/CFTR-1 (Rich a spol. (1973)).

Vďaka vysokému stupňu homológie s typom C adenovírusovej podskupiny sa táto rekombinácia pravdepodobne objavuje, ak je vektor na báze akejkoľvek skupiny C adenovírusu (typy 1,2,5,6).

V produkcii rekombinantných adenovírusov v malom meradle, generovanie kontaminácie vírusom štandardného typu môže byť dosiahnuté skríningovým procesom, ktorý odkladá tie preparáty vírusu, ktoré boli zistené ako kontaminované. So vzrastaním meradla vírusovej produkcie pre splnenie požiadaviek génovej terapie, bude pravdepodobnosť akéhokoľvek podielu, kontaminovaného štandardným typom vírusu, tiež stúpať a rovnako tak obtiažnosť poskytnutia nekontaminovaných prípravkov.

V tomto roku bude diagnostikovaných viac než jeden milión nových prípadov rakoviny, a polovica z tohto počtu je spojená s úmrtím (Američan Cancer Society, 1993). p53 mutácie sú najčastejšou genetickou zmenou spojenou s ľudskými rakovinami, objavujúce sa v 50 - 60 % ľudských rakovín (Hollstein a spol. (1991) Bartek a spol. (1991) Levine (1993). Cieľom génovej terapie v liečbe p53 deficientných tumorov je, napríklad, «inštalácia normálnej, funkčnej kópie štandardného p53 génu, takže sa obnoví riadenie bunkovej proliferácie. p53 má podstatnú úlohu v progresii bunkového cyklu, znemožnení rastu tak, že sa môže objaviť oprava alebo apoptosis v odpovedi na DNA poškodenie. Štandardný typ p53 bol v súčasnosti identifikovaný ako nevyhnutná zložka pre apoptózu indukovanú ožiarením alebo ošetrením niektorými chemoterapeutickými činidlami (Lowe a spol. (1993) A a B). Vzhľadom na vysoké rozšírenie p53 mutácií v ľudských tumoroch je možné, že tumory, ktoré boli odolné proti chemoterapeutickej a ožarovacej liečbe, sa tak môžu chovať preto, že nemajú štandardný typ p53. Pri dodaní funkčného p53 do týchto tumorov sa tieto stávajú náchylnými na apoptózu normálne spojenú s DNA poškodením vyvolaným ožiarením a chemoterapiou.

Jedným z kritických bodov v úspešnej humánnej tumorovej supresorovej génovej terapii je schopnosť ovplyvňovať významnú frakciu rakovinových buniek. Použitie retrovírusových vektorov bolo rozsiahle vyskúšané na mnohých tumorových modeloch. Napríklad pri liečbe pečeňových malignancií boli použité retrovírusové vektory s malým úspechom, pretože tieto vektory nie sú schopné dosiahnuť vysokú hladinu génového transferu vyžadovaného pre in vivo génovú terapiu (Huber B. E. a spol., 1991, Caruso M. a spol., 1993).

Na dosiahnutie trvalejšieho zdroja vírusovej produkcie sa výskumníci snažili prekonať problém spojený s nízkou hladinou génového transferu priamou injekciou retrovírusových obalových („packaging“) bunkových línií do pevných tumorov (Caruso M. a spol., 1993, Ezzidine Z. D. a spol., Culver K. W. a spol., 1992). Tieto metódy sú však nevhodné na použitie pri ľudských pacientoch, pretože táto metóda je obtiažna a vyvoláva pri pacientoch zápalovú odpoveď na obalovú bunkovú líniu. Ďalšou nevýhodou retrovírusových vektorov je, že vyžadujú rozdelenie buniek do účinného integrátu a expresiu rekombinantného génu (Huber B. E., 1991). Stála integrácia do základného hostiteľského génu môže viesť k vývoju alebo dedeniu patogénnych chorobných stavov.

Rekombinantné adenovírusy majú významné výhody proti metódam retrovírusového a iného génového doručovania (prehľad pozri Siegfried (1993). Adenovírusy neboli nikdy dokázané ako vyvolávajúce tumory pri ľuďoch a boli bezpečne používané ako živé vakcíny (Straus (1984)). Replikácia deficientných rekombinantných adenovírusov môže byť produkovaná nahradením E1 oblasti nevyhnutnej na replikáciu s cieľovým génom. Adenovírus neintegruje do ľudského genómu ako normálny následok infekcie, čím sa väčšinou redukuje riziko inzerčnej mutagenézy možnej s retrovírusovými alebo adeno- spojenými vírusovými (AAV) vektormi. Strata stabilnej integrácie tiež vedie k ďalšiemu bezpečnému rysu tým, že účinok transferovaného génu bude prechodný, pri tom, ako sa extrachromozomálny bude postupne strácať s kontinuálnym delením normálnych buniek. Stabilne môže byť vysoký titer rekombinantného adenovírusu produkovaný v hladinách nedosiahnuteľných s retrovírusom alebo AAV, čo umožňuje, aby bol produkovaný materiál použitý na ošetrenie veľkého množstva populácie pacientov. Navyše sú adenovírusové vektory schopné vysokej účinnosti in vivo génového transferu do širokého rozsahu typov tkanív a tumorových buniek. Napríklad bolo preukázané, že adenovírusovo sprostredkované génové doručovanie má silný potenciál pre génovú terapiu pre choroby ako je cystická fibróza (Rosenfeld a spol. (1992), Rich a spol. (1993)). a a_r antitrypsínovú nedostatočnosť (Lemarchand a spol. (1992)). Aj keď v súčasnosti sú využívané i iné alternatívy génového doručovania, ako sú komplexy kationický lipozóm/DNA, nikto doteraz neobjavil, ako účinne tak adenovírusovo sprostredkované génové doručovanie.

Ako pri liečbe p53 deficientných tumorov je cieľom génovej terapie pri iných tumoroch obnovenie riadenia bunkovej proliferácie. V prípade p53 zavedenie funkčného génu obnovuje kontrolu bunkového cyklu umožnením apoptickej bunkovej smrti indukovanej terapeutickými činidlami. Podobne je rovnako tak génová terapia aplikova teľná na iné tumor potlačujúce gény, ktoré môžu byť použité buď samotné, alebo v kombinácii s terapeutickými činidlami na kontrolu progresie bunkového cyklu tumorových buniek a/alebo indukcie bunkovej smrti.

Navyše, gény, ktoré nekódujú regulátorové proteiny bunkového cyklu, ale priamo indukujú bunkovú smrť ako sú samovražedné gény alebo gény, ktoré sú priamo toxické pre bunky, môžu byť použité v génových terapeutických protokoloch na priame odstránenie progresie bunkového cyklu tumorových buniek.

Bez ohľadu na to, ktorý gén sa použije na reinštaláciu riadenia progresie bunkového cyklu, je racionálna a praktická použiteľnosť tohto priblíženia identická. Totiž dosiahnutie vysokých účinností génového transferu k expresii terapeutických množstiev rekombinantného produktu. Voľba toho, ktorý vektor sa použije na umožnenie vysokej účinnosti génového transferu s minimálnym rizikom pre pacienta je preto dôležitá pre úroveň úspechu ošetrenia génovou terapiou.

Existuje tu teda potreba vektorov a metód, ktoré poskytujú vysokú hladinu účinností génového transferu a proteínovej expresie, ktoré poskytujú bezpečné a účinné ošetrenia génovou terapiou. Predložený vynález napĺňa túto potrebu a poskytuje s tým spojené výhody.

Podstata vynálezu

Predložený vynález poskytuje rekombinantný adenovírusový expresný vektor, charakterizovaný parciálnou alebo úplnou deléciou ad eno víru sovej proteín IX DNA a majúci gén, kódujúci cudzí proteín alebo funkčný fragment alebo jeho mutant. Transformované hostiteľské bunky a spôsob produkcie rekombinantných proteínov a génová terapia sú tiež zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.

Napríklad adenovírusový vektor podľa vynálezu môže obsahovať cudzí gén na expresiu cyklu, ako je p53, Rb alebo mitozín, alebo v indukcii bunkovej smrti ako je podmieňovací samovražedný gén tymidín kinázy. (Posledný uvedený musí byť, aby bol účinný, použitý v spojení s metabolitom tymidín kinázy).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje rekombinantný adenovírusový vektor podľa predloženého vynálezu. Tento konštrukt bol zostavený ako je ukázané na obr. 1. Výsledný vírus nesie 5 delécií adenovírusových sekvencii rozkladajúce sa od nukleotidu 356 do 4020 a eliminuje Ela a Elb gény, ako i celú proteín IX kódujúcu sekvenciu s ponechaním polyadcnylačného miesta strihaného pri Elb a pIX génoch intaktného pre použitie v terminačnej transkripcii akéhokoľvek požadovaného génu.

Obr. 2 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu p 110^Μ.

Obr. 3 predstavuje DNA sekvenciu, kódujúcu retinoblastomový tumor potlačujúci proteín.

Obr. 4 predstavuje schematicky rekombinantný p53/adenovírus konštrukty v rozsahu tohto vynálezu. p53 rekombinanty sú založené na Ad 5 a majú hlavu EI regiónu nukleotidov 360-3325 nahradenú 1,4 kb plnej dĺžky p53 cDNA riadenú Ad 2 MLP (A/M/53) alebo ľudskými CMV (A/C/53) promótormi nasledovanou Ad 2 tripartitnou leader cDNA. Kontrolný vírus A/M má rovnaké Ad5 delécie ako A/M/53 vírus, ale nemá 1,4 kf p53 cDNA inzert. Zvyšujúca Elb sekvencia (705 nukleotidov) bola deletovaná pre vytvorenie proteín IX deletovaných konštruktov A/M/N/53 a A/C/N/53. Tieto konštrukty tiež majú 1,9 kb Xba 1 deléciu v adenovírus typ 5 regiónu E3.

Obr. 5A a 5B predstavujú p53 proteínovú expresiu v nádorových bunkách infikovaných s A/M/53 a A/C/53. Obr. 5A) Saos-2 (osteosarkóm) bunky boli infikované uvedenými násobkami infekcie (MOI) buď s A/M/53, alebo A/C/53 čistený vírus a odoberané o 24 hodín neskôr. p53 protilátka pAb 1801 bola použitá na vyfarbenie imunoblotov vzoriek s rovnakými celkovými koncentráciami proteínov. Extrakty s rovnakou proteínovou koncentráciou nadmerne exprimujúce mutantný p53 proteín, boli použité ako marker pre veľkosť p53. „O“ pod A/C/53 záhlavím indikuje falošnú infekciu, obsahujúcu neošetrený Saos-2 lyzát. Obr. 5B) Hep 3B (hepatobunkový karcinóm) bunky boli indikované s A/M/53 alebo A/C/53 vírusom pri uvedenej MOI a analyzované ako v časti A). Šípka označuje polohu p53 proteínu.

Obr. 6A až 6C ukazuje p53 závislú Saos-2 morfologickú zmenu. Subkonfluentné (1 x 10 buniek/10 cm platňa) Saos-2 bunky buď neboli infikované (A), boli infikované pri MOI = 50 s (B) kontrolným A/M vírusom alebo (C) A/C/53 vírusom. Bunky boli fotografované 72 hodín po infekcii.

Obr. 7 predstavuje p53 závislú inhibíciu DNA syntézy v ľudskej nádorovej bunkovej línii pri A/M/N/53 a A/C/N/53. Deväť rôznych bunkových línií bolo infikovaných buď kontrolným adenovírusom (A/M(-x-x-), alebo p53 exprimujúcim Α/Μ/Ν/53/-Δ-Δ-), alebo A/C/N/53 (-O-O-) vírusom pri zvyšujúcich sa MOI ako je uvedené. Typ nádoru a p53 status je poznamenaný pri každej bunkovej línii (wt = štandardný typ, nula = neexprimovaný žiadny proteín, mut = exprimovaný mutantný proteín), Syntéza DNA bola meraná 72 h po infekcii ako je opísané ďalej v pokuse č. II. Výsledky sú z trojnásobných meraní v každej dávke (priemer +/- ŠD, a sú graficky vyjadrené ako % média kontroly versus MOI. H69 bunky boli testované iba s AIM a A/M/N/53 vírusom.

Obr. 8 ukazuje tumorigenicitu p53 infikovaných Saos-2 buniek pri holej myši. Saos-2 bunky boli infektované buď s kontrolným A/M vírusom, alebo p53 rekombinantným A/M/N/53 pri MOI = 30. Ošetrené bunky boli injektované subkutánne do bokov holých myší a rozmery nádoru boli merané (ako je opísané v pokuse č. II) dvakrát za týždeň po 8 týždňov. Výsledky sú graficky vyjadrené ako veľkosti nádorov v závislosti od dni po implantácii nádorových buniek tak pre kontrolné A/M (-x-x-), ako A/M/N/53 (-Δ-Δ-) ošetrené bunky. Čiary pre chybu predstavujú priemernú veľkosť nádoru = /-SEM pre každú skupinu 4 zvierat v každom časovom bode.

Obr. 9 je expresia rAd/p53 RNA v stanovených nádoroch. H69 (SCLC) bunky boli injektované subkutánne do holej myši a tumory boli ponechané vývinu po 32 dní do dosiahnutia veľkosti približne 25 - 50 mm³. Myši boli náhodne rozdelené a injektované peritumorálne s 2 x 10 pfu buď kontrolného A/C/B-gal, alebo A/C/53 vírusu. Nádory boli vyrezané 2. a 7. deň po injekcii a poly ARNA bola pripravená z každej nádorovej vzorky. RT-PCR bola uskutočnená s použitím rovnakých RNA koncentrácií a primerov špecifických pre rekombinantný p53 mediátor. PCR amplikácia bola 30 cyklov pri 94 °C 1 min., 55 °C 1,5 min., 72 °C 2 min. a 10 min. 72 °C konečná predlžovacia perióda v Omnigen termálnom cyklovači (Hybaid). Boli použité PCR priméry 5' tripartitný leader cDNA (5'-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3’)a 3' p53 primér (5-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Dráhy 1, 2, 4 a 5 sú p53 ošetrené vzorky vyrezané 2. deň alebo 7. deň ako je uvedené. Dráhy 3 a 6 sú z B-gal ošetrených nádorov. Dráhy 7,8 a 9

SK 283703 Β6 sú repliky dráh 4, 5 a 6, amplifikované aktin priméry na overenie rovnakej šarže. Dráha 10 je pozitívna kontrola používajúca tripartitný/p53 obsahujúci plazmid.

Obr. 10A a 10B znázorňujú in vivo nádorové potlačenie a zvýšenie v časoch prežitia s A/M/N/53. H69 (SCLC) nádorové bunky boli injektované subkutánne do holej myši a ponechané 2 týždne vývoju. Peritumorálna injekcia buď samotného pufra (—), kontroly Λ/M adenovírusu (-x-x-), alebo A/M/N/ (-Δ-Δ), oboch vírusov (2x10 pfu/injekcia) boli podávané dvakrát týždenne po celkom 8 dávkach. Rozmery nádorov boli merané dvakrát týždenne a objemy nádorov boli hodnotené ako je opísané v experimente č. IIA). Veľkosť nádoru sa graficky vynesie pre každý vírus v závislosti od dní po inokulácii H69 buniek. Úsečky chýb označujú priemernú veľkosť nádoru (+/-SEM pre každú skupinu 5 zvierat). Šípky označujú dni po vírusovej injekcii. B) Myši boli sledované na prežitie a graficky je vynesený podiel myší prežívajúcich v skupine proti času po inokulácii pufrom samotným (-—), kontrola A/M (.........) alebo A/M/N/53 (----) vírusom ošetrenými H69 bunkami.

Obr. HA až 11C predstavujú mapy rekombinantných plazmidových konštrukcií. Plazmidy boli konštruované ako je podrobne opísané ďalej. Tučné čiary v konštruktoch označujú záujmové gény, zatiaľčo tučné písmená označujú reštrikčné miesta použité na generovanie fragmentov, ktoré sa budú vzájomne ligovať za vzniku následného plazmidu, ako je označené šípkami. Na obr. HA bol plazmid pACNTK konštruovaný subklonovaním HSV-TK génu z pMLBKTK (ATCC č. 39369) do polylinkeru klonovacieho vektora s nasledujúcou izoláciou TK génu s požadovanými koncami pre klonovanie do pACN vektora. pACN vektor obsahuje adenovírusové sekvencie nutné pre in vivo rekombináciu k tomu, aby sa vytvoril rekombinantný adenovírus (pozri obr. 12). Na obr. 1 IB je uvedená konštrukcia plazmidu pAANTK začínajúca s PCR amplifikovanými fragmentmi, kódujúcimi α-fetoproteín cnhancerovú (AFP-E) a promótorovú (AFP-P) oblasť subklonovanej niekoľkými stupňami do konečného plazmidu, kde AFP enhancer a promótor sú proti smeru HSV-TK génu nasledované adenovírus typ 2 sekvenciami nevyhnutnými pre in vivo rekombináciu na dosiahnutie vzniku rekombinantného adenovírusu. Na obr. 11C je uvedená konštrukcia plazmidu pAANCAT začínajúca s izoláciou chloramfenikolacetyltransferázového (CAT) génu z komerčne dostupného plazmidu a jeho subklonovaním do pAAN plazmidu /pozri skôr/, za vzniku konečného plazmidu pAANCAT, kde AFP enhancer/promótor riadi transkripciu CAT génu v adenovírus sekvenčnom základe.

Obr. 12 je schematická mapa rekombinantných adenovírusov ACNTK, AANTK a AANCAT. Na konštrukciu rekombinantných adenovírusov z plazmidov opísaných na obr. 11, sa linearizujú 4 diely (20 pg) plazmidu pACNTK, pAANTK alebo pAANCAT s Eco R1 a cotransferujú s 1 dielom (5 pg) veľkého fragmentu Cla 1 štiepeného rekombinančného adenovírusu (rACB-gal). obsahujúceho dcléciu E3 regiónu (Wils a kol., 1994). Vo výsledných vírusoch sú Ad5 nukleotidy 360-4021 nahradené buď CMV promótorom a tripartitný leader cDNA (TPL) alebo a-fetoproteín enhanccrom a promótorom (AFP) riadiacim expresiu HSV1 TK alebo CAT génu ako je uvedené. Výsledné rekombinančné adenovírusy sú označené ACNTK, AANTK a AANCAT.

Obr. 13 predstavuje promótorovú špecifitu CAT expresie v rekombinantných adenovírusových vektoroch. Dva (2) X 10⁶ označených bunkových línií sa infikuje pri MOls = 30 alebo 100 rekombinantného adenovírusu AANCAT ako je označené alebo naľavo neinfikované (UN).

Hep G2 a Hep 3B bunky exprimujú α-fetoproteín zatiaľčo iné bunkové línie neexprimujú. Po troch dňoch sa bunky upokoja, extraktové objemy sa upravia na rovnaké proteínové koncentrácie a meria sa CAT aktivita, ako je opísané ďalej v sekcii Metódy. Rovnaký počet neinfikovaných buniek slúži ako jednotlivé kontroly pre základnú CÁT aktivitu, zatiaľčo ¹⁴C označený chloramfenikol (^l4C-iba) a extrakt zo stabilnej bunkové línie (B21), exprimujúci CAT aktivitu, slúži ako negatívne a pozitívne kontroly. Percento konverzie acetyl CoA je uvedené, čo demonštruje, že CAT expresia je obmedzená na tie bunky, ktoré exprimujú a-fetoproteín.

Obr. 14 predstavuje účinky TK/GCV ošetrení na hepatocelulámu karcinómovú bunkovú líniu a účinky promótorovej špecifity. Hep-G2 (AFP-pozitívne) a HLF (AFP negatívne) bunkové línie boli infikované cez noc pomocou ACNTK /-Δ-/, AANTK /-Ä-/ alebo kontrolným ACN /-O-/ vírusom v infekčnej! multiplicite 30 a následne ošetrené jedinou dávkou ganciclovírusu v uvedených koncentráciách. Bunková proliferácia bola hodnotená prídavkom ³H-tymidínu k bunkám približne 18 hod. pred zberom. Inkorporácia ³H-thymidinu do bunkovej nukleovej kyseliny bola meraná 72 hodín po infekcii (Top Count, Packard) a vyjadrená ako percentá (priemer +/- S. D.) neošetrenej kontroly. Výsledky ukazujú neselektívnu davkovo závislú inhibiciu proliferácie s CMV riadeným konštruktom, zatiaľčo AFP riadený TK selektívne inhibuje Hep-G2.

Obr. 15 predstavuje cytotoxicitu ACNTK plus ganciclovírusu v HCC. HLF bunky boli infikované pri MOI 30 buď ACNTK /-·-/, alebo kontrolný vírus ACN /-□-/ a ošetrené ganciclovírusom v uvedených dávkach. Sedemdesiat dva (72) hodín po ošetrení ganciclovírusom sa meria množstvo laktát-dehydrogenázy (LDH) uvoľnenej do bunkového supematantu kolorimetricky a vynesie sa do grafu (priemer +/- SEM) proti koncentrácii ganciclovírusu pre dva vírusy ošetrenej skupiny.

Obr. 16A a 16B predstavujú vplyv ACNTK plus ganciclovírusu na stanovené hepatoceluláme karcinómové (HCC) tumory pri holých myšiach. Jeden (l)x 10' Hep 3B buniek bolo injektovaných subkutáme do boku samice holej myši a ponechané rásť 27 dní. Myši potom dostali intratumorálne a peritumorálne injekcie buď ACNTK /-·-/, alebo kontrolného ACN (-Γ1-/ vírusu (1 x 10⁹ m. j. v 100 μΐ objemu) každý ďalší deň v celkom troch dávkach (označené šípkami). Injekcie ganciclovírusu (100 mg/kg) začali 24 hodín po počiatočnej vírusovej dávke a pokračovali celkom 10 dní. Na obr. 6A sú graficky vynesené veľkosti tumorov proti každému vírusu proti dňom po infekcii (priemer +/SEM). Na obr. 6B je vynesená telesná hmotnosť pre každú vírusom ošetrenú skupinu zvierat ako priemer +/-SEM proti dňom po infekcii.

Podrobný opis vynálezu

Na zníženie početnosti kontaminácie štandardným typom adenovírusu, je žiaduce zlepšiť buď vírusovú, alebo bunkovú líniu na zníženie pravdepodobnosti rekombinácie. Napríklad adenovírus zo skupiny s nízkou homológiou k skupine C vírusov by mohol byť použitý na vytvorenie rekombinantných vírusov s malým sklonom k rekombinácii s Ad5 sekvenciami v 293 bunkách. Ale alternatívne jednoduchším prostriedkom na redukciu je zvýšenie veľkosti delécie v rekombinantnom víruse a tým redukcie rozsahu podielu sekvencie medzi ňou a Ad5 génmi v 293 bunkách.

Delécie, ktoré zasahujú po 3,5 kb od 5' konca adenovírusového genómu napodobňujú gén pre adenovírusový proteín a nie sú považované za žiaduce v adenovírusových vektoroch (pozri ďalej).

Gén proteínu IX adenovírusu kóduje minoritnú zložku vonkajšieho adenovírusového kapsidu, ktorý' stabilizuje skupinu deväť hexónov, ktoré tvoria majoritu vírusového kapsidu (Stewart (1993)). Podľa štúdie adenovírus delečných mutantov, proteín IX bol na začiatku považovaný za nepodstatnú zložku adenovírusu, hoci jeho neprítomnosť bola spojená s väčšou tepelnou labilitou, než bola pozorovaná so štandardným typom vírusu (Colby a Shenk (1991)). Nedávno bolo objavené, že proteín IX je podstatný pre uzavrenie plnej dĺžky vírusovej DNA do kapsidov a že v neprítomnosti proteínu IX by iba genómy aspoň 1 kb menšie než genómy štandardného typu mohli byť propagované ako rekombinantné vírusy (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)). Vzhľadom na to uzavieracie obmedzenie proteín IX delécie zámerne neboli uvažované pri vytváraní adenovirusových vektorov.

V tejto prihláške sa odkazuje na štandardné učebnice molekulárnej biológie, ktoré obsahujú definície, metódy a prostriedky na uskutočnenie základných techník, zahrnutých v predloženom vynáleze. Pozri napr. Sambrook a spol. (1989) a rôzne tam citované odkazy. Tieto odkazy a citované publikácie sú úmyselne zahrnuté v tomto opise odkazom.

Na rozdiel od známeho stavu techniky nárokuje predložený vynález použitie rekombinantných adenovírusov, nesúcich delécie proteín IX génu ako prostriedok na zníženie rizika kontaminácie štandardným typom adenovírusu vo vírusových prípravkoch na použitie v diagnostických a terapeutických aplikáciách ako je génová terapia. Ako je tu použité, je výraz „rekombinant“ mienený ako potomstvo vytvorené ako výsledok génového inžinierstva. Tieto delécie môžu odstrániť ďalších 500 až 700 párov báz DNA sekvencic, ktorá je prítomná v konvenčných E1 deletovaných vírusoch (menší, menej žiaduci, delécie častí pIX génu sú možné a sú zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu) a je dostupná pre rekombináciu s Ad5 sekvenciami integrovanými v 293 bunkách. Rekombinantné adenovírusy založené na akejkoľvek skupine C vírusu, serotyp 1, 2, 5 a 6 sú zahrnuté v tomto vynáleze. Tiež je v tomto vynáleze zahrnutý hybrid Ad2/Ad5 na báze rekombinantného vírusu, exprimujúceho ľudskú p53 cDNA z adenovírusu typ 2 hlavného neskorého promótora. Tento konštrukt je zostavený ako je uvedené na obr. 1. Výsledný vírus nesie 5' deléciu adenovírusovej sekvencie rozkladajúcej sa od asi nukleotidu 357 do 4020 a eliminujúcej Ela a Elb gény ako i celý proteín IX kódujúci sekvenciu, činiaci polyadenylačné miesto podieľajúce sa na Elb a proteín IX génoch intaktné na použitie v terminačnej transkripcii akéhokoľvek požadovaného génu. Uskutočnenie je znázornené na obrázku 4. Alternatívne môže byť delécia rozšírená na ďalších 30 až 40 párov báz bez ovplyvnenia susedného génu pre proteín IVa2, i keď v tomto prípade je exogénny polyadenylačný signál poskytnutý na ukončenie transkriptu génu inzertovaného do rekombinantného vírusu. Počiatočný vírus konštruovaný s týmito deléciami je ľahko propagovaný v 293 bunkách s riadnou zrejmou kontamináciou štandardného typu a riadi robustnú p53 expresiu z transkripčnej jednotky inzertovanej na miesto delécie.

Inzertná kapacita rekombinantných vírusov, nesúcich deléciu génu proteínu IX deléciu opísanú skôr, je približne 2,6 kb. Toto je dostačujúce pre mnoho génov, obsahujúcich p53 cDNA. Inzertná kapacita môže byť zvýšená zavedením iných delécií do adenovírusového reťazca, napríklad deléciou v skorých regiónoch 3 alebo 4 (pozri Graham a Prevec (1991)). Napríklad použitie adenovírusového reťazca, obsahujúceho 1,9 kg deléciu nepodstatnej sekvencie v skorom regióne 3. S touto ďalšou deléciou j c inzertná kapacita vektora zvýšená o približne 4,5 kb, čo je dosť veľké i pre mnoho väčších cDNA vrátane tých z retinoblastomového tumor supresorového génu.

Rekombinantný adenovírus expresný vektor charakterizovaný parciálnou alebo celkovou deléciou adenovírusovej proteínovej IX DNA a majúci gén kódujúci cudzí proteín alebo jeho funkčný fragment, alebo mutant, je poskytnutý predloženým vynálezom. Tieto vektory sú použiteľné na bezpečnú rekombinantnú produkciu diagnostických a terapeutických polypeptidov a proteínov a, čo je dôležitejšie, na zavedenie génov v génovej terapii. Tak, napríklad, môže adenovírusový vektor podľa tohto vynálezu obsahovať cudzí gén pre expresiu proteínu účinného v regulácii bunkového cyklu, ako je p53, Rb alebo mitozín alebo v indukcii bunkovej smrti ako je podmienený samovražedný gén tymidín kinázy. (Posledný uvedený musí byť použitý v spojení s tymidín kinázovým metabolitom preto, aby bol účinný). Akákoľvek expresná kazeta môže byť použitá vo vektoroch podľa vynálezu. „Expresná kazeta“ znamená DNA molekulu, majúcu transkripčný promótor/enhancer ako je CMV promótor enhancer atď., cudzí gén, a v niektorých ďalej definovaných uskutočneniach, polyadenylačný signál. Výraz „cudzí gén“ tu používaný, označuje DNA molekulu neprítomnú v exaktnej orientácii a polohe ako partnera DNA molekuly nájdenej v štandardnom type adenovírusu. Cudzí gén je DNA molekula s až 4,5 kilobázami. „Expresný vektor“ znamená vektor, ktorý vedie k expresii inzertovaných DNA sekvencií, ak je propagovaný vo vhodnej hostiteľskej bunke, t. j. proteín alebo polypeptid kódovaný DNA je syntetizovaný hostiteľským systémom. Rekombinantný adenovírus expresný vektor môže obsahovať časť génu, kódujúceho adenovírus proteín IX, s podmienkou, že biologicky aktívny proteín IX alebo jeho fragment nie je produkovaný. Príkladom takéhoto vektora je expresný vektor, majúci reštrikčnú enzýmovú mapu na obr. 1 alebo 4.

V adenovírusovom vektore podľa tohto vynálezu môžu byť tiež použité indukovateľné promótory. Tieto promótory budú iniciovať transkripciu iba za prítomnosti ďalšej molekuly. Príklady indukovateľných promótorov zahŕňajú tie, ktoré sú pripraviteľne z B-interferón génu, génu pre proteíny tepelného šoku, metallotioninový gén alebo tie gény, ktoré sú získavateľné z génov, odpovedajúcich na steroidné hormóny. Tkanivovo špecifická expresia bola dobre charakterizovaná v oblasti génovej expresie a tkanivovo špecifické a indukovateľné promótory, ako sú tieto, sú v odbore dobre známe. Tieto gény sú použite na reguláciu expresie cudzieho génu potom, čo bol zavedený do cieľovej bunky.

Tento vynález tiež poskytuje rekombinantný adenovírus expresný vektor, ako je opísaný skôr, majúci menej rozsiahle delécie proteín IX génovej sekvencie, rozkladajúcej sa od 3500 bp od 5' vírusového konca do približne 4000 bp, v jednom uskutočnení. V zvláštnom uskutočnení môže mať rekombinantný adenovírus expresný vektor ďalšiu deléciu nepodstatnej DNA sekvencie v adenovírusovom časovom regióne 3 a/alebo 4 a/alebo deléciu DNA sekvencií označených adenovírus Ela a Elb. V tomto uskutočnení je cudzí gén DNA molekula veľkosti až 4,5 kilobáz.

Ďalšie uskutočnenie má deléciu až štyridsať nukleotidov umiestených 3' k Ela a Elb delécii a pIX a cudziu DNA molekulu kódujúci polyadenylačný signál inzertovaný do rekombinantného vektora v polohe vztiahnutej k cudziemu génu k regulácii expresie cudzieho génu.

Na účely tohto vynálezu môže byť rekombinantný adenovírus expresný vektor odvodený od štandardnej skupiny adenovírusu, serotyp 1,2,5 alebo 6.

V jednom uskutočnení má rekombinantný adenovírus expresný vektor cudzí gén, kódujúci funkčný nádorovo supresorový protein alebo jeho biologicky aktívny fragment. Ako je tu použité, výraz „funkčný“ pokiaľ je vztiahnutý k nádorovo supresorovému génu, označuje nádorovo supresorové gény, ktoré účinne inhibujú bunky od toho, aby sa chovali ako nádorové bunky. Funkčné gény môžu napríklad zahŕňať štandardný typ normálneho génu a modifikácie normálnych génov, ktoré si uchovávajú ich schopnosť kódovať účinné nádorové supresorové proteíny a iné protinádorové gény ako je podmienený samovražedný proteín alebo toxín.

Podobne „nefunkčné“ ako je tu použité, je synonymom s „neaktivované“. Nefunkčné alebo defektné gény môžu pôsobiť mnoho dejov, zahŕňajúcich napríklad bodové mutácie, delécie, metylácie a iné známe odborníkom v odbore.

„Aktívny fragment“ génu, ako je tu používané, zahŕňa menšie časti génu, ktoré si udržujú schopnosť kódovať proteíny, majúce nádor potlačujúcu aktivitu. p56^RR opísaný podrobnejšie ďalej je ale jedným z príkladov aktívneho fragmentu funkčného nádorového supresor génu. Modifikácie nádorových supresor génov sú tiež zahrnuté pod označenie aktívny fragment, nech ide o adície, dclécie alebo substitúcie, pokiaľ je zachovaná funkčná aktivita nemodifikovaného génu.

Ďalší príklad nádorového - supresor génu je retinoblastóm (RB). Kompletná RB cDNA nukleotidovej sekvencie a predpovedanej aminokyselinovej sekvencie výsledného RB proteínu (označenie p 110^RB ) sú uvedené v práci Lee-a a spol. (1987) a na obr. 3. Vhodná na expresiu retinoblastóm nádorového supresor proteínu je tiež DNA molekula, kódujúca aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 2 alebo majúca aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 3. Vhodná je tiež skrátená verzia p 110¹¹³ nazvaná p 56^RB Sekvencia p 56^RB pozri Huang a spol. (1991). Ďalšie nádorové supresor gény môžu byť použité vo vektoroch podľa tohto vynálezu. Len na ilustráciu, môže nimi byť p 16 protein /Kamb a spol. (1994)/, p21 protein, WT1 protein Wilmovho nádoru, mitozín, h-NUC alebo DCC protein karcinómu kolónu. Mitozín je opísaný v X.Lhu a W-H Lee, US prihláška č. 08/141239, podaná 22. októbra 1993, a v jej pokračovaní od rovnakých autorov, značka autorov P-CJ 1191, podanom 24. októbra 1994, obe práce sú tu zahrnuté ako odkazy. Podobne je h-NUC opísaný v práci W-H Lee a P-L Chen, US prihláška č. 08/170586, podaná 20. decembra 1993, zahrnutej tu ako odkaz.

Ako je známe odborníkom v odbore, výraz „protein“ znamená lineárny polymér aminokyselín spojených do špecifickej sekvencie peptidovými väzbami. Ako je tu použitý, znamená výraz „aminokyselina“ buď D, alebo L stereoizomému formu aminokyseliny, pokiaľ nie je špecificky označená. V rozsahu tohto vynálezu sú ekvivalentné proteíny alebo ekvivalentné peptidy, napr. majúci biologickú aktivitu čisteného štandardného typu nádorového supresor proteínu. „Ekvivalentné proteíny“ a „ekvivalentné polypeptidy“ označujú zlúčeniny, ktoré sa odlišujú od lineárnej sekvencie prirodzene sa vyskytujúcich proteínov alebo polypeptidov, ale ktoré majú aminokyselinové substitúcie, ktoré nemenia ich biologickú aktivitu. Tieto ekvivalenty sa môžu líšiť od natívnych sekvencii nahradením jednej alebo viac aminokyselín príbuznými aminokyselinami, napríklad podobne nabitými aminokyselinami alebo substitúciou alebo modifikáciou vedľajších reťazcov alebo funkčných skupín.

V definícii funkčného nádorového supresor proteínu je zahrnutý akýkoľvek protein, ktorého prítomnosť redukuje tumorigenicitu, malignantnosť alebo hyperproliferatívny fenotyp hostiteľskej bunky. Príklady nádorových supresor proteínov v tejto definícii zahŕňajú, ale nie sú tak obmedzené p 110^RB, p56^M, mitozín, h-NUC a p53. „Tumorigenicita“ je mienená ako prostriedok, majúci schopnosť tvoriť nádory alebo byť schopný vyvolať tvorbu nádoru a je synonymom neoplastického rastu. „Malignantnosť“ je mienená ako opisujúci tumorigenicitu bunky, majúci schopnosť metastázovať a ohrozovať život hostiteľského organizmu. „Hyperproliferatívny fenotyp“ je mienený na opísanie bunkového rastu a delenia pri rýchlosti za normálnymi medzami rastu pre tento bunkový typ. „Neoplastický“ tiež zahŕňa bunky, ktoré nemajú endogénny funkčný nádorový supresor protein alebo neschopnosť bunky exprimovať endogénnu nukleokyselinu, kódujúcu funkčný nádorový supresor protein.

Príkladom vektora podľa tohto vynálezu je rekombinantný adenovírus expresný vektor, majúci cudzí gén, kódujúci p53 protein alebo jeho aktívny protein, poskytnutý týmto vynálezom. Kódujúca sekvencia p53 génu je uvedená ďalej v tabuľke I.

TABUĽKA 1 so

V*SHR PGSR*	LLGSG	DTLRS GWERA	FHDGD TI.PWI GSQTA FRVTA MEEPQ 100
SDPSV	EPPLS	QETFS	DLWKL	LPENN	VLSPL	PSQAM	DDLML	SPDGI	EQWFT
									150
EDPGP	DEAPR	MFEAA	PPVAP	APAAP	TPAAP	APAPS	WPLSS	SVPSQ	KTYQG
									200
SYGFR	LGFLH	SG^AK	SVTCT	YSPAL	NKMFC	QLAKT	CPVQL	WVDST	PPPGT
									250
RVRAM	AIYKQ	SQHMT	EWRR	CPHHE	RCSDS	DGLAP	PQKLI	RVEGN	LRVEY
									300
LDDRN	TFRHS	VWPY	ZPPEV	GSDCT	TIHYN	YMCNS	SCMGG	MNRRP	:ltii
									350
TLEDS	SGNTjL·	GRKSF	EVRVC	ACPGR	DRRTE	EENLR	KKGEP	HHELP	PGSTK
									400
RALPN	NTSSS	PQPKK	KPLDG	EYFTL	QIRGR	ERFEM	FRELN	EALEL	KDAQA
GKEPG	GSRAH	SSHLK	SKKGQ	STSRH	KKLMF	' KTEGP DSD*

♦Stop kodon

Akékoľvek z tu opísaných vektorov sú vhodné ako kompozícia na diagnózu alebo terapiu. Vektory môžu byť použité na skríning, ktoré z mnohých nádorových supresor génov by mohli byť použiteľné v génovej terapii. Napríklad vzorom buniek považovaných za neoplastické môže byť odstránený zo subjektu a cicavca. Bunky môžu potom byť kontaktované za vhodných podmienok a s účinným množstvom rekombinantného vektora podľa tohto vynálezu, majúceho v sebe inzertovaný cudzí gén, kódujúci jeden z niektorých funkčných nádorových supresor génov. Ako bude zavedenie tohto génu obracať malígny fenotyp, môže byť merané tvorbou kolónií v mäkkom agare alebo tvorbou nádorov v holej myši. Ak je obrátený malígny fenotyp, je potom cudzí gén uznaný ako pozitívny kandidát pre úspešnú génovú terapiu pre subjekt alebo cicavce. Ak sú použité farmaceutický, môžu byť kombinované s jedným alebo viac ťarmaceutickými nosičmi. Farmaceutické nosiče sú v odbore dobre známe a zahŕňajú vodné roztoky ako sú fyziologické pufrované soľné roztoky alebo iné rozpúšťadlá alebo vehikulá ako sú glykoly, glycerín, rastlinné oleje /napr. olivový olej/ alebo injektovateľné organické estery. Farmaceutický prijateľný nosič môže byť použitý na podanie instantnej kompozície k bunke in vitro alebo subjektu in vivo.

Farmaceutický prijateľný nosič môže obsahovať fyziologicky prijateľnú zlúčeninu, ktorá spôsobí, napríklad, stabilizáciu kompozície alebo zvýšenie alebo zníženie absorpcie činidla. Fyziologicky prijateľná zlúčenina môže zahŕňať, napríklad, cukry ako je glukóza, sacharóza, alebo dextrany, antioxidanty, ako je kyselina askorbová alebo glutatión, chelatačné činidlá, proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou alebo iné stabilizátory alebo prísady. Iné fyziologicky prijateľné zlúčeniny zahŕňajú zmáčacie činidlá, emulgačné činidlá, dispergačné činidlá alebo chrániace činidlá, ktoré sú zvlášť vhodné na prevenciu rastu alebo pôsobenia mikroorganizmov. Rôzne chrániace látky sú dobre známe a napríklad zahŕňajú fenol a kyselinu askorbovú. Odborníkovi v odbore je zrejmé, že voľba farmaceutický prijateľného nosiča, zahŕňajúceho fyziologicky prijateľnú zlúčeninu, závisí napríklad od spôsobu podania polypeptidu a konkrétnych fyzikálno-chemických charakteristikách špecifického polypeptidu. Napríklad je fyziologicky prijateľná zlúčenina ako je monostearát hlinitý alebo želatína, zvlášť vhodná ako oneskorujúce činidlo, ktoré predlžuje rýchlosť absorpcie farmaceutickej kompozície podávanej subjektu. Ďalšie príklady nosičov, stabilizátorov alebo prísad, môžu byť nájdené v Martin, Remington's Pharm. Sci., 15. vyd. /Mack, Co., Easton, 1975), zahrnutom tu ako odkaz. Farmaceutická kompozícia môže byť tiež inkorporovaná, ak je to žiaduce, do lipozómov, mikrosfér alebo iných polymérnych matríc (Gregoriadis, Liposome Technology, Sv. 1 (CBC Press, Boca Raton, Florida 1984), zahrnuté tu ako odkaz). Lipozómy, napríklad, ktoré tvoria fosfolipidy alebo iné lipidy, sú netoxické, fyziologicky prijateľné a metabolizovateľné nosiče, ktoré je veľmi jednoduché vyrobiť a podávať.

„Farmaceutická kompozícia“ ako je tu používané, označuje akékoľvek kompozície látky tu opísanej v kombinácii s jedným alebo viac z uvedených farmaceutický prijateľných nosičov. Kompozície môžu byť podávané terapeuticky alebo profylaktický. Môžu byť kontaktované s hostiteľskou bunkou in vivo, ex vivo alebo in vitro, v účinnom množstve. Podmienky kontaktovania in vitro a ex vivo hostiteľských buniek sú uvedené ďalej. Ak sa pracuje in vivo, metódy podávania liečiva, obsahujúceho vektor podľa predloženého vynálezu, sú dobre známe v odbore a zahŕňajú, ale nie sú tak obmedzené, podanie orálne, intratumorálne, intravenózne, intramuskuláme alebo intraperitoneálne. Podanie môže byť uskutočňované kontinuálne alebo prerušovane a bude sa meniť podľa liečebného subjektu a podmienok, napr. ako v prípade iných terapeutických kompozícií (Laudmann a spol. (1992), Aulitzky a spol. (1991), Lantz a spol., (1990), Supersaxo a spol. (1988), Demetri a spol. (1989) a Le Maistre a spol. (1991).

Tento vynález ďalej poskytuje transformovanú prokaryotickú alebo eukaryotickú hostiteľskú bunku, napríklad živočíšnu bunku alebo cicavčiu bunku, majúcu inzertovaný rekombinantný adenovírus/expresný vektor opísaný skôr. Vhodné prokaryotické bunky zahŕňajú, ale nie sú tak obmedzené, bakteriálne bunky ako sú E. coli bunky. Spôsoby transformácie hostiteľských buniek retrovírusovými vektormi sú v odboru známe, pozri Sambrook a spol. (1989) a zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, transfekciu, elektroporáciu a mikroinjektáciu.

V tejto prihláške je výraz živočích mienený ako synonymum k výrazu cicavec a zahŕňa, ale nie je tak obmedzený, hovädzí dobytok, ošípané, mačky, opice, psy, kone, myši, krysy a ľudí. Ďalšie hostiteľské bunky zahŕňajú, ale nie sú tak obmedzené, akékoľvek neoplastické alebo nádorové bunky ako je osteosarkóm, karcinóm vaječníkov, rakovina prsníka, melanóm, hepatokarcinóm, rakovina pľúc, rakovina mozgu, kolorektálna rakovina, hematopoietická bunka, rakovina prostaty, cervikálna rakovina, retinoblastóm, rakovina esoľágu, rakovina mechúra, neuroblastóm alebo renálna rakovina.

Ďalej je ako hostiteľ pre tento vektor vhodná akákoľvek eukaryotickú bunková línia, exprimujúci Ela a Elb alebo Ela, Elb a pl. V jednom uskutočnení je vhodná eukaryotickou hostiteľskou línií 293 bunková línia dostupná z American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20231.

Akékoľvek z transformovaných hostiteľských buniek tu opísaných sú vhodné ako kompozície pre diagnózu alebo terapiu. Pri farmaceutickom použití sú kombinované s rôznymi farmaceutický prijateľnými nosičmi. Vhodné farmaceutický prijateľné nosiče sú známe v odbore odborníkom a sú napríklad opísané skôr. Kompozícia môže potom byť podávaná terapeuticky alebo profylaktický, v účinných množstvách, ktoré sú podrobnejšie opísané ďalej.

Predložený vynález tiež poskytuje spôsob transformácie hostiteľskej bunky. Tento spôsob poskytuje kontaktovanie hostiteľskej bunky, t. j. prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky, s akýmkoľvek z expresných vektorov tu opísaných a za vhodných podmienok. Hostiteľské bunky transformované touto metódou sú tiež nárokované v rozsahu tohto vynálezu. Kontaktovanie môže byť uskutočnené in vitro, in vivo alebo ex vivo s použitím metód dobre známych v odbore (Sambrook a spol. (1989)) a s použitím účinných množstiev expresných vektorov. Tento vynález tiež poskytuje spôsob produkcie rekombinantného proteínu alebo polypeptidu pri raste transformovanej hostiteľskej bunky za vhodných podmienok pre transkripciu a translaciu inzertovaného cudzieho génu. Metódy rekombinantnej expresie v rôznych hostiteľských bunkách, ako sú cicavčie, kvasinkové, hmyzie alebo bakteriálne bunky sú dobre známe a zahŕňajú tie, ktoré sú opísané v práci Sambrooka a spol., supra. Translatovaný cudzí gén môže byť potom izolovaný bežnými spôsobmi, ako je čistenie na stĺpci alebo čistenie s použitím antiproteínovej protilátky. Izolovaný proteín alebo polypeptid tiež spadá do rozsahu tohto vynálezu. Čistený alebo izolovaný (ako je tu použité) znamená v podstate zbavený natívnych proteínov alebo nukleových kyselín normálne spojených s proteínom alebo polypeptidom v natívnom prostredí alebo v prostredí hostiteľskej bunky.

Tento vynález tiež poskytujú živočíchy, ktorými nie sú ľudia, majúce v sebe inzertované vektory alebo transformované hostiteľské bunky podľa vynálezu. Tieto „transgénne“ živočíchy boli pripravené použitím metód dobre známych v odbore odborníkom, napríklad ako je opísané v US patente č. 5.175.384 alebo bežne ex vivo terapeutickými technikami, ako opísal Culver a spol. (1991).

Ako je podrobnejšie opísané ďalej, rekombinantné adenovírusy exprimujúce nádorovo supresorový štandardný typ p53, ako je opísané skôr, môžu účinne inhibovať DNA syntézu a potlačovať rast širokého rozmedzia typov ľudských nádorových buniek, zahŕňajúcich klinické ciele. Ďalej môžu rekombinantné adenovírusy exprimovať nádorovo supresorové gény ako je p53 v in vivo sa vyskytujúcom nádore bez uskutočnenia priameho injektovania do nádoru alebo pred ex vivo ošetrením rakovinových buniek. Exprimovaný p53 je funkčný a účinne potlačuje rast nádoru in vivo a významne zvyšuje čas prežitia v modeli ľudskej pľúcnej rakoviny holej myši.

Vektory podľa vynálezu sú zvlášť vhodné na génovú terapiu. V súlade s tým sú metódy génovej terapie, používajúce tieto vektory v rozsahu tohto vynálezu. Vektor sa čistí a potom sa podáva účinné množstvo in vivo alebo ex vivo do subjektu. Spôsoby génovej terapie sú dobre známe v odbore, pozri napr. Larrick J. W. a Burck K. L. (1991) a Kreigler M. (1990). „Subjektom“ je mienený akýkoľvek živočích, cicavec, krysa, myš, hovädzí dobytok, ošípaná, kôň, králik, mačka alebo ľudský pacient. Ak cudzí gén kóduje nádorovo supresorový gén alebo iný protinádorový proteín, používa sa vektor na ošetrenie alebo redukciu hyperproliferatívnych buniek v subjekte, na inhibíciu nádorovej proliferácie v subjekte alebo na zmiernenie určitej s tým spojenej patológie. Patologické hyperproliferatívne bunky sú charakteristické pre nasledujúce chorobné stavy, tyroidnú hyperplasiu-Graveova choroba, psoriasis, benígnu prostatickú hypertrofiu, Li-Fraumeni syndróm, zahŕňajúci rakovinu prsníka, sarkómy a iné neoplazmy, rakovinu mechúra, rakovinu kolónu, rakovinu pľúc, rôzne leukémie a lymfómy. Príklady nepatologických hyperproliferatívnych buniek je možné napríklad nájsť v cicavčích duktálnych epiteliálnych bunkách počas vývoja laktácie a tiež v bunkách spojených s hojením rán. Patologické hyperproliferatívne bunky charakteristicky majú stratu kontaktnej irthibície a úbytok svojej schopnosti selektívne adherovať, čo zahŕňa zmenu v povrchových vlastnostiach bunky a ďalší prielom v intercelulárnej komunikácii. Tieto zmeny zahŕňajú stimuláciu k rozdeleniu a schopnosti sekrétovať proteolytické enzýmy.

Navyše sa predložený vynález týka spôsobu deplécie vhodnej vzorky patologických cicavčích hyperproliferatívnych buniek, kontaminujúcich hematopoietické prekurzory počas rekonštitúcie kostnej drene cez zavedenie štandardného typu nádorového supresor génu do bunkového prípravku s použitím vektora podľa tohto vynálezu (získaného z autológnej krvi alebo kostnej drene). Ako je tu použité, „vhodná vzorka“ je definovaná ako heterogénny bunkový prípravok získaný z pacienta, napr. zmesová populácia buniek, obsahujúcich tak fenotypicky normálne, ako patogénne bunky. „Podanie“ zahŕňa, ale nie je obmedzené, zavedenie do bunky alebo subjektu intravenózne, priamou injekciou do nádoru, intra nádorovou injekciou, intraperitoneálnym podaním, aerosólovým podaním do pľúc alebo topicky. Takéto podanie môže byť spojené s farmaceutický prijateľným nosičom opísaným skôr.

Výrazom „redukovaná tumorigenicita“ je mienené to, že nádorové bunky boli prevedené na menej tumorigénne alebo netumorigénne bunky. Bunky s redukovanou tumorigenicitou buď netvoria nádory in vivo, alebo majú predĺženú lag dobu týždne až mesiace pred objavením sa in vivo nádorového rastu a/alebo spomalenie rastu trojrozmernej nádorovej hmoty v porovnaní s nádormi, majúcimi plne inaktivovaný alebo nefunkčné nádorovo supresorový gén.

Ako je tu použité znamená výraz „účinné množstvo“ množstvo vektora alebo protirakovinového proteínu, ktorým sa dosiahne pozitívna kontrola bunkovej proliferácie. Napríklad jedna dávka obsahuje od asi 10⁸ do asi 10¹³ infekčných jednotiek. Typický priebeh liečenia by mal zahŕňať jednu takúto dávku denne počas päť dní. Účinné množstvo sa bude meniť podľa patológie alebo liečeného stavu pacienta a jeho stavu a iných faktorov, dobre známych odborníkom v odbore. Účinné množstvo odborník v odbore ľahko stanoví.

V rozsahu tohto vynálezu je spôsob zmiernenia patológie vyznačenej hyperproliferatívnymi bunkami alebo genetických defektov pri subjekte podaním subjektu účinného množstva vektora opísaného skôr, obsahujúceho cudzí gén, kódujúci génový produkt, majúci schopnosť zmierňovať patológiu, za vhodných podmienok. Ako je tu použité, výraz „genetický defekt“ znamená akúkoľvek chorobu alebo abnormalitu, ktorá vzniká z inheritných faktorov, ako je anémia kosáčikovitých buniek alebo Tay-Sachsova choroba.

Tento vynález tiež poskytuje metódu na redukciu proliferácie nádorových buniek v subjekte zavedením účinného množstva adenovírusového, expresného vektora, obsahujúceho protinádorový gén iný než nádorový supresor gén, do hmoty nádoru. Protinádorový gén môže kódovať napríklad tymidín kinázu (TK). Subjektu sa potom podáva účinné množstvo terapeutického činidla, ktoré je za prítomnosti protinádorového génu toxické k bunke. V špecifickom prípade tymidín kinázy je terapeutickým činidlom metabolit tymidín kinázy ako je ganciclovírus (GCV), 6-metoxypurín arabinonukleozid (araM) alebo ich funkčný ekvivalent. Tak tymidín kinázový gén ako tymidín kinázový metabolit musia byť použité súčasne preto, aby boli pre hostiteľskú bunku toxické. Ale v ich prítomnosti je GCV fosforylovaný a stáva sa potentným inhibítorom DNA syntézy, zatiaľčo araM sa konvertuje na cytotoxický anabolit araATP. Iné protinádorové gény môžu byť použité i v kombinácii so zodpovedajúcim terapeutickým činidlom pre zníženie proliferácie nádorových buniek. Takéto kombinácie iného génu a terapeutického činidla sú známe odborníkom v odbore. Ďalším príkladom by mohol byť vektor podľa vynálezu, exprimujúci enzým cytozín deaminázu. Taký vektor by mohol byť použitý v spojení s podaním liečiva 5-fluoracilu (Austin a Huber, 1993) alebo v poslednej dobe opísaný E. coli Deo gén v kombinácii sa 6-metyl-purín-2'-deosribonukleozidom (Sorscher a spol. 1994).

Ako pri použití nádorových supresor génov opísaných skôr, použitie iných protinádorových génov, buď samotných, alebo v kombinácii s vhodným terapeutickým činidlom, poskytuje liečenie nekontrolovaného bunkového rastu alebo proliferácie charakteristických pre nádory a malignancie. Vynález tak poskytuje terapiu na ukončenie nekontrolovaného bunkového rastu pri pacientovi a tým odstránenie symptómov choroby alebo kachécie prítomnej u pacienta. Účinok tohto liečenia zahŕňa, ale nie je tak obmedzený, predĺžený čas prežitia pacienta, redukciu nádorovej hmoty alebo obtiaží, apoptosis nádorových buniek alebo redukciu počtu cirkulujúcich nádorových buniek. Prostriedky na kvantifikáciu prínosných účinkov tejto terapie sú dobre známe odborníkom v odbore.

Vynález poskytuje rekombinantný adenovírus expresný vektor, charakterizovaný čiastočnou alebo úplnou deléciou adnovírusový proteín IX DNA a majúci cudzí gén, kódujúci cudzí proteín, kde cudzím génom je samovražedný gén alebo jeho funkčný ekvivalent. Protirakovinový gén TK opísaný skôr je príkladom samovražedného génu, pretože, ak je exprimovaný, génový produkt je, alebo sa môže stať, letálnym k bunke. Pri TX je letabilita indukovaná prítomnosťou GCV. TK gén je odvodený z herpes simplex vírusu metódami dobre známymi odborníkom v odbore. Plazmid pMLBKTK v E. coli HB101 (z ATCC č. 39369) je zdrojom herpes simplex vírus (HSV-1) tymidín kinázového (TK) génu na použitie v tomto vynáleze. Ale existuje i mnoho iných zdrojov.

TK gén môže byť zavedený do nádorovej hmoty kombináciou adenovírusového expresného vektora s vhodným farmaceutický prijateľným nosičom. Zavedenie môže byť napríklad uskutočnené priamou injekciou rekombinantného adenovírusu do nádorovej hmoty. V špecifickom prípade rakoviny ako je hcpatocelulárna rakovina (HCC), môže byť použitá na doručenie priama injekcia do hepatickej artérie, pretože väčšina HCC odvodzuje svoju cirkuláciu z tejto artérie. Na kontrolu proliferácie nádoru je bunková smrť indukovaná ošetrením pacientov s TK metabolitom ako je ganciclovírus na dosiahnutie redukcie nádorovej hmoty.

TK metabolit môže byť podávaný napríklad systémovo, miestnou inokuláciou do nádoru alebo v špecifickom prípade HCC, injekciou do hepatickej artérie. TK metabolit je výhodne podávaný aspoň jedenkrát denne, ale môže to byť viackrát denne alebo menejkrát podľa potreby. TK metabolit môže byť podávaný súčasne alebo následne k podaniu TK obsahujúceho vektora. Odborníkom v odbore bude známe alebo môžu stanoviť dávku a trvanie, ktoré je terapeuticky účinné.

Spôsob nádorovo špecifického doručenia nádorovo supresor génu sa uskutočňuje kontaktovaním cieľového tkaniva živočíchovi účinným množstvom rekombinantného adenovírusového expresného vektora podľa tohto vynálezu. Gén je mienený na kódovanie protinádorového činidla ako je funkčný nádorovo supresorový gén alebo samovražedný gén. „Kontaktovaním“ je mienená akákoľvek doručovacia metóda pre účinný transfer vektora, ako je intranádorová injekcia.

Použitie adenovírusového vektora podľa tohto vynálezu na prípravu liečiv na liečenie choroby alebo na terapiu poskytuje ďalej tento vynález.

Nasledujúce príklady sú mienené na ilustrovanie, nie na obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad č. 1

Plazmid pAd/MLP/p53/Elb bol použitý ako východiskový materiál pre tieto manipulácie. Tento plazmid je založený na pBR322 deriváte pML2 (pBR322 deletovaný v bázových pároch 1140 až 2490) a obsahuje adenovírus typ 5 sekvencie, zasahujúci od bázového páru 1 k bázovému páru 5788 s tým rozdielom, že sú deletované bázové páry 357 až 3327 adenovírus typu 5. Na mieste Ad5 357/3327 delécie je inzertovaná transkripčná jednotka, ktorá zahŕňa adenovírus typ 2 hlavný oneskorený promótor, adenovírus typ 2 tripartitný leader c DNA a ľudskú p53 cDNA. Typický E1 náhradový vektor je deletovaný pri Ad5 Ela a Elb génov, ale obsahuje Ad5 proteín IX gén (prehľad adenovírusových vektorov pozri: Graham a Prevec (1992). Ad2 DNA bola získaná od Gibco BRL. Reštrikčné endonukleázy a T4 DNA ligázy boli získané od New England Biolabs. E. coli DH5 kompetentné bunky boli zakúpené pri Gibco BRL a 293 bunky boli získané od Američan Type Culture Collection (ATCC). Prep-A-Gene DNA čistiaca živice bola získaná od BioRad. LB pôdne bakteriálne rastové médium bolo získané od Difco. Quiagen DNA čistiace kolóny boli získané od Quiagen Inc. Ad5 dl327 boli získané od R. J. Schneidera, NYU.MBS DNA transfekčný kit bol získaný od Stratagene.

Jeden (1) pg p Ad/MLP/p53/Elb - bol štiepený s 20 jednotkami každého z reštrikčných enzýmov Ecl 136II a NgoMI podľa doporučenia výrobcu. Reštrikčné štiepenia boli vložené do oddelených dráh na 0,8 % agarosovom géli a clektroforezované 2 hodiny pri 100 voltoch. 4268 bp reštrikčný fragment z Pad/MLP/p53/Elb-vzorky a 6437 bp fragment z Ad2 vzorky boli izolované z gélu s použitím Prep-A-gene DNA extrakčnej živice podľa špecifikácií výrobcu. Reštrikčné fragmenty boli zmiešané a spracované s T4 DNA ligázou v celkovom objeme 50 μΐ pri 16 °C po 16 hodín podľa návodu výrobcu. Po ligácii 5 pl reakčnej zmesi bolo použité na transformovanie E. coli DH5a buniek k ampicilínovej rezistencii podľa postupu výrobcu. Šesť bakteriálnych kolónií vzniknutých z tohto postupu bolo použité na inokuláciu 2 ml kultúr LB rastového média a inkubované cez noc pri 37 °C za trepania. DNA bola pripravená z každej bakteriálnej kultúry použitím štandardných postupov (Sambrook a spol. (1989)). Štvrtina plazmidovej DNA z každého izolátu bola štiepená 20 jednotkami reštrikčnej endonukleázy Xhol k skríningu správneho rekombinantu, obsahujúceho Xhol reštrikčné fragmenty 3627, 3167, 2466 a 1445 bázových párov. Päť zo šiestich skrinovaných izolátov obsahuje správny plazmid. Jeden z nich bol použitý na inokuláciu 1 litra kultúry LB média pre izoláciu veľkých množstiev plazmidovej DNA. Po inkubácii cez noc bola plazmidová DNA izolovaná z 1 litra kultúry pri použití Qiagen DNA čistiacich kolón podľa doporučenia výrobcu. Výsledný plazmid bol označený Pad/MLP/p53/PIX-. Vzorky tohto plazmidu sú uložené v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 12301, 22. októbra 1993. Uloženie bolo vykonané podľa podmienok Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom ukladaní mikroorganismov na účely patentového konania. Uloženie dostalo prírastkové číslo ATCC Č. 75576.

Na konštrukciu rekombinantného adenovírusu bolo 10 pg Pad/MLP/p53/PIX-spracované so 40 jednotkami reštrikčnej endonukleázy EcoRI pre linearizáciu plazmidu. Adenovírus typ 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982)) boli štiepené s reštrikčnou endonukleázou Clal a veľký fragment (približne 33 kilobázových párov) bol čistený odstreďovaním so sacharózovým gradientom. Desať (10) pg EcoRI spracovaného Pad/MLP/p53/Elb- a 2,5 pg Clal spracovaného Ad5 dl327 bolo zmiešané a použité k transfekcii kitu podľa doporučení dodávateľa. Osem (8) dní po transfekcii boli 293 bunky odrezané 1 až 3 do čerstvého média a dva dni po tom bol zrejmý adenovírusom indukovaný cytopatický účinok na transfektované bunky. 13. deň po transfekcii sa pripraví DNA z infikovaných buniek použitím štandardných postupov (Graham a Prevec (1991)) a analyzuje sa reštrikčným štiepením reštrikčnou endonukleázou Xhol. Vírusom riadená expresia p53 bola overená po infekcii SaoS2 osteosarkomových buniek vírusovým lyzátom a imunoblottingom s anti-p53 monoklonálnou protilátkou označenou 1801 Novocasta Lab., Ltd., U. K.).

Príklad č. 2

Materiály a metódy Bunkové línie

Rekombinantné adenovírusy boli ponechané rásť a rozmnožovať sa v ľudskej embryonálnej obličkovej bunkovej línii 293 (ATCC CRL 1573) udržovanej v DME médiu, obsahujúcom 10 % definované, doplnené teľacie sérum (Hyclone). Saos-2 bunky boli udržované v Kaighnovom médiu doplnenom 15 % fetálneho teľacieho séra. HeLa a Hep 3B bunky boli udržované v DME médiu doplnenom 10 % teľacieho fetálneho séra. Všetky bunkové línie rástli v Kaighnovom médiu doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom. Saos-2 bunky boli láskavo poskytnuté Dr. Ericom Stanbridgom. Všetky ostatné bunkové línie boli získané z ATCC.

Konštrukcia rekombinantného adenovírusu

Pre konštrukciu Ad5 p53 vírusov bol 1,4 kb HindlII-Smal fragment, obsahujúci plnú dĺžku cDNA pre p53 (tabuľka I) izolovaný z pGEMl-p53-B-T (dodaný láskavo Dr. Wen Hwa Lee-em) a inzertovaný do viacnásobného klonovacieho miesta expresného vektora pSP72 (Promega) s použitím štandardných klonovacích postupov (Sambrook a spol. (1989)). p53 inzert bol získaný z tohto vektora po štiepení s Xhol-BglII a gélovou elektroforézou. p53 kódujúca sekvencia bola potom inzertovaná buď do pNL3CMV adenovírus génových transfer vektorov (láskavo poskytnuté

SK 283703 Β6

Dr. Róbertom Schneiderem), ktorý obsahuje Ad5 5' invertované terminálové opakovanie a vírusové obalové signály a Ela enhancer v smere proti buď Ad2 hlavnému oneskorenému promótoru (MLP-major late promoter), alebo ľudskému cytomegalovírus bezprostrednému včasnému génovému promótoru (CMV), nasledovaného tripartitnou leader cDNA a Ad5 sekvenciou 3325-5525 bp v PPML2 základu. Tieto nové konštrukty nahradzujú E1 región (bp 360-3325) Ad5 s p53 riadeným buď Ad2 MLP (A/M/53), alebo ľudským CMV promótorom (A/C/53), oba nasledované tripartitnou leader CDNA (pozri obr. 4). p53 inzerty užívajú zvyšujúci Elb polyadenylačný po smere expresie umiestnené miesto. Boli vytvorené ďalšie MLP a CMV riadené p53 rekombinanty (A/M/N/53), ktoré mali ďalšiu 705 nukleotidovú deléciu Ad5 sekvencie pre odstránenie proteín IX (PIX) kódujúceho regiónu. Ako kontrola bol vyvinutý rekombinantný adenovírus z rodičovského PNL3C plazmidu bez p53 inzertu (A/M). Druhú kontrolu tvorí rekombinantný adenovírus, kódujúci beta-galaktozidazový gén pod kontrolou CMV promótoru (A/C/B-gal). Plazmidy boli linearizované buď Nrul, alebo EcoRI a kotransfektované s veľkým fragmentom Cll štiepených Ad5 dl309 alebo d 1327 mutantov (Jones a Shenk (1979)) s použitím Ca/PO4 transfekčného kitu (Stratagene). Vírusové plaky boli izolované a rekombinanty identifikované tak analýzou reštrikčným štiepením ako PCR s použitím rekombinantných špecifických primárov proti tripartitnej leader CDNA sekvencií v smere p53 CDNA sekvencie. Rekombinantný vírus bol ďalej čistený limitným riedením a vírusové častice boli čistené a titrované štandardnými metódami (Graham a van der Erb (1973), Graham a Prevec (1991)).

Detekcia p53 proteínu

Saos-2 alebo Hep 3 B bunky (5 x 10⁵) boli infikované uvedenými rekombinantnými adenovírusmi počas 24 h pri zvyšujúcich sa multiplicitách infekcie (multiplicity of infection(MOI)) plakotvomých jednotiek vírus/bunka. Bunky potom boli jedenkrát premyté s PBC a zberané v lýzovom pufre (50 mM Tris-HCl pH 7,5. 250 mM' NaCl, 0,01 %NpyO, 50 mM Naf, 5 mM EDTA, 10 pg/ml aprotinínu, 10 μ/ml leupeptínu a 1 mM PMSF). Bunkové proteíny (približne 30 pg) boli oddelené 10 % SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózu. Membrány boli inkubované s ot-p53 protilátkou PAb 1801 (Novocastro) a potom konjugované s ovčím antimvším IgG s chrenovou peroxidázou. p53 proteín bol vizualizovaný chemilumiscenciou (ECL kit, Amersham) na kodak XAR-5 filmu.

Meranie rýchlosti syntézy DNA

Bunky (5 x 10³/jamka) boli umiestnené na 96-jamkovej titračnej platni (Costar) a ponechané priľnúť počas noci (37 °C, 7 % CO₂). Bunky potom boli infikované 24 hodín s čistenými rekombinantnými vírusovými časticami pri MOI v rozmedzí 0,3 až 100 ako je uvedené. Média boli vymenené 24 hodín po infekcii a v inkubácii sa pokračovalo celkom 24 hodín. ³H-tymidín (Amersham, 1 pCi/jamka) bol pridaný 18 hodín pred odobratím. Bunky boli odobrané na filtre zo sklenených vlákien a boli merané hladiny inkorporovanej rádioaktivity' pomocou beta scintilačného čítača. Inkorporácia ³H-tymidínu bola vyjadrená ako priemerné % (+/- SD) kontroly média a graficky vynesená v závislosti od MOI.

Tumorigenicita pri holej myši

Približne 2,4 x 10⁸ Saos-2 buniek, umiestnených v T225 bankách, bolo spracované v suspenzii pufra (1 % sacharóza v PBS), obsahujúcej buď A/M/N/53, alebo A/M čistený vírus pri MOI 3 alebo 30. Po infekcii počas noci boli bunky injektované subkutánne do ľavých a pravých bokov BALB/c athymickej holej myši (4 myši na skupinu). Jeden bok bol injektovaný s A/M/N/53 ošetrenými bunkami, zatiaľ čo kolaterálny bok bol injektovaný s kontrolnými A/M ošetrenými bunkami, každá myš slúži ako svoja vlastná kontrola. Zvieratá, ktoré dostali bilaterálnu injekciu pufrom spracovaných buniek, slúžia ako ďalšie kontroly. Rozmery nádoru (dĺžka, šírka a výška) a telesnej hmotnosti zvierat boli potom merané dvakrát týždenne počas 8 týždňov. Objemy nádorov boli hodnotené pre každé zviera s predpokladom sférickej geometrie priemeru nameraných nádorových rozmerov.

Intranádorová RNA analýza

BALB/c athymické holé myši (približne 5 týždňov staré) boli subkutánne injektované s 1 x 10⁷ H69 bunkami malobunkového pľúcneho karcinómu (SCLC) do pravých bokov. Nádory boli ponechané sa rozvinúť počas 32 dní do približne 25 - 50 mm³. Myši dostali peritumorálnu injekciu buď A/C/53, alebo A/C/B-gal rekombinantných adenovírusových (2 x 10⁹ plakotvomých jednotiek (plaque forming units (pfu)) do subkutánneho priestoru pod nádorovú hmotu. Nádory boli vyrezané zo zvierat 2. a 7. deň po ošetrení adenovírusom a PBS. Vzorky nádorov boli homogenizované, a celková RNA bola izolovaná s použitím TriReagent kitu (Molecular Research Center lnc.). PolyA RNA bola izolovaná s použitím PolyATract mRNA Isolation Systém (Promega) a približne 2 pg vzorka bola použitá na RT-PCR stanovenie rekombinantnej p53 MRNA expresie (Wang a spol. (1989)). Boli pripravené printery na amplifikáciu sekvencie medzi adenovírus tripartitný leader CDNA a p53 CDNA v smere expresie, zaisťujúci, že by mal byť amplifikovaný iba jeden rekombinant a nie endogénna p53.

p53 génová terapia vytvorených nádorov v holej myši

Približne 1 x ΙΟ⁷ H69 (SCLC) nádorových buniek v 200 μΙ objemoch bolo injektované subkutánne do samíc BALB/c athymickej holej myši. Nádory boli ponechané 2 týždne vývoju a potom bola pri zvieratách náhodne stanovená veľkosť nádoru (N = 5/skupina). Dvakrát týždenne boli podávané peritumorálne injekcie, celkom 8 dávok/skupina. Rozmery nádoru a telesnej hmotnosti boli merané dvakrát týždenne a objemy nádorov boli hodnotené ako je opísané skôr. Zvieratá potom boli pozorované na vplyv ošetrenia na prežitie myši.

Výsledky Konštrukcia rekombinantného p53-adenovírusu p53 adenovírusy boli konštruované nahradením časti Ela a Elb regiónu adenovírusu typ 5 s p53 CDNA pod kontrolou buď Ad2 MLP (A/M/53), alebo CMV (A/C/53) promótora (schematicky na obr. 4). Táto E1 substitúcia silne zhoršuje schopnosť rekombinantných adenovírusov sa replikovať, obmedzením ich propagácie na 293 bunky, čo prevádza Ad5 E1 génové produkty na trans (Graham a spol. (1977)). Po identifikácii p53 rekombinantného adenovírusu tak reštrikčným štiepením, ako PCR analýzou bola celá p53 CDNA sekvencia z jedného z rekombinantných adenovírusov (A/M/53) sekvenovaná na overenie, že je bez mutácií. Potom boli použité čistené prípravky p53 rekombinantov na infekciu HeLa buniek na skúšanie prítomnosti fenotypove štandardného adenovírusu. HeLa bunky, ktoré nie sú permisivne pre replikáciu El-deletovaného adenovírusu, boli infikované s 1 - 4 x 10 infekčných jednotiek rekombinantného adenovírusu, kultivované 4 týždne a pozorované na objavenie sa cytopatického efektu (CPE). Použitím tejto skúšky nebola zaznamenaná replikácia rekombinantného adenovírusu alebo kontaminácia štandardným typom, zrejmé pri CPE pozorovanom v kontrolných bunkách infikovaných štandardným typom adenovírusu v hladine citlivosti približne 1 v 10⁹.

p53 proteínová expresia z rekombinantného adenovírusu

Na stanovenie, či p53 rekombinantné adenovírusy exprimujú p53 proteín, boli infikované nádorové bunkové línie, ktoré nccxprimujú proteín p53. Ľudské nádorové bunkové línie Saos-2(osteosarkom) a Hep 3B (hepatocelulárny karcinóm) boli infikované počas 24 hodín s p53 rekombinantnými adenovírusmi A/M/53, alebo A/C/53 pri MOI v rozmedzí 0,1 až 200 pfu/bunku. Westem analýzy lyzátov pripravených z infikovaných buniek demonštrujú dávkové závislú p53 proteínovú expresiu v oboch bunkových typoch (obr. 5). Obe bunkové línie exprimujú vyššie hladiny p53 proteínu po infekcii s A/C/53 než s A/M/53 (obr. 3). Žiadny p53 proteín nebol detegovaný pri neinfikovaných bunkách. Hladiny endogénneho štandardného typu p53 sú normálne príliš nízke a nie sú detegovateľné Westem analýzou bunkových extraktov (Bartek a spol. (1991)). Je však jasné, že hladiny štandardného typu p53 proteínu sú ľahko detegovateľné po infekcii s buď A/M/53, alebo A/C/53 pri nižších MOI (obr. 5), čo naznačuje, že aj nízke dávky p53 rekombinantných adenovírusov môžu produkovať účinné hladiny p53.

p53 závislé morfologické zmeny

Znovu zavedenie štandardného typu p53 do p53 negatívnej osteosarkómovej bunkovej línie, Saos-2, vedie k charakteristickému predĺženiu a splošteniu týchto normálne vretenovite tvarovaných buniek (Chen a spol. (1990)). Nesúvislé Saos-2 bunky (1 x 10⁵ bunky/10 cm platňa) boli infikované pri MOI 50 buď s A'C/53, alebo kontrolným A/M vírusom a inkubované pri 37 °C počas 72 hodín, až sú neinfikované kontrolné platne konfluentné. V tomto bode bola očakávaná morfologická zmena zrejmá v A/C/53 ošetrenej platni (obr. 6 panel C), ale nie pri neinfikovanej (obr. 6, panel B). Tento účinok nebol funkciou bunkovej hustoty, pretože kontrolná platňa na počiatku naočkovaná v nižšej hustote, si udržuje normálnu morfológiu 72 hodín, keď je jej konfluencia približne taká, ako pri A/C/53 ošetrenej platni. Skoršie výsledky demonštrovali vyššiu hladinu p53 proteínovej expresie pri MOI 50 v Saos-2 bunkách (obr. 5A) a z týchto výsledkov je zrejmé, že p53 proteín exprimovaný týmito rekombinantnými adenovírusmi bol biologicky aktívny.

p53 inhibícia bunkovej DNA syntézy

Pre ďalší test aktivity p53 rekombinantných adenovírusov bola hodnotená ich schopnosť inhibovať proliferáciu ľudských nádorových buniek meraním príjmu ³H-tymidínu. Skôr už bolo uvedené, že zavedenie štandardného typu p53 do buniek, ktoré neexprimujú endogénny štandardný typ p53 môže zastaviť bunky na prechode G,/S, viest k inhibícii príjmu značeného tymidínu do novo syntetizovanej DNA (Baker a spol. (1990), Mercer a spol. (1990), Diller a spol. (1990)). Rôzne p53-deficientne nádorové bunkové línie boli infikované buď A/M/N/53, A/C/N/53 alebo p53 neexprimujúcim kontrolným rekombinantným adenovírusom (A/M). Bola pozorovaná silná, dávkové závislá inhibícia DNA syntézy tak pri A/M/N/53, ako A/C/N/53 rekombinantoch v 7 z 9 rôznych nádorových testovaných línií (obr. 7). Oba konštrukty sú schopné inhibovať DNA syntézu v týchto ľudských nádorových bunkách, bez ohľadu na to, či sú exprimované mutantom p53 alebo neexprimujú p53 proteín. Bolo tiež zistené v tejto štúdii, že A/C/N/53 konštrukt bol omnoho potentnejší než A/M/N/53. V Saos-2 (osteosarkom) a MDA-MB468 (rakovina prsníka) bunkách, bola dosiahnutá skoro 100 % inhibícia DNA syntézy s A/C/N/53 konštruktéra pri tak nízkej MOI ako 10. V dávkach, kde inhibícia kontrolným adenovírusom je iba 10 - 30 %, bola pozorovaná 50 - 100 % redukcia DNA syntézy s použitím buď p53 rekombinantného adenovírusu. Naopak nebol žiadny významný efekt pozorovaný s použitím ani konštruktu v porovnaní s kontrolným vírusom v HEP g2 bunkách (hepatokarcinómová bunková línia exprimujúca endogénny štandardný typ p53, Bressac a spol. (1990)), ani v K562 (p53 nula) leukemickej bunkovej línie.

Tumoriqenicita pri holej myši

V prísnejšom teste funkcie p53 rekombinantných adenovírusov boli nádorové bunky infikované ex vivo a potom injektované do holej myši na vyhodnotenie schopnosti rekombinantov potlačovať rast nádoru in vivo. Saos-2 bunky infikované A/M/N/53 alebo kontrolným A/M vírusom boli pri MOI 3 alebo 30 injektované do protiľahlých bokov holej myši. Veľkosti nádorov boli merané dvakrát za týždeň počas 8 týždňovej periódy. Pri MOI 30 nebol pozorovaný rast nádorov v p53-ošetrených bokoch žiadneho zo zvierat, zatiaľ čo kontrolou ošetrené nádory pokračovali v raste (obr. 8). Progresívne zväčšenia kontrolným vírusom ošetrených nádorov boli podobné ako boli pozorované pri pufrom ošetrených kontrolných zvierat. Jasný rozdiel bol v raste nádoru medzi kontrolným adenovírusom a p53 rekombinantom pri MOI 3, hoci nádory pri 2 zo 4 p53-ošetrených myší ukazovali pri štarte rovnaký rast po približne 6 týždňoch. Tak je A/M/N/53 rekombinantný adenovírus schopný sprostredkovať p53-špecifické nádorové potlačenie v in vivo prostredí.

In vivo expresia Ad/p53

Aj keď ex vivo ošetrenie rakovinových buniek a následná injekcia do zvierat poskytuje podstatný test nádorového potlačenia, je klinicky relevantnejším experimentom stanoviť, či by p53 rekombinantný adenovírus mohol infikovať a exprimovať p53 vo vytvorených nádoroch in vivo. Preto boli H69 (SCLC, p53”^uIa) bunky injektované subkutánne do holej myši a nádory boli ponechané 32 dní sa vyvíjať. Po tomto čase bola jediná injekcia 2 x 10⁹ pfu buď A/C/53, alebo A/C/B-gal adenovírusu injektovaná do peritumorálneho priestoru, obklopujúceho nádor. Nádory boli potom vyrezané buď 2. alebo 7. deň po injekcii adenovírusu a z každého nádoru bola izolovaná polyA RNA. RT-PCR s použitím rekombinant-p53 špecifických primérov potom bola použitá na detegovanie p53 MRNA v p53 ošetrených nádoroch (obr. 9, dráhy 1,2,4,5). Nebol zrejmý žiadny p53 signál z nádorov vyrezaných z β-gal ošetrených zvierat (obr. 9, dráhy 3 a 6). Amplifikácia s aktin primérmi slúži ako kontrola pre RT-PCR reakciu (obr. 9, dráhy 7 - 9), zatiaľ čo plazmid obsahujúci rekombinant p53 sekvencie slúži ako pozitívna kontrola pre rekombinant-p53 špecifický prah (obr. 9, dráha 10). Tento experiment demonštruje, že p53 rekombinantný adenovírus môže špecificky riadiť expresiu p53 mRNA vo vytvorených nádoroch s nasledujúcou jedinou injekciou do peritumorálneho priestoru. Je tiež uvedená in vivo vírusová perzistencia počas aspoň jedného týždňa po infekcii s p53 rekombinantným adenovírusom.

Účinnosť in vivo

Na uľahčenie génovej terapie vytvorených nádorov bol použitý model nahej myši nesúci nádor. H69 bunky boli injektované do subkutánneho priestoru do pravého boku myši a nádory boli ponechané rásť dva týždne. Myši potom dostali peritumorálne injekcie pufra alebo rekombinantného vírusu dvakrát týždenne v celkom 8 dávkach. Pri myši ošetrenej pufrom alebo kontrolným A/M vírusom pokračujú nádory v rýchlom raste počas celého ošetrenia, zatiaľ čo tie, ktoré boli ošetrené s A/M/N/53 vírusom rástli omnoho pomalšou rýchlosťou (obr. 10A). Potom, čo sa prestalo s injekciami, kontrolné ošetrené nádory pokračujú v raste, zatiaľ čo p53 ošetrené nádory majú malý alebo žiadny rast po aspoň jednom týždni v neprítomnosti akéhokoľvek ďalšieho doplnku exogénneho p53 (obr. 10A). Aj keď kontrolné zvieratá ošetrené samotným pufrom mali urýchlený rast nádoru v porovnaní so skupinou ošetrenou vírusom, nebol nájdený žiadny podstatný rozdiel v telesnej hmotnosti medzi tromi skupinami počas periódy ošetrenia. Ulcerácia nádoru pri niektorých zvieratách obmedzuje relevantnosť, meraní veľkosti nádoru po 42. dni. Ale pokračuje sledovanie zvierat na stanovenie doby prežitia demonštrujúce výhodu prežívania pri p53-ošetrených zvierat (obr. 10B). Posledné z kontrolných adenovirusom ošetrených zvierat uhynulo 83. deň, zatiaľ čo samotným pufrom ošetrené zvieratá uhynuli všetky 56. deň. Naopak všetkých 5 zvierat ošetrených s A/M/N/53 ďalej prežíva (130. deň po bunkovej inokulácii). Tieto údaje spoločne predstavujú p53-špecifický účinok tak na rast nádoru, ako na dobu prežitia pri zvieratách s vytvorenými p53-deficientnými nádormi.

Adenovírusové vektory exprimujúce p53

Boli konštruované rekombinantné adenovírusové vektory, ktoré sú schopné exprimovať vysoké hladiny štandardného typu p53 proteínu v dávkové závislom spôsobe. Každý vektor obsahuje delécie v Ela a Elb regiónoch, ktoré robia vírusovú replikáciu deficientnou (Challberg a Kelly (1979), Horowitz (1991)). Ďalším významom týchto delécií je, že tieto sekvencie, kódujúce Elb 19 a 55 kd proteín 15 kd proteín je uvádzaný ako inhibujúci apoptosis (White a spol. (1992), Rao a spol. (1992)), zatiaľčo 55 kd proteín je schopný viazať štandardný typ p53 proteínu (Samow a spol. (1982), Heuwell a spol. (1990)). Pri delécii týchto adenovírusových sekvencií boli odstránené potenciálne inhibítory p53 funkcie priamou väzbou k p53 alebo potenciálnou inhibíciou p53 sprostredkovanej apoptosis. Boli vyrobené ďalšie konštrukty majúce zvyšujúcu 3' Elb sekvenciu, zahŕňajúcu celý proteín IX kódujúci sekvenciu, tiež deletovanú. Aj keď bolo uvádzané, že redukcia obalovej veľkosti kapacity adenovírusu na približne o 3 kb menej než pri štandardnom type vírusu (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)), tieto konštrukty sú tiež deletované v E3 regióne tak, že A/M/N/53 a A/C/N/53 konštrukty sú v tomto rozmedzí veľkostí. Pri delécii pIX regiónu sú adenovírusové sekvencie homológne k sekvenciám obsiahnutým v 293 bunkách redukované na približne 300 bázových párov, znižujúcich šancu regenerácie replikačne schopného adenovírusu štandardného typu rekombinácií. Konštrukty postrádajúce pIX kódujúcu sekvenciu sa javia byť rovnako účinné ako tie s pIX.

p53/adenovírus účinnosť in vitro

V súlade so silnou dávkou závislosti pre expresiu p53 proteínu v infikovaných bunkách, bola demonštrovaná p53-špecifická inhibícia rastu nádorových buniek. Bunkové delenie bolo inhibované a demonštrované inhibíciou DNA syntézy v širokom rozsahu typov nádorových buniek, o ktorých je známe, že nemajú štandardný typ p53 proteínovej expresie. Barchetti a Graham (1993) v poslednom čase uvádzajú p53 špecifickú inhibíciu DNA syntézy v bunkovej línii buniek karcinómu vaječníka SKOV-3 p53 rekombi nantným adenovirusom v podobných pokusoch. Navyše ku karcinómu vaječníkov boli demonštrované ďalšie ľudské nádorové bunkové línie predstavujúce klinicky dôležité ľudské rakoviny a zahŕňajúce línie nadmerne exprimujúce mutant p53 proteín, ako byť inhibované p53 rekombinantmi podľa tohto vynálezu. Pri MOI, kde je A/C/N/53 rekombinant 90 až 100 % účinný pri inhibícii DNA syntézy v nádoroch týchto typov, je kontrolné adenovirusom sprostredkované potlačenie menšie než 20 %.

Aj keď Feinstein a spol. (1992) uvádzajú, že znovu zavedenie štandardného p53 by mohlo vyvolať diferenciáciu a zvýšenie podielu buniek v G[ versus S + G₂ pre leukemické K562 bunky, žiadny p53 špecifický účinok nebol v tejto línii nájdený. Horvath a Weber (1988) uviedli, že lymfocyty ľudskej periférnej krvi sú vysoko nepermisívne v adenovírusovej infekcii. V separátnych pokusoch rekombinant významne infikuje nezodpovadajúce K562 bunky s rekombinantným A/C/B-gal adenovirusom, zatiaľčo ostatné bunkové línie, zahŕňajúce kontrolnú Hep G2 líniu a tie, ktoré majú silný p53 efekt, boli ľahko infektovateľné. Tak aspoň časť variability účinnosti by sa mohla objaviť vďaka variabilite infekcie, i keď môže obsahovať aj iné faktory.

Výsledky pozorované s A/M/N/53 vírusom na obr. 5 demonštrujú, že je možné kompletné potlačenie v in vivo prostredí. Obnovený rast nádorov v 2 zo 4 pri p53 ošetrených zvieratách pri nižších MOI najpravdepodobnejšie vzniká z malého percenta buniek na počiatku neinfikovaných p53 rekombinantom v tejto dávke. Kompletné potlačenie viditeľné s A/M/N/53 vo vyššej dávke však ukazuje, že schopnosť nádoru obnoviť rast môže byť prekonaná.

p53/adenovírus in vivo účinnosť

Tu predložená práca a práce iných skupín (Chen a spol. (1990), Takahoshi a spol. (1992)), ukázali, že ľudské nádorové bunky postrádajúce expresiu štandardného typu p53 môžu byť ošetrené ex vivo s p53 a viesť k potlačeniu nádorového rastu, ak sú ošetrené bunky transferované do zvieracieho modelu. Prihlasovatelia predkladajú prvú zmienku o nádorovej supresor génovej terapii in vivo ustanoveného nádoru, vedúcu tak k potlačeniu nádorového rastu, ako ku zvýšeniu času prežitia. V prihlasovateľovom systéme doručenie do nádorových buniek nie je založené na priamej injekcii do nádorovej hmoty. Skôr bol p53 rekombinantný adenovírus injektovaný do peritumorálneho priestoru a v nádore bola detegovaná p53 mRNA expresia. p53 exprimovaný rekombinantmi bol funkčný a silne potlačoval rast nádoru v porovnaní s kontrolnými, p53-neexprimujúcim adenovirusom ošetrenými nádormi. Ale tak p53 ako kontrolným vírusom ošetrené nádorové skupiny ukazujú nádorové potlačenie v porovnaní s pufrom ošetrenými kontrolami. Bolo demonštrované, že miestna expresia faktora nádorovej nekrózy (TNF), interferonu-gama, interleukinu (IL)-2, IL-4 alebo IL-7 môže viesť k T-bunkove nezávislému prechodovému nádorovému potlačeniu pri holej myši (Hoch a spol. (1992)). Vystavenie monocytov adenovírusovým virionom sú tiež slabými induktormi IFN-/ (prehľad v práci Gooding a Wold (1990)). Preto nie je prekvapujúce, že určité nádorové potlačenie pri holej myši bolo pozorované aj s kontrolným adenovirusom. Toto vírusom sprostredkované nádorové potlačenie nebolo pozorované v ex vivo kontrolných vírusom ošetrených Saos-2 nádorových bunkách opísaných skôr. p53-špecifické in vivo nádorové potlačenie bolo silne demonštrované pokračovaním sledovania zvierat na obr. 10. Čas prežitia p53-ošetrenej myši bola výrazne zvýšená, 5 z 5 zvierat prežívalo ešte viac než 130 dní od bunkovej inokulácie v porovnaní s 0 z 5 kontrolných zvierat ošetrených adenovirusom. Prežívajúce zvieratá ešte majú rastúce nádory, ktoré môžu pôsobiť bunky na počiatku neinfikované s p53 rekombinantným adenovírusom. Vyšší alebo častejší režim dávkovania ich môže odstrániť. Ďalej promótorové odrezanie (Palmer a spol. (1991)) alebo ďalšie mutácie môžu urobiť tieto bunky rezistentné k p53 rekombinantnému adenovírusovému ošetreniu. Napríklad mutácie v poslednej dobe opísanom WAF1 génu, génu indukovanému štandardným typom p53, ktoré následne inhibujú progresiu bunkového cyklu do S fázy (El-Deiry a spol. (1993), Hunter (1993)) by mohli viesť k p53-rezistentnému nádoru.

Príklad č. 3

Tento príklad ukazuje použitie samovražedných génov a tkanivovo špecifickú expresiu takých génov v metódach génovej terapie, tu opísaných. Hepatocelulárny karcinóm bol zvolený ako cieľ, pretože je jednou z najčastejších ľudských malignáncií postihujúcich človeka a vyvolávajúcich ročne vo svete 1 250 000 úmrtí. Výskyt tejto rakoviny je veľmi vysoký v juhovýchodnej Ázii a Afrike, kde je spojený s infekciou hepatitídou B a C a vystavením aflatoxínu. Chirurgia je v súčasnosti jedinou liečbou, ktorá umožňuje potenciálne uzdravenie z HCC, aj keď je menej než 20 % pacientov považované za kandidátov na resekciu (Ravoet C a spol. 1993). Ale nádory iné než hepatocelulárny karcinóm sú tiež použiteľné na metódy redukcie ich proliferácie, ktoré sú tu opísané.

Bunkové línie

Všetky bunkové línie mimo HLF bunkovej línie boli získané z Američan Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. ATCC prírastkové čísla sú uvedené v zátvorkách. Ľudská embryonálna ľadvinová bunková línia 293/CRL 1573) bola použitá na generovanie a rozmnoženie rekombinantných adenovírusov tu opísaných. Tieto boli udržiavané v DME médiu obsahujúcom 10 % definované, doplnené teľacie sérum (Hyclone). Hepatoceluláme rakovinové bunkové línie Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) a HLF boli udržiavané v DME/F12 médiu doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom, a rovnako tak bunkové línie MDA-MB 468(HTB 132) a BT-549 (HTB 122) rakoviny prsníka. Chang pečeňové bunky (CCL 13) rástli v MEM médiu doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom. HLF bunková línia bola získaná od dr. T. Morsaki a Dr. H. Kitsuku z Kyushu University School of Medicíne v Japonsku.

Konštrukcia rekombinantného vírusu

Dva adenovírusové expresné vektory, označené tu ako ACNTK a AANTK a postrádajúce proteín funkciu (znázornené na obr. 11), sú schopné riadiť expresiu TK samovražedného génu v nádorových bunkách. Tretí adenovirus expresný vektor označený AANCAT bol skonštruovaný na ďalšie demonštrovanie jednoduchosti expresie špecificky cieleného génu k špecifickým bunkovým typom s použitím adenovírusových vektorov. Tieto adenovírusové konštrukty boli zostavené ako je znázornené na obr. 11 a 12 a sú deriváty tých, ktoré boli skôr opísané pre expresiu nádorových supresor génov.

Pre expresiu cudzieho génu boli inzertované expresné kazety, ktoré využívajú buď ľudský cytomegalovírus bezprostredný včasný promotór/enhancer (CMV) (Boshart M. a spol., 1985), alebo ľudský alfa-fetoproteín (AFP) enhancer/promótor (Watanable K. a spol., 1987), Nakabayashi H. a spol., 1989) pre riadenie transkripcie TK génu alebo chloramfenikol acetyltransferasového génu (GAT). CMV enhancer promótor je schopný riadiť robustnú génovú expre siu v mnohých rôznych bunkových typoch, zatiaľčo AFP enhancer/promótor konštrukt obmedzuje expresiu k hepatocelulárnym rakovinovým bunkám (HCC), ktoré exprimujú AFP pri asi 70 - 80 % populácie HCC pacientov. Do konštruktu využívajúcom CMV promotór/enhancer, bola tiež inzertovaná adenovirus typ 2 tripartitný leader sekvencia. Na zvýšenie translácie TK transkriptu (Berkner K.L. a Sharp, 1985). Navyše k E1 delécii, sú oba adenovirus vektory ďalej deletované o 1,9 kilobáz (kb) DNA vo vírusovom E3 regióne. DNA deletovaná v E3 regióne nie je podstatná pre rozmnožovanie vírusu a jej delécia zvyšuje inzertnú kapacitu rekombinantného vírusu pre cudziu DNA v ekvivalentnom množstve (1,9 kb) (Graham a Prevec, 1991).

Na demonštrovanie špecifity AFP promótora/enhancer, bol tiež skonštruovaný vírus AANCAT, kde je marker gén chloramfenikol acetyltransferásy (CAT) pod kontrolou AFP enhancer/ promótora. V ACNTK vírusovom konštrukte bola Ad2 tripartitný leader sekvencia umiestnená medzi CMV promotór/enhancer a TK gén. Tripartitný leader bol uvádzaný ako zvyšujúci transláciu pripojených génov. E1 substitúcia zhoršuje schopnosť rekombinantných vírusov k replikácii, obmedzuje ich pomnoženie k 293 bunkám, ktoré dopĺňajú Ad5 E1 génové produkty do trans (Graham a spol., 1977).

Adenovírusový vektor ACNTK: Plazmid pMLBKTK v E. coli HB101 (z ATCC č. 39369) sa použije ako zdroj herpes simplex vírus (HSV-1) tymidín kinázového (TK) génu. TK sa vyreže z plazmidu ako 1,7 kb génový fragment štiepením s reštrikčnými enzýmami Bgl II a pVU II a subklonuje sa do kompatibilných Bam Hl, EcoR V reštrikčných miest plazmidu pSP72 (Promega) s použitím štandardných techník klonovania (Sambrook a spol., 1989). TK inzert sa potom izoluje ako 1,7 kg fragment z tohto vektora štiepením s Xba I a Bgl II a klonuje do Xba I, BamHI štiepeného plazmidu pACN (Wills a spol., 1994). Dvadsať (20) pg tohto plazmidu označeného pACNTK sa linearizuje s Eco RI a kontransfektuje do 293 buniek (ATCC CRL 1573) s 5 pg Cla I štiepeného ACBGL (Wills a spol., 1994 supra) s použitím CaPO₄ transfekčného kitu (Stratagene, San Diego, Kalifornie). Virálne plaky boli izolované a rekombinanty, označené ACNTK, boli identifikované reštrikčnou štiepnou analýzou izolovanej DNA pomocou Xho I a Bsi WI. Pozitívne rekombinanty boli ďalej čistené obmedzujúcim riedením a expandované a titrované štandardnými metódami (Graham a Prevec, 1991).

Adenovírusový vektor AANTK: α-fetoproteín promótor (AFP-P) a enhancer (AFP-E) boli klonované z ľudskej genomickej cDNA (Clontech) s použitím PCR amplifikácie s primármi, obsahujúcimi reštrikčné miesta na svojich koncoch. Priméry použité na izoláciu 210 bp AFP-E obsahovali Nhe I reštrikčné miesto na 5' primére a Xba I, Xho I, Κηρ I linker na 3' pri-mére. 5' primérová sekvencia bola 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3'. 5' primérová sekvencia bola 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG - 3'. Priméry použité na izoláciu 1763 bp AFE fragmentu obsahovali Not I reštrikčné miesto na 5' primére a Xba I miesto na 3' primére. 5' primérová sekvencia bola 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA - 3’. Pre PCR amplifikáciu bola DNA denaturovaná pri 97° 7 minút, s nasledujúcimi 5 cyklami amplifikáce pri 97°, 1 min, 53°, 1 min, 72°, 2 min a nakoniec 72°, 10 minút predlžovania. Amplifikovaný AFE bol štiepaný s Not I a Xba I a inzertovaný do Not I, Xba I miesta plazmidového vektora (pA/ITR/B) obsahujúceho adenovirus typ 5 sekvencie 1-350 a 3330-5790 oddelené polylinkerom, obsahujúcim Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Κρη I, Bam Hl, Nco I, Srna I, a Bgl II miesta.

Amplifikovaný AFP-E bol štiepený s Nhe I a Κρη I a inzertovaný do AFP-E obsahujúceho konštrukt opísaný skôr, ktorý bol štiepený s Xba I a Κρη I. Tento nový konštrukt bol potom ďalej štiepený s Xba I a Ngo Mi pre odstránenie adenovírusových sekvencii 3330-5780, ktoré boli následne nahradené s Xba I, NgoMI reštrikčným fragmentom plazmidu pACN, obsahujúcim nukleotidy 4021-10457 adenovírusu typu 2 pre konštrukciu plazmidu pAAN, obsahujúceho tak α-fetoproteínový enhancer, ako promótor. Tento konštrukt bol potom štiepený s Eco RI a Xba I na izoláciu 2,3 kb fragmentu obsahujúceho Ad5 invertované koncové opakovanie, AFP-E a AFP-P, ktoré bolo následne ligované s 8,55 kb fragmentom Eco RI, Xba I štiepeného pACNTK opísaného skôr na prípravu pAANTK, kde TK gén je riadený α-fetoproteín enhancerom a promótorom v adenovírusovom základe. Tento plazmid bol potom linearizovaný s Eco RI a kotransfektovaný s veľkým fragmentom Cla I štiepeného ALBGL ako vyššie a boli izolované a čistené rekombinanty, označené AANTK, ako je opísané skôr.

Adenovírusový vektor AANCAT: chloramfenikol acetyltransferasový (CAT) gén bol izolovaný z pCAT-Basic Vektor (Promega Corporation) štiepením Xba I, Bam Hl. Tento 1,64 kb fragment bol ligovaný do Xba I, Bam Hl, štiepeného pAAN (opísaný vyššie) na vytvorenie pAANCAT. Tento plazmid bol potom linearizovaný s Eco RI a kotransfektovaný s veľkým fragmentom Cla I štiepeným ra/C/B-gal na vytvorenie AANCAT.

Expresia reportér génu: β-Galaktozidázová expresia

Bunky boli umiestnené v množstve 1 x 10⁵ buniek/jamka na 24-jamkovú tkaninovú kultivačnú platňu (Costar) a ponechané cez noc adherovať (37 °C, 7 % O₂). Infekcie ACBGL počas noci boli uskutočnené pri multiplicite infekcie (MOI) 30. Po 24 hodinách sa bunky fixujú s 3,7 % formaldehydom, PBS a vyfarbené s 1 mg/ml Xgal činidla (USB). Dáta boli hodnotené (+, ++, +++) vyhodnotením percenta pozitívne vyfarbených buniek pri každej MOI (+ = 1 - 33 %, ++ = 33 - 67 % a +++ = 67 %).

Expresia reportér génu: CAT expresia

Dva (2) x 10⁶ buniek (hep G2, Hep 3B, HLF, Chang a MDA-MB468) bolo vysiatych na 10 cm platne (trojmo) a inkubovaných cez noc (37 °C, 7 % CO₂). Každá platňa potom bola infikovaná buď s AANCAT pri MOI = 30 alebo 100 alebo neinfikovaná a ponechaná inkubovať 3 dní. Bunky boli potom tryptinizované a premyté PBS a rcsuspendované v 100 μΐ 0,25 M Tris pH 7,8. Vzorky boli zmrazené a 3 x ponechané roztopiť a supematant bol prenesený do nových skúmaviek a inkubovaný pri 60 °C 10 minút. Vzorky potom boli rozvírené pri 4 °C počas 5 minút a suspemanty sledované na koncentráciu proteínu s použitím Bradfordovej eseje (Βίο-Rad Proteín Assay Kit). Vzorky boli upravené na rovnaké koncentrácie proteínu v konečnom objeme 75 μΐ s použitím 0,25 M Tris, 25 μΐ 4 mM acetyl CoA a 1 μΐ ¹⁴C - chloramfenikolu a inkubované cez noc pri 37 °C. Ku každej vzorke bolo pridané 500 μΐ etylacetátu a miešané vortexovaním s nasledujúcim odstreďovaním počas 5 minút pri teplote miestnosti. Horná fáza sa potom prenesie do novej skúmavky a etylacetát sa odparí odstreďovaním vo vákuu. Reakčné produkty sa potom znovu rozpustia v 25 μΐ etylacetátu a nanesú na dosku pre chromatografiu na tenkej vrstve (TLC) a doska sa potom umiestni do TLC komory vopred ekvilibrovanej (95 % chloroform, 5 % metanol). Rozpúšťadlo sa nechá migrovať na koniec dosky a doska sa potom suší a vystaví rentgenovému filmu.

Bunková proliferácia: Inkorporácia ³H-tymidínu

Bunky sa umiestnia v množstve 5 x 10³ buniek/jamka na 96-jamkovú mikrotitračnú platňu (Costar) a nechajú sa inkubovať cez noc (37 °C, 7 % CO2) . Sériovo riedený ACN,ACNTK alebo AATK vírus v DMEM, 15 % FBS, 1 % glutamín sa použije na transfektovanie buniek pri multiciplite infekcie 30 počas noci, potom sa k bunkám dávkuje (trojmo) ganciclovírus (Cytovene) v log intervaloch medzi 0,001 a 100 mM (mikromolárny). Do každej jamky sa 12 - 18 h pred žobraním pridá 1 pCi ³H-tymidínu (Amersham). 72 hodín po infekcii sa bunky zobrali na filtre zo sklenených vlákien a inkorporovaný ³H-tymidín bol spočítaný s použitím kapalinovej scintilácie (Top Count, Packard). Výsledky sú graficky vyjadrené ako percentá proliferácie neošetrenej kontroly a vyjadrené tabeláme ako účinná dávka (ED5()SD) pre 50 percentnú redukciu proliferácie vzhľadom na kontrolné médium. ED₅₀ hodnoty boli hodnotené s použitím logistickej rovnice pre hodnoty závislosti od dávky.

Cytotoxicita: Uvoľnenie LDH

Bunky (HLF, ľudský HCC) boli umiestnené na platňu, infikované s ACN alebo ACNTK a ošetrené s ganciclovírusom ako je opísané pre proliferačnú esej. 72 hodín po podaní ganciclovírusu boli bunky rozvírené, supematant bol odstránený. Hladiny laktát dehydrogenázy boli namerané kolorimetricky (Promega, Cytotox 96 %™). Priemerné uvoľnenie LDH (+/- S. D.) je graficky vynesené v závislosti od M. 0.1.

Terapia in vivo

Ľudské hepatoceluláme karcinómové bunky (Hep 3B) boli injektované do desiatich samíc (10) athymickej nu/nu myši (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Každé zviera dostalo približne 1 x 10 buniek do ľavého boku. Nádory boli ponechané rásť počas 27 dní pred náhodným hodnotením myši na veľkosť nádoru. Myši boli ošetrené intratumorálnymi a peritumorálnymi injekciami ACNTK alebo kontrolného vírusu ACN (1 x 10⁵ iu v 100 μΐ) každý ďalší deň v celkom troch dávkach. Za 24 hodín po počiatočnej dávke adenovírusu bolo započaté s intraperitoneálnym dávkovaním ganciclovírusu myši (Cytovene 100 mg/kg) denne po celkom 10 dní. Myši boli sledované na veľkosť nádoru a telesnú hmotnosť dvakrát týždenne. Merania nádorov boli uskutočňované trojrozmerne s použitím noniových hmatadiel a objemy boli vypočítané s použitím vzorca 4/3 r³, kde r je polovica priemeru rozmeru nádoru.

Výsledky:

Rekombinantné adenovírusy boli použité na infikovanie troch HCC bunkových línií (HLF, Hep 3B a Hep-G2). Jedna ľudská pečeňová bunková línia (Chang) a dve bunkové línie rakoviny prsníka (MDAMB 468 a BT 549) boli použité ako kontroly. Na demonštrovanie špecifity AFP promótor/enhancer, bol skonštruovaný AANCAT. Tento vírus bol použitý na infekciu buniek, ktoré buď exprimujú (Hep 3B, Hep G2), alebo ncexprimujú (HLE, Chang, MDAMB 468) HCC nádorový marker α-fetoproteín (AFP). Ako je uvedené na obr. 13, AANCAT riadi expresiu CAT marker génu iba v tých HCC bunkách, ktoré sú schopné expresie AFP (obr. 13).

Účinnosť ACNTK a AANTK na liečenie HCC bola hodnotená s použitím ³H-tymidín inkorporačnej eseje na meranie účinku kombinácie HSV-TK expresie a ošetrenia ganciclovírusom po bunkovej proliferácii. Bunkové línie boli infikované buď ACNTK, alebo AANTK, alebo kontrolným vírusom ACN (Wills a spol., 1994, supra), ktorý neriadi expresiu HSV-TK a potom ošetrené so stúpajúcimi koncentráciami ganciclovírusu. Účinok tohto ošetrenia bol hodnotený ako funkcia zvyšujúcich sa koncentrácií ganciclovírusu a bola stanovená koncentrácia ganciclovírusu vyžadovaná pre inhibíciu ³H-tymidínu inkorporovaného z 50 % (ED₅₀). Ďalej relatívna miera adenovírus-sprostredkovaného génového transferu a expresie každej bunkovej línie bola stanovená s použitím kontrolného vírusu, ktorý riadi expresiu marker génu beta-galaktozidázy. Dáta na obr. 14 a v tabuľke 1 ďalej ukazujú, že ACNTK vírus/ganciclovírus kombinačná liečba bola schopná inhibovať bunkovú proliferáciu vo všetkých bunkových skúšaných líniách v porovnaní s kontrolným adenovírusom ACN v kombinácii s ganciclovírusom. Naopak AANTK vírusový vektor bol účinný iba v tých HCC bunkových líniách, ktoré boli demonštrované ako exprimujúce α-fetoproteín. Ďalej bola kombinácia AANTK/GCV omnoho účinnejšia, keď boli bunky umiestnené na platne vo vysokých hustotách.

TABUĽKA č. 1

Bunková línia	aFP	β-gal expresia	ACN	ED50 ACNTK	AANTK
MDAJ4B468	-	*++	>100	2	>100
BT549		*++	>100	<0.3	>100
HLF		+*+	>100	0 . B	>100
CHANG	-	—	>100	22	>100
HEP-3B	-	*	80	a	a
HEP-G2 LOW	-	-	90	2	35
HEP-G2 HIGH	-	-	e9	0.5	4

Holé myši nesúce Hep 3B nádory (N = 5/skupina) boli ošetrené intratumorálne a peritumorálne s ekvivalentnými dávkami ACNTK alebo ACN kontroly. Dvadsaťštyri hodín po prvom podaní rekombinantného adenovírusu sa započalo pri všetkých myšiach s denným ošetrovaním ganciclovírusom. Dvakrát týždenne boli pri všetkých myšiach merané rozmery nádoru pomocou hmatadiel a priemerné veľkosti nádorov sú graficky znázornené na obr. 16. Priemerná veľkosť nádoru v 58. deň bola menšia než pri ACNTK-ošetrených zvieratách, ale rozdiel nebol štatisticky významný (p 0,09, nepárovaný - test). Tieto dáta podporujú špecifický účinok ACNTK na rast nádoru in vivo. Medzi skupinami neboli pozorované žiadne významné rozdiely v priemernej telesnej hmotnosti.

Aj keď vynález bol opísaný vzhľadom na uvedené uskutočnenia, je treba chápať, že sú možné rôzne jeho modifikácie, bez toho aby bola narušená myšlienka vynálezu. V súlade s tým je vynález obmedzený nasledujúcimi nárokmi.

Odkazy: AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.

AMERIČAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.

AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27 (4): 462-467.

AUSTIN, E.A. and HUBER, B. E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.

BACCHETTI, S. AND GRAHAM, F. (1993) Intemational Joumal of Oncology 3:781-788.

BAKER S. J., MARKOWITZ, S., FEARON E. R., WILLSON, J. K. V., AND VOGÉLSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.

BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B., STASKOVÁ, Z., LUKAS, J., REJTHAR, A., KOVARIK, J., MIDGLEY, C. A., GANNON, J. V., A LANE, D. P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.

BERKNER, K. L. a SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:841-857.

BOSHART, M. et al. (1985) Celí 41:521-530.

BRESSAC, B., GALV1N, K.M., LIANG, T. I, ISSELBACHER, K. J., WANDS, J. R., AND OZTURK, M. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.

CARUSO M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028.

CHALLBERG, M. D., KELLY, T. J. (1979) Biochemistry 76:655-659.

CHEN P. L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., AND LEE W. H. (1990) Science 250:1576-1580.

CHEN, Y., CHEN, P. L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D., Al LEE, W. H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.

CHENG, JL, YEE, J. K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T., Al HAAS, M. (1992) Cancer Rcscarch 52:222-226.

COLBY, W. W. Al SHENK, T. J. (1981) Virology 39:977-980.

CULVER ET AL. (1991) 'P. N. A. S. (U.S.A.) 88:3155-3159.

CULVER, K. W. et al. (1992) Science 256:1550-1552.

DEMETRI et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7 (10) :1545-1553.

DILLER, L., etal (1990) Mol. Celí. Biology 10:5772-5781.

EL-DEIRY, W. S., et al. (1993) Celí 75:817-825.

EZZ1D1NE, Z. D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.

FEINSTEIN, E., GALE, R. P., REED, J., A CANAANI, E. (1992) Oncogene 7:1853-1857.

GHOSH-CHOUDHURY, G., HAJ-AHMAD, Y., A GRAHAM, F. L. (1987) EMBO Joumal 6:1733-1739.

GOODING, L. R., A WOLD, W. S. M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.

GRAHAM F. L., P. VAN DER ERB A. J. (1973) Virology 52:456-467.

GRAHAM, F. L. A PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Aoproaches to Immunological Problems. R. W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston. . 363-390.

GRAHAM, F. L., SMILEY, J., RUSSELL, W. C. A NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74.

GRAHAM F. L. A PREVEC L. (1991) Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Vol 7: Gene Transfer and Expression Protocols. Murray E. J. (ed.) The Humana Press Inc., Clifton N. J., Vol 7:109-128.

HEUVEL, s. J. L., LAAR‘, T., KÁST, W. M. MELIEF, C. J. M., ZANTEMA, A., A VAN DER EB, A. J. (1990) EMBO Joumal 9:2621-2629.

HOCK, H., DORSCH, M., KUZENDORF, U., QIN, Z., DIAMANTSTEIN, T„ A BLANKENSTEIN, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2774-2778.

HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGÉLSTEIN, B., A HARRIS, C. (1991) Science 253:49-53.

HOROWITZ, M. S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology. B. N. Fields, ed. (Raven Press, New York). 1679-1721.

HORVATH, J., A WEBER, J. M. (1988) J. Virol. 62:341-345.

HUANG et al. (1991) Náture 350:160-162.

HUBER, B. E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043.

HUNTER, T. (1993) Celí 75:839-841.

JONES, N. A SHENK, T. (1979) Celí 17:683-689.

KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.

KEURBITZ, S. J., PLUNKETT, B. S., WALSH, W. V., A.' KASTAN, M. B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7491-7495.

KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratorv Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1990).

LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12 (2) : 103-111.

LANE, D. P. (1992) Náture 358:15-16.

LANTZ et al. (1990) Cytokine 2(6):402-406.

LARRICK, J. W. a BURCK, K. L. Gene Therapy: Application of Molecular Biology. Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991).

LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.

LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.

LEMARCHAND, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :6482-6486.

LEVINE, A. J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. 1993. 62:623-651.

LOWE S. W., SCHMITT, E. M., SMITH, S. W., OSBORNE, B. A., A JACKS, J. (1993) Náture 362:847-852.

LOWE , S . W. , RULEY, H. E., JACKS, T., AJ HOUSMAN, D. E. (1993) Celí 74:957-967.

MARTIN (1975) In: Remington's Pharm. Sci.. 15th Ed. (MackPubl. Co., Easton).

MERCER, W. E., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6166-6170.

NAKABAYASH1, H. et al. (1989) The Joumal of Biological Chemistry 264:266-271.

PALMER, T. D., ROSMAN, G. J., OSBORNE, W. R., A MILLER, A. D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:1330-1334.

RAO, L., DEBBAS, M., SABEATIN1, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S., A WHITE, E. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746.

RAVOET C. et al. (1993) Joumal of Surgical Oncology Supplement 3:104-111.

RICH, D. P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.

ROSENFELD, M. A., et al. (1992) Celí 68:143-155.

SAMBROOK J., FRITSCH E. F., aMANIATIS T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

SARNOW, P., HO, Y. S., WILLIAMS, J., A LEVINE, A. J. (1982) Celí 28:387-394.

SHAW, P., BOVEY, R., TARDY, S., SAHLI, R., SORDAT, B., A COSTA, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4495-4499.

SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.

SORSCHER, E. J. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.

SPECTOR, D. J. (1983) Virology 130:533-538.

STEWART, P. L. et al. (1993) EMBO Joumal 12:2589-2599.

STRAUS. S. E. (1984) Adenovirus infections in humans. In: The Adenoviruses. Ginsberg HS, ed. New York: Plénum Press, 451 -496.

SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5(8) :472-476.

TAKAHASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.

TAKAHASHI, T., et al.' (1992) Cancer Research 52:2340-2343.

TH1MMAPPAYA, B. et al. (1982) Celí 31:543-551.

WANG, A. M., DOYLE, M. V., A MARK, D. F. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9717-9721.

WATANABLE, K. et al. (1987) The Joumal of Biological Chemistry 262:4812-4818.

WHITE, E., etal. (1992) Mol. Celí. Biol. 12:2570-2580.

WILLS, K. N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088. YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Náture 352:345-347.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantný adenovírusový expresný vektor, zahŕňajúci a) inzert exogénnej DNA, zahŕňajúci gén kódujúci cudzí proteín, a b) adenovírusovú DNA, v ktorej boli vypustené všetky kódujúce sekvencie Ela, Elb a proteínu IX a aspoň časť E3.
2. 2. Vektor podľa nároku 1, kde adenovírusová DNA ďalej zahrnuje deléciu neesenciálnej sekvencie DNA vo včasnej oblasti 3 a/alebo včasnej oblasti 4 adenovírusu.
3. 3. Vektor podľa nároku 1 alebo 2, kde adenovírusová DNA ďalej zahrnuje deléciu až štyridsiatich nukleotidov v smere 3' vzhľadom na deléciu Ela a Elb a proteín IX, pričom exogénna DNA ďalej zahrnuje polyadenylačný signál.
4. 4. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde adenovírusová DNA je adenovírus skupiny C, vybraného zo sérotypu 1, 2, 5 alebo 6.
5. 5. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde génom kódujúcim cudzí proteín je molekula DNA s až 2,6 kilobázami.
6. 6. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde génom kódujúcim cudzí proteín je molekula DNA s až 4,5 kilobázami.
7. 7. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde gén kódujúci cudzí proteín kóduje cudzí funkčný proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment.
8. 8. Vektor podľa nároku 7, kde cudzím funkčným proteínom je tumor supresorový proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment.
9. 9. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde gén kódujúci cudzí proteín kóduje samovražedný proteín alebo jeho funkčný ekvivalent.
10. 10. Vektor podľa nároku 9, kde samovražedným proteínom je tymidín kináza herpes simplex I.
11. 11. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa t ý m , že zahrnuje vektor podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
12. 12. Použitie vektora podľa nároku 1 na prípravu farmaceutického prípravku na génovú terapiu.
13. 13. Použitie vektora podľa nároku 1 na prípravu farmaceutického prípravku na transformáciu hyperproliferatívnej cicavčej bunky.
14. 14. Použitie vektora podľa nároku 1 na prípravu farmaceutického prípravku na liečbu rakoviny.
15. 15. Použitie podľa nároku 14, kde vektor zahrnuje gén kódujúci cudzí funkčný proteín, ktorým je tumor supresorový proteín, a kde rakovina je spojená s nedostatkom endogénneho štandardného tumor supresorového proteínu.
16. 16. Použitie podľa nároku 15, kde rakovinou je nemalobunková rakovina pľúc, malobunková rakovina pľúc, hepatokarcinóm, melanóm, retinoblastóm, nádor prsníka, kolorektálny karcinóm, leukémia, lymfóm, mozgový nádor, cervikálny karcinóm, sarkóm, nádor prostaty, nádor močového mechúra, nádor retikuloendotelových tkanív, Wilmov nádor, astrocytóm, glioblastóm, neuroblastóm, ovariálny karcinóm, osteosarkóm a renálna rakovina.
17. 17. Použitie vektora podľa nároku 1, kde génom kódujúcim cudzí proteín je protinádorový gén, na prípravu far maceutického prípravku na podávanie účinného množstva terapeutického činidla, ktoré je v prítomnosti proti nádorového génu toxické pre bunku, na redukciu proliferácie nádorových buniek pri subjekte.
18. 18. Použitie vektora podľa nároku 1 na prípravu farmaceutického prípravku na inhibíciu proliferácie nádoru u živočícha.
19. 19. Použitie vektora podľa nároku 1, kde gén kódujúci cudzí proteín kóduje tymidín kinázu, na prípravu farmaceutického prípravku na podávanie účinného množstva metabolitu tymidín kinázy alebo jeho funkčného ekvivalentu na redukciu proliferácie nádorových buniek pri subjekte.
20. 20. Použitie podľa nároku 19, kde metabolitom tymidín kinázy je ganciklovir alebo 6-metoxypurín arabinonukleozid, alebo jeho funkčný ekvivalent.
21. 21. Použitie podľa nároku 19, kde nádorové bunky predstavuje hepatocelulárny karcinóm.