CN114728072A - TGF-β多肽 - Google Patents
TGF-β多肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114728072A CN114728072A CN202080074437.3A CN202080074437A CN114728072A CN 114728072 A CN114728072 A CN 114728072A CN 202080074437 A CN202080074437 A CN 202080074437A CN 114728072 A CN114728072 A CN 114728072A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- tgf
- sequence
- seq
- masked
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5418—IL-7
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/545—IL-1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本公开提供转化生长因子β(TGF‑β)多肽构建体和复合物,其可用于例如包括自身免疫疾病在内的疾病的治疗性治疗。还描述了编码所述构建体和复合物的核酸以及在基于细胞的表达系统中制备所述构建体和复合物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月23日提交的美国临时申请号62/925,227的权益,所述申请以引用方式整体并入本文。
通过引用序列表的方式并入
本申请含有以电子方式提交的序列表,其充当纸质副本和计算机可读形式(CRF),并且由名为“123640-8012WO00_seqlist.txt”的文件组成,所述文件创建于2020年10月21日,大小为341,966字节,并且所述序列表以引用方式整体并入本文。
I.引言
A.TGF-β及其作用
转化生长因子β(TGF-β)是属于转化生长因子超家族的细胞因子,所述超家族包含三种哺乳动物(人)同工型,TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β作为前体分子来合成,所述前驱分子除了作为TGF-β的活性形式均二聚化的TGF-β序列以外还含有前肽区域。TGF-β由巨噬细胞和其他细胞类型以潜伏复合物形式分泌,在所述复合物中其与两种其他多肽潜伏TGF-β结合蛋白(LTBP)和潜伏相关肽(LAP)组合。潜伏TGF-β复合物储存在细胞外基质(ECM)中,例如,通过CD36经由血小板反应蛋白-1结合至细胞表面(其中所述复合物可由胞浆素活化)或结合至潜伏转化生长因子β结合蛋白1、2、3和/或4(LTBP1-4)。
在潜伏TGF-β活化之后,观察到TGF-β的生物功能,所述活化响应于ECM扰动受到严格调控。TGF-β可通过多种细胞或组织特异性途径或在多个细胞或组织类型中观察到的途径来活化;然而,此类活化途径背后的完整机制尚不完全清楚。活化剂包括但不限于蛋白酶、整联蛋白、pH和活性氧物种(reactive oxygen species,ROS)。事实上,细胞/组织结合的潜伏TGF-β复合物起到环境扰动的作用、感知并且对环境扰动作出反应,从而以空间和/或时间方式释放活性TGF-β。所释放的TGF-β用于促进或抑制细胞增殖,这取决于其释放的环境。其还募集干细胞/祖细胞来参与组织再生/重塑过程。TGF-β配体表达、生物利用度、活化、受体功能或转录后修饰的异常干扰正常功能,并且可导致与许多疾病相关的病理后果,诸如通过募集过量祖细胞(例如,在骨关节炎或卡-恩二氏病(Camurati–Engelmanndisease)中),或通过将驻留细胞转分化成不利的谱系(例如,在癌症转移或组织/器官纤维化期间,上皮向间质的转变)。Xu等人Bone Research,6(论文编号2)(2018)。
1非整联蛋白依赖性和整联蛋白依赖性活化
a.非整联蛋白依赖性活化
非整联蛋白依赖性的TGF-β活化手段是通过蛋白酶和/或金属蛋白酶、活性含氧物(ROS)和血小板反应蛋白-1等起作用的手段。
胞浆素和若干基质金属蛋白酶(MMP)通过细胞外基质组分的蛋白水解来促进肿瘤入侵和组织重塑。TGF-β可通过将潜伏复合物自基质中释放的此类蛋白酶的作用而变得活化,随后是LAP的蛋白水解以将TGF-β释放给其受体。已知基质金属蛋白酶-9和-2均可裂解潜伏TGF-β。
已经证明在辐射曝露以诱导ROS释放之后,TGF-β可在活体内快速活化。认为ROS会改变LAP与TGF-β之间的相互作用,导致其活化。
已知一种在健康个体的血浆中发现的糖蛋白,血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1),其响应于损伤而增加。TSP-1被认为通过形成与潜伏TGF-β复合物的直接相互作用并且防止其结合至成熟的TGF-β而激活潜伏TGF-β。血小板反应蛋白介导的活化被认为涉及伤口(例如,皮肤伤口)愈合。
b.通过含有α(V)的整联蛋白的活化
已理解整联蛋白并且特别是含有β6、αV和β8的整联蛋白可促成潜伏TGF-β(例如,TGF-β1)活化。活化似乎通过诱导潜伏TGF-β1复合物的构形变化并由此释放活性TGF-β1或通过整联蛋白-蛋白酶依赖性机制而发生。已理解在无蛋白水解的情况下,导致TGF-β1活化的构形变化(尤其在上皮细胞中)通过整联蛋白结合存在于LAP-β1或LAP-β3中的精氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酸细胞黏附基序(RGD基序)而发生。含有RGD基序的LAP由大部分含有αV的整联蛋白所识别。例如,αVβ6整联蛋白可通过结合至存在于LAP-β1和LAP-β3中的RGD基序而活化/释放TGF-β1。另外,整联蛋白-蛋白酶依赖性TGF-β活化可通过在潜伏TGF-β复合物与MMP诸如MMP-2和MMP-9之间产生连接而发生,所述连接可通过潜伏TGF-β复合物的蛋白水解降解来活化TGF-β。
2 TGF-β信号传导和作用
活化的TGF-β在细胞分化以及T-细胞调控中发挥关键作用。参见例如Cold SpringHarborPerspect.Biol.2017;9:a022236和其中的引用。TGF-β通过支持胸腺衍生的Treg(tTreg)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)和CD8α+ T-细胞前体的存活,并且因此促进可由强促效剂配体诱导的T-细胞的发育来促进若干T-细胞谱系的胸腺发育。TGF-β通过促进白细胞介素(interleukin,IL)-7Rα的胸腺细胞表达来支持常规CD8+T细胞。TGF-β还通过促进低亲和力T细胞的IL-7依赖性存活、通过控制胸腺细胞IL-7Rα表达和通过抑制T-细胞受体(TCR)驱动的自身反应性或高亲和力T细胞的活化来调控周围T-细胞稳态。在早期CD8+ T-细胞分化中,TGF-β抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)形成并且促进短寿命的效应细胞(SLEC)的细胞凋亡,同时促进表达CD103的组织驻留记忆(TRM)细胞的分化。虽然TGF-β抑制T辅助1和2(Thelper 1,Th1和T helper 2,Th2)细胞分化,但TGF-β与其他因子一起促进各种T-细胞的发育。TGF-β与IL-2结合促进外周Treg(pTreg)的产生,与IL-6结合促进Th-17细胞的产生,与IL-4结合促进Th9细胞的产生,并且与IL-21和/或23结合促进T滤泡性辅助(Tfh)细胞的产生。
除了对T细胞的作用外,TGF-β还调控多种其他细胞,包括B淋巴细胞或“B细胞”、单核细胞和巨噬细胞。TGF-β通常对B细胞有抑制作用(Li等人,Annual Review ofImmunology.24(1):99–146(2006)和Roes等人,PNAS USA,100(12):7241–7246(2003));抑制B细胞增殖并且诱导未成熟或静息B细胞的细胞凋亡(Arsura,等人,Immunity 5(1):31–40.(1996))。TGF-β对B细胞的至少一部分作用可归因于诱导IKBa,其是一种调控包括IL-1、TNF-a和防御素的细胞因子的产生的NF-κB的抑制剂。参见例如Cold Spring HarborPerspect.Biol.2017;9:a022236和其中的引用。
除了对B细胞的作用外,TGF-β还刺激静息单核细胞并且抑制活化的巨噬细胞。TGF-β展示出已由Toll样受体(“Toll-Like-Receptor,TLR”)配体刺激的巨噬细胞的抑制效应,诸如促炎性反应。在不存在TLR配体或其他细胞因子的情况下,TGF-β刺激促进髓系细胞产生若干炎性细胞因子。已经证明TGF-β将外周血单核细胞和巨噬细胞诱导至组织中并且增强单核细胞黏附性质。TGF-β可诱导趋化性并且增强肥大细胞的粘附性质。参见例如ColdSpring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236和其中的引用。
一旦TGF-β被活化,应理解其可通过细胞表面信号传导受体起作用。当活性TGF-β配体结合至细胞表面上的转化生长因子β受体II(“TβRII”)时,信号传导开始。这种相互作用可引起转化生长因子β受体I(“TβRI”)的募集。TβRII能够单独结合TGF-β1,而TβRI仅可与TβRII协作来结合配体。TβRI被磷酸化并由TβRII激活,由此通过经由R-Smad蛋白(Smad2和Smad3)的募集和磷酸化的典型信号传导通路进行信号传导。那些Smad随后结合至co-Smad(Smad4),并且复合物共同驱动若干基因的转录。参见Smith等人,Clin.Cancer Res.;18(17):4514–21(2012)。TGF-β还可通过由配体占据的受体激活的非典型(非Smad)通路来发出信号,所述通路包括MAP激酶途径的各种分支、Rho样GTP酶信号传导通路和磷脂酸肌醇-3-激酶/AKT通路。通过非典型路径的信号传导可增强、减弱或以其他方式调节下游细胞反应。Zhang Ye,Cell Res.19(1):128-39(2009)。与TβRI和TβRII相比,转化生长因子β受体III(“transforming growth factor beta receptor III,TβRIII”受体或“β聚糖”)不参与TGF-β信号转导,而是充当TGF-β的储存库。
活化因子的扰动、活化的TGF-β的异常水平和/或TGF-β信号传导的变化可产生不受调控的TGF-β信号传导水平,从而可导致若干疾病或复杂疾病状况。事实上,TGF-β已经证明对诸如炎症、自身免疫病症、纤维化、癌症和白内障的不同疾患的作用。
TGF-β在作为涉及诱导耐受性的因子来保持免疫系统稳态并由此影响自身免疫反应方面发挥关键作用。TGF-β可由此引起此类作用的一种机制是通过驱动T-细胞(例如,CD4+、CD8+、CD4-CD8+和CD4-CD8-细胞)分化成调节性T细胞或“T-Reg”细胞(例如,在IL-2存在下)。参见例如Bettini和Vagnali,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1183:1-12(2010)。T-Reg细胞对于保持免疫耐受性至关重要。Josefowicz等人Annu Rev Immunol,30:531–564.(2012)。TGF-β在诱导对于抗原包括自身抗原的耐受性方面的作用使得其成为防止患上诸如关节炎(类风湿性关节炎或“rheumatoid arthritis,RA”)、1型糖尿病(“Type 1diabetes mellitus,T1D”)、多发性硬化(“multiple sclerosis,MS”)和全身性红斑狼疮(“systemic lupuserythematosus,SLE”)的疾病的关键因子。例如,TGF-β的关键功能是调控自身免疫疾病和相关炎性过程。在肠道中尤其如此,TGF-β被认为在诸如炎性肠病或“inflammatory boweldisease,IBD”的疾患中抑制巨噬细胞细胞因子产生和粘膜炎症。Sanjab等人Cold SpringHarbor Perspect.Biol.2017;9:a022236。如同IBD一样,RA是具有针对关节的炎性组分的自身免疫病症。RA由T和/或B细胞的异常反应造成。全身性TGF-β似乎可预防RA的发展。参见Schramm等人,Arthritis Res.Ther.6:R114-R119(2004)和Sanjab等人Cold SpringHarbor Perspect.Biol.2017;9:a022236)和其中引用的参考文献。
已在文献中描述通过螯合TGF-β以便有效地中和其作用来在蛋白质水平上调控TGF-β作用的许多方法。例如,已开发在体内结合、螯合和中和TGF-β的单克隆抗体,诸如针对TGF-β1的美替木单抗(Metelimumab;CAT192),和针对TGF-β的多种同工型的非苏木单抗(Fresolimumab)。另外,还已开发受体陷阱,所述陷阱紧密结合并螯合TGF-β,由此将其螯合并中和(参见例如,Swaagrtra等人,Mol Cancer Ther;11(7):1477-87(2012)和美国专利公布号2018/0327477)。
不同于设计用于结合并螯合TGF-β并且充当TGF-β作用的拮抗剂的如上所述的分子,本文所述的掩蔽的TGF-β复合物提供活性TGF-β多肽(例如,TGF-β信号传导通路激动剂和掩蔽多肽(例如,TGF-β受体片段),其彼此相互作用以便可逆地掩蔽TGF-β多肽序列。掩蔽的TGF-β复合物可包括TGF-β和/或掩蔽多肽的序列变异,所述变异可降低其彼此的亲和力并且促成TGF-β的去掩蔽,允许其通过异质细胞表面受体的结合信号传导(例如,结合至TβRII,随后结合至TβRI以形成异质受体)。一旦形成,对TGF-β具有高亲和力的异质TβRI-TβRII多肽复合物便可有效地与掩蔽多肽竞争。TGF-β和/或其掩蔽多肽的序列变异还可允许避免去掩蔽的TGF-β多肽与其他分子之间的不期望的相互作用。此类序列变异包括减弱与TβRI的结合的TβRII的N末端部分的缺失和/或防止其二聚化的TGF-β序列变异(例如,C77S取代),所述变异限制与非信号传导TβRIII分子的储存库的脱靶结合。除了前述以外,掩蔽的TGF-β构建体和复合物还可包含额外的野生型(wt.)和/或变体免疫调节多肽序列(MOD),其可实质上影响TGF-β结合至靶细胞的结果,包括体外作用和体内作用,诸如治疗结果。
II.发明内容
本公开描述其中TGF-β由另一种多肽掩蔽的构建体(“掩蔽的TGF-β构建体”,参见例如,具有单一多肽链的图1结构A),和其中TGF-β由另一种多肽掩蔽的复合物(“TGF-β多肽复合物”,参见例如,显示出包含两条多肽链的复合物的图1结构B-F)的制备,还可包含额外元件的所述构建体和复合物在本文中统称为“掩蔽的TGF-β构建体和复合物”。掩蔽的TGF-β构建体和复合物围绕支架多肽(例如,免疫球蛋白Fc区)构建并且含有结合至TGF-β的掩蔽多肽序列(“掩蔽多肽序列”、“掩蔽多肽”或“掩蔽序列”)。掩蔽的TGF-β构建体和复合物还可含有一个或多个独立选择的免疫调节多肽序列,诸如野生型或变体IL-2多肽序列。
掩蔽的TGF-β构建体和复合物可在许多哺乳动物细胞类型中表达,因为掩蔽的非靶向TGF-β活性不会像在去掩蔽的TGF-β下所观察到的情况一样不利地影响细胞。
掩蔽的TGF-β构建体可包含以下作为第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的构建体在本文中统称为“掩蔽的TGF-β构建体”,其中掩蔽多肽序列与TGF-β多肽序列彼此结合。所述掩蔽的TGF-β构建体可按例如如下顺序(从N末端至C末端)来组织:
i)支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列;或
ii)第一MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列;或
iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列、任选地一个或多个额外的MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列;
其中掩蔽的TGF-β构建体任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
上述掩蔽的TGF-β构建体的支架多肽可包含导致形成同二聚体的种间或非种间二聚化序列,其中支架多肽序列任选地具有一个或多个彼此的共价连接。
上述掩蔽的TGF-β构建体的支架多肽还可包含种间二聚化序列,并且进一步包含第二多肽,其通过对应种间二聚化序列与第一多肽(如上所述)二聚化以形成掩蔽的TGF-β复合物异二聚体。第二多肽可包含以下结构中的一种:(i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;(ii)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;(iii)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列和独立选择的MOD序列;或(iv)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列,其中第一和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。因此,第二多肽可从N末端至C末端包含以下结构中的一种:(i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;(ii)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;(iii)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列和一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列;或(iv)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;其中第一和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。可选地,掩蔽的TGF-β复合物异二聚体可从N末端至C末端的顺序包含:(i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列;(ii)第一MOD多肽序列、包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列;或(iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列、包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列和TGF-β多肽序列。
掩蔽的TGF-β复合物还可包含第一多肽和第二多肽作为掩蔽的TGF-β复合物异二聚体,其中:
(i)第一多肽包含
a)包含种间二聚化序列的支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列;
(ii)第二多肽包含
a)支架多肽序列,所述支架多肽序列包含第一多肽中的种间二聚化序列的对应种间二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的复合物统称为“掩蔽的TGF-β复合物”,其中掩蔽多肽序列与TGF-β多肽序列在不同多肽链上提供并且彼此结合;
其中种间结合序列与对应种间结合序列在异二聚体中彼此相互作用;并且
其中掩蔽的TGF-β第一多肽和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
TGF-β多肽序列可来源于TGF-β同工型中的任一种,并且可包含限制TGF-β序列二聚化的能力的取代。掩蔽序列可以是例如抗TGF-β抗体序列或TGF-β受体(TβR)胞外结构域序列。当TβR胞外结构域用于掩蔽TGF-β序列时,其可被修饰以避免掩蔽的分子的无意的信号传导(例如,通过缺失与TGF-β序列相互作用不需要的胞外结构域的全部或一部分)。
本公开还描述并提供产生掩蔽的TGF-β构建体和复合物的方法,以及其用于影响各种细胞类型和治疗多种疾病/病症(包括自身免疫和炎性疾病)的方法。本文所述的治疗方法可包括将掩蔽的TGF-β构建体和复合物与可有利于实现所期望的实验室或治疗结果的其他分子共同施用,所述其他分子包括但不限于:免疫调节剂(例如,白细胞介素、细胞因子、趋化因子等);抗体和抗体片段(例如,scFv、纳米抗体等);小分子治疗剂(例如,维生素D或视黄酸);及其组合。
III.附图说明
图1描绘了掩蔽的TGF-β构建体和复合物的一些型式,其中TGF-β受体序列用于掩蔽TGF-β多肽。结构A描绘了具有用于一个或多个独立选择的MOD(例如,一组串联独立选择的MOD)的单一位置的单体构建体。结构B描绘了其中多肽通过其相应Ig Fc序列相互作用的对称同二聚体,所述序列可自发形成连接两个多肽的二硫键。结构C-F描绘其中TGF-β与TGF-β受体序列呈异二聚体的“顺式”(相同多肽)或“反式”(不同多肽)的异二聚体结构。其中可放置一个或多个独立选择的MOD的位置由用对角线或垂直线或方格图案填充的圆圈示出。种间结合对由杵臼结构(knob-in-hole)序列表示,但可以是如下论述的其他序列中的任一种。构建体可能不包括MOD,或可包括一个、两个或两个以上独立选择的MOD序列,包括呈串联形式的MOD序列,所述MOD可在所指示位置提供。示例性MOD包括例如野生型或突变体(例如,对一种或多种特定受体具有降低的亲和力和/或选择性亲和力)PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23 MOD序列。在使用TGF-β受体序列来掩蔽TGF-β多肽的每种情况下,受体多肽可用另一种掩蔽多肽诸如对TGF-β多肽具有亲和力的抗体多肽(例如,scFV或纳米抗体)来替换。支架序列可被连接(例如,通过二硫键)以形成共价连接的同二聚体或共价连接的异二聚体。图中示出的构建体中的任一个可在TGF-β多肽中具有限制其二聚化能力的序列变异(例如,C77S取代)。
图2A至图2H提供了免疫球蛋白Fc多肽的氨基酸序列(aas)(SEQ ID NO:68-83)。
图2I提供了其中信号肽aas 1-22加下划线的人J-链的氨基酸序列(SEQ ID NO:84)。
图2J提供了Ig G1重链恒定区CH1结构域的序列。位置70和72处的丝氨酸残基可分别被谷氨酸和缬氨酸取代(S70E和S72V)以形成MD13样构建体。
图2K提供了来自Igκ和Igλ链的轻链恒定区“CL”结构域的序列。位置68处的丝氨酸和位置70处的苏氨酸可分别被亮氨酸和丝氨酸取代(S68L和T70S)以形成MD13样构建体。
图3提供了TGF-β作为前原蛋白的三种不同同工型和TGF-β3的成熟形式以及成熟蛋白的C77S突变体的序列。
图4提供了TGF-β同工型1-3的比对,其中对应于TGF-β2的成熟形式的残基呈粗体,而TGF-β2的aa残基Lys 25、Cys 77、Ile 92和/或Lys 94及其在TGF-β同工型1和3的其他形式中的对应残基则带下划线但不加粗体。
图5A提供了1型TGF-β受体(TβRI)及其胞外结构域的序列。
图5B提供了2型TGF-β受体(TβRII)、其胞外结构域和胞外结构域片段的序列。同工型B中以粗体和下划线指示的位置是成熟多肽的aas F30、D32、S52、E55和D118,其中任一个可被除了天然存在的aa以外的aa取代。
图5C提供了3型TGF-β受体(TβRIII)的序列。
图6示出了显示出基于荧光细胞计数分析,不同浓度的各种掩蔽的TGF-β构建体和复合物刺激幼稚CD4T细胞上的FoxP3表达的能力的绘图。部分A示出了在细胞培养5天之后在不存在和存在50U/ml所添加的IL-2的情况下,基于指示浓度的TGF-β3或掩蔽的TGF-β3WT构建体(参见图1,结构A)的FoxP3(作为CD4+细胞的百分比)的诱导。部分B示出了用各种浓度的TGF-β3或三种掩蔽的TGF-β3构建体中的一种或带有至少一个N末端wt.或变体IL-2MOD的掩蔽的TGF-β3复合物(关于结构,参见图7G至图7I)处理5天的幼稚T细胞群体中的FoxP3+细胞(作为CD4细胞的百分比)的分布。部分C示出了在存在0.1nM或1000nM浓度的掩蔽的TGF-β3多肽(在图6中的部分B中,结构(i))的情况下,FoxP3+CD4+细胞的诱导。
图7A提供了代表性掩蔽的TGF-β(构建体编号:3470)的aa序列SEQ ID NO:146,其具有图1结构A的总体结构。多肽从N末端至C末端包含:wt.人IL-2(hIL2)、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人单IgG Fc、G4S接头的三个重复序列、具有D118A取代的人TβRII(hTβRII)Δ25序列、G4S接头的五个重复序列以及具有C77S取代的人TGF-β3(hTGF-β3)序列。
图7B提供了代表性掩蔽的TGF-β(构建体编号:3334)的aa序列SEQ ID NO:147,其具有图1结构B的总体结构。形成同二聚体的多肽从N末端至C末端包含:具有H16T和F42A取代的hIL2、G4S的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc、G5S和G4S接头的两个重复序列、hTβRIIΔ25、D118A、G4S的五个重复序列以及hTGF-β3序列。
图7C提供了具有包含第一和第二多肽的图1结构D的总体结构的代表性掩蔽的TGF-β构建体的aa序列。第一多肽构建体编号:3618(SEQ ID NO:148)从N末端至C末端包含:wt hIL-2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc杵臼(knob-in-hole,KiH)多肽链A、G4S接头序列的五个重复序列以及具有C77S取代的hTGF-β3序列。第二多肽(构建体编号:3619)SEQ ID NO:149从N末端至C末端包含:wt.hIL2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc KiH多肽链B、G5S接头和G4S接头的两个重复序列以及hTβRIIΔ25、D118A序列。
图7D提供了具有包含第一和第二多肽的图1结构E的总体结构的代表性掩蔽的TGF-β构建体的aa序列。如上所述的第一多肽(构建体编号:3618)SEQ ID NO:150从N末端至C末端包含:wt hIL-2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc杵臼(KiH)多肽链A、G4S接头序列的五个重复序列以及具有C77S取代的hTGF-β3序列。第二多肽(构建体编号:3855)SEQ ID NO:151从N末端至C末端包含:具有LALA、T366S、L368A和Y407V取代的人IgG1 Fc KiH多肽链B,G4S接头的三个重复序列以及hTβRIIΔ25,D118A序列。
图7E提供了具有包含第一和第二多肽的图1结构F的总体结构的代表性掩蔽的TGF-β构建体的aa序列。第一多肽(构建体编号:3891)SEQ ID NO:152从N末端至C末端包含:具有H16A、F42A的hIL-2,G4S接头序列的三个重复序列,具有LALA和T366W取代的人IgG1Fc杵臼(KiH)多肽链A,G5S和G4S接头的两个重复序列,hTβRIIΔ25,D118A,G4S接头的五个重复序列以及具有C77S取代的hTGF-β3。第二多肽(构建体编号:3664号)SEQ ID NO:153从N末端至C末端包含:具有LALA取代的人IgG1 Fc KiH多肽链B。
图7F提供了具有包含第一和第二多肽的图1结构F的总体结构的代表性掩蔽的TGF-β构建体的aa序列。第一多肽(构建体编号:3715)SEQ ID NO:155从N末端至C末端包含:具有LALA取代的人IgG1 Fc KiH多肽链A、G4S接头的三个重复序列以及人wt IL2序列。第二多肽(构建体编号:3714)SEQ ID NO:156从N末端至C末端包含:具有LALA取代的人IgG1 FcKiH多肽链B、G4S接头的三个重复序列、具有D32N和D118A取代的hTβRIIΔ25、G4S接头序列的五个重复序列以及具有C77S取代的hTGF-β3序列。
图7A至图7F中IL-2序列中的任一个可被除了IL-2以外的MOD或变体MOD取代,由wtIL-2来替换,或由在N88、H16和/或F42处具有取代(例如,N88R、选自H16A或H16T的在H16处的取代和/或选自F42A和F42T的在F42处的取代)的IL-2序列来替换。
图7G提供了代表性掩蔽的TGF-β构建体(构建体编号:3472)的aa序列SEQ ID NO:157,其具有图1结构A的总体结构。多肽从N末端至C末端包含:wt.hIL-2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人单IgG Fc、G4S接头的三个重复序列、具有D32N和D118A取代的人TβRII(hTβRII)Δ25序列、G4S接头的五个重复序列以及具有C77S取代的人TGF-β3(hTGF-β3)序列。
图7H提供了代表性掩蔽的TGF-β构建体(构建体编号:3466)的aa序列SEQ ID NO:158,其具有图1结构A的总体结构。多肽从N末端至C末端包含:wt.hIL2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人单IgG Fc、G4S接头的三个重复序列、具有D118A取代的人TβRII(hTβRII)Δ25序列、G4S接头的五个重复序列以及具有C77S取代的人TGF-β3(hTGF-β3)序列。
图7I提供了代表性掩蔽的TGF-β构建体(构建体编号:3468)的aa序列SEQ ID NO:159,其具有图1结构A的总体结构。多肽从N末端至C末端包含:具有H16T F42A取代的hIL-2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人单IgG Fc、G4S接头的三个重复序列、具有D32N和D118A取代的人TβRII(hTβRII)Δ25序列、G4S接头的五个重复序列以及具有C77S取代的人TGF-β3(hTGF-β3)序列。
图7J提供了具有包含第一和第二多肽的图1结构D的总体结构的代表性掩蔽的TGF-β构建体的aa序列。第一多肽(构建体编号:3618)SEQ ID NO:148从N末端至C末端包含:wt hIL-2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc杵臼(KiH)多肽链A、G4S接头序列的五个重复序列以及具有C77S取代的hTGF-β3序列。第二多肽(构建体编号:3621)SEQID NO:160从N末端至C末端包含:wt.hIL2、G4S接头的三个重复序列、具有LALA取代的人IgG1 Fc KiH多肽链B、G4S接头的三个重复序列以及具有D32N和D118A取代的hTβRIIΔ25序列。
图8示出了一个掩蔽的TGF-β构建体(左侧)和两个掩蔽的TGF-β复合物(中心和右侧)。复合物的样品通过构建编码多肽的核酸载体,转染ExpiCHO细胞和表达多肽来制备。多肽通过蛋白A色谱随后以尺寸排阻色谱来纯化。纯化的蛋白经历SDS-PAGE并且所得凝胶用考马斯蓝染色。NR=未还原或非还原样品,并且R=还原样品(用二硫化物还原剂还原)。
图9示出了成熟TβRII多肽序列中的各种aa取代(参见图5B)对于其针对TβRII和TGF-β3或TGF-β1(表,左上部)的亲和力的作用。图9还示出了那些取代中的三个E55A、D32N和S52L对于TβRII掩蔽的TGF-β构建体与固定的TβRII-Fc受体构建体之间的结合相互作用的作用。受体构建体以TGF-β3在图的右上部的捕获测定型式示出,其中:单Fc是不与其他支架形成种间键的Ig支架,并且抗IL-2是用生物素(B)标记的针对IL-2的抗体。Strep和HRP是用于检测的链霉亲和素和辣根过氧化物酶。在捕获中对结合的作用检测为对于四种掩蔽的构建体中的每一种开发的结合曲线(底部)。参见实施例3。
图10示出了形成掩蔽的TGF-β3复合物PSM-4033-4039的多肽的结构和氨基酸序列。
图11示出了其中PSM-4033-4039用于诱导来自人外周幼稚CD4+T细胞的Foxp3+iTreg的实验的结果。参见实施例4。
图12示出了由PSM-4033-4039诱导的Foxp3+iTreg用于抑制T细胞增殖的实验的结果。参见实施例4。
图13示出了其中PSM-4033-4039用于诱导来自人外周CD4+T细胞(包括幼稚和记忆CD4+T细胞)的Foxp3+iTreg的表达的实验的结果。参见实施例4。
图14A和图14B示出了其中PSM-4033-4039用于诱导来自通过同种异体淋巴细胞反应活化的CD4+T细胞的Foxp3+iTreg的实验的结果。参见实施例4。
图15示出了将PSM-4033-4039以各种浓度静脉内施用于小鼠以测定在注射后至多72小时的不同时间间隔下的小鼠中的血清浓度的实验的结果。参见实施例4。
IV.具体实施方式
A.定义
如本文所用,氨基酸(在单数时缩写为“aa”,除非上下文规定,否则其可以是复数,并且在复数形式中,缩写为“aas”)表示在哺乳动物细胞翻译中掺入多肽和蛋白质中的天然存在的蛋白原性α氨基酸。除非另外陈述:L(Leu,亮氨酸)、A(Ala,丙氨酸)、G(Gly,甘氨酸)、S(Ser,丝氨酸)、V(Val,缬氨酸)、F(Phe,苯丙氨酸)、Y(Tyr,酪氨酸)、H(His,组氨酸)、R(Arg,精氨酸)、N(Asn,天冬酰胺)、E(Glu,谷氨酸)、D(Asp,天冬酰胺)、C(Cys,半胱氨酸)、Q(Gln,谷氨酰胺)、I(Ile,异亮氨酸)、M(Met,蛋氨酸)、P(Pro,脯氨酸)、T(Thr,苏氨酸)、K(Lys,赖氨酸)和W(Trp,色氨酸)。氨基酸还包括氨基酸羟基脯氨酸和硒代半胱氨酸,其出现在哺乳动物细胞中发现的一些蛋白质中。
如本文所用的术语“多肽”、“多肽序列”和“蛋白质”是同义词并且表示通过其C-1羧基与其α胺之间的肽键接合在一起以形成多肽的主链的aas序列。因此,包含MOD多肽序列、支架多肽序列、TGF-β多肽序列和/或掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列)的任何一个或多个的各多肽(例如,第一多肽)包含那些多肽序列中的任何一个或多个作为具有单一连续主链的多肽链。此类多肽(例如,第一多肽)可通过共价键(例如诸如半胱氨酸残基的侧链之间的二硫键)连接至其他多肽。此外,如本文所用,术语“多肽”、“多肽序列”和“蛋白质”包括对于天然序列的修饰,诸如缺失、添加和取代(如本领域技术人员已知,通常在性质上是保守的),只要蛋白质保持所期望的活性。这些修饰可以是故意的,如通过定点诱变,或可以是意外的,诸如通过产生蛋白质的宿主的突变,或归因于PCR扩增或其他重组DNA方法的误差。
当实施方案、权利要求或方面针对特定类型的哺乳动物(例如,人或非人受试者)时,核酸和多肽序列可限于来自那些受试者的序列。除非另外陈述,否则蛋白质(例如,TGF-β、TβR、免疫球蛋白和MOD)的多肽序列是人(智人(Homo Sapiens))序列。
如本文所用,“掩蔽的”表示分子(例如,掩蔽的多肽或掩蔽的蛋白)通过掩蔽分子(例如,多肽、蛋白质或蛋白质片段)结合或以其他方式衔接,所述掩蔽分子限制掩蔽的分子相对于也对所述分子具有亲和力的其他蛋白质(例如,细胞表面受体)的可用性。
如本文所用,术语掩蔽的TGF-β构建体是指包含TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β)多肽序列和结合至或以其他方式与TGF-β多肽相互作用的掩蔽多肽序列两者的单一多肽。除非另外陈述,否则掩蔽的TGF-β构建体包含支架多肽序列并且任选地包含一个或多个独立选择的免疫调节(MOD)多肽序列。
如本文所用,术语掩蔽的TGF-β复合物是指两个或两个以上多肽(通常被布置成同二聚体或异二聚体的称为第一多肽和第二多肽的两个多肽,但可以是高阶多聚体)。掩蔽的TGF-β复合物包含TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β)多肽序列、结合至或以其他方式与TGF-β多肽相互作用的掩蔽多肽序列以及支架多肽,所述支架多肽包含TGF-β复合物的多肽通过其缔合的二聚化或多聚化序列。TGF-β复合物多肽中的任何一个或多个任选地包含一个或多个独立选择的MOD多肽序列。
短语“掩蔽的TGF-β构建体或复合物”是掩蔽的TGF-β构建体或掩蔽的TGF-β复合物的缩写。算是缩写可以其复数形式“掩蔽的TGF-β构建体或复合物”使用。
短语“掩蔽的TGF-β构建体和复合物”是“掩蔽的TGF-β构建体”和“掩蔽的TGF-β复合物”两者的缩写。
如本文所用的二聚化和多聚化序列是允许多肽序列(例如,单独多肽)缔合为二聚体(例如,异二聚体或同二聚体)或多聚体(三个、四个、五个或更多个多肽序列的同或异多聚体)的多肽序列。二聚化和多聚化序列允许序列以非共价方式缔合,其可在一些情况(例如,在多肽之间形成二硫键)下转化为共价复合物。
种间结合序列是允许多肽的不对称配对(异二聚体形成)的二聚化序列。种间结合序列有利于与作为其同源结合伴侣的其对应种间结合序列形成异二聚体(如与形成同二聚体相反)。孔匙(“Key-in-hole或key-into-hole”)Fc多肽对表示种间结合序列及其对应种间结合序列的一个实例。
关于aa序列的野生型(缩写为“wt.”)表示如从上下文中所理解的天然存在的aa序列、或天然存在的aa序列的连续部分,其相对于天然地在活生物体中发现的序列未被改变(其中不具有任何取代、缺失或插入)。特定的天然存在的序列可称为wt.序列以供参考。
如本文所用,“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞,包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)和NK-T细胞。
如本文所用的术语“结合”是指两个分子之间的非共价相互作用,例如,MOD与其共MOD之间的非共价相互作用。非共价结合是指两个分子之间由于例如静电、疏水性、离子和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)而直接缔合。非共价结合相互作用的特征通常在于解离常数(KD)小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10- 11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10-14M或小于10-15M。“特异性结合”通常是指具有至少约10-7M或更大,例如5x10-7M、10-8M、5x10-8M、10-9M和更大的亲和力的结合。“非特异性结合”通常是指以小于约10-7M的亲和力结合(例如,配体与除了其指定结合位点或受体以外的部分的结合)(例如以10-6M、10-5M、10-4M的亲和力结合)。如本文所用,“共价结合”或“共价键”是指两个不同分子之间的一个或多个共价化学键的形成。
“亲和力”是指非共价结合强度,结合亲和力的增加与较低KD相关联。如本文所用,术语“亲和力”是指两种剂(例如抗体与抗原)的可逆结合的平衡常数并且表示为解离常数(KD)。
如本文所用,术语“免疫调节多肽”或MOD包括抗原呈递细胞(APC)(例如,树突状细胞、B细胞等)上的多肽、或APC上的多肽的一部分,其特异性结合T细胞上的同源共免疫调节多肽(“共MOD”),由此提供信号。例如,白细胞介素诸如IL-2或其片段(MOD)与细胞表面IL-2受体(共MOD)的键合为细胞提供信号。MOD包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23、PD-L1以及Fas配体(FAS-L)。MOD还尤其涵盖与存在于T细胞上的共MOD分子特异性结合从而造成由共MOD的信号传导的抗体或抗体序列(例如,纳米抗体)。如本文论述,MOD还包括wt.MOD的变体,包括例如对共MOD具有降低的结合亲和力的变体MOD。此降低的亲和力可采用多种形式。例如,变体IL-2 MOD可对IL-2R的α、β和/或γ链中的一个或多个具有降低的亲和力。如本文所讨论,包含位置16和42处的突变的变体IL-2 MOD可与IL-2R的α链实质上不结合并且对IL-2R的β链表现出降低的亲和力。另外,对于具有多于一种共MOD的MOD(例如,CD80结合至CD28和CTLA-4两者),变体MOD可对共MOD中的一个具有降低的亲和力以使得其优先或选择性地结合其他共MOD。出于本公开的目的,TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)及其片段不被视为MOD。
除非另外指定,否则术语“实质上”意图涵盖“完全地”和“基本上但并非完全地”两者。例如,对IL-2R的α链表现出实质上不结合的变体IL-2 MOD是完全不结合至IL-2R的α链或基本上不结合至IL-2R的α链的IL-2变体MOD。
如本文所用,术语“体内”是指在例如自身免疫患者的体内出现的任何过程或程序。
如本文所用,“体外”是指在体外出现的任何过程或程序,包括可称为离体的程序。
如本文用于描述MOD多肽序列的放置的“串联”表示使两个或两个以上MOD在多肽上彼此相邻地排列,所述MOD至多由接头分隔(例如,不介入支架、掩蔽多肽或TGF-β序列)。
如本文所用,术语“胞外结构域”表示膜蛋白的部分(结构域),其延伸至胞外空间中并且不包括足以使得其锚定在细胞膜中的跨膜结构域部分。
如本文所用的“序列同一性”是两个多核苷酸序列或两个多肽序列之间的aa或核苷酸同一性的量度。陈述蛋白质或多肽序列与另一个多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”意指当比对时在比较两个序列时碱基或氨基酸的百分比相同且处于相同的相对位置中。序列同一性可以许多不同方式确定。为了确定序列同一性,可使用各种便利方法和在万维网的网站上可获得的计算机程序(例如BLA ST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)来比对序列,所述网站包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tool s/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。参见例如Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10。除非另外陈述,否则使用以2019年4月1日公布的NCBI BLAST算法版本BLAST+2.9.0(对于蛋白质,是BLASTP 2.9.0+并且对于核酸,是BLASTN 2.9.0+)进行的比对来测定序列同一性。
如本文所用,“重组”意指特定核酸(DNA或RNA)是克隆、限制、聚合酶链反应(PCR)和/或连接步骤的各种组合的产物,所述组合产生具有与在自然系统中发现的内源性核酸可区分的结构性编码或非编码序列的构建体。编码多肽的DNA序列可由cDNA片段或一系列合成寡核苷酸组装以提供合成核酸,所述合成核酸能够从细胞或无细胞转录和翻译系统中所含的重组转录单元表达。涉及肽、多核苷酸或蛋白质所使用的重组指示其已通过从重组核酸的表达来制备。
如本文所用,关于量所用的术语“约”指示量可变化所示量的10%。例如,“约100”表示90-110的量。当约在范围的情形下使用时,涉及范围的较低量所用的“约”表示较低量包括比范围的较低量低10%的量,并且涉及范围的较高量所用的“约”表示较高量包括比范围的较高量高10%的量。例如,约100至约1000表示范围从90扩展至1100。
术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中用于通常表示获得所期望的药理学和/或生理学作用。所述作用可在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的,并且/或者可在疾病和/或因疾病引起的不良影响的部分或完全治愈方面是治疗性的。如本文所用,“治疗”涵盖哺乳动物中疾病或症状的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病或症状出现于可能倾向于获得所述疾病或症状但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中;(b)抑制疾病或症状,即阻止其发展;和/或(c)缓解疾病,即引起疾病消退。治疗剂(例如,掩蔽的TGF-β构建体或复合物)可在发生疾病或损伤之前、期间或之后施用。尤其关注正在发展的疾病的治疗,其中所述治疗使患者的不期望的临床症状稳定或减轻。此类治疗理想地在患病组织中的功能完全丧失之前进行。治疗性治疗可在疾病的有症状阶段期间并且在一些情况下在疾病的有症状阶段之后施用。
术语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、“宿主(host)”和“患者(patient)”在本文中可互换使用并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠;小鼠)、兔类动物(例如兔)、有蹄类动物(例如奶牛、大鼠、山羊、绵羊、马、猪等)、犬类(例如狗)、猫科动物(例如猫)等(例如人、牛、犬、猫、啮齿动物、鼠类、山羊、猿猴、绵羊、马、兔、猪等)。
必须注意,除非上下文另外明确规定,否则如本文和随附方面和权利要求中所用,单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此,例如,提及“一个Treg”包括复数个此类Treg并且提及“所述TGF-β多肽”包括提及一个或多个TGF-β多肽以及本领域技术人员已知的其等效物等。还应注意,权利要求可被草拟以包括或排除任何任选地存在的要素。因此,本陈述意图充当在权利要求中使用(包含)此类要素(例如,使用诸如“单独”、“仅”等的术语),或将其从权利要求去除的前提基础或作为排除任何特定任选要素的“否定性”限制的基础。
应理解,为明确起见在单独方面或实施方案的情形下描述的本发明的某些特征还可在单一方面或实施例中组合提供,包括随后要求保护的那些。相反,为简洁起见在单一实施方案的情况下描述的本发明的各种特征还可单独或以任何合适的子组合提供。本发明所涉及的实施方案的全部组合明确由本发明包括,并且就如同每一个组合单独地和明确地在本文中公开一般于本文中公开。另外,多个实施方案及其要素的所有子组合也由本发明明确包括,并且就如同每一个此子组合单独地和明确地在本文中公开一般于本文中公开。
本文讨论的公布仅针对其在本申请提交日之前的公开内容。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公布。此外,所提供的公布日期可与实际公布日期有所不同,实际公布日期可能需要独立确认。
B.描述
1引言
TGF-β超家族包括具有生长抑制功能的内源性蛋白质。TGF-β表达的增加或抑制TGF-β作用的细胞机制中的缺陷尤其与由于TGF-β的免疫抑制作用所导致的许多癌症的恶性肿瘤相关联。在自身免疫疾病中还牵涉到TGF-β的免疫抑制功能失调。因为TGF-β是免疫功能的关键调控剂,所以其是许多研究的靶标并且TGF-β及其信号传导通路两者被视为治疗多种疾病包括炎性过程和自身免疫病症的治疗靶标。
有效地制备和递送TGF-β作为治疗剂的能力由于分子毒性和TGF-β受体系统的复杂性而变得复杂化。TGF-β在哺乳动物细胞表达系统中的大量产生受到蛋白质对许多哺乳动物细胞的毒性的限制。经历TGF-β的细胞毒性的细胞包括许多用于产生生物分子的细胞,诸如中国仓鼠卵巢或“CHO”细胞,其是用于商业蛋白质产生的最稳健和常用细胞中的一种。TGF-β作为治疗剂的用途还由于具有约8.59的pI的TGF-β1的高pI(与TGF-β3的约6.1的pI形成对照)而变得复杂化,其稳定性/溶解性在非酸性的条件下受到限制(此类酸性条件通常不适于治疗用途)。另外,相对于TβRII对TGF-β的亲和力(大约1-2μM),存在于哺乳动物系统中的大量高亲和力TβRIII受体(例如,对于TGF-β2,大约5nM)代表显著药效动力学贮库,其限制基于TGF-β的生物制剂接近靶组织。类似地,TβRIII在将TGF-β募集至TβRII/TβRI复合物中的作用可导致TGF-β的显著脱靶递送,伴有非预期、不期望的和甚至有毒性的作用。此类脱靶递送可造成非特异性活化,并且还可导致活性TGF-β的进一步产生,尤其当TGF-β信号传导处于前馈控制下时更是如此,由此产生进一步非预期和不期望的作用。参见例如Jiang等人,Redox Biol.2:267–272(2014)。
TGF-β作为治疗剂的有效用途由于需要向细胞提供额外刺激以引导TGF-β刺激的结果而进一步复杂化。如上所示,细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23、PD-L1以及Fas配体(FAS-L)可对TGF-β的作用具有深远影响。因此,递送TGF-β和呈细胞因子等形式的额外刺激的能力对于实现特定治疗或细胞介导结果(例如,体外或体内)作用可以是有利的。
如以下更详细地讨论,本公开描述能够与带有TβRI和TβRII蛋白的细胞相互作用并且刺激所述细胞上的信号传导的TGF-β多肽的用途。有利地,TGF-β多肽是掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一部分,其是融合蛋白(单一多肽链)或融合蛋白复合物(两条或更多条多肽链),所述融合蛋白或融合蛋白复合物还含有结合并掩蔽围绕支架(例如,一个或两个多肽诸如免疫球蛋白Fc多肽)构建的TGF-β多肽序列(例如,充当掩蔽序列的TβRII序列)的多肽。此类融合蛋白或融合蛋白复合物的实例描绘于图1中。当融合蛋白的TGF-β多肽与例如细胞TβRIII相互作用时,融合蛋白结合并掩蔽TGF-β的部分与TβRIII竞争,从而防止TGF-β螯合于TβRIII储存库中。另外,可有意地使用aa取代改变的掩蔽多肽对TGF-β多肽的亲和力控制掩蔽的多肽对其靶受体(例如,TβRII)的总体效力,如图9中所示。因为TGF-β多肽主要作为二硫化物连接的二聚体结合TβRIII,所以导致螯合的与所述受体的相互作用可通过包括限制二聚化(例如,C77S)或二聚体稳定性的aa取代来减弱,如下讨论。TGF-β融合蛋白或融合蛋白复合物与TβRII的相互作用置换掩蔽序列,从而形成细胞表面结合的TGF-β/TβRII复合物。随后募集TβRI以形成异二聚体TGF-β受体,提供紧密地结合TGF-β(例如,皮摩尔亲和力)的高亲和力复合物,甚至在存在掩蔽多肽序列时还如此。因此,掩蔽的TGF-β仍然能够结合至异二聚体TβRI/TβRII受体复合物并且通过典型Smad蛋白通路、非典型Jun激酶通路和p38信号传导路径进行信号传导。事实上,掩蔽多肽将TGF-β递送至细胞并且将其转移至细胞表面TβRII分子,其随后募集TβRI蛋白,形成有效地将TGF-β多肽保持在适当位置中的功能性和活性信号传导复合物。
除了以避免不期望的脱靶相互作用的形式来递送由TGF-β结合蛋白(例如,TGF-β受体中包含其TGF-β结合胞外结构域的全部或一部分的片段)掩蔽的TGF-β以外,掩蔽的TGF-β构建体或复合物还可包含一个或多个充当免疫调节剂的多肽(“MOD”多肽),其能够影响TGF-β对靶细胞作用的结果。TGF-β与免疫调节剂两者一起递送的能力不仅允许引导TGF-β活化信号的作用,而且相对于施用单独免疫调节剂,其减少对靶细胞产生作用效应所需的免疫调节剂的量。这是通过使两个多肽序列对相同靶细胞上的受体具有亲和力所获得的亲和力增加(通过亲合力增强)的结果。带有一个或多个MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与带有TGF-β多肽和一个或多个MOD两者的受体的靶细胞之间的亲合力的增加(由于MOD与其受体的相互作用导致的增加的结合自由能ΔG所引起)在具有两种类型受体的靶细胞的活化中提供增强的选择性,前提条件为存在次饱和量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物。例如,与缺少IL-2 MOD的在其他方面相同的掩蔽的TGF-β构建体相比,具有IL-2 MOD的诸如图1结构A或图7G的掩蔽的TGF-β构建体是幼稚CD4+细胞的iTReg分化的更有效诱导物,甚至在存在等效(等摩尔)量的IL-2 MOD多肽时也如此。另外,在次饱和剂量下,并且当存在类似数目的细胞类型时,相对于缺少IL-2 MOD的构建体,具有如例如图7G示出的IL-2 MOD的诸如图1结构A中的构建体选择性地结合至具有TGF-β和IL-2受体两者的细胞。
掩蔽的TGF-β构建体或复合物的作用可通过掺入改变个别多肽序列的作用的修饰来进一步指定。在一些实施方案中,可掺入改变TGF-β二聚化的能力的aa取代(例如,TGF-β3中的C77S取代)。因为单体形式的TGF-β对TβRIII展示出极小(如果有的话)亲和力,所以掺入限制TGF-β二聚化能力的突变限制与TβRIII的脱靶结合,从而可将复合物拖至TGF-β“储存库”中并且限制其刺激靶细胞的能力。
还可对除了TGF-β多肽序列以外的多肽序列进行修饰(例如,取代、缺失、插入等),所述序列包括掩蔽多肽序列和免疫调节多肽序列。
除了TGF-β多肽序列的修饰以外,可对结合至TGF-β并将其掩蔽的多肽进行修饰。此类修饰可通过改变掩蔽多肽对TGF-β的亲和力以及掩蔽多肽和TGF-β多肽的呼吸率(缔合和解离率)来改变TGF-β多肽序列的可利用性。虽然两个不同TGF-β多肽/掩蔽多肽复合物可具有相同结合缔合常数(k缔合与k解离的比率),但具有较高k缔合和k解离的复合物可更有效地用于细胞表面TβRII结合,这取决于速率常数、尤其是k解离率。图9提供TβRII中改变对TGF-β1和TGF-β3的亲和力的一些aa取代的清单,以及显示出在不存在或存在各自对TβRII与TGF-β3的结合具有不同影响的三个取代中的一个的情况下,在其他方面相同的TβRII掩蔽的TGF-β构建体的亲和力的图。
虽然可能利用各种多肽来掩蔽TGF-β,包括两种单链抗体序列(例如,人源化单链抗体序列),但可采用结合TGF-β的最小TGF-β受体序列(例如,TβRI、TβRII或TβRIII的胞外结构域)。TβRIII的胞外结构域可用作二聚体TGF-β的掩蔽多肽;然而,其对TGF-β的高亲和力可使得其拮抗TGF-β多肽序列与TβRII的结合。虽然如此,TβRIII掩蔽序列可由对TGF-β多肽具有更高亲和力的细胞表面TβRI/TβRII复合物有效置换,由此允许那些细胞表面受体的激活。
TβRII的胞外结构域可用作掩蔽多肽。在存在或不存在D118A取代的情况下,TβRII的N末端氨基酸(例如,δ14或25)的缺失可产生蛋白质(或多肽),其适于掩蔽具有计算为约4.5至约5.0(例如,约4.7至4.85)的pI的TGF-β。TGF-β1多肽(其具有高pI值)与TβRII掩蔽多肽(例如,包括具有N末端缺失的多肽)的组合可潜在地中和TGF-β1多肽电荷。TβRII(δ25,D118A)/TGFβ1的计算出的pI大约为6.23,其中TGFβ1具有约8.59的pI。相比之下,δ14或δ25TβRII和TGF-β3(具有或不具有D118A和/或C77S取代)的复合物经计算具有约4.9至约5.3的pI值(约5.06至5.17的pI)。另外,虽然将TβRII胞外结构域与活性TGF-β多肽组合可产生一种复合物,其能够与细胞表面TβRI相互作用,由此影响TGF-β的TGF-β信号传导(例如,充当激动剂、部分激动剂、拮抗剂或部分拮抗剂),但掺入限制与TβRI相互作用的aa取代限制或阻断掩蔽的复合物参与主动信号传导的能力。因此,如下讨论,掺入减少或消除与TβRI的结合的具有N末端缺失(例如,14至25aa、Δ14至Δ25的缺失)或取代(例如,在D118处由除了天冬氨酸以外的aa的取代,诸如D118A、D118R等)的TβRII胞外结构域序列可用于掩蔽TGF-β并且防止其中TβRII的N末端是完整的TβRII胞外结构域掩蔽的TGF-β多肽对细胞的刺激。因此,掩蔽的TGF-β复合物,包括其中TGF-β由TβRII的N末端缺失突变体掩蔽的那些复合物,可通过使TGF-β去掩蔽(从掩蔽肽解离或打开折叠的分子),结合至靶细胞的TβRII和TβRI以形成活性异二聚体TβRI/TβRII信号传导复合物来起作用。
TGF-β的掩蔽使得其在哺乳动物细胞(例如,CHO细胞)中以高水平表达而细胞活力不会降低。当通过N末端aa缺失、取代和/或其他突变来阻断掩蔽的TGF-β多肽衔接TβRI时,情况尤其如此。TβRIII相互作用的阻断(例如,通过阻断二聚化)可进一步减少与细胞表达相关的问题。
C.掩蔽的TGF-B构建体和掩蔽的TGF-B复合物
本公开描述掩蔽的TGF-β构建体(参见例如,图1,结构A,具有单一多肽链)和掩蔽的TGF-β复合物(参见例如,图1,结构B-F,具有两条多肽链的复合物)的制备。掩蔽的TGF-β构建体和掩蔽的TGF-β复合物包含至少一个TGF-β多肽序列、至少一个结合至并掩蔽TGF-β多肽的多肽和任选地一个或多个(例如,一个、两个或三个)免疫调节多肽(MOD)作为其组分,其全部在支架结构上组装。虽然掩蔽的TGF-β构建体和掩蔽的TGF-β复合物包含膜结合蛋白(例如,TGF-β受体)的部分,但除非另外陈述,否则其不包含膜锚定结构域部分(例如,足以导致大部分所表达的蛋白质变得锚定在细胞膜(例如,表达的CHO细胞)中的跨膜结构域。
TGF-β构建体和复合物的非限制性实例(包括图1示出的形式的那些)在下文中描述。
掩蔽的TGF-β构建体和复合物的组分,包括MOD、支架、接头、TGF-β多肽和TGF-β掩蔽多肽(例如,单链抗体或TGF-β受体胞外结构域)各自描述于以下章节中。
D.免疫调节多肽序列(“MOD”)
1 MOD掺入掩蔽的TGF-β构建体和复合物中
如上讨论,虽然免疫调节多肽(MOD)不是递送掩蔽的TGF-β多肽或其通过TβRI和TβRII异二聚体受体来活化细胞的能力所必需的,但MOD可实质上影响TGF-β受体活化的结果。因此,可能需要掺入野生型(wt.)或变体MOD(例如,对于也称为“共MOD”、“共免疫调节多肽”或同源共刺激受体或其亚型的特定受体,其展现出降低的亲和力、增加的亲和力或选择性)。虽然TGF-β是免疫调节多肽,但因为其是本文所述的掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的中心元素,所以如本文所用的术语“MOD”不包括TGF-β或其多肽。
适于包含在掩蔽的TGF-β构建体和复合物(例如,同二聚体或异二聚体复合物)的任一者中的MOD包括但不限于如PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23。
在一些情况下,MOD独立地选自成熟PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23多肽或其任一者的片段。掺入掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的MOD多肽序列可仅包含分泌型MOD多肽的一部分或全长成熟MOD蛋白的胞外部分,只要其呈膜锚定形式。因此,例如,掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD多肽序列在一些情况下可排除通常在一些天然存在的MOD中发现的信号肽、跨膜结构域和/或胞内结构域中的一个或多个(例如,每个)。
在一些情况下,适于包含在本公开的掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的MOD多肽序列包含天然存在的MOD的氨基酸序列的全部或一部分(例如,胞外部分)。在其他情况下,适于包含在本公开的掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的MOD包括至少一个(例如,一个、两个、或三个独立选择的)变体MOD,与天然存在的MOD的氨基酸序列相比,其包含至少一个氨基酸插入、取代和/或缺失。
在一些情况下,与对应的天然存在的MOD(例如,不包含存在于变体中的氨基酸取代的MOD)对共MOD的亲和力相比,变体MOD对共MOD表现出较低的结合亲和力。根据亲和力的降低,使用对其共MOD具有降低的亲和力的MOD允许TGF-β多肽对结合相互作用具有更大影响,或甚至支配所述结合相互作用。当TGF-β多肽的结合亲和力高于MOD时,其可驱动掩蔽的TGF-β构建体或复合物与具有TGF-β受体系统(例如,形成高亲和力TGF-β结合异二聚体的TGF-βR1和TGF-βR2)的细胞缔合,同时限制与具有甚至丰富的共MOD但缺少或具有极少TGF-β受体的细胞的脱靶结合。本质上,当TGF-β多肽对其细胞受体的亲和力(例如,结合的ΔG)大于MOD对其共MOD的亲和力(例如,其结合的ΔG)时,TGF-β驱动掩蔽的TGF-β构建体或复合物的结合和特异性。
在一个实施方案中,与掩蔽的TGF-β构建体和复合物相关的任何一个或多个MOD独立地选自由以下组成的组:wt.或变体:PD-L1;FAS-L;IL-1;IL-2;IL-4;IL-6;IL-7;IL-10;IL-15;IL-21;IL-23;及其组合。
在一些情况下,诸如当需要刺激Treg细胞的产生时,存在于掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-2多肽或IL-2变体多肽。IL-2中的序列变异可被选择以将IL-2多肽与掩蔽的TGF-β构建体或复合物的结合偏向于带有IL-2R受体亚基的不同组合的靶细胞。IL-2受体包含共用的IL-2Rγ和两个额外的IL-2Rα和/或IL-2Rβ亚基以形成三聚体(IL-2Rα)2-IL-2Rγ、(IL-2Rβ)2-IL-2Rγ或高亲和力(约10皮摩尔的Kd)IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ受体。α链(CD25)对IL-2是独特的,而β链(CD122)与IL-15受体共用,并且对信号传导至关重要的γ链(CD132)可与其他细胞因子受体链搭配。H16处(例如,H16A或H16T)或F42处(例如,F42A或F42T)的取代可使结合偏向有利于具有IL-2Rβ亚基的受体;并且因此其掺入使结合偏向于展现出β-γ受体((IL-2Rβ)2-IL-2Rγ)的记忆T细胞和NK细胞,或展现出高亲和力α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受体的活化T-细胞和Treg。相比之下,N88处的取代(例如,N88R)减少与IL-2Rβ的结合并且可使结合偏向有利于具有IL-2Rα亚基的受体;并且因此N88处的取代使结合偏向于具有α-γ((IL-2Rα)2-IL-2Rγ))和α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受体的细胞,同时避免具有β-γ受体的细胞的结合和活化。参见例如Skrombolas和Frelinger Expert Rev Clin Immunol.,10(2):207–217(2014)。如在使取代的MOD(诸如具有aa取代的IL-2多肽)结合至其共MOD或展现出共MOD的细胞的情形下所用,偏向表示相对于wt.MOD与相同共MOD之间的相互作用,取代的存在使取代的MOD与共MOD的相互作用的程度发生变化。例如,可包括具有较低副作用特征(例如,更安全)并且是人受试者更好耐受的具有N88处的取代(例如,N88R)的IL-2序列,其具有在H16和/或F42处的上述取代。
在一些情况下,诸如当需要刺激iTreg细胞(CD4+FoxP3+细胞)的产生(例如,以诱导外周耐受性,从而主动地抑制效应T细胞和/或抑制免疫介导的组织破坏)时,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是独立选择的wt.或变体PD-L1 MOD多肽。参见例如Francisco等人,J.Exp.Med.,206(13):3015-3029(2009)。除了wt.或变体PD-L1序列以外,掩蔽的TGF-β构建体或复合物还可包含一个或多个独立选择的wt.或变体IL-2多肽。IL-2中的序列变异可被选择以将IL-2多肽与掩蔽的TGF-β构建体的结合偏向于带有IL-2R受体亚基的不同组合的靶细胞。如上讨论,IL-2变体包括H16处(例如,H16A或H16T)或F42处(例如,F42A或F42T)的取代,其可使结合偏向有利于具有IL-2Rβ亚基的受体;并且/或者减少与IL-2Rβ的结合的具有N88处的取代(例如,N88R)的IL-2是人受试者更好耐受的。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体/-β复合物包含H16T和F42A两者,或H16A和F42取代两者,其中任一对都可与N88(例如,N88R)取代组合。
在一些情况下,诸如当需要刺激Th17细胞的产生时,存在于掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-6多肽或IL-6变体多肽。
在一些情况下,诸如当需要刺激Th9细胞的产生时,存在于掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-4多肽或IL-4变体多肽。参见例如Elyaman等人Immunity.,36(4):623–634,Immunity.(2012)。
在一些情况下,诸如当需要通过控制胸腺细胞IL-7Ra表达来促进低亲和力T细胞的IL-7依赖性存活时,存在于掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-7多肽或IL-7变体多肽。
在一些情况下,诸如当需要刺激T滤泡性辅助(Tfh)细胞的产生时,存在于掩蔽的TGF-β构建体掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-21或IL-23多肽、或IL-21或IL-23多肽的变体。
在一些情况下,诸如当需要诱导耐受性时,存在于掩蔽的TGF-β构建体中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)和/或Fas配体(FasL)多肽的变体。
在一些情况下,诸如当需要抑制II型先天淋巴细胞(ILC2细胞)(例如,抑制哮喘和过敏性炎症)时,存在于掩蔽的TGF-β构建体和复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)是IL-10多肽、或IL-10多肽的变体。参见例如Rajas等人,JAllergy Clin Immunol,139(5):1468(2017);和Ogasawara等人,J Allergy ClinImmunol,141(3):1147–1151(2018)。ILC2细胞的抑制可通过其在体内(在组织或体液中)或在体外(在培养基中)的2型细胞因子IL-5和IL-13的产生减少来评估。IL-10多肽可以是单体异构物,诸如描述于Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)中的IL-10M1分子、或其变体,两者均在下文中讨论。与其生物活性形式是形成由2个IL-10分子和4个IL-10Ra受体链组成的复合物的缠结IL-10肽对的野生型IL-10相比,IL-10M1以30nm的解离常数与可溶性IL-10Ra形成1:1复合物,其在细胞增殖测定中具有生物活性。同上。
2具有降低的亲和力的MOD和变体MOD
对其共MOD展现出降低的亲和力的合适MOD与野生型MOD序列可具有1个氨基酸(aa)至20个aa差异。例如,在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体复合物中的变体MOD多肽序列与相应野生型MOD多肽序列在氨基酸序列上可相差1个aa、2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa或10个aa。作为另一实例,在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD多肽与相应野生型MOD多肽在氨基酸序列上相差11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa。举例而言,在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个aa取代。在一些情况下,与相应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含单个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含2个aa取代(例如,不超过2个aa取代)。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含3个aa取代(例如,不超过3个aa取代)。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含4个aa或5个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含6个aa或7个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含8个aa或9个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含10个aa或11个aa取代(例如,不超过10个aa取代)。
在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含11个aa或12个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含13个aa或14个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含15个aa或16个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含17个aa或18个aa取代。在一些情况下,与对应参考(例如,野生型)MOD序列相比,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD包含19个aa或20个aa取代。
如上讨论,与对应野生型MOD对同源共MOD的亲和力相比,适于包含在掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD可对其同源共MOD展现出降低的亲和力。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD多肽序列对同源共MOD具有1nM至100μM的结合亲和力。例如,在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD多肽序列对同源共MOD具有以下结合亲和力:1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
3测定结合亲和力
介于MOD(例如,MOD多肽)与其同源共MOD之间的结合亲和力可通过生物膜干涉技术(BLI)使用经纯化的MOD和纯化的同源共MOD来测定。包含MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与MOD的同源共MOD之间的结合亲和力还可通过BLI使用纯化的掩蔽TGF-β构建体或复合物和MOD的同源共MOD来测定。BLI方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如Lad等人(2015)J.Biomol.Screen.20(4):498-507;以及Shah和Duncan(2014)J.Vis.Exp.18:e51383。本公开所述的介于MOD与其同源共MOD之间,或介于具有MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与其同源共MOD之间的特异性和相对结合亲和力可使用以下程序来测定。
为了测定介于含有MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与MOD的同源共MOD之间的结合亲和力,BLI测定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)仪器或如下类似仪器进行。将对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,包含野生型MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物)固定在不溶性支持物(“生物传感器”)上。固定的掩蔽TGF-β构建体或复合物是“靶标”。固定可通过将捕获抗体固定至不溶性支持物上来实现,其中捕获抗体固定掩蔽的TGF-β构建体或复合物。例如,当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含Ig Fc支架时,固定可通过将抗Ig Fc(例如,抗人IgG Fc)抗体固定在不溶性支持物上来实现,其中固定的抗Ig Fc抗体结合至并固定掩蔽的TGF-β构建体或复合物。将共MOD以若干不同浓度应用于固定的掩蔽TGF-β构建体或复合物,并且记录仪器的反应。测定在包含25mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1%牛血清白蛋白和0.02%Tween 20非离子清洁剂的液体介质中进行。共MOD与固定的掩蔽TGF-β构建体或复合物的结合在30℃下进行。
作为结合和结合亲和力的阳性对照,可使用抗体(例如,单克隆抗体)。抗体可基于掩蔽的TGF-β构建体或复合物的特定结构来选择(参见例如,图1)。例如,针对TGF-β、TGF-β受体、支架或MOD多肽序列的单克隆抗体(mAb)可用作阳性对照,前提条件是抗体不造成掩蔽的TGF-β构建体或复合物从支持物(生物传感器)上解离。标准曲线可使用抗I类或II类MHC单克隆抗体的连续稀释液生成。共MOD或抗MHC mAb是“分析物”。BLI分析从以下两个表面反射的白光的干涉图型:i)固定的多肽(“靶标”);和ii)内部参考层。结合至生物传感器尖部的分子(“分析物”;例如,共MOD;抗HLA抗体)数目的变化引起干涉图型的偏移;干涉图型的这种偏移可实时测量。描述靶标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语是缔合常数(ka)和解离常数(kd)。这两个术语的比率(kd/a)产生亲和力常数KD。
如上所示,测定介于MOD(例如,IL-2或IL-2变体)与其同源共MOD(例如,IL-2R)之间的结合亲和力还可通过BLI测定。测定类似于如上对于掩蔽的TGF-β构建体或复合物所述的测定。BLI测定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)仪器或如下类似仪器进行。将掩蔽的TGF-β构建体或复合物的组分MOD(例如,本公开的变体IL-2多肽);和对照MOD(其中对照MOD包含野生型MOD,例如野生型IL-2)单独地固定在不溶性支持物(“生物传感器”)上。每个MOD都是“靶标”。固定可通过将捕获抗体固定至不溶性支持物上来实现,其中捕获抗体固定MOD。例如,如果靶标融合至免疫亲和标签(例如FLAG、人IgG Fc等),固定可通过将免疫亲和标签的合适抗体(例如抗人IgG Fc)固定在不溶性支持物上来实现,其中固定的抗体结合至并固定MOD(其中MOD包含IgFc多肽)。共MOD(或多肽)以若干不同浓度应用于固定的MOD,并且记录仪器的反应。可选地,将共MOD(或多肽)固定至生物传感器(例如,对于IL-2受体异三聚体,作为单体亚基、异二聚体子复合物或完整异三聚体),将MOD以若干不同浓度应用于固定的共-MOD,并且记录仪器的反应。测定在包含25mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1%牛血清白蛋白和0.02%Tween 20非离子清洁剂的液体介质中进行。共MOD与固定的MOD的结合在30℃下进行。BLI分析从以下两个表面反射的白光的干涉图型:i)固定的多肽(“靶标”);和ii)内部参考层。结合至生物传感器尖部的分子(“分析物”;例如,共MOD)的数目的变化引起干涉图型的偏移;干涉图型中的此偏移可实时测量。描述靶标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语为缔合常数(ka)和解离常数(kd)。该两个术语的比率(kd/a)产生亲和力常数KD。因此,测定野生型MOD(例如,IL-2)对其共MOD(例如,其同源结合伴侣或受体;在IL-2的情况下,IL-2R),和变体MOD(例如,如本文揭示的IL-2变体)对其共MOD(例如,在IL-2变体的情况下,IL-2R)两者的结合亲和力允许测定变体共MOD如与野生型共MOD相比对共MOD的相对结合亲和力。即,可测定如与野生型MOD对相同同源共MOD的结合亲和力相比,变体MOD对其共MOD的结合亲和力是否降低,并且如果降低,则测定与野生型共MOD的结合亲和力相比降低的百分比。
BLI测定在多孔板中进行。为了操作所述测定,限定板布局,限定测定步骤,并且在Octet Data Acquisition软件中指派生物传感器。使生物传感器组件水合。将经水合的生物传感器组件和测定板在Octet仪器上平衡10分钟。一旦获取数据,即将所获取的数据加载至Octet Data Analysis软件中。在处理窗口中通过指定用于参考减法、y轴对齐、步间校正和Savitzky-Golay滤波的方法来处理数据。在分析窗口中通过指定分析(缔合和解离)的步骤、选择曲线拟合模型(1:1)、拟合方法(全域)和目标窗口(以秒计)来分析数据。评价拟合质量。如果在3倍范围内,则对每个数据追踪(分析物浓度)的KD值取平均值。KD误差值应处于亲和力常数值的一个数量级内;R2值应高于0.95。参见例如Abdiche等人.(2008)J.Anal.Biochem.377:209。
在一些情况下,i)对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物(其中对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含野生型MOD)与同源共MOD的结合亲和力同ii)包含野生型MOD变体的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与同源共MOD的结合亲和力的比率当通过BLI(如上所述)测量时为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。在一些情况下,i)对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物(其中对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含野生型MOD)与同源共MOD的结合亲和力同ii)包含野生型MOD变体的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与同源共MOD的结合亲和力的比率当通过BLI测量时在1.5:1至106:1的范围内,例如,1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1、或105:1至106:1。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD对同源共MOD具有1nM至100μM、或100nM至100μM的结合亲和力。例如,在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD对同源共MOD具有以下结合亲和力:约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD对同源共MOD具有约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、或约50nM至约100nM的结合亲和力。
4PD-L1及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是PD-L1或变体PD-L1多肽。野生型PD-L1结合至PD1。
野生型人PD-L1多肽可包含以下氨基酸序列:MRIFAVFIFM T YWHLLNAFTVTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AA LIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKDQLSL GNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYN KINQR ILVVDPVTSEHELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSG KTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENHTAELVIPGNI LNVSIKICLT LSPST(SEQ ID NO:1);其中aas 1-18形成信号序列,aas 19-127形成Ig样V型或IgV结构域,并且133-225是Ig样C2型结构域。
野生型人PD-L1胞外结构域可包含以下氨基酸序列:FT VTVP KDLYVV EYGSNMTIECKFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQ FVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVT SE HELTCQAEGY PKAEVIWTSSDHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVS IKI(SEQ ID NO:2);其中aas 1-109形成Ig样V型或“IgV”结构域,并且aas 115-207是Ig样C2型结构域。
适合用作MOD的野生型PD-L1IgV结构域可包含SEQ ID No.1的aa 18、aas IgV aas19-127,和羧基末端稳定化序列,诸如例如所述序列的最后七个氨基酸(粗体和斜体): 当羧基稳定序列包含在约aa122处的组氨酸(例如,作为SEQ ID NO:138的aa 117出现的tyr(Y)的C末端侧约5个残基处的组氨酸)时,组氨酸可与aas 82和83(在SEQ ID NO:138中呈粗体和斜体(SEQ ID NO:1的Q107和L106)处的主链酰胺形成稳定静电键。作为替代方案,稳定二硫键可通过取代aas 82或83)(SEQ ID NO:1的Q107和L106)之一和aa残基121、122或123(相当于SEQ ID NO:1的aa位置139-141)之一而形成。
野生型PD-1多肽可包含以下氨基酸序列:PGWFLDSPDR PWN PPTFSPA LLVVTEGDNATFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQT DKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGSLVLLVWVLAV ICSRAARGTI G ARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCS WPL(SEQ ID NO:3)。
在一些情况下,变体PD-L1多肽(例如,SEQ ID NO:2的变体或PD-L1的IgV结构域)表现出与PD-1(例如,包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的PD-1多肽)的结合亲和力同包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列示的氨基酸序列的PD-L1多肽的结合亲和力相比有所降低。例如,在一些情况下,变体PD-L1多肽结合PD-1(例如,包含SEQ ID NO:3中列示的氨基酸序列的PD-1多肽)的结合亲和力比包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列示的氨基酸序列的PD-L1多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体PD-L1多肽(例如,SEQ ID NO:2的变体或其IgV域)对PD-1(例如SEQ ID NO:3)具有1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)的结合亲和力。作为另一个实例,在一些情况下,变体PD-L1多肽(例如SEQ ID NO:2的变体)对PD1(例如,包含SEQ ID NO:3中列示的氨基酸序列的PD1多肽)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
可在用作MOD的PD-L1胞外结构域序列中制造许多aa取代,包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1的aas 19-127(IgV域)和SEQ ID NO:138中任一个的至少85个连续aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105个连续aas)具有大于90%(95%、98%或99%)序列同一性的序列的取代。取代可包括(a)二硫键取代对D103C和G33C,或V104和S34C;(b)盐桥形成取代对Q107D和K62R或Q107D和S80R;和/或(c)Pi堆叠取代M36Y或M36F(基于SEQ ID NO:1)。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:2的至少85个连续aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105个连续aas)和至少一个二硫化物、盐桥或Pi堆叠取代的序列。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:1的aas 19-127(IgV域)的至少85个连续aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105个连续aas)和至少一个二硫化物、盐桥或Pi堆叠取代的序列。PD-L1 MOD序列可包含具有aas SEQ ID NO:138的至少85个连续aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105个连续aas)和至少一个二硫化物、盐桥或Pi堆叠取代的序列。
在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有单个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列示的PD-L1氨基酸序列或PD-L1的IgV域相比,变体PD-L1多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:2(例如,其具有至少一个aa插入、缺失或取代)的至少170个连续aa(例如,至少180、190或200个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。合适的变体PD-L1IgV多肽序列包括与SEQ ID NO:2的aas 1-109(例如,其具有至少一个aa插入、缺失或取代)的至少70个连续aa(例如,至少80、90、100或105个连续aas)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
在一个实例中,变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:2具有至少90%(例如,至少95%、98%或99%)或100%aa序列同一性的多肽序列,其中位置8处的残基是除D以外的aa;在一个此类实例中,所述残基是A,并且在另一个实例中,所述残基是R。变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:2具有至少90%(例如,至少95%、98%或99%)或100%aa序列同一性的多肽序列,其中位置36处的残基为除I以外的aa;在一个此类实例中,所述残基是A,并且在另一实例中,所述残基是D。变体PD-L1多肽序列还包括与SEQ ID NO:2具有至少90%(例如,至少95%、98%或99%)或100%aa序列同一性的多肽序列,其中位置54处的残基是除E以外的aa;在一个此类实例中,所述残基是A,并且在另一个实例中,所述残基是R。
5 IL-1及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是IL-1或变体IL-1多肽。野生型IL-1具有两个同工型,即IL-1α和IL-1β,其均结合至IL-1受体。
野生型人IL-1α前体多肽可包含以下氨基酸序列:MAKVPDMF EDL KNCYSENEEDSSSIDHLSLNQK SFYHVSYGPLH EGCMDQ SVSLS ISETSKTSKLT FKESMVVVATN GKVLKKRRLSLSQSIT DDDLEA IANDSEEEIIK PRSAPFSFLSN VKYNFMRIIKY EFILND ALNQS IIRANDQYLTAAALHNLDEAVK FDMGAYKSSKD DAK ITVILRIS KTQLYVTAQDE DQPVLLKEMPE IPKTITGSETN LLFFWETHGTK NYFTSVAHPNL FIATKQDYWVC LAGGPPSITDF Q ILENQA(SEQ ID NO:4)UniProtKB-P01583,NCBI参考序列NP_000566.3,其可具有以下天然存在的变异中的一种或多种:R85Q、A114S、N125D、D138N和D176H。
成熟野生型人IL-1α多肽可包含以下氨基酸序列:PRSAPFSFLS NVKYNFMRIIKYEFILNDAL NQSIIRANDQ YLTAAALHNL DE AVKFDMGA YKSSKDDAKI TVILRISKTQ LYVTAQDEDQPVLL KEMPEI PKTITGSETN LLFFWETHGT KNYFTSVAHP NLFIATK QDY WVCLAGGPPSITDFQILENQ A(SEQ ID NO:5)。
野生型人IL-1β前体多肽可包含以下氨基酸序列:MAEVPELAS E MMAYYSGNEDDLFFEADGPK QMKCSFQDLD LCPLDGGIQL RISDHHYSKG FRQAASVVVA MDKLRKMLVP CPQTFQENDLSTFFPFIFEE EPIFFDTWDN EAYVHDAPVR SLNCTLRDSQ QKS LVMSGPY ELKALHLQGQ DMEQQVVFSMSFVQGEESND KIPV ALGLKE KNLYLSCVLK DDKPTLQLES VDPKNYPKKK MEKRF VFNKIEINNKLEFES AQFPNWYIST SQAENMPVFL GGTKGGQ DIT DFTMQFVSS(SEQ ID NO:6)UniProtKB-P0158,NCBI参考序列NP_000567.1。
成熟野生型人IL-1β多肽可包含以下氨基酸序列APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQ ID NO:7)。
IL-1α和IL-1β结合至IL-1受体,其可具有序列:MKVLLRLICF IALLISSLEADKCKEREEKI ILVSSANEID VRPCPLNPNE HKGT ITWYKD DSKTPVSTEQ ASRIHQHKEK LWFVPAKVEDSGHYY CVVRN SSYCLRIKIS AKFVENEPNL CYNAQAIFKQ KLPVAGD GGL VCPYMEFFKNENNELPKLQW YKDCKPLLLD NIHFSGVK DR LIVMNVAEKH RGNYTCHASY TYLGKQYPIT RVIEFITLEENKPTRPVIVS PANETMEVDL GSQIQLICNV TGQLSDIAYW KW NGSVIDED DPVLGEDYYS VENPANKRRSTLITVLNISE IESRFY KHPF TCFAKNTHGI DAAYIQLIYP VTNFQKHMIG ICVTLTVIIV CSVFIYKIFKIDIVLWYRDS CYDFLPIKAS DGKTYDAYIL YPK TVGEGST SDCDIFVFKV LPEVLEKQCG YKLFIYGRDDYVGED IVEVI NENVKKSRRL IIILVRETSG FSWLGGSSEE QIAMYNALV Q DGIKVVLLELEKIQDYEKMP ESIKFIKQKH GAIRWSGDFT Q GPQSAKTRF WKNVRYHMPV QRRSPSSKHQ LLSPATKEKLQR EAHVPLG,(SEQ ID NO:8),NCBI参考序列NP_000868.1,其中aas 21至569形成成熟多肽,其胞外结构域可用于测定与IL-1α和IL-1β的结合亲和力。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的氨基酸序列的IL-1多肽的结合亲和力相比,变体IL-1α和IL-1β多肽与具有SEQ ID NO:8中列示的序列的IL-1受体或其胞外结构域的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,变体IL-1α和IL-1β多肽结合SEQ ID NO:8中列示的IL-1受体或胞外结构域的成熟蛋白的结合亲和力比包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7中列示的氨基酸序列的IL-1α或IL-1β多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-1α或IL-1β多肽(例如,SEQ ID NO:5或7的变体)对具有SEQID NO:8中列示的序列的IL-1受体具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-1α或IL-1β多肽(例如,SEQ ID NO:5或7的变体)对SEQ ID NO:8中列示的IL-1受体或其胞外结构域具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有单个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的IL-1α或IL-1β氨基酸序列相比,变体IL-1α或IL-1β多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-1α或IL-1β多肽序列包括与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列示的氨基酸序列(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少100个连续aa具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
6 IL-2及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD为IL-2或变体IL-2多肽。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的变体MOD是变体IL-2多肽。野生型IL-2结合至IL-2受体(IL-2R)。野生型IL-2氨基酸序列可如下: (UniProtP60568,SEQ ID NO:9的aa 21-153)。
野生型IL-2结合至细胞表面上的IL-2受体(IL-2R)。在一些情况下,IL-2受体是包含α链(IL-2Rα;也称为CD25)、β链(IL-2Rβ;也称为CD122)和γ链(IL-2Rγ;也称为CD132)的异三聚体多肽。人IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的氨基酸序列可如下。
人IL-2Rα:ELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE CKR GFRRIKS GSLYMLCTGNSSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVT PQPEE QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY HFVVGQMVYY QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTR WTQP QLICTGEMET SQFPGEEKPQASPEGRPESE TSCLVTTTD F QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ VAVAGCVFLL ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI(SEQ ID NO:10)。
人IL-2Rβ:VNG TSQFTCFYNS RANISCVWSQ DGALQDTSC Q VHAWPDRRRW NQTCELLPVSQASWACNLIL GAPDSQKLTT VDIVTLRVLC REGVRWRVMA IQDFKPFENL RLMAPISLQV V HVETHRCNISWEISQASHY FERHLEFEAR TLSPGHTWEE APLL TLKQKQ EWICLETLTP DTQYEFQVRV KPLQGEFTTWSPWSQP LAFR TKPAALGKDT IPWLGHLLVG LSGAFGFIIL VYLLINCRN T GPWLKKVLKCNTPDPSKFFS QLSSEHGGDV QKWLSSPFPS SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ DKVPEPASLSSNHS LTSCFT NQGYFFFHLP DALEIEACQV YFTYDPYSEE DPDEGVA GAP TGSSPQPLQPLSGEDDAYCT FPSRDDLLLF SPSLLGGPSP PSTAPGGSGA GEERMPPSLQ ERVPRDWDPQ PLGPPTPGVPDL VDFQPPPE LVLREAGEEV PDAGPREGVS FPWSRPPGQG EFRA LNARLP LNTDAYLSLQELQGQDPTHL V(SEQ ID NO:11)。
人IL-2Rγ:LNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLP LPEV QCFVFNVEYMNCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDND KVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQSVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW SHPIHWGSNT SKENPFLFAL E AVVISVGSMGLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV TEYH GNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGGALGEGP GASP CNQHSPYWAP PCYTLKPET(SEQ ID NO:12)。
在一些情况下,当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含变体IL-2多肽时,同源共MOD是包含含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一个的氨基酸序列的多肽的IL-2R。
在一些情况下,变体IL-2多肽对IL-2R的结合亲和力与包含SEQ ID NO:9中列示的氨基酸序列的IL-2多肽的结合亲和力相比表现出降低。例如,在一些情况下,当在相同条件下测定时,变体IL-2多肽结合IL-2R的结合亲和力比包含SEQ ID NO:9中列示的氨基酸序列的IL-2多肽对IL-2R(例如,包含含有SEQ ID NO:10-12中列示的氨基酸序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-2多肽(例如,SEQ ID NO:9的变体)对IL-2R(例如,SEQ IDNO:10-12)具有的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-2多肽(例如SEQ ID NO:9的变体)对IL-2R(例如,包含含有SEQ ID NO:10-12中列示的氨基酸序列的多肽的IL-2R)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有单个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有2至10个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有2个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有3个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有4个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有5个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有6个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有7个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有8个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有9个aa取代。在一些情况下,变体IL-2多肽与SEQ ID NO:9中列示的IL-2氨基酸序列相比具有10个aa取代。
合适的变体IL-2多肽序列包括包含与SEQ ID NO:9的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的aa序列的多肽序列。另外,IL-2变体包括包含与以下变体IL-2aa序列(参见SEQ ID NO:13-27)中任一个的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的aa序列的多肽。
其中X(H16)是除His以外的任何氨基酸。在一些情况下,X是Ala(H16A)。在一些情况下,X是Arg。在一些情况下,X是Asn。在一些情况下,X是Asp。在一些情况下,X是Cys。在一些情况下,X是Glu。在一些情况下,X是Gln。在一些情况下,X是Gly。在一些情况下,X是Ile。在一些情况下,X是Lys。在一些情况下,X是Leu。在一些情况下,X是Met。在一些情况下,X是Phe。在一些情况下,X是Pro。在一些情况下,X是Ser。在一些情况下,X是Thr(H16T)。在一些情况下,X是Tyr。在一些情况下,X是Trp。在一些情况下,X是Val。
其中X1(H16)是除His以外的任何氨基酸,并且其中X2(F42)是除Phe以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X1是Ala;并且X2是Ala(H16A、F42A)。在一些情况下,X1是Thr;并且X2是Ala(H16T、F42A)。在一些情况下,X1是Ala;并且X2是Thr(H16A、F42T)。在一些情况下,X1是Thr;并且X2是Thr(H16T、F42T)。
其包含N88R取代,并且其中X1(H 16)是除His以外的任何氨基酸,且其中X2(F42)是除Phe以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X1是Ala;并且X2是Ala。在一些情况下,X1是Thr;并且X2是Ala。在一些情况下,X1是Ala;并且X2是Thr。在一些情况下,X1是Thr;并且X2是Thr。
其中X1是除Glu以外的任何氨基酸;其中X2是除Asp以外的任何氨基酸;并且其中X3是除Phe以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,任何两个或所有三个X1是Ala;X2是 Ala;并且X3是Ala。
其中X1是除His以外的任何氨基酸;其中X2是除Asp以外的任何氨基酸;并且其中X3是除Phe以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X1是Ala;X2是Ala;并且X3是Ala。
其中X1是除Asp以外的任何氨基酸;其中X2是除Phe以外的任何氨基酸;并且其中X3是除Gln以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X1是Ala;X2是Ala;并且X3是Ala。
其中X1是除Asp以外的任何氨基酸;其中X2是除Phe以外的任何氨基酸;并且其中X3是除Tyr以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X1是Ala;X2是Ala;并且X3是Ala。
其中X1是除His以外的任何氨基酸;其中X2是除Asp以外的任何氨基酸;其中X3是除Phe以外的任何氨基酸;并且其中X4是除Tyr以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X4是Ala。在一些情况下,X1是Ala;X2是Ala;X3是Ala;并且X4是Ala。
其中X1是除Asp以外的任何氨基酸;其中X2是除Phe以外的任何氨基酸;其中X3是除Tyr以外的任何氨基酸;并且其中X4是除Gln以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X4是Ala。在一些情况下,X1是Ala;X2是Ala;X3是Ala;并且X4是Ala。
其中X1是除His以外的任何氨基酸;其中X2是除Asp以外的任何氨基酸;其中X3是除Phe以外的任何氨基酸;其中X4是除Tyr以外的任何氨基酸;并且其中X5是除Gln以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,X4是Ala。在一些情况下,X5是Ala。在一些情况下,任何两个、三个、四个或所有五个X1是Ala;X2是Ala;X3是Ala;X4是Ala;并且/或者X5是Ala。
其中X1是除His以外的任何氨基酸;其中X2是除Phe以外的任何氨基酸;并且其中X3是除Gln以外的任何氨基酸。在一些情况下,X1是Ala。在一些情况下,X2是Ala。在一些情况下,X3是Ala。在一些情况下,任何两个或所有三个X1是Ala;X2是Ala;并且/或者X3是Ala。
7IL-4及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是IL-4或变体IL-4多肽。野生型IL-4具有两个同工型,即IL-4α和IL-4β,其均结合至膜结合的IL-4受体(同工型1)或其可溶性对应物(同工型2)。
野生型人IL-4同工型1前体多肽可包含以下氨基酸序列:MGLTSQLLPP LFFLLACAGNFVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCLGATAQQFHRH KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKYSK CSS(SEQ IDNO:28)NCBI参考序列NP_000580.1。
成熟野生型人IL-4同工型1多肽可包含以下氨基酸序列:KCDIT LQEIIKTLNSLTEQKTLCTE LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFYSHHEKDTRCL GATAQQFHRH KQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKYSK CSS(SEQ ID NO:29)。
野生型人IL-4同工型2前体多肽可包含以下氨基酸序列:MGLTSQLLPP LFFLLACAGNFVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRFLKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS,NCBI参考序列:NP_758858.1,(SEQ ID NO:30)。
成熟野生型人IL-4同工型2多肽可包含以下氨基酸序列KCDIT LQEIIKTLNSLTEQKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMRE KYSKCSS(SEQ ID NO:31)。
IL-4同工型1和同工型2均结合至膜结合的IL-4受体(IL-4R)和/或其可溶性同工型2。膜结合的IL-4可具有序列MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMSISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLLWKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPD NYLYNHLTYA VNIWSENDPA DFRIYNVTYLEPSLRIAAST LKSGISYRAR VRAWAQCYNT TWSEWSPSTK WHNSYREPFE QHLLLGVSVS CIVILAVCLLCYVSITKIKK EWWDQIPNPA RSRLVAIIIQ DAQGSQWEKR SRGQEPAKCP HWKNCLTKLL PCFLEHNMKRDEDPHKAAKE MPFQGSGKSA WCPVEISKTV LWPESISVVR CVELFEAPVE CEEEEEVEEE KGSFCASPESSRDDFQEGRE GIVARLTESL FLDLLGEENG GFCQQDMGES CLLPPSGSTS AHMPWDEFPS AGPKEAPPWGKEQPLHLEPS PPASPTQSPD NLTCTETPLV IAGNPAYRSF SNSLSQSPCP RELGPDPLLA RHLEEVEPEMPCVPQLSEPT TVPQPEPETW EQILRRNVLQ HGAAAAPVSA PTSGYQEFVH AVEQGGTQAS AVVGLGPPGEAGYKAFSSLL ASSAVSPEKC GFGASSGEEG YKPFQDLIPG CPGDPAPVPV PLFTGFLDRE PPRSPQSSHLPSSSPEHLGL EPGEKVEDMP KPPLPQEQAT DPLVDSLGSG IVYSALTCHL CGHLKQCHGQ EDGGQTPVMASPCCGCCCGD RSSPPTTPLR APDPSPGGVP LEASLCPASL APSGISEKSK SSSSFHPAPG NAQSSSQTPKIVNFVSVGPT YMRVS,(SEQ ID NO:32),NCBI参考序列NP_000409.1,其中aas 26至825形成成熟多肽,并且aas 233-256是跨膜区;蛋白质的胞外结构域可用于确定与IL-4同工型1或2的结合亲和力。
可溶性同工型2,其具有序列MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMSISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLLWKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPDN YLYNHLTYAVN IWSENDPADFRIYNVTYLEP SLRIAASTLK SGISYRARVRA WAQCYNTTWSE WSPSTKWHNS NIC,(SEQ ID NO:33),UniProtKB-P24394,其还可用于确定两种IL-4同工型的结合亲和力。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的氨基酸序列的IL-4多肽的结合亲和力相比,变体IL-4同工型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31的变体)对SEQID NO:32中列示的成熟IL-4受体序列或其胞外结构域、或SEQ ID NO:33中列示的可溶性IL-4受体的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,变体IL-4同工型1或2多肽结合SEQ ID NO:32(或其胞外结构域)或SEQ ID NO:33中列示的成熟IL-4受体的结合亲和力比包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的氨基酸序列的IL-4同工型1或2多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-4同工型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31的变体)对SEQID NO:32(或其胞外结构域)或SEQ ID NO:33中列示的成熟IL-4受体具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-4同工型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31的变体)对SEQ ID NO:32(或其胞外结构域)或SEQ ID NO:33中列示的成熟IL-4受体具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有单个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列示的IL-4同工型1或2的氨基酸序列相比,变体IL-4同工型1或2多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-4同工型1或2多肽序列包括与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少80个连续aa(例如至少100或110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
8 IL-6及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是IL-6或变体IL-6多肽。野生型IL-6结合至包含α和β(gp130)亚基的IL-6受体,所述亚基形成具有IL-6分子和每个亚基的两个三聚体的信号传导六聚体。参见例如Lacroix等人,J.Biol.Chem.290(45)26943-953(2015)。
野生型人IL-6前体多肽可包含以下氨基酸序列:MNSFSTSAFG PVAFSLGLLLVLPAAFPAPV PPGEDSKDVA APHRQPLTSS ERIDKQIRYI LDGISALRKE TCNKSNMCES SKEALAENNLNLPKMAEKDG CFQSGFNEET CLVKIITGLL EFEVYLEYLQ NRFESSEEQA RAVQMSTKVL IQFLQKKAKNLDAITTPDPT TNASLLTKLQ AQNQWLQDMT THLILRSFKE FLQSSLRALR QM(SEQ ID NO:34)NCBI参考序列NP_000591.1。
成熟野生型人IL-6多肽可包含以下氨基酸序列:VPPGEDSKDVA APHRQPLTSSERIDKQIRYI LDGISALRKE TCNKSNMCES SKEALAENNL NLPKMAEKDG CFQSGFNEET CLVKIITGLLEFEVYLEYLQ NRFESSEEQA RAVQMSTKVL IQFLQKKAKN LDAITTPDPT TNASLLTKLQ AQNQWLQDMTTHLILRSFKE FLQSSLRALR QM(SEQ ID NO:35)。
IL-6结合至膜结合的IL-6受体,所述受体包含α和β亚基。人IL-6Rα亚基可具有序列MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGV EPEDNATVHWVLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLS CFRKSPLSNVVCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIV SMCVASSVGSKFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAE RSKTFTTWMVKDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTP MQALTTNKDDDNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEG KTSMHPPYSLGQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR,(SEQ ID NO:36),NCBI参考序列:NP_000556.1,其中aas 26至825形成成熟多肽,并且aas 233-256是跨膜区。结合IL-6之后,IL6α亚基结合IL-6β亚基。
人IL-6Rβ亚基可具有序列
MLTLQTWLVQ ALFIFLTTES TGELLDPCGY ISPESPVVQL HSNFTAVCVL KEKCMDYFHVNANYIVWKTN HFTIPKEQYT IINRTASSVT FTDIASLNIQ LTCNILTGFQ LEQNVYGITI ISGLPPEKPKNLSCIVNEGK KMRCEWDGGR ETHLETNFTL KSEWATHKFA DCKAKRDTPT SCTVDYSTVY FVNIEVWVEAENALGKVTSD HINFDPVYKV KPNPPHNLSV INSEELSSIL KLTWTNPSIK SVIILKYNIQ YRTKDASTWSQIPPEDTAST RSSFTVQDLK PFTEYVFRIR CMKEDGKGYW SDWSEEASGI TYEDRPSKAP SFWYKIDPSHTQGYRTVQLV WKTLPPFEAN GKILDYEVTL TRWKSHLQNY TVNATKLTVN LTNDRYLATL TVRNLVGKSDAAVLTIPACD FQATHPVMDL KAFPKDNMLW VEWTTPRESV KKYILEWCVL SDKAPCITDW QQEDGTVHRTYLRGNLAESK CYLITVTPVY ADGPGSPESI KAYLKQAPPS KGPTVRTKKV GKNEAVLEWD QLPVDVQNGFIRNYTIFYRT IIGNETAVNV DSSHTEYTLS SLTSDTLYMV RMAAYTDEGG KDGPEFTFTT PKFAQGEIEAIVVPVCLAFL LTTLLGVLFC FNKRDLIKKH IWPNVPDPSK SHIAQWSPHT PPRHNFNSKD QMYSDGNFTDVSVVEIEAND KKPFPEDLKS LDLFKKEKIN TEGHSSGIGG SSCMSSSRPS ISSSDENESS QNTSSTVQYSTVVHSGYRHQ VPSVQVFSRS ESTQPLLDSE ERPEDLQLVD HVDGGDGILP RQQYFKQNCS QHESSPDISHFERSKQVSSV NEEDFVRLKQ QISDHISQSC GSGQMKMFQE VSAADAFGPG TEGQVERFET VGMEAATDEGMPKSYLPQTV RQGGYMPQ,(SEQ ID NO:37),UniProtKB-P40189,其中aas 23至918形成成熟多肽,并且aas 620-641是跨膜区。
作为IL-6结合至膜结合的IL-6Rα亚基的替代方案,其可结合具有以下序列的成熟可溶性形式的IL-6Rα亚基:MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGVEPEDNATVHW VLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLSCFRKSPLSNV VCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIVSMCVASSVGS KFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAERSKTFTTWMV KDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTPMQALTTNKDD DNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEGKTSMHPPYSL GQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR,(SEQ ID NO:38),其中成熟肽包含aas 20至468,UniProtKB-P08887.1。可溶性亚基可替代膜结合的IL-6Rα亚基并且可用于结合亲和力测定。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:35中列示的氨基酸序列的IL-6多肽的结合亲和力相比,变体IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35的变体)对SEQ ID NO:36和37或SEQ ID NO:37和38中列示的成熟IL-6受体的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,变体IL-6多肽结合SEQ ID NO:36和37或SEQ ID NO:37和38中列示的成熟IL-6受体的结合亲和力比包含SEQ ID NO:35中列示的氨基酸序列的IL-6多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35的变体)对SEQ ID NO:36和37或SEQ ID NO:37和38中列示的成熟IL-6受体具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35的变体)对SEQ ID NO:36和37或SEQID NO:37和38中列示的成熟IL-6受体具有的亲和力为100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-6多肽(例如,SEQ IDNO:35的变体)对SEQ ID NO:36和37或SEQ ID NO:37和38中列示的成熟IL-6受体具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有单个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有2个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ IDNO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,变体IL-6多肽与SEQ ID NO:35中列示的IL-6氨基酸序列相比具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-6多肽序列包括与SEQ ID NO:35(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少80个连续aa(例如至少100或110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
9IL-7及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是IL-7或变体IL-7多肽。野生型IL-7具有四个同工型,其全部结合至膜结合的IL-7受体,所述受体具有两个亚基,即阿尔法(α)和共用伽玛(共用-γ)链。
野生型人IL-7同工型1前体多肽可包含以下氨基酸序列:MFHVSFRYIF GLPPLILVLLPVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQFLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ VKGRKPAALG EAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLLQEIKTCWNKI LMGTKEH(SEQ ID NO:39)UniProtKB-P13232,NCBI参考序列NP_000871.1。
成熟野生型人IL-7同工型1多肽可包含以下氨基酸序列:DCDIE GKDGKQYESVLMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEGTTILLNCTGQ VKGRKPAALG EAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLL QEIKTCWNKI LMGTKEH(SEQID NO:40)。
野生型人IL-7同工型2前体多肽可包含以下氨基酸序列:MFHVSFRYIF GLPPLILVLLPVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKVKGR KPAALGEAQPTKSLEENKSL KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH,(SEQ ID NO:41)NCBI参考序列:NP_001186815.1。
成熟野生型人IL-7同工型2多肽可包含以下氨基酸序列:SDCDIE GKDGKQYESVLMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKVKGR KPAALGEAQP TKSLEENKSL KEQKKLNDLCFLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH(SEQ ID NO:42)。
野生型人IL-7同工型3前体多肽可包含以下氨基酸序列:MFHVSFRYIF GLPPLILVLLPVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQFLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ EENKSLKEQK KLNDLCFLKR LLQEIKTCWN KILMGTKEH,(SEQ ID NO:43)NCBI参考序列:NP_001186816.1。
成熟野生型人IL-7同工型3多肽可包含以下氨基酸序列:CDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEGTTILLNCTGQ EENKSLKEQK KLNDLCFLKR LLQEIKTCWN KILMGTKEH(SEQ ID NO:44)。
野生型人IL-7同工型4前体多肽可包含以下氨基酸序列:MFHVSFRYIF GLPPLILVLLPVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLNDLCFLKRLLQE IKTCWNKILM GTKEH,NCBI参考序列:NP_001186817.1(SEQ ID NO:45)。
成熟野生型人IL-7同工型4多肽可包含以下氨基酸序列:SDCDIE GKDGKQYESVLMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLND LCFLKRLLQE IKTCWNKILMGTKEH(SEQ ID NO:46)。
IL-7受体α亚基可具有序列:MTILGTTGFM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSFSCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNITNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVKVGEKSLTCKK IDLTTIVKPE APFDLSVVYR EGANDFVVTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTHVNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSFFSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEVEGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVVITPESFGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDCRESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ(SEQ ID NO:47),NCBI参考序列NP_002176.2,其中aas 21至459形成成熟多肽,并且aas240-264是跨膜区。蛋白质的受体亚基的全部或一部分(例如,胞外结构域(aas 21-239)可与IL-7受体γ亚基一起用于测定与IL-7同工型的结合亲和力。
共用γ亚基(IL-7RG或IL-R7γ)可具有序列MLKPSLPFTS LLFLQLPLLG VGLNTTILTPNGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLPLPEV QCFVFNVEYM NCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQKCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQLELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEWSHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV TEYHGNFSAWSGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASP CNQHSPYWAP PCYTLKPET,NCBI参考序列NP_000197.1,(SEQ ID NO:48),其中aas 23至369形成成熟多肽,并且aas 263-283是跨膜区。蛋白质的受体亚基的全部或一部分(例如,胞外结构域(aas 23-262)可与α亚基一起用于测定与IL-7的结合亲和力。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的氨基酸序列的IL-7多肽的结合亲和力相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽(例如SEQ ID NO:40、42、44或46)对成熟IL-7受体序列(例如,包含SEQ ID NO:47和48中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-7受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽结合包含SEQ ID NO:47和48中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-7受体的结合亲和力比包含SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的氨基酸序列的IL-7同工型1、2、3或4多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽(例如SEQ ID NO:40、42、44或46的变体)与包含SEQ ID NO:47和48中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-7受体具有的结合亲和力为1nM至1mM。在一些情况下,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽(例如SEQID NO:40、42、44或46的变体)与包含SEQ ID NO:47和48中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的成熟IL-7受体具有的结合亲和力为100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽对包含SEQ ID NO:47和48中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的成熟IL-7受体具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有单个aa取代。在一些情况下,与在SEQ IDNO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与在SEQ ID NO:40、42、44或46中列示的IL-7同工型1、2、3或4氨基酸序列相比,变体IL-7同工型1、2、3或4多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-7同工型1、2、3或4多肽序列包括与SEQ ID NO:40、42、44或46(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
10 IL-10及其变体
作为一个非限制性实例,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD或变体MOD是IL-10或变体IL-10多肽,诸如在D与E螺旋之间的铰链区中具有插入的单体IL-10变体,如由Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)所述。野生型IL-10具有同工型,其全部结合至膜结合的IL-10受体,所述受体具有两个阿尔法(α)IL-10RA和贝塔(β)IL-10RB亚基。受体以四聚体形式存在于细胞(例如,B细胞、T细胞、NK细胞、肥大细胞和树突状细胞)的表面上。
野生型人IL-10同工型1前体多肽可包含以下氨基酸序列:MHSSALLCCLVLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQEKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN(SEQ ID NO:49)UniProtKB-P22301,NCBI参考序列NP_000563.1,其可具有H227L序列变异。
成熟野生型人IL-10多肽可包含以下氨基酸序列SP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVNSLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN(SEQ ID NO:50)。
人IL-10多肽可包含以下氨基酸序列MIQFYLEEVM PQAENQDPDI KAHVNSLGENLKTLRLRLRR CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNKLQEKGIY KAMS,UniProtKB-A0A286YEX3 1(SEQID NO:51)。
IL-10多肽可包含介于IL-10多肽的D与E螺旋之间的铰链区中的插入(例如,与SEQID NO:51的E48、N49、K50或S51中的任一个相邻或在SEQ ID NO:49或50的等效位置处的5-7个aa插入),所述插入使得其呈单体形式。单体IL-10多肽可包含介于SEQ ID NO:51的N49与K50之间(或SEQ ID NO:49或50的等效位置)的5-7个aa插入。在实例中,5-7个氨基酸包含Ala、Gly和/或Ser。在一个实例中,5-7个氨基酸选自Ala或Ser。在一个实例中,5-7个aas选自Gly和Ser。在一个实例中,插入包含介于SEQ ID NO:51的N49与K50之间(或SEQ ID NO:49或50的等效位置)的IL-10M1 aa插入(GGGGSGGG SEQ ID NO:142)。在一个实例中,IL-10变体由插入SEQ ID NO:51的aa 49与50之间的IL-10M1(SEQ ID NO:189)GGGSGG组成。参见例如Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)。
IL-10受体α亚基可具有序列:
MLPCLVVLLA ALLSLRLGSD AHGTELPSPP SVWFEAEFFH HILHWTPIPN QSESTCYEVALLRYGIESWN SISNCSQTLS YDLTAVTLDL YHSNGYRARV RAVDGSRHSN WTVTNTRFSV DEVTLTVGSVNLEIHNGFIL GKIQLPRPKM APANDTYESI FSHFREYEIA IRKVPGNFTF THKKVKHENF SLLTSGEVGEFCVQVKPSVA SRSNKGMWSK EECISLTRQY FTVTNVIIFF AFVLLLSGAL AYCLALQLYV RRRKKLPSVLLFKKPSPFIF ISQRPSPETQ DTIHPLDEEA FLKVSPELKN LDLHGSTDSG FGSTKPSLQT EEPQFLLPDPHPQADRTLGN REPPVLGDSC SSGSSNSTDS GICLQEPSLS PSTGPTWEQQ VGSNSRGQDD SGIDLVQNSEGRAGDTQGGS ALGHHSPPEP EVPGEEDPAA VAFQGYLRQT RCAEEKATKT GCLEEESPLT DGLGPKFGRCLVDEAGLHPP ALAKGYLKQD PLEMTLASSG APTGQWNQPT EEWSLLALSS CSDLGISDWS FAHDLAPLGCVAAPGGLLGS FNSDLVTLPL ISSLQSSE,(SEQ ID NO:52),NCBI参考序列NP_001549.2,其中aas21至587形成成熟多肽,并且aas 236-256是跨膜区。蛋白质的受体亚基的全部或一部分(例如,胞外结构域(aas 21-235)可与IL-10受体β亚基一起用于测定与IL-10同工型的结合亲和力。
IL-10受体β亚基可具有序列
MAWSLGSWLG GCLLVSALGM VPPPENVRMN SVNFKNILQW ESPAFAKGNLTFTAQYLSYRIFQDKCMNTT LTECDFSSLS KYGDHTLRVR AEFADEHSDW VNITFCPVDD TIIGPPGMQVEVLADSLHMR FLAPKIENEY ETWTMKNVYN SWTYNVQYWK NGTDEKFQIT PQYDFEVLRNLEPWTTYCVQVRGFLPDRNK AGEWSEPVCE QTTHDETVPS WMVAVILMAS VFMVCLALLGCFAL LWCVYK KTKYAFSPRNSLPQHLKEFL GHPHHNTLLF FSFPLSDEND VFDKLSVIAEDSESGKQNPG DSCSLGTPPG QGPQS,NCBI参考序列NP_000619.3,(SEQ ID NO:53),其中aas 20至325形成成熟多肽,并且aas 221-242是跨膜区。蛋白质的受体亚基的全部或一部分(例如,胞外结构域(aas 20-220)可与α亚基一起用于测定与IL-10的结合亲和力。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:50或51中列示的氨基酸序列的IL-10多肽的结合亲和力相比,变体IL-10同工型多肽(例如,SEQ ID NO:50、51的变体、或在如上所述的D与E螺旋之间的铰链中带有5-7个aa插入的那些序列的单体IL-10变体)对成熟IL-10受体序列(例如,包含SEQ ID NO:52或53中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-10受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,IL-10多肽的变体(例如,SEQ ID NO:50或51的变体)结合包含SEQ ID NO:52和53中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-10受体的结合亲和力比IL-10同工型(例如,SEQ ID NO:50或51)与包含SEQ ID NO:52或53中列示的多肽的全部或一部分(诸如其胞外结构域)的IL-10受体的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51的变体,其可包含介于D与E螺旋之间的铰链区中的上述插入之一)对IL-10受体(例如,包含SEQ ID NO:52和53中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。在一些情况下,变体IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51的变体)对成熟IL-10受体(例如,包含SEQ ID NO:52和53中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51的变体)对成熟IL-10受体(例如,包含SEQ ID NO:52和53中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有单个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与SEQ IDNO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有9个aa或10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:50或51中列示的IL-10多肽序列相比,变体IL-10多肽具有1-10个aa取代,并且包含介于D与E螺旋之间的铰链区中的5-7个aa取代(例如,SEQID NO:50的K49和N50)。
合适的变体IL-10多肽序列包括与SEQ ID NO:50或51(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160个)连续aa具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
11 IL-15及其变体
在一些情况下,存在于本公开的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD是IL-15多肽。IL-15多肽的序列在本领域是已知的,包括通过产生不同前体蛋白的选择性剪接形成的两个同工型。在一个实施方案中,wt.IL-15多肽具有序列:MRISKPHLRS ISIQCYLCLLLNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANW VNVISDLKKIEDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKCFLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANNSLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFINTS,(SEQ ID NO.54),UniProtKB-P40933,NCBI Ref.NP_000576.1,IL-15前蛋白,其中aa 1至29是信号肽,并且30-48是原肽。
出于本公开的目的而表示为同工型1的成熟IL-15多肽可具有形式NWVNVISDLKKIEDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS,(SEQ ID NO:55)。
IL-15在结构上类似于IL-2并且通过具有与IL-2受体相同β和γ链但具有不同IL-15受体α(IL-15Rα)亚基的细胞表面三聚体受体进行信号传导。人IL-15Rα同工型1前体蛋白的氨基酸序列可以是MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYSLYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPESLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA KNWELTASASHQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE MEAMEALPVT WGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO:56)NCBI Ref NP_002180,其中aas 1-30形成信号序列,并且aas肽31-267是成熟多肽。IL-2Rβ和IL-2Rγ的序列提供为SEQ ID NO:11和12。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:55中列示的氨基酸序列的IL-15多肽的结合亲和力相比,变体IL-15同工型1多肽(例如SEQ ID NO:55的变体)对成熟IL-15受体序列(例如,包含SEQ ID NO:11、12和56中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-15受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,IL-15多肽的变体(例如,SEQ ID NO:55的变体)结合包含SEQ ID NO:11、12和56中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-15受体的结合亲和力比包含SEQ ID NO:55中列示的氨基酸序列的IL-15多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55的变体)对包含SEQ ID NO:11、12和56中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-15受体具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55的变体)对包含SEQ ID NO:11、12和56中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的成熟IL-15受体具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55的变体)具有单个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55的变体)具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:55中列示的IL-15多肽序列相比,变体IL-15多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-15多肽序列包括与SEQ ID NO:55(并且其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
12IL-21及其变体
在一些情况下,存在于本公开的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD是IL-21多肽。IL-21多肽的序列在本领域是已知的,包括通过产生不同前体蛋白的选择性剪接形成的两个同工型。
在一个实施方案中,野生型(wt.)IL-21同工型1多肽具有序列MRSSPGNMERIVICLMVIFL GTLVHKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQKAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQHLSSRTHGSE DS,(SEQ ID NO:57),UniProtKB-Q9HBE4,NCBI Ref.NP_068575.1,IL-21蛋白,其中aa 1至29是信号肽。
成熟IL-21同工型1多肽可具有aa序列Q GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEFLPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEKKPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS,(SEQ ID NO:58)。
在一个实施方案中,野生型(wt.)IL-21同工型2多肽具有序列MRSSPGNMERIVICLMVIFL GTLVHKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQKAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQHLSSRTHGSE DS,(SEQ ID NO:59),NP_001193935.1,IL-21蛋白,其中aa 1至29是信号肽。
成熟IL-21同工型2多肽可具有aa序列MRSSPGNMER IVICLMVIFL GTLVHKSSSQGQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSIKKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKVSTL SFI,(SEQ ID NO:60)。
IL-21通过具有与IL-2受体相同γ链但具有不同IL-21R受体亚基的二聚体细胞表面受体进行信号传导。人IL-21R同工型1前体蛋白的aa序列可以是
MPRGWAAPLL LLLLQGGWGC PDLVCYTDYL QTVICILEMW NLHPSTLTLT WQDQYEELKDEATSCSLHRS AHNATHATYT CHMDVFHFMA DDIFSVNITD QSGNYSQECG SFLLAESIKP APPFNVTVTFSGQYNISWRS DYEDPAFYML KGKLQYELQY RNRGDPWAVS PRRKLISVDS RSVSLLPLEF RKDSSYELQVRAGPMPGSSY QGTWSEWSDP VIFQTQSEEL KEGWNPHLLL LLLLVIVFIP AFWSLKTHPL WRLWKKIWAVPSPERFFMPL YKGCSGDFKK WVGAPFTGSS LELGPWSPEV PSTLEVYSCH PPRSPAKRLQ LTELQEPAELVESDGVPKPS FWPTAQNSGG SAYSEERDRP YGLVSIDTVT VLDAEGPCTW PCSCEDDGYP ALDLDAGLEPSPGLEDPLLD AGTTVLSCGC VSAGSPGLGG PLGSLLDRLK PPLADGEDWA GGLPWGGRSP GGVSESEAGSPLAGLDMDTF DSGFVGSDCS SPVECDFTSP GDEGPPRSYL RQWVVIPPPL SSPGPQAS(SEQ ID NO:61)NCBI参考序列NP_068570.1,其中aas 1-19形成信号序列,aas 20-538是成熟多肽,aas233..253是跨膜结构域,并且aas 20-232是胞外结构域。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:58或60中列示的氨基酸序列的wt.IL-21多肽的结合亲和力相比,变体IL-21多肽对成熟IL-21受体序列(例如,包含SEQ ID NO:12和61中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-21受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,包含SEQ ID NO:58或60的IL-21多肽的变体结合包含SEQ ID NO:12和61中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-21受体的结合亲和力比包含SEQ IDNO:58或60中列示的氨基酸序列的wt.IL-21多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60的变体)对IL-21受体(例如,包含SEQ ID NO:12和61中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。在一些情况下,变体IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60的变体)对成熟IL-21受体的全部或一部分(例如,包含SEQ ID NO:12和61中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60的变体)对IL-21受体的全部或一部分(例如,包含SEQ ID NO:12和61中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60的变体)具有单个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60的变体)具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:58或60中列示的IL-21多肽序列相比,变体IL-21多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的IL-21多肽序列包括与SEQ ID NO:58或60(并且其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
13IL-23及其变体
在一些情况下,存在于本公开的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD是IL-23多肽。IL-23是由IL-23A(IL-23p19)亚基和IL-12B(IL-12p40)亚基(其与IL-12共用)构成的异二聚体细胞因子。
在一个实施方案中,野生型(wt.)IL-23A多肽具有序列:MLGSRAVMLL LLLPWTAQGRAVPGGSSPAW TQCQQLSQKL CTLAWSAHPL VGHMDLREEGDEETTNDVPH IQCGDGCDPQ GLRDNSQFCLQRIHQGLIFY EKLLGSDIFT GEPSLLPDSPVGQLHASLLG LSQLLQPEGH HWETQQIPSL SPSQPWQRLLLRFKILRSLQ AFVAVAARVFAHGAATLSP,(SEQ ID NO:62),NCBI参考序列NP_057668.1蛋白,其中aa 1至19是信号肽,并且20-189为成熟肽。
成熟IL-23A多肽可具有aa序列:R AVPGGSSPAW TQCQQLSQKL CTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPH IQCGDGCDPQ GLRDNSQFCL QRIHQGLIFY EKLLGSDIFT GEPSLLPDSPVGQLHASLLG LSQLLQPEGH HWETQQIPSL SPSQPWQRLL LRFKILRSLQ AFVAVAARVFAHGAATLSP,(SEQID NO:63)。
在一个实施方案中,野生型(wt.)IL-12B多肽具有序列:MCHQQLVISW FSLVFLASPLVAIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTCHKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSRGSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIRDIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVICRKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS,(SEQ ID NO:64),UniProtKB-P29460蛋白,其中aa 1至22是信号肽,并且23至328是成熟肽。
成熟IL-12B多肽可具有aa序列:IWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITWTLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLRCEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACPAAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFSLTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS,(SEQ ID NO:65)。
IL-23经由二聚体细胞表面受体进行信号传导,所述受体包含IL-23受体多肽(IL-23R)及其与IL-12受体共有的称为12RB1或12Rβ1的亚基。
IL-23R同工型1前体蛋白序列可以是:MNQVTIQWDA VIALYILFSW CHGGITNINCSGHIWVEPAT IFKMGMNISI YCQAAIKNCQ PRKLHFYKNG IKERFQITRI NKTTARLWYK NFLEPHASMYCTAECPKHFQ ETLICGKDIS SGYPPDIPDE VTCVIYEYSG NMTCTWNAGK LTYIDTKYVV HVKSLETEEEQQYLTSSYIN ISTDSLQGGK KYLVWVQAAN ALGMEESKQL QIHLDDIVIP SAAVISRAET INATVPKTIIYWDSQTTIEK VSCEMRYKAT TNQTWNVKEF DTNFTYVQQS EFYLEPNIKY VFQVRCQETG KRYWQPWSSLFFHKTPETVP QVTSKAFQHD TWNSGLTVAS ISTGHLTSDN RGDIGLLLGM IVFAVMLSIL SLIGIFNRSFRTGIKRRILL LIPKWLYEDI PNMKNSNVVK MLQENSELMN NNSSEQVLYV DPMITEIKEI FIPEHKPTDYKKENTGPLET RDYPQNSLFD NTTVVYIPDL NTGYKPQISN FLPEGSHLSN NNEITSLTLK PPVDSLDSGNNPRLQKHPNF AFSVSSVNSL SNTIFLGELS LILNQGECSS PDIQNSVEEE TTMLLENDSP SETIPEQTLLPDEFVSCLGI VNEELPSINT YFPQNILESH FNRISLLEK,(SEQ ID NO:66)NCBI参考序列NP_653302.2,其中aas 1-23形成信号序列,aas 24-629是成熟多肽,aas 356至376是跨膜结构域,并且aas 24-355是胞外结构域。
12RB1同工型1前体蛋白aa序列可以是:MEPLVTWVVP LLFLFLLSRQ GAACRTSECCFQDPPYPDAD SGSASGPRDL RCYRISSDRY ECSWQYEGPT AGVSHFLRCC LSSGRCCYFA AGSATRLQFSDQAGVSVLYT VTLWVESWAR NQTEKSPEVT LQLYNSVKYE PPLGDIKVSK LAGQLRMEWE TPDNQVGAEVQFRHRTPSSP WKLGDCGPQD DDTESCLCPL EMNVAQEFQL RRRQLGSQGS SWSKWSSPVC VPPENPPQPQVRFSVEQLGQ DGRRRLTLKE QPTQLELPEG CQGLAPGTEV TYRLQLHMLS CPCKAKATRT LHLGKMPYLSGAAYNVAVIS SNQFGPGLNQ TWHIPADTHT EPVALNISVG TNGTTMYWPA RAQSMTYCIE WQPVGQDGGLATCSLTAPQD PDPAGMATYS WSRESGAMGQ EKCYYITIFA SAHPEKLTLW STVLSTYHFG GNASAAGTPHHVSVKNHSLD SVSVDWAPSL LSTCPGVLKE YVVRCRDEDS KQVSEHPVQP TETQVTLSGL RAGVAYTVQVRADTAWLRGV WSQPQRFSIE VQVSDWLIFF ASLGSFLSIL LVGVLGYLGL NRAARHLCPP LPTPCASSAIEFPGGKETWQ WINPVDFQEE ASLQEALVVE MSWDKGERTE PLEKTELPEG APELALDTEL SLEDGDRCKAKM,(SEQ ID NO:67)NCBI参考序列NP_005526.1,其中aas 1-23形成信号序列,aas 24-662是成熟多肽,aas 546至570是跨膜结构域,并且aas 24-545是胞外结构域。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:63或65中列示的氨基酸序列的IL-23多肽的结合亲和力相比,变体IL-23(例如包含SEQ ID NO:63和/或65的变体)多肽对成熟IL-23受体序列(例如,包含SEQ ID NO:66和67中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的IL-23受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,IL-23多肽的变体(例如,包含SEQID NO:63和/或65的变体)结合IL-23受体(例如,包含SEQ ID NO:66和67中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)的结合亲和力比包含SEQ ID NO:63或65中列示的氨基酸序列的IL-23多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63和/或65的变体)对IL-23受体(例如,包含SEQ ID NO:66和67中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体IL-23多肽(例如,包含SEQID NO:63和/或65的变体)对成熟IL-23受体(例如,包含SEQ ID NO:66和67中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63和/或65的变体)具有单个aa取代。在一些情况下,与SEQ IDNO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63和/或65的变体)具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:63和/或65中列示的IL-23多肽序列相比,变体IL-23多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体IL-23多肽序列包括与SEQ ID NO:63和/或65(并且其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160、至少180、至少200、至少220、至少240、至少260、至少280、至少300、至少320或至少340个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
14Fas配体(FasL)及其变体
在一些情况下,存在于本公开的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD是Fas配体(FasL)。FasL是肿瘤坏死因子(TNF)家族中的同聚体II型跨膜蛋白。FasL通过靶细胞中的Fas受体的三聚化进行信号传导,其形成导致靶细胞的细胞凋亡的死亡诱导复合物。可溶性FasL由基质金属蛋白酶-7(MMP-7)在保守位点处使膜结合的FasL裂解而产生。
在一个实施方案中,wt.智人FasL蛋白具有序列
MQQPFNYPYP QIYWVDSSAS SPWAPPGTVL PCPTSVPRRP GQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPP LKKRGNHSTG LCLLVMFFMV LVALVGLGLG MFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYF VYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L,(SEQ ID NO:143),NCBI参考序列NP_000630.1,UniProtKB-P48023,其中残基1-80是细胞质的,810102是跨膜结构域并且aas 103-281是细胞外的(胞外结构域)。
合适的FasL多肽包含FasL的胞外结构域的全部或一部分:QLFHLQKE LAELRESTSQMHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVL LSGVKYKKGG LVINETGLYFVYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM SYCTTGQMWA RSSYLGAVFN LTSADHLYVNVSELSLVNFE ESQTFFGLYK L.(SEQ ID NO144)。
Fas受体可具有序列
MLGIWTLLPL VLTSVARLSS KSVNAQVTDI NSKGLELRKT VTTVETQNLE GLHHDGQFCHKPCPPGERKA RDCTVNGDEP DCVPCQEGKE YTDKAHFSSK CRRCRLCDEG HGLEVEINCTRT QNTKCRCKPNFFCNSTVC EHCDPCTKCE HGIIKECTLT SNTKCKEEGS RSNLGWLCLLLLPIPLIVWV KRKEVQKTCRKHRKENQGSH ESPTLNPETV AINLSDVDLS KYITTIAGVMTLSQVKGFVR KNGVNEAKID EIKNDNVQDTAEQKVQLLRN WHQLHGKKEA YDTLIKDLKKANLCTLAEKI QTIILKDITS DSENSNFRNE IQSLV,(SEQID NO:145)NCBI参考序列:NP_000034.1,UniProtKB-P25445,其中aas 26-173形成胞外结构域(细胞外结构域),aas 174-190形成跨膜结构域,并且191-335是细胞质域。胞外结构域可用于测定与FasL的结合亲和力。
在一些情况下,与包含SEQ ID NO:144中列示的氨基酸序列的FasL多肽的结合亲和力相比,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO144的变体)对成熟Fas受体序列(例如,包含多肽SEQ ID NO:145中列示的多肽的全部或一部分诸如其胞外结构域的FasL受体)的结合亲和力表现出降低。例如,在一些情况下,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144的变体)结合Fas受体(例如,包含SEQ ID NO:145中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)的结合亲和力比包含SEQ ID NO:144中列示的氨基酸序列的FasL多肽的结合亲和力低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上。
在一些情况下,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144的变体)对Fas受体(例如,包含SEQ ID NO:145中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作为另一个实例,在一些情况下,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144的变体)对成熟Fas受体(例如,包含SEQ ID NO:145中列示的多肽的全部或一部分,诸如其胞外结构域)具有的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144的变体)具有单个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144的变体)具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽具有2个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下,与SEQ ID NO:144中列示的FasL多肽序列相比,变体FasL多肽具有9个aa或10个aa取代。
合适的变体FasL多肽序列包括与SEQ ID NO:144(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160或至少180个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
E.支架
支架多肽尤其充当结构元件,提供掩蔽的TGF-β构建体或复合物的其他组分加以组织的构架(参见例如,图1,结构A,具有IgFc支架)。当掩蔽TGF-β多肽的多肽序列与TGF-β多肽反式定位(在复合物的不同多肽上)时,形成种间和非种间双链体(或高阶结构)的支架序列可保持与TGF-β多肽缔合的掩蔽多肽序列,甚至在复合物呈打开形式并且TGF-β多肽序列可用于与其他分子相互作用(不与掩蔽序列直接接触)期间也如此。根据支架的性质,其还可充当组织元件,在蛋白质折叠和二聚化或多聚化(例如,通过二聚化序列完成的同二聚化或异二聚化)方面提供高阶结构。支架还可促成血清稳定性,尤其当其是免疫球蛋白重链恒定区(例如,Ig Fc)时。合适的支架多肽在一些情况下是半衰期延长的多肽。在一些情况下,与具有拥有不同、非免疫球蛋白序列的支架多肽的对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物相比,合适的支架多肽使掩蔽的TGF-β构建体或复合物的体内半衰期(例如,血清半衰期)增加了至少约10%、至少约15%、至少约25%、至少约50%、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或大于100倍。作为一个实例,在一些情况下,与具有通过接头(例如,相等序列长度的GGGS aa重复序列)替换的Ig Fc多肽序列的对照掩蔽的TGF-β构建体或复合物相比,Ig Fc多肽序列(例如,包括种间Ig序列,诸如杵臼序列对)增加掩蔽的TGF-β构建体或复合物的稳定性和/或体内半衰期(例如,血清半衰期)。体内半衰期的增加可以是至少约10%、至少约15%、至少约25%、至少约50%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或超过100倍。当Ig Fc多肽用于掩蔽的TGF-β构建体中时,Ig Fc可含有防止自发形成掩蔽的TGF-β构建体的二聚体的突变(参见例如,Tianlei Ying等人,J.Biol.Chem,287(23),第19399-19408页(2012年6月1日)),并且另外可包括实质上降低或消除Ig多肽例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来诱导细胞溶解的能力的突变(例如,以下讨论的LALA突变)。
当掩蔽的TGF-β构建体的支架多肽序列包含允许支架与其他支架分子相互作用(特异性结合)的一个或多个序列时,掩蔽的TGF-β构建体可形成同二聚体复合物(参见例如,图1,结构B)或异二聚体复合物(参见例如,图1,结构C-F)。掩蔽的TGF-β构建体还可包含允许支架与其他支架分子相互作用(特异性结合)以形成高阶结构的一个或多个aa序列。形成高阶多聚体结构的序列允许形成高阶掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,三聚体、四聚体、五聚体等)。例如,包含IgM Fc区(例如,SEQ ID NO:83)的支架多肽允许形成五聚体(尤其在也表达j链序列时,例如SEQ ID NO:84)或六聚体掩蔽的TGF-β构建体或复合物。等人,Med Hypotheses.77(6):959-61(2011)。呈同二聚体和异二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等形式的掩蔽的TGF-β构建体系称为掩蔽的TGF-β复合物。
当需要使掩蔽的TGF-β与一个或多个其他多肽序列(诸如一个或多个特异性MOD或MOD的拷贝)在一起时,支架多肽序列可包含种间二聚化序列,所述序列倾向于与其对应种间结合(二聚化)序列形成异二聚体。在一些情况下,种间结合序列可形成同二聚体,但优先与其对应种间结合序列二聚化(更强地结合)。因此,在将种间二聚化序列及其对应种间结合序列掺入一对多肽中时,可(倾向于)形成特异性异二聚体。例如,当将种间二聚化序列及其对应物掺入一对多肽中以选择性形成异二聚体时,大于60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的等摩尔肽混合物参与异二聚体形成,并且肽的其余部分以单体或同二聚体形式存在。
以足够亲和力彼此或本身特异性结合的多种aa序列可用作掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的二聚化序列(参见例如美国专利公布号2003/0138440)。序列可具有相对紧凑尺寸(例如诸如小于约300、250、225、200、175、150、125、100、75或50个aa)。二聚化/多聚化序列包括但不限于:免疫球蛋白重链恒定区(Ig Fc)多肽序列(包含免疫球蛋白的CH2-CH3区的序列;参见例如,图2A-2H和SEQ ID NO:68至83);Fc杵臼序列(例如,SEQ ID NO:77和78);胶原凝集素家族的多肽(例如,ACRP30或ACRP30样蛋白),其含有由胶原蛋白重复序列Gly-Xaa-Yaa组成的胶原蛋白结构域;卷曲螺旋结构域;亮氨酸-拉链结构域;Fos/Jun结合对;Ig重链区1(CH1)和轻链恒定区CL序列(CH1/CL对,诸如与κ或λIg轻链恒定区序列配对的CH1序列)。
在一些实施方案中,支架多肽序列包含免疫球蛋白重链恒定区(CH2-CH3)多肽序列,其充当二聚化或多聚化序列(参见例如,图2A-2H和SEQ ID NO:68至83)。在实施方案中,Ig多肽实质上不例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的活化来诱导细胞溶解,并且因此可包括实质上降低或消除Ig多肽诱导细胞溶解的能力的突变。在一些情况下,Fc序列与图2A至图2H描述的Fc区的aa序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性。此类免疫球蛋白序列可通过形成一个或两个链间二硫键来使掩蔽的TGF-β复合物的多肽共价地连接在一起。如下讨论,可引入额外的二硫键来使二聚体稳定,尤其当采用一对种间Ig序列诸如杵臼多肽对时。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的支架多肽序列包含与图2A描述的IgAFc序列(SEQ ID NO:68)的至少150个连续aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350个连续aas)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2B描述的IgD Fc序列(SEQ ID NO:69)的至少150个连续aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350个连续aas)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2C描述的IgE Fc序列(SEQ ID NO:70)的至少125个连续aas(至少150、至少175或至少200个连续aas)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与wt.IgG Fc多肽序列,诸如图2D描述的IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71-78)的至少125个连续aas(至少150、至少175或至少200个连续aas)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2E描述的IgG2Fc多肽序列(SEQ ID NO:79)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300个)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2F描述的IgG3Fc序列(SEQ ID NO:80)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200或至少225个)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2G描述的IgG4Fc序列(SEQ ID NO:81或82)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250个)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。在一个实施方案中,支架多肽序列包含与图2H描述的IgM Fc多肽序列(SEQ IDNO:83)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250个)或所有aas具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。包含免疫球蛋白支架多肽序列(例如,图2A至图2H所述)的掩蔽的TGF-β复合物的上文列举的多肽可通过在与其铰链区相邻的半胱氨酸之间形成一个或两个链间二硫键来共价地连接在一起。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列与图2D描述的人IgG1 Fc多肽具有至少约70%(例如,至少约80%、90%、95%、98%、99%或100%)aa序列同一性,并且包含用丙氨酸(N297A取代,或如图2D,SEQ ID NO:74中编号的N77)取代的N297的取代。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(人IgG1 Fc),用除天冬酰胺以外的aa的取代N297(图2D描述的aa序列的N77)除外。N297处的取代导致碳水化合物修饰的去除并且与wt.蛋白相比,所产生的抗体序列具有减少的补体组分1q(“C1q”)结合,并且因此,补体依赖性细胞毒性降低。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(人IgG1 Fc),用除亮氨酸以外的aa的L234的取代(图2D描述的aa序列的L14)除外。IgG的较低铰链区中的L234和其他aas(例如,aas 234-LLGGPS-239,其对应于SEQ ID NO:71的aas 14-19)参与与Fcλ受体(FcλR)的结合,并且因此,所述位置处的突变减少与受体的结合(相对于wt.蛋白)。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(人IgG1 Fc),用除亮氨酸以外的aa的L235的取代(图2D描述的aa序列的L15)除外。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(例如,wt.人IgG1序列),其具有L234A和L235A(“LALA”)取代(对应于图2D描述的wt.aa序列的位置14和15的位置;参见例如,SEQ ID NO:75)。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(人IgG1 Fc),其具有用除脯氨酸以外的aa的P331的取代(图2D描述的aa序列的P111);在一些情况下,取代是P331S取代。P331处的取代,如同N297处的取代一样,导致相对于wt.蛋白与C1q的结合减少,因此补体依赖性细胞毒性降低。例如用丙氨酸的D270、K322和/或P329的取代(对应于图2D中的SEQ ID NO:71的D50、K122和P119)可单独或代替P331取代使用以减少与C1q的结合。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列为IgG1 Fc多肽,其包含L234A和/或L235A取代(用Ala取代图2D描述的aa序列的L14和/或L15处的亮氨酸)。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D描述的aa序列(wt.人IgG1 Fc),用除亮氨酸以外的aas在L234和/或L235(图2D描述的aa序列的L14和/或L15)处的取代和用除脯氨酸以外的aa的P331(图2D描述的aa序列的P111)的取代除外。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含图2D(人IgG1 Fc)描述的“三重突变体”aa序列(SEQ ID NO:73),其包含L234F、L235E和P331S取代(对应于图2D描述的aa序列的aa位置14、15和111)。
当需要掩蔽的TGF-β复合物的两个多肽之间的不对称配对时,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的支架多肽的二聚化序列包含种间结合序列、基本上由种间结合序列组成、或由种间结合序列组成。种间结合序列有利于与其同源多肽序列形成异二聚体(即,种间序列及其对应种间序列),尤其是基于免疫球蛋白Fc序列变体的那些异二聚体。此类种间多肽序列包括没有(KiH)或具有(KiH)S-s稳定化二硫键的杵臼、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s和A107序列。一个种间结合对包含IgG1的CH3结构域界面或其他免疫球蛋白的对应残基中的T366Y和Y407T突变体对。参见Ridgway等人,Protein Engineering9:7,617-621(1996)(取代由Kabat等人.(1991)的EU编号方案表示)。第二种间结合对涉及通过T366W取代形成杵,和在互补Fc序列上通过三重取代T366S、L368A和Y407V形成臼。参见Xu等人mAbs 7:1,231-242(2015)。另一个种间结合对具有含有Y349C、T366S、L368A和Y407V取代的第一Fc多肽和含有S354C和T366W取代的第二Fc多肽(二硫键可在Y349C与S354C之间形成)。Brinkmann和Konthermann,mAbs 9:2,182–212(2015)。具有或不具有杵臼修饰的Fc多肽序列可通过在Fc多肽(例如,铰链区二硫键)之间形成二硫键来稳定化。若干种间多肽结合序列总结在表1中,并且交叉引用如图2D列示的wt.IgG1序列(SEQ ID NO:71)中出现的aa位置的编号,所述编号在括号“{}”中示出。
表1.种间序列及其同源对应种间序列
表1从Ha等人,Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)中修改而来。
*aa形成稳定二硫键。
除了表1中的种间序列对以外,种间“SEED”序列在种间序列的IgG1CH3结构域中具有来源于IgA的45个残基并且在对应种间序列上的IgA CH3中具有来源于IgG1的57个残基。参见Ha等人,Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)。
在一个实施方案中,在掩蔽的TGF-β构建体或复合物中发现的支架序列包含选自由以下组成的组的种间结合序列或其对应种间结合序列:杵臼(KiH);具有稳定二硫化物的杵臼(KiHs-s);HA-TF;ZW-1;7.8.60;DD-KK;EW-RVT;EW-RVTs-s;A107;或SEED序列。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含:含有具有T146W KiH序列取代的IgG1支架的第一多肽和含有具有T146W、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1支架的第二多肽,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列。一个或两个支架aa序列任选地在使用Kabat编号的以下一者或多者处包含取代:L234和L235(例如,L234A/L235A“LALA”或L234F/L235E)、N297(例如,N297A)、P331(例如,P331S)、L351(例如,L351K)、T366(例如,T366S)、P395(例如,P395V)、F405(例如,F405R)、Y407(例如,Y407A)和K409(例如,K409Y)。那些取代出现在SEQ ID NO:71的IgG1序列中的L14和L15(例如,L14A/L15A“LALA”或L14F/L15E)、N77(例如,N77A)、P111(例如,P111S)、L131(例如,L131K)、T146(例如,T146S)、P175(例如,P175V)、F185(例如,F185R)、Y187(例如,Y187A)和K189(例如,K189Y)处。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含:含有具有T146W KiH序列取代的IgG1支架的第一多肽和含有具有T146S、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1支架的第二多肽,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。参见例如图2D SEQ ID NO:77和78,
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含T146W和S134C KiHs-s取代,并且在第二支架序列中包含T146S、L148A、Y187V和Y129CKiHs-s取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含S144H和F185A HA-TF取代,并且在第二支架序列中包含Y129T和T174F HA-TF取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含T130V、L131Y、F185A和Y187V ZW1取代,并且在第二支架序列中包含T130V、T146L、K172L和T174W ZW1取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含K140D、D179M和Y187A 7.8.60取代,并且在第二支架序列中包含E125R、Q127R、T146V和K189V7.8.60取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二β多肽在第一支架序列中包含K189D和K172D DD-KK取代,并且在第二支架序列中包含D179K和E136K DD-KK取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G),
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含K140E和K189W EW-RVT取代,并且在第二支架序列中包含Q127R、D179V和F185T EW-RVT取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含K140E、K189W和Y129C EW-RVTs-s取代,并且在第二支架序列中包含Q127R、D179V、F185T和S134C EW-RVTs-s取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含K150E和K189W A107取代,并且在第二支架序列中包含E137N、D179V和F185TA107取代,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或N77取代以通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。
作为使用免疫球蛋白重链恒定区作为支架的替代方案,免疫球蛋白轻链恒定区可与重链CH1序列配对作为二聚化序列,所述二聚化序列形成支架多肽序列或者是其一部分。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含Ig CH1结构域(例如,SEQ ID NO:85的多肽),并且在第二支架序列中包含Igκ链恒定区序列SEQ IDNO:86),其中支架包含分别与SEQ ID NO:85和/或86的至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aas具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列。参见图2J和2K。CH1和Igκ序列可被修饰以增加它们彼此的亲和力,并且因此提高利用其作为二聚化序列所形成的任何异二聚体的稳定性。在提高CH1-Igκ异二聚体的稳定性的取代的中是被鉴定为MD13组合的取代,Chen等人,MAbs,8(4):761-774(2016)。在MD13中,将两个取代引入CH1和Igκ序列的每个中。CH1序列被修饰以含有S64E和S66V取代(图2J中示出的SEQ ID NO:85中的S70E和S72V)。Igκ序列被修饰以含有S69L和T71S取代(图2K中示出的SEQID NO:86中的S68L和T70S)。
在另一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽在第一支架序列中包含Ig CH1结构域(例如,SEQ ID NO:85的多肽),并且在第二支架序列中包含Igλ链恒定区序列SEQ ID NO:87),其中支架包含分别与SEQ ID NO:85和/或87的至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aas具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列。参见图2J和2K。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽的支架多肽序列各自包含亮氨酸拉链多肽作为二聚化序列。亮氨酸拉链多肽彼此结合以形成二聚体(例如,同二聚体)。亮氨酸-拉链多肽的非限制性实例包括例如以下aa序列中任一个的肽:RMKQIED-KIEEILS-KIYHIENEIARIKKLIGER(SEQ ID NO:88);LSSIEK-KQEEQTS-WLIWISNELTL-IRNELAQS(SEQ ID NO:89);LSSIEKKLE-EITSQLIQIS-NELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:90;LSSIE-KKL-E--EITSQLIQIRNELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:91);LSSIEKKL-EEITSQLQQ-IRNELTLI-RNELAQ(SEQID NO:92);LSSLEKKLEEL-TSQLIQLRNELT-LLRNELAQ(SEQ ID NO:93);ISSLE-KKIEE-LTSQI-QQLRNEITLLRNEIAQ(SEQ ID NO:94)。在一些情况下,亮氨酸拉链多肽包含以下aa序列:LEIEAAFLERENT-ALET-RVAE-LRR-VRLR-NRV-SYRT-RYGPLGGGK(SEQ ID NO:95)。额外的亮氨酸-拉链多肽在本领域是已知的,其任一种适于用作支架或作为二聚化序列掺入支架中。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽的支架多肽序列各自包含形成二聚体(例如,同二聚体)的卷曲螺旋肽。卷曲螺旋多肽的非限制性实例包括例如以下aa序列中任一种的肽:LKSVENRLAVVENQLKT-VIEE-LK-TVKDLLSN(SEQ ID NO:96);LARIE-EKLKTIKAQLSEIASTLNMIREQLAQ(SEQ ID NO:97);VSRLE-EKVKT-LKSQV-TELAS-TVSLL-REQVAQ(SEQ ID NO:98);IQSEKKIEDI-SSLI-G-QIQSEITLIRNEIAQ(SEQ ID NO:99);LMSLE-KKLEE-LTQTLMQLQNELSMLKNELAQ(SEQ ID NO:100)。
在一些情况下,允许掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽的二聚化(同二聚化)的支架多肽序列各自包含具有可形成二硫键的至少一个半胱氨酸残基的多肽序列。此类多肽序列的实例包括:人FasL多肽VDLEGSTSNGRQ-CAGIRL(SEQ ID NO:101);EDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMA(SEQ ID NO:102);和GHDQE-TTTQG-PGVLL-PLPKGACTGQMA(SEQ ID NO:103)。
适合作为多聚化(低聚化)序列的肽允许形成大于二聚体(例如,三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等)的掩蔽的TGF-β复合物,包括但不限于形成六聚体或五聚体的IgM恒定区(参见例如,图2H)(尤其在与诸如图2I中提供的缺少信号序列的成熟j-链肽组合时)。还可采用形成三聚体的胶原蛋白结构域。胶原蛋白结构域可包含(Gly-Xaa-Xaa)n,其中Xaa是任何aa,或者/并且其中n是整数(例如,10至40);其中Xaa和Yaa独立地是任何aa并且n是10至40的整数。在Gly-Xaa-Yaa序列中,Xaa和Yaa通常在大于25%、50%、75%、80%、90%或95%的Gly-Xaa-Yaa中或在每次Gly-Xaa-Yaa出现时分别是脯氨酸和羟基脯氨酸。在一些情况下,胶原蛋白结构域包含序列(Gly-Xaa-Pro)n,其中n是整数(例如,10至40)。胶原蛋白低聚化肽可包含以下aa序列:VTAFSNMDDMLQKAHL-VIEGTFIYLRDSTEFFIRVRDGW-KKLQLGE-LIPIP-ADSPP-PP-AL-SSNP(SEQ ID NO:104)。
F.TGF-β多肽
如上所示,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含至少一个TGF-β多肽(例如,一个或多个独立选择的TGF-β多肽)。TGF-β多肽的氨基酸序列在本领域是已知的。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β多肽是TGF-β1多肽。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β多肽是TGF-β2多肽。在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β多肽是TGF-β3多肽。
虽然TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3多肽序列可掺入掩蔽的TGF-β构建体或复合物中,但多种因素可影响特定TGF-β多肽以及将采用的特定序列和aa取代的选择。例如,TGF-β1和TGF-β3在许多哺乳动物细胞系统(例如,CHO细胞)中表达时经历其氨基酸序列的“剪切(clipping)”。另外,二聚TGF-β(例如,TGF-β2)对TβR3(β聚糖受体)的亲和力高于对TβR2受体的亲和力,这会导致生物活性掩蔽的蛋白对于非信号传导TβR3分子的较大体内池的脱靶结合和损失。为了最大限度地减少与TβR3的高亲和力脱靶结合,可能需要取代产生二聚体TGF-β分子的残基,所述残基由二硫键来接合。因此,半胱氨酸77(C77)可被除半胱氨酸以外的氨基酸(例如,形成C77S取代的丝氨酸)取代。
合适的TGF-β多肽可具有约70aas至约125aas的长度;例如,合适的TGF-β多肽可具有约70aas至约80aas约80aas至约90aas;约90aas至约100aas;约100aas至约105aas、约105aas至约110aas、约110aas至约112aas、约113aas至约120aas、或约120aas至约125aas的长度。合适的TGF-β多肽可包含与成熟形式的人TGF-β1多肽、人TGF-β2多肽或人TGF-β3多肽的至少80、至少90、至少100或至少110个连续aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列。
1 TGF-β1多肽
合适的TGF-β1多肽可包含与以下TGF-β1氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: (SEQ ID NO:105,112aas长度);其中TGF-β1多肽具有约112aas的长度。TGF-β1前原蛋白在图3中作为SEQ ID NO:106提供。氨基酸R25、C77、V92和R94呈粗体和斜体,参见图4。
在一些情况下,合适的TGF-β1多肽包含C77S取代。因此,在一些情况下,合适的TGF-β1多肽包含与以下TGF-β1氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: (SEQ ID NO:107),其中氨基酸77是Ser。位置25、77、92和94呈粗体和斜体。
2 TGF-β2多肽
合适的TGF-β2多肽可包含与以下TGF-β2氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: 其中TGF-β2多肽具有约112aas的长度。TGF-β2前原蛋白在图3中作为SEQ ID NO:109提供。残基Lys 25、Ile 92和/或Lys 94呈粗体和斜体。
在一些情况下,合适的TGF-β2多肽包含C77S取代。因此,在一些情况下,合适的TGF-β2多肽包含与以下TGF-β2氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列:ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPSCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS(SEQ IDNO110),其中氨基酸77是Ser。
3 TGF-β3多肽
合适的TGF-β3多肽可包含与以下TGF-β3氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: 其中TGF-β3多肽具有约112aas的长度。TGF-β3同工型1前原蛋白在图3中作为SEQ ID NO:112提供。位置25、92和94呈粗体和斜体。
在一些情况下,合适的TGF-β3多肽包含C77S取代。在一些情况下,合适的TGF-β3多肽包含与以下TGF-β3氨基酸序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: 其中氨基酸77是Ser。位置25、92和94呈粗体和斜体。
4额外的TGF-β多肽序列变异
除了改变TGF-β分子二聚化的序列变异(例如,半胱氨酸77取代,诸如C77S)以外,具有影响亲和力和其他性质的序列变异的TGF-β1-3多肽还可掺入掩蔽的TGF-β构建体或复合物中。当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含对掩蔽多肽(例如TβR多肽,诸如TβRII多肽)具有降低的亲和力的TGF-β变体时,那些组分更容易解离,使得掩蔽的TGF-β多肽更可以被细胞TβR蛋白利用。因为TβRII蛋白通常是异质TβR信号传导复合物的与TGF-β相互作用的第一肽,所以与TβRII的相互作用有效地控制TGF-β进入活性信号传导复合物中。因此,控制TGF-β对TβRII的亲和力的变体有效地控制掩蔽的TGF-β构建体和复合物进入活性信号传导复合物中。
本公开包括并提供掩蔽的TGF-β构建体和复合物,其包含(相对于没有序列变异的在其他方面相同的掩蔽的TGF-β构建体或复合物)彼此具有改变(例如,降低)的亲和力的变体掩蔽TβR(例如,TβRII)多肽序列和/或变体TGF-β多肽。TGF-β多肽与TβR(例如,TβRII)多肽之间的亲和力可使用如上针对MOD及其共MOD所述的(BLI)来测定。
a.额外的TGF-β2序列变体
本公开包括并且提供掩蔽的TGF-β2构建体和复合物,其包含掩蔽TβR(例如,TβRII)多肽序列和wt.或变体TGF-β2多肽;其中(相对于没有序列变异的在其他方面相同的wt.TGF-β多肽序列)变体多肽对掩蔽TβR具有降低的亲和力。
本公开提供掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含掩蔽TβRII受体序列和变体TGF-β2多肽,其对SEQ ID NO.108的至少100个连续aa具有大于85%(例如,大于90%、95%、98%或99%)序列同一性,并且包含降低变体TGF-β2多肽对TβRII受体序列的亲和力的取代。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含掩蔽TβRII多肽和变体TGF-β(例如TGF-β2)多肽,其在Lys 25、Ile 92和/或Lys 94的一者或多者、两者或更多者或所有三者处包含取代(关于残基的位置,参见SEQ ID NO:108,并且关于TGF-β1和TGF-β3中的对应残基,参见图4)。那些aa残基已经证明影响TGF-β2对TβRII多肽的亲和力(参见Crescenzo等人,J.Mol.Biol.355:47–62(2006))。掩蔽的TGF-β多肽任选地包含一个或多个独立选择的MOD诸如IL-2或其变体。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含掩蔽TβRII多肽和在SEQ ID NO:108的位置25处具有除Lys或Arg以外的aa的TGF-β2多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2 MOD多肽或其亲和力降低的变体)。具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含在SEQ ID NO:108的位置92处具有除Ile或Val以外的aa(或位置92处的除Ile、Val或Leu以外的aa)的TGF-β2多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2 MOD多肽或其亲和力降低的变体)。具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含在SEQ ID NO:108的位置94处具有除Lys或Arg以外的aa的TGF-β2多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2MOD多肽或其亲和力降低的变体)。具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含在Lys 25、Ile 92和/或Lys 94的一者或多者、两者或更多者或所有三者处包含取代的TGF-β2多肽,并且进一步包含一个或多个独立选择的MOD。具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含在Lys 25、Ile 92和/或Lys 94的一者或多者、两者或更多者或所有三者处包含取代的TGF-β2多肽,并且进一步包含一个或多个独立选择的IL-2 MOD或其亲和力降低的变体。
b.额外的TGF-β1和TGF-β3序列变体
在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含掩蔽TβRII多肽和变体TGF-β1或TGF-β3多肽,其在对应于TGF-β2SEQ ID NO:108中的Lys 25、Ile 92和/或Lys 94的一个或多个、两个或更多个或所有三个aa位置处包含取代。在TGF-β1或TGF-β3中,对应于Lys 25的aa是Arg 25,Ile 92是Val 92并且Lys 94是Arg 94,其各自都是保守取代。关于TGF-β1,参见例如SEQ ID NO:106和107,并且关于TGF-β3,参见SEQ ID NO:112和113。
如上所示,掩蔽的TGF-β构建体或复合物任选地包含一个或多个独立选择的MOD诸如IL-2或其变体。在一种情况下,具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含在位置25处具有除Arg或Lys以外的aa的TGF-β1或β3多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2 MOD多肽或其亲和力降低的变体)。在一种情况下,具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含在位置92处具有除Val或Ile以外的aa(或在位置92处除Ile、Val或Leu以外的aa)的TGF-β1或β3多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2 MOD多肽或其亲和力降低的变体)。在另一种情况下,具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含具有除Arg或Lys以外的aa的TGF-β2多肽;并且任选地包含一个或多个独立选择的MOD(例如,一个或多个IL-2 MOD多肽或其亲和力降低的变体)。在一种特定情况下,具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含在Arg 25、Val 92和/或Arg 94的一者或多者、两者或更多者或所有三者处包含取代的TGF-β1或β3多肽,并且进一步包含一个或多个独立选择的MOD。在另一种特定情况下,具有掩蔽TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含在Arg 25、Val 92和/或Arg 94的一者或多者、两者或更多者或所有三者处包含取代的TGF-β1或β3多肽,并且进一步包含一个或多个独立选择的IL-2 MOD或其亲和力降低的变体。
G.TGF-β受体多肽和结合并掩蔽TGF-β的其他多肽
在上述TGF-β多肽或多肽复合物的任一种中,结合至并掩蔽TGF-β多肽的多肽(“掩蔽多肽”)可采用多种形式,包括TβRI、TβRII、TβRIII的片段和抗TGF-β抗体或其片段(例如,Fab、单链抗体等)。
1TGF-β受体多肽
掩蔽的TGF-β构建体和复合物中TGF-β的掩蔽可通过利用包含足以结合TGF-β多肽(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)的多肽序列的TGF-β受体片段(例如,TβRI、TβRII或TβRIII的胞外结构域序列)来完成。在一个实施方案中,掩蔽序列包含TβRI、TβRII或TβRIII胞外结构域的全部或一部分。
a.TGF-β受体I(TβRI)
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的多肽序列可来源于TβRI(例如,同工型1SEQ ID NO:114)并且可包含TβRI胞外结构域(aas 34-126)的全部或一部分。在一些情况下,用于掩蔽TGF-β的合适的TβRI多肽包含与以下TβRI胞外结构域aa序列的至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列:LQCFCHLCTKDNFTCVT DGLCFVSVTE TTDKVIHNSM CIAEIDLIPR DRPFVCAPSS KTGSVTTTYC CNQDHCNKIELPTTVKSSPG LGPVEL(SEQ ID NO:115)。
b.TGF-β受体II(TβRII)
在实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的多肽序列可来源于TβRII(例如,同工型A SEQ ID NO:116),并且可包含TβRII胞外结构域序列(aas 24至177)的全部或一部分。在一个实施方案中,用于掩蔽TGF-β的合适的TβRII同工型A多肽可包含与以下TβRII同工型A胞外结构域aa序列的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少154aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: 对应于B同工型中的D118的天冬氨酸残基的位置呈粗体、加下划线并且呈斜体。
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的多肽序列可来源于TβRII同工型B SEQ ID NO:118)并且可包含TβRII胞外结构域序列(aas 24至166)的全部或一部分。在实施例中,用于掩蔽TGF-β的合适的TβRII同工型B多肽包含与TβRII同工型B胞外结构域aa序列的至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列: 如下讨论,F30、D32、S52、E55或D118(斜体和粗体)中的任何一者或多者可在那些位置处被除天然存在的aa以外的氨基酸(例如,丙氨酸)取代。掩蔽TGF-β的多肽序列可包含带有D118A或D118R取代的SEQ ID NO:119多肽。掩蔽TGF-β的序列可包含带有D118A或D118R取代以及F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一者或多者的SEQ ID NO:119肽。
虽然TβRII的胞外结构域可用作掩蔽多肽,但所述蛋白质的区域具有带电和疏水性区块,其可产生不利的pI并且可对表达多肽的细胞有毒性。另外,将TβRII胞外结构域与活性TGF-β多肽组合可产生复合物,所述复合物可与细胞表面TβRI组合并且导致所述信号传导受体的激活(例如,通过Smad通路进行信号传导)。通过去除或改变涉及TβRI缔合的序列来修饰用于掩蔽TGF-β的TβRII胞外结构域序列可避免细胞除了通过其自身细胞表面异二聚体TβRI/TβRII复合物以外由掩蔽的TGF-β进行的无意刺激。TβRII的修饰还可改变(例如,降低)TβRII对TGF-β(例如,TGF-β3)的亲和力,由此允许控制TGF-β去掩蔽及其作为信号传导分子的可利用性。包含对TGF-β(例如,TGF-β3)具有最高亲和力的TβR(例如,TβRII)肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物最紧密地掩蔽TGF-β序列并且需要更高剂量来达到相同作用。相比之下,TβRII中降低亲和力的aa取代使TGF-β多肽去掩蔽并且在较低剂量下是生物有效的。参见例如实施例3。
因此,当需要通过TβRI来阻断/限制由掩蔽的TGF-β多肽进行的信号传导和/或修改(例如,降低)掩蔽TβRII多肽对TGF-β的亲和力时,对TβRII的许多改变可掺入TβRII多肽序列中。可制造的修饰包括1至25aa长度的N末端25个氨基酸的上述缺失(例如Δ14,Δ25)和/或L27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118和/或E119中的一者或多者的取代。造成TβRI与TβRII的缔合减少和对TGF-β的亲和力降低的一些特定修饰包括基于SEQ IDNO:119的以下任何一者或多者:L27A、F30A、D32A、D32N、S49A、I50A、T51A、S52A、S52L、I53A、E55A、V77A、D118A、D118R、E119A和/或E119Q。参见例如J.Groppe等人Mol Cell 29,157-168,(2008)和De Crescenzo等人JMB 355,47-62(2006)。关于那些取代对TGF-β3-TβRII和TβRI-TβRII复合物的作用,参见图X。TβRII的修饰包括N末端Δ25缺失和/或F24处的取代(例如,F24A取代),其实质上或完全阻断通过典型SMAD信号传导通路的信号。在一个方面,成熟TβRII B同工型(SEQ ID NO:119)的位置118处的天冬氨酸(D118)被除Asp或Glu以外的氨基酸诸如Ala替换,产生“D118A”取代,或被Arg替换,产生D118R取代。对应于D118的Asp残基在SEQ ID NO.117-123中指示(在图5B中,呈粗体并加下划线)。1至25aa长度的N末端缺失(例如,Δ25缺失)和/或F24处的取代(例如,F24A取代)可与D118取代(例如,D118A或D118R)组合。1至25aa长度的N末端缺失(例如,Δ25缺失)和/或F24处的取代(例如,F24A取代)还可与L27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118和/或E119(例如,D118A)取代中的任一者的取代和尤其针对上述SEQ ID NO:119中的那些位置列举的改变亲和力的特定取代中的任一者组合。
TβRII多肽的N末端的缺失还可造成TβRI相互作用的丧失并且防止包含TβRII多肽的掩蔽的TGF-β构建体和复合物充当衔接并激活TβRI信号传导的组成型活性复合物。TβRII多肽的14aa缺失(Δ14)实质上减少蛋白质与TβRI的相互作用,并且TβRII的Δ25aa缺失似乎完全消除与TβRI的相互作用。N末端缺失还实质上改变蛋白质的pI,其中Δ14TβRII胞外结构域突变体展现出约4.5-5.0(例如,约4.74)的pI。因此,TGF-β构建体或复合物可包含具有诸如14至25aas(例如,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25aa)的N末端缺失的TβRII胞外结构域多肽(例如,SEQ ID NO:117或118的多肽)。可用于掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β多肽的修饰的胞外结构域序列(包括限制与TβRI的相互作用的那些序列)在以下段落中描述。
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含与TβRII同工型B胞外结构域序列的至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的序列: F30、D32、S52、E55或D118(斜体和粗体)中的任何一者或多者可在那些位置处被除天然存在的aa以外的氨基酸(例如,丙氨酸)取代。在一个实施方案中,掩蔽TGF-β的序列包含带有D118A取代的SEQ ID NO:120肽。在一个实施方案中,掩蔽TGF-β的序列包含带有D118A取代以及F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一者或多者的SEQ ID NO:120多肽。
阻断由于掩蔽的TGF-β/TβRII复合物与TβRI相互作用引起的无意细胞信号传导的诸如14至25aas(例如,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25aa)的TβRII的N末端缺失的组合可与其他TβRII胞外结构域取代(包括在F30、D32、S52、E55和/或D118中的任何一者或多者处的那些取代)组合。缺失和取代的组合确保掩蔽的TGF-β构建体或复合物不引起细胞信号传导,通过细胞的膜结合TβRI和TβRII受体的除外。
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含与TβRII同工型B胞外结构域序列的至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的序列: 其具有aas 1-14(Δ14)缺失。F30、D32、S52、E55或D118(斜体和粗体)中的任何一者或多者可在那些位置处被除天然存在的aa以外的氨基酸(例如,丙氨酸)取代。在一个实施方案中,掩蔽TGF-β的序列包含带有D118A取代的SEQ ID NO:120肽。在一个实施方案中,掩蔽TGF-β的序列包含带有D118A取代以及F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一者或多者的SEQ ID NO:121多肽。
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含与以下序列的至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的序列: 其具有aas 1-25(Δ25)缺失。F30、D32、S52、E55或D118(斜体和粗体)中的任何一者或多者可在那些位置处被除天然存在的aa以外的氨基酸(例如,丙氨酸)取代。在一个实施方案中,掩蔽TGF-β的序列包含带有D118A取代的SEQ ID NO:122多肽(在图5B中显示为SEQ ID NO:123)。在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含带有D118A取代以及F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一者或多者的SEQ ID NO:122肽。在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含(参见图5B)带有D118A和F30A取代的SEQ ID NO:122肽。在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含(参见图5B)带有D118A和D32N取代的SEQ ID NO:122肽。在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含(参见图5B)带有D118A和S52L取代的SEQ ID NO:122肽。在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的序列包含(参见图5B)带有D118A和E55A的SEQ ID NO:122肽。
c.TGF-β受体III(TβRIII)
在一个实施方案中,掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β的多肽序列可来源于TβRIII(例如,同工型A SEQ ID NO:124和同工型B 125),并且可包含TβRIII胞外结构域(A同工型的aas 27-787或B同工型的27-786)的全部或一部分。在一些情况下,用于掩蔽TGF-β的合适的TβRIII多肽包含与TβRIII A同工型或B同工型胞外结构域序列的至少70、至少80、至少90、至少100或120aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性的氨基酸序列(例如,在图5C中作为SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125提供)。
2抗体
虽然TGF-β受体多肽(例如,胞外结构域序列)可起到结合并掩蔽掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β多肽的作用,但结合至TGF-β序列的其他多肽序列(蛋白质序列)还可用作掩蔽多肽。在可用于掩蔽TGF-β的合适多肽或蛋白质序列中,有对TGF-β具有亲和力的抗体(例如,对TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中的一种或多种具有特异性的抗体)或其片段、对TGF-β多肽具有亲和力的纳米抗体以及尤其是单链抗TGF-β抗体(例如,其中的任一种可以是人源化的)。已描述结合并中和TGF-β的一些抗体,包括scFV抗体。参见例如US 9,090,685。在本公开描述的本发明的整个实施方案和/或方面中,用于掩蔽TGF-β多肽的TβR(例如,TβRII)序列可用对TGF-β多肽具有亲和力的掩蔽抗体序列(例如,scFV或纳米抗体)替换。例如,在其中TGF-β受体序列用于掩蔽TGF-β多肽的图1的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的每个中,受体多肽可用对TGF-β多肽具有亲和力的掩蔽抗体多肽(例如,scFV或纳米抗体)替换。
使用抗体(例如,单链抗体)作为掩蔽多肽的一个潜在优势是将其限于待掩蔽的TGF-β多肽的同工型的能力。例如,基于针对TGF-β1的美替木单抗(CAT192)的单链抗体序列(例如,Lord等人,mAbs 10(3):444-452(2018))可用于掩蔽存在于TGF-β构建体或复合物中的所述TGF-β同工型。在另一个实施方案中,对TGF-β2具有特异性的单链抗体序列用于掩蔽存在于TGF-β构建体或复合物中的所述TGF-β同工型。在另一个实施方案中,对TGF-β3具有特异性的单链抗体序列用于掩蔽存在于TGF-β构建体或复合物中的所述TGF-β同工型。单链抗体还可对TGF-β同工型的组合具有特异性(例如,出现在选自由以下组成的组的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的胞外结构域序列:TGF-β1和TGF-β2;TGF-β1和TGF-β3;以及TGF-β2和TGF-β3。单链抗体还可对出现在掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3胞外结构域序列具有泛特异性,参见例如WO2014/164709。对TGF-β同工型具有所期望特异性和亲和力的抗体和单链抗体可通过多种方法制备,包括筛选杂交瘤和/或对靶TGF-β多肽序列具有亲和力的抗体的可变区序列的修饰(例如,组合修饰)。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含单链抗体以掩蔽TGF-β序列(例如,TGF-β3序列)。在一个此类实施方案中,单链氨基酸序列对包含C77S取代的SEQ IDNO:111中列示的TGF-β3(参见SEQ ID NO:112)具有特异性。
H.接头如上所示,掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包括介于掩蔽的TGF-β构建体或复合物的任何两个元件之间的接头肽/多肽序列。虽然采用术语“接头”,但以下描述为接头的相同序列还可放置在掩蔽的TGF-β构建体或复合物的多肽的N末端和/或C末端以便例如防止蛋白水解降解。
合适的接头(也称为“间隔物”)可容易选择并且可以是许多合适长度中的任一个,诸如1aa至25aa、3aa至20aa、2aa至15aa、3aa至12aa、4aa至10aa、5aa至9aa、6aa至8aa、或7aa至8aa。合适的接头的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25aa。合适的接头的长度可以是25至35aa。合适的接头的长度可以是25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35aa。合适的接头的长度还可以是35至45aa。合适的接头的长度可以是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45aa。合适的接头的长度可以是45至50aa。合适的接头的长度可以是45、46、47、48、49或50aa。
示例性接头包括包含甘氨酸的那些接头,或含有约2至约50(例如,2-4、4-7、7-10、10-20、20-35或35-50)个连续甘氨酸残基的序列的聚甘氨酸;甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如,(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:126)和(GGGS)n(SEQ ID NO:127),其中n是至少1的整数(例如,1-10、10-20或20-30);甘氨酸-丙氨酸聚合物或丙氨酸-丝氨酸聚合物(例如,具有1-10、10-20或20-30aa的长度);以及本领域已知的其他可柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物;Gly和Ser都是相对非结构化的,并且因此可充当组分之间的中性系链。可使用甘氨酸聚合物;甘氨酸甚至比丙氨酸显著更易进入(assess)phi-psi空间,并且比具有更长侧链的残基受限少得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性接头可包含氨基酸序列,包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:128)、GGSGG(SEQ ID NO:129)、GSGSG(SEQ ID NO:130)、GSGGG(SEQ ID NO:131)、GGGSG(SEQ ID NO:132)、GSSSG(SEQID NO:133)等。示例性接头可包含例如可重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次的GGSG(SEQ ID NO:134)。在一些情况下,接头包含可重复2、3或4次的氨基酸序列(GSSSS)(SEQ ID NO:135)。在一些情况下,接头包含重复四或五次的氨基酸序列(GSSSS)(SEQ ID NO:135)。示例性接头可包括例如可重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次的(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情况下,接头包含重复一次或2次的氨基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情况下,接头包含重复3或4次的氨基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情况下,接头包含重复5、6或7次的氨基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情况下,接头包含重复8、9或10次的氨基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。
在一些情况下,存在于掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽中的接头多肽包括可与存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第二多肽中的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基。在一些情况下,例如,合适的接头包含氨基酸序列
I.示例性掩蔽的TGF-β构建体和复合物
如以上讨论,在本公开中描述的掩蔽的TGF-β构建体和复合物的任一种中,结合至并掩蔽TGF-β多肽序列的掩蔽多肽可采用多种形式。掩蔽肽可以是抗体,抗体的结合片段、单链抗体或其结合TGF-β的部分(例如,scFv)、或纳米抗体;其中的任一种可以是人源化的。掩蔽多肽还可以是TGF-β受体片段(例如,TβRI、TβRII或TβRIII的胞外结构域序列),其包含足以结合TGF-β多肽(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)的多肽序列。
在上述掩蔽的TGF-β构建体和复合物的任一种中,所使用的TGF-β多肽序列可基于TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。在一个实施方案中,TGF-β多肽包含TGF-β3序列。在掩蔽的TGF-β构建体和复合物中并不需要全长成熟TGF-β蛋白序列,仅需要与细胞表面TβRII相互作用并且允许与细胞表面TβRII的掩蔽的TGF-β复合物募集TβRI并由此启始信号传导(例如通过Smad和非Smad通路的信号传导)的TGF-β的部分。
虽然免疫调节多肽(MOD)不是递送掩蔽的TGF-β或其如以上所示活化带有TβRI和TβRII的细胞的能力所需的,MOD的存在可实质上影响TGF-β细胞活化的结果。因此,将MOD掺入任何上述掩蔽的TGF-β构建体和复合物中可用于驱动由于使用本文所述的掩蔽的TGF-β构建体和复合物所产生的各种结果,包括治疗结果。在一个实施方案中,存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的MOD选自由以下组成的组:PD-L1、Fas-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-21、IL-23及其任一种的变体,包括对其共MOD具有降低的亲和力的那些变体。
虽然可能需要将MOD掺入掩蔽的TGF-β构建体和复合物中,但其存在在所有情况下不是必需的,尤其当掩蔽的TGF-β构建体和复合物与其他材料一起施用时,包括细胞因子(例如,一种或多种独立选择的白细胞介素、淋巴因子、干扰素、趋化因子和/或肿瘤坏死因子)。例如,当需要通过促进胸腺细胞表达白细胞介素7受体(例如,IL-7Ra)来支持传统CD8+T细胞的发育(或低亲和力CD8+T细胞的存活)时,可采用没有MOD多肽(“无MOD”)的掩蔽的TGF-β构建体和复合物。类似地,当需要促进由强激动剂配体诱导的T-细胞群的发育时,可采用含有MOD或无MOD的掩蔽的TGF-β构建体和复合物来支持胸腺衍生的Treg(tTreg)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)和CD8αα+T-细胞前体的存活。
以下是掩蔽的TGF-β构建体和复合物的非限制性实例。
1掩蔽的TGF-β构建体
在掩蔽的TGF-β构建体的情况下,所有组分(例如,TGF-β、支架、掩蔽多肽诸如TβRII序列、和任选地一个或多个MOD)是单一多肽链的部分(参见例如,图1,结构A)。在此实施方案中,支架多肽不与其他支架多肽形成二聚体或高阶结构,并且因此掩蔽的TGF-β构建体不呈同二聚体、异二聚体或高阶多聚体结构(三聚体等)形式。
在图1中的掩蔽的TGF-β构建体的情况下,结构A多肽可从N末端至C末端包含:任选地一个或多个MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的多肽;以及TGF-β多肽序列。
此类掩蔽的TGF-β构建体包括以下构建体,其中:
(i)多肽从N末端至C末端包含:任选地一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的TβR多肽;和TGF-β多肽序列;
(ii)多肽从N末端至C末端包含:任选地一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的TβRII多肽;和TGF-β多肽序列;
(iii)多肽从N末端至C末端包含:一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的TβR多肽;和TGF-β多肽序列;
(iv)多肽从N末端至C末端包含:一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体IL-2 MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的TβR多肽;和TGF-β多肽序列;
(v)多肽从N末端至C末端包含:一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β3多肽的TβR多肽;和TGF-β3多肽序列;
(vi)多肽从N末端至C末端包含:一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β3多肽的TβRII多肽;和TGF-β3多肽序列;以及
(vii)多肽从N末端至C末端包含:一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体IL-2 MOD;支架多肽(没有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β3多肽的TβRII多肽;和TGF-β3多肽序列。
在本文所述的掩蔽的TGF-β构建体的任何情况下,TGF-β多肽序列的C77被经取代以防止二聚化(例如,C77S取代),并且TGF-β多肽可进一步(例如,在aas 25、92和/或94的一者、两者或所有三者处)包含降低其对掩蔽TβR多肽的亲和力的变异,以及MOD和TβR多肽序列中的修饰。可掺入掩蔽的TGF-β构建体中的示例性TβR多肽序列包括任选地具有D118A或D118R取代以减弱TβRI衔接的Δ14或Δ25TβRII多肽。描述了MOD变体以及其多肽序列并且TβRI、TβRII和TβRIII的额外修饰如上所述。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体具有SEQ ID NO:146中列示的序列(参见图7A)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体具有SEQ ID NO:147中列示的序列(参见图7B)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体具有SEQ ID NO:157中列示的序列(参见图7G)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体具有SEQ ID NO:158中列示的序列(参见图7H)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体具有SEQ ID NO:159中列示的序列(参见图7I)。
2掩蔽的TGF-β复合物
掩蔽的TGF-β复合物包含至少两个多肽,第一多肽和第二多肽,其各自含有与另一支架多肽缔合的支架多肽,使第一多肽与第二多肽结合在一起成为复合物。因此,TGF-β多肽复合物形成同二聚体、异二聚体或高阶多聚体结构:
(i)在第一种情况下,掩蔽的TGF-β复合物包含至少一个TGF-β多肽序列、结合至并掩蔽一个或多个TGF-β多肽的至少一个多肽(例如,用于每个TGF-β多肽序列的掩蔽序列)和任选地在可二聚化以形成同二聚体(例如,对称二聚体)的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD),如在图1结构B中。在此类同二聚体中,Ig Fc多肽可允许在每个构建体的支架中的Ig Fc多肽之间自发形成二硫键,并且可包括突变(例如,本文讨论的LALA突变),其实质上降低或消除Ig多肽例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来诱导细胞溶解的能力。
(ii)在第二种情况下,掩蔽的TGF-β复合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一个TGF-β多肽序列、结合至并掩蔽一个或多个TGF-β多肽的至少一个多肽(例如,用于每个TGF-β多肽序列的掩蔽序列)和任选地在包含种间二聚化序列的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含至少一个TGF-β多肽序列、结合至并掩蔽至少一个TGF-β多肽的至少一个多肽和任选地在包含第一多肽的种间二聚化序列的对应物的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD);
其中第一多肽与第二多肽通过种间二聚化序列的相互作用形成异二聚体,如在图1结构C中。
(iii)在第三种情况下,掩蔽的TGF-β复合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一个TGF-β多肽序列、结合至并掩蔽至少一个或多个TGF-β多肽的至少一个多肽(例如,用于每个TGF-β多肽序列的掩蔽序列)和任选地在包含种间二聚化序列的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含含有第一多肽的种间二聚化序列的对应物的支架结构和任选地一个或多个免疫调节多肽(MOD);
其中第一多肽与第二多肽通过种间二聚化序列的相互作用形成异二聚体,如在图1结构F中,以及
(iv)在第四种情况下,掩蔽的TGF-β复合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一个TGF-β多肽序列和任选地,在包含种间二聚化序列的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含结合至并掩蔽至少一个或多个TGF-β多肽的至少一个多肽和任选地在包含第一多肽的种间二聚化序列的对应物的支架结构上组装的一个或多个免疫调节多肽(MOD);
其中第一多肽与第二多肽通过种间二聚化序列的相互作用形成异二聚体,如在图1结构D和E中。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物(图1,结构B、C和F),构成TGF-β多肽(第一多肽)的序列可从N末端至C末端包含:任选地一个或多个MOD;支架多肽(具有或不具有种间结合序列);结合至并掩蔽TGF-β多肽的多肽;和TGF-β多肽序列。不含图1结构F中的TGF-β序列的多肽(第二多肽)包含具有种间结合序列的支架多肽并且任选地在N末端、C末端或N末端和C末端两者处包含MOD。
在一些情况下,在图1结构D和E中的掩蔽的TGF-β复合物,含有TGF-β多肽序列的多肽(第一多肽)可从N末端至C末端包含:一个或多个任选的MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β多肽序列。在图1结构D和E中的不含TGF-β序列的多肽(第二多肽)可从N末端至C末端包含:任选地一个或多个MOD、具有种间结合序列的支架多肽和结合至并掩蔽TGF-β多肽的多肽。虽然未在图1中说明,但包含TGF-β多肽序列的第一多肽可不含一个或多个MOD并且包含掩蔽序列的第二多肽可包含一个或多个MOD。
掩蔽的TGF-β复合物的上述情况包括其中第一多肽从N末端至C末端包含以下各项的那些复合物:
(i)任选地一个或多个MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β多肽序列;
(ii)任选地一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β多肽序列;
(iii)一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β1或2多肽序列;
(iv)一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体IL-2MOD;支架多肽(不具有种间结合序列);和TGF-β多肽序列;
(v)一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β3多肽序列;
(vi)一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β3多肽序列;或
(vii)一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体IL-2MOD;支架多肽(具有种间结合序列);和TGF-β3多肽序列。在每种情况下,第二多肽从N末端至C末端包含:包含第一多肽的种间结合(二聚化序列)的对应物的支架多肽,随后是结合至并掩蔽第一多肽的TGF-β多肽的TβR(例如,TβRII)多肽。在如图1结构F中的掩蔽的TGF-β复合物的情况下,TβR(例如,TβRII)多肽可介于N末端MOD(如存在)与第一多肽的支架之间,并且第二多肽包含第一多肽的种间结合(二聚化序列)的对应物,一个或多个独立选择的wt.或亲和力降低的变体MOD(例如,wt.或变体IL-2 MOD)可在N末端或C末端处附接至所述对应物。
在本文所述的掩蔽的TGF-β复合物的任何情况下,TGF-β多肽序列的C77可被取代以防止二聚化(例如,C77S取代),并且TGF-β多肽可进一步(例如,在aas 25、92和/或94的一者、两者或所有三者处)包含降低其对掩蔽TβR多肽的亲和力的变异,以及在MOD和TβR多肽序列中的修饰。可掺入掩蔽的TGF-β构建体中的示例性TβR多肽序列包括任选地具有D118A取代的Δ14或Δ25TβRII多肽。描述了MOD变体以及其多肽序列,并且TβRI、TβRII和TβRIII的额外修饰如上所述。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含具有SEQ ID NO:148和149中列示的序列的多肽(参见图7C)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含具有SEQ ID NO:150和151中列示的序列的多肽(参见图7D)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含具有SEQ ID NO:152和153中列示的序列的多肽(参见图7E)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含具有SEQ ID NO:155和156中列示的序列的多肽(参见图7F)。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β复合物包含具有SEQ ID NO:148和160中列示的序列的多肽(参见图7J)。
J.核酸
本公开提供一种包含编码掩蔽的TGF-β构建体和复合物的核苷酸序列的核酸。在一些情况下,核酸是重组表达载体;因此,本公开提供一种包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的重组表达载体。在一些情况下,核酸是重组表达载体;因此,本公开提供一种包含编码多个掩蔽的TGF-β构建体和复合物的核苷酸序列的重组表达载体。以下关于核酸的讨论涉及编码本公开的掩蔽的TGF-β构建体和复合物的核酸。
编码单链抗原呈递多肽的核酸
如上所述,掩蔽的TGF-β构建体包含单一多肽链。因此,本公开提供一种包含编码单链掩蔽的TGF-β构建体的核苷酸序列的核酸。包含编码单链掩蔽的TGF-β构建体的核苷酸序列的核酸可以可操作地连接至转录控制元件,例如,启动子。
编码掩蔽的TGF-β复合物的核酸
如上所示,在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物包含至少两个单独多肽链(第一多肽链和第二多肽链)。本公开提供包含编码掩蔽的TGF-β复合物的核苷酸序列的核酸。在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物的个别多肽链在单独的核酸中编码。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物的所有多肽链在单一核酸中编码。在一些情况下,第一核酸包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽的核苷酸序列;并且第二核酸包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下,单一核酸包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第一和第二多肽的核苷酸序列,其可以可操作地连接单一启动子或两个独立选择的启动子并且在其转录控制下。
编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的个别多肽链的单独核酸
如上所示,在一些情况下,掩蔽的TGF-β复合物的个别多肽链由单独的核酸编码。在一些情况下,编码掩蔽的TGF-β复合物的单独多肽链的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件,例如启动子,诸如在真核细胞中起作用的启动子,其中所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。
例如,本公开提供第一核酸和第二核酸,其中第一核酸包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽的核苷酸序列,并且其中第二核酸包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下,编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下,转录控制元件是在真核细胞中起作用的启动子。在一些情况下,核酸存在于单独的表达载体中。
在一些情况下,编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下,转录控制元件是在真核细胞中起作用的启动子。在一些情况下,核酸存在于单独的表达载体中。
编码存在于掩蔽的TGF-β复合物中的两个或更多个多肽的核酸
本公开提供一种核酸,其包含至少编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下,在掩蔽的TGF-β复合物包括第一多肽、第二多肽和第三多肽时,核酸包括编码第一多肽、第二多肽和第三多肽的核苷酸序列。在一些情况下,编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列编码介于所编码的第一多肽与第二多肽之间的蛋白水解可裂解位点或接头。在一些情况下,编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列包括编码介于所编码的第一多肽与第二多肽之间的内部核糖体进入位点(IRES)的核苷酸。在一些情况下,编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列包括编码介于编码第一多肽的核苷酸序列与编码第二多肽的核苷酸序列之间的核糖体跳跃信号(或顺式作用水解酶元件,CHYSEL)的序列。
在一些情况下,第一核酸(例如,重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第一多肽链的核苷酸序列;并且第二核酸(例如,重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码掩蔽的TGF-β复合物的第二多肽链的核苷酸序列。在一些情况下,编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列各自可操作地连接至独立选择的转录控制元件,例如启动子,诸如在真核细胞中起作用的启动子,其中所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。
重组表达载体
本公开提供包含核酸的重组表达载体。在一些情况下,重组表达载体是非病毒载体。在一些情况下,重组表达载体是病毒构建体,例如重组腺相关病毒构建体(参见例如美国专利号7,078,387)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体、非整合病毒载体等。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如,基于以下的病毒载体:牛痘病毒;脊髓灰质炎病毒;腺病毒(参见例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999;Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamo to等人,H Gene Ther 5:1088 1097,1999;WO 94/12649、WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984和WO 95/00655);腺相关病毒(参见例如Ali等人,HumGene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等人,InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997;Jomary等人,Gene Ther 4:683690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999;Ali等人,Hum Mol Genet 5:591 594,1996;Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828;Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165;以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617);SV40;单纯疱疹病毒;人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,PNAS 94:1031923,1997;Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999);逆转录病毒载体(例如,鼠类白血病病毒、脾坏死病毒和来源于逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体);等。大量合适的表达载体是本领域技术人员已知的,并且许多表达载体是可商购获得的。
根据所利用的宿主/载体系统,在表达载体中可使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种,包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些情况下,编码掩蔽的TGF-β构建体和复合物的多肽的核苷酸序列可操作地连接至控制元件,例如,转录控制元件,诸如启动子。转录控制元件可在真核细胞例如哺乳动物细胞;或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)中起作用。在一些情况下,编码DNA靶向RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接至允许编码DNA靶向RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列在原核细胞和真核细胞两者中表达的多个控制元件。
合适的真核细胞启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自以下的那些启动子:巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I。适当的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的水平内。表达载体还可含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包括用于扩增表达的适当序列。
表达掩蔽的TGF-β构建体和复合物的遗传修饰的宿主细胞的制备和掩蔽的TGF-β构建体和复合物的纯化
本公开提供一种遗传修饰的宿主细胞,其中宿主细胞用编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸来遗传修饰。
合适的宿主细胞包括真核细胞,诸如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些情况下,宿主细胞是哺乳动物细胞系的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如,美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(例如,ATCC号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如,ATCC号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如,ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如,ATCC号CCL10)、PC12细胞(ATCC号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
遗传修饰的宿主细胞可用于产生掩蔽的TGF-β构建体或复合物。例如,遗传修饰的宿主细胞可用于产生掩蔽的TGF-β复合物,或单链掩蔽的TGF-β构建体,方法是通过将包含编码多肽的核苷酸序列的表达载体,诸如如上所述的表达载体,引入宿主细胞中,由此产生遗传修饰的宿主细胞。宿主细胞可组成性地表达掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或响应于暴露于诱导物而表达,其中驱动表达的启动子是可诱导的(例如,CMV启动子和通过暴露于四环素来诱导的抗四环素操纵子)。
掩蔽的TGF-β构建体或复合物获自细胞,或如果通过掺入信号序列将多肽靶向分泌途径,则获自细胞培养基。蛋白质可通过本领域已知的任何手段来纯化,包括例如以下中的一种或多种:沉淀(例如,硫酸铵或乙醇)、等电聚焦和一种或多种类型的色谱。合适的色谱方法包括但不限于基于尺寸的色谱分离(例如,尺寸排阻或凝胶渗透)、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱和亲和色谱。当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含免疫球蛋白多肽序列(例如,作为支架)时,蛋白A或蛋白G可用于亲和纯化掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在不存在免疫球蛋白多肽的情况下,复合物可使用针对存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的多肽的抗体进行亲和纯化;或可选地,通过掺入亲和标签诸如myc表位(CEQKLISEEDL SEQID NO:154)、“HIS”标签(用于二价金属离子树脂结合)或“FLAG”标签。可与任何前述方法组合的纯化和/或浓缩步骤采用尺寸受限的半透膜(例如,透析膜或压敏元件),其可用于去除具有实质上不同分子量的污染物和/或浓缩纯化的蛋白质。
在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体或复合物从引入哺乳动物细胞(例如,CHO细胞)中并且靶向分泌途径的核酸序列表达以使得其从细胞分泌至其培养基(例如,无血清培养基)中。使用单独或与基于尺寸的分离(例如,基于尺寸的色谱或膜分离)组合的亲和色谱,将掩蔽的TGF-β构建体或复合物自细胞培养基中纯化。在此实施例的特定实例中,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含免疫球蛋白支架(例如,IgG多肽序列),并且纯化系通过单独或与基于尺寸的分离(基于尺寸的色谱)组合的亲和色谱(例如,蛋白A或G)完成。
K.组合物
本公开提供包含掩蔽的TGF-β构建体或复合物的组合物,包括药物组合物。本公开还提供包含核酸或重组表达载体的组合物,包括药物组合物。
1包含掩蔽的TGF-β构建体或复合物的组合物
除了掩蔽的TGF-β构建体或复合物以外,本公开的组合物还可包含以下中的一种或多种:盐,例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等;缓冲剂,例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等;增溶剂;清洁剂,例如非离子性清洁剂,诸如Tween-20等;蛋白酶抑制剂;甘油;等。
组合物可包含药学上可接受的赋形剂,多种赋形剂是本领域已知的标签不必在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在多种出版物中充分描述,包括例如“Remington:The Science and Practice of P harmacy”,第19版(1995)或最新版,Mack PublishingCo;A.Genn aro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins;Pharmaceutical Dosage For ms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel等人编,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins;以及Handbookof Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编,第3版,Amer.PharmaceuticalAssoc。
药物组合物可包含:i)掩蔽的TGF-β构建体或复合物;和ii)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下,本发明药物组合物将适于向受试者施用,例如将是无菌的。例如,在一些实施方案中,本发明药物组合物适于向人受试者施用,例如其中组合物是无菌的并且实质上不含可检测的热原和/或其他毒素,或其中此类可检测的热原和/或其他毒素以由适当监管机构例如美国食品药物管理局(USF&DA)设定的可接受限度内的水平存在。
蛋白质组合物可包含其他组分,诸如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质,诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等,例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、盐酸盐、硫酸盐、溶剂化物(例如,混合的离子盐、水、有机物)、水合物(例如,水)等。
例如,组合物可包括水溶液、粉末形式、颗粒、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、混悬液、喷雾剂等。组合物可根据下文所述的各种施用途径进行配置。
在利用掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,引入细胞培养系统中)或作为可注射物(例如,皮下、腹膜内、肌肉内、淋巴内和/或静脉内)直接施用至组织中时,制剂可以即用剂型或以非水性形式(例如,可复原的保存稳定的粉末)或水性形式(诸如,由药学上可接受的载剂和赋形剂构成的液体)提供。含有蛋白质的制剂还可在施用之后增加本发明蛋白质的血清半衰期的形式提供。例如,所述蛋白质可提供于脂质体制剂中,制备为胶体,或用于延长血清半衰期的其他常规技术。多种方法可用于制备脂质体,如例如在Szoka等人1980Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467、美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028号中所描述。制剂还可以受控释放或缓慢释放形式提供。
在一些情况下,组合物包含:a)掩蔽的TGF-β构建体或复合物;和b)盐水(例如,0.9%NaCl)。在一些情况下,组合物是无菌的。在一些情况下,组合物适于向人受试者施用,例如其中组合物是无菌的并且实质上不含可检测的热原和/或其他毒素,或其中此类可检测的热原和/或其他毒素以可接受限度内的量存在。因此,本公开提供一种包含以下各者的组合物:a)掩蔽的TGF-β构建体或复合物;和b)盐水(例如,0.9%NaCl),其中组合物是无菌的并且实质上不含可检测的热原和/或其他毒素,或其中此类可检测的热原和/或其他毒素以可接受限度内的量存在。
适于胃肠外施用的制剂的其他实例包括等渗无菌注射溶液、抗氧化剂、抑菌剂、和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。例如,本发明药物组合物可存在于容器,例如无菌容器,诸如注射器中。制剂可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供,并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下,其仅需要在临使用前添加无菌液体赋形剂,例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可从无菌散剂、颗粒和片剂制备。
制剂中掩蔽的TGF-β构建体或复合物的浓度可广泛地变化,诸如按重量计小于约0.1%(通常为或至少为约2%)至多达20%至50%或更大(例如,按重量计0.1%至1%、1%至5%、5%至10%、10%至20%、或20%至50%)并且通常根据所选的特定施用模式和患者需要,主要基于流体体积、粘度和基于患者的因素来选择。
本公开提供一种包含组合物(例如液体组合物)的容器。容器可以是例如注射器、安瓿等。在一些情况下,容器是无菌的。在一些情况下,容器和组合物二者都是无菌的。
2包含核酸或重组表达载体的组合物
本公开提供包含本公开的核酸或重组表达载体的组合物,例如药物组合物。多种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的并且无需在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多个出版物中,包括例如A.Gennaro(2000)“Remington:The Science andPractice of Pharmacy”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins;PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins;以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编,第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
本公开的组合物可包含:a)一种或多种核酸或一种或多种重组表达载体,其包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列;以及b)以下中的一种或多种:缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂、亲水性聚合物、糊精、螯合剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、抑菌剂、润湿剂和防腐剂。合适的缓冲剂包括但不限于(诸如N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)、甘氨酰甘氨酸、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢钠、3-(N-三(羟甲基)-甲基-氨基)-2-羟基-丙磺酸)TAPSO、(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)、三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)等)。合适的盐包括例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等。
药物制剂可包含约0.001%至约99%(w/w)(例如,0.001-0.1、0.1-1.0、1.0-10、10-20、20-40、40-80或80-100%w/w)的量的核酸或重组表达载体。在制剂的以下描述中,“主题核酸或重组表达载体”应理解为包括核酸或重组表达载体。例如,在一些情况下,本发明制剂包含核酸或重组表达载体。
本发明核酸或重组表达载体可与其他化合物或化合物的混合物掺合,用其他化合物或化合物的混合物包封,与其他化合物或化合物的混合物缀合,或以其他方式与其他化合物或化合物的混合物缔合;此类化合物可包括例如脂质体或受体靶向分子。本发明核酸或重组表达载体可与帮助摄取、分布和/或吸收的一种或多种组分一起组合于制剂中。
本发明核酸或重组表达载体组合物可被配置成许多可能剂型中的任一种,诸如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明核酸或重组表达载体组合物还可被配置成水性、非水性或混合介质中的混悬液。水性混悬液可进一步含有增加混悬液粘度的物质,包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬液还可含有稳定剂。
包含本发明核酸或重组表达载体的制剂可以是脂质体制剂。如本文所用,术语“脂质体”意指由以一个或多个球形双层排列的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡,其具有由亲脂性材料形成的膜和含有待递送的组合物的水性内腔。阳性脂质体是带正电脂质体,其可与带负电DNA分子相互作用以形成稳定复合物。pH敏感性或带负电的脂质体被认为截留DNA,而非与其复合。阳离子和非阳离子脂质体都可用于递送本核酸或重组表达载体。
脂质体还包括“空间上稳定的”脂质体,如本文所用,所述术语是指包含一种或多种特化脂质的脂质体,所述特化脂质当掺入脂质体中时导致其循环寿命相对于缺乏此类特化脂质的脂质体有所增加。空间上稳定的脂质体的实例是如下的那些,其中脂质体的囊泡形成脂质的一部分包含一种或多种糖脂或以一种或多种亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。脂质体及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中,其以引用方式整体并入本文。
制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳液中的用途是本领域众所周知的。表面活性剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。
在一个实施方案中,包括各种渗透增强剂以实现核酸的有效递送。除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜以外,渗透增强剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透增强剂可分类为属于五大类别之一,即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透增强剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中,其以引用方式整体并入本文。
用于经口施用的组合物和制剂包括散剂或颗粒、微粒、纳米颗粒、水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或微型片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。合适的口服制剂包含如下的那些,其中本发明反义核酸与渗透增强剂表面活性剂和螯合剂中的一种或多种一起施用。合适的表面活性剂包括但不限于脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。合适的胆酸/盐和脂肪酸及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。渗透增强剂,例如脂肪酸/盐与胆酸/盐组合的组合也是合适的。示例性的合适组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括但不限于聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚。合适的渗透增强剂还包括丙二醇、二甲基亚砜、三乙醇胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮及其衍生物、四氢糠醇和AZONETM。
L.制剂
合适的制剂如上所述,其中组合物具有药学上可接受的级别(例如,组合物包括药学上可接受的赋形剂和活性分子)。在一些情况下,合适的制剂包含:a)掩蔽的TGF-β构建体或复合物;和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下,合适的制剂包含:a)包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的核酸;和b)药学上可接受的赋形剂;在一些情况下,核酸是mRNA。在一些情况下,合适的制剂包含:a)第一核酸,其包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第一多肽的核苷酸序列;b)第二核酸,其包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第二多肽的核苷酸序列;和c)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下,合适的制剂包含:a)包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的重组表达载体;和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下,合适的制剂包含:a)第一重组表达载体,其包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第一多肽的核苷酸序列;b)第二重组表达载体,其包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第二多肽的核苷酸序列;和c)药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂在上文中描述。
M.方法
掩蔽的TGF-β构建体或复合物适于调节T细胞的活性。因此,本公开提供调节T细胞活性的方法,所述方法通常涉及使靶T细胞与掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触。
1调节免疫细胞活性的方法,包括产生、刺激或抑制特定的免疫细胞类型。
本公开提供一种选择性地调节表达TβRI和TβRII的细胞的活性的方法,所述方法包括使细胞(例如,T细胞、B细胞和先天细胞,包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞)与掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触,其中T细胞与掩蔽的TGF-β构建体或复合物的接触选择性地调节表位特异性T细胞的活性。在一些情况下,所述接触在体外发生。在一些情况下,所述接触在体内发生。其中经历掩蔽的TGF-β构建体或复合物的细胞的活性(例如,通过典型通路、非典型通路的信号传导和/或下游基因表达)可相对于未暴露于TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞受试者)来评估。
本公开提供一种降低T细胞或B细胞(例如,病原自身反应性T细胞和/或病原自身反应性B细胞)的数目和/或活性的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在一些情况下,所述方法增加调节性T细胞(Treg)的数目和/或活性,导致T细胞或B细胞(例如,一种或多种自身反应性T细胞和/或一种或多种自身反应性B细胞)的数目和/或活性降低,其中经历一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的T细胞或B细胞的数目和/或活性的降低相对于未暴露于TGF-β或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞受试者)来评估。
施用任选地包含一种或多种(例如,一种、两种或更多种或三种或更多种)独立选择的野生型或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可直接或间接地影响各种细胞群。例如,施用任选地包含一种或多种野生型或变体IL-2 MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可直接刺激FoxP3+ Treg细胞(体内或体外)的发育和/或存活。除了TGF-β/IL-2复合物对各种免疫细胞具有的任何直接作用以外,所得Treg细胞可通过例如阻断T细胞活化的诱导和/或T细胞反应的效应阶段、抑制B细胞活化和/或抑制自然杀伤细胞的分化和/或增殖来抑制免疫反应。
a.Treg
(i)tTreg、pTreg、iTreg和包含IL-2的TGF-β构建体或复合物
本公开提供一种促进胸腺衍生的Treg(tTreg)和/或外周Treg(pTreg)(Treg是可抑制自身反应性T细胞和B细胞的CD4+、FoxP3+和CD25+细胞)的发育(例如扩增)和/或存活的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的一个或多个受试者)一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,在组织培养物、血液或特定组织位置诸如伤口中),或使CD4+ T细胞(例如,幼稚CD4+ T细胞)与其接触。在所述方法中施用或接触的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列。施用或接触可与向细胞施用维生素D(例如,维生素D3或其类似物)、视黄酸(例如,全反式视黄酸)和/或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian targetof rapamycin,mTOR)的抑制剂(例如,雷帕霉素或其功能类似物,诸如西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)或坦罗莫司(temsirolimus))或使细胞与所述物质接触来联合进行。因此,本公开提供一种促进诱导型调节性T细胞(iTreg)的发育和/或存活的方法,所述细胞是FoxpP3+、FoxP3+胸腺衍生的Treg(tTreg)和/或FoxP3+外周Treg(pTreg),所述方法包括任选地在维生素D或其类似物、视黄酸(例如,全反式视黄酸)或其类似物、和/或雷帕霉素或其类似物存在下,施用(例如,向有需要的受试者)包含一种或多种IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+ T细胞(例如,幼稚CD4+ T细胞)与其接触。用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物施用或治疗的效果可相对于基线值(例如,治疗前的细胞数目)或相对于与测试组匹配(例如,在其他方面相同)但未暴露于TGF-β或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估。
本公开提供一种增加Treg的诱导/增殖、保持Treg和/或维持其功能的方法,所述方法包括使T细胞(例如,体内或体外的CD4+ T细胞)与包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触。相对于接触之前测定的基线值或相对于未与一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触的在其他方面相同的细胞的对照组,所述接触增加Treg的诱导/增殖、保持Treg和/或维持其功能。本公开包括并提供用于所述方法中的包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构A、B或C描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构D或E描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构F描述的结构组织。
本公开提供一种增加Treg的诱导/增殖、保持Treg和/或维持其功能的方法,所述方法包括使T细胞(例如,体内或体外的CD4+ T细胞)与包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触。相对于接触之前测定的基线值或相对于未与一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触的在其他方面相同的细胞的对照组,所述接触增加Treg的诱导/增殖、保持Treg和/或维持其功能。本公开包括并提供用于所述方法中的包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构A、B或C描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构D或E描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构F描述的结构组织。包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物可与用于诱导/增殖Treg(例如,Tbet+FoxP3+iTreg细胞)、保持Treg和/或维持其功能的IL-2(例如,重组IL-2,诸如Proleukin(阿地白介素(aldesleukin))一起施用。
本公开提供一种增加Treg的诱导/增殖、保持Treg(例如Treg数目)和/或维持其功能的方法,所述方法包括使T细胞(例如,体内或体外的CD4+细胞)与包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2和/或变体IL-2 MOD多肽序列和一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触。相对于接触之前测定的基线值或相对于未与一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触的在其他方面相同的细胞的对照组,所述接触增加Treg的诱导/增殖、保持Treg和/或维持其功能。本公开包括并提供用于所述方法中的包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD和/或变体IL-2 MOD多肽序列和一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD和/或变体IL-2 MOD多肽序列和一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构A、B或C描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD和/或变体IL-2 MOD多肽序列和一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构D或E描述的结构组织。在一个实施方案中,包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2MOD和/或变体IL-2 MOD多肽序列和一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构F描述的结构组织。
使T细胞(例如,幼稚CD4+细胞)与包含单独或与一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列组合的一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD和/或变体IL-2MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,体内或体外)接触可增加FoxP3的表达和Treg细胞诱导(例如,Tbet+FoxP3+iTreg细胞)。类似地,使T细胞(例如,幼稚CD4+细胞)与包含单独或与IL-2(例如,重组人IL-2)组合的一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的PD-L1或PDL2和/或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,体外或体内)接触可增加FoxP3的表达和Treg细胞诱导(例如,Tbet+FoxP3+iTreg细胞)。当将IL-2和PD-L1或PD-L2两者提供至细胞时,所述接触可减少Treg溶酶体天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase)。造成Treg中的Foxp3去稳定化的溶酶体天冬酰胺内肽酶的减少导致保持Treg(例如,iTreg)和维持其功能。参见例如Francsisco等人,J Exp.Med.,206(13)3015-3029(2018)和Stathopoulou等人Immunity 49(2):247–263(2018)。因此,当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含IL-2和PD-L1或PD-L2两者时,接触T-细胞可不仅导致Treg的数目增加,而且还提高那些细胞的稳定性和功能。
当包含IL-2 MOD(wt.和/或变体)和/或PD-L1和/或PD-L2(wt.和/或变体)多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与施用于患者的经处理细胞的接触在体内(或在体外)发生时,所述接触可构成治疗。此类治疗导致个体或个体群中Treg细胞水平(例如,iTreg的总数或其在组织中或循环血液中的级分)的提高。治疗还可导致Treg中FoxP3水平的升高。
当掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含wt.和/或变体IL-2 MOD多肽序列以及wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列时,在个体或个体群中Treg细胞水平(例如,iTreg的总数或其在组织中或循环血液中的级分)升高的持续时间比在用缺少PD-L1序列的在其他方面相同的掩蔽的TGF-β构建体或复合物治疗的个体或个体群(例如,年龄、性别、体重和/或疾病状态匹配)时所观察到的持续时间更长。相对于在用缺少PD-L1多肽序列的在其他方面相同的掩蔽的TGF-β构建体或复合物进行治疗时所观察到的水平,用包含wt.和/或变体IL-2 MOD多肽序列以及wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗还可导致Treg中FoxP3水平持续升高。相对于用缺少PD-L1MOD多肽序列的在其他方面相同的掩蔽的TGF-β构建体或复合物治疗的个体(或平均个体组)的T-细胞中的酶活性,用包含wt.和/或变体IL-2 MOD多肽序列以及wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗还可导致Treg细胞中溶酶体天冬酰胺内肽酶活性的降低。
使T-细胞与包含单独或与wt.或变体PD-L1和/或PD-L2 MOD多肽序列组合的wt.和/或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触的过程(例如,体外、离体或体内,诸如治疗个体的过程)可进一步包括在维生素D或其类似物、视黄酸(例如,全反式视黄酸)或其类似物和/或mTOR抑制剂诸如雷帕霉素或其类似物)存在下接触T细胞。相对于接触之前测定的基线值或相对于未与一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触的对照组(例如,个体组)中测定的值,在那些剂存在下的接触可提高Treg的水平(例如,由于具有Treg表型的细胞的增殖或维持,个体或组织中Treg的数目或相对数目)。当使用对照个体组时,个体可在年龄、性别和体重中的一项或多项上匹配。个体还可在种族、饮酒和/或吸烟状况上匹配。
本公开提供一种增加一个或多个受试者(例如,个体或患者)中Treg的数目的方法,所述方法包括向一个或多个受试者施用包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2 MOD多肽序列和/或变体IL-2 MOD多肽序列且任选地包含一个或多个独立选择的wt.或变体PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述施用导致一个或多个受试者中Treg数目的增加。例如,相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前个体中的Treg数目或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照组,(例如,在血液或组织或诸如伤口的位置中)Treg的平均数目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。
本公开提供一种增加一个或多个受试者(例如,个体或患者)中Treg的数目的方法,所述方法包括向一个或多个受试者施用包含任选地与IL-2(例如,重组IL-2诸如Proleukin(阿地白介素))组合的一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的wt.或变体PD-L1和/或PD-L2多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述施用导致一个或多个受试者中Treg数目的增加。例如,相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前个体中的Treg数目或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照组,(例如,在血液或组织或诸如伤口的位置中)Treg的平均数目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。
b.T辅助细胞
(i)Th9细胞和包含IL-4的掩蔽的TGF-β构建体或复合物
本公开提供一种促进胸腺衍生的Th9细胞(通过表达CD4和CCR6和缺少CCR4表征的CD4+细胞)的发育和/或存活的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+ T细胞(例如,幼稚CD4+ T细胞或Th2细胞)与其接触。在所述方法中施用或接触的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-4 MOD多肽序列和/或变体IL-4 MOD多肽序列。因此,本公开提供一种促进Th9细胞的发育和/或存活的方法,其包括施用(例如,向有需要的受试者)包含一个或多个IL-4 MOD多肽序列和/或变体IL-4MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使幼稚T细胞与其接触,其中所述施用导致个体中Th9细胞数目的增加。例如,(例如,在组织培养物、血液或特定组织位置中)Th9细胞的数目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。
(ii)Th17细胞和包含IL-17的TGF-β构建体或复合物
本公开提供一种刺激Th17细胞(通过其IL-17产生来定义的T细胞)的产生的方法,所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)包含至少一种IL-6或变体IL-6 MOD多肽(例如,一种、两种或三种IL-6和/或变体IL-6 MOD多肽)的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+ T细胞(例如,幼稚CD4+ T细胞)与其接触。例如,相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前存在的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照组,(例如,在组织培养物、血液或特定组织位置中)Th17细胞的数目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。所述方法可用于保持肠粘膜屏障功能并且可以是防止病原细菌(例如,对抗柠檬酸杆菌(Citrobacter))以及募集中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞来攻击并破坏胞外真菌(例如,粘膜皮肤念珠菌(Candida))所需的。
(iii)Tfh细胞和包含IL-21和IL-23的掩蔽的TGF-β构建体或复合物
本公开提供一种刺激T滤泡性辅助(Tfh)细胞(通过CXCR5表达来定义的T细胞)的产生的方法,所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)包含至少一种MOD多肽(例如,一种、两种或三种)独立选自IL-21 MOD多肽、IL-23 MOD多肽、IL-21的变体或IL-23 MOD多肽的变体的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使巨噬细胞与其接触。例如,相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前存在的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照组,(例如,在组织培养物、血液或特定组织位置诸如淋巴滤泡中)Tfh细胞的数目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。所述方法可用于支持抗原特异性抗体反应的发展。
c.T效应细胞和包含IL-7的掩蔽的TGF-β构建体或复合物
(i)IL-7和CD8+ T细胞
本公开提供一种(例如,通过促进胸腺细胞表达IL-7R(例如,IL-7Rα)促进CD4+和/或CD8+ T-细胞的发育(谱系定型)和/或存活的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使前体CD4+CD8+ T-细胞与其接触。在所述方法中施用或接触的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-7 MOD多肽序列和/或变体IL-7 MOD多肽序列。因此,本公开提供一种(例如,通过促进胸腺细胞表达白细胞介素(IL)-7Rα)促进专注于CD4+或CD8+谱系的细胞的发育的方法,所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-7 MOD多肽序列和/或变体IL-7 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+和或CD8+细胞前体(例如,CD4+8+ T-细胞)与其接触;其中CD4+和/或CD8+细胞的发育和/或存活通过监测外周血或特定组织(例如,胸腺)CD4+和/或CD8+细胞数目来评估。
(i)IL-7和低亲和力T-细胞
本公开提供一种通过用对由MHC蛋白呈递的肽具有低亲和力的T-细胞受体促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的IL-7-依赖性存活来调控外周T-细胞稳态的方法。参见例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236和其中的引用。所述方法可通过控制胸腺细胞IL-7Rα表达来操作。促进IL-7-依赖性存活的方法包括(例如,向有需要的受试者)施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。所施用的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-7 MOD多肽序列和/或变体IL-7 MOD多肽序列。因此,本公开提供一种调控外周T-细胞稳态的方法;所述方法包括(例如,向有需要的受试者)施用包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-7 MOD多肽序列和/或变体IL-7 MOD多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中相对于施用之前那些细胞的数目,施用TGF-β构建体或复合物增加受试者或受试者组中外周CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数目。
d.掩蔽的TGF-β构建体或复合物和IL-10
本公开提供一种抑制2型先天淋巴细胞(ILC2细胞)(例如,抑制哮喘和过敏性炎症,参见例如,Rajas等人,J Allergy Clin Immunol,139(5):1468(2017);和Ogasawara等人,J Allergy Clin Immunol,141(3):1147–1151(2018))的方法,其使用包含至少一个(例如至少两个)独立选择的野生型或变体IL-10 MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。变体IL-10MOD多肽可包括单体IL-10多肽的全部或一部分(例如,SEQ ID NO:50或51的全部或一部分,在螺旋D与E之间的铰链区中用以上提及的5-7aa插入来取代)。参见例如Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)。抑制II型先天淋巴细胞的方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体IL-10 MOD的一种或多种掩蔽TGF-β构建体或复合物,或使II型先天淋巴细胞与其接触。ILC2细胞的抑制通过相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前2型细胞因子的量,或相对于未暴露于TGF-β或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照组中(例如,在来自受试者的细胞、组织或体液中)2型细胞因子的量,由ILC2细胞对2型细胞因子(例如,IL-3和/或IL-13)表达的抑制来评估。
TGF-β和IL-10在保持胃肠道稳态中具有非冗余作用,其中IL-10在TGF-β上游和下游两者起作用。例如,IL-10可诱导由固有层T细胞进行的TGF-β表达和分泌并且其与TGF-b协同作用来促进Treg细胞的分化。因此,本公开提供保持受试者中Treg细胞的肠道稳态和分化的方法,其包括施用包含wt.或变体IL-10序列或IL-2和IL-10aa序列两者的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,所述IL-2和IL-10aa序列中的一者或两者可以是独立选择的wt.或变体序列。参见例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236和其中的引用。
在一些情况下,诸如当需要诱导耐受性时,存在于一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)包含至少一个(例如至少两个)独立选择的野生型或变体IL-10 MOD多肽。参见例如Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 306:G575–G581(2014),和Levings等人Int Arch AllergyImmunol.129(4):263-76(2002)。变体IL-10 MOD多肽可包括单体IL-10多肽的全部或一部分(例如,SEQ ID NO:50或51的全部或一部分,在螺旋D与E之间的铰链区中用以上提及的5-7aa插入来取代以形成活性单体IL-10)。因此,本公开提供诱导受试者的耐受性的方法,其包括施用包含wt.或变体IL-10序列或IL-2和IL-10多肽序列两者的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。可选地,包含wt.或变体IL-10(例如,单体IL-10)序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可与包含wt.或变体IL-2多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物一起(同时或组合)施用。
e.掩蔽的TGF-β构建体或复合物和FasL
在一些情况下,诸如当需要诱导耐受性或抑制T-效应细胞时,存在于一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一个MOD多肽(例如,一个、两个或三个独立选择的MOD)可包含Fas配体(FasL)多肽或Fas配体多肽的变体。(参见例如Qiu等人J SurgRes.218:180-193(2017)。如上讨论,IL-10或变体IL-10多肽也可用于诱导耐受性。
因此,本公开提供诱导受试者的耐受性或抑制T-效应细胞的方法,其包括施用包含wt.或变体FasL多肽序列或IL-2和FasL多肽序列两者的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。本公开还提供耐受性的诱导。可选地,包含wt.或变体FasL序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物可与包含wt.或变体IL-2多肽序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物一起(同时或组合)施用。
f.调节其他细胞的方法
本公开提供一种支持恒定自然杀伤T细胞(iNKT)细胞的发育和/或存活的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使iNKT细胞前体细胞与其接触。其中相对于未暴露于TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估发育和/或存活。
本公开提供一种抑制巨噬细胞(例如,由Toll样受体配体或细胞因子刺激来活化的巨噬细胞)的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使巨噬细胞与其接触;其中相对于未暴露于TGF-β和/或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估抑制。巨噬细胞的活化和活化的抑制通过本领域已知的方法来评估,诸如由活化巨噬细胞进行的一氧化氮产生。
TGF-β抑制由单核细胞进行的H2O2产生,并且是抑制纤连蛋白粘附的单核细胞的化学引诱物。参见例如Warwick Davies和Cole,J Immunol.155(6):3186-3193(1995)。因此,本公开提供一种刺激单核细胞(例如,静息单核细胞)经历迁移的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使单核细胞与其接触;其中相对于未暴露于TGF-β和/或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估刺激。单核细胞的活化和抑制的活化通过本领域已知的方法来评估,包括测量H2O2产生和纤连蛋白粘附。H2O2产生(例如,响应于单核细胞刺激)可减少至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、10倍、20倍、30倍或更多)。
本公开提供一种改变外周血单核细胞和/或巨噬细胞迁移(例如,通过延时显微术或Boyden腔室测定来评估)至组织(例如,受伤或炎症组织)中,和/或增强巨噬细胞和/或单核细胞粘附性质的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使髓系细胞
与其接触;其中相对于未暴露于TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估迁移和/或粘附性质。例如,在一些情况中,细胞或组织与TGF-β(例如,TGF-β1)的短期相互作用刺激巨噬细胞或单核细胞的迁移,而长期暴露减少其迁移。参见例如Kim等人,Blood 108:1821-1829(2006),和Xu等人Bone Research,6(论文编号2)(2018)。
本公开提供一种诱导趋化性(例如,通过延时显微术或Boyden腔室测定来评估)和/或增强肥大细胞的粘附性质的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型或变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使肥大细胞与其接触;其中相对于未暴露于TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)来评估趋化性和/或粘附性质。
本公开包括并提供调节自身反应性和/或炎性T细胞(例如,Th1、Th2、Th17和/或Th22细胞)的方法。所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型和/或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使T细胞(例如,体内或体外)与其接触。任选地包含一个或多个野生型和/或变体MOD的TGF-β构建体或复合物可直接与此类炎性T细胞相互作用,并且/或者通过释放的分子(例如,细胞因子/白细胞介素)或通过其他细胞群来间接地影响此类细胞。例如,施用任选地包含一个或多个野生型和/或变体IL-2 MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(TGF-β/IL-2复合物)可直接刺激FoxP3+Treg细胞的发育和/或存活(在体外或体内)。除了TGF-β/IL-2复合物与细胞直接相互作用由此产生FoxP3+ Treg细胞以外,所得Treg可诸如通过例如阻断T细胞活化的诱导和/或T细胞反应的效应阶段、抑制B细胞活化和抑制自然杀伤细胞的分化和/或增殖来影响其他细胞。T reg的此类作用可通过各种手段来进行,包括但不限于产生IL-10、TGF-β和/或Treg上的CTLA-4结合至抗原呈递细胞上的B7(B7-1或CD80/B7-2或CD86),由此与那些细胞的CD28共刺激竞争。因此,本公开包括并提供调节属于诸如Th1、Th2、Th17、Th22等谱系的自身反应性T细胞和炎性T细胞的方法。自身反应性细胞可以是旁观者T细胞(例如,旁观者Th1、Th2和/或Th17细胞)的群。例如,在乳糜泻中,所调节的T细胞可包括在肠道粘膜中发现的Th17细胞,导致IL-17A、IL-17F、IL-21和/或IL-22的表达、分泌和/或粘膜组织水平降低。
本公开包括并提供一种抑制CD4+ Th1细胞(例如,减少其分泌干扰素γ和/或TNF)的作用并由此活化巨噬细胞(例如,在迟发型超敏反应或“DTH”中涉及到的吞噬作用和巨噬细胞,所述反应是包括肉芽肿性炎症的炎性疾病的构成因素)的方法。所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型和/或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+ Th1细胞与其接触;其中通过相对于未暴露于TGF-β和/或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)而言干扰素γ和/或TNF的产生来评估Th1细胞作用的抑制。
本公开包括并提供一种抑制CD4+ Th2细胞的作用(活化)(例如,减少的IgE、肥大细胞和嗜酸性粒细胞介导的反应)的方法;所述方法包括施用(例如,向有需要的受试者)任选地包含一个或多个(例如,一个、两个或更多个或三个或更多个)独立选择的野生型和/或变体MOD的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或使CD4+ Th2细胞与其接触;其中通过相对于未暴露于TGF-β和/或一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,细胞或受试者)而言IL-4、IL-5和/或IL-13的产生来评估Th2细胞作用的抑制(Th2细胞活化的程度)。
2选择性地递送共刺激多肽的方法
本公开提供一种使用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送呈掩蔽形式的TGF-β以及一个或多个(例如,一个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个)独立选择的MOD和/或变体MOD的方法。MOD向包含TβR的细胞的递送可由于MOD与其在含有或不含有TβR的细胞上的受体(共-MOD)的相互作用而复杂化。通过改变MOD的数目并且相对于掩蔽的TGF-β多肽对TβR的有效亲和力改变对其对应共MOD的亲和力,可将掩蔽的TGF-β构建体或复合物靶向细胞。具有降低的亲和力的变体MOD向掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的掺入允许TGF-β多肽更强地影响或甚至支配结合相互作用。掺入具有降低的亲和力的变体MOD(只要其仍然可刺激其共MOD)与对TβR具有相对强亲和力的TGF-β多肽的组合允许包含一个或多个MOD的掩蔽的TGF-β构建体和复合物在其与具有TβR和对应共MOD两者的细胞的结合中获得偏向性(或甚至选择性)。此类组合还避免在无TβR的情况下带有共MOD的细胞的脱靶刺激。
本公开提供将TGF-β多肽和至少一种变体MOD两者选择性地递送至在其表面膜上表达TβR(例如,TβRII和/或TβRI)和对应于至少一种变体MOD的共MOD的靶细胞(例如,体外或体内)。当在这种情形下使用时,“选择性递送”意指将掩蔽的TGF-β构建体或复合物的MOD递送至更高数目的表达TβR(例如,TβRII和/或TβRI)的细胞,即,“靶细胞”上的共MOD,而不是递送至不包含TβR的细胞,即,“非靶细胞”。
鉴于前述内容,本公开提供将TGF-β多肽和至少一种变体MOD两者选择性递送至在其表面膜上表达TβR(例如,TβRII和/或TβRI)和对应于至少一种变体MOD的共MOD的靶细胞(例如,体外或体内);所述方法包括:使细胞群与不足以使存在于细胞上的TβR饱和(例如,占据少于70%、60%、50%、40%或30%存在于细胞上的TβR)的量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触,所述构建体或复合物包含至少一种亲和力降低的变体MOD;和允许包含至少一种亲和力降低的变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物与细胞相互作用(例如,持续一段足以结合的时间)。在此方法中,(i)表达由包含至少一种亲和力降低的变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物所结合的TβR和共MOD两者的细胞的数目除以表达由包含至少一种亲和力降低的变体MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物所结合的共MOD的细胞的数目的比率大于(ii)表达由包含wt.MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物所结合的TβR和共MOD两者的细胞的数目除以表达由包含wt.MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物所结合的共MOD的细胞的数目的比率。
本公开提供将掩蔽的TGF-β多肽和至少一种wt.和/或变体IL-2MOD多肽两者递送至靶细胞(例如,在体外或体内),其包含任选地在维生素D、视黄酸(例如,全反式视黄酸)和/或雷帕霉素存在下,使靶细胞与包含至少一种wt.和/或变体IL-2 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物接触。在一种情况下,在维生素D、视黄酸(例如,全反式视黄酸)和/或雷帕霉素中的任一种、任两种或所有三种存在下,递送包含至少一种wt.或变体IL-2 MOD多肽的掩蔽的TGF-β多肽。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-6 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-7 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-15 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-21 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体IL-23 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体PD-L1 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
本公开提供将包含至少一种野生型和/或变体FasL MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物递送和任选地选择性递送至靶细胞(例如,在体外或体内)。
3治疗或预防方法
本公开提供治疗和预防方法,所述方法可包括接触来自个体的靶细胞群(例如,在体外或体内)和/或向个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)或编码有效地选择性调节靶细胞群的活性和/或治疗个体的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸或表达载体。当将靶细胞与个体分开治疗(即,在体外)时,可将细胞或其子代的全部或一部分施用个体。在一些情况下,治疗或预防方法包括向有需要的个体施用有效量的包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的一种或多种重组表达载体。在一些情况下,治疗或预防方法包括向有需要的个体施用包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的一种或多种mRNA分子。在一些情况下,治疗或预防方法包括使来自有需要的个体的靶细胞群(即,在体外)与有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)接触并且由此形成接触的靶细胞群,所述方法还包括将接触的靶细胞(和/或其子代)群的全部或一部分施用于个体。在一些情况下,治疗或预防方法包括向有需要的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039),或包含有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)的药学上可接受的组合物。可用包含有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)的组合物来治疗(例如,治愈和/或改善症状)的疾患包括:与数目不足的Treg细胞或活性不充分的Treg细胞相关的疾患、自身免疫疾病或病症、过敏反应、伤口(例如,皮肤和/或粘膜伤口)和/或烧伤。另外,接受器官移植的个体也可受益于治疗。
治疗或预防方法包括向具有不足数目的FoxP3+Treg细胞或不充分活性的FoxP3+Treg细胞的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含PSM-4033-4039。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2或变体IL-2 MOD多肽序列。在具有或不具有IL-2或变体IL-2 MOD的情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)可在施用维生素D(例如,1α,25-二羟维生素D3或1α,25-二羟基胆钙化醇)或维生素D类似物、雷帕霉素和/或视黄酸(例如,全反式视黄酸)中的任何一种或多种之前、期间(同时或组合施用)或之后施用。
治疗或预防方法可包括向有需要的患有自身免疫疾病或病症的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-2或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,PSM-4033-4039)。在第二种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽序列。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含至少一个独立选择的IL-2或变体IL-2 MOD多肽序列和至少一个独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽序列。在第二种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽序列。可用本公开的方法治疗的自身免疫疾病包括但不限于艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫相关性不孕症、自身免疫血小板减少性紫癜、大疱性类天疱疮、克罗恩氏病、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎(例如新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力(myasthenia gravis,MG)、天疱疮(例如寻常性天疱疮)、恶性贫血、多发性肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、休格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎和白斑病。在一个实施方案中,可用本公开的方法治疗的自身免疫疾病是T1D。在一个实施方案中,可用本公开的方法治疗的自身免疫疾病是乳糜泻。T1D和/或乳糜泻还可从经历用本公开的方法来治疗的自身免疫疾病中排除。
治疗或预防方法包括向患有Th17细胞缺乏的个体(例如,不能对肠道中的细菌和/或真菌感染作出充分反应的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-6或变体IL-6 MOD多肽序列。治疗或预防方法可包括向不能对肠道中的细菌和/或真菌感染作出充分反应的个体施用有效量的包含一个或多个独立选择的IL-6和/或变体IL-6多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码包含一个或多个独立选择的IL-6和/或变体IL-6多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向患有Th9细胞缺乏的个体(例如,不能对蠕虫感染作出充分反应的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码足以对蠕虫感染作出反应的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-4或变体IL-4 MOD多肽序列。治疗或预防方法可包括向不能对蠕虫感染作出充分反应的个体施用有效量的包含一个或多个独立选择的IL-4和/或变体IL-4多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码包含一个或多个独立选择的IL-4和/或变体IL-4多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向患有Tfh细胞缺乏的个体(例如,不能产生高亲和力抗体或足够量的高亲和力抗体的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码足以增加高亲和力抗体的产生的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-21、IL-23、变体IL-21或变体IL-23 MOD多肽序列。治疗或预防方法可包括向不能产生高亲和力抗体或不足量的高亲和力抗体的个体施用有效量的包含一个或多个独立选择的IL-21、IL-23、变体IL-21或变体IL-23 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码包含一个或多个独立选择的IL-21、IL-23、变体IL-21或变体IL-23 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向相对于对照组具有过度Th1细胞活性的个体(例如,在靶组织或循环中具有较高水平的活化巨噬细胞和/或较高水平的干扰素γ“IFN-γ”的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。治疗或预防方法可包括向具有较高水平的活化巨噬细胞和/或较高水平的干扰素γ“IFN-γ”(例如,在循环或靶组织中)的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向相对于对照组具有过度Th2细胞活性的个体(例如,具有较高水平的活化肥大细胞且/或具有较高水平的循环或组织局部的IgE的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。治疗或预防方法可包括向具有较高水平的活化肥大细胞且/或具有较高水平的IgE(循环或组织局部)的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向具有T-细胞受体驱动的自身反应性T细胞(或高亲和力T-细胞)活化的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。治疗或预防方法可包括向具有自身反应性T-细胞的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039),或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向需要(例如,通过控制胸腺细胞IL-7Ra表达)促进低亲和力CD4+和/或CD8+ T细胞的IL-7依赖性存活的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种条件下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-7或变体IL-7 MOD多肽序列。治疗或预防方法可包括向不能充分保持低亲和力CD4+和/或CD8+ T细胞的水平的个体施用有效量的包含一个或多个独立选择的IL-7和/或变体IL-7多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或编码包含一个或多个独立选择的IL-7和/或变体IL-7多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗或预防方法包括向需要促进特定细胞(例如,癌细胞或带有特定标志物诸如癌症抗原15-3、27-29、125、癌胚抗原、α-胎蛋白和/或β2-微球蛋白的癌细胞)的细胞凋亡的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种条件下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的wt.Fas配体或变体Fas配体MOD多肽序列。
治疗或预防方法包括向需要诱导iTreg(CD4+FoxP3+)细胞的个体(例如,需要诱导外周耐受性,从而主动地抑制效应T(Teff)细胞和/或抑制免疫介导的组织破坏的个体)施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的wt.或变体PD-L1 MOD多肽序列。在另一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的wt.和/或变体PD-L1 MOD多肽序列和一个或多个wt.和/或变体IL-2MOD多肽序列。在一个实施方案中,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含(i)一个独立选择的wt.或变体PD-L1 MOD多肽序列和(ii)一个wt.或变体IL-2 MOD序列。参见例如Francisco等人,J.Exp.Med.,206(13):3015-3029(2009)。
治疗或预防方法包括向需要抑制II型先天淋巴细胞(ILC2细胞)(例如,抑制哮喘、过敏反应、和/或过敏性炎症)的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽序列。在具有或不具有IL-10或变体IL-10MOD的情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)可在施用糖皮质激素(例如,地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)等)、抗组织胺(例如,苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)等)和/或肾上腺素之前、期间(同时或组合施用)或之后施用。
治疗或预防方法包括向患有过敏症、过敏性炎症和/或较高水平的IgE(循环或组织局部)的个体施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。治疗或预防方法可包括向具有较高水平的IgE(循环或组织局部)的个体施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在具有或不具有IL-10或变体IL-10MOD的情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)可在施用糖皮质激素(例如,地塞米松、泼尼松等)、抗组织胺(例如,苯海拉明、氯苯那敏等)和/或肾上腺素之前、期间(同时或组合施用)或之后施用。TGF-β和IL-10用于抑制使肥大细胞活化的高亲和力IgE受体(Fc1RI)的表达并且IL-10另外用于防止过度肥大细胞活化和慢性炎症的发展。参见例如Kennedy等人Journal ofImmunology,180(5)2848-2854(2008)。
预防方法包括向诊断患有或具有多发性硬化的个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含一个或多个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽序列。
治疗具有至少一个皮肤或粘膜烧伤的个体的方法,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在一种情况下,所述方法可包括施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。烧伤可以是一度、二度或三度烧伤。
治疗具有至少一个皮肤或粘膜伤口(表皮或粘膜的擦伤、撕脱、切口、割伤或刺伤)的个体的方法,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)以相对于未治疗伤口加速伤口闭合(缩短闭合的时间)、缩短愈合时间、或减少瘢痕形成。在一种情况下,所述方法可包括施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。当在具有或不具有IL-10 MOD多肽的情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含TGF-β1多肽时,所述方法还可包括以下中的一项或多项:将炎症细胞募集至损伤部位;表达细胞外基质蛋白诸如纤连蛋白、胶原蛋白(例如,I和/或III型)和/或VEGF;刺激成纤维细胞收缩以实现伤口闭合;整联蛋白诸如β1、α5、αv和β5的伤口部位表达;和角化细胞迁移。当在具有或不具有IL-10 MOD多肽的情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含TGF-β2多肽时,所述方法还可包括以下中的一项或多项:将来自循环和伤口边缘的成纤维细胞和免疫细胞两者募集至伤口区域中;表达胶原蛋白(例如,I和/或III型);和表达纤连蛋白。参见例如Pakyari等人Adv Wound Care,2(5):215–224(2013)。在此类方法中,掩蔽的TGF-β构建体或复合物可直接应用或注射至伤口中。
治疗具有至少一个皮肤或粘膜伤口(表皮或粘膜的擦伤、撕脱、切口、割伤或刺伤)的个体的方法,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的TGF-β(例如,TGF-β3)构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β3构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)以便相对于未治疗的伤口,减少瘢痕形成。在一种情况下,所述方法可包括施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β(例如,TGF-β3)构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β(例如,TGF-β3)构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。在此类方法中,掩蔽的TGF-β(例如,TGF-β3)构建体或复合物可直接应用或注射至伤口中。不受理论约束,可理解TGF-β3减少1型胶原蛋白沉积,同时促进通过MMP-9的胶原蛋白降解,导致瘢痕形成减少。参见例如Pakyari等人Adv Wound Care,2(5):215–224(2013)。
促进个体的器官移植的方法,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)以便相对于器官移植类型、年龄、性别、吸烟习惯和/或身体质量指数匹配的未治疗个体中平均闭合时间、恢复时间或瘢痕形成,加速切口闭合(缩短闭合的时间)、缩短恢复时间或减少瘢痕形成。在一种情况下,所述方法可包括施用有效量的包含至少一个(例如,一个、两个或三个)独立选择的IL-10或变体IL-10 MOD多肽的掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
治疗患有移植物抗宿主疾病(GVHD,包括急性GVHD)的个体的方法,所述方法包括施用个体有效量的掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)。
在任何前述方法中,除非另外规定,否则掩蔽的TGF-β构建体或复合物的TGF-β多肽可以是如前述章节中讨论的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3多肽或其变体(例如,具有限制TGF-β多肽二聚化的对应突变的TGF-β3C77S变体或TGF-β1或TGF-β2变体)。类似地,掩蔽TGF-β多肽的多肽可选自如上所述的多肽(例如,抗体或其片段、单链抗体或结合至TGF-β的TβRI或TβRII胞外结构域片段)。
如上所示,在一些情况下,在进行治疗或预防的主题方法中,将掩蔽的TGF-β构建体或复合物作为多肽本身施用于有需要的个体。在其他情况下,在进行治疗或预防的主题方法中,将包含编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的核苷酸序列的一种或多种核酸施用于有需要的个体。因此,在其他情况下,向有需要的个体施用一种或多种核酸,例如,一种或多种重组表达载体。
N.剂量
合适的剂量可由主治医师或其他合格医务人员基于各种临床因素来确定。如医学领域众所周知,用于任一患者的剂量取决于许多因素,包括患者的体型、身体表面积、年龄、待施用的特定多肽或核酸、患者的性别、施用时间和途径、一般健康状况、和同时施用的其他药物。掩蔽的TGF-β构建体或复合物可施用的量介于1ng/kg体重与20mg/kg体重/剂量之间,例如在0.1mg/kg体重至10mg/kg体重之间,例如在0.5mg/kg体重至5mg/kg体重之间;然而,设想低于或高于此示例性范围的剂量,特别是考虑到上述因素。如果方案是连续输注,则其也可处于1μg至10mg/kg体重/min的范围内。掩蔽的TGF-β构建体或复合物可施用的量为约1mg/kg体重至50mg/kg体重,例如约1mg/kg体重至约5mg/kg体重、约5mg/kg体重至约10mg/kg体重、约10mg/kg体重至约15mg/kg体重、约15mg/kg体重至约20mg/kg体重、约20mg/kg体重至约25mg/kg体重、约25mg/kg体重至约30mg/kg体重、约30mg/kg体重至约35mg/kg体重、约35mg/kg体重至约40mg/kg体重、或约40mg/kg体重至约50mg/kg体重。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物的合适剂量为0.01μg至100g/kg体重、0.1μg至10g/kg体重、1μg至1g/kg体重、10μg至100mg/kg体重、100μg至10mg/kg体重、或100μg至1mg/kg体重。本领域普通技术人员可容易基于所测量的滞留时间和所施用的剂在体液或组织中的浓度来估计给药的重复率。在成功治疗之后,可能需要使患者接受维持疗法以防止疾病状态的复发,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物或单链掩蔽的TGF-β构建体或复合物施用的维持剂量的范围为0.01μg至100g/kg体重、0.1μg至10g/kg体重、1μg至1g/kg体重、10μg至100mg/kg体重、100μg至10mg/kg体重、或100μg至1mg/kg体重。
本领域技术人员将容易理解,剂量水平可随特定掩蔽的TGF-β构建体或复合物、症状严重程度和受试者对副作用的易感性而变化。给定化合物的优选剂量可容易由本领域技术人员通过多种手段确定。
在一些情况下,施用掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体的多个剂量。掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体的施用频率可根据多种因素中的任一种,例如,症状的严重程度等而变化。例如,在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体每月施用一次、每月两次、每月三次、隔周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、隔天一次(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)。
掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体的施用持续时间,例如,施用掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体的时间段可根据多种因素中的任一种,例如,患者反应等而变化。例如,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体可施用的时间段的范围为约一天至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约八个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
O.施用途径
使用适于药物递送的任何可获得方法和途径,包括体内和体外方法,以及全身和局部施用途径,将活性剂(掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体)施用于个体。
常规和药学上可接受的施用途径包括肿瘤内、肿瘤周围、肌肉内、气管内、淋巴管内、颅内、皮肤、皮下、皮内、局部应用、静脉内、动脉内、经直肠、经鼻、经口、以及其他经肠和胃肠外施用途径。施用途径在需要时可组合或根据掩蔽的TGF-β构建体或复合物和/或所要效果而调整。掩蔽的TGF-β构建体或复合物、或核酸或重组表达载体可以单一剂量或多个剂量来施用。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体静脉内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体肌肉内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体淋巴管内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体局部施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体肿瘤内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体肿瘤周围施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体颅内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体经皮肤施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体皮下施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体施用于伤口(例如,皮肤或粘膜伤口)。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸或重组表达载体施用于烧伤组织(例如,皮肤烧伤)。
在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物静脉内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物肌肉内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物局部施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物肿瘤内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物肿瘤周围施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物颅内施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物经皮施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物皮下施用。在一些情况下,掩蔽的TGF-β构建体或复合物淋巴管内施用。在一些情况下,向伤口(例如,皮肤或粘膜伤口)施用掩蔽的TGF-β构建体或复合物。在一些情况下,向烧伤组织(例如,皮肤烧伤)施用掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸、或重组表达载体可使用适于递送常规药物的任何可获得常规方法和途径,包括全身或局部途径来施用于宿主。一般而言,设想用于方法中的施用途径包括但不一定限于经肠、胃肠外、皮肤和吸入途径。
除了吸入施用以外的胃肠外施用途径包括但不一定限于局部、经皮、皮下、肌肉内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、肿瘤内、淋巴管内、肿瘤周围和静脉内途径,即除通过消化道以外的任何施用途径。可进行胃肠外施用以实现掩蔽的TGF-β构建体或复合物、核酸、或重组表达载体的全身或局部递送。在需要全身递送时,递送通常涉及药物制剂的侵袭性或全身吸收的局部或粘膜施用。
P.适于治疗的受试者
适于用掩蔽的TGF-β构建体或复合物例如,PSM-4033-4039),诸如通过本文所述方法治疗的受试者包括具有自身免疫疾病、过敏反应、伤口(例如,皮肤和/或粘膜伤口)和/或烧伤的个体(例如,人)。受试者另外包括接受器官移植的个体。除人外,受试者还包括非人哺乳动物,包括但不限于需要治疗的牛、犬、山羊、猴、猫、兔、鼠类、绵羊、猪或猿猴受试者或患者。
患有自身免疫疾病或疾患并且适于用掩蔽的TGF-β构建体或复合物(例如,PSM-4033-4039)治疗的受试者(个体)包括诊断为患有自身免疫疾病或疾患的个体,和已经对自身免疫疾病或疾患进行治疗但未能对治疗作出反应的个体。可用本公开的方法治疗的自身免疫疾病和疾患包括但不限于艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫结肠炎、自身免疫胃炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫相关性不孕症、自身免疫胰炎、自身免疫视网膜病、自身免疫血小板减少性紫癜、自身免疫荨麻疹、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩氏病、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎(例如新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、移植物抗宿主疾病(GVHD,包括急性GVHD),格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、炎症性肠病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力(MG)、天疱疮(例如寻常性天疱疮)、恶性贫血、多发性肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、休格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、移植排斥反应、1型糖尿病(T1D)血管炎和白斑病。在一个实施方案中,自身免疫疾病是T1D。在一个实施方案中,自身免疫疾病是乳糜泻。患有T1D和/或乳糜泻的个体可从适于治疗的受试者中排除。类似地,T1D和/或乳糜泻可从经历治疗的自身免疫疾病中排除。
在一个实施方案中,可用本公开的方法治疗的自身免疫疾病和疾患包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣/牛皮癣性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病、艾迪生氏病、格雷夫氏病、休格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫血管炎和恶性贫血。
患有过敏反应的受试者不能容易地根据过敏原来分类,因为过敏原太多而无法列举。但例如,具有过敏反应的受试者(例如,先前接受过过敏治疗或从未接受过治疗的个体)包括对以下物质产生反应的受试者:花生和坚果、植物花粉、乳胶等。例如,患有对花生过敏原的过敏反应的受试者包括对来自七个蛋白家族的Ara h 1至13蛋白具有反应的受试者,包括Ara h 1(例如,PGQFEDFF(SEQ ID NO:161)、YLQGFSRN(SEQ ID NO:162)、FNAEFNEIRR(SEQ ID NO:163)、QEERGQRR(SEQ ID NO:164)、DITNPINLRE(SEQ ID NO:165)、NNFGKLFEVK(SEQ ID NO:166)、GNLELV(SEQ ID NO:167)、RRYTARLKEG(SEQ ID NO:168)、ELHLLGFGIN(SEQ ID NO:169)、HRIFLAGDKD(SEQ ID NO:170)、IDQIEKQAKD(SEQ ID NO:171)、KDLAFPGSGE(SEQ ID NO:172)、KESHFVSARP(SEQ ID NO:173)、NEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSK(SEQ ID NO:174)、Ara h 2(例如,HASARQQWEL(SEQ ID NO:175)、QWELQGDRRC(SEQ ID NO:176)、DRRCQSQLER(SEQ ID NO:177)、LRPCEQHLMQ(SEQ ID NO:178)、KIQRDEDSYE(SEQ IDNO:179)、YERDPYSPSQ(SEQ ID NO:180)、SQDPYSPSPY(SEQ ID NO:181)、DRLQGRQQEQ(SEQ IDNO:182)、KRELRNLPQQ(SEQ ID NO:183)、QRCDLDVESG(SEQ ID NO:184)和Ara h 3(例如,IETWNPNNQEFECAG(SEQ ID NO:185)、GNIFSGFTPEFLAQA(SEQ ID NO:186)、VTVRGGLRILSPDRK(SEQ ID NO:187)、DEDEYEYDEEDRRRG(SEQ ID NO:188)。参见例如Zhou等人,(2013)Intl.J.of Food Sci.2013:8页论文ID 909140。具有过敏反应的受试者还包括对膜翅目昆虫蛋白(例如,蜜蜂和黄蜂毒素中的过敏原诸如磷脂酶A2、蜂毒蛋白、在黄蜂毒素中发现的“抗原5”和透明质酸酶)具有反应的受试者。
具有伤口的受试者包括具有表皮或粘膜的擦伤、撕脱、切口、割伤或刺伤的个体。可理解经历器官移植的受试者就其本质而言将具有那些伤口类型中的一种或多种。
V.某些方面
包括针对如上所述的TGF-β构建体或复合物的主题的方面的某些方面单独或与一个或多个其他方面组合时可以是有益的,诸如以下针对TGF-β构建体和复合物、其制造方法及其使用方法(例如,如治疗剂)列举的那些方面。
1.一种构建体,其包含以下各项作为第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列);
iv)任选地一个或多个(例如,一个、两个或两个以上)独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于任何前述多肽序列之间);
包含这些元件的构建体在本文中统称为“掩蔽的TGF-β构建体”,其中掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列)与TGF-β多肽序列彼此结合(彼此相互作用来掩蔽TGF-β多肽序列)。参见例如,图1,结构A。
2.如方面1所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中第一多肽以从N末端至C末端的顺序包含:
i)支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列;或
ii)第一MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列;或
iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列(呈串联形式的MOD)、支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列;
其中掩蔽的TGF-β构建体任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如介于任何前述多肽序列之间)。
3.如方面1或方面2所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中支架多肽包含二聚化(或多聚化)序列。
4.如方面3所述的掩蔽的TGF-β构建体,其呈掩蔽的TGF-β复合物同二聚体形式,其中支架多肽序列任选地具有一个或多个(例如,一个、两个或更多个)彼此共价连接(例如,二硫键)(例如,其中掩蔽的TGF-β构建体的作为第一多肽的第一分子与掩蔽的TGF-β构建体的作为第二多肽的第二分子通过其支架多肽序列的共价或非共价相互作用来二聚化以形成同二聚体),任选地其中支架包含Ig Fc多肽,其包括实质上降低或消除Ig多肽例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力的突变(例如,LALA突变)。参见例如图1,结构B。
5.如方面1-3中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中支架多肽包含种间二聚化序列(例如,优先与其对应种间结合序列二聚化,而非同二聚化的二聚化序列)。参见例如,图1,结构C和F。
6.如方面5所述的掩蔽的TGF-β构建体,进一步包含与第一多肽二聚化以形成掩蔽的TGF-β复合物异二聚体的第二多肽;
其中第二多肽包含含有第一多肽的种间结合序列的对应种间二聚化序列的支架多肽序列;并且其中种间结合序列与对应种间结合序列在异二聚体中彼此相互作用。
7.如方面6所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第二多肽包含:
(i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
(ii)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列(例如,呈串联形式)和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
(iii)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列和独立选择的MOD序列;或
(iv)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列(例如,呈串联形式)和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
其中第一和或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于任何前述多肽序列之间)。参见例如,图1,结构F。
8.如方面6或7所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第二多肽从N末端至C末端包含:
i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
(ii)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列(例如,呈串联形式)和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
(iii)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列和一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列;或
(iv)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列(例如,呈串联形式)和包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列
其中第一和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于任何前述多肽序列之间)。参见例如,图1,结构F。
9.如方面6所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第二多肽包含:
i)任选地,一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列;
ii)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列;
iii)TGF-β多肽序列;
iv)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列);
以及
v)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于第二多肽的任何前述多肽序列之间);
其中掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列)与TGF-β多肽序列彼此结合(彼此相互作用来掩蔽TGF-β多肽序列)。参见例如,图1,结构C。
10.如方面9所述的掩蔽的TGF-β复合物异二聚体,其中第二多肽以从N末端至C末端的顺序包含:
i)包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列;
ii)第一MOD多肽序列、包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列;或
iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列、包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列)和TGF-β多肽序列。参见例如,图1,结构C。
11.一种复合物,其包含第一多肽和第二多肽作为异二聚体(或多聚体),其中:
(i)所述第一多肽包含
a)包含种间二聚化序列的支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列),
c)任选地,一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于所述第一多肽的任何前述多肽序列之间);
(ii)所述第二多肽包含
a)支架多肽序列,其包含第一多肽中的种间二聚化序列的对应种间二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于所述第二多肽的任何前述多肽序列之间);
包含这些元件的复合物统称为“掩蔽的TGF-β复合物”,其中所述掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列)与所述TGF-β多肽序列彼此结合(彼此相互作用来掩蔽所述TGF-β多肽序列);
其中所述种间结合序列与所述对应种间结合序列在所述异二聚体中彼此相互作用(例如非共价结合);并且
其中掩蔽的TGF-β第一多肽和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列(例如,介于其任何多肽序列之间)。参见例如,图1,结构D和E。
12.如方面11所述的掩蔽的TGF-β复合物异二聚体,其中第一多肽从N末端至C末端包含:
a)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含种间二聚化序列的支架多肽序列和掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列),或
b)包含种间二聚化序列的支架多肽序列和掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列);并且
第二多肽从N末端至C末端包含一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含对应种间二聚化序列的支架多肽序列和TGF-β多肽序列。
13.如方面1-12中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中支架多肽序列选自由以下组成的组:Ig Fc多肽序列(例如,CH2-CH3区序列);Ig重链区1(CH1)域;轻链恒定区(“CL”)(例如Igκ链(κ链)恒定区或Igλ链(λ链));亮氨酸拉链多肽序列;Fos或Jun结合对序列;胶原凝集素多肽(例如,ACRP30或ACRP30样蛋白);卷曲螺旋结构域;以及前述中的任一者的变体(例如,表1中的杵臼和其他种间序列)。
14.如方面1-13中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中支架多肽序列选自由以下组成的组:Ig Fc多肽序列(免疫球蛋白序列);Ig重链序列(例如,CH2-CH3区序列);Ig重链区1(CH1)域;轻链恒定区(“CL”)(例如Igκ链(κ链)以及前述中的任一者的变体。在一个实施方案中,支架多肽选自带有MD13取代的Ig CH1结构域或带有MD13取代的Igκ链序列。
15.如方面14所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白序列包含与SEQ ID NO:68至83或85-87中的任一者具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。参见例如,图2A至图2H和图2J至图2K。(免疫球蛋白序列可形成二聚体并且在诸如图2H中的IgM序列的情况下,形成多聚体)。
16.如15所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白序列包含与SEQ IDNO:68至83中的任一者具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的免疫球蛋白重链序列。参见例如,图2A至图2H。(免疫球蛋白序列可形成二聚体并且在诸如图2H中的IgM序列的情况下,形成多聚体)。
17.如方面4和6-16中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中支架多肽序列具有一个或多个(例如,一个、两个或更多个)彼此的共价连接。
18.如方面17所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个共价连接中的至少一个(例如,一个、两个或更多个)是第一多肽的支架多肽序列与第二多肽的支架多肽序列之间的二硫键。
19.如方面14-18中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中支架序列是免疫球蛋白重链恒定区(Ig Fc)多肽序列,其包含任选地通过一个或多个(例如,一个、两个或更多个)二硫键共价连接的CH2-CH3免疫球蛋白区。
20.如方面5所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中支架多肽包含选自由以下组成的组的种间二聚化序列:i)种间免疫球蛋白(Ig)重链序列;ii)Ig CH1结构域;iii)Ig轻链恒定区(“CL”)(例如Igκ链(κ链)或Igλ链(λ链)恒定区);以及(iv)Fos/Jun结合对的多肽。在一个实施方案中,支架多肽包含选自带有MD13取代的Ig CH1结构域或带有MD13取代的Igκ链序列的种间二聚化序列。
21.如方面20所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中种间结合序列包含与SEQ ID NO:68至82或85-87中的任一者具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。参见例如,图2A至图2G和图2J至图2K。
22.如方面4和6-12中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽和第二多肽的支架多肽包含选自由以下组成的组的种间二聚化序列和对应种间二聚化序列对:(i)种间免疫球蛋白(Ig)重链序列(例如,重链CH1-CH2区);(ii)Ig CH1结构域及其对应种间轻链恒定区(“CL”)(例如Igκ链(κ链)恒定区或Igλ链(λ链)恒定区)之一;(iii)Fos/Jun结合对;以及(iv)Ig重链区1(CH1)和轻链恒定区(“CL”)序列(CH1/CL对,诸如与κ或λIg轻链恒定区序列配对的CH1序列)。在一个实施方案中,第一多肽和第二多肽的支架多肽包含种间二聚化序列和对应种间二聚化序列对,所述对包含带有MD13取代的Ig CH1结构域和带有MD13取代的Igκ链序列。
23.如方面22所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中支架多肽序列具有一个或多个(例如,一个、两个或更多个)彼此的共价连接。
24.如方面22所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中一个或多个共价连接中的至少一个(例如,一个、两个或更多个)是第一多肽的支架序列与第二多肽的支架序列之间的二硫键。
25.如方面22-24中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中支架序列是免疫球蛋白重链恒定区(Ig Fc)多肽序列,其包含任选地通过一个或多个(例如,一个、两个或更多个)二硫键(介于第一多肽与第二多肽之间)共价连接的CH2-CH3免疫球蛋白区。
26.如方面22-25中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中种间结合序列和/或对应种间结合序列包含与SEQ ID NO:68至82或85-87中的任一者具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的序列。参见例如,图2A至图2G和图2J至图2K。
27.如26所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中免疫球蛋白序列包含与SEQ ID NO:68至83中的任一者具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%aa序列同一性的免疫球蛋白重链序列。参见例如,图2A至图2H。(免疫球蛋白序列可形成二聚体并且在诸如图2H中的IgM序列的情况下,形成多聚体)。
27.方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2A描述的IgA Fc序列(SEQ ID NO:68)的至少150个连续aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350个连续aas)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
28.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2B描述的IgD Fc序列(SEQ ID NO:69)的至少150个连续aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350个连续aas)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
29.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2C描述的IgE Fc序列(SEQ ID NO:70)的至少125个连续aas(至少150、至少175或至少200个连续aas)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
30.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与wt.IgG Fc多肽序列,诸如图2D描述的IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71-78)的至少125个连续aas(至少150、至少175或至少200个连续aas)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
31.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2E描述的IgG2Fc多肽序列(SEQ ID NO:79)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
32.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2F描述的IgG3Fc序列(SEQ ID NO:80)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200或至少225个)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
33.如方面1-27中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含支架多肽序列,所述序列任选地包含种间二聚化序列和/或对应种间二聚化序列,其中支架多肽序列与图2G描述的IgG4Fc序列(SEQ ID NO:81或82)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250个)或所有aas具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性。
34.如方面27-33中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物,其包含介于第一多肽与第二多肽之间(例如,与其IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列的铰链区相邻的半胱氨酸之间)的一个或两个链间二硫键。
35.如方面1-34中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个支架多肽包含免疫球蛋白(Ig)多肽序列,所述Ig多肽序列带有限制(例如,减少)多肽与补体组分1q(C1q)和/或Fcλ受体(FcλR)的结合和/或实质上降低或消除Ig多肽通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力的一个或多个取代。
36.如方面35所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中每个支架多肽包含免疫球蛋白(Ig)多肽序列,该Ig多肽序列包含与wt.IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71)的至少125个连续aas(至少150、至少175、至少200或至少220个连续aas)具有至少约70%(例如,至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%)aa序列同一性的多肽。
37.如方面36所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含aas 234、235、236、237、238、和239(234-LLGGPS-239)中任一个、两个或更多个的取代。
38.如方面36或37所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含N297、P331、D270、K322和/或P329中任一个、两个或更多个的取代。
39.如方面36-38中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含用除天冬酰胺以外的aa(例如,丙氨酸以给出诸如SEQ ID NO:74中的N297A)的N297取代(SEQ ID NO:71的N77)。
40.如方面36-38中的任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含用除亮氨酸以外的aa(例如,丙氨酸,L234A和/或L235A)的L234和/或L235(SEQ ID NO:71中的L14和L15)取代。
41.如39所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含L234A和/或L235A取代(参见例如,SEQ ID NO:75)。
42.如方面36-41中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含被除脯氨酸以外的aa(例如,丝氨酸用于P331S取代)取代的P331(SEQ ID NO:71的P111)。
43.如方面36-38中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含L234和/或L235处的取代和P331的取代。
44.如方面43所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含(i)L234F、L235E和P331S或(ii)L234A、L235A和P331S取代。
45.如方面20-44中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含选自由以下组成的组的种间二聚化对的种间二聚化序列:KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s和A107序列(参见例如,表1)。
46.如方面4和22-44中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中种间二聚化序列和对应种间二聚化序列是选自由以下组成的组的一对序列:KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s和A107序列对(参见例如,表1)。
47.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽和第二多肽之一包含种间IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71的序列),其包含T366Y取代并且另一个包含Y407T取代,或其他种间免疫球蛋白重链序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重链序列的种间序列)中的对应取代。
48.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽和第二多肽之一包含种间IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71的序列),其包含T366W取代并且另一个包含T366S、L368A和Y407V取代,或其他种间免疫球蛋白重链序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重链序列的种间序列)中的对应取代。
49.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽和第二多肽之一包含种间IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71的序列),其包含Y349C、T366S、L368A和Y407V取代并且另一个包含S354C和T366W取代,或其他种间免疫球蛋白重链序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重链序列的种间序列)中的对应取代。
50.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽包含具有T146W KiH序列取代的IgG1支架,并且第二多肽包含具有T146W、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1支架,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170个(例如,至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个)连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列,并且任选地包含如在SEQ ID NO:71中编号的以下一者或多者处的取代:L14和L15(例如,L14A/L15A“LALA”或L14F/L15E);N77(例如,N77A);P111(例如,P111S);L131(例如,L131K);T146(例如,T146S);P175(例如,P175V);F185(例如,F185R);Y187(例如,Y187A);和K189(例如,K189Y)。
51.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽包含具有T146W KiH序列取代的IgG1支架,并且第二多肽包含具有T146S、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1支架,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170个(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个)连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能的N77取代(N297,例如,Kabat编号中的N297A或N297G)。参见例如,图2D SEQ ID NO:77和78,
52.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一多肽包含具有T146W和S134CKiHs-s取代的IgG1支架,并且第二多肽包含具有T146S、L148A、Y187V和Y129C KiHs-s取代的IgG1支架,其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170个(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个)连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;其中第一和第二多肽的支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能的N77(Kabat编号中的N297)取代(例如,Kabat编号中的N297A或N297G取代)。
53.如方面46所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一和第二多肽选自:
包含具有S144H和F185A取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有Y129T和T174F取代的IgG1支架的第二多肽;
包含具有T130V、L131Y、F185A和Y187V取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有130V、T146L、K172L和T174W取代的IgG1支架的第二多肽;
包含具有K140D、D179M和Y187A取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有E125R、Q127R、T146V和K189V取代的IgG1支架的第二多肽;
包含具有K189D和K172D取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有D179K和E136K取代的IgG1支架的第二多肽;
包含具有K140E和K189W取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有Q127R、D179V和F185T取代的IgG1支架的第二多肽;
包含具有K140E、K189W和Y129C取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有Q127R、D179V、F185T和S134C取代的IgG1支架的第二多肽;
以及
包含具有K150E和K189W取代的IgG1支架的第一多肽,和包含具有E137N、D179V和F185T取代的IgG1支架的第二多肽;
其中支架包含与SEQ ID NO:71的IgG1的至少170个(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227个)连续aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的序列;并且
其中第一和第二多肽的支架aa序列中没有一者、有一者或两者包含L14和L15取代(例如,Kabat编号中的L234A和L235A“LALA”),和/或通过阻断与Fcγ受体的相互作用来去除效应功能的N77(Kabat编号中的N297)取代(例如,Kabat编号中的N297A或N297G取代)。
54.如方面20所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中支架多肽包含选自由以下组成的组的种间二聚化序列:
(i)Ig重链CH1结构域(例如,SEQ ID NO:85的多肽);
(ii)Igκ链恒定区序列(例如,SEQ ID NO:86);以及
(iii)Igλ链恒定区序列(例如,SEQ ID NO:87);
其中支架包含分别与SEQ ID NO:85、86或87的至少70、至少80、至少90或至少100个连续aas具有至少80%(85%、90%、95%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。参见图2J和图2K。Ig CH1结构域和/或Igκ链序列任选地包含其相应MD13取代。
55.如方面22所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中第一和第二多肽之一的支架多肽包含Ig重链CH1结构域(例如,SEQ ID NO:85的多肽);并且第一和第二多肽中的另一个包含Igκ链恒定区序列(例如,任选地包含MD13取代的SEQ ID NO:86)或Igλ链恒定区序列(例如,SEQ ID NO:87);
其中支架包含分别与SEQ ID NO:85、86或87的至少70、至少80、至少90或至少100个连续aas具有至少80%(85%、90%、95%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。参见图2J和图2K。
56.如方面1-56中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的接头多肽序列。
57.如方面56所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中独立选择的接头具有约1aa至约25aa的长度(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25aa长度)。
58.如方面56所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中独立选择的接头具有约25至约35aa的长度(例如,25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35aa长度)。
59.如方面56所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中独立选择的接头具有约35至约50aa的长度(例如,35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45、46、47、48、49或50aa长度)。
60.如方面56至59中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的接头包含(i)甘氨酸或含有具有约2至约50个连续甘氨酸残基的序列的聚甘氨酸;
(ii)甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如,(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:126)、(GGGGS)nSEQ ID NO:136和(GGGS)n(SEQ ID NO:127),其中n是至少1的整数(例如,1-10、10-20或20-30);或
(iii)甘氨酸-丙氨酸聚合物或丙氨酸-丝氨酸聚合物(例如,具有1-10、10-20或20-30aa的长度)。
61.如方面56至59中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中独立选择的接头中的至少一个(例如,至少两个或至少三个)包含选自由以下组成的组的aa序列:GGSG(SEQ ID NO:128)、GGSGG(SEQ ID NO:129)、GSGSG(SEQ ID NO:130)、GSGGG(SEQ ID NO:131)、GGGSG(SEQ ID NO:132)、GSSSG(SEQ ID NO:133)、GSGS(SEQ ID NO:134)、GSSSSS(SEQID NO:135)、GGGGS SEQ ID NO:136等。
62.如方面56至59中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中独立选择的接头中的至少一个包含半胱氨酸残基(例如,接头aa序列SEQID NO:137),其可或确实与存在于掩蔽的TGF-β构建体或复合物的第二多肽中(例如,在第二多肽的接头中)的半胱氨酸残基形成二硫键。
63.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列选自由以下组成的组:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一个的变体(例如,相对于对应wt.MOD多肽序列,对其受体具有降低的亲和力的变体)。
64.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列选自由以下组成的组:PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一个的变体(例如,相对于相应wt.MOD多肽序列,对其受体具有降低的亲和力的变体)。
65.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列选自由以下组成的组:PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-10 MOD多肽序列及其任一个的变体(例如,相对于对应wt.MOD多肽序列,对其受体具有降低的亲和力的变体)。
66.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中MOD多肽序列中的至少一个(例如,至少两个)是IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列:
(i)与SEQ ID NO:9的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性;或
(ii)与SEQ ID NO:13-27的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性。
67.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)选自由以下组成的组的至少一个(例如,至少两个)MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一个的变体(例如,相对于对应wt.MOD多肽序列,对其受体具有降低的亲和力的变体)。
68.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)wt.IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列或变体PD-L1或PD-L2MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对PD1受体具有降低的亲和力)。
69.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)wt.IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)FAS-L MOD多肽序列或变体FAS-L MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对Fas受体具有降低的亲和力)。
70.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)wt.IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-1 MOD多肽序列或变体IL-1 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-1受体具有降低的亲和力)。
71.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-4 MOD多肽序列或变体IL-4 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-4受体具有降低的亲和力)。
72.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-6 MOD多肽序列或变体IL-6 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-6受体具有降低的亲和力)。
73.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-7 MOD多肽序列或变体IL-7 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-7受体具有降低的亲和力)。
74.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-10 MOD多肽序列或变体IL-10 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-10受体具有降低的亲和力)。
75.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-15 MOD多肽序列或变体IL-15 MOD多肽序列(例如,相对于对应wt.序列,对IL-15受体具有降低的亲和力)。
76.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)IL-2 MOD多肽序列或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-21 MOD多肽序列(例如,SEQ ID NO:58或60的序列)或变体IL-21(例如,相对于对应wt.序列,对IL-21受体具有降低的亲和力)MOD多肽序列。
77.如方面1至62中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一个或多个(例如,一个、两个或更多个)独立选择的MOD多肽序列包含:
(i)至少一个(例如,至少两个)wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:9的序列)或变体IL-2 MOD多肽序列(例如,方面66的变体IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一个(例如,至少两个)IL-23 MOD多肽序列(例如,SEQ ID NO:63或65)或变体IL-23(例如,相对于对应wt.序列,对IL-23受体具有降低的亲和力)MOD多肽序列。
78.如方面63至77中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中当TGF-β多肽/多肽复合物包含变体IL-2 MOD多肽序列时,变体IL-MOD多肽(例如,SEQ ID NO:9的变体)包含N88、F42和/或H16中的任一个、两个或全部三个处的取代。
79.如方面78所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中至少一个变体IL-2 MOD多肽序列包含F42A、F42T、H16A或H16T取代。
80.如方面78所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中至少一个变体IL-2 MOD多肽序列包含:(i)F42A和H16A;(ii)F42T和H16A;(iii)F42A和H16T;或(iv)F42T和H16T取代。
81.如方面78所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中至少一个变体IL-2 MOD多肽序列包含:(i)N88R、F42A和H16A;(ii)N88R、F42T和H16A;(iii)N88R、F42A和H16T;或(iv)N88R、F42T和H16T取代。
82.如方面1至81中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽多肽序列是包含I型(TβRI)、II型(TβRII)或III型(TβRIII)TβR的胞外结构域片段的TGF-β受体(“TβR”)多肽序列。
83.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含与SEQ ID NO:117中列示的TβRII同工型A胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
84.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含与SEQ ID NO:119中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或143个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
85.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含与SEQ ID NO:120中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或143个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
86.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含选自包含以下各者的TβRII同工型B多肽序列的氨基酸序列:SEQ ID NO:120的胞外结构域片段;SEQ ID NO:121中的TβRII胞外结构域N末端Δ14(δ14)aa缺失序列;SEQ ID NO:122中列示的N末端Δ25(δ25)aa缺失序列;或与那些TβRII同工型B多肽序列中的任一者的至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或118个连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的序列。
87.如方面83-86中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含F30、D32、S52、E55和/或D118中的任何一个、两个、三个、四个或所有五个的取代(例如,用丙氨酸或精氨酸)。
88.如方面83-87中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,包含:
D118A或D118R取代(参见例如,SEQ ID NO:123的具有N末端Δ25缺失和D118取代的TβRII胞外结构域);或
D118A或D118R取代以及F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一个、两个、三个或所有四个。
89.如方面87所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120的至多14aas的N末端缺失(Δ14aa缺失)(参见例如,SEQID NO:121中的序列)和D118取代(例如,D118A或D118R);或与那些TβRII多肽序列中的任一个的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或118个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的序列。
90.如方面89所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其进一步包含F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一个、两个、三个或所有四个。
91.如方面87所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII胞外结构域序列包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120的至多25aas的N末端缺失(Δ25aa缺失)和D118取代(例如,D118A或D118R,参见SEQ ID NO:123);或与那些TβRII多肽序列中的任一个的至少70个(例如、至少80、至少90或至少100个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的序列。
92.如方面91所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其进一步包含F30A、D32N、S52L和/或E55A取代中的一个、两个、三个或所有四个。
93.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβR多肽序列包含TβRI胞外结构域序列。
94.如方面93所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRI胞外结构域序列包含与SEQ ID NO:115的至少70个(例如,至少80、至少90或93个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
95.如方面82所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβR多肽序列包含TβRIII胞外结构域序列。
96.如方面95所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRIII胞外结构域序列包含与(A同工型SEQ ID NO:124的aas 27-787或B同工型SEQ ID NO:125的aas 27-786)的至少70个(例如,至少80、90、100、150、200、250、300、400、500或600个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
97.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列包含与包含人TGF-β1多肽、人TGF-β2多肽或人TGF-β3多肽的成熟形式的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100或至少110个)连续aas的多肽具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
98.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是TGF-β1多肽,其包含与SEQ ID NO:105(例如,SEQ ID NO:106的aas 279-390)的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)连续aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
99.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是带有C77S取代的TGF-β1多肽,其包含与SEQ ID NO:107的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)连续aa序列同一性的氨基酸序列。
100.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是TGF-β2多肽,其包含与(SEQ ID NO:108)(例如SEQ ID NO:109的aas 302-413)的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)连续aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
101.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是带有C77S取代的TGF-β2多肽,其包含与SEQ ID NO:110的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)连续aas序列同一性的氨基酸序列。
102.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是TGF-β3多肽,其包含与SEQ ID NO:111(例如SEQ ID NO:112的aas 301-412)的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)连续aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
103.如方面1至96中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列是带有C77S取代的TGF-β3多肽,其包含具有与SEQ ID NO:113的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112个)连续aas至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列。
104.如方面97-103中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列包含成熟TGF-β多肽序列(参见例如,图3和图4中的SEQ ID NO:112)的位置25、92和/或94中的一者或多者处的取代。
105.如方面100-101中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列包含成熟TGF-β多肽序列(参见例如,图3和图4中的SEQ ID NO:112)的位置25、92和/或94中的一者或多者处的取代。
106.如方面97-105中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽序列包含:
(i)位置25处除Lys或Arg以外的aa
(ii)位置92处除Ile或Val以外的aa;和/或
(iii)位置94处除Lys或Arg以外的aa(例如,基于SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:110)。
107.如方面1-106中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1中的结构A-F的任一种的形式。
108.如方面107所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物是具有图1中的结构A的形式的掩蔽的TGF-β多肽。
109.如方面108所述的掩蔽的TGF-β多肽,其包含至少一个(例如,一个、两个或更多个)wt.或变体IL-2 MOD多肽序列。
110.如方面107所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物是具有图1中的结构B的形式的掩蔽的TGF-β复合物。
111.如方面110所述的掩蔽的TGF-β多肽,其包含至少一个(例如,一个、两个或更多个)wt.或突变体IL-2 MOD多肽序列。
112.如方面107所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物是具有图1中的结构C的形式的种间掩蔽的TGF-β复合物。
113.如方面112所述的掩蔽的TGF-β多肽,其包含至少一个(例如,一个、两个或更多个)wt.或突变体IL-2 MOD多肽序列。
114.如方面107的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物是具有图1中的结构D或E的形式的种间掩蔽的TGF-β复合物。
115.如方面114所述的掩蔽的TGF-β多肽,其包含至少一个(例如,一个、两个或更多个)wt.或突变体IL-2 MOD多肽序列。
116.如方面107所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物是具有图1中的结构F的形式的种间掩蔽的TGF-β复合物。
117.如方面116所述的掩蔽的TGF-β多肽,其包含至少一个(例如,一个、两个或更多个)wt.或突变体IL-2 MOD多肽序列。
118.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:117的序列)或与SEQ ID NO:117中列示的TβRII同工型A胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:9的序列)。
119.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:119的序列)或与SEQ ID NO:119中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140至少143个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:9的序列)。
120.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:120的序列)或与SEQ ID NO:120中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120或至少129个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:9的序列)。
121.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:117的序列)或与SEQ ID NO:117中列示的TβRII同工型A胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含变体IL-2 MOD多肽序列,其包含与SEQ IDNO:9的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的aa序列。
122.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:119的序列)或与SEQ ID NO:119中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少143个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含变体IL-2 MOD多肽序列,其包含与SEQ IDNO:9的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的aa序列。
123.如方面107-117中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111的序列)或与SEQ ID NO:111中列示的TGF-β3序列的至少70个(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;
掩蔽多肽序列是TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ IDNO:120的序列)或与SEQ ID NO:120中列示的TβRII同工型B胞外结构域的至少90个(例如,至少100、至少110、至少120或至少129个)连续aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的氨基酸序列;并且
其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含变体IL-2 MOD多肽序列,其包含与SEQ IDNO:9的至少80个(例如,90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列同一性的aa序列。
124.如方面121-123中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β3多肽序列包含C77S取代。
125.如方面121-124中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TβRII多肽序列包含N末端Δ14和D118A或D118R序列修饰,或N末端Δ25和D118A或D118R序列修饰。
126.如方面121-125中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中IL-2 MOD多肽序列包含H16处的aa取代或F42处的aa取代。
127.如方面121-125中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中IL-2 MOD多肽序列包含H16和F42处的aa取代。
128.方面125-127中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中H16和F42处的取代选自由以下组成的组:H16A、H16T、F42A和F42T(例如,H16A和F42A或H16T和F42A)。
129.如方面121-128中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中IL-2 MOD多肽序列进一步包含N88R aa取代。
130a.如方面121-129a中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中:
TGF-β3多肽序列包含C77S取代;
TβRII多肽序列包含N末端Δ14和D118A或D118R序列修饰或N末端Δ25和D118A或D118R序列修饰;并且
IL-2 MOD多肽序列包含H16和F42处的aa取代。
130b.如方面130a所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中H16和F42处的取代是H16A和F42A取代或H16T和F42A取代。
131.如方面1-130b中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其进一步包含选自由以下组成的组的野生型或变体MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21和IL-23。
132.如方面1-130b中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其包含选自由以下组成的组的野生型或变体MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-10。
133.如方面1-132中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中TGF-β多肽/复合物包含变体TGF-β多肽,相对于没有序列变异的在其他方面相同的wt.TGF-β多肽,其对掩蔽多肽(例如,TGF-β受体多肽)序列的亲和力降低至少10%(例如,至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%)。
134.如方面1-133中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中相对于没有序列变异的对应wt.TβR多肽序列,TGF-β多肽/复合物包含对TGF-β多肽(低至少10%、低至少20%、低至少30%、低至少40%、低至少50%、低至少60%、低至少70%、低至少80%、低至少90%、低至少95%或低95%以上)的亲和力降低的具有一个或多个序列变异(例如,一个或多个aa缺失、插入或取代)的TβR多肽序列。
135.掩蔽的TGF-β复合物PSM-4033-4039。
136.一种或多种核酸(例如,表达载体),其编码方面1-135中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码方面4和6-135中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物。
137.一种诱导哺乳动物(例如,人)受试者或其细胞、组织或体液中的Treg细胞的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-135中任一项的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
138.如方面137所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-2 MOD多肽序列。
139.如方面137所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含(i)wt.或变体IL-2 MOD多肽序列,和(ii)wt.或变体PL-L1多肽序列。
140.如方面137-139中任一项所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物在施用维生素D(例如,1α,25-二羟基维生素D3或维生素D类似物(例如,维生素D3)、mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素)和/或视黄酸(例如,全反式视黄酸)中的任何一种或多种之前、期间(同时或组合施用)或之后施用。
141.如方面137-140中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中FoxP3+Treg细胞(例如,诱导型调节性T细胞(iTreg);胸腺衍生的Treg细胞(tTreg)和/或外周Treg细胞(pTreg)中的任何一种或多种)的数目增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,一个受试者或来自两个或更多个受试者的平均值)的组织或体液中Treg细胞的量。
142.如方面141所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液体积中Treg的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中的Treg细胞(例如,FoxP3+细胞、iTreg、tTreg和/或pTreg)数目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
143.一种诱导哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中的Th9细胞的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
144.如方面143所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-4 MOD多肽序列。
145.如方面143-144中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中Th9细胞的数目增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中Th9细胞的量。
146.如方面145所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液体积中Th9细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中Th9细胞的数目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
147.一种诱导哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中的Th17细胞的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
148.如方面147所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-6 MOD多肽序列。
149.如方面147-148中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中Th17细胞的数目增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中Th17细胞的量。
150.如方面149所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中Th17细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中Th17细胞的数目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
151.一种诱导哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中的Thf细胞的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
152.如方面151所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个wt.或变体IL-21和/或IL-23 MOD多肽序列。
153.如方面152所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个wt.或变体IL-21和至少一个wt.或变体IL-23 MOD多肽序列。
154.如方面151-153中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中Thf细胞的数目增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中Thf的数目。
155.如方面154所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中Thf细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中Thf细胞的数目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
156.一种抑制哺乳动物受试者(或其组织或体液)中Th1细胞的作用的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
157.如方面156所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-4 MOD多肽序列。
158.如方面156-157中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下情况下的量,Th1介导的干扰素γ和/或TNF向受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中(或所得浓度)的释放的抑制:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中干扰素γ和/或TNF的量。
159.如方面149所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中干扰素γ和/或TNF的量,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中干扰素γ和/或TNF的量减少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
160.一种抑制哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中Th2细胞的作用和/或增殖的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
161.如方面160所述的方法,其中所述施用导致相对于以下情况下的量,Th2介导的IL-4、IL-5和/或IL-13向受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中(或所得浓度)的释放的抑制:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中的量。
162.如方面161所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中IL-4、IL-5和/或IL-13的量,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的组织或体液中IL-4、IL-5和/或IL-13的平均值,在组织或体液的体积中IL-4、IL-5和/或IL-13的量减少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
163.一种抑制哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中II型先天淋巴细胞(ILC2细胞)的作用的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种任选地包含一个或多个独立选择的wt.或变体IL-10多肽序列(例如,单体形式诸如IL-10M1)。
164.如方面160所述的方法,其中所述施用导致相对于以下情况下的量,ILC2细胞介导的IL-5和/或IL-13向受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中(或所得浓度)的释放的抑制:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗之前或不存在所述治疗的施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中的量。
165.如方面164所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的量,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的平均值,在组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的量减少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
166.如方面所述164的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的量,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的平均值,在组织或体液的体积中IL-5和/或IL-13的量减少了至少25%。
167.一种支持哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中恒定自然杀伤T细胞(iNKT)细胞的发育和/或存活的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
168.如方面167所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个wt.或变体MOD多肽序列。
169.如方面167-168中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中iNKT细胞数目的增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中iNKT细胞的数目。
170.如方面169所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中iNKT细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中iNKT细胞的数目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
171.如方面169所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中iNKT细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中iNKT细胞的数目增加了至少25。
172.一种阻断哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中CD4+ T细胞数目的增加或减少CD4+ T细胞的数目的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
173.如方面172所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种除TGF-β多肽序列以外还包含至少一个wt.或变体MOD多肽序列。
174.如方面172-173中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中CD4+ T细胞数目的增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中CD4+ T细胞的量。
175.如方面174所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中CD4+细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中CD4+细胞的数目减少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
176.如方面174所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中CD4+细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中CD4+细胞的数目减少了至少25%。
177.一种阻断哺乳动物(例如,人)受试者或其组织或体液中CD8+ T细胞数目的增加或减少CD4+ T细胞的数目的方法,所述方法包括向受试者施用根据方面1-134中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
178.如方面172所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种除TGF-β多肽序列以外还包含至少一个wt.或变体MOD多肽序列。
179.如方面172-173中任一项所述的方法,其中所述施用导致相对于以下任一情况的那些细胞的数目,来自受试者的组织或体液(例如,血液或淋巴)流体的体积中CD8+ T细胞数目的增加:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的对照治疗组(例如,来自个体组的平均值)的组织或体液中CD8+ T细胞的量。
180.如方面174所述的方法,其中相对于施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前的组织或体液的体积中CD8+细胞的数目,或相对于未接受一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的匹配对照组的平均值,在组织或体液的体积中CD8+细胞的数目减少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
181.一种提供伤口、过敏反应、疾病或病症的治疗或预防的方法,所述方法包括向有需要的受试者(例如,人)施用(i)根据方面1-134中任一项所述的一种或多种独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,和/或(ii)编码根据方面1-134中任一项所述的一种或多种独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸。
182.如方面181所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的wt.或变体IL-2 MOD多肽序列。
183.如方面182所述的方法,其中独立选择的wt.或变体IL-2 MOD多肽包含SEQ IDNO:9的IL-2多肽或其变体。
184.如方面183所述的方法,其中独立选择的变体IL-2 MOD多肽序列包含具有以下各项的序列:
(i)与SEQ ID NO:9的至少80个(例如,至少90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性;或
(ii)与SEQ ID NO:15-27中任一个的至少80个(例如,至少90、100、110、120、130或133个)连续aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性。
185.如方面182-184中任一项所述的方法,其中独立选择的变体IL-2 MOD多肽序列包含N88、F42和/或H16中任一者、两者或所有三者处的取代。
186.如方面182-185中任一项所述的方法,其中独立选择的变体IL-2 MOD多肽序列包含选自由以下组成的组的取代或取代对:(i)F42A;(ii)F42T;(iii)H16A;(iv)H16T;(v)F42A和H16A;(vi)F42T和H16A;(vii)F42A和H16T;或(viii)F42T和H16T取代。
187.如方面181-186中任一项所述的方法,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物包含至少一个(例如,至少两个)独立选择的wt.或变体PD-L1多肽序列。
188.如方面187所述的方法,其中独立选择的变体PD-L1多肽序列包含与SEQ IDNO:2的至少170个连续aa(例如,至少180、190或200个连续aa)具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性的多肽序列。
189.如方面181-188中任一项所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β多肽中的至少一种包含独立选择的wt.或变体IL-10多肽序列(例如,单体异构体诸如IL-10M1)。
190.如方面189所述的方法,其中独立选择的wt.或变体IL-10多肽序列包含与SEQID NO:50或51(例如当所述序列是变体IL-10序列时,具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如,至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160个)连续aa具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性的多肽序列;并且其中变体IL-10多肽序列任选地包含SEQ ID NO:51的N49与K50之间或SEQ ID NO:49或50中的等效位置处的5-7aa插入(例如,插入介于aa 49与aa 50之间的SEQ ID NO:51中的IL-10M1GGGSGG)。
191.如方面181-190中任一项所述的方法,其中独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含独立选择的wt.或变体FasL多肽序列。
192.如方面191所述的方法,其中独立选择的wt.或变体FasL多肽序列包含与SEQID NO:144(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个连续aa(例如,至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160或至少180个连续aa)具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性的多肽序列。
193.如方面181-192中任一项所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物在施用维生素D(例如,1α,25-二羟基维生素D3)、视黄酸(例如,全反式视黄酸)和/或雷帕霉素中的任一种、两种或所有三种之前、同时、组合或之后施用。
194.如方面181-193中任一项所述的方法,其中自身免疫疾病选自由以下组成的组:艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫相关性不孕症、自身免疫血小板减少性紫癜、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩氏病、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎(例如新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力(MG)、天疱疮(例如寻常性天疱疮)、恶性贫血、多发性肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、休格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1D)、血管炎和白斑病。
195.如方面181-193中任一项所述的方法,其中自身免疫疾病是T1D或乳糜泻。
196.如方面181-193中任一项所述的方法,其中自身免疫疾病并非T1D或乳糜泻。
197.如方面181-193中任一项所述的方法,其中所述方法是过敏反应的治疗或预防方法。
198.如方面197所述的方法,其中过敏反应是对花生、坚果、植物花粉、乳胶、蜂毒或黄蜂毒素过敏原的反应。
199.如方面181-190中任一项所述的方法,其中所述方法是提供烧伤或伤口的治疗或预防的方法。
200.如方面199所述的方法,其中伤口是表皮或粘膜的擦伤、撕脱、切口、割伤或刺伤。
201.如方面200所述的方法,其中i)根据方面1-134中任一项所述的一种或多种独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,和/或(ii)编码根据方面1-134中任一项所述的一种或多种独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸在形成伤口之前、期间和/或之后施用。
202.如方面199-201中任一项所述的方法,其中烧伤和/或伤口在外科手术或其他医疗程序期间发生,或者是所述外科手术或其他医疗程序的结果。
203.如方面199-202中任一项所述的方法,其中将一种或多种独立选择的掩蔽的TGF-β构建体或复合物施用于伤口或烧伤部位。
204.如方面199-203中任一项所述的方法,其中相对于未治疗受试者或伤口,施用掩蔽的TGF-β构建体或复合物(有效量)和/或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,重组表达载体)会加速伤口闭合(缩短闭合的时间)、缩短愈合时间或减少瘢痕形成。
205.如方面181所述的方法,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的wt.(例如,SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31)或变体IL-4多肽序列。
206.如方面205所述的方法,其中变体IL-4多肽序列包含与SEQ ID NO:29或SEQID NO:31(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少80个连续aa(例如至少100或110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
207.如方面205-206中任一项所述的方法,其中疾病或病症是蠕虫感染。
208.如方面181所述的方法,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的wt.(例如,SEQ ID NO:35的多肽)或变体IL-6多肽序列。
209.如方面208所述的方法,其中变体IL-6多肽序列包含与SEQ ID NO:35(例如,其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少80个连续aa(例如至少100或110个连续aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性的多肽序列。
210.如方面204-209中任一项所述的方法,其中疾病或病症是细菌和/或真菌感染(例如,在肠道中)。
211.如方面181所述的方法,其中掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含至少一个(例如,至少两个或至少三个)独立选择的wt.或变体IL-21和/或IL-23多肽序列。
212.如方面209所述的方法,其中至少一个(例如,至少两个)IL-21 MOD多肽序列包含(i)SEQ ID NO:58或60的多肽序列或(ii)与SEQ ID NO:58或60(并且其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个)连续aa具有至少80%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性的多肽序列。
213.如方面211或212所述的方法,其中至少一个(例如,至少两个)IL-23 MOD多肽序列包含(i)SEQ ID NO:63或65的多肽序列或(ii)与SEQ ID NO:63和/或65(并且其具有至少一个aa取代、缺失或插入)的至少50个(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160、至少180、至少200、至少220、至少240、至少260、至少280、至少300、至少320或至少340个)连续aas具有至少80%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列同一性的多肽序列。
214.如方面211-213中任一项所述的方法,其中疾病或病症没有产生高亲和力抗体或足够量的高亲和力抗体的能力。
215.一种诱导哺乳动物受试者的耐受性的方法,所述方法包括向受试者施用:
(i)根据方面1-136中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,表达载体),
(ii)根据方面1-136中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,表达载体),其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-2多肽序列;
(iii)根据方面1-136中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,表达载体),其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体FasL多肽序列;或
(iv)根据方面1-136中任一项所述的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,表达载体),其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体IL-2多肽序列,并且其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的至少一种包含wt.或变体FasL多肽序列或wt.或变体IL-10多肽序列。
216.如方面137-215中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用非甾体抗炎药物(NSAID)(例如,Cox-1和/或Cox-2抑制剂,诸如塞来昔布(Celecoxib)、双氯芬酸(Diclofenac)、双氟尼酸(Diflunisal)、依托度酸(Etodolac)、布洛芬(Ibuprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、酮洛芬(Ketoprofen)和萘普生(Naproxen))。
217.如方面137-216中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用皮质类固醇(例如,可的松(Cortisone)、地塞米松(Dexamethasone)、氢化可的松(Hydrocortisone)、依他米松(Ethamethasoneb)、氟氢可的松(Fludrocortisone)、甲基泼尼松龙(Methylprednisolone)、泼尼松(Prednisone)、泼尼松龙(Prednisolone)和曲安西龙(Triamcinolone))。
218.如方面137-217中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用阻断肿瘤坏死因子α的一种或多种作用的试剂(例如,抗TNFα,诸如戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)或TNFα诱饵受体,诸如依那西普(etanercept))。
219.如方面137-218中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用与IL-1竞争性地结合至IL-1受体的剂(例如,阿那白滞素(anakinra))。这个方面可经历以下限制条件:如果施用于受试者的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的任一种包含IL-1多肽,则不施用与IL-1竞争性地结合至IL-1受体的剂。
220.如方面137-219中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用结合至IL-6受体并抑制IL-6通过受体的信号传导的剂(例如,托珠单抗(tocilizumab))。这个方面可经历以下限制条件:如果施用受试者的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物中的任一种包含IL-6多肽,则不施用结合至IL-6受体的试剂。
221.如方面137-220中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用结合至CD80或CD86受体并抑制T细胞增殖和/或B细胞免疫反应的剂(例如,阿巴西普(abatacept))。
222.如方面137-221中任一项所述的方法,其还包括在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前、期间(同时或组合施用)或之后,施用结合至CD20由此导致B-细胞死亡的剂(例如,利妥昔单抗(rituximab))。
223.如方面137-222中任一项所述的方法,其中哺乳动物受试者选自:人、牛、犬、猫、啮齿动物、鼠类、山羊、猿猴、绵羊、马、兔、猪等受试者。
224.如方面137-223中任一项所述的方法,其中受试者是人(例如,需要治疗或预防的人患者或人受试者)。
225.一种将TGF-β多肽或TGF-β多肽和免疫调节多肽(MOD)递送至细胞的方法,其包括使细胞与以下各项接触:(i)方面1-134中任一项的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,(ii)方面1-134中任一项的包含一个或多个独立选择的wt.或变体MOD序列的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物,或(iii)编码方面135-136中任一项的一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸,其任选地编码一个或多个独立选择的wt.或变体MOD。
226.一种产生表达掩蔽的TGF-β构建体或复合物的细胞的方法,所述方法包括将编码方面1-134中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物的一种或多种核酸(例如,表达载体)引入细胞中(例如,在体外的哺乳动物细胞),并且任选地选择包含未整合和/或整合到至少一个细胞染色体中的一种或多种核酸的全部或一部分的细胞(例如,抗生素选择,随后进行分析以确定一种或多种核酸中的任一种是否整合到细胞染色体中)。
227.如方面224所述的方法,其中细胞是选自以下细胞的哺乳动物细胞系的细胞:HeLa细胞、CHO细胞、293细胞、Vero细胞、NIH 3T3细胞、Huh-7细胞、BHK细胞、PC12、COS细胞、COS-7细胞、RAT1细胞、小鼠L细胞、人胚肾(HEK)细胞和HLHepG2细胞。
228.一种细胞,其瞬时或稳定表达通过方面226或227的方法制备的掩蔽的TGF-β构建体或复合物。
229.如方面228所述的细胞,其中细胞表达约25至约350毫克/升或更多(例如,约25至约100、约100至约200、约200至约300、约300至约350毫克/升、或大于350毫克/升)掩蔽的TGF-β构建体或复合物,而相对于不表达掩蔽的TGF-β构建体或复合物的在其他方面相同的细胞,活力没有实质性降低(少于5%、10%或15%降低)。
230.如方面138-142中任一项所述的方法,其中施用包含wt.或变体IL-2 MOD多肽序列的掩蔽的TGF-β构建体或复合物造成受试者、细胞、组织或体液中的一种或多种T细胞(例如,炎性T细胞诸如Th1、Th2、Th17和/或Th22细胞)的调节。
231.如方面230所述的方法,其中一种或多种T细胞是Th1细胞并且调节通过Th1细胞数目的减少,由Th1细胞表达或分泌的干扰素γ的减少,或受试者、细胞、组织或体液中干扰素γ的水平降低来评估:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,一个受试者或来自两个或更多个受试者的平均值)的受试者、细胞、组织或体液中干扰素γ的量。
232.如方面230所述的方法,其中一种或多种T细胞是Th2细胞并且调节通过Th2细胞数目的减少,由Th2细胞表达或分泌的IL-4、IL-5和/或IL-13的减少,或受试者、细胞、组织或体液中L-4、IL-5和/或IL-13的水平降低来评估:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,一个受试者或来自两个或更多个受试者的平均值)的受试者、细胞、组织或体液中L-4、IL-5和/或IL-13的量。
233.如方面230所述的方法,其中一种或多种T细胞是Th17细胞并且调节通过Th17细胞数目的减少,由Th17细胞表达或分泌的IL-17和/或IL-22的减少,或受试者、细胞、组织或体液中IL-17和/或IL-22的水平降低来评估:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,一个受试者或来自两个或更多个受试者的平均值)的受试者、细胞、组织或体液中IL-17和/或IL-22的量。
234.如方面230所述的方法,其中一种或多种T细胞是Th22细胞并且调节通过Th22细胞数目的减少,由Th22细胞表达或分泌的IL-22、IL-13和/或TNF-α中至少两种的减少,或受试者、细胞、组织或体液中IL-22、IL-13和/或TNF-α的水平降低来评估:
(i)在施用一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物之前或不存在所述施用时;或
(ii)相对于与受试者匹配(例如,疾病状态、年龄、性别、身高、体重和/或吸烟习惯中的一项或多项)但未施用TGF-β或掩蔽的TGF-β构建体或复合物的治疗组(例如,一个受试者或来自两个或更多个受试者的平均值)的受试者、细胞、组织或体液中IL-22、IL-13和TNF-α的量。
235.如方面234所述的方法,其中所述方法还包括评估IL-4、IL-17和/或干扰素γ中的一种或多种的表达、分泌,或受试者、细胞、组织或体液中IL-4、IL-17和/或干扰素γ中的一种或多种的水平。
236.如方面230-235中任一项所述的方法,其中T细胞是旁观者T细胞。
237.如方面230-236中任一项所述的方法,其中一种或多种掩蔽的TGF-β构建体或复合物在施用维生素D(例如,1α,25-二羟基维生素D3或维生素D类似物(例如,维生素D3)、mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素)和/或视黄酸(例如,全反式视黄酸)中的任何一种或多种之前、期间(同时或组合施用)或之后施用。
238.如方面230-237中任一项所述的方法,其中包含wt.或变体IL-2 MOD的掩蔽的TGF-β构建体或复合物具有图1结构A至F中列示的结构。
239.如方面238所述的方法,其中Fc区缺少免疫球蛋白效应序列(与wt.蛋白相比,补体组分1q(“C1q”)结合减少,并且因此参与补体依赖性细胞毒性的能力降低)。
VI.实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的更完整公开和描述,而非意图限制发明人认为其发明的范围,也不意图表示以下实验是进行的所有或仅有实验。已尽力确保所使用的数值(例如量、温度等)的准确性,但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指定,否则份是按重量计的份,分子量是重量平均分子量,温度以摄氏度表示,并且压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写,例如,bp,碱基对;kb,千碱基;μl,微升;pl,皮升;s或sec,秒;min,分钟;h或hr,小时;aa,氨基酸;kb,千碱基;bp,碱基对;nt,核苷酸;i.m.,肌肉内;i.p.,腹膜内;s.c.,皮下;wt.,野生型;等。
A.实施例1:
1单一多肽链掩蔽的TGF-β构建体
呈递掩蔽的TGF-β蛋白的完整单一多肽链的稳定表达通过制备编码所需组分的核酸并且使用哺乳动物细胞的表达载体驱动表达来证明。核酸编码从N末端至C末端包含以下各项的多肽:MOD多肽序列(例如,wt.IL-2多肽序列,诸如SEQ ID NO:20,或带有H16和/或F42处的取代的所述IL-2多肽的变体;带有L234A和L235A取代以及防止Fc二聚化的取代的IgG1 Fc支架多肽序列,II型TGF-β受体(例如,具有D32N和/或D118A序列变异的TGF-βRII B同工型多肽序列),和TGF-β多肽序列(例如,wt.TGF-β3或C77S序列变体)。具有所表达蛋白质的总体结构的示意图在图1中示出为结构A,其一个实例在图7A中示出为构建体3470(SEQID NO:146),此多肽的aa序列的另一个实例是与标记的元件比对的构建体编号3472,在图7G中示出为SEQ ID NO:157。在适于哺乳动物蛋白质表达的质粒中(例如,在中国仓鼠卵巢或CHO细胞中)构建核酸之后,所述蛋白质得以表达并且使用蛋白A和尺寸分离色谱来纯化。
除了构建和分离构建体3470和3472以外,还制备两个额外的单一多肽链掩蔽的TGF-β构建体3466和3468。构建体3470,与构建体3472、3466和3468(如以下(i)至(iii)编号)一起证明尤其通过传统Fc缔合制备实质上不二聚化的单链掩蔽的TGF-β蛋白的可行性。多肽从N末端至C末端包含以下多肽序列:
(i)wt.IL-2-IgG Fc-TβRIIΔ25(D32N,D118A)取代-TGF-β3(C77S)(图7G,构建体编号3472)SEQ ID NO:157;
(ii)IL-2(H16T,F42A)-IgG Fc-TβRIIΔ25(D118)-TGF-β3(C77S)(图7H,构建体编号:3466)SEQ ID NO:158;和
(iii)IL-2(H16T,F42A)-IgG Fc-TβRIIΔ25(D32N,D118)-TGF-β3(C77S)(图7I,构建体编号3468)SEQ ID NO:159。
如上所示,单一多肽链掩蔽的TGF-β构建体可包含防止Fc区的二聚化的取代,例如在如SEQ ID NO:71的IgG1序列中编号的L131(例如,L131K)、T146(例如,T146S)、P175(例如,P175V)、F185(例如,F185R)、Y187(例如,Y187A)和K189(例如,K189Y)处。(i)至(iii)中的上述构建体包含如SEQ ID NO:71的IgG1序列中编号的L131K、T146S、P175V、F185R、Y187A和K189Y。
2异二聚体多肽链
通过制备编码包含TGF-β多肽序列的第一多肽的核酸和编码TGF-β受体多肽序列的第二核酸并且使用哺乳动物表达载体(例如,CHO细胞中的质粒表达系统)表达多肽来证明包含两个多肽的掩蔽的TGF-β复合物和掩蔽的TGF-β构建体的稳定表达。第一多肽包含,例如,MOD多肽序列(例如,wt.或变体IL-2多肽序列)、IgG Fc支架多肽序列(例如,KiH Fc)和TGF-β多肽序列(例如,带有TGF-β1或wt.TGF-β3的wt.或序列变体)(参见例如,图7J构建体3618)。第二多肽包含例如MOD多肽序列(例如,wt.或变体IL-2多肽序列)、IgG Fc支架多肽序列(例如,第一多肽的KiH序列的对应部分)和II型TGF-β受体(TGF-βRII)多肽序列(wt.或具有序列变异)(参见例如,图7J构建体3621)。所表达蛋白质的示意性结构在图1中示出为结构D。从N末端至C末端包含以下多肽序列的一对此类多肽(iv.a)和(iv.b)的表达和纯化(蛋白A和尺寸分离色谱):
(iv.a)IL-2(wt.MOD)-杵臼Fc(例如,杵Fc)-TGF-β3(wt.)参见图7J构建体3618(SEQ ID NO:148);和
(iv.b)IL-2(wt.MOD)-杵臼Fc(例如,臼Fc)-TβRII(D32N)参见图7J构建体3621(SEQ ID NO:160)。
在构建体(iv.a)或(iv.b)中,IL-2多肽可包含H16和/或H42处的取代,诸如H16T和F42A取代或H16A和F42A取代。
3掩蔽的TGF-β构建体的活性
测试各种浓度的纯化的掩蔽的TGF-β多肽复合物和构建体(例如,构建体(i)至(iii)和本实施例的部分1和2中制备的多肽(vi.a)和(vi.b)的复合物)的诱导幼稚CD4细胞产生FoxP3的能力。对于测定,将105个幼稚CD4细胞涂铺于含有5μg/ml结合抗CD3以及1μg/ml抗CD28和所指定的掩蔽的TGF-β多肽复合物或构建体的孔中。培养五天之后,FoxP3CD4+双重阳性细胞的数目使用荧光标记抗CD4和抗-FoxP3通过流式细胞术来评估。提供通过TGF-β3或TGF-β3和重组人IL-2 100U/ml的刺激的对照也并行运行。
在图6中的A处,测试在存在或不存在IL-2的情况下,与wt.TGF-β3的作用相比,具有图1中的A处示出的总体结构的包含wt.IL-2-IgG Fc-(mFc)-TβRII与D32N取代-TGF-β3的掩蔽的TGF-β构建体关于FoxP3表达的比较。图6中的A处示出的结果指示wt.TGF-β3在测试条件下实际上不刺激FoxP3,但wt.IL-2补充可导致FoxP3表达。
在图6中的B处,测试在IL-2存在下,与wt.TGF-β3的作用相比,本实施例的部分1和2的掩蔽的TGF-β构建体(i)、(ii)和(iii),和包含多肽(iv.a)和(iv.b)的掩蔽的TGF-β复合物的FoxP3表达的比较。图6中的B处示出的结果指示具有wt.IL-2的掩蔽的TGF-β构建体和复合物比具有IL-2取代H16T和F42A的那些更有效。H16T和F42A处的取代将掩蔽的复合物的效力从约5纳摩尔向约50纳摩尔偏移一个数量级,而基于表达FoxP3的细胞的数目的最大功效无实质性变化。与图6中的A处示出的结果一样,与IL-2和TGF-β3相比,掩蔽的TGF-β构建体和复合物更有效地诱导T细胞产生FoxP3。
基于CD4+和FoxP3的细胞的选通和分离的实例在图6中的C处示出。结果证明暴露于1,000nM的掩蔽的TGF-β构建体的细胞中FoxP3得以诱导,显示出相对于暴露于0.1nM相同构建体的细胞,FoxP3表达增加大约30倍。
B.实施例2
1非种间的支架
本章节描述了掩蔽的TGFβ序列,其不采用种间支架,并且因此要么是单体的,或要么如果其二聚化,则其不优先与对应序列形成异二聚体。
a.单一多肽链掩蔽的TGF-β构建体
核酸编码的多肽从N末端至C末端包含,MOD多肽序列:wt.IL-2多肽序列(SEQ IDNO:20),带有L234A和L235A(“LALA”)、L351K、T366S、P395V、F405R、Y407A和K409Y取代的IgG1 Fc支架多肽序列wt.IgG1 aas 11-215(Δ10),具有D118A取代(*D119A参见图5B中的注释)的成熟蛋白的aa 26至136aas的TGF-βRII同工型B多肽序列,和具有C77S取代的人TGF-β3型同工型1多肽序列。所表达蛋白质的示意性结构在图1中示出为结构A(SEQ ID NO:146)。蛋白质通过蛋白A和尺寸色谱来纯化。
b.同二聚体多肽复合物
核酸编码的多肽从N末端至C末端包含MOD多肽序列(具有H16T和F42A取代的IL-2SEQ ID NO:20)、IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1)、具有D118A取代(*D119A参见图5B中的注释)的成熟蛋白的aa 26至136aas的TGF-βRII同工型B多肽序列、和具有C77S取代的人TGF-β3型同工型1多肽序列。所表达蛋白质的示意性结构在图1中示出为结构B。与标记的元件比对的对应aa酸序列在图7B中示出(SEQID NO:147)。蛋白质通过蛋白A和尺寸色谱来纯化。
2具有种间支架多肽的异二聚体掩蔽的TGF-β复合物
a.具有各自带有IL-2 MOD多肽的种间支架的异二聚体掩蔽的TGF-β复合物
通过制备编码包含TGF-β多肽序列的第一多肽的核酸和编码TGF-β受体多肽序列的第二核酸并且使用哺乳动物表达载体(例如,CHO细胞中的质粒表达系统)来表达多肽来证明包含两个多肽的掩蔽的TGF-β复合物和掩蔽的TGF-β构建体的稳定表达。
第一多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1残基1-225),和T366W KiH“杵”取代,和具有C77S取代的人TGF-β3型同工型1多肽序列。
第二多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1残基1-225),以及T366S、L368A和Y407V KiH“臼”取代,和具有D118A取代的成熟蛋白的aa 26至136aas的TGF-βRII同工型B多肽序列。所表达蛋白质的示意性结构在图1中示出为结构D。与标记的元件比对的对应aa酸序列在图7C中示出。表达和纯化(蛋白A随后是尺寸排阻色谱)提供异二聚体复合物。
b.具有种间支架的异二聚体掩蔽的TGF-β复合物,其中单链带有MOD多肽
通过制备编码包含TGF-β多肽序列的第一多肽的核酸和编码TGF-β受体多肽序列的第二核酸并且使用哺乳动物表达载体(例如,CHO细胞中的质粒表达系统)表达多肽来证明包含两个多肽的掩蔽的TGF-β复合物和掩蔽的TGF-β构建体的稳定表达。
第一多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代、和T366W(杵)取代的wt.IgG1残基1-225,和具有C77S取代的人TGF-β3型同工型1多肽序列。
第二多肽包含IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1残基1-225),以及T366S、L368A和Y407V“臼”取代,和具有D118A取代的成熟蛋白的aa 26至136aas的TGF-βRII同工型B多肽序列。
所表达蛋白质的示意性结构在图1中示出为结构E。与标记的元件比对的对应aa酸序列在图7D中示出。表达和纯化(蛋白A随后是尺寸排阻色谱)提供异二聚体复合物。
c.具有种间支架多肽稳定性的异二聚体掩蔽的TGF-β复合物,其中单链带有MOD多肽
通过制备编码包含TGF-β多肽序列的第一多肽的核酸和编码TGF-β受体多肽序列的第二核酸并且使用哺乳动物表达载体(例如,CHO细胞中的质粒表达系统)表达多肽证明包含两个多肽的掩蔽的TGF-β复合物和掩蔽的TGF-β构建体的稳定表达。
第一多肽包含IL-2多肽序列(具有H16T和F42A取代的SEQ ID NO 20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1残基1-225),和T366W(杵)取代,具有D118A取代的成熟蛋白的aa 26至136aas的TGF-βRII同工型B多肽序列,和具有C77S取代的人TGF-β3型同工型1多肽序列。
第二多肽包含IgG1 Fc支架多肽序列(例如,带有L234A和L235A(“LALA”)取代的wt.IgG1残基1-225),以及T366S、L368A和Y407V“臼”取代。
所表达蛋白质的示意性结构以图1的结构的变化形式示出为结构F,但缺少第二多肽上的任何免疫调节多肽序列。与标记的元件比对的对应aa酸序列在图7E中示出。表达和纯化(蛋白A随后是尺寸排阻色谱)提供异二聚体复合物。
C.实施例3表达和纯化
制备编码掩蔽的TGF-β构建体的核酸编码两种掩蔽的TGF-β复合物的核酸(参见图8)。复合物的样品通过用核酸构建体转染ExpiCHO细胞并且允许细胞表达多肽来制备。多肽通过蛋白A色谱随后是尺寸排阻色谱来纯化。纯化的蛋白质经历SDS-PAGE并且所得凝胶用考马斯蓝染色。NR=未还原或非还原样品,并且R=还原样品(用二硫化物还原剂来还原)。
D.实施例4掩蔽多肽与TGF-β之间的生物活性和亲和力
制备一系列掩蔽的TGF-β构建体来证明TGF-β的生物可利用性,并且其与TβRII相互作用的能力与掩蔽多肽对于TGF-β多肽序列的亲和力呈反比。构建体具有图1中的结构A的形式,并且从N末端至C末端,MOD是IL-2多肽;支架是IgG多肽;掩蔽受体是具有N末端aas1-25(Δ25)缺失和D118A取代的SEQ ID NO.119的TβRII多肽(并且其包含所指定的额外取代E55A、D32N或S52L),和TGF-β3多肽序列。
掩蔽的TGF-β构建体与TβRII的相互作用使用捕获测定来评估,其中TβRII-Ig Fc融合物捕获于微量滴定板的孔中并且将各种浓度的四种构建体应用于孔中。在冲洗掉未结合构建体之后,使用生物素标记的抗IL-2,随后是链霉亲和素-辣根过氧化物酶和450nm下的比色检测(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺),来检测和测量结合构建体。在图9中示出的结果指示Δ25-D118A构建体具有对于TβRII(TβRII-Ig融合物)的最低亲和力。添加E55A、D32N或S52L对于TGF-β3-TβRII复合物的解离常数具有越来越大影响,提供对于外源TβRII(在这种情况下为TβRII-Ig融合物)具有增加的亲和力的复合物。
E.实施例5具有种间支架多肽稳定性的异二聚体掩蔽的TGF-β复合物(PSM-4033-4039)的生物活性,其中单链带有变体IL-2 MOD多肽
制备如图10A示出的掩蔽的TGF-β复合物PSM-4033-4039。复合物包含分别在图10B和图10C中示出的第一和第二多肽4033和4039。然后用PSM-4033-4039进行一系列实验。
实验1:诱导来自人外周幼稚CD4+T细胞的Foxp3+iTreg。
将幼稚CD4+T细胞从人血液中分选出来,并且与抗人CD3(5ug/mL)、抗人CD28(1ug/mL)和增加剂量的PSM-4033-4039或单一剂量的作为阳性对照的重组TGFb3和IL-2一起涂铺。培养5天之后,通过流式细胞术评估细胞的转录因子Foxp3的表达。n=2,stdev。图11中提供的结果显示出在暴露于至多1,000nM的浓度的PSM-4033-4039的细胞中,FoxP3得以显著诱导。这些结果与图6B中示出的使用其他掩蔽的TGF-β构建体和复合物的结果类似,进一步证明本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物可实现FoxP3的显著诱导,FoxP3是包括天然和诱导Treg两者的Treg中的基因表达的主要调节因子,并且对于Treg身份和功能而言是重要的。
实验2:通过PSM-4033-4039诱导的Foxp3+iTreg来抑制T细胞增殖
将PSM-4033-4039诱导的Foxp3+调节性T细胞(iTreg)以与常规T细胞(T应答者)的不同比率培养并且用抗人CD3(1ug/mL)和丝裂霉素C处理的外周血单核细胞(PBMC)进行刺激。四天之后,通过cell trace violet(CTV)染料在T应答者细胞中的稀释,通过流式细胞术来评估增殖。图12中示出的数据表示各自一式两份涂铺的三个供体的平均值。使用TGF-β3和IL-2诱导的调节性T细胞或总外周CD4+ T细胞代替iTreg作为对照。抑制定义为与未添加iTreg对照相比的%更少CTV稀释(平均78%CTV稀释)。本实验的结果表明通过本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物例如PSM-4033-4039诱导的Foxp3+ T调控细胞可抑制T细胞的增殖,所述T细胞通过PBMC中的抗原呈递细胞提供的CD3交联和共刺激来活化。
除了Treg表达转录因子Foxp3以外,Treg的限定特征是其能够抑制其他白细胞的活化和功能。本实验表明通过本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物诱导的iTreg确实可抑制T细胞的增殖,所述T细胞通过PBMC中的抗原呈递细胞提供的CD3交联和共刺激来活化。
实验3:通过PSM-4033-4039诱导来自人外周CD4+T细胞的Foxp3+表达。
将幼稚CD4+T细胞从人血液中分选出来,并且与抗人CD3(5ug/mL)、抗人CD28(1ug/mL)和剂量增加的PSM-4033-4039一起涂铺。培养5天之后,通过流式细胞术评估细胞的转录因子Foxp3的表达。n=2。数据在图13A中示出。
为了测定CD4+ T细胞类型的混合物中的哪个细胞类型可分化成Foxp3表达细胞,将不同群体进行分选并单独用PSM-4033-4039处理。因此,在使用或不使用PSM-4033-4039(300nM)的情况下,将与图13A的供体不同的供体的幼稚、总、和记忆CD4+ T细胞进行分选并且以与上述相同的方法进行培养,并且在第5天通过流式细胞术来评估Foxp3。数据在图13B中示出。
在本实验中分化成Foxp3表达细胞的总CD4+ T细胞表示幼稚和记忆外周T细胞两者,其是本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物例如PSM-4033-4039在体内施用时遇到的细胞类型的混合物。这项数据显示出甚至在混合T细胞群中,本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物例如PSM-4033-4039可增加表达Foxp3的细胞的频率,Foxp3是定义调节性T细胞的基因表达的主要调节因子。图13B中示出的结果显示出PSM-4033-4039可诱导记忆CD4+T细胞分化成Foxp3+细胞,即使以比幼稚CD4+ T细胞更低的频率。
实验4:通过PSM-4033-4039从由同种异体淋巴细胞反应活化的CD4+T细胞中诱导Foxp3+iTreg
将总外周CD4+ T细胞从人血液中分选出来并且与同种异体单核细胞衍生的DC(moDC)一起涂铺以诱导T细胞增殖。将T细胞与作为对照的自体moDC混合,并且将同种异体或自体供体组合两者用作为额外对照的可溶性抗CD3(1ug/mL)来处理。将T细胞用celltrace violet(CTV)染料标记以追踪对同种异体活化作出反应的细胞。在第5天,Foxp3的增殖和表达通过流式细胞术来分析,并且表达Foxp3的增殖细胞的频率在图14A和图14B中作图。示出了两个供体组合。n=2,stdev。结果尤其证明本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物例如PSM-4033-4039用于治疗在骨髓或干细胞移植患者中出现的移植物抗宿主疾病的潜在用途。
实验5:使用PSM-4033-4039在小鼠中的PK实验。
PSM-4033-4039作为单一剂量以0.1、1或10mg/kg向Balb/c小鼠静脉内施用。然后在给药后5分钟、2、8、24和72小时收集外周血清样品。然后使用配体结合测定来测定PSM-4033-4039的血清浓度,所述测定使用抗IL2抗体捕获分子,并且使用抗TGFB3抗体检测分子。图15中提供的结果显示,本文公开的掩蔽的TGF-β3构建体和复合物例如PSM-4033-4039可在施用后以生物学相关浓度保留在血清中持续超过72小时。构建体4033的序列提供于图10B(SEQ ID NO:191)中,并且构建体4039的序列提供于图10C(SEQ ID NO:192)中。
***
尽管已参考本公开的特定实施方案描述本公开,但本领域技术人员应理解,在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下,可进行各种改变且可以等效物替换。另外,可根据本公开的目的、精神和范围进行许多修改以改变特定情况、材料、物质组成、方法、方法步骤。所有此类修改均旨在处于本文所附加权利要求的范围内。
序列表
<110> 库尔生物制药有限公司 (Cue Biopharma, Inc.)
<120> TGF-β多肽
<130> 123640-8012.WO00
<150> US 62/925,227
<151> 2019-10-23
<160> 192
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr
225 230 235 240
Leu Ser Pro Ser Thr
245
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val Ser Ile Lys Ile
210 215
<210> 3
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165 170 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180 185 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195 200 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210 215 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 4
<211> 271
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
20 25 30
Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met
35 40 45
Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys
50 55 60
Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val
65 70 75 80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
100 105 110
Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg
115 120 125
Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile
130 135 140
Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu
145 150 155 160
Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp
165 170 175
Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr
180 185 190
Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
195 200 205
Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe
210 215 220
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro
225 230 235 240
Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly
245 250 255
Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala
260 265 270
<210> 5
<211> 161
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Pro Arg Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe
1 5 10 15
Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln
20 25 30
Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His
35 40 45
Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser
50 55 60
Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu
85 90 95
Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu
100 105 110
Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala
115 120 125
His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu
130 135 140
Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln
145 150 155 160
Ala
<210> 6
<211> 269
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met
20 25 30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile
35 40 45
Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala
50 55 60
Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65 70 75 80
Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe
85 90 95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala
100 105 110
Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
130 135 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145 150 155 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
165 170 175
Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
180 185 190
Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
195 200 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
210 215 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225 230 235 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly
245 250 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
260 265
<210> 7
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys
1 5 10 15
Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln
20 25 30
Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln
35 40 45
Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
115 120 125
Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145 150
<210> 8
<211> 569
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu
20 25 30
Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro
35 40 45
Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr
50 55 60
Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys
65 70 75 80
Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys
100 105 110
Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe
115 120 125
Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr
130 135 140
Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp
145 150 155 160
Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly
165 170 175
Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly
180 185 190
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro
195 200 205
Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr
210 215 220
Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu
225 230 235 240
Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg
275 280 285
Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg
290 295 300
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys
325 330 335
His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser
340 345 350
Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg
355 360 365
Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr
370 375 380
Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr
385 390 395 400
Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu
405 410 415
Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val
420 425 430
Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg
435 440 445
Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu
450 455 460
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln
465 470 475 480
Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr
485 490 495
Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala
500 505 510
Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr
515 520 525
Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser
530 535 540
Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu
545 550 555 560
Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly
565
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 10
<211> 251
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 11
<211> 524
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys
20 25 30
Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu
35 40 45
Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly
50 55 60
Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg
65 70 75 80
Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp
85 90 95
Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln
100 105 110
Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser
115 120 125
Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys
145 150 155 160
Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln
165 170 175
Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr
180 185 190
Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala
195 200 205
Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu
210 215 220
Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys
225 230 235 240
Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro
245 250 255
Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp
260 265 270
Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro
275 280 285
Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp
290 295 300
Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala
305 310 315 320
Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly
325 330 335
Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln
340 345 350
Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly
355 360 365
Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu
370 375 380
Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu
385 390 395 400
Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr
405 410 415
Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu
420 425 430
Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro
435 440 445
Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu
450 455 460
Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu
465 470 475 480
Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg
485 490 495
Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu
500 505 510
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
515 520
<210> 12
<211> 347
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met
35 40 45
Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr
50 55 60
Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys
65 70 75 80
Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln
85 90 95
Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn
115 120 125
Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys
145 150 155 160
Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr
165 170 175
Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp
180 185 190
Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu
195 200 205
Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp
210 215 220
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
245 250 255
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
260 265 270
Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp
275 280 285
Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser
290 295 300
Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
305 310 315 320
Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp
325 330 335
Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
340 345
<210> 13
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> X 是 Glu 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 13
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Xaa His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X 是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala、Arg、Asn、Asp、
Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、
Thr、Tyr、Trp 或 Val。
<400> 15
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 不确定
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 Thr。
<400> 16
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> X 是除 Tyr 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 17
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 18
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (88)..(88)
<223> X 是除 Asn 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 Arg。
<400> 18
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Xaa Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 19
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> X 是除 Gln 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 20
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 The。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 Thr。
<400> 20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 21
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 The。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala 或 Thr。
<400> 21
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> X 是除 Glu 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Xaa His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X 是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> X 是除 Gln 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 25
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 26
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> X 是除 Tyr 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 26
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 27
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X 是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> X 是除 Tyr 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 27
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 28
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20 25 30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys
35 40 45
Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr
50 55 60
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
85 90 95
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
100 105 110
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
115 120 125
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
130 135 140
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
145 150
<210> 29
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu
1 5 10 15
Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe
20 25 30
Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala
35 40 45
Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys
50 55 60
Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg
65 70 75 80
Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn
85 90 95
Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu
100 105 110
Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20 25 30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr
35 40 45
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
50 55 60
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
65 70 75 80
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
85 90 95
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
100 105 110
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
115 120 125
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
130 135
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu
1 5 10 15
Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala
20 25 30
Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys
35 40 45
Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg
50 55 60
Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn
65 70 75 80
Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu
85 90 95
Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
100 105 110
<210> 32
<211> 825
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
100 105 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
165 170 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
195 200 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
210 215 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser
225 230 235 240
Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr
245 250 255
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
260 265 270
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
275 280 285
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
290 295 300
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
305 310 315 320
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
325 330 335
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
340 345 350
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
355 360 365
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
370 375 380
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
385 390 395 400
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
405 410 415
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
420 425 430
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
435 440 445
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
450 455 460
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
465 470 475 480
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
485 490 495
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
500 505 510
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
515 520 525
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
530 535 540
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
545 550 555 560
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
565 570 575
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
580 585 590
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
610 615 620
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
625 630 635 640
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Gly Phe
645 650 655
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
660 665 670
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
675 680 685
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
690 695 700
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
705 710 715 720
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
725 730 735
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
740 745 750
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
755 760 765
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
770 775 780
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
785 790 795 800
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
805 810 815
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
820 825
<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
100 105 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
165 170 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
195 200 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
210 215 220
Asn Ile Cys
225
<210> 34
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 35
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu
20 25 30
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met
35 40 45
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu
65 70 75 80
Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr
85 90 95
Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg
100 105 110
Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys
115 120 125
Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met
145 150 155 160
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180
<210> 36
<211> 468
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu
355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu
405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val
420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
435 440 445
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr
450 455 460
Phe Phe Pro Arg
465
<210> 37
<211> 918
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
35 40 45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
50 55 60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
85 90 95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Gly Phe Gln Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
130 135 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
180 185 190
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr
195 200 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
210 215 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu
225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
245 250 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385 390 395 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
405 410 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala
420 425 430
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu
435 440 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
450 455 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala
500 505 510
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
515 520 525
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val
530 535 540
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu
565 570 575
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met
580 585 590
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe
595 600 605
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro
610 615 620
Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys
625 630 635 640
Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro
645 650 655
Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro
660 665 670
Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe
675 680 685
Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn
705 710 715 720
Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser
725 730 735
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
740 745 750
Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg
755 760 765
His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln
770 775 780
Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp
785 790 795 800
His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys
805 810 815
Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu
820 825 830
Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu
835 840 845
Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln
850 855 860
Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly
865 870 875 880
Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala
885 890 895
Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln
900 905 910
Gly Gly Tyr Met Pro Gln
915
<210> 38
<211> 468
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu
355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu
405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val
420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
435 440 445
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr
450 455 460
Phe Phe Pro Arg
465
<210> 39
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 40
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 41
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Val Lys Gly Arg
65 70 75 80
Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu
85 90 95
Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu
100 105 110
Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met
115 120 125
Gly Thr Lys Glu His
130
<210> 42
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala
50 55 60
Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys
85 90 95
Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
100 105
<210> 43
<211> 159
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu
115 120 125
Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu
130 135 140
Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150 155
<210> 44
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
1 5 10 15
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
35 40 45
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
50 55 60
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
65 70 75 80
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Glu Glu
85 90 95
Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu
100 105 110
Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met
115 120 125
Gly Thr Lys Glu His
130
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Glu Asn Lys
65 70 75 80
Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg
85 90 95
Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr
100 105 110
Lys Glu His
115
<210> 46
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu
50 55 60
Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys
65 70 75 80
Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
85 90
<210> 47
<211> 459
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Gly Phe Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu
245 250 255
Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val
260 265 270
Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys
275 280 285
Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val
305 310 315 320
Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu
325 330 335
Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu
340 345 350
Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser
370 375 380
Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val
385 390 395 400
Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala
420 425 430
Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala
435 440 445
Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455
<210> 48
<211> 369
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro
275 280 285
Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His
290 295 300
Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn
340 345 350
Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu
355 360 365
Thr
<210> 49
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn
<210> 50
<211> 160
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 51
<211> 74
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln
1 5 10 15
Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys
20 25 30
Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu
35 40 45
Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu
50 55 60
Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser
65 70
<210> 52
<211> 578
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Met Leu Pro Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Gly Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val
20 25 30
Trp Phe Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile
35 40 45
Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr
50 55 60
Gly Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr
85 90 95
Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr
100 105 110
Val Thr Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly
115 120 125
Ser Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln
130 135 140
Leu Pro Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile
145 150 155 160
Phe Ser His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly
165 170 175
Asn Phe Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser
195 200 205
Val Ala Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile
210 215 220
Ser Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Val Ile Ile Phe Phe
225 230 235 240
Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Leu
245 250 255
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe
260 265 270
Lys Lys Pro Ser Pro Phe Ile Phe Ile Ser Gln Arg Pro Ser Pro Glu
275 280 285
Thr Gln Asp Thr Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys Val
290 295 300
Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly
305 310 315 320
Phe Gly Ser Thr Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Pro Gln Phe Leu
325 330 335
Leu Pro Asp Pro His Pro Gln Ala Asp Arg Thr Leu Gly Asn Arg Glu
340 345 350
Pro Pro Val Leu Gly Asp Ser Cys Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser Thr
355 360 365
Asp Ser Gly Ile Cys Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Thr Gly
370 375 380
Pro Thr Trp Glu Gln Gln Val Gly Ser Asn Ser Arg Gly Gln Asp Asp
385 390 395 400
Ser Gly Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Glu Gly Arg Ala Gly Asp Thr
405 410 415
Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu Val
420 425 430
Pro Gly Glu Glu Asp Pro Ala Ala Val Ala Phe Gln Gly Tyr Leu Arg
435 440 445
Gln Thr Arg Cys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Lys Thr Gly Cys Leu Glu
450 455 460
Glu Glu Ser Pro Leu Thr Asp Gly Leu Gly Pro Lys Phe Gly Arg Cys
465 470 475 480
Leu Val Asp Glu Ala Gly Leu His Pro Pro Ala Leu Ala Lys Gly Tyr
485 490 495
Leu Lys Gln Asp Pro Leu Glu Met Thr Leu Ala Ser Ser Gly Ala Pro
500 505 510
Thr Gly Gln Trp Asn Gln Pro Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Ala Leu
515 520 525
Ser Ser Cys Ser Asp Leu Gly Ile Ser Asp Trp Ser Phe Ala His Asp
530 535 540
Leu Ala Pro Leu Gly Cys Val Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Gly Ser
545 550 555 560
Phe Asn Ser Asp Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser
565 570 575
Ser Glu
<210> 53
<211> 325
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser
1 5 10 15
Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val
20 25 30
Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly
35 40 45
Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp
50 55 60
Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu
85 90 95
His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile
100 105 110
Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His
115 120 125
Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr
130 135 140
Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys
145 150 155 160
Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu
165 170 175
Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg
180 185 190
Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val
195 200 205
Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala
210 215 220
Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly
225 230 235 240
Cys Phe Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe
245 250 255
Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His
260 265 270
Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu
275 280 285
Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser
290 295 300
Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly
305 310 315 320
Gln Gly Pro Gln Ser
325
<210> 54
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 55
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 56
<211> 267
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
145 150 155 160
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
165 170 175
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
180 185 190
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
195 200 205
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
210 215 220
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
225 230 235 240
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
260 265
<210> 57
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser
<210> 58
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 59
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser
<210> 60
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Val Ser Thr Leu Ser Phe Ile
145 150
<210> 61
<211> 538
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
20 25 30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
35 40 45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
50 55 60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
85 90 95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
100 105 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
115 120 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
130 135 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
165 170 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
180 185 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
195 200 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
210 215 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu
225 230 235 240
Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys
245 250 255
Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser
260 265 270
Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe
275 280 285
Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly
290 295 300
Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His
305 310 315 320
Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu
325 330 335
Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp
340 345 350
Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp
355 360 365
Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala
370 375 380
Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro
385 390 395 400
Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp
405 410 415
Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser
420 425 430
Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg
435 440 445
Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro
450 455 460
Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser
465 470 475 480
Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly
485 490 495
Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp
500 505 510
Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro
515 520 525
Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
530 535
<210> 62
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
1 5 10 15
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
20 25 30
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
35 40 45
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
50 55 60
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
85 90 95
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
100 105 110
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
130 135 140
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
145 150 155 160
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
165 170 175
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
180 185
<210> 63
<211> 170
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln
1 5 10 15
Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val
20 25 30
Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp
35 40 45
Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg
50 55 60
Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu
85 90 95
Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu
100 105 110
Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile
115 120 125
Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe
130 135 140
Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val
145 150 155 160
Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
165 170
<210> 64
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 65
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 66
<211> 629
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Met Asn Gln Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly
20 25 30
His Ile Trp Val Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile
35 40 45
Ser Ile Tyr Cys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu
50 55 60
His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile
65 70 75 80
Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His
85 90 95
Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr
100 105 110
Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro
115 120 125
Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys
130 135 140
Thr Trp Asn Ala Gly Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val
145 150 155 160
His Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser
165 170 175
Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr
180 185 190
Leu Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys
195 200 205
Gln Leu Gln Ile His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val
210 215 220
Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile
225 230 235 240
Tyr Trp Asp Ser Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg
245 250 255
Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr
260 265 270
Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp
290 295 300
Gln Pro Trp Ser Ser Leu Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro
305 310 315 320
Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu
325 330 335
Thr Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg Gly
340 345 350
Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser
355 360 365
Ile Leu Ser Leu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile
370 375 380
Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile
385 390 395 400
Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser
405 410 415
Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro
420 425 430
Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr
435 440 445
Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro
450 455 460
Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu
465 470 475 480
Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser
485 490 495
His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro
500 505 510
Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro
515 520 525
Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile
530 535 540
Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser
545 550 555 560
Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu
565 570 575
Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp
580 585 590
Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile
595 600 605
Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Ser His Phe Asn Arg Ile
610 615 620
Ser Leu Leu Glu Lys
625
<210> 67
<211> 662
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Met Glu Pro Leu Val Thr Trp Val Val Pro Leu Leu Phe Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Gln Gly Ala Ala Cys Arg Thr Ser Glu Cys Cys Phe Gln
20 25 30
Asp Pro Pro Tyr Pro Asp Ala Asp Ser Gly Ser Ala Ser Gly Pro Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Cys Tyr Arg Ile Ser Ser Asp Arg Tyr Glu Cys Ser Trp
50 55 60
Gln Tyr Glu Gly Pro Thr Ala Gly Val Ser His Phe Leu Arg Cys Cys
65 70 75 80
Leu Ser Ser Gly Arg Cys Cys Tyr Phe Ala Ala Gly Ser Ala Thr Arg
85 90 95
Leu Gln Phe Ser Asp Gln Ala Gly Val Ser Val Leu Tyr Thr Val Thr
100 105 110
Leu Trp Val Glu Ser Trp Ala Arg Asn Gln Thr Glu Lys Ser Pro Glu
115 120 125
Val Thr Leu Gln Leu Tyr Asn Ser Val Lys Tyr Glu Pro Pro Leu Gly
130 135 140
Asp Ile Lys Val Ser Lys Leu Ala Gly Gln Leu Arg Met Glu Trp Glu
145 150 155 160
Thr Pro Asp Asn Gln Val Gly Ala Glu Val Gln Phe Arg His Arg Thr
165 170 175
Pro Ser Ser Pro Trp Lys Leu Gly Asp Cys Gly Pro Gln Asp Asp Asp
180 185 190
Thr Glu Ser Cys Leu Cys Pro Leu Glu Met Asn Val Ala Gln Glu Phe
195 200 205
Gln Leu Arg Arg Arg Gln Leu Gly Ser Gln Gly Ser Ser Trp Ser Lys
210 215 220
Trp Ser Ser Pro Val Cys Val Pro Pro Glu Asn Pro Pro Gln Pro Gln
225 230 235 240
Val Arg Phe Ser Val Glu Gln Leu Gly Gln Asp Gly Arg Arg Arg Leu
245 250 255
Thr Leu Lys Glu Gln Pro Thr Gln Leu Glu Leu Pro Glu Gly Cys Gln
260 265 270
Gly Leu Ala Pro Gly Thr Glu Val Thr Tyr Arg Leu Gln Leu His Met
275 280 285
Leu Ser Cys Pro Cys Lys Ala Lys Ala Thr Arg Thr Leu His Leu Gly
290 295 300
Lys Met Pro Tyr Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Asn Val Ala Val Ile Ser
305 310 315 320
Ser Asn Gln Phe Gly Pro Gly Leu Asn Gln Thr Trp His Ile Pro Ala
325 330 335
Asp Thr His Thr Glu Pro Val Ala Leu Asn Ile Ser Val Gly Thr Asn
340 345 350
Gly Thr Thr Met Tyr Trp Pro Ala Arg Ala Gln Ser Met Thr Tyr Cys
355 360 365
Ile Glu Trp Gln Pro Val Gly Gln Asp Gly Gly Leu Ala Thr Cys Ser
370 375 380
Leu Thr Ala Pro Gln Asp Pro Asp Pro Ala Gly Met Ala Thr Tyr Ser
385 390 395 400
Trp Ser Arg Glu Ser Gly Ala Met Gly Gln Glu Lys Cys Tyr Tyr Ile
405 410 415
Thr Ile Phe Ala Ser Ala His Pro Glu Lys Leu Thr Leu Trp Ser Thr
420 425 430
Val Leu Ser Thr Tyr His Phe Gly Gly Asn Ala Ser Ala Ala Gly Thr
435 440 445
Pro His His Val Ser Val Lys Asn His Ser Leu Asp Ser Val Ser Val
450 455 460
Asp Trp Ala Pro Ser Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Val Leu Lys Glu
465 470 475 480
Tyr Val Val Arg Cys Arg Asp Glu Asp Ser Lys Gln Val Ser Glu His
485 490 495
Pro Val Gln Pro Thr Glu Thr Gln Val Thr Leu Ser Gly Leu Arg Ala
500 505 510
Gly Val Ala Tyr Thr Val Gln Val Arg Ala Asp Thr Ala Trp Leu Arg
515 520 525
Gly Val Trp Ser Gln Pro Gln Arg Phe Ser Ile Glu Val Gln Val Ser
530 535 540
Asp Trp Leu Ile Phe Phe Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Ile Leu
545 550 555 560
Leu Val Gly Val Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Asn Arg Ala Ala Arg His
565 570 575
Leu Cys Pro Pro Leu Pro Thr Pro Cys Ala Ser Ser Ala Ile Glu Phe
580 585 590
Pro Gly Gly Lys Glu Thr Trp Gln Trp Ile Asn Pro Val Asp Phe Gln
595 600 605
Glu Glu Ala Ser Leu Gln Glu Ala Leu Val Val Glu Met Ser Trp Asp
610 615 620
Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys Thr Glu Leu Pro Glu Gly
625 630 635 640
Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu Ser Leu Glu Asp Gly Asp
645 650 655
Arg Cys Lys Ala Lys Met
660
<210> 68
<211> 353
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210> 69
<211> 383
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg His
1 5 10 15
Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
20 25 30
His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser Gln
35 40 45
Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Met
50 55 60
Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly Glu
65 70 75 80
Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile
85 90 95
Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr
100 105 110
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro
115 120 125
Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu
130 135 140
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
145 150 155 160
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val
165 170 175
Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val
180 185 190
Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys
195 200 205
Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn
210 215 220
Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val
260 265 270
Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
305 310 315 320
Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
325 330 335
Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
340 345 350
Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser
355 360 365
Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
370 375 380
<210> 70
<211> 222
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Ala Asp Pro Cys Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser
1 5 10 15
Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr
20 25 30
Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr
35 40 45
Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu
50 55 60
Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val
65 70 75 80
Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr
85 90 95
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser
100 105 110
Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp
115 120 125
Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe
130 135 140
Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser
165 170 175
Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu
180 185 190
Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro
195 200 205
Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 71
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 72
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 73
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 74
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 75
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 76
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu
165 170 175
Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215
<210> 77
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 78
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 79
<211> 325
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
85 90 95
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
100 105 110
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
115 120 125
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
130 135 140
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
145 150 155 160
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
165 170 175
Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu
180 185 190
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala
195 200 205
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
210 215 220
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
225 230 235 240
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
245 250 255
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
260 265 270
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
275 280 285
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
290 295 300
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
305 310 315 320
Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 80
<211> 246
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25 30
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
35 40 45
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
50 55 60
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
65 70 75 80
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
85 90 95
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
100 105 110
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
145 150 155 160
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
165 170 175
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
180 185 190
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
210 215 220
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
225 230 235 240
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 81
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 82
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 83
<211> 276
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glx Ser Asp Trp Leu Gly Glu Ser
1 5 10 15
Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn
20 25 30
Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe
35 40 45
Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys
50 55 60
Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asx Ser Val Thr Ile
65 70 75 80
Ser Trp Thr Arg Glu Glu Asn Gly Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile
85 90 95
Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser
100 105 110
Ile Cys Glu Asp Asx Asp Trp Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val
115 120 125
Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro
130 135 140
Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asx Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
145 150 155 160
Arg Glx Glx Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val
165 170 175
Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Glu Trp Met Gln Arg Gly
180 185 190
Glu Pro Leu Ser Pro Gln Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu
195 200 205
Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser
210 215 220
Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His
225 230 235 240
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
245 250 255
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
260 265 270
Gly Thr Cys Tyr
275
<210> 84
<211> 159
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
1 5 10 15
Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
20 25 30
Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
35 40 45
Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val
50 55 60
Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg
65 70 75 80
Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro
85 90 95
Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg
115 120 125
Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr
130 135 140
Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
145 150 155
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Phe Thr Val Arg Glu Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1 5 10 15
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
20 25 30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
35 40 45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
50 55 60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
85 90 95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
100 105 110
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 87
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 88
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
1 5 10 15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu
20 25 30
Arg
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Gln Glu Glu Gln Thr Ser Trp Leu Ile
1 5 10 15
Trp Ile Ser Asn Glu Leu Thr Leu Ile Arg Asn Glu Leu Ala Gln Ser
20 25 30
<210> 90
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ile Ser Asn Glu Leu Thr Leu Ile Arg Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 91
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ile Arg Asn Glu Leu Thr Leu Ile Arg Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 92
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Gln Ile Arg Asn Glu Leu Thr Leu Ile Arg Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 93
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Leu Ser Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Glu Leu Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
Gln Leu Arg Asn Glu Leu Thr Leu Leu Arg Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 94
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Ile Ser Ser Leu Glu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Thr Ser Gln Ile Gln
1 5 10 15
Gln Leu Arg Asn Glu Ile Thr Leu Leu Arg Asn Glu Ile Ala Gln
20 25 30
<210> 95
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Arg Glu Asn Thr Ala Leu Glu
1 5 10 15
Thr Arg Val Ala Glu Leu Arg Gln Arg Val Gln Arg Leu Arg Asn Arg
20 25 30
Val Ser Gln Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Pro Leu Gly Gly Gly Lys
35 40 45
<210> 96
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Leu Lys Ser Val Glu Asn Arg Leu Ala Val Val Glu Asn Gln Leu Lys
1 5 10 15
Thr Val Ile Glu Glu Leu Lys Thr Val Lys Asp Leu Leu Ser Asn
20 25 30
<210> 97
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Leu Ala Arg Ile Glu Glu Lys Leu Lys Thr Ile Lys Ala Gln Leu Ser
1 5 10 15
Glu Ile Ala Ser Thr Leu Asn Met Ile Arg Glu Gln Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 98
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Val Ser Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ser Gln Val Thr
1 5 10 15
Glu Leu Ala Ser Thr Val Ser Leu Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
<210> 99
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Ile Gln Ser Glu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ile Gln Ser Glu Ile Thr Leu Ile Arg Asn Glu Ile Ala Gln
20 25 30
<210> 100
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Leu Met Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Glu Leu Thr Gln Thr Leu Met
1 5 10 15
Gln Leu Gln Asn Glu Leu Ser Met Leu Lys Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile
1 5 10 15
Arg Leu
<210> 102
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10 15
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala
20 25
<210> 103
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Gly His Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Pro Lys Gly Ala Cys Thr Gly Gln Met Ala
20 25
<210> 104
<211> 64
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Val Thr Ala Phe Ser Asn Met Asp Asp Met Leu Gln Lys Ala His Leu
1 5 10 15
Val Ile Glu Gly Thr Phe Ile Tyr Leu Arg Asp Ser Thr Glu Phe Phe
20 25 30
Ile Arg Val Arg Asp Gly Trp Lys Lys Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile
35 40 45
Pro Ile Pro Ala Asp Ser Pro Pro Pro Pro Ala Leu Ser Ser Asn Pro
50 55 60
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 106
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 107
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Ser Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 109
<211> 413
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
Pro Ser Glu Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg Ile
115 120 125
Val Arg Phe Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu Val
130 135 140
Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg Val
145 150 155 160
Pro Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp Leu
165 170 175
Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr Arg
180 185 190
Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His Glu
195 200 205
Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu His
210 215 220
Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro Asn
225 230 235 240
Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr Ser
245 250 255
Thr Tyr Thr Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys Lys
260 265 270
Asn Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr
275 280 285
Arg Leu Glu Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp
290 295 300
Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu
325 330 335
Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu
340 345 350
Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr
355 360 365
Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu
370 375 380
Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu
385 390 395 400
Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410
<210> 110
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Ser
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 111
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 112
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Phe Ala Thr Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe
20 25 30
Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu
35 40 45
Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His
50 55 60
Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu
65 70 75 80
Glu Glu Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Asn Thr
85 90 95
Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln
100 105 110
Gly Leu Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr
115 120 125
Ser Lys Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Arg Thr
130 135 140
Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Arg Asn Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro
180 185 190
Thr Arg Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val
195 200 205
Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser
210 215 220
Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu
225 230 235 240
Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu
245 250 255
Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp
260 265 270
His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu
275 280 285
Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr
290 295 300
Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro
325 330 335
Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu
355 360 365
Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu
370 375 380
Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln
385 390 395 400
Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410
<210> 113
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 114
<211> 503
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr
20 25 30
Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys
35 40 45
Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys
50 55 60
Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg
65 70 75 80
Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr
85 90 95
Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro
100 105 110
Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala
115 120 125
Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met
130 135 140
Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn
145 150 155 160
Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr
165 170 175
Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln
195 200 205
Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp
210 215 220
Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg
225 230 235 240
Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His
245 250 255
Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr
260 265 270
Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys
290 295 300
Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile
305 310 315 320
Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser
325 330 335
Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu
340 345 350
Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala
355 360 365
Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu
370 375 380
Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp
385 390 395 400
Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser
405 410 415
Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val
420 425 430
Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln
435 440 445
Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu
450 455 460
Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala
465 470 475 480
Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser
485 490 495
Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met
500
<210> 115
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu
85 90
<210> 116
<211> 592
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn
35 40 45
Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
50 55 60
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
85 90 95
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
115 120 125
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
145 150 155 160
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
180 185 190
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
195 200 205
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
210 215 220
Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His
225 230 235 240
Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys
245 250 255
Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp
260 265 270
Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe
290 295 300
Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser
305 310 315 320
Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu
325 330 335
Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe
340 345 350
His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser
355 360 365
Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala
370 375 380
His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile
385 390 395 400
Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu
405 410 415
Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr
420 425 430
Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg
435 440 445
Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val
450 455 460
Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp
465 470 475 480
Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu
485 490 495
Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met
500 505 510
Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe
515 520 525
Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu
530 535 540
Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala
545 550 555 560
Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser
565 570 575
Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
580 585 590
<210> 117
<211> 154
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln Lys
1 5 10 15
Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu Arg
20 25 30
His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
35 40 45
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
50 55 60
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
65 70 75 80
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
85 90 95
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
100 105 110
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
115 120 125
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
130 135 140
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
145 150
<210> 118
<211> 567
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu
225 230 235 240
Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala
245 250 255
Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu
260 265 270
Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys
275 280 285
Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile
290 295 300
Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr
325 330 335
Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser
340 345 350
Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys
355 360 365
Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn
370 375 380
Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser
405 410 415
Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser
420 425 430
Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr
435 440 445
Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val
450 455 460
Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu
465 470 475 480
His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly
485 490 495
Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met
500 505 510
Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg
515 520 525
Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
565
<210> 119
<211> 143
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
<210> 120
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu
<210> 121
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
1 5 10 15
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
20 25 30
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
35 40 45
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
50 55 60
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
65 70 75 80
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
85 90 95
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
100 105 110
Glu Glu
<210> 122
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
20 25 30
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
35 40 45
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
85 90 95
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
100
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
20 25 30
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
35 40 45
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn
85 90 95
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
100 105 110
<210> 124
<211> 851
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Met Thr Ser His Tyr Val Ile Ala Ile Phe Ala Leu Met Ser Ser Cys
1 5 10 15
Leu Ala Thr Ala Gly Pro Glu Pro Gly Ala Leu Cys Glu Leu Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ser His Pro Val Gln Ala Leu Met Glu Ser Phe Thr Val
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Ala Ser Arg Gly Thr Thr Gly Leu Pro Gln Glu Val
50 55 60
His Val Leu Asn Leu Arg Thr Ala Gly Gln Gly Pro Gly Gln Leu Gln
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Leu His Leu Asn Pro Ile Ser Ser Val His Ile His
85 90 95
His Lys Ser Val Val Phe Leu Leu Asn Ser Pro His Pro Leu Val Trp
100 105 110
His Leu Lys Thr Glu Arg Leu Ala Thr Gly Val Ser Arg Leu Phe Leu
115 120 125
Val Ser Glu Gly Ser Val Val Gln Phe Ser Ser Ala Asn Phe Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Glu Thr Glu Glu Arg Asn Phe Pro His Gly Asn Glu His Leu
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ala Arg Lys Glu Tyr Gly Ala Val Thr Ser Phe Thr Glu
165 170 175
Leu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Tyr Ile Lys Val Gly Glu Asp Gln Val
180 185 190
Phe Pro Pro Lys Cys Asn Ile Gly Lys Asn Phe Leu Ser Leu Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Glu Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Ala Glu Gly Cys Val Met Ser
210 215 220
Ser Gln Pro Gln Asn Glu Glu Val His Ile Ile Glu Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asn Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp Ile
245 250 255
Arg Pro Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Val Lys Asn Leu Ile Leu Ile
260 265 270
Leu Lys Cys Lys Lys Ser Val Asn Trp Val Ile Lys Ser Phe Asp Val
275 280 285
Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ile Ala Pro Asn Ser Ile Gly Phe Gly Lys
290 295 300
Glu Ser Glu Arg Ser Met Thr Met Thr Lys Ser Ile Arg Asp Asp Ile
305 310 315 320
Pro Ser Thr Gln Gly Asn Leu Val Lys Trp Ala Leu Asp Asn Gly Tyr
325 330 335
Ser Pro Ile Thr Ser Tyr Thr Met Ala Pro Val Ala Asn Arg Phe His
340 345 350
Leu Arg Leu Glu Asn Asn Ala Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu Val His
355 360 365
Thr Ile Pro Pro Glu Leu Arg Ile Leu Leu Asp Pro Gly Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Leu Gln Asn Pro Pro Ile Arg Gly Gly Glu Gly Gln Asn Gly Gly
385 390 395 400
Leu Pro Phe Pro Phe Pro Asp Ile Ser Arg Arg Val Trp Asn Glu Glu
405 410 415
Gly Glu Asp Gly Leu Pro Arg Pro Lys Asp Pro Val Ile Pro Ser Ile
420 425 430
Gln Leu Phe Pro Gly Leu Arg Glu Pro Glu Glu Val Gln Gly Ser Val
435 440 445
Asp Ile Ala Leu Ser Val Lys Cys Asp Asn Glu Lys Met Ile Val Ala
450 455 460
Val Glu Lys Asp Ser Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Met Asp Val
465 470 475 480
Thr Leu Leu Asp Pro Thr Cys Lys Ala Lys Met Asn Gly Thr His Phe
485 490 495
Val Leu Glu Ser Pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Pro Arg Trp Ser
500 505 510
Ala Leu Asp Gly Val Val Tyr Tyr Asn Ser Ile Val Ile Gln Val Pro
515 520 525
Ala Leu Gly Asp Ser Ser Gly Trp Pro Asp Gly Tyr Glu Asp Leu Glu
530 535 540
Ser Gly Asp Asn Gly Phe Pro Gly Asp Met Asp Glu Gly Asp Ala Ser
545 550 555 560
Leu Phe Thr Arg Pro Glu Ile Val Val Phe Asn Cys Ser Leu Gln Gln
565 570 575
Val Arg Asn Pro Ser Ser Phe Gln Glu Gln Pro His Gly Asn Ile Thr
580 585 590
Phe Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Leu Val Pro Ser Gln
595 600 605
Gly Val Phe Ser Val Pro Glu Asn Gly His Val Tyr Val Glu Val Ser
610 615 620
Val Thr Lys Ala Glu Gln Glu Leu Gly Phe Ala Ile Gln Thr Cys Phe
625 630 635 640
Ile Ser Pro Tyr Ser Asn Pro Asp Arg Met Ser His Tyr Thr Ile Ile
645 650 655
Glu Asn Ile Cys Pro Lys Asp Glu Ser Val Lys Phe Tyr Ser Pro Lys
660 665 670
Arg Val His Phe Pro Ile Pro Gln Ala Asp Met Asp Lys Lys Arg Phe
675 680 685
Ser Phe Val Phe Lys Pro Val Phe Asn Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln
690 695 700
Cys Glu Leu Thr Leu Cys Thr Lys Met Glu Lys His Pro Gln Lys Leu
705 710 715 720
Pro Lys Cys Val Pro Pro Asp Glu Ala Cys Thr Ser Leu Asp Ala Ser
725 730 735
Ile Ile Trp Ala Met Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu
740 745 750
Ala Val Ile His His Glu Ala Glu Ser Lys Glu Lys Gly Pro Ser Met
755 760 765
Lys Glu Pro Asn Pro Ile Ser Pro Pro Ile Phe His Gly Leu Asp Thr
770 775 780
Leu Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala Ala Phe Val Ile Gly Ala Leu
785 790 795 800
Leu Thr Gly Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Gly Glu Thr Ala
805 810 815
Gly Arg Gln Gln Val Pro Thr Ser Pro Pro Ala Ser Glu Asn Ser Ser
820 825 830
Ala Ala His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Ser Ser
835 840 845
Ser Thr Ala
850
<210> 125
<211> 850
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Met Thr Ser His Tyr Val Ile Ala Ile Phe Ala Leu Met Ser Ser Cys
1 5 10 15
Leu Ala Thr Ala Gly Pro Glu Pro Gly Ala Leu Cys Glu Leu Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ser His Pro Val Gln Ala Leu Met Glu Ser Phe Thr Val
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Ala Ser Arg Gly Thr Thr Gly Leu Pro Gln Glu Val
50 55 60
His Val Leu Asn Leu Arg Thr Ala Gly Gln Gly Pro Gly Gln Leu Gln
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Leu His Leu Asn Pro Ile Ser Ser Val His Ile His
85 90 95
His Lys Ser Val Val Phe Leu Leu Asn Ser Pro His Pro Leu Val Trp
100 105 110
His Leu Lys Thr Glu Arg Leu Ala Thr Gly Val Ser Arg Leu Phe Leu
115 120 125
Val Ser Glu Gly Ser Val Val Gln Phe Ser Ser Ala Asn Phe Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Glu Thr Glu Glu Arg Asn Phe Pro His Gly Asn Glu His Leu
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ala Arg Lys Glu Tyr Gly Ala Val Thr Ser Phe Thr Glu
165 170 175
Leu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Tyr Ile Lys Val Gly Glu Asp Gln Val
180 185 190
Phe Pro Pro Lys Cys Asn Ile Gly Lys Asn Phe Leu Ser Leu Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Glu Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Ala Glu Gly Cys Val Met Ser
210 215 220
Ser Gln Pro Gln Asn Glu Glu Val His Ile Ile Glu Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asn Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp Ile
245 250 255
Arg Pro Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Val Lys Asn Leu Ile Leu Ile
260 265 270
Leu Lys Cys Lys Lys Ser Val Asn Trp Val Ile Lys Ser Phe Asp Val
275 280 285
Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ile Ala Pro Asn Ser Ile Gly Phe Gly Lys
290 295 300
Glu Ser Glu Arg Ser Met Thr Met Thr Lys Ser Ile Arg Asp Asp Ile
305 310 315 320
Pro Ser Thr Gln Gly Asn Leu Val Lys Trp Ala Leu Asp Asn Gly Tyr
325 330 335
Ser Pro Ile Thr Ser Tyr Thr Met Ala Pro Val Ala Asn Arg Phe His
340 345 350
Leu Arg Leu Glu Asn Asn Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu Val His Thr
355 360 365
Ile Pro Pro Glu Leu Arg Ile Leu Leu Asp Pro Gly Ala Leu Pro Ala
370 375 380
Leu Gln Asn Pro Pro Ile Arg Gly Gly Glu Gly Gln Asn Gly Gly Leu
385 390 395 400
Pro Phe Pro Phe Pro Asp Ile Ser Arg Arg Val Trp Asn Glu Glu Gly
405 410 415
Glu Asp Gly Leu Pro Arg Pro Lys Asp Pro Val Ile Pro Ser Ile Gln
420 425 430
Leu Phe Pro Gly Leu Arg Glu Pro Glu Glu Val Gln Gly Ser Val Asp
435 440 445
Ile Ala Leu Ser Val Lys Cys Asp Asn Glu Lys Met Ile Val Ala Val
450 455 460
Glu Lys Asp Ser Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Met Asp Val Thr
465 470 475 480
Leu Leu Asp Pro Thr Cys Lys Ala Lys Met Asn Gly Thr His Phe Val
485 490 495
Leu Glu Ser Pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Pro Arg Trp Ser Ala
500 505 510
Leu Asp Gly Val Val Tyr Tyr Asn Ser Ile Val Ile Gln Val Pro Ala
515 520 525
Leu Gly Asp Ser Ser Gly Trp Pro Asp Gly Tyr Glu Asp Leu Glu Ser
530 535 540
Gly Asp Asn Gly Phe Pro Gly Asp Met Asp Glu Gly Asp Ala Ser Leu
545 550 555 560
Phe Thr Arg Pro Glu Ile Val Val Phe Asn Cys Ser Leu Gln Gln Val
565 570 575
Arg Asn Pro Ser Ser Phe Gln Glu Gln Pro His Gly Asn Ile Thr Phe
580 585 590
Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Leu Val Pro Ser Gln Gly
595 600 605
Val Phe Ser Val Pro Glu Asn Gly His Val Tyr Val Glu Val Ser Val
610 615 620
Thr Lys Ala Glu Gln Glu Leu Gly Phe Ala Ile Gln Thr Cys Phe Ile
625 630 635 640
Ser Pro Tyr Ser Asn Pro Asp Arg Met Ser His Tyr Thr Ile Ile Glu
645 650 655
Asn Ile Cys Pro Lys Asp Glu Ser Val Lys Phe Tyr Ser Pro Lys Arg
660 665 670
Val His Phe Pro Ile Pro Gln Ala Asp Met Asp Lys Lys Arg Phe Ser
675 680 685
Phe Val Phe Lys Pro Val Phe Asn Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Cys
690 695 700
Glu Leu Thr Leu Cys Thr Lys Met Glu Lys His Pro Gln Lys Leu Pro
705 710 715 720
Lys Cys Val Pro Pro Asp Glu Ala Cys Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile
725 730 735
Ile Trp Ala Met Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu Ala
740 745 750
Val Ile His His Glu Ala Glu Ser Lys Glu Lys Gly Pro Ser Met Lys
755 760 765
Glu Pro Asn Pro Ile Ser Pro Pro Ile Phe His Gly Leu Asp Thr Leu
770 775 780
Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala Ala Phe Val Ile Gly Ala Leu Leu
785 790 795 800
Thr Gly Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Gly Glu Thr Ala Gly
805 810 815
Arg Gln Gln Val Pro Thr Ser Pro Pro Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala
820 825 830
Ala His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Ser Ser Ser
835 840 845
Thr Ala
850
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 126
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 127
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 127
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 128
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 128
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 129
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 130
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 131
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 132
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 133
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 134
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 134
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 135
Gly Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 136
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 137
Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 138
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Thr Gln His Ser Ser Tyr
50 55 60
Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg
85 90 95
Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys
100 105 110
Val Asn Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Leu His Glu His
115 120
<210> 139
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> X 是除 Tyr 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> X 是除 Gln 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 139
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 140
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X 是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (20)..(20)
<223> X 是除 Asp 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> X 是除 Tyr 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> X 是除 Gln 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 140
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 141
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> X 是除 His 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> X 是除 Phe 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> X 是除 Gln 以外的任何氨基酸,或 X 是 Ala。
<400> 141
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 143
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 144
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro
20 25 30
Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr
50 55 60
Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val
65 70 75 80
Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg
85 90 95
Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg
100 105 110
Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met
115 120 125
Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly
130 135 140
Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser
145 150 155 160
Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu
165 170 175
Tyr Lys Leu
<210> 145
<211> 335
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
165 170 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg
180 185 190
Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly
195 200 205
Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu
210 215 220
Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
245 250 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
260 265 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
275 280 285
Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
325 330 335
<210> 146
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe
370 375 380
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
385 390 395 400
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
405 410 415
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
420 425 430
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
450 455 460
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
465 470 475 480
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu
515 520 525
Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly
530 535 540
Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser
545 550 555 560
Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val
565 570 575
Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser
580 585 590
Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly
595 600 605
Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys
610 615 620
Lys Cys Ser
625
<210> 147
<211> 637
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
385 390 395 400
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
405 410 415
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
420 425 430
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
435 440 445
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
450 455 460
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
465 470 475 480
Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
485 490 495
Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp
515 520 525
Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro
530 535 540
Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu
545 550 555 560
Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu
565 570 575
Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr
580 585 590
Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu
595 600 605
Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu
610 615 620
Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
625 630 635
<210> 148
<211> 511
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
385 390 395 400
Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val
405 410 415
Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val
420 425 430
His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro
435 440 445
Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr
450 455 460
Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro Gln
465 470 475 480
Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys
485 490 495
Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
500 505 510
<210> 149
<211> 500
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
385 390 395 400
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
405 410 415
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
420 425 430
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
435 440 445
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
450 455 460
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
465 470 475 480
Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
485 490 495
Ser Asn Pro Asp
500
<210> 150
<211> 511
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
385 390 395 400
Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val
405 410 415
Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val
420 425 430
His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro
435 440 445
Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr
450 455 460
Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro Gln
465 470 475 480
Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys
485 490 495
Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
500 505 510
<210> 151
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn
245 250 255
Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys
260 265 270
Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile
275 280 285
Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe
290 295 300
Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys
325 330 335
Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
340 345 350
<210> 152
<211> 637
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
385 390 395 400
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
405 410 415
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
420 425 430
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
435 440 445
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
450 455 460
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
465 470 475 480
Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
485 490 495
Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp
515 520 525
Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro
530 535 540
Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu
545 550 555 560
Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu
565 570 575
Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr
580 585 590
Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro Gln Asp Leu
595 600 605
Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu
610 615 620
Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
625 630 635
<210> 153
<211> 226
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 155
<211> 374
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370
<210> 156
<211> 489
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asn Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn
245 250 255
Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys
260 265 270
Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile
275 280 285
Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe
290 295 300
Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys
325 330 335
Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys
370 375 380
Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp
385 390 395 400
Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr
405 410 415
Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp
420 425 430
Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu
435 440 445
Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr
450 455 460
Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn
465 470 475 480
Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
485
<210> 157
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe
370 375 380
Cys Asn Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
385 390 395 400
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
405 410 415
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
420 425 430
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
450 455 460
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
465 470 475 480
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu
515 520 525
Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly
530 535 540
Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser
545 550 555 560
Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val
565 570 575
Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser
580 585 590
Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly
595 600 605
Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys
610 615 620
Lys Cys Ser
625
<210> 158
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe
370 375 380
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
385 390 395 400
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
405 410 415
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
420 425 430
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
450 455 460
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
465 470 475 480
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu
515 520 525
Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly
530 535 540
Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser
545 550 555 560
Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val
565 570 575
Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser
580 585 590
Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly
595 600 605
Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys
610 615 620
Lys Cys Ser
625
<210> 159
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe
370 375 380
Cys Asn Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
385 390 395 400
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
405 410 415
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
420 425 430
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
450 455 460
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
465 470 475 480
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu
515 520 525
Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly
530 535 540
Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser
545 550 555 560
Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val
565 570 575
Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser
580 585 590
Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly
595 600 605
Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys
610 615 620
Lys Cys Ser
625
<210> 160
<211> 500
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asn Val Arg Phe Ser
385 390 395 400
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
405 410 415
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
420 425 430
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
435 440 445
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
450 455 460
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
465 470 475 480
Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
485 490 495
Ser Asn Pro Asp
500
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 161
Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe
1 5
<210> 162
<211> 8
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 162
Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn
1 5
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 163
Phe Asn Ala Glu Phe Asn Glu Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 164
Gln Glu Glu Arg Gly Gln Arg Arg
1 5
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 165
Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 166
Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys
1 5 10
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 167
Gly Asn Leu Glu Leu Val
1 5
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 168
Arg Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly
1 5 10
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 169
Glu Leu His Leu Leu Gly Phe Gly Ile Asn
1 5 10
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 170
His Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp
1 5 10
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 171
Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp
1 5 10
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 172
Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu
1 5 10
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 173
Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro
1 5 10
<210> 174
<211> 25
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 174
Asn Glu Gly Val Ile Val Lys Val Ser Lys Glu His Val Glu Glu Leu
1 5 10 15
Thr Lys His Ala Lys Ser Val Ser Lys
20 25
<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 175
His Ala Ser Ala Arg Gln Gln Trp Glu Leu
1 5 10
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 176
Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys
1 5 10
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 177
Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu Glu Arg
1 5 10
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 178
Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln
1 5 10
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 179
Lys Ile Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Glu
1 5 10
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 180
Tyr Glu Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln
1 5 10
<210> 181
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 181
Ser Gln Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Pro Tyr
1 5 10
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 182
Asp Arg Leu Gln Gly Arg Gln Gln Glu Gln
1 5 10
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 183
Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln
1 5 10
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 184
Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Glu Ser Gly
1 5 10
<210> 185
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 185
Ile Glu Thr Trp Asn Pro Asn Asn Gln Glu Phe Glu Cys Ala Gly
1 5 10 15
<210> 186
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 186
Gly Asn Ile Phe Ser Gly Phe Thr Pro Glu Phe Leu Ala Gln Ala
1 5 10 15
<210> 187
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 187
Val Thr Val Arg Gly Gly Leu Arg Ile Leu Ser Pro Asp Arg Lys
1 5 10 15
<210> 188
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生 (Arachis hypogaea)
<400> 188
Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Asp Glu Glu Asp Arg Arg Arg Gly
1 5 10 15
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 189
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 190
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 191
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白质构建体
<400> 191
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
385 390 395 400
Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val
405 410 415
Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val
420 425 430
His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro
435 440 445
Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr
450 455 460
Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro Gln
465 470 475 480
Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys
485 490 495
Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
500 505 510
<210> 192
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白质构建体
<400> 192
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn
245 250 255
Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys
260 265 270
Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile
275 280 285
Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe
290 295 300
Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys
325 330 335
Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
340 345 350
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种构建体,其包含以下各项作为第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的构建体统称为“掩蔽的TGF-β构建体”,其中所述掩蔽多肽序列与所述TGF-β多肽序列彼此结合。
2.如权利要求1所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中所述第一多肽以从N末端至C末端的顺序包含:
i)所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;
ii)第一MOD多肽序列、所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;或
iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列、所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;
其中所述掩蔽的TGF-β构建体任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
3.如权利要求2所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中所述支架多肽包含二聚化序列,任选地其中所述支架多肽包含种间二聚化序列。
4.如权利要求3所述的掩蔽的TGF-β构建体,其还包含第二多肽,所述第二多肽与所述第一多肽二聚化以形成掩蔽的TGF-β复合物异二聚体;
其中所述第二多肽包含:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列。
5.如权利要求4所述的掩蔽的TGF-β构建体,
其中所述第一多肽包含支架多肽,所述支架多肽包含种间二聚化序列,
其中所述第二多肽包含支架多肽序列,所述支架多肽序列包含所述第一多肽的所述种间结合序列的对应种间二聚化序列;并且
其中所述种间结合序列与所述对应种间结合序列在所述异二聚体中彼此相互作用。
6.一种TGF-β复合物,其包含第一多肽和第二多肽作为异二聚体,其中:
(i)所述第一多肽包含
a)包含种间二聚化序列的支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;并且
(ii)所述第二多肽包含
a)支架多肽序列,所述支架多肽序列包含所述第一多肽中的所述种间二聚化序列的对应种间二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的复合物统称为“掩蔽的TGF-β复合物”,
其中所述掩蔽多肽序列与所述TGF-β多肽序列彼此结合;
其中所述种间结合序列与所述对应种间结合序列在所述异二聚体中彼此相互作用(例如,共价或非共价结合);并且
其中所述掩蔽的TGF-β第一多肽和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
7.如权利要求6所述的掩蔽的TGF-β复合物异二聚体,其中:
所述第一多肽从N末端至C末端包含,
a)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含所述种间二聚化序列的所述支架多肽序列和所述掩蔽多肽序列;或
b)包含种间二聚化序列的所述支架多肽序列和所述掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列);并且
所述第二多肽从N末端至C末端包含一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含所述对应种间二聚化序列的所述支架多肽序列和所述TGF-β多肽序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述一个或多个支架多肽序列选自由Ig Fc多肽序列及其变体组成的组,任选地其中所述Ig Fc多肽序列包含突变,所述突变减少所述多肽与补体组分1q(C1q)和/或Fcλ受体(FcλR)的结合和/或实质上降低或消除所述Ig多肽例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力。
9.如权利要求1-7中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述一个或多个独立选择的MOD多肽序列选自由以下组成的组:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23MOD多肽序列及其任一个的变体。
10.如权利要求1至7中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述MOD多肽序列中的至少一个是具有以下条件的wt.IL-2MOD多肽序列或变体IL-2MOD多肽序列
(i)与SEQ ID NO:9的至少80、90、100、110、120、130或133个连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性;或
(ii)与SEQ ID NO:13-27中的一个的至少80、90、100、110、120、130或133个连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%aa序列同一性。
11.如权利要求1至7中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述掩蔽多肽序列是TGF-β受体(“TβR”)多肽序列,所述多肽序列包含I型(TβRI)、II型(TβRII)或III型(TβRIII)TβR的胞外结构域片段。
12.如权利要求7所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中所述复合物由多肽构建体4033(SEQ.ID.NO.:191)与多肽构建体4039(SEQ.ID.NO.:192)的组合形成。
13.一个或多个核酸,其编码如权利要求1-7中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物。
14.一种诱导哺乳动物受试者中的Treg细胞或治疗受试者的疾病或疾患的方法,其包括向所述受试者施用一种或多种如权利要求1-7中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物或编码如权利要求1-7中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物的核酸。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述方法用于治疗选自由以下组成的组的自身免疫疾患或疾病:艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫相关性不孕症、自身免疫血小板减少性紫癜、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩氏病、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力(MG)、天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、肖格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1D)、乳糜泻、血管炎和白斑病。
Claims (15)
1.一种构建体,其包含以下各项作为第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的构建体统称为“掩蔽的TGF-β构建体”,其中所述掩蔽多肽序列与所述TGF-β多肽序列彼此结合。
2.如权利要求1所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中所述第一多肽以从N末端至C末端的顺序包含:
i)所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;
ii)第一MOD多肽序列、所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;或
iii)第一独立选择的MOD多肽序列、第二独立选择的MOD多肽序列、所述支架多肽序列、所述掩蔽多肽序列和所述TGF-β多肽序列;
其中所述掩蔽的TGF-β构建体任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的掩蔽的TGF-β构建体,其中所述支架多肽包含二聚化序列,任选地其中所述支架多肽包含种间二聚化序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体,其还包含第二多肽,所述第二多肽与所述第一多肽二聚化以形成掩蔽的TGF-β复合物异二聚体;
其中所述第二多肽包含:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列;
以及
v)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列。
5.如权利要求4所述的掩蔽的TGF-β构建体,
其中所述第一多肽包含支架多肽,所述支架多肽包含种间二聚化序列,
其中所述第二多肽包含支架多肽序列,所述支架多肽序列包含所述第一多肽的所述种间结合序列的对应种间二聚化序列;并且
其中所述种间结合序列与所述对应种间结合序列在所述异二聚体中彼此相互作用。
6.一种TGF-β复合物,其包含第一多肽和第二多肽作为异二聚体,其中:
(i)所述第一多肽包含
a)包含种间二聚化序列的支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列,所述掩蔽多肽序列任选地包含TGF-β受体多肽序列或抗TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;并且
(ii)所述第二多肽包含
a)支架多肽序列,所述支架多肽序列包含所述第一多肽中的所述种间二聚化序列的对应种间二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)任选地,一个或多个独立选择的MOD多肽序列,以及
d)任选地,一个或多个独立选择的接头多肽序列;
包含这些元件的复合物统称为“掩蔽的TGF-β复合物”,
其中所述掩蔽多肽序列与所述TGF-β多肽序列彼此结合;
其中所述种间结合序列与所述对应种间结合序列在所述异二聚体中彼此相互作用(例如,共价或非共价结合);并且
其中所述掩蔽的TGF-β第一多肽和/或第二多肽任选地包含一个或多个独立选择的接头多肽序列。
7.如权利要求6所述的掩蔽的TGF-β复合物异二聚体,其中:
所述第一多肽从N末端至C末端包含,
a)一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含所述种间二聚化序列的所述支架多肽序列和所述掩蔽多肽序列;或
b)包含种间二聚化序列的支架多肽序列和所述掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受体多肽序列);并且
所述第二多肽从N末端至C末端包含一个或两个(或更多个)独立选择的MOD序列、包含所述对应种间二聚化序列的所述支架多肽序列和所述TGF-β多肽序列。
8.如权利要求1-12中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述一个或多个支架多肽序列选自由Ig Fc多肽序列及其变体组成的组,任选地其中所述Ig Fc多肽序列包含突变,所述突变减少所述多肽与补体组分1q(C1q)和/或Fcλ受体(FcλR)的结合和/或实质上降低或消除所述Ig多肽例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导细胞溶解的能力。
9.如权利要求1至13中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述一个或多个独立选择的MOD多肽序列选自由以下组成的组:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23MOD多肽序列及其任一个的变体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述MOD多肽序列中的至少一个是具有以下条件的wt.IL-2MOD多肽序列或变体IL-2MOD多肽序列
(i)与SEQ ID NO:9的至少80、90、100、110、120、130或133个连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性;或
(ii)与SEQ ID NO:13-27中的一个的至少80、90、100、110、120、130或133个连续aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%aa序列同一性或100%序列同一性。
11.如权利要求1至10中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物,其中所述掩蔽多肽序列是TGF-β受体(“TβR”)多肽序列,所述多肽序列包含I型(TβRI)、II型(TβRII)或III型(TβRIII)TβR的胞外结构域片段。
12.如权利要求7所述的掩蔽的TGF-β复合物,其中所述复合物由多肽构建体4033(SEQ.ID.NO.:191)与多肽构建体4039(SEQ.ID.NO.:192)的组合形成。
13.一种或多种核酸,其编码如权利要求1-12中任一项所述的掩蔽的TGF-β复合物。
14.一种诱导哺乳动物受试者中的Treg细胞或治疗受试者的疾病或疾患的方法,其包括向所述受试者施用一种或多种如权利要求1-12中任一项所述的掩蔽的TGF-β构建体或复合物或如权利要求13所述的核酸。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述方法用于治疗选自由以下组成的组的自身免疫疾患或疾病:艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫相关性不孕症、自身免疫血小板减少性紫癜、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩氏病、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力(MG)、天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、肖格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1D)、乳糜泻、血管炎和白斑病。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962925227P | 2019-10-23 | 2019-10-23 | |
US62/925,227 | 2019-10-23 | ||
PCT/US2020/056937 WO2021081258A1 (en) | 2019-10-23 | 2020-10-22 | TGF-β POLYPEPTIDES |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114728072A true CN114728072A (zh) | 2022-07-08 |
Family
ID=75620850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080074437.3A Pending CN114728072A (zh) | 2019-10-23 | 2020-10-22 | TGF-β多肽 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11692018B2 (zh) |
EP (1) | EP4034170A4 (zh) |
JP (1) | JP2023500066A (zh) |
KR (1) | KR20220087491A (zh) |
CN (1) | CN114728072A (zh) |
AU (1) | AU2020372413A1 (zh) |
BR (2) | BR112022007749A2 (zh) |
CA (1) | CA3155510A1 (zh) |
IL (1) | IL292253A (zh) |
MX (1) | MX2022004873A (zh) |
TW (1) | TW202130655A (zh) |
WO (1) | WO2021081258A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114728072A (zh) | 2019-10-23 | 2022-07-08 | 库尔生物制药有限公司 | TGF-β多肽 |
CA3190579A1 (en) * | 2020-08-27 | 2022-03-03 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Oncolytic viruses encoding recombinant tranforming growth factor (tgf)-beta monomers and uses thereof |
JP2024096518A (ja) * | 2023-01-03 | 2024-07-16 | エフビーデー バイオロジクス リミテッド | 操作されたtgfbriiバリアント及びその使用方法 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
JP3534749B2 (ja) | 1991-08-20 | 2004-06-07 | アメリカ合衆国 | アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送 |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
CA2145641C (en) | 1992-12-03 | 2008-05-27 | Richard J. Gregory | Pseudo-adenovirus vectors |
ES2249761T3 (es) | 1993-06-24 | 2006-04-01 | Advec Inc. | Vectores de adenovirus para terapia genica. |
DK0797676T3 (da) | 1993-10-25 | 2006-04-18 | Canji Inc | Rekombinant adenoviral vektor og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
US7078387B1 (en) | 1998-12-28 | 2006-07-18 | Arch Development Corp. | Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors |
US6287860B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of MEKK2 expression |
CA2454358A1 (en) | 2001-07-19 | 2003-07-31 | Perlan Therapeutics, Inc. | Multimeric proteins and methods of making and using same |
WO2005068499A1 (en) | 2004-01-06 | 2005-07-28 | The Government Of The United States As Representedby The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for the high efficiency expression of the transforming growth factor-beta supergene family |
PL3520815T3 (pl) | 2005-02-08 | 2022-04-11 | Genzyme Corporation | Przeciwciała przeciwko TGFBETA |
US20100120627A1 (en) | 2006-08-02 | 2010-05-13 | Abdelmajid Belouchi | Genemap of the human genes associated with psoriasis |
WO2010096838A2 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Cytomx Therapeutics, Llc | Proproteins and methods of use thereof |
US8952130B2 (en) | 2009-02-24 | 2015-02-10 | The Salk Institute For Biological Studies | Designer ligands of TGF-β superfamily |
EP3798237A1 (en) | 2010-03-05 | 2021-03-31 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins |
AU2014308751B2 (en) | 2013-08-22 | 2020-03-05 | Acceleron Pharma, Inc. | TGF-beta receptor type II variants and uses thereof |
JP6484634B2 (ja) | 2014-01-08 | 2019-03-13 | シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッドShanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | Il−15ヘテロ二量体タンパク質及びその用途 |
US10414814B2 (en) | 2014-07-03 | 2019-09-17 | City Of Hope | Tumor-selective CTLA-4 antagonists |
WO2017023749A1 (en) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Tarveda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunomodulation |
CA3014458A1 (en) | 2016-03-02 | 2017-09-08 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
CN118406157A (zh) | 2017-05-04 | 2024-07-30 | 阿塞勒隆制药公司 | TGF-β受体II型融合蛋白及其用途 |
US20200377571A1 (en) | 2017-12-08 | 2020-12-03 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules and uses thereof |
CA3112989A1 (en) | 2018-09-27 | 2020-04-02 | Xilio Development, Inc. | Masked cytokine polypeptides |
CN114728072A (zh) | 2019-10-23 | 2022-07-08 | 库尔生物制药有限公司 | TGF-β多肽 |
-
2020
- 2020-10-22 CN CN202080074437.3A patent/CN114728072A/zh active Pending
- 2020-10-22 CA CA3155510A patent/CA3155510A1/en active Pending
- 2020-10-22 JP JP2022523967A patent/JP2023500066A/ja active Pending
- 2020-10-22 AU AU2020372413A patent/AU2020372413A1/en active Pending
- 2020-10-22 MX MX2022004873A patent/MX2022004873A/es unknown
- 2020-10-22 TW TW109136757A patent/TW202130655A/zh unknown
- 2020-10-22 BR BR112022007749A patent/BR112022007749A2/pt unknown
- 2020-10-22 BR BR122023021925-2A patent/BR122023021925A2/pt unknown
- 2020-10-22 WO PCT/US2020/056937 patent/WO2021081258A1/en active Application Filing
- 2020-10-22 KR KR1020227016675A patent/KR20220087491A/ko unknown
- 2020-10-22 EP EP20878575.8A patent/EP4034170A4/en active Pending
-
2022
- 2022-04-13 IL IL292253A patent/IL292253A/en unknown
- 2022-04-16 US US17/722,328 patent/US11692018B2/en active Active
-
2023
- 2023-04-12 US US18/134,016 patent/US20230416322A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112022007749A2 (pt) | 2022-07-05 |
US20220372093A1 (en) | 2022-11-24 |
CA3155510A1 (en) | 2021-04-29 |
EP4034170A4 (en) | 2023-06-07 |
IL292253A (en) | 2022-06-01 |
US20230416322A1 (en) | 2023-12-28 |
BR122023021925A2 (pt) | 2024-02-27 |
WO2021081258A1 (en) | 2021-04-29 |
MX2022004873A (es) | 2022-05-13 |
AU2020372413A1 (en) | 2022-06-09 |
TW202130655A (zh) | 2021-08-16 |
EP4034170A1 (en) | 2022-08-03 |
JP2023500066A (ja) | 2023-01-04 |
US11692018B2 (en) | 2023-07-04 |
KR20220087491A (ko) | 2022-06-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11692018B2 (en) | TGF-β polypeptides | |
AU2022204946A1 (en) | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune disease | |
RU2769871C2 (ru) | Поливалентные модуляторы регуляторных t-клеток | |
AU2021257949A1 (en) | Molecules that selectively activate regulatory T cells for the treatment of autoimmune diseases | |
BR112021006783A2 (pt) | proteína de fusão fc heterodimérica de il-15/r¿ direcionada, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos de produção da proteína de fusão fc heterodimérica de il-15/r¿ direcionada e de tratamento de um câncer. | |
JP2017519491A (ja) | synTacポリペプチド及びその使用 | |
JP2022544771A (ja) | 優先的にil-2rアルファに結合するil-2融合タンパク質 | |
JP2023509969A (ja) | 新規なマスクされたサイトカインおよびその使用方法 | |
KR20210104673A (ko) | 다량체 t-세포 조절 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 | |
KR20230009872A (ko) | 다량체 t-세포 조절 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 | |
WO2022099157A1 (en) | Antigen presenting polypeptide complexes and methods of use thereof | |
CN116981470A (zh) | T细胞调节多肽和其使用方法 | |
KR20230042292A (ko) | 개선된 항원 결합 수용체 | |
US20230416321A1 (en) | TGF-Beta Polypeptides | |
US20240101627A1 (en) | Mhc class ii t-cell modulatory polypeptides for treating type 1 diabetes mellitus (t1d) and methods of use thereof | |
US7557084B2 (en) | IL-18 specific polypeptides and therapeutic uses thereof | |
US20240190933A1 (en) | Antigen Presenting Polypeptide Complexes Bearing TGF-Beta and Methods of Use Thereof | |
EP4047021A1 (en) | Ox40/pd-l1 bispecific antibody | |
RU2812283C2 (ru) | Сконструированные слитые белки ил-2-fc | |
KR20230009391A (ko) | 다량체 t-세포 조절 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 | |
CN118355024A (zh) | 包含il-21r突变蛋白的免疫细胞因子 | |
EA042111B1 (ru) | Способы модулирования иммунного ответа |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |