TW202130655A - TGF—β多肽 - Google Patents
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Abstract
本揭示案提供轉化生長因子β(TGF-β)多肽構築體及複合物,其適用於例如包括自體免疫疾病之疾病的治療性治療。亦描述編碼該等構築體及複合物之核酸以及在基於細胞之表現系統中製備該等構築體及複合物之方法。
Description
本揭示案係關於免疫學、免疫治療學及其用途之領域。
I.引言
A. TGF-β及其作用
轉化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)為屬於轉化生長因子超家族之細胞介素,該超家族包含三種哺乳動物(人類)同功型,亦即TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。TGF-β作為前驅分子來合成,該等前驅分子除了作為TGF-β之活性形式均二聚化之TGF-β序列以外亦含有前肽區域。TGF-β係由巨噬細胞及其他細胞類型以潛伏複合物形式分泌,在該複合物中其與兩種其他多肽潛伏TGF-β結合蛋白(latent TGF-β binding protein,LTBP)及潛伏相關肽(latency-associated peptide,LAP)組合。潛伏TGF-β複合物儲存於細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)中,例如,藉由CD36經由血小板反應蛋白-1結合至細胞表面(其中該複合物可由胞漿素激活)或結合至潛伏轉化生長因子β結合蛋白1、2、3及/或4(LTBP1-4)。
在潛伏TGF-β活化之後,觀察到TGF-β之生物功能,該活化響應於ECM擾動受到嚴格調控。TGF-β可藉由多種細胞或組織特異性途徑或在多個細胞或組織類型中觀察到之途徑來活化;然而,支援此類活化途徑之全部機制尚未完全清楚。活化劑包括但不限於蛋白酶、整聯蛋白、pH及活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)。事實上,細胞/組織結合之潛伏TGF-β複合物運作、感測並且對於環境擾動作出響應,從而以空間及/或時間方式釋放活性TGF-β。所釋
放之TGF-β用於促進或抑制細胞增殖,視其釋放之環境而定。其亦募集幹細胞/祖細胞來參與組織再生/重塑過程。TGF-β配位體表現、生體可用率、活化、受體功能或轉錄後修飾之異常干擾正常功能,並且可導致與許多疾病相關之病理後果,諸如經由募集過量祖細胞(例如,在骨關節炎或卡莫拉蒂-恩格爾曼病(Camurati-Engelmann disease)中),或藉由將駐留細胞轉分化成不利的譜系(例如,在癌症轉移或組織/器官纖維化期間,上皮向間質的轉變)。Xu等人Bone Research,6(論文編號2)(2018)。
1 非整聯蛋白依賴性及整聯蛋白依賴性之活化
a.非整聯蛋白依賴性之活化
非整聯蛋白依賴性之TGF-β活化手段係經由蛋白酶及/或金屬蛋白酶、活性含氧物(ROS)及血小板反應蛋白-1等起作用之手段。
胞漿素及若干基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase。MMP)藉由細胞外基質組分之蛋白水解來促進腫瘤侵入及組織重塑。TGF-β可藉由將潛伏複合物自基質中釋放的此類蛋白酶之作用而變得活化,繼之以LAP之蛋白水解以便將TGF-β釋放給其受體。已知基質金屬蛋白酶-9及-2可裂解潛伏TGF-β。
已顯示在輻射曝露以誘導ROS釋放之後,TGF-β可在活體內快速活化。認為ROS會改變LAP與TGF-β之間的相互作用,導致其活化。
已知一種在健康個體之血漿中發現之醣蛋白,亦即血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1),其響應於損傷而增加。咸信TSP-1藉由形成與潛伏TGF-β複合物之直接相互作用並且防止其結合至成熟的TGF-β而激活潛伏TGF-β。咸信血小板反應蛋白介導之活化涉及傷口(例如,皮膚傷口)癒合。
b.藉由含有α(V)之整聯蛋白之活化
已認識到整聯蛋白且尤其是含有β6、αV及β8之整聯蛋白可促成潛伏TGF-β(例如,TGF-β1)活化。活化似乎藉由誘導潛伏TGF-β1複合物之構形變
化並由此釋放活性TGF-β1或藉由整聯蛋白-蛋白酶依賴性機制而發生。已理解在無蛋白水解之情況下,導致TGF-β1活化之構形變化(尤其在上皮細胞中)經由整聯蛋白結合存在於LAP-β1或LAP-β3中之精胺醯基-甘胺醯基-天冬胺酸細胞黏附模體(RGD模體)而發生。含有RGD模體之LAP由大部分含有αV之整聯蛋白所識別。例如,αVβ6整聯蛋白可藉由結合至存在於LAP-β1及LAP-β3中之RGD模體而激活/釋放TGF-β1。另外,整聯蛋白-蛋白酶依賴性TGF-β活化可藉由在潛伏TGF-β複合物與MMP諸如MMP-2及MMP-9之間創建關聯而發生,該關聯可藉由潛伏TGF-β複合物之蛋白水解降解來激活TGF-β。
2 TGF-β訊息傳導及作用
經活化之TGF-β在細胞分化以及T-細胞調控中發揮關鍵作用。參見例如Cold Spring HarborPerspect.Biol.2017;9:a022236及其中之引用。TGF-β藉由支援胸腺衍生之Treg(thymus-derived Treg,tTreg)、不變的自然殺手細胞T(invariant natural killer T,iNKT)及CD8α+ T-細胞前驅物的存活,並且相應地促進可由強促效劑配位體誘導之T-細胞的發育來促進若干T-細胞譜系之胸腺發育。TGF-β藉由促進介白素(interleukin,IL)-7Rα之胸腺細胞表現來支援習知CD8+T細胞。TGF-β亦藉由促進低親和力T細胞之IL-7依賴性存活、藉由控制胸腺細胞IL-7Rα表現及藉由抑制T-細胞受體(T-cell receptor,TCR)驅動之自體反應性或高親和力T細胞之活化來調控周圍T-細胞穩態。在早期CD8+ T-細胞分化中,TGF-β抑制細胞毒性T淋巴球(cytotoxic T lymphocyte,CTL)形成並且促進短壽命的效應細胞(short-lived effector cell,SLEC)之細胞凋亡,同時促進表現CD103之組織駐留記憶(tissue resident memory,TRM)細胞之分化。雖然TGF-β抑制T輔助1及2(T helper 1,Th1及T helper 2,Th2)細胞分化,但TGF-β與其他因子一起促進各種T-細胞之發育。TGF-β與IL-2聯合促進周圍Treg(peripheral Treg,pTreg)之產生,與IL-6聯合促進Th-17細胞之產生,與IL-4聯合促進Th9
細胞之產生,並且與IL-21及/或23聯合促進T濾泡性輔助(T follicular helper,Tfh)細胞之產生。
除了對T細胞之作用外,TGF-β亦調控多種其他細胞,包括B淋巴球或「B細胞」、單核球及巨噬細胞。TGF-β通常對B細胞有抑制作用(Li等人Annual Review of Immunology.24(1):99-146(2006)及Roes等人,PNAS USA,100(12):7241-7246(2003));抑制B細胞增殖並且誘導未成熟或靜息B細胞之細胞凋亡(Arsura,等人,Immunity5(1):31-40.(1996))。TGF-β對B細胞之至少一部分作用可歸因於誘導IKBa,其為一種調控包括IL-1、TNF-a及防禦素之細胞介素之產生的NF-κB之抑制劑。參見例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236及其中之引用。
除了對B細胞之作用外,TGF-β亦刺激靜息單核球並且抑制經活化之巨噬細胞。TGF-β展示已由Toll樣受體(「Toll-Like-Receptor,TLR」)配位體刺激的巨噬細胞之抑制效應,諸如促炎性反應。在不存在TLR配位體或其他細胞介素的情況下,TGF-β刺激促進骨髓細胞產生若干發炎性細胞介素。已顯示TGF-β將周圍血液單核球及巨噬細胞誘導至組織中並且增強單核球黏附性質。TGF-β可誘導趨化性並且增強肥大細胞之黏附性質。參見例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236及其中之引用。
一旦TGF-β經活化,應瞭解其可經由細胞表面訊息傳導受體起作用。當活性TGF-β配位體結合至細胞表面上之轉化生長因子β受體II(「transforming growth factor beta receptor II,TβRII」)時,訊息傳導開始。此相互作用可造成轉化生長因子β受體I(「transforming growth factor beta receptor I,TβRI」)之募集。TβRII能夠單獨結合TGF-β1,而TβRI僅可與TβRII協作來結合配位體。TβRI經磷酸化且由TβRII激活,由此藉由經R-Smad蛋白(Smad2及Smad3)之募集及磷酸化的典型訊息傳導途徑進行訊息傳導。彼等Smad隨後
結合至co-Smad(Smad4),並且複合物共同驅動若干基因之轉錄。參見Smith等人,Clin.Cancer Res.;18(17):4514-21(2012)。TGF-β亦可經由由配位體佔據之受體激活的非典型(非Smad)途徑來發出訊息,該等途徑包括MAP激酶途徑之各種分支、Rho樣GTP酶訊息傳導途徑及磷脂酸肌醇-3-激酶/AKT途徑。經由非典型路徑之訊息傳導可增強、減弱或以其他方式調節下游細胞反應。Zhang Ye,Cell Res.19(1):128-39(2009)。與TβRI及TβRII相比,轉化生長因子β受體III(「transforming growth factor beta receptor III,TβRIII」受體或「β聚醣」)不參與TGF-β訊息轉導,而是充當TGF-β之儲器。
活化因子之擾動、經活化之TGF-β之異常水準及/或TGF-β訊息傳導之變化可產生不受調控之TGF-β訊息傳導水準,從而可導致若干疾病或複雜疾病狀況。事實上,TGF-β已展示對諸如炎症、自體免疫病症、纖維化、癌症及白內障之不同病狀的作用。
TGF-β在作為涉及誘導耐受性之因子來保持免疫系統穩態並由此影響自體免疫反應方面發揮關鍵作用。TGF-β可藉以引起此類效應之一種機制為驅動T-細胞(例如,CD4+、CD8+、CD4-CD8+及CD4-CD8-細胞)分化成T調節細胞或「T-Reg」細胞(例如,在IL-2存在下)。參見例如Bettini及Vagnali,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1183:1-12(2010)。T-Reg細胞為維持免疫耐受性所必不可少的。Josefowicz等人Annu Rev Immunol,30:531-564.(2012)。TGF-β在誘導對於抗原包括自體抗原之耐受性方面之作用使得其成為防止患上諸如關節炎(類風濕性關節炎或「rheumatoid arthritis,RA」)、1型糖尿病(「Type 1 diabetes mellitus,T1D」)、多發性硬化(「multiple sclerosis,MS」)及全身性紅斑狼瘡(「systemic lupus erythematosus,SLE」)之疾病的關鍵因子。例如,TGF-β之關鍵功能為調控自體免疫疾病及相關發炎性過程。在腸道中尤其如此,咸信TGF-β在諸如發炎性腸病或「inflammatory bowel disease,IBD」之病狀中抑制巨噬細胞細胞介素產生
及黏膜發炎。Sanjab等人Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236。如同IBD一樣,RA為具有針對關節之炎性組分的自體免疫病症。RA係由T及/或B細胞之異常反應造成。全身性TGF-β似乎可以預防RA之發展。參見Schramm等人,Arthritis Res.Ther.6:R114-R119(2004)及Sanjab等人Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236)及其中引用之參考文獻。
已在文獻中描述藉由螯合TGF-β以便有效地中和其作用來在蛋白質水準上調控TGF-β作用之許多方法。例如,已開發在活體內結合、螯合及中和TGF-β之單株抗體,諸如針對TGF-β1之美替木單抗(Metelimumab;CAT192),及針對TGF-β之多種同功型的弗雷西單抗(Fresolimumab)。另外,亦開發受體捕集物,該等捕集物緊密結合並螯合TGF-β,由此將其螯合並中和(參見,例如,Swaagrtra等人,Mol Cancer Ther;11(7):1477-87(2012)及美國專利公開案第2018/0327477號)。
不同於經設計來結合並螯合TGF-β並且充當TGF-β作用之拮抗劑的如上所述之分子,本文所述的經掩蔽之TGF-β複合物提供活性TGF-β多肽(例如,TGF-β訊息傳導途徑促效劑)及掩蔽多肽(例如,TGF-β受體片段),其彼此相互作用以便可逆地掩蔽TGF-β多肽序列。經掩蔽之TGF-β複合物可包括TGF-β及/或掩蔽多肽之序列變異,該等變化可減小其彼此之親和力並且促成TGF-β之去掩蔽,允許其經由異質細胞表面受體之結合訊息傳導(例如,結合至TβRII,繼之以結合至TβRI以形成異質受體)。一旦形成,對TGF-β具有高親和力之異質TβRI-TβRII多肽複合物便可有效地與掩蔽多肽競爭。TGF-β及/或其掩蔽多肽之序列變異亦可允許避免經去掩蔽之TGF-β多肽與其他分子之間的不當相互作用。此類序列變異包括減弱與TβRI之結合的TβRII之N端部分之缺失及/或防止其二聚化之TGF-β序列變異(例如,C77S取代),該等變化限制與非訊息傳導TβRIII分子之儲器的脫靶結合。除了前述以外,經掩蔽之TGF-β構築體及複合
物亦可包含額外的野生型(wild type,wt.)及/或變異體免疫調節多肽序列(immunomodulatory polypeptide sequence,MOD),其可實質上影響TGF-β結合至靶細胞之結果,包括活體外效應及活體內效應,諸如治療結果。
本揭示案描述其中TGF-β由另一種多肽掩蔽之構築體(「經掩蔽之TGF-β構築物」,參見,例如,具有單一多肽鏈之圖1結構A),及其中TGF-β由另一種多肽掩蔽之複合物(「TGF-β多肽複合物」,參見,例如,示出包含兩條多肽鏈之複合物的圖1結構B-F)的製備,亦可包含額外元件之該等構築體及複合物在本文中共同地稱為「經掩蔽之TGF-β構築體及複合物」。經掩蔽之TGF-β構築體及複合物係圍繞支架多肽(例如,免疫球蛋白Fc區)建構並且含有結合至TGF-β之掩蔽多肽序列(「掩蔽多肽序列」、「掩蔽多肽」或「掩蔽序列」)。經掩蔽之TGF-β構築體及複合物亦可含有一或多個獨立選定之免疫調節多肽序列,諸如野生型或變異體IL-2多肽序列。
經掩蔽之TGF-β構築體及複合物可在許多哺乳動物細胞類型中表現,因為經掩蔽之非靶向TGF-β活性不會像在經去掩蔽之TGF-β下所觀察到的情況一樣不利地影響細胞。
經掩蔽之TGF-β構築體可包含以下作為第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列,該掩蔽多肽序列視情況包含TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列;
iv)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列;以及
v)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;
包含此等元件之構築體在本文中共同地稱為「經掩蔽之TGF-β構築體」,其中掩蔽多肽序列與TGF-β多肽序列彼此結合。該經掩蔽之TGF-β構築體可按例如如下順序(自N端至C端)來組織:
i)支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列;或
ii)第一MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列;或
iii)第一獨立選定之MOD多肽序列、第二獨立選定之MOD多肽序列、視情況選用之一或多個額外的MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列;其中經掩蔽之TGF-β構築體視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。
上述經掩蔽之TGF-β構築體之支架多肽可包含導致形成同二聚體之種間或非種間二聚化序列,其中支架多肽序列視情況具有一或多個彼此之共價連接。
上述經掩蔽之TGF-β構築體之支架多肽亦可包含種間二聚化序列,並且進一步包含第二多肽,其經由對應種間二聚化序列與第一多肽(如上所述)二聚化以形成經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體。第二多肽可包含以下結構中之一者:(i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;(ii)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;(iii)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列及獨立選定之MOD序列;或(iv)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列,其中第一及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。因此,第二多肽可自N端至C端包含以下結構中之一者:(i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;(ii)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;(iii)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列及一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列;或(iv)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD
序列及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;其中第一及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。或者,經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體可以自N端至C端之順序包含:(i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列;(ii)第一MOD多肽序列、包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列;或(iii)第一獨立選定之MOD多肽序列、第二獨立選定之MOD多肽序列、包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列及TGF-β多肽序列。
經掩蔽之TGF-β複合物亦可包含第一多肽及第二多肽作為經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體,其中:
(i)第一多肽包含
a)包含種間二聚化序列之支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列,該掩蔽多肽序列視情況包含TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列,
c)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列,以及
d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;
(ii)第二多肽包含
a)支架多肽序列,該支架多肽序列包含第一多肽中之種間二聚化序列的對應種間二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列,以及
d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;包含此等元件之複合物共同地稱為「經掩蔽之TGF-β複合物」,其中掩蔽多肽序列與TGF-β多肽序列在不同多肽鏈上提供並且彼此結合;其中種間結合序列與對應種間結合序列在異二聚體中彼此相互作用;並且
其中經掩蔽之TGF-β第一多肽及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。
TGF-β多肽序列可來源於TGF-β同功型中之任一者,並且可包含限制TGF-β序列二聚化之能力的取代。掩蔽序列可為例如抗TGF-β抗體序列或TGF-β受體(TβR)胞外域序列。當TβR胞外域用於掩蔽TGF-β序列時,其可經修飾以避免經掩蔽之分子之無意的訊息傳導(例如,藉由缺失不為與TGF-β序列相互作用所必需的胞外域之全部或一部分)。
本揭示案亦描述並提供產生經掩蔽之TGF-β構築體及複合物的方法,以及其用於影響各種細胞類型及治療多種疾病/病症(包括自體免疫及發炎性疾病)之方法。本文所述之治療方法可包括將經掩蔽之TGF-β構築體及複合物與可有利於達成所需實驗室或治療結果之其他分子共同投與,該等其他分子包括但不限於:免疫調節劑(例如,介白素、細胞介素、趨化因子及其類似物);抗體及抗體片段(例如,scFv、奈米抗體等);小分子治療劑(例如,維生素D或視黃酸);及其組合。
圖1描繪經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之一些型式,其中TGF-β受體序列用於掩蔽TGF-β多肽。結構A描繪具有用於一或多個獨立選定之MOD(例如,一組串聯獨立選定之MOD)之單一位置的單體構築體。結構B描繪其中多肽經由其相應Ig Fc序列相互作用之對稱同二聚體,該等序列可自發形成連接兩個多肽之二硫鍵。結構C-F描述其中TGF-β與TGF-β受體序列呈異二聚體之「順式」(相同多肽)或「反式」(不同多肽)的異二聚體結構。其中可安置一或多個獨立選定之MOD的位置係由用對角線或垂直線或方格圖案填充之圓圈顯示。種間結合對係由杵臼(knob-in-hole)序列表示,但可為如下論述之其他序列中之任一者。構築
體可能不包括MOD,或可包括一個、兩個或兩個以上獨立選定之MOD序列,包括呈串聯形式之MOD序列,該等MOD可在所示位置提供。示範性MOD包括例如野生型或突變體(例如,對一種或多種特定受體具有降低之親和力及/或選擇性親和力)PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及IL-23 MOD序列。在其中TGF-β受體序列用於掩蔽TGF-β多肽之各情形下,受體多肽可用另一種掩蔽多肽諸如對TGF-β多肽具有親和力之抗體多肽(例如,scFV或奈米抗體)來置換。支架序列可經連接(例如,藉由二硫鍵)以形成共價連接之同二聚體或共價連接之異二聚體。圖中示出之構築體中之任一者可在TGF-β多肽中具有限制其二聚化能力的序列變異(例如,C77S取代)。
圖2A-2H提供免疫球蛋白Fc多肽之胺基酸序列(aas)(SEQ ID NO:68-83)。
圖2I提供其中訊息肽aas 1-22加下劃線之人類J-鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO:84)。
圖2J提供Ig G1重鏈恆定區CH1域之序列。位置70及72處之絲胺酸殘基可分別經麩胺酸及纈胺酸取代(S70E及S72V)以形成MD13樣構築體。
圖2K提供來自Ig κ及Ig λ鏈之輕鏈恆定區「CL」域之序列。位置68處之絲胺酸及位置70處之蘇胺酸可分別經白胺酸及絲胺酸取代(S68L及T70S)以形成MD13樣構築體。
圖3提供TGF-β作為前原蛋白之三種不同同功型及TGF-β3之成熟形式以及成熟蛋白之C77S突變體的序列。
圖4提供TGF-β同功型1-3之比對,其中對應於TGF-β2之成熟形式的殘基呈粗體,而TGF-β2之aa殘基Lys 25、Cys 77、Ile 92及/或Lys 94及其在TGF-β同功型1及3之其他形式中的相應殘基則帶下劃線但不加粗體。
圖5A提供1型TGF-β受體(TβRI)及其胞外域之序列。
圖5B提供2型TGF-β受體(TβRII)、其胞外域及胞外域片段之序列。同功型B
中以粗體及下劃線指示之位置為成熟多肽之aas F30、D32、S52、E55及D118,其任一者可經除了天然存在之aa以外的aa取代。
圖5C提供3型TGF-β受體(TβRIII)之序列。
圖6示出展示基於螢光細胞計數分析,不同濃度之各種經掩蔽之TGF-β構築體及複合物刺激幼稚CD4 T細胞上之FoxP3表現的能力之繪圖。部分A示出在細胞培養5天之後在不存在及存在50U/ml所添加之IL-2的情況下,基於指示濃度之TGF-β3或經掩蔽之TGF-β3WT構築體(參見圖1,結構A)之FoxP3(作為CD4+細胞之百分比)之誘導。部分B示出用各種濃度之TGF-β3或三種經掩蔽之TGF-β3構築體中之一者或帶有至少一個N端wt.或變異體IL-2 MOD的經掩蔽之TGF-β3複合物(關於結構,參見圖7G至7I)處理5天之幼稚T細胞群體中的FoxP3+細胞(作為CD4細胞之百分比)之分佈。部分C示出在存在0.1nM或1000nM濃度的經掩蔽之TGF-β3多肽(在圖6中之部分B中,結構(i))的情況下,FoxP3+CD4+細胞之誘導。
圖7A提供代表性經掩蔽之TGF-β(構築體第3470號)之aa序列SEQ ID NO:146,其具有圖1結構A之總體結構。多肽自N端至C端包含:wt.人類IL-2(human IL-2,hIL2)、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類單IgG Fc、G4S連接子之三個重複序列、具有D118A取代之人類TβRII(human TβRII,hTβRII)△25序列、G4S連接子之五個重複序列以及具有C77S取代之人類TGF-β3(human TGF-β3,hTGF-β3)序列。
圖7B提供代表性經掩蔽之TGF-β(構築體第3334號)之aa序列SEQ ID NO:147,其具有圖1結構B之總體結構。形成同二聚體之多肽自N端至C端包含:具有H16T及F42A取代之hIL2、G4S之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc、G5S及G4S連接子之兩個重複序列、hTβRII△25、D118A、G4S之五個重複序列以及hTGF-β3序列。
圖7C提供具有包含第一及第二多肽的圖1結構D之總體結構的代表性經掩蔽之TGF-β構築體之aa序列。第一多肽構築體第3618號(SEQ ID NO:148)自N端至C端包含:wt hIL-2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc杵臼(knob-in-hole,KiH)多肽鏈A、G4S連接子序列之五個重複序列以及具有C77S取代之hTGF-β3序列。第二多肽(構築體第3619號)SEQ ID NO:149自N端至C端包含:wt.hIL2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈B、G5S連接子及G4S連接子之兩個重複序列以及hTβRII△25、D118A序列。
圖7D提供具有包含第一及第二多肽的圖1結構E之總體結構的代表性經掩蔽之TGF-β構築體之aa序列。如上所述之第一多肽(構築體第3618號)SEQ ID NO:150自N端至C端包含:wt hIL-2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc杵臼(KiH)多肽鏈A、G4S連接子序列之五個重複序列以及具有C77S取代之hTGF-β3序列。第二多肽(構築體第3855號)SEQ ID NO:151自N端至C端包含:具有LALA、T366S、L368A及Y407V取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈B,G4S連接子之三個重複序列以及hTβRII△25,D118A序列。
圖7E提供具有包含第一及第二多肽的圖1結構F之總體結構的代表性經掩蔽之TGF-β構築體之aa序列。第一多肽(構築體第3891號)SEQ ID NO:152自N端至C端包含:具有H16A、F42A之hIL-2,G4S連接子序列之三個重複序列,具有LALA及T366W取代之人類IgG1 Fc杵臼(KiH)多肽鏈A,G5S及G4S連接子之兩個重複序列,hTβRII△25,D118A,G4S連接子之五個重複序列以及具有C77S取代之hTGF-β3。第二多肽(構築體第3664號)SEQ ID NO:153自N端至C端包含:具有LALA取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈B。
圖7F提供具有包含第一及第二多肽的圖1結構F之總體結構的代表性經掩蔽之TGF-β構築體之aa序列。第一多肽(構築體第3715號)SEQ ID NO:155自N端至
C端包含:具有LALA取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈A、G4S連接子之三個重複序列以及人類wt IL2序列。第二多肽(構築體第3714號)SEQ ID NO:156自N端至C端包含:具有LALA取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈B、G4S連接子之三個重複序列、具有D32N及D118A取代之hTβRII△25、G4S連接子序列之五個重複序列以及具有C77S取代之hTGF-β3序列。
圖7A至7F中IL-2序列中之任一者可經除了IL-2以外的MOD或變異體MOD取代,由wt IL-2來置換,或由在N88、H16及/或F42處具有取代(例如,N88R、選自H16A或H16T的在H16處之取代及/或選自F42A及F42T的在F42處之取代)之IL-2序列來置換。
圖7G提供代表性經掩蔽之TGF-β構築體(構築體第3472號)之aa序列SEQ ID NO:157,其具有圖1結構A之總體結構。多肽自N端至C端包含:wt.hIL-2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類單IgG Fc、G4S連接子之三個重複序列、具有D32N及D118A取代之人類TβRII(hTβRII)△25序列、G4S連接子之五個重複序列以及具有C77S取代之人類TGF-β3(hTGF-β3)序列。
圖7H提供代表性經掩蔽之TGF-β構築體(構築體第3466號)之aa序列SEQ ID NO:158,其具有圖1結構A之總體結構。多肽自N端至C端包含:wt.hIL2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類單IgG Fc、G4S連接子之三個重複序列、具有D118A取代之人類TβRII(hTβRII)△25序列、G4S連接子之五個重複序列以及具有C77S取代之人類TGF-β3(hTGF-β3)序列。
圖7I提供代表性經掩蔽之TGF-β構築體(構築體第3468號)之aa序列SEQ ID NO:159,其具有圖1結構A之總體結構。多肽自N端至C端包含:具有H16T F42A取代之hIL-2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類單IgG Fc、G4S連接子之三個重複序列、具有D32N及D118A取代之人類TβRII(hTβRII)△25序列、G4S連接子之五個重複序列以及具有C77S取代之人類TGF-β3(hTGF-β3)
序列。
圖7J提供具有包含第一及第二多肽的圖1結構D之總體結構的代表性經掩蔽之TGF-β構築體之aa序列。第一多肽(構築體第3618號)SEQ ID NO:148自N端至C端包含:wt hIL-2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc杵臼(KiH)多肽鏈A、G4S連接子序列之五個重複序列以及具有C77S取代之hTGF-β3序列。第二多肽(構築體第3621號)SEQ ID NO:160自N端至C端包含:wt.hIL2、G4S連接子之三個重複序列、具有LALA取代之人類IgG1 Fc KiH多肽鏈B、G4S連接子之三個重複序列以及具有D32N及D118A取代之hTβRII△25序列。
圖8示出一個經掩蔽之TGF-β構築體(左側)及兩個經掩蔽之TGF-β複合物(中心及右側)。複合物之樣品藉由構築編碼多肽之核酸載體,轉染ExpiCHO細胞及表現多肽來製備。多肽藉由蛋白A層析繼之以尺寸排阻層析來純化。經純化之蛋白經受SDS-PAGE並且所得凝膠用考馬斯藍染色。NR=未還原或非還原樣品,並且R=還原樣品(用二硫化物還原劑還原)。
圖9示出成熟TβRII多肽序列中之各種aa取代(參見圖5B)對於其針對TβRII及TGF-β3或TGF-β1(表,左上部)之親和力的效應。圖9亦示出彼等取代中之三個E55A、D32N及S52L對於TβRII經掩蔽之TGF-β構築體與經固定之TβRII-Fc受體構築體之間的結合相互作用之效應。受體構築體以TGF-β3在圖之右上部的捕獲檢定型式示出,其中:單Fc為不與其他支架形成種間鍵之Ig支架,並且抗IL-2為用生物素(B)標記的針對IL-2之抗體。Strep及HRP為用於偵測之鏈黴親和素及辣根過氧化物酶。在捕獲中對結合之效應係偵測為對於四種經掩蔽之構築體中之各者開發的結合曲線(底部)。參見實例3。
圖10示出形成經掩蔽之TGF-β3複合物PSM-4033-4039的多肽之結構及胺基酸序列。
圖11示出其中PSM-4033-4039用於誘導來自人類周圍幼稚CD4+T細胞的Foxp3+ iTreg的實驗之結果。參見實例4。
圖12示出由PSM-4033-4039誘導之Foxp3+ iTreg用於抑制T細胞增殖的實驗之結果。參見實例4。
圖13示出其中PSM-4033-4039用於誘導來自人類周圍CD4+T細胞(包括幼稚及記憶CD4+T細胞)之Foxp3+ iTreg之表現的實驗之結果。參見實例4。
圖14A及B示出其中PSM-4033-4039用於誘導來自藉由同種異體淋巴球反應激活之CD4+ T細胞之Foxp3+ iTreg的實驗之結果。參見實例4。
圖15示出將PSM-4033-4039以各種濃度靜脈內投與小鼠以便測定在直至注射後72小時之各個時間間隔下的小鼠中之血清濃度的實驗之結果。參見實例4。
IV.詳細說明
A.定義
如本文所用,胺基酸(在為單數時縮寫為「aa」,除非上下文規定,否則其可為複數,並且在複數形式中,縮寫為「aas」)意謂在哺乳動物細胞轉譯中併入多肽及蛋白質中的天然存在之蛋白原性α胺基酸。除非另外陳述:L(Leu,白胺酸)、A(Ala,丙胺酸)、G(Gly,甘胺酸)、S(Ser,絲胺酸)、V(Val,纈胺酸)、F(Phe,苯丙胺酸)、Y(Tyr,酪胺酸)、H(His,組胺酸)、R(Arg,精胺酸)、N(Asn,天冬醯胺)、E(Glu,麩胺酸)、D(Asp,天冬醯胺)、C(Cys,半胱胺酸)、Q(Gln,麩醯胺酸)、I(Ile,異白胺酸)、M(Met,甲硫胺酸)、P(Pro,脯胺酸)、T(Thr,蘇胺酸)、K(Lys,離胺酸)及W(Trp,色胺酸)。胺基酸亦包括胺基酸羥基脯胺酸及硒代半胱胺酸,其出現在哺乳動物細胞中所見的一些蛋白質中。
如本文所用之術語「多肽」、「多肽序列」及「蛋白質」為同義詞並且意謂藉由其C-1羧基與其α胺之間的肽鍵連接在一起以形成多肽之主鏈的
aas序列。因此,包含MOD多肽序列、支架多肽序列、TGF-β多肽序列及/或掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列)之任何一或多者的各多肽(例如,第一多肽)包含彼等多肽序列中之任何一或多者作為具有單一連續主鏈之多肽鏈。此等多肽(例如,第一多肽)可藉由共價鍵(例如半胱胺酸殘基之側鏈之間的二硫鍵)連接至其他多肽。此外,如本文所用,術語「多肽」、「多肽序列」及「蛋白質」包括對於原生序列之修飾,諸如缺失、添加及取代(如熟習此項技術者已知,通常在性質上為保守的),只要蛋白質保持所需活性。此等修飾可為故意的,如經由定點誘變,或可為意外的,諸如經由產生蛋白質的宿主之突變,或歸因於聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增或其他重組去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)方法之誤差。
當實施例、請求項或態樣係針對特定類型之哺乳動物(例如,人類或非人類受試者)時,核酸及多肽序列可限於來自彼等受試者之序列。除非另外陳述,否則蛋白質(例如,TGF-β、TβR、免疫球蛋白及MOD)之多肽序列為人類(智人(Homo Sapiens))序列。
如本文所用,「經掩蔽之」意謂分子(例如,經掩蔽之多肽或經掩蔽之蛋白)藉由掩蔽分子(例如,多肽、蛋白質或蛋白質片段)結合或以其他方式接合,該掩蔽分子限制經掩蔽之分子相對於亦對該分子具有親和力之其他蛋白質(例如,細胞表面受體)的可獲得性。
如本文所用,術語經掩蔽之TGF-β構築體係指包含TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β)多肽序列及結合至或以其他方式與TGF-β多肽相互作用之掩蔽多肽序列兩者的單一多肽。除非另外陳述,否則經掩蔽之TGF-β構築體包含支架多肽序列並且視情況包含一或多個獨立選定之免疫調節(MOD)多肽序列。
如本文所用,術語經掩蔽之TGF-β複合物係指兩個或兩個以上多肽
(通常經排列成同二聚體或異二聚體的稱為第一多肽及第二多肽的兩個多肽,但可為高階多聚體)。經掩蔽之TGF-β複合物包含TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β)多肽序列、結合至或以其他方式與TGF-β多肽相互作用之掩蔽多肽序列以及支架多肽,該支架多肽包含TGF-β複合物之多肽藉以締合的二聚化或多聚化序列。TGF-β複合物多肽中之任何一或多者視情況包含一或多個獨立選定之MOD多肽序列。
片語「經掩蔽之TGF-β構築體或複合物」為經掩蔽之TGF-β構築體或經掩蔽之TGF-β複合物的縮寫。該縮寫可以其複數形式「經掩蔽之TGF-β構築體或複合物」使用。
片語「經掩蔽之TGF-β構築體及複合物」為「經掩蔽之TGF-β構築體」及「經掩蔽之TGF-β複合物」兩者之縮寫。
如本文所用之二聚化及多聚化序列為允許多肽序列(例如,單獨多肽)締合為二聚體(例如,異二聚體或同二聚體)或多聚體(三個、四個、五個或更多個多肽序列之同或異多聚體)的多肽序列。二聚化及多聚化序列允許序列以非共價方式締合,其可在一些情況(例如,在多肽之間形成二硫鍵)下轉化為共價複合物。
種間結合序列為允許多肽之不對稱配對(異二聚體形成)的二聚化序列。種間結合序列有利於與作為其同源結合搭配物的其對應種間結合序列形成異二聚體(如與形成同二聚體相反)。孔匙(「Key-in-hole或key-into-hole」)Fc多肽對表示種間結合序列及其對應種間結合序列之一實例。
如本文所用之Nanobodies®或奈米抗體係指由單一單體可變抗體域組成之抗體片段,與完整抗體一樣,該抗體域能夠選擇性地結合至特異性抗原。
關於aa序列之野生型(縮寫為「wt.」)意謂如自上下文所理解的天然存在之aa序列、或天然存在之aa序列之連續部分,其相對於天然地見於活有機
體中之序列未經改變(其中不具有任何取代、缺失或插入)。特定的天然存在之序列可稱為wt.序列以供參考。
如本文所用,「T細胞」包括所有類型的表現CD3之免疫細胞,包括T-輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T-細胞(CD8+細胞)、T-調節性細胞(Treg)及NK-T細胞。
如本文所用之術語「結合」係指兩個分子之間的非共價相互作用,例如,MOD與其共MOD之間的非共價相互作用。非共價結合係指兩個分子之間由於例如靜電、疏水性、離子及/或氫鍵相互作用(包括諸如鹽橋及水橋之相互作用)而直接締合。非共價結合相互作用之特徵通常在於解離常數(KD)小於10-6M、小於10-7M、小於10-8M、小於10-9M、小於10-10M、小於10-11M、小於10-12M、小於10-13M、小於10-14M或小於10-15M。「特異性結合」通常係指具有至少約10-7M或更大,例如5x 10-7M、10-8M、5 x 10-8M、10-9M及更大之親和力的結合。「非特異性結合」通常係指以小於約10-7M之親和力結合(例如,配位體與除了其指定結合位點或受體以外的部分之結合)(例如以10-6M、10-5M、10-4M之親和力結合)。如本文所用,「共價結合」或「共價鍵」係指兩個不同分子之間的一或多個共價化學鍵之形成。
「親和力」係指非共價結合強度,結合親和力之增加與較低KD相關聯。如本文所用,術語「親和力」係指兩種試劑(例如抗體與抗原)之可逆結合的平衡常數且表示為解離常數(KD)。
如本文所用,術語「免疫調節多肽」或MOD包括抗原呈現細胞(APC)(例如,樹突狀細胞、B細胞及其類似細胞)上之多肽、或APC上之多肽之一部分,其特異性結合T細胞上之同源共免疫調節多肽(「共MOD」),由此提供訊息。例如,介白素諸如IL-2或其片段(MOD)與細胞表面IL-2受體(共MOD)之鍵結為細胞提供訊息。MOD包括但不限於IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、
IL-15、IL-21及IL-23、PD-L1以及Fas配位體(Fas ligand,FAS-L)。MOD亦尤其涵蓋與存在於T細胞上之共MOD分子特異性結合從而造成由共MOD之訊息傳導的抗體或抗體序列(例如,奈米抗體)。如本文論述,MOD亦包括wt.MOD之變異體,包括例如對共MOD具有減小之結合親和力的變異體MOD。此減小之親和力可採用多種形式。例如,變異體IL-2 MOD可對IL-2R之α、ß及/或γ鏈中之一或多者具有減小之親和力。如本文論述,包含位置16及42處之突變的變異體IL-2 MOD可與IL-2R之α鏈實質上不結合並且對IL-2R之ß鏈展現減小之親和力。另外,對於具有一種以上共MOD之MOD(例如,CD80結合至CD28及CTLA-4兩者),變異體MOD可對共MOD中之一者具有減小之親和力以使得其優先或選擇性地結合其他共MOD。對於本揭示案之目的,TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)及其片段不被視為MOD。
除非另外指示,否則術語「實質上」意欲涵蓋「完全地」及「基本上但並非完全地」兩者。例如,對IL-2R之α鏈展現實質上不結合的變異體IL-2 MOD為完全不結合至IL-2R之α鏈或基本上不結合至IL-2R之α鏈的IL-2變異體MOD。
如本文所用,術語「活體內」係指在例如自體免疫患者之體內出現的任何過程或程序。
如本文所用,「活體外」係指在體外出現之任何過程或程序,包括可稱為離體之程序。
如本文用於描述MOD多肽序列之安置的「串聯」意謂使兩個或兩個以上MOD在多肽上彼此相鄰地排列,該等MOD至多由連接子分隔(例如,不插入支架、掩蔽多肽或TGF-β序列)。
如本文所用,術語「胞外域」意謂膜蛋白之部分(域),其延伸至胞外空間中並且不包括足以使得其錨定在細胞膜中之跨膜域部分。
如本文所用之「序列一致性」為兩個多核苷酸序列或兩個多肽序列之間的aa或核苷酸一致性之量度。陳述蛋白質或多肽序列與另一個多核苷酸或多肽具有一定百分比之「序列一致性」意指當比對時在比較兩個序列時鹼基或胺基酸之百分比相同且處於相同的相對位置中。序列一致性可以許多不同方式判定。為了判定序列一致性,可使用各種便利方法及在全球資訊網之網址上可獲得之計算機程式(例如BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)來比對序列,該等網址包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。參見例如Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10。除非另外陳述,否則使用以2019年4月1日公佈之NCBI BLAST演算法版本BLAST+2.9.0(對於蛋白質,為BLASTP 2.9.0+並且對於核酸,為BLASTN 2.9.0+)執行之比對來測定序列一致性。
如本文所用,「重組」意指特定核酸(DNA或核醣核酸(ribonucleic acid,RNA))為選殖、限制、聚合酶鏈反應(PCR)及/或連接步驟之各種組合的產物,該等組合產生具有與見於自然系統中的內源性核酸可區分之結構性編碼或非編碼序列的構築體。編碼多肽之DNA序列可由互補去氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)片段或一系列合成寡核苷酸組裝以提供合成核酸,該合成核酸能夠自細胞或無細胞轉錄及轉譯系統中所含之重組轉錄單元表現。涉及肽、多核苷酸或蛋白質所使用之重組指示其已藉由自重組核酸之表現來製備。
如本文所用,關於量所用之術語「約」指示量可變化所示量之10%。例如,「約100」意謂90-110之量。當約在範圍之情況中使用時,涉及範圍之較低量所用之「約」意謂較低量包括比範圍之較低量低10%之量,並且涉及範圍之較高量所用之「約」意謂較高量包括比範圍之較高量高10%之量。例如,約100至約1000意謂範圍自90擴展至1100。
術語「治療(treatment/treating)」及其類似詞語在本文中用於通常意指獲得所要藥理學及/或生理學作用。該作用可在完全或部分預防疾病或其症狀方面為預防性的,且/或可在疾病及/或因疾病引起之不良效應的部分或完全治癒方面為治療性的。如本文所用,「治療」涵蓋哺乳動物中疾病或症狀之任何治療,且包括:(a)預防疾病或症狀出現於可能傾向於獲得該疾病或症狀但尚未診斷為患有該疾病之受試者中;(b)抑制疾病或症狀,亦即阻止其發展;及/或(c)緩解疾病,亦即引起疾病消退。治療劑(例如,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物)可在發生疾病或損傷之前、期間或之後投與。尤其關注正在發展的疾病之治療,其中該治療使患者之不希望有的臨床症狀穩定或減輕。此類治療理想地在患病組織中的功能完全喪失之前進行。治療性治療可在疾病之有症狀階段期間且在一些情況下在疾病之有症狀階段之後投與。
術語「個體(individual)」、「受試者(subject)」、「宿主(host)」及「患者(patient)」在本文中可互換使用且係指需要診斷、處理或治療之任何哺乳動物受試者。哺乳動物包括例如人類、非人類靈長類動物、齧齒動物(例如大鼠;小鼠)、兔類動物(例如兔)、有蹄類動物(例如奶牛、大鼠、山羊、綿羊、馬、豬及其類似物)、犬類(例如狗)、貓科動物(例如貓)等(例如人、牛、犬、貓、齧齒動物、鼠類、山羊、猿猴、綿羊、馬、兔、豬等)。
必須注意,除非上下文另外明確規定,否則如本文及隨附態樣及請求項中所用,單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此,舉例而言,提及「一Treg」包括複數個此等Treg且提及「該TGF-β多肽」包括提及一或多種TGF-β多肽及其為熟習此項技術者所知之等效物等。還應注意,請求項可經草擬以包括或排除任何視情況存在之要素。因此,此陳述意欲充當在請求項中使用(包含)此類要素(例如,使用諸如「單獨」、「僅」及其類似術語之術語),或將其自請求項移除之前提基礎或作為排除任何特定視情況選用之要素的「否
定性」限制之基礎。
應瞭解,為明確起見在單獨態樣或實施例之情形下描述的本發明之某些特徵亦可於單一態樣或實施例中組合提供,包括隨後主張之彼等。相反,為簡潔起見在單一實施例之情形下描述的本發明之各種特徵亦可單獨或以任何適合子組合提供。本發明所涉及之實施例之全部組合明確由本發明包括,且就如同各個及每個組合個別地及明確地在本文中揭露一般於本文中揭露。此外,各種實施例及其要素之所有子組合亦由本發明明確包括,且就如同各個及每個此子組合個別地及明確地在本文中揭露一般於本文中揭露。
本文討論之公開案係僅關於其在本發明提交日之前的披露內容。本文中之任何內容均不得解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於此類公開案。此外,所提供之公開日期可與實際公開日期有所不同,實際公開日期可能需要單獨確認。
B.描述
1 引言
TGF-β超家族包括具有生長抑制功能之內源性蛋白質。TGF-β表現之增加或抑制TGF-β作用的細胞機制中之缺陷尤其與由於TGF-β之免疫抑制作用所致的許多癌症之惡性腫瘤相關聯。在自體免疫疾病中亦牽涉到TGF-β之免疫抑制功能失調。因為TGF-β為免疫功能之關鍵調控劑,所以其為許多研究之靶標並且TGF-β及其訊息傳導途徑兩者被視為治療多種疾病包括發炎性過程及自體免疫病症之治療靶標。
有效地製備及遞送TGF-β作為治療劑之能力由於分子毒性及TGF-β受體系統之複雜性而變得複雜化。TGF-β在哺乳動物細胞表現系統中之大量產生受到蛋白質對許多哺乳動物細胞之毒性的限制。經受TGF-β之細胞毒性的細胞包括許多用於產生生物分子之細胞,諸如中國倉鼠卵巢或「Chinese Hamster
Ovary,CHO」細胞,其為用於商業蛋白質產生之最穩健及常用細胞中之一者。TGF-β作為治療劑之用途亦由於具有約8.59之pI的TGF-β1之高pI(與TGF-β3之約6.1之pI形成對照)而變得複雜化,其穩定性/溶解性在非酸性之條件下受到限制(此類酸性條件通常不適於治療用途)。另外,相對於TβRII對TGF-β之親和力(大約1-2μM),存在於哺乳動物系統中之大量高親和力TβRIII受體(例如,對於TGF-β2,大約5nM)代表顯著藥效動力學貯庫,其限制基於TGF-β之生物製劑接近靶組織。類似地,TβRIII在將TGF-β募集至TβRII/TβRI複合物中之作用可導致TGF-β之顯著脫靶遞送,伴有非預期、不希望有的及甚至有毒性之效應。此類脫靶遞送可造成非特異性活化,並且亦可導致活性TGF-β之進一步產生,尤其當TGF-β訊息傳導處於前饋控制下時更是如此,由此產生進一步非預期及不希望有的效應。參見例如Jiang等人,Redox Biol.2:267-272(2014)。
TGF-β作為治療劑之有效用途由於需要向細胞提供額外刺激以指導TGF-β刺激之結果而進一步複雜化。如上所示,細胞介素諸如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及IL-23、PD-L1以及Fas配位體(FAS-L)可對TGF-β之作用具有深遠影響。因此,遞送TGF-β及呈細胞介素等形式之額外刺激的能力對於達成特定治療或細胞介導結果(例如,活體外或活體內)效應可為有利的。
如以下更詳細地論述,本揭示案描述能夠與帶有TβRI及TβRII蛋白之細胞相互作用並且刺激該等細胞上之訊息傳導的TGF-β多肽之用途。有利地,TGF-β多肽為經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之一部分,其為融合蛋白(單一多肽鏈)或融合蛋白複合物(兩條或兩條以上多肽鏈),該融合蛋白或融合蛋白複合物亦含有結合並掩蔽圍繞支架(例如,一或兩個多肽諸如免疫球蛋白Fc多肽)建構之TGF-β多肽序列(例如,充當掩蔽序列之TβRII序列)的多肽。此類融合蛋白或融合蛋白複合物之實例描繪於圖1中。當融合蛋白之TGF-β多肽與例如細
胞TβRIII相互作用時,融合蛋白結合並掩蔽TGF-β之部分與TβRIII競爭,從而防止TGF-β螯合於TβRIII儲器中。另外,可有意地使用aa取代改變的掩蔽多肽對TGF-β多肽之親和力控制經掩蔽之多肽對其靶受體(例如,TβRII)之總體效力,如圖9中所示。因為TGF-β多肽主要作為二硫化物連接之二聚體結合TβRIII,所以導致螯合的與該受體之相互作用可藉由包括限制二聚化(例如,C77S)或二聚體穩定性之aa取代來減弱,如下論述。TGF-β融合蛋白或融合蛋白複合物與TβRII之相互作用使掩蔽序列移位,從而形成細胞表面結合之TGF-β/TβRII複合物。隨後募集TβRI以形成異二聚體TGF-β受體,提供緊密地結合TGF-β(例如,皮莫耳親和力)之高親和力複合物,甚至在存在掩蔽多肽序列時亦如此。因此,經掩蔽之TGF-β仍然能夠結合至異二聚體TβRI/TβRII受體複合物並且經由典型Smad蛋白途徑、非典型Jun激酶途徑及p38訊息傳導路徑進行訊息傳導。事實上,掩蔽多肽將TGF-β遞送至細胞並且將其轉移至細胞表面TβRII分子,其隨後募集TβRI蛋白,形成有效地將TGF-β多肽保持在適當位置中的功能性及活性訊息傳導複合物。
除了以避免不希望有的脫靶相互作用之形式來遞送由TGF-β結合蛋白(例如,TGF-β受體中包含其TGF-β結合胞外域之全部或一部分的片段)掩蔽之TGF-β以外,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物亦可包含一或多個充當免疫調節劑之多肽(「MOD」多肽),其能夠影響TGF-β對靶細胞作用之結果。TGF-β與免疫調節劑兩者一起遞送之能力不僅允許指導TGF-β活化訊息之作用,而且相對於投與單獨免疫調節劑,其減少對靶細胞產生相同效應所需的免疫調節劑之量。此係藉由使兩個多肽序列對相同靶細胞上之受體具有親和力所獲得的親和力增加(經由親合力提高)之結果。帶有一或多個MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與帶有TGF-β多肽及一或多個MOD兩者之受體的靶細胞之間的親合力之增加(由於MOD與其受體之相互作用導致的增加之結合自由能△G所引起)
在具有兩種類型受體之靶細胞的活化中提供增強之選擇性,前提條件為存在次飽和量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。舉例而言,與缺少IL-2 MOD的在其他方面相同之經掩蔽之TGF-β構築體相比,具有IL-2 MOD的諸如圖I結構A或圖7G之經掩蔽之TGF-β構築體為幼稚CD4+細胞之iTReg分化的更有效誘導物,甚至在存在等效(等莫耳)量之IL-2 MOD多肽時亦如此。另外,在次飽和劑量下,並且當存在類似數目之細胞類型時,相對於缺少IL-2 MOD之構築體,具有如例如圖7G示出之IL-2 MOD的諸如圖1結構A中之構築體選擇性地結合至具有TGF-β及IL-2受體兩者的細胞。
經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之作用可藉由併入改變個別多肽序列之作用的修飾來進一步指定。在一些實施例中,可併入改變TGF-β二聚化之能力的aa取代(例如,TGF-β3中之C77S取代)。因為單體形式之TGF-β對TβRIII展現極小(若有的話)親和力,所以併入限制TGF-β二聚化能力之突變限制與TβRIII之脫靶結合,從而可將複合物拖至TGF-β「儲器」中並且限制其刺激靶細胞之能力。
亦可對除了TGF-β多肽序列以外之多肽序列進行修飾(例如,取代、缺失、插入等),這些序列包括掩蔽多肽序列及免疫調節多肽序列。
除了TGF-β多肽序列之修飾以外,可對結合至TGF-β並將其掩蔽之多肽進行修飾。此類修飾可藉由改變掩蔽多肽對TGF-β之親和力以及掩蔽多肽及TGF-β多肽之呼吸率(締合及解離率)來改變TGF-β多肽序列之可利用性。雖然兩個不同TGF-β多肽/掩蔽多肽複合物可具有相同結合締合常數(k締合與k解離之比率),但具有較高k締合及k解離之複合物可更有效地用於細胞表面TβRII結合,視速率常數、尤其是k解離率而定。圖9提供TβRII中改變對TGF-β1及TGF-β3之親和力的一些aa取代之清單,以及示出在不存在或存在各自對TβRII與TGF-β3之結合具有不同影響的三個取代中之一者的情況下,在其他方面相同
之TβRII掩蔽之TGF-β構築體之親和力的圖。
雖然可能利用各種多肽來掩蔽TGF-β,包括兩種單鏈抗體序列(例如,人源化單鏈抗體序列),但可使用結合TGF-β之最小TGF-β受體序列(例如,TβRI、TβRII或TβRIII之胞外域)。TβRIII之胞外域可用作二聚體TGF-β之掩蔽多肽;然而,其對TGF-β之高親和力可使得其拮抗TGF-β多肽序列與TβRII之結合。雖然如此,TβRIII掩蔽序列可由對TGF-β多肽具有更高親和力之細胞表面TβRI/TβRII複合物有效置換,由此允許彼等細胞表面受體之激活。
TβRII之胞外域可用作掩蔽多肽。在存在或不存在D118A取代之情況下,TβRII之N端胺基酸(例如,δ 14或25)之缺失可產生蛋白質(或多肽),其適合於掩蔽具有經計算為約4.5至約5.0(例如,約4.7至4.85)之pI的TGF-β。TGF-β1多肽(其具有高pI值)與TβRII掩蔽多肽(例如,包括具有N端缺失之多肽)之組合可潛在地中和TGF-β1多肽電荷。TβRII(δ 25,D118A)/TGFβ1之經計算pI大約為6.23,其中TGFβ1具有約8.59之pI。相比之下,δ 14或δ 25 TβRII及TGF-β3(具有或不具有D118A及/或C77S取代)之複合物經計算具有約4.9至約5.3之pI值(約5.06至5.17之pI)。另外,雖然將TβRII胞外域與活性TGF-β多肽組合可產生一種複合物,其能夠與細胞表面TβRI相互作用,由此影響TGF-β之TGF-β訊息傳導(例如,充當促效劑、部分促效劑、拮抗劑或部分拮抗劑),但併入限制與TβRI相互作用之aa取代限制或阻斷經掩蔽之複合物參與主動訊息傳導之能力。因此,如下論述,併入減少或消除與TβRI之結合的具有N端缺失(例如,14至25 aa、△14至△25之缺失)或取代(例如,在D118處由除了天冬胺酸以外之aa的取代,諸如D118A、D118R等)的TβRII胞外域序列可用於掩蔽TGF-β並且防止其中TβRII之N端呈完整的TβRII胞外域掩蔽之TGF-β多肽對細胞之刺激。因此,經掩蔽之TGF-β複合物,包括其中TGF-β由TβRII之N端缺失突變體掩蔽之複合物,可藉由使TGF-β去掩蔽(自掩蔽肽解離或打開經折疊
之分子),結合至靶細胞之TβRII及TβRI以形成活性異二聚體TβRI/TβRII訊息傳導複合物來起作用。
TGF-β之掩蔽使得其在哺乳動物細胞(例如,CHO細胞)中以高水準表現而細胞生存力無降低。當藉由N端aa缺失、取代及/或其他突變來阻斷經掩蔽之TGF-β多肽接合TβRI時,情況尤其如此。TβRIII相互作用之阻斷(例如,藉由阻斷二聚化)可進一步減少與細胞表現相關之問題。
C.經掩蔽之TGF-β構築體及經掩蔽之TGF-β複合物
本揭示案描述經掩蔽之TGF-β構築體(參見,例如,圖1,結構A,具有單一多肽鏈)及經掩蔽之TGF-β複合物(參見,例如,圖1,結構B-F,具有兩條多肽鏈之複合物)之製備。經掩蔽之TGF-β構築體及經掩蔽之TGF-β複合物包含至少一個TGF-β多肽序列、至少一個結合至並掩蔽TGF-β多肽之多肽及視情況選用之一或多個(例如,一個、兩個或三個)免疫調節多肽(MOD)作為其組分,其全部在支架結構上組裝。雖然經掩蔽之TGF-β構築體及經掩蔽之TGF-β複合物包含膜結合蛋白(例如,TGF-β受體)之部分,但除非另外陳述,否則其不包含膜錨定域部分(例如,足以導致大部分所表現之蛋白質變得錨定在細胞膜(例如,表現之CHO細胞)中的跨膜域。
TGF-β構築體及複合物之非限制性實例(包括圖1示出之形式之彼等)於下文中描述。
經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之組分,包括MOD、支架、連接子、TGF-β多肽及TGF-β掩蔽多肽(例如,單鏈抗體或TGF-β受體胞外域)各自描述於以下部分中。
D.免疫調節多肽序列(「MOD」)
1 MOD併入經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中
如上論述,雖然免疫調節多肽(MOD)並非遞送經掩蔽之TGF-β多肽
或其經由TβRI及TβRII異二聚體受體激活細胞之能力所必需的,但MOD可實質上影響TGF-β受體活化之結果。因此,可需要併入野生型(wt.)或變異體MOD(例如,對於亦稱為「共MOD」、「共免疫調節多肽」或同源共刺激受體或其亞型之特定受體,其展現減小之親和力、增加之親和力或選擇性)。雖然TGF-β為免疫調節多肽,但因為其為本文所述之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的中心元素,所以如本文所用之術語「MOD」不包括TGF-β或其多肽。
適合於包含在經掩蔽之TGF-β構築體及複合物(例如,同二聚體或異二聚體複合物)之任一者中的MOD包括但不限於如PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及IL-23。
在一些情況下,MOD獨立地選自成熟PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及IL-23多肽或其任一者之片段。併入經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的MOD多肽序列可僅包含分泌型MOD多肽之一部分或全長成熟MOD蛋白之胞外部分,只要其呈膜錨定形式。因此,例如,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD多肽序列在一些情況下可排除通常見於一些天然存在之MOD中的訊息肽、跨膜域及/或胞內域中之一或多者(例如,各者)。
在一些情況下,適合於包含在本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的MOD多肽序列包含天然存在之MOD之胺基酸序列之全部或一部分(例如,胞外部分)。在其他情況下,適合於包含在本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的MOD包括至少一個(例如,一個、兩個、或三個獨立選定之)變異體MOD,與天然存在之MOD之胺基酸序列相比,其包含至少一個胺基酸插入、取代及/或缺失。
在一些情況下,與相應的天然存在之MOD(例如,不包含存在於變異體中之胺基酸取代的MOD)對共MOD之親和力相比,變異體MOD對共MOD
展現較低之結合親和力。視親和力之減少而定,使用對其共MOD具有減小之親和力的MOD允許TGF-β多肽對結合相互作用具有更大影響,或甚至支配該結合相互作用。當TGF-β多肽之結合親和力高於MOD時,其可驅動經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與具有TGF-β受體系統(例如,形成高親和力TGF-β結合異二聚體之TGF-βR1及TGF-βR2)之細胞締合,同時限制與具有甚至豐富的共MOD但缺少或具有極少TGF-β受體之細胞的脫靶結合。本質上,當TGF-β多肽對其細胞受體之親和力(例如結合之△G)大於MOD對其共MOD之親和力(例如其結合△G)時,TGF-β驅動經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之結合及特異性。
在一實施例中,與經掩蔽之TGF-β構築體及複合物相關之任何一或多個MOD獨立地選自由以下組成之群:wt.或變異體:PD-L1;FAS-L;IL-1;IL-2;IL-4;IL-6;IL-7;IL-10;IL-15;IL-21;IL-23;及其組合。
在一些情況下,諸如當需要刺激Treg細胞之產生時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-2多肽或IL-2變異體多肽。IL-2中之序列變異可經選擇以將IL-2多肽與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之結合偏向於帶有IL-2R受體次單元之不同組合的靶細胞。IL-2受體包含共用的IL-2Rγ及兩個額外的IL-2Rα及/或IL-2Rβ次單元以形成三聚體(IL-2Rα)2-IL-2Rγ、(IL-2Rβ)2-IL-2Rγ或高親和力(約10皮莫耳之Kd)IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ受體。α鏈(CD25)對IL-2係獨特的,而β鏈(CD122)與IL-15受體共用,並且對訊息傳導至關重要之γ鏈(CD132)可與其他細胞介素受體鏈搭配。H16處(例如,H16A或H16T)或F42處(例如,F42A或F42T)之取代可使結合偏向有利於具有IL-2Rβ次單元之受體;且相應地,其併入使結合偏向於展現β-γ受體((IL-2Rβ)2-IL-2Rγ)之記憶T細胞及NK細胞,或展現高親和力α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受體之活化T-細胞及Treg。相比之下,N88處之取代(例如,N88R)減少與IL-2Rβ之結合並併且可使結合偏向有利
於具有IL-2Rα次單元之受體;且相應地,N88處之取代使結合偏向於具有α-γ((IL-2Rα)2-IL-2Rγ))及α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受體之細胞,同時避免具有β-γ受體之細胞之結合及活化。參見例如Skrombolas及Frelinger Expert Rev Clin Immunol.,10(2):207-217(2014)。如在使經取代之MOD(諸如具有aa取代之IL-2多肽)結合至其共MOD或展現共MOD之細胞的情形中所用,偏向意謂相對於wt.MOD與相同共MOD之間的相互作用,取代之存在使經取代之MOD與共MOD之相互作用之程度發生變化。例如,可包括具有較低副作用概況(例如,更安全)且為人類受試者更好耐受的具有N88處之取代(例如,N88R)的IL-2序列,其具有在H16及/或F42處之上述取代。
在一些情況下,諸如當需要刺激iTreg細胞(CD4+FoxP3+細胞)之產生(例如,以誘導周圍耐受性,從而主動地抑制效應T細胞及/或抑制免疫介導之組織破壞)時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為獨立選定之wt.或變異體PD-L1MOD多肽。參見例如Francisco等人,J.Exp.Med.,206(13):3015-3029(2009)。除了wt.或變異體PD-L1序列以外,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物亦可包含一或多個獨立選定之wt.或變異體IL-2多肽。IL-2中之序列變異可經選擇以將IL-2多肽與經掩蔽之TGF-β構築體之結合偏向於帶有IL-2R受體次單元之不同組合的靶細胞。如上論述,IL-2變異體包括H16處(例如,H16A或H16T)或F42處(例如,F42A或F42T)之取代,其可使結合偏向有利於具有IL-2Rβ次單元之受體;且/或減少與IL-2Rβ之結合的具有N88處之取代(例如,N88R)的IL-2為人類受試者更好地耐受。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體/-β複合物包含H16T及F42A兩者,或H16A及F42取代兩者,任一對皆可與N88(例如,N88R)取代組合。
在一些情況下,諸如當需要刺激Th17細胞之產生時,存在於經掩蔽
之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-6多肽或IL-6變異體多肽。
在一些情況下,諸如當需要刺激Th9細胞之產生時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-4多肽或IL-4變異體多肽。參見例如Elyaman等人Immunity.,36(4):623-634,Immunity.(2012)。
在一些情況下,諸如當需要藉由控制胸腺細胞IL-7Ra表現來促進低親和力T細胞之IL-7依賴性存活時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-7多肽或IL-7變異體多肽。
在一些情況下,諸如當需要刺激T濾泡性輔助(Tfh)細胞之產生時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-21或IL-23多肽、或IL-21或IL-23多肽之變異體。
在一些情況下,諸如當需要誘導耐受性時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)及或Fas配位體(FasL)多肽之變異體。
在一些情況下,諸如當需要抑制II型先天淋巴細胞(ILC2細胞)(例如,抑制哮喘及過敏性炎症)時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)為IL-10多肽、或IL-10多肽之變異體。參見例如Rajas等人,J Allergy Clin Immunol,139(5):1468(2017);及Ogasawara等人,J Allergy Clin Immunol,141(3):1147-1151(2018)。ILC2細胞之抑制可藉由其在活體內(在組織或體液中)或在活體外(在培養基中)之2型細胞介素IL-5及IL-13之產生減少來評定。IL-10多肽可為單體異構物,諸如
Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)所述之IL-10M1分子、或其變異體,兩者皆在下文中論述。與其生物活性形式為形成由2個IL-10分子及4個IL-10Ra受體鏈組成之複合物的纏結IL-10肽對的野生型IL-10相比,IL-10M1以30nm之解離常數與可溶性IL-10Ra形成1:1複合物,其在細胞增殖檢定中具有生物活性。同上
2 具有減小之親和力的MOD及變異體MOD
對其共MOD展現減小之親和力的合適MOD與野生型MOD序列可具有1個胺基酸(aa)至20個aa差異。例如,在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體複合物中的變異體MOD多肽序列與相應野生型MOD多肽序列在胺基酸序列上可相差1個aa、2個aa、3個aa、4個aa、5個aa、6個aa、7個aa、8個aa、9個aa或10個aa。作為另一實例,在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD多肽與相應野生型MOD多肽在胺基酸序列上相差11個aa、12個aa、13個aa、14個aa、15個aa、16個aa、17個aa、18個aa、19個aa或20個aa。舉例而言,在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含單個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含2個aa取代(例如,不超過2個aa取代)。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含3個aa取代(例如,不超過3個aa取代)。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含4個aa或5個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD
序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含6個aa或7個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含8個aa或9個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含10個aa或11個aa取代(例如,不超過10個aa取代)。
在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含11個aa或12個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含13個aa或14個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含15個aa或16個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含17個aa或18個aa取代。在一些情況下,與相應參考(例如,野生型)MOD序列相比,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD包含19個aa或20個aa取代。
如上論述,與相應野生型MOD對同源共MOD之親和力相比,適合於包含在經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD可對其同源共MOD展現減小之親和力。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD多肽序列對同源共MOD具有1nM至100μM之結合親和力。例如,在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD多肽序列對同源共MOD具有以下結合親和力:1nM至約5nM、約5nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM、約100nM至約200nM、約200nM
至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
3 測定結合親和力
介於MOD(例如,MOD多肽)與其同源共MOD之間的結合親和力可藉由生物層干涉術(bio-layer interferometry,BLI)使用經純化之MOD及經純化之同源共MOD來測定。包含MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與MOD之同源共MOD之間的結合親和力亦可藉由BLI使用經純化之掩蔽TGF-β構築體或複合物及MOD之同源共MOD來測定。BLI方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如Lad等人(2015)J.Biomol.Screen.20(4):498-507;以及Shah及Duncan(2014)J.Vis.Exp.18:e51383。本揭示案所述的介於MOD與其同源共MOD之間,或介於具有MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與其同源共MOD之間的特異性及相對結合親和力可使用以下程序來測定。
為了測定介於含有MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與MOD之同源共MOD之間的結合親和力,BLI檢定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)儀器或如下類似儀器進行。將對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,包含野生型MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物)固定在不溶性支撐物(「生物感測器」)上。經固定之掩蔽TGF-β構築體或複合物為「靶標」。固定可藉由將捕獲抗體固定至不溶性支撐物上來實現,其中捕獲抗體固定經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。例如,當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含Ig Fc支架時,固定可藉由將抗Ig Fc(例如,抗人類IgG Fc)抗體固定在不溶性支撐物上來實現,其中經固定之抗Ig Fc抗體結合至並固定經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。將共
MOD以若干不同濃度施加於經固定之掩蔽TGF-β構築體或複合物,並且記錄儀器之反應。檢定在包含25mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1%牛血清白蛋白及0.02% Tween 20非離子清潔劑之液體介質中進行。共MOD與經固定之掩蔽TGF-β構築體或複合物之結合在30℃下進行。
作為結合及結合親和力之陽性對照,可使用抗體(例如,單株抗體)。抗體可基於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之特定結構來選擇(參見,例如,圖1)。例如,針對TGF-β、TGF-β受體、支架或MOD多肽序列之單株抗體(mAb)可用作陽性對照,前提條件為抗體不造成經掩蔽之TGF-β構築體或複合物自支撐物(生物感測器)上解離。標準曲線可使用抗I類或II類MHC單株抗體之連續稀釋液生成。共MOD或抗MHC mAb為「分析物」。BLI分析自以下兩個表面反射之白光的干涉圖型:i)經固定之多肽(「靶標」);及ii)內部參考層。結合至生物感測器尖部之分子(「分析物」;例如,共MOD;抗HLA抗體)數目之變化引起干涉圖型之偏移;干涉圖型之此偏移可即時量測。描述靶標/分析物相互作用之親和力的兩個動力學術語為締合常數(k a)及解離常數(k d)。該兩個術語之比率(k d/a)產生親和力常數KD。
如上所示,測定介於MOD(例如,IL-2或IL-2變異體)與其同源共MOD(例如,IL-2R)之間的結合親和力亦可藉由BLI測定。檢定類似於如上對於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物所述之檢定。BLI檢定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)儀器或如下類似儀器進行。將經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之組分MOD(例如,本揭示案之變異體IL-2多肽);及對照MOD(其中對照MOD包含野生型MOD,例如野生型IL-2)單獨地固定在不溶性支撐物(「生物感測器」)上。各MOD為「靶標」。固定可藉由將捕獲抗體固定至不溶性支撐物上來實現,其中捕獲抗體固定MOD。例如,若靶標融合至免疫親和標記物(例如FLAG、人類IgG Fc等),固定可藉由將免疫親和標記物之合適抗體(例如抗人類IgG Fc)固
定在不溶性支撐物上來實現,其中經固定之抗體結合至並固定MOD(其中MOD包含IgFc多肽)。共MOD(或多肽)以若干不同濃度施加於經固定之MOD,且記錄儀器之反應。或者,將共MOD(或多肽)固定至生物感測器(例如,對於IL-2受體異三聚體,作為單體次單元、異二聚體子複合物或完整異三聚體),將MOD以若干不同濃度施加於經固定之共-MOD,並且記錄儀器之反應。檢定在包含25mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1%牛血清白蛋白及0.02% Tween 20非離子清潔劑之液體介質中進行。共MOD與經固定之MOD之結合在30℃下進行。BLI分析自以下兩個表面反射之白光的干涉圖型:i)經固定之多肽(「靶標」);及ii)內部參考層。結合至生物感測器尖部之分子(「分析物」;例如,共MOD)之數目的變化引起干涉圖型之偏移;干涉圖型中之此偏移可即時量測。描述靶標/分析物相互作用之親和力的兩個動力學術語為締合常數(k a)及解離常數(k d)。該兩個術語之比率(k d/a)產生親和力常數KD。因此,測定野生型MOD(例如,IL-2)對其共MOD(例如,其同源結合搭配物或受體;在IL-2的情況下,IL-2R),及變異體MOD(例如,如本文揭示之IL-2變異體)對其共MOD(例如,在IL-2變異體的情況下,IL-2R)兩者之結合親和力允許測定變異體共MOD如與野生型共MOD相比對共MOD之相對結合親和力。亦即,可判定如與野生型MOD對相同同源共MOD之結合親和力相比,變異體MOD對其共MOD之結合親和力是否減小,且若減小,則測定與野生型共MOD之結合親和力相比減小之百分比。
BLI檢定在多孔板中進行。為了操作該檢定,限定板佈局,限定檢定步驟,且在Octet Data Acquisition軟體中指派生物感測器。使生物感測器組件水合。將經水合之生物感測器組件及檢定板在Octet儀器上平衡10分鐘。一旦採集資料,即將所採集之資料加載至Octet Data Analysis軟體中。在處理窗口中藉由指定用於參考減法、y軸對準、步間校正及Savitzky-Golay濾波之方法來處
理資料。在分析窗口中藉由指定分析(締合及解離)之步驟、選擇曲線擬合模型(1:1)、擬合方法(全域)及目標窗口(以秒計)來分析資料。評價擬合品質。若在3倍範圍內,則對各資料追蹤(分析物濃度)之KD值取平均值。KD誤差值應處於親和力常數值之一個數量級內;R2值應高於0.95。參見,例如Abdiche等人.(2008)J.Anal.Biochem.377:209。
在一些情況下,i)對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(其中對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含野生型MOD)與同源共MOD之結合親和力同ii)包含野生型MOD變異體的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與同源共MOD之結合親和力的比率當藉由BLI(如上所述)量測時為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5 x 102:1、至少103:1、至少5 x 103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。在一些情況下,i)對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(其中對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含野生型MOD)與同源共MOD之結合親和力同ii)包含野生型MOD變異體的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與同源共MOD之結合親和力的比率當藉由BLI量測時在1.5:1至106:1之範圍內,例如,1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1、或105:1至106:1。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD對同源共MOD具有1nM至100μM、或100nM至100μM之結合親和力。例如,在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD對同源共MOD具有以下結合親和力:約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約
20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD對同源共MOD具有約1nM至約5nM、約5nM至約10nM、約10nM至約50nM、或約50nM至約100nM之結合親和力。
4 PD-L1及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為PD-L1或變異體PD-L1多肽。野生型PD-L1結合至PD1。
適合用作MOD之野生型PD-L1 IgV域可包含SEQ ID No.1之aa 18、aas IgV aas 19-12,及羧基末端穩定化序列,諸如例如該序列之最後七個胺基酸(粗
體及斜體): SEQ ID NO:138。當羧基穩定序列包含在約aa 122處之組胺酸(例如,作為SEQ ID NO:138之aa 117出現的Tyr(Y)之C端側約5個殘基處之組胺酸)時,組胺酸可與aas 82及83(在SEQ ID NO:138中呈粗體及斜體(SEQ ID NO:1之Q107及L106)處之主鏈醯胺形成穩定靜電鍵。作為一替代方案,穩定二硫鍵可藉由取代aas 82或83)(SEQ ID NO:1之Q107及L106)中之一者及aa殘基121、122或123(相當於SEQ ID NO:1之aa位置139-141)中之一者而形成。
在一些情況下,變異體PD-L1多肽(例如,SEQ ID NO:2之變異體或PD-L1之IgV域)呈現出與PD-1(例如,包含SEQ ID NO:3中列出之胺基酸序列的PD-1多肽)之結合親和力同包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出之胺基酸序列的PD-L1多肽之結合親和力相比有所減小。舉例而言,在一些情況下,變異體PD-L1多肽結合PD-1(例如,包含SEQ ID NO:3中列出之胺基酸序列的PD-1多肽)之結合親和力比包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出之胺基酸序列的PD-L1多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小
至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體PD-L1多肽(例如,SEQ ID NO:2之變異體或其IgV域)對PD-1(例如SEQ ID NO:3)具有1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)之結合親和力。作為另一實例,在一些情況下,變異體PD-L1多肽(例如SEQ ID NO:2之變異體)對PD1(例如,包含SEQ ID NO:3中列出之胺基酸序列的PD1多肽)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
可在用作MOD之PD-L1胞外域序列中製造許多aa取代,包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1之aas 19-127(IgV域)及SEQ ID NO:138中任一者之至少85個連續aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105個連續aas)具有大於90%(95%、98%或99%)序列一致性的序列之取代。取代可包括(a)二硫鍵取代對D103C及G33C,或V104及S34C;(b)鹽橋形成取代對Q107D及K62R或Q107D及S80R;及/或(c)Pi堆疊取代M36Y或M36F(基於SEQ ID NO:1)。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:2之至少85個連續aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105個連續aas)及至少一個二硫化物、鹽橋或Pi堆疊取代的序列。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:1之aas 19-127(IgV域)之至少85個連續aas(例如,至少90、至少95、至少100或至少105個連續aas)及至少一個二硫化物、鹽橋或Pi堆疊取代的序列。PD-L1 MOD序列可包含具有aas SEQ ID NO:138之至少85個連續aas(例如,至少90、至少
95、至少100或至少105個連續aas)及至少一個二硫化物、鹽橋或Pi堆疊取代的序列。
在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有單個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2中列出之PD-L1胺基酸序列或PD-L1之IgV域相比,變異體PD-L1多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體PD-L1多肽序列包括與SEQ ID NO:2(例如,其具有至少一個aa插入、缺失或取代)之至少170個連續aa(例如,至少180、190或200個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。合適的變異體PD-L1 IgV多肽序列包括與SEQ ID NO:2之aas 1-109(例如,其具有至少一個aa插入、缺失或取代)之至少70個連續aa(例如,至少80、90、100或105個連續aas)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
在一實例中,變異體PD-L1多肽序列包括與SEQ ID NO:2具有至少
90%(例如,至少95%、98%或99%)或100% aa序列一致性之多肽序列,其中位置8處之殘基為除D以外之aa;在一此類實例中,該殘基為A,並且在另一實例中,該殘基為R。變異體PD-L1多肽序列包括與SEQ ID NO:2具有至少90%(例如,至少95%、98%或99%)或100% aa序列一致性之多肽序列,其中位置36處之殘基為除I以外之aa;在一此類實例中,該殘基為A,並且在另一實例中,該殘基為D。變異體PD-L1多肽序列亦包括與SEQ ID NO:2具有至少90%(例如,至少95%、98%或99%)或100% aa序列一致性之多肽序列,其中位置54處之殘基為除E以外之aa;在一此類實例中,該殘基為A,並且在另一實例中,該殘基為R。
5 IL-1及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-1或變異體IL-1多肽。野生型IL-1具有兩個同功型,亦即IL-1α及IL-1β,其皆結合至IL-1受體。
野生型人類IL-1α前驅物多肽可包含以下胺基酸序列:
(SEQ ID NO:4)UniProtKB-P01583,NCBI參考序列NP_000566.3,其可具有以下天然存在之變異中之一或多者:R85Q、A114S、N125D、D138N及D176H。
IL-1α及IL-1β結合至IL-1受體,其可具有序列: (SEQ ID NO:8),NCBI參考序列NP_000868.1,其中aas 21至569形成成熟多肽,其胞外域可用於測定與IL-1α及IL-1β之結合親和力。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之胺基酸序列的IL-1多肽之結合親和力相比,變異體IL-1α及IL-1β多肽與具有SEQ ID NO:8中列出之序列的IL-1受體或其胞外域之結合親和力呈現出減小。舉例而言,在一些情況下,變異體IL-1α及IL-Iβ多肽結合SEQ ID NO:8中列出之IL-1受體或胞外域之成熟蛋白的結合親和力比包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之胺基酸序列的IL-1α或IL-1β多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-1α或IL-1β多肽(例如,SEQ ID NO:5或7之變異體)對具有SEQ ID NO:8中列出之序列的IL-1受體具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-1α或IL-1β多肽(例如,SEQ ID NO:5或7之變異體)對SEQ ID NO:8中列出之IL-1受體或其胞外域具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM
至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有單個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-1α或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之IL-lα或IL-1β胺基酸序列相比,變異體IL-1α或IL-1β多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-1α或IL-1β多肽序列包括與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中列出之胺基酸序列(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少100個連續aa具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
6 IL-2及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-2或變異體IL-2多肽。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的變異體MOD為變異體IL-2多肽。野生型IL-2結合至IL-2受體(IL-2R)。野生型IL-2胺基酸序列可如下: (UniProtP60568,SEQ ID NO:9之aa 21-153)。
野生型IL-2結合至細胞表面上之IL-2受體(IL-2R)。在一些情況下,IL-2受體為包含α鏈(IL-2Rα;亦稱為CD25)、β鏈(IL-2Rβ;亦稱為CD122)及γ鏈(IL-2Rγ;亦稱為CD132)之異三聚體多肽。人類IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ之胺基酸序列可如下。
在一些情況下,當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含變異體IL-2多肽時,同源共MOD為包含含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12中任一者之胺基酸序列之多肽的IL-2R。
在一些情況下,變異體IL-2多肽對IL-2R之結合親和力與包含SEQ ID NO:9中列出之胺基酸序列的IL-2多肽之結合親和力相比呈現出減小。舉例而言,在一些情況下,當在相同條件下測定時,變異體IL-2多肽結合IL-2R之結合親和力比包含SEQ ID NO:9中列出之胺基酸序列的IL-2多肽對IL-2R(例如,包含含有SEQ ID NO:10-12中列出之胺基酸序列之多肽的IL-2R)之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-2多肽(例如,SEQ ID NO:9之變異體)對IL-2R(例如,SEQ ID NO:10-12)具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-2多肽(例如SEQ ID NO:9之變異體)對IL-2R(例如,包含含有SEQ ID NO:10-12中列出之胺基酸序列之多肽的IL-2R)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700
nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有單個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有2至10個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有2個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有3個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有4個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有5個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有6個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有7個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有8個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有9個aa取代。在一些情況下,變異體IL-2多肽與SEQ ID NO:9中列出之IL-2胺基酸序列相比具有10個aa取代。
合適的變異體IL-2多肽序列包括包含與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性之aa序列的多肽序列。另外,IL-2變異體包括包含與以下變異體IL-2 aa序列(參見SEQ ID NO:13-27)中任一者之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性之aa序列的多肽。
(SEQ ID NO:15),其中X(H16)為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下,X為Ala(H16A)。在一些情況下,X為Arg。在一些情況下,X為Asn。在一些情況下,X為Asp。在一些情況下,X為Cys。在一些情況下,X為Glu。在一些情況下,X為Gln。在一些情況下,X為Gly。在一些情況下,X為Ile。在一些情況下,X為Lys。在一些情況下,X為Leu。在一些情況下,X為Met。在一些情況下,X為Phe。在一些情況下,X為Pro。在一些情況下,X為Ser。在一些情況下,X為Thr(H16T)。在一些情況下,X為Tyr。在一些情況下,X為Trp。在一些情況下,X為Val。
(SEQ ID NO:20),其中X1(H16)為除His以外之任何胺基酸,且其中X2(F42)為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X1為Ala;且X2為Ala(H16A、F42A)。在一些情況下,X1為Thr;且X2為Ala(H16T、F42A)。在一些情況下,X1為Ala;且X2為Thr(H16A、F42T)。在一些情況下,X1為Thr;且X2為Thr(H16T、F42T)。
(SEQ ID NO:21),其包含N88R取代,並且其中X1(H16)為除His以外之任何胺基酸,且其中X2(F42)為除Phe
以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X1為Ala;且X2為Ala。在一些情況下,X1為Thr;且X2為Ala。在一些情況下,X1為Ala;且X2為Thr。在一些情況下,X1為Thr;且X2為Thr。
(SEQ ID NO:22),其中X1為除Asp以外之任何胺基酸;且其中X2為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X1為Ala;且X2為Ala。
(SEQ ID NO:23),其中X1為除Glu以外之任何胺基酸;其中X2為除Asp以外之任何胺基酸;且其中X3為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,任何兩個或所有三個X 1 為Ala;X 2 為Ala;且X 3 為Ala。
(SEQ ID NO:24),其中X1為除His以外之任何胺基酸;其中X2為除Asp以外之任何胺基酸;且其中X3為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X1為Ala;X2為Ala;且X3為Ala。
(SEQ ID NO:25),其中X1為除
Asp以外之任何胺基酸;其中X2為除Phe以外之任何胺基酸;且其中X3為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X1為Ala;X2為Ala;且X3為Ala。
(SEQ ID NO:26),其中X1為除Asp以外之任何胺基酸;其中X2為除Phe以外之任何胺基酸;且其中X3為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X1為Ala;X2為Ala;且X3為Ala。
(SEQ ID NO:27),其中X1為除His以外之任何胺基酸;其中X2為除Asp以外之任何胺基酸;其中X3為除Phe以外之任何胺基酸;且其中X4為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X4為Ala。在一些情況下,X1為Ala;X2為Ala;X3為Ala;且X4為Ala。
(SEQ ID NO:139),其中X1為除Asp以外之任何胺基酸;其中X2為除Phe以外之任何胺基酸;其中X3為除Tyr以外之任何胺基酸;且其中X4為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X4為Ala。在一些情況下,X1為Ala;X2為Ala;X3為Ala;且X4為Ala。
(SEQ ID NO:140),其中X1為除His以外之任何胺基酸;其中X2為除Asp以外之任何胺基酸;其中X3為除Phe以外之任何胺基酸;其中X4為除Tyr以外之任何胺基酸;且其中X5為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,X4為Ala。在一些情況下,X5為Ala。在一些情況下,任何兩個、三個、四個或所有五個X1為Ala;X2為Ala;X3為Ala;X4為Ala;且/或X5為Ala。
(SEQ ID NO:141),其中X1為除His以外之任何胺基酸;其中X2為除Phe以外之任何胺基酸;且其中X3為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下,X1為Ala。在一些情況下,X2為Ala。在一些情況下,X3為Ala。在一些情況下,任何兩個或所有三個X1為Ala;X2為Ala;且/或X3為Ala。
7 IL-4及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-4或變異體IL-4多肽。野生型IL-4具有兩個同功型,亦即IL-4α及IL-4β,其皆結合至膜結合之IL-4受體(同功型1)或其可溶性對應物(同功型2)。
IL-4同功型1及同功型2皆結合至膜結合之IL-4受體(IL-4R)及/或其可溶性同功型2。膜結合之IL-4可具有序列 (SEQ ID NO:32),NCBI參考序列NP_000409.1,其中aas 26至825形成成熟多肽,且aas 233-256為跨膜區;蛋白質之胞外域可用於判定與IL-4同功型1或2之結合親和力。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之胺基酸序列的IL-4多肽之結合親和力相比,變異體IL-4同功型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31之變異體)對SEQ ID NO:32中列出之成熟IL-4受體序列或其胞外域、或SEQ ID NO:33中列出之可溶性IL-4受體之結合親和力呈現出減
小。舉例而言,在一些情況下,變異體IL-4同功型1或2多肽結合SEQ ID NO:32(或其胞外域)或SEQ ID NO:33中列出之成熟IL-4受體之結合親和力比包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之胺基酸序列的IL-4同功型1或2多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-4同功型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31之變異體)對SEQ ID NO:32(或其胞外域)或SEQ ID NO:33中列出之成熟IL-4受體具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-4同功型1或2多肽(例如,SEQ ID NO:29或31之變異體)對SEQ ID NO:32(或其胞外域)或SEQ ID NO:33中列出之成熟IL-4受體具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有單個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或
2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中列出之IL-4同功型1或2之胺基酸序列相比,變異體IL-4同功型1或2多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-4同功型1或2多肽序列包括與SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少80個連續aa(例如至少100或110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
8 IL-6及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-6或變異體IL-6多肽。野生型IL-6結合至包含α及β(gp130)次單元之IL-6受體,該次單元形成具有IL-6分子及各次單元的兩個三聚體之訊息傳導六聚體。參見例如Lacroix等人,J.Biol.Chem.290(45)26943-953(2015)。
IL-6結合至膜結合之IL-6受體,該受體包含α及β次單元。人類IL-6R
α次單元可具有序列 (SEQ ID NO:36),NCBI Ref.Seq:NP_000556.1,其中aas 26至825形成成熟多肽,並且aas 233-256為跨膜區。結合IL-6之後,IL6 α次單元結合IL-6 β次單元。
作為IL-6結合至膜結合之IL-6R α次單元之一替代方案,其可結合
具有以下序列的成熟可溶性形式之IL-6R α次單元: (SEQ ID NO:38),其中成熟肽包含aas 20至468,UniProtKB-P08887.1。可溶性次單元可替代膜結合之IL-6Rα次單元並且可用於結合親和力檢定。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:35中列出之胺基酸序列的IL-6多肽之結合親和力相比,變異體IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35之變異體)對SEQ ID NO:36及37或SEQ ID NO:37及38中列出之成熟IL-6受體之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,變異體IL-6多肽結合SEQ ID NO:36及37或SEQ ID NO:37及38中列出之成熟IL-6受體之結合親和力比包含SEQ ID NO:35中列出之胺基酸序列的IL-6多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35之變異體)對SEQ ID NO:36及37或SEQ ID NO:37及38中列出之成熟IL-6受體具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35之變異體)對SEQ ID NO:36及37或SEQ ID NO:37及38中列出之成熟IL-6受體具有之親和力為100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-6多肽(例如,SEQ ID NO:35之變異體)對SEQ ID NO:36及37或SEQ ID NO:37及38中列出之成熟IL-6受體具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM
至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有單個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有2個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,變異體IL-6多肽與SEQ ID NO:35中列出之IL-6胺基酸序列相比具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-6多肽序列包括與SEQ ID NO:35(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少80個連續aa(例如至少100或110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
9 IL-7及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-7或變異體IL-7多肽。野生型IL-7具有四個同功型,其全部結合至膜結合之IL-7受體,該受體具有兩個次單元,亦即阿爾法(α)及共用伽瑪(共用-γ)鏈。
IL-7受體α次單元可具有序列: (SEQ ID NO:47),NCBI參考序列NP_002176.2,其中aas 21至459形成成熟多肽,並且aas 240-264為跨膜區。蛋白質之受體次單元之全部或一部分(例如,胞外域(aas 21-239)可與IL-7受體γ次單元一起用於測定與IL-7同功型之結合親和力。
共用γ次單元(IL-7RG或IL-R7γ)可具有序列 (SEQ ID NO:48),其中aas 23至369形成成熟多肽,並且aas 263-283為跨膜區。蛋白質之受體次單元之全部或一部分(例如,胞外域(aas 23-262)可與α次單元一起用於測定與IL-7之結合親和力。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之胺基酸序列的IL-7多肽之結合親和力相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽(例如SEQ ID NO:40、42、44或46)對成熟IL-7受體序列(例如,包含SEQ ID NO:47及48中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-7受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽結合包含SEQ ID NO:47及48中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-7受體之結合親和力比包含SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之胺基酸序列的IL-7同功型1、2、3或4多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽(例如SEQ ID NO:40、42、44或46之變異體)與包含SEQ ID NO:47及48中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-7受體具有之結合親和力為1nM至1mM。在一些情況下,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽(例如SEQ ID NO:40、42、44或46之變異體)與包含SEQ ID NO:47及48中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞
外域的成熟IL-7受體具有之結合親和力為100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽對包含SEQ ID NO:47及48中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的成熟IL-7受體具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有單個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與在SEQ ID NO:40、42、44或46中列出之IL-7同功型1、2、3或4胺基酸序列相比,變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-7同功型1、2、3或4多肽序列包括與SEQ ID NO:40、42、44或46(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
10 IL-10及其變異體
作為一非限制性實例,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD或變異體MOD為IL-10或變異體IL-10多肽,諸如在D與E螺旋之間的鉸鏈區中具有插入之單體IL-10變異體,如由Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)所述。野生型IL-10具有同功型,其全部結合至膜結合之IL-10受體,該受體具有兩個阿爾法(α)IL-10RA及貝他(β)IL-10RB次單元。受體以四聚體形式存在於細胞(例如,B細胞、T細胞、NK細胞、肥大細胞及樹突狀細胞)之表面上。
IL-10多肽可包含介於IL-10多肽之D與E螺旋之間的鉸鏈區中之插入(例如,與SEQ ID NO:51之E48、N49、K50或S51中之任一者相鄰或在SEQ ID NO:49或50之等效位置處之5-7個aa插入),該插入使得其呈單體形式。單體IL-10多肽可包含介於SEQ ID NO:51之N49與K50之間(或SEQ ID NO:49或50之等效位置)的5-7個aa插入。在實例中,5-7個胺基酸包含Ala、Gly及/或Ser。在一實例中,5-7個胺基酸選自Ala或Ser。在一實例中,5-7個aas選自Gly及Ser。在一實例中,插入包含介於SEQ ID NO:51之N49與K50之間(或SEQ ID NO:49或50之等效位置)的IL-10M1 aa插入(GGGGSGGGSEQ ID NO:142)。在一實例中,IL-10變異體由插入SEQ ID NO:51之aa 49與50之間的IL-10M1(SEQ ID NO:189)GGGSGG組成。參見例如Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)。
IL-10受體α次單元可具有序列:
(SEQ ID NO:52),NCBI參考序列NP_001549.2,其中aas 21至587形成成熟多肽,並且aas 236-256為跨膜區。蛋白質之受體次單元之全部或一部分(例如,胞外域(aas 21-235)可與IL-10受體β次單元一起用於測定與IL-10同功型之結合親和力。
IL-10受體β次單元可具有序列
(SEQ ID NO:53),其中aas 20至325形成成熟多肽,並且aas 221-242為跨膜區。蛋白質之受體次單元之全部或一部分(例如,胞外域(aas 20-220)可與α次單元一起用於測定與IL-10之結合親和力。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:50或51中列出之胺基酸序列的IL-10多肽之結合親和力相比,變異體IL-10同功型多肽(例如,SEQ ID NO:50、51之變異體、或在如上所述之D與E螺旋之間的鉸鏈中帶有5-7個aa插入之彼等序列的單體IL-10變異體)對成熟IL-10受體序列(例如,包含SEQ ID NO:52或53中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-10受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,IL-10多肽之變異體(例如,SEQ ID NO:50或51之變異體)結合包含SEQ ID NO:52及53中列出之多肽之全部或一部分諸如其
胞外域的IL-10受體之結合親和力比IL-10同功型(例如,SEQ ID NO:50或51)與包含SEQ ID NO:52或53中列出之多肽之全部或一部分(諸如其胞外域)的IL-10受體之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51之變異體,其可包含介於D與E螺旋之間的鉸鏈區中之上述插入中之一者)對IL-10受體(例如,包含SEQ ID NO:52及53中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。在一些情況下,變異體IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51之變異體)對成熟IL-10受體(例如,包含SEQ ID NO:52及53中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-10多肽(例如,SEQ ID NO:50或51之變異體)對成熟IL-10受體(例如,包含SEQ ID NO:52及53中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有單個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有2個aa至10個aa取代。
在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有9個aa或10個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:50或51中列出之IL-10多肽序列相比,變異體IL-10多肽具有1-10個aa取代,並且包含介於D與E螺旋之間的鉸鏈區中之5-7個aa取代(例如,SEQ ID NO:50之K49及N50)。
合適的變異體IL-10多肽序列包括與SEQ ID NO:50或51(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160個)連續aa具有至少80%、至少85%、至少90%.、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
11 IL-15及其變異體
在一些情況下,存在於本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD為IL-15多肽。IL-15多肽之序列在此項技術中為已知的,包括藉由產生不同前驅物蛋白之選擇性剪接形成之兩個同功型。在一實施例中,wt.IL-15
多肽具有序列: (SEQ ID NO.54),UniProtKB-P40933,NCBI Ref.NP_000576.1,IL-15前蛋白,其中aa 1至29為訊息肽,並且30-48為原肽。
IL-15在結構上類似於IL-2並且經由具有與IL-2受體相同β及γ鏈但具有不同IL-15受體α(IL-15Rα)次單元之細胞表面三聚體受體進行訊息傳導。
人類IL-15Rα同功型1前驅物蛋白之胺基酸序列可為 (SEQ ID NO:56)NCBI RefNP_002180,其中aas 1-30形成訊息序列,並且aas肽31-267為成熟多肽。IL-2Rβ及IL-2Rγ之序列提供為SEQ ID NO:11及12。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:55中列出之胺基酸序列之IL-15多肽之結合親和力相比,變異體IL-15同功型1多肽(例如SEQ ID NO:55之變異體)對成熟IL-15受體序列(例如,包含SEQ ID NO:11、12及56中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-15受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,IL-15多肽之變異體(例如,SEQ ID NO:55之變異體)結合包含SEQ ID NO:11、12及56中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-15受體之結合親和力比包含SEQ ID NO:55中列出之胺基酸序列的IL-15多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55之變異體)對包含SEQ ID NO:11、12及56中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-15受體具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55之變異體)對包含SEQ ID NO:11、12及56中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的成熟IL-15受體具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55之變異體)具有單個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽(例如,SEQ ID NO:55之變異體)具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:55中列出之IL-15多肽序列相比,變異體IL-15多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-15多肽序列包括與SEQ ID NO:55(並且其具有至少
一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
12 IL-21及其變異體
在一些情況下,存在於本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD為IL-21多肽。IL-21多肽之序列在此項技術中為已知的,包括藉由產生不同前驅物蛋白之選擇性剪接形成之兩個同功型。
在一實施例中,野生型(wt.)IL-21同功型1多肽具有序列
(SEQ ID NO:57),UniProtKB-Q9HBE4,NCBI Ref.NP_068575.1,IL-21蛋白,其中aa 1至29為訊息肽。
IL-21經由具有與IL-2受體相同γ鏈但具有不同IL-21R受體次單元之二聚體細胞表面受體進行訊息傳導。人類IL-21R同功型1前驅物蛋白之aa序列可為
(SEQ ID NO:61)NCBI參考序列NP_068570.1,其中aas 1-19形成訊息序列,aas 20-538為成熟多肽,aas 233..253為跨膜域,並且aas 20-232為胞外域。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:58或60中列出之胺基酸序列的wt.IL-21多肽之結合親和力相比,變異體IL-21多肽對成熟IL-21受體序列(例如,包含SEQ ID NO:12及61中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-21受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,包含SEQ ID NO:58或60之IL-21多肽之變異體結合包含SEQ ID NO:12及61中列出之多肽之全部或
一部分諸如其胞外域的IL-21受體之結合親和力比包含SEQ ID NO:58或60中列出之胺基酸序列的wt.IL-21多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60之變異體)對IL-21受體(例如,包含SEQ ID NO:12及61中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。在一些情況下,變異體IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60之變異體)對成熟IL-21受體之全部或一部分(例如,包含SEQ ID NO:12及61中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為100nM至100μM(例如,100nM至1μM、1μM至10μM、或10μM至100μM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60之變異體)對IL-21受體之全部或一部分(例如,包含SEQ ID NO:12及61中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60之變異體)具有單個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽(例如,SEQ ID NO:58或60之變異體)具有2個aa至10個aa取代。
在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:58或60中列出之IL-21多肽序列相比,變異體IL-21多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的IL-21多肽序列包括與SEQ ID NO:58或60(並且其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
13 IL-23及其變異體
在一些情況下,存在於本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的MOD為IL-23多肽。IL-23為由IL-23A(IL-23p19)次單元及IL-12B(IL-12p40)次單元(其與IL-12共用)構成之異二聚體細胞介素。
IL-23經由二聚體細胞表面受體進行訊息傳導,該受體包含IL-23受體多肽(IL-23R)及其與IL-12受體共有之稱為12RB1或12Rβ1的次單元。
IL-23R同功型1前驅物蛋白序列可為: (SEQ ID NO:66)NCBI參考序列NP_653302.2,其中aas 1-23形成訊息序列,aas 24-629為成熟多肽,aas 356至376為跨膜域,並且aas 24-355為胞外域。
12RB1同功型1前驅物蛋白aa序列可為: (SEQ ID NO:67)NCBI參考序列NP_005526.1,其中aas 1-23形成訊息序列,aas 24-662為成熟多肽,aas 546至570為跨膜域,並且aas 24-545為胞外域。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:63或65中列出之胺基酸序列的IL-23多肽之結合親和力相比,變異體IL-23(例如包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)多肽對成熟IL-23受體序列(例如,包含SEQ ID NO:66及67中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的IL-23受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,IL-23多肽之變異體(例如,包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)結合IL-23受體(例如,包含SEQ ID NO:66及67中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)之結合親和力比包含SEQ ID NO:63或65中列出之胺基酸序列的IL-23多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)對IL-23受體(例如,包含SEQ ID NO:66及67中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)對成熟IL-23受體(例如,包含SEQ ID NO:66及67中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400
nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)具有單個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽(例如,包含SEQ ID NO:63及/或65之變異體)具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:63及/或65中列出之IL-23多肽序列相比,變異體IL-23多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體IL-23多肽序列包括與SEQ ID NO:63及/或65(並且其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160、至少180、至少200、至少220、至少240、至少260、至少280、至少300、至少320或至少340個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
14 Fas配位體(FasL)及其變異體
在一些情況下,存在於本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物
中的MOD為Fas配位體(FasL)。FasL為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族中之同聚體II型跨膜蛋白。FasL藉由靶細胞中之Fas受體之三聚化進行訊息傳導,其形成導致靶細胞之細胞凋亡的死亡誘導複合物。可溶性FasL由基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)在保守部位處使膜結合之FasL裂解而產生。
在一實施例中,wt.智人FasL蛋白具有序列
(SEQ ID NO:143),NCBI參考序列NP_000630.1,UniProtKB-P48023,其中殘基1-80為細胞質的,810102為跨膜域並且aas 103-281為細胞外(胞外域)。
Fas受體可具有序列
(SEQ ID NO:145)NCBI參考序列:NP_000034.1,UniProtKB-P25445,其中aas 26-173形成胞外域(細胞外域),aas 174-190形成跨膜域,並且191-335為細胞質域。胞外域可用於測定與FasL之結合親和力。
在一些情況下,與包含SEQ ID NO:144中列出之胺基酸序列的FasL多肽之結合親和力相比,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO144之變異體)對成熟Fas受體序列(例如,包含多肽SEQ ID NO:145中列出之多肽之全部或一部分諸如其胞外域的FasL受體)之結合親和力呈現出減小。例如,在一些情況下,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144之變異體)結合Fas受體(例如,包含SEQ ID NO:145中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)之結合親和力比包含SEQ ID NO:144中列出之胺基酸序列的FasL多肽之結合親和力小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144之變異體)對Fas受體(例如,包含SEQ IDNO:145中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為1nM至1mM(例如,1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM、或100μM至1mM)。作為另一實例,在一些情況下,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144之變異體)對成熟Fas受體(例如,包含SEQ ID NO:145中列出之多肽之全部或一部分,諸如其胞外域)具有之結合親和力為約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、
約10μM至約20μM、約20μM至約30μM、約30μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144之變異體)具有單個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽(例如,包含SEQ ID NO:144之變異體)具有2個aa至10個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽具有2個aa取代。在一些情況下,與SEQ IDNO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽具有3個aa或4個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽具有5個aa或6個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽具有7個aa或8個aa取代。在一些情況下,與SEQ ID NO:144中列出之FasL多肽序列相比,變異體FasL多肽具有9個aa或10個aa取代。
合適的變異體FasL多肽序列包括與SEQ ID NO:144(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160或至少180個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
E.支架
支架多肽尤其充當結構元件,提供經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之其他組分加以組織之構架(參見,例如,圖1,結構A,具有IgFc支架)。當掩蔽TGF-β多肽之多肽序列與TGF-β多肽反式定位(在複合物之不同多肽上)時,形成種間及非種間雙鏈體(或高階結構)之支架序列可保持與TGF-β多肽締合之掩蔽多肽序列,甚至在複合物呈打開形式並且TGF-β多肽序列可用於與其他分
子相互作用(不與掩蔽序列直接接觸)期間亦如此。視支架性質而定,其亦可充當組織元件,在蛋白質折疊及二聚化或多聚化(例如,經由二聚化序列完成之同二聚化或異二聚化)方面提供高階結構。支架亦可促成血清穩定性,尤其當其為免疫球蛋白重鏈恆定區(例如,Ig Fc)時。合適的支架多肽在一些情況下為半衰期延長之多肽。在一些情況下,與具有擁有不同、非免疫球蛋白序列之支架多肽的對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物相比,合適的支架多肽使經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之活體內半衰期(例如,血清半衰期)增加了至少約10%、至少約15%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或大於100倍。舉例而言,在一些情況下,與具有藉由連接子(例如,相等序列長度之GGGS aa重複序列)置換之Ig Fc多肽序列的對照經掩蔽之TGF-β構築體或複合物相比,Ig Fc多肽序列(例如,包括種間Ig序列,諸如杵臼序列對)增加經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之穩定性及/或活體內半衰期(例如,血清半衰期)。活體內半衰期之增加可為至少約10%、至少約15%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或大於100倍。當Ig Fc多肽用於經掩蔽之TGF-β構築體中時,Ig Fc可含有防止自發形成經掩蔽之TGF-β構築體之二聚體的突變(參見,例如,Tianlei Ying等人,J.Biol.Chem,287(23),第19399-19408頁(2012年6月1日)),並且另外可包括實質上減弱或消除Ig多肽例如經由補體依賴性細胞毒性(CDC)及/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來誘導細胞溶解之能力的突變(例如,以下論述之LALA突變)。
當經掩蔽之TGF-β構築體之支架多肽序列包含允許支架與其他支架分子相互作用(特異性結合)之一或多個序列時,經掩蔽之TGF-β構築體可形成同二聚體複合物(參見,例如,圖1,結構B)或異二聚體複合物(參見,例如,圖1,結構C-F)。經掩蔽之TGF-β構築體亦可包含允許支架與其他支架分子相互作用
(特異性結合)以形成高階結構的一或多個aa序列。形成高階多聚體結構之序列允許形成高階經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,三聚體、四聚體、五聚體等)。舉例而言,包含IgM Fc區(例如,SEQ ID NO:83)之支架多肽允許形成五聚體(尤其在亦表現j鏈序列時,例如SEQ ID NO:84)或六聚體掩蔽之TGF-β構築體或複合物。Petrui等人,Med Hypotheses.77(6):959-61(2011)。呈同及異二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等形式的經掩蔽之TGF-β構築體係稱為經掩蔽之TGF-β複合物。
當需要使經掩蔽之TGF-β與一或多個其他多肽序列(諸如一或多個特異性MOD或MOD之拷貝)在一起時,支架多肽序列可包含種間二聚化序列,該等序列傾向於與其對應種間結合(二聚化)序列形成異二聚體。在一些實例中,種間結合序列可形成同二聚體,但優先與其對應種間結合序列二聚化(更強地結合)。因此,在將種間二聚化序列及其對應種間結合序列併入一對多肽中時,可(傾向於)形成特異性異二聚體。舉例而言,當將種間二聚化序列及其對應物併入一對多肽中以選擇性形成異二聚體時,大於60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之等莫耳肽混合物參與異二聚體形成,且肽之其餘部分以單體或同二聚體形式存在。
以足夠親和力彼此或本身特異性結合之多種aa序列可用作經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之二聚化序列(參見,例如美國專利公開案第2003/0138440號)。序列可具有相對緊湊尺寸(例如小於約300、250、225、200、175、150、125、100、75或50個aa)。二聚化/多聚化序列包括但不限於:免疫球蛋白重鏈恆定區(Ig Fc)多肽序列(包含免疫球蛋白之CH2-CH3區之序列;參見,例如,圖2A-2H及SEQ ID NO:68至83);Fc杵臼序列(例如,SEQ ID NO:77及78);凝集素家族之多肽(例如,ACRP30或ACRP30樣蛋白),其含有由膠原蛋白重複序列Gly-Xaa-Yaa組成之膠原蛋白域;捲曲螺旋域;白胺酸-拉鍊域;
Fos/Jun結合對;Ig重鏈區1(CH1)及輕鏈恆定區CL序列(CH1/CL對,諸如與κ或λ Ig輕鏈恆定區序列配對之CH1序列)。
在一些實施例中,支架多肽序列包含免疫球蛋白重鏈恆定區(CH2-CH3)多肽序列,其充當二聚化或多聚化序列(參見,例如,圖2A-2H及SEQ ID NO:68至83)。在實施例中,Ig多肽實質上不例如經由補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)及/或抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)之活化來誘導細胞溶解,且因此可包括實質上減弱或消除Ig多肽誘導細胞溶解之能力的突變。在一些情況下,Fc序列與圖2A-2H描述之Fc區之aa序列具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性。此類免疫球蛋白序列可藉由形成一或兩個鏈間二硫鍵來使經掩蔽之TGF-β複合物之多肽共價地連接在一起。如下論述,可引入額外的二硫鍵來使二聚體穩定,尤其當使用一對種間Ig序列諸如杵臼多肽對時。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之支架多肽序列包含與圖2A描述之IgA Fc序列(SEQ ID NO:68)之至少150個連續aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350個連續aas)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2B描述之IgD Fc序列(SEQ ID NO:69)之至少150個連續aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350個連續aas)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2C描述之IgE Fc序列(SEQ ID NO:70)之至少125個連續aas(至少150、至少175或至少200個連續aas)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、
至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與wt.IgG Fc多肽序列,諸如圖2D描述之IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71-78)之至少125個連續aas(至少150、至少175或至少200個連續aas)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2E描述之IgG2 Fc多肽序列(SEQ ID NO:79)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300個)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2F描述之IgG3 Fc序列(SEQ ID NO:80)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200或至少225個)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2G描述之IgG4 Fc序列(SEQ ID NO:81或82)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250個)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。在一實施例中,支架多肽序列包含與圖2H描述之IgM Fc多肽序列(SEQ ID NO:83)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250個)或所有aas具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。包含免疫球蛋白支架多肽序列(例如,圖2A-2H所述)的經掩蔽之TGF-β複合物之上述多肽可藉由在相鄰於其鉸鏈區之半胱胺酸之間形成一或兩個鏈間二硫鍵來共價地連接在一起。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列與圖2D描述之人類IgG1 Fc多肽具有至少約70%(例如,至少約
80%、90%、95%、98%、99%或或100%)aa序列一致性,並且包含用丙胺酸(N297A取代,或如圖2D,SEQ ID NO:74中編號之N77)取代之N297之取代。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(人類IgG1 Fc),用除天冬醯胺以外之aa的取代N297(圖2D描述之aa序列之N77)除外。N297處之取代導致碳水化合物修飾之移除並且與wt.蛋白相比,所產生之抗體序列具有減少之補體組分1q(「C1q」)結合,且因此,補體依賴性細胞毒性降低。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(人類IgG1 Fc),用除白胺酸以外之aa的L234之取代(圖2D描述之aa序列之L14)除外。IgG之較低鉸鏈區中之L234及其他aas(例如,aas 234-LLGGPS-239,其對應於SEQ ID NO:71之aas 14-19)牽涉於與Fcλ受體(FcλR)之結合,且因此,該位置處之突變減少與受體之結合(相對於wt.蛋白)。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(人類IgG1 Fc),用除白胺酸以外之aa的L235之取代(圖2D描述之aa序列之L15)除外。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(例如,wt.人類IgG1序列),其具有L234A及L235A(「LALA」)取代(對應於圖2D描述之wt.aa序列之位置14及15的位置;參見,例如,SEQ ID NO:75)。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(人類IgG1 Fc),其具有用除脯胺酸以外之aa的P331之取代(圖2D描述之aa序列之P111);在一些情況下,取代為P331S取代。P331處之取代,如同N297處之取代一樣,導致相對於wt.蛋白與C1q之結合減少,且因而,補體依賴性細胞毒性降低。例如用丙胺酸的D270、K322及/或P329之取代(對應於圖2D中之SEQ ID NO:71之D50、K122及P119)
可單獨或代替P331取代使用以減少與C1q之結合。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列為IgG1 Fc多肽,其包含L234A及/或L235A取代(圖2D描述之aa序列之L14及/或L15處的白胺酸經Ala之取代)。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D描述之aa序列(wt.人類IgG1 Fc),用除白胺酸以外之aas在L234及/或L235(圖2D描述之aa序列之L14及/或L15)處之取代及用除脯胺酸以外之aa的P331(圖2D描述之aa序列之P111)之取代除外。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含圖2D(人類IgG1 Fc)描述之「三重突變體」aa序列(SEQ ID NO:73),其包含L234F、L235E及P331S取代(對應於圖2D描述之aa序列之aa位置14、15及111)。
當需要經掩蔽之TGF-β複合物之兩個多肽之間的不對稱配對時,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架多肽之二聚化序列包含種間結合序列、基本上由種間結合序列組成、或由種間結合序列組成。種間結合序列有利於與其同源多肽序列形成異二聚體(亦即,種間序列及其對應種間序列),尤其是基於免疫球蛋白Fc序列變異體之彼等異二聚體。此類種間多肽序列包括沒有(KiH)或具有(KiH)s-s穩定化二硫鍵之杵臼、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s及A107序列。一個種間結合對包含IgG1之CH3域界面或其他免疫球蛋白之相應殘基中之T366Y及Y407T突變體對。參見Ridgway等人,Protein Engineering 9:7,617-621(1996)(取代係由Kabat等人.(1991)之EU編號方案指示)。第二種間結合對涉及藉由T366W取代形成杵,及在互補Fc序列上藉由三重取代T366S、L368A及Y407V形成臼。參見Xu等人mAbs 7:1,231-242(2015)。另一個種間結合對具有含有Y349C、T366S、L368A及Y407V取代之第一Fc多肽及含有S354C及T366W取代之第二Fc多肽(二硫鍵可在Y349C與S354C之間形成)。Brinkmann及Konthermann,mAbs 9:2,182-212(2015)。具有或
不具有杵臼修飾之Fc多肽序列可藉由在Fc多肽(例如,鉸鏈區二硫鍵)之間形成二硫鍵來穩定化。若干種間多肽結合序列概述於表1中,並且交叉引用如圖2D列出之wt.IgG1序列(SEQ ID NO:71)中出現的aa位置之編號,該編號在括號「{}」中示出。
表1係自Ha等人,Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)中修改而來。
*aa形成穩定二硫鍵。
除了表1中之種間序列對以外,種間「SEED」序列在種間序列之IgG1 CH3域中具有源自IgA之45個殘基並且在對應種間序列上之IgA CH3中具有源自IgG1之57個殘基。參見Ha等人,Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)。
在一實施例中,見於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的支架序列包含選自由以下組成之群的種間結合序列或其對應種間結合序列:杵臼(KiH);具有穩定二硫化物之杵臼(KiHs-s);HA-TF;ZW-1;7.8.60;DD-KK;EW-RVT;EW-RVTs-s;A107;或SEED序列。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含:含有具有T146W KiH----序列取代之IgG1支架的第一多肽及含有具有T146W、L148A及Y187V KiH序列取代之IgG1支架的第二多肽,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列。一個或兩個支架aa序列視情況在使用Kabat編號之以下一或多者處包含取代:L234及L235(例如,L234A/L235A「LALA」或L234F/L235E)、N297(例如,N297A)、P331(例如,P331S)、L351(例如,L351K)、T366(例如,T366S)、P395(例如,P395V)、F405(例如,F405R)、Y407(例如,Y407A)及K409(例如,K409Y)。彼等取代出現於SEQ ID NO:71之IgG1序列中的L14及L15(例如,L14A/L15A「LALA」或L14F/L15E)、N77(例如,N77A)、P111(例如,P111S)、L131(例如,L131K)、T146(例如,T146S)、P175(例如,P175V)、F185(例如,F185R)、Y187(例如,Y187A)及K189(例如,K189Y)處。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含:含有具有T146W KiH----序列取代之IgG1支架的第一多肽及含有具有T146S、L148A及Y187V KiH序列取代之IgG1支架的第二多肽,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個
連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。參見,例如圖2D SEQ ID NO:77及78,
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含T146W及S134C KiHs-s取代,並且在第二支架序列中包含T146S、L148A、Y187V及Y129C KiHs-s取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含S144H及F185A HA-TF取代,並且在第二支架序列中包含Y129T及T174F HA-TF取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含T130V、L131Y、F185A及Y187V ZW1取代,並且在第二支架序列中包含T130V、T146L、K172L及T174W ZW1取代,其中支架包含與SEQ ID
NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含K140D、D179M及Y187A 7.8.60取代,並且在第二支架序列中包含E125R、Q127R、T146V及K189V7.8.60取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二β多肽在第一支架序列中包含K189D及K172D DD-KK取代,並且在第二支架序列中包含D179K及E136K DD-KK取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G),
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含K140E及K189W EW-RVT取代,並且在第二支架序列中包含
Q127R、D179V及F185T EW-RVT取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含K140E、K189W及Y129C EW-RVTs-s取代,並且在第二支架序列中包含Q127R、D179V、F185T及S134C EW-RVTs-s取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含K150E及K189W A107取代,並且在第二支架序列中包含E137N、D179V及F185TA107取代,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或N77取代以藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。
作為使用免疫球蛋白重鏈恆定區作為支架之一替代方案,免疫球蛋
白輕鏈恆定區可與重鏈CH1序列配對作為二聚化序列,該等二聚化序列形成支架多肽序列或為其一部分。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含Ig CH1域(例如,SEQ ID NO:85之多肽),並且在第二支架序列中包含Ig κ鏈恆定區序列SEQ ID NO:86),其中支架包含分別與SEQ ID NO:85及/或86之至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個連續aas具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列。參見圖2J及2K。CH1及Ig κ序列可經修飾以增加它們彼此之親和力,且因此提高使用其作為二聚化序列所形成的任何異二聚體之穩定性。在提高CH1-Ig κ異二聚體之穩定性的取代之中為鑑別為MD13組合之取代,Chen等人,MAbs,8(4):761-774(2016)。在MD13中,將兩個取代引入CH1及Ig κ序列之各者中。CH1序列經修飾以含有S64E及S66V取代(圖2J示出之SEQ ID NO:85中之S70E及S72V)。Ig κ序列經修飾以含有S69L及T71S取代(圖2K示出之SEQ ID NO:86中之S68L及T70S)。
在另一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽在第一支架序列中包含Ig CH1域(例如,SEQ ID NO:85之多肽),並且在第二支架序列中包含Ig λ鏈恆定區序列SEQ ID NO:87),其中支架包含分別與SEQ ID NO:85及/或87之至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個連續aas具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列。參見圖2J及2K。
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽之支架多肽序列各自包含白胺酸拉鍊多肽作為二聚化序列。白胺酸拉鍊多肽彼此結合以形成二聚體(例如,同二聚體)。白胺酸-拉鍊多肽之非限制性實例包括例如以下aa序列中任一者之肽:RMKQIED-KIEEILS-KIYHIENEIARIKKLIGER(SEQ ID NO:88);LSSIEK-KQEEQTS-WLIWISNELTL-IRNELAQS(SEQ ID NO:89);LSSIE
KKLE-EITSQLIQIS-NELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:90;LSSIE-KKL-E--EITSQLIQIRNELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:91);LSSIEKKL-EEITSQLQQ-IRNELTLI-RNELAQ(SEQ ID NO:92);LSSLEKKLEEL-TSQLIQLRNELT-LLRNELAQ(SEQ ID NO:93);ISSLE-KKIEE-LTSQI-QQLRNEITLLRNEIAQ(SEQ ID NO:94)。在一些情況下,白胺酸拉鍊多肽包含以下aa序列:LEIEAAFLERENT-ALET-RVAE-LRR-VRLR-NRV-SYRT-RYGPLGGGK(SEQ ID NO:95)。額外的白胺酸-拉鍊多肽在此項技術中為已知的,其任一者適於用作支架或作為二聚化序列併入支架中。
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽之支架多肽序列各自包含形成二聚體(例如,同二聚體)之捲曲螺旋肽。捲曲螺旋多肽之非限制性實例包括例如以下aa序列中任一者之肽:LKSVENRLAVVENQLKT-VIEE-LK-TVKDLLSN(SEQ ID NO:96);LARIE-EKLKTIKAQLSEIASTLNMIREQLAQ(SEQ ID NO:97);VSRLE-EKVKT-LKSQV-TELAS-TVSLL-REQVAQ(SEQ ID NO:98);IQSEKKIEDI-SSLI-G-QIQSEITLIRNEIAQ(SEQ ID NO:99);LMSLE-KKLEE-LTQTLMQLQNELSMLKNELAQ(SEQ ID NO:100)。
在一些情況下,允許經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽之二聚化(同二聚化)的支架多肽序列各自包含具有可形成二硫鍵之至少一個半胱胺酸殘基的多肽序列。此類多肽序列之實例包括:人類FasL多肽VDLEGSTSNGRQ-CAGIRL(SEQ ID NO:101);EDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMA(SEQ ID NO:102);及GHDQE-TTTQG-PGVLL-PLPKGACTGQMA(SEQ ID NO:103)。
適合作為多聚化(低聚合化)序列之肽允許形成大於二聚體(例如,三聚體、四聚體、五聚體、六聚體等)之經掩蔽之TGF-β複合物,包括但不限於形成六聚體或五聚體之IgM恆定區(參見例如,圖2H)(尤其在與諸如圖2I中提供的缺少訊息序列之成熟j-鏈肽組合時)。亦可使用形成三聚體之膠原蛋白域。膠原蛋白域可包含(Gly-Xaa-Xaa)n,其中Xaa為任何aa,或且其中n為整數(例如,
10至40);其中Xaa及Yaa獨立地為任何aa並且n為10至40之整數。在Gly-Xaa-Yaa序列中,Xaa及Yaa通常在大於25%、50%、75%、80%、90%或95%之Gly-Xaa-Yaa中或在每次Gly-Xaa-Yaa出現時分別為脯胺酸及羥基脯胺酸。在一些情況下,膠原蛋白域包含序列(Gly-Xaa-Pro)n,其中n為整數(例如,10至40)。膠原蛋白低聚合肽可包含以下aa序列:VTAFSNMDDMLQKAHL-VIEGTFIYLRDSTEFFIRVRDGW-KKLQLGE-LIPIP-ADSPP-PP-AL-SSNP(SEQ ID NO:104)。
F. TGF-β多肽
如上所示,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含至少一個TGF-β多肽(例如,一或多個獨立選定之TGF-β多肽)。TGF-β多肽之胺基酸序列在此項技術中為已知的。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的TGF-β多肽為TGF-β1多肽。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的TGF-β多肽為TGF-β2多肽。在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的TGF-β多肽為TGF-β3多肽。
雖然TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3多肽序列可併入經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中,但多種因素可影響特定TGF-β多肽、及所使用之特定序列及aa取代的選擇。例如,TGF-β1及TGF-β3在許多哺乳動物細胞系統(例如,CHO細胞)中表現時經受其胺基酸序列之「截斷(clipping)」。另外,與對TβR2受體相比,二聚TGF-β(例如,TGF-β2)對TβR3(β聚醣受體)具有更高親和力,可導致生物活性經掩蔽之蛋白對於非訊息傳導TβR3分子之較大活體內池之脫靶結合及損失。為了最大限度地減少與TβR3之高親和力脫靶結合,可需要取代產生二聚體TGF-β分子之殘基,該等殘基由二硫鍵來連接。因此,半胱胺酸77(C77)可經除半胱胺酸以外之胺基酸(例如,形成C77S取代之絲胺酸)取代。
合適的TGF-β多肽可具有約70 aas至約125 aas之長度;例如,合適
的TGF-β多肽可具有約70 aas至約80 aas約80 aas至約90 aas;約90 aas至約100 aas;約100 aas至約105 aas、約105 aas至約110 aas、約110 aas至約112 aas、約113 aas至約120 aas、或約120 aas至約125 aas之長度。合適的TGF-β多肽可包含與成熟形式之人類TGF-β1多肽、人類TGF-β2多肽或人類TGF-β3多肽之至少80、至少90、至少100或至少110個連續aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列。
1 TGF-β1多肽
合適的TGF-β1多肽可包含與以下TGF-β1胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:105,112 aas長度);其中TGF-β1多肽具有約112 aas之長度。TGF-β1前原蛋白在圖3中提供為SEQ ID NO:106。胺基酸R25、C77、V92及R94呈粗體及斜體,參見圖4。
在一些情況下,合適的TGF-β1多肽包含C77S取代。因此,在一些情況下,合適的TGF-β1多肽包含與以下TGF-β1胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:107),其中胺基酸77為Ser。位置25、77、92及94呈粗體及斜體。
2 TGF-β2多肽
合適的TGF-β2多肽可包含與以下TGF-β2胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:108),其中TGF-β2多肽具有約112 aas之長度。TGF-β2前原蛋白在圖3中提供為SEQ ID NO:109。殘基Lys 25、Ile 92及/或Lys 94呈粗體及斜體。
在一些情況下,合適的TGF-β2多肽包含C77S取代。因此,在一些情況下,合適的TGF-β2多肽包含與以下TGF-β2胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO110),其中胺基酸77為Ser。
3 TGF-β3多肽
合適的TGF-β3多肽可包含與以下TGF-β3胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:111),其中TGF-β3多肽具有約112 aas之長度。TGF-β3同功型1前原蛋白在圖3中提供為SEQ ID NO:112。位
置25、92及94呈粗體及斜體。
在一些情況下,合適的TGF-β3多肽包含C77S取代。在一些情況下,合適的TGF-β3多肽包含與以下TGF-β3胺基酸序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或112 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列:
(SEQ ID NO:113),其中胺基酸77為Ser。位置25、92及94呈粗體及斜體。
4 額外的TGF-β多肽序列變異
除了改變TGF-β分子二聚化之序列變異(例如,半胱胺酸77取代,諸如C77S)以外,具有影響親和力及其他性質之序列變異的TGF-β1-3多肽亦可併入經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中。當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含對掩蔽多肽(例如TβR多肽,諸如TβRII多肽)具有減小之親和力的TGF-β變異體時,彼等組分更容易解離,使得經掩蔽之TGF-β多肽更可為細胞TβR蛋白所利用。因為TβRII蛋白通常為異質TβR訊息傳導複合物的與TGF-β相互作用之第一肽,所以與TβRII之相互作用有效地控制TGF-β進入活性訊息傳導複合物中。因此,控制TGF-β對TβRII之親和力的變異體有效地控制經掩蔽之TGF-β構築體及複合物進入活性訊息傳導複合物中。
本揭示案包括並且提供經掩蔽之TGF-β構築體及複合物,其包含(相對於沒有序列變異的在其他方面相同的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物)彼此具有改變(例如,減小)之親和力的變異體掩蔽TβR(例如,TβRII)多肽序列及/或變異體TGF-β多肽。TGF-β多肽與TβR(例如,TβRII)多肽之間的親和力可使用如上對於MOD及其共MOD所述之(BLI)來測定。
a.額外的TGF-β2序列變異體
本揭示案包括並且提供經掩蔽之TGF-β2構築體及複合物,其包含掩蔽TβR(例如,TβRII)多肽序列及wt.或變異體TGF-β2多肽;其中(相對於沒有序列變異的在其他方面相同之wt.TGF-β多肽序列)變異體多肽對掩蔽TβR具有減小之親和力。
本揭示案提供經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含掩蔽TβRII受體序列及變異體TGF-β2多肽,其對SEQ ID NO.108之至少100個連續aa具有大於85%(例如,大於90%、95%、98%或99%)序列一致性,並且包含減小變異體TGF-β2多肽對TβRII受體序列之親和力的取代。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含掩蔽TβRII多肽及變異體TGF-β(例如TGF-β2)多肽,其在Lys 25、Ile 92及/或Lys 94之一或多者、兩者或兩者以上或所有三者處包含取代(關於殘基之位置,參見SEQ ID NO:108,並且關於TGF-β1及TGF-β3中之相應殘基,參見圖4)。彼等aa殘基已顯示影響TGF-β2對TβRII多肽之親和力(參見Crescenzo等人,J.Mol.Biol.355:47-62(2006))。經掩蔽之TGF-β多肽視情況包含一或多個獨立選定之MOD諸如IL-2或其變異體。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含掩蔽TβRII多肽及在SEQ ID NO:108之位置25處具有除Lys或Arg以外之aa的TGF-β2多肽;並且視情況包含一或多個獨立選定之MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。具有掩蔽TβRII多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含在SEQ ID NO:108之位置92處具有除Ile或Val以外之aa(或位置92處之除Ile、Val或Leu以外之aa)的TGF-β2多肽;並且視情況包含一或多個獨立選定之MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。具有掩蔽TβRII多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含在SEQ ID NO:108之位置94處具有除Lys或Arg以外之aa的TGF-β2多肽;並且視情況包含一或多個獨立選定之
MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。具有掩蔽TβRII多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含在Lys 25、Ile 92及/或Lys 94之一或多者、兩者或兩者以上或所有三者處包含取代之TGF-β2多肽,並且進一步包含一或多個獨立選定之MOD。具有掩蔽TβRII多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含在Lys 25、Ile 92及/或Lys 94之一或多者、兩者或兩者以上或所有三者處包含取代之TGF-β2多肽,並且進一步包含一或多個獨立選定之IL-2 MOD或其親和力減小之變異體。
b.額外的TGF-β1及TGF-β3序列變異體
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含掩蔽TβRII多肽及變異體TGF-β1或TGF-β3多肽,其在對應於TGF-β2 SEQ ID NO:108中之Lys 25、Ile 92及/或Lys 94之一或多個、兩個或兩個以上或所有三個aa位置處包含取代。在TGF-β1或TGF-β3中,對應於Lys 25之aa為Arg 25,Ile 92為Val 92並且Lys 94為Arg 94,其各自為保守取代。關於TGF-β1,參見例如SEQ ID NO:106及107,並且關於TGF-β3,參見SEQ ID NO:112及113。
如上所示,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物視情況包含一或多個獨立選定之MOD諸如IL-2或其變異體。在一實例中,具有掩蔽TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含在位置25處具有除Arg或Lys以外之aa的TGF-β1或β3多肽;並且視情況包含一或多個獨立選定之MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。在一實例中,具有掩蔽TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含在位置92處具有除Val或Ile以外之aa(或在位置92處除Ile、Val或Leu以外之aa)的TGF-β1或β3多肽;並且視情況包含一或多個獨立選定之MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。在另一實例中,具有掩蔽TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含具有除Arg或Lys以外之aa的TGF-β2多肽;並且視情況包含一或多個獨立
選定之MOD(例如,一或多個IL-2 MOD多肽或其親和力減小之變異體)。在一特定實例中,具有掩蔽TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含在Arg 25、Val 92及/或Arg 94之一或多者、兩者或兩者以上或所有三者處包含取代的TGF-β1或β3多肽,並且進一步包含一或多個獨立選定之MOD。在另一特定實例中,具有掩蔽TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含在Arg 25、Val 92及/或Arg 94之一或多者、兩者或兩者以上或所有三者處包含取代的TGF-β1或β3多肽,並且進一步包含一或多個獨立選定之IL-2 MOD或其親和力減小之變異體。
G. TGF-β受體多肽及結合並掩蔽TGF-β之其他多肽
在上述TGF-β多肽或多肽複合物之任一者中,結合至並掩蔽TGF-β多肽之多肽(「掩蔽多肽」)可採用多種形式,包括TβRI、TβRII、TβRIII之片段及抗TGF-β抗體或其片段(例如,Fab、單鏈抗體等)。
1 TGF-β受體多肽
經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中TGF-β之掩蔽可藉由使用包含足以結合TGF-β多肽(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)之多肽序列的TGF-β受體片段(例如,TβRI、TβRII或TβRIII之胞外域序列)來完成。在一實施例中,掩蔽序列包含TβRI、TβRII或TβRIII胞外域之全部或一部分。
a. TGF-β受體I(TβRI)
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的多肽序列可源自TβRI(例如,同功型1 SEQ ID NO:114)並且可包含TβRI胞外域(aas 34-126)之全部或一部分。在一些情況下,用於掩蔽TGF-β之合適的TβRI多肽包含與以下TβRI胞外域aa序列之至少70、至少80、至少90、至少100或103 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:115)。
b. TGF-β受體II(TβRII)
在實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的多肽序列可源自TβRII(例如,同功型A SEQ ID NO:116),並且可包含TβRII胞外域序列(aas 24至177)之全部或一部分。在一實施例中,用於掩蔽TGF-β之合適的TβRII同功型A多肽可包含與以下TβRII同功型A胞外域aa序列之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少154 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:117)。對應於B同功型中之D118的天冬胺酸殘基之位置呈粗體、加下劃線且呈斜體。
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的多肽序列可源自TβRII同功型B SEQ ID NO:118)並且可包含TβRII胞外域序列(aas 24至166)之全部或一部分。在實施例中,用於掩蔽TGF-β之合適的TβRII同功型B多肽包含與TβRII同功型B胞外域aa序列之至少70、至少80、至少90、至少100或103aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列: (SEQ ID NO:119)。如下論述,
F30、D32、S52、E55或D118(斜體及粗體)中之任何一或多者可在彼等位置處經除天然存在之aa以外的胺基酸(例如,丙胺酸)取代。掩蔽TGF-β之多肽序列可包含帶有D118A或D118R取代之SEQ ID NO:119多肽。掩蔽TGF-β之序列可包含帶有D118A或D118R取代以及F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一或多者的SEQ ID NO:119肽。
雖然TβRII之胞外域可用作掩蔽多肽,但該蛋白質之區域具有帶電及疏水性區塊,其可產生不利的pI並且可對表現多肽之細胞有毒性。另外,將TβRII胞外域與活性TGF-β多肽組合可產生複合物,該複合物可與細胞表面TβRI組合並且導致該訊息傳導受體之激活(例如,經由Smad途徑進行訊息傳導)。藉由移除或改變涉及TβRI締合之序列來修飾用於掩蔽TGF-β之TβRII胞外域序列可避免細胞除了經由其自身細胞表面異二聚體TβRI/TβRII複合物以外由經掩蔽之TGF-β進行之無意刺激。TβRII之修飾亦可改變(例如,減小)TβRII對TGF-β(例如,TGF-β3)之親和力,由此允許控制TGF-β去掩蔽及其作為訊息傳導分子之可利用性。包含對TGF-β(例如,TGF-β3)具有最高親和力之TβR(例如,TβRII)肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物最緊密地掩蔽TGF-β序列並且需要更高劑量來達成相同效應。相比之下,TβRII中降低親和力之aa取代使TGF-β多肽去掩蔽並且在較低劑量下為生物有效的。參見例如實例3。
因此,當需要經由TβRI來阻斷/限制由經掩蔽之TGF-β多肽進行之訊息傳導及/或修改(例如,減小)掩蔽TβRII多肽對TGF-β之親和力時,對TβRII之許多更改可併入TβRII多肽序列中。可製造之修飾包括1至25 aa長度之N端25個胺基酸之上述缺失(例如△14,△25)及/或L27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118及/或E119中之一或多者之取代。造成TβRI與TβRII之締合減少及對TGF-β之親和力減小的一些特定修飾包括基於SEQ ID NO:119之以下任何一或多者:L27A、F30A、D32A、D32N、S49A、I50A、T51A、S52A、
S52L、I53A、E55A、V77A、D118A、D118R、E119A及/或E119Q。參見例如J.Groppe等人Mol Cell 29,157-168,(2008)及De Crescenzo等人JMB 355,47-62(2006)。關於彼等取代對TGF-β3-TβRII及TβRI-TβRII複合物之效應,參見圖X。TβRII之修飾包括N端△25缺失及/或F24處之取代(例如,F24A取代),其實質上或完全阻斷經由典型SMAD訊息傳導途徑之訊息。在一態樣中,成熟TβRII B同功型(SEQ ID NO:119)之位置118處的天冬胺酸(D118)係由除Asp或Glu以外之胺基酸諸如Ala置換,產生「D118A」取代,或由Arg置換,產生D118R取代。對應於D118之Asp殘基在SEQ ID NO.117-123中指示(在圖5B中,呈粗體並加下劃線)。1至25 aa長度之N端缺失(例如,△25缺失)及/或F24處之取代(例如,F24A取代)可與D118取代(例如,D118A或D118R)組合。1至25 aa長度之N端缺失(例如,△25缺失)及/或F24處之取代(例如,F24A取代)亦可與L27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118及/或E119(例如,D118A)取代中之任一者之取代及尤其對於上述SEQ ID NO:119中之彼等位置列舉的改變親和力之特定取代中之任一者組合。
TβRII多肽之N端之缺失亦可造成TβRI相互作用之喪失並且防止包含TβRII多肽之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物充當接合並激活TβRI訊息傳導的組成性活性複合物。TβRII多肽之14 aa缺失(△14)實質上減少蛋白質與TβRI之相互作用,並且TβRII之△25 aa缺失似乎完全消除與TβRI之相互作用。N端缺失亦實質上改變蛋白質之pI,其中△14 TβRII胞外域突變體呈現約4.5-5.0(例如,約4.74)之pI。因此,TGF-β構築體或複合物可包含具有諸如14至25 aas(例如,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 aa)之N端缺失的TβRII胞外域多肽(例如,SEQ ID NO:117或118之多肽)。可用於掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β多肽的經修飾之胞外域序列(包括限制與TβRI之相互作用的彼等序列)在以下段落中描述。
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含與TβRII同功型B胞外域序列之至少70、至少80、至少90、至少100或103 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的序列: (SEQ ID NO:120)。F30、D32、S52、E55或D118(斜體及粗體)中之任何一或多者可在彼等位置處經除天然存在之aa以外的胺基酸(例如,丙胺酸)取代。在一實施例中,掩蔽TGF-β之序列包含帶有D118A取代之SEQ ID NO:120肽。在一實施例中,掩蔽TGF-β之序列包含帶有D118A取代以及F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一或多者的SEQ ID NO:120多肽。
阻斷由於經掩蔽之TGF-β/TβRII複合物與TβRI相互作用引起之無意細胞訊息傳導的諸如14至25 aas(例如,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 aa)的TβRII之N端缺失之組合可與其他TβRII胞外域取代(包括在F30、D32、S52、E55及/或D118中之任何一或多者處之彼等取代)組合。缺失及取代之組合確保經掩蔽之TGF-β構築體或複合物不引起細胞訊息傳導,經由細胞之膜結合TβRI及TβRII受體的除外。
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含與TβRII同功型B胞外域序列之至少70、至少80、至少90、至少100或103 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的序列: (SEQ ID NO:121),其具有aas 1-14(△14)缺失。F30、D32、S52、E55或D118(斜體及
粗體)中之任何一或多者可在彼等位置處經除天然存在之aa以外的胺基酸(例如,丙胺酸)取代。在一實施例中,掩蔽TGF-β之序列包含帶有D118A取代之SEQ ID NO:120肽。在一實施例中,掩蔽TGF-β之序列包含帶有D118A取代以及F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一或多者的SEQ ID NO:121多肽。
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含與以下序列之至少70、至少80、至少90、至少100或103 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的序列: (SEQ ID NO:122),其具有aas 1-25(△25)缺失。F30、D32、S52、E55或D118(斜體及粗體)中之任何一或多者可在彼等位置處經除天然存在之aa以外的胺基酸(例如,丙胺酸)取代。在一實施例中,掩蔽TGF-β之序列包含帶有D118A取代之SEQ ID NO:122多肽(在圖5B中顯示為SEQ ID NO:123)。在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含帶有D118A取代以及F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一或多者的SEQ ID NO:122肽。在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含(參見圖5B)帶有D118A及F30A取代之SEQ ID NO:122肽。在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含(參見圖5B)帶有D118A及D32N取代之SEQ ID NO:122肽。在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含(參見圖5B)帶有D118A及S52L取代之SEQ ID NO:122肽。在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的序列包含(參見圖5B)帶有D118A及E55A之SEQ ID NO:122肽。
c. TGF-β受體III(TβRIII)
在一實施例中,掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β的多肽序列可源自TβRIII(例如,同功型A SEQ ID NO:124及同功型B 125),並且可包含TβRIII胞外域(A同功型之aas 27-787或B同功型之27-786)之全部或一部分。在一些情況下,用於掩蔽TGF-β之合適的TβRIII多肽包含與TβRIII A同功型或B同功型胞外域序列之至少70、至少80、至少90、至少100或120 aas具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% aa序列一致性的胺基酸序列(例如,在圖5C中提供為SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125)。
2 抗體
雖然TGF-β受體多肽(例如,胞外域序列)可用於結合並掩蔽經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之TGF-β多肽,但結合至TGF-β序列之其他多肽序列(蛋白質序列)亦可用作掩蔽多肽。在可用於掩蔽TGF-β之合適多肽或蛋白質序列之中為對TGF-β具有親和力之抗體(例如,對TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中之一或多者具有特異性之抗體)或其片段、對TGF-β多肽具有親和力之奈米抗體以及尤其是單鏈抗TGF-β抗體(例如,其中之任一者可經人源化)。已描述結合並中和TGF-β之一些抗體,包括scFV抗體。參見例如US 9,090,685。在本揭示案描述之本發明之實施例及/或態樣中,用於掩蔽TGF-β多肽之TβR(例如,TβRII)序列可用對TGF-β多肽具有親和力之掩蔽抗體序列(例如,scFV或奈米抗體)置換。例如,在其中TGF-β受體序列用於掩蔽TGF-β多肽的圖1之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的各者中,受體多肽可用對TGF-β多肽具有親和力之掩蔽抗體多肽(例如,scFV或奈米抗體)置換。
使用抗體(例如,單鏈抗體)作為掩蔽多肽之一潛在優勢為將其限於待掩蔽之TGF-β多肽之同功型之能力。舉例而言,基於針對TGF-β1之美替木單抗(Metelimumab;CAT192)的單鏈抗體序列(例如,Lord等人,mAbs 10(3):444-452
(2018))可用於掩蔽存在於TGF-β構築體或複合物中之該TGF-β同功型。在另一實施例中,對TGF-β2具有特異性之單鏈抗體序列用於掩蔽存在於TGF-β構築體或複合物中之該TGF-β同功型。在另一實施例中,對TGF-β3具有特異性之單鏈抗體序列用於掩蔽存在於TGF-β構築體或複合物中之該TGF-β同功型。單鏈抗體亦可對TGF-β同功型之組合具有特異性(例如,出現在選自由以下組成之群的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的胞外域序列:TGF-β1及TGF-β2;TGF-β1及TGF-β3;以及TGF-β2及TGF-β3。單鏈抗體亦可對出現在經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的TGF-β1、TGF-β3及TGF-β3胞外域序列具有泛特異性,參見例如WO2014/164709。對TGF-β同功型具有所需特異性及親和力之抗體及單鏈抗體可藉由多種方法製備,包括篩檢融合瘤及/或對靶TGF-β多肽序列具有親和力的抗體之可變區序列之修飾(例如,組合修飾)。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含單鏈抗體以掩蔽TGF-β序列(例如,TGF-β3序列)。在一此類實施例中,單鏈胺基酸序列對包含C77S取代之SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3(參見SEQ ID NO:112)具有特異性。
H.連接子
如上所示,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包括插入經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之任何兩個元件之間的連接子肽/多肽序列。雖然使用術語「連接子」,但以下描述為連接子之相同序列亦可安置在經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之多肽之N端及/或C端以便例如防止蛋白水解降解。
合適的連接子(亦被稱為「分隔物」)可易於選擇並且可為許多合適長度中之任一者,諸如1 aa至25 aa、3 aa至20 aa、2 aa至15 aa、3 aa至12 aa、4 aa至10 aa、5 aa至9 aa、6 aa至8 aa、或7 aa至8 aa。合適的連接子之長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24或25 aa。合適的連接子之長度可為25至35 aa。合適的連接子之長度可為25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35 aa。合適的連接子之長度亦可為35至45 aa。合適的連接子之長度可為35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45 aa。合適的連接子之長度可為45至50 aa。合適的連接子之長度可為45、46、47、48、49或50 aa。
示範性連接子包括包含甘胺酸之彼等連接子,或含有約2至約50(例如,2-4、4-7、7-10、10-20、20-35或35-50)個連續甘胺酸殘基之序列的聚甘胺酸;甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括,例如,(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:126)及(GGGS)n(SEQ ID NO:127),其中n為至少1之整數(例如,1-10、10-20或20-30);甘胺酸-丙胺酸聚合物或丙胺酸-絲胺酸聚合物(例如,具有1-10、10-20或20-30 aa之長度);以及在此項技術中已知之其他可撓性連接子。可使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物;Gly及Ser皆相對未結構化,且因此可充當組分之間的中性連接物。可使用甘胺酸聚合物;甘胺酸甚至比丙胺酸顯著更易進入phi-psi空間,且比具有更長側鏈之殘基受限少得多(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示範性連接子可包含胺基酸序列,包括但不限於GGSG(SEQ ID NO:128)、GGSGG(SEQ ID NO:129)、GSGSG(SEQ ID NO:130)、GSGGG(SEQ ID NO:131)、GGGSG(SEQ ID NO:132)、GSSSG(SEQ ID NO:133)及其類似序列。示範性連接子可包含例如可重複2、3、4、5、6、7、8、9或10次之GGSG(SEQ ID NO:134)。在一些情況下,連接子包含可重複2、3或4次之胺基酸序列(GSSSS)(SEQ ID NO:135)。在一些情況下,連接子包含重複四或五次之胺基酸序列(GSSSS)(SEQ ID NO:135)。示範性連接子可包括例如可重複2、3、4、5、6、7、8、9或10次之(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情況下,連接子包含重複一次或2次之胺基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情況下,連接子包含重複3或4次之胺基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情況下,連接
子包含重複5、6或7次之胺基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。在一些情況下,連接子包含重複8、9或10次之胺基酸序列(GGGGS)(SEQ ID NO:136)。
在一些情況下,存在於經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽中的連接子多肽包含可與存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第二多肽中的半胱胺酸殘基形成二硫鍵之半胱胺酸殘基。在一些情況下,例如,合適的連接子包含胺基酸序列G C GASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:137)。
I.示範性經掩蔽之TGF-β構築體及複合物
如以上論述,在本揭示案中描述的經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之任一者中,結合至並掩蔽TGF-β多肽序列之掩蔽多肽可採用多種形式。掩蔽肽可為抗體,抗體之結合片段、單鏈抗體或其結合TGF-β之部分(例如,scFv)、或奈米抗體;其中之任一者可經人源化。掩蔽多肽亦可為TGF-β受體片段(例如,TβRI、TβRII或TβRIII之胞外域序列),其包含足以結合TGF-β多肽(例如,TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)之多肽序列。
在上述經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之任一者中,所使用之TGF-β多肽序列可基於TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。在一實施例中,TGF-β多肽包含TGF-β3序列。在經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中並不需要全長成熟TGF-β蛋白序列,僅需要與細胞表面TβRII相互作用並且允許與細胞表面TβRII的經掩蔽之TGF-β複合物募集TβRI並由此啟始訊息傳導(例如經由Smad及非Smad途徑之訊息傳導)的TGF-β之部分。
雖然免疫調節多肽(MOD)並非遞送經掩蔽之TGF-β或其如以上所示激活帶有TβRI及TβRII之細胞的能力所需的,MOD之存在可實質上影響TGF-β細胞活化之結果。因此,將MOD併入任何上述經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中可用於驅動由於使用本文所述的經掩蔽之TGF-β構築體及複合物所產生之各種結果,包括治療結果。在一實施例中,存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複
合物中的MOD選自由以下組成之群:PD-L1、Fas-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-21、IL-23及其任一者之變異體,包括對其共MOD具有減小之親和力的彼等變異體。
雖然可需要將MOD併入經掩蔽之TGF-β構築體及複合物中,但其存在在所有情況下並非必需的,尤其當經掩蔽之TGF-β構築體及複合物與其他材料一起投與時,包括細胞介素(例如,一或多種獨立選定之介白素、淋巴因子、干擾素、趨化因子及/或腫瘤壞死因子)。例如,當需要藉由促進胸腺細胞表現介白素7受體(例如,IL-7Ra)來支援習知CD8+T細胞之發育(或低親和力CD8+T細胞之存活)時,可使用沒有MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體及複合物(「無MOD」)。類似地,當需要促進由強促效性配位體誘導之T-細胞群之發育時,可使用含有MOD或無MOD的經掩蔽之TGF-β構築體及複合物來支援胸腺衍生之Treg(tTreg)、不變自然殺手細胞T(iNKT)及CD8αα+T-細胞前驅物之存活。
以下為經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之非限制性實例。
1 經掩蔽之TGF-β構築體
在經掩蔽之TGF-β構築體之情況下,所有組分(例如,TGF-β、支架、掩蔽多肽諸如TβRII序列、及視情況選用之一或多個MOD)為單一多肽鏈之部分(參見,例如,圖1,結構A)。在此實施例中,支架多肽不與其他支架多肽形成二聚體或高階結構,且因此,經掩蔽之TGF-β構築體不呈同二聚體、異二聚體或高階多聚體結構(三聚體等)形式。
在圖1中之經掩蔽之TGF-β構築體的情況下,結構A多肽可自N端至C端包含:視情況選用之一或多個MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之多肽;以及TGF-β多肽序列。此類經掩蔽之TGF-β構築體包括以下構築體,其中:
(i)多肽自N端至C端包含:視情況選用之一或多個獨立選定之wt.或親和力減
小之變異體MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之TβR多肽;及TGF-β多肽序列;
(ii)多肽自N端至C端包含:視情況選用之一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之TβRII多肽;及TGF-β多肽序列;
(iii)多肽自N端至C端包含:一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之TβR多肽;及TGF-β多肽序列;
(iv)多肽自N端至C端包含:一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體IL-2 MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之TβR多肽;及TGF-β多肽序列;
(v)多肽自N端至C端包含:一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β3多肽之TβR多肽;及TGF-β3多肽序列;
(vi)多肽自N端至C端包含:一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β3多肽之TβRII多肽;及TGF-β3多肽序列;以及
(vii)多肽自N端至C端包含:一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體IL-2 MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β3多肽之TβRII多肽;及TGF-β3多肽序列。
在本文所述的經掩蔽之TGF-β構築體之任何實例中,TGF-β多肽序列之C77可經取代以預防二聚化(例如,C77S取代),並且TGF-β多肽可進一步(例如,在aas 25、92及/或94之一者、兩者或所有三者處)包含減小其對掩蔽TβR多肽之親和力的變異,以及MOD及TβR多肽序列中之修飾。可併入經掩蔽之
TGF-β構築體中的示範性TβR多肽序列包括視情況具有D118A或D118R取代以減弱TβRI接合的△14或△25 TβRII多肽。描述MOD變異體以及其多肽序列並且TβRI、TβRII及TβRIII之額外修飾如上所述。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體具有SEQ ID NO:146中列出之序列(參見圖7A)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體具有SEQ ID NO:147中列出之序列(參見圖7B)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體具有SEQ ID NO:157中列出之序列(參見圖7G)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體具有SEQ ID NO:158中列出之序列(參見圖7H)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體具有SEQ ID NO:159中列出之序列(參見圖7I)。
2 經掩蔽之TGF-β複合物
經掩蔽之TGF-β複合物包含至少兩個多肽,亦即第一多肽及第二多肽,其各自含有與另一支架多肽相關之支架多肽,使第一多肽與第二多肽結合在一起成為複合物。因此,TGF-β多肽複合物形成同二聚體、異二聚體或高階多聚體結構:
(i)在第一實例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含至少一個TGF-β多肽序列、結合至並掩蔽一或多個TGF-β多肽之至少一個多肽(例如,用於各TGF-β多肽序列之掩蔽序列)及視情況選用的在可二聚化以形成同二聚體(例如,對稱二聚體)的支架結構上組裝之一或多個免疫調節多肽(MOD),如在圖1結構B中。在此類同二聚體中,Ig Fc多肽可允許在各構築體之支架中之Ig Fc多肽之間自發形成二硫鍵,並且可包括突變(例如,本文論述之LALA突變),其實質上減弱或消除Ig多肽例如經由補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來誘導細胞溶解之能力。
(ii)在第二實例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一個TGF-β多肽序列、結合至並掩蔽一或多個TGF-β
多肽之至少一個多肽(例如,用於各TGF-β多肽序列之掩蔽序列)及視情況選用的在包含種間二聚化序列之支架結構上組裝的一或多個免疫調節多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含至少一個TGF-β多肽序列、結合至並掩蔽至少一個TGF-β多肽之至少一個多肽及視情況選用的在包含第一多肽之種間二聚化序列之對應物的支架結構上組裝的一或多個免疫調節多肽(MOD);其中第一多肽與第二多肽經由種間二聚化序列之相互作用形成異二聚體,如在圖1結構C中。
(iii)在第三實例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一個TGF-β多肽序列、結合至並掩蔽至少一個或多個TGF-β多肽之至少一個多肽(例如,用於各TGF-β多肽序列之掩蔽序列)及視情況選用的在包含種間二聚化序列之支架結構上組裝的一或多個免疫調節多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含含有第一多肽之種間二聚化序列之對應物的支架結構及視情況選用之一或多個免疫調節多肽(MOD);其中第一多肽與第二多肽經由種間二聚化序列之相互作用形成異二聚體,如在圖1結構F中,以及
(iv)在第四實例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含
(a)第一多肽,其包含至少一個TGF-β多肽序列及視情況選用的在包含種間二聚化序列之支架結構上組裝的一或多個免疫調節多肽(MOD),以及
(b)第二多肽,其包含結合至並掩蔽至少一或多個TGF-β多肽之至少一個多肽及視情況選用的在包含第一多肽之種間二聚化序列的對應物之支架結構上組裝的一或多個免疫調節多肽(MOD);其中第一多肽與第二多肽經由種間二聚化序列之相互作用形成異二聚體,如在
圖1結構D及E中。
在一些實例中,經掩蔽之TGF-β複合物(圖1,結構B、C及F),構成TGF-β多肽(第一多肽)之序列可自N端至C端包含:視情況選用之一或多個MOD;支架多肽(具有或不具有種間結合序列);結合至並掩蔽TGF-β多肽之多肽;及TGF-β多肽序列。不含圖1結構F中之TGF-β序列的多肽(第二多肽)包含具有種間結合序列之支架多肽並且視情況在N端、C端或N端及C端兩者處包含MOD。
在一些實例中,在圖1結構D及E中之經掩蔽之TGF-β複合物,含有TGF-β多肽序列之多肽(第一多肽)可自N端至C端包含:一或多個視情況選用之MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β多肽序列。在圖1結構D及E中之不含TGF-β序列之多肽(第二多肽)可自N端至C端包含:視情況選用之一或多個MOD、具有種間結合序列之支架多肽及結合至並掩蔽TGF-β多肽之多肽。雖然未在圖1中示出,但包含TGF-β多肽序列之第一多肽可不含一或多個MOD並且包含掩蔽序列之第二多肽可包含一或多個MOD。
經掩蔽之TGF-β複合物之上述實例包括其中第一多肽自N端至C端包含以下各者的彼等複合物:
(i)視情況選用之一或多個MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β多肽序列;
(ii)視情況選用之一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β多肽序列;
(iii)一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β1或2多肽序列;
(iv)一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體IL-2 MOD;支架多肽(沒有種間結合序列);及TGF-β多肽序列;
(v)一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β3多肽序列;
(vi)一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β3多肽序列;或
(vii)一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體IL-2 MOD;支架多肽(具有種間結合序列);及TGF-β3多肽序列。在各實例中,第二多肽自N端至C端包含:包含第一多肽之種間結合(二聚化序列)之對應物的支架多肽,繼之以結合至並掩蔽第一多肽之TGF-β多肽的TβR(例如,TβRII)多肽。在如圖1結構F中之經掩蔽之TGF-β複合物的情況下,TβR(例如,TβRII)多肽可插入N端MOD(若存在)與第一多肽之支架之間,並且第二多肽包含第一多肽之種間結合(二聚化序列)的對應物,一或多個獨立選定之wt.或親和力減小之變異體MOD(例如,wt.或變異體IL-2 MOD)可在N端或C端處附接至該對應物。
在本文所述的經掩蔽之TGF-β複合物之任何實例中,TGF-β多肽序列之C77可經取代以預防二聚化(例如,C77S取代),並且TGF-β多肽可進一步(例如,在aas 25、92及/或94之一者、兩者或所有三者處)包含減小其對掩蔽TβR多肽之親和力的變異,以及在MOD及TβR多肽序列中之修飾。可併入經掩蔽之TGF-β構築體中的示範性TβR多肽序列包括視情況具有D118A取代之△14或△25 TβRII多肽。描述MOD變異體以及其多肽序列,並且TβRI、TβRII及TβRIII之額外修飾如上所述。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含具有SEQ ID NO:148及149中列出之序列的多肽(參見圖7C)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含具有SEQ ID NO:150及151中列出之序列的多肽(參見圖7D)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含具有SEQ ID NO:152及153中列出之序列的多肽(參見圖7E)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含具有SEQ ID NO:155
及156中列出之序列的多肽(參見圖7F)。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β複合物包含具有SEQ ID NO:148及160中列出之序列的多肽(參見圖7J)。
J.核酸
本揭示案提供一種包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之核苷酸序列的核酸。在一些情況下,核酸為重組表現載體;因而,本揭示案提供一種包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之核苷酸序列的重組表現載體。在一些情況下,核酸為重組表現載體;因而,本揭示案提供一種包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之核苷酸序列的重組表現載體。以下關於核酸之論述涉及編碼本揭示案之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物的核酸。
編碼單鏈抗原呈現多肽之核酸
如上所述,經掩蔽之TGF-β構築體包含單一多肽鏈。因此,本揭示案提供一種包含編碼單鏈經掩蔽之TGF-β構築體之核苷酸序列的核酸。包含編碼單鏈經掩蔽之TGF-β構築體之核苷酸序列的核酸可以可操作地連接至轉錄控制元件,例如,啟動子。
編碼經掩蔽之TGF-β複合物之核酸
如上所示,在一些情況下,經掩蔽之TGF-β複合物包含至少兩個單獨多肽鏈(第一多肽鏈及第二多肽鏈)。本揭示案提供包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之核苷酸序列的核酸。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β複合物之個別多肽鏈係在單獨的核酸中編碼。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之所有多肽鏈在單一核酸中編碼。在一些情況下,第一核酸包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽的核苷酸序列;並且第二核酸包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下,單一核酸包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一及第二多肽的核苷酸序列,其可以可操作地連接至單一啟動子或兩個獨立選定之啟動子並且在其轉錄控制下。
編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之個別多肽鏈的單獨核酸
如上所示,在一些情況下,經掩蔽之TGF-β複合物之個別多肽鏈係由單獨的核酸編碼。在一些情況下,編碼經掩蔽之TGF-β複合物之單獨多肽鏈的核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件,例如啟動子,諸如在真核細胞中起作用之啟動子,其中該啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。
例如,本揭示案提供第一核酸及第二核酸,其中第一核酸包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽的核苷酸序列,並且其中第二核酸包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下,編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下,轉錄控制元件為在真核細胞中起作用之啟動子。在一些情況下,核酸存在於單獨的表現載體中。
在一些情況下,編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下,轉錄控制元件為在真核細胞中起作用之啟動子。在一些情況下,核酸存在於單獨的表現載體中。
編碼存在於經掩蔽之TGF-β複合物中的兩個或兩個以上多肽之核酸
本揭示案提供一種核酸,其包含至少編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽及第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下,在經掩蔽之TGF-β複合物包括第一多肽、第二多肽及第三多肽時,核酸包括編碼第一多肽、第二多肽及第三多肽之核苷酸序列。在一些情況下,編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽及第二多肽的核苷酸序列編碼插入所編碼的第一多肽與第二多肽之間的蛋白水解可裂解位點或連接子。在一些情況下,編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽及第二多肽的核苷酸序列包括編碼插入所編碼的第一多肽與第二多肽之間的內部核糖體進入位點(IRES)之核苷酸。在一些情況下,編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽及第二多肽的核苷酸序列包括編碼插入編碼第一多肽之核苷
酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的核糖體跳躍信號(或順式作用水解酶元件,CHYSEL)之序列。
在一些情況下,第一核酸(例如,重組表現載體、訊息核糖核酸(messenger RNA,mRNA)、病毒RNA等)包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第一多肽鏈的核苷酸序列;且第二核酸(例如,重組表現載體、mRNA、病毒RNA等)包含編碼經掩蔽之TGF-β複合物之第二多肽鏈的核苷酸序列。在一些情況下,編碼第一多肽之核苷酸序列及編碼第二多肽之第二核苷酸序列各自可操作地連接至獨立選定之轉錄控制元件,例如啟動子,諸如在真核細胞中起作用之啟動子,其中該啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。
重組表現載體
本揭示案提供包含核酸之重組表現載體。在一些情況下,重組表現載體為非病毒載體。在一些情況下,重組表現載體為病毒構築體,例如重組腺相關病毒構築體(參見,例如美國專利第7,078,387號)、重組腺病毒構築體、重組慢病毒構築體、重組逆轉錄病毒構築體、非整合病毒載體等。
合適的表現載體包括但不限於病毒載體(例如,基於以下之病毒載體:牛痘病毒;脊髓灰質炎病毒;腺病毒(參見,例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras等人,Gene Ther 5:515 524,1999;Li及Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto等人,H Gene Ther 4:1088 1097,1999;WO 94/12649、WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984及WO 95/00655);腺相關病毒(參見,例如Ali等人,Hum Gene Ther 8:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997;Jomary等人,Gene Ther 3:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,9;Ali等人,Hum Mol Genet 5:591 594,1996;Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828;Mendelson等人,Virol.(1988)
166:154-165;以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617);SV40;單純疱疹病毒;人類免疫缺陷病毒(參見,例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997;Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999);逆轉錄病毒載體(例如,鼠類白血病病毒、脾壞死病毒及源自逆轉錄病毒諸如勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、慢病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒之載體);及其類似物。大量合適的表現載體為熟習此項技術者所知,且許多表現載體為市售的。
視所利用之宿主/載體系統而定,在表現載體中可使用許多合適的轉錄及轉譯控制元件中之任一者,包括組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等(參見,例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些情況下,編碼經掩蔽之TGF-β構築體及複合物之多肽的核苷酸序列可操作地連接至控制元件,例如,轉錄控制元件,諸如啟動子。轉錄控制元件可在真核細胞例如哺乳動物細胞;或原核細胞(例如細菌或古細菌細胞)中起作用。在一些情況下,編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列可操作地連接至允許編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列在原核細胞及真核細胞兩者中表現之多個控制元件。
合適的真核細胞啟動子(在真核細胞中起作用之啟動子)之非限制性實例包括來自以下之彼等啟動子:巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)即刻早期、單純疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)胸苷激酶、早期及晚期SV40、來自逆轉錄病毒之長末端重複序列(long terminal repeat,LTR)及小鼠金屬硫蛋白-I。適當的載體及啟動子之選擇完全在普通熟習此項技術者之技能水準內。表現載體亦可含有用於轉譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當序列。
表現經掩蔽之TGF-β構築體及複合物的經基因修飾之宿主細胞之製備及經掩蔽
之TGF-β構築體及複合物之純化
本揭示案提供一種經基因修飾之宿主細胞,其中宿主細胞用編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多個核酸來基因修飾。
合適的宿主細胞包括真核細胞,諸如酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。在一些情況下,宿主細胞為哺乳動物細胞株之細胞。合適的哺乳動物細胞株包括人類細胞株、非人靈長類動物細胞株、齧齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株及其類似物。合適的哺乳動物細胞株包括但不限於HeLa細胞(例如,美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)號CCL-2)、CHO細胞(例如,ATCC號CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例如,ATCC號CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如,ATCC號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如,ATCC號CCL10)、PC12細胞(ATCC號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC號CRL1651)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC號CCLI.3)、人類胚腎(human embryonic kidney,HEK)細胞(ATCC號CRL1573)、HLHepG2細胞及其類似物。
經基因修飾之宿主細胞可用於產生經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。例如,經基因修飾之宿主細胞可用於產生經掩蔽之TGF-β複合物,或單鏈經掩蔽之TGF-β構築體,方法為藉由將包含編碼多肽之核苷酸序列的表現載體,諸如如上所述之表現載體,引入宿主細胞中,由此產生經基因修飾之宿主細胞。宿主細胞可組成性地表現經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或響應於暴露於誘導因子來表現其,其中驅動表現之啟動子為可誘導的(例如,CMV啟動子及藉由暴露於四環素來誘導之抗四環素操縱子)。
經掩蔽之TGF-β構築體或複合物獲自細胞,或若藉由併入訊息序列將多肽靶向分泌途徑,則獲自細胞培養基。蛋白質可藉由此項技術中已知之任何手段來純化,包括例如以下中之一或多者:沉澱(例如,硫酸銨或乙醇)、等電
聚焦及一或多種類型之層析。合適的層析方法包括但不限於基於尺寸之層析分離(例如,尺寸排阻或凝膠滲透)、疏水性相互作用層析、離子交換層析及親和層析。當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含免疫球蛋白多肽序列(例如,作為支架)時,蛋白A或蛋白G可用於親和純化經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在不存在免疫球蛋白多肽時,複合物可使用針對存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的多肽之抗體進行親和純化;或替代地,藉由併入親和標記物諸如myc抗原決定基(CEQKLISEEDL SEQ ID NO:154)、「HIS」標記物(用於二價金屬離子樹脂結合)或「FLAG」標記物。可與任何前述方法組合之純化及/或濃縮步驟使用尺寸受限之半透膜(例如,滲析膜或壓敏元件),其可用於移除具有實質上不同分子量之污染物及/或濃縮經純化之蛋白質。
在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物自引入哺乳動物細胞(例如,CHO細胞)中並且靶向分泌途徑之核酸序列表現以使得其自細胞分泌至其培養基(例如,無血清培養基)中。使用單獨或與基於尺寸之分離(例如,基於尺寸之層析或膜分離)組合之親和層析,將經掩蔽之TGF-β構築體或複合物自細胞培養基中純化。在此實施例之特定實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含免疫球蛋白支架(例如,IgG多肽序列),並且純化係藉由單獨或與基於尺寸之分離(基於尺寸之層析)組合之親和層析(例如,蛋白A或G)完成。
K.組成物
本揭示案提供包含經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之組成物,包括醫藥組成物。本揭示案亦提供包含核酸或重組表現載體之組成物,包括醫藥組成物。
1 包含經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的組成物
除了經掩蔽之TGF-β構築體或複合物以外,本揭示案之組成物亦可包含以下中之一或多者:鹽,例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等;緩衝劑,例
如Tris緩衝液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、N-參[羥甲基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(TAPS)等;增溶劑;清潔劑,例如非離子性清潔劑,諸如Tween-20等;蛋白酶抑制劑;甘油;及其類似物。
組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑,多種賦形劑為此項技術中已知的且不必在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已在多種出版物中充分描述,包括例如「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」,第19版(1995)或最新版,Mack Publishing Co;A.Gennaro(2000)「Remington:The Science and Practice of Pharmacy,」第20版,Lippincott,Williams,& Wilkins;Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人編,第7版,Lippincott,Williams,& Wilkins;以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人編,第3版,Amer.Pharmaceutical Assoc。
醫藥組成物可包含:i)經掩蔽之TGF-β構築體或複合物;及ii)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下,本發明醫藥組成物將適用於向受試者投與,例如將為無菌的。例如,在一些實施例中,本發明醫藥組成物適用於向人類受試者投與,例如其中組成物為無菌的且實質上不含可偵測之熱原及/或其他毒素,或其中此類可偵測之熱原及/或其他毒素以由適當監管機構例如美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration,USF&DA)設定之可接受限度內之水準存在。
蛋白質組成物可包含其他組分,諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽及其類似物。組成物可含有接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質,諸如pH值調節劑及緩衝劑、毒性調節劑及其類似物,例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、鹽酸鹽、硫酸鹽、溶劑合物(例如,混合型離子鹽、水、有機物)、水合
物(例如,水)及其類似物。
舉例而言,組成物可包括水溶液、粉末形式、顆粒、錠劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、懸浮劑、噴霧劑及其類似物。組成物可根據下文所述之各種投與途徑調配。
在利用經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,引入細胞培養系統中)或作為可注射物(例如,皮下、腹膜內、肌肉內、淋巴內及/或靜脈內)直接投與至組織中時,調配物可以即用劑型或以非水性形式(例如,可重構之保存穩定的粉末)或水性形式(諸如,由醫藥學上可接受之載劑及賦形劑構成之液體)提供。含有蛋白質之調配物亦可以在投與之後增加本發明蛋白質之血清半衰期的形式提供。舉例而言,該蛋白質可提供於脂質體調配物中,製備為膠體,或用於延長血清半衰期之其他習知技術。多種方法可用於製備脂質體,如例如在Szoka等人1980 Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467、美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所描述。製劑亦可以受控釋放或緩慢釋放形式提供。
在一些情況下,組成物包含:a)經掩蔽之TGF-β構築體或複合物;及b)鹽水(例如,0.9% NaCl)。在一些情況下,組成物為無菌的。在一些情況下,組成物適用於向人類受試者投與,例如其中組成物為無菌的且實質上不含可偵測之熱原及/或其他毒素,或其中此類可偵測之熱原及/或其他毒素以可接受限度內之量存在。因此,本揭示案提供一種包含以下各者之組成物:a)經掩蔽之TGF-β構築體或複合物;及b)鹽水(例如,0.9% NaCl),其中組成物為無菌的且實質上不含可偵測之熱原及/或其他毒素,或其中此類可偵測之熱原及/或其他毒素以可接受限度內之量存在。
適用於非經腸投與之調配物之其他實例包括等張無菌注射溶液、抗氧化劑、抑菌劑、及使調配物與預定接受者之血液等張的溶質、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。舉例而言,本發明醫藥組成物可存在於容器,
例如無菌容器,諸如注射器中。調配物可於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)中提供,且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下,其僅需要在臨使用前添加無菌液體賦形劑,例如注射用水。臨時注射溶液及懸浮液可自無菌散劑、顆粒及錠劑製備。
調配物中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之濃度可廣泛地變化,諸如以重量計小於約0.1%(通常為或至少為約2%)至多達20%至50%或更大(例如,0.1%至1%、1%至5%、5%至10%、10%至20%、或20%至50重量%)並且通常根據所選擇之特定投與模式及患者需要,主要基於流體體積、黏度及基於患者之因素來選擇。
本揭示案提供一種包含組成物(例如液體組成物)之容器。容器可為例如注射器、安瓿及其類似物。在一些情況下,容器為無菌的。在一些情況下,容器及組成物二者皆為無菌的。
2 包含核酸或重組表現載體之組成物
本揭示案提供包含本揭示案之核酸或重組表現載體的組成物,例如醫藥組成物。多種醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中已知的且無需在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已充分描述於多個出版物中,包括例如A.Gennaro(2000)「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」,第20版,Lippincott,Williams,& Wilkins;Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人編,第7版,Lippincott,Williams,& Wilkins;以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人編,第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
本揭示案之組成物可包含:a)一或多種核酸或一或多種重組表現載體,其包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的核苷酸序列;以及b)以下中之一或多者:緩衝劑、界面活性劑、抗氧化劑、親水性聚合物、糊精、螯合劑、
懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、抑菌劑、潤濕劑及防腐劑。合適的緩衝劑包括但不限於(諸如N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸(BES)、雙(2-羥乙基)胺基-參(羥甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)、甘胺醯甘胺酸、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、碳酸氫鈉、3-(N-參(羥甲基)-甲基-胺基)-2-羥基-丙烷磺酸)TAPSO、(N-參(羥甲基)甲基-2-胺基乙烷磺酸(TES)、N-參(羥甲基)甲基-甘胺酸(Tricine)、參(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)等)。合適的鹽包括例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等。
醫藥調配物可包含約0.001%至約99%(w/w)(例如,0.001-0.1、0.1-1.0、1.0-10、10-20、20-40、40-80或80-100% w/w)之量的核酸或重組表現載體。在調配物之以下描述中,「本發明核酸或重組表現載體」應理解為包括核酸或重組表現載體。舉例而言,在一些情況下,本發明調配物包含核酸或重組表現載體。
本發明核酸或重組表現載體可與其他化合物或化合物之混合物摻合,用其他化合物或化合物之混合物包封,與其他化合物或化合物之混合物偶聯,或以其他方式與其他化合物或化合物之混合物締合;此類化合物可包括例如脂質體或受體靶向分子。本發明核酸或重組表現載體可與幫助攝取、分佈及/或吸收之一或多種組分一起組合於調配物中。
本發明核酸或重組表現載體組成物可經調配成許多可能劑型中之任一者,諸如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。本發明核酸或重組表現載體組成物亦可經調配成水性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液黏度之物質,包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
包含本發明核酸或重組表現載體之調配物可為脂質體調配物。如本
文所用,術語「脂質體」意指由以一個或多個球形雙層排列之兩親性脂質構成的囊泡。脂質體為單層或多層囊泡,其具有由親脂性材料形成之膜及含有待遞送之組成物的水性內腔。陽性脂質體為帶正電脂質體,其可與帶負電DNA分子相互作用以形成穩定複合物。咸信pH敏感性或帶負電之脂質體截留DNA,而非與其複合。陽離子及非陽離子脂質體皆可用於遞送本核酸或重組表現載體。
脂質體亦包括「空間上穩定之」脂質體,如本文所用,該術語係指包含一或多種特化脂質之脂質體,該特化脂質當併入脂質體中時導致其循環壽命相對於缺乏此類特化脂質之脂質體有所增加。空間上穩定之脂質體之實例為如下之彼等,其中脂質體之囊泡形成脂質之一部分包含一或多種醣脂或以一或多種親水性聚合物諸如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)部分衍生化。脂質體及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中,其以全文引用方式併入本文。
調配物及組成物亦可包括界面活性劑。界面活性劑於藥物產品、調配物及乳液中之用途為此項技術中所熟知。界面活性劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
在一實施例中,包括各種滲透增強劑以實現核酸之有效遞送。除了幫助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜以外,滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可經分類為屬五大類別之一者,亦即界面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑。滲透增強劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中,其以全文引用方式併入本文。
用於經口投與之組成物及調配物包括散劑或顆粒、微粒、奈米顆粒、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、小藥囊、錠劑或微型錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。合適的口服調配物包含如下之彼等,其中本發明反義核酸與滲透增強劑界面活性劑及螯合劑中之一或多者一起投與。合適的界面活性劑包括但不限於脂肪酸及/或其
酯或鹽、膽酸及/或其鹽。合適的膽酸/鹽及脂肪酸及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。滲透增強劑,例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽組合之組合亦為合適的。示範性的合適組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他滲透增強劑包括但不限於聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-十六烷基醚。合適的滲透增強劑亦包括丙二醇、二甲亞碸、三乙醇胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、2-吡咯啶酮及其衍生物、四氫糠醇及AZONETM。
L.調配物
合適的調配物如上所述,其中組成物具有醫藥學上可接受之級別(例如,組成物包括醫藥學上可接受之賦形劑及活性分子)。在一些情況下,合適的調配物包含:a)經掩蔽之TGF-β構築體或複合物;及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下,合適的調配物包含:a)包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的核苷酸序列之核酸;及b)醫藥學上可接受之賦形劑;在一些情況下,核酸為mRNA。在一些情況下,合適的調配物包含:a)第一核酸,其包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第一多肽的核苷酸序列;b)第二核酸,其包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第二多肽的核苷酸序列;及c)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下,合適的調配物包含:a)包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的核苷酸序列之重組表現載體;及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下,合適的調配物包含:a)第一重組表現載體,其包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第一多肽的核苷酸序列;b)第二重組表現載體,其包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第二多肽的核苷酸序列;及c)醫藥學上可接受之賦形劑。合適的醫藥學上可接受之賦形劑在上文中描述。
M.方法
經掩蔽之TGF-β構築體或複合物適用於調節T細胞之活性。因此,
本揭示案提供調節T細胞活性之方法,該方法通常涉及使靶T細胞與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸。
1 調節免疫細胞活性之方法,包括產生、刺激或抑制特定的免疫細胞類型。
本揭示案提供一種選擇性地調節表現TβRI及TβRII之細胞之活性的方法,該方法包含使細胞(例如,T細胞、B細胞及先天細胞,包括自然殺手(natural killer,NK)細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及顆粒球)與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸,其中T細胞與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之接觸選擇性地調節抗原決定基特異性T細胞之活性。在一些情況下,該接觸在活體外發生。在一些情況下,該接觸在活體內發生。其中經受經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的細胞之活性(例如,經由典型途徑、非典型途徑之訊息傳導及/或下游基因表現)可相對於未暴露於TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之治療組(例如,細胞受試者)來評定。
本揭示案提供一種減少T細胞或B細胞(例如,病原自體反應性T細胞及/或病原自體反應性B細胞)之數目及/或活性的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在一些情況下,該方法增加調節性T細胞(Treg)之數目及/或活性,導致T細胞或B細胞(例如,一或多種自體反應性T細胞及/或一或多種自體反應性B細胞)之數目及/或活性減少,其中經受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的T細胞或B細胞之數目及/或活性之減少相對於未暴露於TGF-β或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞受試者)來評定。
投與視情況包含一或多種(例如,一種、兩種或兩種以上或三種或三種以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可直接或間接地影響各種細胞群。舉例而言,投與視情況包含一或多種野生型或變異體IL-2 MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可直接刺激
FoxP3+ Treg細胞(活體內或活體外)之發育及/或存活。除了TGF-β/IL-2複合物對各種免疫細胞具有的任何直接作用以外,所得Treg細胞可藉由例如阻斷T細胞活化之誘導及/或T細胞反應之效應階段、抑制B細胞活化及/或抑制自然殺手細胞之分化及/或增殖來抑制免疫反應。
a. Treg
(i)tTreg、pTreg、iTreg及包含IL-2之TGF-β構築體或複合物
本揭示案提供一種促進胸腺衍生之Treg(tTreg)及/或周圍Treg(pTreg)(Treg為可抑制自體反應性T細胞及B細胞之CD4+、FoxP3+及CD25+細胞)之發育(例如擴增)及/或存活的方法;該方法包含投與(例如,有需要之一或多個受試者)一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,在組織培養物、血液或特定組織位置諸如傷口中),或使CD4+ T細胞(例如,幼稚CD4+ T細胞)與其接觸。在該方法中投與或接觸之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列。投與或接觸可與向細胞投與維生素D(例如,維生素D3或其類似物)、視黃酸(例如,全反視黃酸)及/或哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)之抑制劑(例如,雷帕黴素或其功能類似物,諸如西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)或坦羅莫司(temsirolimus))或使細胞與該等物質接觸來聯合進行。因此,本揭示案提供一種促進誘導型調節性T細胞(iTreg)之發育及/或存活的方法,該等細胞為FoxpP3+、FoxP3+胸腺衍生之Treg(tTreg)及/或FoxP3+周圍Treg(pTreg),該方法包含視情況在維生素D或其類似物、視黃酸(例如,全反視黃酸)或其類似物、及/或雷帕黴素或其類似物存在下,投與(例如,向有需要之受試者)包含一或多種IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+ T細胞(例如,幼稚CD4+ T細胞)與其接觸。用一或多種經掩蔽之TGF-β
構築體或複合物投與或治療之效應可相對於基線值(例如,治療前之細胞數目)或相對於與測試組匹配(例如,在其他方面相同)但未暴露於TGF-β或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定。
本揭示案提供一種增加Treg之誘導/增殖、保持Treg及/或維持其功能的方法,該方法包含使T細胞(例如,活體內或活體外之CD4+ T細胞)與包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸。相對於接觸之前測定的基線值或相對於未與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸的在其他方面相同之細胞之對照組,該接觸增加Treg之誘導/增殖、保持Treg及/或維持其功能。本揭示案包括並提供用於該方法中的包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構A、B或C描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構D或E描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構F描述之結構組織。
本揭示案提供一種增加Treg之誘導/增殖、保持Treg及/或維持其功能的方法,該方法包含使T細胞(例如,活體內或活體外之CD4+ T細胞)與包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸。相對於接觸之前測定的基線值或相對於未與一或多種經掩蔽之
TGF-β構築體或複合物接觸的在其他方面相同之細胞之對照組,該接觸增加Treg之誘導/增殖、保持Treg及/或維持其功能。本揭示案包括並提供用於該方法中的包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構A、B或C描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構D或E描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構F描述之結構組織。包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可與用於誘導/增殖Treg(例如,Tbet+FoxP3+iTreg細胞)、保持Treg及/或維持其功能之IL-2(例如,重組IL-2,諸如Proleukin(阿地白介素(aldesleukin))一起投與。
本揭示案提供一種增加Treg之誘導/增殖、保持Treg(例如Treg數目)及/或維持其功能的方法,該方法包含使T細胞(例如,活體內或活體外之CD4+細胞)與包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2及/或變異體IL-2 MOD多肽序列及一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸。相對於接觸之前測定的基線值或相對於未與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸的在其他方面相同之細胞之對照組,該接觸增加Treg之誘導/增殖、保持Treg及/或維持
其功能。本揭示案包括並提供用於該方法中之包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD及/或變異體IL-2 MOD多肽序列及一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD及/或變異體IL-2 MOD多肽序列及一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構A、B或C描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD及/或變異體IL-2 MOD多肽序列及一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構D或E描述之結構組織。在一實施例中,包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD及/或變異體IL-2 MOD多肽序列及一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構F描述之結構組織。
使T細胞(例如,幼稚CD4+細胞)與包含單獨或與一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多肽序列組合的一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,活體內或活體外)接觸可增加FoxP3之表現及Treg細胞誘導(例如,Tbet+FoxP3+iTreg細胞)。類似地,使T細胞(例如,幼稚CD4+細胞)與包含單獨或與IL-2(例如,重組人類IL-2)組合的一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之PD-L1或PDL2及/或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,活體外或活體內)接觸可增加FoxP3之表現及Treg細胞誘導(例如,Tbet+FoxP3+iTreg細胞)。當將IL-2及PD-L1或PD-L2兩者提供至細胞時,該接觸可減少Treg溶酶體天冬醯胺基內肽酶。造成Treg中之Foxp3去穩定化的溶酶體天冬醯胺基內肽酶之減少導致保持Treg(例
如,iTreg)及維持其功能。參見例如Francsisco等人,J Exp.Med.,206(13)3015-3029(2018)及Stathopoulou等人Immunity 49(2):247-263(2018)。因此,當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含IL-2及PD-L1或PD-L2兩者時,接觸T-細胞可不僅導致Treg之數目增加,而且提高彼等細胞之穩定性及功能。
當包含IL-2 MOD(wt.及/或變異體)及/或PD-L1及/或PD-L2(wt.及/或變異體)多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與投與患者的經處理細胞之接觸在活體內(或在活體外)發生時,該接觸可構成治療。此類治療造成個體或個體群中Treg細胞水準(例如,iTreg之總數或其在組織中或循環血液中之分率)之提高。治療亦可造成Treg中FoxP3水準之升高。
當經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽序列以及wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多肽序列時,在個體或個體群中Treg細胞水準(例如,iTreg之總數或其在組織中或循環血液中之分率)升高之持續時間比在用缺少PD-L1序列的在其他方面相同之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物治療的個體或個體群(例如,年齡、性別、體重及/或疾病狀態匹配)時所觀察到的持續時間更長。相對於在用缺少PD-L1多肽序列的在其他方面相同之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物進行治療時所觀察到的水準,用包含wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽序列以及wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之治療亦可造成Treg中FoxP3持久較高之水準。相對於用缺少PD-L1MOD多肽序列的在其他方面相同之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物治療之個體(或平均個體組)的T-細胞中之酶活性,用包含wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽序列以及wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之治療亦可造成Treg細胞中溶酶體天冬醯胺基內肽酶活性之降低。
使T-細胞與包含單獨或與wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2 MOD多
肽序列組合的wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸之過程(例如,活體外、離體或活體內,諸如治療個體之過程)可進一步包括在維生素D或其類似物、視黃酸(例如,全反視黃酸)或其類似物及/或mTOR抑制劑諸如雷帕黴素或其類似物)存在下接觸T細胞。相對於接觸之前測定的基線值或相對於未與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸的對照組(例如,個體組)中測定之值,在彼等試劑存在下之接觸可提高Treg之水準(例如,由於具有Treg表型之細胞之增殖或維持所致的個體或組織中Treg之數目或相對數目)。當使用對照個體組時,個體可在年齡、性別及體重中之一或多者上匹配。個體亦可在種族、飲酒及/或吸煙狀況上匹配。
本揭示案提供一種增加一或多個受試者(例如,個體或患者)中Treg之數目的方法,該方法包含向一或多個受試者投與包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2 MOD多肽序列及/或變異體IL-2 MOD多肽序列且視情況包含一或多個獨立選定之wt.或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中該投與造成一或多個受試者中Treg數目之增加。例如,相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前個體中之Treg數目或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照組,(例如,在血液或組織或諸如傷口之位置中)Treg之平均數目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大於10倍。
本揭示案提供一種增加一或多個受試者(例如,個體或患者)中Treg之數目的方法,該方法包含向一或多個受試者投與包含視情況與IL-2(例如,重組IL-2諸如Proleukin(阿地白介素))組合的一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之wt.或變異體PD-L1及/或PD-L2多肽序列的一或多種經掩蔽之
TGF-β構築體或複合物,其中該投與造成一或多個受試者中Treg數目之增加。例如,相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前個體中之Treg數目或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照組,(例如,在血液或組織或諸如傷口之位置中)Treg之平均數目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大於10倍。
b. T輔助細胞
(i)Th9細胞及包含IL-4的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物
本揭示案提供一種促進胸腺衍生之Th9細胞(藉由表現CD4及CCR6及缺少CCR4表徵之CD4+細胞)之發育及/或存活的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+ T細胞(例如,幼稚CD4+ T細胞或Th2細胞)與其接觸。在該方法中投與或接觸之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-4 MOD多肽序列及/或變異體IL-4 MOD多肽序列。因此,本揭示案提供一種促進Th9細胞之發育及/或存活的方法,其包含投與(例如,向有需要之受試者)包含一或多個IL-4MOD多肽序列及/或變異體IL-4MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使幼稚T細胞與其接觸,其中該投與造成個體中Th9細胞數目之增加。例如,(例如,在組織培養物、血液或特定組織位置中)Th9細胞之數目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大於10倍。
(ii)Th17細胞及包含IL-17之TGF-β構築體或複合物
本揭示案提供一種刺激Th17細胞(藉由其IL-17產生來定義之T細
胞)之產生的方法,該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)包含至少一種IL-6或變異體IL-6 MOD多肽(例如,一種、兩種或三種IL-6及/或變異體IL-6 MOD多肽)的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+ T細胞(例如,幼稚CD4+ T細胞)與其接觸。例如,相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前存在的數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照組,(例如,在組織培養物、血液或特定組織位置中)Th17細胞之數目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大於10倍。該方法可適用於維持腸黏膜屏障功能並且可為防止病原細菌(例如,對抗檸檬酸桿菌(Citrobacter))以及募集嗜中性球及單核球及嗜中性球來攻擊並破壞胞外真菌(例如,黏膜皮膚念珠菌(Candida))所需的。
(iii)Tfh細胞及包含IL-21及IL-23的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物
本揭示案提供一種刺激T濾泡性輔助(Tfh)細胞(藉由CXCR5表現來定義之T細胞)之產生的方法,該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)包含至少一種MOD多肽(例如,一種、兩種或三種)獨立選自IL-21 MOD多肽、IL-23 MOD多肽、IL-21之變異體或IL-23 MOD多肽之變異體的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使巨噬細胞與其接觸。例如,相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前存在的數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照組,(例如,在組織培養物、血液或特定組織位置諸如淋巴濾泡中)Tfh細胞之數目可增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大於10倍。該方法可適用於支援抗原特異性抗體反應之發展。
c. T效應細胞及包含IL-7的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物
(i)IL-7及CD8+ T細胞
本揭示案提供一種(例如,藉由促進胸腺細胞表現IL-7R(例如,IL-7Rα)促進CD4+及/或CD8+ T-細胞之發育(譜系定型)及/或存活的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使前驅物CD4+CD8+ T-細胞與其接觸。在該方法中投與或接觸之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-7 MOD多肽序列及/或變異體IL-7 MOD多肽序列。因此,本揭示案提供一種(例如,藉由促進胸腺細胞表現介白素(IL)-7Rα)促進專注於CD4+或CD8+譜系之細胞之發育的方法,該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-7 MOD多肽序列及/或變異體IL-7 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+及或CD8+細胞前驅物(例如,CD4+8+ T-細胞)與其接觸;其中CD4+及/或CD8+細胞之發育及/或存活藉由監測周圍血液或特定組織(例如,胸腺)CD4+及/或CD8+細胞數目來評定。
(i)IL-7及低親和力T-細胞
本揭示案提供一種藉由用對由MHC蛋白呈現的肽具有低親和力之T-細胞受體促進CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之IL-7-依賴性存活來調控周圍T-細胞穩態的方法。參見例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236及其中之引用。該方法可藉由控制胸腺細胞IL-7Rα表現來操作。促進IL-7-依賴性存活之方法包含(例如,向有需要之受試者)投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。所投與之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-7 MOD多肽序列及/或變異體IL-7 MOD多肽序列。因此,本揭示案提供一種調控周圍T-細胞穩態之方法;該方法包含(例
如,向有需要之受試者)投與包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-7 MOD多肽序列及/或變異體IL-7 MOD多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中相對於投與之前彼等細胞之數目,投與TGF-β構築體或複合物增加受試者或受試者組中周圍CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之數目。
d.經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及IL-10
本揭示案提供一種抑制2型先天淋巴細胞(ILC2細胞)(例如,抑制哮喘及過敏性炎症,參見例如,Rajas等人,J Allergy Clin Immunol,139(5):1468(2017);及Ogasawara等人,J Allergy Clin Immunol,141(3):1147-1151(2018))之方法,其使用包含至少一個(例如至少兩個)獨立選定之野生型或變異體IL-10 MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。變異體IL-10 MOD多肽可包括單體IL-10多肽之全部或一部分(例如,SEQ ID NO:50或51之全部或一部分,在螺旋D與E之間的鉸鏈區中用以上提及之5-7 aa插入來取代)。參見例如Josephson等人,J.Biol.Chem.275:13552-13557(2000)。抑制II型先天淋巴細胞之方法包括投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體IL-10 MOD的一或多種掩蔽TGF-β構築體或複合物,或使II型先天淋巴細胞與其接觸。ILC2細胞之抑制藉由相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前2型細胞介素之量,或相對於未暴露於TGF-β或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照組中(例如,在來自受試者之細胞、組織或體液中)2型細胞介素之量,由ILC2細胞對2型細胞介素(例如,IL-3及/或IL-13)表現之抑制來評定。
TGF-β及IL-10在保持胃腸穩態中具有非冗餘作用,其中IL-10在TGF-β上游及下游兩者起作用。例如,IL-10可誘導由固有層T細胞進行之TGF-β
表現及分泌並且其與TGF-b協同作用來促進Treg細胞之分化。因此,本揭示案提供保持受試者中Treg細胞之腸道穩態及分化的方法,其包含投與包含wt.或變異體IL-10序列或IL-2及IL-10 aa序列兩者的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,該IL-2及IL-10 aa序列中之一者或兩者可為獨立選定之wt.或變異體序列。參見例如Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017;9:a022236及其中之引用。
在一些情況下,諸如當需要誘導耐受性時,存在於一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)包含至少一個(例如至少兩個)獨立選定之野生型或變異體IL-10 MOD多肽。參見例如Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 306:G575-G581(2014),及Levings等人Int Arch Allergy Immunol.129(4):263-76(2002)。變異體IL-10 MOD多肽可包括單體IL-10多肽之全部或一部分(例如,SEQ ID NO:50或51之全部或一部分,在螺旋D與E之間的鉸鏈區中用以上提及之5-7 aa插入來取代以形成活性單體IL-10)。因此,本揭示案提供誘導受試者之耐受性的方法,其包含投與包含wt.或變異體IL-10序列或IL-2及IL-10多肽序列兩者的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。替代地,包含wt.或變異體IL-10(例如,單體IL-10)序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可與包含wt.或變異體IL-2多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物一起(同時或組合)投與。
e.經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及FasL
在一些情況下,諸如當需要誘導耐受性或抑制T-效應細胞時,存在於一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中的至少一個MOD多肽(例如,一個、兩個或三個獨立選定之MOD)可包含Fas配位體(FasL)多肽或Fas配位體多肽之變異體。(參見例如Qiu等人J Surg Res.218:180-193(2017)。如上論述,IL-10
或變異體IL-10多肽亦可用於誘導耐受性。
因此,本揭示案提供誘導受試者之耐受性或抑制T-效應細胞的方法,其包含投與包含wt.或變異體FasL多肽序列或IL-2及FasL多肽序列兩者的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。本揭示案亦提供耐受性之誘導。替代地,包含wt.或變異體FasL序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可與包含wt.或變異體IL-2多肽序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物一起(同時或組合)投與。
f.調節其他細胞之方法
本揭示案提供一種支援不變自然殺手T(iNKT)細胞之發育及/或存活的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使iNKT細胞前驅細胞與其接觸。其中相對於未暴露於TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定發育及/或存活。
本揭示案提供一種抑制巨噬細胞(例如,由Toll樣受體配位體或細胞介素刺激來激活之巨噬細胞)的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使巨噬細胞與其接觸;其中相對於未暴露於TGF-β及/或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定抑制。巨噬細胞之活化及活化之抑制藉由在此項技術中已知之方法來評定,諸如由活化巨噬細胞進行之氮氧化物產生。
TGF-β抑制由單核球進行之H2O2產生,並且為抑制纖連蛋白黏附的單核球之化學引誘物。參見例如Warwick Davies及Cole,J Immunol.155(6):
3186-3193(1995)。因此,本揭示案提供一種刺激單核球(例如,靜息單核球)經歷遷移之方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使單核球與其接觸;其中相對於未暴露於TGF-β及/或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定刺激。單核球之活化及抑制之活化藉由在此項技術中已知之方法來評定,包括量測H2O2產生及纖連蛋白黏附。H2O2產生(例如,響應於單核球刺激)可減少至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、10倍、20倍、30倍或更多)。
本揭示案提供一種改變周圍血液單核球及/或巨噬細胞遷移(例如,藉由延時顯微術或Boyden腔室檢定來評定)至組織(例如,受傷或發炎組織)中,及/或增強巨噬細胞及/或單核球黏附性質的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使骨髓細胞與其接觸;其中相對於未暴露於TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定遷移及/或黏附性質。例如,在一些情況中,細胞或組織與TGF-β(例如,TGF-β1)之短期相互作用刺激巨噬細胞或單核球之遷移,而長期暴露減少其遷移。參見例如Kim等人,Blood 108:1821-1829(2006),及Xu等人Bone Research,6(論文編號2)(2018)。
本揭示案提供一種誘導趨化性(例如,藉由延時顯微術或Boyden腔室檢定來評定)及/或增強肥大細胞之黏附性質的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型或變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合
物,或使肥大細胞與其接觸;其中相對於未暴露於TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)來評定趨化性及/或黏附性質。
本揭示案包括並提供調節自體反應性及/或發炎性T細胞(例如,Th1、Th2、Th17及/或Th22細胞)之方法。該等方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型及/或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使T細胞(例如,活體內或活體外)與其接觸。視情況包含一或多個野生型及/或變異體MOD的TGF-β構築體或複合物可直接與此類發炎性T細胞相互作用,且/或經由所釋放分子(例如,細胞介素/介白素)或經由其他細胞群來間接地影響此類細胞。舉例而言,投與視情況包含一或多個野生型及/或變異體IL-2 MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(TGF-β/IL-2複合物)可直接刺激FoxP3+ Treg細胞之發育及/或存活(在活體外或活體內)。除了TGF-β/IL-2複合物與細胞直接相互作用由此產生FoxP3+ Treg細胞以外,所得T reg可諸如藉由例如阻斷T細胞活化之誘導及/或T細胞反應之效應階段、抑制B細胞活化及抑制自然殺手細胞之分化及/或增殖來影響其他細胞。T reg之此類作用可經由各種手段來進行,包括但不限於產生IL-10、TGF-β及/或Treg上之CTLA-4結合至抗原呈現細胞上之B7(B7-1或CD80/B7-2或CD86),由此與彼等細胞之CD28共刺激競爭。因此,本揭示案包括並提供調節自體反應性T細胞及屬諸如Th1、Th2、Th17、Th22等譜系之發炎性T細胞的方法。自體反應性細胞可為旁觀者T細胞(例如,旁觀者Th1、Th2及/或Th17細胞)之群。例如,在乳糜瀉中,所調節的T細胞可包括見於腸道黏膜中之Th17細胞,導致IL-17A、IL-17F、IL-21及/或IL-22之表現、分泌及/或黏膜組織水準降低。
本揭示案包括並提供一種抑制CD4+ Th1細胞(例如,減少其分泌干擾素γ及/或TNF)之作用並由此活化巨噬細胞(例如,在遲發型超敏反應或
「delayed type hypersensitivity,DTH」中牽涉到之吞噬作用及巨噬細胞,該反應為包括肉芽腫性炎症之發炎性疾病之構成因素)的方法。該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型及/或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+ Th1細胞與其接觸;其中藉由相對於未暴露於TGF-β及/或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)而言干擾素γ及/或TNF之產生來評定Th1細胞作用之抑制。
本揭示案包括並提供一種抑制CD4+ Th2細胞之作用(活化)(例如,減少的IgE、肥大細胞及嗜伊紅球介導之反應)的方法;該方法包含投與(例如,向有需要之受試者)視情況包含一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上或三個或三個以上)獨立選定之野生型及/或變異體MOD的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或使CD4+ Th2細胞與其接觸;其中藉由相對於未暴露於TGF-β及/或一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,細胞或受試者)而言IL-4、IL-5及/或IL-13之產生來評定Th2細胞作用之抑制(Th2細胞活化之程度)。
2 選擇性地遞送共刺激多肽之方法
本揭示案提供一種使用一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送呈掩蔽形式之TGF-β以及一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上、三個或三個以上、或四個或四個以上)獨立選定之MOD及/或變異體MOD的方法。MOD向包含TβR之細胞的遞送可由於MOD與其在含有或不含有TβR之細胞上之受體(共-MOD)的相互作用而複雜化。藉由改變MOD之數目並且相對於經掩蔽之TGF-β多肽對TβR之有效親和力改變對其相應共MOD之親和力,可將經掩蔽之TGF-β構築體或複合物靶向細胞。具有減小之親和力的變異體MOD向經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之併入允許TGF-β多肽更強地影響或甚至支配結合相互作用。併入具有減小之親和力的變異體MOD(只要其仍然可刺激其共
MOD)與對TβR具有相對強親和力之TGF-β多肽的組合允許包含一或多個MOD的經掩蔽之TGF-β構築體及複合物在其與具有TβR及相應共MOD兩者之細胞之結合中獲得偏向性(或甚至選擇性)。此類組合亦避免在無TβR之情況下帶有共MOD之細胞的脫靶刺激。
本揭示案提供將TGF-β多肽及至少一種變異體MOD兩者選擇性地遞送至在其表面膜上表現TβR(例如,TβRII及/或TβRI)及對應於至少一種變異體MOD之共MOD的靶細胞(例如,活體外或活體內)。當在此上下文中使用時,「選擇性遞送」意謂與不包含TβR之細胞,亦即,「非靶細胞」相比,在更高數目之表現TβR(例如,TβRII及/或TβRI)之細胞,亦即,「靶細胞」上,將經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之MOD遞送至共MOD。
鑒於前述內容,本揭示案提供將TGF-β多肽及至少一種變異體MOD兩者選擇性遞送至在其表面膜上表現TβR(例如,TβRII及/或TβRI)及對應於至少一種變異體MOD之共MOD的靶細胞(例如,活體外或活體內);該方法包含:使細胞群與不足以使存在於細胞上之TβR飽和(例如,佔據少於70%、60%、50%、40%或30%存在於細胞上之TβR)之量的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸,該構築體或複合物包含至少一種親和力減小之變異體MOD;及允許包含至少一種親和力減小之變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物與細胞相互作用(例如,持續一段足以結合之時間)。在此方法中,表現由包含至少一種親和力減小之變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物所結合之TβR及共MOD兩者的細胞之數目除以表現由包含至少一種親和力減小之變異體MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物所結合之共MOD的細胞之數目的比率(i)大於(ii)表現由包含wt.MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物所結合之TβR及共MOD兩者的細胞之數目除以表現由包含wt.MOD之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物所結合之共MOD的細胞之數目的比率。
本揭示案提供將經掩蔽之TGF-β多肽及至少一種wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽兩者遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內),其包含視情況在維生素D、視黃酸(例如,全反視黃酸)及/或雷帕黴素存在下,使靶細胞與包含至少一種wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物接觸。在一種情況下,在維生素D、視黃酸(例如,全反視黃酸)及/或雷帕黴素中任一者、任兩者或所有三者存在下,遞送包含至少一種wt.或變異體IL-2 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β多肽。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-6 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-7 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-15 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-21 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體IL-23 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在
活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體PD-L1 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
本揭示案提供將包含至少一種野生型及/或變異體FasL MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物遞送及視情況選擇性遞送至靶細胞(例如,在活體外或活體內)。
3 治療或預防方法
本揭示案提供治療及預防方法,該等方法可包含接觸來自個體之靶細胞群(例如,在活體外或活體內)及/或向個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)或編碼有效地選擇性調節靶細胞群之活性及/或治療個體之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸或表現載體。當將靶細胞與個體單獨治療(亦即,在活體外)時,可將細胞或其子代之全部或一部分投與個體。在一些情況下,治療或預防方法包含向有需要之個體投與有效量之包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之核苷酸序列的一或多種重組表現載體。在一些情況下,治療或預防方法包含向有需要之個體投與包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之核苷酸序列的一或多種mRNA分子。在一些情況下,治療或預防方法包含使來自有需要之個體之靶細胞群(亦即,在活體外)與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)接觸並且由此形成經接觸之靶細胞群,該方法進一步包含將經接觸之靶細胞(及/或其子代)群之全部或一部分投與個體。在一些情況下,治療或預防方法包含向有需要之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039),或包含有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)的醫藥學上可接受之組成物。可用包含有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,
PSM-4033-4039)的組成物來治療(例如,治癒及/或改善症狀)之病狀包括:與數目不足之Treg細胞或活性不充分之Treg細胞相關之病狀、自體免疫疾病或病症、過敏性反應、傷口(例如,皮膚及/或黏膜傷口)及/或燒傷。另外,經歷器官移植之個體亦可受益於治療。
治療或預防方法包含向具有不足數目之FoxP3+Treg細胞或不充分活性之FoxP3+Treg細胞的個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含PSM-4033-4039。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2或變異體IL-2 MOD多肽序列。在具有或不具有IL-2或變異體IL-2 MOD的情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)可在投與維生素D(例如,1α,25-二羥維生素D3或1α,25-二羥基膽鈣化醇)或維生素D類似物、雷帕黴素及/或視黃酸(例如,全反視黃酸)中之任何一或多者之前、期間(同時或組合投與)或之後投與。
治療或預防方法可包含向有需要之患有自體免疫疾病或病症之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之核苷酸序列的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-2或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,PSM-4033-4039)。在第二實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽序列。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含至少一個獨立選定之IL-2或變異體IL-2 MOD多肽序列及至少一個獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽序列。在第二實例
中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽序列。可用本揭示案之方法治療之自體免疫疾病包括但不限於艾迪森氏病、斑禿、關節黏連性脊椎炎、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫相關性不孕症、自體免疫血小板減少性紫癜、大皰性類天皰瘡、克羅恩氏病、古巴士德氏症候群、腎絲球腎炎(例如新月形腎絲球腎炎、增生性腎絲球腎炎)、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力(myasthenia gravis,MG)、天皰瘡(例如尋常性天皰瘡)、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、休格倫氏症候群、系統性紅斑狼瘡(SLE)、血管炎及白斑病。在一實施例中,可用本揭示案之方法治療之自體免疫疾病為T1D。在一實施例中,可用本揭示案之方法治療之自體免疫疾病為乳糜瀉。T1D及/或乳糜瀉亦可自經受用本揭示案之方法來治療之自體免疫疾病中排除。
治療或預防方法包含向患有Th17細胞缺乏之個體(例如,不能對腸道中之細菌及/或真菌感染充分反應之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-6或變異體IL-6 MOD多肽序列。治療或預防方法可包含向不能對腸道中之細菌及/或真菌感染充分反應之個體投與有效量之包含一或多個獨立選定之IL-6及/或變異體IL-6多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼包含一或多個獨立選定之IL-6及/或變異體IL-6多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向患有Th9細胞缺乏之個體(例如,不能對蠕蟲感染充分反應之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼足以對蠕蟲感染作出反應之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之一或多種核酸(例
如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-4或變異體IL-4 MOD多肽序列。治療或預防方法可包含向不能對蠕蟲感染充分反應之個體投與有效量之包含一或多個獨立選定之IL-4及/或變異體IL-4多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼包含一或多個獨立選定之IL-4及/或變異體IL-4多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向患有Tfh細胞缺乏之個體(例如,不能產生高親和力抗體或足夠量之高親和力抗體之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼足以增加高親和力抗體之產生的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-21、IL-23、變異體IL-21或變異體IL-23 MOD多肽序列。治療或預防方法可包含向不能產生高親和力抗體或不足量之高親和力抗體之個體投與有效量之包含一或多個獨立選定之IL-21、IL-23、變異體IL-21或變異體IL-23 MOD多肽序列之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼包含一或多個獨立選定之IL-21、IL-23、變異體IL-21或變異體IL-23 MOD多肽序列之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向相對於對照組具有過度Th1細胞活性之個體(例如,在目標組織或循環中具有較高水準之活化巨噬細胞及/或較高水準之干擾素γ「IFN-γ」之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之一或多種核酸(例如,重組表現載體)。治療或預防方法可包含向具有較高水準之活化巨噬細胞及/或較高水準之干擾素γ「IFN-γ」(例如,在循環或目標組織中)之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載
體)。
治療或預防方法包含向相對於對照組具有過度Th2細胞活性之個體(例如,具有較高水準之活化肥大細胞且/或具有較高水準之循環或組織局部之IgE之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。治療或預防方法可包含向具有較高水準之活化肥大細胞且/或具有較高水準之IgE(循環或組織局部)之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向具有T-細胞受體驅動之自體反應性T細胞(或高親和力T-細胞)活化的個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。治療或預防方法可包含向具有自體反應性T-細胞之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039),或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向需要(例如,藉由控制胸腺細胞IL-7Ra表現)促進低親和力CD4+及/或CD8+ T細胞之IL-7依賴性存活的個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-7或變異體IL-7 MOD多肽序列。治療或預防方法可包含向不能充分保持低親和力CD4+及/或CD8+ T細胞之水準之個體投與有效量之包含一或多個獨立選定之IL-7及/或變異體IL-7多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或編碼包含一或多個獨立選定之IL-7及/或變異體IL-7多肽之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療或預防方法包含向需要促進特定細胞(例如,癌細胞或帶有特定標記諸如癌症抗原15-3、27-29、125、癌胚抗原、α-胎蛋白及/或β2-微球蛋白之癌細胞)之細胞凋亡的個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之wt.Fas配位體或變異體Fas配位體MOD多肽序列。
治療或預防方法包含向需要誘導iTreg(CD4+FoxP3+)細胞之個體(例如,需要誘導周圍耐受性,從而主動地抑制效應T(Teff)細胞及/或抑制免疫介導之組織破壞之個體)投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之wt.或變異體PD-L1 MOD多肽序列。在另一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之wt.及/或變異體PD-L1 MOD多肽序列及一或多個wt.及/或變異體IL-2 MOD多肽序列。在一實施例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含(i)一個獨立選定之wt.或變異體PD-L1 MOD多肽序列及(ii)一個wt.或變異體IL-2 MOD序列。參見例如Francisco等人,J.Exp.Med.,206(13):3015-3029(2009)。
治療或預防方法包含向需要抑制II型先天淋巴細胞(ILC2細胞)(例如,抑制哮喘、過敏性反應、及/或過敏性發炎)之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變
異體IL-10 MOD多肽序列。在具有或不具有IL-10或變異體IL-10 MOD的情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)可在投與糖皮質激素(例如,地塞米松、普賴松等)、抗組織胺(例如,苯海拉明、氯菲安明等)及/或腎上腺素之前、期間(同時或組合投與)或之後投與。
治療或預防方法包含向患有過敏症、過敏性發炎及/或較高水準之IgE(循環或組織局部)之個體投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。治療或預防方法可包含向具有較高水準之IgE(循環或組織局部)之個體投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在具有或不具有IL-10或變異體IL-10 MOD的情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)可在投與糖皮質激素(例如,地塞米松、普賴松等)、抗組織胺(例如,苯海拉明、氯菲安明等)及/或腎上腺素之前、期間(同時或組合投與)或之後投與。TGF-β及IL-10用於抑制使肥大細胞活化之高親和力IgE受體(Fc1RI)之表現並且IL-10另外用於預防過度肥大細胞活化及慢性炎症之發展。參見例如Kennedy等人Journal of Immunology,180(5)2848-2854(2008)。
預防方法包含向經診斷患有或具有多發性硬化之個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含一或多個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定
之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽序列。
治療具有至少一個皮膚或黏膜燒傷之個體的方法,該方法包含向個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在一實例中,該方法可包含投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。燒傷可為一度、二度或三度燒傷。
治療具有至少一個皮膚或黏膜傷口(表皮或黏膜之擦傷、撕脫、切口、割傷或刺傷)之個體的方法,該方法包含向個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)進行相對於未治療傷口,加速傷口閉合(縮短閉合之時間)、縮短癒合時間、或減少癜痕形成。在一實例中,該方法可包含投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。當在具有或不具有IL-10 MOD多肽的情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含TGF-β1多肽時,該方法可進一步包含以下中之一或多者:將炎症細胞募集至損傷部位;表現細胞外基質蛋白諸如纖連蛋白、膠原蛋白(例如,I及/或III型)及/或VEGF;刺激纖維母細胞收縮以實現傷口閉合;整聯蛋白諸如β1、α5、αv及β5之傷口部位表現;及角化細胞遷移。當在具有或不具有IL-10 MOD多肽的情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含TGF-β2多肽時,該方法可進一步包含以下中之一或多者:將來自循環及傷口邊緣之纖維母細胞及免疫細胞兩者募集至傷口區域中;表現膠原蛋白(例如,I及/或III型);及表現纖連蛋白。參見例如Pakyari
等人Adv Wound Care,2(5):215-224(2013)。在此類方法中,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可直接施加或注射至傷口中。
治療具有至少一個皮膚或黏膜傷口(表皮或黏膜之擦傷、撕脫、切口、割傷或刺傷)之個體的方法,該方法包含向個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β(例如,TGF-β3)構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β3構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)以便相對於未經治療之傷口,減少癜痕形成。在一實例中,該方法可包含投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β(例如,TGF-β3)構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β(例如,TGF-β3)構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。在此等方法中,經掩蔽之TGF-β(例如,TGF-β3)構築體或複合物可直接施加或注射至傷口中。不受理論約束,可理解TGF-β3減少1型膠原蛋白沉積,同時促進藉由MMP-9之膠原蛋白降解,導致癜痕形成減少。參見例如Pakyari等人Adv Wound Care,2(5):215-224(2013)。
促進個體之器官移植之方法,該方法包含向個體投與有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)以便相對於器官移植類型、年齡、性別、吸煙習慣及/或身體質量指數匹配之未治療個體中平均閉合時間、癒合時間或癜痕形成,加速切口閉合(縮短閉合之時間)、縮短癒合時間或減少癜痕形成。在一實例中,該方法可包含投與有效量之包含至少一個(例如,一個、兩個或三個)獨立選定之IL-10或變異體IL-10 MOD多肽的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
治療患有移植物抗宿主疾病(GVHD,包括急性GVHD)之個體的方
法,該方法包含投與個體有效量之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)。
在任何前述方法中,除非另外規定,否則經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之TGF-β多肽可為如前述章節中論述之TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3多肽或其變異體(例如,具有限制TGF-β多肽二聚化之對應突變的TGF-β3 C77S變異體或TGF-β1或TGF-β2變異體)。類似地,掩蔽TGF-β多肽之多肽可選自如上所述之多肽(例如,抗體或其片段、單鏈抗體或結合至TGF-β之TβRI或TβRII胞外域片段)。
如上所示,在一些情況下,在進行本發明治療或預防方法中,將經掩蔽之TGF-β構築體或複合物投與有需要之個體,如多肽本身。在其他情況下,在進行本發明治療或預防方法中,將包含編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之核苷酸序列的一或多種核酸投與有需要之個體。因此,在其他情況下,向有需要之個體投與一或多種核酸,例如,一或多種重組表現載體。
N.劑量
合適的劑量可由主治醫師或其他合格醫務人員基於各種臨床因素來判定。如醫學技術中所熟知,用於任一患者之劑量視許多因素而定,包括患者之體型、身體表面積、年齡、待投與之特定多肽或核酸、患者之性別、投與時間及途徑、一般健康狀況、及同時投與之其他藥物。經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可投與之量介於1ng/kg體重與20mg/kg體重/劑量之間,例如在0.1mg/kg體重至10mg/kg體重之間,例如在0.5mg/kg體重至5mg/kg體重之間;然而,設想低於或高於此示範性範圍之劑量,特別是考慮到上述因素。若方案為連續輸注,則其亦可處於1μg至10mg/kg體重/min之範圍內。經掩蔽之TGF-β構築體或複合物可投與之量為約1mg/kg體重至50mg/kg體重,例如約1mg/kg體重
至約5mg/kg體重、約5mg/kg體重至約10mg/kg體重、約10mg/kg體重至約15mg/kg體重、約15mg/kg體重至約20mg/kg體重、約20mg/kg體重至約25mg/kg體重、約25mg/kg體重至約30mg/kg體重、約30mg/kg體重至約35mg/kg體重、約35mg/kg體重至約40mg/kg體重、或約40mg/kg體重至約50mg/kg體重。
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之合適劑量為0.01μg至100g/kg體重、0.1μg至10g/kg體重、1μg至1g/kg體重、10μg至100mg/kg體重、100μg至10mg/kg體重、或100μg至1mg/kg體重。一般熟習此項技術者可容易基於所量測之滯留時間及所投與之藥劑在體液或組織中之濃度來估計給藥之重複率。在成功治療之後,可能期望使患者經歷維持療法以預防疾病狀態之復發,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或單鏈經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的經投與之維持劑量的範圍為0.01μg至100g/kg體重、0.1μg至10g/kg體重、1μg至1g/kg體重、10μg至100mg/kg體重、100μg至10mg/kg體重、或100μg至1mg/kg體重。
熟習此項技術者將易於瞭解,劑量水準可隨特定經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、症狀嚴重程度及受試者對副作用之易感性而變化。給定化合物之較佳劑量可容易由熟習此項技術者藉由多種方式判定。
在一些情況下,投與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體之多個劑量。經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體之投與頻率可視多種因素中之任一者而定,例如,症狀之嚴重程度等而變化。例如,在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體每月投與一次、每月兩次、每月三次、每隔一周(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、每天兩次(qid)或每天三次(tid)。
經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體之投與持續時間,例如,投與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體之時間段可視多種因素中之任一者而定,例如,患者反應等而變化。舉例而言,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體可投與之時間段的範圍為約一日至約一週、約兩週至約四週、約一個月至約兩個月、約兩個月至約四個月、約四個月至約六個月、約六個月至約八個月、約八個月至約1年、約1年至約2年、或約2年至約4年、或更長時間。
O.投與途徑
使用適合於藥物遞送之任何可獲得方法及途徑,包括活體內及活體外方法,以及全身及局部投與途徑,將活性劑(經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體)投與個體。
習知及醫藥學上可接受之投與途徑包括腫瘤內、腫瘤周圍、肌肉內、氣管內、淋巴管內、顱內、皮膚、皮下、皮內、局部施用、靜脈內、動脈內、經直腸、經鼻、經口、以及其他經腸及非經腸投與途徑。投與途徑在需要時可經組合或根據經掩蔽之TGF-β構築體或複合物及/或所要效果而調整。經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、或核酸或重組表現載體可以單一劑量或多個劑量來投與。
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體靜脈內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體肌肉內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體淋巴管內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體局部投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體腫瘤內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體腫瘤周圍投與。在一些情況下,經掩蔽
之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體顱內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體經皮膚地投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體皮下投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體投與傷口(例如,皮膚或黏膜傷口)。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸或重組表現載體投與燒傷組織(例如,皮膚燒傷)。
在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物靜脈內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物肌肉內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物局部投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物腫瘤內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物腫瘤周圍投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物顱內投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物經皮投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物皮下投與。在一些情況下,經掩蔽之TGF-β構築體或複合物淋巴管內投與。在一些情況下,向傷口(例如,皮膚或黏膜傷口)投與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。在一些情況下,向燒傷組織(例如,皮膚燒傷)投與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸、或重組表現載體可使用適合於遞送習知藥物之任何可獲得習知方法及途徑,包括全身或局部途徑來投與宿主。一般而言,預期用於方法中的投與途徑包括但不一定限於經腸、非經腸、皮膚及吸入途徑。
除了吸入投與以外的非經腸投與途徑包括但不一定限於局部、經皮、皮下、肌肉內、眼眶內、囊內、脊柱內、胸骨內、腫瘤內、淋巴管內、腫瘤周圍及靜脈內途徑,亦即除通過消化道以外的任何投與途徑。可執行非經腸投與以便實現經掩蔽之TGF-β構築體或複合物、核酸、或重組表現載體之全身
或局部遞送。在需要全身性遞送時,遞送通常涉及醫藥製劑之侵襲性或全身性吸附性局部或黏膜投與。
P.適於治療之受試者
適於用經掩蔽之TGF-β構築體或複合物例如,PSM-4033-4039),諸如藉由本文所述方法治療之受試者包括具有自體免疫疾病、過敏性反應、傷口(例如,皮膚及/或黏膜傷口)及/或燒傷之個體(例如,人類)。受試者另外包括經歷器官移植之個體。除人類外,受試者亦包括非人類哺乳動物,包括但不限於需要治療的牛、犬、山羊、猴、貓、兔、鼠、綿羊、豬或猿猴受試者或患者。
患有自體免疫疾病或病狀並且適合用經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(例如,PSM-4033-4039)治療之受試者(個體)包括經診斷為患有自體免疫疾病或病狀之個體,及對自體免疫疾病或病狀治療但未能對治療作出反應的個體。可用本揭示案之方法治療之自體免疫疾病及病狀包括但不限於艾迪森氏病、斑禿、關節黏連性脊椎炎、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫結腸炎、自體免疫胃炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫相關性不孕症、自體免疫胰炎、自體免疫視網膜病、自體免疫血小板減少性紫癜、自體免疫蕁麻疹、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉、克羅恩氏病、古巴士德氏症候群、腎絲球腎炎(例如新月形腎絲球腎炎、增生性腎絲球腎炎)、移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease,GVHD,包括急性GVHD),格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、炎症性腸病、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力(MG)、天皰瘡(例如尋常性天皰瘡)、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、休格倫氏症候群、系統性紅斑狼瘡(SLE)、移植排斥反應、1型糖尿病(T1D)血管炎及白斑病。在一實施例中,自體免疫疾病為T1D。在一實施例中,自體免疫疾病為乳糜瀉。患有T1D及/或乳糜瀉之個體可自適於治療之受試者中排除。類似地,T1D及/或乳糜瀉可自經受治療之自體免疫疾病中排除。
在一實施例中,可用本揭示案之方法治療之自體免疫疾病及病狀包括但不限於類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬/牛皮癬性關節炎、多發性硬化、炎症性腸病、艾迪森氏病、格雷夫氏病、休格倫氏症候群、橋本甲狀腺炎、重症肌無力、自體免疫血管炎及惡性貧血。
患有過敏性反應之受試者不能容易地根據過敏原來分類,因為過敏原太多而不可敘述。但舉例而言,具有過敏反應之受試者(例如,先前接受過過敏治療或從未接受過治療之個體)包括對以下物質產生反應之受試者:花生及堅果、植物花粉、乳膠及其類似物。例如,患有對花生過敏原之過敏性反應的受試者包括對來自七個蛋白家族之Ara h 1至13蛋白具有反應之受試者,包括Ara h 1(例如,PGQFEDFF(SEQ ID NO:161)、YLQGFSRN(SEQ ID NO:162)、FNAEFNEIRR(SEQ ID NO:163)、QEERGQRR(SEQ ID NO:164)、DITNPINLRE(SEQ ID NO:165)、NNFGKLFEVK(SEQ ID NO:166)、GNLELV(SEQ ID NO:167)、RRYTARLKEG(SEQ ID NO:168)、ELHLLGFGIN(SEQ ID NO:169)、HRIFLAGDKD(SEQ ID NO:170)、IDQIEKQAKD(SEQ ID NO:171)、KDLAFPGSGE(SEQ ID NO:172)、KESHFVSARP(SEQ ID NO:173)、NEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSK(SEQ ID NO:174)、Ara h 2(例如,HASARQQWEL(SEQ ID NO:175)、QWELQGDRRC(SEQ ID NO:176)、DRRCQSQLER(SEQ ID NO:177)、LRPCEQHLMQ(SEQ ID NO:178)、KIQRDEDSYE(SEQ ID NO:179)、YERDPYSPSQ(SEQ ID NO:180)、SQDPYSPSPY(SEQ ID NO:181)、DRLQGRQQEQ(SEQ ID NO:182)、KRELRNLPQQ(SEQ ID NO:183)、QRCDLDVESG(SEQ ID NO:184)及Ara h 3(例如,IETWNPNNQEFECAG(SEQ ID NO:185)、GNIFSGFTPEFLAQA(SEQ ID NO:186)、VTVRGGLRILSPDRK(SEQ ID NO:187)、DEDEYEYDEEDRRRG(SEQ ID NO:188)。參見例如Zhou等人,(2013)Intl.J.of Food Sci.2013:8頁論文ID
909140。具有過敏性反應之受試者亦包括對膜翅目昆蟲蛋白(例如,蜜蜂及黃蜂毒素中之過敏原諸如磷脂酶A2、蜂毒蛋白、見於黃蜂毒素中之「抗原5」及透明質酸酶)具有反應之受試者。
具有傷口之受試者包括具有表皮或黏膜之擦傷、撕脫、切口、割傷或刺傷之個體。可理解具有器官移植之受試者就其本質而言具有彼等傷口類型中之一或多者。
V.某些態樣
包括針對如上所述之TGF-β構築體或複合物的標的物之態樣的某些態樣單獨或與一或多個其他態樣組合時可為有益的,諸如以下針對TGF-β構築體及複合物、其製造方法及其使用方法(例如,如治療劑)敘述之彼等態樣。
1.一種構築體,其包含以下各者作為第一多肽:
i)支架多肽序列;
ii)TGF-β多肽序列;
iii)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列);
iv)視情況選用之一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列;以及
v)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於任何前述多肽序列之間);包含此等元件之構築體在本文中共同地稱為「經掩蔽之TGF-β構築體」,其中掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列)與TGF-β多肽序列彼此結合(彼此相互作用來掩蔽TGF-β多肽序列)。參見例如,圖1,結構A。
2.態樣1之經掩蔽之TGF-β構築體,其中第一多肽以自N端至C端之順序包含:
i)支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列;
或
ii)第一MOD多肽序列、支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列;或
iii)第一獨立選定之MOD多肽序列、第二獨立選定之MOD多肽序列(呈串聯形式之MOD)、支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列;其中經掩蔽之TGF-β構築體視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如介於任何前述多肽序列之間)。
3.態樣1或態樣2之經掩蔽之TGF-β構築體,其中支架多肽包含二聚化(或多聚化)序列。
4.態樣3之經掩蔽之TGF-β構築體,其呈經掩蔽之TGF-β複合物同二聚體形式,其中支架多肽序列視情況具有一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)彼此共價連接(例如,二硫鍵)(例如,其中經掩蔽之TGF-β構築體之作為第一多肽之第一分子與經掩蔽之TGF-β構築體之作為第二多肽之第二分子經由其支架多肽序列之共價或非共價相互作用來二聚化以形成同二聚體),視情況其中支架包含Ig Fc多肽,其包括實質上減弱或消除Ig多肽例如經由補體依賴性細胞毒性(CDC)及/或抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)誘導細胞溶解之能力的突變(例如,LALA突變)。參見例如圖1,結構B。
5.態樣1-3中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體,其中支架多肽包含種間二聚化序列(例如,優先與其對應種間結合序列二聚化,而非同二聚化之二聚化序列)。
參見例如,圖1,結構C及F。
6.態樣5之經掩蔽之TGF-β構築體,進一步包含與第一多肽二聚化以形成經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體的第二多肽;其中第二多肽包含含有第一多肽之種間結合序列的對應種間二聚化序列的支架
多肽序列;並且其中種間結合序列與對應種間結合序列在異二聚體中彼此相互作用。
7.態樣6之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第二多肽包含:
(i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;
(ii)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列(例如,呈串聯形式)及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;
(iii)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列及獨立選定之MOD序列;或
(iv)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列(例如,呈串聯形式)及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;其中第一及或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於任何前述多肽序列之間)。參見例如,圖1,結構F。
8.態樣6或7之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第二多肽自N端至C端包含:
i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;
(ii)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列(例如,呈串聯形式)及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;
(iii)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列及一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列;或
(iv)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列(例如,呈串聯形式)及包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列其中第一及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於任何前述多肽序列之間)。參見例如,圖1,結構F。
9.態樣6之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第二多肽包含:
i)視情況選用之一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列;
ii)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列;
iii)TGF-β多肽序列;
iv)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列);以及
v)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於第二多肽之任何前述多肽序列之間);其中掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列)與TGF-β多肽序列彼此結合(彼此相互作用來掩蔽TGF-β多肽序列)。參見例如,圖1,結構C。
10.態樣9之經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體,其中第二多肽以自N端至C端之順序包含:
i)包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列;
ii)第一MOD多肽序列、包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列;或
iii)第一獨立選定之MOD多肽序列、第二獨立選定之MOD多肽序列、包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列、掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列)及TGF-β多肽序列。參見例如,圖1,結構C。
11.一種複合物,其包含第一多肽及第二多肽作為異二聚體(或多聚體),其中:
(i)該第一多肽包含
a)包含種間二聚化序列之支架多肽序列,
b)掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列),
c)視情況選用之一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列,以及
d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於該第一多肽之任何前述多肽序列之間);
(ii)該第二多肽包含
a)支架多肽序列,其包含第一多肽中之種間二聚化序列的對應種間二聚化序列,
b)TGF-β多肽序列,
c)視情況選用之一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列,以及
d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於該第二多肽之任何前述多肽序列之間);包含此等元件之複合物共同地稱為「經掩蔽之TGF-β複合物」,其中該掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列)與該TGF-β多肽序列彼此結合(彼此相互作用來掩蔽該TGF-β多肽序列);其中該種間結合序列與該對應種間結合序列在該異二聚體中彼此相互作用(例如非共價結合);並且其中經掩蔽之TGF-β第一多肽及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列(例如,介於其任何多肽序列之間)。參見例如,圖1,結構D及E。
12.態樣11之經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體,其中第一多肽自N端至C端包含:
a)一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列、包含種間二聚化序列之支架多肽序列及掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列),或
b)包含種間二聚化序列之支架多肽序列及掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列);並且第二多肽自N端至C端包含一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列、包含對應種間二聚化序列之支架多肽序列及TGF-β多肽序列。
13.態樣1-12中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中支架多肽序列選自由以下組成之群:Ig Fc多肽序列(例如,CH2-CH3區序列);Ig重鏈區1(CH1)域;輕鏈恆定區(「CL」)(例如Ig κ鏈(κ鏈)恆定區或Ig λ鏈(λ鏈));白胺酸拉鍊多肽序列;Fos或Jun結合對序列;集合蛋白多肽(例如,ACRP30或ACRP30樣蛋白);捲曲螺旋域;以及前述中之任一者之變異體(例如,表1中之杵臼及其他種間序列)。
14.態樣1-13中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中支架多肽序列選自由以下組成之群:Ig Fc多肽序列(免疫球蛋白序列);Ig重鏈序列(例如,CH2-CH3區序列):Ig重鏈區1(CH1)域;輕鏈恆定區(「CL」)(例如Ig κ鏈(κ鏈)以及前述中之任一者之變異體。在一個實施例中,支架多肽選自帶有MD13取代之Ig CH1域或帶有MD13取代之Ig κ鏈序列。
15.態樣14之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白序列包含與SEQ ID NO:68至83或85-87中之任一者具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。參見例如,圖2A-2H及2J-2K。(免疫球蛋白序列可形成二聚體並且在諸如圖2H中之IgM序列的情況下,形成多聚體)。
16. 15之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白序列包含與SEQ ID NO:68至83中之任一者具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的免疫球蛋白重鏈序列。參見例如,圖2A-2H。(免疫球蛋白序列可形成二聚體並且在諸如圖2H中之IgM序列的情況下,形成多聚體)。
17.態樣4及6-16中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中支架多肽序列具有一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)彼此之共價連接。
18.態樣17之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個共價連接中之至
少一者(例如,一者、兩者或兩者以上)為第一多肽之支架多肽序列與第二多肽之支架多肽序列之間的二硫鍵。
19.態樣14-18中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中支架序列為免疫球蛋白重鏈恆定區(Ig Fc)多肽序列,其包含視情況藉由一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)二硫鍵共價連接之CH2-CH3免疫球蛋白區。
20.態樣5之經掩蔽之TGF-β構築體,其中支架多肽包含選自由以下組成之群的種間二聚化序列:i)種間免疫球蛋白(Ig)重鏈序列;ii)Ig CH1域;iii)Ig輕鏈恆定區(「CL」)(例如Ig κ鏈(κ鏈)或Ig λ鏈(λ鏈)恆定區);以及(iv)Fos/Jun結合對之多肽。在一實施例中,支架多肽包含選自帶有MD13取代之Ig CH1域或帶有MD13取代之Ig κ鏈序列的種間二聚化序列。
21.態樣20之經掩蔽之TGF-β構築體,其中種間結合序列包含與SEQ ID NO:68至82或85-87中之任一者具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。參見例如,圖2A-2G及2J-2K。
22.態樣4及6-12中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽及第二多肽之支架多肽包含選自由以下組成之群的種間二聚化序列及對應種間二聚化序列對:(i)種間免疫球蛋白(Ig)重鏈序列(例如,重鏈CH1-CH2區);(ii)Ig CH1域及其對應種間輕鏈恆定區(「CL」)(例如Ig κ鏈(κ鏈)恆定區或Ig λ鏈(λ鏈)恆定區)中之一者;(iii)Fos/Jun結合對;以及(iv)Ig重鏈區1(CH1)及輕鏈恆定區(「CL」)序列(CH1/CL對,諸如與κ或λ Ig輕鏈恆定區序列配對之CH1序列)。在一實施例中,第一多肽及第二多肽之支架多肽包含種間二聚化序列及對應種間二聚化序列對,該對包含帶有MD13取代之Ig CH1域及帶有MD13取代之Ig κ鏈序列。
23.態樣22之經掩蔽之TGF-β複合物,其中支架多肽序列具有一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)彼此之共價連接。
24.態樣22之經掩蔽之TGF-β複合物,其中一或多個共價連接中之至少一者(例如,一者、兩者或兩者以上)為第一多肽之支架序列與第二多肽之支架序列之間的二硫鍵。
25.態樣22-24中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物,其中支架序列為免疫球蛋白重鏈恆定區(Ig Fc)多肽序列,其包含視情況藉由一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)二硫鍵(介於第一多肽與第二多肽之間)共價連接之CH2-CH3免疫球蛋白區。
26.態樣22-25中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物,其中種間結合序列及/或對應種間結合序列包含與SEQ ID NO:68至82或85-87中之任一者具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的序列。參見例如,圖2A-2G及2J-2K。
27. 26之經掩蔽之TGF-β複合物,其中免疫球蛋白序列包含與SEQ ID NO:68至83中之任一者具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100% aa序列一致性的免疫球蛋白重鏈序列。參見例如,圖2A-2H。(免疫球蛋白序列可形成二聚體並且在諸如圖2H中之IgM序列的情況下,形成多聚體)。
27.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多肽序列與圖2A描述之IgA Fc序列(SEQ ID NO:68)之至少150個連續aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350個連續aas)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
28.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多
肽序列與圖2B描述之IgD Fc序列(SEQ ID NO:69)之至少150個連續aas(至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325或至少350個連續aas)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
29.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多肽序列與圖2C描述之IgE Fc序列(SEQ ID NO:70)之至少125個連續aas(至少150、至少175或至少200個連續aas)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
30.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多肽序列與wt.IgG Fc多肽序列,諸如圖2D描述之IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71-78)之至少125個連續aas(至少150、至少175或至少200個連續aas)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
31.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多肽序列與圖2E描述之IgG2 Fc多肽序列(SEQ ID NO:79)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
32.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多
肽序列與圖2F描述之IgG3 Fc序列(SEQ ID NO:80)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200或至少225個)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
33.態樣1-27中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含支架多肽序列,該序列視情況包含種間二聚化序列及/或對應種間二聚化序列,其中支架多肽序列與圖2G描述之IgG4 Fc序列(SEQ ID NO:81或82)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200、至少225或至少250個)或所有aas具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性。
34.態樣27-33中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物,其包含介於第一多肽與第二多肽之間(例如,與其IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列之鉸鏈區相鄰的半胱胺酸之間)的一或兩個鏈間二硫鍵。
35.態樣1-34中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個支架多肽包含免疫球蛋白(Ig)多肽序列,該Ig多肽序列帶有限制(例如,減少)多肽與補體組分1q(C1q)及/或Fc λ受體(FcλR)之結合及/或實質上減弱或消除Ig多肽經由補體依賴性細胞毒性(CDC)及/或抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)誘導細胞溶解之能力的一或多個取代。
36.態樣35之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中各支架多肽包含免疫球蛋白(Ig)多肽序列,該Ig多肽序列包含與wt.IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:71)之至少125個連續aas(至少150、至少175、至少200或至少220個連續aas)具有至少約70%(例如,至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%)aa序列一致性的多肽。
37.態樣36之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含
aas 234、235、236、237、238、及239(234-LLGGPS-239)中任一者、兩者或兩者以上之取代。
38.態樣36或37之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含N297、P331、D270、K322及/或P329中任一者、兩者或兩者以上之取代。
39.態樣36-38中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含用除天冬醯胺以外之aa(例如,丙胺酸以給出諸如SEQ ID NO:74中之N297A)的N297取代(SEQ ID NO:71之N77)。
40.態樣36-38中之任一者之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含用除白胺酸以外之aa(例如,丙胺酸,L234A及/或L235A)的L234及/或L235(SEQ ID NO:71中之L14及L15)取代。
41. 39之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含L234A及/或L235A取代(參見例如,SEQ ID NO:75)。
42.態樣36-41中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含經除脯胺酸以外之aa(例如,絲胺酸用於P331S取代)取代之P331(SEQ ID NO:71之P111)。
43.態樣36-38中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含L234及/或L235處之取代及P331之取代
44.態樣43之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中免疫球蛋白多肽序列包含(i)L234F、L235E及P331S或(ii)L234A、L235A及P331S取代。
45.態樣20-44中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其包含選自由以下組成之群的種間二聚化對之種間二聚化序列:KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s及A107序列(參見,例如,表1)。
46.態樣4及22-44中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物,其中種間二聚化序列及對應種間二聚化序列為選自由以下組成之群的一對序列:KiH、KiHs-s、HA-TF、
ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s及A107序列對(參見,例如,表1)。
47.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽及第二多肽中之一者包含種間IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71之序列),其包含T366Y取代且另一者包含Y407T取代,或其他種間免疫球蛋白重鏈序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重鏈序列之種間序列)中之相應取代。
48.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽及第二多肽中之一者包含種間IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71之序列),其包含T366W取代且另一者包含T366S、L368A及Y407V取代,或其他種間免疫球蛋白重鏈序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重鏈序列之種間序列)中之相應取代。
49.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽及第二多肽中之一者包含種間IgG1多肽序列(例如,SEQ ID NO:71之序列),其包含Y349C、T366S、L368A及Y407V取代且另一者包含S354C及T366W取代,或其他種間免疫球蛋白重鏈序列(例如,包含IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3或IgG4重鏈序列之種間序列)中之相應取代。
50.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽包含具有T146W KiH----序列取代之IgG1支架,且第二多肽包含具有T146W、L148A及Y187V KiH序列取代之IgG1支架,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170個(例如,至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個)連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列,且視情況包含如在SEQ ID NO:71中編號之以下一或多者處之取代:L14及L15(例如,L14A/L15A「LALA」或L14F/L15E);N77(例如,N77A);P111(例如,P111S);L131(例如,L131K);T146(例如,T146S);P175(例如,P175V);F185(例如,F185R);Y187(例如,Y187A);及K189(例如,K189Y)。
51.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽包含具有T146W KiH----序列取代之IgG1支架,且第二多肽包含具有T146S、L148A及Y187V KiH序列取代之IgG1支架,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170個(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個)連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能的N77取代(N297,例如,Kabat編號中之N297A或N297G)。參見例如,圖2D SEQ ID NO:77及78,
52.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一多肽包含具有T146W及S134CKiHs-s取代之IgG1支架,且第二多肽包含具有T146S、L148A、Y187V及Y129CKiHs-s取代之IgG1支架,其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170個(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個)連續aas具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;其中第一及第二多肽之支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能的N77(Kabat編號中之N297)取代(例如,Kabat編號中之N297A或N297G取代)。
53.態樣46之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一及第二多肽選自:包含具有S144H及F185A取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有Y129T及T174F取代之IgG1支架的第二多肽;包含具有T130V、L131Y、F185A及Y187V取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有130V、T146L、K172L及T174W取代之IgG1支架的第二多肽;包含具有K140D、D179M及Y187A取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有
E125R、Q127R、T146V及K189V取代之IgG1支架的第二多肽;包含具有K189D及K172D取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有D179K及E136K取代之IgG1支架的第二多肽;包含具有K140E及K189W取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有Q127R、D179V及F185T取代之IgG1支架的第二多肽;包含具有K140E、K189W及Y129C取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有Q127R、D179V、F185T及S134C取代之IgG1支架的第二多肽;以及包含其有K150E及K189W取代之IgG1支架的第一多肽,及包含具有E137N、D179V及F185T取代之IgG1支架的第二多肽;其中支架包含與SEQ ID NO:71之IgG1之至少170個(例如至少180、至少190、至少200、至少210、至少220或所有227個)連續aas具有至少80%、90%.95%、98%、99%或100%序列一致性的序列;並且其中第一及第二多肽之支架aa序列中沒有一者、有一者或兩者包含L14及L15取代(例如,Kabat編號中之L234A及L235A「LALA」),及/或藉由阻斷與Fcγ受體之相互作用來移除效應功能的N77(Kabat編號中之N297)取代(例如,Kabat編號中之N297A或N297G取代)。
54.態樣20之經掩蔽之TGF-β構築體,其中支架多肽包含選自由以下組成之群的種間二聚化序列:
(i)Ig重鏈CH1域(例如,SEQ ID NO:85之多肽);
(ii)Ig κ鏈恆定區序列(例如,SEQ ID NO:86);以及
(iii)Ig λ鏈恆定區序列(例如,SEQ ID NO:87);其中支架包含分別與SEQ ID NO:85、86或87之至少70、至少80、至少90或至少100個連續aas具有至少80%(85%、90%、95%、98%、99%或100%)序列
一致性的序列。參見圖2J及2K。Ig CH1域及/或Ig κ鏈序列視情況包含其相應MD13取代。
55.態樣22之經掩蔽之TGF-β複合物,其中第一及第二多肽中之一者之支架多肽包含Ig重鏈CH1域(例如,SEQ ID NO:85之多肽);且第一及第二多肽中之另一者包含Ig κ鏈恆定區序列(例如,視情況包含MD13取代之SEQ ID NO:86)或Ig λ鏈恆定區序列(例如,SEQ ID NO:87);其中支架包含分別與SEQ ID NO:85、86或87之至少70、至少80、至少90或至少100個連續aas具有至少80%(85%、90%.95%、98%、99%或100%)序列一致性的序列。參見圖2J及2K。
56.態樣1-56中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之連接子多肽序列。
57.態樣56之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中獨立選定之連接子具有約1 aa至約25 aa之長度(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 aa長度)。
58.態樣56之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中獨立選定之連接子具有約25至約35 aa之長度(例如,25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35 aa長度)。
59.態樣56之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中獨立選定之連接子具有約35至約50 aa之長度(例如,35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45、46、47、48、49或50 aa長度)。
60.態樣56至59中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之連接子包含
(i)甘胺酸或含有具有約2至約50個連續甘胺酸殘基之序列的聚甘胺酸;
(ii)甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如,(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:126)、(GGGGS)n SEQ ID NO:136及(GGGS)n(SEQ ID NO:127),其中n為至少1之整數(例如,1-10、10-20或20-30);或
(iii)甘胺酸-丙胺酸聚合物或丙胺酸-絲胺酸聚合物(例如,具有1-10、10-20或20-30 aa之長度)。
61.態樣56至59中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中獨立選定之連接子中之至少一者(例如,至少兩者或至少三者)包含選自由以下組成之群的aa序列:GGSG(SEQ ID NO:128)、GGSGG(SEQ ID NO:129)、GSGSG(SEQ ID NO:130)、GSGGG(SEQ ID NO:131)、GGGSG(SEQ ID NO:132)、GSSSG(SEQ ID NO:133)、GSGS(SEQ ID NO:134)、GSSSSS(SEQ ID NO:135)、GGGGS SEQ ID NO:136及其類似序列。
62.態樣56至59中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中獨立選定之連接子中之至少一者包含半胱胺酸殘基(例如,G C GASGGGGSGGGGS連接子aa序列SEQ ID NO:137),其可或確實與存在於經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之第二多肽中(例如,在第二多肽之連接子中)的半胱胺酸殘基形成二硫鍵。
63.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列選自由以下組成之群:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一者之變異體(例如,相對於相應wt.MOD多肽序列,對其受體具有減小之親和力的變異體)。
64.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列選自由以下組成之群:PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一者之變異體(例如,相對於相應wt.MOD多肽序列,對其受體具有減小
之親和力的變異體)。
65.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列選自由以下組成之群:PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-10 MOD多肽序列及其任一者之變異體(例如,相對於相應wt.MOD多肽序列,對其受體具有減小之親和力的變異體)。
66.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中MOD多肽序列中之至少一者(例如,至少兩者)為IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列:
(i)與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性;或
(ii)與SEQ ID NO:13-27之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性。
67.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)選自由以下組成之群的至少一個(例如,至少兩個)MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一者之變異體(例如,相對於相應wt.MOD多肽序列,對其受體具有減小之親和力的變異體)。
68.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)wt.IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列或變異體PD-L1或PD-L2 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對PD1受體具有減小之親和力)。
69.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)wt.IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)FAS-L MOD多肽序列或變異體FAS-L MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對Fas受體具有減小之親和力)。
70.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)wt.IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-1 MOD多肽序列或變異體IL-1 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-1受體具有減小之親和力)。
71.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-4 MOD多肽序列或變異體IL-4 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-4受體具有減小之親和力)。
72.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例
如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-6 MOD多肽序列或變異體IL-6 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-6受體具有減小之親和力)。
73.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-7 MOD多肽序列或變異體IL-7 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-7受體具有減小之親和力)。
74.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-10 MOD多肽序列或變異體IL-10 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-10受體具有減小之親和力)。
75.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-15 MOD多肽序列或變異體IL-15 MOD多肽序列(例如,相對於相應wt.序列,對IL-15受體具有減小之親和力)。
76.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例
如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-21 MOD多肽序列(例如,SEQ ID NO:58或60之序列)或變異體IL-21(例如,相對於相應wt.序列,對IL-21受體具有減小之親和力)MOD多肽序列。
77.態樣1至62中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多個(例如,一個、兩個或兩個以上)獨立選定之MOD多肽序列包含:
(i)至少一個(例如,至少兩個)wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:9之序列)或變異體IL-2 MOD多肽序列(例如,態樣66之變異體IL-2 MOD多肽序列);以及
(ii)至少一個(例如,至少兩個)IL-23 MOD多肽序列(例如,SEQ ID NO:63或65)或變異體IL-23(例如,相對於相應wt.序列,對IL-23受體具有減小之親和力)MOD多肽序列。
78.態樣63至77中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中當TGF-β多肽/多肽複合物包含變異體IL-2 MOD多肽序列時,變異體IL-MOD多肽(例如,SEQ ID NO:9之變異體)包含N88、F42及/或H16中之任一者、兩者或所有者處之取代。
79.態樣78之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中至少一個變異體IL-2 MOD多肽序列包含F42A、F42T、H16A或H16T取代。
80.態樣78之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中至少一個變異體IL-2 MOD多肽序列包含:(i)F42A及H16A;(ii)F42T及H16A;(iii)F42A及H16T;或(iv)F42T及H16T取代。
81.態樣78之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中至少一個變異體IL-2 MOD
多肽序列包含:(i)N88R、F42A及H16A;(ii)N88R、F42T及H16A;(iii)N88R、F42A及H16T;或(iv)N88R、F42T及H16T取代。
82.態樣1至81中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中掩蔽多肽序列為包含I型(TβRI)、II型(TβRII)或III型(TβRIII)TβR之胞外域片段的TGF-β受體(「TβR」)多肽序列。
83.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含與SEQ ID NO:117中列出之TβRII同功型A胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
84.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含與SEQ ID NO:119中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或143個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
85.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含與SEQ ID NO:120中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或143個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
86.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含選自包含以下各者之TβRII同功型B多肽序列的胺基酸序列:SEQ ID NO:120之胞外域片段;SEQ ID NO:121中之TβRII胞外域N端△14(δ14)aa缺失序列;SEQ ID NO:122中列出之N端△25(δ25)aa缺失序列;或與彼等TβRII同功型B多肽序
列中之任一者之至少70、至少80、至少90、至少100、至少110或118個連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的序列。
87.態樣83-86中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含F30、D32、S52、E55及/或D118中之任一者、兩者、三者、四者或所有五者之取代(例如,用丙胺酸或精胺酸)。
88.態樣83-87中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,包含:D118A或D118R取代(參見例如,SEQ ID NO:123之具有N端△25缺失及D118取代之TβRII胞外域);或D118A或D118R取代以及F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一者、兩者、三者或所有四者。
89.態樣87之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120之多達14 aas之N端缺失(△14 aa缺失)(參見例如,SEQ ID NO:121中之序列)及D118取代(例如,D118A或D118R);或與彼等TβRII多肽序列中之任一者之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或118個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的序列。
90.態樣89之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,進一步包含F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一者、兩者、三者或所有四者。
91.態樣87之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII胞外域序列包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120之多達25 aas之N端缺失(△25 aa缺失)及D118取代(例如,D118A或D118R,參見SEQ ID NO:123);或與彼等TβRII多肽序列中之任一者之至少70個(例如、至少80、至少90或至少100個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%
或100%)aa序列一致性的序列。
92.態樣91之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,進一步包含F30A、D32N、S52L及/或E55A取代中之一者、兩者、三者或所有四者。
93.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβR多肽序列包含TβRI胞外域序列。
94.態樣93之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRI胞外域序列包含與SEQ ID NO:115之至少70個(例如,至少80、至少90或93個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
95.態樣82之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβR多肽序列包含TβRIII胞外域序列。
96.態樣95之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRIII胞外域序列包含與(A同功型SEQ ID NO:124之aas 27-787或B同功型SEQ ID NO:125之aas 27-786)之至少70個(例如,至少80、90、100、150、200、250、300、400、500或600個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
97.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列包含與包含人類TGF-β1多肽、人類TGF-β2多肽或人類TGF-β3多肽之成熟形式的至少70個(例如,至少80、至少90、至少100或至少110個)連續aas之多肽具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
98.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為TGF-β1多肽,其包含與SEQ ID NO:105(例如,SEQ ID NO:106之aas 279-390)之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)
連續aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
99.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為帶有C77S取代之TGF-β1多肽,其包含與SEQ ID NO:107之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)連續aa序列一致性的胺基酸序列。
100.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為TGF-β2多肽,其包含與(SEQ ID NO:108)(例如SEQ ID NO:109之aas 302-413)之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)連續aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
101.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為帶有C77S取代之TGF-β2多肽,其包含與SEQ ID NO:110之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)連續aas序列一致性的胺基酸序列。
102.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為TGF-β3多肽,其包含與SEQ ID NO:111(例如SEQ ID NO:112之aas 301-412)之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)連續aas具有至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
103.態樣1至96中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列為帶有C77S取代之TGF-β3多肽,其包含具有與SEQ ID NO:113之至少70
個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或112個)連續aas至少60%(至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列。
104.態樣97-103中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列包含成熟TGF-β多肽序列(參見例如,圖3及圖4中之SEQ ID NO:112)的位置25、92及/或94中之一或多者處之取代。
105.態樣100-101中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列包含成熟TGF-β多肽序列(參見例如,圖3及圖4中之SEQ ID NO:112)的位置25、92及/或94中之一或多者處之取代。
106.態樣97-105中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽序列包含:
(i)位置25處除Lys或Arg以外之aa
(ii)位置92處除Ile或Val以外之aa;及/或
(iii)位置94處除Lys或Arg以外之aa(例如,基於SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:110)。
107.態樣1-106中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1中之結構A-F之任一者之形式。
108.態樣107之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物為具有圖1中之結構A之形式的經掩蔽之TGF-β多肽。
109.態樣108之經掩蔽之TGF-β多肽,其包含至少一個(例如,一個、兩個或兩個以上)wt.或變異體IL-2 MOD多肽序列。
110.態樣107之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物為具有圖1中之結構B之形式的經掩蔽之TGF-β複合物。
111.態樣110之經掩蔽之TGF-β多肽,其包含至少一個(例如,一個、兩個或兩
個以上)wt.或突變體IL-2 MOD多肽序列。
112.態樣107之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物為具有圖1中之結構C之形式的種間經掩蔽之TGF-β複合物。
113.態樣112之經掩蔽之TGF-β多肽,包含至少一個(例如,一個、兩個或兩個以上)wt.或突變體IL-2 MOD多肽序列。
114.態樣107之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物為具有圖1中之結構D或E之形式的種間經掩蔽之TGF-β複合物。
115.態樣114之經掩蔽之TGF-β多肽,其包含至少一個(例如,一個、兩個或兩個以上)wt.或突變體IL-2 MOD多肽序列。
116.態樣107之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物為具有圖1中之結構F之形式的種間經掩蔽之TGF-β複合物。
117.態樣116之經掩蔽之TGF-β多肽,其包含至少一個(例如,一個、兩個或兩個以上)wt.或突變體IL-2 MOD多肽序列。
118.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:117之序列)或與SEQ ID NO:117中列出之TβRII同功型A胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且
其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:9之序列)。
119.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:119之序列)或與SEQ ID NO:119中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140至少143個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:9之序列)。
120.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:120之序列)或與SEQ ID NO:120中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120或至少129個)連續aas具有至少60%(例
如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含wt.IL-2 MOD多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:9之序列)。
121.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:117之序列)或與SEQ ID NO:117中列出之TβRII同功型A胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或154個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含變異體IL-2 MOD多肽序列,其包含與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的aa序列。
122.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性
的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:119之序列)或與SEQ ID NO:119中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少143個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含變異體IL-2 MOD多肽序列,其包含與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的aa序列。
123.態樣107-117中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β多肽序列包含wt.TGF-β3多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:111之序列)或與SEQ ID NO:111中列出之TGF-β3序列之至少70個(例如,至少80、至少90、至少100、至少110或至少112個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;掩蔽多肽序列為TβRII多肽序列,其包含wt.TβRII多肽序列(例如,包含SEQ ID NO:120之序列)或與SEQ ID NO:120中列出之TβRII同功型B胞外域之至少90個(例如,至少100、至少110、至少120或至少129個)連續aas具有至少60%(例如,至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)aa序列一致性的胺基酸序列;並且其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含變異體IL-2 MOD多肽序列,其包含與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或
100%)aa序列一致性的aa序列。
124.態樣121-123中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β3多肽序列包含C77S取代。
125.態樣121-124中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TβRII多肽序列包含N端△14及D118A或D118R序列修飾,或N端△25及D118A或D118R序列修飾。
126.態樣121-125中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中IL-2 MOD多肽序列包含H16處之aa取代或F42處之aa取代。
127.態樣121-125中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中IL-2 MOD多肽序列包含H16及F42處之aa取代。
128.態樣125-127中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中H16及F42處之取代選自由以下組成之群:H16A、H16T、F42A及F42T(例如,H16A及F42A或H16T及F42A)。
129.態樣121-128中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中IL-2 MOD多肽序列進一步包含N88R aa取代。
130a.態樣121-129a中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中:TGF-β3多肽序列包含C77S取代;TβRII多肽序列包含N端△14及D118A或D118R序列修飾或N端△25及D118A或D118R序列修飾;並且IL-2 MOD多肽序列包含H16及F42處之aa取代。
130b.態樣130a之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中H16及F42處之取代為H16A及F42A取代或H16T及F42A取代。
131.態樣1-130b中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,進一步包含選自由以下組成之群的野生型或變異體MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、
IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及IL-23。
132.態樣1-130b中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,包含選自由以下組成之群的野生型或變異體MOD多肽序列:PD-L1、FAS-L、IL-10。
133.態樣1-132中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中TGF-β多肽/複合物包含變異體TGF-β多肽,相對於沒有序列變異的在其他方面相同之wt.TGF-β多肽,其對掩蔽多肽(例如,TGF-β受體多肽)序列之親和力減小至少10%(例如,至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大於95%)。
134.態樣1-133中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中相對於沒有序列變異之相應wt.TβR多肽序列,TGF-β多肽複合物包含對TGF-β多肽(小至少10%、小至少20%、小至少30%、小至少40%、小至少50%、小至少60%、小至少70%、小至少80%、小至少90%、小至少95%或小大於95%)之親和力減小的具有一或多個序列變異(例如,一或多個aa缺失、插入或取代)之TβR多肽序列。
135.經掩蔽之TGF-β複合物PSM-4033-4039。
136.一或多種核酸(例如,表現載體),其編碼態樣1-135中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或編碼態樣4及6-135中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物。
137.一種誘導哺乳動物(例如,人類)受試者或其細胞、組織或體液中之Treg細胞的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-135中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
138.態樣137之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-2 MOD多肽序列。
139.態樣137之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少
一者包含(i)wt.或變異體IL-2 MOD多肽序列,及(ii)wt.或變異體PL-L1多肽序列。
140.態樣137-139中任一項之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物在投與維生素D(例如,1α,25-二羥基維生素D3或維生素D類似物(例如,維生素D3)、mTOR抑制劑(例如,雷帕黴素)及/或視黃酸(例如,全反視黃酸)中之任何一或多者之前、期間(同時或組合投與)或之後投與。
141.態樣137-140中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中FoxP3+Treg細胞(例如,誘導型調節性T細胞(iTreg);胸腺衍生之Treg細胞(tTreg)及/或周圍Treg細胞(pTreg)中之任何一或多者)的數目增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,一個受試者或來自兩個或兩個以上受試者之平均值)之組織或體液中Treg細胞之量。
142.態樣141之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液體積中Treg之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中的Treg細胞(例如,FoxP3+細胞、iTreg、tTreg及/或pTreg)數目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
143.一種誘導哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中之Th9細胞的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之
TGF-β構築體或複合物。
144.態樣143之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-4 MOD多肽序列。
145.態樣143-144中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中Th9細胞之數目增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中Th9細胞之量。
146.態樣145之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液體積中Th9細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中Th9細胞之數目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
147.一種誘導哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中之Th17細胞的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
148.態樣147之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-6 MOD多肽序列。
149.態樣147-148中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中Th17細胞之數目增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)之組織或體液中Th17細胞之量。
150.態樣149之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中Th17細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中Th17細胞之數目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
151.一種誘導哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中之Thf細胞的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
152.態樣151之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個wt.或變異體IL-21及/或IL-23 MOD多肽序列。
153.態樣152之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個wt.或變異體IL-21及至少一個wt.或變異體IL-23 MOD多肽序列。
154.態樣151-153中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中Thf細胞之數目增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治
療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中Thf之數目。
155.態樣154之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中Thf細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中Thf細胞之數目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
156.一種抑制哺乳動物受試者(或其組織或體液)中Th1細胞之作用的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
157.態樣156之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-4 MOD多肽序列。
158.態樣156-157中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下情況下之量,Th1介導之干擾素γ及/或TNF向受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中(或所得濃度)的釋放之抑制:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)之組織或體液中干擾素γ及/或TNF之量。
159.態樣149之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中干擾素γ及/或TNF之量,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中干擾素γ及/或TNF之量減少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至
少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
160.一種抑制哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中Th2細胞之作用及/或增殖的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
161.態樣160之方法,其中該投與導致相對於以下情況下之量,Th2介導之IL-4、IL-5及/或IL-13向受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中(或所得濃度)的釋放之抑制:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中之量。
162.態樣161之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中IL-4、IL-5及/或IL-13之量,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之組織或體液中IL-4、IL-5及/或IL-13之平均值,在組織或體液之體積中IL-4、IL-5及/或IL-13之量減少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
163.一種抑制哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中II型先天淋巴細胞(ILC2細胞)之作用的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者視情況包含一或多個獨立選定之wt.或變異體IL-10多肽序列(例如,單體形式諸如IL-10M1)。
164.態樣160之方法,其中該投與導致相對於以下情況下之量,ILC2細胞介導之IL-5及/或IL-13向受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中(或
所得濃度)的釋放之抑制:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之治療之前或不存在該治療之投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中之量。
165.態樣164之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之量,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之平均值,在組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之量減少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
166.態樣164之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之量,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之平均值,在組織或體液之體積中IL-5及/或IL-13之量減少了至少25%。
167.一種支援哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中不變自然殺手T(iNKT)細胞之發育及/或存活的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
168.態樣167之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個wt.或變異體MOD多肽序列。
169.態樣167-168中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中iNKT細胞數目之增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中iNKT細胞之數目。
170.態樣169之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中iNKT細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中iNKT細胞之數目增加了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。
171.態樣169之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中iNKT細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中iNKT細胞之數目增加了至少25。
172.一種阻斷哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中CD4+ T細胞數目之增加或減少CD4+ T細胞之數目的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
173.態樣172之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者除TGF-β多肽序列以外亦包含至少一個wt.或變異體MOD多肽序列。
174.態樣172-173中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中CD4+ T細胞數目之增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙
習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中CD4+ T細胞之量。
175.態樣174之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中CD4+細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中CD4+細胞之數目減少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
176.態樣174之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中CD4+細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中CD4+細胞之數目減少了至少25%。
177.一種阻斷哺乳動物(例如,人類)受試者或其組織或體液中CD8+ T細胞數目之增加或減少CD4+ T細胞之數目的方法,該方法包含向受試者投與根據態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
178.態樣172之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者除TGF-β多肽序列以外亦包含至少一個wt.或變異體MOD多肽序列。
179.態樣172-173中任一項之方法,其中該投與導致相對於以下任一情況之彼等細胞之數目,來自受試者之組織或體液(例如,血液或淋巴)流體之體積中CD8+ T細胞數目之增加:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的對照治療組(例如,來自個體組之平均值)的組織或體液中CD8+ T細胞之量。
180.態樣174之方法,其中相對於投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前的組織或體液之體積中CD8+細胞之數目,或相對於未接受一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的匹配對照組之平均值,在組織或體液之體積中CD8+細胞之數目減少了至少5%(例如,至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大)。
181.一種提供傷口、過敏性反應、疾病或病症之治療或預防的方法,該方法包含向有需要之受試者(例如,人類)投與(i)根據態樣1-134中任一項之一或多種獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,及/或(ii)編碼根據態樣1-134中任一項之一或多種獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸。
182.態樣181之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之wt.或變異體IL-2 MOD多肽序列。
183.態樣182之方法,其中獨立選定之wt.或變異體IL-2 MOD多肽包含SEQ ID NO:9之IL-2多肽或其變異體。
184.態樣183之方法,其中獨立選定之變異體IL-2 MOD多肽序列包含具有以下各者之序列:
(i)與SEQ ID NO:9之至少80個(例如,至少90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性;或
(ii)與SEQ ID NO:15-27中任一者之至少80個(例如,至少90、100、110、120、130或133個)連續aas具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性。
185.態樣182-184中任一項之方法,其中獨立選定之變異體IL-2 MOD多肽序列
包含N88、F42及/或H16中任一者、兩者或所有三者處之取代。
186.態樣182-185中任一項之方法,其中獨立選定之變異體IL-2 MOD多肽序列包含選自由以下組成之群的取代或取代對:(i)F42A;(ii)F42T;(iii)H16A;(iv)H16T;(v)F42A及H16A;(vi)F42T及H16A;(vii)F42A及H16T;或(viii)F42T及H16T取代。
187.態樣181-186中任一項之方法,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物包含至少一個(例如,至少兩個)獨立選定之wt.或變異體PD-L1多肽序列。
188.態樣187之方法,其中獨立選定之變異體PD-L1多肽序列包含與SEQ ID NO:2之至少170個連續aa(例如,至少180、190或200個連續aa)具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性的多肽序列。
189.態樣181-188中任一項之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β多肽中之至少一者包含獨立選定之wt.或變異體IL-10多肽序列(例如,單體異構物諸如IL-10M1)。
190.態樣189之方法,其中獨立選定之wt.或變異體IL-10多肽序列包含與SEQ ID NO:50或51(例如當該序列為變異體IL-10序列時,具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如,至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160個)連續aa具有至少80%(至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性的多肽序列;且其中變異體IL-10多肽序列視情況包含SEQ ID NO:51之N49與K50之間或SEQ ID NO:49或50中之等效位置處的5-7 aa插入(例如,插入介於aa 49與aa 50之間的SEQ ID NO:51中之IL-10M1 GGGSGG)。
191.態樣181-190中任一項之方法,其中獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含獨立選定之wt.或變異體FasL多肽序列。
192.態樣191之方法,其中獨立選定之wt.或變異體FasL多肽序列包含與SEQ ID NO:144(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個連續aa(例如,至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160或至少180個連續aa)具有至少80%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性的多肽序列。
193.態樣181-192中任一項之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物在投與維生素D(例如,1α,25-二羥基維生素D3)、視黃酸(例如,全反視黃酸)及/或雷帕黴素中之任一者、兩者或所有三者之前、同時、組合或之後投與。
194.態樣181-193中任一項之方法,其中自體免疫疾病選自由以下組成之群:艾迪森氏病、斑禿、關節黏連性脊椎炎、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫相關性不孕症、自體免疫血小板減少性紫癜、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉、克羅恩氏病、古巴士德氏症候群、腎絲球腎炎(例如新月形腎絲球腎炎、增生性腎絲球腎炎)、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力(MG)、天皰瘡(例如尋常性天皰瘡)、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、休格倫氏症候群、系統性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病(T1D)、血管炎及白斑病。
195.態樣181-193中任一項之方法,其中自體免疫疾病為T1D或乳糜瀉。
196.態樣181-193中任一項之方法,其中自體免疫疾病並非T1D或乳糜瀉。
197.態樣181-193中任一項之方法,其中該方法為過敏性反應之治療或預防方法。
198.態樣197之方法,其中過敏性反應為對花生、堅果、植物花粉、乳膠、蜂毒或黃蜂毒素過敏原之反應。
199.態樣181-190中任一項之方法,其中該方法為提供燒傷或傷口之治療或預防的方法。
200.態樣199之方法,其中傷口為表皮或黏膜之擦傷、撕脫、切口、割傷或刺傷。
201.態樣200之方法,其中i)根據態樣1-134中任一項之一或多種獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,及/或(ii)編碼根據態樣1-134中任一項之一或多種獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸在形成傷口之前、期間及/或之後投與。
202.態樣199-201中任一項之方法,其中燒傷及/或傷口在手術或其他醫療程序期間發生,或作為該程序之結果。
203.態樣199-202中任一項之方法,其中將一或多種獨立選定之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物投與傷口或燒傷部位。
204.態樣199-203中任一項之方法,其中相對於未治療受試者或傷口,投與經掩蔽之TGF-β構築體或複合物(有效量)及/或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,重組表現載體)加速傷口閉合(縮短閉合之時間)、縮短癒合時間或減少癜痕形成。
205.態樣181之方法,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之wt.(例如,SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31)或變異體IL-4多肽序列。
206.態樣205之方法,其中變異體IL-4多肽序列包含與SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少80個連續aa(例如至少100或110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
207.態樣205-206中任一項之方法,其中疾病或病症為蠕蟲感染。
208.態樣181之方法,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之wt.(例如,SEQ ID NO:35之
多肽)或變異體IL-6多肽序列。
209.態樣208之方法,其中變異體IL-6多肽序列包含與SEQ ID NO:35(例如,其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少80個連續aa(例如至少100或110個連續aa)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性的多肽序列。
210.態樣204-209中任一項之方法,其中疾病或病症為細菌及/或真菌感染(例如,在腸道中)。
211.態樣181之方法,其中經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含至少一個(例如,至少兩個或至少三個)獨立選定之wt.或變異體IL-21及/或IL-23多肽序列。
212.態樣209之方法,其中至少一個(例如,至少兩個)IL-21 MOD多肽序列包含(i)SEQ ID NO:58或60之多肽序列或(ii)與SEQ ID NO:58或60(並且其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少110個)連續aa具有至少80%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性的多肽序列。
213.態樣211或212之方法,其中至少一個(例如,至少兩個)IL-23 MOD多肽序列包含(i)SEQ ID NO:63或65之多肽序列或(ii)與SEQ ID NO:63及/或65(並且其具有至少一個aa取代、缺失或插入)之至少50個(例如至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少140、至少160、至少180、至少200、至少220、至少240、至少260、至少280、至少300、至少320或至少340個)連續aas具有至少80%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)aa序列一致性的多肽序列。
214.態樣211-213中任一項之方法,其中疾病或病症為不能產生高親和力抗體或足夠量之高親和力抗體。
215.一種誘導哺乳動物受試者之耐受性的方法,該方法包含向受試者投與:
(i)根據態樣1-136中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,表現載體),
(ii)根據態樣1-136中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,表現載體),其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-2多肽序列;
(iii)根據態樣1-136中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,表現載體),其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體FasL多肽序列;或
(iv)根據態樣1-136中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或編碼經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,表現載體),其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體IL-2多肽序列,且其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之至少一者包含wt.或變異體FasL多肽序列或wt.或變異體IL-10多肽序列。
216.態樣137-215中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與非類固醇消炎藥物(NSAID)(例如,Cox-1及/或Cox-2抑制劑,諸如塞來昔布(Celecoxib)、雙氯芬酸(Diclofenac)、雙氟尼酸(Diflunisal)、依託度酸(Etodolac)、布洛芬(Ibuprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、酮洛芬(Ketoprofen)及萘普生(Naproxen))。
217.態樣137-216中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與皮質類固醇(例如,可的松(Cortisone)、地塞米松(Dexamethasone)、氫化可體松(Hydrocortisone)、依
他米松(Ethamethasoneb)、氟氫可的松(Fludrocortisone)、甲基潑尼松龍(Methylprednisolone)、潑尼松(Prednisone)、普賴蘇穠(Prednisolone)及曲安西龍(Triamcinolone))。
218.態樣137-217中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與阻斷腫瘤壞死因子α之一或多種作用的試劑(例如,抗TNFα,諸如戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、阿達木單抗(adalimumab)或TNFα誘餌受體,諸如依那西普(etanercept))。
219.態樣137-218中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與與IL-1競爭性地結合至IL-1受體之試劑(例如,阿那白滯素(anakinra))。此態樣可經受以下限制條件:若投與受試者之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之任一者包含IL-1多肽,則不投與與IL-1競爭性地結合至IL-1受體之試劑。
220.態樣137-219中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與結合至IL-6受體並抑制IL-6經由受體之訊息傳導的試劑(例如,托珠單抗(tocilizumab))。此態樣可經受以下限制條件:若投與受試者之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物中之任一者包含IL-6多肽,則不投與結合至IL-6受體之試劑。
221.態樣137-220中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與結合至CD80或CD86受體並抑制T細胞增殖及/或B細胞免疫反應之試劑(例如,阿巴西普(abatacept))。
222.態樣137-221中任一項之方法,進一步包含在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前、期間(同時或組合投與)或之後,投與結合至CD20由此導致B-細胞死亡之試劑(例如,利妥昔單抗(rituximab))。
223.態樣137-222中任一項之方法,其中哺乳動物受試者選自:人類、牛、大、貓、齧齒動物、鼠科動物、山羊、猿猴、綿羊、馬、兔、豬等受試者。
224.態樣137-223中任一項之方法,其中受試者為人類(例如,需要治療或預防之人類患者或人類受試者)。
225.一種將TGF-β多肽或TGF-β多肽及免疫調節多肽(MOD)遞送至細胞的方法,其包含使細胞與以下各者接觸:(i)態樣1-134中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,(ii)態樣1-134中任一項之包含一或多個獨立選定之wt.或變異體MOD序列的一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,或(iii)編碼態樣135-136中任一項之一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸,其視情況編碼一或多個獨立選定之wt.或變異體MOD。
226.一種產生表現經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之細胞的方法,該方法包含將編碼態樣1-134中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的一或多種核酸(例如,表現載體)引入細胞中(例如,在活體外之哺乳動物細胞),並且視情況選擇包含未整合及/或整合至至少一個細胞染色體中的一或多種核酸之全部或一部分的細胞(例如,抗生素選擇,繼之以分析以便判定一或多種核酸中之任一者是否整合至細胞染色體中)。
227.態樣224之方法,其中細胞為選自以下各者之哺乳動物細胞株的細胞:HeLa細胞、CHO細胞、293細胞、Vero細胞、NIH 3T3細胞、Huh-7細胞、BHK細胞、PC12、COS細胞、COS-7細胞、RAT1細胞、小鼠L細胞、人類胚腎(HEK)細胞及HLHepG2細胞。
228.一種細胞,其瞬時或穩定表現藉由態樣226或227之方法製備之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物。
229.態樣228之細胞,其中細胞表現約25至約350毫克/公升或更多(例如,約25至約100、約100至約200、約200至約300、約300至約350毫克公升、或
大於350毫克/公升)經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,而相對於不表現經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的在其他方面相同之細胞,沒有生存力之實質性降低(少於5%、10%或15%降低)。
230.態樣138-142中任一項之方法,其中投與包含wt.或變異體IL-2 MOD多肽序列的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物造成受試者、細胞、組織或體液中之一或多種T細胞(例如,發炎性T細胞諸如Th1、Th2、Th17及/或Th22細胞)之調節。
231.態樣230之方法,其中一或多種T細胞為Th1細胞並且調節係藉由Th1細胞數目之減少,由Th1細胞表現或分泌之干擾素γ之減少,或受試者、細胞、組織或體液中干擾素γ之水準降低來評定:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,一個受試者或來自兩個或兩個以上受試者之平均值)之受試者、細胞、組織或體液中干擾素γ之量。
232.態樣230之方法,其中一或多種T細胞為Th2細胞並且調節係藉由Th2細胞數目之減少,由Th2細胞表現或分泌之IL-4、IL-5及/或IL-13之減少,或受試者、細胞、組織或體液中IL-4、IL-5及/或IL-13之水準降低來評定:(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,一個受試者或來自兩個或兩個以上受試者之平均值)之受試者、細胞、組織或體液中L-4、IL-5及/或IL-13之量。
233.態樣230之方法,其中一或多種T細胞為Th17細胞並且調節係藉由Th17
細胞數目之減少,由Th17細胞表現或分泌之IL-17及/或IL-22之減少,或受試者、細胞、組織或體液中IL-17及/或IL-22之水準降低來評定:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,一個受試者或來自兩個或兩個以上受試者之平均值)之受試者、細胞、組織或體液中IL-17及/或IL-22之量。
234.態樣230之方法,其中一或多種T細胞為Th22細胞並且調節係藉由Th22細胞數目之減少,由Th22細胞表現或分泌之IL-22、IL-13及/或TNF-α中至少兩者之減少,或受試者、細胞、組織或體液中IL-22、IL-13及/或TNF-α之水準降低來評定:
(i)在投與一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物之前或不存在該投與時;或
(ii)相對於與受試者匹配(例如,疾病狀態、年齡、性別、高度、體重及/或吸煙習慣中之一或多者)但未投與TGF-β或經掩蔽之TGF-β構築體或複合物的治療組(例如,一個受試者或來自兩個或兩個以上受試者之平均值)之受試者、細胞、組織或體液中IL-22、IL-13及TNF-α之量。
235.態樣234之方法,其中方法進一步包含評估IL-4、IL-17及/或干擾素γ中之一或多者之表現、分泌,或受試者、細胞、組織或體液中IL-4、IL-17及/或干擾素γ中之一或多者之水準。
236.態樣230-235中任一項之方法,其中T細胞為旁觀者T細胞。
237.態樣230-236中任一項之方法,其中一或多種經掩蔽之TGF-β構築體或複合物在投與維生素D(例如,1α,25-二羥基維生素D3或維生素D類似物(例如,維生素D3)、mTOR抑制劑(例如,雷帕黴素)及/或視黃酸(例如,全反視黃酸)中之任何一或多者之前、期間(同時或組合投與)或之後投與。
238.態樣230-237中任一項之方法,其中包含wt.或變異體IL-2 MOD的經掩蔽之TGF-β構築體或複合物具有圖1結構A至F中列出之結構。
239.態樣238之方法,其中Fc區缺少免疫球蛋白效應序列(與wt.蛋白相比,補體組分1q(「C1q」)結合減少,且參與補體依賴性細胞毒性之能力相應地降低)。
VI.實例
提出以下實例以便向此項技藝中普通技術人員提供關於如何製作及使用本發明之更完整披露及描述,而無意於限制發明人認為其發明之範疇,亦不欲表示以下實驗為進行之所有或僅有實驗。已盡力確保所用數值(例如量、溫度等)之準確性,但應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另外指示,否則份為重量份,分子量為重量平均分子量,溫度以攝氏度表示,且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫,例如,bp,鹼基對;kb,千鹼基;μl,微升;pl,皮升;s或sec,秒;min,分鐘;h或hr,小時;aa,胺基酸;kb,千鹼基;bp,鹼基對;nt,核苷酸;i.m.,肌肉內:i.p.,腹膜內;s.c.,皮下;wt.,野生型;及其類似縮寫。
A.實例1:
1 單一多肽鏈掩蔽之TGF-β構築體
呈現經掩蔽之TGF-β蛋白的完整單一多肽鏈之穩定表現藉由製備編碼所需組分之核酸並且使用哺乳動物細胞之表現載體驅動表現來證明。核酸編碼自N端至C端包含以下各者之多肽:MOD多肽序列(例如,wt.IL-2多肽序列,諸如SEQ ID NO:20,或帶有H16及/或F42處之取代的該IL-2多肽之變異體;帶有L234A及L235A取代以及防止Fc二聚化之取代的IgG1 Fc支架多肽序列,II型TGF-β受體(例如,具有D32N及/或D118A序列變異之TGF-βRII B同功型多肽序列),及TGF-β多肽序列(例如,wt.TGF-β3或C77S序列變異體)。具有所表現蛋白質之總體結構的示意圖在圖1中展示為結構A,其一實例在圖7A中展
示為構築體3470(SEQ ID NO:146),此多肽之aa序列之另一實例為與經標記之元件比對之構築體第3472號,在圖7G中展示為SEQ ID NO:157。在適合於哺乳動物蛋白質表現之質體中(例如,在中國倉鼠卵巢或CHO細胞中)構築核酸之後,蛋白質得以表現並且使用蛋白A及尺寸分離層析來純化。
除了構築及分離構築體3470及3472以外,亦製備兩個額外的單一多肽鏈掩蔽之TGF-β構築體3466及3468。構築體3470,與構築體3472、3466及3468(如以下(i)至(iii)編號)一起證明尤其經由傳統Fc締合製備實質上不二聚化之單鏈掩蔽之TGF-β蛋白的可行性。多肽自N端至C端包含以下多肽序列:
(i)wt.IL-2-IgG Fc-TβRII△25(D32N,D118A)取代-TGF-β3(C77S)(圖7G,構築體第3472號)SEQ ID NO:157;
(ii)IL-2(H16T,F42A)-IgG Fc-TβRII△25(D118)-TGF-β3(C77S)(圖7H,構築體第3466號)SEQ ID NO:158;及
(iii)IL-2(H16T,F42A)-IgG Fc-TβRII△25(D32N,D118)-TGF-β3(C77S)(圖7I,構築體第3468號)SEQ ID NO:159。如上所述,單一多肽鏈掩蔽之TGF-β構築體可包含防止Fc區之二聚化的取代,例如在如SEQ ID NO:71之IgG1序列中編號之L131(例如,L131K)、T146(例如,T146S)、P175(例如,P175V)、F185(例如,F185R)、Y187(例如,Y187A)及K189(例如,K189Y)處。(i)至(iii)中之上述構築體包含如SEQ ID NO:71之IgG1序列中編號之L131K、T146S、P175V、F185R、Y187A及K189Y。
2 異二聚體多肽鏈
藉由製備編碼包含TGF-β多肽序列之第一多肽的核酸及編碼TGF-β受體多肽序列之第二核酸並且使用哺乳動物表現載體(例如,CHO細胞中之質體表現系統)表現多肽來證明包含兩個多肽之經掩蔽之TGF-β複合物及經掩蔽之TGF-β構築體的穩定表現。第一多肽包含,例如,MOD多肽序列(例如,wt.或
變異體IL-2多肽序列)、IgG Fc支架多肽序列(例如,KiH Fc)及TGF-β多肽序列(例如,帶有TGF-β1或wt.TGF-β3之wt.或序列變異體)(參見例如,圖7J構築體3618)。第二多肽包含例如MOD多肽序列(例如,wt.或變異體IL-2多肽序列)、IgG Fc支架多肽序列(例如,第一多肽之KiH序列之對應部分)及II型TGF-β受體(TGF-βRII)多肽序列(wt.或具有序列變異)(參見例如,圖7J構築體3621)。所表現蛋白質之示意性結構在圖1中展示為結構D。自N端至C端包含以下多肽序列之一此類成對多肽(iv.a)及(iv.b)之表現及純化(蛋白A及尺寸分離層析):
(iv.a)IL-2(wt.MOD)-杵臼Fc(例如,杵Fc)-TGF-β3(wt.)參見圖7J構築體3618(SEQ ID NO:148);及
(iv.b)IL-2(wt.MOD)-杵臼Fc(例如,臼Fc)-TβRII(D32N)參見圖7J構築體3621(SEQ ID)NO:160。在構築體(iv.a)或(iv.b)中,IL-2多肽可包含H16及/或H42處之取代,諸如H16T及F42A取代或H16A及F42A取代。
3 經掩蔽之TGF-β構築體之活性
測試各種濃度的經純化之經掩蔽之TGF-β多肽複合物及構築體(例如,構築體(i)至(iii)及此實例之部分1及2中製備之多肽(vi.a)及(vi.b)之複合物)的誘導幼稚CD4細胞產生FoxP3之能力。對於檢定,將105個幼稚CD4細胞塗鋪於孔中,其含有具有1μg/ml抗-CD28之5μg/ml結合抗CD3及如指示之經掩蔽之TGF-β多肽複合物或構築體。培養五天之後,FoxP3 CD4+雙重陽性細胞之數目使用螢光標記抗-CD4及抗-FoxP3藉由流式細胞術來評定。提供藉由TGF-β3或TGF-β3及重組人類IL-2 100U/ml之刺激的對照亦並行運作。
在圖6中之A處,測試在存在或不存在IL-2的情況下,與wt.TGF-β3之效應相比,具有圖1中之A處示出之總體結構的包含wt.IL-2-IgG Fc-(mFc)-TβRII與D32N取代-TTGF-β3的經掩蔽之TGF-β構築體關於FoxP3表
現之比較。圖6中之A處示出之結果指示wt.TGF-β3在測試條件下實際上不刺激FoxP3,但wt.IL-2補充可導致FoxP3表現。
在圖6中之B處,測試在IL-2存在下,與wt.TGF-β3之效應相比,此實例之部分1及2之經掩蔽之TGF-β構築體(i)、(ii)及(iii),及包含多肽(iv.a)及(iv.b)之經掩蔽之TGF-β複合物的FoxP3表現之比較。圖6中之B處示出之結果指示具有wt.IL-2之經掩蔽之TGF-β構築體及複合物比具有IL-2取代H16T及F42A之彼等更有效。H16T及F42A處之取代將經掩蔽之複合物之效力自約5奈莫耳向約50奈莫耳偏移一個數量級,而基於表現FoxP3之細胞之數目的最大功效無實質性變化。與圖6中之A處示出之結果一樣,與IL-2及TGF-β3相比,經掩蔽之TGF-β構築體及複合物更有效地誘導T細胞產生FoxP3。
基於CD4+及FoxP3之細胞之選通及分離之實例在圖6中之C處示出。結果表現出暴露於1,000nM之經掩蔽之TGF-β構築體之細胞中FoxP3得以誘導,證明相對於暴露於0.1nM相同構築體之細胞,FoxP3表現增加約30倍。
B.實例2
1 非種間之支架
此章節描述經掩蔽之TGF β序列,其不使用種間支架,並且相應地為單體的,或若其二聚化,則其不優先與對應序列形成異二聚體。
a.單一多肽鏈掩蔽TGF-β構築體
核酸編碼之多肽自N端至C端包含,MOD多肽序列:wt.IL-2多肽序列(SEQ ID NO:20),帶有L234A及L235A(「LALA」)、L351K、T366S、P395V、F405R、Y407A及K409Y取代之IgG1 Fc支架多肽序列wt.IgG1 aas 11-215(△10),具有D118A取代(*D119A參見圖5B中之注釋)的成熟蛋白之aa 26至136 aas之TGF-β RII同功型B多肽序列,及具有C77S取代之人類TGF-β 3型同功型1多肽序列。所表現蛋白質之示意性結構在圖1中展示為結構A(SEQ ID NO:146)。
蛋白質藉由蛋白A及尺寸層析來純化。
b.同二聚體多肽複合物
核酸編碼之多肽自N端至C端包含MOD多肽序列(具有H16T及F42A取代之IL-2 SEQ ID NO:20)、IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1)、具有D118A取代(*D119A參見圖5B中之注釋)的成熟蛋白之aa 26至136 aas之TGF-β RII同功型B多肽序列、及具有C77S取代之人類TGF-β 3型同功型1多肽序列。所表現蛋白質之示意性結構在圖1中展示為結構B。與經標記之元件比對之對應aa酸序列在圖7B中示出(SEQ ID NO:147)。蛋白質藉由蛋白A及尺寸層析來純化。
2 具有種間支架多肽之異二聚體經掩蔽之TGF-β複合物
a.具有各自帶有IL-2 MOD多肽之種間支架的異二聚體經掩蔽之TGF-β複合物
藉由製備編碼包含TGF-β多肽序列之第一多肽的核酸及編碼TGF-β受體多肽序列之第二核酸並且使用哺乳動物表現載體(例如,CHO細胞中之質體表現系統)來表現多肽來證明包含兩個多肽之經掩蔽之TGF-β複合物及經掩蔽之TGF-β構築體的穩定表現。
第一多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1殘基1-225),及T366W KiH「結」取代,及具有C77S取代之人類TGF-β 3型同功型1多肽序列。
第二多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1殘基1-225),及T366S、L368A及Y407V KiH「孔」取代,及具有D118A取代之成熟蛋白之aa 26至136 aas之TGF-β RII同功型B多肽序列。所表現蛋白質之示意性結構在圖1中展示為結構D。與經標記之元件比對之對應aa酸序列在圖7C中示出。表現及純化(蛋白A繼之以尺寸排阻層析)提供異二聚體複合物。
b.具有種間支架之異二聚體經掩蔽之TGF-β複合物,其中單鏈帶有MOD多肽
藉由製備編碼包含TGF-β多肽序列之第一多肽的核酸及編碼TGF-β受體多肽序列之第二核酸並且使用哺乳動物表現載體(例如,CHO細胞中之質體表現系統)表現多肽來證明包含兩個多肽之經掩蔽之TGF-β複合物及經掩蔽之TGF-β構築體的穩定表現。
第一多肽包含wt.IL-2多肽(SEQ ID NO:20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代、及T366W(杵)取代之wt.IgG1殘基1-225,及具有C77S取代之人類TGF-β 3型同功型1多肽序列。
第二多肽包含IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1殘基1-225),及T366S、L368A及Y407V「臼」取代,及具有D118A取代之成熟蛋白之aa 26至136 aas之TGF-β RII同功型B多肽序列。
所表現蛋白質之示意性結構在圖1中展示為結構E。與經標記之元件比對之對應aa酸序列在圖7D中示出表現及純化(蛋白A繼之以尺寸排阻層析)提供異二聚體複合物。
c.具有種間支架多肽穩定性之異二聚體經掩蔽之TGF-β複合物,其中單鏈帶有MOD多肽
藉由製備編碼包含TGF-β多肽序列之第一多肽的核酸及編碼TGF-β受體多肽序列之第二核酸並且使用哺乳動物表現載體(例如,CHO細胞中之質體表現系統)表現多肽證明包含兩個多肽之經掩蔽之TGF-β複合物及經掩蔽之TGF-β構築體的穩定表現。
第一多肽包含IL-2多肽序列(具有H16T及F42A取代之SEQ ID NO 20),IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1殘基1-225),及T366W(杵)取代,具有D118A取代之成熟蛋白之aa 26至136 aas
之TGF-β RII同功型B多肽序列,及具有C77S取代之人類TGF-β 3型同功型1多肽序列。
第二多肽包含IgG1 Fc支架多肽序列(例如,帶有L234A及L235A(「LALA」)取代之wt.IgG1殘基1-225),以T366S、L368A及Y407V「臼」取代。
所表現蛋白質之示意性結構以圖1之結構之變化形式展示為結構F,但缺少第二多肽上之任何免疫調節多肽序列。與經標記之元件比對的對應aa酸序列在圖7E中示出。表現及純化(蛋白A繼之以尺寸排阻層析)提供異二聚體複合物。
C.實例3表現及純化
製備編碼經掩蔽之TGF-β構築體之核酸編碼兩種經掩蔽之TGF-β複合物之核酸(參見圖8)。複合物之樣品藉由用核酸構築體轉染ExpiCHO細胞並且允許細胞表現多肽來製備。多肽藉由蛋白A層析繼之以尺寸排阻層析來純化。經純化之蛋白質經受SDS-PAGE並且所得凝膠用考馬斯藍染色。NR=未還原或非還原樣品,並且R=還原樣品(用二硫化物還原劑來還原)。
D.實例4掩蔽多肽與TGF-β之間之生物活性及親和力
製備一系列經掩蔽之TGF-β構築體來證明TGF-β之生物可利用性,並且其與TβRII相互作用之能力與掩蔽多肽對於TGF-β多肽序列之親和力呈反比。構築體為圖1中之結構A之形式,並且自N端至C端,MOD為IL-2多肽;支架為IgG多肽;掩蔽受體為具有N端aas 1-25(△25)缺失及D118A取代之SEQ ID NO.119之TβRII多肽(並且其包含如指示之額外取代E55A、D32N或S52L),及TGF-β3多肽序列。
經掩蔽之TGF-β構築體與TβRII之相互作用使用捕獲檢定來評定,其中TβRII-Ig Fc融合物捕獲於微量滴定板之孔中並且將各種濃度之四種構築體
施加於孔中。在沖洗掉未結合構築體之後,使用生物素標記之抗IL-2,繼之以鏈黴親和素-辣根過氧化物酶及450nm下之比色偵測(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺),來偵測及量測結合構築體。在圖9中示出之結果指示△25-D118A構築體具有對於TβRII(TβRII-Ig融合物)之最低親和力。添加E55A、D32N或S52L對於TGF-β3TβRII複合物之解離常數具有越來越大影響,提供對於外源TβRII(在此情況下TβRII-Ig融合物)具有增加之親和力的複合物。
E.實例5具有種間支架多肽穩定性之異二聚體經掩蔽之TGF-β複合物(PSM-4033-4039)之生物活性,其中單鏈帶有變異體IL-2 MOD多肽
製備如圖10A示出之經掩蔽之TGF-β複合物PSM-4033-4039。複合物包含分別圖10B及10C示出之第一及第二多肽4033及4039。接著,用PSM-4033-4039執行一系列實驗。
實驗1:誘導來自人類周圍幼稚CD4
+
T細胞之Foxp3
+
iTreg。
將幼稚CD4+T細胞自人類血液中分選,並且與抗人類CD3(5ug/mL)、抗人類CD28(1ug/mL)及增加劑量之PSM-4033-4039或單一劑量之作為陽性對照之重組TGFb3及IL-2一起鋪板。培養5天之後,藉由流式細胞術評定細胞之轉錄因子Foxp3之表現。n=2,stdev。圖11提供之結果顯示在暴露於多達1,000nM之濃度之PSM-4033-4039的細胞中,FoxP3得以顯著誘導。此等結果類似於在圖6B中使用其他經掩蔽之TGF-β構築體及複合物來展示之結果,進一步證明本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物可實現FoxP3之顯著誘導,FoxP3為包括天然及誘導Treg兩者之Treg中之基因表現之主要調控因子,並且對於Treg特性及功能而言為中心性的。
實驗2:藉由PSM-4033-4039誘導之Foxp3
+
iTreg來抑制T細胞增殖
將PSM-4033-4039誘導之Foxp3+ T調控細胞(iTreg)以與習知T細胞(T應答者)之不同比率培養並且用抗人類CD3(1ug/mL)及絲裂黴素C治療之周圍
血液單核細胞(PBMC)來刺激。四天之後,藉由cell trace violet(CTV)染料在T應答者細胞中之稀釋,藉由流式細胞術來評定增殖。圖12示出之資料表示各自雙份鋪板之三個供體之平均值。TGF-β3及IL-2誘導之T調控細胞或總周圍CD4+ T細胞用於代替iTreg作為對照。抑制定義為與未添加iTreg對照相比之更少CTV稀釋%(平均78% CTV稀釋)。此實驗之結果表明藉由本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物例如PSM-4033-4039誘導之Foxp3+ T調控細胞可抑制T細胞之增殖,該等T細胞藉由PBMC中之抗原呈現細胞提供之CD3交聯及共刺激來活化。
除了Treg表現轉錄因子Foxp3以外,Treg之限定特徵為其能夠抑制其他白血球之活化及功能。此實驗表明藉由本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物誘導之iTreg確實可抑制T細胞之增殖,該等T細胞藉由PBMC中之抗原呈現細胞提供之CD3交聯及共刺激來活化。
實驗3:藉由PSM-4033-4039誘導來自人類周圍CD4
+
T細胞之Foxp3
+
表現。
將幼稚CD4+T細胞自人類血液中分選,並且與抗人類CD3(5ug/mL)、抗人類CD28(1ug/mL)及劑量增加之PSM-4033-4039一起鋪板。培養5天之後,藉由流式細胞術評定細胞之轉錄因子Foxp3之表現。n=2。資料在圖13A中示出。
為了測定CD4+ T細胞類型之混合物中之哪個細胞類型可分化成Foxp3表現細胞,將不同群體分選並且個別地用PSM-4033-4039治療。因此,在使用或不使用PSM-4033-4039(300nM)的情況下,將用於與圖13A之供體不同之供體的幼稚、總、及記憶CD4+ T細胞分選並且以與上述相同的方法培養,並且在第5天藉由流式細胞術來評定Foxp3。資料在圖13B中示出。
在此實驗中分化成Foxp3表現細胞之總CD4+ T細胞表示幼稚及記憶周圍T細胞兩者,其為本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物例如
PSM-4033-4039在活體內投與時遇到的細胞類型之混合物。此資料示出甚至在混合T細胞群中,本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物例如PSM-4033-4039可增加表現Foxp3之細胞之出現率,Foxp3為定義T調節性細胞之基因表現之主要調控因子。圖13B示出之結果示出PSM-4033-4039可誘導記憶CD4+ T細胞分化成Foxp3+細胞,即使以比幼稚CD4+ T細胞更低之出現率。
實驗4:藉由PSM-4033-4039自藉由同種異體淋巴球反應活化之CD4
+
T細胞中誘導Foxp3
+
iTreg
將總周圍CD4+ T細胞自人類血液中分選並且與同種異體單核球衍生之DC(moDC)一起鋪板以便誘導T細胞增殖。將T細胞與作為對照之自體moDC混合,並且同種異體或自體供體組合兩者係用作為額外對照之可溶性抗CD3(1ug/mL)來治療。將T細胞用cell trace violet(CTV)染料標記以追蹤對同種異體活化有反應之細胞。在第5天,Foxp3之增殖及表現藉由流式細胞術來分析,並且表現Foxp3之增殖細胞之出現率在圖14A及B中作圖。展示出兩個供體組合。n=2,stdev。結果尤其展現本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物例如PSM-4033-4039用於治療在骨髓或幹細胞移植患者中出現之移植物抗宿主疾病的潛在用途。
實驗5:使用PSM-4033-4039在小鼠中之PK實驗。
PSM-4033-4039作為單一劑量以0.1、1或10mg/kg向Balb/c小鼠靜脈內投與。接著,在給藥後5分鐘、2、8、24及72小時收集周圍血清樣品。隨後,PSM-4033-4039之血清濃度使用配位體結合檢定來測定,該檢定使用抗IL2抗體捕獲分子,並且使用抗TGFB3抗體偵測分子。圖15提供之結果展示,本文揭示之經掩蔽之TGF-β3構築體及複合物例如PSM-4033-4039可以生物學相關濃度保留於血清中持續投與後大於72小時。構築體4033之序列提供於圖10B(SEQ ID NO:191)中,並且構築體4039之序列提供於圖10C(SEQ ID NO:192)中。
***
儘管已參考本發明之特定實施例描述本發明,但熟練技術者應瞭解,在不背離本發明之真實精神及範圍之情況下,可進行各種改變且可以等效物替換。另外,可根據本揭露之目的、精神及範圍進行諸多修改以改變特定情況、材料、物質組成、方法、方法步驟。所有此類修改均旨在屬本文隨附申請專利範圍之範圍內。
Claims (15)
- 一種構築體,其包含以下各者作為第一多肽:i)支架多肽序列;ii)TGF-β多肽序列;iii)掩蔽多肽序列,該掩蔽多肽序列視情況包含TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列;iv)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列;以及v)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;包含此等元件之構築體共同地稱為「經掩蔽之TGF-β構築體」,其中該掩蔽多肽序列與該TGF-β多肽序列彼此結合。
- 如請求項1之經掩蔽之TGF-β構築體,其中該第一多肽以自N端至C端之順序包含:i)該支架多肽序列、該掩蔽多肽序列及該TGF-β多肽序列;ii)第一MOD多肽序列、該支架多肽序列、該掩蔽多肽序列及該TGF-β多肽序列;或iii)第一獨立選定之MOD多肽序列、第二獨立選定之MOD多肽序列、該支架多肽序列、該掩蔽多肽序列及該TGF-β多肽序列;其中該經掩蔽之TGF-β構築體視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。
- 如請求項1或請求項2之經掩蔽之TGF-β構築體,其中該支架多肽包含二聚化序列,視情況其中該支架多肽包含種間二聚化序列。
- 如請求項1至3中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體,其進一步包含第二多肽,該第二多肽與該第一多肽二聚化以形成經掩蔽之TGF-β複合 物異二聚體;其中該第二多肽包含:i)支架多肽序列;ii)TGF-β多肽序列;iii)掩蔽多肽序列,該掩蔽多肽序列視情況包含TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列;iv)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列;以及v)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列。
- 如請求項4之經掩蔽之TGF-β構築體,其中該第一多肽包含支架多肽,該支架多肽包含種間二聚化序列,其中該第二多肽包含支架多肽序列,該支架多肽序列包含該第一多肽之該種間結合序列的對應種間二聚化序列;並且其中該種間結合序列與該對應種間結合序列在該異二聚體中彼此相互作用。
- 一種TGF-β複合物,其包含第一多肽及第二多肽作為異二聚體, 其中:(i)該第一多肽包含a)包含種間二聚化序列之支架多肽序列,b)掩蔽多肽序列,該掩蔽多肽序列視情況包含TGF-β受體多肽序列或抗TGF-β多肽序列,c)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列,以及d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;並且(ii)該第二多肽包含a)支架多肽序列,該支架多肽序列包含該第一多肽中之該種間二聚化序列的對應種間二聚化序列,b)TGF-β多肽序列,c)視情況選用之一或多個獨立選定之MOD多肽序列,以及d)視情況選用之一或多個獨立選定之連接子多肽序列;包含此等元件之複合物共同地稱為「經掩蔽之TGF-β複合物」,其中該掩蔽多肽序列與該TGF-β多肽序列彼此結合;其中該種間結合序列與該對應種間結合序列在該異二聚體中彼此相互作用(例如,共價或非共價結合);並且其中該經掩蔽之TGF-β第一多肽及/或第二多肽視情況包含一或多個獨立選定之連接子多肽序列。
- 如請求項6之經掩蔽之TGF-β複合物異二聚體,其中:該第一多肽自N端至C端包含,a)一個或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列、包含該種間二聚化序列之該支架多肽序列及該掩蔽多肽序列;或b)包含種間二聚化序列之支架多肽序列及該掩蔽多肽序列(例如,TGF-β受體多肽序列);並且該第二多肽自N端至C端包含一或兩個(或更多個)獨立選定之MOD序列、包含該對應種間二聚化序列之該支架多肽序列及該TGF-β多肽序列。
- 如請求項1至12中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中該一或多個支架多肽序列選自由Ig Fc多肽序列及其變異體組成之群,視情況其中該等Ig Fc多肽序列包含突變,該等突變減少該多肽與補體組分1q(C1q)及/或Fcλ受體(FcλR)之結合及/或實質上減弱或消除該Ig多肽例如經由補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)誘導細胞溶解 之能力。
- 如請求項1至13中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中該一或多個獨立選定之MOD多肽序列選自由以下組成之群:PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MOD多肽序列及其任一者之變異體。
- 如請求項1至9中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中該等MOD多肽序列中之至少一者為具有以下條件之wt.IL-2 MOD多肽序列或變異體IL-2 MOD多肽序列(i)與SEQ ID NO:9之至少80、90、100、110、120、130或133個連續aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性;或(ii)與SEQ ID NO:13-27中之一者之至少80、90、100、110、120、130或133個連續aas具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% aa序列一致性或100%序列一致性。
- 如請求項1至10中任一項之經掩蔽之TGF-β構築體或複合物,其中該掩蔽多肽序列為TGF-β受體(「TβR」)多肽序列,該多肽序列包含I型(TβRI)、II型(TβRII)或III型(TβRIII)TβR之胞外域片段。
- 如請求項7之經掩蔽之TGF-β複合物,其中該複合物由多肽構築體4033(SEQ.ID.NO.:191)與多肽構築體4039(SEQ.ID.NO.:192)之組合形成。
- 一或多種核酸,其編碼如請求項1至12中任一項之經掩蔽之TGF-β複合物。
- 一種誘導哺乳動物受試者中之Treg細胞或治療受試者之疾病或病狀的方法,其包含向該受試者投與一或多種如請求項1至12中任一項之 經掩蔽之TGF-β構築體或複合物或如請求項13之核酸。
- 如請求項14之方法,其中該方法用於治療選自由以下組成之群的自體免疫病狀或疾病:艾迪森氏病(Addison’s disease)、斑禿、關節黏連性脊椎炎、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫相關性不孕症、自體免疫血小板減少性紫癜、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、古巴士德氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、腎絲球腎炎、格雷夫氏病(Grave’s disease)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、混合性結締組織病、多發性硬化症、重症肌無力(MG)、天皰瘡、惡性貧血、多發性肌炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、休格倫氏症候群(Sjögren’s syndrome)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病(T1D)、乳糜瀉、血管炎及白斑病。
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