JP2023500066A - ＴＧＦ－βポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、例えば、自己免疫疾患を含む疾患の治療的処置での使用を見出された形質転換成長因子ベータ(TGF-β)ポリペプチド構築物及び複合体を提供する。前記構築物及び複合体をコードする核酸、並びに、細胞ベースの発現系における、前記構築物及び複合体を調製する方法もまた記載される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年10月23日に出願された米国仮特許出願第62/925,227号の利益を主張するものであり、本出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の組み込み
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、これは、紙のコピー及びコンピュータ可読フォーム(CRF)の両方として機能し、「123640-8012WO00_seqlist.txt」と題されたファイルからなり、それは2020年10月21日に作成され、そのサイズは341,966バイトであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
I.序論
A.TGF-β及びその作用
形質転換成長因子ベータ(TGF-β)は、3つの哺乳動物(ヒト)アイソフォームTGF-β1、TGF-β2及びTGF-β3を含む形質転換成長因子スーパーファミリーに属するサイトカインである。TGF-βは、TGF-βの活性型としてホモ二量体化するTGF-β配列と、それに加えたプロペプチド領域とを含有する前駆体分子として合成される。TGF-βは、マクロファージ及び他の細胞種によって、2つの他のポリペプチド-潜在型TGF-β結合タンパク質(LTBP)及び潜在型関連ペプチド(LAP)と組み合わされた潜在型複合体として分泌される。潜在型TGF-β複合体は、細胞外マトリックス(ECM)中に、例えば、トロンボスポンジン-1(プラスミンによって活性化され得る)を介してCD36によって細胞の表面に、又は潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質1、2、3、及び/もしくは4(LTBP1-4)に結合することで保持される。
TGF-βの生物学的機能は、ECM撹乱(perturbation)に応答して厳格に調節される潜在型TGF-βの活性化の後に見られる。TGF-βは、様々な細胞もしくは組織に特異的な経路、又は複数の細胞もしくは組織種で観察される経路によって活性化され得るが、そのような活性化経路の背後にある完全なメカニズムは完全には知られていない。活性化剤としては、限定されないが、プロテアーゼ、インテグリン、pH、及び活性酸素種(ROS)が挙げられる。活性化において、細胞/組織に結合している潜在型TGF-β複合体は、機能し、環境撹乱に対して感知及び応答して、空間的及び/又は時間的な様式で活性型TGF-βを放出する。放出されたTGF-βは、その放出の状況に依存して細胞増殖を促進又は阻害するように作用する。それはまた、幹細胞/前駆細胞を動員して、組織再生/リモデリングプロセスに参加させる。TGF-βリガンドの発現、バイオアベイラビリティ、活性化、受容体機能、又は転写後修飾の異常は、正常な機能を妨げ、過剰な前駆体の動員(例えば、変形性関節症又はカムラチ-エンゲルマン病における)、又は好ましくない系統への常駐細胞の分化転換(例えば、がん転移中又は組織/臓器線維症中の上皮から間葉への移行における)など、多くの疾患と関連する病理学的結果をもたらし得る。Xuらの文献、Bone Research,6(Article No.2)(2018)。
1.インテグリン非依存性及びインテグリン依存性の活性化
a.インテグリン非依存性の活性化
TGF-β活性化のインテグリン非依存性の手段の中には、とりわけ、プロテアーゼ及び/又はメタロプロテアーゼ、活性酸素種(ROS)、及びトロンボスポンジン-1の作用を通して作用するものが含まれる。
プラスミン及びいくつかのマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス成分のタンパク質分解により、腫瘍侵入及び組織リモデリングを促進する。TGF-βは、マトリックスから潜在型複合体を放出するそのようなプロテアーゼの作用によって活性化され得、その後、LAPのタンパク質分解が行われ、TGF-βがその受容体へ放出される。マトリックスメタロプロテアーゼ-9及び-2のいずれも、潜在型TGF-βを切断することが知られている。
TGF-βは、ROS放出を誘導する放射線曝露後にインビボで迅速に活性化されることが示されている。ROSは、LAPとTGF-βとの間の相互作用を変化させ、その活性化をもたらすと考えられている。
健常個体の血漿中に存在する糖タンパク質であるトロンボスポンジン-1(TSP-1)は、損傷に応答して増加することが知られている。TSP-1は、潜在型TGF-β複合体と直接相互作用を形成し、その成熟TGF-βへの結合を防止することによって、潜在型TGF-βを活性化すると考えられている。トロンボスポンジンの媒介による活性化は、創傷(例えば、皮膚創傷)治癒に関与すると考えられている。
b.α(V)含有インテグリンによる活性化
インテグリン、特にβ6、αV、及びβ8含有インテグリンは、潜在型TGF-β(例えば、TGF-β1)活性化に寄与することが理解されている。活性化は、潜在型TGF-β1複合体にコンフォメーション変化を誘導して活性型TGF-β1を放出することによって、又は、インテグリン-プロテアーゼ依存的なメカニズムによって、生じると考えられる。特に上皮細胞において、タンパク質分解を伴わないTGF-β1活性化につながる立体構造変化は、LAP-β1又はLAP-β3に存在するアルギニン-グリシン-アスパルギン酸細胞接着モチーフ(RGDモチーフ)にインテグリンが結合することによって生じると理解されている。RGDモチーフを含むLAPは、大部分のαV含有インテグリンによって認識される。例えば、αVβ6インテグリンは、LAP-β1及びLAP-β3に存在するRGDモチーフに結合することにより、TGF-β1を活性化/放出することができる。加えて、TGF-βのインテグリン-プロテアーゼ依存的な活性化は、潜在型TGF-β複合体とMMP-2及びMMP-9などのMMPとの間の連結を形成することによって生じ得、それにより潜在型TGF-β複合体のタンパク質分解によってTGF-βを活性化することができる。
2.TGF-βのシグナル伝達及び作用
活性化されたTGF-βは、細胞分化及びT細胞調節において重要な役割を果たす。例えば、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236及びその引用を参照されたい。TGF-βは、胸腺由来のTreg(tTreg)、インバリアントナチュラルキラーT(iNKT)、及びCD8α＋T細胞前駆体の生存をサポートすることによって、いくつかのT細胞系統の胸腺における発達を促進し、それにより、強力なアゴニストリガンドによって誘導されるT細胞の発達を促進する。TGF-βは、インターロイキン(IL)-7Rαの胸腺細胞における発現を促進することによって、通常型(conventional)のCD8＋T細胞を支持する。TGF-βはまた、低親和性T細胞のIL-7依存性の生存を促進することによって、胸腺細胞におけるIL-7Rα発現を制御することによって、及びT細胞受容体(TCR)駆動型の自己反応性又は高親和性T細胞の活性化を阻害することによって、末梢T細胞の恒常性を調節する。初期のCD8＋T細胞分化において、TGF-βは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の形成を阻害し、短寿命エフェクター細胞(SLEC)のアポトーシスを促進する一方で、CD103を発現する組織常在メモリー(TRM)細胞の分化を促進する。TGF-βは、Tヘルパー1及び2(Th1及びTh2)細胞の分化を阻害するが、他の因子と作用するTGF-βは、様々なT細胞の発達を促進する。TGF-βは、IL-2と共に、末梢Treg(pTreg)の産生を促進し、IL-6と共に、Th-17細胞の産生を促進し、IL-4と共に、Th9細胞の産生を促進し、IL-21及び/又は23と共に、T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞の産生を促進する。
T細胞に対するその作用に加えて、Bリンパ球又は「B細胞」、単球、及びマクロファージを含む様々な他の細胞が、TGF-βによって調節される。TGF-βは、概して、B細胞に対する阻害作用を有し(Liらの文献、Annual Review of Immunology.24(1)：99-146(2006)及びRoesらの文献、PNAS USA,100(12)：7241-7246(2003))、B細胞増殖を阻害し、未成熟又は休止期のB細胞のアポトーシスを誘発する(Arsuraらの文献、Immunity 5(1)31：-40：1996)。B細胞に対するTGF-βの作用の少なくとも一部は、IL-1、TNF-a、及びデフェンシンを含むサイトカインの産生を調節するNF-κBの阻害剤であるIKBaの誘導に起因し得る。例えば、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236及びその引用を参照されたい。
B細胞への作用に加えて、TGF-βは休止期の単球を刺激し、活性化されたマクロファージを阻害する。TGF-βは、Toll様受容体(「TLR」)リガンドによって刺激されたマクロファージの炎症誘発応答などを阻害する効果を示す。TGF-β刺激は、TLRリガンド又は他のサイトカインの不在下で、骨髄系細胞によるいくつかの炎症性サイトカインの産生を促進する。TGF-βは、末梢血の単球及びマクロファージを組織内に誘導し、単球の付着特性を増強することが示されている。TGF-βは、化学走性を誘導し、肥満細胞の付着特性を増強することができる。例えば、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236及びその引用を参照されたい。
TGF-βが活性化されると、細胞表面のシグナル伝達受容体を介して作用することが理解されている。シグナル伝達は、活性化されたTGF-βリガンドが細胞表面上の形質転換成長因子β受容体II(「TβRII」)に結合するときに開始される。この相互作用は、形質転換成長因子β受容体I(「TβRI」)の動員をもたらし得る。TβRIIは、TGF-β1に単独で結合することができる一方で、TβRIは、TβRIIと協働してのみリガンドに結合することができる。TβRIは、TβRIIによってリン酸化されて活性化され、R-Smadタンパク質(Smad2及びSmad3)の動員及びリン酸化を介する、古典的シグナル伝達経路を通してシグナル伝達をもたらす。これらのSmadは次に、co-Smad(Smad4)に結合し、一緒になった複合体は、いくつかの遺伝子の転写を駆動する。Smithらの文献、Clin.Cancer Res.；18(17)：4514-21(2012)を参照されたい。TGF-βはまた、リガンドに占有された受容体によって活性化される、MAPキナーゼ経路、Rho様GTPaseシグナル伝達経路、及びホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ/AKT経路などの、様々な分岐を含む非古典的(非Smad)経路を通してシグナル伝達することができる。非古典的経路を通るシグナル伝達は、下流の細胞応答を強化、減衰、又は他の方法で調節し得る。Zhang Yeの文献、Cell Res.19(1)：128-39(2009)を参照されたい。TβRI及びTβRIIとは対照的に、形質転換成長因子ベータ受容体III(「TβRIII」受容体又は「ベータグリカン」)は、TGF-βシグナル伝達に関与せず、むしろTGF-βのリザーバーとして機能する。
活性化因子の撹乱、活性化TGF-βの異常レベル、及び/又はTGF-βシグナル伝達の変化は、制御されざるTGF-βシグナル伝達レベルをもたらす可能性があり、それによりいくつかの疾患又は複雑な疾患状態が生じ得る。実際、TGF-βは、炎症、自己免疫疾患、線維症、がん及び白内障などの多様な症状に作用を及ぼすことが示されている。
TGF-βは、忍容性の誘導に関与する因子として、免疫系において止血を維持する極めて重要な役割を果たし、それによって自己免疫応答に影響を及ぼす。TGF-βがそのような効果を発揮することができる1つのメカニズムは、T細胞(例えば、CD4＋、CD8＋、CD4-CD8＋及びCD4-CD8-細胞)の、(例えば、IL-2の存在下での)制御性T細胞又は「T-Reg」細胞への分化を駆動することによるものである。例えば、Bettini及びVagnaliの文献、Ann.N.Y.Acad.Sci.,1183：1-12(2010)を参照されたい。T-Reg細胞は、免疫寛容性の維持に不可欠である。Josefowiczらの文献、Annu Rev Immunol,30：531-564.(2012)を参照されたい。自己抗原などの抗原に対する寛容を誘導するTGF-βの役割は、関節炎(関節リウマチ又は「RA」)、1型糖尿病(「T1D」)、多発性硬化症(「MS」)、及び全身性エリテマトーデス(「SLE」)などの疾患の発症を防御する上で、TGF-βを重要な因子とする。例えば、TGF-βの機能のうち主要なものとしては、自己免疫疾患及び関連する炎症プロセスの調節が挙げられる。これは腸において特に当てはまり、炎症性腸疾患又は「IBD」などの症状におけるマクロファージによるサイトカイン産生及び粘膜炎症を抑制すると考えられている。Sanjabらの文献、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236を参照されたい。RAは、IBDと同様に、関節に対する、炎症性成分を伴う自己免疫疾患である。RAは、T細胞及び/又はB細胞における異常な応答から生じる。TGF-βは全身において、関節リウマチの発症から保護すると考えられる。Schrammらの文献、Arthritis Res.Ther.6：R114-R119(2004)及びSanjabらの文献、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236)、及びその中で引用される参考文献を参照されたい。
文献においては、タンパク質を捕捉し、その作用を効果的に中和することによって、タンパク質のレベルでTGF-β作用を調節するための多くのアプローチが報告されている。例えば、TGF-β1に対するメテリムマブ(CAT192)、及びTGF-βの複数のアイソフォームに対するフレソリムマブなどのモノクローナル抗体が、インビボでTGF-βに結合し、捕捉し、そして中和するために開発されている。さらに、TGF-βと強固に結合して捕捉し、それによってそれを捕捉して中和する受容体トラップも又開発されている(例えば、Swaagrtraらの文献、Mol Cancer Ther；11(7)：1477-87(2012)及び米国特許出願公開第2018/0327477号参照)。
TGF-βに結合して捕捉し、TGF-β作用のアンタゴニストとして機能するよう設計された上述の分子とは異なり、本明細書に記載のマスキングされたTGF-β複合体は、互いに相互作用してTGF-βポリペプチド配列を可逆的にマスキングする、活性TGF-βポリペプチド(例えば、TGF-βシグナル伝達経路アゴニスト)及びマスキングポリペプチド(例えば、TGF-β受容体断片)を提供する。マスキングされたTGF-β複合体は、TGF-β及び/又はマスキングポリペプチドの配列変異を含み得、これにより、相互の親和性が低下し、TGF-βのアンマスキングに寄与することができ、ヘテロマーの細胞表面受容体を介したその結合によるシグナル伝達を可能にする(例えば、TβRIIに結合し、続いてTβRIがヘテロマー受容体を形成する)。TGF-βに対して高い親和性を有するヘテロマーTβRI-TβRIIポリペプチド複合体は、形成されると、マスキングポリペプチドと効果的に競合することができる。TGF-β及び/又はそのマスキングポリペプチドにおける配列変異はまた、マスキングされていないTGF-βポリペプチドと他の分子との間の望ましくない相互作用を回避させることもできる。そのような配列変異としては、TβRIへの結合を減弱させるTβRIIのN末端の部分の欠失、及び/又は、その二量体化を防止するTGF-β配列変異(例えば、C77S置換)であって、非シグナリングTβRIII分子のリザーバーへの標的結合制限を解除するものが挙げられる。上記に加えて、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体は、インビトロ効果及び治療効果などのインビボ効果など、標的細胞へのTGF-β結合の結果に実質的に影響を及ぼし得る、追加の野生型(wt)及び/又は変異型の免疫調節ポリペプチド配列(MOD)を含み得る。
II.概要
本開示は、TGF-βが別のポリペプチドによってマスキングされている構築物(「マスキングされたTGF-β構築物」、例えば、単一のポリペプチド鎖を有する図1の構造Aを参照)、及びTGF-βが別のポリペプチドによってマスキングされている複合体(「TGF-βポリペプチド複合体」、例えば、2つのポリペプチド鎖を含む図1の構造B～Fを参照)の調製物を記載し、これらには、追加のエレメントを含み得る構築物及び複合体も含まれ、本明細書では、「マスキングされたTGF-β構築物及び複合体」と総称される。マスキングされたTGF-β構築物及び複合体は、足場ポリペプチド(例えば、免疫グロブリンFc領域)の周りに構築され、TGF-βに結合するマスキングポリペプチド配列(「マスキングポリペプチド配列」、「マスキングポリペプチド」、又は「マスキング配列」)を含有する。マスキングされたTGF-β構築物及び複合体はまた、野生型又は変異型IL-2ポリペプチド配列などの1つ以上の独立して選択される免疫調節ポリペプチド配列を含み得る。
マスキングされた非標的TGF-β活性が、マスキングされていないTGF-βで観察される程には細胞内で悪影響を及ぼさないため、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体は、多数の哺乳動物細胞種内で発現され得る。
マスキングされたTGF-β構築物は、第1のポリペプチドとして、
(i)足場ポリペプチド配列と、
(ii)TGF-βポリペプチド配列と、
(iii)TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列を任意に含むマスキングポリペプチド配列と、
(iv)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(v)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含み、
これらのエレメントを含む構築物は、本発明では「マスキングされたTGF-β構築物」と総称され、マスキングポリペプチド配列及びTGF-βポリペプチド配列は、相互に結合する。上記のマスキングされたTGF-β構築物は、例えば(N末端からC末端にかけて)
(i)足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列、及びTGF-βポリペプチド配列、又は
(ii)第1のMODポリペプチド配列、足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列、及びTGF-βポリペプチド配列、又は
(iii)第1の独立して選択されるMODポリペプチド配列、第2の独立して選択されるMODポリペプチド配列、任意に1つ以上の追加のMODポリペプチド配列、足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列、及びTGF-βポリペプチド配列、の順序で構成され、
マスキングされたTGF-β構築物は、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含むことができる。
上述のマスキングされたTGF-β構築物の足場ポリペプチドは、ホモ二量体の形成を引き起こす相互特異的(interspecific)又は相互特異的でない二量体化配列を含み得、その場合、足場ポリペプチド配列は、任意に、1つ以上の互いに共有的な結合(attachment)を有する。
上述のマスキングされたTGF-β構築物の足場ポリペプチドはまた、相互特異的二量体化配列を含んでもよく、さらに、相手側となる相互特異的二量体化配列を介して(上述の)第1のポリペプチドと二量体化して、マスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体を形成する、第2のポリペプチドを含んでもよい。第2のポリペプチドは、下記の構造のうちの1つ：(i)相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、(ii)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、(iii)相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、1の独立して選択されるMOD配列、又は、(iv)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、を含み得、前記第1及び/又は第2のポリペプチドは、任意に1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む。したがって、第2のポリペプチドは、N末端からC末端に、下記の構造のうちの1つ：(i)相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、(ii)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、(iii)相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列、又は、(iv)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、を含み得、前記第1及び/又は第2のポリペプチドは、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む。代替的に、マスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体は、N末端からC末端の順に、(i)相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、マスキングポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチド配列、(ii)第1のMODポリペプチド配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、マスキングポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチド配列、又は、(iii)第1の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、第2の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、マスキングポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチド配列、を含み得る。
マスキングされたTGF-β複合体はまた、マスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体として、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含み得、
(i)第1のポリペプチドが、
(a)相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、
(b)TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列を任意に含むマスキングポリペプチド配列と、
(c)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(d)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含み、
(ii)第2のポリペプチドが、
(a)第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる相互特異的二量体化配列を含む、足場ポリペプチド配列と、
(b)TGF-βポリペプチド配列と、
(c)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(d)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含み、
これらのエレメントを含む複合体は、「マスキングTGF-β複合体」と総称され、マスキングポリペプチド配列及びTGF-βポリペプチド配列は、異なるポリペプチド鎖上に提供され、相互に結合し、
相互特異的結合配列及び相手側相互特異的結合配列は、ヘテロ二量体において互いに相互作用し、
マスキングされたTGF-βの第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチドは、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む。
TGF-βポリペプチド配列は、TGF-βアイソフォームのいずれかに由来し得、TGF-β配列の二量体化の能力を制限する置換を含み得る。マスキング配列は、例えば、抗TGF-β抗体配列又はTGF-β受容体(TβR)エクトドメイン配列であり得る。TβRエクトドメインがTGF-β配列をマスキングするために使用される場合、それらは、マスキングされた分子による意図しないシグナル伝達を回避するために、(例えば、TGF-β配列との相互作用に必要でないエクトドメインの全部又は一部の欠失によって)修飾され得る。
本開示はまた、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体を産生する方法、並びに、様々な細胞種で効果を得るため、及び自己免疫疾患及び炎症性疾患を含む様々な疾患/障害を治療するためのそれらの使用方法を記載し、提供する。本明細書に記載の治療方法は、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体の、他の分子、例えば、限定されないが、免疫調節物質(例えば、インターロイキン、サイトカイン、ケモカインなど)、抗体及び抗体断片(例えば、scFv、ナノボディなど)、低分子治療薬(例えば、ビタミンD又はレチノイン酸)、並びにそれらの組み合わせであって、所望の実験室的又は治療的な結果を達成するのに有益であり得るものとの共投与を包含し得る。
III.図面の簡単な説明
TGF-β受容体配列を使用してTGF-βポリペプチドをマスキングする、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体のいくつかのフォーマットを示す。構造Aは、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、独立して選択されるMODのタンデムセット)を一か所に有する単量体構築物を示す。構造Bは、ポリペプチドがそれぞれのIgFc配列を介して相互作用する対称性のホモ二量体を示し、そのIgFc配列は、2つのポリペプチドを連結するジスルフィド結合を自発的に形成できる。構造C～Fは、TGF-β及びTGF-β受容体配列が、ヘテロ二量体で「シス」(同一のポリペプチド上)又は「トランス」(異なるポリペプチド上)において存在するヘテロ二量体構造を示す。1つ以上の独立して選択されるMODが配置され得る位置を、交差対角線もしくは垂直線又は縦格子柄で塗りつぶされた円によって示す。相互特異的結合対は、ノブインホール配列が代表的であるが、下記で考察されるように、他の任意のものであってもよい。構築物は、MODを含まなくてもよく、あるいは、図示する位置でMODを配置した形でMOD配列をタンデムに含む、1つ、2つ以上の独立して選択されるMOD配列を含んでもよい。例示的なMODとしては、例えば、野生型又は(例えば、特定の受容体に対する低減した親和性及び/又は選択的親和性を有する)変異型のPD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23のMOD配列が挙げられる。TGF-β受容体配列がTGF-βポリペプチドをマスキングするために使用される各例では、受容体ポリペプチドは、TGF-βポリペプチドに対する親和性を有する抗体ポリペプチド(例えば、scFV又はナノボディ)などの、別のマスキングポリペプチドで置き換えられてもよい。足場配列は、(例えば、ジスルフィド結合によって)結合して、共有結合性のホモ二量体又は共有結合ヘテロ二量体を形成し得る。図示される構築物のうちのいずれも、TGF-βポリペプチド内に、その二量体化能を制限する配列変異(例えば、C77S置換)を有し得る。
免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号68)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号69)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号70)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号71～78)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号79)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号80)。 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号81及び82) 免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列(aas)を示す(配列番号83)。
下線で示されたシグナルペプチドass1～22を含む、ヒトJ鎖のアミノ酸配列(配列番号84)を示す。
IgG1重鎖定常領域CH1ドメインの配列を示す。MD13様構築物の形成のために、ポジトン(positons)70及び72のセリン残基をそれぞれグルタミン酸及びバリン(S70E及びS72V)によって置換し得る。
Igκ及びIgλ鎖由来の軽鎖定常領域「CL」ドメインの配列を示す。位置68のセリン及び位置70のスレオニンは、MD13様構築物の形成のために、それぞれロイシン及びセリン(S68L及びT70S)によって置換され得る。
プレプロタンパク質としての3つの異なるTGF-βのアイソフォームの配列及びTGF-β3の成熟形態を、成熟タンパク質のC77S変異体と共に示す。
TGF-βアイソフォーム1～3のアラインメントを提供し、図中、TGF-β2のaa残基Lys25、Cys77、Ile92、及び/又はLys94を除く、TGF-β2の成熟形態の対応する残基を太字で示し、TGF-βアイソフォーム1及び3の他の形態におけるそれらの対応する残基を下線付きの太字なしで示す。
TGF-β受容体1型(TβRI)及びそのエクトドメインの配列を示す。
TGF-β受容体2型(TβRII)、そのエクトドメイン、及びエクトドメインの断片の配列を示す。アイソフォームB中、太字及び下線で示す位置は、成熟ポリペプチドのaasF30、D32、S52、E55、及びD118であり、これらのいずれも、天然に存在するaa以外のaaで置換され得る。
TGF-β受容体3型(TβRIII)の配列を示す。
蛍光サイトメトリー解析に基づく、様々な濃度の、様々なマスキングされたTGF-β構築物及び複合体の、ナイーブCD4T細胞上のFoxP3の発現を刺激する能力を示すプロットを示す。パートAは、細胞培養開始5日後における、50U/mlのIL-2の添加の不在下及び存在下での、表示濃度のTGF-β3又はマスキングされたTGF-β3WT構築物(図1、構造Aを参照)に基づく、(CD4＋細胞の割合としての)FoxP3の誘導を示す。パートBは、様々な濃度のTGF-β3、又は3つのマスキングされたTGF-β3構築物のうちの1つ、又は少なくとも1つのN末端wtもしくは変異型IL-2 MODを担持するマスキングされたTGF-β3複合体で、5日間処理されたナイーブT細胞の集団における、(CD4細胞の割合としての)FoxP3＋細胞の分布を示す(構造については、図7G～7Iを参照)。パートCは、0.1nM又は1000nMの濃度の、マスキングされたTGF-β3ポリペプチド(図6のパートBの構造(i))の存在下での、FoxP3＋CD4＋細胞の誘導を示す。
図1の構造Aの全体構造を有する、代表的なマスキングされたTGF-β(構築物番号：3470)配列番号146のaa配列を示す。該ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、wtのヒトIL-2(hIL2)、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトモノIgGFc、G4Sリンカーの3回反復、D118A置換を有するヒトTβRII(hTβRII)Δ25配列、G4Sリンカーの5回反復、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3(hTGF-β3)配列、を含む。
図1の構造Bの全体構造を有する、代表的なマスキングされたTGF-β(構築物番号：3334)配列番号147のaa配列を示す。ホモ二量体を形成する該ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、H16T及びF42A置換を有するhIL2、G4Sの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1Fc、G5S及びG4Sリンカーの2回反復、hTβRIIΔ25、D118A、G4Sの5回反復、及びhTGF-β3配列、を含む。
第1及び第2のポリペプチドを含む、図1の構造Dの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物のaa配列を示す。第1のポリペプチド構築物番号：3618(配列番号148)は、N末端からC末端にかけて、wt hIL-2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1Fcノブインホール(KiH)ポリペプチド鎖A、G4Sリンカー配列の5回反復、及びC77S置換を有するhTGF-β3配列、を含む。第2のポリペプチド(構築物番号：3619)配列番号149は、N末端からC末端にかけて、wt.hIL2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖B、G5Sリンカー及びG4Sリンカーの2回反復、及びhTβRIIΔ25、D118A配列、を含む。
第1及び第2のポリペプチドを含む、図1の構造Eの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物のaa配列を示す。上述の第1のポリペプチド(構築物番号：3618)配列番号150は、N末端からC末端にかけて、wt hIL-2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1Fcノブインホール(KiH)ポリペプチド鎖A、G4Sリンカー配列の5回反復、及びC77S置換を有するhTGF-β3配列、を含む。第2のポリペプチド(構築物番号：3855)配列番号151は、N末端からC末端にかけて、LALA、T366S、L368A、及びY407V置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖B、G4Sリンカーの3回反復、及びhTβRIIΔ25、D118A配列、を含む。
第1及び第2のポリペプチドを含む、図1の構造Fの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物のaa配列を示す。第1のポリペプチド(構築物番号：3891)配列番号152は、N末端からC末端にかけて、H16A、F42Aを有するhIL-2、G4Sリンカー配列の3回反復、LALA及びT366W置換を有するヒトIgG1Fcノブインホール(KiH)ポリペプチド鎖A、G5S及びG4Sリンカーの2回反復、hTβRIIΔ25、D118A、G4Sリンカーの5回反復、及びC77S置換を有するhTGF-β3、を含む。第2のポリペプチド(構築物番号：3664)配列番号153は、N末端からC末端にかけて、LALA置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖Bを含む。
第1及び第2のポリペプチドを含む、図1の構造Fの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物のaa配列を示す。第1のポリペプチド(構築物番号：3715)配列番号155は、N末端からC末端にかけて、LALA置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖A、G4Sリンカーの3回反復、及びヒトwtIL2配列を含む。第2のポリペプチド(構築物番号：3714)配列番号156は、N末端からC末端にかけて、LALA置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖B、G4Sリンカーの3回反復、hTβRIIΔ25(D32N及びD118A置換を有する)G4Sリンカー配列の5回反復、及びC77S置換を有するhTGF-β3配列、を含む。
図7A～7FのIL-2配列のいずれかは、IL-2以外のMOD又は変異体MODで置換されてもよく、wtIL-2で置き換えられてもよく、又はN88、H16及び/又はF42の置換(例えば、N88R、H16A又はH16Tから選択されるH16での置換、及び/又はF42A及びF42Tから選択されるF42での置換)を有するIL-2配列で置き換えられてもよい。
図1の構造Aの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物(構築物番号：3472)配列番号157のaa配列を示す。該ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、wt.hIL2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトモノIgGFc、G4Sリンカーの3回反復、D32N及びD118A置換を有するヒトTβRII(hTβRII)Δ25配列、G4Sリンカーの5回反復、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3(hTGF-β3)配列、を含む。
図1の構造Aの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物(構築物番号：3466)配列番号158のaa配列を示す。該ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、wt.hIL2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトモノIgGFc、G4Sリンカーの3回反復、D118A置換を有するヒトTβRII(hTβRII)Δ25配列、G4Sリンカーの5回反復、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3(hTGF-β3)配列、を含む。
図1の構造Aの全体構造を有する、代表的なマスキングされたTGF-β構築物(構築物番号：3468)配列番号159のaa配列を示す。該ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、H16T、F42A置換を有するhIL2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトモノIgGFc、G4Sリンカーの3回反復、D32N及びD118A置換を有するヒトTβRII(hTβRII)Δ25配列、G4Sリンカーの5回反復、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3(hTGF-β3)配列、を含む。
第1及び第2のポリペプチドを含む、図1の構造Dの全体構造を有する代表的なマスキングされたTGF-β構築物のaa配列を示す。第1のポリペプチド(構築物番号：3618)配列番号148は、N末端からC末端にかけて、wt hIL-2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1Fcノブインホール(KiH)ポリペプチド鎖A、G4Sリンカー配列の5回反復、及びC77S置換(subsitition)を有するhTGF-β3配列、を含む。第2のポリペプチド(構築物番号：3621)配列番号160は、N末端からC末端にかけて、wt.hIL2、G4Sリンカーの3回反復、LALA置換を有するヒトIgG1FcKiHポリペプチド鎖B、G4Sリンカーの3回反復、及びD32N及びD118A置換を有するhTβRIIΔ25配列、を含む。
マスキングされたTGF-β構築物(左)及び2つのマスキングされたTGF-β複合体(中央及び右)を示す。複合体のサンプルは、ポリペプチドをコードする核酸ベクターを構築し、ExpiCHO細胞にトランスフェクションし、ポリペプチドを発現させることによって調製した。プロテインAクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、このポリペプチドを精製した。精製したタンパク質をSDS-PAGEにかけ、得られたゲルをクマシーブルーで染色した。NR＝還元されていない又は非還元サンプル、R＝還元されたサンプル(ジスルフィド還元剤による還元)。
成熟TβRIIポリペプチド配列における様々なaa置換(図5Bを参照)の、TβRII及びTGF-β3又はTGF-β1への親和性に対する効果を示す(表、左上)。図9はまた、TβRIIでマスキングされたTGF-β構築物と固定化TβRII-Fc受容体構築物との間の結合相互作用に対する、これら3つの置換、すなわちE55A、D32N、及びS52Lの効果を示す。受容体構築物を、図の右上のTGF-β3を用いる捕捉アッセイ形式で示し、ここで、モノ-Fcは、他の足場への相互特異的結合を形成しないIg足場であり、抗IL-2は、ビオチン(B)で標識された、IL-2に対する抗体である。Strep及びHRPは、検出に使用されるストレプトアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼである。結合に対する効果は、4つのマスキングされた構築物の各々について作成した結合曲線として、捕捉において検出した(下)。実施例3を参照されたい。
マスキングされたTGF-β3複合体PSM-4033-4039を形成するポリペプチドの構造を示す。 マスキングされたTGF-β3複合体PSM-4033を形成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 マスキングされたTGF-β3複合体PSM-4039を形成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
PSM-4033-4039を用いて、ヒト末梢ナイーブCD4＋T細胞からFoxp3＋iTregを誘導させる実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。
PSM-4033-4039によって誘導されたFoxp3＋iTregを使用して、T細胞増殖を抑制する実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。
PSM-4033-4039を使用して、ナイーブ及びメモリーCD4＋T細胞を含むヒト末梢CD4＋T細胞からのFoxp3＋iTregの発現を誘導する実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。 PSM-4033-4039を使用して、ナイーブ及びメモリーCD4＋T細胞を含むヒト末梢CD4＋T細胞からのFoxp3＋iTregの発現を誘導する実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。
PSM-4033-4039を使用して、同種他家の(allogeneic)リンパ球反応によって活性化されたCD4＋T細胞からFoxp3＋iTregを誘導する実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。 PSM-4033-4039を使用して、同種他家のリンパ球反応によって活性化されたCD4＋T細胞からFoxp3＋iTregを誘導する実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。
PSM-4033-4039を様々な濃度でマウスに静脈内投与し、マウスにおける血清中濃度を、注射後72時間までの様々な間隔で測定した実験の結果を示す。実施例4を参照されたい。
IV.詳細な説明
A.定義
本明細書で使用されるとき、アミノ酸(文脈上複数であることができる場合を除き、単数形である場合は「aa」と略記し、複数形では「aas」とする)とは、哺乳動物細胞での翻訳においてポリペプチド及びタンパク質に組み込まれる天然に存在するタンパク質源性のαアミノ酸を意味する。特に明記しない限り、L(Leu、ロイシン)、A(Ala、アラニン)、G(Gly、グリシン)、S(Ser、セリン)、V(Val、バリン)、F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、H(His、ヒスチジン)、R(Arg、アルギニン)、N(Asn、アスパラギン)、E(Glu、グルタミン酸)、D(Asp、アスパラギン)、C(Cys、システイン)、Q(Gln、グルタミン)、I(Ile、イソロイシン)、M(Met、メチオニン)、P(Pro、プロリン)、T(Thr、スレオニン)、K(Lys、リジン)、及びW(Trp、トリプトファン)で示す。アミノ酸には、哺乳動物細胞に存在するいくつかのタンパク質に見られるアミノ酸であるヒドロキシプロリン及びセレノシステインも含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、及び「タンパク質」は、同義語であり、それらのC-1カルボキシル基とそれらのαアミンとの間のペプチド結合によって連結され、ポリペプチドの骨格を形成するaasの配列を意味する。したがって、MODポリペプチド配列、足場ポリペプチド配列、TGF-βポリペプチド配列、及び/又はマスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)のうちのいずれか1つ以上を含む各ポリペプチド(例えば、第1のポリペプチド)は、単一の連続する骨格を有するポリペプチド鎖として、それらのポリペプチド配列のうちのいずれか1つ以上を含む。かかるポリペプチド(例えば、第1のポリペプチド)は、共有結合(例えば、システイン残基の側鎖間のジスルフィド結合など)によって他のポリペプチドに連結され得る。さらに、本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、及び「タンパク質」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する(一般的には、当業者に既知のような保存的な性質の)修飾、例えば、欠失、付加、及び置換を含む。これらの修飾は、部位特異的変異導入などの意図的なものでもあり得、又は、タンパク質を産生する宿主における突然変異などの偶発的なものでもあり得、又は、PCR増幅又は他の組換えDNA法に起因するエラーでもあり得る。
実施態様、特許請求の範囲、又は態様が、特定種の哺乳動物(例えば、ヒト又は非ヒト対象)を対象とする場合、核酸及びポリペプチド配列は、それらの対象由来の配列に限定され得る。特に断りのない限り、タンパク質(例えば、TGF-β、TβR、免疫グロブリン、及びMOD)のポリペプチド配列は、ヒト(ホモサピエンス)の配列である。
本明細書で使用されるとき、「マスキングされた」とは、ある分子(例えば、マスキングされるポリペプチド又はマスキングされるタンパク質)が、マスキング分子(例えば、ポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質断片)に結合されるか、又はマスキング分子に関与されていることを意味し、それにより、該マスキングされた分子に対して同様に親和性を有する他のタンパク質(例えば、細胞表面受容体)による該マスキングされた分子の利用可能性が制限される。
本明細書で使用されるとき、マスキングされたTGF-β構築物という用語は、TGF-β(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β)ポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチドに結合するか、又はそうでなければTGF-βポリペプチドと相互作用するマスキングポリペプチド配列との両方を含む単一のポリペプチドを指す。特に断りのない限り、マスキングされたTGF-β構築物は、足場ポリペプチド配列を含み、任意に、1つ以上の独立して選択される免疫調節(MOD)ポリペプチド配列を含む。
本明細書で使用されるとき、マスキングされたTGF-β複合体という用語は、2つ以上のポリペプチド(典型的には、ホモ二量体又はヘテロ二量体として配置されるが、より高次の多量体でもあり得る、第1及び第2のポリペプチドとして指定される2つのポリペプチド)を指す。マスキングされたTGF-β複合体は、TGF-β(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β)ポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチドに結合するか、又はそうでなければTGF-βポリペプチドと相互作用するマスキングポリペプチド配列と、それを通してTGF-β複合体のポリペプチドが会合する二量体化又は多量体化配列を含む足場ポリペプチドと、を含む。いずれか1つ以上のTGF-β複合体ポリペプチドは、任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列を含む。
「マスキングされたTGF-β構築物又は複合体」という用語は、マスキングされたTGF-β構築物又はマスキングされたTGF-β複合体の略称である。この略語は、その複数形「マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(constructs or complexes)」で使用され得る。
用語「マスキングされたTGF-β構築物及び複合体」は、「マスキングされたTGF-β構築物」及び「マスキングされたTGF-β複合体」の両方の略語である。
本明細書で使用される二量体化及び多量体化配列は、二量体(例えば、ヘテロ二量体もしくはホモ二量体)、又は多量体(3つ、4つ、5つ以上のポリペプチド配列のホモもしくはヘテロ多量体)としてのポリペプチド配列(例えば、別個のポリペプチド)の会合を可能にするポリペプチド配列である。二量体化及び多量体化配列は、非共有様式での配列の会合を可能にし、いくつかの状況下では、それは共有結合による複合体(例えば、ポリペプチド間のジスルフィド結合形成)へ変換され得る。
相互特異的結合配列は、ポリペプチドの非対称な対形成(ヘテロ二量体形成)を可能にする二量体化配列である。相互特異的結合配列は、(ホモ二量体を形成するのとは対照的に)それらの相手側となる相互特異的結合配列(複数可)、すなわちそれらの同種(cognate)の結合相手とのヘテロ二量体の形成を有利にする。キーインホール(又はキーイントゥホール)Fcポリペプチド対は、相互特異的結合配列及びその相手側相互特異的結合配列の一例を表す。
本明細書で使用されるとき、Nanobodies(登録商標)又はナノボディは、全抗体と同様に、特定の抗原に選択的に結合することができる、単一単量体の抗体可変ドメインからなる抗体断片を意味する。
aa配列に関して野生型(「wt」と略記される)とは、文脈から理解されるように、生体において天然に見出される配列と比較し変化していない(その中にいずれの置換、欠失、もしくは挿入も有さない)、天然に存在するaa配列か、又は天然に存在するaa配列の連続部分を意味する。特定の天然に存在する配列は、参照のためにwt.配列として標記されうる。
本明細書で使用されるとき、「T細胞」は、例えば、ヘルパーT細胞(CD4＋細胞)、細胞傷害性T細胞(CD8＋細胞)、制御性T細胞(Treg)、及びNK-T細胞などの、CD3を発現する全ての型の免疫細胞を包含する。
用語「結合」とは、本明細書で使用されるとき、2つの分子間の非共有結合性の相互作用、例えば、MODとそのco-MODとの間の非共有結合相互作用を指す。非共有結合とは、例えば、静電的、疎水的、イオン性及び/又は水素結合性の相互作用による、2つの分子間の直接の会合を意味し、例えば塩橋や水橋などの相互作用を含む。非共有結合相互作用は通常、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、10-10M未満、10-11M未満、10-12M未満、10-13M未満、10-14M未満、又は10-15M未満の解離定数(KD)を特徴とする。「特異的結合」とは、一般に、少なくとも約10-7M以上の、例えば、5×10-7M、10-8M、5×10-8M、10-9M、及びそれ超の親和性での結合を指す。「非特異的結合」は、概して、約10-7M未満の親和性での結合(例えば、10-6M、10-5M、10-4Mの親和性での結合)のこと(例えば、リガンドの指定結合部位又は受容体以外の成分へのリガンドの結合)を意味する。本明細書で使用されるとき、「共有の結合(covalent binding)」又は「共有結合(covalent bond)」は、2つの異なる分子間に1つ以上の共有化学結合が形成されることを意味する。
「親和性」とは、非共有結合の強度を指し、高い結合親和性は低いKDと相関する。本明細書で使用する場合、用語「親和性」とは、2つの作用物質(例えば、抗体及び抗原)の可逆的結合における平衡定数のことを意味し、また解離定数(KD)で表される。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫調節ポリペプチド」又はMODとしては、T細胞上の同種の共免疫調節ポリペプチド(「co-MOD」)に特異的に結合し、それによりシグナルを生じさせる、抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞、B細胞など)上のポリペプチド、又はAPC上のポリペプチドの一部が挙げられる。例えば、IL-2などのインターロイキン又はその断片(MOD)の、細胞表面IL-2受容体(co-MOD)への結合は、細胞へのシグナルを提供する。MODとしては、限定されないが、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23、PD-L1並びにFasリガンド(FAS-L)が挙げられる。MODは、とりわけ、T細胞上に存在するco-MOD分子と特異的に結合して、coMODによるシグナル伝達をもたらす、抗体又は抗体配列(例えば、ナノボディ)も包含する。本明細書で考察されるように、MODはまた、例えばco-MODに対して低減された結合親和性を有する変異型MODなどの、wt.MODの変異型を包含する。このような親和性の低下は、複数の形態をとることができる。例えば、変異型IL-2 MODは、IL-2Rのα鎖、β鎖、及び/又はγ鎖のうちの1つ以上に対する親和性が低下し得る。本明細書で考察されるように、16位及び42位に変異を含む変異型IL-2 MODは、IL-2Rのα鎖への結合を実質的に示さず、IL-2Rのβ鎖に対する低下した親和性を示すことができる。加えて、2つ以上のco-MODを有するMOD(例えば、CD80はCD28及びCTLA-4の両方に結合する)の場合、変異型MODは、一方のco-MODに対する低下した親和性を有し、他方のco-MODに優先的に又は選択的に結合することができる。本開示の目的においては、TGF-β(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3)、及びその断片は、MODとはみなされない。
特に示されない限り、用語「実質的に」とは、「完全に」及び「大部分であるが完全にではない」の両方を包含することが意図される。例えば、IL-2Rのα鎖に実質的に結合を示さない変異型IL-2 MODは、IL-2Rのα鎖に全く結合しないか、又はIL-2Rのα鎖にほとんど結合しないIL-2変異型MODである。
本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」とは、例えば自己免疫性患者の体内で生じる任意のプロセス又は手順を指す。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ」とは、エクスビボと称され得る手順を含む、体外で生じる任意のプロセス又は手順を指す。
MODポリペプチド配列の配置を説明するために本明細書で使用されるとき、「タンデム」とは、2つ以上のMODが、相互に隣接して、最も分離されるとしてもリンカーによってのみ分離されて(例えば、足場、マスキングポリペプチド又はTGF-β配列が介在しない)、ポリペプチド上に配置されていることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「エクトドメイン」は、細胞外空間内に延在し、膜貫通ドメインの充分な部分を含まずに、それを細胞膜内に固定する膜タンパク質の部分(ドメイン)を意味する。
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」とは、2つのポリヌクレオチド配列又は2つのポリペプチド配列間の、aa又はヌクレオチド同一性の尺度である。あるタンパク質又はポリヌクレオチド配列が、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対する特定のパーセント「配列同一性」を有するということは、2つの配列のアラインメントで比較したときに、塩基又はアミノ酸のパーセンテージが同一であり、同一の相対位置にあることを意味する。配列同一性については多数の異なる方式を用いて測定することができる。配列同一性を測定するために、様々な簡便な方法、及び、ワールドワイドウェブのサイトで利用可能なコンピュータプログラム(例えば、BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFTなど)を使用して、配列をアラインしてもよく、そのサイトにはncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/が含まれる。例えば、Altschulらの文献、(1990),J.Mol.Biol.215：403-10を参照されたい。特に明記しない限り、配列同一性は、2019年4月1日にリリースされたNCBI BLASTアルゴリズム、バージョンBLAST＋2.9.0(タンパク質の場合BLASTP 2.9.0＋、及び核酸の場合BLASTN 2.9.0＋)で実行されたアラインメントを使用して決定される。
本明細書で使用する場合、「組換え」とは、特定の核酸(DNA又はRNA)が、天然系に存在する内在性核酸と識別することが可能な構造コード又は非コード配列を有する構築物をもたらすクローニングステップ、制限ステップ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ステップ及び/又はライゲーションステップの様々な組み合わせによる生成物であることを意味する。ポリペプチドをコードするDNA配列を、cDNA断片又は一連の合成オリゴヌクレオチドからアセンブルして、細胞内に、又は無細胞転写系及び無細胞翻訳系内に含有される組換え転写単位から発現可能な合成核酸を得てもよい。ペプチド、ポリヌクレオチド、又はタンパク質に関して使用される組換えとは、それらが組換え核酸からの発現によって調製されたことを示す。
本明細書で使用されるとき、ある量に関連して使用される用語「約」とは、その量が記載の量の10％変化し得ることを示す。例えば、「約100」は、90～110の量を意味する。約を範囲の文脈において使用する場合、範囲の下限量に関して使用される「約」は、範囲の下限量よりも10％低い量を含むことを意味し、範囲の上限量に関して使用される「約」は、範囲の上限量よりも10％高い量を含むことを意味する。例えば、約100～約1000は、範囲が90～1100に及ぶことを意味する。
本発明で使用する場合、用語「治療」、「治療すること」などは、広義には、所望の薬学的効果及び/又は生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び/又は、疾患及び/又はその疾患に起因する悪作用の部分的又は完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳動物における疾患又は症状の任意の治療を包含し、(a)その疾患又は症状にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象における疾患又は症状の発症を予防すること、(b)その疾患又は症状を抑制すること、すなわち、その進行を阻止すること、及び/又は、(c)その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を退行させること、を含む。疾患又は傷害の発症前、その間、又はその後に、治療薬(例えば、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体)を投与し得る。進行中の疾患の治療(その治療は患者の望ましくない臨床症状を安定化又は抑制する)には特に利点がある。このような治療は、望ましくは、罹患組織の機能が完全に喪失される前に実施される。治療的処置は、疾患の症候期中に、及び幾つかの例では、疾患の症候期後に施される。
用語「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」は本明細書において同じ意味で使用され、診断、治療又は療法が望まれる任意の哺乳動物対象のことを意味する。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類(例えば、ラット、マウス)、ウサギ目(例えば、ウサギ)、有蹄類(例えば、雌ウシ、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタなど)、イヌ目(例えば、イヌ)、ネコ目(例えば、ネコ)など(例えば、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、ネズミ、ヤギ類、サル類、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラッピン(lappine)、ブタなど)が挙げられる。
本明細書並びに添付の態様及び特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。それゆえ、例えば、「a Treg」というときは、複数のそのTregを包含し、「TGF-βポリペプチド」というときは、1つ以上のTGF-βポリペプチド及び当業者に既知のその均等物などへの言及を包含する。さらに、特許請求の範囲は、いずれの任意のエレメントも含むか又は除外するかのいずれかであるように作成され得るということに留意されたい。すなわち、この宣言は、(例えば、「単に」、「のみ」などの用語を用いて)特許請求の範囲でのそのようなエレメントの使用(包含)、もしくは特許請求の範囲からのそれらの除外、のいずれかである、前者の根拠として、又は、特定の任意のエレメントを除外する「否定的な」限定のための根拠として、機能することを意図するものである。
明確さのために個々の態様又は実施態様との関係において記載した本発明における特定の特徴はまた、従属請求項記載の発明を含む単一の態様又は実施態様において、組み合わせて提供してもよいということを理解されたい。逆の言い方をすれば、簡潔にするため、単一の実施態様との関係において記載した本発明における様々な特徴を、さらに、別々に、又は、任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に属する実施態様の全ての組み合わせは、本発明により明示的に包含され、それぞれ及び全ての組み合わせが個別にかつ明確に開示されるかのように本明細書において開示される。加えて、様々な実施態様及びそれらのエレメントにおける全ての副組み合わせもまた、本発明により明示的に包含され、それぞれ及び全てのこのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書において開示されるかのように、本明細書において開示される。
本明細書で考察される刊行物は、単に本願の出願日前にそれらの開示を提供したに過ぎない。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明によりこのような刊行物に先行する権利を持たないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供した刊行物の日付は実際の刊行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要が生じる場合がある。
B.説明
1.序論
TGF-βスーパーファミリーは、成長阻害機能を有する内因性タンパク質を包含する。TGF-βの発現の増加、又はTGF-βの作用を阻害する細胞メカニズムの欠陥は、とりわけ、TGF-βの免疫抑制作用により、多くのがんの悪性腫瘍と相関している。TGF-βの免疫抑制機能の調節不全は、自己免疫疾患にも関与する。TGF-βは、免疫機能の主要な調節因子であるため、多数の研究の標的となり、TGF-β及びそのシグナル伝達経路の両方は、炎症プロセス及び自己免疫障害を含む様々な疾患の治療のための治療標的と考えられている。
治療薬としてTGF-βを効果的に産生及び送達する能力は、分子の毒性及びTGF-βの受容体系の複雑さのため、複雑である。哺乳動物細胞発現系におけるTGF-βの大量産生は、多くの哺乳動物細胞に対する該タンパク質の毒性によって制限される。TGF-βの細胞傷害性が問題となる細胞としては、市販のタンパク質製造のために最も強健でかつ一般的に用いられる細胞の1つである、チャイニーズハムスター卵巣(又は「CHO」)細胞などの、生体分子の産生に使用される多くのものが挙げられる。治療薬としてのTGF-βの使用はまた、(TGF-β3のpIが約6.1であるのとは対照的に)約8.59ものpIを有するTGF-β1の高いpIによって複雑であり、その非酸性条件下での安定性/溶解性(そのような酸性条件は、一般に、治療的使用に適していない)は限られている。加えて、哺乳動物系内に存在する多量の高親和性TβRIII受容体(例えば、TGF-β2に対して5nM程度)は、TGF-βに対するTβRIIIの親和性(1～2μM程度)と比較して有意な薬力学的シンク(sink)を表し、TGF-βベースの生物学的製剤の標的組織へのアクセスを制限する。同様に、TGF-βをTβRII/TβRI複合体に動員するTβRIIIの役割は、TGF-βの有意なオフターゲット送達をもたらし、意図しない、望ましくない、さらには毒性効果をもたらし得る。このようなオフターゲット送達は、非特異的な活性化をもたらし得、また、特にTGF-βシグナル伝達がフィードフォワード制御下にある場合に、活性型TGF-βのさらなる産生をもたらし得、それによってさらなる意図しない及び望ましくない効果をもたらす。例えば、Jiangらの文献、Redox Biol.2：267-272(2014)を参照されたい。
治療薬としてのTGF-βの効果的な使用は、TGF-β刺激の結果を得るために細胞に対し追加の刺激を提供する必要性があるため、さらに複雑である。上述のように、サイトカイン、例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23、PD-L1並びにFasリガンド(FAS-L)は、TGF-βの作用に重大な影響を与えるものとなり得る。したがって、TGF-βの送達及びサイトカインなどの形態での追加の刺激を送達する能力は、特定の治療的又は細胞媒介性の(例えば、インビトロ又はインビボの)効果を達成するのに有利であり得る。
下記でより詳細に考察されるように、本開示は、TβRI及びTβRIIタンパク質を有する細胞と相互作用し、シグナル伝達を刺激することができる、TGF-βポリペプチドの使用を記載する。有利には、TGF-βポリペプチドは、足場(例えば、免疫グロブリンFcポリペプチドなどの1つ又は2つのポリペプチド)の周りに構築されたTGF-βポリペプチド配列(例えば、マスキング配列として機能するTβRII配列)に結合してマスキングするポリペプチドも含有する融合タンパク質(単一のポリペプチド鎖)又は融合タンパク質複合体(2つ以上のポリペプチド鎖)である、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の一部である。このような融合タンパク質又は融合タンパク質複合体の例を、図1に示す。融合タンパク質のTGF-βポリペプチドが、例えば細胞のTβRIIIと相互作用する場合、TGF-βと結合してマスキングする融合タンパク質の部分は、TβRIIIと競合し、TGF-βがTβRIIIリザーバー内で捕捉されるのを防止する。加えて、TGF-βポリペプチドに対するマスキングポリペプチドの親和性は、aa置換を使用して意図的に変化させることができ、図9に示されるように、その標的受容体(例えば、TβRII)に対するマスキングポリペプチドの全体的な効力を制御する。TGF-βポリペプチドは、主にジスルフィド結合二量体としてTβRIIIに結合するため、隔離につながるその受容体との相互作用は、下記で考察されるように、二量体化を制限するaa置換(例えば、C77S)又は二量体の安定性を制限するaa置換を含むことによって減弱させることができる。TGF-β融合タンパク質又は融合タンパク質複合体とTβRIIとの相互作用は、マスキング配列に取って代わり、細胞表面結合型のTGF-β/TβRII複合体を形成する。ヘテロ二量体TGF-β受容体を形成するためのTβRIのその後の動員は、マスキングポリペプチド配列の存在下でもTGF-βに強固に結合する高親和性複合体(例えば、ピコモルレベルの親和性)を提供する。したがって、マスキングされたTGF-βは、依然として、ヘテロ二量体TβRI/TβRII受容体複合体に結合し、古典的Smadタンパク質経路、非古典的Junキナーゼ経路、及びp38シグナル伝達経路を通してシグナル伝達することができる。実際には、マスキングポリペプチドは、TGF-βを細胞に送達し、それを細胞表面TβRII分子に引き渡し、その後TβRIタンパク質が動員され、TGF-βポリペプチドを適切な位置に効果的に保持する機能的で活性なシグナル伝達複合体を形成する。
TGF-β結合タンパク質(例えば、そのTGF-β結合エクトドメインの全て又は一部を含むTGF-β受容体の断片)によってマスキングされたTGF-βを、望ましくないオフターゲット相互作用を回避する形態で送達することに加えて、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、標的細胞に対するTGF-β作用の結果に影響を及ぼすことができる免疫調節物質(「MOD」ポリペプチド)として機能する、1つ以上のポリペプチドを含んでもよい。TGF-β及び免疫調節物質の両方を一緒に送達する能力は、TGF-β活性化シグナルの動作を生じさせることを可能にするだけでなく、免疫調節物質の単独投与と比較して、標的細胞に同じ効果をもたらすために必要となる免疫調節物質の量を低減させる。これは、同じ標的細胞上の受容体に対する親和性を有する2つのポリペプチド配列を有することによって得られる(アビディティ増強による)親和性の増加の結果である。1つ以上のMODを担持するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、TGF-βポリペプチド及び1つ以上のMODの両方に対する受容体を担持する標的細胞との間のアビディティ増強(それらの受容体とのMOD相互作用に起因する、結合の遊離エネルギーΔGの増加の結果として)は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が飽和未満の量で存在する場合にも、両方の種類の受容体を有する標的細胞の活性化において選択性を向上させる。例として、IL-2 MODを有する、図1の構造A又は図7GのようなマスキングされたTGF-β構築物は、同等(等モル)量のIL-2 MODポリペプチドの存在下であっても、IL-2 MODを欠く以外は同一のマスキングされたTGF-β構築物と比較して、ナイーブCD4＋細胞のiTReg分化のより強力な誘導物質である。加えて、飽和未満の用量で、かつ類似数の細胞種が存在する場合、例えば、図7Gに示すようなIL-2 MODを有する図1構造Aのような構築物は、IL-2 MODを欠く構築物と比較して、TGF-β及びIL-2受容体の両方を有する細胞に選択的に結合する。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の作用は、個々のポリペプチド配列の作用を変化させる修飾の組み込みによってさらに特定することができる。幾つかの実施態様では、TGF-βの二量体化能力を変化させるaa置換(例えば、TGF-β3におけるC77S置換)を組み込み得る。TGF-βの単量体形態はTβRIIIに対する親和性をほとんど示さないが、TGF-βの二量体化する能力を制限する変異の組み込みは、TβRIIIへの標的結合の制限を解除することができ、複合体をTGF-β「リザーバー」に引き込むことができ、標的細胞を刺激するその能力を制限することができる。
マスキングポリペプチド配列、及び免疫調節性ポリペプチド配列を含む、TGF-βポリペプチド配列以外のポリペプチド配列に対しても、修飾(例えば、置換、欠失、挿入など)を行い得る。
TGF-βポリペプチド配列の修飾に加えて、TGF-βに結合しそれをマスキングするポリペプチドへの修飾を行うことができる。かかる修飾は、TGF-βに対するマスキングポリペプチドの親和性、並びにマスキングポリペプチド及びTGF-βポリペプチドのブリージング速度(breathing rate)(オン及びオフ速度)を変更することによって、TGF-βポリペプチド配列の利用可能性を変化させることができる。2つの異なるTGF-βポリペプチド/マスキングポリペプチド複合体は、同じ結合会合定数(kon対koffの比)を有し得るが、より高いkon及びkoffを有する複合体は、速度定数(rate constants)、特にkoff率(rate)に応じて、細胞表面TβRIIへの結合においてより効果的に利用可能であり得る。図9は、TGF-β1及びTGF-β3に対する親和性を変化させるTβRIIにおけるいくつかのaa置換のリストと共に、TGF-β3へのTβRII結合に各々異なる影響を有する3つの置換なし、又はそのうちの1つの置換を有する以外は同一の、TβRIIマスキングされたTGF-β構築物の親和性を示すグラフを示す。
様々なポリペプチドを利用して、両方の一本鎖抗体配列(例えば、ヒト化一本鎖抗体配列)を含むTGF-βをマスキングすることが可能であるが、TGF-βに結合する最小限のTGF-β受容体配列(例えば、TβRI、TβRII、又はTβRIIIのエクトドメイン)を用い得る。TβRIIIのエクトドメインは、二量体TGF-βのマスキングポリペプチドとして利用され得るが、TGF-βに対するその高い親和性は、TGF-βポリペプチド配列のTβRIIへの結合をアンタゴナイズさせ得る。それにもかかわらず、TβRIIIマスキング配列は、TGF-βポリペプチドに対してより高い親和性を有する細胞表面TβRI/TβRII複合体によって効果的に置き換えられ得、それによって、それらの細胞表面受容体の活性化を可能にする。
TβRIIのエクトドメインは、マスキングポリペプチドとして利用され得る。TβRIIのN末端アミノ酸の欠失(例えば、デルタ14又は25)により、D118A置換の存在下又は不在下で、約4.5～約5.0(例えば、約4.7～4.85)の計算値pIでTGF-βをマスキングするのに好適なタンパク質(又はポリペプチド)を産生することができる。TGF-β1ポリペプチド(高いpI値を有する)とTβRIIマスキングポリペプチド(例えば、N末端欠失を有するものを含む)との組み合わせは、TGF-β1ポリペプチド電荷を潜在的に中和することができる。TβRII(デルタ25、D118A)/TGFβ1の計算値pIは6.23程度であり、TGFβ1は約8.59のpIを有する。対照的に、デルタ14又はデルタ25TβRII及びTGF-β3の複合体(D118A及び/又はC77S置換の有無を問わない)は、約4.9～約5.3(約5.06～5.17のpI)のpI計算値を有する。加えて、TβRIIエクトドメインを活性TGF-βポリペプチドと組み合わせることで、細胞表面のTβRIと相互作用可能な複合体が得られ、それによって、TGF-βのTGF-βシグナル伝達に影響を与えることができる(例えば、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、又は部分的アンタゴニストとして作用する)が、このaa置換の組み込みは、TβRIとの相互作用を制限し、シグナル伝達活性化に関与するマスキングされた複合体の能力を制限又は遮断する。したがって、下記で考察されるように、TβRIへの結合を低減又は切断する、N末端欠失(例えば、14～25aa、Δ14～Δ25の欠失)又は置換(例えば、D118における、D118A、D118Rなどのアスパラギン酸以外のaaによる置換)を有するTβRIIエクトドメイン配列の組み込みを使用して、TGF-βをマスキングし、TβRIIのN末端がインタクトである、TβRIIエクトドメインでマスキングされたTGF-βポリペプチドにより、細胞の刺激を防止することができる。したがって、マスキングされたTGF-β複合体には、TGF-βがTβRIIのN末端欠失変異体によってマスキングされたものが含まれ、TGF-βのマスキングを解除(マスキングペプチドからの解離又は折りたたみ分子の展開)すること、標的細胞のTβRII及びTβRIに結合して活性ヘテロ二量体TβRI/TβRIIシグナル伝達複合体を形成すること、によって作用することができる。
TGF-βのマスキングは、細胞の生存率を低下させることなく、哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞)において高レベルでのその発現を可能にする。これは特に、マスキングされたTGF-βポリペプチドが、N末端aa欠失、置換、及び/又は他の変異によってTβRIとの結合を遮断される場合に当てはまる。TβRIII相互作用の遮断(例えば、二量体化を遮断することによって)は、細胞発現と関連する問題をさらに低減することができる。
C.マスキングされたTGF-Β構築物及びマスキングされたTGF-Β複合体
本開示は、マスキングされたTGF-β構築物(例えば、図1、単一のポリペプチド鎖を有する構造Aを参照)及びマスキングされたTGF-β複合体(例えば、図1、2つのポリペプチド鎖の複合体を有する構造B～Fを参照)の調製を記載する。マスキングされたTGF-β構築物及びマスキングされたTGF-β複合体は、それらの構成要素として、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、TGF-βポリペプチド(複数可)に結合してマスキングする少なくとも1つのポリペプチドと、任意に1つ以上の(例えば、1つ、2つ又は3つの)免疫調節ポリペプチド(MOD)と、を含み、これらは全て足場構造上に組み立てられる。マスキングされたTGF-β構築物及びマスキングされたTGF-β複合体は、膜結合タンパク質の部分(例えば、TGF-β受容体)を含むが、別段の記載がない限り、それらは膜アンカードメイン(例えば、発現したタンパク質の大部分が(例えば、発現したCHO細胞の)細胞膜に固定されるのに充分な膜貫通ドメイン)の部分を含まない。
図1に示される形態のものを含む、TGF-β構築物及び複合体の非限定的な例を次に記載する。
MOD、足場、リンカー、TGF-βポリペプチド及びTGF-βマスキングポリペプチド(例えば、一本鎖抗体又はTGF-β受容体エクトドメイン)を含む、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体の構成要素について、各々次のセクションに記載する。
D.免疫調節ポリペプチド配列(「MOD」)
1.マスキングされたTGF-β構築物及び複合体へのMODの組み込み
上で考察されたように、免疫調節ポリペプチド(MOD)は、マスキングされたTGF-βポリペプチドの送達、又はTβRI及びTβRIIヘテロ二量体受容体を介して細胞を活性化するその能力には必要ではないが、MODは、TGF-β受容体活性化の結果に実質的に影響を与えることができる。したがって、野生型(wt.)又は変異型MOD(例えば、「co-MOD」、「共免疫調節ポリペプチド」又は同種の共刺激受容体もしくはそれらのサブタイプとも称される、特定の受容体に対する低減された親和性、増加された親和性又は選択性を示す)を組み込むことが望ましい場合がある。TGF-βも免疫調節ポリペプチドであるが、本明細書に記載のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体における中心エレメントであるため、本明細書で使用されるとき、用語「MOD(複数可)」は、TGF-β又はそのポリペプチドを含まない。
マスキングされたTGF-β構築物及び複合体(例えば、ホモ二量体又はヘテロ二量体複合体)のいずれかへの包含に好適なMODとしては、PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23が挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの例では、MODは、成熟PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23ポリペプチド、又はそれらのいずれかの断片から独立して選択される。マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に組み込まれたMODポリペプチド配列(複数可)は、分泌されたMODポリペプチドの部分のみを、又は膜アンカー型である場合は全長成熟MODタンパク質の細胞外部分を含むことができる。したがって、例えば、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内のMODポリペプチド配列は、幾つかの例では、幾つかの天然のMOD内で通常見られるシグナルペプチド、膜貫通ドメイン、及び/又は細胞内ドメインの1つ以上(例えば、各々)を除外することができる。
幾つかの例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体に含めるのに好適なMODポリペプチド配列は、天然に存在するMODのアミノ酸配列の全部又は一部分(例えば、細胞外部分)を含む。他の例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体に含めるのに好適なMODとしては、天然に存在するMODのアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、置換、及び/又は欠失を含む、少なくとも1つの(例えば、1つ、2つ、もしくは3つの独立して選択される)変異型MODが挙げられる。
幾つかの例では、変異型MODは、co-MODに対する対応する天然型MOD(例えば、変異型内に存在するアミノ酸置換(複数可)を含まないMOD)の親和性よりも低い、co-MODに対する結合親和性を呈する。親和性の低下に応じて、それらのco-MODに対する親和性が低下しているMODの使用は、TGF-βポリペプチドが結合相互作用に対してより多くの影響を有する、又はそれを優勢にすることを可能にする。TGF-βポリペプチドの結合親和性がMODのものよりも高い場合、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を駆動して、TGF-β受容体系を有する細胞(例えば、高親和性TGF-β結合ヘテロ二量体を形成するTGF-βR1及びTGF-βR2)と会合させることができると同時に、充分なco-MODの存在下であっても、TGF-β受容体を欠いているか又はほとんど有していない細胞への標的結合を制限することができる。本質的に、TGF-βポリペプチドのその細胞受容体に対する親和性(例えば、結合のΔG)が、それらのco-MODに対するMODの親和性(例えば、結合のΔG)よりも大きい場合、TGF-βは、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の結合及び特異性を左右する。
一実施態様において、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体と関連する任意の1つ以上のMODは、wt.又は下記変異型：PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23、及びそれらの組み合わせ、からなる群から独立して選択される。
幾つかの例では、Treg細胞の産生を刺激することが望ましい場合などでは、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-2ポリペプチド又はIL-2変異型ポリペプチドである。IL-2における配列変異は、IL-2ポリペプチド及びマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、IL-2R受容体サブユニットの異なる組み合わせを有する標的細胞への結合を偏らせるように選択され得る。IL-2受容体は、共通のIL-2Rγ及び2つの追加のIL-2Rα及び/又はIL-2Rβサブユニットから構成され、三量体(IL-2Rα)2-IL-2Rγ、(IL-2Rβ)2-IL-2Rγ、又は高親和性(Kd約10ピコモル)IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ受容体を形成する。α鎖(CD25)はIL-2に特有であるが、β鎖(CD122)はIL-15受容体と共有され、シグナル伝達に重要なγ鎖(CD132)は、他のサイトカイン受容体鎖と連携することができる。H16(例えば、H16A又はH16T)又はF42(例えば、F42A又はF42T)での置換は、IL-2Rβサブユニットを有する受容体に有利に結合を偏らせることができ、したがって、それらの組み込みは、β-γ受容体((IL-2Rβ)2-IL-2Rγ)を提示するメモリーT細胞及びNK細胞、又は高親和性α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受容体を提示する活性化されたT細胞及びTreg細胞への結合を偏らせる。対照的に、N88(例えば、N88R)での置換は、IL-2Rβへの結合を減少させ、IL-2Rαサブユニットを有する受容体に有利に結合を偏らせることができ、したがって、N88での置換は、α-γ((IL-2Rα)2-IL-2Rγ)及びα-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ)受容体を有する細胞への結合を偏らせると同時に、β-γ受容体を有する細胞の結合及び活性化を回避する。例えば、Skrombolas及びFrelingerの文献、Expert Rev Clin Immunol.,10(2)：207-217(2014)を参照されたい。置換されたMOD(aa置換を有するIL-2ポリペプチドなど)を、そのco-MOD又はco-MODを提示する細胞に結合させる文脈で使用する場合、偏りとは、置換の存在が、wt.MODとco-MOD間の相互作用と比較して、置換されたMODと同じco-MODとの相互作用の程度を変化させることを意味する。例えば、より低い副作用プロファイルを有し(例えば、より安全であり)、ヒト対象でより優れた忍容性を示す、N88における置換(例えば、N88R)を有するIL-2配列は、H16及び/又はF42における上述の置換と共に含まれ得る。
iTreg細胞(CD4＋FoxP3＋細胞)の産生を刺激することが望ましい場合(例えば、エフェクターT細胞を能動的に抑制する、及び/又は免疫媒介性組織損傷を阻害するために末梢寛容を誘導することが望ましい場合)などの、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、独立して選択されるwt.又は変異型のPD-L1 MODポリペプチドである。例えば、Franciscoらの文献、J.Exp.Med.,206(13)：3015-3029(2009)を参照されたい。wt.又は変異型PD-L1配列に加えて、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型のIL-2ポリペプチドを含むことができる。IL-2における配列変異は、異なる組み合わせIL-2R受容体サブユニットを有する標的細胞への、IL-2ポリペプチド及びマスキングされたTGF-β構築物の結合を偏らせるように選択され得る。上で考察されたように、IL-2変異体は、IL-2Rβサブユニットを有する受容体に有利に結合を偏らせることができる、H16(例えば、H16A又はH16T)及び/又はF42(例えば、F42A又はF42T)における置換；及び/又は、IL-2Rβへの結合の減少が、ヒト対象でより優れた忍容性を示す、N88(例えば、N88R)における置換を含むIL-2、を含む。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物/TGF-β複合体は、H16T及びF42A置換の両方、又はH16A及びF42置換の両方を含み、そのペアのいずれかを、N88置換(例えば、N88R)と組み合わせ得る。
Th17細胞の産生を刺激することが望ましい場合など、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-6ポリペプチド又はIL-6変異型ポリペプチドである。
Th9細胞の産生を刺激することが望ましい場合など、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-4ポリペプチド又はIL-4変異型ポリペプチドである。例えば、Elyamanらの文献、Immunity.,36(4)：623-634,Immunity.(2012)を参照されたい。
低親和性T細胞のIL-7依存的な生存を、胸腺細胞IL-7Ra発現の制御によって促進することが望ましい場合など、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-7ポリペプチド又はIL-7変異型ポリペプチドである。
T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞の産生を刺激することが望ましい場合など、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-21もしくはIL-23ポリペプチド、又は変異型のIL-21もしくはIL-23ポリペプチドである。
忍容性を誘導することが望ましい場合など、幾つかの例では、少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)が、マスキングされたTGF-β構築物及び/又はFasリガンド(FasL)ポリペプチドの変異型の内部に存在する。
II型自然リンパ系細胞(ILC2細胞)を阻害する(例えば、喘息及びアレルギー性炎症を抑制するために)ことが望ましい場合など、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つ、もしくは3つの独立して選択されるMOD)は、IL-10ポリペプチド、又は変異型IL-10ポリペプチドである。例えば、Rajasらの文献、J Allergy Clin Immunol,139(5)：1468(2017)、及びOgasawaraらの文献、J Allergy Clin Immunol,141(3)：1147-1151(2018)を参照されたい。ILC2細胞の阻害は、インビボ(組織もしくは体液中)又はインビトロ(培養培地中)での2型サイトカインIL-5及びIL-13の産生の減少によって評価され得る。IL-10ポリペプチドは、Josephsonらの文献、J.Biol.Chem.275：13552-13557(2000)に記載されるような、IL-10M1分子などの単量体の異性体、又はその変異型であり得、いずれも下記で考察される。生物学的に活性な形態は絡み合ったIL-10ペプチド対であり、2つのIL-10分子及び4つのIL-10Ra受容体鎖からなる複合体が形成されている野生型IL-10とは対照的に、IL-10M1は可溶性IL-10Raと1：1複合体を形成し、その解離定数は30nmであり、細胞増殖アッセイにおいて生物学的に活性である(同上)。
2.親和性の低いMOD及び変異型MOD
そのco-MODに対して低い親和性を呈する好適なMODは、野生型MOD配列に対して、1アミノ酸(aa)～20aaの変異を有することができる。例えば、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物・複合体内に存在する変異型MODポリペプチドは、アミノ酸配列において、対応する野生型MOD配列と比較し、1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、又は10aa異なる。別の例として、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODポリペプチドは、アミノ酸配列において、対応する野生型MOD配列と比較し、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、又は20aa異なる。一例として、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODポリペプチドは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、1個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、2個のaa置換(例えば、2個以下のaa置換)を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、3個のaa置換(例えば、3個以下のaa置換)を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、4個又は5個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、6個又は7個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、8個又は9個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、10個又は11個のaa置換(例えば、10個以下のaa置換)を含む。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、11個又は12個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、13個又は14個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、15個又は16個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、17個又は18個のaa置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、対応する参照(例えば、野生型)MOD配列と比較して、19個又は20個のaa置換を含む。
上で考察されたように、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に含めるのに好適な変異型MODは、対応する野生型MODの同種co-MODに対する親和性と比較して、それらの同種co-MODに対する低い親和性を示し得る。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、同種co-MODに対して、1nM～100μMの結合親和性を有する。
例えば、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、同種co-MODに対して、約1nM～約5nM、約5nM～約10nM、約10nM～約50nM、約50nM～約100nM、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
3.結合親和性の測定
MOD(例えば、MODポリペプチド)とその同種co-MODとの間の結合親和性は、精製されたMOD及び精製された同種co-MODを使用して、バイオレイヤー干渉法(BLI)によって測定することができる。MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、MODの同種co-MODとの間の結合親和性もまた、精製されたマスキングされたTGF-β構築物又は複合体及びMODの同種co-MODを使用して、BLIによって測定することができる。BLI法は、当業者に周知である。例えば、Ladらの文献、(2015)J.Biomol.Screen.20(4)：498-507及びShahおよびDuncanの文献、(2014)J.Vis.Exp.18：e51383を参照されたい。MODとその同種co-MODとの間、又はMODを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体とその同種co-MODとの間の、本開示に記載される特異的及び相対的な結合親和性は、下記の手順を使用して測定することができる。
MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体とMODの同種co-MODとの間の結合親和性を測定するため、下記のように、Octet RED96(Pal ForteBio)装置、又は同様の装置を使用して、BLIアッセイを実施することができる。対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、野生型MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体)を、不溶性支持体(「バイオセンサー」)上に固定化する。固定化されたマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が「標的」である。固定化は、捕捉抗体を不溶性支持体上に固定することによって行うことができ、その捕捉抗体が、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を固定化する。例えば、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体がIgFc足場を含む場合、固定化は、抗IgFc(例えば、抗ヒトIgGFc)抗体を不溶性支持体上に固定化することによって実施され得、その固定化された抗IgFc抗体が、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に結合し、それを固定化する。co-MODを、いくつかの異なる濃度で、固定化されたマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に適用し、装置の応答を記録する。アッセイは、25mMのHEPES(pH6.8)、5％ポリ(エチレングリコール)6000、50mMのKCl、0.1％ウシ血清アルブミン、及び0.02％Tween20非イオン性界面活性剤を含む液体培地で行われる。固定化されたマスキングされたTGF-β構築物又は複合体へのco-MODの結合を30℃で行う。
結合及び結合親和性の陽性対照として、抗体(例えば、モノクローナル抗体)を使用することができる。抗体は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の特異的構造に基づいて選択され得る(例えば、図1を参照されたい)。例えば、TGF-β、TGF-β受容体、足場又はMODポリペプチド配列に対するモノクローナル抗体(mAb)は、該抗体が、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を支持体(バイオセンサー)から解離させないものであれば、陽性対照として使用することができる。抗MHCクラスI又はクラスIIモノクローナル抗体の段階希釈を使用して標準曲線を作成することができる。co-MOD又は抗MHC mAbは、「分析物」である。BLIは、(i)固定化されたポリペプチド(「標的」)、及び(ii)内部基準層、の2つの表面から反射される白色光の干渉パターンを分析する。バイオセンサー先端に結合した分子(「分析物」；例えば、co-MOD；抗HLA抗体)の数の変化は干渉パターンのシフトを引き起こし、干渉パターンにおけるこのシフトを、リアルタイムで測定することができる。標的/分析物相互作用の親和性を説明する動態関連の2つの値は、会合定数(ka)及び解離定数(kd)である。これらの2つの値の比(kd/a)は、親和性定数KDを与える。
上述のように、MOD(例えば、IL-2又はIL-2変異型)とその同種co-MOD(例えば、IL-2R)との間の結合親和性の測定もまた、BLIによって測定することができる。このアッセイは、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体について上述したものと同様である。BLIアッセイは、下記のように、Octet RED 96(Pal ForteBio)装置、又は同様の装置を使用して実行することができる。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の構成要素であるMOD(例えば、本開示の変異型IL-2ポリペプチド)、及び対照MOD(対照MODは、野生型MOD、例えば、野生型IL-2を含む)を、不溶性支持体(「バイオセンサー」)上に別個に固定化する。各MODが「標的」である。固定化は、捕捉抗体を不溶性支持体上に固定することによって行うことができ、その捕捉抗体がMODを固定化する。例えば、標的が免疫親和性タグ(例えば、FLAG、ヒトIgGFcなど)に融合される場合、固定化は、適切な抗体を、不溶性支持体上の免疫親和性タグ(例えば、抗ヒトIgGFc)に固定化することによって実施でき、固定化された抗体は、MOD(MODは、IgFcポリペプチドを含む)に結合し、それを固定化する。co-MODを、いくつかの異なる濃度で、固定化されたMODに適用し、装置の応答を記録する。代替的に、co-MOD(又はポリペプチド)を(例えば、IL-2受容体ヘテロ三量体、すなわち単量体サブユニット＋ヘテロ二量体のサブ複合体、又は完全なヘテロ三量体のために)バイオセンサーに固定化し、MODをいくつかの異なる濃度で、固定化されたco-MOD(複数可)に適用し、装置の応答を記録する。アッセイは、25mMのHEPES(pH6.8)、5％ポリ(エチレングリコール)6000、50mMのKCl、0.1％ウシ血清アルブミン、及び0.02％Tween20非イオン性界面活性剤を含む液体培地で行われる。固定化されたMODへのco-MODの結合は、30℃で実施する。BLIは、(i)固定化されたポリペプチド(「標的」)、及び(ii)内部基準層、の2つの表面から反射される白色光の干渉パターンを分析する。バイオセンサー先端に結合した分子(「分析物」；例えば、co-MOD)の数の変化は干渉パターンのシフトを引き起こし、干渉パターンにおけるこのシフトを、リアルタイムで測定することができる。標的/分析物相互作用の親和性を説明する動態関連の2つの値は、会合定数(ka)及び解離定数(kd)である。これらの2つの値の比(kd/a)は、親和性定数KDを与える。野生型MOD(例えば、IL-2)のそのco-MOD(例えばその同種結合パートナー又は受容体、IL-2の場合には、IL-2R)に対する結合親和性、及び、変異型MOD(例えば、本明細書に開示されるようなIL-2変異型)のそのco-MOD(例えば、IL-2変異型の場合には、IL-2R)に対する結合親和性、の両方を測定することにより、野生型co-MODと比較した変異型co-MODの、co-MODに対する相対結合親和性を測定することができる。すなわち、変異型MODのそのco-MODに対する結合親和性が、同じ同種co-MODに対する野生型MODの結合親和性と比較して低下するかどうかを判定することができ、そうである場合、野生型co-MODの結合親和性からの低下パーセンテージはどの程度かを判定することができる。
BLIアッセイは、マルチウェルプレートで実行される。アッセイを実行するには、プレートレイアウトを画定し、アッセイステップを定義し、バイオセンサーをOctet Data Acquisitionソフトウェアにおいて割り当てる。バイオセンサアセンブリは水和される。水和されたバイオセンサアセンブリ及びアッセイプレートは、Octet装置上で10分間平衡化される。データが取得されると、取得されたデータがOctet Data Analysisソフトウェアにロードされる。データは、参照(reference)減算、y軸アラインメント、ステップ間補正、及びSavitzky-Golayフィルタリングの方法を指定して、処理ウィンドウで処理される。データは、分析ウィンドウにおいて、(会合及び解離の)分析ステップの特定、並びに曲線適合モデル(1：1)、適合法(グローバル)、及び目的ウィンドウ(秒単位)の選択により、分析される。適合の品質を評価する。各データトレース(分析物濃度)のKD値は、3倍の範囲内であれば平均化することができる。KD誤差値は、親和性定数値の1桁以内でなければならない。R2値は0.95を超えなければならない。例えば、Abdicheらの文献、(2008)J.Anal.Biochem.377：209を参照されたい。
幾つかの例では、(i)同種co-MODに対する、対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体には野生型MODが含まれる)の結合親和性、対、(ii)同種co-MODに対する、野生型MODの変異型を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の結合親和性、の比は、(上述のように)BLIによって測定したとき、少なくとも1.5：1、少なくとも2：1、少なくとも5：1、少なくとも10：1、少なくとも15：1、少なくとも20：1、少なくとも25：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも500：1、少なくとも102：1、少なくとも5×102：1、少なくとも103：1、少なくとも5×103：1、少なくとも104：1、少なくとも105：1、又は少なくとも106：1である。幾つかの例では、(i)同種co-MODに対する、対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体には野生型MODが含まれる)の結合親和性、対、(ii)同種co-MODに対する、野生型MODの変異型を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の結合親和性、の比は、BLIによって測定したとき、1.5：1～106：1、例えば、1.5：1～10：1、10：1～50：1、50：1～102：1、102：1～103：1、103：1～104：1、104：1～105：1、又は105：1～106：1の範囲にある。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、同種co-MODに対して、1nM～100nM又は100nM～100μMの結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、同種co-MODに対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、同種co-MODに対して、約1nM～約5nM、約5nM～約10nM、約10nM～約50nM、約50nM～約100nMの結合親和性を有する。
4.PD-L1及びその変異型
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するMOD又は変異型MODは、PD-L1又は変異型PD-L1ポリペプチドである。野生型PD-L1はPD1に結合する。
野生型ヒトPD-L1ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を含み得る：
Figure 2023500066000002
 配列中、aas1～18はシグナル配列を形成し、aas19～127はIg様V型又はIgVドメインを形成し、133～225はIg様C2型ドメインを形成する。
野生型ヒトPD-L1エクトドメインは、下記のアミノ酸配列を含み得る：
Figure 2023500066000003
 配列中、aas1～109はIg様V型又は「IgV」ドメインを形成し、aas115～207はIg様C2型ドメインを形成する。
MODとしての使用に好適な野生型PD-L1 IgVドメインは、配列番号1のaa18、aas IgV aas19～127、及びカルボキシル末端安定化配列、例えば、配列番号138
Figure 2023500066000004
 の最後の7つのアミノ酸(太字及び斜体)を含み得る。
カルボキシル安定化配列が、約aa122でヒスチジン(例えば、配列番号138のaa117として示される、Tyr(Y)のC末端側への約5残基のヒスチジン)を含む場合、ヒスチジンは、aas82及び83で骨格アミドと安定的な静電結合を形成し得る(配列番号138(配列番号1のQ107及びL106)で太字及び斜体で示す)。代替として、aas82又は83)(配列番号1のQ107及びL106)のうちの1つ、及び、aa残基121、122、又は123(配列番号1のaa位置139～141に相当する)のうちの1つを、置換することによって、安定的なジスルフィド結合を形成させ得る。
野生型PD-1ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を含み得る：
Figure 2023500066000005
 。
幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチド(例えば、配列番号2又はPD-1のIgVドメインの変異型)は、配列番号1又は配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD-L1ポリペプチドの結合親和性と比較して、PD-1(例えば、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むPD-1ポリペプチド)に対する低い結合親和性を示す。例えば、幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD-L1ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、PD-1(例えば、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むPD-1ポリペプチド)に結合する。
幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチド(例えば、配列番号2又はそのIgVドメインの変異型)は、PD-1(例えば、配列番号3の変異型)に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。別の例として、幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチド(例えば、配列番号2の変異型)は、PD1(例えば、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むPD1ポリペプチド)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
MODとして使用されるPD-L1エクトドメイン配列に対して、配列番号1、配列番号2、配列番号1のaas19～127(IgVドメイン)、及び配列番号138のうちのいずれか1つの少なくとも85個の連続するaas(例えば、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、又は少なくとも105個の連続するaas)と90％超(95％、98％、又は99％超)の配列同一性を有する配列への置換を含む、多くのaa置換を行い得る。該置換としては、(a)ジスルフィド結合のための置換ペアであるD103C及びG33C、もしくはV104及びS34C、(b)塩橋形成のための置換ペアであるQ107D及びK62R、もしくはQ107D及びS80R、並びに/又は(c)Piスタッキングのための置換であるM36YもしくはM36F(配列番号1に基づく)が挙げられる。PD-L1 MOD配列は、配列番号2の少なくとも85個の連続するaas(例えば、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、又は少なくとも105個の連続するaas)を有する配列、及び少なくとも1つのジスルフィド、塩橋、又はPiスタッキング置換を含み得る。PD-L1 MOD配列は、配列番号1のaas19～127(IgVドメイン)の少なくとも85個の連続するaas(例えば、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、又は少なくとも105個の連続するaas)を有する配列、及び少なくとも1つのジスルフィド、塩橋、又はPiスタッキング置換を含み得る。PD-L1 MOD配列は、aas配列番号138の少なくとも85個の連続するaas(例えば、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、又は少なくとも105個の連続するaas)を有する配列、及び少なくとも1つのジスルフィド、塩橋、又はPiスタッキング置換を含み得る。
幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、3つ又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、5つ又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、7つ又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型PD-L1ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はPD-L1のIgVドメインに示されるPD-L1アミノ酸配列と比較して、9つ又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型PD-L1ポリペプチド配列は、配列番号2の少なくとも170個の連続するaa(例えば、少なくとも180、190、又は200個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有する(例えば、少なくとも1つのaaの挿入、欠失、又は置換を有する)ポリペプチド配列を含む。好適な変異型PD-L1 IgVポリペプチド配列は、配列番号2のaas1～109のうちの少なくとも70個の連続するaa(例えば、少なくとも80、90、100、又は105個の連続するaas)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有する(例えば、少なくとも1つのaa挿入、欠失、又は置換を有する)ポリペプチド配列を含む。
ある例では、変異型PD-L1ポリペプチド配列は、配列番号2に対して少なくとも90％(例えば、少なくとも95％、98％、もしくは99％)、又は100％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、8位の残基は、D以外のaaであり、かかる一例では、該残基はAであり、別の例ではRである。変異型PD-L1ポリペプチド配列は、配列番号2に対して少なくとも90％(例えば、少なくとも95％、98％、もしくは99％)、又は100％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、36位の残基は、I以外のaaであり、かかる一例では、該残基はAであり、別の例ではDである。変異型PD-L1ポリペプチド配列はまた、配列番号2に対して少なくとも90％(例えば、少なくとも95％、98％、もしくは99％)、又は100％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、54位の残基は、E以外のaaであり、かかる一例では、該残基はAであり、別の例ではRである。
5.IL-1及びその変異体
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、IL-1又は変異型IL-1ポリペプチドである。
野生型IL-1は、IL-1α及びIL-1βの2つのアイソフォームを有し、両方ともIL-1受容体に結合する。
野生型ヒトIL-1α前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000006
 UniProtKB-P01583、NCBI参照配列NP_000566.3を含み得るが、天然に存在するバリエーションである下記R85Q、A114S、N125D、D138N、及びD176Hのうちの1つ以上を有することができる。
成熟型野生型ヒトIL-1αポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000007
 を含み得る。
野生型ヒトIL-1β前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000008
 UniProtKB - P0158, NCBI参照配列 NP_000567.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-1βポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000009
 を含み得る。
IL-1α及びIL-1βのいずれも、IL-1受容体に結合し、それは下記の配列：
Figure 2023500066000010
 NCBI参照配列NP_000868.1を有し得、成熟ポリペプチドを形成するaas21～569を有し、そのエクトドメインを使用して、IL-1α及びIL-1βに対する結合親和性を測定することができる。
幾つかの例では、変異型IL-1α及びIL-1βポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むIL-1ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むIL-1受容体又はそのエクトドメインに対する低い結合親和性を示す。例えば、幾つかの例では、変異型IL-1α及びIL-1βポリペプチドは、配列番号5もしくは配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むIL-1α及びIL-1βポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、配列番号8に示されるIL-1受容体に結合する。
幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βポリペプチド(例えば、配列番号5もしくは7の変異型)は、配列番号8に示される配列を有するIL-1受容体に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。
別の例として、幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βポリペプチド(例えば、配列番号5もしくは7の変異型)は、配列番号8に示される配列を有するIL-1受容体に対して、約100nM～約200nM、約200nM～～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号2に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-1α又はIL-1βのポリペプチドは、配列番号5又は配列番号7に示されるIL-1α又はIL-1βのアミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-1α又はIL-1βポリペプチド配列は、配列番号5又は配列番号7に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも100個の連続するaaに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaaの置換、欠失、もしくは挿入を有する)を含む。
6.IL-2及びその変異型
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、IL-2又は変異型IL-2ポリペプチドである。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する変異型MODは、変異型IL-2ポリペプチドである。野生型IL-2は、IL-2受容体(IL-2R)に結合する。野生型IL-2アミノ酸配列は、下記のとおりである：
Figure 2023500066000011
 (UniProtP60568のaa21～153、配列番号9)。
野生型IL-2は、細胞の表面上のIL-2受容体(IL-2R)に結合する。IL-2受容体は、幾つかの例では、α鎖(IL-2Rα；CD25とも称される)、β鎖(IL-2Rβ；CD122とも称される)、及びγ鎖(IL-2Rγ；CD132とも称される)を含むヘテロ三量体ポリペプチドである。ヒトIL-2Rα、IL-2Rβ、及びIL-2Rγのアミノ酸配列は、下記のとおりであり得る。
ヒトIL-2Rα：
Figure 2023500066000012
 。
ヒトIL-2Rβ：
Figure 2023500066000013
 。
ヒトIL-2Rγ：
Figure 2023500066000014
 。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が変異型IL-2ポリペプチドを含む場合、同種co-MODは、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むIL-2Rである。
幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むIL-2ポリペプチドの結合親和性と比較して、IL-2Rに対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、同じ条件下でアッセイした場合、IL-2R(例えば、配列番号10～12に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むIL-2R)に対する配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むIL-2ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、IL-2Rに結合する。
幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチド(例えば、配列番号9の変異型)は、IL-2R(例えば、配列番号10～12の)に対して100nM～100μMの結合親和性を有する。別の例として、幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチド(例えば、配列番号9の変異型)は、IL-2R(例えば、配列番号10～12に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むIL-2R)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、3個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、5個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、7個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、9個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-2ポリペプチドは、配列番号9に示されるIL-2アミノ酸配列と比較して、10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-2ポリペプチド配列としては、配列番号9の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するaa配列を含むポリペプチド配列が挙げられる。加えて、IL-2変異型は、下記の変異型IL-2aa配列(配列番号13～27を参照のこと)のうちのいずれか1つの少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するaa配列を含むポリペプチドを含む。
Figure 2023500066000015
 配列中、Xは、Glu以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAlaである。
Figure 2023500066000016
 配列中、Xは、Asp以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAlaである。
Figure 2023500066000017
 配列中、X(H16)は、His以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAla(H16A)である。幾つかの例では、XはArgである。幾つかの例では、XはAsnである。幾つかの例では、XはAspである。幾つかの例では、XはCysである。幾つかの例では、XはGluである。幾つかの例では、XはGlnである。幾つかの例では、XはGlyである。幾つかの例では、XはIleである。幾つかの例では、XはLysである。幾つかの例では、XはLeuである。幾つかの例では、XはMetである。幾つかの例では、XはPheである。幾つかの例では、XはProである。幾つかの例では、XはSerである。幾つかの例では、XはThr(H16T)である。幾つかの例では、XはTyrである。幾つかの例では、XはTrpである。
幾つかの例では、XはValである。
Figure 2023500066000018
 配列中、X(F42)は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAla(F42A)である。幾つかの例では、XはThr(F42T)である。
Figure 2023500066000019
 配列中、Xは、Tyr以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAlaであり
Figure 2023500066000020
 配列中、X(N88)は、Asn以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAlaであり、幾つかの例では、XはArgである。
Figure 2023500066000021
 配列中、Xは、Gln以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、XはAlaである。
Figure 2023500066000022
 配列中、X1(H16)は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2(F42)は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaであり、X2はAlaである(H16A、F42A)。幾つかの例では、X1はThrであり、X2はAlaである(H16T、F42A)。幾つかの例では、X1がAlaであり、X2がThrである(H16A、F42T)。幾つかの例では、X1はThrであり、X2はThrである(H16T、F42T)。
Figure 2023500066000023
 N88R置換を含み、配列中、X1(H16)は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2(F42)は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaであり、X2はAlaである。幾つかの例では、X1はThrであり、X2はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaであり、X2はThrである。幾つかの例では、X1はThrであり、X2はThrである。
Figure 2023500066000024
 配列中、X1は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaであり、X2はAlaである。
Figure 2023500066000025
 配列中、X1は、Glu以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaである、X2はAlaである、X3はAlaである、のうちのいずれか2つ、又は3つ全てである。
Figure 2023500066000026
 配列中、X1は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Phe以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X1がAlaであり、X2がAlaであり、X3がAlaである。
Figure 2023500066000027
 配列中、X1は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Gln以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X1がAlaであり、X2がAlaであり、X3がAlaである。
Figure 2023500066000028
 配列中、X1は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Tyr以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X1がAlaであり、X2がAlaであり、X3がAlaである。
Figure 2023500066000029
 配列中、X1は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X4は、Tyr以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X4はAlaである。幾つかの例では、X1がAlaであり、X2がAlaであり、X3がAlaであり、X4がAlaである。
Figure 2023500066000030
 配列中、X1は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Tyr以外の任意のアミノ酸であり、X4は、Gln以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X4はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaであり、X2はAlaであり、X3はAlaであり、X4はAlaである。
Figure 2023500066000031
 配列中、X1は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Asp以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X4は、Tyr以外の任意のアミノ酸であり、X5は、Gln以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X4はAlaである。幾つかの例では、X5はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaである、X2はAlaである、X3はAlaである、X4はAlaである、X5はAlaである、のうちのいずれか2つ、3つ、4つ、又は5つ全てである。
Figure 2023500066000032
 配列中、X1は、His以外の任意のアミノ酸であり、X2は、Phe以外の任意のアミノ酸であり、X3は、Gln以外の任意のアミノ酸である。幾つかの例では、X1はAlaである。幾つかの例では、X2はAlaである。幾つかの例では、X3はAlaである。幾つかの例では、X1はAlaである、X2はAlaである、X3はAlaである、のうちのいずれか2つ又は3つ全てである。
7.IL-4及びその変異体
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、IL-4又は変異型IL-4ポリペプチドである。野生型IL-4は、2つのアイソフォーム、IL-4α及びIL-4βを有し、いずれも膜結合型IL-4受容体(アイソフォーム1)又はその可溶性対応物(アイソフォーム2)に結合する。
野生型ヒトIL-4アイソフォーム1前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000033
 NCBI参照配列NP_000580.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-4アイソフォーム1ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000034
 を含み得る。
野生型ヒトIL-4アイソフォーム2前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000035
 NCBI参照配列 NP_758858.1(配列番号30)を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-4アイソフォーム2ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000036
 を含み得る。
IL-4アイソフォーム1及びアイソフォーム2のいずれも、膜結合型IL-4受容体(IL-4R)及び/又はその可溶性アイソフォーム2に結合する。膜結合型IL-4は、下記の配列：
Figure 2023500066000037
 NCBI参照配列NP_000409.1を有し得、aas26～825が成熟ポリペプチドを形成し、aas233～256が膜貫通領域を形成し、タンパク質のエクトドメインを使用して、IL-4アイソフォーム1又は2への結合親和性を測定することができる。
下記配列
Figure 2023500066000038
 UniProtKB-P24394、を有する可溶性アイソフォーム2もまた、両IL-4アイソフォームの結合親和性を測定するために使用することができる。
幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチド(例えば、配列番号29もしくは31の、変異型)は、配列番号32又はそのエクトドメインに示される成熟IL-4受容体配列、又は配列番号33に示される可溶性IL-4受容体に対して、配列番号29又は配列番号31に示されるアミノ酸配列を含むIL-4ポリペプチドの結合親和性と比較して、低い結合親和性を呈する。
例えば、幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号32(もしくはそのエクトドメイン)又は配列番号33に示される成熟IL-4受容体に対し、配列番号29又は配列番号31に示されるアミノ酸配列を含むIL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で結合する。
幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチド(例えば、配列番号29もしくは31の、変異型)は、配列番号32(もしくはそのエクストドメイン)又は配列番号33に示される成熟IL-4受容体に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μMもしくは100μM～1mM)の結合親和性を有する。他の例として、幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチド(例えば、配列番号29もしくは31の、変異型)は、配列番号32(もしくはそのエクストドメイン)又は配列番号33に示される成熟IL-4受容体に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチドは、配列番号29又は配列番号31に示されるIL-4アイソフォーム1又は2アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-4アイソフォーム1又は2ポリペプチド配列は、配列番号29又は配列番号31の少なくとも80個の連続するaa(例えば、少なくとも100、又は110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)を含む。
8.IL-6及びその変異型
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、IL-6又は変異型IL-6ポリペプチドである。野生型IL-6は、α及びβ(gp130)サブユニットから構成されるIL-6受容体に結合し、これは、IL-6分子及び各サブユニットを有する2つの三量体のシグナル伝達六量体を形成する。例えば、Lacroixらの文献、J.Biol.Chem.290(45)26943-953(2015)を参照されたい。
野生型ヒトIL-6ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000039
 NCBI参照配列NP_000591.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-6ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000040
 を含み得る。
IL-6は、α及びβサブユニットから構成される膜結合型IL-6受容体に結合する。ヒトIL-6Rαサブユニットは、配列：
Figure 2023500066000041
 NCBI参照配列 NP_000556.1を含み得、aas26～825が成熟ポリペプチドを形成し、aas233～256が膜貫通領域を形成する。IL-6に結合した後、IL6αサブユニットはIL-6βサブユニットに結合する。
ヒトIL-6Rβサブユニットは、下記の配列：
Figure 2023500066000042
 UniProtKB-P40189を有し得、aas23～918が成熟ポリペプチドを形成し、aas620～641が膜貫通領域を形成する。
膜結合型IL-6RαサブユニットへのIL-6の結合の代替として、それは、配列：
Figure 2023500066000043
 を有する、可溶性形態の成熟型IL-6Rαサブユニットに結合することができ、該成熟ペプチドはaas20～468、UniProtKB - P08887.1を含む。可溶性サブユニットは、膜結合型IL-6Rαサブユニットの代わりとなることができ、結合親和性アッセイで使用することができる。
幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチド(例えば、配列番号35の変異型)は、配列番号35に示されるアミノ酸配列を含むIL-6ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号36及び37、又は配列番号37及び38に示される成熟IL-6受容体に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるアミノ酸配列を含むIL-6ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、配列番号36及び37、又は配列番号37及び38に示される成熟IL-6受容体に結合する。
幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチド(例えば、配列番号35の変異型)は、配列番号36及び37、又は配列番号37及び38に示される成熟IL-6受容体に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、もしくは100μM～1mM)の結合親和性を有する。別の例として、幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチド(例えば、配列番号35の変異型)は、配列番号36及び37、又は配列番号37及び38に示される成熟IL-6受容体に対して、100nM～100μM(例えば、100nM～1μM、1μM～10μM、もしくは10μM～100μM)の親和性を有する。別の例として、幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチド(例えば、配列番号35の変異型)は、配列番号36及び37又は配列番号37及び38に示される成熟IL-6受容体に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-6ポリペプチドは、配列番号35に示されるIL-6アミノ酸配列と比較して、9個又は8個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-6ポリペプチド配列は、配列番号35の少なくとも80個の連続するaa(例えば、少なくとも100、もしくは110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)を含む。
9.IL-7及びその変異型
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、IL-7又は変異型IL-7ポリペプチドである。野生型IL-7は、4つのアイソフォームを有し、これらは全て、2つのサブユニット、α(α)及び共通γ(共通γ)鎖を有する膜結合型IL-7受容体に結合する。
野生型ヒトIL-7アイソフォーム1前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000044
 UniProtKB-P13232、NCBI参照配列NP_000871.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-7アイソフォーム1ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000045
 を含み得る。
野生型ヒトIL-7アイソフォーム2前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000046
 NCBI参照配列NP_001186815.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-7アイソフォーム2ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000047
 を含み得る。
野生型ヒトIL-7アイソフォーム3前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000048
 NCBI参照配列：NP_001186816.1を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-7アイソフォーム3ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000049
 を含み得る。
野生型ヒトIL-7アイソフォーム4前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000050
 NCBI参照配列 NP_001186817.1(配列番号45)を含み得る。
成熟型の野生型ヒトIL-7アイソフォーム4ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000051
 を含み得る。
IL-7受容体αサブユニットは、下記の配列：
Figure 2023500066000052
 NCBI参照配列NP_002176.2を含み得、aas21～459が成熟ポリペプチドを形成し、aas240～264が膜貫通領域を形成する。タンパク質の受容体サブユニット(例えば、エクトドメイン(aas21～239))の全て又は一部を使用して、IL-7受容体γサブユニットと共にIL-7アイソフォームへの結合親和性を測定することができる。
共通のγサブユニット(IL-7RG又はIL-R7γ)は、下記の配列：
Figure 2023500066000053
 NCBI参照配列NP_000197.1(配列番号48)を有し得、aas23～369が成熟ポリペプチドを形成し、aas263～283が膜貫通領域を形成する。タンパク質の受容体サブユニット(例えば、エクトドメイン(aas23～262))の全部又は一部を使用して、αサブユニットと共にIL-7への結合親和性を測定することができる。
幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4のポリペプチド(例えば、配列番号40、42、44、もしくは46のポリペプチド)は、配列番号40、42、44、又は46に示されるアミノ酸配列を含むIL-7ポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型IL-7受容体配列(例えば、配列番号47及び48に示されるポリペプチドの全てもしくは一部を含むIL-7受容体、例えば、それらのエクトドメイン)に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるアミノ酸配列を含むIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、配列番号47及び48に示されるポリペプチドの全て又は一部を含むIL-7受容体に結合する。
幾つかの例では、IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4のポリペプチドの変異型(例えば、配列番号40、42、44、もしくは46の変異型)は、配列番号47及び48に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-7受容体に対して、1nM～1mMの結合親和性を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4のポリペプチド(例えば、配列番号40、42、44、もしくは46の変異型)は、配列番号47及び48に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメイン、を含む成熟IL-7受容体に対して、100nM～100μM(例えば、100nM～1μM、1μM～10μM、もしくは10μM～100μM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4のポリペプチドは、配列番号47及び48に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインに対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4ポリペプチドは、配列番号40、42、44、又は46に示されるIL-7アイソフォーム1、2、3、又は4アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-7アイソフォーム1、2、3、又は4のポリペプチド配列は、配列番号40、42、44、又は46の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、もしくは少なくとも110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有する)を含む。
10.IL-10及びその変異体
1つの非限定的な例として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するMOD又は変異型MODは、例えば、Josephsonらの文献、J.Biol.Chem.275：13552-13557(2000)に記載されたDヘリックスとEヘリックスとの間のヒンジ領域内の挿入を有する単量体IL-10変異型などの、IL-10又は変異型IL-10ポリペプチドである。野生型IL-10はアイソフォームを有し、これらは全て、アルファ(α)IL-10RA及びベータ(β)IL-10RBサブユニットの両方を有する膜結合型IL-10受容体に結合する。この受容体は、細胞(例えば、B細胞、T細胞、NK細胞、肥満細胞、及び樹状細胞)の表面上に四量体として存在する。
野生型ヒトIL-10アイソフォーム1前駆体ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000054
 UniProtKB-P22301、NCBI参照配列NP_000563.1を含み得、H227Lの配列変異を有し得る。
成熟型の野生型ヒトIL-10ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000055
 を含み得る。
ヒトIL-10ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Figure 2023500066000056
 を含み得る。
IL-10ポリペプチドは、IL-10ポリペプチドのD及びEヘリックス間のヒンジ領域内の挿入(例えば、配列番号51のE48、N49、K50、又はS51のいずれかに隣接する位置、又は配列番号49又は50内の相当する位置における、5～7aaの挿入)を含むことができ、それにより単量体形態となる。単量体IL-10ポリペプチドは、配列番号51のN49とK50との間(又は配列番号49もしくは50内の相当する位置)に5～7aaの挿入を含むことができる。例では、5～7個のアミノ酸は、Ala、Gly、及び/又はSerを含む。例では、5～7個のアミノ酸は、Ala又はSerから選択される。例では、5～7個のaasは、Gly及びSerから選択される。一例では、挿入は、配列番号51のN49とK50の間(又は配列番号49又は50の相当する位置)のIL-10M1aaの挿入
Figure 2023500066000057
 を含む。一例では、IL-10変異型は、配列番号51のaa49と50との間に
Figure 2023500066000058
 が挿入されたIL-10M1(配列番号189)からなる。例えば、Josephsonらの文献、J.Biol.Chem.275：13552-13557(2000)を参照されたい。
IL-10受容体αサブユニットは、下記の配列：
Figure 2023500066000059
 NCBI参照配列NP_001549.2を有し得、aas21～587が成熟ポリペプチドを形成し、aas236～256が膜貫通領域を形成する。タンパク質の受容体サブユニットの全部又は一部(例えば、エクトドメイン(aas21～235))を使用して、IL-10受容体βサブユニットと共にIL-10アイソフォームへの結合親和性を測定することができる。
IL-10受容体βサブユニットは、下記の配列：
Figure 2023500066000060
 NCBI参照配列NP_000619.3(配列番号53)を有し得、aas20～325が成熟ポリペプチドを形成し、aas221～242が膜貫通領域を形成する。タンパク質の受容体サブユニットの全部又は一部(例えば、エクトドメイン(aas20～220))を使用して、αサブユニットと共にIL-10への結合親和性を測定することができる。
幾つかの例では、変異型IL-10アイソフォームポリペプチド(例えば、配列番号50、51の変異型、又は上述のDヘリックスとEヘリックスとの間のヒンジへの5～7aa挿入を有するそれらの配列の単量体IL-10変異型)は、配列番号50又は51に示されるアミノ酸配列を含むIL-10ポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型IL-10受容体配列(配列番号52又は53に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインなど、を含むIL-10受容体)に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、IL-10ポリペプチドの変異型(例えば、配列番号50もしくは51の変異型)は、配列番号52又は53に示されるポリペプチドの全部又は一部(例えば、それらのエクトドメイン)を含むIL-10受容体に対して、配列番号52又は53に示されるポリペプチドの全部又は一部(例えば、それらのエクトドメインなど)に対するIL-10アイソフォーム(例えば、配列番号50もしくは51の)の結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で結合する。
幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチド(例えば、D及びEヘリックス間のヒンジ領域内への上述の挿入のうちの1つを含み得る、配列番号50又は51の変異型)は、IL-10受容体(配列番号52及び53に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインなど、を含む)に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチド(例えば、配列番号50又は51の変異型)は、成熟型IL-10受容体(例えば、配列番号52及び53に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメイン、を含む)に対して、100nM～100μM(例えば、100nM～1μM、1μM～10μM、又は10μM～100μM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチド(例えば、配列番号50又は51の変異型)は、成熟型IL-10受容体(例えば、配列番号52及び53に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメイン、を含む)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-10ポリペプチドは、配列番号50又は51に示されるIL-10ポリペプチド配列と比較して、1～10個のaa置換を有し、D及びEのヘリックスの間のヒンジ領域に5～7個のaa置換(例えば、配列番号50のK49及びN50)を含む。
好適な変異型IL-10ポリペプチド配列は、配列番号50又は51の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は少なくとも160個)の連続するaaに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有する)を含む。
11.IL-15及びその変異型
幾つかの例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するMODは、IL-15ポリペプチドである。異なる前駆体タンパク質を生じさせる選択的スプライシングによって形成される2つのアイソフォームを含むIL-15ポリペプチドの配列は、当該技術分野において既知である。
一実施態様では、wt.IL-15ポリペプチドは下記の配列：
Figure 2023500066000061
 UniProtKB-P40933、NCBI参照NP_000576.1を有し得、IL-15プレタンパク質ではaa1～29がシグナルペプチドであり、30～48がプロペプチドである。
本開示の目的である、アイソフォーム1として示される成熟型IL-15ポリペプチドは、下記の形態：
Figure 2023500066000062
 を有することができる。
IL-15は、IL-2と構造的に類似しており、IL-2受容体と同じβ鎖及びγ鎖を有するが、別個のIL-15受容体α(IL-15Rα)サブユニットを有する細胞表面三量体受容体を介してシグナルを伝達する。ヒトIL-15Rαアイソフォーム1前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、
Figure 2023500066000063
 NCBI参照NP_002180、とすることができ、aas1～30がシグナル配列を形成し、aasペプチド31～267が成熟ポリペプチドである。IL-2Rβ及びIL-2Rγの配列を、配列番号11及び12として示す。
幾つかの例では、変異型IL-15アイソフォーム1ポリペプチド(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型IL-15受容体配列(例えば、配列番号11、12、及び56に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-15受容体)に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、IL-15ポリペプチドの変異型(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号55に示されるアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、配列番号11、12、及び56に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-15受容体に結合する。
幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチド(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号11、12、及び56に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-15受容体に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチド(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号11、12、及び56に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む成熟型IL-15受容体に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチド(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号55に示されるIL-15ポリペプチド配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチド(例えば、配列番号55の変異型)は、配列番号55に示されるIL-15ポリペプチド配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチドは、配列番号55に示されるIL-15アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチドは、配列番号55に示されるIL-15アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチドは、配列番号55に示されるIL-15アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチドは、配列番号55に示されるIL-15アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-15ポリペプチドは、配列番号55に示されるIL-15アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-15ポリペプチド配列は、配列番号55の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有し、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有するポリペプチド配列を含む。
12.IL-21及びその変異体
幾つかの例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するMODは、IL-21ポリペプチドである。異なる前駆体タンパク質を生じさせる選択的スプライシングによって形成される2つのアイソフォームを含むIL-21ポリペプチドの配列は、当該技術分野において既知である。
一実施態様では、野生型(wt.)IL-21アイソフォーム1ポリペプチドは、下記の配列：
Figure 2023500066000064
 UniProtKB - Q9HBE4,NCBI参照NP_068575.1を有し、IL-21タンパク質のaa1～29がシグナルペプチドである。
成熟型IL-21アイソフォーム1ポリペプチドは、下記のaa配列：
Figure 2023500066000065
 を有し得る。
一実施態様では、野生型(wt.)IL-21アイソフォーム2ポリペプチドは、下記の配列：
Figure 2023500066000066
 NP_001193935.1を有し、IL-21タンパク質のaa1～29がシグナルペプチドである。
成熟型IL-21アイソフォーム2ポリペプチドは、下記のaa配列：
Figure 2023500066000067
 を有し得る。
IL-21は、IL-2受容体と同じγ鎖を有するが、異なるIL-21R受容体サブユニットを有する二量体細胞表面受容体を介してシグナル伝達する。ヒトIL-21Rアイソフォーム1前駆体タンパク質のaa配列は、下記：
Figure 2023500066000068
 NCBI参照配列NP_068570.1であり得、aas1～19がシグナル配列を形成し、aas20～538が成熟ポリペプチドであり、aas233～253が膜貫通ドメインであり、aas20～232がエクトドメインである。
幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるアミノ酸配列を含むwt.IL-21ポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型IL-21受容体配列(例えば、配列番号12及び61に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-21受容体)に対する低い結合親和性を示す。例えば、幾つかの例では、配列番号58又は60を含むIL-21ポリペプチドの変異型は、配列番号58又は60に示されるアミノ酸配列を含むwt.IL-21ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、配列番号12及び61に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-21受容体に結合する。
幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチド(例えば、配列番号58又は60の変異型)は、IL-21受容体(例えば、配列番号12及び61に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)に対して1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチド(例えば、配列番号58又は60の変異型)は、成熟型IL-21受容体の全て又は一部(例えば、配列番号12及び61に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)に対して、100nM～100μM(例えば、100nM～1μM、1μM～10μM、又は10μM～100μM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチド(例えば、配列番号58又は60の変異型)は、IL-21受容体の全て又は一部(例えば、配列番号12及び61に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチド(例えば、配列番号58又は60の変異型)は、配列番号58又は60に示されるIL-21ポリペプチド配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチド(例えば、配列番号58又は60の変異型)は、配列番号58又は60に示されるIL-21ポリペプチド配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるIL-21アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるIL-21アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるIL-21アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるIL-21アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-21ポリペプチドは、配列番号58又は60に示されるIL-21アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適なIL-21ポリペプチド配列は、配列番号58又は60の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有し、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有するポリペプチド配列を含む。
13.IL-23及びその変異体
幾つかの例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するMODは、IL-23ポリペプチドである。IL-23は、IL-23A(IL-23p19)サブユニット及びIL-12B(IL-12p40)サブユニット(IL-12と共有される)から構成されるヘテロ二量体サイトカインである。
一実施態様では、野生型(wt.)IL-23Aポリペプチドは、下記の配列：
Figure 2023500066000069
 NCBI参照配列NP_057668.1を有し、タンパク質のaa1～19がシグナルペプチドであり、20～189が成熟ペプチドである。
成熟型IL-23Aポリペプチドは、下記のaa配列：
Figure 2023500066000070
 を有し得る。
一実施態様では、野生型(wt)IL-12Bポリペプチドは、下記の配列：
Figure 2023500066000071
 Unprot-PKKB-29460を有し、タンパク質のaa1～22がシグナルペプチドであり、23～328が成熟ペプチドである。
成熟型IL-12Bポリペプチドは、下記のaa配列：
Figure 2023500066000072
 を有し得る。
IL-23は、IL-23受容体ポリペプチド(IL-23R)と、IL-12受容体と共通のサブユニット(12RB1又は12Rβ1と示される)と、から構成される二量体細胞表面受容体を介してシグナルを伝達する。
IL-23Rアイソフォーム1前駆体タンパク質配列は、下記：
Figure 2023500066000073
 NCBI参照配列NP_653302.2であり得、aas1～23がシグナル配列を形成し、aas24～629が成熟ポリペプチドであり、aas356～376が膜貫通ドメインであり、aas24～355がエクトドメインである。
12RB1アイソフォーム1前駆体タンパク質aa配列は：
Figure 2023500066000074
 (配列番号67)NCBI参照配列NP_005526.1であり得、aas1～23がシグナル配列を形成し、aas24～662が成熟ポリペプチドであり、aas546～570が膜貫通ドメインであり、aas24～545がエクトドメインである。
幾つかの例では、変異型IL-23(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)ポリペプチドは、配列番号63又は65に示されるアミノ酸配列を含むIL-23ポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型IL-23受容体配列(例えば、配列番号66及び67に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含むIL-23受容体)に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、IL-23ポリペプチドの変異型(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)は、配列番号63又は65に示されるアミノ酸配列を含むIL-23ポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、(例えば、配列番号66及び67に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)IL-23受容体に結合する。
幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチド(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)は、IL-23受容体(例えば、配列番号66及び67に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM、又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチド(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)は、成熟型IL-23受容体(例えば、配列番号66及び67に示されるポリペプチドの全て又は一部、例えば、それらのエクトドメインを含む)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチド(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)は、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23ポリペプチド配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチド(例えば、配列番号63及び/又は65の変異型を含む)は、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23ポリペプチド配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチドは、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23アミノ酸配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチドは、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23アミノ酸配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチドは、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23アミノ酸配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチドは、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23アミノ酸配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型IL-23ポリペプチドは、配列番号63及び/又は65に示されるIL-23アミノ酸配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型IL-23ポリペプチド配列は、配列番号63及び/又は65の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも140、少なくとも160、少なくとも180、少なくとも200、少なくとも220、少なくとも240、少なくとも260、少なくとも280、少なくとも300、少なくとも320、又は少なくとも340個の連続するaas)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有し、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有するポリペプチド配列を含む。
14.Fasリガンド(FasL)及びその変異型
幾つかの例では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するMODは、Fasリガンド(FasL)である。FasLは、腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーにおけるホモマー型II型膜貫通タンパク質である。FasLは、標的細胞内のFas受容体の三量体化によってシグナルを伝達し、これは、標的細胞のアポトーシスをもたらす細胞死誘導複合体を形成する。可溶性FasLは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-7(MMP-7)による、膜結合FasLの保存部位における切断から生じる。
一実施態様では、wt.ホモサピエンスFasLタンパク質は、下記の配列：
Figure 2023500066000075
 (配列番号143)、NCBI参照配列NP_000630.1、UniProtKB-P48023、を有し、配列中、残基1～80は細胞質内に存在し、81～102は膜貫通ドメインであり、aas103～281は細胞外に存在する(エクトドメインである)。
好適なFasLポリペプチドは、FasL：
Figure 2023500066000076
 のエクトドメインの全部又は一部を含む。
Fas受容体は、下記の配列：
Figure 2023500066000077
 (配列番号145)、NCBI参照配列 NP_000034.1、UniProtKB-P25445を有し得、配列中、aas26～173がエクトドメイン(細胞外ドメイン)を形成し、aas174～190が膜貫通ドメインを形成し、191～335が細胞質ドメインを形成する。エクトドメインを使用して、FasLとの結合親和性を測定し得る。
幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、配列番号144に示されるアミノ酸配列を含むFasLポリペプチドの結合親和性と比較して、成熟型Fas受容体配列(配列番号145に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、そのエクトドメインなど、を含むFasL受容体)に対して低い結合親和性を呈する。例えば、幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、配列番号144に示されるアミノ酸配列を含むFasLポリペプチドの結合親和性よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも95％低い、又は95％を超えて低い結合親和性で、Fas受容体(配列番号145に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、そのエクトドメインなど、を含む)に結合する。
幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、Fas受容体(配列番号145に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、そのエクトドメインなど、を含む)に対して、1nM～1mM(例えば、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、1μM～10μM、10μM～100μM又は100μM～1mM)の結合親和性を有する。例えば、幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、Fas受容体(配列番号145に示されるポリペプチドの全部又は一部、例えば、そのエクトドメインなど、を含む)に対して、約100nM～約200nM、約200nM～約300nM、約300nM～約400nM、約400nM～約500nM、約500nM～約600nM、約600nM～約700nM、約700nM～約800nM、約800nM～約900nM、約900nM～約1μM、約1μM～約5μM、約5μM～約10μM、約10μM～約20μM、約20μM～約30μM、約30μM～約50μM、約50μM～約75μM、又は約75μM～約100μMの結合親和性を有する。
幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、1個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチド(例えば、配列番号144の変異型を含む)は、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、2～10個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチドは、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、2個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチドは、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、3個又は4個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチドは、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、5個又は6個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチドは、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、7個又は8個のaa置換を有する。幾つかの例では、変異型FasLポリペプチドは、配列番号144に示されるFasLポリペプチド配列と比較して、9個又は10個のaa置換を有する。
好適な変異型FasLポリペプチド配列は、配列番号144の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも140、少なくとも160、又は少なくとも180個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有する)を含む。
E.足場
足場ポリペプチドは、とりわけ、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の他の構成要素が組織化されるフレームワークを提供する構造的エレメントとして機能する(例えば、図1、IgFc足場を有する構造Aを参照)。TGF-βポリペプチドをマスキングするポリペプチド配列とTGF-βポリペプチドとが、トランス(複合体の異なるポリペプチド上)に位置する場合、相互特異的及び相互特異的でないものでデュプレックス(又は、高次構造)を形成する足場配列は、複合体が開放形態であって、TGF-βポリペプチド配列が(マスキング配列と直接接触していない)他の分子と相互作用することができる期間であっても、マスキングポリペプチド配列をTGF-βポリペプチドと会合する状態を維持することができる。足場は、その性質に応じて、タンパク質のフォールディング及び二量体化又は多量体化(例えば、二量体化配列を通じて達成されるホモ二量体化又はヘテロ二量体化)の観点から、より高次の構造を提供する組織構成的なエレメントとしても機能することができる。足場はまた、特に、免疫グロブリン重鎖定常領域(例えば、IgFc)である場合、血清中での安定性に寄与することができる。好適な足場ポリペプチドは、幾つかの例では、半減期を延長するポリペプチドである。幾つかの例では、好適な足場ポリペプチドは、異なる、非免疫グロブリン配列を有する足場ポリペプチドを有する、対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と比較して、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体のインビボ半減期(例えば、血清中半減期)を、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、又は100倍超で延長する。例として、幾つかの例では、IgFcポリペプチド配列(例えば、ノブインホール型配列対などの相互特異的なIg配列を含む)は、リンカー(例えば、等しい配列長のGGGSaa反復)によって置き換えられたIgFcポリペプチド配列を有する対照のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と比較して、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の安定性及び/又はインビボ半減期(例えば、血清中半減期)を延長する。インビボ半減期の延長は、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、又は100倍超であり得る。IgFcポリペプチドをマスキングされたTGF-β構築物に用いる場合、IgFcは、マスキングされたTGF-β構築物の二量体の自発的な形成を防止する変異を含むことができ(例えば、Tianlei Yingらの文献、J.Biol.Chem.,287(23)、pp19399-19408(2012年6月1日)を参照されたい)、さらに、例えば、補体依存性細胞傷害(CDC)及び/又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介して細胞溶解を誘発するIgポリペプチドの能力を実質的に低減又は排除する変異(例えば、下記で考察されるLALA変異)を含み得る。
マスキングされたTGF-β構築物の足場ポリペプチド配列が、該足場が他の足場分子と相互作用(特異的に結合)することを可能にする1つ以上の配列を含む場合、マスキングされたTGF-β構築物は、ホモ二量体複合体(例えば、図1、構造Bを参照)又はヘテロ二量体複合体を形成することができる(例えば、図1、構造C～Fを参照)。マスキングされたTGF-β構築物はまた、足場が他の足場分子と相互作用(特異的に結合)して高次構造を形成することを可能にする1つ以上のaa配列を含み得る。より高次の多量体構造を形成する配列は、より高次のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、三量体、四量体、五量体など)の形成を可能にする。例として、IgMFc領域(例えば、配列番号83)を含む足場ポリペプチドは、五量体(特に、例えば配列番号84のJ鎖配列もまた発現される場合)又は六量体のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の形成を可能にする。Petrusicらの文献、Med Hypotheses.77(6)：959-61(2011)を参照されたい。ホモ及びヘテロの、二量体、三量体、四量体、五量体などの形態のマスキングされたTGF-β構築物は、マスキングされたTGF-β複合体と称される。
マスキングされたTGF-βを1つ以上の他のポリペプチド配列(1つ以上の特異的MOD又はMODのコピーなど)と一緒にすることが望ましい場合、足場ポリペプチド配列は、相手側となる相互特異的結合(二量体化)配列と共にヘテロ二量体を形成する傾向がある相互特異的二量体化配列を含んでもよい。相互特異的結合配列は、いくつかの例では、ホモ二量体を形成し得るが、その相手側の相互特異的結合配列と優先的に二量体化する(より強く結合する)。したがって、特定のヘテロ二量体は、相互特異的二量体化配列とその相手側相互特異的結合配列とが結びついて一対のポリペプチドとなるときに形成され得る(形成される傾向がある)。例として、相互特異的二量体化配列とその相手側相互特異的結合配列とが結びついて一対のポリペプチドとなり、選択的にヘテロ二量体を形成する場合、ペプチドの等モル混合物の60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％超がヘテロ二量体形成に寄与し、残りのペプチドが単量体又はホモ二量体として存在する。
充分な親和性で相互に又はそれら自体が特異的に結合する様々なaa配列は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体における二量体化配列として利用され得る(例えば、米国特許出願公報第2003/0138440号を参照)。その配列は、比較的コンパクトなサイズ(例えば、約300、250、225、200、175、150、125、100、75、又は50aa未満など)であり得る。二量体化/多量体化配列としては、免疫グロブリン重鎖定常領域(IgFc)ポリペプチド配列(免疫グロブリンのCH2～CH3領域を含む配列；例えば、図2A～2H及び配列番号68～83を参照)、Fcノブインホール配列(例えば、配列番号77及び78)、コラーゲン反復Gly-Xaa-Yaaからなるコラーゲンドメインを含むコレクチンファミリーのポリペプチド(例えば、ACRP30又はACRP30様タンパク質)、コイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、Fos/Jun結合対、Ig重鎖領域1(CH1)及び軽鎖定常領域CL配列(例えば、κ又はλIg軽鎖定常領域配列と対になったCH1配列などのCH1/CL対)が挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの実施態様では、足場ポリペプチド配列は、二量体化又は多量体化配列として機能する免疫グロブリン重鎖定常領域(CH2-CH3)ポリペプチド配列を含む(例えば、図2A～2H及び配列番号68～83を参照)。実施態様において、Igポリペプチドが、例えば、補体依存性細胞傷害(CDC)及び/又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)の活性化を介する細胞溶解を実質的に誘発しないであろう場合は、Igポリペプチドによる細胞溶解を誘発する能力を実質的に低下又は排除する変異を含む可能性がある。幾つかの例では、Fc配列は、図2A～2Hに示されるFc領域のaa配列に対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する。そのような免疫グロブリン配列は、1つ又は2つの鎖間ジスルフィド結合を形成することによって、マスキングされたTGF-β複合体のポリペプチドを共有結合することができる。下記で考察されるように、特に、ノブインホール型ポリペプチド対のような一対の相互特異的なIg配列が用いられる場合、二量体を安定化するために、追加のジスルフィド結合を導入することができる。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の足場ポリペプチド配列は、図2A(配列番号68)に示されるIgA Fc配列の少なくとも150個の連続するaas(少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、又は少なくとも350個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性の配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2B(配列番号69)に示されるIgD Fc配列の少なくとも150個の連続するaas(少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、又は少なくとも350個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性の配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2C(配列番号70)に示されるIgE Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2Dに示されるIgG1 Fc配列(配列番号71～78)などのwt.IgG Fcポリペプチド配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、又は少なくとも200個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2E(配列番号79)に示されるIgG2 Fcポリペプチド配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、又は少なくとも300個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2F(配列番号80)に示されるIgG3 Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、又は少なくとも225個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2G(配列番号81又は82)に示されるIgG4 Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、又は少なくとも250個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。一実施態様では、足場ポリペプチド配列は、図2H(配列番号83)に示されるIgM Fcポリペプチド配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、又は少なくとも250個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。免疫グロブリン足場ポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β複合体の上述のポリペプチド(例えば、図2A～2Hに示される)は、それらのヒンジ領域に隣接するシステイン間の1つ又は2つの鎖間ジスルフィド結合の形成によって共有結合することができる。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、図2Dに示されるヒトIgG1 Fcポリペプチドに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、90％、95％、98％、99％、又は100％)のaa配列同一性を有し、アラニンによるN297の置換(図2D、配列番号74に付番されるようなN297A置換、又はN77)置換を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、図2Dに示されるaa配列(ヒトIgG1Fc)を含むが、但し、N297の、アスパラギン以外のaaによる置換(図2Dに示されるaa配列のN77)を除く。N297での置換は、炭化水素部分の修飾の除去をもたらし、それによりwt.タンパク質と比較して補体成分1q(「C1q」)への結合が低下した抗体配列が得られ、その結果、補体依存性細胞傷害の低下がもたらされる。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、図2Dに示されるaa配列(ヒトIgG1Fc)を含み、但し、L234の、ロイシン以外のaaによる置換(図2Dに示されるaa配列のL14)を除く。IgGの下部ヒンジ領域(例えば、配列番号71のaas14～19に対応する、aas234-LLGGPS-239)内のL234及び他のaasは、Fcラムダ受容体(FcλR)への結合に関与し、したがって、その位置での変異は、(wtタンパク質に対して)受容体への結合を低減させる。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、図2Dに示されるaa配列(ヒトIgG1Fc)を含み、但し、L235の、ロイシン以外のaaによる置換(図2Dに示されるaa配列のL15)を除く。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、L234A及びL235A(「LALA」)置換(図2Dに示されるwt.aa配列の14位及び15位に対応する位置；例えば、配列番号75を参照されたい)を有する、図2Dに示されるaa配列(例えば、wt.ヒトIgG1配列)を含む。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、P331(図2Dに示されるaa配列のP111)のプロリン以外のaaによる置換を含む、図2Dに示されるaa配列(ヒトIgG1Fc)を含み、幾つかの例では、該置換はP331S置換である。P331での置換は、N297での置換と同様に、wt.タンパク質と比較してC1qへの結合が低下し、したがって、補体依存性細胞傷害が低下する。D270、K322、及び/又はP329(図2Dの配列番号71のD50、K122、及びP119に対応する)の、例えば、アラニンによる置換は、C1qへの結合を低減するための、単独で、又はP331置換の代わりに利用し得る。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、L234A及び/又はL235A置換(図2Dに示されるaa配列のL14及び/又はL15におけるロイシンのAlaによる置換)を含むIgG1Fcポリペプチドである。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、図2Dに示されるaa配列(wt.ヒトIgG1Fc)を含むが、但し、L234及び/又はL235(図2Dに示されるaa配列のL14及び/又はL15)におけるロイシン以外のaaによる置換、並びにP331(図2Dに示されるaa配列のP111)におけるプロリン以外のaaによる置換を除く。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、L234F、L235E、及びP331S置換(図2Dに示されるaa配列のaa位置14、15、及び111に対応する)を含む、図2D(ヒトIgG1Fc)に示される「三重変異」aa配列(配列番号73)を含む。
マスキングされたTGF-β複合体の2つのポリペプチド間の非対称な対が所望される場合、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在する足場ポリペプチドの二量体化配列は、相互特異的結合配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。相互特異的結合配列は、それらと同種のポリペプチド配列(すなわち、相互特異的配列及びその相手側となる相互特異的配列)、特に免疫グロブリンFc配列の変異型に基づくものと、優先的にヘテロ二量体を形成する。かかる相互特異的ポリペプチド配列には、安定化ジスルフィド結合を伴わないノブインホール(KiH)又は安定化ジスルフィド結合を有する(KiH)s-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、及びA107配列が含まれる。1つの相互特異的結合対は、IgG1のCH3ドメインのインターフェース上のT366Y及びY407T変異体対、又は他の免疫グロブリンの対応する残基を含む。Ridgwayらの文献、Protein Engineering 9：7,617-621(1996)(置換はKabatらの文献、(1991)のEU付番スキームによって示される)を参照されたい。第2の相互特異的結合対は、T366W置換によるノブの形成、並びに相補的Fc配列上の三重置換T366S、L368A、及びY407Vによるホールの形成を伴う。Xuらの文献、mAbs 7：1,231-242(2015)を参照されたい。別の相互特異的結合対は、Y349C、T366S、L368A、及びY407V置換を有する第1のFcポリペプチドと、S354C、及びT366W置換を有する第2のFcポリペプチドと、を有する(ジスルフィド結合が、Y349CとS354Cとの間で形成され得る)。Brinkmann及びKonthermann,mAbs 9：2,182-212(2015)を参照されたい。Fcポリペプチドは、ノブインホール修飾の有無にかかわらず、Fcポリペプチド間のジスルフィド結合(例えば、ヒンジ領域ジスルフィド結合)の形成によって安定化させることができる。いくつかの相互特異的ポリペプチド間結合配列を表1に要約し、図2Dに括弧「｛｝」内に示される、wt.IgG1配列(配列番号71)に示されるaa位置の付番の相互参照と共に示す。
Figure 2023500066000078
表1の配列の相互特異的な対に加えて、相互特異的「シード」(SEED)配列は、相互特異的配列のIgG1 CH3ドメイン内のIgAに由来する45個の残基、及び相手側の相互特異的配列上のIgA CH3内のIgG1に由来する57個の残基を有する。Haらの文献、Frontiers in Immunol.7：1-16(2016)を参照されたい。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体において見出される足場配列は、ノブインホール(KiH)、安定化ジスルフィドを有するノブインホール(KiHs-s)、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、A107、又はシード配列からなる群から選択される、相互特異的結合配列又はその相手側の相互特異的結合配列を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、T146W KiH配列置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチドと、T146W、L148A、及びY187V KiH配列置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチドとを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含む。1つ又は両方の足場aa配列は、任意で、Kabat付番による、L234及びL235(例えば、L234A/L235A「LALA」又はL234F/L235E)、N297(例えば、N297A)、P331(例えば、P331S)、L351(例えば、L351K)、T366(例えば、T366S)、P395(例えば、P395V)、F405(例えば、F405R)、Y407(例えば、Y407A)、及びK409(例えば、K409Y)のうちの1つ以上の置換を含む。これらの置換は、配列番号71のIgG1配列では、L14及びL15(例えば、L14A/L15A「LALA」又はL14F/L15E)、N77(例えば、N77A)、P111(例えば、P111S)、L131(例えば、L131K)、T146(例えば、T146S)、P175(例えば、P175V)、F185(例えば、F185R)、Y187(例えば、Y187A)、及びK189(例えば、K189Y)として示される。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、T146W KiH配列置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチドと、T146S、L148A、及びY187VKiH配列置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチドとを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。例えば、図2Dの配列番号77及び78を参照されたい。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のT146W及びS134C KiHs-s置換と、第2の足場配列のT146S、L148A、Y187V及びY129C KiHs-s置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のS144H及びF185A HA-TF置換と、第2の足場配列のY129T及びT174F HA-TF置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のT130V、L131Y、F185A、及びY187V ZW1置換と、第2の足場配列のT130V、T146L、K172L、及びT174W ZW1置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のK140D、D179M、及びY187A 7.8.60置換と、第2の足場配列のE125R、Q127R、T146V、及びK189V 7.8.60置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のβポリペプチドは、第1の足場配列のK189D及びK172D DD-KK置換と、第2の足場配列のD179K及びE136KD D-KK置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のK140E及びK189W EW-RVT置換と、第2の足場配列のQ127R、D179V、及びF185T EW-RVT置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のK140E、K189W、及びY129C EW-RVTs-s置換と、第2の足場配列のQ127R、D179V、F185T、及びS134C EW-RVTs-s置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列のK150E及びK189W A107置換と、第2の足場配列のE137N、D179V、及びF185T A107置換とを含み、その足場は、配列番号71のIgG1の少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全ての連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによって、エフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235Aの「LALA」)、並びに/又はN77置換(N297、例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む。
足場としての免疫グロブリン重鎖定常領域の使用の代替として、免疫グロブリン軽鎖定常領域を用いて、足場ポリペプチド配列を形成するか、又は足場ポリペプチド配列の一部である二量体化配列としての重鎖CH1配列と対にすることができる。一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列において、IgCH1ドメイン(例えば、配列番号85のポリペプチド)を含み、第2の足場配列において、Igκ鎖定常領域配列(配列番号86)を含み、その足場は、それぞれ、配列番号85及び/又は86の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110の連続するaasに対して、少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含む。図2J及び2Kを参照されたい。CH1及びIgκ配列は、相互に対する親和性を増大させ、したがって、それらを二量体化配列として利用して形成される任意のヘテロ二量体の安定性を増加させるように修飾され得る。CH1-Igκヘテロ二量体の安定性を増加させる置換としては、Chenらの文献、MAbs,8(4)：761-774(2016)のMD13コンビネーションとして特定されるものが挙げられる。MD13には、CH1及びIgκの配列の各々に2つの置換が導入される。CH1配列は、S64E及びS66V置換(図2Jに示される配列番号85のS70E及びS72V)を含むように修飾される。Igκ配列は、S69L及びT71S置換(図2Kに示される配列番号86のS68L及びT70S)を含むように修飾される。
別の実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドは、第1の足場配列において、IgCH1ドメイン(例えば、配列番号85のポリペプチド)を含み、第2の足場配列において、Igλ鎖定常領域配列(配列番号87)を含み、その足場は、それぞれ、配列番号85及び/又は87の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110個の連続するaasに対して、少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含む。図2J及び2Kを参照されたい。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドの足場ポリペプチド配列は各々、二量体化配列としてロイシンジッパーポリペプチドを含む。ロイシンジッパーポリペプチドは、相互に結合して二量体(例えば、ホモ二量体)を形成する。ロイシンジッパーポリペプチドの非限定的な例としては、例えば、下記のaa配列のうちのいずれか1つのペプチドが挙げられる：
Figure 2023500066000079
 。幾つかの例では、ロイシンジッパーポリペプチドは、下記のaa配列：
Figure 2023500066000080
 を含む。
追加的なロイシンジッパーポリペプチドは、当該技術分野で既知であり、これらのうちのいずれも、足場としての使用又は二量体化配列としての足場への組み込みに好適である。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドの足場ポリペプチド配列は各々、二量体(例えば、ホモ二量体)を形成するコイルドコイルペプチドを含む。コイルドコイルポリペプチドの非限定的な例としては、例えば、下記のaa配列のうちのいずれか1つのペプチドが挙げられる：
Figure 2023500066000081
 。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドの二量体化(ホモ二量体化)を可能にする足場ポリペプチド配列は各々、ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも1つのシステイン残基を有するポリペプチド配列を含む。かかるポリペプチド配列の例としては、ヒトFasLポリペプチド：
Figure 2023500066000082
 が挙げられる。
マスキングされたTGF-β複合体の二量体よりも大きい(例えば、三量体、四量体、五量体、六量体などの)形成を可能にする多量体化(オリゴマー化)配列として好適なペプチドは、限定されないが、六量体、又は五量体を形成する(特に、図2Iに提供されるようなシグナル配列を欠く成熟J鎖ペプチドと組み合わせた場合)IgM定常領域(例えば、図2Hを参照されたい)が挙げられる。三量体を形成するコラーゲンドメインも用いることができる。コラーゲンドメインは、(Gly-Xaa-Xaa)nを含み得、Xaaは、任意のaaであるか、又は、nは整数であり(例えば、10～40)、Xaa及びYaaは、独立して、任意のaaであり、nは10～40の整数である。Gly-Xaa-Yaa配列において、Xaa及びYaaは、Gly-Xaa-Yaaの出現の25％、50％、75％、80％、90％又は95％超において、又はGly-Xaa-Yaaの各々の出現において、それぞれプロリン及びヒドロキシプロリンであることが多い。幾つかの例では、コラーゲンドメインは、配列(Gly-Xaa-Pro)nを含み、nは整数(例えば、10～40)である。コラーゲンオリゴマー化ペプチドは、下記のaa配列を含み得る：
Figure 2023500066000083
 。
F.TGF-βポリペプチド
上述のように、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド(例えば、1つ以上の独立して選択されるTGF-βポリペプチド)を含む。TGF-βポリペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するTGF-βポリペプチドは、TGF-β1ポリペプチドである。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するTGF-βポリペプチドは、TGF-β2ポリペプチドである。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内に存在するTGF-βポリペプチドは、TGF-β3ポリペプチドである。
TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3ポリペプチド配列は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に組み込まれ得るが、様々な要因が、具体的なTGF-βポリペプチドの選択、並びに使用される具体的な配列及びaa置換に影響を及ぼし得る。例えば、TGF-β1及びTGF-β3は、多数の哺乳動物細胞系(例えば、CHO細胞)において発現される場合、それらのアミノ酸配列の「クリッピング」を受ける。加えて、二量体化TGF-β(例えば、TGF-β2)は、TβR3(βグリカン受容体)に対して、TβR2受容体に対してよりも高い親和性を有し、これは、オフターゲット結合を生じて、非シグナル伝達TβR3分子のインビボにおける大きなプールへの生物学的に活性なマスキングされたタンパク質の損失をもたらし得る。TβR3への高親和性オフターゲット結合を最小限に抑えるために、ジスルフィド結合によって結合された二量体TGF-β分子をもたらす残基を置換することが望ましい場合がある。したがって、システイン77(C77)は、システイン以外のアミノ酸(例えば、C77S置換を形成するセリン)によって置換され得る。
好適なTGF-βポリペプチドは、約70aas～約125aasを有することができ、例えば、好適なTGF-βポリペプチドは、約70aas～約80aas、約80aas～約90aas、約90aas～約100aas、約100aas～約105aas、約105aas～約110aas、約110aas～約112aas、約113aas～約120aas、又は約120aas～約125aasの長さを有することができる。好適なTGF-βポリペプチドは、ヒトTGF-β1ポリペプチド、ヒトTGF-β2ポリペプチド、又はヒトTGF-β3ポリペプチドの成熟形態の少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110個の連続するaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
1.TGF-β1ポリペプチド
好適なTGF-β1ポリペプチドは、下記のTGF-β1アミノ酸配列
Figure 2023500066000084
 (配列番号105、112aasの長さ)の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は少なくとも112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、このTGF-β1ポリペプチドは、約112aasの長さを有する。TGF-β1プレプロタンパク質を、配列番号106として図3に示す。アミノ酸R25、C77、V92及びR94を太字及び斜体で示す(図4参照)。
幾つかの例では、好適なTGF-β1ポリペプチドは、C77S置換を含む。
したがって、幾つかの例では、好適なTGF-β1ポリペプチドは、下記のTGF-β1アミノ酸配列：
Figure 2023500066000085
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸77がSerである。位置25、77、92及び94を、太字及び斜体で示す。
2.TGF-β2ポリペプチド
好適なTGF-β2ポリペプチドは、下記のTGF-β2アミノ酸配列：
Figure 2023500066000086
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、このTGF-β2ポリペプチドは、約112aasの長さを有する。TGF-β2プレプロタンパク質を、配列番号109として図3に示す。残基Lys25、Ile92、及び/又はLys94を、太字及び斜体で示す。
幾つかの例では、好適なTGF-β2ポリペプチドは、C77S置換を含む。
したがって、幾つかの例では、好適なTGF-β2ポリペプチドは、下記のTGF-β2アミノ酸配列：
Figure 2023500066000087
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、配列中、アミノ酸77はSerである。
3.TGF-β3ポリペプチド
好適なTGF-β3ポリペプチドは、下記のTGF-β3アミノ酸配列：
Figure 2023500066000088
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、このTGF-β3ポリペプチドは、約112aasの長さを有する。TGF-β3アイソフォーム1プレプロタンパク質を、配列番号112として図3に示す。位置25、92、及び94を太字及び斜体で示す。
幾つかの例では、好適なTGF-β3ポリペプチドは、C77S置換を含む。幾つかの例では、好適なTGF-β3ポリペプチドは、下記のTGF-β3アミノ酸配列：
Figure 2023500066000089
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸77はSerである。位置25、92、及び94を、太字及び斜体で示す。
4.追加のTGF-βポリペプチド配列変異
TGF-β分子の二量体化を変化させる配列変異(例えば、C77Sなどのシステイン77置換)に加えて、親和性及び他の特性に影響を及ぼす配列変異を有するTGF-β1～3ポリペプチドを、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に組み込み得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、マスキングポリペプチド(例えば、TβRIIポリペプチドなどのTβRポリペプチド)に対して低い親和性を有するTGF-β変異型を含む場合、これらの構成要素はより容易に解離し、マスキングされたTGF-βポリペプチドを細胞TβRタンパク質に、より利用可能とする。TβRIIタンパク質は、一般に、TGF-βと相互作用するヘテロマーTβRシグナル伝達複合体の第1のペプチドであるため、TβRIIとの相互作用は、TGF-βの活性シグナル伝達複合体への参加を効果的に制御する。したがって、TGF-βのTβRIIに対する親和性を制御する変異型は、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体の活性シグナル伝達複合体への参加を効果的に制御する。
本開示は、(配列変異(複数可)を有さない他の同一のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と比較して)変化した(例えば、減少した)お互いへの親和性を有する、変異型マスキングTβR(例えば、TβRII)ポリペプチド配列及び/又は変異型TGF-βポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体を包含し、提供するものである。TGF-βポリペプチドとTβR(例えば、TβRII)ポリペプチドとの間の親和性は、MOD及びそのco-MODについて上述した(BLI)を使用して測定され得る。
a.追加のTGF-β2配列変異
本開示は、マスキングTβR(例えば、TβRII)ポリペプチド配列と、wt.TGF-β2ポリペプチド又は変異型TGF-β2ポリペプチドのいずれかとを含む、マスキングされたTGF-β2構築物及び複合体を包含し、提供するものであり、ここで、変異型ポリペプチドは、(配列変異を伴わない以外は同一のwt.TGF-βポリペプチド配列と比較して)低い、マスキングTβRに対する親和性を有する。
本開示は、マスキングTβRII受容体配列、及び配列番号108の少なくとも100個の連続するaaに対する85％超(例えば、90％超、95％超、98％超、又は99％超)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型TGF-β2ポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を提供し、該アミノ酸配列は、該TβRII受容体配列に対する該変異型TGF-β2ポリペプチドの親和性を低下させる置換を含む。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、マスキングTβRIIポリペプチドと、Lys25、Ile92、及び/又はLys94のうちの1つ以上、2つ以上、又は3つ全ての置換を含む変異型TGF-β(例えば、TGF-β2)ポリペプチドとを含む(残基の位置については配列番号108、及びTGF-β1及びTGF-β3における対応する残基については図4を参照されたい)。これらのaa残基は、TGF-β2ポリペプチドに対するTGF-β2の親和性に影響を及ぼすことが示されている(Crescenzoらの文献、J.Mol.Biol.355：47-62(2006))も参照されたい。マスキングされたTGF-βポリペプチドは、任意に、IL-2又はその変異型などの1つ以上の独立して選択されるMODを含む。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、マスキングTβRIIポリペプチド、及び配列番号108の25位にLys又はArg以外のaaを有するTGF-β2ポリペプチドを含み、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含む。マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、配列番号108の92位にIleもしくはVal以外のaa(又は92位にIle、ValもしくはLeu以外のaa)を有するTGF-β2ポリペプチドを含み得、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含み得る。マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、配列番号108の94位にLys又はArg以外のaaを有するTGF-β2ポリペプチドを含み得、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含む。マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Lys25、Ile92、及び/又はLys94のうちの1つ以上、2つ以上、又は3つ全ての置換を含むTGF-β2ポリペプチドを含み得、さらに1つ以上の独立して選択されるMODを含み得る。マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Lys25、Ile92、及び/又はLys94のうちの1つ以上、2つ以上、又は3つ全ての置換を含むTGF-β2ポリペプチドを含み得、さらに1つ以上の独立して選択されるIL-2 MOD又はその親和性低減変異型を含み得る。
b.追加のTGF-β1及びTGF-β3配列変異
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、マスキングTβRIIポリペプチドと、TGF-β2の配列番号108内のLys25、Ile92、及び/又はLys94に対応する、1つ以上、2つ以上、又は3つ全てのaa位置での置換を含む、変異型TGF-β1又はTGF-β3ポリペプチドとを含む。TGF-β1又はTGF-β3では、Lys25に対応するaaはArg25であり、Ile92に対応するaaはVal92であり、Lys94に対応するaaはArg94であり、その各々は保存的置換である。例えば、TGF-β1については配列番号106及び107、及びTGF-β3については配列番号112及び113を参照されたい。
上述のように、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、任意に、IL-2又はその変異型などの、1つ以上の独立して選択されるMODを含む。一例では、マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、25位にArg又はLys以外のaaを有するTGF-β1又はTGF-β3ポリペプチドを含み、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含む。一例では、マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、92位にVal又はIle以外のaa(又は92位にIle、Val、もしくはLeu以外のaa)を有するTGF-β1又はTGF-β3ポリペプチドを含み、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含む。別の例では、マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Arg又はLys以外のaaを有するTGF-β2ポリペプチドを含み、任意に、1つ以上の独立して選択されるMOD(例えば、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド又はその親和性低減変異型)を含む。1つの特定の例では、マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Arg25、Val92、及び/又はArg94のうちの1つ以上、2つ以上、又は3つ全ての置換を含むTGF-β1又はTGF-β3ポリペプチドを含み、1つ以上の独立して選択されるMODをさらに含む。別の特定の例では、マスキングTβRIIポリペプチドを有するマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Arg25、Val92、及び/又はArg94のうちの1つ以上、2つ以上、又は3つ全ての置換を含むTGF-β1又はTGF-β3ポリペプチドを含み、1つ以上の独立して選択されるIL-2 MOD又はその親和性低減変異型をさらに含む。
G.TGF-β受容体ポリペプチド、及びTGF-βに結合しマスキングする他のポリペプチド
上述のTGF-βポリペプチド又はポリペプチド複合体のいずれにおいても、TGF-βポリペプチドに結合してマスキングするポリペプチド(「マスキングポリペプチド」)は、TβRI、TβRII、TβRIII、及び抗TGF-β抗体、又はその断片(例えば、Fab、一本鎖抗体など)などの、様々な形態をとることができる。
1.TGF-β受容体ポリペプチド
マスキングされたTGF-β構築物及び複合体におけるTGF-βのマスキングは、TGF-βポリペプチド(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3)に結合するのに充分なポリペプチド配列を含むTGF-β受容体断片(例えば、TβRI、TβRII、又はTβRIIIのエクトドメイン配列)を利用することによって達成し得る。一実施態様では、マスキング配列は、TβRI、TβRII、又はTβRIIIエクトドメインの全部又は一部を含む。
a.TGF-β受容体I(TβRI)
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体内のTGF-βをマスキングするポリペプチド配列は、TβRI(例えば、アイソフォーム1の配列番号114)に由来してもよく、TβRIエクトドメイン(aas34～126)の全部又は一部を含み得る。幾つかの例では、TGF-βをマスキングするための好適なTβRIポリペプチドは、下記のTβRIエクトドメインaa配列：
Figure 2023500066000090
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は103個のaasに対して少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
b.TGF-β受容体II(TβRII)
実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングするポリペプチド配列は、TβRII(例えば、アイソフォームAの配列番号116)に由来してもよく、TβRIIエクトドメイン配列(aas24～177)の全部又は一部を含み得る。一実施態様では、TGF-βをマスキングするための好適なTβRIIアイソフォームAのポリペプチドは、下記のTβRIIアイソフォームAエクトドメインのaa配列：
Figure 2023500066000091
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は少なくとも154個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。Bアイソフォーム中のD118に対応するアスパラギン酸残基の位置を、太字、下線、及び斜体で示す。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングするポリペプチド配列は、TβRIIアイソフォームB(配列番号118)に由来し得、TβRIIエクトドメイン配列(aas24～166)の全部又は一部を含み得る。一実施態様では、TGF-βをマスキングするための好適なTβRIIアイソフォームBのポリペプチドは、下記のTβRIIアイソフォームBエクトドメインのaa配列：
Figure 2023500066000092
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は103個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。下記で考察されるように、F30、D32、S52、E55、又はD118(斜体及び太字)のうちのいずれか1つ以上は、それらの位置で天然に存在するaa以外のアミノ酸(例えば、アラニン)によって置換され得る。TGF-βをマスキングするポリペプチド配列は、D118A又はD118R置換を有する配列番号119のポリペプチドを含み得る。TGF-βをマスキングする配列は、D118A又はD118R置換、並びにF30A、D32N、S52L及び/又はE55A置換のうちの1つ以上を有する配列番号119のペプチドを含み得る。
TβRIIのエクトドメインはマスキングポリペプチドとして利用され得るが、そのタンパク質の領域は荷電性パッチ及び疎水性パッチを有し、それらパッチが好ましくないpI ndをもたらして、該ポリペプチドを発現する細胞に対して毒性であり得る。加えて、TβRIIエクトドメインを活性TGF-βポリペプチドと組み合わせることで、細胞表面TβRIとの組み合わせが可能であって、そのシグナル伝達受容体の活性化(例えば、Smad経路を通じたシグナル伝達)を引き起こすことができる複合体とすることができる。TβRIの会合に関与する配列を除去又は改変して、TGF-βをマスキングするために使用されるTβRIIエクトドメイン配列を修飾することによって、マスキングされたTGF-βによる、自らの細胞表面ヘテロ二量体TβRI/TβRII複合体を介する以外の、細胞内での意図しない刺激を回避することができる。またTβRIIの修飾により、TGF-β(例えば、TGF-β3)に対するTβRIIの親和性を変化させる(例えば、低下させる)ことができ、それによって、TGF-βの脱マスキングの制御を可能にし、シグナル分子としてのTGF-βの利用可能性を高める。TGF-β(例えば、TGF-β3)に対して最も高い親和性を有するTβR(例えば、TβRII)ペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、TGF-β配列を最も強固にマスキングし、同じ効果を達成するためにより高い用量を必要とする。対照的に、親和性を低下させるTβRIIにおけるaa置換は、TGF-βポリペプチドを脱マスキングし、低用量で生物学的に有効である。例えば、実施例3を参照されたい。
したがって、TβRIを介したマスキングされたTGF-βポリペプチドによるシグナル伝達の遮断/制限、及び/又はTGF-βに対するマスキングTβRIIポリペプチドの親和性の改変(例えば、低減)が望ましい場合、TβRIIへの多くの改変を、TβRIIポリペプチド配列に対して組み込み得る。実施できる改変としては、上記の長さ1～25aaのN末端25アミノ酸の欠失(例えば、Δ14、Δ25)及び/又はL27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118、及び/又はE119のうちの1つ以上での置換が挙げられる。TβRIの、TβRIIとの会合の減少、及びTGF-βへの親和性の減少をもたらすいくつかの具体的な改変としては、配列番号119に基づく、L27A、F30A、D32A、D32N、S49A、I50A、T51A、S52A、S52L、I53A、E55A、V77A、D118A、D118R、E119A、及び/又はE119Qのうちのいずれか1つ以上が挙げられる。例えば、J.Groppeらの文献、MolCell29,157-168,(2008)及びDe Crescenzoらの文献、JMB355,47-62(2006)を参照されたい。これらの置換がTGF-β3-TβRII及びTβRI-TβRII複合体に及ぼす影響については、図Xを参照されたい。N末端Δ25の欠失及び/又はF24での置換(例えば、F24Aの置換)を含む、TβRIIの改変は、古典的SMADシグナル伝達経路を通じたシグナルを実質的に又は完全に遮断する。一態様では、成熟型TβRIIBアイソフォーム(配列番号119)の118位(D118)のアスパラギン酸は、AlaなどのAsp又はGlu以外のアミノ酸によって置換されて「D118A」置換を生じるか、又はArgによるD118R置換を生じる。D118に対応するAsp残基は、配列番号117～123に(図5Bの太字及び下線で)示されている。長さが1～25aaのN末端欠失(例えば、Δ25の欠失)及び/又はF24での置換(例えば、F24Aの置換)を、D118置換(例えば、D118A又はD118R)と組み合わせ得る。また、長さが1～25aaのN末端欠失(例えば、Δ25の欠失)及び/又はF24での置換(例えば、F24Aの置換)を、L27、F30、D32、S49、150、T51、S52、I53、E55、V77、D118、及び/又はE119置換のうちのいずれかでの置換(例えば、D118A)、及び特に、上記の配列番号119のそれらの位置について列挙されている特定の置換、のうちのいずれかと組み合わせて、親和性を改変し得る。
TβRIIポリペプチドのN末端の欠失はまた、TβRIとの相互作用の損失をもたらし得、TβRIIポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物及び複合体が、TβRIシグナル伝達に関与し活性化する構成的活性複合体として作用することを防止し得る。TβRIIポリペプチドの14aa欠失(Δ14)は、タンパク質とTβRIとの相互作用を実質的に低減し、TβRIIのΔ25aa欠失は、TβRIとの相互作用を完全に遮断すると考えられる。N末端の欠失はまた、タンパク質のpIを実質的に変化させ、Δ14 TβRIIエクトドメイン変異体は、約4.5～5.0(例えば、約4.74)のpIを示す。したがって、TGF-β構築物又は複合体は、14～25aas(例えば、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25aa)などのN末端欠失を有するTβRIIエクトドメインポリペプチド(例えば、配列番号117又は118のポリペプチド)を含み得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βポリペプチドをマスキングするために利用され得る、TβRIとの相互作用を制限するものを含む修飾エクトドメイン配列を、下記の段落に記載する。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、TβRIIアイソフォームBエクトドメイン配列：
Figure 2023500066000093
 の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は103個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。F30、D32、S52、E55、又はD118(斜体及び太字)のうちのいずれか1つ以上は、それらの位置で天然型aa(例えば、アラニン)以外のアミノ酸によって置換され得る。一実施態様では、TGF-βをマスキングする配列は、D118A置換を有する配列番号120のペプチドを含む。一実施態様では、TGF-βをマスキングする配列は、D118A置換と、F30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ以上とを有する配列番号120のポリペプチドを含む。
TβRIIのN末端欠失、例えば、14～25aas(例えば、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25aa)の組み合わせは、TβRIと相互作用するマスキングされたTGF-β/TβRII複合体に起因する意図しない細胞内のシグナル伝達を遮断し、F30、D32、S52、E55、及び/又はD118のいずれか1つ以上の位置でのTβRIIエクトドメイン置換を含む、他のTβRIIエクトドメイン置換との組み合わせとし得る。
欠失及び置換の組み合わせは、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、細胞の膜結合TβRI及びTβRII受容体を介する以外の細胞シグナル伝達を引き起こさないことを確実にする。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中の、TGF-βをマスキングする配列は、下記のTβRIIアイソフォームBエクトドメイン配列：
Figure 2023500066000094
 (この配列中、aas1～14を欠失している(Δ14))の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は103個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。F30、D32、S52、E55、又はD118(斜体及び太字)のうちのいずれか1つ以上は、それらの位置で天然に存在するaa以外のアミノ酸(例えば、アラニン)によって置換され得る。一実施態様では、TGF-βをマスキングする配列は、D118A置換を有する配列番号120のペプチドを含む。一実施態様では、TGF-βをマスキングする配列は、D118A置換と、F30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ以上とを有する配列番号121のポリペプチドを含む。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、下記配列：
Figure 2023500066000095
 (この配列中、aas1～25を欠失している(Δ25))の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は103個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む。F30、D32、S52、E55、又はD118(斜体及び太字)のうちのいずれか1つ以上は、それらの位置で天然に存在するaa以外のアミノ酸(例えば、アラニン)によって置換され得る。一実施態様では、TGF-βをマスキングする配列は、D118A置換を有する配列番号122のポリペプチドを含む(図5Bの配列番号123として示す)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、D118A置換と、F30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ以上とを有する、配列番号122のペプチドを含む。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、D118A及びF30A置換を有する配列番号122(図5Bを参照されたい)のペプチドを含む。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、D118A及びD32N置換を有する配列番号122(図5Bを参照されたい)のペプチドを含む。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、D118A及びS52L置換を有する配列番号122(図5Bを参照されたい)のペプチドを含む。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングする配列は、D118A及びE55Aを有する配列番号122(図5Bを参照されたい)のペプチドを含む。
c.TGF-β受容体III(TβRIII)
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βをマスキングするポリペプチド配列は、TβRIIIに由来し得(例えば、アイソフォームAの配列番号124及びアイソフォームBの配列番号125)、TβRIIIエクトドメインの全部又は一部(Aアイソフォームのaas27～787又はBアイソフォームの27～786)を含み得る。幾つかの例では、TGF-βをマスキングするのに好適なTβRIIIポリペプチドは、TβRIIIAアイソフォーム又はBアイソフォームのエクトドメイン配列(例えば、配列番号124又は配列番号125として、図5Cで提供される)の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は120個のaasに対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
2.抗体
TGF-β受容体ポリペプチド(例えば、エクトドメイン配列)は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中のTGF-βポリペプチドに結合し、マスキングするよう機能することもできるが、TGF-β配列に結合する他のポリペプチド配列(タンパク質配列)もまた、マスキングポリペプチドとして用いることができる。TGF-βをマスキングするために使用することができる好適なポリペプチド又はタンパク質配列としては、TGF-βに対する親和性を有する抗体(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3のうちの1つ以上に特異的な抗体)、又はそれらの断片、TGF-βポリペプチドに対する親和性を有するナノボディ、及び特に一本鎖抗TGF-β抗体(例えば、それらのいずれもヒト化し得る)が挙げられる。TGF-βに結合し中和する、scFV抗体を含むいくつかの抗体が報告されている。例えば、米国特許9,090,685号を参照されたい。本開示に記載される本発明の実施態様及び/又は態様を考慮すると、TGF-βポリペプチドをマスキングするために使用されるTβR(例えば、TβRII)配列は、TGF-βポリペプチドに対する親和性を有するマスキング抗体配列(例えば、scFV又はナノボディ)で置き換えられ得る。例えば、TGF-β受容体配列がTGF-βポリペプチドをマスキングするために使用される、図1のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の各々において、受容体ポリペプチドは、TGF-βポリペプチドに対する親和性を有するマスキング抗体ポリペプチド(例えば、scFV又はナノボディ)で置き換えられ得る。
抗体(例えば、一本鎖抗体)をマスキングポリペプチドとして使用する潜在的な利点の1つは、それをマスキングされるTGF-βポリペプチド(複数可)のアイソフォームに限定する能力である。例えば、TGF-β1に対するメテリムマブ(CAT192)ベースの一本鎖抗体配列(例えば、Lordらの文献、mAbs 10(3)：444-452(2018))を使用して、TGF-βアイソフォームを、それがTGF-β構築物又は複合体に存在する場合に、マスキングすることができる。別の実施態様では、TGF-β2に特異的な一本鎖抗体配列を使用して、TGF-βアイソフォームを、それがTGF-β構築物又は複合体に存在する場合に、マスキングする。別の実施態様では、TGF-β3に特異的な一本鎖抗体配列を使用して、TGF-βアイソフォームを、それがTGF-β構築物又は複合体に存在する場合に、マスキングする。また、一本鎖抗体は、TGF-βアイソフォームの組合せ(例えば、下記：TGF-β1及びTGF-β2、TGF-β1及びTGF-β3、並びにTGF-β2及びTGF-β3、からなる群から選択される、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中に存在するエクトドメイン配列)に対して特異的なものとすることができる。一本鎖抗体はまた、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するTGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3エクトドメイン配列に対して凡そ特異的であり得る。例えば、国際公開WO2014/164709号を参照されたい。TGF-βアイソフォームに対する所望の特異性及び親和性を有する抗体及び一本鎖抗体は、標的TGF-βポリペプチド配列に対する親和性を有する抗体の可変領域配列に対するハイブリドーマ及び/又は修飾(例えば、コンビナトリアル修飾)をスクリーニングすることを含む、様々な方法によって調製することができる。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、TGF-β配列(例えば、TGF-β3配列)をマスキングするための一本鎖抗体を含む。かかる一実施態様では、一本鎖アミノ酸配列は、C77S置換(配列番号112を参照)を含む配列番号111に示されるTGF-β3に特異的である。
H.リンカー
上述のように、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の任意の2つのエレメントの間に挿入されているリンカーペプチド/ポリペプチド配列を含むことができる。用語「リンカー」とは言っても、下記のリンカーと同様の配列が、例えば、タンパク質分解に対する保護として、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体のポリペプチドのN末端及び/もしくはC末端に配置される場合もある。
好適なリンカー(「スペーサー」とも称される)は、容易に選択することができ、1aa～25aa、3aa～20aa、2aa～15aa、3aa～12aa、4aa～10aa、5aa～9aa、6aa～8aa、又は7aa～8aaなどの、多くの好適な長さのいずれかであり得る。好適なリンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25aaの長さであり得る。好適なリンカーは、25～35aaの長さであり得る。好適なリンカーは、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は35aaの長さであり得る。好適なリンカーはまた、35～45aaの長さであり得る。好適なリンカーは、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、又は45aaの長さであり得る。好適なリンカーは、45～50aaの長さであり得る。好適なリンカーは、45、46、47、48、49、又は50aaの長さであり得る。
例示的なリンカーとしては、グリシンを含むもの、又は約2～約50(例えば、2～4、4～7、7～10、10～20、20～35、又は35～50)の連続するグリシン残基配列を含むポリグリシン、グリシン-セリンポリマー(例えば、
Figure 2023500066000096
 などであり、nは少なくとも1の整数(例えば、1～10、10～20、又は20～30)である)、グリシン-アラニンポリマー、又はアラニン-セリンポリマー(例えば、1～10、10～20、又は20～30aaの長さを有する)、並びに当該技術分野で既知の他の可塑性リンカーが挙げられる。グリシンポリマーを使用することもグリシン-セリンポリマーを使用することもでき、その場合、Gly及びSerの両方は比較的構造不定であるため、成分間の中性なテザーとして機能することができる。グリシンポリマーを使用することができ、グリシンは、アラニンよりも有意にファイ-プサイ空間を認識評価し、長い側鎖を有する残基よりも大幅に制限が少なくなる(Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992)を参照されたい)。例示的なリンカーは、
Figure 2023500066000097
 などを含むが、これらに限定されない、アミノ酸配列を含み得る。例示的なリンカーは、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10回繰り返され得る
Figure 2023500066000098
 を含むことができる。幾つかの例では、リンカーは、2回、3回、又は4回繰り返され得るアミノ酸配列
Figure 2023500066000099
 を含む。幾つかの例では、リンカーは、4回又は5回繰り返されるアミノ酸配列
Figure 2023500066000100
 を含む。例示的なリンカーとしては、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10回繰り返され得る
Figure 2023500066000101
 が挙げられる。幾つかの例では、リンカーは、1回のみ、又は2回繰り返されるアミノ酸
Figure 2023500066000102
 を含む。幾つかの例では、リンカーは、3回又は4回繰り返されるアミノ酸配列
Figure 2023500066000103
 を含む。幾つかの例では、リンカーは、5、6又は7回繰り返されるアミノ酸配列
Figure 2023500066000104
 を含む。幾つかの例では、リンカーは、8、9又は10回繰り返されるアミノ酸配列
Figure 2023500066000105
 を含む。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチドに存在するリンカーポリペプチドは、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第2のポリペプチドに存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含む。幾つかの例では、例えば、好適なリンカーは、下記のアミノ酸配列
Figure 2023500066000106
 を含む。
I.例示的なマスキングされたTGF-β構築物及び複合体
上で考察されたように、本開示に記載されるマスキングされたTGF-β構築物及び複合体のいずれにおいても、TGF-βポリペプチド配列に結合してマスキングするマスキングポリペプチドは、様々な形態をとることができる。マスキングペプチドは、抗体、抗体の結合断片、TGF-βに結合する一本鎖抗体(例えば、scFv)又はその一部、又はナノボディであってもよく、それらはいずれもヒト化され得る。マスキングポリペプチドはまた、TGF-βポリペプチド(例えば、TGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3)に結合するのに充分なポリペプチド配列を含むTGF-β受容体断片(例えば、TβRI、TβRII、又はTβRIIIのエクトドメイン配列)であり得る。
上述のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体のいずれにおいても、用いられるTGF-βポリペプチド配列は、TGF-β1、TGF-β2又はTGF-β3に基づき得る。一実施態様では、TGF-βポリペプチドは、TGF-β3配列を含む。マスキングされたTGF-β構築物及び複合体内に、完全長の成熟型TGF-βタンパク質配列は必須ではなく、細胞表面TβRIIと相互作用し、マスキングされたTGF-β複合体が細胞表面TβRIIと共に、TβRIを動員し、それによってシグナル伝達を開始する(例えば、Smad経路及び非Smad経路を通じたシグナル伝達)のに必要なTGF-βの部分のみが必須である。
上述のような、マスキングされたTGF-βの送達、又はTβRI及びTβRIIを有する細胞を活性化するその能力には、免疫調節ポリペプチド(MOD)は必須ではないが、MODの存在は、TGF-β細胞活性化の結果に実質的に影響を及ぼし得る。したがって、上記のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体のいずれかへのMODの組み込みは、本明細書に記載のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体の使用からの治療的効果など、様々な効果を得るために使用することができる。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体中に存在するMODは、PD-L1、Fas-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-21、IL-23、並びにそれらのco-MODに対する親和性が低減したものを含む、それらのいずれかの変異型からなる群から選択される。
マスキングされたTGF-β構築物及び複合体にMODを組み込むことが望ましい場合もあるが、その存在は全ての場合において必須ではなく、特に、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体がサイトカイン(例えば、1つ以上の独立して選択されるインターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、ケモカイン、及び/又は腫瘍壊死因子)を含む他の材料と共に投与される場合には必須ではない。例えば、インターロイキン7受容体(例えば、IL-7Ra)の胸腺細胞における発現を促進することによって、従来のCD8＋T細胞(又は低親和性CD8＋T細胞の生存)の発達をサポートすることが望ましい場合、MODポリペプチドを含まない(「MOD不含有の」)マスキングされたTGF-β構築物及び複合体を用い得る。同様に、強力なアゴニストリガンドによって誘導されるT細胞集団の発達を促進することが望ましい場合、胸腺由来Treg(tTreg)、インバリアントナチュラルキラーT(iNKT)、及びCD8αα＋T細胞前駆体の生存をサポートするために、MOD含有又はMOD不含有のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体を用い得る。
下記は、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体の非限定的な例である。
1.マスキングされたTGF-β構築物
マスキングされたTGF-β構築物の場合、構成要素(例えば、TGF-β、足場、TβRII配列などのマスキングポリペプチド、及び任意に1つ以上のMOD)の全ては、単一のポリペプチド鎖の一部である(例えば、図1、構造Aを参照されたい)。そのような実施態様では、足場ポリペプチドは、他の足場ポリペプチドと二量体又はより高次の構造を形成せず、したがって、マスキングされたTGF-β構築物は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又はより高次の多量体構造(三量体など)の形態ではない。
図1のマスキングされたTGF-β構築物の場合、構造Aでは、ポリペプチドは、N末端からC末端まで、任意に、1つ以上のMODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しマスキングするポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含み得る。かかるマスキングされたTGF-β構築物としては、下記のものが挙げられる：
(i)N末端からC末端にかけて、任意に1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しマスキングするTβRポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；
(ii)N末端からC末端にかけて、任意に1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しマスキングするTβRIIポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；
(iii)N末端からC末端にかけて、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しマスキングするTβRポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；
(iv)N末端からC末端にかけて、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型IL-2 MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドしマスキングするTβRポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；
(v)N末端からC末端にかけて、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチドに結合しマスキングするTβRポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；
(vi)N末端からC末端にかけて、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチドに結合しマスキングするTβRIIポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列と、を含むポリペプチド；及び
(vii)N末端からC末端にかけて、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型IL-2 MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチドに結合しマスキングするTβRIIポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列と、を含むポリペプチド。
本明細書に記載のマスキングされたTGF-β構築物のいずれかの例では、TGF-βポリペプチド配列のC77は、二量体化を防止するために置換され得(例えば、C77S置換)、TGF-βポリペプチドは、MOD及びTβRポリペプチド配列の修飾と共に、マスキングTβRポリペプチドに対する親和性を低下させるための変異(例えば、aas25、92、及び/又は94のうちの1つ、2つ、もしくは3つ全て)をさらに含み得る。マスキングされたTGF-β構築物に組み込まれ得る例示的なTβRポリペプチド配列としては、TβRI会合(engagement)を減弱させるためのD118A又はD118R置換を任意に有するΔ14又はΔ25 TβRIIポリペプチドが挙げられる。MOD変異型については、そのポリペプチド配列と共に記載し、またTβRI、TβRII、及びTβRIIIの追加の修飾については上述したとおりである。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、配列番号146に示される配列を有する(図7Aを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、配列番号147に示される配列を有する(図7Bを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、配列番号157に示される配列を有する(図7Gを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、配列番号158に示される配列を有する(図7Hを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、配列番号159に示される配列を有する(図7Iを参照)。
2.マスキングされたTGF-β複合体
マスキングされたTGF-β複合体は、少なくとも2つのポリペプチド、すなわち第1及び第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、別の足場ポリペプチドと会合して、第1及び第2のポリペプチドを一緒にして、複合体とする足場ポリペプチドを含む。したがって、TGF-βポリペプチド複合体は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又はより高次の多量体構造を形成する。
(i)第1の例では、マスキングされたTGF-β複合体は、図1の構造Bのように二量体化してホモ二量体(例えば、対称性二量体)を形成することができる足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、1つ以上のTGF-βポリペプチドに結合しマスキングする少なくとも1つのポリペプチド(例えば、各TGF-βポリペプチド配列のマスキング配列)と、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)と、を含む。かかるホモ二量体において、IgFcポリペプチドは、各構築物の足場内のIgFcポリペチド(polypetide)間のジスルフィド結合の自発的な形成を可能にすることができ、例えば、補体依存性細胞傷害(CDC)及び抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介して細胞溶解を誘発するIgポリペプチドの能力を実質的に低下又は排除する変異(例えば、本明細書で考察されるLALA変異)を含み得る。
(ii)第2の例では、マスキングされたTGF-β複合体は、
(a)相互特異的二量体化配列を含む足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、1つ以上のTGF-βポリペプチドに結合しマスキングする少なくとも1つのポリペプチド(例えば、各TGF-βポリペプチド配列のマスキング配列)と、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む、第1のポリペプチド、並びに
(b)第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる配列を含む足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、少なくとも1つのTGF-βポリペプチドに結合しマスキングする少なくとも1つのポリペプチドと、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む、第2のポリペプチド、を含み、
ここで、第1及び第2のポリペプチドは、図1の構造Cのような相互特異的二量体化配列の相互作用を通じてヘテロ二量体を形成する。
(iii)第3の例では、マスキングされたTGF-β複合体は、
(a)相互特異的二量体化配列を含む足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、少なくとも1つ以上のTGF-βポリペプチドに結合しマスキングする少なくとも1つのポリペプチド(例えば、各TGF-βポリペプチド配列のマスキング配列)と、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む、第1のポリペプチド、並びに
(b)第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる配列と、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む足場構造を含む第2のポリペプチド、を含み、
ここで、第1及び第2のポリペプチドは、図1の構造Fのような相互特異的二量体化配列の相互作用を通じてヘテロ二量体を形成する。
(iv)第4の例では、マスキングされたTGF-β複合体は、
(a)相互特異的二量体化配列を含む足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つのTGF-βポリペプチド配列と、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む、第1のポリペプチド、並びに
(b)第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる配列を含む足場構造上に組み立てられた、少なくとも1つ以上のTGF-βポリペプチドに結合しマスキングする少なくとも1つのポリペプチドと、任意に、1つ以上の免疫調節ポリペプチド(MOD)とを含む、第2のポリペプチド、を含み、
ここで、第1及び第2のポリペプチドは、図1の構造D及びEのような特異的相互作用二量体化配列を介してヘテロ二量体を形成する。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体において(図1、構造B、C及びF)、TGF-βポリペプチドを含む配列(第1のポリペプチド)は、N末端からC末端にかけて、任意に、1つ以上のMODと、(相互特異的結合配列を有するか又は有さない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しマスキングするポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含み得る。図1、構造FのTGF-β配列を含まないポリペプチド(第2のポリペプチド)は、相互特異的結合配列を有する足場ポリペプチドを含み、任意に、N末端、C末端、又はN末端及びC末端の両方にMODを含む。
幾つかの例では、図1の構造D及びEのマスキングされたTGF-β複合体において、TGF-βポリペプチド含有ポリペプチド(第1のポリペプチド)は、N末端からC末端にかけて、1つ以上の任意のMODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列と、を含み得る。図1の構造D及びEのTGF-β配列を含まないポリペプチド(第2のポリペプチド)は、N末端からC末端にかけて、任意に、1つ以上のMODと、相互特異的結合配列を有する足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチドに結合しそれをマスキングするポリペプチドと、を含み得る。図1には例示されていないが、TGF-βポリペプチド配列を含む第1のポリペプチドは、1つ以上のMODを含まない場合があり、マスキング配列を含む第2のポイペプチド(poypeptide)は、1つ以上のMODを含む場合がある。
上述のマスキングされたTGF-β複合体の例としては、第1のポリペプチドが、N末端からC末端にかけて、下記を含むものが挙げられる：
(i)任意に、1つ以上のMODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列；
(ii)任意に、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列；
(iii)1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-β1又は2ポリペプチド配列；
(iv)1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型IL-2 MODと、(相互特異的結合配列を含まない)足場ポリペプチドと、TGF-βポリペプチド配列；
(v)1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列；
(vi)1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列；
(vii)1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型IL-2 MODと、(相互特異的結合配列を有する)足場ポリペプチドと、TGF-β3ポリペプチド配列。
各例では、第2のポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、第1のポリペプチドの相互特異的結合(二量体化配列)の相手側を含む足場ポリペプチドと、それに続く、第1のポリペプチドのTGF-βポリペプチドに結合しそれをマスキングするTβR(例えば、TβRII)ポリペプチドと、を含む。図1、構造FのようなマスキングされたTGF-β複合体の場合、TβR(例えば、TβRII)ポリペプチドは、N末端MOD(存在する場合)と第1のポリペプチドの足場との間に配置され得、第2のポリペプチドは、第1のポリペプチドの相互特異的結合(二量体化配列)の相手側を含み、そこにおいて、N末端又はC末端に、1つ以上の独立して選択されるwt.又は親和性低減変異型MOD(例えば、wt.又は変異形IL-2 MOD)が結合し得る。
本明細書に記載のマスキングされたTGF-β複合体のいずれかの例では、TGF-βポリペプチド配列のC77は、二量体化(例えば、C77S置換)を防止するために置換され得、TGF-βポリペプチドは、MOD及びTβRポリペプチド配列の修飾と共に、マスキングTβRポリペプチドに対する親和性を低下させるための変異(例えば、aas25、92、及び/又は94のうちの1つ、2つ、もしくは3つ全て)をさらに含み得る。マスキングされたTGF-β構築物に組み込まれ得る例示的なTβRポリペプチド配列としては、任意に、D118A置換を有するΔ14又はΔ25 TβRIIポリペプチドが挙げられる。MOD変異型については、そのポリペプチド配列と共に記載し、またTβRI、TβRII、及びTβRIIIの追加の修飾については上述したとおりである。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、配列番号148及び149に示される配列を有するポリペプチドを含む(図7Cを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、配列番号150及び151に示される配列を有するポリペプチドを含む(図7Dを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、配列番号152及び153に示される配列を有するポリペプチドを含む(図7Eを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、配列番号155及び156に示される配列を有するポリペプチドを含む(図7Fを参照)。一実施態様では、マスキングされたTGF-β複合体は、配列番号148及び160に示される配列を有するポリペプチドを含む(図7Jを参照)。
J.核酸
本開示は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。幾つかの例では、核酸は組換え発現ベクターであり、したがって、本開示は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。幾つかの例では、核酸は組換え発現ベクターであり、したがって、本開示は、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。下記の核酸の考察では、本開示のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体をコードする核酸を扱う。
一本鎖抗原提示ポリペプチドをコードする核酸
上述のように、マスキングされたTGF-β構築物は、一本鎖ポリペプチドを含む。したがって、本開示は、一本鎖のマスキングされたTGF-β構築物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一本鎖のマスキングされたTGF-β構築物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、転写制御エレメント(複数可)、例えばプロモーター、に作動可能に連結することができる。
マスキングされたTGF-β複合体をコードする核酸(複数可)
上記のように、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体は、少なくとも2つの別個のポリペプチド鎖(第1のポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖)を含む。本開示は、マスキングされたTGF-β複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の個々のポリペプチド鎖は、個々の核酸内でコードされる。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の全てのポリペプチド鎖は、単一の核酸内でコードされる。幾つかの例では、第1の核酸は、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、第2の核酸は、マスキングされたTGF-β複合体の第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。幾つかの例では、単一の核酸は、マスキングされたTGF-β複合体の第1及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、これは、作動可能に連結されて、単一のプロモーター又は2つの独立して選択されるプロモーターの転写制御下となり得る。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の個々のポリペプチド鎖をコードする個々の核酸
上記のように、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の個々のポリペプチド鎖は、個々の核酸内でコードされる。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の個々のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント、例えばプロモーター、例えば真核細胞において機能的であるプロモーター、などに作動可能に連結し、該プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターでもよい。
例えば、本開示は、第1の核酸及び第2の核酸を提供し、第1の核酸は、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、第2の核酸は、マスキングされたTGF-β複合体の第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。幾つかの例では、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメントに機能的に連結する。幾つかの例では、転写制御エレメントは、真核細胞において機能的であるプロモーターである。幾つかの例では、核酸は、個々の発現ベクター内に存在する。
幾つかの例では、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメントに機能的に連結する。幾つかの例では、転写制御エレメントは、真核細胞において機能的であるプロモーターである。幾つかの例では、核酸は、個々の発現ベクター内に存在する。
マスキングされたTGF-β複合体内に存在する2つ以上のポリペプチドをコードする核酸
本開示は、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを少なくともコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体は、第1、第2及び第3のポリペプチドを含み、その核酸は、第1、第2及び第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コードされた第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間に配置されたタンパク質分解性の切断可能な部位又はリンカーをコードする。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コードされた第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドの間に配置された内部リボソーム進入部位(IRES)をコードするヌクレオチドを含む。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β複合体の、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置されたリボソームスキッピングシグナル(又はシス作用性加水分解酵素エレメント、CHYSEL)をコードする配列を含む。
幾つかの例では、第1の核酸(例えば、組換え発現ベクター、mRNA、ウイルスRNAなど)は、マスキングされたTGF-β複合体の第1のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、第2の核酸(例えば、組換え発現ベクター、mRNA、ウイルスRNAなど)は、マスキングされたTGF-β複合体の第2のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。幾つかの例では、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列は各々、独立して選択される転写制御エレメント、例えばプロモーター、例えば真核細胞において機能的であるプロモーター、などに作動可能に連結し、プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。
組換え発現ベクター
本開示は、核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。幾つかの例では、組換え発現ベクターは非ウイルスベクターである。幾つかの例では、組換え発現ベクターは、ウイルス性構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス性構築物(例えば、米国特許第7,078,387号を参照されたい)、組換えアデノウイルス性構築物、組換えレンチウイルス性構築物、組換えレトロウイルス性構築物、非一体型ウイルスベクターなどである。
好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス(例えば、Liらの文献、Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543 2549,1994、Borrasらの文献、Gene Ther 6：515 524,1999、Li and Davidson,PNAS 92：7700 7704,1995、Sakamotoらの文献、H Gene Ther 5：1088 1097,1999、国際公開第WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、及びWO95/00655号を参照されたい)、アデノ随伴ウイルス(例えば、Aliらの文献、Hum Gene Ther 9：81 86,1998、Flanneryらの文献、PNAS 94：6916 6921,1997、Bennettらの文献、Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863,1997、Jomaryらの文献、Gene Ther 4：683 690,1997、Rollingらの文献、Hum Gene Ther 10：641 648,1999、Aliらの文献、Hum Mol Genet 5：591 594,1996、国際公開第WO93/09239号のSrivastavaの文献、Samulskiらの文献、J.Vir.(1989)63：3822-3828、Mendelsonらの文献、Virol.(1988)166：154-165、及びFlotteらの文献、PNAS(1993)90：10613-10617を参照されたい)、SV40、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshiらの文献、PNAS 94：10319 23,1997、Takahashiらの文献、J Virol 73：7812 7816,1999を参照されたい)に基づくウイルスベクター、レトロウイルスベクター(例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス)、並びに、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター)などが挙げられるが、これらに限定されない。多数の好適な発現ベクターが当業者に既知であり、その多くは市販されている。
利用される宿主/ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多くの好適な転写及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る(例えば、Bitterらの文献、(1987)Methods in Enzymology,153：516-544を参照されたい)。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えばプロモーターなど、の転写制御エレメントに作動可能に連結する。転写制御エレメントは、真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)又は原核細胞(例えば、細菌細胞又は古細菌細胞)のいずれかにおいて機能的であり得る。幾つかの例では、DNA標的化RNA及び/又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞と真核細胞の両方においてDNA標的化RNA及び/又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能とする複数の制御エレメントに機能的に連結する。
好適な真核細胞プロモーター(真核細胞において機能的なプロモーター)の非限定例としては、サイトメガロウイルス(CMV)前初期、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルス由来長末端反復配列(LTR)、及びマウスメタロチオネイン-Iからのものが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択については、充分に当業者レベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有していてもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含んでいてもよい。
マスキングされたTGF-β構築物及び複合体を発現する遺伝子改変宿主細胞の調製及びマスキングされたTGF-β構築物及び複合体の精製
本開示は、遺伝子組換え宿主細胞を提供し、その宿主細胞はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(複数可)で遺伝子組換えされている。
好適な宿主細胞としては、イースト菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞などの真核細胞が挙げられる。幾つかの例では、宿主細胞は哺乳動物細胞株の細胞である。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類(例えば、マウス、ラット)細胞株などが挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、HeLa細胞(例えば、American Type Culture Collection(ATCC)番号CCL-2)、CHO細胞(例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例えば、ATCC番号CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えば、ATCC番号CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC番号CCL10)、PC12細胞(ATCC番号CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC番号CRL1651)、RAT1細胞、マウスL細胞(ATCC番号CCLI.3)、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞(ATCC番号CRL1573)、HLHepG2細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。
遺伝子組換え宿主細胞を使用して、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を作製することができる。例えば、遺伝子組換え宿主細胞は、ポリペプチド(複数可)をコードするヌクレオチド配列を含む上記のような発現ベクター(複数可)を宿主細胞に導入し、それによって遺伝子組換え宿主細胞を作製することによって、マスキングされたTGF-β複合体、又は一本鎖のマスキングされたTGF-β構築物を作製するために使用することができる。宿主細胞において、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を構成的に発現させることも、又は発現を駆動するプロモーター(例えば、CMVプロモーター及びテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるテトラサイクリン耐性オペロン)を用いて誘導可能な誘導物質への曝露に応答してそれを発現させることも、なし得る。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は細胞から得られ、又は、ポリペプチド(複数可)がシグナル配列の組み込みによって分泌経路を経過するよう設計されている場合には、細胞培養培地から得られる。このタンパク質は、例えば、(硫酸アンモニウム又はエタノールによる)沈殿、等電点電気泳動、及び1つ以上の種類のクロマトグラフィー、のうちの1つ以上を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって精製され得る。好適なクロマトグラフィー法としては、サイズベースのクロマトグラフィー分離(例えば、サイズ排除又はゲル浸透)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、(例えば、足場としての)免疫グロブリンポリペプチド配列を含む場合、プロテインA又はプロテインGを使用して、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をアフィニティ精製し得る。免疫グロブリンポリペプチドが存在しない場合、その複合体は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在するポリペプチドを認識する抗体を使用して、又は代替的に、mycエピトープ
Figure 2023500066000107
 などの親和性タグ、「HIS」タグ(二価金属イオン樹脂結合用)、もしくは「FLAG」タグを組み込むことによって、アフィニティ精製され得る。前述の方法のいずれかと組み合わせ得る精製及び/又は濃縮ステップでは、実質的に異なる分子量を有する混入物質を除去するために、及び/又は精製されたタンパク質を濃縮するために、使用され得る、サイズ限定の半透過性膜(例えば、透析膜又は圧力セル)が用いられる。
一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞)に導入された核酸配列から発現され、その分泌経路を標的として、その細胞からその培養培地(例えば、無血清培地)に分泌される。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、親和性クロマトグラフィーを単独で使用して、又はサイズベースの分離(例えば、サイズベースのクロマトグラフィー又は膜分離)と組み合わせて使用して、細胞培養培地から精製される。かかる実施態様の特定の例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、免疫グロブリン足場(例えば、IgGポリペプチド配列)を含み、その精製は、親和性クロマトグラフィー(例えば、プロテインA又はG)単独で、又はサイズベースの分離(サイズベースのクロマトグラフィー)と組み合わせて、実施される。
K.組成物
本開示は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を含む組成物(医薬組成物を含む)を提供する。本開示はまた、核酸又は組換え発現ベクターを含む組成物(医薬組成物を含む)を提供する。
1.マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を含む組成物
本開示の組成物は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体に加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など；可溶化剤；界面活性剤、例えば、Tween-20などの非イオン性界面活性剤など；プロテアーゼ阻害剤；グリセロールなどのうちの1つ以上を含み得る。
組成物は薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよく、その種類は当該技術分野において周知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”第19版(1995)又は最新版、Mack Publishing Co、A.Gennaro(2000)”Remington：The Science and Practice of Pharmacy”第20版、Lippincott,Williams,＆Wilkins、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Anselら編、第7版Lippincott,Williams,＆Wilkins、並びにHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbeら編、第3版Amer.Pharmaceutical Assocを含む、様々な刊行物において充分に説明されている。
医薬組成物は、(i)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、(ii)薬学的に許容される賦形剤と、を含むことができる。幾つかの例では、本医薬組成物は対象への投与に好適であり、例えば、滅菌されている。例えば、幾つかの実施態様では、本医薬組成物は、ヒト対象への投与に好適であり、例えば、組成物は滅菌されており、検出可能な発熱物質及び/又はその他の毒素を実質的に含まないか、又はかかる検出可能な発熱物質及び/又はその他の毒素が、適用可能な監督機関、例えばアメリカ食品医薬品局によって規定された許容限界内のレベルで存在する。
タンパク質組成物は、その他の成分、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カーボネート、などを含んでいてもよい。組成物は、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助剤、例えば、pH調整剤及びpH緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、塩酸塩、硫酸塩、溶媒和物(例えば、混合イオン性塩、水、有機物質)、水和物(例えば、水)など、を含有していてもよい。
例えば、組成物としては、水性液剤、粉末形状剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、懸濁剤、噴霧剤など、を挙げてもよい。組成物は、次に記載する様々な投与経路に応じて製剤化されてもよい。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が利用される(例えば、細胞培養系へ導入される)、又は注射剤として組織へと直接(例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、リンパ管内、及び/又は静脈内)投与される場合、製剤は、即時使用可能な剤形で、又は、非水性形態(例えば、再構成可能な保存安定性のある粉末)もしくは水性形態(例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤から構成される液体など)として提供され得る。タンパク質含有製剤はまた、投与後における対象タンパク質の血清中半減期を延長する形態で提供され得る。例えば、タンパク質は、コロイド状に調製されるリポソーム製剤として提供され得、あるいは、血清中半減期を延長するためのその他の従来技術を用いて提供され得る。例えば、Szokaらの文献、1980 Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、及び第4,837,028号に記載されるように、リポソームを調整するための様々な方法が利用可能である。製剤はまた、制御放出形態又は徐放形態で提供されてもよい。
幾つかの例では、組成物は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、(b)生理食塩水(例えば、0.9％NaCl)と、を含む。幾つかの例では、組成物は滅菌されている。幾つかの例では、組成物はヒト対象への投与に好適であり、例えば、組成物は滅菌されており、検出可能な発熱物質及び/又はその他の毒素を実質的に含まないか、又はかかる検出可能な発熱物質及び/又はその他の毒素が許容可能な限度内の量で存在する。それゆえ、本開示は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、(b)生理食塩水(例えば、0.9％NaCl)と、を含む組成物を提供し、該組成物は滅菌されており、検出可能な発熱物質及び/もしくはその他の毒素を実質的に含まないか、又はそのような検出可能な発熱物質及び/もしくはその他の毒素が許容範囲内の量で存在する。
非経口投与に好適な製剤のその他の例としては、等張性滅菌注射用液剤、酸化防止剤、静菌剤、製剤を目的のレシピエントの血液と等張とする溶質、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び、防腐剤、が挙げられる。例えば、本医薬組成物は、容器、例えば、注射器などの滅菌容器で提供されてもよい。製剤は、単回用量又は複数回用量の密閉容器、例えば、アンプル及びバイアルなどで提供されてもよく、使用の直前において、注射用の滅菌液体賦形剤(例えば、水)の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存されてもよい。即時注射用液剤及び即時注射用懸濁剤は、滅菌した散剤、顆粒剤及び錠剤から調製してもよい。
製剤中のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の濃度は、約0.1重量％未満(通常約2重量％、又は少なくとも約2重量％)から、20％～50重量％以上(例えば、0.1％～1％、1％～5％、5％～10％、10％～20％、又は20％～50重量％)であり、通常は、主に、液量、粘度、並びに、選択した特定の投与方法及び患者のニーズに従った患者ベースの要因に基づいて選択される。
本開示は、組成物(例えば、液体組成物)を含む容器を提供する。容器は、例えば、注射器、アンプルなどであってもよい。幾つかの例では、容器は滅菌されている。幾つかの例では、容器と組成物の両方は滅菌されている。
2.核酸又は組換え発現ベクターを含む組成物
本開示は、本開示の核酸又は組換え発現ベクターを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。多種多様な薬学的に許容される賦形剤は当該技術分野において周知であり、本明細書において詳細に考察される必要はない。薬学的に許容される賦形剤については、例えば、A.Gennaro(2000)”Remington：The Science and Practice of Pharmacy”第20版、Lippincott,Williams,＆ Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Anselら編、第7版Lippincott,Williams,＆ Wilkins；and Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbeら編、第3版Amer.Pharmaceutical Assocを含む、様々な刊行物において充分に説明されている。
本開示の組成物は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の核酸又は1つ以上の組換え発現ベクターと、(b)緩衝剤、界面活性剤、酸化防止剤、親水性ポリマー、デキストリン、キレート化剤、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、静菌剤、湿潤剤、及び、防腐剤のうちの1つ以上と、を含み得る。好適な緩衝剤としては、例えば、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス-トリス)、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’3-プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)、グリシルグリシン、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、ピペラジン-N,N’-ビス(2-エタン-スルホン酸)(PIPES)、重炭酸ナトリウム、3-(N-トリス(ヒドロキシメチル)-メチル-アミノ)-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸(TAPSO)、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-グリシン(トリシン)、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン(トリス)、などが挙げられるがこれらに限定されない。好適な塩としては、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4などが挙げられる。
医薬製剤は、約0.001％～約99％(重量/重量)(例えば、0.001～0.1、0.1～1.0、1.0～10、10～20、20～40、40～80、又は80～100％(重量/重量))の量で、核酸又は組換え発現ベクターを含み得る。次の製剤の記述において、「本核酸又は組換え発現ベクター」は、核酸又は組換え発現ベクターを含むものと理解するものとする。例えば、幾つかの例では、本製剤は、核酸又は組換え発現ベクターを含む。
本核酸又は組換え発現ベクターは、その他の化合物又は化合物の混合物と混合してもよく、それらに封入してもよく、それらにコンジュゲートするか又は別の方法で結合させてもよく、このような化合物としては、例えば、リポソーム又は受容体標的化分子が挙げられる。本核酸又は組換え発現ベクターは、取り込み、分散及び/又は吸収を補助する1種以上の成分と製剤内で組み合せてもよい。
本核酸又は組換え発現ベクター組成物は、限定するわけではないが例えば、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化してもよい。本核酸又は組換え発現ベクター組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、又は混合媒体中の懸濁剤として製剤化してもよい。水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を上昇させる物質をさらに含有していてもよく、それらとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び/又はデキストランが挙げられる。懸濁剤はまた安定化剤を含有していてもよい。
本核酸又は組換え発現ベクターを含む製剤はリポソーム製剤であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「リポソーム」とは、1つの球状二重層又は複数の球状二重層に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルのことを意味する。リポソームは、親油性物質と、送達される組成物を含有する水性の内側部とで形成された膜を有するユニラメラ又はマルチラメラベシクルである。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定した複合体を形成することができる、正に荷電したリポソームである。pH感受性の又は負に荷電しているリポソームは、DNAと複合体を形成するのではなくDNAを取り込むと考えられている。カチオン性リポソームと非カチオン性リポソームの両方は、本核酸又は組換え発現ベクターを送達するのに使用することができる。
リポソームとしてはまた「立体安定化」リポソームが挙げられ、本明細書で使用する場合、この用語は、1種以上の特殊な脂質を含むリポソームのことを意味し、それら特殊な脂質をリポソームに組み込むと、このような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して向上した循環寿命がもたらされる。立体安定化リポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、1種以上の糖脂質を含むか、又は、ポリエチレングリコール(PEG)成分などの1種以上の親水性ポリマーで誘導体化された、立体安定化リポソームである。リポソーム及びその使用については、米国特許第6,287,860号においてさらに記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
製剤及び組成物はまた、界面活性剤を含み得る。医薬品製品、製剤及びエマルション剤における界面活性剤の使用については、当該技術分野において周知である。界面活性剤及びその使用については、米国特許第6,287,860号においてさらに記載されている。
一実施態様では、核酸の効率的な送達を達成するために、様々な浸透促進剤が含まれている。細胞膜を通る非親油性薬物の拡散補助に加え、浸透促進剤はまた、親油性薬物の浸透性を向上させる。浸透促進剤は、5つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート性非界面活性剤、のうちの1つに属するように分類され得る。浸透促進剤及びその使用については、米国特許第6,287,860号においてさらに記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
経口投与用の組成物及び製剤としては、散剤もしくは顆粒剤、マイクロ微粒子剤、ナノ微粒子剤、水もしくは水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ剤、錠剤、又は、ミニ錠剤、が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。好適な経口製剤としては、1種以上の浸透促進界面活性剤及びキレート化剤と共に本アンチセンス核酸を投与する経口製剤が挙げられる。好適な界面活性剤としては、脂肪酸及び/又はエステル又はその塩、胆汁酸及び/又はその塩が挙げられるがこれらに限定されない。好適な胆汁酸/塩及び脂肪酸並びにその使用については、米国特許第6,287,860号においてさらに記載されている。浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩も好適である。例示的な好適な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、及び、UDCA、のナトリウム塩のものである。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられるがこれらに限定されない。好適な浸透促進剤としてはまた、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、トリエタノールアミン、N,N-ジメチルアセトアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、2-ピロリドン及びその誘導体、テトラヒドロフルフリルアルコール、並びに、アゾン(商標)も挙げられる。
L.製剤
好適な製剤については上述したとおりであるが、ここでは組成物は薬学的に許容される等級である(例えば、組成物は薬学的に許容される賦形剤(複数可)及び活性分子を含む)。幾つかの例では、好適な製剤は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、(b)薬学的に許容される賦形剤と、を含む。幾つかの例では、好適な製剤は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、(b)薬学的に許容される賦形剤と、を含み、幾つかの例では、該核酸はmRNAである。幾つかの例では、好適な製剤は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸と、(b)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸と、(c)薬学的に許容される賦形剤と、を含む。幾つかの例では、好適な製剤は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと、(b)薬学的に許容される賦形剤と、を含む。幾つかの例では、好適な製剤は、(a)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の組換え発現ベクターと、(b)マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の組換え発現ベクターと、(c)薬学的に許容される賦形剤と、を含む。好適な薬学的に許容される賦形剤については上述したとおりである。
M.方法
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、T細胞の活性を調節するのに有用である。それゆえ、本開示は、T細胞の活性化を調節する方法を提供し、該方法は、広義には、標的T細胞をマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含む。
1.特定の免疫細胞種の生成、刺激、又は阻害を含む、免疫細胞活性の調節方法
本開示は、TβRI及びTβRIIを発現する細胞の活性を選択的に調節するための方法を提供し、該方法は、細胞(例えば、T細胞、B細胞、及びナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び顆粒球を含む先天性細胞)を、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含み、T細胞をマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることにより、エピトープ特異的T細胞の活性が選択的に調節される。幾つかの例では、接触はインビトロで生じる。幾つかの例では、接触はインビボで生じる。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を作用させる細胞の活性(例えば、古典的経路、非古典的経路、及び/又は下流の遺伝子発現を通じたシグナル伝達)は、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞、対象)と比較して評価され得る。
本開示は、T細胞又はB細胞(例えば、病原性自己反応性T細胞及び/又は病原性自己反応性B細胞)の数及び/又は活性を低下させる方法を提供し、該方法は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与することを含む。幾つかの例では、該方法は、制御性T細胞(Treg)の数及び/又は活性を増加させ、T細胞又はB細胞(例えば、1つ以上の自己反応性T細胞及び/又は1つ以上の自己反応性B細胞)の数及び/又は活性を減少させるものであり、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を作用させたT細胞又はB細胞の数及び/又は活性の減少は、TGF-β又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞、対象)と比較して評価される。
1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の独立して選択される野生型又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与は、様々な細胞集団に直接的又は間接的に影響を及ぼし得る。例として、任意に1つ以上の野生型又は変異型IL-2 MODを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与は、FoxP3＋Treg細胞の発達及び/又は生存を(インビボ又はインビトロにおいて)直接刺激し得る。TGF-β/IL-2複合体が様々な免疫細胞に与えるいずれかの直接作用に加えて、その結果のTreg細胞は、例えば、T細胞活性化の誘導及び/又はT細胞応答のエフェクター段階を遮断し、B細胞活性化を抑制し、及び/又はナチュラルキラー細胞の分化及び/又は増殖を阻害することによって、免疫応答を抑制することができる。
a.Treg
(i)tTreg、pTreg、iTreg、及びIL-2を含むTGF-β構築物又は複合体
本開示は、胸腺由来Treg(tTreg)及び/又は末梢Treg(pTreg)(Tregは、自己反応性T細胞及びB細胞を抑制することができるCD4＋、FoxP3＋、及びCD25＋細胞である)の発達(例えば、増殖)及び/又は生存を促進するための方法を提供し、該方法は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋T細胞(例えば、ナイーブCD4＋T細胞)と(例えば、組織培養中、血液中、又は創傷などの特定の組織位置において)接触させることを含む。該方法で投与するか又は接触させる1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含み得る。投与又は接触は、ビタミンD(例えば、ビタミンD3又はその類似体)、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)、及び/又はラパマイシン(例えば、ラパマイシン又はその機能的類似体、例えば、シロリムス、エベロリムス又はテムシロリムス)の哺乳動物標的(mTOR)の阻害剤の、共投与又は細胞との接触と併せて行い得る。したがって、本開示は、FoxpP3＋、FoxP3＋胸腺由来Treg(tTreg)及び/又はFoxP3＋末梢Treg(pTreg)である、誘導された制御性T細胞(iTreg)の発達及び/又は生存を促進するための方法を提供し、該方法は、任意でビタミンD又はその類似体、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)又はその類似体、及び/又はラパマイシン又はその類似体の存在下で、1つ以上のIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は、CD4＋T細胞(例えば、ナイーブCD4＋T細胞)と接触させることを含む。1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を用いた投与又は処置の効果は、ベースライン値(例えば、処置前の細胞数)に対して、又は、例えばTGF-β又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていないこと以外は同一である試験群などの、処置群(例えば、細胞又は対象)との比較において評価され得る。
本開示は、Tregの誘導/増殖を増加させ、Tregを維持し、及び/又はその機能を維持する方法を提供し、該方法は、T細胞(例えば、インビボ又はインビトロのCD4＋T細胞)を、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含む。該接触は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体との接触の前に測定されたベースライン値よりも、もしくは該接触をしていない以外は同一の対照群の細胞よりも、Tregの誘導/増殖を増加させ、Tregを維持し、及び/又はそれらの機能を維持する。本開示は、該方法で使用するための、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を包含し、提供する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、図1の構造A、B又はCに記載される構造組織を有する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、図1の構造D又はEに記載される構造組織を有する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上の(例えば、1つ、2つもしくは3つの)独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、図1の構造Fに記載される構造組織を有する。
本開示は、Tregの誘導/増殖を増加させ、Tregを維持し、及び/又はその機能を維持する方法を提供し、該方法は、T細胞(例えば、インビボ又はインビトロのCD4＋T細胞)を、1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ)の独立して選択されるPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含む。該接触は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体との接触の前に測定されたベースライン値よりも、もしくは該接触をしていない以外は同一の対照群の細胞よりも、Tregの誘導/増殖を増加させ、Tregを維持し、及び/又はそれらの機能を維持する。本開示は、該方法で使用するための、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を包含し、提供する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含む、図1の構造A、B、又はCに記載される構造組織を有する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のPD-L1 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含む、図1の構造D又はEに記載の構造組織を有する。一実施態様では、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、図1の構造Fに記載の構造組織を有する。独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、Treg(例えば、Tbet＋FoxP3＋iTreg細胞)の誘導/増殖、Tregの維持、及び/又はその機能の維持のために、IL-2(例えば、プロロイキン(アルデスロイキン)などの組換えIL-2など)と共に投与され得る。
本開示は、Tregの誘導/増殖を増加させ、Treg(例えば、Treg数)を維持し、及び/又はその機能を維持するための方法を提供し、該方法は、T細胞(例えば、インビボ又はインビトロのCD4＋細胞)を、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列、並びに1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含む。該接触は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体との接触の前に測定されたベースライン値よりも、もしくは該接触をしていない以外は同一の対照群の細胞よりも、Tregの誘導/増殖を増加させ、Tregを維持し、及び/又はそれらの機能を維持する。本開示は、該方法で使用するための、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2 MOD及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列と、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2ポリペプチド配列とを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を包含し、提供する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-2 MOD及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列と、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2ポリペプチド配列と、を含む、図1の構造A、B又はCに記載される構造組織を有する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-2 MOD及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列と、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2ポリペプチド配列と、を含む、図1の構造D又はEに記載される構造組織を有する。一実施態様では、マスキングされたTGF-β構築物は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-2 MOD及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列と、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2ポリペプチド配列と、を含む、図1の構造Fに記載される構造組織を有する。
T細胞(例えば、ナイーブCD4＋細胞)と、1つ以上の独立して選択されるIL-2 MOD及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を単独で、又は1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列との組み合わせで含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、を接触(例えば、インビボ又はインビトロ)させることにより、FoxP3及びTreg細胞の誘導(例えば、Tbet＋FoxP3＋iTreg細胞)の発現を増加させることができる。同様に、T細胞(例えば、ナイーブCD4＋細胞)と、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるPD-L1又はPDL2及び/又は変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列を単独で、又はIL-2(例えば、組換えヒトIL-2)との組み合わせで含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と、を接触(例えば、インビトロ又はインビボ)させることにより、FoxP3及びTreg細胞の誘導(例えば、Tbet＋FoxP3＋iTreg細胞)の発現を増加させることができる。IL-2と、PD-L1もしくはPD-L2のいずれかと、の両方が細胞に提供される場合、それとの接触により、Tregエンドリソソームアスパラギニルエンドペプチダーゼを低減し得る。TregにおけるFoxp3の不安定化の原因となるエンドリソソームアスパラギニルエンドペプチダーゼの低減は、Treg(例えば、iTreg)の維持をもたらし、それらの機能を維持する。例えば、Francsiscoらの文献、J Exp.Med.,206(13)3015-3029(2018)、及びStathopoulouらの文献、Immunity 49(2)：247-263(2018)を参照されたい。したがって、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体がIL-2と、PD-L1又はPD-L2と、の両方を含む場合、T細胞との接触により、Treg数の増加のみならず、それらの細胞の安定性及び機能の増加をもたらし得る。
IL-2 MOD(wt.及び/又は変異体)及び/又はPD-L1及び/又はPD-L2(wt.及び/又は変異体)ポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の接触が、インビボで生じる(又はインビトロで細胞を処理してそれを患者に投与する)場合、該接触は治療を構成するといえる。そのような治療は、個体又は個体集団におけるTreg細胞レベルの増加(例えば、組織内又は血液循環内でのiTreg総数又はその分画)をもたらす。この治療はまた、TregにおけるFoxP3のレベルの上昇をもたらし得る。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、wt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列(複数可)との組み合わせでwt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(複数可)を含む場合、PD-L1配列(複数可)を欠く以外は同一のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を用いて、個体又は個体集団(例えば、年齢、性別、体重、及び/又は疾患状態についてマッチングした)を処置したときに観察されるよりも長い期間、個体又は個体集団における増加したTreg細胞レベル(例えば、組織内又は血液循環内でのiTreg総数又はその分画)が維持される。wt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列との組み合わせで、wt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を用いた処置によっても、PD-L1ポリペプチド配列を欠く以外は同一のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を用いて処置を行ったときに観察されるレベルと比較して、TregにおけるFoxP3のレベルの持続的な上昇をもたらし得る。Wt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列との組み合わせで、wt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体での処置により、PD-L1 MODポリペプチド配列を欠く以外は同一のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体で処置した個体(又は個体群の平均)のT細胞におけるその酵素の活性と比較して、Treg細胞におけるエンドリソソームアスパラギニルエンドペプチドアーゼの活性の低下をもたらし得る。
T細胞を、wt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を単独で、又はwt.又は変異型PD-L1及び/又はPD-L2 MODポリペプチド配列との組み合わせで含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と(例えば、インビトロ、エクスビボ、又は個体を処置する操作などのインビボで)接触させるプロセスは、ビタミンD又はその類似体、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)又はその類似体、及び/又はラパマイシン又はその類似体などのmTOR阻害剤の存在下で、T細胞と接触させることをさらに含み得る。これらの薬剤の存在下での接触は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体との接触前に測定されたベースライン値よりも、又は該接触をしていない対照群(例えば、個体群)で測定された値よりも、Tregのレベル(例えば、Treg表現型を有する細胞の増殖又は維持に起因する個体又は組織中のTregの数又は相対数)を増加させ得る。個体の対照群が用いられる場合、個体は、年齢、性別、及び体重のうちの1つ以上についてマッチングされ得る。個体はまた、民族、アルコール摂取、及び/又は喫煙状態についてもマッチングされ得る。
本開示は、1以上の対象(例えば、個体又は患者)におけるTregの数を増加させるための方法を提供し、該方法は、1以上の対象に、1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)以上の独立して選択されるIL-2 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含み、かつ任意に、1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1もしくはPD-L2 MODポリペプチド配列を含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与することを含み、その投与により、1以上の対象におけるTregの数の増加がもたらされる。例えば、(例えば、血液、又は組織、又は創傷などの位置における)Tregの平均数を、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の個体におけるTregの数と比較して、又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与しなかった対照群と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又は10倍を超えて増加させることができる。
本開示は、1つ以上の対象(例えば、個人又は患者)におけるTregの数を増加させるための方法を提供し、該方法は、1以上の対象に、任意でIL-2(例えば、プロロイキン(アルデスロイキン)などの組換えIL-2)と組み合わされる、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるwt.もしくは変異型PD-L1及び/又はPD-L2ポリペプチド配列を含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与することを含み、その投与により、1つ以上の対象におけるTregの数の増加がもたらされる。例えば、(例えば、血液、又は組織、又は創傷などの位置における)Tregの平均数は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の個体におけるTregの数と比較して、又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与しなかった対照群と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又は10倍を超えて増加させることができる。
b.Tヘルパー細胞
(i)Th9細胞、及びIL-4を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体
本開示は、胸腺由来Th9細胞(CD4及びCCR6の発現及びCCR4の欠如を特徴とする、CD4＋細胞)の発達及び/又は生存を促進するための方法を提供し、該方法は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋T細胞(例えば、ナイーブCD4＋T細胞又はTh2細胞)と接触させることを含む。該方法で投与するか又は接触させる1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-4MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-4MODポリペプチド配列を含み得る。したがって、本開示は、Th9細胞の発達及び/又は生存を促進するための方法を提供し、該方法は、1つ以上のIL-4MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-4MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、 (例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はナイーブT細胞と接触させることを含み、その投与により個体におけるTh9細胞の数が増加する。例えば、Th9細胞の数(例えば、組織培養、血液、又は特定の組織位置における)を、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又は10倍を超えて増加させることができる。
(ii)Th17細胞、及びIL-17を含むTGF-β構築物又は複合体
本開示は、Th17細胞(IL-17の産生によって特徴付けられるT細胞)の産生を刺激する方法を提供し、該方法は、少なくとも1つのIL-6又は変異型IL-6 MODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つのIL-6及び/又は変異型IL-6 MODポリペプチド)を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋T細胞(例えば、ナイーブCD4＋T細胞)と接触させることを含む。例えば、(例えば、組織培養、血液、又は特定の組織位置における)Th17細胞の数を、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前に存在する数と比較して、又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与しなかった対照群と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又は10倍を超えて増加させることができる。該方法は、腸粘膜バリア機能の維持に有用であり得、病原性細菌に対する(例えば、シトロバクターに対する)保護、及び好中球及び単球並びに好中球を動員して細胞外真菌(例えば、粘膜皮膚カンジダ)を攻撃及び破壊するために必要となり得る。
(iii)Tfh細胞、及びIL-21及びIL-23を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体
本開示は、T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞(CXCR5発現によって特徴付けられるT細胞)の産生を刺激するための方法を提供し、該方法は、IL-21 MODポリペプチド、IL-23 MODポリペプチド、IL-21の変異型又はIL-23 MODポリペプチドの変異型から独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のMODポリペプチドを含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はマクロファージに接触させることを含む。例えば、(例えば、組織培養、血液、又はリンパ濾胞などの特定の組織位置における)Tfh細胞の数を、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前に存在する数と比較して、又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与しなかった対照群と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又は10倍を超えて増加させることができる。該方法は、抗原特異的抗体応答の発達をサポートするのに有用であり得る。
c.Tエフェクター細胞、及びIL-7を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体
(i)IL-7及びCD8＋T細胞
本開示は、(例えば、IL-7R(例えば、IL-7Rα)の胸腺細胞における発現を促進することによって)CD4＋及び/又はCD8＋T細胞の発達(系統への参加)及び/又は生存を促進する方法を提供し、該方法は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は前駆体CD4＋CD8＋T細胞と接触させることを含む。該方法で投与するか又は接触させる1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-7 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列を含み得る。したがって、本開示は、(例えば、インターロイキン(IL)-7Rαの胸腺細胞における発現を促進することによって)CD4＋又はCD8＋系統へ参加する細胞の発達を促進するための方法を提供し、該方法は、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-7 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋及び/又はCD8＋細胞前駆体(例えば、CD4＋8＋T細胞)と接触させることを含み、CD4＋及び/又はCD8＋細胞の発達及び/又は生存は、末梢血液又は特定の組織(例えば、胸腺)におけるCD4＋及び/又はCD8＋細胞数をモニターすることによって評価される。
(i)IL-7及び低親和性T細胞
本開示は、MHCタンパク質によって提示されるペプチドに対して低い親和性を有するT細胞受容体を有するCD4＋T細胞及びCD8＋T細胞のIL-7依存的生存を促進することによって、末梢T細胞の恒常性を調節する方法を提供する。例えば、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236及びその引用を参照されたい。該方法は、胸腺細胞のIL-7Rα発現を制御することによって操作し得る。IL-7依存的生存を促進する方法は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与することを含む。投与される1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-7 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列を含み得る。したがって、本開示は、末梢T細胞恒常性を調節するための方法を提供し、該方法は、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-7 MODポリペプチド配列及び/又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与することを含み、TGF-β構築物又は複合体の投与は、投与前のそれらの細胞の数と比較して、対象又は対象群における末梢CD4＋T細胞及びCD8＋T細胞の数を増加させる。
d.マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及びIL-10
本開示は、(例えば、喘息及びアレルギー性炎症を抑制するために)2型先天性リンパ球(ILC2細胞)(例えば、Rajasらの文献、J Allergy Clin Immunol,139(5)：1468(2017)、及びOgasawaraらの文献、J Allergy Clin Immunol,141(3)：1147-1151(2018)を参照されたい)を阻害するための方法を提供し、該方法では、少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)の独立して選択される野生型又は変異型IL-10 MODポリペプチド(例えば、1つ、2つ、もしくは3つの独立して選択されるMOD)を含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を用いる。変異型IL-10 MODポリペプチドは、単量体IL-10ポリペプチドの全部又は一部(例えば、上記のヘリックスDとEとの間のヒンジ領域内への5～7aaの挿入で置換された配列番号50又は51の全部又は一部)を含み得る。例えば、Josephsonらの文献、J.Biol.Chem.275：13552-13557(2000)を参照されたい。このII型先天性リンパ球の阻害方法は、独立して選択される野生型又は変異型IL-10 MODのうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)を任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はII型先天性リンパ球に接触させることを含む。ILC2細胞の阻害は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前の2型サイトカインの量、又はTGF-β又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない対照群(例えば、対象からの細胞、組織、又は体液中)の2型サイトカインの量のいずれかと比較した、ILC2細胞による2型サイトカイン(例えば、IL-3及び/又はIL-13)発現の抑制によって評価される。
TGF-β及びIL-10は、消化管の恒常性を維持する上で重要な役割を果たし、IL-10はTGF-βの上流及び下流の両方で機能する。例えば、IL-10は、粘膜固有層T細胞によるTGF-βの発現及び分泌を誘導することができ、またそれはTGF-bと協働して作用しTreg細胞の分化を促進する。したがって、本開示は、対象における腸内の恒常性及びTreg細胞の分化を維持するための方法を提供し、該方法は、wt.又は変異型IL-10配列、又はIL-2及びIL-10aa配列の両方を含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与することを含み、そのいずれか又は両方は、独立して選択されるwt.又は変異型配列であり得る。例えば、Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2017；9：a022236及びその引用を参照されたい。
幾つかの例では、例えば忍容性を誘導することが望ましい場合などでは、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在する、少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つ、もしくは3つの独立して選択されるMOD)は、少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)の独立して選択される野生型又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含む。例えば、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 306：G575-G581(2014)、及びLevingsらの文献、Int Arch Allergy Immunol.129(4)：263-76(2002)を参照されたい。変異型IL-10 MODポリペプチドは、単量体IL-10ポリペプチドの全部又は一部(例えば、ヘリックスDとEとの間のヒンジ領域内への5～7aaの挿入で置換された配列番号50又は51の全部又は一部)を含むことで、上述のように活性な単量体IL-10を形成し得る。それゆえ、本開示は、wt.又は変異型IL-10配列、又はIL-2及びIL-10ポリペプチド配列の両方を含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与することを含む、対象における忍容性を誘導する方法を提供する。代替的に、wt.又は変異型IL-10(例えば、単量体IL-10)配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、wt.又は変異型IL-2ポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と共に(同時に又は組み合わせて)投与されてもよい。
e.マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及びFasL
幾つかの例では、例えば忍容性を誘導するか又はTエフェクター細胞を抑制することが望ましい場合などでは、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に存在する少なくとも1つのMODポリペプチド(例えば、1つ、2つもしくは3つの独立して選択されるMOD)は、Fasリガンド(FasL)ポリペプチド、又はFasリガンドポリペプチドの変異型を含み得る。(例えば、Qiuらの文献、J Surg Res.218：180-193(2017)を参照されたい。上で考察されたように、IL-10又は変異型IL-10ポリペプチドはまた、忍容性を誘導するために利用され得る。
したがって、本開示は、wt.又は変異型FasLポリペプチド配列を、又はIL-2及びFasLポリペプチド配列の両方を、含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与することを含む、対象における忍容性の誘導又はTエフェクター細胞の抑制方法を提供する。本開示はまた、忍容性の誘導を提供する。代替的に、wt.又は変異型FasL配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、wt.又は変異型IL-2ポリペプチド配列を含む1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と(同時に又は組み合わせて)投与され得る。
f.他の細胞を調節するための方法
本開示は、インバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞の発達及び/又は生存をサポートする方法を提供し、該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与するか、又はiNKT細胞前駆細胞と接触させることを含む。その場合、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較して、発達及び/又は生存が評価される。
本開示は、マクロファージ(例えば、Toll様受容体リガンド又はサイトカイン刺激によって活性化されたマクロファージ)を阻害する方法を提供し、該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はマクロファージと接触させることを含み、その阻害は、TGF-β及び/又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較して評価される。マクロファージ活性化の活性化及び阻害は、活性化されたマクロファージによる一酸化窒素産生などの当該技術分野において既知の方法によって評価される。
TGF-βは単球によるH2O2産生生成を阻害し、フィブロネクチン付着を阻害する単球の化学誘引剤である。例えば、Warwick Davies及びColeの文献、J Immunol.155(6)：3186-3193(1995)を参照されたい。したがって、本開示は、単球(例えば、休止期の単球)を刺激して遊走を行なわせるための方法を提供し、該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は単球と接触させることを含み、その刺激は、TGF-β及び/又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較して評価される。単球活性化の活性化及び阻害は、H2O2産生及びフィブロネクチン付着の測定を含む、当該技術分野において既知の方法によって評価される。(例えば、単球刺激に応答した)H2O2産生は、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、10倍、20倍、30倍、又はそれを超えて)減少し得る。
本開示は、末梢血単球及び/又はマクロファージの遊走(例えば、タイムラプス顕微鏡法又はボイデンチャンバアッセイによって評価される)を、組織(例えば、傷害又は炎症を起こした組織)内へ変化させる、及び/又はマクロファージ及び/又は単球付着特性を向上させるための方法を提供し、該方法は、1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の独立して選択される野生型又は変異型MODを任意に含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は骨髄系細胞と接触させることを含み、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較して、遊走及び/又は付着特性が評価される。例えば、幾つかの例では、TGF-β(例えば、TGF-β1)との細胞又は組織の短期的な相互作用は、マクロファージ又は単球の遊走を刺激したが、長期的な曝露はそれらの遊走を低下させた。例えば、Kimらの文献、Blood,108：1821-1829(2006)、及びXuらの文献、Bone Research,6(論文2)(2018)を参照されたい。
本開示は、化学走性(例えば、タイムラプス顕微鏡法又はボイデンチャンバアッセイによって評価される)及び/又は肥満細胞の付着特性を増強する方法を提供し、該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを任意に含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は肥満細胞と接触させることを含み、化学走性及び/又は付着特性は、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較して評価される。
本開示は、自己反応性及び/又は炎症性T細胞(例えば、Th1、Th2、Th17及び/又はTh22細胞)を調節する方法を包含し、提供する。該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型及び/又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又は(例えば、インビボ又はインビトロで)T細胞と接触させることを含む。任意に1つ以上の野生型及び/又は変異型MODを含むTGF-β構築物又は複合体は、かかる炎症性T細胞と直接相互作用し得、及び/又は、放出された分子(例えば、サイトカイン/インターロイキン)を介して、又は他の細胞集団を介して、かかる細胞に間接的に影響を与え得る。例として、1つ以上の野生型及び/又は変異型IL-2 MOD(TGF-β/IL-2複合体)を任意に含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与は、FoxP3＋Treg細胞の発達及び/又は生存を(インビトロ又はインビボで)直接的に刺激し得る。TGF-β/IL-2複合体とFoxP3＋Treg細胞をもたらす細胞との直接的な相互作用に加えて、得られるTregは、例えば、T細胞活性化の誘導及び/又はT細胞応答のエフェクター段階を遮断し、B細胞活性化を抑制し、ナチュラルキラー細胞の分化及び/又は増殖を阻害することによって、他の細胞に影響を与え得る。Tregによるそのような作用は、限定されないが、IL-10、TGF-βの産生、及び/又は、Treg上のCTLA-4の、抗原提示細胞上のB7(B7-1又はCD80/B7-2又はCD86)への結合により、これらの細胞のCD28共刺激と競合させるなど、様々な手段を通じて行われ得る。したがって、本開示は、Th1、Th2、Th17、Th22などの系統に属する自己反応性T細胞及び炎症性T細胞を調節する方法を包含し、提供するものである。自己反応性細胞は、バイスタンダーT細胞(例えば、バイスタンダーTh1、Th2、及び/又はTh17細胞)の集団であり得る。例えば、セリアック病では、調節されるT細胞として、IL-17A、IL-17F、IL-21、及び/又はIL-22の発現、分泌、及び/又は粘膜組織レベルの低下をもたらす、腸粘膜内で見出されるTh17細胞が挙げられる。
本開示は、CD4＋Th1細胞の作用を阻害し(例えば、インターフェロンγ及び/又はTNFの分泌を低下させ)、それによってマクロファージを活性化する(例えば、肉芽腫性炎症を含む炎症性疾患に含まれる遅延型過敏症「DTH」における、食作用及びマクロファージの関与)方法を包含し、提供する。該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋Th1細胞と接触させることを含み、Th1細胞作用の阻害は、TGF-β及び/又は1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較した、インターフェロンγ及び/又はTNFの産生によって評価される。
本開示は、CD4＋Th2細胞(例えば、低下したIgE、肥満細胞、及び好酸球媒介反応)の作用(活性化)を阻害する方法を包含し、提供するものであり、該方法は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、もしくは3つ以上)の野生型又は変異型MODを任意に含む、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を(例えば、それを必要とする対象に)投与すること、又はCD4＋Th2細胞と接触させることを含み、Th2細胞作用の阻害(Th2細胞活性化の程度)は、TGF-β及び/又はTGF-βの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に曝露されていない処置群(例えば、細胞又は対象)と比較した、IL-4、IL-5、及び/又はIL-13の産生によって評価される。
2.共刺激ポリペプチドを選択的に送達する方法
本開示は、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を使用して、1つ以上(例えば、1つ、2つ以上、3つ以上、もしくは4つ以上)の独立して選択されるMOD及び/又は変異型MODと共に、マスキングされた形態でTGF-βを送達する方法を提供する。TβRを含む細胞へのMODの送達は、TβRを含有するか又は含有しない細胞におけるMODとその受容体(co-MOD)との相互作用のために複雑であり得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、TβRに対するマスキングされたTGF-βポリペプチドの有効な親和性に対する、MODの数及びそれらの対応するco-MODに対する親和性を変化させることによって、細胞を標的とし得る。低い親和性の変異型MODをマスキングされたTGF-β構築物又は複合体に組み込むことにより、TGF-βポリペプチドが結合相互作用に対して、より強く影響を及ぼすか、又はそれを支配することが可能になる。TβRに対して、低い親和性の変異型MOD(それらは依然としてそれらのco-MODを刺激することができる)及び比較的強い親和性のTGF-βポリペプチド、の組み合わせを組み込むことにより、1つ以上のMOD(複数可)を含むマスキングされたTGF-β構築物及び複合体は、TβR及び対応するco-MOD(複数可)の両方を有する細胞との結合へ偏らせる(又は選択させる)ことが可能となる。このような組み合わせはまた、TβRを含まないco-MODを担持する細胞のオフターゲット刺激を回避する。
本開示は、TGF-βポリペプチドと、少なくとも1つの変異型MODとの両方を選択的に、TβR(例えば、TβRII及び/又はTβRI)と、少なくとも1つの変異型MODに対応するco-MODとをそれらの表面膜上に発現する標的細胞に選択的に(例えば、インビトロ又はインビボ)送達することを提供する。この文脈で使用される場合、「選択的送達」とは、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体のMODが、TβRを含まない細胞、すなわち「非標的細胞」よりも、TβR(例えば、TβRII及び/又はTβRI)を発現する細胞、すなわち、「標的細胞」に対して数多く、co-MODに送達されることを意味する。
前述に鑑みて、本開示は、TGF-βポリペプチド及び少なくとも1つの変異型MODの両方を、その表面膜上にTβR(例えば、TβRII及び/又はTβRI)及び少なくとも1つの変異型MODに対応するco-MODを発現する標的細胞に選択的に(例えば、インビトロ又はインビボ)送達することを提供し、該方法は、細胞集団を、細胞上に存在するTβRを飽和させるのに不充分な(例えば、細胞上に存在するTβRの70％、60％、50％、40％又は30％未満を占める)、少なくとも1つの親和性低減変異型MODを含む一定量のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させ、少なくとも1つの親和性低減変異型MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、(例えば、結合するのに充分な時間)該細胞と相互作用させることを含む。このような方法では、(i)少なくとも1つの親和性低減変異型MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体によって結合された、TβR及びco-MODの両方を発現する細胞の数を、少なくとも1つの親和性低減変異型MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体によって結合されたco-MODを発現する細胞の数で割った比率は、(ii)wt.MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体によって結合された、TβR及びco-MODの両方を発現する細胞の数を、wt.MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体によって結合されたco-MODを発現する細胞の数で割った比率よりも大きい。
本開示は、標的細胞を、任意に、ビタミンD、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)、及び/又はラパマイシンの存在下で、少なくとも1つのwt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体と接触させることを含む、マスキングされたTGF-βポリペプチド及び少なくとも1つのwt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチドの両方の、標的細胞への(例えば、インビトロ又はインビボ)送達を提供する。一例では、少なくとも1つのwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-βポリペプチドは、ビタミンD、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)、及び/又はラパマイシンのうちのいずれか1つ、いずれか2つ、又は3つ全ての存在下で送達される。
本開示は、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-6 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な選択的送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-7 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な選択的送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-15 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-21 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型IL-23 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/変異型PD-L1 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
本開示は、両方共、少なくとも1つの野生型及び/又は変異型FasL MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の、(例えば、インビトロ又はインビボでの)標的細胞への送達、及び、任意で選択的な送達を提供する。
3.治療又は予防方法
本開示は治療及び予防方法を提供し、該方法は、標的の細胞集団の活性を選択的に調節すること及び/又は個体を治療することに有効な、有効量のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸もしくは発現ベクターを、個体由来の標的細胞集団に(例えば、インビトロ又はインビボ)接触させること、及び/又は、個体に投与することを含み得る。標的細胞を個体から分離して(すなわち、インビトロで)処置する場合、細胞又はその子孫の全部又は一部を個体に投与し得る。幾つかの例では、本治療又は予防方法は、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の組換え発現ベクターを、それを必要とする個体に投与することを含む。幾つかの例では、本治療又は予防方法は、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上のmRNA分子を、それを必要とする個体に投与することを含む。幾つかの例では、本治療又は予防方法は、それを必要とする個体からの標的集団の細胞を、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)と(すなわち、インビトロ)接触させ、それによって接触させた標的集団の細胞を形成することを含み、該方法は、接触させた標的集団の細胞(及び/又はその子孫)の全部又は一部を個体に投与することをさらに含む。幾つかの例では、治療又は予防方法は、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、又は有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を含む薬学的に許容される組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を含む組成物で治療する(例えば、症状を治癒及び/又は改善する)ことができる症状としては、不充分な数のTreg細胞、又は不充分な活性のTreg細胞と関連する症状、自己免疫疾患又は障害、アレルギー反応(複数可)、創傷(例えば、皮膚及び/又は粘膜創傷)、及び/又は火傷が挙げられる。加えて、臓器移植を受ける個体もまた、治療の恩恵を受け得る。
FoxP3＋Treg細胞の数が不充分な、又はFoxP3＋Treg細胞の活性が不充分な個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、PSM-4033-4039を含む。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-2又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む。IL-2又は変異型IL-2 MODの有無に拘わらず、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を、ビタミンD(例えば、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3又は1α,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール)又はビタミンD類似体、ラパマイシン、及び/又はレチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)のうちのいずれか1つ以上の投与前に、投与中(同時投与もしくは併用投与)に、又は投与後に、投与し得る。
本治療又は予防方法は、それを必要とする自己免疫疾患又は障害を有する個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つもしくは3つ)の独立して選択されるIL-2又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、PSM-4033-4039)を含む。第2の例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列を含む。1つの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、少なくとも1つの独立して選択されるIL-2又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列と、少なくとも1つの独立して選択されるIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列とを含む。第2の例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列を含む。本開示の方法で治療することができる自己免疫疾患としては、限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性不妊症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、水疱性類天疱瘡、クローン病、グッドパスチュア症候群、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症(MG)、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、硬皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、脈管炎及び白斑が挙げられる。一実施態様では、本開示の方法で治療することができる自己免疫疾患は、T1Dである。一実施態様では、本開示の方法で治療することができる自己免疫疾患は、セリアック病である。T1D及び/又はセリアック病はまた、本開示の方法による治療の対象となる自己免疫疾患からも除外され得る。
Th17細胞の欠損を有する個体(例えば、腸内の細菌及び/又は真菌感染症に充分に応答することができない個体)に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)の独立して選択されるIL-6又は変異型IL-6 MODポリペプチド配列を含む。治療又は予防方法は、腸内の細菌及び/又は真菌感染症に充分に応答することができない個体に、有効量の、1つ以上の独立して選択されるIL-6及び/又は変異型IL-6ポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又は1つ以上の独立して選択されるIL-6及び/又は変異型IL-6ポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
Th9細胞の欠損を有する個体(例えば、蠕虫感染症に充分に応答することができない個体)に、有効量の、蠕虫感染症に応答するのに充分なマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-4又は変異型IL-4 MODポリペプチド配列を含む。治療又は予防方法は、蠕虫感染症に充分に応答することができない個体に、有効量の、1つ以上の独立して選択されるIL-4及び/又は変異型IL-4ポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又は1つ以上の独立して選択されるIL-4及び/又は変異型IL-4ポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
Tfh細胞の欠損を有する個体(例えば、高親和性抗体を、又は充分な量の高親和性抗体を産生することができない個体)に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又は高親和性抗体の産生を増加させるのに充分なマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-21、IL-23、変異型IL-21、又は変異型IL-23 MODポリペプチド配列を含む。治療又は予防方法は、高親和性抗体を産生することができないか、又は高親和性抗体の量が不充分な個体に、有効量の、1つ以上の独立して選択されるIL-21、IL-23、変異型IL-21もしくは変異型IL-23 MODポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又は1つ以上の独立して選択されるIL-21、IL-23、変異型IL-21もしくは変異型IL-23 MODポリペプチド配列を含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
対照群と比較して過剰なTh1細胞活性を有する個体(例えば、標的組織又は循環中の活性化マクロファージのレベルの上昇及び/又はインターフェロンγ「IFN-γ」のレベルの上昇を有する個体)に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。治療又は予防方法は、活性化されたマクロファージのレベルの上昇及び/又はインターフェロンガンマ「IFN-γ」のレベルの上昇(例えば、循環中又は標的組織内で)を有する個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含みうる。
対照群と比較して過剰なTh2細胞活性を有する個体(例えば、活性化された肥満細胞のレベルの上昇、及び/又は循環もしくは組織局在化するIgEのレベルの上昇を有する個体)に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。治療又は予防方法は、活性化された肥満細胞のレベルが上昇した、及び/又はIgE(循環もしくは組織局在化)のレベルが上昇した個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
自己反応性T細胞(又は高親和性T細胞)のT細胞受容体駆動活性化を有する個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。治療又は予防方法は、自己反応性T細胞を有する個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を、(例えば、胸腺細胞IL-7Ra発現の制御による)低親和性CD4＋及び/又はCD8＋T細胞のIL-7依存性の生存を促進することが望ましい個体に投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-7又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列を含む。治療又は予防方法は、低親和性CD4＋及び/又はCD8＋T細胞のレベルを充分に維持することができない個体に、有効量の、1つ以上の独立して選択されるIL-7及び/又は変異型IL-7ポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、又は1つ以上の独立して選択されるIL-7及び/又は変異型IL-7ポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を、投与することを含み得る。
有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を、特定の細胞(例えば、がん細胞、又はがん抗原15-3、27-29、125、がん胚抗原、α-フェトプロテイン及び/又はβ2-マイクログロブリンなどの特定のマーカーを有するがん細胞)のアポトーシスを促進することが望ましい個体に投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のwt.Fasリガンド又は変異型FasリガンドMODポリペプチド配列を含む。
iTreg(CD4＋FoxP3＋)細胞を誘導することが望ましい個体(例えば、エフェクターT(Teff)細胞を能動的に抑制するために末梢寛容を誘導することが望ましい、及び/又は免疫媒介性組織損傷を阻害することが望ましい個体)に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のwt.又は変異型PD-L1 MODポリペプチド配列を含む。別の例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のwt.及び/又は変異型PD-L1 MODポリペプチド配列と、1つ以上のwt.及び/又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列とを含む。一実施態様において、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、(i)1つの独立して選択されるwt.又は変異型PD-L1 MODポリペプチド配列、及び(ii)1つのwt.又は変異型IL-2 MOD配列を含む。例えば、Franciscoらの文献、J.Exp.Med.,206(13)：3015-3029(2009)を参照されたい。
II型先天性リンパ球(ILC2細胞)を阻害する(例えば、喘息、アレルギー反応、及び/又はアレルギー性炎症を抑制する)ことが望ましい個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列を含む。IL-10又は変異型IL-10 MODの有無に拘わらず、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)は、グルコココルチコイド(例えば、デキサメタゾン、プレドニゾンなど)、抗ヒスタミン剤(例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミンなど)、及び/又はエピネフリンの投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に投与され得る。
アレルギー、アレルギー性炎症、及び/又はIgEレベルの上昇(循環又は組織局在化)を有する個体に、有効量の、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、治療又は予防方法。治療又は予防方法は、有効量の、独立して選択されるIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を、IgEレベルの上昇(循環又は組織局在化)を有する個体に投与することを含み得る。IL-10又は変異型IL-10 MODの有無に拘わらず、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)は、グルコココルチコイド(例えば、デキサメタゾン、プレドニゾンなど)、抗ヒスタミン剤(例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミンなど)、及び/又はエピネフリンの投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に投与され得る。TGF-β及びIL-10は、肥満細胞を活性化する高親和性IgE受容体(Fc1RI)の発現を抑制する働きをし、IL-10はさらに、過剰な肥満細胞活性化及び慢性炎症の発生を防止する働きをする。例えば、Kennedyらの文献、Journal of Immunology,180(5)2848-2854(2008)を参照されたい。
多発性硬化症と診断されるか、又は多発性硬化症を有する個体に、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む、予防方法。一例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、独立して選択される1つ以上(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列を含む。
少なくとも1つの皮膚又は粘膜熱傷を有する個体を治療する方法であって、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を個体に投与することを含む。一例では、該方法は、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含む、有効量のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。火傷は、第I度、第II度、又は第III度の火傷であり得る。
少なくとも1つの皮膚又は粘膜の創傷(表皮又は粘膜の擦り傷、剥離創、切開、裂傷、又は刺し傷)を有する個体を治療する方法であって、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を個体に投与して、創傷閉鎖を加速する(閉鎖までの時間を短縮する)、治癒時間を短縮する、又は未治療の創傷と比較して瘢痕形成を低減することを含む。一例では、該方法は、有効量の、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、IL-10 MODポリペプチドの有無にかかわらず、TGF-β1ポリペプチドを含む場合、該方法は、下記のうちの1つ以上をさらに含み得る：損傷部位への炎症性細胞の動員；フィブロネクチン、コラーゲン(例えば、I型及び/又はIII型)、及び/又はVEGFなどの細胞外マトリックスタンパク質の発現；創傷閉鎖を可能にするための線維芽細胞の収縮刺激；β1、α5、αv、及びβ5などのインテグリンの創傷部位での発現；並びに角質細胞の遊走。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、IL-10 MODポリペプチドの有無にかかわらず、TGF-β2ポリペプチドを含む場合、該方法は、下記のうちの1つ以上をさらに含み得る：循環及び創傷辺縁から創傷部位への線維芽細胞及び免疫細胞の両方の動員；コラーゲン(例えば、I型及び/又はIII型)の発現；及びフィブロネクチンの発現。例えば、Pakyariらの文献、Adv Wound Care,2(5)：215-224(2013)を参照されたい。このような方法では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、創傷に直接適用されるか、又は創傷に注入され得る。
少なくとも1つの皮膚又は粘膜の創傷(表皮又は粘膜の擦り傷、剥離創、切開、裂傷、又は刺し傷)を有する個体を治療する方法であって、有効量の、マスキングされたTGF-β(例えば、TGF-β3)構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β3構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を個体に投与して、未治療の創傷と比較して瘢痕形成を低減することを含む。一例では、該方法は、有効量の、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、もしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β(例えば、TGF-β3)構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β(例えば、TGF-β3)構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。このような方法では、マスキングされたTGF-β(例えば、TGF-β3)構築物又は複合体を、創傷に直接適用するか、又は創傷に注入し得る。理論に拘束されないが、TGF-β3は、MMP-9によるコラーゲン分解を促進しながら、1型コラーゲン沈着を低減し、瘢痕形成の低下をもたらすものと理解され得る。例えば、Pakyariらの文献、Adv Wound Care,2(5)：215-224(2013)を参照されたい。
個体における臓器移植を容易にするための方法であって、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を個体に投与して、臓器移植の種類、年齢、性別、喫煙習慣、及び/又は肥満度指数に関して一致した未処置個体における、閉鎖までの平均時間、回復時間又は瘢痕形成と比較して、切開閉鎖を高速化する(閉鎖までの時間を短縮する)、回復時間を短縮する、又は瘢痕形成を低減するためことを含む。
一例では、該方法は、有効量の、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、1つ、2つもしくは3つ)のIL-10又は変異型IL-10 MODポリペプチドを含む、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含み得る。
移植片対宿主病(急性GVHDを含むGVHD)を有する個体を治療する方法であって、有効量の、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を、及び/又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)を個体に投与することを含む。
前述の方法のいずれにおいても、別段の定めがない限り、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体のTGF-βポリペプチドは、前節で考察されたTGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3ポリペプチド、又はその変異型(例えば、TGF-β3 C77S変異型、又はTGF-β1もしくはTGF-β2変異型であって、対応する変異制限TGF-βポリペプチド二量体化を有する変異型)であり得る。同様に、TGF-βポリペプチドをマスキングするポリペプチドは、上記のもの(例えば、TGF-βに結合する抗体もしくはその断片、一本鎖抗体、又はTβRIもしくはTβRIIエクトドメイン断片)から選択することができる。
上記のように、幾つかの例では、本治療又は予防方法の実施において、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、それを必要とする個体にそれ自体として投与される。他の例では、本治療又は予防方法の実施において、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の核酸が、それを必要とする個体に投与される。したがって、その他の例では、本開示の1つ以上の核酸、例えば、本開示の1つ以上の組換え発現ベクターが、それを必要とする個体に投与される。
N.用量
好適な用量については、様々な臨床学的因子に基づき、主治医又はその他の資格のある医療関係者が決定することができる。医学技術分野においては周知のことではあるが、任意の1名の患者の用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定のポリペプチド又は核酸、患者の性別、投与期間及び投与経路、全身の健康、並びに、同時に投与するその他の薬物、を含む多くの因子によって決まる。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、用量当たり1ng/kg(体重)～20mg/kg(体重)、例えば、0.1mg/kg(体重)～10mg/kg(体重)、例えば、0.5mg/kg(体重)～5mg/kg(体重)の量で投与され得るが、この例示的な範囲未満又はこの例示的な範囲超の用量も、特に上記の因子を考慮して想定される。レジメンが持続注入である場合、これは、1分当たり体重1キログラム当たり1μg～10mgの範囲であり得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、約1mg/体重1kg～50mg/体重1kg、例えば、約1mg/体重1kg～約5mg/体重1kg、約5mg/体重1kg～約10mg/体重1kg、約10mg/体重1kg～約15mg/体重1kg、約15mg/体重1kg～約20mg/体重1kg、約20mg/体重1kg～約25mg/体重1kg、約25mg/体重1kg～約30mg/体重1kg、約30mg/体重1kg～約35mg/体重1kg、約35mg/体重1kg～約40mg/体重1kg、又は、約40mg/体重1kg～約50mg/体重1kgの量で投与することができる。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の好適な用量は、体重1kg当たり0.01μg～100g、体重1kg当たり0.1μg～10g、体重1kg当たり1μg～1g、体重1kg当たり10μg～100mg、体重1kg当たり100μg～10mg、又は、体重1kg当たり100μg～1mgである。当業者は、体液又は組織中における投与薬剤の測定滞留時間及び濃度に基づき、投与の反復速度を容易に概算することができる。奏効した治療に続き、患者に維持療法を受けさせて疾患状態の再発を予防することが望ましい場合があり、その場合、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、体重1kg当たり0.01μg～100g、体重1kg当たり0.1μg～10g、体重1kg当たり1μg～1g、体重1kg当たり10μg～100mg、体重1kg当たり100μg～10mg、又は、体重1kg当たり100μg～1mgの範囲の維持量で投与される。
症状の重症度、及び、対象の副作用の受けやすさに応じて、特定のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の用量レベルが変化し得るということを、当業者は容易に理解するであろう。任意の化合物の好ましい用量は、当業者が様々な手段を用いて容易に決定することができる。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターの複数回用量が、投与される。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は本開示の組換え発現ベクターの投与頻度は、様々な因子、例えば、症状の重症度などのいずれかに応じて変化し得る。例えば、幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は、本開示の組換え発現ベクターは、月に1回、月に2回、月に3回、1週おき(qow)、週に1回(qw)、週に2回(biw)、週に3回(tiw)、週に4回、週に5回、週に6回、1日おき(qod)、毎日(qd)、1日2回(qid)、又は1日3回(tid)投与される。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は本開示の組換え発現ベクターの投与の持続期間、例えば、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は、本開示の組換え発現ベクターを投与する期間は、様々な因子、例えば、患者の応答などのいずれかに応じて変化し得る。例えば、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は、本開示の組換え発現ベクターを、約1日間～約1週間、約2週間～約4週間、約1ヶ月間～約2ヶ月間、約2ヶ月間～約4ヶ月間、約4ヶ月間～約6ヶ月間、約6ヶ月間～約8ヶ月間、約8ヶ月間～約1年間、約1年間～約2年間、もしくは、約2年間～約4年間以上の範囲の期間にわたり投与することができる。
O.投与経路
活性成分(マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は、本開示の組換え発現ベクター)は、全身及び局所投与経路に加えて、インビボ法及びエクスビボ法などの、任意の利用可能な方法及び薬物送達に好適な経路を使用して、個体に投与される。
慣習的かつ薬学的に許容される投与経路としては、腫瘍内、腫瘍周囲、筋肉内、気管内、リンパ管内、頭蓋内、皮膚性、皮下、皮膚内、局所適用、静脈内、動脈内、経直腸、経鼻、経口、並びに、その他の経腸及び非経口投与経路が挙げられる。必要に応じて、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体及び/又は所望の効果に応じて、投与経路を組み合わせ、又は、投与経路を調整し得る。マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、又は、本開示の核酸又は組換え発現ベクターを、単回用量又は複数回用量で投与し得る。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、静脈内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、筋肉内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、リンパ管内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、局所的に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、腫瘍内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、腫瘍周辺に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、頭蓋内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、皮膚に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、皮下に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、創傷(例えば、皮膚又は粘膜の創傷)に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターは、火傷した組織(例えば、皮膚火傷)に投与される。
幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、静脈内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、筋肉内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、局所的に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、腫瘍内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、腫瘍周辺に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、頭蓋内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、皮膚に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、皮下に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、リンパ管内に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、創傷(例えば、皮膚又は粘膜の創傷)に投与される。幾つかの例では、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、火傷した組織(例えば、皮膚の火傷)に投与される。
マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、本開示の核酸、又は、本開示の組換え発現ベクターは、任意の利用可能な一般的な方法、及び、全身又は局所経路を含む一般的な薬物の送達に好適な経路を使用して、宿主に投与され得る。一般的に、本開示の方法における使用を検討する投与経路としては、経腸経路、非経口経路、及び、吸入経路が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
吸入投与以外の非経口投与経路としては、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、嚢内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、腫瘍内経路、リンパ管内経路、腫瘍周囲経路、及び、静脈内経路、すなわち、消化管を通る以外の任意の投与経路、が挙げられるが必ずしもこれらに限定されるものではない。非経口投与を実施して、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体、核酸、又は組換え発現ベクターの全身又は局所送達を実施し得る。
全身送達が望まれる場合、投与は通常、浸潤性又は全身吸収性の、医薬品製剤の局所又は粘膜投与を含む。
P.治療に好適な対象
本明細書に記載の方法などによる、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)による治療に好適な対象としては、自己免疫疾患、アレルギー反応(複数可)、創傷(例えば、皮膚及び/又は粘膜創傷)、及び/又は火傷を有する個体(例えば、ヒト)が挙げられる。対象には、さらに、臓器移植を受ける個体が含まれる。ヒトに加えて、対象としては、非ヒト哺乳動物が挙げられ、ウシ、イヌ、ヤギ、サル類(cercopithecine)、ネコ、ラパイン(lapine)、ラパイン、ネズミ、ヒツジ、ブタ、又はサル(simian)の対象又は治療を必要とする患者を含むが、これらに限定されない。
自己免疫疾患又は症状を有し、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、PSM-4033-4039)を用いる治療に好適な対象(個体)であって、自己免疫疾患又は症状を有すると診断されている個体と、自己免疫疾患又は症状の治療を受けてはいるがその治療に反応を示していない個体と、を含む、対象(個体)。本開示の方法で治療することができる自己免疫疾患及び症状としては、限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫大腸炎、自己免疫胃炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性不妊症、自己免疫膵臓炎、自己免疫網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫じんま疹、水疱性類天疱瘡、セリアック病、クローン病、グッドパスチュア症候群、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、移植片対宿主病(GVHD(急性GVHDを含む))、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、炎症性腸疾患、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症(MG)、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、硬皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、移植拒否、1型糖尿病(T1D)、脈管炎及び白斑が挙げられる。一実施態様では、自己免疫疾患は、T1Dである。一実施態様では、自己免疫疾患は、セリアック病である。T1D及び/又はセリアック病を有する個体は、治療に好適な対象から除外され得る。同様に、T1D及び/又はセリアック病は、治療の対象となる自己免疫疾患から除外され得る。
一実施態様において、本開示の方法で治療することができる自己免疫疾患及び症状としては、リウマチ性関節炎(RA)、乾癬/乾癬性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、アジソン病、グレイブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、及び悪性貧血が挙げられるが、これらに限定されない。
アレルギー反応を有する対象は、アレルゲンの数が多すぎて言い尽くすことができないため、アレルゲンによって容易に分類することができない。しかしながら、例として、アレルギー反応(複数可)を有する対象(例えば、以前にそのアレルギーで治療されたことがあるか、又は治療されたことがない個体)としては、ピーナッツ及び木の実、植物の花粉、ラテックスなどに対する反応を有する対象が含まれる。例えば、ピーナッツアレルゲンへのアレルギー反応を有する対象としては、7つのタンパク質ファミリーに由来するArah1～13タンパク質への反応を有する対象が挙げられ、Arah1(例えば、
Figure 2023500066000108
 Arah2(例えば、
Figure 2023500066000109
 及びArah3(例えば、
Figure 2023500066000110
 が挙げられる。例えば、Zhouらの文献、(2013)Intl.J.of Food Sci.2013：8 pages article ID 909140を参照。アレルギー反応を有する対象には、ハチ毒タンパク質(例えば、ホスホリパーゼA2、メリチン、スズメバチ(wasp)毒中の「抗原5」、及びヒアルロニダーゼなどのミツバチ毒及びスズメバチ毒のアレルゲン)に対する反応を有する対象も含まれる。
創傷を有する対象には、皮膚又は粘膜の擦り傷、剥離創、切開、裂傷、及び刺し傷を有する個体が含まれる。臓器移植を有する対象は、その性質上、それらの創傷タイプのうちの1つ以上を有することが理解され得る。
V.特定の態様
上述のTGF-β構築物又は複合体に関する主題の態様を含む特定の態様は、単独で、又は1つ以上の他の態様、例えば、下記に列挙されるTGF-β構築物及び複合体、それらの製造方法、及びそれらの使用方法(例えば、治療薬として)に関するものとの組み合わせにおいて、有益であり得る。
1.第1のポリペプチドとして、
(i)足場ポリペプチド配列と、
(ii)TGF-βポリペプチド配列と、
(iii)マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)と、
(iv)任意に、1つ以上(例えば、1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(v)任意に、(例えば、前述のポリペプチド配列のいずれかの間の)1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含む構築物であって、
これらのエレメントを含む構築物が、「マスキングされたTGF-β構築物」と総称され、前記マスキングポリペプチド配列(例えばTGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)及び前記TGF-βポリペプチド配列が、相互に結合する(互いに相互作用してTGF-βポリペプチド配列をマスキングする)、前記構築物。例えば、図1、構造Aを参照されたい。
2.前記第1のポリペプチドが、N末端からC末端の順に、
(i)足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及びTGF-βポリペプチド配列、又は
(ii)第1のMODポリペプチド配列、足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及びTGF-βポリペプチド配列、又は
(iii)第1の独立して選択されるMODポリペプチド配列、第2の独立して選択されるMODポリペプチド配列(タンデムでのMOD)、足場ポリペプチド配列、マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及びTGF-βポリペプチド配列、を含み、
任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を(例えば、前記のポリペプチド配列のいずれかの間に)含む、態様1に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
3.前記足場ポリペプチドが二量体化(又は多量体化)配列を含む、態様1又は態様2に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
4.マスキングされたTGF-β複合体ホモ二量体の形態であり、前記足場ポリペプチド配列が、任意に、1つ以上(例えば、1つ、2つ以上)の共有的結合(例えば、ジスルフィド結合)を互いに有し(例えば、第1のポリペプチドとしてのマスキングされたTGF-β構築物の第1の分子は、それらの足場ポリペプチド配列の共有又は非共有相互作用を通じて第2のポリペプチドとしてのマスキングされたTGF-β構築物の第2の分子と二量体化されてホモ二量体を形成し)、任意に、前記足場が、補体依存性細胞傷害(CDC)及び/又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介して細胞溶解を誘発するIgポリペプチドの能力を実質的に低減又は除去する変異(例えば、LALA変異)を含むIgFcポリペプチドを含む、態様3に記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図1、構造Bを参照されたい。
5.前記足場ポリペプチドが、相互特異的二量体化配列(例えば、ホモ二量体化とは対照的に、その相手側となる相互特異的結合配列と優先的に二量体化する二量体化配列)を含む、態様1～3のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図1、構造C及びFを参照されたい。
6.前記第1のポリペプチドと二量体化して、マスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体を形成する、第2のポリペプチドをさらに含み、
該第2のポリペプチドが、該第1のポリペプチドの相互特異的結合配列の相手側となる相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該ヘテロ二量体において、該相互特異的結合配列及び該相手側相互特異的結合配列が互いに相互作用する、態様5に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
7.前記第2のポリペプチドが、
(i)前記相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、
(ii)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択される(例えばタンデムの)MOD配列、及び該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、
(iii)該相手側相互特異的二量体化配列、及び独立して選択されるMOD配列を含む足場ポリペプチド配列、又は
(iv)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択される(例えばタンデムの)MOD配列、及び該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、を含み、
前記第1及び/又は該第2のポリペプチドが、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を(例えば、該ポリペプチド配列のいずれかの間に)含む、態様6に記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図1、構造Fを参照されたい。
8.前記第2のポリペプチドが、N末端からC末端にかけて、
(i)前記相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、
(ii)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択される(例えばタンデムの)MOD配列、及び該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、
(iii)該相手側相互特異的二量体化配列、及び1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列を含む足場ポリペプチド配列、又は
(iv)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択される(例えばタンデムの)MOD配列、及び該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、を含み、
前記第1及び/又は該第2のポリペプチドが、任意に1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を(例えば、前述のポリペプチド配列のいずれかの間に)含む、態様6又は7に記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図1、構造Fを参照されたい。
9.前記第2のポリペプチドが、
(i)任意に、1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(ii)前記相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、
(iii)TGF-βポリペプチド配列と、
(iv)マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)と、
(v)任意に、1つ以上の独立して選択される(例えば、該第2のポリペプチドのポリペプチド配列のいずれかの間の)リンカーポリペプチド配列と、を含み、
該マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)及び該TGF-βポリペプチド配列が相互に結合する(互いに相互作用して該TGF-βポリペプチド配列をマスキングする)、態様6に記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図1、構造Cを参照されたい。
10.前記第2のポリペプチドが、N末端からC末端の順に、
(i)前記相手側相互特異的二量体化配列、前記マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及び前記TGF-βポリペプチド配列を含む、前記足場ポリペプチド配列、
(ii)第1のMODポリペプチド配列、該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、該マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及び該TGF-βポリペプチド配列、又は
(iii)第1の独立して選択されるMODポリペプチド配列、第2の独立して選択されるMODポリペプチド配列、該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、該マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、及び該TGF-βポリペプチド配列、を含む態様9に記載のマスキングされたTGF-β構築物ヘテロ二量体。例えば、図1、構造Cを参照されたい。
11.ヘテロ二量体(又は多量体)としての、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含む複合体であって、
(i)該第1のポリペプチドが、
(a)相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、
(b)マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)と、
(c)任意に、1つ以上(例えば1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(d)任意に、1つ以上の独立して選択される(例えば、該第1のポリペプチドの該ポリペプチド配列のいずれかの間の)リンカーポリペプチド配列と、を含み、
(ii)該第2のポリペプチドが、
(a)該第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる相互特異的二量体化配列を含む、足場ポリペプチド配列と、
(b)TGF-βポリペプチド配列と、
(c)任意に、1つ以上(例えば1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
(d)任意に、1つ以上の独立して選択される(例えば、該第2のポリペプチドの該ポリペプチド配列のいずれかの間の)リンカーポリペプチド配列と、を含み、
これらのエレメントを含む複合体が、「マスキングされたTGF-β複合体」と総称され、該マスキングポリペプチド配列(例えばTGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列)及び該TGF-βポリペプチド配列が互いに結合し(互いに相互作用して該TGF-βポリペプチド配列をマスキングし)、
該相互特異的結合配列及び該相手側相互特異的結合配列が、前記ヘテロ二量体において互いに相互作用(例えば、非共有結合)し、
該マスキングされたTGF-βの第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチドが、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を(例えば、それらのポリペプチド配列のいずれかの間に)含む、前記複合体。例えば、図1、構造D及びEを参照されたい。
12.前記第1のポリペプチドが、N末端からC末端にかけて、
(a)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して、(a)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列、相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、及びマスキングポリペプチド配列(例えばTGF-β受容体ポリペプチド配列)、又は
(b)相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、及びマスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)、を含み、
該第2のポリペプチドが、N末端からC末端にかけて、1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列、該相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列、及び該TGF-βポリペプチド配列、を含む、態様11に記載のマスキングされたTGF-β複合体二量体。
13.前記足場ポリペプチド配列(複数可)が、IgFcポリペプチド配列(例えば、CH2-CH3領域配列)、Ig重鎖領域1(CH1)ドメイン、軽鎖定常領域(「CL」)(例えば、Igκ鎖(カッパ鎖)定常領域又はIgλ鎖(ラムダ鎖))、ロイシンジッパーポリペプチド配列、Fos又はJun結合対配列、コレクチンポリペプチド(例えば、ACRP30又はACRP30様タンパク質)、コイルドコイルドドドメイン、及び該いずれかの変異型(例えば、表1のノブインホール及び他の相互特異的配列)からなる群から選択される、態様1～12のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
14.前記足場ポリペプチド配列が、IgFcポリペプチド配列(免疫グロブリン配列)、Ig重鎖配列(例えば、CH2-CH3領域配列)、Ig重鎖領域1(CH1)ドメイン、軽鎖定常領域(「CL」)(例えば、Igκ鎖(カッパ鎖)、及び該いずれかの変異型からなる群から選択される、態様1～13のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。一実施態様では、前記足場ポリペプチドは、MD13置換を有するIgCH1ドメイン又はMD13置換を有するIgκ鎖配列から選択される。
15.前記免疫グロブリン配列が、配列番号68～83又は85～87のうちのいずれかに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む、態様14に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。例えば、図2A～2H、及び2J～2Kを参照されたい。(免疫ブロブリン(Immunoblobulin)配列は、二量体を、また図2HのようなIgM配列の場合、多量体を形成することができる。)
16.前記免疫グロブリン配列が、配列番号68～83のいずれかに対して少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖配列を含む、態様15に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。例えば、図2A～2Hを参照されたい。(免疫ブロブリン(Immunoblobulin)配列は、二量体を、また図2HのようなIgM配列の場合、多量体を形成することができる。)
17.前記足場ポリペプチド配列が、1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)互いに共有的な結合を有する、態様4及び6～16のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
18.前記1つ以上の互いに共有的な結合のうちの少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)が、前記第1のポリペプチドの足場ポリペプチド配列と前記第2のポリペプチドの足場ポリペプチド配列との間のジスルフィド結合である、態様17に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
19.前記足場配列が、1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)ジスルフィド結合によって任意に共有結合されている、CH2-CH3免疫グロブリン領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域(IgFc)ポリペプチド配列である、態様14～18のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
20.前記足場ポリペプチドが、i)相互特異的免疫グロブリン(Ig)重鎖配列、ii)IgCH1ドメイン、iii)Ig軽鎖定常領域(「CL」)(例えば、Igκ鎖(カッパ鎖)又はIgλ鎖(ラムダ鎖)定常領域)、及び(iv)Fos/Jun結合対のポリペプチドからなる群から選択される、相互特異的二量体化配列を含む、態様5に記載のマスキングされたTGF-β構築物。一実施態様では、前記足場ポリペプチドは、MD13置換を有するIgCH1ドメイン又はMD13置換を有するIgκ鎖配列から選択される相互特異的二量体化配列を含む。
21.前記相互特異的結合配列が、配列番号68～82又は85～87のうちのいずれかに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む、態様20に記載のマスキングされたTGF-β構築物。例えば、図2A～2G、及び2J～2Kを参照されたい。
22.前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの足場ポリペプチドが、下記からなる群から選択される、相互特異的二量体化配列と相手側相互特異的二量体化配列との対、を含む、態様4及び6～12のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β複合体：(i)相互特異的免疫グロブリン(Ig)重鎖配列(例えば、重鎖CH1-重鎖CH2領域)；(ii)IgCH1ドメイン及びその相手側の相互特異的軽鎖定常領域(「CL」)(例えば、Igκ鎖(カッパ鎖)定常領域又はIgλ鎖(ラムダ鎖)定常領域)のうちの1つ；(iii)Fos/Jun結合対；及び(iv)Ig重鎖領域1(CH1)及び軽鎖定常領域(「CL」)配列(κ又はλIg軽鎖定常領域配列と対になるCH1配列などのCH1/CL対)。一実施態様では、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの足場ポリペプチドは、MD13置換を有するIgCH1ドメイン及びMD13置換を有するIgκ鎖配列を含む、相互特異的二量体化配列と相手側相互特異的二量体化配列との対を含む。
23.前記足場ポリペプチド配列が、1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)互いに共有的な結合を有する、態様22に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
24.前記1つ以上の共有的な結合のうちの少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)が、前記第1のポリペプチドの足場配列と前記第2のポリペプチドの足場配列との間のジスルフィド結合である、態様22に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
25.前記足場配列が、1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)ジスルフィド結合によって(前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとの間で)任意に共有結合されるCH2-CH3免疫グロブリン領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域(IgFc)ポリペプチド配列である、態様22～24のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β複合体。
26.前記相互特異的結合配列及び/又は前記相手側相互特異的結合配列が、配列番号68～82、又は85～87のいずれかに対して、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する配列を含む、態様22～25のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β複合体。例えば、図2A～2G、及び2J～2Kを参照されたい。
27.前記免疫グロブリン配列が、配列番号68～83のいずれかに対して少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％のaa配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖配列を含む、態様26に記載のマスキングされたTGF-β複合体。例えば、図2A～2Hを参照されたい。(免疫ブロブリン(Immunoblobulin)配列は、二量体を、また図2HのようなIgM配列の場合、多量体を形成することができる。)
27.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2A(配列番号68)に示されるIgA Fc配列の、少なくとも150個の連続するaas(少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、又は少なくとも350個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
28.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2B(配列番号69)に示されるIgD Fc配列の、少なくとも150個の連続するaas(少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、又は少なくとも350個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
29.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2C(配列番号70)に示されるIgE Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、又は少なくとも200個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
30.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2Dに示されるwt.のIgG1Fc配列(配列番号71～78)などのIgGFcポリペプチド配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、又は少なくとも200個の連続するaas)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
31.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2E(配列番号79)に示されるIgG2 Fcポリペプチド配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、又は少なくとも300個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
32.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2F(配列番号80)に示されるIgG3 Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、又は少なくとも225個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
33.任意に、相互特異的二量体化配列及び/又は相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、該足場ポリペプチド配列が、図2G(配列番号81又は82)に示されるIgG4Fc配列の少なくとも125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、又は少なくとも250個)、又は全てのaasに対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有する、態様1～27のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
34.前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとの間の1つ又は2つの鎖間(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4配列のそれらのヒンジ領域に隣接するシスチン間)ジスルフィド結合を含む、態様27～33のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β複合体。
35.1つ以上の足場ポリペプチドが、補体成分1q(C1q)及び/又はFcラムダ受容体(FcλR)への該ポリペプチドの結合を制限(例えば、低減)し、並びに/又は補体依存性細胞傷害(CDC)及び/もしくは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介して細胞溶解を誘発するIgポリペプチドの能力を実質的に低減又は排除する、1つ以上の置換を有する免疫グロブリン(Ig)ポリペプチド配列を含む、態様1～34のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
36.各足場ポリペプチドが、wt.IgG1 Fc配列(配列番号71)の125個の連続するaas(少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、又は少なくとも220個の連続するaas)に対して、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は100％)のaa配列同一性を有するポリペプチドを含む免疫グロブリン(Ig)ポリペプチド配列を含む、態様35に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
37.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、aas234、235、236、237、238、及び239(234-LLGGPS-239)のうちのいずれか1つ、2つ、又はそれ超の置換を含む、態様36に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
38.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、N297、P331、D270、K322、及び/又はP329のいずれか1つ、2つ以上の置換を含む、態様36又は37に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
39.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、アスパラギン以外のaa(アラニンによる、例えば配列番号74のaN297A)によるN297(配列番号71のN77)置換を含む、態様36～38のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
40.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、ロイシン以外のaa(例えば、アラニンによる、L234A及び/又はL235A)によるL234及び/又はL235(配列番号71のL14及びL15)置換を含む、態様36～38のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
41.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、L234A及び/又はL235A置換を含む、態様39に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、配列番号75を参照されたい)。
42.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、プロリン以外のaaで置換されたP331(配列番号71のP111)(例えば、セリンによるP331S置換)を含む、態様36～41のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
43.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、L234及び/又はL235置換、並びにP331置換を含む、態様36～38のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
44.前記免疫グロブリンポリペプチド配列が、(i)L234F、L235E、及びP331S置換、又は(ii)L234A、L235A、及びP331S置換を含む、態様43に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
45.KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、及びA107配列(例えば、表1を参照されたい)からなる群から選択される、相互特異的二量体化ペアの相互特異的二量体化配列を含む、態様20～44のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
46.相互特異的二量体化配列及び相手側相互特異的二量体化配列が、KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、及びA107配列対からなる群から選択される一対の配列である、態様4及び22～44のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β複合体(例えば、表1を参照されたい)。
47.前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドのうちの1つが、T366Y置換及び他のY407T置換、又は他の相互特異的免疫グロブリン重鎖配列(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3、もしくはIgG4重鎖配列を含む相互特異的配列)における対応する置換を含む、相互特異的IgG1ポリペプチド配列(例えば、配列番号71の配列)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
48.第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドのうちの1つが、T366W置換及び他のT366S、L368A及びY407V置換、又は他の相互特異的免疫グロブリン重鎖配列(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3、もしくはIgG4重鎖配列を含む相互特異的配列)における対応する置換を含む相互特異的IgG1ポリペプチド配列(例えば、配列番号71の配列)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
49.前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドのうちの1つが、Y349C、T366S、L368A、及びY407V置換、並びに他のS354C、及びT366W置換、又は他の相互特異的免疫グロブリン重鎖配列(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3、又はIgG4重鎖配列を含む相互特異的配列)における対応する置換を含む相互特異的IgG1ポリペプチド配列(例えば、配列番号71の配列)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
50.前記第1のポリペプチドが、T146W KiH配列置換を有するIgG1足場を含み、前記第2のポリペプチドが、T146W、L148A、及びY187V KiH配列置換を有するIgG1足場を含み、前記足場が、配列番号71のIgG1の少なくとも170(例えば、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全て)個の連続するaasに対して少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、任意に、配列番号71に付番される、L14及びL15(例えば、L14A/L15A「LALA」又はL14F/L15E)、N77(例えば、N77A)、P111(例えば、P111S)、L131(例えば、L131K)、T146(例えば、T146S)、P175(例えば、P175V)、F185(例えば、F185R)、Y187(例えば、Y187A)、及びK189(例えば、K189Y)の1つ以上の置換を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
51.前記第1のポリペプチドが、T146W KiH配列置換を有するIgG1足場を含み、前記第2のポリペプチドが、T146S、L148A、及びY187V KiH配列置換を有するIgG1足場を含み、前記足場が、配列番号71のIgG1の少なくとも170(例えば、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全て)個の連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、足場aa配列のうちの0個、1個、又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによってエフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235A「LALA」)、及び/又はN77置換(例えば、Kabat付番におけるN297AもしくはN297G)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。例えば、図2Dの配列番号77及び78を参照されたい。
52.前記第1のポリペプチドが、T146W及びS134C KiHs-s置換を有するIgG1足場を含み、前記第2のポリペプチドが、T146S、L148A、Y187V及びY129C KiHs-s置換を有するIgG1足場を含み、前記足場が、配列番号71のIgG1の少なくとも170(例えば、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全て)個の連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、前記第1及び第2のポリペプチドの足場aa配列のうちの0個、1個又は両方が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによってエフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235A「LALA」)、及び/又はN77(Kabat付番におけるN297)置換(例えば、Kabat付番におけるN297A又はNS97G)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
53.前記第1及び第2のポリペプチドが、
S144H及びF185A置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにY129T及びT174F置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
T130V、L131Y、F185A及びY187V置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びに130V、T146L、K172L及びT174W置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
K140D、D179M、及びY187A置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにE125R、Q127R、T146V、及びK189V置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
K189D及びK172D置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにD179K及びE136K置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
K140E及びK189W置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにQ127R、D179V及びF185T置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
K140E、K189W、及びY129C置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにQ127R、D179V、F185T、及びS134C置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
並びに、
K150E及びK189W置換を有するIgG1足場を含む第1のポリペプチド、並びにE137N、D179V及びF185T置換を有するIgG1足場を含む第2のポリペプチド、
但し、前記足場が、配列番号71のIgG1の少なくとも170(例えば、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、又は227個全て)個の連続するaasに対して、少なくとも80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の配列同一性を有する配列を含み、
前記第1及び第2のポリペプチドの足場aa配列のうちの0、1個又は2個が、Fcγ受容体との相互作用を遮断することによってエフェクター機能を除去する、L14及びL15置換(例えば、Kabat付番におけるL234A及びL235A「LALA」)、及び/又はN77(Kabat付番におけるN297)置換(例えば、Kabat付番におけるN297A又はN297G置換)を含む、態様46に記載のマスキングされたTGF-β複合体。
54.前記足場ポリペプチドが、
(i)Ig重鎖CH1ドメイン(例えば、配列番号85のポリペプチド)、
(ii)Igκ鎖定常領域配列(例えば、配列番号86)、及び
(iii)Igλ鎖定常領域配列(例えば、配列番号87)、からなる群から選択される相互特異的二量体化配列を含み、
前記足場が、それぞれ、配列番号85、86、又は87の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、又は少なくとも100個の連続するaasに対して、少なくとも80％(85％、90％、95％、98％、99％、又は100％)の配列同一性を有する配列を含む、態様20に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
図2J及び2Kを参照されたい。
IgCH1ドメイン及び/又はIgκ鎖配列は、任意に、それらのそれぞれのMD13置換を含む。
55.前記第1及び第2のポリペプチドのうちの1つの前記足場ポリペプチドが、Ig重鎖CH1ドメイン(例えば、配列番号85のポリペプチド)を含み、前記第1及び第2のポリペプチドのうちの他のポリペプチドが、Igκ鎖定常領域配列(例えば、任意にMD13置換を含む配列番号86)又はIgλ鎖定常領域配列(例えば、配列番号87)のいずれかを含み、
前記足場が、それぞれ、配列番号85、86、又は87の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、又は少なくとも100個の連続するaasに対して、少なくとも80％(85％、90％、95％、98％、99％、又は100％)の配列同一性を有する配列を含む、態様22に記載のマスキングされたTGF-β複合体。図2J及び2Kを参照されたい。
56.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む、態様1～56のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
57.前記独立して選択されるリンカーが、長さとして約1aa～約25aaの長さ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25aaの長さ)を有する、態様56に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
58.前記独立して選択されるリンカーが、長さとして約25～約35aaの長さ(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は35aaの長さ)である、態様56に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
59.前記独立して選択されるリンカーが、長さとして約35～約50aaの長さ(例えば、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、又は45、46、47、48、49、又は50aaの長さ)である、態様56に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
60.前記独立して選択されるリンカーのうちの少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)が、下記を含む、態様56～59のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体：
(i)グリシン又は約2～約50の連続するグリシン残基を有する配列を含むポリグリシン、
(ii)グリシン-セリンポリマー(例えば、
Figure 2023500066000111
 であり、nは少なくとも1(例えば、1～10、10～20、もしくは20～30)の整数である)、又は
(iii)グリシン-アラニンポリマー又はアラニン-セリンポリマー(例えば1～10、10～20、もしくは20～30aaの長さを有する)。
61.前記独立して選択されるリンカーの少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)が、下記からなる群から選択されるaa配列を含む、態様56～59のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体：
Figure 2023500066000112
 など。
62.前記独立して選択されるリンカーの少なくとも1つがシステイン残基を含み(例えば、
Figure 2023500066000113
 リンカーaa配列、配列番号137)、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の第2のポリペプチド(例えば、第2のポリペプチドのリンカー)に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる、又は形成する、態様56～59のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
63.前記1つ以上(例えば、1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列が、PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MODポリペプチド配列、及びそれらのいずれかの変異体(例えば、対応するwt.MODポリペプチド配列と比較して、それらの受容体に対する親和性が低下している変異体)からなる群から選択される、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
64.前記1つ以上(例えば、1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列が、PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、IL-23 MODポリペプチド配列、及びそれらのいずれかの変異体(例えば、対応するwt.MODポリペプチド配列と比較してそれらの受容体に対する親和性が低下している変異体)からなる群から選択される、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
65.前記1つ以上(例えば、1つ、2つ以上)の独立して選択されるMODポリペプチド配列が、PD-L1、FAS-L、IL-2、IL-10 MODポリペプチド配列、及びそれらのいずれかの変異体(例えば、対応するwt.MODポリペプチド配列と比較してそれらの受容体に対する親和性が低下している変異体)からなる群から選択される、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
66.前記MODポリペプチド配列の少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)が、IL-2 MODポリペプチド配列であるか、あるいは、下記の変異型IL-2 MODポリペプチド配列である、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体：
(i)配列番号9の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％)のaa配列同一性を有する、又は
(ii)配列番号13～27の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％)のaa配列同一性を有する。
67.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MODポリペプチド配列、及びそれらのいずれかの変異型(例えば、対応するwt.MOD配列と比較してそれらの受容体に対する親和性が低下している変異型)からなる群から選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のMODポリペプチド配列を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
68.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のwt.IL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のPD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列、又は(例えば、対応するwt.配列と比較して、PD1受容体に対する親和性が低下している)変異型PD-L1又はPD-L2 MODポリペプチド配列、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
69.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のwt.IL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のFAS-L MODポリペプチド配列又は(例えば、対応するwt.配列と比較して、Fas受容体に対する親和性が低下している)変異体FAS-L MODポリペプチド配列、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
70.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のwt.IL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-1 MODポリペプチド配列又は変異型IL-1 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-1受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
71.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上の)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-4 MODポリペプチド配列又は変異体IL-4 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-4受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
72.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-6 MODポリペプチド配列又は変異型IL-6 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-6受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
73.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-7 MODポリペプチド配列又は変異型IL-7 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-7受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
74.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-10 MODポリペプチド配列又は変異型IL-10 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-10受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
75.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-15 MODポリペプチド配列又は変異型IL-15 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較して、IL-15受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
76.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-2 MODポリペプチド配列又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-21 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号58又は60の配列)又は変異型IL-21(例えば、対応するwt.配列と比較してIL-21受容体に対する親和性が低下している)MODポリペプチド配列、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
77.前記1つ以上の(例えば、1つ、2つ以上)独立して選択されるMODポリペプチド配列が、
(i)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のwt.IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号9の配列を含む)又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、態様66の変異型IL-2 MODポリペプチド配列)、及び
(ii)少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のIL-23 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号63又は65の配列)又は変異型IL-23 MODポリペプチド配列(例えば、対応するwt.配列と比較してIL-23受容体に対する親和性が低下している)、を含む、態様1～62のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
78.TGF-βポリペプチド/ポリペプチド複合体が変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む場合、変異型IL-MODポリペプチド(例えば、配列番号9の変異型)が、N88、F42、及び/又はH16のうちのいずれか1つ、2つ、又は全ての置換を含む、態様63～77のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
79.少なくとも1つの変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、F42A、F42T、H16A、又はH16T置換を含む、態様78に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
80.少なくとも1つの変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、(i)F42A及びH16A、(ii)F42T及びH16A、(iii)F42A及びH16T、又は(iv)F42T及びH16T置換、を含む、態様78に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
81.少なくとも1つの変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、(i)N88R、F42A、及びH16A、(ii)N88R、F42T、及びH16A、(iii)N88R、F42A、及びH16T、又は(iv)N88R、F42T、及びH16T置換、を含む、態様78に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
82.前記マスキングポリペプチド配列が、I型(TβRI)、II型(TβRII)又はIII型(TβRIII)TβRのエクトドメイン断片を含むTGF-β受容体(「TβR」)ポリペプチド配列である、態様1～81のいずれか1つに記載のマスキングTGF-β構築物又は複合体。
83.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号117の前記TβRIIアイソフォームAエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は154個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
84.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号119の前記TβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、又は143個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
85.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号120の前記TβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、又は143個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
86.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号120の前記エクトドメイン断片、配列番号121の前記TβRIIエクトドメインN末端Δ14(デルタ14)aa欠失配列、配列番号122の前記N末端Δ25(デルタ25)aa欠失配列、を含むTβRIIアイソフォームBポリペプチド配列、又は、これらのいずれかのTβRIIアイソフォームBポリペプチド配列の少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は118個の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有する配列、から選択されるアミノ酸配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
87.前記TβRIIエクトドメイン配列が、F30、D32、S52、E55、及び/又はD118のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つ全ての置換を含む、態様83～86のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
88.D118A又はD118R置換(N末端Δ25欠失及びD118置換を有するTβRIIエクトドメインについては、例えば、配列番号123を参照されたい)、又は
D118A又はD118R置換、及びF30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ、2つ、3つ、又は4つ全て、を含む、態様83～87のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
89.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号119又は配列番号120の14aasまでのN末端欠失(Δ14aa欠失)(例えば、配列番号121の配列を参照)、及びD118置換(例えば、D118A又はD118R)、又は、これらのTβRIIポリペプチド配列のいずれかの少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は118個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有する配列を含む、態様87に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
90.F30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ、2つ、3つ、又は4つ全てをさらに含む、態様89に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
91.前記TβRIIエクトドメイン配列が、配列番号119又は配列番号120の25aasまでのN末端欠失(Δ25aa欠失)、及びD118置換(例えば、D118A又はD118R、配列番号123を参照)、又は、これらのTβRIIポリペプチド配列のうちのいずれかの、少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、又は100個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有する配列を含む、態様87に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
92.F30A、D32N、S52L、及び/又はE55A置換のうちの1つ、2つ、3つ、又は4つ全てをさらに含む、態様91に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
93.前記TβRポリペプチド配列が、TβRIエクトドメイン配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
94.前記TβRIエクトドメイン配列が、配列番号115の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、又は93個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様93に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
95.前記TβRポリペプチド配列が、TβRIIIエクトドメイン配列を含む、態様82に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
96.前記TβRIIIエクトドメイン配列が、(Aアイソフォーム 配列番号124のaas27～787、又はBアイソフォーム 配列番号125のaas27～786)の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、90、100、150、200、250、300、400、500、又は600個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様95に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
97.前記TGF-βポリペプチド配列が、ヒトTGF-β1ポリペプチド、ヒトTGF-β2ポリペプチド、又はヒトTGF-β3ポリペプチドの成熟形態の、少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、又は少なくとも110個)の連続するaasを有するポリペプチドに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
98.前記TGF-βポリペプチド配列が、配列番号105(例えば、配列番号106のaas279～390)の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTGF-β1ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
99.前記TGF-βポリペプチド配列が、配列番号107の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)に対して、少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)の連続するaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、C77S置換を有するTGF-β1ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
100.前記TGF-βポリペプチド配列が、(配列番号108)の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaas(例えば、配列番号109のaas302～413)に対して、少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTGF-β2ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
101.前記TGF-βポリペプチド配列が、配列番号110の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)のaasに対して少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)の連続するaas配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、C77S置換を有するTGF-β2ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
102.前記TGF-βポリペプチド配列が、配列番号111の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaas(例えば、配列番号112のaas301～412)に対して少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTGF-β3ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
103.前記TGF-βポリペプチド配列が、配列番号113の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して少なくとも60％(少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、C77S置換を有するTGF-β3ポリペプチドである、態様1～96のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
104.前記TGF-βポリペプチド配列が、成熟TGF-βポリペプチド配列の25位、92位、及び/又は94位の1つ以上での置換を含む、態様97～103のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、図3及び図4の配列番号112を参照されたい)。
105.前記TGF-βポリペプチド配列が、成熟TGF-βポリペプチド配列の25位、92位、及び/又は94位の1つ以上での置換を含む、態様100～101のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体(例えば、図3及び図4の配列番号112を参照されたい)。
106.前記TGF-βポリペプチド配列が、
(i)25位のLys又はArg以外のaa
(ii)92位のIle又はVal以外のaa、及び/又は
(iii)94位のLys又はArg以外のaa(例えば、配列番号108又は配列番号110に基づく)、を含む、態様97～105のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
107.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造A～Fのいずれか1つの形態を有する、態様1～106のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
108.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造Aの形態を有するマスキングされたTGF-βポリペプチドである、態様107に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
109.少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様108に記載のマスキングされたTGF-βポリペプチド。
110.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造Bの形態を有するマスキングされたTGF-β複合体である、態様107に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
111.少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様110に記載のマスキングされたTGF-βポリペプチド。
112.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造Cの形態を有する相互特異的なマスキングされたTGF-β構築物又は複合体である、態様107に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
113.少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様112に記載のマスキングされたTGF-βポリペプチド。
114.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造D又はEの形態を有する相互特異的なマスキングされたTGF-β複合体である、態様107に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
115.少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様114に記載のマスキングされたTGF-βポリペプチド。
116.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造Fの形態を有する相互特異的なマスキングされたTGF-β複合体である、態様107に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
117.少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ以上)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様116に記載のマスキングされたTGF-βポリペプチド。
118.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号117の配列を含む)、又は配列番号117に示されるTβRIIアイソフォームAエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は154個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、wt.IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号9の配列を含む)を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
119.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号119の配列を含む)、又は配列番号119のTβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも143個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、wt.IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号9の配列を含む)を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
120.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号120の配列を含む)、又は配列番号120のTβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、もしくは少なくとも129個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体は、wt.IL-2 MODポリペプチド配列(例えば、配列番号9の配列を含む)を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
121.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号117の配列を含む)、又は配列番号117のTβRIIアイソフォームAエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は154個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、配列番号9の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するaa配列を含む変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
122.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号119の配列を含む)、又は配列番号119のTβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも143個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、配列番号9の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するaa配列を含む変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
123.前記TGF-βポリペプチド配列が、wt.TGF-β3ポリペプチド配列(例えば、配列番号111の配列を含む)、又は配列番号111のTGF-β3配列の少なくとも70個(例えば、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、又は112個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記マスキングポリペプチド配列が、wt.TβRIIポリペプチド配列(例えば、配列番号120の配列を含む)、又は配列番号120のTβRIIアイソフォームBエクトドメインの少なくとも90個(例えば、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、もしくは少なくとも129個)の連続するaasに対して、少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは100％)のaa配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTβRIIポリペプチド配列であり、
前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、配列番号9の少なくとも80個(例えば、90、100、110、120、130、又は133個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％)のaa配列同一性を有するaa配列を含む変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様107～117のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
124.前記TGF-β3ポリペプチド配列が、C77S置換を含む、態様121～123のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
125.前記TβRIIポリペプチド配列が、N末端Δ14、及びD118AもしくはD118R配列修飾のいずれか、又は、N末端Δ25、及びD118AもしくはD118R配列修飾のいずれかを含む、態様121～124のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
126.前記IL-2 MODポリペプチド配列が、H16におけるaa置換又はF42におけるaa置換を含む、態様121～125のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
127.前記IL-2 MODポリペプチド配列が、H16及びF42におけるaa置換を含む、態様121～125のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
128.H16及びF42における置換が、H16A、H16T、F42A、及びF42Tからなる群から選択される(例えば、H16A及びF42A、又はH16T及びF42Aである)、態様125～127のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
129.前記IL-2 MODポリペプチド配列が、N88Rのaa置換をさらに含む、態様121～128のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
130a.前記TGF-β3ポリペプチド配列がC77S置換を含み、
前記TβRIIポリペプチド配列が、N末端Δ14、及びD118AもしくはD118Rの配列修飾、又は、N末端Δ25、及びD118AもしくはD118Rの配列修飾のいずれかを含み、かつ
前記IL-2 MODポリペプチド配列が、H16及びF42におけるaa置換を含む、態様121～129aのいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
130b.H16及びF42における置換が、H16A及びF42A置換、又はH16T及びF42A置換のいずれかである、態様130aに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
131.さらに、PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及びIL-23からなる群から選択される野生型又は変異型MODポリペプチド配列を含む、態様1～130bのいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
132.PD-L1、FAS-L、IL-10からなる群から選択される野生型又は変異型MODポリペプチド配列を含む、態様1～130bのいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
133.前記TGF-βポリペプチド/複合体が、配列変異を有しない以外は同一のwt.TGF-βポリペプチドと比較して、マスキングポリペプチド(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド)配列に対する親和性が少なくとも10％低下(例えば、少なくとも20％低下、少なくとも30％低下、少なくとも40％低下、少なくとも50％低下、少なくとも60％低下、少なくとも70％低下、少なくとも80％低下、少なくとも90％低下、少なくとも95％低下、又は95％を超えて低下)している変異型TGF-βポリペプチドを含む、態様1～132のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
134.前記TGF-βポリペプチド/複合体が、配列変異を伴わない対応するwt.TβRポリペプチド配列と比較して、TGF-βポリペプチドに対する親和性が低下(少なくとも10％低下、少なくとも20％低下、少なくとも30％低下、少なくとも40％低下、少なくとも50％低下、少なくとも60％低下、少なくとも70％低下、少なくとも80％低下、少なくとも90％低下、少なくとも95％低下、又は95％を超えて低下)している、1つ以上の配列変異(例えば、1つ以上のaa欠失、挿入、又は置換)を有するTβRポリペプチド配列を含む、態様1～133のいずれか1つに記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
135.マスキングされたTGF-β複合体PSM-4033-4039。
136.態様1～135のいずれか1つのマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするか、又は態様4及び6～135のいずれか1つのマスキングされたTGF-β複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))。
137.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその細胞、組織、もしくは体液中のTreg細胞を誘導する方法であって、態様1～135のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
138.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様137に記載の方法。
139.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、(i)wt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列、及び(ii)wt.又は変異型PL-L1ポリペプチド配列を含む、態様137に記載の方法。
140.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、ビタミンD(例えば、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3又はビタミンD類似体(例えば、ビタミンD3)、mTOR阻害剤(例えば、ラパマイシン)、及び/又はレチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)のうちのいずれか1つ以上の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に投与される、態様137～139のいずれか1つに記載の方法。
141.前記投与が、下記いずれかの場合の細胞数に関して、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のFoxP3＋Treg細胞(例えば、誘導された制御性T細胞(iTreg)、胸腺由来Treg細胞(tTreg)、及び/又は末梢Treg細胞(pTreg)のうちのいずれか1つ以上)の数の増加をもたらす、態様137～140のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない処置群(例えば、1人の対象、又は2人以上の対象からの平均)の組織又は体液中のTreg細胞の量に関する場合。
142.前記所定の体積の組織又は体液中のTreg細胞(例えば、FoxP3＋細胞、iTreg、tTreg、及び/又はpTreg)の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のTregの数と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)増加する、態様141に記載の方法。
143.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液においてTh9細胞を誘導する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
144.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型IL-4 MODポリペプチド配列を含む、態様143に記載の方法。
145.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のTh9細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞数に関して増加させる、態様143～144のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のTh9細胞の量(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
146.前記Th9細胞の数が、所定の体積の組織又は体液中で、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のTh9細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)増加する、態様145に記載の方法。
147.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液においてTh17細胞を誘導する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
148.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型IL-6 MODポリペプチド配列を含む、態様147に記載の方法。
149.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のTh17細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞数に関して増加させる、態様147～148のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のTh17細胞の量(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
150.前記Th17細胞の数が、所定の体積の組織又は体液中で、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の前記Th17細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)増加する、態様149に記載の方法。
151.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液においてThf細胞を誘導する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
152.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つのwt.又は変異型IL-21及び/又はIL-23 MODポリペプチド配列を含む、態様151に記載の方法。
153.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つのwt.又は変異型IL-21、及び少なくとも1つのwt.又は変異型IL-23 MODポリペプチド配列を含む、態様152に記載の方法。
154.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のThf細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞数に関して増加させる、態様151～153のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のThfの数(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
155.前記Thf細胞の数が、所定の体積の組織又は体液中で、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中の前記Thf細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)増加する、態様154に記載の方法。
156.哺乳動物対象(又はその組織もしくは体液)におけるTh1細胞の作用を阻害する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
157.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型IL-4 MODポリペプチド配列を含む、態様156に記載の方法。
158.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液もしくはリンパ液)流体へのインターフェロンγ及び/又はTNFのTh1媒介性の放出(又はその結果である濃度)の阻害を、下記の場合の量に関してもたらす、態様156～157のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のインターフェロンγ及び/又はTNFの量(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
159.所定の体積の組織又は体液中のインターフェロンγ及び/又はTNFの量が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のインターフェロンγ及び/又はTNFの量と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)減少する、態様149に記載の方法。
160.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液におけるTh2細胞の作用及び/又は増殖を阻害する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
161.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体へのIL-4、IL-5、及び/又はIL-13のTh2媒介性の放出の阻害(又はその結果である濃度)を、下記の場合の量に関してもたらす、態様160に記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中の量(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
162.所定の体積の組織又は体液中のIL-4、IL-5、及び/又はIL-13の量が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のIL-4、IL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群からの組織又は体液中のIL-4、IL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は、少なくとも90％)減少する、態様161に記載の方法。
163.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液におけるII型先天性リンパ球(ILC2細胞)の作用を阻害する方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含み、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、任意に1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型IL-10ポリペプチド配列(例えば、IL-10M1などの単量体形態)を含む、前記方法。
164.前記投与が、IL-5、及び/又はIL-13の、前記対象からの所定の体積の組織もしくは体液(例えば、血液もしくはリンパ液)流体へのILC2細胞の媒介による放出の阻害(又はその結果である濃度)を、下記の場合の量に関してもたらす、態様160に記載の方法。
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体による処置の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中の量(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
165.所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量が、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群からの所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は、少なくとも90％)減少する、態様164に記載の方法。
166.所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群からの所定の体積の組織又は体液中のIL-5、及び/又はIL-13の量と比較して、少なくとも25％減少する、態様164に記載の方法。
167.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液におけるインバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞の発達及び/又は生存をサポートする方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
168.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つのwt.又は変異型MODポリペプチド配列を含む、態様167に記載の方法。
169.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のiNKT細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞数に関して増加させる、態様167～168のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のiNKT細胞の数(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
170.所定の体積の組織又は体液中の、iNKT細胞の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のiNKT細胞の数と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群からの平均値と比較して、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は、少なくとも90％)増加する、態様169に記載の方法。
171.所定の体積の組織又は体液中のiNKT細胞の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のiNKT細胞の数と比較して、又は、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群からの平均値と比較して、少なくとも25増加する、態様169に記載の方法。
172.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液中のCD4＋T細胞の数の増加を遮断するか、又はCD4＋T細胞の数を減少させる方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
173.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、TGF-βポリペプチド配列に加えて、少なくとも1つのwt.又は変異型MODポリペプチド配列を含む、態様172に記載の方法。
174.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のCD4＋T細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞の数と比較して減少させる、態様172～173のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のCD4＋T細胞の数(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
175.前記CD4＋細胞の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のCD4＋細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、前記組織又は前記体液の体積において、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)減少する、態様174に記載の方法。
176.前記CD4＋細胞の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のCD4＋細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、前記組織又は前記体液の体積において、少なくとも25％減少する、態様174に記載の方法。
177.哺乳動物(例えば、ヒト)対象、又はその組織もしくは体液中のCD8＋T細胞の数の増加を遮断するか、又はCD4＋T細胞の数を減少させる方法であって、態様1～134のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を該対象に投与することを含む、前記方法。
178.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、TGF-βポリペプチド配列に加えて、少なくとも1つのwt.又は変異型MODポリペプチド配列を含む、態様172に記載の方法。
179.前記投与が、前記対象からの所定の体積の組織又は体液(例えば、血液又はリンパ液)流体中のCD8＋T細胞の数を、下記いずれかの場合の細胞の数と比較して減少させる、態様172～173のいずれか1つに記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない対照処置群の組織又は体液中のCD8＋T細胞の数(例えば、個体群からの平均)に関する場合。
180.前記CD8＋細胞の数が、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与する前の所定の体積の組織又は体液中のCD8＋細胞の数と比較して、又は該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されなかった以外は一致する対照群の平均値と比較して、前記組織又は前記体液の体積において、少なくとも5％(例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍以上)減少する、態様174に記載の方法。
181.創傷、アレルギー反応、疾患又は障害の治療又は予防を提供する方法であって、前記方法が、(i)態様1～134のいずれかの1つ以上の独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及び/又は(ii)態様1～134のいずれかの1つ以上の独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするもう1つの核酸、のいずれかを、それを必要とする対象(例えば、ヒト)に投与することを含む、前記方法。
182.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)のwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む、態様181に記載の方法。
183.前記独立して選択されるwt.又は変異型IL-2 MODポリペプチドが、配列番号9のIL-2ポリペプチド又はその変異型を含む、態様182に記載の方法。
184.前記独立して選択される変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、
(i)配列番号9の少なくとも80個(例えば、少なくとも90、100、110、120、130、もしくは133個)の連続するaasに対する、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)のaa配列同一性、又は
(ii)配列番号15～27のいずれかの少なくとも80個(例えば、少なくとも90、100、110、120、130、もしくは133個)の連続するaasに対する、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)のaa配列同一性、を有する配列を含む、態様183に記載の方法。
185.前記独立して選択される変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、N88、F42、及び/又はH16のうちのいずれか1つ、2つ、もしくは3つ全ての置換を含む、態様182～184のいずれか1つに記載の方法。
186.前記独立して選択される変異型IL-2 MODポリペプチド配列が、(i)F42A；(ii)F42T；(iii)H16A；(iv)H16T；(v)F42A及びH16A；(vi)F42T及びH16A；(vii)F42A及びH16T；又は(viii)F42T及びH16T置換、からなる群から選択される置換又は一対の置換を含む、態様182～185のいずれか1つに記載の方法。
187.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ)のwt.又は変異型PD-L1ポリペプチド配列を含む、態様181～186のいずれか1つに記載の方法。
188.前記独立して選択される変異型PD-L1ポリペプチド配列が、配列番号2の少なくとも170個の連続するaa(例えば、少なくとも180、190、又は200個の連続するaa)に対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％)のaa配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、態様187に記載の方法。
189.前記1つ以上のマスキングされたTGF-βポリペプチドのうちの少なくとも1つが、独立して選択されるwt.又は変異型IL-10ポリペプチド配列(例えば、IL-10M1などの単量体異性体)を含む、態様181～188のいずれか1つに記載の方法。
190.前記独立して選択されるwt.又は変異型IL-10ポリペプチド配列が、配列番号50又は51の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、又は少なくとも160個)の連続するaaに対して少なくとも80％(少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％)のaa配列同一性を有する(例えば、該配列が変異型IL-10配列である場合、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)ポリペプチド配列を含み、該変異型IL-10ポリペプチド配列が、任意に、配列番号51のN49とK50との間に、又は配列番号49又は50の相当する位置に、5～7aaの挿入(例えば、配列番号51のaa49とaa50との間へのIL-10M1
Figure 2023500066000114
 の挿入)を含む、態様189に記載の方法。
191.前記独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、独立して選択されるwt.又は変異型FasLポリペプチド配列を含む、態様181～190のいずれか1つに記載の方法。
192.前記独立して選択されるwt.又は変異型のFasLポリペプチド配列が、配列番号144の少なくとも50個の連続するaa(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも140、少なくとも160、又は少なくとも180個の連続するaa)に対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％)のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)を含む、態様191に記載の方法。
193.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、ビタミンD(例えば、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3)、レチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)、及び/又はラパマイシンのいずれか1つ、2つ、もしくは3つ全ての投与の前に、同時に、組み合わせて、又は後に投与される、態様181～192のいずれか1つに記載の方法。
194.前記自己免疫疾患が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性不妊症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、クローン病、グッドパスチュア症候群、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症(MG)、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、硬皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、1型糖尿病(T1D)、脈管炎及び白斑からなる群から選択される、態様181～193のいずれか1つに記載の方法。
195.前記自己免疫疾患が、T1D又はセリアック病である、態様181～193のいずれか1つに記載の方法。
196.前記自己免疫疾患が、T1D又はセリアック病以外である、態様181～193のいずれか1つに記載の方法。
197.前記方法が、アレルギー反応の治療又は予防方法である、態様181～193のいずれか1つに記載の方法。
198.前記アレルギー反応が、ピーナッツ、木の実、植物花粉、ラテックス、ハチ毒、又はスズメバチ毒のアレルゲンに対する反応である、態様197に記載の方法。
199.前記方法が、火傷又は創傷の治療又は予防を提供する方法である、態様181～190のいずれか1つに記載の方法。
200.前記創傷が、前記表皮又は粘膜の擦り傷、剥離創、切開、裂傷、又は刺し傷である、態様199に記載の方法。
201.(i)態様1～134のいずれかの1つ以上の独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体、及び/又は(ii)態様1～134のいずれかの1つ以上の独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードするもう1つの核酸が、前記創傷の形成前、形成中及び/又は形成後に投与される、態様200に記載の方法。
202.前記火傷及び/又は創傷が、外科的又は他の医療的処置中に生じるか、又はその結果である、態様199～201のいずれか1つに記載の方法。
203.前記1つ以上の独立して選択されるマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、創傷又は火傷の部位に投与される、態様199～202のいずれか1つに記載の方法。
204.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体(有効量)、及び/又は前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、組換え発現ベクター)の投与が、創傷の閉鎖を促進する(閉鎖までの時間を短縮する)か、治癒時間を短縮するか、又は未処置の対象もしくは創傷と比較して瘢痕形成を低減する、態様199～203のいずれか1つに記載の方法。
205.前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)のwt.(例えば、配列番号29又は配列番号31)又は変異型IL-4ポリペプチド配列を含む、態様181に記載の方法。
206.前記変異型IL-4ポリペプチド配列が、配列番号29又は配列番号31の少なくとも80個の連続するaa(例えば、少なくとも100、又は110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)を含む、態様205に記載の方法。
207.前記疾患又は障害が、蠕虫感染症である、態様205～206のいずれか1つに記載の方法。
208.前記少なくとも1つのマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)のwt.(例えば、配列番号35のポリペプチド)又は変異型IL-6ポリペプチド配列を含む、態様181に記載の方法。
209.前記変異型IL-6ポリペプチド配列が、配列番号35の少なくとも80個の連続するaa(例えば、少なくとも100、又は110個の連続するaa)に対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％のaa配列同一性を有するポリペプチド配列(例えば、少なくとも1個のaa置換、欠失もしくは挿入を有する)を含む、態様208に記載の方法。
210.前記疾患又は障害が、(例えば、腸内の)細菌及び/又は真菌感染症である、態様204～209のいずれか1つに記載の方法。
211.前記少なくとも1つマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、独立して選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ)のwt.又は変異型IL-21及び/もしくはIL-23ポリペプチド配列を含む、態様181に記載の方法。
212.前記少なくとも1つの(例えば、少なくとも2つの)IL-21 MODポリペプチド配列が、(i)配列番号58もしくは60のポリペプチド配列、又は、(ii)配列番号58もしくは60の、少なくとも50個(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、もしくは少なくとも110個)の連続するaaに対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)のaa配列同一性を有し、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有するポリペプチド配列を含む、態様209に記載の方法。
213.前記少なくとも1つの(例えば、少なくとも2つの)IL-23 MODポリペプチド配列が、(i)配列番号63及び/もしくは65のポリペプチド配列、又は、(ii)配列番号63及び/もしくは65の、少なくとも50個(例えば、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも140、少なくとも160、少なくとも180、少なくとも200、少なくとも220、少なくとも240、少なくとも260、少なくとも280、少なくとも300、少なくとも320、もしくは少なくとも340個)の連続するaasに対して、少なくとも80％(例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)のaa配列同一性を有し、少なくとも1個のaa置換、欠失、もしくは挿入を有するポリペプチド配列を含む、態様211又は212に記載の方法。
214.前記疾患又は障害が、高親和性抗体又は充分な量の高親和性抗体を産生することができないことである、態様211～213のいずれか1つに記載の方法。
215.哺乳動物対象の忍容性を誘導する方法であって、
(i)態様1～136のいずれかの、1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))、
(ii)態様1～136のいずれかの1つ以上の、マスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体、又はマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))であって、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型IL-2ポリペプチド配列を含むもの、
(iii)態様1～136のいずれかの1つ以上の、マスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体、又はマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))であって、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体のうちの少なくとも1つが、wt.又は変異型FasLポリペプチド配列を含むもの、又は
(iv)態様1～136のいずれかの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体、又はマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))であって、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体のうちの少なくとも1つが、wt.もしくは変異型IL-2ポリペプチド配列を含み、かつ、該1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体のうちの少なくとも1つが、wt.もしくは変異型FasLポリペプチド配列又はwt.もしくは変異型IL-10ポリペプチド配列を含むもの、を該対象に投与することを含む、前記方法。
216.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)(例えば、Cox-1及び/又はCox-2阻害剤、例えば、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、及びナプロキセン)を投与することをさらに含む、態様137～215のいずれか1つに記載の方法。
217.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、コルチコステロイド(例えば、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エタメタゾネブ(Ethamethasoneb)、フルドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びトリアムシノロン)を投与することをさらに含む、態様137～216のいずれか1つに記載の方法。
218.腫瘍壊死因子α(例えば、ゴリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブ、アダリムマブなどの抗TNFα、又はエタネルセプトなどのTNFαおとり受容体)の1つ以上の作用を遮断する薬剤を、前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に投与することをさらに含む、態様137～217のいずれか1つに記載の方法。
219.1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、IL-1と競合的にIL-1受容体に結合する薬剤(例えば、アナキンラ)を投与することをさらに含む、態様137～218のいずれか1つに記載の方法。この態様では、対象に投与される前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のいずれかがIL-1ポリペプチドを含む場合、IL-1と競合的にIL-1受容体に結合する薬剤は投与されないことが前提である。
220.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、IL-6受容体に結合して、受容体を介したシグナル伝達からIL-6を阻害する薬剤(例えば、トシリズマブ)を投与することをさらに含む、態様137～219のいずれか1つに記載の方法。この態様では、対象に投与される1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体のいずれかがIL-6ポリペプチドを含む場合、IL-6受容体に結合する薬剤は投与されないことが前提である。
221.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、CD80又はCD86受容体に結合してT細胞増殖及び/又はB細胞免疫応答を阻害する薬剤(例えば、アバタセプト)を投与することをさらに含む、態様137～220のいずれか1つに記載の方法。
222.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に、CD20に結合してB細胞死をもたらす薬剤(例えば、リツキシマブ)を投与することをさらに含む、態様137～221のいずれか1つに記載の方法。
223.前記哺乳動物対象が、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、ネズミ、ヤギ類、サル類、ヒツジ、ウマ、ラッピン、ブタなどの対象から選択される、態様137～222のいずれか1つに記載の方法。
224.前記対象が、ヒト(例えば、ヒト患者又は治療もしくは予防を必要とするヒト対象)である、態様137～223のいずれか1つに記載の方法。
225.TGF-βポリペプチド、又は、TGF-βポリペプチド及び免疫調節ポリペプチド(MOD)を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、
(i)態様1～134のいずれか1つの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体、
(ii)1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型MOD配列を含む、態様1～134のいずれか1つの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体、又は
(iii)態様135～136のいずれか1つの1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードし、任意に1つ以上の独立して選択されるwt.又は変異型MODをコードする、1つ以上の核酸、と接触させることを含む、前記方法。
226.マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を発現する細胞を産生する方法であって、態様1～134のいずれかのマスキングされたTGF-β構築物又は複合体をコードする1つ以上の核酸(例えば、発現ベクター(複数可))を細胞(例えば、インビトロの哺乳動物細胞)に導入することを含み、任意で、少なくとも1つの細胞染色体に組み込まれていない、及び/又は組み込まれている、前記1つ以上の核酸の全て又は一部を含む細胞を選択(例えば、抗生物質による選択、続いて、前記1つ以上の核酸のいずれかが細胞染色体に組み込まれたか否かを決定する分析)を行うことを含む、前記方法。
227.前記細胞が、HeLa細胞、CHO細胞、293細胞、Vero細胞、NIH3T3細胞、Huh-7細胞、BHK細胞、PC12、COS細胞、COS-7細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、及びHLHepG2細胞から選択される哺乳動物細胞株の細胞である、態様224に記載の方法。
228.態様226又は227に記載の方法によって調製された、マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を一過的に又は安定的に発現する細胞。
229.前記細胞が、前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体を発現しない他の同一の細胞と比較して、生存率が実質的に低下(5％、10％、又は15％未満の低下)することなく、約25～約350mg/リットル以上(例えば、約25～約100、約100～約200、約200～約300、約300～約350mg/リットル、又は350mg/リットル超)のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を発現する、態様228の細胞。
230.wt.又は変異型IL-2 MODポリペプチド配列を含む前記マスキングされたTGF-β構築物又は複合体の前記投与が、前記対象、細胞、組織、又は体液中の1つ以上のT細胞(例えば、Th1、Th2、Th17、及び/もしくはTh22細胞などの炎症性T細胞)の調節をもたらす、態様138～142のいずれか1つに記載の方法。
231.前記1つ以上のT細胞が、Th1細胞であり、前記調節が、下記の場合との、Th1細胞の数の減少、Th1細胞によるインターフェロンγの発現もしくは分泌の減少、又は前記対象、細胞、組織、又は体液中のインターフェロンγのレベルの比較によって評価される、態様230に記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない処置群の前記対象、細胞、組織、又は体液中のインターフェロンγの(例えば、1人の対象、又は2人以上の対象からの平均)量の場合。
232.前記1つ以上のT細胞が、Th2細胞であり、前記調節が、下記の場合との、Th2細胞の数の減少、Th2細胞によるIL-4、IL-5、及び/又はIL-13の発現又は分泌の減少、又は前記対象、細胞、組織、又は体液におけるL-4、IL-5、及び/又はIL-13のレベルの比較によって評価される、態様230に記載の方法。
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない処置群の前記対象、細胞、組織、又は体液中のL-4、IL-5、及び/又はIL-13の(例えば、1人の対象、又は2人以上の対象からの平均)量の場合。
233.前記1つ以上のT細胞が、Th17細胞であり、前記調節が、下記の場合との、Th17細胞の数の減少、Th17細胞によるIL-17及び/もしくはIL-22の発現もしくは分泌の減少、又は前記対象、細胞、組織、もしくは体液におけるIL-17及び/もしくはIL-22のレベルの比較によって評価される、態様230に記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない処置群の前記対象、細胞、組織、又は体液中のIL-17及び/又はIL-22の(例えば、1人の対象、又は2人以上の対象からの平均)量の場合。
234.前記1つ以上のT細胞が、Th22細胞であり、前記調節が、下記の場合との、Th22細胞の数の減少、Th22細胞による少なくとも2つの又はIL-22、IL-13及び/もしくはTNF-αの発現もしくは分泌の減少、又は対象、細胞、組織、もしくは体液におけるIL-22、IL-13及び/もしくはTNF-αのレベルの比較によって評価される、態様230に記載の方法：
(i)前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体の投与前又は無投与の場合、又は
(ii)(例えば、疾患状態、年齢、性別、身長、体重、及び/又は喫煙習慣のうちの1つ以上)については該対象と一致するが、TGF-β、又はマスキングされたTGF-β構築物又は複合体を投与されていない処置群の前記対象、細胞、組織、又は体液中のIL-22、IL-13、及びTNF-αの(例えば、1人の対象、又は2人以上の対象からの平均)量の場合。
235.前記方法が、前記対象、細胞、組織、又は体液中のIL-4、IL-17、及び/又はインターフェロンγのうちの1つ以上の発現、分泌、又はIL-4、IL-17、及び/又はインターフェロンγのうちの1つ以上のレベル、を評価することをさらに含む、態様234に記載の方法。
236.前記T細胞が、バイスタンダーT細胞である、態様230～235のいずれか1つに記載の方法。
237.前記1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、ビタミンD(例えば、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3又はビタミンD類似体(例えば、ビタミンD3)、mTOR阻害剤(例えば、ラパマイシン)、及び/又はレチノイン酸(例えば、オールトランスレチノイン酸)のうちのいずれか1つ以上の投与前、投与中(同時投与もしくは併用投与)、又は投与後に投与される、態様230～236のいずれか1つに記載の方法。
238.前記wt.もしくは変異型IL-2 MODを含むマスキングされたTGF-β構築物又は複合体が、図1の構造A～Fに示される構造を有する、態様230～237のいずれか1つに記載の方法。
239.前記Fc領域が、免疫グロブリンエフェクター配列を欠く(wt.タンパク質と比較して、補体成分1q(「C1q」)結合が減少し、したがって、補体依存性の細胞傷害に関与する能力が減少している)、態様238に記載の方法。
VI.実施例
下記の実施例は、本発明の製造方法及び使用方法の開示及び説明についてより完全性を期すために当業者に提供するために提示するものであって、本発明について本発明者らが想定する範囲を限定することを意図するものではなく、また、下記の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用する数値(例えば、量、温度など)に関して、正確さを確保するように努めてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に明記されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はその付近である。標準的な略語、例えば、bp：塩基対(複数可)、kb：キロベース(複数可)、μl：マイクロリットル(複数可)、pl：ピコリットル(複数可)、s又はsec：秒(複数可)、min：分(複数可)、h又はhr：時間(複数可)、aa：アミノ酸(複数可)、kb：キロベース(複数可)、bp：塩基対(複数可)、nt：ヌクレオチド(複数可)、i.m.：筋肉内(に)、i.p.：腹腔内(に)、s.c.：皮下(に)、wt.：野生型などが使用され得る。
A.実施例1：
1.一本鎖ポリペプチドのマスキングされたTGF-β構築物
マスキングされたTGF-βタンパク質を提示するインタクトな一本鎖ポリペプチドの安定した発現を、所望の成分をコードする核酸を調製し、哺乳動物細胞の発現ベクターを使用して発現させることによって実証した。この核酸は、N末端からC末端にかけて、MODポリペプチド配列(例えば、wt.IL-2ポリペプチド配列(配列番号20など)、又はそのIL-2ポリペプチドの変異型であって、H16及び/又はF42での置換を有するもの、Fc二量体化を防止する置換と共にL234A及びL235A置換を有するIgG1Fc足場ポリペプチド配列、II型TGF-β受容体(例えば、D32N及び/又はD118A配列変異を有するTGF-βRIIBアイソフォームポリペプチド配列)、並びにTGF-βポリペプチド配列(例えば、wt.TGF-β3又はC77S配列変異体を含む)をコードする。発現したタンパク質の全体構造を有する概略図を、構造Aとして図1に示し、その一例を、構築物3470(配列番号146)として図7Aに示し、かかるポリペプチドのaa配列の別の例は、エレメントを標識して整列させた構築物番号3472であり、配列番号157として図7Gに示す。哺乳動物の(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(又はCHO)細胞における)タンパク質発現に好適なプラスミド中で核酸を構築した後、タンパク質を発現させ、プロテインA及びサイズ分離クロマトグラフィーを使用して精製した。
構築物3470及び3472の構築及び単離に加えて、2つの追加の一本鎖ポリペプチドのマスキングされたTGF-β構築物、3466及び3468を調製した。構築物3470は、構築物3472、3466、及び3468(下記、(i)～(iii)として付番される)と共に、特に古典的なFc会合を通じて、実質的に二量体化しない一本鎖マスキングされたTGF-βタンパク質を調製することの実現可能性を実証する。ポリペプチドは、N末端からC末端にかけて、下記のポリペプチド配列を含む：
(i)wt.IL-2-IgGFc-TβRIIΔ25(D32N、D118A)置換-TGF-β3(C77S)(図7G、構築物番号3472)配列番号157；
(ii)IL-2(H16T、F42A)-IgGFc-TβRIIΔ25(D118)-TGF-β3(C77S)(図7H、構築物番号3466)配列番号158、及び
(iii)IL-2(H16T、F42A)-IgGFc-TβRIIΔ25(D32N、D118)-TGF-β3(C77S)(図7I、構築物番号3468)配列番号159。
上記に示されるように、一本鎖ポリペプチドのマスキングされたTGF-β構築物は、Fc領域の二量体化を防止する、例えば、配列番号71のIgG1配列で付番されるL131(例えば、L131K)、T146(例えば、T146S)、P175(例えば、P175V)、F185(例えば、F185R)、Y187(例えば、Y187A)、及びK189(例えば、K189Y)での置換を含み得る。(i)～(iii)の上記構築物は、配列番号71のIgG1配列に番号を付したL131K、T146S、P175V、F185R、Y187A、及びK189Yを含む。
2.ヘテロ二量体ポリペプチド鎖
2つのポリペプチドから構成されるマスキングされたTGF-β複合体の安定的な発現を、TGF-βポリペプチド配列を含む第1のポリペプチドをコードする核酸と、TGF-β受容体ポリペプチド配列をコードする第2の核酸とを調製し、哺乳動物発現ベクター(例えば、CHO細胞内のプラスミド発現系)を用いてポリペプチドを発現させることにより、マスキングされたTGF-β構築物を実証した。第1のポリペプチドは、例えば、MODポリペプチド配列(例えば、wt.又は変異型IL-2ポリペプチド配列)、IgGFc足場ポリペプチド配列(例えば、KiHFc)、及びTGF-βポリペプチド配列(例えば、TGF-β1もしくはwt.TGF-β3を有するwt.又は変異型配列)を含む(例えば、図7Jの構築物3618を参照されたい)。第2のポリペプチドは、例えば、MODポリペプチド配列(例えば、wt.又は変異型IL-2ポリペプチド配列)、IgGFc足場ポリペプチド配列(例えば、第1のポリペプチドのKiH配列の相手側)、及びII型TGF-β受容体(TGF-βRII)ポリペプチド配列(wt.又は配列変異を有する)を含む(例えば、図7Jの構築物3621を参照されたい)。発現したタンパク質の概略構造を、構造Dとして図1に示す。1つのかかるポリペプチド対(iv.a)及び(iv.b)の発現及び精製(プロテインA及びクロマトグラフィーによるサイズ分離)は、N末端からC末端にかけて、下記のポリペプチド配列を含む：
(iv.a)IL-2(wt.MOD)-ノブインホールFc(例えば、ノブFc)-TGF-β3(wt.)(図7Jの構築物3618(配列番号148)を参照されたい)；及び
(iv.b)IL-2(wt.MOD)-ノブインホールFc(例えば、ホールFc)-TβRII(D32N)(図7Jの構築物3621(配列番号160を参照されたい)。
構築物(iv.a)又は(iv.b)において、IL-2ポリペプチドは、H16及び/又はH42における置換、例えば、H16T及びF42A置換、又はH16A及びF42A置換を含み得る。
3.マスキングされたTGF-β構築物の活性
様々な濃度の精製されたマスキングされたTGF-βポリペプチド複合体及び構築物(例えば、本実施例のパート1及び2で調製された構築物(i)～(iii)及びポリペプチド(vi.a)及び(vi.b)の複合体)を用い、ナイーブCD4細胞を誘導してFoxP3を産生する能力について試験した。アッセイの際、105個のナイーブCD4細胞を、5μg/mlの結合した抗CD3を含有するウェルに、1μg/mlの抗CD28、及び表示するマスキングされたTGF-βポリペプチド複合体又は構築物と共にプレーティングした。培養開始から5日後、蛍光標識抗CD4及び抗FoxP3を使用して、フローサイトメトリーにより培養物中のFoxP3CD4＋二重陽性細胞の数を評価した。また、TGF-β3、又はTGF-β3＋組換えヒトIL-2 100U/ml、のいずれかによる刺激を与える対照実験も並行して行った。
図6のAにおいて、図1のAに示す全体構造を有する、D32N置換TGF-β3を有するwt.IL-2-IgG Fc(mFc)-TβRIIを含むマスキングされたTGF-β構築物の比較を、FoxP3の発現について、IL-2の有無において、wt.TGF-β3の効果との比較により試験した。図6のAにおける結果は、wt.TGF-β3が、試験条件下ではFoxP3を効果的に刺激しないが、wt.IL-2補充によりFoxP3発現がもたらされることを示す。
図6のBにおいて、本実施例のパート1及び2に由来するマスキングされたTGF-β構築物(i)、(ii)及び(iii)と、ポリペプチド(iv.a)及び(iv.b)を含むマスキングされたTGF-β複合体との比較を、FoxP3の発現について、IL-2の存在下でのwt.TGF-β3の効果との比較により試験した。図6のBにおける結果は、wt.IL-2を有するマスキングされたTGF-β構築物及び複合体が、H16T及びF42A置換のIL-2を有するものよりも強力であることを示す。H16T及びF42Aにおける置換は、FoxP3を発現する細胞数に基づく最大有効性の実質的な変化なしに、マスキングされた複合体の効力を約5ナノモルから約50ナノモルへ一桁大きくシフトさせる。図6のAに示す結果と同様に、マスキングされたTGF-β構築物及び複合体は、T細胞を誘導してFoxP3を産生する際、IL-2及びTGF-β3よりも効果的であった。
CD4＋及びFoxP3に基づく細胞のゲーティング及び分離の例を図6のCに示す。この結果は、マスキングされたTGF-β構築物1,000nMで曝露された細胞におけるFoxP3の誘導により、同じ構築物0.1nMで曝露された細胞よりもFoxP3発現が約30倍増加することを示す。
B.実施例2
1.相互特異的でないものでの足場
このセクションでは、相互特異的な足場を使用せず、したがって単量体であるか、又は二量体化する場合であっても相手側の配列と優先的にヘテロ二量体を形成しない、マスキングされたTGFβ配列について説明する。
a.一本鎖ポリペプチドのマスキングされたTGF-β構築物
N末端からC末端にかけて、MODポリペプチド配列：wt.IL-2ポリペプチド配列(配列番号20)、L234A及びL235A(「LALA」)、L351K、T366S、P395V、F405R、Y407A、及びK409Y置換を有するIgG1Fc足場ポリペプチド配列(wt.IgG1 aas11～215(Δ10))、D118A置換を有する成熟タンパク質のaa26～136aasのTGF-βRIIアイソフォームBポリペプチド配列(＊D119Aは、図5Bの注記を参照されたい)、並びにC77S置換を有するヒトTGF-β3型アイソフォーム1ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする核酸。発現したタンパク質の概略構造を、構造A(配列番号146)として図1に示す。このタンパク質をプロテインA及びサイズクロマトグラフィーによって精製した。
b.ホモ二量体ポリペプチド複合体
N末端からC末端にかけて、MODポリペプチド配列(H16T及びF42A置換を有するIL-2配列番号20)、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1)、D118A置換を有する成熟タンパク質のaa26～136aasのTGF-βRIIアイソフォームBポリペプチド配列(＊D119Aは図5Bの注記を参照)、並びにC77S置換を有するヒトTGF-β3型アイソフォーム1ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする核酸。発現したタンパク質の概略構造を構造Bとして図1に示す。エレメントを標識して整列させた対応するaa酸配列を図7Bに示す(配列番号147)。このタンパク質をプロテインA及びサイズクロマトグラフィーによって精製した。
2.相互特異的足場ポリペプチドを有し、ヘテロ二量体であるマスキングされたTGF-β複合体
a.各々IL-2 MODポリペプチドを含む相互特異的足場を有する、ヘテロ二量体であるマスキングされたTGF-β複合体
2つのポリペプチドから構成されるマスキングされたTGF-β複合体の安定的な発現により、TGF-βポリペプチド配列を含む第1のポリペプチドをコードする核酸と、TGF-β受容体ポリペプチド配列をコードする第2の核酸とを調製し、哺乳動物発現ベクター(例えば、CHO細胞内のプラスミド発現系)を用いてポリペプチドを発現させることにより、マスキングされたTGF-β構築物を実証した。
第1のポリペプチドは、wt.IL-2ポリペプチド(配列番号20)、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、及びT366W KiH「ノブ」置換、及びC77S置換を有するヒトTGF-βタイプ3アイソフォーム1ポリペプチド配列を含む。
第2のポリペプチドは、wt.IL-2ポリペプチド(配列番号20)、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、及びT366S、L368A及びY407VのKiH「ホール」置換、及びD118A置換を有する成熟タンパク質のaa26～136aasのTGF-βRIIアイソフォームBポリペプチド配列を含む。発現したタンパク質の概略構造を、図1に構造Dとして示す。対応するaa酸配列をエレメントを標識して整列させ、図7Cに示す。発現及び精製(プロテインA、続いてサイズ排除クロマトグラフィー)により、ヘテロ二量体複合体を得る。
b.一本鎖でMODポリペプチドを含む、相互特異的足場を有するヘテロ二量体であるマスキングされたTGF-β複合体
2つのポリペプチドから構成されるマスキングされたTGF-β複合体の安定的な発現により、TGF-βポリペプチド配列を含む第1のポリペプチドをコードする核酸と、TGF-β受容体ポリペプチド配列をコードする第2の核酸とを調製し、哺乳動物発現ベクター(例えば、CHO細胞内のプラスミド発現系)を用いてポリペプチドを発現させることにより、マスキングされたTGF-β構築物を実証した。
第1のポリペプチドは、wt.IL-2ポリペプチド(配列番号20)、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、及びT366W(ノブ)置換、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3型アイソフォーム1ポリペプチド配列を含む。
第2のポリペプチドは、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、及びT366S、L368A及びY407Vの「ホール」置換、及びD118A置換を有する成熟タンパク質のaa26～136aasのTGF-βRIIアイソフォームBポリペプチド配列を含む。
発現したタンパク質の概略構造を図1に構造Eとして示す。エレメントを標識して整列させた対応するaa酸配列を、図7Dに示す。発現及び精製(プロテインA、続いてサイズ排除クロマトグラフィー)により、ヘテロ二量体複合体を得る。
c.一本鎖MODポリペプチドを有する、相互特異的足場ポリペプチド安定化している、ヘテロ二量体であるマスキングされたTGF-β複合体
2つのポリペプチドから構成されるマスキングされたTGF-β複合体の安定的な発現を、TGF-βポリペプチド配列を含む第1のポリペプチドをコードする核酸と、TGF-β受容体ポリペプチド配列をコードする第2の核酸とを調製し、哺乳動物発現ベクター(例えば、CHO細胞内のプラスミド発現系)を用いてポリペプチドを発現させることにより、マスキングされたTGF-β構築物を実証した。
第1のポリペプチドは、IL-2ポリペプチド配列(H16T及びF42A置換を有する配列番号20)、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、及びT366W(ノブ)置換、D118A置換を有する成熟タンパク質のaa26～136aasのTGF-βRIIアイソフォームBポリペプチド配列、及びC77S置換を有するヒトTGF-β3型アイソフォーム1ポリペプチド配列を含む。
第2のポリペプチドは、IgG1Fc足場ポリペプチド配列(例えば、L234A及びL235A(「LALA」)置換を有するwt.IgG1残基1～225)、並びにT366S、L368A及びY407V「ホール」置換を含む。
発現したタンパク質の概略構造を、図1に構造Fとして構造のバリエーションを示すが、第2のポリペプチド上の任意の免疫調節ポリペプチド配列を欠くものである。エレメントを標識して整列させた対応するaa酸配列を図7Eに示す。発現及び精製(プロテインA、続いてサイズ排除クロマトグラフィー)により、ヘテロ二量体複合体を得る。
C.実施例3 発現及び精製
1つのマスキングされたTGF-β構築物をコードする核酸、2つのマスキングされたTGF-β複合体をコードする核酸、を調製した(図8を参照)。ExpiCHO細胞に核酸構築物をトランスフェクトし、その細胞でポリペプチドを発現させることによって、複合体のサンプルを調製した。プロテインAクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによってポリペプチドを精製した。精製したタンパク質をSDS-PAGEにかけ、得られたゲルをクマシーブルーで染色した。NR＝還元されていない又は非還元サンプル、R＝還元されたサンプル(ジスルフィド還元剤による還元)。
D.実施例4 生物学的活性及びマスキングポリペプチドとTGF-βとの間の親和性
一連のマスキングされたTGF-β構築物を調製して、TGF-βの生物学的利用能を実証し、TβRIIと相互作用するその能力が、TGF-βポリペプチド配列に対するマスキングポリペプチドの親和性に反比例することを示した。構築物は、図1の構造Aの形態であり、N末端からC末端にかけて、MODであるIL-2ポリペプチド、足場であるIgGポリペプチド、マスキング受容体である、N末端aas1～25が欠失(Δ25)し、D118A置換(示されるように、追加の置換E55A、D32N、又はS52Lを含む)を有する配列番号119のTβRIIポリペプチド、及びTGF-β3ポリペプチド配列を有した。
TβRII-IgFc融合体をマイクロタイタープレートのウェル中に捕捉し、様々な濃度の4つの構築物をウェルに適用する捕捉アッセイを用いて、マスキングされたTGF-β構築物とTβRIIとの相互作用を評価した。非結合の構築物を洗い流した後、結合した構築物を、ビオチン標識抗IL-2、続いてストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び450nmでの比色検出(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン)を用いて、検出して測定した。図9に示す結果は、Δ25～D118A構築物がTβRII(TβRII-Ig融合体)に対する親和性が最も低かったことを示す。TGF-β3-TβRII複合体に対する解離定数の影響がより大きくなるE55A、D32N又はS52L置換の追加により、外因性TβRII(この場合はTβRII-Ig融合体)に対する親和性が増加した複合体が得られる。
E.実施例5 一本鎖変異型IL-2 MODポリペプチドを有する相互特異的足場ポリペプチド安定化している、ヘテロ二量体であるマスキングされたTGF-β複合体(PSM-4033-4039)の生物学的活性
図10Aに示すマスキングされたTGF-β複合体、PSM-4033-4039を調製した。複合体は、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチド、4033及び4039を含み、それぞれ、図10B及び10Cに示す。次に、PSM-4033-4039で一連の実験を行った。
実験1：ヒト末梢ナイーブCD4＋T細胞からのFoxp3＋ iTregの誘導
ナイーブCD4＋T細胞をヒト血液から選別し、抗ヒトCD3(5ug/mL)、抗ヒトCD28(1ug/mL)で、PSM-4033-4039を用量を増加させて、又は陽性対照として組換えTGFb3及びIL-2を単回投与で、プレーティングした。培養開始の5日後、フローサイトメトリーにより、転写因子Foxp3の発現について細胞を評価した。n＝2、stdev。図11に提供される結果は、最大1,000nMの濃度でPSM-4033-4039で曝露された細胞におけるFoxP3の有意な誘導を示す。これらの結果は、他のマスキングされたTGF-β構築物及び複合体を用いた図6Bに示されるものと同様であり、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体が、天然及び誘導体Tregの両方を含めたTregにおける、遺伝子発現の主な調節因子であり、Tregの独自性及び機能の中心であるFoxP3の有意な誘導に影響を及ぼすことができることをさらに実証する。
実験2：PSM-4033-4039が誘導するFoxp3＋ iTregによるT細胞増殖の抑制
PSM-4033-4039で誘導されたFoxp3＋制御性T細胞(iTreg)を、通常のT細胞(Tレスポンダー)に対していくつかの比率で培養し、抗ヒトCD3(1ug/mL)及びマイトマイシンCで処理した末梢血単核細胞(PBMC)で刺激した。4日後にフローサイトメトリーを用いて、Tレスポンダー細胞中のセルトレースバイオレット(CTV)色素の希釈により増殖を評価した。図12に示されるデータは、3人のドナーの平均を表し、各々2連でプレーティングした。TGF-β3及びIL-2誘導された制御性T細胞又はトータル末梢CD4＋T細胞を、対照として、iTregの代わりに使用した。無添加のiTreg対照と比較した、CTVの色素希釈の減少％を、抑制と定義する(平均78％のCTV希釈)。この実験の結果は、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体、例えば、PSM-4033-4039によって誘導されたFoxp3＋制御性T細胞が、PBMC内の抗原提示細胞によって提供される、CD3架橋及び共刺激によって活性化されるT細胞の増殖を抑制することができることを実証する。
転写因子であるFoxp3の発現を超えたTregの決定的な特徴は、他の白血球の活性化及び機能を抑制する能力である。この実験は、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体によって誘導されるiTregが、PBMC内の抗原提示細胞によって提供される、CD3架橋及び共刺激によって活性化されるT細胞の増殖を、確実に抑制することができることを実証する。
実験3：PSM-4033-4039による、ヒト末梢CD4＋T細胞からのFoxp3＋発現の誘導
トータルCD4＋T細胞をヒト血液から選別し、抗ヒトCD3(5ug/mL)、抗ヒトCD28(1ug/mL)で、PSM-4033-4039を用量を増加させてプレーティングした。培養開始の5日後、フローサイトメトリーにより、転写因子Foxp3の発現について細胞を評価した。n＝2。図13Aにデータを示す。
CD4＋T細胞種の混合物中のどの細胞種がFoxp3発現細胞に分化し得るかを決定するために、異なる集団を選別し、PSM-4033-4039で個別に処理した。したがって、図13Aのドナーとは異なるドナーのナイーブ、トータル、及びメモリーCD4＋T細胞を、上記と同じ方式で選別し、PSM-4033-4039(300nM)の有無において培養し、5日目にフローサイトメトリーによりFoxp3を評価した。データを図13Bに示す。
この実験でFoxp3発現細胞に分化したトータルCD4＋T細胞は、ナイーブ及びメモリー末梢T細胞の両方を表し、これらは、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体、例えばPSM-4033-4039が、インビボで投与されるときに遭遇するであろう細胞種の混合物である。このデータは、混合されたT細胞集団においても、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体、例えばPSM-4033-4039が、制御性T細胞を特定する遺伝子発現の主要な調節因子であるFoxp3を発現する細胞頻度を増加させることができることを示す。図13Bに示される結果は、PSM-4033-4039が、ナイーブCD4＋T細胞よりも低い頻度ではあるが、メモリーCD4＋T細胞を誘導してFoxp3＋細胞に分化させることができることを示す。
実験4：同種他家リンパ球反応によって活性化されたCD4＋T細胞からのPSM-4033-4039によるFoxp3＋ iTregの誘導
トータル末梢CD4＋T細胞をヒト血液から選別し、同種他家の単球由来DC(moDC)でプレーティングして、T細胞増殖を誘導した。T細胞を自己由来moDCと混合して対照とし、同種他家ドナー組み合わせ又は自己由来ドナー組み合わせの両方を、追加の対照としての可溶性抗CD3(1ug/mL)で処理した。T細胞をセルトレースバイオレット(CTV)色素で標識して、同種他家による活性化に応答した細胞をトレースした。Foxp3の増殖及び発現を5日目にフローサイトメトリーにより解析し、Foxp3を発現する細胞の増殖頻度を図14A及びBにプロットした。2つのドナーの組み合わせを示す。n＝2、stdev。とりわけ、この結果は、骨髄又は幹細胞を移植された患者で生じる移植片対宿主病の治療のための、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体、例えば、PSM-4033-4039の利用有用性を実証する。
実験5：PSM-4033-4039を使用したマウスにおけるPK実験
PSM-4033-4039を、0.1、1、又は10mg/kgでBalb/cマウスに単回用量として静脈内投与した。次いで、末梢血清サンプルを、投与から5分、2、8、24、及び72時間後に採取した。次に、抗IL2抗体を用いて分子を捕捉するリガンド結合アッセイを用いてPSM-4033-4039の血清濃度を測定し、抗TGFB3抗体を用いて分子を検出した。図15に示す結果は、本明細書に開示されるマスキングされたTGF-β3構築物及び複合体、例えば、PSM-4033-4039が、投与後72時間を超えて生物学的に適切な濃度で血清中に存在し続け得ることを示す。構築物4033の配列を図10B(配列番号191)に示し、構築物4039の配列を図10C(配列番号192)に示す。
本発明における特定の実施態様を参照して本開示を説明してきたが、本開示の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことが可能であること、また均等物で置き換え可能であることを当業者は理解するであろう。加えて、多くの修正を行って、特定の状態、材料、合成物、プロセス、プロセスステップ(単数又は複数)を、本開示の目的、趣旨、及び範囲に適合させてもよい。全てのこのような修正は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。

Claims (15)

  1. 第1のポリペプチドとして、
    (i)足場ポリペプチド配列と、
    (ii)TGF-βポリペプチド配列と、
    (iii)TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列を任意に含むマスキングポリペプチド配列と、
    (iv)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
    (v)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含む構築物であって、
    これらのエレメントを含む構築物が、「マスキングされたTGF-β構築物」と総称され、前記マスキングポリペプチド配列及び前記TGF-βポリペプチド配列が相互に結合する、前記構築物。
  2. 請求項1に記載のマスキングされたTGF-β構築物であって、前記第1のポリペプチドが、N末端からC末端への順に、
    (i)前記足場ポリペプチド配列、前記マスキングポリペプチド配列、及び前記TGF-βポリペプチド配列、
    (ii)第1のMODポリペプチド配列、前記足場ポリペプチド配列、前記マスキングポリペプチド配列、及び前記TGF-βポリペプチド配列、又は
    (iii)第1の独立して選択されるMODポリペプチド配列、第2の独立して選択されるMODポリペプチド配列、前記足場ポリペプチド配列、前記マスキングポリペプチド配列、及び前記TGF-βポリペプチド配列、を含み、
    前記マスキングされたTGF-β構築物が、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む、前記マスキングされたTGF-β構築物。
  3. 前記足場ポリペプチドが、二量体化配列を含み、任意に、前記足場ポリペプチドが、相互特異的二量体化配列を含む、請求項1又は請求項2に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
  4. 前記第1のポリペプチドと二量体化して、マスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体を形成する第2のポリペプチドをさらに含み、
    前記第2のポリペプチドが、
    (i)足場ポリペプチド配列と、
    (ii)TGF-βポリペプチド配列と、
    (iii)TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列を任意に含むマスキングポリペプチド配列と、
    (iv)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
    (v)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含む、請求項1～3のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
  5. 前記第1のポリペプチドが、相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチドを含み、
    前記第2のポリペプチドが、前記第1のポリペプチドの相互特異的結合配列の相手側となる相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列を含み、
    該相互特異的結合配列及び該相手側相互特異的結合配列が、前記ヘテロ二量体において互いに相互作用する、請求項4に記載のマスキングされたTGF-β構築物。
  6. 第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをヘテロ二量体として含む、TGF-β複合体であって、
    (i)該第1のポリペプチドが、
    (a)相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、
    (b)TGF-β受容体ポリペプチド配列又は抗TGF-βポリペプチド配列を任意に含むマスキングポリペプチド配列と、
    (c)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
    (d)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含み、
    (ii)該第2のポリペプチドが、
    (a)該第1のポリペプチドの相互特異的二量体化配列の相手側となる相互特異的二量体化配列を含む、足場ポリペプチド配列と、
    (b)TGF-βポリペプチド配列と、
    (c)任意に、1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列と、
    (d)任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列と、を含み、
    これらのエレメントを含む複合体が「マスキングされたTGF-β複合体」と総称され、
    該マスキングポリペプチド配列及び該TGF-βポリペプチド配列が、相互に結合し、
    該相互特異的結合配列及び該相手側相互特異的結合配列が、該ヘテロ二量体において互いに相互作用(例えば、共有的に又は非共有的に)し、
    該マスキングされたTGF-βの第1のポリペプチド及び/又は該第2のポリペプチドが、任意に、1つ以上の独立して選択されるリンカーポリペプチド配列を含む、前記TGF-β複合体。
  7. 前記第1のポリペプチドが、N末端からC末端に、
    (a)1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、前記相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、前記マスキングポリペプチド配列と、を含むか、又は、
    (b)相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、前記マスキングポリペプチド配列(例えば、TGF-β受容体ポリペプチド配列)と、を含み、
    前記第2のポリペプチドが、N末端からC末端に、1つ又は2つの(又はそれを超える)独立して選択されるMOD配列と、前記相手側相互特異的二量体化配列を含む足場ポリペプチド配列と、前記TGF-βポリペプチド配列と、を含む、請求項6に記載のマスキングされたTGF-β複合体ヘテロ二量体。
  8. 前記足場ポリペプチド配列(複数可)が、IgFcポリペプチド配列及びその変異型からなる群から選択され、任意に、前記IgFcポリペプチド配列が、前記ポリペプチドの補体成分1q(C1q)及び/もしくはFcラムダ受容体(FcλR)への結合を低減し、並びに/又は、前記Igポリペプチドの、例えば、補体依存性細胞傷害(CDC)及び抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介して細胞溶解を誘発する能力を実質的に低減又は排除する変異を含む、請求項1～12のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
  9. 前記1つ以上の独立して選択されるMODポリペプチド配列が、PD-L1、FAS-L、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-23 MODポリペプチド配列及びこれらのいずれかの変異体、からなる群から選択される、請求項1～13のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
  10. 前記MODポリペプチド配列のうちの少なくとも1つが、wt.IL-2 MODポリペプチド配列であるか、あるいは、
    (i)配列番号9の少なくとも80、90、100、110、120、130もしくは133個の連続するaasに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のaa配列同一性を有するか、又は、
    (ii)配列番号13～27の少なくとも80、90、100、110、120、130もしくは133個の連続するaasに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のaa配列同一性又は100％の配列同一性を有する、変異型IL-2 MODポリペプチド配列である、請求項1～9のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
  11. 前記マスキングポリペプチド配列が、TGF-β受容体(「TβR」)ポリペプチド配列であり、TβRのI型(TβRI)、II型(TβRII)又はIII型(TβRIII)のエクトドメイン断片を含む、請求項1～10のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
  12. 前記複合体が、ポリペチド構築物4033(配列番号191)及びポリペチド構築物4039(配列番号192)の組み合わせから形成される、請求項7に記載のマスキングされたTGF-β構築物又は複合体。
  13. 請求項1～12のいずれか1項に記載のマスキングされたTGF-β複合体をコードする1つ以上の核酸。
  14. 哺乳動物の対象におけるTreg細胞を誘導するか、又は前記対象における疾患もしくは症状を治療する方法であって、請求項1～12のいずれか1項に記載の1つ以上のマスキングされたTGF-β構築物もしくは複合体、又は請求項13に記載の核酸を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  15. 前記方法が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性不妊症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、クローン病、グッドパスチュア症候群、糸球体腎炎、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症(MG)、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、硬皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、1型糖尿病(T1D)、セリアック病、脈管炎及び白斑からなる群から選択される自己免疫症状又は疾患の治療のためのものである、請求項14に記載の方法。
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