CN118290564A - 经工程改造的TGFβRII变体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及经工程改造的TGFβRII变体、蛋白质构建体及其使用方法。

Description

经工程改造的TGFβRII变体及其使用方法

相关申请的交叉引用

本公开要求于2023年1月3日提交的美国临时专利申请序列号63/436,822的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已经作为命名为52246-0011WO1_SL_ST26.xml的XML文件以电子方式提交的序列表。创建于2023年10月4日的XML文件的大小为19,331字节。XML文件中的材料特此通过引用整体并入。

技术领域

本公开涉及经工程改造的TGFβRII变体及其使用方法。

背景技术

TGF-β受体2型(TGFΒR2、TGFβRII或TβRII)是TGF-β家族所有成员的配体结合受体，并且在包含成纤维细胞的几乎所有细胞类型中表达。

转化生长因子(TGF)β信号传导途径参与许多细胞过程，包含增殖、分化、粘附、运动和凋亡。这些功能在恶性细胞中往往被破坏，并且TGFβII型受体(TGFβRII)随后被证明是肿瘤抑制基因(TSG)。TGFβ信号传导途径在正常细胞中介导有效的生长抑制，并且根据其作为TSG的作用，癌细胞使用遗传机制和表观遗传机制两者来灭活TGFβRII。

考虑到其在正常细胞和癌细胞中的作用，需要开发针对TGFβRII途径的毒性有限的癌症疗法。

发明内容

本公开涉及经工程改造的TGFβRII变体及其使用方法。

一方面，本公开涉及一种经工程改造的TGFβRII多肽，其包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的氨基酸序列，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽在与SEQ ID NO:7的S49和D118相对应的位置处包括一个或多个氨基酸突变。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括以下中的一种或多种：

(a)与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为G、A、L、M、F、W、K、Q、E、P、V、I、C、Y、H、R、N、D或T；以及

(b)与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为G、A、L、M、F、W、K、Q、E、S、P、V、I、C、Y、H、R、N或T。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E或Q。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的位置32相对应的氨基酸为D。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的位置119相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:7-12中的任一个至少85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ1之间的解离速率低于野生型TGFβRII与TGFβ1之间的解离速率。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ3之间的解离速率低于野生型TGFβRII与TGFβ3之间的解离速率。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽不与TGFβ2结合。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽通过氢键相互作用与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽通过氢键相互作用与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽可以捕获TGFβ(例如，TGFβ1)，并且由此改善肿瘤微环境。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽可以阻断或干扰TGFβ(例如，TGFβ1)与TGFβRII之间的结合。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽可以阻断或干扰在肿瘤细胞、成纤维细胞或免疫细胞的表面上表达的TGFβ(例如，TGFβ1)与TGFβRII之间的结合。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽进一步包括CH2结构域和CH3结构域。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽进一步包括铰链区。

在一些实施例中，CH2结构域为IgG CH2结构域，并且CH3结构域为IgG CH3结构域。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽任选地通过接头序列连接到(a)所述铰链区或CH2结构域的N端，或(b)所述CH3结构域的C端。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:1-6中的任一个相同的氨基酸序列。

一方面，本公开涉及一种蛋白质构建体，其包括本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽。

在一些实施例中，所述蛋白质构建体包括两个或更多个经工程改造的TGFβRII多肽。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽中的至少两个是相同的。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽中的至少两个是不同的。

在一些实施例中，所述蛋白质构建体进一步包括Fc区。

在一些实施例中，所述Fc区为IgG4 Fc区。

在一些实施例中，所述Fc区为IgG1 Fc区(例如，具有LALA突变或LALA-PG突变)。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽连接到Fc区的C端。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽通过肽接头连接到Fc区的C端。

一方面，本公开涉及一种蛋白质构建体，其包括：第一融合多肽，所述第一融合多肽包括本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽、第一CH2结构域和第一CH3结构域；以及第二融合多肽，所述第二融合多肽包括第二CH2结构域和第二CH3结构域，其中所述第一融合多肽和所述第二融合多肽彼此缔合，从而形成二聚体。

在一些实施例中，第二融合多肽进一步包括第二经工程改造的TGFβRII多肽。

一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包括：本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽或本文所述的蛋白质构建体；以及药学上可接受的载剂。

一方面，本公开涉及一种核酸，其编码本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽或本文所述的蛋白质构建体。

一方面，本公开涉及一种载体，其包括本文所述的核酸。

一方面，本公开涉及一种细胞，其包括本文所述的核酸或本文所述的载体。

在一些实施例中，所述细胞为CHO细胞。

一方面，本公开涉及一种产生经工程改造的TGFβRII多肽或包括所述经工程改造的TGFβRII多肽的蛋白质构建体的方法，所述方法包括

(a)在足以使本文所述的细胞产生所述经工程改造的TGFβRII多肽或所述蛋白质构建体的条件下培养所述细胞；以及

(b)收集由所述细胞产生的所述经工程改造的TGFβRII多肽或所述蛋白质构建体。

一方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽或本文所述的蛋白质构建体的组合物。

在一些实施例中，所述受试者患有实体瘤或血液癌。

在一些实施例中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、结肠癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌或肝癌。

一方面，本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的包括本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽或本文所述的蛋白质构建体的组合物接触。

一方面，本公开涉及一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的包括本文所述的经工程改造的TGFβRII多肽或本文所述的蛋白质构建体的组合物接触。

如本文所使用的，术语“经工程改造的TGFβRII多肽”是指衍生自野生型TGFβRII多肽或其一部分(例如，TGFβRII的胞外区)的具有一个或多个突变(例如，插入、缺失或取代)的多肽。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：TGFβRII的胞外区或所述胞外区的一部分。

如本文所使用的，术语“蛋白质构建体”是指具有一个或多个多肽的复合物。在一些实施例中，蛋白质构建体具有两个或更多个多肽，其中所述多肽可以彼此缔合，从而形成二聚体或多聚体。

如本文所使用的，术语“癌症”是指具有不受控制的自主生长能力的细胞。此类细胞的实例包含具有以使细胞生长迅速激增为特征的异常状态或状况的细胞。所述术语意在包含癌性生长，例如肿瘤；致癌过程、转移性组织和恶性转化细胞、组织或器官，而不论组织病理学类型或侵袭性阶段。还包含如呼吸系统、心血管系统、肾脏系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝脏系统、胃肠道系统和内分泌系统等各种器官系统的恶性肿瘤；以及包含恶性肿瘤的腺癌，如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌和小肠癌。“自然出现”的癌症包含不是通过将癌细胞移植到受试者体内来实验性诱导的任何癌症，并且包含例如自发出现的癌症、由于患者暴露于致癌物质所引起的癌症、由插入转基因致癌基因或敲除肿瘤抑制基因而引起的癌症以及由于感染，例如病毒感染，所引起的癌症。术语“癌(carcinoma)”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。术语还包含癌肉瘤，所述癌肉瘤包含由癌性组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。术语“造血肿瘤性病症”包含涉及造血起源的增生性细胞/肿瘤性细胞的疾病。造血肿瘤性病症可能是由骨髓系、淋巴系或红系或其前体细胞引起的。血液癌为开始于如骨髓等成血组织或者免疫系统细胞的癌症。血液癌的实例包含例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等。

如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述提供根据本发明的方法进行治疗的动物、人或非人。在本公开中设想了兽医应用和非兽医应用。人类患者可以是成年人或青少年(例如，18岁以下的人)。除了人类，患者包含但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包含例如非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔类动物、猪类动物(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其它家畜动物、农场动物和动物园动物。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代至少两个氨基酸中的任意长度的氨基酸的聚合物。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用以指代至少两个核苷酸中的任意长度的核苷酸的聚合物，并且包含但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体和其修饰。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其它在本领域已知的合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。

本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求书变得显而易见。

附图说明

图1A示出了TGFβRII胞外结构域与其配体TGFβ1之间的界面的3D结构。

图1B示出了突变的TGFβRII胞外结构域(在S49和D118处突变)与其配体TGFβ1之间的界面的3D结构。

图2示出了G4_TGFβRII蛋白的氨基酸序列。

图3示出了产量和CMC分析结果的概述。

图4A-4C示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ之间的结合亲和力。

图5A示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ之间的缔合速率结合能力。

图5B示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ之间的解离速率结合能力。

图5C示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ之间的缔合速率结合能力的EC50。

图6示出了BLI结合测定的结果。

图7A-7C示出了smad2报告基因活性测定的结果。

图8列出了本公开中讨论的相关蛋白质序列。

具体实施方式

转化生长因子(TGF)β信号传导途径参与许多细胞过程，包含增殖、分化、粘附、运动和凋亡。这些功能在恶性细胞中往往被破坏，并且TGFβII型受体(TGFβRII)随后被证明是肿瘤抑制基因(TSG)。TGFβ信号传导途径在正常细胞中介导有效的生长抑制，并且根据其作为TSG的作用，癌细胞使用遗传机制和表观遗传机制两者来灭活TGFβRII。然而，TGFβ信号传导途径与癌症进展之间的关系是复杂的。TGFβ信号传导的消除为早期恶性肿瘤提供了生长优势，但TGFβ在进展性肿瘤中具有促转移作用。因此，TGFβRII的缺失与不良临床结果相关联，并且是早期乳腺癌不良预后的预测因子，但是TGFβ配体的过表达与许多肿瘤的转移表型相关联。TGFβ的这种双重性对恢复TGFβ信号传导以利用生长抑制效应提出了挑战。

在哺乳动物系统中，TGFβ被分类为TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，它们由不同的基因编码，但都通过相同的受体信号传导系统发挥作用。TGFβ作为与其它胞外蛋白结合的潜在复合物(如将TGFβ束缚在胞外基质中的潜在TGFβ结合蛋白)分泌。TGFβ在细胞表面与TGFβRIII结合，后者将配体呈递给TGFβRII受体。胞内信号传导开始于活性细胞因子与具有组成型活性Ser/Thr激酶活性的TGFβRII同型二聚体的选择性结合。TGFβ结合后，TGFβRII与TGFβRI形成异源四聚体，其由两个与二聚体TGFβ结合的相同TGFβRI/TGFβRII受体异二聚体组成。一旦形成受体复合物，TGFβRII就转磷酸并激活TGFβRI Ser/Thr激酶。TGFβRI的激活通过Smad蛋白质家族传播下游信号传导。TGFβRI受体直接与Smad 2和Smad 3(也称为受体激活Smad或R-Smad)相互作用并使其磷酸化。这些Smad与Smad 4(也称为Co-Smad)结合，从而导致该复合物易位到细胞核，在所述细胞核中Smad调节TGFβ应答基因的表达。全身施用TGFβ受体陷阱可以抑制肿瘤细胞增殖。这表明在肿瘤发生的相对早期阶段，TGFβ充当启动子而不是抑制因子。

对TGFβ、TGFΒR2以及TGFβ陷阱用于治疗癌症的用途的详细描述例如在以下文献中描述：Chowdhury、Sanjib、Sudhakar Ammanamanchi和Gillian M.Howell.“转化生长因子β受体II的表观遗传靶向性及其对癌症治疗的意义(Epigenetic targetingoftransforming growth factorβreceptor II and implications for cancertherapy.)”《分子和细胞药理学(Molecular and cellular pharmacology)》1.1(2009):57；Bierie,B.等人“TGFβ：癌症的分子Jekyll和Hyde(TGFβ:the molecular Jekyll andHyde of cancer.)”《癌症自然评论(Nature Reviews Cancer)》6.7(2006):506-520；Kim,B.等人“肿瘤学中出现的靶向TGF-β通路的新颖疗法(Novel therapies emerging inoncology to target the TGF-βpathway)”.《血液学与肿瘤学杂志(Journal ofHematology&Oncology)》14.1(2021):1-20；以及Lind,H.等人“通过双功能抗PD-L1/TGF-βRII药剂双重靶向TGF-β和PD-L1：临床前和临床进展状况(Dual targeting of TGF-βandPD-L1 via a bifunctionalanti-PD-L1/TGF-βRII agent:status of preclinical andclinical advances)”.《癌症免疫疗法杂志(Journal for immunotherapy of cancer)》8.1(2020)，所述文献中的每个文献通过引用整体并入。

本公开提供了经工程改造的TGFβRII变体。这些经工程改造的TGFβRII变体可以用于靶向TGFβRII途径，而经工程改造的TGFβRII变体和TGFβ的相互作用被仔细调节。

经工程改造的TGFβRII变体

TGFβ家族配体通过由一个配体、两个I型受体和两个II型受体组成的受体复合物的组装启动信号传导。每个受体ECD由约100个残基组成，呈现三个β链的三指毒素折叠。除了核心β-片层侧翼的延伸环外，I型和II型受体都表现出高度的同源性。五个II型受体ECD中的四个和七个I型受体ECD中的四个已经单独进行了结构表征(II型：ActRIIA，TBRII，BMPII/I型：Alk1，Alk3，Alk5)或在配体-受体复合物中进行了结构表征(II型：ActRIIA，ActRIIB，TBRII，BMPII/I型：Alk1，Alk3，Alk5，Alk6)。这些结构揭示了一组共同的四个二硫键，它们稳定了每个受体中的β-片层结构。另外，ActRIIA、ActRIIB、BMPRII和I型受体含有另外的二硫键，以稳定β4-β5环并防止受体表面闭塞，所述受体表面是维持配体结合的关键区，特别是对II型受体而言。TGFβRII的独特之处在于有两个另外的二硫键将β1-β2环束缚在配体相互作用的位置。

TGFβRII对于与TGFβ类(TGFβ1-3)的结合具有高度特异性。在与TGFβ形成复合物期间，TGFβRII结合在配体的远侧指尖处，其中受体β折叠垂直于手指的β链。具体地讲，TGFβRII的β2形成了重要的接触，并且在由带正电荷的残基(TGFβ1中的Arg303和Arg372)形成的裂缝内结合——这是TGFβ配体共有的特征。这些残基解释了TGFβ配体对TGFβRII的特异性，并且不存在于BMP或激活素类配体中。这种相互作用通过仅限于TGFβRII的β1-β2环的延伸进一步稳定。

TGF-βII型受体(TGFβRII)在其家族的I型II型受体中是独特的，因为它通过独特的界面(即，较小的β1-β2-片层上的边缘β-链、β2-链以及侧翼的β1和β1'链)结合其同源配体。与ActRII、ActRIIB和BMPRII相比，TGFβRII的两个重要结构差异促进了这种替代界面的使用。首先，TGFβRII中的β4-β5环相对于其它II型受体延伸了七个至八个残基，并且缺少f二硫化物。这种二硫化物的缺乏允许延伸的β4-β5环折叠到β4-β3-β5片层的凹面上，从而阻断配体通过此界面结合。其次，TGFβRII中的β1-β2环与家族中除AMHRII之外的所有其它I型和II型受体相比延伸了10个以上的残基。β1-β2环通过其底部的e二硫化物(如在I型受体中)和其顶端附近的TGFβRII特异性g二硫化物进一步稳定。延伸的环缠绕在β4-β3-β5片层的凸面上，并紧紧地贴着它。这种不寻常的结构特征可能对短β2-链的正确定位和支撑很重要，所述短β2-链形成了由TGFβRII用于结合三种TGF-β亚型的主要结构元素。

基于本公开中提供的TGFβ1与TGFβRII复合物的结构，确定了相互作用的残基。在图1A中，与TGFβ1形成氢键的TGFβRII氨基酸残基(D32和E119)被突出显示。在图1B中，可能与TGFβ1形成另外的氢键的突变氨基酸残基(S49和D118)被突出显示。

进一步分析表明，TGFβRII中突变的S49和D118参与了与TGFβ1的相互作用。因此，在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽可以包括S49和D118处的一个或多个氨基酸突变。位置编号是基于SEQ ID NO:7确定的。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为具有带电侧链的氨基酸，例如，R、H、K、D或E。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为具有极性不带电侧链的氨基酸，例如，T、N或Q。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸具有疏水性侧链，例如，A、V、I、L、M、F、Y或W。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为C、G或P。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸不是S。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸仍然为S。

在一些实施例中，与S49相对应的氨基酸与TGFβ1中的K37形成氢键。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为Q。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为具有带电侧链的氨基酸，例如，R、H、K、D或E。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为具有极性不带电侧链的氨基酸，例如，T、N或Q。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸具有疏水性侧链，例如，A、V、I、L、M、F、Y或W。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为C、G或P。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸不是D。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸仍然为D。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸与TGFβ1中的K31形成氢键(基于SEQ ID NO:15)。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E或Q。在一些实施例中，与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽可以具有以下突变中的一个或多个突变：(a)与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E或Q；(b)与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上另外突变，其中经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ1和/或TGFβ2具有类似或改善的结合亲和力。

另外，本公开中的分析表明，TGFβRII的D32(与TGFβ1的R94相互作用)和E119(与TGFβ1的R25相互作用)是区分TGFβ1和TGFβ3与TGFβ2的结合亲和力的关键残基。因此，在一些实施例中，这些氨基酸残基被保留。在一些实施例中，这些氨基酸残基是突变的。

因此，一方面，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO:7-12中的任一个至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:7至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:8至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:9至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:10至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:11至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQ IDNO:12至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，与SEQ ID NO:7-12中的任一个相比，经工程改造的TGFβRII变体可以具有至少或约1个(例如，至少或约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个)氨基酸插入、缺失或取代。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽在S49和D118处具有一个或多个突变。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽在S49处具有突变。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽在D118处具有突变。位置编号根据SEQ ID NO:7确定。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽具有以下突变中的一个或多个突变：

(a)与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸不是S。

(b)与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸不是D。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽具有以下突变中的一个或多个突变：

(a)与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E或Q；

(b)与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。

在一些实施例中，所述经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQID NO:7-12中任一个至少80％、85％、90％或95％相同的具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个突变的氨基酸序列。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个或140个氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：不超过50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150或160个氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：来自经工程改造的TGFβRII多肽的胞外结构域的约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130或140个连续氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体可以具有至少或约1个(例如，至少或约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个)氨基酸插入、缺失或取代。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽中的TGFβ结合结构域包括以下或由以下组成：约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个或140个氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽中的TGFβ结合结构域包括以下或由以下组成：不超过50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150或160个氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽中的TGFβ结合结构域包括以下或由以下组成：来自经工程改造的TGFβRII多肽的胞外结构域的约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130或140个连续氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体中的TGFβ结合结构域可以具有至少或约1个(例如，至少或约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个)氨基酸插入、缺失或取代。

经工程改造的TGFβRII多肽可以具有另外的修饰。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽(或TGFβ结合结构域)可以具有Fc的CH2结构域和/或CH3结构域。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽(或TGFβ结合结构域)可以(例如，通过任选的铰链区或GS接头)连接到CH2结构域的N端。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽(或TGFβ结合结构域)可以(例如，通过任选的GS接头)连接到CH3结构域的C端。在一些实施例中，铰链区为IgG铰链区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4铰链区)。在一些实施例中，CH2结构域为IgG CH2结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 CH2结构域)。在一些实施例中，CH3结构域为IgG CH3结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 CH3结构域)。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽包括以下或由以下组成：与SEQIDNO:1-12中的任一个至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

TGFβRII蛋白质构建体

本公开还提供了可以特异性结合到TGFβ(例如，TGFβ1或TGFβ3)的经工程改造的TGFβRII蛋白质构建体。在一些实施例中，这些蛋白质构建体不与TGFβ2结合。在一些实施例中，这些蛋白质构建体可以阻断TGFβRII信号传导途径。在一些实施例中，这些蛋白质构建体可以改善肿瘤微环境。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽连接到Fc。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII多肽连接到Fc的N端(例如，通过铰链区)或Fc的C端(例如，通过接头序列)。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII蛋白质构建体包括如本文所述的任何经工程改造的TGFβRII变体。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII蛋白质构建体具有与SEQID NO:1-6中的任一个至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

本公开还提供了一种核酸，其包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括与如本文所述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1-14)至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位的数量和每个空位的长度，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。例如，序列的比较以及两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用其中空位罚分为12、空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵来完成。另外，术语“对应于”通常用于指定聚合物中残基的位置/身份，如多肽中的氨基酸残基或核酸中的核苷酸残基。本领域普通技术人员将理解，为了简单起见，此类聚合物中的残基通常使用基于参考聚合物的编号系统来指定，使得例如第一序列中“对应于”参考聚合物中的位置49处的残基的残基实际上不必是第一聚合物中的第49位残基，而是对应于基于比对在参考聚合物中的第49位处发现的残基。本领域普通技术人员容易理解如何鉴定“对应的”氨基酸，包含通过使用一种或多种专门为聚合物序列比较设计的商用算法。

经工程改造的TGFβRII蛋白质构建体进一步包括抗体的Fc区。这些抗体可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE1、IgE2)。在一些实施例中，he Fc区源自人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施例中，Fc区为IgG4 Fc区(例如，人IgG4 Fc区)。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体通过抗体铰链区(例如，IgG、IgE铰链区)连接到Fc区。另外，Fc区域可以被修饰成提供期望的效应子功能或血清半衰期。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体通过接头序列(例如，SEQ ID NO:14)连接到Fc。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII蛋白质构建体进一步包括抗体(例如，双特异性抗体)。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体连接到抗体(例如，双特异性抗体)的C端。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体通过肽接头连接到抗体(例如，双特异性抗体)的C端。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体连接到抗体(例如，双特异性抗体)的N端。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体连接到抗体的抗原结合结构域。

经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的特性

本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以阻断TGFβ(例如，TGFβ1和/或TGFβ2)与在肿瘤细胞、成纤维细胞或免疫细胞的表面上表达的内源性TGFβRII之间的结合。在一些实施例中，通过与TGFβ结合，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以抑制TGFβ与内源性TGFβRII的结合，从而阻断TGFΒ/TGFβRII途径。

在一些实施方案中，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以以小于0.1s^-1、小于0.01s^-1、小于0.001s^-1、小于0.0001s^-1或小于0.00001s^-1的解离速率(k_off)与TGFβ(例如，人TGFβ1、人TGFβ3)结合。在一些实施例中，解离速率(k_off)大于0.01s^-1、大于0.001s^-1、大于0.0001s^-1、大于0.00001s^-1或大于0.000001s^-1。

在一些实施例中，动力学缔合速率(k_on)大于1x 10²/Ms、大于1x 10³/Ms、大于1x10⁴/Ms、大于1x 10⁵/Ms或大于1x 10⁶/Ms。在一些实施例中，动力学缔合速率(k_on)小于1x10⁵/Ms、小于1x 10⁶/Ms或小于1x 10⁷/Ms。

亲和力可以由动力学速率常数的商(KD＝k_off/k_on)推导。在一些实施例中，KD小于1x 10^-6M、小于1x 10^-7M、小于1x 10^-8M、小于1x 10^-9M或小于1x 10^-10M。在一些实施例中，KD小于300nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。在一些实施例中，KD大于1x 10^-7M、大于1x 10^-8M、大于1x 10^-9M、大于1x 10^-10M、大于1x 10^-11M或大于1x 10^-12M。

用于测量亲和力的通用技术包含例如ELISA、RIA、表面等离子共振(SPR)和生物层干涉测量法(BLI)。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以与猴TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)和/或小鼠TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)结合。在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体不与猴TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)和/或小鼠TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)结合。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体不与TGFβ2(例如，人TGFβ2)结合。

在一些实施例中，确定了热稳定性。如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的Tm可以大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94或95℃。在一些实施例中，Tm小于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94或95℃。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体通过氢键相互作用与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体通过氢键相互作用与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体可以捕获TGFβ(例如，TGFβ1或TGFβ3)，并且由此改善肿瘤微环境。

在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体可以抑制肿瘤生长。

在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的肿瘤生长抑制百分比小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。TGI％可以在治疗开始后例如3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天确定，或在治疗开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月确定。如本文所使用的，肿瘤生长抑制百分比(TGI％)使用以下公式计算：

TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100

Ti为第i天治疗组的平均肿瘤体积。T0为第零天治疗组的平均肿瘤体积。Vi为第i天对照组的平均肿瘤体积。V0为第零天对照组的平均肿瘤体积。

在一些实施例中，如本文所述的蛋白质构建体具有功能性Fc区。在一些实施例中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质构建体具有不具有效应子功能的Fc区。在一些实施例中，Fc为人IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc不具有功能性Fc区。例如，Fc区具有LALA突变(EU编号中为L234A和L235A突变)或LALA-PG突变(EU编号中为L234A、L235A、P329G突变)。

可以对Fc区进行一些其它修饰。例如，可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中，由此允许此区中的链间二硫键形成。由此产生的同源二聚体融合蛋白在体外和/或体内可以具有任何增加的半衰期。

在一些实施例中，IgG4具有S228P突变(EU编号)。S228P突变防止体内和体外IgG4Fab臂交换。

在一些实施例中，Fc区被提供为具有缺乏与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类Fc区组合物中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算Asn297处的相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的糖链内的岩藻糖的平均量确定的，例如，如WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指在Fc区中大约位于位置297(Fc区残基的Eu编号；或Kabat编号中的位置314)处的天冬酰胺残基；然而，由于Fc区序列中的微小序列变化，Asn297还可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即，位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改进的ADCC功能。在一些实施例中，为了降低聚糖异质性，可以将Fc区进一步工程改造为用丙氨酸(N297A)替代位置297处的天冬酰胺。

在一些实施例中，TGFβ(例如，TGFβ1和/或TGFβ3)与如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体之间的结合亲和力比TGFβ与野生型TGFβRII或其蛋白质构建体之间的结合亲和力强至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。

在一些实施例中，在通过蛋白A柱纯化后，HPLC-SEC的主峰占本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。

在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的表达量高于50mg/L、高于100mg/L、高于200mg/L、高于300mg/L或高于400mg/L。

在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体可以阻断人TGFβ与人TGFβRII之间的相互作用。在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体可以抑制HEK293T细胞中TGFβ诱导的信号传导。在一些实施例中，与抗TGFβ参考抗体相比，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体的阻断能力为至少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％或至少150％。在一些实施例中，如本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体的阻断能力比野生型TGFβRII或其蛋白质构建体的阻断能力强至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在一些实施例中，阻断TGFβ/TGFβRII相互作用的经工程改造的TGFβRII变体和/或其蛋白质构建体的IC50值小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM。

制造经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的方法

本文所述的TGFβRII的变体可以通过将适当的核苷酸变化引入到编码TGFβRII肽或其部分的DNA中或通过肽合成来制备。此类变体包含例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。

可以执行筛选。在此类变体的群体中，一些经工程改造的TGFβRII变体对TGFβ的亲和力增加。可以进行缺失、插入和/或组合的任何组合以获得对靶标结合亲和力增加的变体。引入到变体中的氨基酸变化还可以改变多肽或将新的翻译后修饰引入到多肽中，如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得通过细胞中存在的酶连接不同的糖)或引入新的糖基化位点。

经工程改造的TGFβRII变体可以源自任何动物物种，包含哺乳动物。TGFβRII变体的非限制性实例包含源自人、灵长类动物(例如，猴和猿)、奶牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如，骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)的TGFβRII变体。

本公开还提供了包含本文所公开的分离多核苷酸(例如，编码本文所公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如，表达载体)、组合载体引入到其中(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包括多核苷酸的载体)的宿主细胞以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。

如本文所使用的，“载体”是在将载体引入到宿主细胞中时能够将一个或多个所关注的多核苷酸递送到宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个所关注的多核苷酸作为经编码的多肽。因此，在表达载体中，所关注的多核苷酸被定位成用于通过以下在载体中进行表达：在载体内或在所述宿主细胞的位于所关注的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼的基因组中与如启动子、增强子和/或poly-A尾等调节元件可操作地连接，使得将在引入有表达载体的宿主细胞中对所关注的多核苷酸进行翻译。

可以通过本领域已知的方法将载体引入到宿主细胞中，例如电穿孔、化学转染(例如，DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如，使用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包含病毒载体(其可以用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体。

在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸(例如，编码本文所公开的多肽的多核苷酸)是使用病毒表达系统(例如，牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入的，这可能涉及使用非病原性(缺陷型)、有复制能力的病毒，或者可以使用复制缺陷型病毒。用于将DNA掺入到此类表达系统中的技术是本领域普通技术人员众所周知的。DNA还可以是“裸的”。裸DNA的摄取可以通过将DNA包被到可生物降解的珠粒上来增加，所述珠粒被高效地转运到细胞中。

为了进行表达，可以将包括本文所公开的编码多肽的多核苷酸的DNA插入物与适当的启动子(例如，异源启动子)操作性地连接，所述启动子如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子，仅举几例。其它适合的启动子是技术人员已知的。在一些实施例中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。表达构建体可以进一步含有转录起始、终止的位点，并且在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包含起始于开始处的翻译以及适当定位于待翻译的多肽的末端处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

如所指示的，表达载体可以包含至少一种可选择标志物。此类标志物包含用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶抗性或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。适合的宿主的代表性实例包含但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HK 293细胞；以及植物细胞。本文所述的宿主细胞的适合的培养基和条件是本领域已知的。

用于细菌的非限制性载体包含：pQE70、pQE60和pQE-9，其可从凯杰公司(Qiagen)获得；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，其可从斯特拉特基因公司(Stratagene)获得；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，其可从法玛西亚公司(Pharmacia)获得。非限制性真核载体包含：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，其可从斯特拉特基因公司获得；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，其可从法玛西亚公司获得。其它适合的载体对于技术人员将是显而易见的。

适于使用的非限制性细菌启动子包含大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包含CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子，如劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。

在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多含有如α因子、醇氧化酶和PGH等组成型或诱导型启动子的载体。

可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现将构建体引入到宿主细胞中。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述，如Davis等人,《分子生物学基础方法(Basic Methods InMolecularBiology)》(1986)，所述文献通过引用以其整体并入本文。

可以通过将增强子序列插入到载体中来提高由较高真核细胞进行的对编码本公开的多肽的DNA的转录。增强子是DNA的，通常为约10bp至300bp的起到增加给定宿主细胞类型中的启动子的转录活性的作用的顺式作用元件。增强子的实例包含位于碱基对100至270处的复制起点的后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

为了使经翻译的蛋白质分泌到内质网的腔、周质空间或胞外环境中，可以将适当的分泌信号并入到所表达多肽中。所述信号对多肽可以是内源性的，或者其也可以是异源性信号。

多肽(例如，TGFβRII变体)可以以经修饰的形式，如融合蛋白(例如，GST-融合物)或用组氨酸标签表达，并且不仅可以包含分泌信号，而且还可以包含另外的异源性功能区。例如，可以将另外的氨基酸，特别是带电荷的氨基酸的区添加到多肽的N-末端，以改进在纯化期间或在随后的处理和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。可以在最终制备多肽之前将此类区去除。将肽部分添加到多肽以引起分泌或排泄、改进稳定性并促进纯化(除其它外)是本领域的熟知且常规的技术。

治疗方法

本公开的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以用于各种治疗目的。

一方面，本公开提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低随着时间的推移受试者中的肿瘤的体积增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法或降低受试者中发生另外的转移的风险的方法。在一些实施例中，治疗可以停止、减缓、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施例中，治疗可以使受试者的癌症的一种或多种症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。

一方面，本公开的特征在于包含向有需要的受试者(例如，患有癌症或者被鉴定为或被诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效量的本文所公开的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的方法，所述癌症为例如，乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系统恶性肿瘤。在一些实施例中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施例中，所述受试者患有实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施例中，所述癌症为黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液系统恶性肿瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病或晚期实体瘤。在一些实施例中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、结肠癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌或肝癌。

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可以用于治疗有患癌症的风险的患者。患有癌症的患者可以用本领域已知的各种方法来鉴定。

在一些实施例中，本文所述的方法可以用于治疗严重的血液病症，例如，贫血。

在一些实施例中，本文所述的方法或本公开的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以用于治疗癌症、囊性纤维化和/或由无效红细胞生成引起的贫血(例如，骨髓增生异常综合征相关贫血、获得性再生障碍性贫血或范科尼贫血(Fanconi anemia))。

如本文所使用的，“有效量”意指足以实现有益或期望结果的量或剂量。在一些实施例中，期望结果可以包含停止、减缓、延缓或抑制疾病(例如，癌症)的进展。有效量将根据例如要向其施用经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体、包括编码经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的多核苷酸的载体和/或其组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用的途径而变化，并且因此施用可以根据个人情况而确定。

可以以一次或多次施用来施用有效量。举例来说，经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的有效量为足以在体外改善、阻止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延缓患者的癌症的进展的量，或者为足以在体外改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延缓细胞(例如，活检细胞、本文所述的癌细胞中的任何癌细胞或细胞系(例如，癌细胞系))的增殖的量。如本领域所了解的，有效量可以变化，尤其取决于患者病史以及如所使用经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的类型(和/或剂量)等其它因素。

用于施用本文所公开的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体、编码经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的多核苷酸和/或组合物的有效量和时间表可以凭经验确定，并且做出此类确定在本领域的技术范围内。本领域的技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受本文所公开的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体、多核苷酸和/或组合物的哺乳动物、施用途径、所使用的本文所公开的多核苷酸和/或组合物的具体类型以及施用于哺乳动物的其它药物而变化。

有效量的经工程改造的TGFβRII变体和/或蛋白质构建体的典型每日剂量为0.1mg/kg至100mg/kg(mg每kg患者体重)。在一些实施例中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施例中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施例中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg或1mg/kg。在一些实施例中，剂量为约1至10mg/kg、约1至5mg/kg或约2至5mg/kg。

在本文所述的方法中的任何方法中，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以至少每周一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用于受试者。

在一些实施例中，可以在施用经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体之前或之后向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施例中，所述一种或多种另外的治疗剂被施用于受试者，使得所述一种或多种另外的治疗剂与经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体在受试者体内的生物活性时间段存在重叠。

在一些实施例中，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)抑制剂以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂。在一些实施例中，另外的治疗剂为吲哚胺2,3-双加氧酶-1)(IDO1)的抑制剂(例如，艾卡哚司他(epacadostat))。

在一些实施例中，另外的治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活的刺猬信号传导途径抑制剂以及选择性降解雌激素受体的药剂。

在一些实施例中，另外的治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、纳布紫杉醇(nab-paclitaxel)、特伯纳尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、IFL、瑞格拉非尼(regorafenib)、溶血素(Reolysin)、爱宁达(Alimta)、立克癌(Zykadia)、索坦(Sutent)、替西罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依维莫司、索拉非尼(sorafenib)、帕唑帕尼(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春花碱、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺、来那度胺(lenalidomide)、阿扎胞苷(azacytidine)、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎滔林(enzastaurin)。

在一些实施例中，另外的治疗剂可以包括选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、治疗靶向CX3CL1、治疗靶向CXCL9、治疗靶向CXCL10、治疗靶向CCL5、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。

在一些实施例中，向受试者施用卡铂、纳布紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。

在一些实施例中，另外的治疗剂为抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗TGFβRII抗体、抗TGFβ抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。在一些实施例中，另外的治疗剂为抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))或抗EGF受体抗体(例如，西妥昔单抗(cetuximab))。

药物组合物和施用途径

本文还提供了含有本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的药物组合物。药物组合物可以以本领域已知的任何方式调配。

药物组合物被调配成与其预期施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹膜内)相容。组合物可以包含无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗菌剂或抗真菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及等渗剂，如糖(例如，右旋糖)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)或盐(例如，氯化钠)或其任何组合。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载剂。组合物的制剂可以调配并封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在需要的情况下(例如，在可注射调配物中)，可以例如通过使用涂层(如卵磷脂或表面活性剂)来维持适当的流动性。药剂的吸收可以通过包含延缓吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。可替代地，可以通过植入物和微囊化递送系统实现控制释放，所述系统可以包含可生物降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸)。

含有本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的组合物可以被调配成用于以剂量单位形式(即含有预定量的活性化合物的物理离散单元，以便于施用和剂量均匀)肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹膜内)施用。

用于肠胃外施用的药物组合物优选地是无菌的且基本上等渗的，并且在良好生产规范(GMP)条件下制造。药物组合物可以以单位剂型(即单次施用的剂量)提供。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂调配。调配物取决于所选的施用途径。对于注射，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以在水溶液中调配，优选地在生理上相容的缓冲液中调配，以减少注射部位的不适。溶液可以含有配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体可以呈冻干形式以用于在使用之前与合适的媒剂(例如，无菌的无热原水)一起构造。

可以通过标准药物程序来确定组合物在细胞培养物或实验动物(例如，猴子)中的毒性和治疗功效。例如，可以确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的药剂是优选的。当药物表现出不期望的副作用时，应注意使潜在损害最小化(即，减少不希望的副作用)。毒性和治疗功效可以通过其它标准制药程序来确定。

示例性剂量包含每千克受试者的体重毫克或微克量的本文所述的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体中的任一种(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；约1μg/kg/至约50μg/kg；约1mg/kg至约10mg/kg；或约1mg/kg至约5mg/kg)。虽然这些剂量涵盖宽泛的范围，但是本领域的普通技术人员将理解，治疗剂的效力可以变化，并且有效量可以通过本领域已知的方法来确定。典型地，最初施用相对低的剂量，并且主治卫生保健专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(当仍在研发阶段工作时)可以随后且逐渐增加剂量，直到获得适当的应答为止。另外，应理解的是，对任何特定受试者的具体剂量水平将取决于各种各样的因素，包含受试者所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率以及经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体在体内的半衰期。

药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制造用于如本文所述的各种用途的经工程改造的TGFβRII变体和蛋白质构建体的方法。

实例

本发明在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实例1.经工程改造的TGFβRII变体的设计

TGFβRII胞外结构域与其配体TGFβ1之间的界面的3D结构如图1A所示。

对TGFβRII/TGFβ1复合结构进行了详细分析。从结构上确定了TGFβRII的D32(与TGFβ1的R94相互作用)和E119(与TGFβ1的R25相互作用)是区分TGFβ1和TGFβ3与TGFβ2的结合亲和力的关键残基。因此，分析表明经工程改造的TGFβRII变体应该优选保留D32和E119。

TGFβRII与TGFβ1之间存在两种主要的氢键相互作用(D32-R94和E119-R25)。为了增加TGFβRII与TGFβ1的结合能力，需要增加另外的氢键相互作用。

基于以上发现，确定了TGFβRII的S49和D118处的突变对于增加TGFβRII与TGFβ1的结合亲和力可能很重要，因为突变的TGFβRII将具有两种另外的氢键相互作用(S49E/Q-K37和D118E-K31)。

K31在TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中是保守的。为了确定突变的TGFβRII与TGFβ2的结合亲和力是否改变，对结合亲和力进行了检查。

为了找到与TGFβ1的结合亲和力比与野生型TGFβRII的结合亲和力高的经工程改造的TGFβRII变体，使S49和/或D118突变。氨基酸位置基于野生型TGFβRII胞外结构域的序列(SEQ ID NO:7)。

经工程改造的TGFβRII变体(G4_TGFβRII蛋白)是通过根据图2中列出的序列将突变的TGFβRII胞外结构域连接到IgG4的Fc区来设计的。

实例2.G4_TGFβRII蛋白的产生和CMC分析

G4_TGFβRII蛋白根据图2中列出的序列进行表达。

将所表达的蛋白通过蛋白A柱，之后通过HPLC-SEC(高效液相色谱法与尺寸排阻色谱法结合；安捷伦公司(Agilent)进行纯化；并且测量了高分子量峰的百分比(HMW％)、主峰的百分比(主要％)和低分子量峰的百分比(LMW％)。使用去免疫工具(免疫表位数据库和分析资源；Dhanda等人“用于选择HLA结合和免疫原性减少的候选蛋白质类似物的策略和计算应用的开发(Development of a strategy and computational applicationto selectcandidate protein analogues with reduced HLA binding and immunogenicity)”《免疫学(Immunology)》153.1(2018):118-132)分析了氨基酸序列，以鉴定免疫原性区。未鉴定出免疫原性。

图3是产量和CMC分析结果的概述。HMW％指示蛋白A纯化后样品中的高分子量物种的百分比。主要％指示蛋白A纯化后样品中的主要分子量物种的百分比。LMW％指示蛋白A纯化后样品中的低分子量物种的百分比。

使用CuBiAnXC(OPTOCELL科技公司)通过高灵敏度(hs)IgG测定试剂盒(4BioCell，类别号：200112，800312)确定表达量。使用Waters E2695分离模块(沃特世公司(WatersCorporation))和AdvanceBio SEC 2.7um色谱柱(安捷伦科技有限公司)确定和分析HPLCSEC图谱。

图3中的数据表明G4_TGFβRII_mt5具有相对较低的表达量和较低的主要分子量物种。G4_TGFβRII_mt5未用于进一步的体外功能分析。

实例3.ELISA结合测定

为了确定G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ的结合能力，使用指定浓度(1.1pM、6.4pM、38.6pM、231.5pM、1.4nM、8.3nM、50nM或300nM)的G4_TGFβRII蛋白进行结合滴定ELISA测定。使用G4_TGFβRII(wt)作为阳性对照。使用IgG4同种型对照作为阴性对照。在4℃下将96孔EIA微孔板用0.5μg/ml人TGFβ(TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3)包覆过夜。用含有5％脱脂牛奶的1xPBS封闭后，添加经稀释的G4_TGFβRII蛋白(mt1，mt2，mt3，mt4)并在室温(RT)下温育1小时。通过用1x PBST(含有0.05％Tween 20的1x PBS)洗涤孔三次来去除未结合的蛋白质。在室温(RT)下将HRP缀合的二级抗体(1:5000)添加到孔中，持续1小时。温育后，通过用1x PBST洗涤孔三次来去除过量的二级抗体。最后，添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)以用于显色。停止反应并且使用分光光度计在450nm处测量HRP活性。

图4A-4C示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ之间的结合亲和力。数据表明，所有测试的G4_TGFβRII蛋白都能与TGFβ1和TGFβ3结合。如图4A所示，与G4_TGFβRII(wt)相比，TGFβ1、G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt4显示出更好的结合亲和力。G4_TGFβRII_mt2、G4_TGFβRII_mt3和G4_TGFβRII(wt)显示出类似的结合亲和力。如图4C所示，TGFβ3、G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt4显示出比G4_TGFβRII(wt)更好的结合亲和力。G4_TGFβRII_mt2和G4_TGFβRII_mt3显示出比G4_TGFβRII(wt)更差的结合亲和力。如图4B所示，没有一种测试的TGFβRII蛋白显示出与TGFβ2的结合。

实例4.ELISA结合测定(缔合速率和解离速率)

为了确定G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ1的缔合速率和解离速率结合能力，使用指定浓度(1.1pM、6.4pM、38.6pM、231.5pM、1.4nM、8.3nM、50nM或300nM)的G4_TGFβRII蛋白进行结合滴定ELISA测定。使用G4_TGFβRII(wt)作为阳性对照。使用IgG4同种型对照作为阴性对照。对于缔合速率结合能力，在4℃下将96孔EIA微孔板用0.5μg/ml人TGFβ(TGFβ1)包覆过夜。用含有5％脱脂牛奶的1x PBS封闭后，添加经稀释的G4_TGFβRII蛋白并在室温(RT)下温育5分钟。通过用1x PBST(含有0.1％Tween 20的1x PBS)洗涤孔三次来去除未结合的蛋白质。在室温下将HRP缀合的二级抗体(1:5000)添加到孔中，持续1小时。温育后，通过用1xPBST洗涤孔三次来去除过量的二级抗体。最后，添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)以用于显色。停止反应并且使用分光光度计在450nm处测量HRP活性。

对于解离速率结合能力，在4℃下将96孔EIA微孔板用0.5μg/ml人TGFβ(TGFβ1)包覆过夜。用含有5％脱脂牛奶的1x PBS封闭后，添加稀释的G4_TGFβRII蛋白并且在室温(RT)下温育1小时。通过在800rpm振荡器上用1x PBST(含有0.1％Tween 20的1x PBS)洗涤孔2小时(每半小时更换一次洗涤缓冲液)来除去未结合的蛋白质。在室温下将HRP缀合的二级抗体(1:5000)添加到孔中，持续1小时。温育后，通过用1x PBST洗涤孔三次来去除过量的二级抗体。最后，添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)以用于显色。停止反应并且使用分光光度计在450nm处测量HRP活性。

图5A示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ1之间的缔合速率结合能力。图5B示出了如通过ELISA测量的G4_TGFβRII蛋白与人TGFβ1之间的解离速率结合能力。如图5A所示，对于缔合速率，G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt4显示出比G4_TGFβRII(wt)更好的结合能力。G4_TGFβRII_mt2、G4_TGFβRII_mt3和G4_TGFβRII(wt)显示出类似的结合能力。如图5B所示，对于解离速率，G4_TGFβRII_mt1和m4显示出比G4_TGFβRII(wt)更好的结合能力。G4_TGFβRII_mt3和G4_TGFβRII(wt)显示出类似的结合能力。G4_TGFβRII_mt2显示出比G4_TGFβRII(wt)更差的结合能力。图5C示出了缔合速率结合的EC50。

实例5.使用BLI确定结合亲和力

进一步使用Octet Red96(Forebio公司)通过生物层干涉测量法(BLI)来确定TGFβ结合亲和力。将G4_TGFBRII蛋白固定在抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Fortebio公司，类别号：18-5060)上。将测定缓冲液(含有0.05％Tween-20的1x PBS和0.1％BSA，pH 7.4)中的18.8nM至75nM连续稀释的TGFβ1或TGFβ3用作G4_TGFBRII蛋白的分析物。使用FortebioData Analysis 11.0软件中的1:1Langmuir结合模型评估结合动力学。

BLI结合测定的结果在图6中示出。如图6所示，G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt4显示出最好的TGFβ1和TGFβ3结合亲和力。进一步地，G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt4显示出最好的TGFβ1和TGFβ3保留时间(koff)。

实例6.TGFβ诱导的smad2报告基因活性的抑制

确定了G4_TGFβRII蛋白抑制TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3诱导的smad2报告基因活性的能力。将G4_TGFβRII蛋白连续稀释(5倍)到6.4pM、32pM、160pM、0.8nM、4nM、20nM、100nM和500nM的最终浓度。使用G4_TGFβRII(wt)作为阳性对照。使用IgG4同种型对照作为阴性对照。将表达smad2报告基因的4×10³个转染的HEK293T细胞分别与稀释的G4_TGFβRII蛋白以及20ng/mL TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3一起温育。在5％CO₂培养箱中在37℃下温育24小时后，通过Varioskan^TMLUX多模式酶标仪(赛默公司(Thermo))检测发光信号。

smad2报告基因活性测定的结果在图7A-7C中示出。如图7A所示，所有四种G4-TGFβRII蛋白都能抑制TGFβ1介导的smad2报告基因蛋白活性。G4_TGFβRII_mt4和G4_TGFβRII_mt1显示出比G4_TGFβRII(wt)更好的抑制效果。G4_TGFβRII_mt2和G4_TGFβRII_mt3显示出比G4_TGFβRII(wt)更差的抑制效果。如图7B所示，没有一种G4-TGFβRII蛋白能够抑制TGFβ2诱导的smad2报告基因活性。如图7C所示，所有四种G4-TGFβRII蛋白都能抑制TGFβ3介导的smad2报告基因蛋白活性。G4_TGFβRII_mt4、G4_TGFβRII_mt1和G4_TGFβRII_mt3显示出比G4_TGFβRII(wt)更好的抑制效果。G4_TGFβRII_mt2显示出比G4_TGFβRII(wt)更差的抑制效果。

其它实施例

应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改都在以下权利要求的范围内。

Claims (50)

1.一种经工程改造的TGFβRII多肽，其包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的氨基酸序列，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽在与SEQ ID NO:7的S49和D118相对应的位置处包括一个或多个氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括以下中的一种或多种：

(a)与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为G、A、L、M、F、W、K、Q、E、P、V、I、C、Y、H、R、N、D或T；以及

(b)与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为G、A、L、M、F、W、K、Q、E、S、P、V、I、C、Y、H、R、N或T。

3.根据权利要求1或2所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E或Q。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中与SEQ ID NO:7的D118相对应的氨基酸为E。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中与SEQ ID NO:7的S49相对应的氨基酸为E。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中与SEQ ID NO:7的位置32相对应的氨基酸为D。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中与SEQ ID NO:7的位置119相对应的氨基酸为E。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:7-12中的任一个至少85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列。

10.根据权利要求8所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列。

11.根据权利要求8所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列。

12.根据权利要求8所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列。

13.根据权利要求8所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ1之间的解离速率低于野生型TGFβRII与TGFβ1之间的解离速率。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ3之间的解离速率低于野生型TGFβRII与TGFβ3之间的解离速率。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽不与TGFβ2结合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽通过氢键相互作用与TGFβ1上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽通过氢键相互作用与TGFβ3上的R94、R25、K37和/或K31相互作用。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽能够捕获TGFβ(例如，TGFβ1)，并且由此改善肿瘤微环境。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽能够阻断或干扰TGFβ(例如，TGFβ1)与TGFβRII之间的结合。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽能够阻断或干扰在肿瘤细胞、成纤维细胞或免疫细胞的表面上表达的TGFβ(例如，TGFβ1)与TGFβRII之间的结合。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽进一步包括CH2结构域和CH3结构域。

25.根据权利要求24所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽进一步包括铰链区。

26.根据权利要求24或25所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述CH2结构域为IgGCH2结构域，并且所述CH3结构域为IgG CH3结构域。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽任选地通过接头序列连接到(a)所述铰链区或CH2结构域的N端，或(b)所述CH3结构域的C端。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽包括与SEQ ID NO:1-6中的任一个相同的氨基酸序列。

29.一种蛋白质构建体，其包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽。

30.根据权利要求29所述的蛋白质构建体，其中所述蛋白质构建体包括两个或更多个经工程改造的TGFβRII多肽。

31.根据权利要求30所述的蛋白质构建体，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽中的至少两个是相同的。

32.根据权利要求30所述的蛋白质构建体，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽中的至少两个是不同的。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的蛋白质构建体，其进一步包括Fc区。

34.根据权利要求33所述的蛋白质构建体，其中所述Fc区为IgG4 Fc区。

35.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中所述Fc区为IgG1 Fc区(例如，具有LALA突变或LALA-PG突变)。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽连接到所述Fc区的C端。

37.根据权利要求33至35中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述经工程改造的TGFβRII多肽通过肽接头连接到所述Fc区的C端。

38.一种蛋白质构建体，其包括

第一融合多肽，所述第一融合多肽包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽、第一CH2结构域和第一CH3结构域；以及

第二融合多肽，所述第二融合多肽包括第二CH2结构域和第二CH3结构域，

其中所述第一融合多肽和所述第二融合多肽彼此缔合，从而形成二聚体。

39.根据权利要求38所述的蛋白质构建体，其中所述第二融合多肽进一步包括第二经工程改造的TGFβRII多肽。

40.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽或根据权利要求29至39中任一项所述的蛋白质构建体；以及

药学上可接受的载剂。

41.一种核酸，其编码根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽或根据权利要求29至39中任一项所述的蛋白质构建体。

42.一种载体，其包括根据权利要求41所述的核酸。

43.一种细胞，其包括根据权利要求41所述的核酸或根据权利要求42所述的载体。

44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞为CHO细胞。

45.一种产生经工程改造的TGFβRII多肽或包括所述经工程改造的TGFβRII多肽的蛋白质构建体的方法，所述方法包括

(a)在足以使根据权利要求43或44所述的细胞产生所述经工程改造的TGFβRII多肽或所述蛋白质构建体的条件下培养所述细胞；以及

(b)收集由所述细胞产生的所述经工程改造的TGFβRII多肽或所述蛋白质构建体。

46.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽或根据权利要求29至39中任一项所述的蛋白质构建体。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者患有实体瘤或血液癌。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、结肠癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌或肝癌。

49.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括

使肿瘤细胞与有效量的包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽或根据权利要求29至39中任一项所述的蛋白质构建体的组合物接触。

50.一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括

使肿瘤细胞与有效量的包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程改造的TGFβRII多肽或根据权利要求29至39中任一项所述的蛋白质构建体的组合物接触。