BR122023021925A2

BR122023021925A2 - Complexo de tgf-b, seus usos, um ou mais ácidos nucleicos, composição, método para produzir uma construção ou complexo de tgf-b mascarado, composição farmacêutica, método para entrega de um polipeptídeo tgf-b e opcionalmente pelo menos um polipeptídeo mod a células que expressam em sua membrana superficial um tbr

Info

Publication number: BR122023021925A2
Application number: BR122023021925-2A
Authority: BR
Inventors: Ronald D Seidel Iii; Rodolfo J. Chaparro; John F. Ross; Chee Meng Low
Original assignee: Cue Biopharma, Inc
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2024-02-27
Also published as: US20220372093A1; KR20220087491A; MX2022004873A; CN114728072A; US20230416322A1; TW202130655A; EP4034170A1; BR112022007749A2; JP2023500066A; CA3155510A1; US11692018B2; AU2020372413A1; IL292253A; EP4034170A4; WO2021081258A1

Abstract

COMPLEXO DE TGF-B, SEUS USOS, UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CONSTRUÇÃO OU COMPLEXO DE TGF-B MASCARADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA ENTREGA DE UM POLIPEPTÍDEO TGF-B E OPCIONALMENTE PELO MENOS UM POLIPEPTÍDEO MOD A CÉLULAS QUE EXPRESSAM EM SUA MEMBRANA SUPERFICIAL UM TBR A presente divulgação fornece construtos e complexos polipeptídicos do Fator de Crescimento Transformador Beta (TGF-β) que encontram uso, por exemplo, no tratamento terapêutico de doenças incluindo doenças autoimunes. Também são descritos ácidos nucleicos que codificam os construtos e complexos e métodos de preparação dos construtos e complexos em sistemas de expressão baseados em células.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N.° 62/925.227, depositado em 23 de outubro de 2019, cujo pedido é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

Incorporação por Referência de Listagem de Sequências

[002] Este pedido contém uma listagem de sequências enviada eletronicamente, que serve como cópia em papel e forma legível por computador (CRF) e consiste em um arquivo intitulado “123640- 8012WO00_seqlist.txt”, que foi criado em 21 de outubro de 2020, que tem 341.966 bytes de tamanho, e que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade. I.

INTRODUÇÃO A. TGF-β e suas ações

[003] O fator de crescimento transformador beta (TGF-β) é uma citocina pertencente à superfamília do fator de crescimento transformador que inclui três isoformas de mamíferos (humanos), TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3. Os TGF-βs são sintetizados como moléculas precursoras contendo uma região pró-peptídeo, além das sequências de TGF-β que homodimerizam como uma forma ativa de TGF-β. O TGF-β é secretado por macrófagos e outros tipos de células em um complexo latente no qual é combinado com duas outras proteínas de ligação-a TGF-β polipeptídicas (LTBP) e peptídeo associado à latência (LAP). O complexo de TGF-β latente é armazenado na matriz extracelular (ECM), por exemplo, ligado à superfície das células por CD36 via trombospondina-1 (onde pode ser ativado por plasmina) ou às proteínas de ligação beta do fator de crescimento transformador latente 1, 2, 3 e/ou 4 (LTBP1-4).

[004] As funções biológicas de TGF-β são vistas após a ativação latente de TGF-β, que é fortemente regulada em resposta a perturbações de ECM. O TGF-β pode ser ativado por uma variedade de vias específicas de células ou tecidos, ou vias observadas em vários tipos de células ou tecidos; no entanto, os mecanismos completos por trás de tais vias de ativação não são totalmente conhecidos. Os ativadores incluem, mas não estão limitados a proteases, integrinas, pH e espécies reativas de oxigênio (ROS). Com efeito, o complexo de TGF-β latente ligado a células/tecidos funciona, detecta e responde a perturbações ambientais liberando TGF-β ativo de uma maneira espacial e/ou temporal. O TGF-β liberado atua para promover ou inibir a proliferação celular, dependendo do contexto de sua liberação. Também recruta células-tronco/progenitoras para participar do processo de regeneração/remodelação tecidual. As aberrações na expressão do ligante TGF-β, biodisponibilidade, ativação, função do receptor ou modificações pós- transcricionais perturbam a função normal e podem levar a consequências patológicas associadas a muitas doenças, como através do recrutamento de progenitores excessivos (por exemplo, na osteoartrite ou doença de Camurati- Engelmann) ou pela transdiferenciação de células residentes para linhagens desfavoráveis (por exemplo, na transição epitelial para mesenquimal durante metástase de câncer ou fibrose de tecido/órgão). Xu et al Bone Research, 6 (Article N.° 2) (2018).

1. Ativação independente de integrina e dependente de integrina a. Ativação independente de integrina

[005] Entre os meios independentes de integrina de ativação de TGF-β estão aqueles que trabalham através da ação de, entre outras coisas, proteases e/ou metaloproteases, espécies reativas de oxigênio (ROS) e trombospondina-1.

[006] A plasmina e várias metaloproteinases de matriz (MMPs) promovem a invasão tumoral e o remodelamento tecidual por proteólise de componentes da matriz extracelular. O TGF-β pode ser ativado pela ação de tais proteases que liberam o complexo latente da matriz, que é seguida pela proteólise do LAP para liberar o TGF-β para seus receptores. Ambas as metaloproteases de matriz -9 e -2 são conhecidas por clivar TGF-β latente.

[007] Demonstrou-se que o TGF-β é rapidamente ativado in vivo após a exposição à radiação para induzir a liberação de ROS. Acredita-se que as ROS alterem a interação entre LAP e TGF-β, levando à sua ativação.

[008] Sabe-se que a trombospondina-1 (TSP-1), uma glicoproteína encontrada no plasma de indivíduos saudáveis, aumenta em resposta à lesão. Acredita-se que o TSP-1 ativa o TGF-β latente formando interações diretas com o complexo de TGF-β latente e impedindo-o de se ligar ao TGF-β maturado. Acredita-se que a ativação mediada por trombospondina esteja envolvida na cicatrização de feridas (por exemplo, ferida dérmica).

b. Ativação por Alfa(V) contendo integrinas

[009] As integrinas, e particularmente β6, αV e β8 contendo integrinas são entendidas como contribuindo para a ativação latente de TGF-β (por exemplo, TGF-β1). A ativação parece ocorrer induzindo mudanças conformacionais no complexo de TGF-β1 latente e, portanto, liberando o TGF-β1 ativo ou por um mecanismo dependente da protease de integrina. Entende-se que as alterações conformacionais que levam à ativação de TGF- β1 sem proteólise, particularmente em células epiteliais, ocorrem através da ligação de integrina a um motivo de adesão celular Arginil-Glicil-Aspártico (motivo RGD) presente em LAP-β1 ou LAP-β3. Os LAPs contendo o motivo RGD são reconhecidos pela maioria das integrinas contendo αV. Por exemplo, a integrina αVβ6 pode ativar/liberar TGF-β1 ligando-se ao motivo RGD presente em LAP-β1 e LAP-β3. Além disso, a ativação dependente da protease de integrina de TGF-β pode ocorrer criando uma conexão entre o complexo de TGF-β latente e MMPs, tais como MMP-2 e MMP-9, que podem ativar TGF-β por degradação proteolítica do complexo de TGF-β latente.

2. Sinalização e ações de TGF-β

[0010] O TGF-β ativado desempenha um papel crucial na diferenciação celular, bem como na regulação das células T. Ver, por exemplo, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 e suas citações. O TGF-β promove o desenvolvimento tímico de várias linhagens de células T, apoiando a sobrevida de Treg derivada do timo (tTreg), T natural killer invariante (iNKT) e precursores de células T CD8α+ e, consequentemente, promovendo o desenvolvimento de células T induzíveis por fortes ligantes agonistas. O TGF-β suporta células T CD8+ convencionais promovendo a expressão de timócitos da interleucina (IL)-7Rα. O TGF-β também regula a homeostase de células T periféricas, promovendo a sobrevida dependente de IL-7 de células T de baixa afinidade, controlando a expressão de IL-7Rα de timócitos e inibindo a ativação conduzida pelo receptor de células T (TCR) de células T autorreativas ou de alta afinidade. Na diferenciação inicial de células T CD8+, o TGF-β inibe a formação de linfócitos T citotóxicos (CTL) e promove a apoptose de células efetoras de vida curta (SLECs), promovendo a diferenciação de células residentes em tecido que expressam CD103 (TRM). Embora o TGF-β iniba a diferenciação de células helper T 1 e 2 (Th1 e Th2), o TGF-β que atua com outros fatores promove o desenvolvimento de várias células T. TGF-β em conjunto com: IL-2 promove a produção de Treg periférico (pTreg), IL-6 promove a produção de células Th-17, IL-4 promove a produção de células Th9 e IL-21 e/ou 23 promove a produção de células helper T foliculares (Tfh).

[0011] Além de sua ação nas células T, uma variedade de outras células é regulada por TGF-β, incluindo linfócitos B ou “células B”, monócitos e macrófagos. O TGF-β geralmente tem ações inibitórias nas células B (Li et al., Annual Review of Immunology. 24 (1): 99-146 (2006) and Roes et al., PNAS USA, 100 (12): 7241-7246 (2003)); inibindo a proliferação de células B e induzindo a apoptose de células B imaturas ou em repouso (Arsura, et al., Immunity 5(1): 31-40.(1996)). Pelo menos parte da ação de TGF-β nas células B pode ser devido à indução de IKBa, um inibidor de NF-KB que regula a produção de citocinas, incluindo IL-1, TNF-a e defensinas. Ver, por exemplo, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 e citações neste documento.

[0012] Além de suas ações nas células B, o TGF-β estimula os monócitos em repouso e inibe os macrófagos ativados. TGF-β exibe efeitos inibitórios, tais como a resposta pró-inflamatória de macrófagos que foram estimulados por ligantes de Receptor Semelhante a Toll (“TLR”). A estimulação de TGF-β, na ausência de ligantes de TLR ou outras citocinas, promove a produção de várias citocinas inflamatórias por células mieloides. Demonstrou-se que o TGF-β induz monócitos e macrófagos do sangue periférico nos tecidos e aumenta as propriedades aderentes dos monócitos. O TGF-β pode induzir quimiotaxia e aumentar as propriedades aderentes dos mastócitos. Ver, por exemplo, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 e citações neste documento.

[0013] Uma vez que o TGF-β é ativado, entende-se que atua através de receptores de sinalização da superfície celular. A sinalização começa quando um ligante TGF-β ativo se liga ao receptor II do fator de crescimento transformador beta (“TβRII”) em uma superfície celular. Esta interação pode resultar no recrutamento do receptor I do fator de crescimento transformador beta (“TβRI”). TβRII é capaz de se ligar a TGF-β1 sozinho, enquanto TβRI só pode se ligar ao ligante em cooperação com TβRII. TβRI é fosforilado e ativado por TβRII, levando à sinalização através da via de sinalização canônica através do recrutamento e fosforilação das proteínas R-Smad (Smad2 e Smad3). Esses Smads subsequentemente se ligam a um co-Smad (Smad4) e, juntos, o complexo conduz a transcrição de vários genes. Ver Smith et al., Clin. Cancer Res.; 18(17): 4514-21 (2012). O TGF-β também pode sinalizar através de vias não canônicas (não-Smad) que incluem vários ramos de vias de MAP quinase, vias de sinalização de GTPase semelhante a Rho e vias de fosfatidilinositol-3-quinase/AKT, que são ativadas por receptores ocupados por ligantes. A sinalização através dos caminhos não canônicos pode reforçar, atenuar ou modular as respostas celulares a jusante. Zhang Ye, Cell Res. 19(1):128-39 (2009). Em contraste com TβRI e TβRII, o receptor beta do fator de crescimento transformador III (receptor “TβRIII” ou “beta glicano”) não participa da transdução de sinal de TGF-β, mas atua como um reservatório para TGF-β.

[0014] Perturbações dos fatores de ativação, níveis anormais de TGF- β ativado e/ou alterações na sinalização de TGF-β podem levar a níveis de sinalização de TGF-β não regulados que podem levar a várias doenças ou a estados de doença complicados. De fato, o TGF-β demonstrou ter efeitos em condições tão diversas como inflamação, distúrbios autoimunes, fibrose, câncer e catarata.

[0015] O TGF-β desempenha um papel fundamental na manutenção da hemostasia no sistema imunológico como um fator envolvido na indução da tolerância e, assim, afetando as respostas autoimunes. Um mecanismo pelo qual o TGF-β pode provocar tais efeitos é a condução de células T (por exemplo, CD4+, CD8+, CD4-CD8+ e CD4-CD8-) para se diferenciar em células T-reguladoras ou células “T-Reg” (por exemplo, na presença de IL-2). Ver, por exemplo, Bettini e Vagnali, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1183:1-12 (2010). As células T-Reg são essenciais para a manutenção da tolerância imunológica. Josefowicz et al. Annu Rev Immunol, 30: 531-564. (2012). O papel do TGF-β na indução da tolerância a antígenos, incluindo autoantígenos, o torna um fator crucial na proteção contra o desenvolvimento de doenças como artrite (artrite reumatoide ou “RA”), diabetes mellitus tipo 1 (“T1D”), esclerose múltipla (“MS”) e lúpus eritematoso sistêmico (“SLE”). Por exemplo, entre as principais funções do TGF-β está a regulação de doenças autoimunes e os processos inflamatórios relacionados. Isso é particularmente verdadeiro no intestino, onde acredita-se que suprime a produção de citocinas de macrófagos e a inflamação da mucosa em condições como doença inflamatória intestinal ou “IBD.” Sanjab et al. Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236. Assim como a IBD, a AR é um distúrbio autoimune com um componente inflamatório direcionado às articulações. A AR resulta de respostas aberrantes em células T e/ou B. O TGF-β sistêmico parece oferecer proteção contra o desenvolvimento de AR. Ver Schramm et al., Arthritis Res. Ther. 6: R114-R119 (2004) e Sanjab et al. Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236) e referências nele citadas.

[0016] Várias abordagens para regular a ação do TGF-β no nível da proteína, sequestrando-a para neutralizar efetivamente sua ação, foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos monoclonais como Metelimumabe (CAT192) que é direcionado contra TGF-β1 e Fresolimumabe direcionado contra múltiplas isoformas de TGF-β foram desenvolvidos para ligar, sequestrar e neutralizar TGF-β in vivo. Além disso, traps de receptor que se ligam firmemente e sequestram TGF-β, desse modo, sequestrando e neutralizando-o também foram desenvolvidas (ver, por exemplo, Swaagrtra, et al., Mol Cancer Ther; 11(7): 1477-87 (2012) e Pat. U.S. Pub. N.° 2018/0327477).

[0017] Ao contrário das moléculas descritas acima que são projetadas para ligar e sequestrar o TGF-β e atuar como antagonistas da ação de TGF-β, os complexos de TGF-β mascarados descritos neste documento fornecem polipeptídeos de TGF-β ativos (por exemplo, agonistas da via de sinalização de TGF-β) e um polipeptídeo de mascaramento (por exemplo, um fragmento de receptor TGF-β) que interagem entre si para mascarar reversivelmente a sequência polipeptídica de TGF-β. Os complexos de TGF-β mascarados podem incluir variações de sequência no TGF-β e/ou nos polipeptídeos de mascaramento que podem reduzir sua afinidade mútua e contribuir para o desmascaramento de TGF-β, permitindo sua sinalização de ligação através de receptores de superfície celular heteroméricos (por exemplo, ligação a TβRII seguida por TβRI para formar um receptor heteromérico). Uma vez formado, o complexo polipeptídico TβRI-TβRII heteromérico, que tem alta afinidade para TGF-β, pode competir efetivamente com o polipeptídeo de mascaramento. Variações de sequência em TGF-β e/ou seu polipeptídeo de mascaramento também podem permitir evitar interações indesejáveis entre o polipeptídeo TGF-β não mascarado e outras moléculas. Tais variações de sequência incluem deleções de porções do terminal N de TβRII que atenuam a ligação a TβRI e/ou variações de sequência de TGF-β impedindo sua dimerização (por exemplo, substituições C77S) que limitam a ligação do alvo ao reservatório de moléculas TβRIII não sinalizadoras. Além do acima exposto, os construtos e complexos de TGF-β mascarados também podem compreender sequências polipeptídicas imunomoduladoras (MODs) de tipo selvagem (wt) e/ou variantes que podem afetar substancialmente o resultado da ligação de TGF-β a uma célula alvo, incluindo efeitos in vitro e efeitos in vivo, como resultados terapêuticos.

II. SUMÁRIO

[0018] A presente divulgação descreve a preparação de construtos em que o TGF-β é mascarado por outro polipeptídeo (“construtos de TGF-β mascarados”, ver, por exemplo, a estrutura A da FIG 1 com uma única cadeia polipeptídica) e complexos em que o TGF-β é mascarado por outro polipeptídeo (“complexos polipeptídicos de TGF-β”, ver, por exemplo, estruturas B-F da FIG 1 mostrando complexos compreendendo duas cadeias polipeptídicas), cujos construtos e complexos, que também podem compreender elementos adicionais, são referidos neste documento coletivamente como “construtos e complexos de TGF-β mascarados.” Os construtos e complexos de TGF-β mascarados são construídos em torno de um polipeptídeo de scaffold (por exemplo, uma região Fc de imunoglobulina) e contêm sequências polipeptídicas de mascaramento que se ligam a TGF-β (uma “sequência polipeptídica de mascaramento”, “polipeptídeo de mascaramento” ou “sequência de mascaramento”). Os construtos e complexos de TGF-β mascarados também podem conter uma ou mais sequências polipeptídicas imunomoduladoras selecionadas independentemente, tais como sequências polipeptídicas de IL-2 de tipo selvagem ou variante.

[0019] Os construtos e complexos de TGF-β mascarados podem ser expressos em vários tipos de células de mamíferos, uma vez que a atividade de TGF-β não direcionada mascarada não afeta adversamente as células na medida em que é observada com TGF-β não mascarado.

[0020] Construtos de TGF-β mascarados podem compreender como um primeiro polipeptídeo: i) uma sequência polipeptídica de scaffold; ii) uma sequência polipeptídica de TGF-β; iii) uma sequência polipeptídica de mascaramento compreendendo opcionalmente uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou uma sequência polipeptídica anti-TGF-β; iv) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente; e v) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente; um construto compreendendo esses elementos sendo coletivamente referidos neste documento como um “construto de TGF-β mascarado”, em que a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β se ligam umas às outras. Esse construto de TGF-β mascarado pode ser organizado em ordem (do terminal N ao terminal C) como, por exemplo: i) a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou ii) uma primeira sequência polipeptídica MOD, a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou iii) uma primeira sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente, uma segunda sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente, opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas MOD adicionais, a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β; em que o construto de TGF-β mascarado compreende opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente.

[0021] O polipeptídeo de scaffold dos construtos de TGF-β mascarados acima mencionados pode compreender sequências de dimerização interespecíficas ou não interespecíficas que causam a formação de um homodímero em que as sequências polipeptídicas de scaffold opcionalmente têm uma ou mais ligações covalentes entre si.

[0022] Os polipeptídeos de scaffold dos construtos de TGF-β mascarados acima mencionados também podem compreender uma sequência de dimerização interespecífica e compreender ainda um segundo polipeptídeo que dimeriza com um primeiro polipeptídeo (como descrito acima) através de uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte para formar um heterodímero de complexo de TGF-β mascarado. O segundo polipeptídeo pode compreender uma das seguintes estruturas: (i) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (ii) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (iii) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte e uma sequência MOD selecionada independentemente; ou (iv) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte em que o primeiro e/ou o segundo polipeptídeos compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente. O segundo polipeptídeo, portanto, pode compreender uma das seguintes estruturas, do terminal N ao terminal C: (i) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (ii) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (iii) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte e uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente; ou (iv) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; em que o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente. Alternativamente, o heterodímero do complexo de TGF-β mascarado pode compreender, em ordem, do terminal N ao terminal C: (i) a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β; (ii) uma primeira sequência polipeptídica MOD, a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou (iii) uma primeira sequência polipeptídica MOD independentemente selecionada, uma segunda sequência polipeptídica MOD independentemente selecionada, a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF- β.

[0023] Os complexos TGF-β mascarados também podem compreender um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo como um heterodímero do complexo de TGF-β mascarado, em que: (i) o primeiro polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, b) uma sequência polipeptídica de mascaramento compreendendo opcionalmente uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou uma sequência polipeptídica anti-TGF-β, c) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente; (ii) o segundo polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte à sequência de dimerização interespecífica no primeiro polipeptídeo, b) uma sequência polipeptídica de TGF-β, c) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente; um complexo compreendendo esses elementos sendo coletivamente referidos a um “complexo de TGF-β mascarado”, em que a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF- β são fornecidas em diferentes cadeias polipeptídicas e se ligam umas às outras; em que a sequência de ligação interespecífica e a sequência de ligação interespecífica da contraparte interagem entre si no heterodímero; e em que o primeiro polipeptídeo TGF-β mascarado e/ou o segundo polipeptídeo compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente.

[0024] As sequências polipeptídicas de TGF-β podem ser derivadas de qualquer uma das isoformas de TGF-β e podem compreender substituições que limitam a capacidade das sequências de TGF-β de dimerização. As sequências de mascaramento podem ser, por exemplo, sequências de anticorpo anti-TGF-β ou sequências de ectodomínio do receptor TGF-β (TβR). Quando ectodomínios de TβR são usados para mascarar as sequências de TGF-β, eles podem ser modificados para evitar sinalização inadvertida pela molécula mascarada (por exemplo, por deleção de todo ou parte do ectodomínio não necessário para interação com a sequência de TGF-β).

[0025] Esta divulgação também descreve e fornece métodos de produção dos construtos e complexos de TGF-β mascarados e métodos de seu uso na efetivação de vários tipos de células e no tratamento de uma variedade de doenças/distúrbios, incluindo doenças autoimunes e inflamatórias. Os métodos de tratamento descritos neste documento podem incluir co- administração dos construtos e complexos de TGF-β mascarados com outras moléculas incluindo, mas não se limitando a: imunomoduladores (por exemplo, interleucinas, citocinas, quimiocinas e semelhantes); anticorpos e fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv, nanocorpos, etc.); agentes terapêuticos de moléculas pequenas (por exemplo, vitamina D ou ácidos retinoicos); e combinações destes que podem ser benéficas para alcançar o resultado laboratorial ou terapêutico desejado.

III. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A FIG. 1 representa alguns formatos para construtos e complexos de TGF-β mascarados em que uma sequência do receptor TGF-β é usada para mascarar um polipeptídeo de TGF-β. A estrutura A representa um construto monomérico com uma única localização para um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um conjunto de MODs selecionados independentemente em tandem). A estrutura B representa um homodímero simétrico em que os polipeptídeos interagem por meio de suas respectivas sequências Fc de Ig, que podem formar espontaneamente ligações dissulfeto que ligam os dois polipeptídeos. As estruturas C-F representam estruturas heterodiméricas em que as sequências do receptor TGF-β e TGF-β estão em “cis” (no mesmo polipeptídeo) ou “trans” (em diferentes polipeptídeos) do heterodímero. Locais onde um ou mais MODs selecionados independentemente podem ser colocados são mostrados por círculos preenchidos com linhas diagonais ou verticais ou um padrão quadriculado. Pares de ligação interespecíficos são representados por sequências knob-in- hole, mas podem ser qualquer um dos outros como discutido abaixo. Os construtos podem incluir nenhum MODs, ou podem incluir uma, duas ou mais sequências MOD selecionadas independentemente, incluindo sequências MOD em tandem, cujas MODs podem ser fornecidas nos locais indicados. MODs exemplificativos incluem, por exemplo, tipo selvagem ou mutante (por exemplo, com afinidade reduzida e/ou afinidade seletiva para um receptor ou receptores particulares) sequências PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23 MOD Em cada caso em que uma sequência de receptor TGF-β é usada para mascarar um polipeptídeo de TGF-β, o polipeptídeo de receptor pode ser substituído por outro polipeptídeo de mascaramento, tal como um polipeptídeo de anticorpo (por exemplo, scFV ou um nanocorpo) com afinidade para o polipeptídeo de TGF-β. As sequências de scaffold podem ser unidas (por exemplo, por ligações dissulfeto) para formar homodímeros ligados covalentemente ou heterodímeros ligados covalentemente. Qualquer um dos construtos mostrados nas figuras pode ter variações de sequência no polipeptídeo TGF-β que limitam sua capacidade de dimerizar (por exemplo, substituições C77S).

[0027] As FIGs. 2A-2H fornecem sequências de aminoácidos (aas) de polipeptídeos Fc de imunoglobulina (SEQ ID NOs:68-83).

[0028] A FIG. 2I fornece as sequências de aminoácidos de uma cadeia J humana com o peptídeo de sinal 1-22 aas sublinhado (SEQ ID NO:84).

[0029] A FIG. 2J fornece uma sequência de um domínio CH1 da região constante da cadeia pesada de Ig G1. Os resíduos de serina nas posições 70 e 72, que podem ser substituídos por ácido glutâmico e valina, respectivamente (S70E e S72V) para a formação de um construto semelhante a MD13.

[0030] A FIG. 2K fornece uma sequência de um domínio “CL” da região constante da cadeia leve das cadeias Ig K e Ig À. A serina na posição 68 e a treonina na posição 70 podem ser substituídas por leucina e serina, respectivamente (S68L e T70S) para a formação de um construto semelhante a MD13.

[0031] A FIG. 3 fornece as sequências de três isoformas diferentes de TGF-β como pré-proproteínas e a forma madura de TGF-β3 juntamente com o mutante C77S da proteína madura.

[0032] A FIG. 4 fornece um alinhamento das isoformas 1-3 de TGF-β com os resíduos correspondentes à forma madura de TGF-β2 em negrito, exceto os resíduos aa Lys 25, Cys 77, Ile 92 e/ou Lys 94 de TGF-β2 e seus resíduos correspondentes nas outras formas de isoformas 1 e 3 de TGF-β que estão sublinhadas e não em negrito.

[0033] A FIG. 5A fornece as sequências de um receptor TGF-β tipo 1 (TβRI) e seu ectodomínio.

[0034] A FIG. 5B fornece as sequências de um receptor TGF-β tipo 2 (TβRII), seu ectodomínio e fragmentos do ectodomínio. Os locais indicados em negrito e sublinhado na isoforma B são aas F30, D32, S52, E55 e D118 do polipeptídeo maduro, qualquer um dos quais pode ser substituído por um aa diferente do aa de ocorrência natural.

[0035] A FIG. 5C fornece as sequências de um receptor TGF-β tipo 3 (TβRIII).

[0036] A FIG. 6 mostra um gráfico que mostra a capacidade de diferentes concentrações de vários construtos e complexos de TGF-β mascarados para estimular a expressão de FoxP3 nas células T CD4 não expostas com base na análise de citometria de fluorescência. A Parte A mostra a indução de FoxP3 (como a porcentagem de células CD4+) com base nas concentrações indicadas de TGF-β3 ou um construto de TGF-β3WT mascarado (ver FIG. 1, estrutura A) na ausência e presença de 50U/ml de IL-2 adicionada após 5 dias em cultura de células. A Parte B mostra a distribuição de células FoxP3+ (como a porcentagem de células CD4) em populações de células T não expostas tratadas por 5 dias com várias concentrações de TGF- β3 ou um dos três construtos de TGF-β3 mascarados ou um complexo de TGF-β3 mascarado contendo pelo menos um N-terminal em peso. ou IL-2 MOD variante (ver FIGs. 7G a 7I para as estruturas). A parte C mostra a indução de células FoxP3+ CD4+ na presença de um polipeptídeo TGF-β3 mascarado (estrutura (i) na parte B da FIG. 6) em concentrações de 0,1 nM ou 1000 nM.

[0037] As FIGs. 7A fornecem a sequência de aa de um TGF-β mascarado representativo (construto N.°:3470) SEQ ID NO:146, com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura A. O polipeptídeo compreendendo, do N- terminal ao C-terminal em peso, IL-2 humana (hIL2), três repetições de ligante G4S, Fc de mono IgG humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S, uma sequência humana TβRII (hTβRII)Δ25 com uma subscrição D118A, cinco repetições de ligante G4S e sequência humana TGF-β3 (hTGF-β3) com uma substituição C77S.

[0038] As FIGs. 7B fornecem a sequência de aa de um TGF-β mascarado representativo (construto N.°:3334) SEQ ID NO:147 com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura B. O polipeptídeo, que forma um homodímero compreende, do terminal N ao terminal C, hIL2 com substituições H16T e F42A, três repetições de um G4S, Fc de IgG1 humana com substituições LALA, um G5S e duas repetições de um ligante G4S, um hTβRIIΔ25, D118A, cinco repetições de G4S e sequência hTGF-β3.

[0039] As FIGs. 7C fornecem as sequências de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura D que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro construto polipeptídico N.°:3618 (SEQ ID NO:148), compreende de N- terminal a C-terminal, hIL-2 em peso, três repetições de um ligante G4S, cadeia A de polipeptídeo knob-in-hole (KiH) de IgG1 Fc humana com substituições LALA, cinco repetições da sequência ligante G4S e sequência hTGF-β3 com uma substição C77S. O segundo polipeptídeo (construto N.°:3619), SEQ ID NO:149, compreende, do terminal N ao terminal C, hIL2 em peso, três repetições de ligante G4S, cadeia polipeptídica B de Fc KiH de IgG1 humana com substituições LALA, um ligante G5S e duas repetições de ligante G4S e uma sequência hTβRIIΔ25, D118A.

[0040] As FIGs. 7D fornecem as sequências de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura E que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo (construto N.°:3618), SEQ ID NO:150 descrito acima, compreende de N-terminal a C-terminal, hIL-2 em peso, três repetições de um ligante G4S, cadeia de polipeptídeo A de knob in hole (KiH) de IgG1 Fc humana com substituições LALA, cinco repetições de sequência de ligante G4S e sequência hTGF-β3 com uma substição C77S. O segundo polipeptídeo (construto N.°:3855), SEQ ID NO:151, compreende, do terminal N ao terminal C, cadeia polipeptídica B de Fc KiH de IgG1 humana com substituições LALA, T366S, L368A e Y407V, três repetições de ligante G4S e uma sequência hTβRIIΔ25, D118A.

[0041] As FIGs. 7E fornecem as sequências de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura F que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo (construto N.°:3891), SEQ ID NO:152, compreende, do terminal N ao terminal C, hIL-2 com H16A, F42A, três repetições da sequência de ligante G4S, cadeia polipeptídica A de knob in hole (KiH) Fc de IgG1 humana com substituições LALA e T366W, um G5S e duas repetições de ligante G4S, hTβRIIΔ25, D118A, cinco repetições de ligante G4S e hTGF-β3 com uma subscrição C77S. O segundo polipeptídeo (construto N.°:3664), SEQ ID NO:153, compreende, do terminal N ao terminal C, cadeia polipeptídica B de Fc KiH de IgG1 humana com substituições LALA.

[0042] As FIGs. 7F fornecem as sequências de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura F que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo (construto N.°:3715), SEQ ID NO:155, compreende do terminal N ao terminal C, cadeia A de polipeptídeo Fc KiH de IgG1 humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S e sequências de IL2 em peso humano. O segundo polipeptídeo (construto N.°:3714), SEQ ID NO:156, compreende, do terminal N ao terminal C, cadeia de polipeptídeo FcKiH de IgG1 humana B com substituições LALA, três repetições de um ligante G4S, um hTβRIIΔ25, com substituições D32N e D118A, cinco repetições da sequência de ligante G4S e uma sequência hTGF-β3 com uma substituição C77S.

[0043] Qualquer uma da sequência de IL-2 nas FIGs. 7A a 7F pode ser substituída por um MOD ou MOD variante diferente de IL-2, substituído por IL-2 em peso ou substituído por uma sequência de IL-2 com substituições em N88, H16 e/ou F42, (por exemplo, um N88R, uma substituição em H16 selecionada de H16A ou H16T e/ou uma substituição em F42 selecionada de F42A e F42T).

[0044] As FIGs. 7G fornecem a sequência de aa de um TGF-β mascarado representativo (construto N.°:3472) SEQ ID NO:157, com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura A. O polipeptídeo compreendendo, a partir do terminal N ao terminal C de hIL2 em peso, três repetições de ligante G4S, Fc de mono IgG humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S, uma sequência humana TβRII (hTβRII)Δ25 com substituições D32N e D118A, cinco repetições de ligante G4S e sequência humana TGF-β3 (hTGF- β3) com uma substituição C77S.

[0045] As FIGs. 7H fornecem a sequência de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo (construto N.°:3466), SEQ ID NO:158, tendo a estrutura geral da FIG. 1 estrutura A. O polipeptídeo compreendendo, a partir do N-terminal ao C-terminal de hIL2 em peso, três repetições de ligante G4S, Fc de IgG mono humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S, uma sequência de TβRII humano (hTβRII)Δ25 com uma substituição D118A, cinco repetições de ligante G4S e sequência de TGF-β3 humano (hTGF-β3) com uma substituição C77S.

[0046] As FIGs. 7I fornecem a sequência de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo (construto N.°:3468), SEQ ID NO:159, com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura A. O polipeptídeo compreendendo, do terminal N ao terminal C hIL2 com substituições de H16T F42A, três repetições de ligante G4S, Fc de IgG mono humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S, uma sequência humana de TβRII (hTβRII) Δ25 com substituições D32N e D118A, cinco repetições de ligante G4S e sequência humana de TGF-β3 (hTGF-β3) com uma substituição C77S.

[0047] As FIGs. 7J fornecem as sequências de aa de um construto de TGF-β mascarado representativo com a estrutura geral da FIG. 1 estrutura D que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo (construto N.°:3618), SEQ ID NO:148, compreende de terminal N a terminal C, hIL-2 em peso, três repetições de um ligante G4S, cadeia A de polipeptídeo knob-in-hole (KiH) de IgG1 Fc humana com substituições LALA, cinco repetições da sequência ligante G4S e sequência hTGF-β3 com uma substição C77S. O segundo polipeptídeo (construto N.°:3621), SEQ ID NO:160, compreende, do terminal N ao terminal C, hIL2 em peso, três repetições de ligante G4S, cadeia polipeptídica B de Fc KiH de IgG1 humana com substituições LALA, três repetições de ligante G4S e uma sequência hTβRIIΔ25 com substituições D32N e D118A.

[0048] A FIG. 8 mostra um construto de TGF-β mascarado (esquerda) e dois complexos de TGF-β mascarados (centro e direita). As amostras dos complexos foram preparadas construindo vetores de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos, transfectando células ExpiCHO e expressando os polipeptídeos. Os polipeptídeos foram purificados por cromatografia de proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purificadas foram submetidas a SDS-PAGE e os géis resultantes foram corados com azul de Coomassie. NR = amostras não reduzindo ou não reduzidas, e R = amostras reduzidas (redução com um agente redutor de dissulfeto).

[0049] A FIG. 9 mostra o efeito de várias substituições de aa em sequências polipeptídicas TβRII maduras (ver FIG. 5B) na sua afinidade para TβRII e TGF-β3 ou TGF-β1 (Tabela, canto superior esquerdo). A FIG. 9 também mostra o efeito de três dessas substituições, E55A, D32N e S52L, na interação de ligação entre um construto de TGF-β mascarado de TβRII e um construto de receptor de TβRII-Fc imobilizado. O construto do receptor é mostrado em um formato de ensaio de captura com TGF-β3 no canto superior direito da figura em que: mono-Fc é um scaffold de Ig que não forma ligações interespecíficas com outros scaffolds, e anti-IL-2 é um anticorpo contra IL-2 marcado com biotina (B). Strep e HRP são estreptavidina e peroxidase de rábano usada para detecção. O efeito na ligação foi detectado em uma captura como curvas de ligação desenvolvidas para cada um dos quatro construtos mascarados (inferior). Veja o Exemplo 3.

[0050] A FIG. 10 mostra a estrutura e as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos que formam o complexo de TGF-β3 mascarado PSM-4033- 4039.

[0051] A FIG. 11 mostra os resultados de um experimento em que PSM-4033-4039 é usado para induzir Foxp3+ iTregs a partir de células T CD4+não expostas periféricas humanas. Veja o Exemplo 4.

[0052] A FIG. 12 mostra os resultados de um experimento em que Foxp3+ iTregs induzidos por PSM-4033-4039 são usados para suprimir a proliferação de células T. Veja o Exemplo 4.

[0053] A FIG. 13 mostra os resultados de um experimento em que PSM-4033-4039 é usado para induzir a expressão de Foxp3+ iTregs de células T CD4+periféricas humanas, incluindo células T CD4+não expostas e de memória. Veja o Exemplo 4.

[0054] As FIGS. 14A e B mostram os resultados de um experimento em que PSM-4033-4039 é usado para induzir Foxp3+ iTregs de células T CD4+ ativadas por uma reação de linfócitos alogênicos. Veja o Exemplo 4.

[0055] A FIG. 15 mostra os resultados de um experimento em que o PSM-4033-4039 foi administrado por via intravenosa a camundongos em várias concentrações para determinar as concentrações séricas nos camundongos em vários intervalos até 72 horas após a injeção. Veja o

Exemplo 4. IV. DESCRIÇÃO DETALHADA A. DEFINIÇÕES

[0056] Tal como utilizado neste documento, o aminoácido (abreviado “aa” quando singular, a menos que o contexto o determine, pode ser plural e, como “aas” na forma plural) significa os aminoácidos alfa proteogênicos de ocorrência natural incorporados em polipeptídeos e proteínas na tradução de células de mamíferos. Salvo indicação em contrário: L (Leu, leucina), A (Ala, alanina), G (Gly, glicina), S (Ser, serina), V (Val, valina), F (Phe, fenilalanina), Y (Tyr, tirosina), H (His, histidina), R (Arg, arginina), N (Asn, asparagina), E (Glu, ácido glutâmico), D (Asp, asparagina), C (Cys, cisteína), Q (Gln, glutamina), I (Ile, isoleucina), M (Met, metionina), P (Pro, prolina), T (Thr, treonina), K (Lys, lisina) e W (Trp, triptofano). O aminoácido também inclui os aminoácidos hidroxiprolina e selenocisteína, que aparecem em algumas proteínas encontradas em células de mamíferos.

[0057] Os termos “polipeptídeo”, “sequência polipeptídica” e “proteína”, conforme usados neste documento, são sinônimos e significam uma sequência de aas unidos por ligações peptídicas entre seu grupo carboxila C-1 e sua alfa amina para formar a estrutura principal do polipeptídeo. Consequentemente, cada polipeptídeo (por exemplo, um primeiro polipeptídeo) que compreende qualquer um ou mais de: uma sequência polipeptídica MOD, uma sequência polipeptídica de scaffold, uma sequência polipeptídica de TGF-β e/ou uma sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β) compreende qualquer uma ou mais dessas sequências polipeptídicas como uma cadeia polipeptídica com uma única estrutura principal contígua. Tais polipeptídeos (por exemplo, primeiros polipeptídeos) podem ser ligados a outros polipeptídeos por ligações covalentes (por exemplo, tais como ligações dissulfeto entre as cadeias laterais de resíduos de cisteína). Além disso, conforme usado neste documento, os termos “polipeptídeo”, “sequência polipeptídica” e “proteína” incluem modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservadora, como seria conhecido por uma pessoa na técnica) para a sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcioada ao local, ou podem ser acidentais, tal como através de mutações dos hospedeiros que produzem as proteínas, ou erros devido à amplificação por PCR ou outros métodos de DNA recombinante.

[0058] Quando uma modalidade, reivindicação ou aspecto é direcionado a um tipo específico de mamífero (por exemplo, sujeitos humanos ou não humanos), as sequências de ácidos nucleicos e polipeptídeos podem ser limitadas a sequências desses sujeitos. Salvo indicação em contrário, a sequência polipeptídica de proteínas (por exemplo, TGF-β, TβRs, imunoglobulinas e MODs) são sequências humanas (Homo Sapiens).

[0059] Conforme usado neste documento, “mascarado” significa que uma molécula (por exemplo, polipeptídeo mascarado ou proteína mascarada) está ligada ou de outra forma engatada por uma molécula de mascaramento (por exemplo, polipeptídeo, proteína ou fragmento de proteína) que limita a disponibilidade da molécula mascarada a outras proteínas (por exemplo, receptores de superfície celular) que também têm afinidade com a molécula.

[0060] Tal como utilizado neste documento, o termo construto de TGF-β mascarado refere-se a um único polipeptídeo que compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β (por exemplo, TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β) e uma sequência polipeptídica de mascaramento que se liga a ou interage com o polipeptídeo de TGF-β. Salvo indicação em contrário, um construto de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica de scaffold e, opcionalmente, compreende uma ou mais sequências polipeptídicas imunomoduladoras (MOD) selecionadas independentemente.

[0061] Tal como utilizado neste documento, o termo complexo de TGF-β mascarado refere-se a dois ou mais polipeptídeos (tipicamente dois polipeptídeos designados um primeiro e um segundo polipeptídeos dispostos como um homodímero ou heterodímero, mas que podem ser um multímero de ordem superior). Os complexos TGF-β mascarados compreendem uma sequência polipeptídica de TGF-β (por exemplo, TGF-β1, TGF-β2 ou TGF- β), uma sequência polipeptídica de mascaramento que se liga ou interage com o polipeptídeo TGF-β e um polipeptídeo de scaffold que compreende uma sequência de dimerização ou multimerização através da qual os polipeptídeos do complexo de TGF-β se associam. Qualquer um ou mais dos polipeptídeos do complexo de TGF-β opcionalmente compreende uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente.

[0062] A frase “construto ou complexo de TGF-β mascarado” é uma abreviação para um construto de TGF-β mascarado ou complexo de TGF-β mascarado. A abreviatura pode ser usada em sua forma plural “construtos ou complexos de TGF-β mascarados.”

[0063] A frase “construtos e complexos de TGF-β mascarados” é uma abreviação para “construtos de TGF-β mascarados” e “complexos de TGF-β mascarados.”

[0064] As sequências de dimerização e multimerização, tal como utilizadas neste documento, são sequências polipeptídicas que permitem a associação de sequências polipeptídicas (por exemplo, polipeptídeos separados) como dímeros (por exemplo, heterodímeros ou homodímeros) ou multímeros (homo- ou hetero-multímeros de três, quatro cinco ou mais sequências polipeptídicas). As sequências de dimerização e multimerização permitem a associação de sequências de uma forma não covalente que pode ser convertida em um complexo covalente em algumas circunstâncias (por exemplo, formação de ligação dissulfeto entre os polipeptídeos).

[0065] As sequências de ligação interespecíficas são sequências de dimerização que permitem um paramento assimétrico de polipeptídeos (formação de heterodímero). As sequências de ligação interespecíficas favorecem a formação de heterodímeros com suas sequências de ligação interespecífica (em oposição à formação de homodímeros), que é seu parceiro de ligação cognato. Os pares de polipeptídeos Fc key-into-hole (ou key-into- hole) representam um exemplo de uma sequência de ligação interespecífica e sua sequência de ligação interespecífica homóloga.

[0066] Nanobodies® ou nanocorpo, conforme usado neste documento, refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo variável monomérico que, como um anticorpo inteiro, é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico.

[0067] O tipo selvagem (abreviado como “peso”) em relação às sequências de aa significa uma sequência de aa de ocorrência natural, ou uma porção contígua de uma sequência de aa de ocorrência natural, conforme entendido a partir do contexto, que não foi alterada (não tem quaisquer substituições, deleções ou inserções nela) em relação a uma sequência encontrada naturalmente em um organismo vivo. Uma sequência específica de ocorrência natural pode ser designada como a sequência em peso para referência.

[0068] Como utilizado neste documento “célula T” inclui todos os tipos de células imunológicas que expressam CD3, incluindo as células T- helper (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células T reguladoras (Treg) e células NK-T.

[0069] O termo “ligação”, conforme usado neste documento, refere-se a uma interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo, a interação não covalente entre um MOD e seu co-MOD. Ligação não covalente refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações eletrostáticas, hidrofóbicas, iônicas e/ou de ligação de hidrogênio, incluindo interações tais como pontes de sal e pontes de água. As interações de ligação não covalentes são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (KD) de inferior a 10-6 M, inferior a 10-7 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, inferior a 10-11 M, inferior a 10-12 M, inferior a 10-13 M, inferior a 10-14 M, ou inferior a 10-15 M. “Ligação específica” geralmente se refere à ligação com uma afinidade de pelo menos cerca de 10-7 M ou superior, por exemplo, 5 x 10-7 M, 10-8 M, 5 x 10-8 M, 10-9 M, e superior. “Ligação não específica” geralmente se refere à ligação (por exemplo, a ligação de um ligante a uma fração diferente de seu sítio ou receptor de ligação designado) com uma afinidade inferior a cerca de 10-7 M (por exemplo, ligação com uma afinidade de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M). “Ligação covalente” ou “ligação covalente”, tal como utilizado neste documento, refere-se à formação de uma ou mais ligações químicas covalentes entre duas moléculas diferentes.

[0070] “Afinidade” refere-se à força de ligação não covalente, afinidade de ligação aumentada sendo correlacionada com um KD mais baixo. Tal como usado neste documento, o termo “afinidade” refere-se à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes (por exemplo, um anticorpo e um antígeno) e é expresso como uma constante de dissociação (KD).

[0071] O termo “polipeptídeo imunomodulador” ou MOD, conforme usado neste documento, inclui um polipeptídeo em uma célula estabelecidora de antígeno (APC) (por exemplo, uma célula dendrítica, uma célula B e semelhantes), ou uma porção do polipeptídeo em um APC, que se liga especificamente a um polipeptídeo co-imunomodulador cognato (“co-MOD”) em uma célula T, fornecendo assim um sinal. Por exemplo, a ligação de uma interleucina tal como IL-2 ou um fragmento desta (uma MOD) a um receptor de IL-2 de superfície celular (uma co-MOD) fornece um sinal para a célula. As MODs incluem, mas não estão limitadas a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23, PD-L1 e ligante Fas (FAS-L). As MODs também abrangem, inter alia, um anticorpo ou uma sequência de anticorpos (por exemplo, um nanocorpo) que se liga especificamente a uma molécula co- MOD presente em uma célula T que resulta na sinalização pelo coMOD. Conforme discutido neste documento, as MODs também incluem variantes de peso MODs incluindo, por exemplo, MODs variantes que têm uma afinidade de ligação reduzida para um co-MOD. Tal afinidade reduzida pode assumir múltiplas formas. Por exemplo, um IL-2 MOD variante pode ter afinidade reduzida para uma ou mais das cadeias α, β e/ou Yde IL-2R. Conforme discutido neste documento, as MODs de IL-2 variantes compreendendo mutações nas posições 16 e 42 podem exibir substancialmente nenhuma ligação à cadeia α de IL-2R e afinidade reduzida para a cadeia β de IL-2R. Além disso, para MODs que têm mais de um co-MOD (por exemplo, CD80 se liga a CD28 e CTLA-4), um MOD variante pode ter afinidade reduzida para um dos co-MODs de modo que se ligue preferencialmente ou seletivamente ao outro co-MOD. Para o propósito desta divulgação, TGF-β (por exemplo, TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3) e fragmentos destes não são considerados MODs.

[0072] Salvo indicação em contrário, o termo “substancialmente” destina-se a abranger tanto “totalmente” quanto “em grande parte, mas não totalmente”. Por exemplo, um IL-2 MOD variante que não exibe substancialmente nenhuma ligação à cadeia α de IL-2R é um IL-2 MOD variante que não se liga à cadeia α de IL-2R ou em grande parte não se liga à cadeia α de IL-2R.

[0073] Tal como utilizado neste documento, o termo “in vivo” refere- se a qualquer processo ou procedimento que ocorra dentro do corpo, por exemplo, de um paciente autoimune.

[0074] Tal como utilizado neste documento, “in vitro” refere-se a qualquer processo ou procedimento que ocorra fora do corpo, incluindo procedimentos que podem ser referidos como ex vivo.

[0075] “Tandem”, conforme usado neste documento para descrever a colocação de sequências polipeptídicas MOD modificativas, significa ter dois ou mais MODs dispostos adjacentes um ao outro em um polipeptídeo separado, no máximo, por um ligante (por exemplo, sem scaffold, polipeptídeo de mascaramento ou sequências TGF-β interpostas).

[0076] Tal como utilizado neste documento, o termo “ectodomínio” significa a parte (domínio) de uma proteína de membrana que se estende para o espaço extracelular e que não inclui uma porção suficiente do domínio transmembranar para fazer com que ele seja ancorado na membrana celular.

[0077] “Identidade de sequência”, conforme usado neste documento, é uma medida da aa ou identidade nucleotídica entre duas sequências polinucleotídicas ou duas sequências polipeptídicas. Afirmar que uma sequência de proteína ou polinucleotídeo tem uma certa porcentagem de “identidade de sequência” com outro polinucleotídeo ou polipeptídeo significa que, quando alinhada, essa porcentagem de bases ou aminoácidos é a mesma e na mesma posição relativa, ao comparar as duas sequências. A identidade de sequência pode ser determinada de várias maneiras diferentes. Para determinar a identidade de sequência, as sequências podem ser alinhadas usando vários métodos e programas de computador convenientes (por exemplo, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc), disponíveis na Internet em sites como ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/,ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Salvo indicação em contrário, a identidade de sequência é determinada usando alinhamentos realizados com a versão BLAST+ 2.9.0 do algoritmo NCBI BLAST liberada em 1° de abril de 2019 (para a proteína BLASTP 2.9.0+ e para os ácidos nucleicos BLASTN 2.9.0+).

[0078] “Recombinante”, conforme usado neste documento, significa que um determinado ácido nucleico (DNA ou RNA) é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição, reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou ligação resultando em um construto com uma sequência codificadora ou não codificadora estrutural distinguível de ácidos nucleicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Sequências de DNA que codificam polipeptídeos podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA ou a partir de uma série de oligonucleotídeos sintéticos para fornecer um ácido nucleico sintético que é capaz de ser expresso a partir de uma unidade transcricional recombinante contida em uma célula ou em um sistema de transcrição e tradução sem células. O recombinante usado em referência a um peptídeo, polinucleotídeo ou proteína indica que eles foram preparados por expressão a partir de um ácido nucleico recombinante.

[0079] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de” usado em conexão com uma quantidade indica que a quantidade pode variar em 10% da quantidade indicada. Por exemplo, “cerca de 100” significa uma quantidade de 90-110. Onde cerca de é usado no contexto de um intervalo, o “cerca de” usado em referência à menor quantidade do intervalo significa que a menor quantidade inclui uma quantidade que é 10% menor do que a menor quantidade do intervalo e “cerca de” usado em referência à maior quantidade de intervalo significa que a maior quantidade inclui uma quantidade 10% maior do que a maior quantidade de intervalo. Por exemplo, de cerca de 100 a cerca de 1000 significa que o intervalo se estende de 90 a 1100.

[0080] Os termos “tratamento” e “tratando” e similares são usados neste documento para geralmente significar a obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou um sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença. “Tratamento”, conforme usado neste documento, abrange qualquer tratamento de uma doença ou sintoma em um mamífero, e inclui: (a) prevenir que a doença ou sintoma ocorra em um sujeito que possa estar predisposto a contrair a doença ou sintoma, mas que ainda não tenha sido diagnosticado como a tendo; (b) inibir a doença ou sintoma, ou seja, interromper o seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença. O agente terapêutico (por exemplo, um construto ou complexo de TGF-β mascarado) pode ser administrado antes, durante ou após o início da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, em que o tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular interesse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da completa perda da função nos tecidos afetados. Tratamento terapêutico pode ser administrado durante a fase sintomática da doença e, em alguns casos, após a fase sintomática da doença.

[0081] Os termos “indivíduo”, “sujeito”, “hospedeiro” e “paciente”, são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a qualquer sujeito mamífero para quem o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejada. Os mamíferos incluem, por exemplo, humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, ratos; camundongos), lagomorfos (por exemplo, coelhos), ungulados (por exemplo, vacas, ratos, cabras, ovelhas, cavalos, porcos e semelhantes), caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, gatos) etc. (por exemplo, humanos, bovinos, caninos, felinos, roedores, murinos, caprinos, símios, ovinos, equinos, lapinos, suínos, etc.).

[0082] Deve-se observar que conforme usado neste documento e nas reivindicações e aspectos anexos, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a “um Treg” inclui uma pluralidade de tais Tregs e a referência ao “polipeptídeo TGF-β” inclui a referência a um ou mais polipeptídeos TGF-β e seus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante. Note-se ainda que as reivindicações podem ser redigidas para incluir ou excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso (inclusão) de tais elementos em reivindicações (por exemplo, com terminologia tal como “exclusivamente”, “apenas” e semelhantes), ou sua remoção das reivindicações ou como base para uma limitação “negativa” excluindo qualquer elemento opcional específico.

[0083] É apreciado que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de aspectos ou modalidades separados, também podem ser fornecidas em combinação em um único aspecto ou modalidade, incluindo aqueles subsequentemente reivindicados. Em contraparte, vários recursos da invenção que são, por concisão, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das modalidades relacionadas com a invenção são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento como se cada uma e todas as combinações tivessem sido individual e explicitamente divulgadas. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e dos elementos destas também são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento como se cada uma e toda subcombinação tivesse sido individual e explicitamente divulgada neste documento.

[0084] As publicações discutidas neste documento são fornecidas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para preceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Adicionalmente, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, que podem precisar ser confirmadas de forma independente.

B. DESCRIÇÃO 1. Introdução

[0085] A superfamília TGF-β inclui proteínas endógenas com funções inibidoras do crescimento. Aumentos na expressão de TGF-β ou defeitos nos mecanismos celulares que inibem a ação de TGF-β têm sido correlacionados com, entre outras coisas, a malignidade de muitos cânceres devido às ações imunossupressoras de TGF-β. A desregulação das funções imunossupressoras do TGF-β também está implicada em doenças autoimunes. Como o TGF-β é um regulador chave da função imunológica, tem sido alvo de inúmeros estudos e tanto o TGF-β quanto sua via de sinalização são considerados alvos terapêuticos para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo processos inflamatórios e distúrbios autoimunes.

[0086] A capacidade de preparar e distribuir efetivamente TGF-β como um terapêutico é complicada pela toxicidade da molécula e pela complexidade do sistema receptor TGF-β. A produção de TGF-β em grandes quantidades em sistemas de expressão de células de mamíferos é limitada pela toxicidade da proteína para muitas células de mamíferos. As células sujeitas à citotoxicidade de TGF-β incluem muitas daquelas usadas para a produção de moléculas biológicas, tais como células de Ovário de Hamster Chinês ou “CHO”, que são uma das células mais robustas e comumente empregadas para a produção comercial de proteínas. O uso de TGF-β como um terapêutico também é complicado pelo alto pI de TGF-β1 com pI de cerca de 8,59 (em oposição ao pI de cerca de 6,1 para TGF-β3), sua estabilidade/solubilidade limitada sob condições que não são ácidas (tais condições ácidas geralmente não são passíveis de uso terapêutico). Além disso, a grande quantidade de receptor TβRIII de alta afinidade (por exemplo, da ordem de 5 nM para TGF-β2) presente em sistemas de mamíferos em relação à afinidade de TβRII para TGF-β (da ordem de 1-2 μM) representa um dissipador farmacodinâmico significativo, limitando o acesso de produtos biológicos à base de TGF-β aos tecidos alvo. Da mesma forma, o papel de TβRIII no recrutamento de TGF-β para complexos TβRII/TβRI pode levar a uma distribuição significativa fora do alvo de TGF-β, com efeitos indesejados, indesejáveis e até tóxicos. Essa distribuição fora do alvo pode levar à ativação não específica e também pode levar a uma produção adicional de TGF-β ativo, particularmente onde a sinalização de TGF-β está sob controle de avanço de alimentação, produzindo assim efeitos indesejados e indesejáveis adicionais. Ver, por exemplo, Jiang et al., Redox Biol. 2: 267-272 (2014).

[0087] O uso eficaz de TGF-β como um terapêutico é ainda mais complicado pela necessidade de fornecer estímulos adicionais às células para direcionar o resultado da estimulação de TGF-β. Como observado acima, citocinas como IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23, PD- L1 e ligante Fas (FAS-L) podem ter profundas influências na ação de TGF-β. Consequentemente, a capacidade de distribuir TGF-β e estímulos adicionais na forma de citocinas, etc., pode ser vantajosa para alcançar efeitos terapêuticos ou mediados por células específicas (por exemplo, in vitro ou in vivo).

[0088] Conforme discutido em mais detalhes abaixo, a presente divulgação descreve o uso de um polipeptídeo TGF-β capaz de interagir e estimular a sinalização em células transportadoras de proteínas TβRI e TβRII. Vantajosamente, o polipeptídeo TGF-β faz parte de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, que é uma proteína de fusão (uma única cadeia polipeptídica) ou complexo de proteína de fusão (duas ou mais cadeias polipeptídicas) que também contém um polipeptídeo que se liga e mascara a sequência polipeptídica de TGF-β (por exemplo, uma sequência TβRII que funciona como uma sequência de mascaramento) construída em torno de um scaffold (por exemplo, um ou dois polipeptídeos, como polipeptídeos Fc de imunoglobulina). Exemplos de tais proteínas de fusão ou complexos de proteínas de fusão são representados na FIG. 1. No caso em que o polipeptídeo TGF-β da proteína de fusão interage com, por exemplo, um TβRIII celular, a porção da proteína de fusão que se liga e mascara o TGF-β compete com o TβRIII, impedindo que o TGF-β seja sequestrado no reservatório de TβRIII. Além disso, a afinidade do polipeptídeo de mascaramento para o polipeptídeo TGF-β, que pode ser intencionalmente variado usando substituições de aa, controla a potência geral do polipeptídeo mascarado para seu receptor alvo (por exemplo, TβRII) como demonstrado na FIG. 9. Como os polipeptídeos TGF-β se ligam principalmente a TβRIII como um dímero ligado por dissulfeto, as interações com esse receptor levando ao sequestro podem ser atenuadas incluindo substituições de aa que limitam a dimerização (por exemplo, C77S) ou a estabilidade do dímero, conforme discutido abaixo. A interação da proteína de fusão TGF-β ou complexo de proteína de fusão com TβRII desloca a sequência de mascaramento, formando um complexo de TGF-β/TβRII ligado à superfície celular. O recrutamento subsequente de TβRI para formar o receptor heterodimérico de TGF-β fornece um complexo de alta afinidade que se liga a TGF-β firmemente (por exemplo, afinidade picomolar) mesmo na presença da sequência polipeptídica de mascaramento. Consequentemente, o TGF-β mascarado ainda é capaz de se ligar ao complexo receptor TβRI/TβRII heterodimérico e sinalizar através da via da proteína Smad canônica, da via da Jun quinase não canônica e da via de sinalização p38. Com efeito, o polipeptídeo de mascaramento distribui TGF-β a uma célula e a distribuição a uma molécula de TβRII de superfície celular que subsequentemente recruta a proteína TβRI, formando um complexo de sinalização funcional e ativo que efetivamente mantém o polipeptídeo TGF-β no lugar.

[0089] Além de distribuir TGF-β mascarado por uma proteína de ligação a TGF-β (por exemplo, um fragmento de um receptor TGF-β compreendendo todo ou parte de seu ectodomínio de ligação a TGF-β) em uma forma que evita interações indesejáveis fora do alvo, um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode compreender um ou mais polipeptídeos que funcionam como um imunomodulador (um polipeptídeo “MOD”) capaz de afetar o resultado da ação de TGF-β nas células alvo. A capacidade de distribuir TGF-β e imunomoduladores juntos não só permite que a ação do sinal de ativação de TGF-β seja direcionada, mas reduz a quantidade de imunomodulador que seria necessária para produzir o mesmo efeito nas células alvo em relação à administração do imunomodulador sozinho. Este é um resultado do aumento da afinidade (através do aumento da avidez) obtido por ter duas sequências polipeptídicas com afinidade para receptores na mesma célula alvo. A avidez aumentada entre o construto ou complexo de TGF-β mascarado contendo um ou mais MODs e receptores de células alvo para o polipeptídeo TGF-β e um ou mais MODs (resultantes de uma energia livre aumentada de ligação, ΔG, devido a interações MOD com seus receptores) fornecem seletividade aprimorada na ativação de células alvo que têm ambos os tipos de receptores, desde que quantidades subsaturantes do construto ou complexo de TGF-β mascarado estejam presentes. A título de exemplo, um construto de TGF-β mascarado, tal como aquele na FIG. 1 estrutura A ou FIG. 7G, tendo um MOD de IL-2 é um indutor mais potente de diferenciação de iTReg de células CD4+ não expostas do que um construto de TGF-β mascarado idêntico que não possui um MOD de IL-2 mesmo na presença de uma quantidade equivalente (equimolar) do polipeptídeo MOD de IL-2. Além disso, em doses subsaturantes, e quando números semelhantes de tipos de células estão presentes, um construto como o da FIG. 1 estrutura A com um MOD de IL-2, como mostrado, por exemplo, na FIG. 7G, liga-se seletivamente a células com receptores de TGF-β e IL-2 em relação ao construto que não possui um MOD de IL-2.

[0090] A ação de construtos ou complexos de TGF-β mascarados pode ser ainda especificada pela incorporação de modificações que alteram as ações das sequências polipeptídicas individuais. Em algumas modalidades, substituições de aa que alteram a capacidade de TGF-β de dimerizar (por exemplo, uma substituição C77S em TGF-β3) podem ser incorporadas. Como a forma monomérica de TGF-β exibe pouca ou nenhuma afinidade para TβRIII, a incorporação de mutações que limitam a capacidade de TGF-β de dimerizar a ligação do alvo ao TβRIII que pode arrastar o complexo para o “reservatório” de TGF-β e limitar sua capacidade de estimular as células alvo.

[0091] Modificações (por exemplo, substituições, deleções, inserções etc.) também podem ser feitas a sequências polipeptídicas diferentes da sequência polipeptídica de TGF-β, incluindo a sequência polipeptídica de mascaramento e as sequências polipeptídicas imunomoduladoras.

[0092] Além das modificações da sequência do polipeptídeo TGF-β, podem ser feitas modificações no polipeptídeo que se liga ao TGF-β e o mascara. Tais modificações podem alterar a disponibilidade da sequência polipeptídica de TGF-β alterando a afinidade do polipeptídeo de mascaramento para TGF-β, bem como a taxa de respiração (taxas on e off) do polipeptídeo de mascaramento e do polipeptídeo de TGF-β. Embora dois complexos polipeptídicos/olipeptídicos de mascaramento de TGF-β diferentes possam ter a mesma constante de associação de ligação (razão de kon to koff), o complexo com um kon e koff mais altos pode efetivamente estar mais disponível para ligação de TβRII de superfície celular dependendo das constantes de taxa, particularmente a taxa de koff. A FIG. 9 fornece uma lista de algumas substituições de aa em TβRII que alteram a afinidade para TGF- β1 e TGF-β3, juntamente com um gráfico que mostra a afinidade de construtos de TGF-β mascarados de TβRII idênticos, sem ou com uma das três substituições, cada uma com um impacto diferente na ligação de TβRII a TGF-β3.

[0093] Embora seja possível utilizar vários polipeptídeos para mascarar TGF-β incluindo ambas as sequências de anticorpos de cadeia única (por exemplo, sequências de anticorpos de cadeia única humanizadas), podem ser empregadas sequências mínimas de receptores de TGF-β que se ligam a TGF-β (por exemplo, o ectodomínio de TβRI, TβRII ou TβRIII). O ectodomínio de TβRIII pode ser utilizado como um polipeptídeo de mascaramento para TGF-β dimérico; no entanto, sua alta afinidade por TGF-β pode fazer com que ele antagonize a ligação de sequências polipeptídicas de TGF-β a TβRII. No entanto, as sequências de mascaramento de TβRIII podem ser efetivamente deslocadas por complexos TβRI/TβRII de superfície celular com maior afinidade por polipeptídeos TGF-β, permitindo assim a ativação desses receptores de superfície celular.

[0094] O ectodomínio de TβRII pode ser utilizado como um polipeptídeo de mascaramento. A deleção de aminoácidos N-terminais de TβRII (por exemplo, delta 14 ou 25) pode produzir uma proteína (ou polipeptídeo) adequada para mascarar TGF-β com um pI calculado como sendo de cerca de 4,5 a cerca de 5,0 (por exemplo, cerca de 4,7 a 4,85) na presença ou ausência de substituições de D118A. Os polipeptídeos TGF-β1 combinados (que têm altos valores de pI) com polipeptídeos de mascaramento de TβRII (por exemplo, incluindo aqueles com deleções N-terminais) podem potencialmente neutralizar a carga polipeptídica de TGF-β1. O pI calculado de TβRII (delta25, D118A)/TGFβ1 é da ordem de 6,23, onde TGFβ1 tem um pI de cerca de 8,59. Em contraste, os complexos de delta 14 ou delta 25 TβRII e TGF-β3 (com ou sem substituições D118A e/ou C77S) são calculados para ter valores de pI de cerca de 4,9 a cerca de 5,3 (cerca de pI de 5,06 a 5,17). Além disso, embora a combinação do ectodomínio TβRII com um polipeptídeo TGF-β ativo possa resultar em um complexo capaz de interagir com o TβRI da superfície celular, afetando assim a sinalização de TGF-β (por exemplo, atuando como um agonista, agonista parcial, antagonista ou antagonista parcial) de TGF-β, a incorporação de substituições de aa limitando as interações com os limites de TβRI ou bloqueia a capacidade do complexo mascarado de participar da sinalização ativa. Consequentemente, como discutido abaixo, as sequências de ectodomínio de incorporação TβRII com deleções N-terminais (por exemplo, deleção de 14 a 25aa, Δ14 a Δ25) ou substituições (por exemplo, substituições em D118 por um aa diferente de ácido aspártico, como D118A, D118R, etc.) que reduzem ou ablacionam a ligação a TβRI podem ser usadas para mascarar TGF-β e prevenir a estimulação de células pelo polipeptídeo TGF-β mascarado de ectodomínio TβII, onde o terminal N do TβRII está intacto. Consequentemente, os complexos TGF-β mascarados, incluindo aqueles em que o TGF-β é mascarado por mutantes de deleção N-terminal de TβRII, podem agir desmascarando o TGF-β (dissociação do peptídeo de mascaramento ou abertura da molécula dobrada), ligação a uma célula alvo TβRII e TβRI de para formar um complexo de sinalização TβRI/TβRII heterodimérico ativo.

[0095] O mascaramento de TGF-β permite sua expressão em altos níveis em células de mamíferos (por exemplo, células CHO) sem redução na viabilidade celular. Isto é particularmente verdadeiro quando o polipeptídeo TGF-β mascarado é impedido de engatar TβRI por deleções, substituições e/ou outras mutações aa N-terminais. O bloqueio de interações TβRIII (por exemplo, bloqueando a dimerização) pode reduzir ainda mais os problemas associados à expressão celular.

C. CONSTRUTOS DE TGF-B MASCARADOS E COMPLEXOS DE TGF-B MASCARADOS

[0096] A presente divulgação descreve a preparação de construtos de TGF-β mascarados (ver, por exemplo, FIG 1, estrutura A, com uma única cadeia polipeptídica) e complexos de TGF-β mascarados (ver, por exemplo, FIG 1, estruturas B-F, tendo um complexo de duas cadeias polipeptídicas). Os construtos de TGF-β mascarados e complexos de TGF-β mascarados compreendem como seus componentes pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β, pelo menos um polipeptídeo que se liga e mascara os polipeptídeos de TGF-β e, opcionalmente, um ou mais (por exemplo, um, dois ou três) polipeptídeos imunomoduladores (MODs), todos os quais são montados em uma estrutura de scaffold. Embora os construtos de TGF-β mascarados e os complexos de TGF-β mascarados compreendam porções de proteínas ligadas à membrana (por exemplo, receptores de TGF-β), a menos que indicado de outra forma, eles não compreendem porções de domínios de ancoragem de membrana (por exemplo, domínios transmembranares suficientes para fazer com que a maioria da proteína expressa fique ancorada em uma membrana celular (por exemplo, células CHO expressas).

[0097] Exemplos não limitativos de construtos e complexos de TGF- β, incluindo aqueles das formas mostradas na FIG. 1 são descritos abaixo.

[0098] Os componentes dos construtos e complexos de TGF-β mascarados, incluindo MODs, scaffold, ligantes, polipeptídeos de TGF-β e polipeptídeos de mascaramento de TGF-β (por exemplo, um anticorpo de cadeia única ou um ectodomínio de receptor TGF-β) são cada um descritos nas seções que se seguem.

D. SEQUÊNCIAS POLIPEPTÍDICAS IMUNOMODULADORAS (“MODS”) 1. A incorporação de MODS em construtos e complexos de TGF-β mascarados

[0099] Como discutido acima, embora o polipeptídeo imunomodulador (MODs) não seja necessário para a distribuição de polipeptídeos TGF-β mascarados ou sua capacidade de ativar células através do receptor heterodimérico TβRI e TβRII, as MODs podem afetar substancialmente o resultado da ativação do receptor TGF-β. Consequentemente, pode ser desejável incorporar MODs de tipo selvagem (wt) ou variantes (por exemplo, que exibem afinidade reduzida, afinidade aumentada ou seletividade para receptores específicos também referidos como “co-MODs”, “polipeptídeos co-imunomoduladores” ou receptores co- estimuladores cognatos ou seus subtipos). Embora TGF-β seja um polipeptídeo imunomodulador, porque é um elemento central nos construtos e complexos de TGF-β mascarados descritos neste documento, o termo “MOD(s)”, conforme usado neste documento, não inclui TGF-β ou seus polipeptídeos.

[00100] MODs que são adequados para inclusão em qualquer um dos construtos e complexos de TGF-β mascarados (por exemplo, complexos de homodímero ou heterodímero) incluem, mas não estão limitados a, como PD- L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23.

[00101] Em alguns casos, as MODs são selecionadas independentemente de umpolipeptídeo PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23 maduro ou um fragmento de qualquer um destes. As sequências polipeptídicas MOD incorporadas em construtos e complexos de TGF-β mascarados podem compreender apenas uma porção do polipeptídeo MOD secretado, ou a porção extracelular de uma proteína MOD madura de comprimento total se estiver em uma forma ancorada à membrana. Assim, por exemplo, a sequência polipeptídica MOD em um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode, em alguns casos, excluir um ou mais (por exemplo, cada um) de um peptídeo sinal, um domínio transmembranar e/ou um domínio intracelular normalmente encontrado em alguns MODs de ocorrência natural.

[00102] Em alguns casos, uma sequência polipeptídica MOD adequada para inclusão em construtos e complexos de TGF-β mascarados da presente divulgação compreende a totalidade ou uma porção (por exemplo, uma porção extracelular) da sequência de aminoácidos de um MOD de ocorrência natural. Em outros casos, as MODs adequadas para inclusão em construtos e complexos de TGF-β mascarados da presente divulgação incluem pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) variante que compreende pelo menos uma inserção, substituição e/ou deleção de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de um MOD de ocorrência natural.

[00103] Em alguns casos, um MOD variante exibe uma afinidade de ligação para um co-MOD que é inferior à afinidade de um MOD de ocorrência natural correspondente (por exemplo, um MOD que não compreende as substituições de aminoácido presentes na variante) para o co- MOD. Dependendo da redução na afinidade, o uso de MODs com afinidade reduzida para seu co-MOD permite que o polipeptídeo TGF-β tenha mais influência sobre, ou mesmo domine, as interações de ligação. Quando a afinidade de ligação do polipeptídeo TGF-β é maior do que a do MOD, ele pode conduzir o construto ou complexo de TGF-β mascarado para se associar a células com um sistema receptor TGF-β (por exemplo, TGF-βR1 e TGF- βR2 que formam um heterodímero de ligação a TGF-β de alta afinidade), enquanto ao mesmo tempo limita a ligação do alvo às células com até uma abundância de co-MODs, mas sem ou com poucos receptores de TGF-β. Em essência, onde a afinidade (por exemplo, ΔG de ligação) do polipeptídeo TGF-β para seu receptor celular é maior do que a afinidade dos MODs para seus co-MODs (por exemplo, seu ΔG de ligação), o TGF-β conduz a ligação e a especificidade do construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00104] Em uma modalidade, qualquer um ou mais MODs associados a construtos e complexos de TGF-β mascarados são selecionados independentemente do grupo que consiste em peso ou variante: PD-L1; FAS- L; IL-1; IL-2; IL-4; IL-6; IL-7; IL-10; IL-15; IL-21; IL-23; e combinações destes.

[00105] Em alguns casos, como onde é desejável estimular a produção de células Treg, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo IL-2 ou um polipeptídeo variante de IL-2. Variações de sequência em IL-2 podem ser selecionadas para polarizar a ligação do polipeptídeo IL-2, e os construtos ou complexos de TGF-β mascarados, a células alvo contendo diferentes combinações de subunidades receptoras de IL-2R. O receptor de IL-2 é composto por um IL- 2RY comum e duas subunidades adicionais de IL-2Rα e/ou IL-2Rβ para formar receptores triméricos de (IL-2Rα)2—IL-2RY, (IL-2R β)2—IL-2RY, ou receptores de alta afinidade (Kd cerca de 10 picomolares) IL-2Rα-IL-2Rβ-IL- 2RY.A cadeia α (CD25) é única para IL-2, enquanto a cadeia β (CD122) é compartilhada com o receptor de IL-15, e a cadeia Y (CD132), que é crítica para a sinalização, pode ser associada a outras cadeias de receptores de citocinas. As substituições em H16 (por exemplo, H16A ou H16T) ou F42 (por exemplo, F42A ou F42T) podem influenciar a ligação em favor de receptores com subunidades IL-2Rβ; e, consequentemente, seus vieses de incorporação se ligam a células T de memória e células NK que exibem receptores β-y ((IL-2R β)2-IL-2Ry), ou células T ativadas e T regs exibindo receptores α-β-y (IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Ry) de alta afinidade. Em contraste, as substituições em N88 (por exemplo, N88R) diminuem a ligação a IL-2Rβ e podem enviesar a ligação em favor de receptores com subunidades de IL-2Rα; e, consequentemente, as substituições em N88 enviesam a ligação a células com receptores α-y((IL-2Rα)2-IL-2Ry)) e α-β-y (IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Ry), evitando a ligação e ativação de células com receptores β-y. Ver, por exemplo, Skrombolas and Frelinger Expert Rev Clin Immunol., 10(2): 207-217 (2014). A polarização, como usada no contexto da ligação de um MOD substituído (como um polipeptídeo IL-2 com uma substituição de aa) ao seu co-MOD ou uma célula exibindo um co-MOD, significa que a presença de uma substituição altera a quantidade de interação do MOD substituído e co- MOD em relação à interação entre o peso MOD e o mesmo co-MOD. Por exemplo, as sequências de IL-2 com substituições em N88 (por exemplo, N88R), que têm um perfil de efeito colateral inferior (por exemplo, mais seguro) e são melhor toleradas por sujeitos humanos, podem ser incluídas com as substituições acima mencionadas em H16 e/ou F42.

[00106] Em alguns casos, tal como onde é desejável estimular a produção de células iTreg (células CD4+ FoxP3+) (por exemplo, para induzir tolerância periférica para suprimir ativamente células T efetoras e/ou inibir dano ao tecido imunomediado), pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos ou complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo MOD de PD-L1 em peso ou variante selecionado independentemente. Ver, por exemplo, Francisco et al., J. Exp. Med., 206(13): 3015-3029 (2009). Além do peso ou sequências PD-L1 variantes, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados podem compreender um ou mais tipos de peso independentemente selecionados ou polipeptídeos de IL-2 variantes. Variações de sequência em IL-2 podem ser selecionadas para polarizar a ligação do polipeptídeo de IL-2, e os construtos de TGF-β mascarados, a células alvo portadoras de diferentes combinações de subunidades receptoras de IL-2R. Como discutido acima, as variantes de IL-2 incluem substituições em H16 (por exemplo, H16A ou H16T) e/ou F42 (por exemplo, F42A ou F42T) que podem influenciar a ligação em favor de receptores com subunidades de IL-2Rβ; e/ou IL-2 com substituições em N88 (por exemplo, N88R) que diminuem a ligação a IL-2Rβ são as melhor toleradas por sujeitos humanos. Em uma modalidade, o construto/complexo -β de TGF-β mascarado compreende H16T e F42A, ou ambas as substituições H16A e F42, qualquer par das quais pode ser combinado com uma substituição N88 (por exemplo, N88R).

[00107] Em alguns casos, como onde é desejável estimular a produção de células Th17, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo IL-6 ou um polipeptídeo variante de IL-6.

[00108] Em alguns casos, como onde é desejável estimular a produção de células Th9, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo IL-4 ou um polipeptídeo variante de IL-4. Ver, por exemplo, Elyaman et al Immunity., 36(4): 623-634, Immunity. (2012).

[00109] Em alguns casos, como onde é desejável promover a sobrevida dependente de IL-7 de células T de baixa afinidade, pelo controle da expressão de IL-7Ra de timócitos, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo de IL-7 ou um polipeptídeo variante de IL-7.

[00110] Em alguns casos, como onde é desejável estimular a produção de células T foliculares helper (Tfh), pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo IL-21 ou IL-23, ou uma variante de um polipeptídeo IL-21 ou IL-23.

[00111] Em alguns casos, tal como onde é desejável induzir tolerância, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos de TGF-β mascarados e, ou uma variante de um polipeptídeo de ligante Fas (FasL).

[00112] Em alguns casos, como onde é desejável inibir células linfoides inatas tipo II (células ILC2) (por exemplo, para suprimir asma e inflamação alérgica) pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em construtos e complexos de TGF-β mascarados é um polipeptídeo IL-10 ou uma variante de um polipeptídeo IL-10. Ver, por exemplo, Rajas et al., J Allergy Clin Immunol, 139(5):1468 (2017); e Ogasawara, et al., J Allergy Clin Immunol, 141(3): 1147-1151 (2018). A inibição de células ILC2 pode ser avaliada pela redução em sua produção de citocinas tipo 2 IL-5 e IL-13 in vivo (em um tecido ou fluido corporal) ou in vitro (em meios de cultura). O polipeptídeo de IL-10 pode ser um isômero monomérico, tal como a molécula de IL-10M1 descrita por Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000), ou uma variante deste, ambos os quais são discutidos abaixo. Em contraste com a IL- 10 de tipo selvagem cuja forma biologicamente ativa é um par entrelaçado de peptídeos de IL-10 que forma um complexo consistindo em 2 moléculas de IL-10 e 4 cadeias receptoras de IL-10Ra, a IL-10M1 forma um complexo 1:1 com a IL-10Ra solúvel com uma constante de dissociação de 30 nm que é biologicamente ativa em ensaios de proliferação celular. Id.

2. MODs e MODs variantes com afinidade reduzida

[00113] MODS adequados que exibem afinidade reduzida para seus co-MODs podem ter de 1 aminoácido (aa) a 20 aa diferenças de uma sequência MOD de tipo selvagem. Por exemplo, em alguns casos, uma sequência polipeptídica MOD variante presente em um complexo de construto de TGF-β mascarado pode diferir na sequência de aminoácidos em 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa ou 10 aa da sequência polipeptídica MOD de tipo selvagem correspondente. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado difere na sequência de aminoácidos em 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa ou 20 aa do polipeptídeo MOD de tipo selvagem correspondente. Como exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aa substituições, em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui uma única substituição de aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 2 substituições de aa (por exemplo, não mais que 2 aa substituições) em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 3 aa substituições (por exemplo, não mais do que 3 substituições de aa) em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 4 substituições de aa ou 5 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 6 substituições de aa ou 7 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 8 substituições de aa ou 9 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 10 substituições de aa ou 11 aa (por exemplo, não mais do que 10 substituições de aa) em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem).

[00114] Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 11 substituições de aa ou 12 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 13 substituições de aa ou 14 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 15 substituições de aa ou 16 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 17 substituições de aa ou 18 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem). Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado inclui 19 substituições de aa ou 20 aa em comparação com a sequência MOD de referência correspondente (por exemplo, tipo selvagem).

[00115] Como discutido acima, MODs variantes adequadas para inclusão em um construto ou complexo de TGF-β mascarado podem exibir afinidade reduzida para seu co-MOD cognato, em comparação com a afinidade de um MOD de tipo selvagem correspondente para o co-MOD cognato.

[00116] Em alguns casos, uma sequência polipeptídica MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem uma afinidade de ligação para um co-MOD cognato que é de 1 nM a 100 μM. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem uma afinidade de ligação para um co-MOD cognato que é de cerca de 1 nM a cerca de 5 nM, de cerca de 5 nM a cerca de 10 nM, de cerca de 10 nM a cerca de 50 nM, de cerca de 50 nM a cerca de 100 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

3. Determinação da afinidade de ligação

[00117] A afinidade de ligação entre um MOD (por exemplo, um polipeptídeo MOD) e seu co-MOD cognato pode ser determinada por interferometria de biocamada (BLI) usando MOD purificado e co-MOD cognato purificado. A afinidade de ligação entre construtos ou complexos de TGF-β mascarados que compreendem um MOD e o co-MOD cognato do MOD também pode ser determinada por BLI usando o construto ou complexo de TGF-β mascarado purificado e o CO-MOD cognato do MOD. Métodos de BLI são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4):498-507; e Shah e Duncan (2014) J. Vis. Exp.18:e51383. As afinidades de ligação específicas e relativas descritas nesta divulgação entre um MOD e seu co-MOD cognato, ou entre um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um MOD e seu co-MOD cognato, podem ser determinadas usando os seguintes procedimentos.

[00118] Para determinar a afinidade de ligação entre um construto ou complexo de TGF-β mascarado contendo MOD e o co-MOD cognato do MOD, um ensaio de BLI pode ser realizado usando um instrumento Octet RED 96 (Pal FortéBio) ou um instrumento semelhante, como se segue. Um construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle (por exemplo, um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo um MOD de tipo selvagem) é imobilizado em um suporte insolúvel (um “biossensor”). O construto ou complexo de TGF-β mascarado imobilizado é o “alvo”. A imobilização pode ser efetuada imobilizando um anticorpo de captura no suporte insolúvel, onde o anticorpo de captura imobiliza o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Por exemplo, onde o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma estrutura Fc de Ig, a imobilização pode ser efetuada imobilizando anticorpos Fc de anti-Ig (por exemplo, IgG Fc anti-humano) no suporte insolúvel, onde os anticorpos Fc de anti-Ig imobilizados se ligam e imobilizam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Um co-MOD é aplicado, em várias concentrações diferentes, ao construto ou complexo de TGF-β mascarado imobilizado, e a resposta do instrumento é registrada. Os ensaios são realizados em um meio líquido compreendendo HEPES a 25 mM, pH 6,8, poli(etileno glicol) 6000 a 5%, KCl a 50 mM, albumina sérica bovina a 0,1% e detergente não iônico Tween 20 a 0,02%. A ligação do co-MOD ao construto ou complexo de TGF-β mascarado imobilizado é conduzida a 30 °C.

[00119] Como um controle positivo para ligação e afinidade de ligação, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) pode ser usado. O anticorpo pode ser selecionado com base na estrutura específica do construto ou complexo de TGF-β mascarado (ver, por exemplo, FIG. 1). Por exemplo, um anticorpo monoclonal (mAb) direcionado contra as sequências polipeptídicas de TGF-β, receptor TGF-β, andaime ou MOD pode ser usado como um controle positivo, desde que o anticorpo não faça com que o construto ou complexo de TGF-β mascarado se dissocie do suporte (biossensor). Uma curva padrão pode ser gerada usando diluições em série do anticorpo monoclonal anti-MHC Classe I ou Classe II. O co-MOD, ou o mAb anti-MHC, é o “analito.” O BLI analisa o padrão de interferência da luz branca refletida em duas superfícies: i) o polipeptídeo imobilizado (“alvo”); e ii) uma camada de referência interna. Uma mudança no número de moléculas (“analito”; por exemplo, co-MOD; anticorpo anti-HLA) ligadas à ponta do biossensor causa uma mudança no padrão de interferência; essa mudança no padrão de interferência pode ser medida em tempo real. Os dois termos cinéticos que descrevem a afinidade da interação alvo/analito são a constante de associação (ka) e a constante de dissociação (kd). A razão desses dois termos (kd/a) gera origem à constante de afinidade KD.

[00120] Como observado acima, a determinaçãoda afinidade de ligação entre um MOD (por exemplo, IL-2 ou uma variante de IL-2) e seu co-MOD cognato (por exemplo, IL-2R) também pode ser determinada por BLI. O ensaio é semelhante ao descrito acima para o construto ou complexo de TGF- β mascarado. Um ensaio de BLI pode ser realizado usando um instrumento Octet RED 96 (Pal FortéBio) ou um instrumento semelhante, como a seguir. Um MOD componente de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2 variante da presente divulgação); e um MOD de controle (em que um MOD de controle compreende um MOD de tipo selvagem, por exemplo, IL-2 de tipo selvagem) são imobilizados separadamente em suportes insolúveis (um “biossensor”). Cada MOD é o “alvo.” A imobilização pode ser efetuada imobilizando um anticorpo de captura no suporte insolúvel, em que o anticorpo de captura imobiliza o MOD. Por exemplo, se o alvo for fundido a uma tag de imunoafinidade (por exemplo, FLAG, IgG Fc humana, etc.), a imobilização pode ser efetuada imobilizando o anticorpo apropriado para a tag de imunoafinidade (por exemplo, IgG Fc anti-humana) no suporte insolúvel, onde os anticorpos imobilizados se ligam e imobilizam o MOD (onde o MOD compreende um polipeptídeo de IgFc). Um co-MOD (ou polipeptídeo) é aplicado, em várias concentrações diferentes, ao MOD imobilizado e a resposta do instrumento é registrada. Alternativamente, um co-MOD (ou polipeptídeo) é imobilizado no biossensor (por exemplo, para o heterotrímero do receptor de IL-2, como uma subunidade monomérica, subcomplexo heterodimérico ou o heterotrímero completo), o MOD é aplicado, em várias concentrações diferentes, aos co- MODs imobilizados e a resposta do instrumento é registrada. Os ensaios são realizados em um meio líquido compreendendo HEPES a 25 mM, pH 6,8, poli(etileno glicol) 6000 a 5%, KCl a 50 mM, albumina sérica bovina a 0,1% e detergente não iônico Tween 20 a 0,02%. A ligação do co-MOD ao MOD imobilizado é conduzida a 30°C. BLI analisa o padrão de interferência da luz branca refletida a partir de duas superfícies: i) o polipeptídeo imobilizado (“alvo”); e ii) uma camada de referência interna. Uma mudança no número de moléculas (“analito”; por exemplo, co-MOD) ligadas à ponta do biossensor causa uma mudança no padrão de interferência; essa mudança no padrão de interferência pode ser medida em tempo real. Os dois termos cinéticos que descrevem a afinidade da interação alvo/analito são a constante de associação (ka) e a constante de dissociação (kd). A razão desses dois termos (kd/a) gera origem à constante de afinidade KD. Determinar a afinidade de ligação de um MOD de tipo selvagem (por exemplo, IL-2) para seu co-MOD (por exemplo, seu parceiro ou receptor de ligação cognato; no caso de IL-2, o IL-2R) e um MOD variante (por exemplo, uma variante de IL-2 conforme divulgado neste documento) para seu co-MOD (por exemplo, no caso de uma variante de IL- 2, o IL-2R), permite assim determinar a afinidade de ligação relativa do co- MOD variante, em comparação com o co-MOD de tipo selvagem, para o co- MOD. Ou seja, pode-se determinar se a afinidade de ligação de um MOD variante para seu co-MOD é reduzida em comparação com a afinidade de ligação do MOD de tipo selvagem para o mesmo co-MOD cognato e, em caso afirmativo, qual é a redução percentual da afinidade de ligação do co-MOD de tipo selvagem.

[00121] O ensaio de BLI é realizado em uma placa de vários poços. Para executar o ensaio, o layout da placa é definido, as etapas do ensaio são definidas e os biossensores são atribuídos no software Octet Data Acquisition. O conjunto do biossensor é hidratado. O conjunto do biossensor hidratado e a placa de ensaio são equilibrados durante 10 minutos no instrumento Octet. Depois que os dados são adquiridos, os dados adquiridos são carregados no software Octet Data Analysis. Os dados são processados na janela Processamento, especificando o método para subtração de referência, alinhamento do eixo y, correção entre etapas e filtragem Savitzky-Golay. Os dados são analisados na janela Análise pela especificação das etapas a serem analisadas (Associação e Dissociação), e selecionando o modelo de ajuste de curva (1:1), o método de ajuste (global) e a janela de interesse (em segundos). A qualidade do ajuste é avaliada. Os valores de KD para cada rastreamento de dados (concentração de analito) podem ter a média calculada se estiver dentro de uma faixa de 3 vezes. Os valores de erro de KD devem estar dentro de uma ordem de magnitude dos valores constantes de afinidade; os valores de R2 devem estar acima de 0,95. Ver, por exemplo, Abdiche et al. (2008) J. Anal. Biochem. 377:209.

[00122] Em alguns casos, a razão de: i) a afinidade de ligação de um construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle (em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle compreende um MOD de tipo selvagem) a um co-MOD cognato para ii) a afinidade de ligação de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo uma variante do MOD de tipo selvagem ao co-MOD cognato, quando medido por BLI (como descrito acima), é pelo menos 1,5:1, pelo menos 2:1, pelo menos 5:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 500:1, pelo menos 102:1, pelo menos 5 x 102:1, pelo menos 103:1, pelo menos 5 x 103:1, pelo menos 104:1, pelo menos 105:1, ou pelo menos 106:1. Em alguns casos, a razão de: i) a afinidade de ligação de um construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle (em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle compreende um MOD de tipo selvagem) a um co-MOD cognato para ii) a afinidade de ligação de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo uma variante do MOD de tipo selvagem ao co-MOD cognato, quando medido por BLI, está em um intervalo de 1,5:1 a 106:1, por exemplo, de 1,5:1 a 10:1, de 10:1 a 50:1, de 50:1 a 102:1, de 102:1 a 103:1, de 103:1 a 104:1, de 104:1 a 105:1, ou de 105:1 a 106:1.

[00123] Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem uma afinidade de ligação para um co- MOD cognato que é de 1 nM a 100 nM, ou de 100 nM a 100 μM. Por exemplo, em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem uma afinidade de ligação para um co- MOD cognato que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM. Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem uma afinidade de ligação para um co-MOD cognato que é de cerca de 1 nM a cerca de 5 nM, de cerca de 5 nM a cerca de 10 nM, de cerca de 10 nM a cerca de 50 nM, ou de cerca de 50 nM a cerca de 100 nM.

4. PD-L1 e suas variantes

[00124] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo PD-L1 ou PD-L1 variante. PD-L1 de tipo selvagem se liga a PD1.

[00125] Um polipeptídeo PD-L1 humano de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipgni lnvsikiclt lspst (SEQ ID NO:1); onde aas 1-18 formam a sequência de sinal, aas 19-127 formam o domínio V semelhante a Ig ou IgV e 133-225 para o domínio C2 semelhante a Ig.

[00126] Um ectodomínio PD-L1 humano de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: ft vtvpkdlyvv eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipgni lnvsiki (SEQ ID NO:2); onde aas 1-109 formam o domínio tipo V semelhante a Ig ou “IgV” e aas 115-207 para o domínio tipo C2 semelhante a Ig.

[00127] Um domínio de IgV PD-L1 de tipo selvagem, adequado para uso como um MOD pode compreender aa 18, aas IgV aas 19-127 da SEQ ID NO. 1 e sequências de estabilização térmica de carboxila, tais como, por exemplo, os últimos sete aminoácidos (em negrito e itálico) da sequência: A FTVTVPKDLY VVEYGSNMTI ECKFPVEKQL DLAALIVYWE MEDKNIIQFV HGEEDLKTQH SSYRQRARLL KDQLSLGNAA LQITDVKLQD AGVYRCMISY GGADYKRITV KVNAPYAAAL HEH SEQ ID NO:138. Quando o sequeno estabilizador de carboxila compreende uma histidina (por exemplo, uma histidina de aproximadamente 5 resíduos para o lado C-terminal do tyr (Y) que aparece como aa 117 da SEQ ID NO:138) em cerca de aa 122, a histidina pode formar uma ligação eletrostática estabilizante com a amida de estrutura principal em aas 82 e 83 (em negrito e italizado na SEQ ID NO:138 (Q107 e L106 da SEQ ID NO:1). Como alternativa, uma ligação de dissulfeto estabilizante pode ser formada substituindo um de aas 82 ou 83) (Q107 e L106 da SEQ ID NO:1) e um dos resíduos aa 121, 122 ou 123 (equivalente às posições aa 139-141 da SEQ ID NO:1).

[00128] Um polipeptídeo PD-1 de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: pgwfldspdr pwnpptfspa llvvtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrm spsnqtdkla afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgvvggllgs lvllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe dghcswpl (SEQ ID NO:3).

[00129] Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1) exibe afinidade de ligação reduzida a PD-1 (por exemplo, um polipeptídeo PD-1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:3), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo PD-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante se liga a PD-1 (por exemplo, um polipeptídeo PD-1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:3) com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo PD-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

[00130] Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:2 ou seu domínio IgV) tem uma afinidade de ligação a PD-1 (por exemplo, da SEQ ID NO:3) que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO:2) tem uma afinidade de ligação para PD1 (por exemplo, um polipeptídeo PD1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3) que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00131] Uma série de substituições de aa pode ser feita nas sequências de ectodomínio PD-L1 usadas como MODs, incluindo substituições para sequências com mais de 90% (95%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com pelo menos 85 aas contíguos (por exemplo, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100 ou pelo menos 105 aas contíguos) de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, aas 19-127 (o domínio IgV) de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:138. As substituições podem incluir (a) pares de substituição de ligação dissulfeto D103C e G33C, ou V104 e S34C; (b) ponte salina formando pares de substituição Q107D e K62R ou Q107D e S80R; e/ou (c) substituições de empilhamento de Pi M36Y ou M36F (com base na SEQ ID NO:1). Uma sequência MOD PD-L1 pode compreender uma sequência com pelo menos 85 aas contíguos (por exemplo, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100 ou pelo menos 105 aas contíguos) da SEQ ID NO:2 e pelo menos uma substituição de dissulfeto, ponte salina ou empilhamento de Pi. Uma sequência MOD PD-L1 pode compreender uma sequência com pelo menos 85 aas contíguos (por exemplo, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100 ou pelo menos 105 aas contíguos) de aas 19-127 (o domínio IgV) da SEQ ID NO:1 e pelo menos uma substituição de dissulfeto, ponte salina ou empilhamento de Pi. Uma sequência MOD PD-L1 pode compreender uma sequência com pelo menos 85 aas contíguos (por exemplo, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100 ou pelo menos 105 aas contíguos) da SEQ ID NO:138 e pelo menos uma substituição de dissulfeto, ponte salina ou empilhamento de Pi.

[00132] Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD- L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD- L1 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-L1 variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos PD-L1 estabelecida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou domínio IgV de PD- L1.

[00133] As sequências polipeptídicas PD-L1 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 170 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 180, 190 ou 200 aa contíguos) da SEQ ID NO:2 (por exemplo, que têm pelo menos uma inserção, deleção ou substituição de aa). As sequências polipeptídicas de PD-L1 IgV variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 70 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 80, 90, 100 ou 105 aas contíguos) de aas 1-109 da SEQ ID NO:2 (por exemplo, que têm pelo menos uma inserção, deleção ou substituição de aa).

[00134] Em um caso, as sequências polipeptídicas PD-L1 variantes incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou 99%) ou 100% de identidade de sequência de aa com a SEQ ID NO:2, em que o resíduo na posição 8 é um aa diferente de D; em um desses casos, esse resíduo é um A e em outro, R. As sequências polipeptídicas PD-L1 variantes incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou 99%) ou 100%, identidade de sequência de aa com a SEQ ID NO:2, em que o resíduo na posição 36 é um aa diferente de I; em um desses casos, esse resíduo é um A e em outro, D. As sequências polipeptídicas PD-L1 variantes também incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou 99%) ou 100%, identidade de sequência de aa com a SEQ ID NO:2, em que o resíduo na posição 54 é um aa diferente de E; em um desses casos esse resíduo é um A e em outro, R.

5. IL-1 e suas variantes

[00135] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-1 ou IL-1 variante. A IL-1 do tipo selvagem tem duas isoformas, IL-1α e IL-1β, ambas se ligando ao receptor de IL-1.

[00136] Um polipeptídeo precursor de IL-1α humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de: MAKVPDMFEDL KNCYSENEEDS SSIDHLSLNQK SFYHVSYGPLH EGCMDQSVSLS ISETSKTSKLT FKESMVVVATN GKVLKKRRLSL SQSITDDDLEA IANDSEEEIIK PRSAPFSFLSN VKYNFMRIIKY EFILNDALNQS IIRANDQYLTA AALHNLDEAVK FDMGAYKSSKD DAKITVILRIS KTQLYVTAQDE DQPVLLKEMPE IPKTITGSETN LLFFWETHGTK NYFTSVAHPNL FIATKQDYWVC LAGGPPSITDF QILENQA (SEQ ID NO:4) UniProtKB - P01583, NCBI Ref. Seq. NP_000566.3, que pode ter uma ou mais das seguintes variações de ocorrência natural R85Q, A114S, N125D, D138N e D176H.

[00137] Um polipeptídeo de IL-1α humano de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: prsapfsfls nvkynfmrii kyefilndal nqsiirandq yltaaalhnl deavkfdmga yksskddaki tvilrisktq lyvtaqdedq pvllkempei pktitgsetn llffwethgt knyftsvahp nlfiatkqdy wvclaggpps itdfqilenq a (SEQ ID NO:5).

[00138] Um polipeptídeo precursor de IL-1β humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MAEVPELASE MMAYYSGNED DLFFEADGPK QMKCSFQDLD LCPLDGGIQL RISDHHYSKG FRQAASVVVA MDKLRKMLVP CPQTFQENDL STFFPFIFEE EPIFFDTWDN EAYVHDAPVR SLNCTLRDSQ QKSLVMSGPY ELKALHLQGQ DMEQQVVFSM SFVQGEESND KIPVALGLKE KNLYLSCVLK DDKPTLQLES VDPKNYPKKK MEKRFVFNKI EINNKLEFES AQFPNWYIST SQAENMPVFL GGTKGGQDIT DFTMQFVSS (SEQ ID NO:6) UniProtKB - P0158, NCBI Ref. Seq. NP_000567.1.

[00139] Um polipeptídeo IL-1β humano de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSF VQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKK KMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQ DITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:7).

[00140] Tanto a IL-1α quanto a IL-1β se ligam ao receptor de IL-1, que pode ter a sequência: MKVLLRLICF IALLISSLEA DKCKEREEKI ILVSSANEID VRPCPLNPNE HKGTITWYKD DSKTPVSTEQ ASRIHQHKEK LWFVPAKVED SGHYYCVVRN SSYCLRIKIS AKFVENEPNL CYNAQAIFKQ KLPVAGDGGL VCPYMEFFKN ENNELPKLQW YKDCKPLLLD NIHFSGVKDR LIVMNVAEKH RGNYTCHASY TYLGKQYPIT RVIEFITLEE NKPTRPVIVS PANETMEVDL GSQIQLICNV TGQLSDIAYW KWNGSVIDED DPVLGEDYYS VENPANKRRS TLITVLNISE IESRFYKHPF TCFAKNTHGI DAAYIQLIYP VTNFQKHMIG ICVTLTVIIV CSVFIYKIFK IDIVLWYRDS CYDFLPIKAS DGKTYDAYIL YPKTVGEGST SDCDIFVFKV LPEVLEKQCG YKLFIYGRDD YVGEDIVEVI NENVKKSRRL IIILVRETSG FSWLGGSSEE QIAMYNALVQ DGIKVVLLEL EKIQDYEKMP ESIKFIKQKH GAIRWSGDFT QGPQSAKTRF WKNVRYHMPV QRRSPSSKHQ LLSPATKEKL QREAHVPLG, (SEQ ID NO:8), NCBI Ref. Seq. NP_000868.1, com aas 21 a 569 formando o polipeptídeo maduro, cujo ectodomínio pode ser usado para determinar a afinidade de ligação a IL-1α e IL-1β.

[00141] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α e IL-1β variante exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor de IL-1 tendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO:8 ou seu ectodomínio, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α e IL-1β variante se liga ao receptor de IL-1 estabelecido na SEQ ID NO:8 ou às proteínas maduras do ectodomínio) com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL- 1α ou IL-1β compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7.

[00142] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs:5 ou 7) tem uma afinidade de ligação a um receptor de IL-1 com a sequência estabelecida na SEQ ID NO:8 que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs:5 ou 7) tem uma afinidade de ligação para o receptor de IL-1 estabelecido na SEQ ID NO:8 ou seu ectodomínio que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00143] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL- 1α ou IL-1β variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-1α ou IL-1β variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-1α ou IL-1β estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7.

[00144] As sequências polipeptídicas de IL-1α ou IL-1β variante adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 100 aa contíguos da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa). 6.

IL-2 e suas variantes

[00145] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-2 ou IL-2 variante. Em alguns casos, um MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo de IL-2 variante. A IL-2 do tipo selvagem se liga a um receptor de IL-2 (IL-2R). Uma sequência de aminoácidos de IL-2 de tipo selvagem pode ser a seguinte: APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (aa 21-153 de UniProt P60568, SEQ ID NO:9).

[00146] A IL-2 do tipo selvagem se liga a um receptor de IL-2 (IL-2R) na superfície de uma célula. Um receptor de IL-2 é, em alguns casos, um polipeptídeo heterotrimérico compreendendo uma cadeia alfa (IL-2Rα; também referida como CD25), uma cadeia beta (IL-2Rβ; também referida como CD122) e uma cadeia gama (IL-2RY; também referida como CD132). As sequências de aminoácidos de IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2RY humanas podem ser as seguintes.

[00147] IL-2Rα humana: ELCDDDPPE iphatfkama ykegtmlnce ckrgfrriks gslymlctgn sshsswdnqc qctssatrnt tkqvtpqpee qkerkttemq spmqpvdqas lpghcreppp weneateriy hfvvgqmvyy qcvqgyralh rgpaesvckm thgktrwtqp qlictgemet sqfpgeekpq aspegrpese tsclvtttdf qiqtemaatm etsiftteyq vavagcvfll isvlllsglt wqrrqrksrr ti (SEQ ID NO:10).

[00148] IL-2Rβ humana: vng tsqftcfyns raniscvwsq dgalqdtscq vhawpdrrrw nqtcellpvs qaswacnlil gapdsqkltt vdivtlrvlc regvrwrvma iqdfkpfenl rlmapislqv vhvethrcni sweisqashy ferhlefear tlspghtwee aplltlkqkq ewicletltp dtqyefqvrv kplqgefttw spwsqplafr tkpaalgkdt ipwlghllvg lsgafgfiil vyllincrnt gpwlkkvlkc ntpdpskffs qlssehggdv qkwlsspfps ssfspgglap eisplevler dkvtqlllqq dkvpepasls snhsltscft nqgyfffhlp daleieacqv yftydpysee dpdegvagap tgsspqplqp lsgeddayct fpsrddlllf spsllggpsp pstapggsga geermppslq ervprdwdpq plgpptpgvp dlvdfqpppe lvlreageev pdagpregvs fpwsrppgqg efralnarlp lntdaylslq elqgqdpthl v (SEQ ID NO:11).

[00149] IL-2RYhumana: Inttiltp ngnedttadf flttmptdsl svstlplpev qcfvfnveym nctwnsssep qptnltlhyw yknsdndkvq kcshylfsee itsgcqlqkk eihlyqtfvv qlqdpreprr qatqmlklqn lvipwapenl tlhklsesql elnwnnrfln hclehlvqyr tdwdhswteq svdyrhkfsl psvdgqkryt frvrsrfnpl cgsaqhwsew shpihwgsnt skenpflfal eavvisvgsm gliisllcvy fwlertmpri ptlknledlv teyhgnfsaw sgvskglaes lqpdyserlc lvseippkgg algegpgasp cnqhspywap pcytlkpet (SEQ ID NO:12).

[00150] Em alguns casos, onde um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um polipeptídeo de IL-2 variante, um co-MOD cognato é um IL-2R compreendendo polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12.

[00151] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante exibe afinidade de ligação reduzida a IL-2R, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:9. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante liga IL-2R com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos, do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:9 para uma IL-2R (por exemplo, uma IL-2R compreendendo polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs:10-12), quando ensaiada nas mesmas condições.

[00152] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:9) tem uma afinidade de ligação à IL- 2R (por exemplo, da SEQ ID NOs:10-12) que é de 100 nM a 100 μM. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO:9) tem uma afinidade de ligação para IL-2R (por exemplo, um IL-2R compreendendo polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NOs: 10-12) que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00153] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL- 2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem de 2 a 10 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem de 3 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem 4 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem de 5 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem 6 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem de 7 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem 8 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem de 9 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 variante tem 10 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-2 estabelecida na SEQ ID NO: 9.

[00154] As sequências polipeptídicas de IL-2 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas compreendendo uma sequência de aa com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos da SEQ ID NO:9. Além disso, IL-2 variantes incluem polipeptídeos que compreendem uma sequência de aa com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos de qualquer uma das sequências de aa de IL-2 variantes que se seguem (ver SEQ ID NOs: 13-27).

[00155] aptssstkkt qlql Xhllld Iqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:13), onde X é qualquer aminoácido diferente de Glu. Em alguns casos, X é Ala.

[00156] aptssstkkt qlqlehlll X Iqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:14), onde X é qualquer aminoácido diferente de Asp. Em alguns casos, X é Ala.

[00157] aptssstkkt qlqle Xl lld Iqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:15), onde X (H16) é qualquer aminoácido diferente de His. Em alguns casos, X é Ala (H16A). Em alguns casos, X é Arg. Em alguns casos, X é Asn. Em alguns casos, X é Asp. Em alguns casos, X é Cys. Em alguns casos, X é Glu. Em alguns casos, X é Gln. Em alguns casos, X é Gly. Em alguns casos, X é Ile. Em alguns casos, X é Lys. Em alguns casos, X é Leu. Em alguns casos, X é Met. Em alguns casos, X é Phe. Em alguns casos, X é Pro. Em alguns casos, X é Ser. Em alguns casos, X é Thr (H16T). Em alguns casos, X é Tyr. Em alguns casos, X é Trp. Em alguns casos, X é Val.

[00158] aptssstkkt qlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tXkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:16), onde X (F42) é qualquer aminoácidodiferente de Phe. Em alguns casos, X é Ala (F42A). Em alguns casos, X é Thr (F42T).

[00159] aptssstkkt qlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tfkfXmpkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:17), onde X é qualquer aminoácido diferente de Tyr. Em alguns casos, X é Ala; aptssstkkt qlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tFkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisXin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:18), onde X (N88) é qualquer aminoácido diferente de Asn. Em alguns casos, X é Ala; em alguns casos, X é Arg. WITFCXSIIS TLT (SEQ ID NO:19), onde X é qualquer aminoácido diferente de Gln. Em alguns casos, X é Ala.

[00160] aptssstkkt qlqleX1llld lqmilnginn yknpkltrml tX2kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:20), onde X1 (H16) é qualquer aminoácido diferente de His, e onde X2 (F42) é qualquer aminoácido diferente de Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Ala (H16A, F42A). Em alguns casos, X1 é Thr; e X2 é Ala (H16T, F42A). Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Thr (H16A, F42T). Em alguns casos, X1 é Thr; e X2 é Thr (H16T, F42T).

[00161] aptssstkkt qlqleX1llld lqmilnginn yknpkltrml tX2kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlis rin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:21), que compreende uma substituição N88R, e onde X1 (H16) é qualquer aminoácido diferente de His, e onde X2 (F42) é qualquer aminoácido diferente de Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Thr; e X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Thr. Em alguns casos, X1 é Thr; e X2 é Thr.

[00162] aptssstkkt qlqlehlllX1lqmilnginn yknpkltrml tX2kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:22), onde X1 é qualuqer aminoácido diferente de Asp; e onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; e X2 é Ala.

[00163] aptssstkkt qlqlX 1hlllX2 Iqmilnginn yknpkltrml tX3kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:23), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de Glu; onde X2 é qualquer aminoácido de Asp; e onde X3 é qualquer aminoácido doferente de Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, quaisquer dois ou três de Xié Ala; X2 é Ala; e X3 é Ala.

[00164] aptssstkkt qlqlEX1lllX2 lqmilnginn yknpkltrml tX3kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:24), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de His; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Asp; e onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Phe. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; e X3 é Ala.

[00165] aptssstkkt qlqlehlllX1lqmilnginn yknpkltrml tX2kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfc X3siis tlt (SEQ ID NO:25), onde Xi é qualquer aminoácido diferente de Asp; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Phe; e onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; e X3 é Ala.

[00166] aptssstkkt qlqlehlllX1lqmilnginn yknpkltrml tX2kfX3mpkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:26), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de Asp; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Phe; e onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Tyr. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; e X3 é Ala.

[00167] aptssstkkt qlqleX1lllX2 lqmilnginn yknpkltrml tX3kfX4mpkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt (SEQ ID NO:27), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de His; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Asp; onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Phe; e onde X4 é qualquer aminoácido diferente de Tyr. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; e X4 é Ala.

[00168] aptssstkkt qlqlehlllX1Iqmilnginn yknpkltrml tX2kfX3mpkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfc X4 siis tlt (SEQ ID NO:139), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de Asp; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Phe; onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Tyr; e onde X4 é qualquer aminoácido diferente de Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; e X4 é Ala.

[00169] aptssstkkt qlqleX1lllX2 lqmilnginn yknpkltrml tX3kfX4mpkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfc X5 siis tlt (SEQ ID NO:140), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de His; onde X2 é aminoácido diferente de Asp; onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Phe; onde X4 é qualquer aminoácido diferente de Tyr; e onde X5 é qualquer aminoácido diferente de Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, X4 é Ala. Em alguns casos, X5 é Ala. Em alguns casos, quaisquer dois, três, quatro ou todos os cinco de X1 é Ala; X2 é Ala; X3 é Ala; X4 é Ala; e/ou X5 é Ala.

[00170] aptssstkkt qlqleX1llld lqmilnginn yknpkltrml tX2kfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcX3siis tlt (SEQ ID NO:141), onde X1 é qualquer aminoácido diferente de His; onde X2 é qualquer aminoácido diferente de Phe; e onde X3 é qualquer aminoácido diferente de Gln. Em alguns casos, X1 é Ala. Em alguns casos, X2 é Ala. Em alguns casos, X3 é Ala. Em alguns casos, quaisquer dois ou todos os três de X1 é Ala; X2 é Ala; e/ou X3 é Ala.

7. IL-4 e suas variantes

[00171] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-4 ou IL-4 variante. A IL-4 de tipo selvagem tem duas isoformas, IL-4α e IL-4β, ambas se ligando ao receptor de IL-4 ligado à membrana (isoforma 1) ou a sua contraparte solúvel (isoforma 2).

[00172] Um polipeptídeo precursor da isoforma 1 da IL-4 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: mgltsqllpp lffllacagn fvhghkcdit lqeiiktlns lteqktlcte ltvtdifaas kntteketfc raatvlrqfy shhekdtrcl gataqqfhrh kqlirflkrl drnlwglagl nscpvkeanq stlenflerl ktimrekysk css (SEQ ID NO:28) NCBI Ref. Seq. NP_000580.1.

[00173] Um polipeptídeo de isoforma 1 de IL-4 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: kcdit lqeiiktlns lteqktlcte ltvtdifaas kntteketfc raatvlrqfy shhekdtrcl gataqqfhrh kqlirflkrl drnlwglagl nscpvkeanq stlenflerl ktimrekysk css (SEQ ID NO:29).

[00174] Um polipeptídeo precursor da isoforma 2 da IL-4 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: mgltsqllpp lffllacagn fvhghkcdit lqeiiktlns lteqknttek etfcraatvl rqfyshhekd trclgataqq fhrhkqlirf lkrldrnlwg laglnscpvk eanqstlenf lerlktimre kyskcss, NCBI Ref. Seq: NP_758858.1, (SEQ ID NO:30).

[00175] Um polipeptídeo de isoforma 2 de IL-4 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos KCDIT LQEIIKTLNS LTEQKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS (SEQ ID NO:31).

[00176] Tanto a isoforma 1 de IL-4 quanto a isoforma 2 se ligam ao receptor de IL-4 ligado à membrana (IL-4R) e/ou à sua isoforma solúvel 2. A IL-4 ligada à membrana pode ter a sequência MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL WKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPD NYLYNHLTYA VNIWSENDPA DFRIYNVTYL EPSLRIAAST LKSGISYRAR VRAWAQCYNT TWSEWSPSTK WHNSYREPFE QHLLLGVSVS CIVILAVCLL CYVSITKIKK EWWDQIPNPA RSRLVAIIIQ DAQGSQWEKR SRGQEPAKCP HWKNCLTKLL PCFLEHNMKR DEDPHKAAKE MPFQGSGKSA WCPVEISKTV LWPESISVVR CVELFEAPVE CEEEEEVEEE KGSFCASPES SRDDFQEGRE GIVARLTESL FLDLLGEENG GFCQQDMGES CLLPPSGSTS AHMPWDEFPS AGPKEAPPWG KEQPLHLEPS PPASPTQSPD NLTCTETPLV IAGNPAYRSF SNSLSQSPCP RELGPDPLLA RHLEEVEPEM PCVPQLSEPT TVPQPEPETW EQILRRNVLQ HGAAAAPVSA PTSGYQEFVH AVEQGGTQAS AVVGLGPPGE AGYKAFSSLL ASSAVSPEKC GFGASSGEEG YKPFQDLIPG CPGDPAPVPV PLFTGFLDRE PPRSPQSSHL PSSSPEHLGL EPGEKVEDMP KPPLPQEQAT DPLVDSLGSG IVYSALTCHL CGHLKQCHGQ EDGGQTPVMA SPCCGCCCGD RSSPPTTPLR APDPSPGGVP LEASLCPASL APSGISEKSK SSSSFHPAPG NAQSSSQTPK IVNFVSVGPT YMRVS, (SEQ ID NO:32), NCBI Ref. Seq. NP_000409.1, com aas 26 a 825 formando o polipeptídeo maduro, e 233-256 aas, a região transmembranar; o ectodomínio da proteína pode ser usado para determinar a afinidade de ligação à isoforma 1 ou 2 de IL-4.

[00177] A isoforma solúvel 2, tendo a sequência MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL WKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPDN YLYNHLTYAVN IWSENDPADF RIYNVTYLEP SLRIAASTLK SGISYRARVRA WAQCYNTTWSE WSPSTKWHNS NIC, (SEQ ID NO:33), UniProtKB - P24394, também pode ser usada para determinar a afinidade de ligação de ambas as isoformas de IL- 4.

[00178] Em alguns casos, um polipeptídeo de isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NOs:29 ou 31) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-4 madura estabelecida na SEQ ID NO:32 ou seu ectodomínio, ou o receptor de IL-4 solúvel estabelecido na SEQ ID NO:33, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-4 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante se liga ao receptor de IL-4 maduro estabelecido na SEQ ID NO:32 (ou seu ectodomínio) ou na SEQ ID NO:33 com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos, do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo de isoforma 1 ou 2 de IL-4 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31.

[00179] Em alguns casos, um polipeptídeo de isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs:29 ou 31) tem uma afinidade de ligação que é de 1 nM a 1 mM para um receptor de IL-4 maduro estabelecido na SEQ ID NO:32 (ou seu ectodomínio) ou na SEQ ID NO:33 (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NOs:29 ou 31) tem uma afinidade de ligação para o receptor de IL-4 maduro estabelecido em SEQ ID NO: 32 (ou seu ectodomínio) ou na SEQ ID NO:33 que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00180] Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem de 3 substituições de aa a 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-4 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem de 7 substituições de aa a 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Em alguns casos, um polipeptídeo da isoforma 1 ou 2 de IL-4 variante tem de 9 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1 ou 2 de IL-4 estabelecida na SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31.

[00181] As sequências de isoforma 1 ou 2 polipeptídeos de IL-4 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 80 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 100 ou 110 aa contíguos) da SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

8. IL-6 e suas variantes

[00182] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-6 ou IL-6 variante. A IL-6 do tipo selvagem se liga ao receptor de IL-6 que é composto por uma subunidade alfa e beta (gp130), que forma um hexâmero de sinalização de dois trímeros com uma molécula de IL- 6 e cada subunidade. Ver, por exemplo, Lacroix et al., J. Biol. Chem. 290(45)26943-953 (2015).

[00183] Um polipeptídeo precursor de IL-6 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: mnsfstsafg pvafslglll vlpaafpapv ppgedskdva aphrqpltss eridkqiryi ldgisalrke tcnksnmces skealaennl nlpkmaekdg cfqsgfneet clvkiitgll efevyleylq nrfesseeqa ravqmstkvl iqflqkkakn ldaittpdpt tnaslltklq aqnqwlqdmt thlilrsfke flqsslralr qm (SEQ ID NO:34) NCBI Ref. Seq. NP_000591.1.

[00184] Um polipeptídeo de IL-6 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: vppgedskdva aphrqpltss eridkqiryi ldgisalrke tcnksnmces skealaennl nlpkmaekdg cfqsgfneet clvkiitgll efevyleylq nrfesseeqa ravqmstkvl iqflqkkakn ldaittpdpt tnaslltklq aqnqwlqdmt thlilrsfke flqsslralr qm (SEQ ID NO:35).

[00185] A IL-6 se liga ao receptor de IL-6 ligado à membrana, que é composto por uma subunidade alfa e beta. A subunidade alfa de IL-6R humana pode ter a sequência MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGV EPEDNATVHW VLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLS CFRKSPLSNV VCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIV SMCVASSVGS KFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAE RSKTFTTWMV KDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTP MQALTTNKDD DNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEG KTSMHPPYSL GQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR, (SEQ ID NO:36), NCBI Ref. Seq: NP_000556.1, com aas 26 a 825 formando o polipeptídeo maduro e 233-256 aas, a região transmembranar. Após a ligação à IL-6, a subunidade alfa da IL6 se liga à subunidade beta da IL-6.

[00186] A subunidade beta da IL-6R humana pode ter a sequência MLTLQTWLVQ ALFIFLTTES TGELLDPCGY ISPESPVVQL HSNFTAVCVL KEKCMDYFHV NANYIVWKTN HFTIPKEQYT IINRTASSVT FTDIASLNIQ LTCNILTGFQ LEQNVYGITI ISGLPPEKPK UniProtKB - P40189, com aas 23 a 918 formando o polipeptídeo maduro e aas 620-641 a região transmembranar.

[00187] Como uma alternativa à ligação da IL-6 à subunidade alfa da IL-6R ligada à membrana, ela pode se ligar à forma solúvel madura da subunidade alfa da IL-6R com a sequência MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGV EPEDNATVHW VLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLS CFRKSPLSNV VCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIV SMCVASSVGS KFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAE RSKTFTTWMV KDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTP MQALTTNKDD DNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEG KTSMHPPYSL GQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR, (SEQ ID NO:38) com o peptídeo maduro compreendendo aas 20 a 468, UniProtKB - P08887.1. A subunidade solúvel pode tomar o lugar da subunidade alfa de IL-6R ligada à membrana e pode ser usada em ensaios de afinidade de ligação.

[00188] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-6 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:35) exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor IL-6 maduro estabelecido nas SEQ ID NOs:36 e 37, ou SEQ ID NOs:37 e 38, em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-6 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:35. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-6 variante se liga a um receptor de IL-6 maduro estabelecido nas SEQ ID NOs:36 e 37, ou SEQ ID NOs:37 e 38, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou maior que 95% menor que a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-6 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:35.

[00189] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-6 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:35) tem uma afinidade de ligação que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM) a um receptor de IL-6 maduro estabelecido nas SEQ ID NOs:36 e 37 ou SEQ ID NOs:37 e 38. Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-6 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:35) tem uma afinidade com um receptor de IL-6 maduro estabelecido nas SEQ ID NOs:36 e 37, ou SEQ ID NOs:37 e 38, que é de 100 nM a 100 μM (por exemplo, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, ou de 10 μM a 100 μM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO:35) tem uma afinidade de ligação para o receptor de IL-6 maduro estabelecido em SEQ ID NOs:36 e 37, ou SEQ ID NOs: 37 e 38, que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00190] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL- 6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem 5 substituições de aa a 6 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-6 variante tem 9 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-6 estabelecida na SEQ ID NO: 35.

[00191] As sequências polipeptídicas de IL-6 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 80 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 100 ou 110 aa contíguos) da SEQ ID NO:35 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

9. IL-7 e suas variantes

[00192] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-7 ou IL-7 variante. A IL-7 de tipo selvagem tem quatro isoformas, todas as quais se ligam ao receptor de IL-7 ligado à membrana, que tem duas subunidades, alfa (α) e a cadeia gama comum (comum-Y).

[00193] Um polipeptídeo precursor da isoforma 1 da IL-7 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência deaminoácidos: QEIKTCWNKI LMGTKEH (SEQ ID NO:39) UniProtKB - P13232, NCBI Ref Seq. NP_000871.1

[00194] Um polipeptídeo de isoforma 1 de IL-7 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: DCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ VKGRKPAALG EAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLL QEIKTCWNKI LMGTKEH (SEQ ID NO:40).

[00195] Um polipeptídeo precursor da isoforma 2 da IL-7 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: mfhvsfryif glpplilvll pvassdcdie gkdgkqyesv lmvsidqlld smkeigsncl nnefnffkrh icdankvkgr kpaalgeaqp tksleenksl keqkklndlc flkrllqeik tcwnkilmgt keh, (SEQ ID NO:41) NCBI Ref. Seq: NP_ 001186815.1.

[00196] Um polipeptídeo de isoforma 2 de IL-7 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos SDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKVKGR KPAALGEAQP TKSLEENKSL KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH (SEQ ID NO:42).

[00197] Um polipeptídeo precursor da isoforma 3 da IL-7 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: mfhvsfryif glpplilvll pvassdcdie gkdgkqyesv lmvsidqlld smkeigsncl nnefnffkrh icdankegmf lfraarklrq flkmnstgdf dlhllkvseg ttillnctgq eenkslkeqk klndlcflkr llqeiktcwn kilmgtkeh, (SEQ ID NO:43) NCBI Ref. Seq: NP_001186816.1.

[00198] Um polipeptídeo de isoforma 3 de IL-7 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: cdie gkdgkqyesv lmvsidqlld smkeigsncl nnefnffkrh icdankegmf lfraarklrq flkmnstgdf dlhllkvseg ttillnctgq eenkslkeqk klndlcflkr llqeiktcwn kilmgtkeh (SEQ ID NO:44).

[00199] Um polipeptídeo precursor da isoforma 4 da IL-7 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLND LCFLKRLLQE IKTCWNKILM GTKEH, NCBI Ref. Seq: NP_001186817.1 (SEQ ID NO:45).

[00200] Um polipeptídeo de isoforma 4 de IL-7 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: SDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLND LCFLKRLLQE IKTCWNKILM GTKEH (SEQ ID NO:46).

[00201] A subunidade alfa do receptor de IL-7 pode ter a sequência: LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (SEQ ID NO:47), NCBI Ref. Seq. NP_002176.2, com 21 a 459 aas formando o polipeptídeo maduro e 240-264 aas, a região transmembranar. Toda ou parte da subunidade receptora (por exemplo, o ectodomínio (21-239 aas) da proteína pode ser usada para determinar a afinidade de ligação às isoformas de IL-7 juntamente com a subunidade gama do receptor de IL-7.

[00202] A subunidade comum-Y (IL-7RG ou JL-R7y) pode ter a sequência mlkpslpfts llflqlpllg vglnttiltp ngnedttadf flttmptdsl svstlplpev qcfvfnveym nctwnsssep qptnltlhyw yknsdndkvq kcshylfsee itsgcqlqkk eihlyqtfvv qlqdpreprr qatqmlklqn lvipwapenl tlhklsesql elnwnnrfln hclehlvqyr tdwdhswteq svdyrhkfsl psvdgqkryt frvrsrfnpl cgsaqhwsew shpihwgsnt skenpflfal eavvisvgsm gliisllcvy fwlertmpri ptlknledlv teyhgnfsaw sgvskglaes lqpdyserlc lvseippkgg algegpgasp cnqhspywap pcytlkpet, NCBI Ref. Seq. NP_000197.1, (SEQ ID NO:48) com 23 a 369 aas formando o polipeptídeo maduro e 263-283 aas a região transmembranar. Toda ou parte da subunidade receptora (por exemplo, o ectodomínio (23-262 aas) da proteína pode ser usada para determinar a afinidade de ligação à IL-7 juntamente com a subunidade alfa.

[00203] Em alguns casos, um polipeptídeo variante 1, 2, 3 ou 4 da isoforma IL-7 (por exemplo, das SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-7 madura (por exemplo, um receptor de IL-7 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 47 e 48, tais como seus ectodomínios), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-7 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 se liga a um receptor de IL-7 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 47 e 48, tais como seus ectodomínios, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais que 95% menor que a afinidade de ligação de um polipeptídeo da isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46.

[00204] Em alguns casos, uma variante do polipeptídeo de isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-7 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 47 e 48, tais como seus ectodomínios, que é de 1 nM a 1 mM. Em alguns casos, um polipeptídeo variante 1, 2, 3 ou 4 da isoforma IL-7 (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46) tem uma afinidade de ligação a um receptor de IL-7 maduro compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 47 e 48, tais como seus ectodomínios, que é de 100 nM a 100 μM (por exemplo, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM ou de 10 μM a 100 μM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo variante de isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-7 maduro compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 47 e 48, tais como seus ectodomínios, que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00205] Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-7 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46. Em alguns casos, um polipeptídeo variante da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma 1, 2, 3 ou 4 da IL-7 estabelecida nas SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46.

[00206] As sequências polipeptídicas de isoforma 1, 2, 3 ou 4 de IL-7 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aa contíguos) de SEQ ID NOs:40, 42, 44 ou 46 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa).

10. IL-10 e suas variantes

[00207] Como um exemplo não limitativo, um MOD ou MOD variante presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo IL-10 ou IL-10 variante, tal como IL-10 variantes monoméricos tendo uma inserção na região de dobradiça entre as hélices D e E descritas por Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000). A IL-10 de tipo selvagem tem isoformas, todas as quais se ligam ao receptor de IL-10 ligado à membrana, que tem tanto subunidades alfa (α) IL-10RA quanto beta (β) IL- 10RB. O receptor existe como um tetrâmero na superfície das células (por exemplo, células B, células T, células NK, mastócitos e células dendríticas). FDIFINYIEA YMTMKIRN (SEQ ID NO:49) UniProtKB Ref Seq. NP_000563.1, que pode ter uma variação de sequência H227L.

[00208] Um polipeptídeo precursor da isoforma 1 da IL-10 humana de tipo selvagem pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE

[00209] Um polipeptídeo de IL-10 humana de tipo selvagem maduro pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos SP GQGTQSENSC EKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN (SEQ ID NO:50).

[00210] Um polipeptídeo IL-10 humano pode compreender a seguinte sequência de aminoácidos MIQFYLEEVM PQAENQDPDI KAHVNSLGEN LKTLRLRLRR CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNKLQEKGIY KAMS, UniProtKB - A0A286YEX3 1 (SEQ ID NO:51).

[00211] Um polipeptídeo de IL-10 pode compreender uma inserção na região de dobradiça entre as hélices D e E do polipeptídeo de IL-10 (por exemplo, uma inserção de 5-7 aa adjacente a qualquer um de E48, N49, K50 ou S51 da SEQ ID NO:51, ou a localização equivalente de nas SEQ ID NOs:49 ou 50) que o tornam uma forma monomérica. Um polipeptídeo IL-10 monomérico pode compreender uma inserção de 5-7 aa entre N49 e K50 da SEQ ID NO:51 (ou a localização equivalente de nas SEQ ID NOs:49 ou 50). Por exemplo, os 5-7 aminoácidos compreendem Ala, Gly e/ou Ser. Em um caso, os 5-7 aminoácidos são selecionados de Ala ou Ser. Em um caso, os 5-7 aas são selecionados de Gly e Ser. Em um caso, a inserção compreende a inserção de IL-10M1 aa (GGGGSGGG SEQ ID NO:142) entre N49 e K50 da SEQ ID NO:51 (ou a localização equivalente nas SEQ ID NOs:49 ou 50). Em um caso, o IL-10 variante consiste na IL-10M1 (SEQ ID NO:189) GGGSGG inserida na SEQ ID NO:51 entre aa 49 e 50. Ver, por exemplo, Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000).

[00212] A subunidade alfa do receptor de IL-10 pode ter a sequência: mlpclvvlla allslrlgsd ahgtelpspp svwfeaeffh hilhwtpipn qsestcyeva llrygieswn sisncsqtls ydltavtldl yhsngyrarv ravdgsrhsn wtvtntrfsv devtltvgsv nleihngfil gkiqlprpkm apandtyesi fshfreyeia irkvpgnftf thkkvkhenf slltsgevge fcvqvkpsva srsnkgmwsk eecisltrqy ftvtnviiff afvlllsgal ayclalqlyv rrrkklpsvl lfkkpspfif isqrpspetq dtihpldeea flkvspelkn ldlhgstdsg fgstkpslqt eepqfllpdp hpqadrtlgn reppvlgdsc ssgssnstds giclqepsls pstgptweqq vgsnsrgqdd sgidlvqnse gragdtqggs alghhsppep evpgeedpaa vafqgylrqt rcaeekatkt gcleeesplt dglgpkfgrc lvdeaglhpp alakgylkqd plemtlassg aptgqwnqpt eewsllalss csdlgisdws fahdlaplgc vaapggllgs fnsdlvtlpl isslqsse, (SEQ ID NO:52), NCBI Ref. Seq. NP_001549.2, com 21 a 587 aas formando o polipeptídeo maduro e 236-256 aas, a região transmembranar. Toda ou parte da subunidade receptora (por exemplo, o ectodomínio (21-235 aas) da proteína pode ser usada para determinar a afinidade de ligação às isoformas de IL-10 juntamente com a subunidade beta do receptor de IL-10.

[00213] A subunidade beta do receptor de IL-10 pode ter a sequência: mawslgswlg gcllvsalgm vpppenvrmn svnfknilqw espafakgnl tftaqylsyr ifqdkcmntt ltecdfssls kygdhtlrvr aefadehsdw vnitfcpvdd tiigppgmqv evladslhmr flapkieney etwtmknvyn swtynvqywk ngtdekfqit pqydfevlrn lepwttycvq vrgflpdrnk agewsepvce qtthdetvps wmvavilmas vfmvclallg cfallwcvyk ktkyafsprn slpqhlkefl ghphhntllf fsfplsdend vfdklsviae dsesgkqnpg dscslgtppg qgpqs, NCBI Ref. Seq. NP_000619.3, (SEQ ID NO:53) com 20 a 325 aas formando o polipeptídeo maduro e 221-242 aas a região transmembranar. Toda ou parte da subunidade receptora (por exemplo, o ectodomínio (20-220 aas) da proteína pode ser usada para determinar a afinidade de ligação à IL-10 juntamente com a subunidade alfa.

[00214] Em alguns casos, um polipeptídeo de isoforma de IL-10 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NOs: 50, 51 ou um IL-10 variante monomérico dessas sequências contendo uma inserção de 5-7 aa na dobradiça entre as hélices D e E descritas acima) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-10 madura (por exemplo, um receptor de IL-10 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 ou 53, tais como seus ectodomínios), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-10 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Por exemplo, em alguns casos, uma variante de um polipeptídeo de IL-10 (por exemplo, uma variante de SEQ ID NOs: 50 ou 51) se liga a um receptor de IL-10 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 e 53, tais como seus ectodomínios, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de uma isoforma de IL-10 (por exemplo, de SEQ ID NOs: 50 ou 51) a um receptor de IL-10 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 ou 53 (tais como seus ectodomínios).

[00215] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs: 50 ou 51 que pode compreender uma das inserções acima mencionadas na região de dobradiça entre as hélices D e E) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-10 (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 e 53, tais como seus ectodomínios), que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante (por exemplo, uma variante das SEQ ID NOs: 50 ou 51) tem uma afinidade de ligação a um receptor de IL-10 maduro (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 e 53, tais como seus ectodomínios), que é de 100 nM a 100 μM (por exemplo, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM ou de 10 μM a 100 μM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NOs: 50 ou 51) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-10 maduro (por exemplo, compreendendo todo ou parte do conjunto de polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 52 e 53, como seus ectodomínios), que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00216] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem uma única substituição de aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem 2 substituições de aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem de 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem de 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida no 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-10 variante tem 1-10 substituições de aa e compreende 5-7 substituiçõs de aa na região de dobradiça entre as hélices D e E (por exemplo, K49 e N50 da SEQ ID NO:50) em comparação com uma sequência polipeptídica de IL-10 estabelecida nas SEQ ID NOs: 50 ou 51.

[00217] As sequências polipeptídicas de IL-10 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa a pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou pelo menos 160) aa contíguos das SEQ ID NOs: 50 ou 51 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa).

11. IL-15 e suas variantes

[00218] Em alguns casos, o MOD presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado da presente divulgação é um polipeptídeo de IL-15. As sequências polipeptídicas de IL-15, incluindo duas isoformas formadas por splicing alternativo dando origem a diferentes proteínas precursoras, são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, um polipeptídeo IL-15 em peso tem a sequência: MRISKPHLRS ISIQCYLCLL EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS, (SEQ ID NO. 54), UniProtKB - P40933, NCBI Ref. NP_000576.1, pré-proteína IL-15 com 1 a 29 aa como o peptídeo de sinal e 30-48 como o pró-peptídeo.

[00219] Um polipeptídeo IL-15 maduro, denotado como isoforma 1 para os fins desta divulgação, pode ter a forma nw vnvisdlkki edliqsmhid atlytesdvh psckvtamkc fllelqvisl esgdasihdt venliilann slssngnvte sgckeceele eknikeflqs fvhivqmfin ts, (SEQ ID NO:55).

[00220] A IL-15 é estruturalmente semelhante à IL-2 e sinaliza através de um receptor trimérico da superfície celular com as mesmas cadeias beta e gama que o receptor de IL-2, mas com subunidade alfa do receptor de IL-15 distinta (IL-15Rα). Uma sequência de aminoácidos de uma proteína precursora da isoforma 1 de IL-15Rα humana pode ITCPPPMSVE SLTECVLNKA TTAGVTPQPE QLMPSKSPST HQPPGVYPQG RQTPPLASVE WGTSSRDEDL ENCSHHL (SEQ ID NO:56) NCBI Ref NP_002180, com 1-30 aas formando a sequência peptídeo de sinal e 31-267 aas, o polipeptídeo maduro. As sequências de IL-2Rβ e IL-2RYsão fornecidas como SEQ ID NOs: 11 e 12.

[00221] Em alguns casos, um polipeptídeo de isoforma 1 de IL-15 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:55) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-15 madura (por exemplo, um receptor de IL-15 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:11, 12 e 56, tais como seus ectodomínios), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-15 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:55. Por exemplo, em alguns casos, uma variante de um polipeptídeo de IL-15 (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:55) se liga a um receptor de IL-15 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:11, 12 e 56, tais como seus ectodomínios, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-15 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:55.

[00222] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:55) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-15 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:11, 12 e 56, tais como seus ectodomínios, que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO: 55) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-15 maduro (por exemplo, compreendendo todo ou parte do conjunto de polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 56, como seus ectodomínios), que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00223] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:55) tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-15 estabelecida na SEQ ID NO:55. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:55) tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-15 estabelecida na SEQ ID NO:55. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-15 estabelecida na SEQ ID NO:55. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-15 variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-15 estabelecida na SEQ ID NO: 55. Em alguns casos, um polipeptídeo IL- 15 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-15 estabelecida na SEQ ID NO:55. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-15 variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-15 estabelecida na SEQ ID NO: 55. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-15 variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-15 estabelecida na SEQ ID NO:55.

[00224] As sequências polipeptídicas de isoforma IL-15 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aa contíguos) de SEQ ID NOs:55 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa).

12. IL-21 e suas variantes

[00225] Em alguns casos, o MOD presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado da presente divulgação é um polipeptídeo de IL-21. As sequências polipeptídicas de IL-21, incluindo duas isoformas formadas por splicing alternativo dando origem a diferentes proteínas precursoras, são conhecidas na técnica.

[00226] Em uma modalidade, um polipeptídeo da isoforma 1 de IL-21 de tipo selvagem (wt) tem a sequência MRSSPGNMER IVICLMVIFL KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS, (SEQ ID NO:57), UniProtKB - Q9HBE4, NCBI Ref. NP_068575.1, proteína IL-21 com 1 a 29 aa como o peptídeo sinal.

[00227] Um polipeptídeo de isoforma 1 de IL-21 madura pode ter a sequência de aa Q GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS, (SEQ ID NO:58).

[00228] Em uma modalidade, um O polipeptídeo da isoforma 2 de IL- 21 tem a sequência MRSSPGNMER IVICLMVIFL GTLVHKSSSQ HLSSRTHGSE DS, (SEQ ID NO:59), NP_001193935.1, proteína IL-21 com 1 a 29 aa como peptídeo de sinal.

[00229] Um polipeptídeo de isoforma 2 de IL-21 maduro pode ter a sequência de aa mrsspgnmer iviclmvifl gtlvhksssq gqdrhmirmr qlidivdqlk nyvndlvpef lpapedvetn cewsafscfq kaqlksantg nneriinvsi kklkrkppst nagrrqkhrl tcpscdsyek kppkeflerf ksllqkvstl sfi, (SEQ ID NO:60).

[00230] A IL-21 sinaliza através de um receptor de superfície celular dimérico com as mesmas cadeias gama que o receptor de IL-2, mas com subunidade distinta do receptor de IL-21R. Uma sequência de aa de uma proteína precursora da isoforma 1 da IL-21R humana pode ser MPRGWAAPLL LLLLQGGWGC PDLVCYTDYL PSPERFFMPL YKGCSGDFKK WVGAPFTGSS LELGPWSPEV PSTLEVYSCH PPRSPAKRLQ LTELQEPAEL VESDGVPKPS FWPTAQNSGG SAYSEERDRP YGLVSIDTVT VLDAEGPCTW PCSCEDDGYP ALDLDAGLEP SPGLEDPLLD AGTTVLSCGC VSAGSPGLGG PLGSLLDRLK PPLADGEDWA GGLPWGGRSP GGVSESEAGS PLAGLDMDTF DSGFVGSDCS SPVECDFTSP GDEGPPRSYL RQWVVIPPPL SSPGPQAS (SEQ ID NO:61) NCBI Ref Seq. NP_068570.1, com 1-19 aas formando a sequência de sinal, 20-538 aas, o polipeptídeo maduro, 233..253 aas, o domínio transmembranar e 20-232 aas, o ectodomínio.

[00231] Em alguns casos, um polipeptídeo variante de IL-21 exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-21 madura (por exemplo, um receptor de IL-21 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:12 e 61, tais como seus ectodomínios), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-21 em peso compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60. Por exemplo, em alguns casos, uma variante de um polipeptídeo IL-21 compreendendo SEQ ID NO:58 ou 60 se liga a um receptor IL-21 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:12 e 61, tais como seus ectodomínios, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo IL-21 em peso compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60.

[00232] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:58 ou 60) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-21 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:12 e 61, tais como seus ectodomínios, que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:58 ou 60) tem uma afinidade de ligação a todo ou parte de um receptor IL-21 maduro (por exemplo, compreendendo todo ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 12 e 61, tais como seus ectodomínios), que é de 100 nM a 100 μM (por exemplo, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM ou de 10 μM a 100 μM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO: 58 ou 60) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-21 maduro (por exemplo, compreendendo todo ou parte do conjunto de polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 12 e 61, como seus ectodomínios), que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00233] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:58 ou 60) tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-21 estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:58 ou 60) tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-21 estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-21 estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-21 variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-21 estabelecida na SEQ ID NO: 58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-21 estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-21 variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-21 estabelecida na SEQ ID NO: 58 ou 60. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-21 variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-21 estabelecida na SEQ ID NO:58 ou 60.

[00234] As sequências polipeptídicas de isoforma IL-21 variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aa contíguos) de SEQ ID NOs:58 ou 60 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa).

13. IL-23 e suas variantes

[00235] Em alguns casos, o MOD presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado da presente divulgação é um polipeptídeo de IL-23. IL-23 é uma citocina heterodimérica composta por uma subunidade IL- 23A (IL-23p19) e uma subunidade IL-12B (IL-12p40) (que é compartilhada com IL-12).

[00236] Em uma modalidade, um polipeptídeo IL-23A de tipo selvagem (wt) tem a sequência: mlgsravmll lllpwtaqgr avpggsspaw tqcqqlsqkl ctlawsahpl vghmdlreeg deettndvph iqcgdgcdpq glrdnsqfcl qrihqglify ekllgsdift gepsllpdsp vgqlhasllg Isqllqpegh hwetqqipsl spsqpwqrll Irfkilrslq afvavaarvf ahgaatlsp, (SEQ ID NO:62), proteína NCBI Ref. Seq. NP_057668.1 com 1 a 19 aa como peptídeo de sinal e 20-189 como peptídeo maduro.

[00237] Um polipeptídeo IL-23A maduro pode ter a sequência de aa: r avpggsspaw tqcqqlsqkl ctlawsahpl vghmdlreeg deettndvph iqcgdgcdpq glrdnsqfcl qrihqglify ekllgsdift gepsllpdsp vgqlhasllg lsqllqpegh hwetqqipsl spsqpwqrll lrfkilrslq afvavaarvf ahgaatlsp, (SEQ ID NO:63).

[00238] Em uma modalidade, um polipeptídeo IL-12B de tipo selvagem (wt) tem a sequência: MCHQQLVISW FSLVFLASPL VAIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS, (SEQ ID NO:64), UniProtKB - Proteína P29460 com 1 a 22 aa como peptídeo de sinal e 23 o 328 como peptídeo maduro.

[00239] Um polipeptídeo IL-12B maduro pode ter a sequência de aa: RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS, (SEQ ID NO:65).

[00240] Os sinais de IL-23 através de um receptor de superfície celular dimérico composto por um polipeptídeo receptor de IL-23 (IL-23R) e uma subunidade que tem em comum com o receptor de IL-12, denotado 12RB1 ou 12Rβ1.

[00241] Uma sequência de proteína precursora da isoforma 1 de IL- 23R pode ser: mnqvtiqwda vialyilfsw chggitninc sghiwvepat ifkmgmnisi ycqaaikncq prklhfykng ikerfqitri nkttarlwyk nflephasmy ctaecpkhfq etlicgkdis sgyppdipde vtcviyeysg nmtctwnagk ltyidtkyvv hvksleteee qqyltssyin istdslqggk kylvwvqaan algmeeskql qihlddivip saavisraet inatvpktii ywdsqttiek vscemrykat tnqtwnvkef dtnftyvqqs efylepniky vfqvrcqetg krywqpwssl ffhktpetvp qvtskafqhd twnsgltvas istghltsdn rgdiglllgm ivfavmlsil sligifnrsf rtgikrrill lipkwlyedi pnmknsnvvk mlqenselmn nnsseqvlyv dpmiteikei fipehkptdy kkentgplet rdypqnslfd nttvvyipdl ntgykpqisn flpegshlsn nneitsltlk ppvdsldsgn nprlqkhpnf afsvssvnsl sntiflgels lilnqgecss pdiqnsveee ttmllendsp setipeqtll pdefvsclgi vneelpsint yfpqnilesh fnrisllek, (SEQ ID NO:66) NCBI Ref. Seq. NP_653302.2, com 1-23 aas formando a sequência de sinal, 24-629 aas, o polipeptídeo maduro, 356 a 376 aas, o domínio transmembranar e 24-355 aas, o ectodomínio.

[00242] Uma sequência de aa da proteína precursora da isoforma 1 de 12RB1 pode ser: meplvtwvvp llflfllsrq gaacrtsecc fqdppypdad sgsasgprdl rcyrissdry ecswqyegpt agvshflrcc lssgrccyfa agsatrlqfs dqagvsvlyt vtlwveswar nqtekspevt lqlynsvkye pplgdikvsk lagqlrmewe tpdnqvgaev qfrhrtpssp wklgdcgpqd ddtesclcpl emnvaqefql rrrqlgsqgs swskwsspvc vppenppqpq vrfsveqlgq dgrrrltlke qptqlelpeg cqglapgtev tyrlqlhmls cpckakatrt lhlgkmpyls gaaynvavis snqfgpglnq twhipadtht epvalnisvg tngttmywpa raqsmtycie wqpvgqdggl atcsltapqd pdpagmatys wsresgamgq ekcyyitifa sahpekltlw stvlstyhfg gnasaagtph hvsvknhsld svsvdwapsl lstcpgvlke yvvrcrdeds kqvsehpvqp tetqvtlsgl ragvaytvqv radtawlrgv wsqpqrfsie vqvsdwliff aslgsflsil lvgvlgylgl nraarhlcpp lptpcassai efpggketwq winpvdfqee aslqealvve mswdkgerte plektelpeg apelaldtel sledgdrcka km, (SEQ ID NO:67) NCBI Ref Seq. NP_005526.1 com aas 1-23 formando a sequência de sinal, 24-662 aas, o polipeptídeo maduro, 546 a 570 aas, o domínio transmembranar e 24-545 aas, o ectodomínio.

[00243] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-23 variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:63 e/ou 65) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de IL-23 madura (por exemplo, um receptor de IL-23 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:66 e 67, tais como seus ectodomínios), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL-23 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:63 ou 65. Por exemplo, em alguns casos, uma variante de um polipeptídeo de IL-23 (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:63 e/ou 65) se liga a um receptor de IL-23 compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:66 e 67, tais como seus ectodomínios, com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo de IL- 23 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:63 ou 65.

[00244] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:63 e/ou 65) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-23 (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs:66 e 67, tais como seus ectodomínios), que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante (por exemplo, uma variante de SEQ ID NO: 63 e/ou 65) tem uma afinidade de ligação para um receptor de IL-23 maduro (por exemplo, compreendendo todo ou parte do conjunto de polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 66 e 67, como seus ectodomínios), que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00245] Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:63 e/ou 65) tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL- 23 estabelecida na SEQ ID NO:63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:63 e/ou 65) tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-23 estabelecida na SEQ ID NO:63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-23 estabelecida na SEQ ID NO:63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-23 variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-23 estabelecida na SEQ ID NO: 63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-23 estabelecida na SEQ ID NO:63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-23 variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos IL-23 estabelecida na SEQ ID NO: 63 e/ou 65. Em alguns casos, um polipeptídeo IL-23 variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica de IL-23 estabelecida na SEQ ID NO:63 e/ou 65.

[00246] As sequências polipeptídicas variantes adequadas de IL-23 incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 140, pelo menos 160, pelo menos 180, pelo menos 200, pelo menos 220, pelo menos 240, pelo menos 260, pelo menos 280, pelo menos 300, pelo menos 320 ou pelo menos 340 aas contíguos) da SEQ ID NO:63 e/ou 65, e que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa.

14. Ligante Fas (FasL) e suas variantes

[00247] Em alguns casos, o MOD presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado da presente divulgação é um Ligante Fas (FasL). O FasL é uma proteína transmembranar homomérica do tipo II na família do fator de necrose tumoral (TNF). Sinais de FasL por trimerização do receptor de Fas em uma célula alvo, que forma um complexo indutor de morte levando à apoptose da célula alvo. O FasL solúvel resulta da clivagem da metaloproteinase-7 da matriz (MMP-7) do FasL ligado à membrana em um sítio conservado.

[00248] Em uma modalidade, um proteínaHomo sapiens FasL em peso tem a sequência MQQPFNYPYP QIYWVDSSAS SPWAPPGTVL PCPTSVPRRP GQRRPPPPPP PPPLPPPPPP PPLPPLPLPP LKKRGNHSTG SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM SYCTTGQMWA RSSYLGAVFN LTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L, (SEQ ID NO:143), NCBI Ref. Seq. NP_000630.1, UniProtKB - P48023 onde os resíduos 1-80 são citoplasmáticos, 810102 são o domínio transmembranar e 103-281 aas são extracelulares (ectodomínio).

[00249] Um polipeptídeo FasL adequado compreende todo ou parte do ectodomínio de FasL QLFHLQKE LAELRESTSQ MHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVL LSGVKYKKGG LVINETGLYF VYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM SYCTTGQMWA RSSYLGAVFN LTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L. (SEQ ID NO144).

[00250] Um receptor Fas pode ter a sequência MLGIWTLLPL LTSVARLSS KSVNAQVTDI NSKGLELRKT VTTVETQNLE GLHHDGQFCH KPCPPGERKA RDCTVNGDEP DCVPCQEGKE YTDKAHFSSK CRRCRLCDEG HGLEVEINCT RTQNTKCRCK PNFFCNSTVC EHCDPCTKCE HGIIKECTLT SNTKCKEEGS RSNLGWLCLL LLPIPLIVWV KRKEVQKTCR KHRKENQGSH ESPTLNPETV AINLSDVDLS KYITTIAGVM TLSQVKGFVR KNGVNEAKID EIKNDNVQDT AEQKVQLLRN WHQLHGKKEA YDTLIKDLKK ANLCTLAEKI QTIILKDITS DSENSNFRNE IQSLV, (SEQ ID NO:145) NCBI Reference Sequence: NP_000034.1, UniProtKB - P25445, onde 26-173 aas formam o ectodomínio (domínio extracelular), 174-190 aas formam o domínio transmembranar e 191-335 o domínio citoplasmático. O ectodomínio pode ser usado para determinar a afinidade de ligação com FasL.

[00251] Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO144) exibe afinidade de ligação reduzida a uma sequência receptora de FasL madura (por exemplo, um receptor FasL compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos na SEQ ID NO:145, tal como seu ectodomínio), em comparação com a afinidade de ligação de um polipeptídeo FasL compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:144. Por exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:144) se liga a um receptor Fas (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 145, tais como seus ectodomínios), com uma afinidade de ligação que é pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, pelo menos 95% menor ou mais de 95% menor do que a afinidade de ligação de um polipeptídeo FasL compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:144.

[00252] Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:144) tem uma afinidade de ligação para um receptor Fas (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos na SEQ ID NO:145, tal como seu ectodomínio), que é de 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, de 10 nM a 100 nM, de 100 nM a 1 μM, de 1 μM a 10 μM, de 10 μM a 100 μM, ou de 100 μM a 1 mM). Como outro exemplo, em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:144) tem uma afinidade de ligação para um receptor Fas maduro (por exemplo, compreendendo todos ou parte dos polipeptídeos estabelecidos em SEQ ID NO:145, como seus ectodomínios), que é de cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, de cerca de 200 nM a cerca de 300 nM, de cerca de 300 nM a cerca de 400 nM, de cerca de 400 nM a cerca de 500 nM, de cerca de 500 nM a cerca de 600 nM, de cerca de 600 nM a cerca de 700 nM, de cerca de 700 nM a cerca de 800 nM, de cerca de 800 nM a cerca de 900 nM, de cerca de 900 nM a cerca de 1 μM, de cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, de cerca de 5 μM a cerca de 10 μM, de cerca de 10 μM a cerca de 20 μM, de cerca de 20 μM a cerca de 30 μM, de cerca de 30 μM a cerca de 50 μM, de cerca de 50 μM a cerca de 75 μM, ou de cerca de 75 μM a cerca de 100 μM.

[00253] Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:144) tem uma única substituição de aa em comparação com a sequência polipeptídica FasL estabelecida na SEQ ID NO:144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante (por exemplo, compreendendo uma variante da SEQ ID NO:144) tem de 2 substituições de aa a 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica FasL estabelecida na SEQ ID NO:144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante tem 2 substituições de aa em comparação com a sequência polipeptídica FasL estabelecida na SEQ ID NO:144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante tem 3 substituições de aa ou 4 aa em comparação com a sequência de aminoácidos FasL estabelecida na SEQ ID NO: 144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante tem 5 substituições de aa ou 6 aa em comparação com a sequência polipeptídica FasL estabelecida na SEQ ID NO:144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante tem 7 substituições de aa ou 8 aa em comparação com a sequência de aminoácidos FasL estabelecida na SEQ ID NO: 144. Em alguns casos, um polipeptídeo FasL variante tem 9 substituições de aa ou 10 aa em comparação com a sequência polipeptídica FasL estabelecida na SEQ ID NO:144.

[00254] As sequências polipeptídicas de FasL variantes adequadas incluem sequências polipeptídicas com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa a pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 140, pelo menos 160, ou pelo menos 180 aa contíguos) da SEQ ID NO: 144 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

E. Scaffolds

[00255] Os polipeptídeos de Scaffold servem, entre outras coisas, como elementos estruturais que fornecem um framework sobre o qual outros componentes de um construto ou complexo de TGF-β mascarado são organizados (ver, por exemplo, FIG. 1, estrutura A, com um Scaffold de IgFc). Quando a sequência polipeptídica que mascara um polipeptídeo TGF-β e o polipeptídeo TGF-β estão localizados em trans (em diferentes polipeptídeos do complexo), as sequências de Scaffold que formam duplexes interespecíficos e não interespecíficos (ou estruturas de ordem superior) podem manter a sequência polipeptídica de mascaramento associada ao polipeptídeo TGF-β mesmo durante períodos em que o complexo está em uma forma aberta com a sequência polipeptídica TGF-β está disponível para interagir com outras moléculas (não em contato direto com a sequência de mascaramento). Dependendo da natureza do Scaffold, ele também pode atuar como um elemento organizacional fornecendo estrutura de ordem superior em termos de dobragem e dimerização ou multimerização de proteínas (por exemplo, homodimerização ou heterodimerização realizada através de sequências de dimerização). O Scaffold também pode contribuir para a estabilidade do soro, particularmente onde é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, um Fc de Ig). Polipeptídeos de scaffold adequados serão, em alguns casos, polipeptídeos que estendem a meia-vida. Em alguns casos, um polipeptídeo de scaffold adequado aumenta a meia-vida in vivo (por exemplo, a meia-vida sérica) de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, em comparação com um construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle com um polipeptídeo de scaffold com uma sequência diferente de não imunoglobulina, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes ou mais de 100 vezes. Como exemplo, em alguns casos, uma sequência polipeptídica de Fc de Ig (por exemplo, incluindo sequência de Ig interespecífica, tal como pares de sequências knob-in-hole) aumenta a estabilidade e/ou meia-vida in vivo (por exemplo, a meia-vida sérica) de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, em comparação com um construto ou complexo de TGF-β mascarado de controle com a sequência polipeptídica Fc de Ig substituída por um ligante (por exemplo, uma repetição de GGGS aa de comprimento de sequência igual). O aumento na meia-vida in vivo pode ser de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes ou mais de 100 vezes. Quando um polipeptídeo Fc de Ig é empregado no construto de TGF-β mascarado, o Fc de Ig pode conter mutações que impedirão a formação espontânea de dímeros do construto de TGF-β mascarado (ver, por exemplo, Tianlei Ying et al., J. Biol. Chem., 287 (23), pp 19399-19408 (1 de junho de 2012)) e, adicionalmente, podem incluir mutações (por exemplo, as mutações LALA discutidas abaixo) que reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular, por exemplo, embora citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[00256] Quando as sequências polipeptídicas de scaffold de um construto de TGF-β mascarado compreendem uma ou mais sequências que permitem que os scaffolds interajam (se liguem especificamente) com outras moléculas de scaffold, os construtos de TGF-β mascarados podem formar complexos de homodímero (ver, por exemplo, FIG. 1, estrutura B) ou complexos de heterodímero (ver, por exemplo, FIG. 1, estruturas C-F). Os construtos de TGF-β mascarados também podem compreender uma ou mais sequências de aa que permitem que os scaffolds interajam (se liguem especificamente) com outras moléculas de scaffold formando estruturas de ordem superior. As sequências que formam estruturas de multímero de ordem superior permitem a formação de construto de TGF-β mascarado ou complexos de ordem superior (por exemplo, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros etc.). A título de exemplo, os polipeptídeos de scaffold compreendendo regiões Fc de IgM (por exemplo, SEQ ID NO:83) permitem a formação de construtos ou complexos pentaméricos (particularmente quando as sequências de cadeia j também são expressas, por exemplo, SEQ ID NO:84) ou TGF-β mascarado hexamérico. Petrusic et al., Med Hypotheses. 77(6):959-61 (2011). Construtos de TGF-β mascarados na forma de homo- e heterodímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros etc. são referidos como complexos de TGF- β mascarados.

[00257] Quando é desejável reunir um TGF-β mascarado com uma ou mais outras sequências polipeptídicas (como um ou mais MODs específicos ou cópias de MODs), as sequências polipeptídicas de scaffold podem compreender sequências de dimerização interespecíficas que tendem a formar um heterodímero com sua sequência de ligação interespecífica (dimerização) de contraparte. As sequências de ligação interespecíficas podem, em alguns casos, formar homodímeros, mas preferencialmente dimerizar (se ligar mais fortemente) com sua sequência de ligação interespecífica de contraparte. Consequentemente, heterodímeros específicos podem ser (tendem a ser) formados quando uma sequência de dimerização interespecífica e sua sequência de ligação interespecífica de contraparte são incorporadas em um par de polipeptídeos. A título de exemplo, onde uma sequência de dimerização interespecífica e sua contraparte são incorporadas em um par de polipeptídeos para formar seletivamente heterodímeros, mais de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de uma mistura equimolar dos peptídeos estão envolvidos na formação de heterodímeros, com o restante dos peptídeos presentes como monômeros ou homodímeros.

[00258] Uma variedade de sequências de aa que se ligam especificamente umas às outras ou a si mesmas com afinidade suficiente pode ser utilizada como sequências de dimerização em um construto ou complexo de TGF-β mascarado (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N.° 2003/0138440). As sequências podem ser de tamanho relativamente compacto (por exemplo, menos de cerca de 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75 ou 50 aa). As sequências de dimerização/multimerização incluem, mas não estão limitadas a: sequências polipeptídicas da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Fc de Ig) (sequências compreendendo regiões CH2-CH3 de imunoglobulinas; ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2H e SEQ ID NOs: 68 a 83); sequências Fc knob-in-hole (por exemplo, SEQ ID NOs:77 e 78); polipeptídeos da família de colecionadores (por exemplo, proteínas semelhantes a ACRP30 ou ACRP30) que contêm domínios de colágeno consistindo em repetições de colágeno Gly-Xaa-Yaa; domínios de bobina enrolada; domínios de leucina-zíper; pares de ligação Fos/Jun; região da cadeia pesada 1 de Ig (CH1) e sequências CL da região constante da cadeia leve (pares CH1/CL, como uma sequência CH1 pareada com uma sequência K ou À Ig da região constante da cadeia leve).

[00259] Em algumas modalidades, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência polipeptídica da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (CH2-CH3) que funciona como uma sequência de dimerização ou multimerização (ver, por exemplo, as FIGs. 2A- 2H e SEQ ID NOs: 68 a 83. Em modalidades, o polipeptídeo de Ig substancialmente não induzirá a lise celular, por exemplo, através da ativação de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e, portanto, pode incluir mutações que reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular. Em alguns casos, a sequência de Fc tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com uma sequência aa de uma região de Fc representada nas Figuras 2A-2H. Tais sequências de imunoglobulina podem ligar covalentemente os polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado formando uma ou duas ligações dissulfeto intercadeias. Conforme discutido abaixo, uma ligação dissulfeto adicional pode ser introduzida para estabilizar dímeros, particularmente onde um par de sequência de Ig interespecífica, tais pares de polipeptídeo knob-in-hole, são empregados.

[00260] Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold de um complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 150 aas contíguos (pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325 ou pelo menos 350 aas contíguos), ou todos aas, da sequência Fc de IgA representada na Figura 2A (SEQ ID NO:68). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 150 aas contíguos (pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325 ou pelo menos 350 aas contíguos) ou todos os aas da sequência Fc de IgD representada na Figura 2B (SEQ ID NO:69). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175 ou pelo menos 200 aas contíguos), ou todos aas, da sequência Fc de IgE representada na Figura 2C (SEQ ID NO:70). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175 ou pelo menos 200 aas contíguos), ou todos os aas, do peso. Sequência polipeptídica Fc de IgG, tal como a sequência Fc de IgG1 representada na Figura 2D (SEQ ID NOs: 71-78). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275 ou pelo menos 300), ou todos os aas, da sequência polipeptídica Fc de IgG2 representada na Figura 2E (SEQ ID NO:79). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200 ou pelo menos 225), ou todos os aas, da sequência Fc de lgG3 representada na Figura 2F (SEQ ID NO:80). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225 ou pelo menos 250) ou todos os aas, da sequência polipeptídica Fc de IgG4 representada na Figura 2G (SEQ ID NO:81 ou 82). Em uma modalidade, a sequência polipeptídica de scaffold compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200 ou pelo menos 225 ou pelo menos 250), ou todos os aas, da sequência Fc de lgM representada na Figura 2H (SEQ ID NO:83). Os polipeptídeos citados acima de um complexo de TGF-β mascarado compreendendo sequências polipeptídicas de scaffold de imunoglobulina (por exemplo, representadas nas Figuras 2A-2H) podem ser ligados covalentemente juntos pela formação de uma ou duas ligações dissulfeto intercadeias entre cisteínas adjacentes às suas regiões de dobradiça.

[00261] Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com o polipeptídeo Fc de IgG1 humana representado na Figura 2D e compreende uma substituição de N297 por uma substituição de alanina (substituição N297A ou N77 conforme enumerado na Figura 2D, SEQ ID NO:74). Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente no construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência aa representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana), exceto por uma substituição de N297 (N77 da sequência aa representada na Figura 2D) por um aa diferente de asparagina. As substituições em N297 levam à remoção de modificações de carboidratos e resultam em sequências de anticorpos com ligação reduzida ao componente 1q do complemento (“C1q”) em comparação com a proteína em peso e, consequentemente, uma redução na citotoxicidade dependente do complemento.

[00262] Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência aa representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana), exceto por uma substituição de L234 (L14 da sequência aa representada na Figura 2D) por um aa diferente de leucina. L234 e outros aas na região de dobradiça inferior (por exemplo, aas 234-LLGGPS-239, que correspondem a aas 14-19 da SEQ ID NO:71) de IgG estão envolvidos na ligação ao receptor Fc lambda (Tc/J<) e, consequentemente, as mutações nesse local reduzem a ligação ao receptor (em relação à proteína em peso). Em alguns casos, a sequência de dimerização polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência aa representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana), exceto por uma substituição de L235 (L15 da sequência aa representada na Figura 2D) por um aa diferente de leucina. Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência aa representada na Figura 2D (por exemplo, a sequência IgG1 humana em peso) com substituições L234A e L235A (“LALA”) (as posições correspondentes às posições 14 e 15 da sequência aa em peso representada na Figura 2D; ver, por exemplo, SEQ ID NO:75).

[00263] Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência aa representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana), tendo uma substituição de P331 (P111 da sequência aa representada na Figura 2D) por uma aa diferente de prolina; em alguns casos, a substituição é uma substituição P331S. As substituições em P331, como aquelas em N297, levam à ligação reduzida a C1q em relação à proteína em peso e, portanto, a uma redução na citotoxicidade dependente do complemento. As substituições de D270, K322 e/ou P329 (correspondentes a D50, K122 e P119 da SEQ ID NO:71 na Figura 2D), por exemplo, com alanina, podem ser utilizadas sozinhas ou em vez de uma substituição de P331 para reduzir a ligação a C1q. Em alguns casos, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo Fc de IgG1 que compreende substituições de L234A e/ou L235A (substituições de leucinas em L14 e/ou L15 das sequências aa representadas na Figura 2D com Ala). Em alguns casos, a sequência de dimerização polipeptídica de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende a sequência aa representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana em peso), exceto para substituições em L234 e/ou L235 (L14 e/ou L15 da sequência aa representada na Figura 2D) por aas diferentes de leucina e uma substituição de P331 (P111 da sequência aa representada na Figura 2D) por um aa diferente de prolina. Em alguns casos, a sequência de dimerização polipeptídica de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende a sequência aa “Mutante Triplo” (SEQ ID NO:73) representada na Figura 2D (Fc de IgG1 humana) compreendendo substituições L234F, L235E e P331S (correspondendo às posições aa 14, 15 e 111 da sequência aa representada na Figura 2D).

[00264] Quando um pareamento assimétrico entre dois polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado é desejado, a sequência de dimerização de um polipeptídeo de scaffold presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de ligação interespecífica. As sequências de ligação interespecíficas favorecem a formação de heterodímeros com sua sequência polipeptídica cognata (isto é, a sequência interespecífica e sua sequência interespecífica homóloga), particularmente aquelas baseadas em variantes de sequência Fc de imunoglobulina. Tais sequências polipeptídicas interespecíficas incluem knob-in-hole sem (KiH) ou com (KiH)s-s uma ligação de dissulfeto estabilizante, sequências HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s e A107. Um par de ligação interespecífica compreende um par mutante T366Y e Y407T na interface de domínio CH3 de IgG1, ou os resíduos correspondentes de outras imunoglobulinas. Ver Ridgway et al., Protein Engineering 9:7, 617-621 (1996), (as substituições são denotadas pelo esquema de numeração EU de Kabat et al. (1991)). Um segundo par de ligação interespecífica envolve a formação de um knob por uma substituição T366W e um hole pelas substituições triplas T366S, L368A e Y407V na sequência Fc complementar. Ver Xu et al. mAbs 7:1, 231-242 (2015). Outro par de ligação interespecífica tem um primeiro polipeptídeo Fc com substituições Y349C, T366S, L368A e Y407V e um segundo polipeptídeo Fc com substituições S354C e T366W (ligações dissulfeto podem se formar entre o Y349C e o S354C). Brinkmann e Konthermann, mAbs 9:2, 182-212 (2015). As sequências polipeptídicas Fc, com ou sem modificações knob-in-hole, podem ser estabilizadas pela formação de ligações dissulfeto entre os polipeptídeos Fc (por exemplo, as ligações dissulfeto da região de dobradiça). Várias sequências de ligação ao polipeptídeo interespecíficas estão resumidas na Tabela 1, com referência cruzada à numeração das posições aa conforme aparecem em peso. Sequência de IgG1 (SEQ ID NO:71) estabelecida na Figura 2D mostrada entre parênteses “{}”.Tabela 1. Sequências Interespecíficas e suas sequências interespecíficas homólogas cognatas Tabela 1 modificada de Ha et al. Frontiers em Immunol.7:1-16 (2016). * aa forma uma ligação de dissulfeto estabilizadora.

[00265] Além dos pares interespecíficos de sequências na Tabela 1, sequências de “SEED” interespecíficas com 45 resíduos derivados de IgA em um domínio CH3 de IgG1 da sequência interespecífica e 57 resíduos derivados de IgG1 no IgA CH3 na sequência interespecífica homóloga. Ver Ha et al., Frontiers in Immunol.7:1-16 (2016).

[00266] Em uma modalidade, as sequências de scaffold encontradas em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendem uma sequência de ligação interespecífica ou sua sequência de ligação interespecífica homóloga selecionada do grupo que consiste em: knob-in-hole (KiH); knob-in-hole com um dissulfeto estabilizador (KiHs-s); HA-TF; ZW- 1; 7.8.60; DD-KK; EW-RVT; EW-RVTs-s; A107; ou sequências de SEED.

[00267] Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com uma substituição de sequência T146W KiH e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições de sequência T146W, L148A e Y187V KiH, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71. Uma ou ambas as sequências aa de scaffold opcionalmente compreendendo substituições em um ou mais de L234 e L235 (por exemplo, L234A/L235A “LALA” ou L234F/L235E), N297 (por exemplo, N297A), P331 (por exemplo, P331S), L351 (por exemplo, L351K), T366 (por exemplo, T366S), P395 (por exemplo, P395V), F405 (por exemplo, F405R), Y407 (por exemplo, Y407A) e K409 (por exemplo, K409Y) usando uma numeração de Kabat. Essas substituições aparecem em L14 e L15 (por exemplo, L14A/L15A “LALA” ou L14F/L15E), N77 (por exemplo, N77A), P111 (por exemplo, P111S), L131 (por exemplo, L131K), T146 (por exemplo, T146S), P175 (por exemplo, P175V), F185 (por exemplo, F185R), Y187 (por exemplo, Y187A) e K189 (por exemplo, K189Y) na sequência de IgG1 da SEQ ID NO:71.

[00268] Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com uma substituição de sequência T146W KiH, e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições de sequência de T146S, L148A e Y187V KiH, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat). Ver, por exemplo, Figura 2D SEQ ID NOs: 77 e 78,

[00269] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado compreendem na primeira sequência de scaffold as substituições T146W e S134C KiHs-s, e na segunda sequência de scaffold as substituições T146S, L148A, Y187V e Y129C KiHs-s, em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear interações com receptores FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00270] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem na primeira sequência de scaffold as substituições S144H e F185A HA-TF, e na segunda sequência de scaffold das substituições Y129T e T174F HA-TF, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear interações com receptores de Fcy (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00271] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem, na primeira sequência de scaffold as substituições T130V, L131Y, F185A e Y187V ZW1 e, na segunda sequência de scaffold as substituições T130V, T146L, K172L e T174W ZW1, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00272] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem na primeira sequência de scaffold as substituições K140D, D179M e Y187A 7.8.60 e, na segunda sequência de scaffold as substituições E125R, Q127R, T146V e K189V 7.8.60, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 para remover a função efetora ao boquear as interações com receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00273] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos β de um complexo de TGF-β mascarado compreendem, na primeira sequência de scaffold as K189D e as substituições K172D DD-KK, e na segunda sequência de scaffold as substituições D179K e E136K DD-KK, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com os receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00274] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem na primeira sequência de scaffold as substituições K140E e K189W EW-RVT e na segunda sequência de scaffold as substituições Q127R, D179V e F185T EW-RVT, em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de Fcy (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00275] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem substituições na primeira sequência de scaffold as substituições K140E, K189W e Y129C EW-RVTs-s, e na segunda sequência de scaffold as substituições Q127R, D179V, F185T e S134C EW-RVTs-s, em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00276] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem na primeira sequência de scaffold as substituições K150E e K189W A107 e na segunda sequência de scaffold as substituições E137N, D179V e F185T A107, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227 aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00277] Como uma alternativa ao uso de regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina como scaffolds, as regiões constantes de cadeia leve de imunoglobulina podem ser pareadas com as sequências CH1 de cadeia pesada como as sequências de dimerização que formam, ou fazem parte das sequências polipeptídicas de scaffold. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem, na primeira sequência de scaffold, um domínio Ig de CH1 (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO:85) e, na segunda sequência de scaffold, a sequência da região constante da cadeia Ig K SEQ ID NO:86), em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aas contíguos da SEQ ID NOs: 85 e/ou 86, respectivamente). Ver Figuras 2J e 2K. Os sequênios de CH1 e Ig Kpodem ser modificados para aumentar sua afinidade entre si e, consequentemente, a estabilidade de qualquer heterodímero formado utilizando-os como sequências de dimerização. Entre as substituições que aumentam a estabilidade dos heterodímeros CH1- Ig k estão aquelas identificadas como a combinação MD13 em Chen et al., MAbs, 8(4):761-774 (2016). Em MD13, duas substituições são introduzidas em cada um dos sequênios de CH1 e Ig k. A sequência de CH1 é modificada para conter as substituições S64E e S66V (S70E e S72V na SEQ ID NO:85 mostrada na Figura 2J). A sequência Ig k é modificada para conter substituições S69L e T71S (S68L e T70S na SEQ ID NO:86 mostrada na Figura 2K).

[00278] Em outra modalidade, o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado compreendem, na primeira sequência de scaffold, um domínio Ig de CH1 (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO:85) e, na segunda sequência de scaffold, a sequência da região constante da cadeia Ig À SEQ ID NO:87), em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aas contíguos da SEQ ID NOs: 85 e/ou 87, respectivamente. Ver Figuras 2J e 2K.

[00279] Em alguns casos, a sequência polipeptídica de scaffold de um primeiro e um segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado compreende, cada um, um polipeptídeo de zíper de leucina como uma sequência de dimerização. Os polipeptídeos de zíper de leucina se ligam uns aos outros para formar o dímero (por exemplo, homodímero). Exemplos não limitativos de polipeptídeos de leucina-zíper incluem, por exemplo, um peptídeo de qualquer uma das seguintes sequênciass aa: RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER (SEQ ID NO:88); LSSIEKKQEEQTSWLIWISNELTLIRNELAQS (SEQ ID NO:89); LSSIEKKLEEITSQLIQISNELTLIRNELAQ (SEQ ID NO:90; LSSIEKKLEEITSQLIQIRNELTLIRNELAQ (SEQ ID NO:91); LSSIEKKLEEITSQLQQIRNELTLIRNELAQ (SEQ ID NO:92); LSSLEKKLEELTSQLIQLRNELTLLRNELAQ (SEQ ID NO:93); ISSLEKKIEELTSQIQQLRNEITLLRNEIAQ (SEQ ID NO:94). Em alguns casos, um polipeptídeo de zíper de leucina compreende a seguinte sequência aa: LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLG GGK (SEQ ID NO:95). Polipeptídeos adicionais de leucina-zíper são conhecidos na técnica, qualquer um dos quais é adequado para uso como scaffold ou incorporação em um scaffold como uma sequência de dimerização.

[00280] Em alguns casos, a sequência polipeptídica de scaffold de um primeiro e um segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado compreende, cada um, um peptídeo de bobina enrolada que forma um dímero (por exemplo, homodímero). Exemplos não limitativos de polipeptídeos de bobina enrolada incluem, por exemplo, um peptídeo de qualquer uma das seguintes sequências aa: LKSVENRLAVVENQLKTVIEELKTVKDLLSN (SEQ ID NO:96); LARIEEKLKTIKAQLSEIASTLNMIREQLAQ (SEQ ID NO:97); VSRLEEKVKTLKSQVTELASTVSLLREQVAQ (SEQ ID NO:98); IQSEKKIEDISSLIGQIQSEITLIRNEIAQ (SEQ ID NO:99); LMSLEKKLEELTQTLMQLQNELSMLKNELAQ (SEQ ID NO:100).

[00281] Em alguns casos, uma sequência polipeptídica de scaffold que permite a dimerização (homodimerização) de um primeiro e um segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado, cada um, compreende uma sequência polipeptídica com pelo menos um resíduo de cisteína que pode formar uma ligação dissulfeto. Exemplos de tais sequências polipeptídicas incluem: um polipeptídeo FasL humano VDLEGSTSNGRQCAGIRL (SEQ ID NO:101); EDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMA (SEQ ID NO:102); e GHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGQMA (SEQ ID NO:103).

[00282] Os peptídeos adequados como as sequências de multimerização (oligomerização) permitem a formação de complexos de TGF-β mascarados maiores que os dímeros (por exemplo, trímeros tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, etc.) incluem, mas não estão limitados a regiões constantes de IgM (ver, por exemplo, Figura 2 H) que formam hexâmero ou pentâmeros (particularmente quando combinados com um peptídeo de cadeia j maduro sem uma sequência de sinal, tal como a fornecida na Figura 2I). Os domínios de colágeno, que formam trímeros, também podem ser empregados. Os domínios de colágeno podem compreender (Gly- Xaa-Xaa)n, onde Xaa é qualquer aa, ou/e onde n é um número inteiro (por exemplo, de 10 a 40); onde Xaa e Yaa são independentemente qualquer aa, e n é um número inteiro de 10 a 40. Nas sequências Gly-Xaa-Yaa, Xaa e Yaa são frequentemente prolina e hidroxiprolina, respectivamente, em mais de 25%, 50%, 75%, 80% 90% ou 95% das ocorrências de Gly-Xaa-Yaa, ou em cada uma das ocorrências de Gly-Xaa-Yaa. Em alguns casos, um domínio de colágeno compreende a sequência (Gly-Xaa-Pro)n, onde n é um número inteiro (por exemplo, de 10 a 40). Um peptídeo de oligomerização de colágeno pode compreender a seguinte sequência aa: VTAFSNMDDMLQKAHLVIEGTFIYLRDSTEFFIRVRDGWKKLQLGELI PIPADSPPPPALSSNP (SEQ ID NO:104).

F. Polipeptídeos de TGF-β

[00283] Conforme observado acima, um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende pelo menos um polipeptídeo de TGF-β (por exemplo, um ou mais polipeptídeos TGF-β selecionados independentemente). As sequências de aminoácidos de polipeptídeos de TGF-β são conhecidas na técnica. Em alguns casos, o polipeptídeo de TGF-β presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo de TGF-β1. Em alguns casos, o polipeptídeo de TGF-β presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo de TGF-β2. Em alguns casos, o polipeptídeo de TGF-β presente em um construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo de TGF-β3.

[00284] Embora as sequências polipeptídicas de TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3 possam ser incorporadas em um construto ou complexo de TGF-β mascarado, uma variedade de fatores pode influenciar a escolha do polipeptídeo TGF-β específico e a sequência específica e as substituições de aa que serão empregadas. Por exemplo, TGF-β1 e TGF-β3 estão sujeitos a um “clipping” de suas sequências de aminoácidos quando expressas em vários sistemas de células de mamíferos (por exemplo, célula CHO). Além disso, o TGF-β dimerizado (por exemplo, TGF-β2) tem uma maior afinidade pelo TβR3 (receptor de beta glicano) do que pelo receptor de TβR2, o que poderia levar à ligação fora do alvo e perda de proteína mascarada ativa biológica ao grande pool in vivo de moléculas de TβR3 não sinalizadoras. A fim de minimizar a ligação fora do alvo de alta afinidade a TβR3, pode ser desejável substituir os resíduos que levam as moléculas de TGF-β diméricas, que são unidas por uma ligação dissulfeto. Por conseguinte, a cisteína 77 (C77) pode ser substituída por um aminoácido diferente de cisteína (por exemplo, uma serina formando uma substituição de C77S).

[00285] Um polipeptídeo de TGF-β adequado pode ter um comprimento de cerca de 70 aas a cerca de 125 aas; por exemplo, um polipeptídeo de TGF-β adequado pode ter um comprimento de cerca de 70 aas a cerca de 80 aas, de cerca de 80 aas a cerca de 90 aas; de cerca de 90 aas a cerca de 100 aas; de cerca de 100 aas a cerca de 105 aas, de cerca de 105 aas a cerca de 110 aas, de cerca de 110 aas a cerca de 112 aas, de cerca de 113 aas a cerca de 120 aas, ou de cerca de 120 aas a cerca de 125 aas. Um polipeptídeo de TGF-β adequado pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110 aas contíguos da forma madura de um polipeptídeo de TGF-β1 humano, um polipeptídeo de TGF-β2 humano ou um polipeptídeo de TGF-β3 humano.

1. Polipeptídeos de TGF-β1

[00286] Um polipeptídeo de TGF-β1 adequado pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112 aas da seguinte sequência de aminoácidos de TGF-β1: AL DTNYCFSSTE KNCCVRQLYI polipeptídeo de TGF-β1 tem um comprimento de cerca de 112 aas. Uma pré- proproteína de TGF-β1 é fornecida na FIigura 3 como a SEQ ID NO:106. Os aminoácidos R25, C77, V92 e R94 estão em negrito e em itálico, ver Figura 4.

[00287] Em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β1 adequado compreende uma substituição de C77S. Assim, em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β1 adequado compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos NMIVRSCKCS (SEQ ID NO:107), onde o aminoácido 77 é Ser. As posições 25, 77, 92 e 94 estão em negrito e em itálico.

2. Polipeptídeos de TGF-β2

[00288] Um polipeptídeo de TGF-β2 adequado pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112 aas da seguinte sequência de aminoácidos de TGF-β2: ALDAAYCFR NVQDNCCLRP LYIDFKRDLG WKWIHEPKGY NANFCAGACP YLWSSDTQHS RVLSLYNTIN PEASASPCCV SQDLEPLTIL YYIGKTPKIE QLSNMIVKSC KCS (SEQ ID NO:108), em que o polipeptídeo de TGF-β2 tem um comprimento de cerca de 112 aas. Uma pré-proproteína de TGF-β2 é fornecida na Figura 3 como a SEQ ID NO:109. Os resíduos Lys 25, Ile 92 e/ou Lys 94 estão em negrito e em itálico.

[00289] Em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β2 adequado compreende uma substituição de C77S. Assim, em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β2 adequado compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112 aas da seguinte sequência de aminoácidos de TGF-β2: ALDAAYCFR NVQDNCCLRP LYIDFKRDLG WKWIHEPKGY NANFCAGACP YLWSSDTQHS RVLSLYNTIN PEASASPSCV SQDLEPLTIL YYIGKTPKIE QLSNMIVKSC KCS (SEQ ID NO110), em que o aminoácido 77 é Ser.

3. Polipeptídeos de TGF-β3

[00290] Um polipeptídeo de TGF-β3 adequado pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112 aas da seguinte sequência de aminoácidos de TGF-β3: ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS (SEQ ID NO:111), em que o polipeptídeo de TGF-β3 tem um comprimento de cerca de 112 aas. Uma pré-proproteína da isoforma 1 de TGF-β3 é fornecida na Fiigura 3 como a SEQ ID NO:112. As posições 25, 92 e 94 estão em negrito e em itálico.

[00291] Em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β3 adequado compreende uma substituição de C77S. Em alguns casos, um polipeptídeo de TGF-β3 adequado compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112 aas da seguinte sequência de aminoácidos de TGF-β3: ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPSCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS (SEQ ID NO:113), em que o aminoácido 77 é Ser. As posições 25, 92 e 94 estão em negrito e em itálico.

4. Variações adicionais da sequência polipeptídica de TGF-β

[00292] Além das variações de sequência que alteram a dimerização da molécula de TGF-β (por exemplo, substituições de cisteína 77, como a C77S), os polipeptídeos de TGF-β1-3 com variações de sequência que afetam a afinidade e outras propriedades podem ser incorporados em um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Quando um construto ou complexo de TGF- β mascarado compreende uma variante de TGF-β com afinidade reduzida para o polipeptídeo de mascaramento (por exemplo, polipeptídeo de TβR, tal como um polipeptídeo de TβRII), esses componentes se dissociam mais prontamente, tornando o polipeptídeo TGF-β mascarado mais disponível para proteínas celulares de TβR. Como a proteína de TβRII é geralmente o primeiro peptídeo do complexo de sinalização de TβR heteromérico a interagir com TGF-β, as interações com TβRII controlam efetivamente a entrada de TGF-β em complexos de sinalização ativos. Consequentemente, as variantes que controlam a afinidade de TGF-β para TβRII controlam efetivamente a entrada de construtos e complexos de TGF-β mascarados em complexos de sinalização ativos.

[00293] A presente divulgação inclui e fornece construtos e complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência polipeptídica de TβR de mascaramento variante (por exemplo, TβRII) e/ou um polipeptídeo de TGF-β variante com afinidade alterada (por exemplo, reduzida) entre si (em relação a um construto ou complexo de TGF-β mascarado idêntico sem a(s) variação(ões) de sequência). A afinidade entre um polipeptídeo de TGF-β e um polipeptídeo de TβR (por exemplo, TβRII) pode ser determinada usando (BLI) conforme descrito acima para MODs e seus co-MODs.

a. Variantes de sequência de TGF-β2 adicionais

[00294] A presente divulgação inclui e fornece construtos e complexos de TGF-β2 mascarados compreendendo uma sequência polipeptídica de TβR de mascaramento (por exemplo, TβRII) e um polipeptídeo de TGF-β2 em peso ou variante; onde o polipeptídeo variante tem uma afinidade reduzida para o TβR de mascaramento (em relação a um peso idêntico, de outro modo, sequência polipeptídica de TGF-β sem as variações de sequência).

[00295] A divulgação fornece um construto ou complexo de TGF-β mascarado que compreende uma sequência receptora de TβRII de mascaramento e um polipeptídeo de TGF-β2 variante com mais de 85% (por exemplo, mais de 90%, 95%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com pelo menos 100 aa contíguos da SEQ ID NO. 108, e compreendendo uma substituição reduzindo a afinidade do polipeptídeo de TGF-β2 variante pela sequência receptora de TβRII.

[00296] Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um polipeptídeo de TβRII de mascaramento e um polipeptídeo de TGF-β variante (por exemplo, TGF-β2) compreendendo uma substituição em um ou mais, dois ou mais ou todos os três de Lys 25, Ile 92 e/ou Lys 94 (ver SEQ ID NO:108 para a localização dos resíduos e Figura 4 para os resíduos correspondentes em TGF-β1 e TGF-β3). Demonstrou-se que esses resíduos aa afetam a afinidade de TGF-β2 para polipeptídeos TβRII (ver Crescenzo et al., J. Mol. Biol. 355: 47-62 (2006)). O polipeptídeo de TGF-β mascarado compreende opcionalmente um ou mais MODs selecionados independentemente, tais como IL-2 ou uma variante do mesmo. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um polipeptídeo de TβRII de mascaramento e um polipeptídeo de TGF-β2 com um aa diferente de Lys ou Arg na posição 25 da SEQ ID NO:108; e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento pode compreender um polipeptídeo de TGF-β2 com um aa diferente de Ile ou Val na posição 92 da SEQ ID NO:108 (ou um aa diferente de Ile, Val ou Leu na posição 92); e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento pode compreender um polipeptídeo de TGF-β2 com um aa diferente de Lys ou Arg na posição 94 da SEQ ID NO:108; e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento pode compreender um polipeptídeo de TGF-β2 compreendendo uma substituição em um ou mais, dois ou mais ou todos os três de Lys 25, Ile 92 e/ou Lys 94 e compreende adicionalmente um ou mais MODs selecionados independentemente. Um construto ou complexo de TGF- β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento pode compreender um polipeptídeo de TGF-β2 compreendendo uma substituição em um ou mais, dois ou mais ou todos os três de Lys 25, Ile 92 e/ou Lys 94, e compreende adicionalmente um ou mais MODs de IL-2 selecionados independentemente, ou variantes de afinidade reduzidas dos mesmos.

b. Variantes de sequência de TGF-β1 e TGF-β3 adicionais

[00297] Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um polipeptídeo de TβRII de mascaramento e um polipeptídeo de TGF-β1 ou TGF-β3 variante compreendendo uma substituição em uma ou mais, duas ou mais ou todas as três posições aa correspondentes a Lys 25, Ile 92 e/ou Lys 94 em TGF-β2 SEQ ID NO:108. Em TGF-β1 ou TGF-β3, o aa que corresponde a: Lys 25 é um Arg 25, Ile 92 é Val 92 e Lys 94 é Arg 94, cada um dos quais é uma substituição conservadora. Ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 106 e 107 para TGF-β1 e SEQ ID NOs: 112 e 113 para TGF-β3.

[00298] Conforme observado acima, o construto ou complexo de TGF- β mascarado compreende opcionalmente um ou mais MODs selecionados independentemente, como IL-2 ou uma variante do mesmo. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento compreende um polipeptídeo de TGF-β1 ou β3 com um aa diferente de Arg ou Lys na posição 25; e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento compreende um polipeptídeo de TGF-β1 ou β3 com um aa diferente de Val ou Ile na posição 92 (ou um aa diferente de Ile, Val ou Leu na posição 92); e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Em outro exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento compreende um polipeptídeo de TGF-β2 com um aa diferente de Arg ou Lys; e opcionalmente compreende um ou mais MODs selecionados independentemente (por exemplo, um ou mais polipeptídeos MOD de IL-2 ou variante de afinidade reduzida dos mesmos). Em um exemplo específico, um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo TβRII de mascaramento compreende um polipeptídeo de TGF-β1 ou β3 compreendendo uma substituição em um ou mais, dois ou mais ou todos os três de Arg 25, Val 92 e/ou Arg 94 e compreende ainda um ou mais MODs selecionados independentemente. Em outro exemplo específico, um construto ou complexo de TGF-β mascarado com um polipeptídeo de TβRII de mascaramento compreende um polipeptídeo de TGF-β1 ou β3 compreendendo uma substituição em um ou mais, dois ou mais ou todos os três de Arg 25, Val 92 e/ou Arg 94, e compreende adicionalmente um ou mais MODs de IL-2 selecionados independentemente ou variantes de afinidade reduzidas dos mesmos.

G. Polipeptídeos do receptor TGF-β e outros polipeptídeos que se ligam e mascaram TGF-β

[00299] Em qualquer um dos polipeptídeos ou complexos polipeptídicos de TGF-β acima mencionados, o polipeptídeo que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β (um “polipeptídeo de mascaramento”) pode assumir uma variedade de formas, incluindo fragmentos de TβRI, TβRII, TβRIII e anticorpos anti TGF-β, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, Fab, anticorpos de cadeia única, etc).

1. Polipeptídeos de Receptores de TGF-β

[00300] O mascaramento de TGF-β em construtos e complexos de TGF-β mascarados pode ser realizado utilizando-se um fragmento do receptor TGF-β (por exemplo, as sequências de ectodomínio de TβRI, TβRII ou TβRIII) que compreende sequências polipeptídicas suficientes para se ligar a um polipeptídeo de TGF-β (por exemplo, TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3). Em uma modalidade, a sequência de mascaramento compreende todo ou parte do ectodomínio TβRI, TβRII ou TβRIII.

a. Receptor I de TGF-β (TβRI)

[00301] Em uma modalidade, a sequência polipeptídica que mascara TGF-β em um construto ou complexos de TGF-β mascarados pode ser derivada de um TβRI (por exemplo, isoforma 1 SEQ ID NO:114) e pode compreender todo ou parte do ectodomínio de TβRI (aas 34-126). Em alguns casos, um polipeptídeo de TβRI adequado para mascarar TGF-β compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 103 aas da seguinte sequência de ectodomínio aa TβRI: LQCFCHL CTKDNFTCVT DGLCFVSVTE TTDKVIHNSM CIAEIDLIPR DRPFVCAPSS KTGSVTTTYC CNQDHCNKIE LPTTVKSSPG LGPVEL (SEQ ID NO:115).

b. Receptor II de TGF-β (TβRII)

[00302] Em modalidades, a sequência polipeptídica que mascara TGF- β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser derivada de um TβRII (por exemplo, isoforma A SEQ ID NO: 116) e pode compreender a totalidade ou parte da sequência do ectodomínio TβRII (aas 24 a 177). Em uma modalidade, um polipeptídeo de isoforma A de TβRII adequado para mascarar TGF-β pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou pelo menos 154 aas da seguinte sequência de aa de ectodomínio de isoforma A de TβRII: IPPHVQK SDVEMEAQKD EIICPSCNRT AHPLRHINND MIVTDNNGAV KFPQLCKFCD VRFSTCDNQK SCMSNCSITS ICEKPQEVCV AVWRKNDENI TLETVCHDPK LPYHDFILED AASPKCIMKE KKKPGETFFM CSCSSDECND NIIFSEE (SEQ ID NO:117). A localização do resíduo de ácido aspártico correspondente a D118 na isoforma B está em negrito, sublinhado e itálico.

[00303] Em uma modalidade, a sequência polipeptídica que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser derivada da isoforma B de TβRII SEQ ID NO:118) e pode compreender a totalidade ou parte da sequência de ectodomínio de TβRII (aas 24 a 166). Na modalidade, um polipeptídeo da isoforma B de TβRII adequado para mascarar TGF-β compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 103 aas da sequência do ectodomínio da isoforma B de TβRII: IPPHVQKSVN NDMIVTDNNG AVKFPQLCKF CDVRFSTCDN QKSCMSNCSI TSICEKPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSSDEC NDNIIFSEEY NTSNPDLLLV IFQ (SEQ ID NO:119). Conforme discutido abaixo, qualquer um ou mais de F30, D32, S52, E55 ou D118 (em itálico e em negrito) pode ser substituído por um aminoácido diferente do aa de ocorrência natural nessas posições (por exemplo, alanina). Uma sequência polipeptídica que mascara TGF-β pode compreender o polipeptídeo da SEQ ID NO:119 com uma substituição de D118A ou D118R. Uma sequência que mascara TGF-β pode compreender o peptídeo da SEQ ID NO:119 com uma substituição de D118A ou D118R e uma ou mais de uma substituição de F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00304] Embora o ectodomínio de TβRII possa ser utilizado como um polipeptídeo de mascaramento, essa região da proteína carregou e os adesivos hidrofóbicos que podem levar a um pI nd desfavorável podem ser tóxicos para as células que expressam o polipeptídeo. Além disso, a combinação de um ectodomínio de TβRII com um polipeptídeo de TGF-β ativo pode resultar em um complexo que poderia combinar com o TβRI da superfície celular e causar a ativação desse receptor de sinalização (por exemplo, sinalização através da via Smad). Modificar as sequências de ectodomínio de TβRII usadas para mascarar TGF-β removendo ou alterando sequências envolvidas na associação de TβRI pode evitar a estimulação não intencional de células pelo TGF-β mascarado, exceto através de seu próprio complexo TβRI/TβRII heterodimérico de superfície celular. Modificações de TβRII também podem alterar (por exemplo, reduzir) a afinidade de TβRII para TGF-β (por exemplo, TGF-β3), permitindo assim o controle de desmascaramento de TGF-β e sua disponibilidade como uma molécula de sinalização. Construto ou complexos de TGF-β mascaradoscompreendendo peptídeos de TβR (por exemplo, TβRII) com a maior afinidade para TGF-β (por exemplo, TGF-β3) mascaram mais firmemente a sequência de TGF-β e exigem doses mais altas para alcançar o mesmo efeito. Em contraste, as substituições de aa em TβRII que diminuem a afinidade desmascaram o polipeptídeo de TGF-β e são biologicamente eficazes em doses mais baixas. Ver, por exemplo, o Exemplo 3.

[00305] Por conseguinte, onde é desejável bloquear/limitar a sinalização pelo polipeptídeo de TGF-β mascarado através de TβRI e/ou modificar (por exemplo, reduzir) a afinidade de um polipeptídeo de TβRII de mascaramento para TGF-β, uma série de alterações para TβRII podem ser incorporadas na sequência polipeptídica de TβRII. Modificações que podem ser feitas incluem as deleções acima mencionadas de 25 aminoácidos do N- terminal de 1 a 25 aa de comprimento (por exemplo, Δ14, Δ25) e/ou substituições em um ou mais de L27, F30, D32, S49, 150, T51, S52, I53, E55, V77, D118 e/ou E119. Algumas modificações específicas que resultam em uma redução na associação de TβRI com TβRII e afinidade reduzida para TGF-β incluem qualquer um ou mais de L27A, F30A, D32A, D32N, S49A, I50A, T51A, S52A, S52L, I53A, E55A, V77A, D118A, D118R, E119A e/ou E119Q com base na SEQ ID NO:119. Ver, por exemplo, J. Groppe et al. Mol Cell 29, 157-168, (2008) e De Crescenzo et al. JMB 355, 47-62 (2006). Ver Figura X para os efeitos dessas substituições nos complexos de TGF- β3-TβRII e TβRI-TβRII. Modificações de TβRII incluindo uma deleção e/ou substituições de Δ25 do N-terminal em F24 (por exemplo, uma substituição de F24A) bloqueiam substancial ou completamente o sinal através da via de sinalização SMAD canônica). Em um aspecto, o ácido aspártico na posição 118 (D118) da isoforma B de TβRII madura (SEQ ID NO:119) é substituído por um aminoácido diferente de Asp ou Glu, tal como Ala dando origem a uma substituição “D118A” ou por um Arg dando origem a uma substituição D118R. Os resíduos de Asp correspondentes a D118 são indicados nas SEQ ID NOs. 117-123 (com negrito e sublinhado na Figura 5B). As deleções do N- terminal de 1 a 25 aa de comprimento (por exemplo, deleções Δ25) e/ou substituições em F24 (por exemplo, uma substituição de F24A) podem ser combinadas com substituições de D118 (por exemplo, D118A ou D118R). As deleções do N-terminal de 1 a 25 aa de comprimento (por exemplo, deleções Δ25) e/ou substituições em F24 (por exemplo, uma substituição F24A) também podem ser combinadas com substituições em qualquer uma das substituições de L27, F30, D32, S49, 150, T51, S52, I53, E55, V77, D118 e/ou E119 (por exemplo, D118A) e particularmente qualquer uma das substituições específicas citadas para esses locais na SEQ ID NO:119, descrita acima para alterar a afinidade.

[00306] As deleções do N-terminal dos polipeptídeos de TβRII também podem resultar na perda de interações de TβRI e impedir que construtos e complexos de TGF-β mascarados compreendendo um polipeptídeo de TβRII atuem como um complexo constitutivamente ativo que engata e ativa a sinalização de TβRI. Uma deleção de 14 aa (Δ14) do polipeptídeo de TβRII reduz substancialmente a interação da proteína com TβRI, e uma deleção de Δ25 aa de TβRII parece anular completamente a interação com TβRI. As deleções do N-terminal também alteram substancialmente o pI da proteína, com o mutante do ectodomínio Δ14 TβRII exibindo um pI de cerca de 4,5-5,0 (por exemplo, cerca de 4,74). Por conseguinte, os construtos ou complexos de TGF-β podem compreender polipeptídeos de ectodomínio de TβRII (por exemplo, polipeptídeos da SEQ ID NOs: 117 ou 118) com deleções do N-terminal, tais como de 14 a 25 aas (por exemplo, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aa). As sequências de ectodomínio modificadas, incluindo aquelas que limitam as interações com TβRI, que podem ser utilizadas para mascarar polipeptídeos de TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado são descritas nos parágrafos a seguir.

[00307] Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 103 aas IPPHVQKSVN QKSCMSNCSI PKLPYHDFIL da sequência do ectodomínio da isoforma B de TβRII: NDMIVTDNNG TSICEKPQEV EDAASPKCIM AVKFPQLCKF CVAVWRKNDE CDVRFSTCDN NITLETVCHD KEKKKPGETF FMCSCSSDEC NDNIIFSEE (SEQ ID NO:120). Qualquer um ou mais de F30, D32, S52, E55 ou D118 (em itálico e em negrito) podem ser substituídos por um aminoácido diferente de aa de ocorrência natural nessas posições (por exemplo, alanina). Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β compreende o peptídeo da SEQ ID NO:120 com uma substituição de D118A. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO:120 com uma substituição de D118A e uma ou mais de uma substituição de F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00308] Combinações de deleções do N-terminal de TβRII, tais como de 14 a 25 aas (por exemplo, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aa), que bloqueiam a sinalização celular inadvertida devido ao complexo de TGF-β/TβRII mascarado interagindo com TβRI podem ser combinadas com outras substituições de ectodomínio de TβRII, incluindo aquelas em qualquer um ou mais de F30, D32, S52, E55 e/ou D118. A combinação de deleções e substituições garante que o construto ou complexo de TGF-β mascarado não cause sinalização celular, exceto através dos receptores de TβRI e TβRII ligados à membrana da célula.

[00309] Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 103 aas da sequência do ectodomínio da isoforma B de TβRII: TDNNG AVKFPQLCKF CDVRFSTCDN QKSCMSNCSI TSICEKPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSSDEC NDNIIFSEE (SEQ ID NO:121), que tem aas 1-14 (Δ14) deletados. Qualquer um ou mais de F30, D32, S52, E55 ou D118 (em itálico e em negrito) podem ser substituídos por um aminoácido diferente de aa de ocorrência natural nessas posições (por exemplo, alanina). Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β compreende o peptídeo da SEQ ID NO:120 com uma substituição de D118A. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO:121 apoiando uma substituição de D118A, e uma ou mais de uma substituição F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00310] Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 103 aas da sequência: QLCKF CDVRFSTCDN QKSCMSNCSI TSICEKPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSSDEC NDNIIFSEE (SEQ ID NO:122), que tem aas 1-25 (Δ25) deletados. Qualquer um ou mais de F30, D32, S52, E55 ou D118 (em itálico e em negrito) podem ser substituídos por um aminoácido diferente do aa de ocorrência natural nessas posições (por exemplo, alanina). Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO:122 com uma substituição D118A (mostrada como SEQ ID NO:123 na Figura 5B). Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende o peptídeo da SEQ ID NO:122 com uma substituição de D118A e uma ou mais de uma substituição de F30A, D32N, S52L e/ou E55A. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende o peptídeo da SEQ ID NO:122 (ver Figura 5B) com substituições D118A e F30A. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende o peptídeo da SEQ ID NO:122 (ver Figura 5B) com substituições de D118A e D32N. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende o peptídeo da SEQ ID NO:122 (ver Figura 5B) com substituições de D118A e S52L. Em uma modalidade, a sequência que mascara TGF-β em um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende o peptídeo da SEQ ID NO:122 (ver Figura 5B) com D118A e E55A.

c. Receptor III de TGF-β (TβRIII)

[00311] Em uma modalidade, a sequência polipeptídica que mascara TGF-β em um construto ou complexos de TGF-β mascarados pode ser derivada de um TβRIII (por exemplo, isoforma A SEQ ID NO:124 e isoforma B 125) e pode compreender todo ou parte de um ectodomínio do TβRIII (aas 27-787 da isoforma A ou 27-786 da isoforma B). Em alguns casos, um polipeptídeo do TβRIII adequado para mascarar TGF-β compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade da sequência de aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou 120 aas de uma isoforma de TβRIII A ou sequências de ectodomínio de isoforma B (por exemplo, fornecidas na Figura 5C como a SEQ ID NO:124 ou SEQ ID NO:125).

2. Anticorpos

[00312] Embora os polipeptídeos do receptor TGF-β (por exemplo, sequências do ectodomínio) possam funcionar para ligar e mascarar polipeptídeos de TGF-β em construtos ou complexos de TGF-β mascarados, outras sequências polipeptídicas (sequências de proteínas) que se ligam a sequências de TGF-β também podem ser empregadas como polipeptídeos de mascaramento. Entre as sequências polipeptídicas ou proteicas adequadas que podem ser usadas para mascarar TGF-β estão anticorpos com afinidade para TGF-β (por exemplo, anticorpos específicos para um ou mais de TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3) ou seus fragmentos, nanocorpos com afinidade para polipeptídeos TGF-β, e particularmente anticorpos anti-TGF-β de cadeia única (por exemplo, qualquer um dos quais pode ser humanizado). Alguns anticorpos, incluindo anticorpos scFV, que se ligam e neutralizam TGF-β foram descritos. Ver, por exemplo, US 9.090.685. Ao longo das modalidades e/ou aspectos da invenção descritos nesta divulgação, as sequências de TβR (por exemplo, TβRII) usadas para mascarar polipeptídeos de TGF-β podem ser substituídas por sequências de anticorpos de mascaramento (por exemplo, um scFV ou um nanocorpo) com afinidade para o polipeptídeo de TGF-β. Por exemplo, em cada um dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados na Figura 1 onde uma sequência de receptor TGF-β é usada para mascarar um polipeptídeo de TGF-β, o polipeptídeo do receptor pode ser substituído por um polipeptídeo de anticorpo de mascaramento (por exemplo, scFV ou um nanocorpo) com afinidade para o polipeptídeo de TGF-β.

[00313] Uma vantagem potencial de usar um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de cadeia única) como um polipeptídeo de mascaramento é a capacidade de limitá-lo à isoforma dos peptídeos de TGF-β a ser(em) mascarado(s). A título de exemplo, sequências de anticorpos de cadeia única baseadas em Metelimumabe (CAT192) direcionadas contra TGF-β1 (por exemplo, Lord et al., mAbs 10(3): 444-452 (2018)) podem ser usadas para mascarar essa isoforma de TGF-β quando presente em construtos ou complexos de TGF-β. Em outra modalidade, uma sequência de anticorpo de cadeia única específica para TGF-β2 é usada para mascarar essa isoforma de TGF-β quando presente em construtos ou complexos de TGF-β. Em outra modalidade, uma sequência de anticorpo de cadeia única específica para TGF-β3 é usada para mascarar essa isoforma de TGF-β quando presente em construtos ou complexos de TGF-β. Os anticorpos de cadeia única também podem ser específicos para uma combinação de isoformas de TGF-β (por exemplo, sequências do ectodomínio que aparecem em construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados do grupo que consiste em: TGF-β1 & TGF-β2; TGF-β1 & TGF-β3; e TGF-β2 & TGF-β3. Os anticorpos de cadeia única também podem ser pan específicos para sequências do ectodomínio de TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3 que aparecem em construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Ver, por exemplo, WO 2014/164709. Anticorpos e anticorpos de cadeia única que têm a especificidade e afinidade desejadas para isoformas de TGF-β podem ser preparados por uma variedade de métodos, incluindo hibridomas de triagem e/ou modificação (por exemplo, modificação combinatória) para a sequência de região variável de anticorpos que têm afinidade para uma sequência polipeptídica de TGF-β alvo.

[00314] Em uma modalidade, um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um anticorpo de cadeia única para mascarar uma sequência de TGF-β (por exemplo, uma sequência de TGF-β3). Numa tal modalidade, a sequência de aminoácidos de cadeia única é específica para o TGF-β3 estabelecido na SEQ ID NO:111 compreendendo uma substituição C77S (ver SEQ ID NO:112).

H. Ligantes

[00315] Conforme observado acima, um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode incluir uma sequência peptídica/polipeptídica ligante interposta entre quaisquer dois elementos de um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Embora o termo “ligante” seja empregado, as mesmas sequências descritas abaixo como ligantes também podem ser colocadas no terminal N e/ou C de um polipeptídeo de um construto ou complexo de TGF- β mascarado, por exemplo, como proteção contra degradação proteolítica.

[00316] Ligantes adequados (também referidos como “espaçadores”) podem ser prontamente selecionados e podem ser qualquer um de um número de comprimentos adequados, tais como de 1 aa a 25 aa, de 3 aa a 20 aa, de 2 aa a 15 aa, de 3 aa a 12 aa, de 4 aa a 10 aa, de 5 aa a 9 aa, de 6 aa a 8 aa ou de 7 aa a 8 aa. Um ligante adequado pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aa em comprimento. Um ligante adequado pode ter de 25 a 35 aa de comprimento. Um ligante adequado pode ter 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 aa de comprimento. Um ligante adequado também pode ter de 35 a 45 aa de comprimento. Um ligante adequado pode ter 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 aa de comprimento. Um ligante adequado pode ter de 45 a 50 aa de comprimento. Um ligante adequado pode ter 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aa de comprimento.

[00317] Os ligantes exemplificativos incluem aqueles que compreendem glicina ou uma sequência contendo poliglicina de cerca de 2 a cerca de 50 (por exemplo, 2-4, 4-7, 7-10, 10-20, 20-35 ou 35-50) resíduos de glicina contíguos; polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:126) e (GGGS)n (SEQ ID NO:127), em que n é um número inteiro de pelo menos um (por exemplo, 1-10, 10-20 ou 20-30); polímeros de glicina-alanina ou polímeros de alanina-serina (por exemplo, com um comprimento de 1-10, 10-20 ou 20-30aa); e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Podem ser usados polímeros de glicina e glicina- serina; Gly e Ser são relativamente desestruturados e, portanto, podem servir como uma cadeia neutra entre os componentes. Podem ser usados polímeros de glicina; a glicina avalia significativamente mais espaço phi-psi do que mesmo a alanina, e é muito menos restrita do que os resíduos com cadeias laterais mais longas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142, 1992). Os ligantes exemplificativos podem compreender sequências de aminoácidos incluindo, mas não se limitando a GGSG (SEQ ID NO:128), GGSGG (SEQ ID NO:129), GSGSG (SEQ ID NO:130), GSGGG (SEQ ID NO:131), GGGSG (SEQ ID NO:132), GSSSG (SEQ ID NO:133) e semelhantes. Ligantes exemplificativos podem compreender, por exemplo, GGSG (SEQ ID NO:134) que pode ser repetido 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dez vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GSSSS) (SEQ ID NO:135) que pode ser repetida 2, 3 ou 4 vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GSSSS) (SEQ ID NO:135) repetida quatro ou cinco vezes. Ligantes exemplificativos podem incluir, por exemplo, (GGGGS) (SEQ ID NO:136), que pode ser repetido 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dez vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS) (SEQ ID NO:136) uma vez ou repetida 2 vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS) (SEQ ID NO:136) repetida 3 ou 4 vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS) (SEQ ID NO:136) repetida 5, 6 ou 7 vezes. Em alguns casos, um ligante compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS) (SEQ ID NO:136) repetida 8, 9 ou 10 vezes.

[00318] Em alguns casos, um polipeptídeo ligante presente em um primeiro polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado inclui um resíduo de cisteína que pode formar uma ligação dissulfeto com um resíduo de cisteína presente em um segundo polipeptídeo do construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, por exemplo, um ligante adequado compreende a sequência de aminoácidos GCGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:137).

I. Construtos e complexos de TGF-β mascarados exemplificativos

[00319] Conforme discutido acima, em qualquer um dos construtos e complexos de TGF-β mascarados descritos na presente divulgação, o polipeptídeo de mascaramento que se liga e mascara as sequências polipeptídicas de TGF-β pode assumir uma variedade de formas. O peptídeo de mascaramento pode ser um anticorpo, fragmento de ligação de um anticorpo, um anticorpo de cadeia única ou porção do mesmo que se liga a TGF-β (por exemplo, um scFv) ou nanocorpo; qualquer um dos quais pode ser humanizado. O polipeptídeo de mascaramento também pode ser um fragmento de receptor TGF-β (por exemplo, as sequências de ectodomínio de TβRI, TβRII ou TβRIII) que compreende sequências polipeptídicas suficientes para se ligar a um polipeptídeo de TGF-β (por exemplo, TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3).

[00320] Em qualquer um dos construtos e complexos de TGF-β mascarados acima mencionados, a sequência polipeptídica de TGF-β empregada pode ser baseada em TGF-β1, TGF-β2 ou TGF-β3. Em uma modalidade, o polipeptídeo de TGF-β compreende uma sequência de TGF-β3. A sequência de proteína de TGF-β madura de comprimento total não é necessária nos construtos e complexos de TGF-β mascarados, apenas a porção de TGF-β necessária para interagir com o TβRII de superfície celular e permitir que os complexos de TGF-β mascarados com o TβRII de superfície celular recrutem TβRI e, assim, iniciem a sinalização (por exemplo, sinalização através das vias Smad e não-Smad).

[00321] Embora o polipeptídeo imunomodulador (MODs) não seja necessário para a distribuição de TGF-β mascarado ou sua capacidade de ativar células portadoras de TβRI e TβRII, conforme observado acima, a presença do MODs pode afetar substancialmente o resultado da ativação de células de TGF-β. Consequentemente, a incorporação dos MODs em qualquer um dos construtos e complexos de TGF-β mascarados acima mencionados pode ser usada para conduzir vários resultados, incluindo resultados terapêuticos, a partir do uso dos construtos e complexos de TGF-β mascarados descritos neste documento. Em uma modalidade, os MODs presentes em um construto ou complexo de TGF-β mascarado são selecionados do grupo que consiste em PD-L1, Fas-L, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-21, IL-23, e variantes de qualquer um dos mesmos, incluindo aqueles com afinidade reduzida para seu co-MOD.

[00322] Embora possa ser desejável incorporar os MODs em construtos e complexos de TGF-β mascarados, sua presença não é necessária em todos os casos, particularmente onde os construtos e complexos de TGF-β mascarados são administrados juntamente com outros materiais, incluindo citocinas (por exemplo, uma ou mais interleucinas, linfocinas, interferon, quimiocinas e/ou fator de necrose tumoral selecionados independentemente). Por exemplo, onde é desejável apoiar o desenvolvimento de células T CD8+ convencionais (ou a sobrevida de células T CD8+ de baixa afinidade) promovendo a expressão de timócitos do receptor de interleucina 7 (por exemplo, IL-7Ra), construtos e complexos de TGF-β mascarados sem um polipeptídeo do MOD (“MOD-less”) podem ser empregados. Me modo semelhante, onde é desejável promover o desenvolvimento de populações de células T que são induzidas por fortes ligantes agonistas, construtos e complexos de TGF-β mascarados contendo o MOD ou sem o MOD podem ser empregados para apoiar a sobrevida de Treg derivado do timo (tTreg), T natural killer invariante (iNKT) e precursores de células T CD8αα +.

[00323] A seguir estão exemplos não limitativos de construtos e complexos de TGF-β mascarados.

1. Construtos de TGF-β mascarados

[00324] No caso de construtos de TGF-β mascarados, todos os componentes (por exemplo, TGF-β, scaffold, um polipeptídeo de mascaramento, tal como uma sequência de TβRII e, opcionalmente, um ou mais MODs) fazem parte de uma única cadeia polipeptídica (ver, por exemplo, Figura 1, estrutura A). Em tal modalidade, o polipeptídeo de scaffold não forma um dímero ou estrutura de ordem superior com outros polipeptídeos de scaffold e, consequentemente, os construtos de TGF-β mascarados não estão na forma de homodímeros, heterodímeros ou estruturas de multímeros de ordem superior (trímeros, etc).

[00325] No caso do construto de TGF-β mascarado na Figura 1, Estrutura A, o polipeptídeo pode compreender, do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β. Tais construtos de TGF-β mascarados incluem aqueles em que: (i) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβR que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (ii) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβRII que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (iii) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβR que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (iv) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs variantes IL-2 de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβR que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (v) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβR que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β3; e uma sequência polipeptídica de TGF-β3; (vi) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβRII que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β3; e uma sequência polipeptídica de TGF- β3; (vii) o polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C: um ou mais MODs variantes IL-2 de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo de TβRII que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β3; e uma sequência polipeptídica de TGF- β3.

[00326] Em qualquer caso dos construtos de TGF-β mascarados descritos neste documento, a C77 da sequência polipeptídica de TGF-β pode ser substituída para impedir a dimerização (por exemplo, uma substituição de C77S) e o polipeptídeo de TGF-β pode compreender adicionalmente variações para reduzir sua afinidade pelo polipeptídeo de mascaramento de TβR (por exemplo, em um, dois ou todos os três de aas 25, 92 e/ou 94), juntamente com modificações nos MODs e nas sequências polipeptídicas de TβR. Exemplos de sequências polipeptídicas de TβR que podem ser incorporadas em construtos de TGF-β mascarados incluem polipeptídeos Δ14 ou Δ25 TβRII opcionalmente com uma substituição de D118A ou D118R para atenuar o acoplamento de TβRI. As variantes dos MODs são descritas juntamente com suas sequências polipeptídicas e são descritas acima modificações adicionais de TβRI, TβRII e TβRIII.

[00327] Em uma modalidade, um construto de TGF-β mascarado tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO:146 (Ver Figura 7A). Em uma modalidade, um construto de TGF-β mascarado tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO:147 (Ver Figura 7B). Em uma modalidade, um construto de TGF-β mascarado tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO157 (ver Figura 7G). Em uma modalidade, um construto de TGF-β mascarado tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO:158 (Ver Figura 7H). Em uma modalidade, um construto de TGF-β mascarado tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO:159 (Ver Figura 7I).

2. Complexos de TGF-β mascarados

[00328] Os complexos de TGF-β mascarados compreendem pelo menos dois polipeptídeos, um primeiro e um segundo polipeptídeos, cada um dos quais contém um polipeptídeo de scaffold que se associa a outro polipeptídeo de scaffold, juntando o primeiro e o segundo polipeptídeos em um complexo. Consequentemente, os complexos polipeptídicos de TGF-β formam homodímeros, heterodímeros ou estruturas multiméricas de ordem superior: (i) em um primeiro caso, o complexo de TGF-β mascarado compreende pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β, pelo menos um polipeptídeo que se liga a e mascara um ou mais polipeptídeos de TGF-β (por exemplo, uma sequência de mascaramento para cada sequência polipeptídica de TGF-β) e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold que pode dimerizar para formar um homodímero (por exemplo, um dímero simétrico) como na Figura 1, estrutura B. Em tais homodímeros, os polipeptídeos Ig Fc podem permitir a formação espontânea de ligações dissulfeto entre os polipeptídeos Ig Fc no scaffold de cada construto e podem incluir mutações (por exemplo, as mutações LALA discutidas neste documento) que reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular, por exemplo, apesar da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[00329] (ii) em um segundo caso, um complexo de TGF-β mascarado compreende (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β, pelo menos um polipeptídeo que se liga a, e mascara um ou mais polipeptídeos de TGF-β (por exemplo, uma sequência de mascaramento para cada sequência polipeptídica de TGF-β) e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β, pelo menos um polipeptídeo que se liga e mascara pelo menos um polipeptídeo de TGF-β e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold compreendendo uma contraparte à sequência de dimerização interespecífica do primeiro polipeptídeo; onde o primeiro e o segundo polipeptídeos formam um heterodímero através da interação das sequências de dimerização interespecíficas como na Figura 1, estrutura C.

[00330] (iii) em um terceiro caso, um complexo de TGF-β mascarado compreende (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β, pelo menos um polipeptídeo que se liga a, e mascara um ou mais polipeptídeos de TGF-β (por exemplo, uma sequência de mascaramento para cada sequência polipeptídica de TGF-β) e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo uma estrutura de scaffold compreendendo uma contraparte para a sequência de dimerização interespecífica do primeiro polipeptídeo e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs); onde o primeiro e o segundo polipeptídeos formam um heterodímero através da interação das sequências de dimerização interespecíficas como na Figura 1, estrutura F, e (iv) em um quarto exemplo, um complexo de TGF-β mascarado compreende (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica de TGF-β e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos um polipeptídeo que se liga e mascara pelo menos um ou mais polipeptídeos de TGF-β e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos imunomoduladores (MODs) agrupados em uma estrutura de scaffold compreendendo uma contraparte à sequência de dimerização interespecífica do primeiro polipeptídeo; onde o primeiro e o segundo polipeptídeos formam um heterodímero através da interação das sequências de dimerização interespecíficas como na Figura 1, estruturas D e E.

[00331] Em alguns casos, os complexos de TGF-β mascarados (Figura 1, estruturas B, C e F), a sequência compreendendo o polipeptídeo de TGF-β (o primeiro polipeptídeo) podem compreender, do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs; um polipeptídeo de scaffold (com ou sem uma sequência de ligação interespecífica); um polipeptídeo que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β; e uma sequência polipeptídica de TGF-β. O polipeptídeo que não contém uma sequência de TGF-β na Figura 1, estrutura F, (o segundo polipeptídeo) compreende um polipeptídeo de scaffold com uma sequência de ligação interespecífica e, opcionalmente, compreende um MOD no terminal N, terminal C ou ambos os terminais N e C.

[00332] Em alguns casos, os complexos de TGF-β mascarados na Figura 1, estruturas D e E, o polipeptídeo contendo a sequência polipeptídica de TGF-β (o primeiro polipeptídeo) podem compreender, do terminal N ao terminal C: um ou mais MODs opcionais; um polipeptídeo de scaffold (com sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF- β. O polipeptídeo que não contém uma sequência de TGF-β na Figura 1, estruturas D e E, (o segundo polipeptídeo) pode compreender, do terminal N ao terminal C: opcionalmente um ou mais MODs, um polipeptídeo de scaffold com uma sequência de ligação interespecífica e um polipeptídeo que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β. Embora não ilustrado na Figura 1, o primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência polipeptídica de TGF-β pode não compreender um ou mais MODs, e o segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de mascaramento pode compreender um ou mais MODs.

[00333] Os casos acima descritos de complexos de TGF-β mascarados incluem aqueles em que o primeiro polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C: (i) opcionalmente um ou mais MODs; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (ii) opcionalmente um ou mais MODs variante de afinidade reduzida ou em peso independentemente selecionado; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (iii) um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF- β1 ou 2; (iv) um ou mais MODs de variantes IL-2 de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (sem uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF-β; (v) um ou mais MODs de variante de afinidade reduzida ou em peso independentemente selecionados; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF- β3; (vi) um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou em peso selecionados independentemente; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF- β3; ou (vii) um ou mais MODs variantes IL-2 de afinidade reduzida ou em peso independentemente selecionados; um polipeptídeo de scaffold (com uma sequência de ligação interespecífica); e uma sequência polipeptídica de TGF-β3. Em cada caso, o segundo polipeptídeo compreende do terminal N ao terminal C um polipeptídeo de scaffold compreendendo a contraparte à ligação interespecífica (sequência de dimerização) do primeiro polipeptídeo seguido por um polipeptídeo TβR (por exemplo, um TβRII) que se liga e mascara o polipeptídeo de TGF-β do primeiro polipeptídeo. No caso de um complexo de TGF-β mascarado como na Figura 1, a estrutura F, um polipeptídeo de TβR (por exemplo, um TβRII) pode ser interposto entre o MOD N-terminal (se presente) e o scaffold do primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreende a contraparte à ligação interespecífica (sequência de dimerização) do primeiro polipeptídeo ao qual um ou mais MODs variantes de afinidade reduzida ou de peso independentemente selecionados (por exemplo, MODs de peso ou variante de IL-2) podem ser ligados nos terminais N ou C.

[00334] Em qualquer caso dos construtos de TGF-β mascarados descritos neste documento, a C77 da sequência polipeptídica de TGF-β pode ser substituída para impedir a dimerização (por exemplo, uma substituição da C77S) e o polipeptídeo de TGF-β pode compreender adicionalmente variações para reduzir sua afinidade pelo polipeptídeo de mascaramento de TβR (por exemplo, em um, dois ou todos os três de aas 25, 92 e/ou 94), juntamente com modificações nos MODs e nas sequências polipeptídicas de TβR. Sequências polipeptídicas de TβR exemplificativas que podem ser incorporadas em construtos de TGF-β mascarados incluem polipeptídeos Δ14 ou Δ25 TβRII opcionalmente com uma substituição de D118A. As variantes dos MODs são descritas juntamente com suas sequências polipeptídicas e são descritas acima modificações adicionais de TβRI, TβRII e TβRIII.

[00335] Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende polipeptídeos tendo as sequências estabelecidas na SEQ ID NO:148 e 149 (Ver Figura 7C). Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende polipeptídeos tendo as sequências estabelecidas na SEQ ID NO:150 e 151 (Ver Figura 7D). Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende polipeptídeos possuindo as sequências apresentadas na SEQ ID NO:152 e 153 (Ver FIG. 7E). Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende polipeptídeos tendo as sequências estabelecidas na SEQ ID NO:155 e 156 (Ver Figura 7F). Em uma modalidade, um complexo de TGF-β mascarado compreende polipeptídeos tendo as sequências estabelecidas na SEQ ID NO:148 e 160 (Ver Figura 7J).

J. ÁCIDOS nucleicos

[00336] A presente divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica construtos e complexos de TGF-β mascarados. Em alguns casos, o ácido nucleico é um vetor de expressão recombinante; assim, a presente divulgação fornece um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, o ácido nucleico é um vetor de expressão recombinante; assim, a presente divulgação fornece um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica construtos e complexos de TGF-β mascarados. A discussão, de ácidos nucleicos que se segue, refere-se a ácidos nucleicos que codificam construtos e complexos de TGF-β mascarados da presente divulgação.

Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos apresentadores de antígeno de cadeia única

[00337] Conforme descrito acima, um construto de TGF-β mascarado compreende uma única cadeia polipeptídica. Assim, a presente divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um construto de TGF-β mascarado de cadeia única. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um construto de TGF-β mascarado de cadeia única pode ser operacionalmente ligado a um/uns elemento(s) de controle de transcrição, por exemplo, um promotor.

Ácidos nucleicos que codificam complexos de TGF-β mascarados

[00338] Conforme observado acima, em alguns casos, um complexo de TGF-β mascarado compreende pelo menos duas cadeias polipeptídicas separadas (uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica). A presente divulgação fornece ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, as cadeias polipeptídicas individuais de um complexo de TGF-β mascarado são codificadas em ácidos nucleicos separados. Em alguns casos, todas as cadeias polipeptídicas de um construto ou complexo de TGF-β mascarado são codificadas em um único ácido nucleico. Em alguns casos, um primeiro ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado; e um segundo ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, o ácido nucleico único compreende uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro e o segundo polipeptídeos de um complexo de TGF-β mascarado, que pode estar operacionalmente ligado e sob o controle transcricional de um único promotor ou dois promotores selecionados independentemente.

Ácidos nucleicos separados que codificam cadeias polipeptídicas individuais de um construto ou complexo de TGF-β mascarado

[00339] Conforme observado acima, em alguns casos, as cadeias polipeptídicas individuais de um complexo de TGF-β mascarado são codificadas por ácidos nucleicos separados. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam as cadeias polipeptídicas separadas de um complexo de TGF-β mascarado estão operacionalmente ligadas a elementos de controle transcricional, por exemplo, promotores, tais como promotores que são funcionais em uma célula eucariótica, em que o promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível.

[00340] Por exemplo, a presente divulgação fornece um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico, em que o primeiro ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado e em que o segundo ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptídeo do complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos estão ligadas operativamente a elementos de controle transcricional. Em alguns casos, o elemento de controle transcricional é um promotor que é funcional em uma célula eucariótica. Em alguns casos, os ácidos nucleicos que estão presentes em vetores de expressão separados.

[00341] Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos estão ligadas operativamente a elementos de controle transcricional. Em alguns casos, o elemento de controle transcricional é um promotor que é funcional em uma célula eucariótica. Em alguns casos, os ácidos nucleicos que estão presentes em vetores de expressão separados.

Ácido nucleico que codifica dois ou mais polipeptídeos presentes em um complexo de TGF-β mascarado

[00342] A presente divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo sequências nucleotídicas que codificam pelo menos o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, onde um complexo de TGF-β mascarado inclui um primeiro, segundo e terceiro polipeptídeos, o ácido nucleico inclui uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro, segundo e terceiro polipeptídeos. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado codificam um sítio ou ligante clivável proteoliticamente interposto entre o primeiro polipeptídeo codificado e o segundo polipeptídeo. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado incluem um nucleotídeo que codifica um sítio interno de entrada de ribossomo (IRES) interposto entre o primeiro polipeptídeo codificado e o segundo polipeptídeo. Em alguns casos, as sequências nucleotídicas que codificam o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo de um complexo de TGF-β mascarado incluem uma sequência que codifica um sinal de salto de ribossomo (ou elemento hidrolase de ação cis, CHYSEL) interposto entre a sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptídeo e a sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptídeo.

[00343] Em alguns casos, o primeiro ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão recombinante, um mRNA, um RNA viral, etc.) compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma primeira cadeia polipeptídica de um complexo de TGF-β mascarado; e um segundo ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão recombinante, um mRNA, um RNA viral, etc.) compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma segunda cadeia polipeptídica de um complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, a sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptídeo, e a segunda sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptídeo, são, cada uma ligadas operacionalmente a elementos de controle transcricional, por exemplo, promotores, tais como promotores que são funcionais em uma célula eucariótica, em que o promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor indutível.

Vetores de Expressão Recombinantes

[00344] A presente invenção fornece vetores de expressão recombinantes compreendendo os ácidos nucleicos. Em alguns casos, o vetor de expressão recombinante é um vetor não viral. Em alguns casos, o vetor de expressão recombinante é um construto viral, por exemplo, um construto de vírus recombinante adeno-associado (ver, por exemplo, Patente US n.° 7078387), um construto recombinante adenoviral, um construto recombinante lentiviral, um construto recombinante retroviral, um vetor viral não integrante, etc.

[00345] Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, vetores virais (por exemplo, vetores virais baseados no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al, Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus da herpes simples; vírus da imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al, PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al, J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, Vírus da Leucemia Murina, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, tais como Vírus do Sarcoma de Rous, Vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário); e semelhantes. Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidos pelos versados na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis.

[00346] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um dentre numerosos elementos de controle de transcrição e de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, elementos pontecializadores da transcrição, terminadores da transcrição, etc, podem ser utilizados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).

[00347] Em alguns casos, uma sequência nucleotídica que codifica os polipeptídeos de construtos e complexos de TGF-β mascarados está operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle transcricional, tal como um promotor. O elemento de controle de transcrição pode ser funcional em uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero; ou uma célula procariótica (por exemplo, bacteriana ou célula de Archaea). Em alguns casos, uma sequência nucleotídica que codifica um RNA direcionado ao DNA e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está operativamente ligado a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência nucleotídica que codifica um RNA-DNA alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio em ambas as células procarióticas e eucarióticas.

[00348] Exemplos não limitantes de promotores eucarióticos adequados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles de citomegalovírus (CMV) precoce, timidina quinase do vírus de herpes simples (HSV), SV40 precoce e tardia, repetições terminais longas (LTRs) do retrovírus, e metalotioneína-I de camundongo. A seleção do vetor e promotor adequado é bem dentro do nível dos versados na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação de ribossomo para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão.

Preparação de células hospedeiras geneticamente modificadas que expressam construtos e complexos de TGF-β mascarados e purificação de construtos e complexos de TGF-β mascarados

[00349] A presente divulgação fornece uma célula hospedeira geneticamente modificada, em que a célula hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00350] As células hospedeiras adequadas incluem células eucarióticas, tais como células de levedura, células de insetos e células de mamíferos. Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula de uma linhagem celular de mamífero. Linhagens celulares de mamíferos adequadas incluem linhagens celulares humanas, linhagens celulares de primatas não humanos, linhagens celulares de roedores (por exemplo, camundongo, rato) e semelhantes. As linhagens celulares de mamíferos adequados incluem, mas não estão limitadas a células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC n° CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC n°s CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por exemplo, ATCC n°s CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC n°s CRL-1658), Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC n°s CCL10), células PC12 (ATCC n° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC n° CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC n° CCLI.3), células embrionárias de rim humano (HEK) (ATCC n° CRL1573), células HLHepG2 e semelhantes.

[00351] As células hospedeiras geneticamente modificadas podem ser usadas para produzir um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Por exemplo, uma célula hospedeira geneticamente modificada pode ser usada para produzir um complexo de TGF-β mascarado, ou um construto de TGF-β mascarado de cadeia única, introduzindo vetores de expressão, como os descritos acima, compreendendo sequências nucleotídicas que codificam os polipeptídeos em uma célula hospedeira, gerando, desse modo, a produção de uma célula hospedeira geneticamente modificada. A célula hospedeira pode expressar constitutivamente o construto ou complexo de TGF-β mascarado, ou expressá-lo em resposta à exposição a um indutor em que os promotores que conduzem a expressão são induzíveis (por exemplo, um promotor de CMV e um operon de resistência à tetraciclina induzido pela exposição à tetraciclina).

[00352] O construto ou complexo de TGF-β mascarado é obtido a partir das células, ou se os peptídeos são direcionados para a via secretora por incorporação de sequências de sinal, a partir do meio de cultura celular. A proteína pode ser purificada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, por exemplo, um ou mais de precipitação (por exemplo, sulfato de amônio ou etanol), focagem isoelétrica e um ou mais tipos de cromatografia. Métodos cromatográficos adequados incluem, mas não estão limitados a separação cromatográfica baseada em tamanho (por exemplo, exclusão de tamanho ou permeação de gel), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade. Quando o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica de imunoglobulina (por exemplo, como um scaffold), a proteína A ou proteína G pode ser usada para purificar por afinidade o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Na ausência de um polipeptídeo de imunoglobulina, o complexo pode ser purificado por afinidade usando um anticorpo dirigido a um polipeptídeo presente no construto ou complexo de TGF-β mascarado; ou alternativamente, por incorporação de uma tag de afinidade, tal como um epítopo myc (CEQKLISEEDL SEQ ID NO:154), tag “HIS” (para ligação de resina de íon metálico bivalente) ou uma tag “FLAG”. Uma etapa de purificação e/ou concentração que pode ser combinada com qualquer um dos métodos anteriores emprega membrana semipermeável de tamanho limitado (por exemplo, uma membrana de diálise ou célula de pressão), que pode ser usada para remover contaminantes tendo um peso molecular substancialmente diferente e/ou para concentrar a proteína purificada.

[00353] Em uma modalidade, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é expresso a partir de uma sequência de ácido nucleico introduzida em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula CHO) e direcionado para a via secretora, de modo que seja excretado da célula em seu meio de cultura (por exemplo, um meio livre de soro). O construto ou complexo de TGF-β mascarado é purificado a partir do meio de cultura celular usando cromatografia de afinidade sozinha ou em combinação com separação baseada em tamanho (por exemplo, separação cromatográfica ou de membrana baseada em tamanho). Em um exemplo específico de tal modalidade, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um scaffold de imunoglobulina (por exemplo, uma sequência polipeptídica de IgG) e a purificação é realizada por cromatografia de afinidade (por exemplo, proteína A ou G) sozinha ou em combinação com separação baseada em tamanho (cromatografia baseada em tamanho).

K. Composições

[00354] A presente divulgação fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um construto ou complexo de TGF-β mascarado. A presente divulgação também fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante.

1. Composições compreendendo um construto ou complexo de TGF-β mascarado

[00355] Uma composição da presente divulgação pode compreender, além de um construto de TGF-β mascarado da presente divulgação, um ou mais dentre: um sal, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc; um agente tamponante, por exemplo, um tampão Tris, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2- ácido etanossulfônico) (HEPES), ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES), sal sódico do ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES), 3-(N- Morfolino)ácido propanossulfônico (MOPS), N-tris[Hidroximetil]metil-3- ácido aminopropanossulfônico (TAPS), etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iônico tal como Tween-20, etc; um inibidor da protease; glicerol; e semelhantes.

[00356] A composição pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, uma variedade da qual é conhecida na técnica e não necessita de ser discutida em detalhes neste documento. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, têm sido amplamente descritos em várias publicações, incluindo, por exemplo, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 19aEd. (1995), or latest edition, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20a edição, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

[00357] Uma composição farmacêutica pode compreender: i) um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma composição farmacêutica da invenção será adequada para administração a um sujeito, por exemplo, será estéril. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica em questão será adequada para administração em um sujeito humano, por exemplo, em que a composição é estéril e está substancialmente livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas, ou em que tais pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas estão presentes a um nível dentro dos limites aceitáveis estabelecidos por uma agência reguladora aplicável, por exemplo, o USF&DA.

[00358] As composições de proteínas podem compreender outros componentes, tais como teores farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, magnésio, carbonato e semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponante, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, cloridrato, sais de sulfato, solvatos (por exemplo, sais iônicos mistos, água, orgânicos), hidratos (por exemplo, água) e semelhantes.

[00359] Por exemplo, as composições podem incluir solução aquosa, forma em pó, grânulos, comprimidos, pílulas, supositórios, cápsulas, suspensões, sprays e semelhantes. A composição pode ser formulada de acordo com as várias vias de administração descritas abaixo.

[00360] Quando um construto ou complexo de TGF-β mascarado é utilizado (por exemplo, introduzido em um sistema de cultura de células) ou administrado (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intralinfática e/ou intravenosa) como injetável diretamente em um tecido, uma formulação pode ser fornecida como uma forma de dosagem pronta para uso ou como forma não aquosa (por exemplo, um pó estável em armazenamento que pode ser reconstituído) ou forma aquosa, tal como líquido composto por carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formulações contendo proteína também podem ser fornecidas em uma forma que aprimora a meia-vida sérica da proteína do sujeito após a administração. Por exemplo, a proteína pode ser fornecida em uma formulação de lipossomas, preparada como um coloide, ou outras técnicas convencionais para estender a meia-vida sérica. Uma variedade de métodos está disponível para preparar lipossomas, conforme descrito em, por exemplo, Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, Patente US n.°s 4,235,871, 4,501,728 e 4,837,028. As preparações também podem ser fornecidas em formas de liberação lenta ou de liberação controlada.

[00361] Em alguns casos, uma composição compreende: a) um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e b) solução salina (por exemplo, NaCl a 0,9%). Em alguns casos, a composição é estéril. Em alguns casos, a composição é adequada para administração a um sujeito humano, por exemplo, onde a composição é estéril e está substancialmente livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas, ou onde tais pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas estão presentes em uma quantidade dentro dos limites aceitáveis. Assim, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo: a) um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e b) solução salina (por exemplo, NaCl a 0,9%), onde a composição é estéril e está substancialmente livre de pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas, ou onde tais pirogênios detectáveis e/ou outras toxinas estão presentes em uma quantidade dentro dos limites aceitáveis.

[00362] Outros exemplos de formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis isotônicas, antioxidantes, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, agentes de suspensão, solubilizantes, espessantes, estabilizantes e conservantes. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode estar presente em um recipiente, por exemplo, num recipiente estéril, tal como uma seringa. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de doses única ou de doses múltiplas, tais como, ampolas e frascos e podem ser armazenadas em uma condição de congelamento a seco (liofilizada), exigindo apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes da utilização. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.

[00363] A concentração de um construto ou complexo de TGF-β mascarado em uma formulação pode variar amplamente, como de menos de cerca de 0,1% (geralmente em ou pelo menos cerca de 2%) a até 20% a 50% ou mais em peso (por exemplo, de 0,1% a 1%, 1% a 5%, 5% a 10%, 10% a 20% ou 20% a 50% em peso) e será geralmente selecionado primariamente com base em volumes de fluido, viscosidades e fatores baseados no paciente, de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente.

[00364] A presente divulgação fornece um recipiente compreendendo uma composição, por exemplo, uma composição líquida. O recipiente pode ser, por exemplo, uma seringa, uma ampola e semelhantes. Em alguns casos, o recipiente é estéril. Em alguns casos, tanto o recipiente como a composição são estéreis.

2. Composições compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante

[00365] A presente divulgação fornece composições, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Uma ampla variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica e não necessita ser discutida em detalhes neste documento. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis, têm sido amplamente descritos em várias publicações, incluindo, por exemplo, A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al, eds, 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

[00366] Uma composição da presente invenção pode incluir: a) um ou mais ácidos nucleicos ou um ou mais vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um complexo ou construto TGF-β mascarado; e b) um ou mais dentre os seguintes: um tampão, um surfactante, um antioxidante, um polímero hidrofílico, uma dextrina, um agente quelante, um agente de suspensão, um solubilizante, um agente espessante, um estabilizador, um agente bacteriostático, um agente molhante e um conservante. Os tampões adequados incluem, mas não estão limitados a (tal como ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES), bis(2- hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano (BIS-Tris), ácido N-(2- hidroxietil)piperazina-N'3-propanossulfônico (EPPS ou HEPPS), glicilglicina, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES), ácido 3-(N- morfolino)propano sulfônico (MOPS), piperazina-N,N'-bis(ácido 2- etanossulfônico) (PIPES), bicarbonato de sódio, ácido 3-(N-tris(hidroximetil)- metil-amino)-2-hidroxi-propanossulfônico) TAPSO, ácido (N- tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanossulfônico (TES), N- tris(hidroximetil)metil-glicina (Tricina), tris(hidroximetil)-aminometano (Tris), etc). Sais adequados incluem, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.

[00367] Uma formulação farmacêutica pode incluir um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 99% (p/p) (por exemplo, 0,001-0,1, 0,1-1,0, 1,0-10, 10-20, 20-40, 40-80 ou 80-100 por cento p/p). Na descrição de formulações, abaixo, “ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da invenção” será entendido como incluindo um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da presente divulgação. Por exemplo, em alguns casos, uma formulação em questão compreende um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante.

[00368] Um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da invenção podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou associados de outra forma com outros compostos ou misturas de compostos; tais compostos podem incluir, por exemplo, lipossomas ou moléculas direcionadas ao receptor. Um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante da invenção pode ser combinado em uma formulação com um ou mais componentes que auxiliam na absorção, distribuição e/ou a absorção.

[00369] Um ácido nucleico ou uma composição do vetor de expressão recombinante da invenção pode ser formulado em qualquer uma das muitas possíveis formas de dosagem, tais como, mas, não se limitando aos comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. Um ácido nucleico ou uma composição do vetor de expressão recombinante da invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não-aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter adicionalmente substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizadores.

[00370] Uma formulação compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante da invenção pode ser uma formulação lipossomal. Conforme usado neste documento, o termo “lipossoma” significa uma vesícula composta de lipídeos anfifílicos dispostos em uma bicamada ou bicamadas esféricas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso que contém a composição a ser distribuída. Os lipossomas catiônicos são lipossomas positivamente carregados que podem interagir com moléculas de DNA carregadas negativamente para formar um complexo estável. Os lipossomas que são sensíveis ao pH ou negativamente carregados são acreditados aprisionar o DNA ao invés do complexo com ele. Tanto lipossomas catiônicos quanto não catiônicos podem ser utilizados para distribuir um ácido nucleico da invenção ou um vetor de expressão recombinante.

[00371] Os lipossomas também incluem os lipossomas “estericamente estabilizados”, um termo que, conforme usado neste documento, refere-se aos lipossomas que compreendem um ou mais lipídeos especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de vida de circulação aprimorado em relação aos lipossomas em que não possuem esses lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da parte da porção de lipídeo formadora de vesícula do lipossoma compreende um ou mais glicolipídeos, ou é derivatizado com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma fração de polietileno glicol (PEG). Os lipossomas e seus usos são descritos adicionalmente na Patente US n.° 6,287,860, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00372] As formulações e composições também podem incluir surfactantes. O uso de surfactantes em produtos farmacológicos, formulações e em emulsões é bem conhecido na técnica. Os surfactantes e seus usos são descritos adicionalmente na Patente US n.° 6,287,860.

[00373] Em uma modalidade, vários potencializadores de penetração são incluídos, para efetuar a distribuição eficiente de ácidos nucleicos. Além de ajudar a difusão de fármacos não-lipofílicos através das membranas celulares, os potencializadores de penetração também aprimoram a permeabilidade de fármacos lipofílicos. Os potencializadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco grandes categorias, isto é, surfactantes, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não-surfactantes não-quelantes. Os potencializadores de penetração e seus usos adicionais são descritos na Patente US n.° 6,287,860, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00374] As composições e formulações para a administração oral incluem pós ou granulados, micropartículas, nanopartículas, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas em gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificadores, auxiliadores dispersantes ou ligantes podem ser desejáveis. As formulações orais adequadas incluem aquelas em que um ácido nucleico antisense da invenção é administrado em conjunção com um ou mais surfactantes e quelantes potencializadores de penetração. Os surfactantes adequados incluem, mas não estão limitados aos ácidos graxos e/ou seus ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Os ácidos/sais biliares e ácidos graxos adequados e seus usos são adicionalmente descritos na Patente US n.° 6,287,860. Também são adequadas combinações de potencializadores de penetração, por exemplo, sais/ácidos graxos em combinação com sais/ácidos biliares. Uma combinação adequada exemplar é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros potencializadores de penetração incluem, mas sem limitação a éter polioxietileno-9-lauril e éter polioxietileno- 20-cetil. Potencializadores de penetração adequados incluem propileno glicol, dimetilsulfóxido, trietanoiamina, N,N-dimetilacetamida, N,N- dimetilformamida, 2-pirrolidona e derivados dos mesmos, álcool tetra- hidrofurfurílico e AZONE™.

L. Formulações

[00375] Formulações adequadas são descritas acima, onde as composições são de teor farmaceuticamente aceitável (por exemplo, as composições incluem um/uns excipientes farmaceuticamente aceitáveis e moléculas ativas). Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável; em alguns casos, o ácido nucleico é um mRNA. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o primeiro polipeptídeo de um construto ou complexo de TGF-β mascarado; b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o segundo polipeptídeo de um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e c) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, uma formulação adequada compreende: a) um primeiro vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de expressão que codifica o primeiro polipeptídeo de um complexo ou construtp de TGF-β mascarado; b) um segundo vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de expressão que codifica o segundo polipeptídeo de um complexo ou construtp de TGF-β mascarado; e c) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00376] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados estão descritos acima.

M. Métodos

[00377] Um construto ou complexo de TGF-β mascarado é útil para modular uma atividade de uma célula T. Assim, a presente divulgação fornece métodos de modulação de uma atividade de uma célula T, sendo que os métodos geralmente envolvem o contato de uma célula T alvo com um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

1. Métodos de modulação da atividade das células imunológicas, incluindo a geração, estimulação ou inibição de tipos específicos de células imunológicas.

[00378] A presente divulgação fornece um método para modular seletivamente a atividade das células que expressam TβRI e TβRII, sendo que o método compreende o contato da célula (por exemplo, células T, células B e células inatas, incluindo células exterminadoras naturais (NK), macrófagos, células dendríticas e granulócitos) com um construto ou complexo de TGF-β mascarado, onde o contato da célula T com um construto ou complexo de TGF-β mascarado modula seletivamente a atividade da célula T específica do epítopo. Em alguns casos, o contato ocorre in vitro. Em alguns casos, o contato ocorre in vivo. Em que a atividade das células (por exemplo, sinalização através de via canônica, vias não canônicas e/ou expressão gênica a jusante) sujeitas a um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser avaliada em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, sujeitos de células) que não foram expostos a TGF-β ou a um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00379] A presente divulgação fornece um método para reduzir o número e/ou a atividade de células T ou células B (por exemplo, células T autorreativas patogênicas e/ou células B autorreativas patogênicas); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, a um sujeito em necessidade do mesmo) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Em alguns casos, o método aumenta o número e/ou atividade de uma célula T reguladora (Treg), resultando em número e/ou atividade reduzida de células T ou células B (por exemplo, uma ou mais células T autorreativas e/ou uma ou mais células B autorreativas), em que a redução no número e/ou atividade de células T ou células B submetidas a um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados é avaliada em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, sujeitos de células) que não foram expostos a TGF-β ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00380] A administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente, pode afetar direta ou indiretamente várias populações de células. A título de exemplo, a administração de construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais MODs de IL-2 de tipo selvagem ou variante, pode estimular diretamente o desenvolvimento e/ou sobrevida de células Treg FoxP3+ (in vivo ou in vitro). Além de qualquer ação direta que um complexo de TGF-β/IL-2 tenha em várias células imunológicas, as células Treg resultantes podem suprimir as respostas imunes, por exemplo, bloqueando-se a indução da ativação de células T e/ou a fase efetora das respostas de células T, suprimindo a ativação de células B e/ou inibindo a diferenciação e/ou proliferação de células exterminadoras naturais.

a. Tregs (1) construtos ou complexos de tTregs, pTregs, iTregs e TGF-β compreendendo IL-2

[00381] A presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento (por exemplo, expansão) e/ou sobrevida de Treg derivada do timo (tTreg) e/ou Treg periférica (pTreg) (Tregs são células CD4+, FoxP3+ e CD25+ que podem suprimir células T autorreativas e células B); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um ou mais sujeitos em necessidade do mesmo) ou contatar células T CD4+ (por exemplo, células T CD4+ não expostas) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; (por exemplo, em cultura de tecidos, sangue ou em um local de tecido específico, como uma ferida). Um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados ou contatados no método podem compreender uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD IL-2 variantes. A administração ou contato pode ser realizado em conjunto com a administração ou contato das células com vitamina D (por exemplo, vitamina D3 ou um análogo da mesma), ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico) e /ou um inibidor do alvo de mamífero de rapamicina (mTOR) (por exemplo, rapamicina ou um análogo funcional da mesma, tal como sirolimus, everolimus ou temsirolimus). Consequentemente, a presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento e/ou sobrevida de células T reguladoras induzidas (iTregs), que são FoxpP3 +, FoxP3+ Treg derivada de timo (tTreg) e/ou FoxP3+ Treg periférica (pTreg), sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito em necessidade do mesmo) ou contatar células T CD4+ (por exemplo, células T CD4+ não expostas) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados que compreendem uma ou mais sequências polipeptídicas MOD IL-2 e/ou sequências polipeptídicas MOD IL-2 variantes, opcionalmente na presença de vitamina D ou um análogo do mesmo, ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido retinoico trans) ou um análogo do mesmo, e/ou rapamicina ou um análogo do mesmo. Os efeitos da administração ou tratamento com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados podem ser avaliados em relação ao valor da avaliação inicial (por exemplo, número de células antes do tratamento) ou em relação a um grupo de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que são combinados com um grupo de teste (por exemplo, de outra forma idêntico a), mas que não foram expostos a TGF-β ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00382] A presente divulgação fornece um método para aumentar a indução/proliferação de Tregs, manter Tregs e/ou sustentar sua função, sendo que o método compreende o contato de células T (por exemplo, células T CD4+ in vivo ou in vitro) com um ou mais construtos ou complexos de TGF- β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD IL-2 variantes. O contato aumenta a indução/proliferação de Tregs, mantém as Tregs e/ou mantém sua função em relação a um valor de avaliação inicial determinado antes do contato ou em relação a um grupo de controle de células idênticas que não foram contatadas com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A divulgação inclui e fornece construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD IL-2 variantes para uso no método. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 variantes têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas A, B ou C. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas IL- 2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 variantes têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas D ou E. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF- β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 variantes têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estrutura F.

[00383] A presente divulgação fornece um método para aumentar a indução/proliferação de Tregs, manter Tregs e/ou sustentar sua função, sendo que o método compreende o contato de células T (por exemplo, células T CD4+ in vivo ou in vitro) com um ou mais construtos ou complexos de TGF- β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD PD-L1 ou PD-L2 variantes. O contato aumenta a indução/proliferação de Tregs, mantém as Tregs e/ou mantém sua função em relação a um valor de avaliação inicial determinado antes do contato ou em relação a um grupo de controle de células idênticas que não foram contatadas com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A divulgação inclui e fornece construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes para uso no método. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas A, B ou C. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas D ou E. Em uma modalidade, os construtos ou complexos compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes tem a organização estrutural descrita na Figura 1 estrutura F. Construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes podem ser administrados com IL-2 (por exemplo, IL-2 recombinante, tal como Proleucina (aldesleucina)) para a indução/proliferação de Tregs (por exemplo, células Tbet+ FoxP3+ iTreg), mantendo Tregs e/ou sustentando sua função.

[00384] A presente divulgação fornece um método para aumentar a indução/proliferação de Tregs, manter Tregs (por exemplo, números de Tregs) e/ou sustentar sua função, sendo que o método compreende o contato de células T (por exemplo, células CD4+ in vivo ou in vitro) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 e/ou variante de IL-2 selecionadas independentemente e uma ou mais sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente. O contato aumenta a indução/proliferação de Tregs, mantém as Tregs e/ou mantém sua função em relação a um valor de avaliação inicial determinado antes do contato ou em relação a um grupo de controle de células idênticas que não foram contatadas com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A divulgação inclui e fornece construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou variantes de IL-2 MOD e uma ou mais sequências polipeptídicas de PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente em peso ou variantes para uso no método. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou variantes de IL-2 MOD e uma ou mais sequências polipeptídicas de PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas A, B ou C. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 e/ou variantes de IL-2 MOD selecionadas independentemente e uma ou mais sequências polipeptídicas de PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estruturas D ou E. Em uma modalidade, os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou variantes de IL-2 MOD e uma ou mais sequências polipeptídicas de PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente têm a organização estrutural descrita na Figura 1 estrutura F.

[00385] O contato de células T (por exemplo, células CD4+ não expostas) com construtos ou complexos de TGF-β mascarados (por exemplo, in vivo ou in vitro) compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente e/ou IL-2 MOD variante, sozinhas ou em combinação com uma ou mais sequências polipeptídicas MOD PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente podem aumentar a expressão de FoxP3 e indução de células Treg (por exemplo, células Tbet+ FoxP3+ iTreg). Da mesma forma, o contato de células T (por exemplo, células CD4+ não expostas) com construtos ou complexos de TGF-β mascarados (por exemplo, in vitro ou in vivo) compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) PD-L1 ou PDL2 selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 variantes, sozinhas ou em combinação com IL-2 (por exemplo, IL-2 humana recombinante) pode aumentar a expressão de FoxP3 e indução de células Treg (por exemplo, células Tbet+ FoxP3+ iTreg). Onde tanto IL-2 quanto PD-L1 ou PD-L2 são fornecidos às células, o contato pode reduzir a T reg endolisossomal asparaginil endopeptidase. A redução da asparaginil endopeptidase endolisossomal, que é responsável por desestabilizar Foxp3 em Tregs, resulta na manutenção de Tregs (por exemplo, iTregs) e sustenta sua função. Ver, por exemplo, Francsisco et al., J Exp. Med., 206(13) 3015-3029 (2018) e Stathopoulou et al. Immunity 49(2): 247-263 (2018). Consequentemente, onde os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendem IL-2 e PD-L1 ou PD-L2, o contato das células T pode resultar não apenas em números aumentados de Treg, mas também em estabilidade e função aumentadas dessas células.

[00386] Quando o contato de construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo sequências polipeptídicas MOD IL-2 (peso e/ou variante) e/ou PD-L1 e/ou PD-L2 (peso e/ou variante) ocorre in vivo (ou in vitro com as células tratadas administradas ao paciente), o contato pode constituir tratamento. Tais tratamentos resultam em níveis aumentados de células Treg (por exemplo, número total de iTregs ou sua fração em um tecido ou circulando no sangue) em um indivíduo ou população de indivíduos. O tratamento também pode resultar em níveis elevados de FoxP3 em Tregs.

[00387] Quando os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreenderem sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 em peso e/ou variantes em combinação com sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 e/ou PD-L2 em peso ou variantes, os níveis aumentados de células Treg (por exemplo, número total de iTregs ou sua fração em um tecido ou circulando no sangue) em um indivíduo ou população de indivíduos persistem por um período de tempo mais longo do que o observado ao tratar um indivíduo ou população de indivíduos (por exemplo, combinados para idade, sexo, peso e/ou estado de doença) com um construto ou complexo de TGF-β mascarado idêntico sem a(s) sequência(s) de PD-L1. O tratamento com construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 em peso e/ou variantes em combinação com sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 e/ou PD-L2 em peso ou variantes também pode resultar em níveis persistentemente elevados de FoxP3 em Tregs em relação aos níveis observados quando o tratamento é conduzido com um construto ou complexo de TGF-β mascarado idêntico que não possui sequências polipeptídicas de PD-L1. O tratamento com construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 em peso e/ou variante em combinação com sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 e/ou PD-L2 em peso ou variante também pode resultar em atividade reduzida de endopeptidase de asparaginil endolisossomal em células Treg em relação à atividade dessa enzima em células T de um indivíduo (ou grupo de indivíduos em média) que foram tratados com um construto ou complexo de TGF-β mascarado idêntico que não possui sequências polipeptídicas MOD modificadas de PD-L1.

[00388] O processo de contato de células T, com construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo peso e/ou sequências polipeptídicas MOD IL-2 sozinhas, ou em combinação com peso ou sequências polipeptídicas MOD PD-L1 variante e/ou PD-L2 (por exemplo, in vitro, ex vivio ou in vivo, como em um processo de tratamento de um indivíduo), pode compreender adicionalmente o contato da presença de células T da vitamina D, ou um análogo destas, ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido retinoico trans) ou um análogo destas, e/ou um inibidor de mTOR, como rapamicina ou um análogo destas). O contato nas presenças desses agentes pode aumentar o nível de Tregs (por exemplo, o número ou número relativo de Tregs em um indivíduo ou tecido devido à proliferação ou manutenção de células com o fenótipo Treg) em relação a um valor de avaliação inicial determinado antes do contato ou em relação ao valor determinado em um grupo de controle (por exemplo, um grupo de indivíduos) que não foram contatados com um ou mais construtos ou complexos de TGF- β mascarados. Quando grupos de controle de indivíduos são empregados, o indivíduo pode ser combinado para um ou mais de idade, sexo e peso. Os indivíduos também podem ser pareados por etnia, consumo de álcool e/ou tabagismo.

[00389] A presente divulgação fornece um método para aumentar o número de Tregs em um ou mais sujeitos (por exemplo, indivíduos ou pacientes), sendo que o método compreende administrar a um ou mais sujeitos, um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais sequências polipeptídicas MOD modificadas IL-2 selecionadas independentemente (por exemplo, uma, duas ou três), e/ou sequências polipeptídicas modificadas MOD IL-2 variantes e opcionalmente compreendendo uma ou mais sequências polipeptídicas MOD modificadas PD-L1 ou PD-L2 selecionadas independentemente ou variantes, onde a administração resulta em um aumento no número de Tregs em um ou mais sujeitos. Por exemplo, o número médio de Tregs (por exemplo, no sangue ou em um tecido, ou em uma localização tal como uma ferida) pode ser aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais de 10 vezes em relação ao número de Tregs no indivíduo antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação a um grupo de controle que não recebeu um ou mais construtos, ou complexos de TGF-β mascarados.

[00390] A presente divulgação fornece um método para aumentar o número de Tregs em um ou mais sujeitos (por exemplo, indivíduos ou pacientes), sendo que o método compreende administrar a um ou mais sujeitos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de PD-L1 e/ou PD-L2 selecionadas independentemente, ou variantes opcionalmente em combinação com IL-2 (por exemplo, IL-2 recombinante, tal como Proleucina (aldesleucina)), em que a administração resulta em um aumento no número de Tregs em um ou mais sujeitos. Por exemplo, o número médio de Tregs (por exemplo, no sangue ou em um tecido, ou em uma localização tal como uma ferida) pode ser aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais de 10 vezes em relação ao número de Tregs no indivíduo antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação a um grupo de controle que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados

b. Células T helper (i) Células Th9 e construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo IL-4

[00391] A presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento e/ou sobrevida de células Th9 derivadas do timo (células CD4+ caracterizadas pela expressão de CD4 e CCR6 e a falta de CCR4); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células T CD4+ (por exemplo, células T CD4+ ou células Th2 não expostas) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados ou contatados no método podem compreender uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-4 MOD selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas de IL-4 MOD variantes. Consequentemente, a presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento e/ou sobrevida de células Th9 compreendendo administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células T não expostas com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados que compreendem uma ou mais sequências polipeptídicas de IL-4 MOD e/ou sequências polipeptídicas de IL-4 MOD variantes, em que a administração resulta em um aumento no número de células Th9 no indivíduo. Por exemplo, o número de células Th9 (por exemplo, em cultura de tecidos, sangue ou em um local de tecido específico) pode ser aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais de 10 vezes.

(ii) Células Th17 e construtos ou complexos de TGF-β compreendendo IL-17

[00392] A presente divulgação fornece um método para estimular a produção de células Th17 (células T definidas por sua produção de IL-17), sendo que o método compreende a administração (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou o contato de células T CD4+ (por exemplo, células T CD4+ não expostas) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo pelo menos um polipeptídeo IL-6 ou IL-6 MOD variante (por exemplo, um, dois ou três polipeptídeos IL-6 e/ou IL-6 MOD variante). Por exemplo, o número de células Th17 (por exemplo, em cultura de tecidos, sangue ou em um local de tecido específico) pode ser aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais de 10 vezes em relação ao número presente antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação a um grupo de controle que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. O método pode ser útil para manter a função de barreira mucosa intestinal e pode ser necessário para proteção contra bactérias patogênicas (por exemplo, contra Citrobacter) e para recrutar neutrófilos e monócitos e neutrófilos para atacar e destruir fungos extracelulares (por exemplo, Candidamucocutânea).

(iii) Células Tfh e construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo IL-21 e IL-23

[00393] A presente divulgação fornece um método para estimular a produção de células T helper foliculares (Tfh) (células T que são definidas pela expressão de CXCR5), sendo que o método compreende a administração (por exemplo, a um sujeito com necessidade do mesmo) ou o contato de macrófagos com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três) independentemente selecionado de um polipeptídeo MOD de IL-21, um polipeptídeo MOD de IL-23, uma variante de uma IL-21 ou uma variante de um polipeptídeo MOD de IL-23. Por exemplo, o número de células Tft (por exemplo, em cultura de tecidos, sangue ou em um local de folículo linfoide) pode ser aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais de 10 vezes em relação ao número presente seja antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação a um grupo de controle que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. O método pode ser útil para apoiar o desenvolvimento de respostas de anticorpos específicos de antígeno.

c. Células T efetoras e construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo IL-7 (i) Células T IL-7 e CD8+

[00394] A presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento (compromisso de linhagem) e/ou sobrevida de células T CD4+ e/ou CD8+ (por exemplo, promovendo a expressão de timócitos da IL- 7R (por exemplo, IL-7Rα); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, a um sujeito com necessidade) ou contatar células T CD4+CD8+ precursoras com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados ou contatados no método podem compreender uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-7 MOD selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas de IL-7 MOD variantes. Consequentemente, a presente divulgação fornece um método para promover o desenvolvimento de células comprometidas com as linhagens CD4+ ou CD8+ (por exemplo, promovendo-se a expressão de timócitos da interleucina (IL)-7Rα), sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar precursores de células CD4 + e ou CD8+ (por exemplo, células T CD4+8+) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-7 MOD selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas de IL-7 MOD variantes; em que o desenvolvimento e/ou a sobrevida de células CD4+ e/ou CD8+ é avaliada pelo sangue periférico monitor ou números de células CD4+ e/ou CD8+ de tecido específico (por exemplo, timo). (2) IL-7 e células T de baixa afinidade

[00395] A presente divulgação fornece um método de regulação da homeostase de células T periféricas promovendo a sobrevida dependente de IL-7 de células T CD4+ e células T CD8+ com receptores de células T com baixa afinidade para peptídeos que são apresentados por proteínas MHC. Ver, por exemplo, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 e citações neste documento. O método pode operar controlando a expressão de IL-7Rα de timócitos. O método que promove a sobrevida dependente de IL-7 compreende administrar (por exemplo, a um sujeito em necessidade do mesmo) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados podem compreender uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-7 MOD selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas de IL-7 MOD variantes. Consequentemente, a presente divulgação fornece um método de regulação da homeostase de células T periféricas; sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-7 MOD selecionadas independentemente e/ou sequências polipeptídicas de IL-7 MOD variantes, em que a administração do construto ou complexo de TGF-β aumenta o número de células T CD4+ periféricas e células T CD8+ em um sujeito, ou grupo de sujeitos, em relação ao número dessas células antes da administração.

d. Construtos ou complexos de TGF-β mascarados e IL-10

[00396] A presente divulgação fornece um método de inibição de células linfoides inatas tipo 2 (células ILC2) (por exemplo, para suprimir asma e inflamação alérgica, ver, por exemplo, Rajas et al., J Allergy Clin Immunol, 139(5):1468 (2017); e Ogasawara, et al., J Allergy Clin Immunol, 141(3): 1147-1151 (2018)), usando um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois) polipeptídeo de IL-10 MOD de tipo selvagem ou variante independentemente selecionado (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente). Os polipeptídeos MOD de IL-10 variantes podem incluir a totalidade ou parte de um polipeptídeo de IL-10 monomérico (por exemplo, a totalidade ou parte da SEQ ID NO:50 ou 51 substituída por uma inserção de 5-7 aa na região de dobradiça entre as hélices D e E mencionadas acima). Ver, por exemplo., Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000). O método de inibição de células linfoides inatas tipo II compreendendo administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células linfoides inatas tipo II com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de IL-10 de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente. A inibição de células ILC2 é avaliada pela supressão da expressão de citocinas tipo 2 (por exemplo, IL-3 e/ou IL-13) por células ILC2 em relação seja à quantidade, se citocinas tipo 2 antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação à quantidade de citocinas tipo 2 em um grupo de controle (por exemplo, em células, tecido ou fluido corporal de um sujeito) que não foram expostos a TGF-β ou a um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00397] O TGF-β e a IL-10 têm papéis não redundantes na manutenção da homeostase gastrointestinal, com a IL-10 funcionando tanto a montante quanto a jusante do TGF-β. Por exemplo, a IL-10 pode induzir a expressão e secreção de TGF-β por células T de lâmina própria e atua cooperativamente com TGF-b para promover a diferenciação de células Treg. Consequentemente, a presente divulgação fornece métodos para manter a homeostase intestinal e a diferenciação de células Treg em um sujeito, compreendendo a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência de IL-10 em peso ou variante, ou uma sequência de IL-2 e IL-10 aa, uma ou ambas podendo ser uma sequência de peso ou variante selecionada independentemente. Ver, por exemplo, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 e citações neste documento.

[00398] Em alguns casos, como onde é desejável induzir tolerância, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois) polipeptídeos MOD de IL-10 de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente. Ver, por exemplo, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 306: G575-G581 (2014), e Levings et al. Int Arch Allergy Immunol. 129(4):263-76 (2002). Os polipeptídeos MOD de IL-10 variantes podem incluir a totalidade ou parte de um polipeptídeo de IL-10 monomérico (por exemplo, a totalidade ou parte da SEQ ID NO:50 ou 51 substituída por uma inserção de 5-7 aa na região de dobradiça entre as hélices D e E para formar um IL-10 monomérica ativa como mencionado acima). Consequentemente, a presente divulgação fornece métodos para induzir tolerância em um sujeito compreendendo administrar um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência de IL-10 em peso ou variante ou uma sequência polipeptídica de IL-2 e IL-10. Alternativamente, um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência de IL-10 em peso ou variante (por exemplo, IL-10 monomérica) podem ser administrados com (simultaneamente ou combinado) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência polipeptídica de IL-2 em peso ou variante.

e. Construtos ou complexos de TGF-β mascarados e FasL

[00399] Em alguns casos, como em que é desejável induzir tolerância ou suprimir células T efetoras, pelo menos um polipeptídeo MOD (por exemplo, um, dois ou três MODs selecionados independentemente) presente em um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, pode compreender um polipeptídeo de ligante Fas (FasL) ou uma variante de um polipeptídeo de ligante Fas. (ver, por exemplo, Qiu et. al. J Surg Res. 218:180-193 (2017). Conforme discutido acima, os polipeptídeos IL-10 ou IL-10 variantes também podem ser utilizados para induzir tolerância.

[00400] Consequentemente, a presente divulgação fornece métodos para induzir tolerância ou suprimir células T efetoras em um sujeito compreendendo administrar um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, compreendendo uma sequência polipeptídica FasL em peso ou variante, ou uma sequência polipeptídica IL-2 e uma sequência polipeptídica FasL. A presente divulgação também fornece indução de tolerância. Alternativamente, um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência FasL em peso ou variante podem ser administrados com (simultaneamente ou combinados) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência polipeptídica de IL-2 em peso ou variante.

f. Métodos de modulação de outras células

[00401] A presente divulgação fornece um método de suporte ao desenvolvimento e/ou sobrevida de células T exterminadoras naturais invariantes (iNKT); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células precursoras de células iNKT com um construto ou complexo de TGF-β mascarado, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente. Onde o desenvolvimento e/ou sobrevida é avaliado em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00402] A presente divulgação fornece um método de inibição de macrófagos (por exemplo, macrófagos ativados por um Ligante Toll Like Receptor ou estimulação de citocinas); sendo que o método compreende a administração (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou o contato de macrófagos com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante independentemente selecionados; em que a inibição é avaliada em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β e/ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A ativação e a inibição da ativação de macrófagos são avaliadas por métodos conhecidos na técnica, tais como a produção de óxido nítrico por macrófagos ativados.

[00403] O TGF-β inibe a produção de H2O2 pelos monócitos e é um quimioatrativo para monócitos que inibe a adesão à fibronectina. Ver, por exemplo, Warwick Davies e Cole, J Immunol. 155(6): 3186-3193 (1995). Consequentemente, a presente divulgação fornece um método de estimulação de monócitos (por exemplo, monócitos em repouso) para sofrer migração; sendo que o método compreende a administração (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou o contato de monócitos com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente; em que a estimulação é avaliada em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β e/ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A ativação e a inibição da ativação de monócitos são avaliadas por métodos conhecidos na técnica, incluindo medição da produção de H2O2 e adesão à fibronectina. A produção de H2O2 (por exemplo, em resposta a um estímulo de monócitos) pode ser diminuída em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes ou mais).

[00404] A presente divulgação fornece um método para alterar a migração de monócitos e/ou macrófagos do sangue periférico (por exemplo, avaliada por microscopia de time-lapse ou ensaio de câmara de Boyden) em tecidos (por exemplo, tecido lesionado ou inflamado) e/ou para aprimorar as propriedades adesivas de macrófagos e/ou monócitos; sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células mieloides com um construto ou complexo de TGF-β mascarado, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante independentemente selecionados; em que a migração e/ou propriedades adesivas são avaliadas em relação aos grupos de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Por exemplo, alguns casos de interação a curto prazo de células ou tecidos com TGF-β (por exemplo, TGF-β1) estimularam a migração de macrófagos ou monócitos, enquanto a exposição a longo prazo diminuiu sua migração. Ver, por exemplo, Kim et al., Blood 108:1821-1829 (2006), and Xu et al Bone Research, 6 (Article No. 2) (2018).

[00405] A presente divulgação fornece um método para induzir quimiotaxia (por exemplo, avaliada por microscopia de time-lapse ou ensaio de câmara de Boyden) e/ou aprimorar as propriedades adesivas de mastócitos; sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar mastócitos com um construto ou complexo de TGF-β mascarado, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante selecionados independentemente; em que a quimiotaxia e/ou propriedades adesivas são avaliadas em relação a grupos de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00406] A presente divulgação inclui e fornece métodos de modulação de células T auto reativas e/ou inflamatórias (por exemplo, células Th1, Th2, Th17 e/ou Th22). Os métodos compreendem a administração (por exemplo, em um sujeito com necessidade) ou o contato das células T (por exemplo, in vivo ou in vitro) com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem e/ou variante selecionados independentemente. Os construtos ou complexos de TGF-β que opcionalmente compreendem um ou mais MODs de tipo selvagem e/ou variante podem interagir diretamente com tais células T inflamatórias e/ou afetar indiretamente tais células através de moléculas liberadas (por exemplo, citocinas/interleucinas) ou através de outras populações de células. A título de exemplo, a administração de construtos ou complexos de TGF-β mascarados opcionalmente compreendendo um ou mais MODs de IL-2 de tipo selvagem e/ou variante (um complexo de TGF-β/IL-2) pode estimular diretamente o desenvolvimento e/ou sobrevida de células T reg FoxP3+ (in vitro ou in vivo). Além das interações diretas de complexos de TGF-β/IL-2 com células resultando em células T reg FoxP3+, as T regs resultantes podem influenciar outras células, como, por exemplo, bloqueando a indução da ativação de células T e/ou a fase efetora das respostas de células T, suprimindo a ativação de células B e inibindo a diferenciação e/ou proliferação de células exterminadoras naturais. Tais ações por T regs podem ser realizadas através de vários meios, incluindo, mas não se limitando a, produção de IL-10, TGF- β e/ou a ligação de CTLA-4 no T reg a B7 (B7-1 ou CD80 / B7-2 ou CD86) em células apresentadoras de antígeno, competindo assim com a coestimulação de CD28 dessas células. Por conseguinte, esta divulgação inclui e fornece métodos de modulação de células T autorreativas e células T inflamatórias pertencentes a linhagens como Th1, Th2, Th17, Th22 etc. As células autorreativas podem ser uma população de células T espectadoras (por exemplo, células espectadoras Th1, Th2 e/ou Th17). Por exemplo, na doença celíaca, as células T que são moduladas podem incluir células Th17 encontradas na mucosa intestinal, resultando em níveis reduzidos de expressão, secreção e/ou tecido mucoso de IL-17A, IL-17F, IL-21 e/ou IL-22.

[00407] A presente divulgação inclui e fornece um método para inibir a ação de células CD4+ Th1 (por exemplo, reduzir sua secreção de interferon y e/ou TNF) e, assim, a ativação de macrófagos (por exemplo, fagocitose e o envolvimento de macrófagos na hipersensibilidade tipo retardada ou “DTH” que é um componente da doença inflamatória, incluindo inflamação granulomatosa). O método compreendendo administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo), ou contatar células CD4+ Th1 com, um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante independentemente selecionados; em que a inibição da ação de células Th1 é avaliada pela produção de interferon y, e/ou TNF em relação a um grupo de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β e/ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00408] A presente divulgação inclui e fornece um método para inibir a ação (ativação) de células CD4+ Th2 (por exemplo, IgE reduzida, mastócitos e reações mediadas por eosinófilos); sendo que o método compreende administrar (por exemplo, em um sujeito com necessidade do mesmo) ou contatar células CD4+ Th2 com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, opcionalmente compreendendo um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais ou três ou mais) MODs de tipo selvagem ou variante independentemente selecionados; em que a inibição da ação de células Th2 (o grau de ativação de células Th2) é avaliada pela produção de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 em relação a um grupo de tratamento (por exemplo, células ou sujeitos) que não foram expostos a TGF-β e/ou um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

2. Métodos de distribuição seletiva de um polipeptídeo coestimulador

[00409] A presente divulgação fornece um método de distribuição de TGF-β em uma forma mascarada juntamente com um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais) MODs selecionados independentemente e/ou MODs variantes usando um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. A entrega de MODs a células compreendendo TβRs pode ser complicada devido às ações de interação de MODs com seus receptores (co-MODs) em células que contêm ou não contêm TβRs. Os construtos ou complexos de TGF-β mascarados podem ser direcionados às células variando o número de MODs e a afinidade para seus co-MODs correspondentes em relação à afinidade eficaz do polipeptídeo TGF-β mascarado para o TβR. A incorporação de MODs variantes com afinidade reduzida em construtos ou complexos de TGF-β mascarados permite que o polipeptídeo TGF-β influencie mais fortemente, ou mesmo domine, as interações de ligação. A incorporação de uma combinação de MODs variantes com afinidade reduzida (desde que ainda possam estimular seus co-MODs) e polipeptídeos TGF-β com afinidade relativamente forte para o TβR permite que os construtos e complexos de TGF-β mascarados compreendendo um ou mais MOD(s) sejam tendenciosos (ou mesmo seletivos) em sua ligação às células com ambos os TβRs e o(s) co-MOD(s) correspondente(s). Tal combinação também evita a estimulação fora do alvo da célula portadora dos co-MODs sem TβR.

[00410] A presente divulgação fornece a distribuição seletiva de um polipeptídeo TGF-β e pelo menos uma variante MOD seletivamente para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) expressando em sua membrana superficial um TβR (por exemplo, TβRII e/ou TβRI) e co-MODs correspondentes a pelo menos uma variante MOD. Quando usado neste contexto, “distribuição seletiva” significa que o MOD do construto ou complexo de TGF-β mascarado é distribuído a um co-MOD em um número maior de células que expressam um TβR (por exemplo, TβRII e/ou TβRI), isto é, as “células alvo”, do que as células que não compreendem um TβR, isto é, “células não alvo”.

[00411] Em vista do exposto, a presente divulgação fornece a distribuição de um polipeptídeo TGF-β e pelo menos uma variante MOD seletivamente para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) expressando em sua membrana superficial, um TβR (por exemplo, TβRII e/ou TβRI) e co- MODs correspondentes a pelo menos uma variante MOD; sendo que o método compreende: contatar uma população de células com uma quantidade de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos uma variante de afinidade reduzida MOD que é insuficiente para saturar as TβRs presentes nas células (por exemplo, ocupar menos de 70%, 60%, 50%, 40% ou 30% das TβRs presentes nas células); e permitir que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos uma variante de afinidade reduzida MOD interaja com as células (por exemplo, por um tempo suficiente para se ligar). Em tal método, a razão de (i) número de células que expressam tanto o TβR quanto um co-MOD ligado pelo construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos uma variante de afinidade reduzida MOD dividida pelo número de células que expressam o co-MOD ligado pelo construto ou complexo de TGF-β mascarado, compreendendo pelo menos uma variante MOD de afinidade reduzida é maior do que (ii) a razão do número de células que expressam tanto o TβR quanto um co-MOD ligado pelo construto ou complexo de TGF- β mascarado compreendendo o peso MOD dividido pelo número de células que expressam o co-MOD ligado pelo construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo o peso MOD.

[00412] A presente divulgação fornece a distribuição às células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) de um polipeptídeo TGF-β mascarado e pelo menos um polipeptídeo IL-2 MOD em peso e/ou variante, sendo que compreende o contato da célula alvo com um construto ou complexo de TGF- β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo IL-2 MOD em peso e/ou variante opcionalmente na presença de vitamina D, ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico) e/ou rapamicina. Em um caso, o polipeptídeo TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-2 em peso ou variante é distribuído na presença de qualquer um, quaisquer dois ou todos os três de vitamina D, ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico) e/ou rapamicina.

[00413] A presente divulgação fornece a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-6 de tipo selvagem e/ou variante.

[00414] A presente divulgação fornece a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quanto do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-7 de tipo selvagem e/ou variante.

[00415] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quanto um complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-10 de tipo selvagem e/ou variante

[00416] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quanto do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-15 de tipo selvagem e/ou variante.

[00417] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quanto do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-21 de tipo selvagem e/ou variante.

[00418] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quando do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de IL-23 de tipo selvagem e/ou variante.

[00419] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quanto do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de PD-L1 de tipo selvagem e/ou variante.

[00420] A presente divulgação proporciona a distribuição e, opcionalmente, a distribuição seletiva para células alvo (por exemplo, in vitro ou in vivo) tanto de um construto quando do complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um polipeptídeo MOD de FasL de tipo selvagem e/ou variante.

3. Métodos de tratamento ou profilaxia

[00421] A presente divulgação fornece métodos de tratamento e profilaxia, os métodos podem compreender o contato de uma população alvo de células de um indivíduo (por exemplo, in vitro ou in vivo) e/ou a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), ou um ou mais ácidos nucleicos ou vetores de expressão que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado, eficaz para modular seletivamente a atividade da população de células alvo e/ou para tratar o indivíduo. Quando as células alvo são tratadas separadamente do indivíduo (isto é, in vitro), todas ou uma porção das células ou sua progênie podem ser administradas ao indivíduo. Em alguns casos, um método de tratamento ou profilaxia compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um ou mais vetores de expressão recombinantes, compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, um método de tratamento ou profilaxia compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma ou mais moléculas de mRNA, compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em alguns casos, um método de tratamento ou profilaxia compreende contatar uma população alvo de células de um indivíduo (isto é, in vitro) com necessidade do mesmo com uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039) e, desse modo, formar uma população alvo de células em contato, sendo que o método compreende adicionalmente administrar toda ou parte da população alvo de células em contato (e/ou sua progênie) ao indivíduo. Em alguns casos, um método de tratamento ou profilaxia compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), ou uma composição farmaceuticamente aceitável, compreendendo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039). Condições que podem ser tratadas (por exemplo, para curar e/ou melhorar os sintomas) com uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039) incluem: condições associadas a um número insuficiente de células Treg ou células Treg insuficientemente ativas, doenças ou distúrbios autoimunes, reação(ões) alérgica(s), feridas (por exemplo, feridas dérmicas e/ou mucosas), e/ou queimaduras. Além disso, indivíduos submetidos a transplante de órgãos também podem se beneficiar do tratamento.

[00422] Método de tratamento ou profilaxia, compreendendo administrar em um indivíduo com um número insuficiente de células Treg FoxP3+ ou células Treg FoxP3+ insuficientemente ativas uma quantidade eficaz de um construto, ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039) e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende PSM-4033-4039. Em um caso, o construto ou complexo de TGF- β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD de IL-2 selecionadas independentemente ou IL-2 MOD variante. O construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado, com ou sem um IL-2 ou IL-2 MOD variante, podem ser administrados antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de qualquer uma ou mais de vitamina D (por exemplo, 1α,25-di-hidroxivitamina D3 ou 1α,25-di-hidroxicolcalciferol) ou um análogo de vitamina D, rapamicina e/ou um ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido retinoico trans).

[00423] Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo com uma doença ou distúrbio autoimune com necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente ou IL-2 variante (por exemplo, PSM-4033- 4039). Em um segundo caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-10 selecionadas independentemente ou IL-10 MOD variante. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende pelo menos uma sequência polipeptídica MOD IL-2 ou variante IL-2 selecionada independentemente e pelo menos uma sequência polipeptídica IL-10 ou variante IL-10 MOD selecionada independentemente. Em um segundo caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-10 selecionadas independentemente ou IL-10 MOD variante. Doenças autoimunes que podem ser tratadas com um método da presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a, doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante, encefalomielite autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, infertilidade autoimune associada, púrpura trombocitopênica autoimune, penfigoide bolhoso, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulonefrite crescente, glomerulonefrite proliferativa), doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis (MG), pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgar), anemia perniciosa, polimiosite, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso sistêmico (LES), vasculite e vitiligo. Em uma modalidade, a doença autoimune que pode ser tratada com um método da presente divulgação é T1D. Em uma modalidade, a doença autoimune que pode ser tratada com um método da presente divulgação é a doença celíaca. T1D e/ou doença celíaca também podem ser excluídos das doenças autoimunes sujeitas a tratamento com um método da presente divulgação.

[00424] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com uma deficiência em células Th17 (por exemplo, indivíduos incapazes de responder suficientemente a infecções bacterianas e/ou fúngicas no intestino) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-6 selecionadas independentemente ou IL-6 MOD variante. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo incapaz de responder suficientemente a infecções bacterianas e/ou fúngicas no intestino uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo um ou mais polipeptídeos de IL-6 e/ou IL-6 variante selecionados independentemente, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo um ou mais polipeptídeos IL-6 e/ou IL-6 variante selecionados independentemente.

[00425] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com uma deficiência em células Th9 (por exemplo, indivíduos incapazes de responder suficientemente a infecções por helmintos) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado suficiente para responder à infecção por helmintos. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-4 ou IL-4 MOD variante independentemente selecionadas. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo incapaz de responder suficientemente a infecções bacterianas e/ou fúngicas no intestino, uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo um ou mais polipeptídeos de IL-4 e/ou IL-4 variante independentemente selecionados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado, compreendendo um ou mais polipeptídeos de IL-4 e/ou IL-4 variante independentemente selecionados.

[00426] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com uma deficiência em células Tfh (por exemplo, indivíduos incapazes de produzir anticorpos de alta afinidade ou quantidades suficientes de anticorpos de alta afinidade), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado suficiente para aumentar a produção de anticorpos de alta afinidade. Em um caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-21, IL-23, IL-21 variante ou IL-23 MOD variante independentemente selecionadas. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo incapaz de produzir anticorpos de alta afinidade ou quantidades insuficientes de anticorpos de alta afinidade, uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo uma ou mais sequências polipeptídicas de IL-21, IL-23, IL-21 variante ou IL-23 MOD variante, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo uma ou mais sequências polipeptídicas de IL-21, IL-23, variante IL-21 ou IL- 23 MOD variante independentemente selecionadas.

[00427] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com atividade de células Th1 tendo excesso em relação a um grupo de controle (por exemplo, e indivíduo com níveis elevados de macrófagos ativados e/ou níveis elevados de interferon gama “IFN-Y” em um tecido alvo ou circulante), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo com níveis elevados de macrófagos ativados e/ou níveis elevados de interferon gama “IFN-Y” (por exemplo, circulando ou em um tecido alvo), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00428] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com atividade de células Th2 em excesso em relação a um grupo de controle (por exemplo, um indivíduo com níveis elevados de mastócitos ativados e/ou com níveis elevados de IgE que circulam ou localizam o tecido) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo com níveis elevados de mastócitos ativados e/ou com níveis elevados de IgE (circulante ou localizada no tecido) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00429] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com ativação conduzida por receptor de células T de células T autorreativas (ou células T de alta afinidade) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039) e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo com células T autorreativas uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033- 4039), ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00430] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo em que é desejável promover a sobrevida dependente de IL-7 de células T CD4+ e /ou CD8+ de baixa afinidade (por exemplo, por controle da expressão de IL-7Ra de timócitos), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-7 ou IL-7 MOD variante independentemente selecionadas. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo incapaz de manter suficientemente os níveis de células T CD4+ e /ou CD8+ de baixa afinidade, uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo um ou mais polipeptídeos de IL-7 e/ou IL-7 variante independentemente selecionados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado, compreendendo um ou mais polipeptídeos de IL-7 e/ou IL-7 variante independentemente selecionados.

[00431] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo a administração a um indivíduo em que é desejável promover a apoptose de células específicas (por exemplo, células cancerosas ou células cancerosas portadoras de um marcador específico, tal como antígenos de câncer 15-3, 2729, 125, antígeno carcinoembrionário, alfa-fetoproteína e/ou Beta 2- microglobulina), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039). Em um caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende um ou mais (por exemplo, um, dois ou três) em peso independentemente selecionados. Sequências polipeptídicas MOD do ligante Fas ou do ligante Fas variante.

[00432] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo em que é desejável induzir células iTreg (CD4+ FoxP3+) (por exemplo, indivíduos em que é desejável induzir tolerância periférica para suprimir ativamente as células T efetoras (T eff) e/ou inibir dano ao tecido imunomediado), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD de PD-L1 variante ou peso independentemente selecionados. Em outro caso, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD modificadas de PD-L1 independentemente selecionadas em peso e/ou variantes, e uma ou mais sequências polipeptídicas MOD modificadas de IL-2 em peso e/ou variantes. Em uma modalidade, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende (i) uma sequência polipeptídica MOD de PD-L1 variante ou peso independentemente selecionado e (ii) uma sequência MOD de IL-2 de peso ou variante. Ver, exemplo, Francisco et al., J. Exp. Med., 206(13): 3015-3029 (2009).

[00433] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo em que é desejável inibir células linfoides inatas tipo II (células ILC2) (por exemplo, para suprimir asma, reação alérgica e/ou inflamação alérgica) uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039) e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas MOD de IL-10 ou IL-10 variante independentemente selecionadas. O construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado, com ou sem um IL-10 ou IL-10 MOD variante, podem ser administrados antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um glicocorticoide (por exemplo, dexametasona, prednisona, etc), anti-histamina (por exemplo, difenidramina, clorfeniramina, etc) e/ou epinefrina.

[00434] Método de tratamento ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo com uma alergia, inflamação alérgica e/ou níveis elevados de IgE (circulante ou localizada no tecido), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) polipeptídeos MOD de IL-10 ou IL-10 variante independentemente selecionados, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Um método de tratamento ou profilaxia pode compreender administrar a um indivíduo com níveis elevados de IgE (circulante ou localizada no tecido), uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) IL-10 independentemente selecionado ou polipeptídeos de IL-10 MOD variante independentemente selecionados, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. O construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto, ou complexo de TGF-β mascarado, com ou sem um IL-10 ou IL-10 MOD variante, podem ser administrados antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um glicocorticoide (por exemplo, dexametasona, prednisona, etc), anti-histamina (por exemplo, difenidramina, clorfeniramina, etc) e/ou epinefrina. O TGF-β e a IL-10 atuam para suprimir a expressão do receptor de IgE de alta afinidade (Fc1RI) que ativa os mastócitos e a IL-10 atua adicionalmente para evitar a ativação excessiva de mastócitos e o desenvolvimento de inflamação crônica. Ver, por exemplo, Kennedy et al. Journal of Immunology, 180(5) 2848-2854 (2008).

[00435] Método ou profilaxia compreendendo administrar a um indivíduo diagnosticado com ou com esclerose múltipla, uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um exemplo, o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequências polipeptídicas de IL-10 ou IL-10 MOD variante independentemente selecionadas.

[00436] Método de tratamento de um indivíduo com pelo menos uma queimadura cutânea ou mucosa, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Em um caso, o método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) IL-10 independentemente selecionado ou polipeptídeos de IL-10 MOD variantes, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. As queimaduras podem ser queimaduras de primeiro, segundo ou terceiro grau.

[00437] Método de tratamento de um indivíduo com pelo menos uma ferida cutânea ou mucosa (uma abrasão, avulsão, incisão, laceração ou punção da epiderme ou mucosa), sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado para acelerar o fechamento da ferida (reduzir o tempo até o fechamento), reduzir o tempo de cicatrização ou reduzir a formação de cicatriz em relação a uma ferida não tratada. Em um caso, o método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) polipeptídeos de IL-10 ou IL-10 MOD variante independentemente selecionados, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado. Quando o construto ou complexo de TGF-β mascarado, com ou sem um polipeptídeo de IL-10 MOD, compreende o polipeptídeo de TGF-β1, sendo que o método pode adicionalmente compreender um ou mais dentre: o recrutamento de células inflamatórias no sítio da lesão; expressão de proteínas da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno (por exemplo, tipos I e/ou III), e/ou VEGF; contração de fibroblastos de estimulação para permitir o fechamento da ferida; expressão no sítio da ferida de integrinas, como β1, α5, αv e β5; e migração de queratinócitos. Quando o construto ou complexo de TGF-β mascarado, com ou sem um polipeptídeo de IL-10 MOD, compreende o polipeptídeo de TGF-β2, sendo que o método pode adicionalmente compreender um ou mais dentre: o recrutamento de fibroblastos e células imunológicas da circulação e das bordas da ferida para a área ferida; expressão de colágeno (por exemplo, tipos I e/ou III); e expressão de fibronectina. Ver, por exemplo, Pakyari et al Adv Wound Care, 2(5): 215-224 (2013). Em tais métodos, o construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser aplicado diretamente ou injetado na ferida.

[00438] Método de tratamento de um indivíduo com pelo menos uma ferida cutânea ou mucosa (uma abrasão, avulsão, incisão, laceração ou punção da epiderme ou mucosa), sendo que o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, TGF-β3) (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β3 mascarado para reduzir a formação de cicatriz em relação a uma ferida não tratada. Em um caso, o método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, TGF-β3) compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) polipeptídeos de IL-10 ou IL-10 MOD variante independentemente selecionados, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, TGF-β3). Em tais métodos, o construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, TGF-β3) pode ser aplicado diretamente ou injetado na ferida. Sem estar limitado pela teoria, pode ser entendido que o TGF-β3 reduz a deposição de colágeno tipo 1, enquanto promove a degradação do colágeno por MMP-9, levando à diminuição da formação de cicatrizes. Ver, por exemplo, Pakyari et al Adv Wound Care, 2(5): 215-224 (2013).

[00439] Método para facilitar o transplante de órgãos em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado para acelerar o fechamento da incisão (reduzir o tempo até o fechamento), reduzir o tempo de recuperação ou reduzir a formação de cicatriz em relação ao tempo médio até o fechamento, tempo de recuperação ou formação de cicatriz em indivíduos não tratados combinados para o tipo de transplante de órgãos, idade, sexo, hábitos de fumar e/ou índice de massa corporal. Em um caso, o método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) polipeptídeos de IL-10 ou IL-10 MOD variante independentemente selecionados, e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00440] Método de tratamento de um indivíduo com doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD, incluindo GVHD aguda), sendo que o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto ou complexo de TGF-β mascarado

[00441] Em qualquer um dos métodos anteriores, a menos que especificado de outra forma, o polipeptídeo de TGF-β de um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser um polipeptídeo de TGF-β1, TGF- β2 ou TGF-β3 ou uma variante do mesmo, conforme discutido na seção anterior (por exemplo, uma variante C77S de TGF-β3 ou uma variante de TGF-β1 ou TGF-β2 com uma dimerização polipeptídica de TGF-β limitante de mutação correspondente). Da mesma forma, o polipeptídeo que mascara o polipeptídeo de TGF-β pode ser selecionado dentre aqueles descritos acima (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, anticorpos de cadeia única ou fragmentos de ectodomínio de TβRI ou TβRII que se ligam a TGF- β).

[00442] Conforme observado acima, em alguns casos, na realização de um método de tratamento ou profilaxia em questão, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado a um indivíduo com necessidade do mesmo, como o polipeptídeo per se. Em outros casos, na realização de um método de tratamento ou profilaxia em questão, um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um construto ou complexo de TGF-β mascarado é/são administrado(s) a um indivíduo com necessidade do mesmo. Assim, em outros casos, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, um ou mais vetores de expressão recombinantes, é/são administrado(s) a um indivíduo com necessidade do mesmo.

N. Dosagens

[00443] Uma dosagem adequada pode ser determinada por um médico assistente ou outra equipe médica qualificada, com base em diversos fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o ácido nucleico ou polipeptídeo específico a ser administrado, sexo do paciente, tempo e via de administração, saúde geral, e outros fármacos sendo administradas concomitantemente. Um complexo ou construto de TGF-β mascarado pode ser administrado em quantidades entre 1 ng/kg de peso corporal e 20 mg/kg de peso corporal por dose, por exemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; entretanto, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplificativa são vislumbradas, especialmente considerando-se os fatores acima mencionados. Se o regime for uma infusão contínua, também pode ser na faixa de 1 μg a 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto. Um construto ou complexo de TGF-β mascarado pode ser administrado em uma quantidade de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, por exemplo, de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal, de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, de cerca de 10 mg/kg de peso corporal a cerca de 15 mg/kg de peso corporal, de cerca de 15 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, de cerca de 20 mg/kg de peso corporal a cerca de 25 mg/kg de peso corporal, de cerca de 25 mg/kg de peso corporal a cerca de 30 mg/kg de peso corporal, de cerca de 30 mg/kg de peso corporal a cerca de 35 mg/kg de peso corporal, de cerca de 35 mg/kg de peso corporal a cerca de 40 mg/kg de peso corporal, ou de cerca de 40 mg/kg de peso corporal a cerca de 50 mg/kg de peso corporal.

[00444] Em alguns casos, uma dose adequada de um complexo ou construto de TGF-β mascarado é de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 μg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 μg a 1 g por kg de peso corporal, a partir de 10 μg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 μg a 10 mg por kg de peso corporal, ou de 100 μg a 1 mg por kg de peso corporal. As pessoas versadas na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para a dosagem com base nos tempos de permanência medidos e nas concentrações do agente administrado nos fluidos corporais ou tecidos. Após o tratamento bem-sucedido, pode ser desejável que o paciente seja submetido a terapia de manutenção para evitar a recorrência do estado da doença, em que um construto ou complexo de TGF-β mascarado ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado de cadeia única) é administrado em doses de manutenção, variando de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, de 0,1 μg a 10 g por kg de peso corporal, de 1 μg a 1 g por kg de peso corporal, de 10 μg a 100 mg por kg de peso corporal, de 100 μg a 10 mg por kg de peso corporal ou de 100 μg a 1 mg por kg de peso corporal.

[00445] Os versados na técnica compreenderão prontamente que níveis de dose podem variar como uma função do construto ou complexo de TGF-β mascarado específico, a gravidade dos sintomas e a suscetibilidade do sujeito a efeitos colaterais. Dosagens preferenciais para um determinado composto são prontamente determináveis por pessoas versadas na técnica por uma variedade de meios.

[00446] Em alguns casos, doses múltiplas de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante são administradas. A frequência de administração de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante podem variar dependendo de qualquer um de uma variedade de fatores, por exemplo, gravidade dos sintomas, etc. Por exemplo, em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou vetores de expressão recombinantes administrados uma vez por mês, duas vezes por mês, três vezes por mês, a cada duas semanas (qow), uma vez por semana (qw), duas vezes por semana (biw), três vezes por semana (tiw), quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, a cada dois dias (qod), diariamente (qd), duas vezes por dia (qid) ou três vezes por dia (tid).

[00447] A duração da administração de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante, por exemplo, o período de tempo ao longo do qual um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado, pode variar, dependendo de qualquer um de uma variedade de fatores, por exemplo, resposta do paciente, etc. Por exemplo, um complexo ou construto de TGF-β mascarado, um ácido nucleico da presente divulgação, ou um vetor de expressão recombinante podem ser administrado ao longo de um período de tempo que varia de cerca de um dia a cerca de uma semana, de cerca de duas semanas a cerca de quatro semanas, entre cerca de um mês a cerca de dois meses, de cerca de dois meses a cerca de quatro meses, de cerca de quatro meses a cerca de seis meses, de cerca de seis meses a cerca de oito meses, de cerca de oito meses a cerca de 1 ano, de cerca de 1 ano a cerca de 2 anos, ou de cerca de 2 anos e cerca de 4 anos, ou mais.

O. Vias de administração

[00448] Um agente ativo (um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante) é administrado a um indivíduo usando qualquer método e via disponíveis adequados para distribuição do fármaco, incluindo métodos in vivo e in vitro, bem como vias sistêmicas e localizadas de administração.

[00449] Vias convencionais e farmaceuticamente aceitáveis de administração incluem aplicação intratumoral, peritumoral, intramuscular, intratraqueal, intracraniana, subcutânea, intradérmica, aplicação tópica, intravenosa, intra arterial, retal, nasal, oral e outras vias entéricas e parentéricas de administração. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do construto ou complexo de TGF-β mascarado e/ou do efeito desejado. Um construto ou complexo de TGF-β mascarado, ou um ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante, pode ser administrado em uma dose única ou em doses múltiplas.

[00450] Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via intravenosa. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via intramuscular. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via intralinfática. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado localmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via intratumoral. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado peritumoralmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via intracranialmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via cutânea. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado por via subcutaneamente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado a uma ferida (por exemplo, uma ferida dérmica ou mucosa). Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante é administrado ao tecido queimado (por exemplo, queimaduras dérmicas).

[00451] Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via intravenosa. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via intramuscular. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado localmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via intratumoralmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado peritumoralmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via intracranialmente. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via cutânea. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via sub cutânea. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado por via intralinfática. Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado a uma ferida (por exemplo, uma ferida dérmica ou mucosa). Em alguns casos, um construto ou complexo de TGF-β mascarado é administrado ao tecido queimado (por exemplo, queimaduras dérmicas).

[00452] Um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante pode ser administrado a um hospedeiro usando quaisquer métodos e vias convencionais disponíveis adequados para distribuição de drogas convencionais, incluindo vias sistêmicas ou localizadas. Em geral, as vias de administração contempladas para uso em um método incluem, mas não estão necessariamente limitadas a vias entéricas, parentéricas, cutâneas e inalatórias.

[00453] As vias parentéricas de administração diferentes de administração de inalação incluem, mas não são necessariamente limitadas a vias tópicas, transdérmicas, subcutâneas, intramusculares, intraorbitais, intracapsulares, intraespinhais, intraesternais, intratumorais, intralinfáticas, peritumorais e intravenosas, isto é, qualquer via de administração diferente daquela através do canal alimentar. A administração parentérica pode ser realizada para efetuar a distribuição sistêmica ou local de um construto ou complexo de TGF-β mascarado, um ácido nucleico ou um vetor de expressão recombinante. Quando a distribuição sistêmica for desejada, a administração tipicamente envolve administração tópica ou através da mucosa, invasiva ou absorvida sistemicamente de preparações farmacêuticas.

P. Sujeitos adequados para tratamento

[00454] Sujeitos adequados para tratamento com um construto ou complexo de TGF-β mascarado, por exemplo, PSM-4033-4039), tal como por um método descrito neste documento, incluem indivíduos (por exemplo, humanos) com uma doença autoimune, reações alérgicas, feridas (por exemplo, feridas dérmicas e/ou mucosas) e/ou queimaduras. Além disso, os sujeitos incluem indivíduos submetidos a transplante de órgãos. Além de humanos, os sujeitos incluem mamíferos não humanos incluindo, mas não se limitando a, caninos bovinos, caprinos, cercopitecinos, felinos, lapinos, lapinos, murinos, ovinos, suínos ou símios ou pacientes que precisam de tratamento.

[00455] Sujeitos (indivíduos) que têm uma doença ou condições autoimunes e são adequados para tratamento com um construto ou complexo de TGF-β mascarado (por exemplo, PSM-4033-4039), incluindo indivíduos que foram diagnosticados como tendo uma doença ou condição autoimune e indivíduos que foram tratados para uma doença ou condição autoimune, mas que não responderam ao tratamento. Doenças e condições autoimunes que podem ser tratadas com um método da presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a, doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante, encefalomielite autoimune, colite autoimune, gastrite autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, infertilidade autoimune-associada, pancreatite autoimune, retinopatia autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, urticária autoimune, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulonefrite crescente, glomerulonefrite proliferativa), doença de enxerto vs. hospedeiro (GVHD, incluindo GVHD aguda), doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, doença inflamatória intestinal, doença conectiva mista, esclerose múltipla, miastenia gravis (MG), pênfigo (por exemplo, pênfigo) vulgar, anemia perniciosa, polimiosite, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjoren, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), rejeição de transplante, vasculite por diabetes tipo 1 (T1D) e vitiligo. Em uma modalidade, a doença autoimune é T1D. Em uma modalidade, a doença autoimune é doença celíaca. Indivíduos com T1D e/ou doença celíaca podem ser excluídos dos sujeitos adequados para tratamento. Da mesma forma, T1D e/ou doença celíaca podem ser excluídos da doença autoimune sujeita a tratamento.

[00456] Em uma modalidade, as doenças e condições autoimunes que podem ser tratadas com um método da presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a artrite reumatoide (RA), psoríase/artrite psoriática, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, doença de Addison, doença de Graves, síndrome de Sjogren, tireoidite de Hashimoto, miastenia gravis, vasculite autoimune e anemia perniciosa.

[00457] Sujeitos que têm reações alérgicas não podem ser facilmente categorizados pelos alérgenos porque os alérgenos são muito numerosos para serem recitados. A título de exemplo, no entanto, os sujeitos (por exemplo, indivíduos previamente tratados por suas alergias ou que nunca foram tratados) que têm uma reação(ões) alérgica (s) incluem aqueles com reações a: amendoim e nozes, pólen de plantas, látex e semelhantes. Por exemplo, sujeitos com reações alérgicas a alérgenos de amendoim incluem aqueles com reações a proteínas Ara h 1 a 13 que vêm de sete famílias de proteínas, incluem aqueles em Ara h 1 (por exemplo, PGQFEDFF (SEQ ID NO:161), YLQGFSRN (SEQ ID NO:162), FNAEFNEIRR (SEQ ID NO:163), QEERGQRR (SEQ ID NO:164), DITNPINLRE (SEQ ID NO:165), NNFGKLFEVK (SEQ ID NO:166), GNLELV (SEQ ID NO:167), RRYTARLKEG (SEQ ID NO:168), ELHLLGFGIN (SEQ ID NO:169), HRIFLAGDKD (SEQ ID NO:170), IDQIEKQAKD (SEQ ID NO:171), KDLAFPGSGE (SEQ ID NO: 172), KESHFVSARP (SEQ ID NO:173), NEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSK (SEQ ID NO:174), Ara h 2 (por exemplo, HASARQQWEL (SEQ ID NO:175), QWELQGDRRC (SEQ ID NO:176), DRRCQSQLER (SEQ ID NO:177), LRPCEQHLMQ (SEQ ID NO:178), KIQRDEDSYE (SEQ ID NO:179), YERDPYSPSQ (SEQ ID NO:180), SQDPYSPSPY (SEQ ID NO:181), DRLQGRQQEQ (SEQ ID NO:182), KRELRNLPQQ (SEQ ID NO:183), QRCDLDVESG (SEQ ID NO:184), e Ara h 3 (por exemplo, IETWNPNNQEFECAG (SEQ ID NO:185), GNIFSGFTPEFLAQA (SEQ ID NO:186), VTVRGGLRILSPDRK (SEQ ID NO:187), DEDEYEYDEEDRRRG (SEQ ID NO:188). Ver, por exemplo, Zhou et al, (2013) Intl. J. of Food Sci. 2013: 8 páginas artigo ID 909140. Sujeitos com reações alérgicas também incluem aqueles com reações a proteínas de himenópteros (por exemplo, alérgenos em venenos de abelhas e vespas, como fosfolipase A2, melitina, “antígeno 5” encontrado no veneno de vespas e hialuronidases).

[00458] Sujeitos que têm feridas incluem indivíduos com abrasão, avulsão, incisão, laceração e punção da pele ou mucosa. Pode ser entendido que os sujeitos que têm transplante de órgãos, por sua natureza, terão um ou mais desses tipos de feridas.

V. CERTOS ASPECTOS

[00459] Certos aspectos, incluindo aspectos do assunto direcionados aos construtos ou complexos de TGF-β descritos acima, podem ser benéficos sozinhos ou em combinação, com um ou mais outros aspectos, tais como os citados abaixo direcionados aos construtos e complexos de TGF-β, seu método de fabricação e seus métodos de uso (por exemplo, como terapêutica).

[00460] 1. Um construto compreendendo como um primeiro polipeptídeo: i) uma sequência polipeptídica de scaffold; ii) uma sequência polipeptídica de TGF-β; iii) uma sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β); iv) opcionalmente, uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente; e v) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores); um construto compreendendo esses elementos sendo coletivamente referidos como um “construto de TGF-β mascarado”, em que a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β se ligam entre si (interagem entre si para mascarar a sequência polipeptídica de TGF-β). Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura A.

[00461] 2. O construto de TGF-β mascarado do aspecto 1, em que o primeiro polipeptídeo compreende, em ordem do terminal N ao terminal C: i) a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou ii) uma primeira sequência polipeptídica MOD, a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou iii) uma primeira sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente, uma segunda sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente (MODs em tandem), a sequência polipeptídica de scaffold, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β; em que o construto de TGF-β mascarado compreende opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores).

[00462] 3. O construto de TGF-β mascarado do aspecto 1 ou aspecto 2, em que o polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência de dimerização (ou multimeriação).

[00463] 4. O construto de TGF-β mascarado do aspecto 3, na forma de um homodímero do complexo de TGF-β mascarado, em que as sequências polipeptídicas de scaffold opcionalmente têm um ou mais (por exemplo, um, dois ou mais) anexos covalentes (por exemplo, ligações dissulfeto) entre si (por exemplo, em que uma primeira molécula do construto de TGF-β mascarado como o primeiro polipeptídeo é dimerizada com uma segunda molécula do construto de TGF-β mascarado como um segundo polipeptídeo através de interações covalentes ou não covalentes de suas sequências polipeptídicas de scaffold para formar um homodímero), opcionalmente em que os andaimes compreendem polipeptídeos Fc de Ig que incluem mutações (por exemplo, as mutações LALA) que reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular, por exemplo, citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura B.

[00464] 5. O construto de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-3, em que o polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência de dimerização interespecífica (por exemplo, uma sequência de dimerização que dimeriza preferencialmente com sua sequência de ligação interespecífica de contraparte em oposição à homodimerização). Ver, por exemplo, FIG 1, estruturas C e F.

[00465] 6. O construto de TGF-β mascarado do aspecto 5, compreendendo ainda um segundo polipeptídeo dimerizado com o primeiro polipeptídeo para formar um heterodímero de complexo de TGF-β mascarado; em que o segundo polipeptídeo compreende uma sequência polipeptídica de scaffold que compreende uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte para a sequência de ligação interespecífica do primeiro polipeptídeo; e em que a sequência de ligação interespecífica e a sequência de ligação interespecífica de contraparte interagem entre si no heterodímero.

[00466] 7. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 6, em que o segundo polipeptídeo compreende: (i) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (ii) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente (por exemplo, em tandem) e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (iii) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte e uma sequência MOD selecionada independentemente; ou (iv) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente (por exemplo, em tandem) e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; em que o primeiro e ou o segundo polipeptídeos compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores). Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura F.

[00467] 8. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 6 ou 7, em que o segundo polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C: (i) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (ii) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente (por exemplo, em tandem) e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; (iii) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte e uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente; ou (iv) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente (por exemplo, em tandem) e uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte em que o primeiro e/ou o segundo polipeptídeos compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores). Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura F.

[00468] 9. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 6, em que o segundo polipeptídeo compreende: i) opcionalmente, uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente; (ii) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte; iii) uma sequência polipeptídica de TGF-β; iv) uma sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β); e v) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores); em que a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β se ligam umas às outras (interagem com cada uma para mascarar a sequência polipeptídica de TGF-β). Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura C.

[00469] 10. O heterodímero do complexo de TGF-β mascarado do aspecto 9, em que o segundo polipeptídeo compreende, em ordem, do terminal N ao terminal C: i) a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β; ii) uma primeira sequência polipeptídica MOD, a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β; ou iii) uma primeira sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente, uma segunda sequência polipeptídica MOD selecionada independentemente, a sequência polipeptídica de scaffold a sequência de dimerização interespecífica da contraparte, a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β. Ver, por exemplo, FIG 1, estrutura C.

[00470] 11. Complexo que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo como um heterodímero (ou multímero), em que: (i) o primeiro polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, b) uma sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β), c) opcionalmente, uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores do primeiro polipeptídeo); (ii) o segundo polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte à sequência de dimerização interespecífica no primeiro polipeptídeo, b) uma sequência polipeptídica de TGF-β, c) opcionalmente, uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das sequências polipeptídicas anteriores do segundo polipeptídeo); um complexo compreendendo esses elementos sendo coletivamente referidos como um “complexo de TGF-β mascarado”, em que a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou sequência polipeptídica anti-TGF-β) e a sequência polipeptídica de TGF-β se ligam entre si (interagem entre si para mascarar a sequência polipeptídica de TGF-β); em que a sequência de ligação interespecífica e a sequência de ligação interespecífica da contraparte interagem entre si (por exemplo, se ligam de forma não covalente) no heterodímero; e em que o primeiro polipeptídeo TGF-β mascarado e/ou o segundo polipeptídeo compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente (por exemplo, entre qualquer uma das suas sequências polipeptídicas). Ver, por exemplo, FIG 1, estruturas D e E.

[00471] 12. O heterodímero do complexo de TGF-β mascarado do aspecto 11, em que o primeiro polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C: a) uma ou duas (ou mais) independentemente a) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente, uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β), ou b) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β); e o segundo polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C, uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente, uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica da contraparte e a sequência polipeptídica de TGF-β.

[00472] 13. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-12, em que a (s) sequência(s) polipeptídica (s) de scaffold são selecionadas do grupo que consiste em sequências polipeptídicas de Fc de Ig (por exemplo, sequências da região CH2-CH3); domínios da região 1 da cadeia pesada de Ig (CH1); regiões constantes da cadeia leve (“CL”) (por exemplo, uma região constante da cadeia Ig K (cadeia kappa) ou uma cadeia Ig À (cadeia lambda)); sequências polipeptídicas de zíper de leucina; sequências de pares de ligação Fos ou Jun; polipeptídeos de colecionina (por exemplo, proteínas semelhantes a ACRP30 ou ACRP30); domínios de bobina enrolada; e variantes de qualquer um dos anteriores (por exemplo, knob-in- hole e outras sequências interespecíficas na Tabela 1).

[00473] 14. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-13, em que a sequência polipeptídica de scaffold é selecionada do grupo que consiste em sequências polipeptídicas de Fc de Ig (sequências de imunoglobulina); sequências de cadeia pesada de Ig (por exemplo, sequências da região CH2-CH3); domínios da região 1 da cadeia pesada de Ig (CH1); regiões constantes da cadeia leve (“CL”) (por exemplo, uma cadeia Ig k (cadeia kappa) e variantes de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade, o polipeptídeo de scaffold é selecionado a partir de um domínio CH1 de Ig com substituições MD13 ou sequência de cadeia k de Ig com substituições MD13.

[00474] 15. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 14, em que as sequências de imunoglobulina compreendem uma sequência com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com qualquer uma das SEQ ID NOs: 68 a 83 ou 85-87. Ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2H e 2J-2K. (A sequência de imunoglobulina pode formar dímeros e, no caso da sequência de IgM, tal como na FIG. 2H, multímeros).

[00475] 16. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do 15, em que as sequências de imunoglobulina compreendem uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com qualquer uma das SEQ ID NOs: 68 a 83. Ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2H. (A sequência de imunoglobulina pode formar dímeros e, no caso da sequência de IgM, tal como na FIG. 2H, multímeros).

[00476] 17. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 4 e 6-16, em que as sequências polipeptídicas de scaffold têm uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) ligações covalentes entre si.

[00477] 18. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 17, em que pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) das uma ou mais ligações covalentes é uma ligação dissulfeto entre a sequência polipeptídica de scaffold do primeiro polipeptídeo e a sequência polipeptídica de scaffold do segundo polipeptídeo.

[00478] 19. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 14-18, em que as sequências de scaffold são sequências polipeptídicas da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig Fc) compreendendo regiões de imunoglobulina CH2-CH3 que são opcionalmente ligadas covalentemente por uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) ligações dissulfeto.

[00479] 20. O construto de TGF-β mascarado dos aspectos 5, em que o polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência de dimerização interespecífica selecionada do grupo que consiste em: i) uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina interespecífica (Ig); ii) um domínio Ig CH1; iii) uma região constante de cadeia leve de Ig (“CL”) (por exemplo, uma cadeia Ig K (cadeia kappa) ou uma região constante de cadeia Ig À (cadeia lambda)); e (iv) um polipeptídeo de um par de ligação Fos/Jun. Em uma modalidade, o polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência de dimerização interespecífica selecionada a partir de um domínio CH1 de Ig com substituições MD13 ou sequência de cadeia K de Ig com substituições MD13.

[00480] 21. O construto de TGF-β mascarado do aspecto 20, em que a sequência de ligação interespecífica compreende uma sequência com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com qualquer uma das SEQ ID NOs: 68 a 82 ou 85-87. Ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2G e 2J-2K.

[00481] 22. O complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 4 e 6-12, em que o polipeptídeo de scaffold do primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem uma sequência de dimerização interespecífica e um par de sequências de dimerização interespecífica de contraparte selecionado do grupo que consiste em: (i) sequências de cadeia pesada de imunoglobulina interespecífica (Ig) (por exemplo, regiões CH1- CH2 de cadeia pesada); (ii) um domínio CH1 de Ig e uma de suas regiões constantes de cadeia leve interespecífica (“CL”) (por exemplo, uma região constante da cadeia Ig k (cadeia kappa) ou uma região constante da cadeia Ig À (cadeia lambda)); (iii) pares de ligação Fos/Jun; e (iv) sequências da região 1 da cadeia pesada de Ig (CH1) e da região constante da cadeia leve (“CL”) (pares CH1/CL, como uma sequência CH1 pareada com uma sequência k ou À da região constante da cadeia leve de Ig). Em uma modalidade, o polipeptídeo de scaffold do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo compreende uma sequência de dimerização interespecífica e um par de sequências de dimerização interespecífica de contraparte que compreende um domínio CH1 de Ig com substituições MD13 e uma sequência de cadeia k de Ig com substituições MD13.

[00482] 23. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 22, em que as sequências polipeptídicas de scaffold têm uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) ligações covalentes entre si.

[00483] 24. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 22, em que pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) das uma ou mais ligações covalentes é uma ligação dissulfeto entre a sequência polipeptídica do primeiro polipeptídeo de scaffold do primeiro polipeptídeo e a sequência polipeptídica de scaffold do segundo polipeptídeo.

[00484] 25. O complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 22-24, em que as sequências de scaffold são sequências polipeptídicas da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig Fc) compreendendo regiões de imunoglobulina CH2-CH3 que são opcionalmente ligadas covalentemente por uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) ligações dissulfeto (entre os primeiro e o segundo polipeptídeos).

[00485] 26. O complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 22-25, em que a sequência de ligação interespecífica e/ou a sequência de ligação interespecífica da contraparte compreendem uma sequência com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com qualquer uma das SEQ ID NOs: 68 a 82 ou 85-87. Ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2G e 2J-2K.

[00486] 27. O complexo de TGF-β mascarado do 26, em que as sequências de imunoglobulina compreendem uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência aa com qualquer uma das SEQ ID NOs: 68 a 83. Ver, por exemplo, as FIGs. 2A-2H. (A sequência de imunoglobulina pode formar dímeros e, no caso da sequência de IgM, tal como na FIG. 2H, multímeros).

[00487] 27. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 150 aas contíguos (pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325 ou pelo menos 350 aas contíguos) ou todos os aas da sequência Fc de IgA representada na FIG. 2A (SEQ ID NO:68).

[00488] 28. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 150 aas contíguos (pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325 ou pelo menos 350 aas contíguos) ou todos os aas da sequência Fc de IgD representada na FIG. 2B (SEQ ID NO:69).

[00489] 29. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200 aas contíguos) ou todos os aas da sequência Fc de IgE representada na FIG. 2C (SEQ ID NO:70).

[00490] 30. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175 ou pelo menos 200 aas contíguos), ou todos os aas, do peso. Sequência polipeptídica Fc de IgG, tal como a sequência Fc de IgG1 representada na Figura 2D (SEQ ID NOs: 71-78).

[00491] 31. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, ou pelo menos 300) ou todos os aas da sequência polipeptídica Fc de IgG2 representada na FIG. 2E (SEQ ID NO:79).

[00492] 32. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225 aas contíguos) ou todos os aas da sequência Fc IgG3 representada na FIG. 2F (SEQ ID NO:80).

[00493] 33. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-27, compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold, opcionalmente compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e/ou uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte, em que a sequência polipeptídica de scaffold tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250) ou todos os aas da sequência polipeptídica Fc de IgG4 representada na FIG. 2G (SEQ ID NO:81 ou 82).

[00494] 34. O complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 27-33, compreendendo uma ou duas ligações dissulfeto intercadeias entre o primeiro e o segundo polipeptídeos (por exemplo, entre cistinas adjacentes às suas regiões de dobradiça das sequências IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00495] 35. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-34, em que um ou mais polipeptídeos de scaffold compreendem uma sequência polipeptídica de imunoglobulina (Ig) contendo uma ou mais substituições que limitam (por exemplo, reduzem) a ligação do polipeptídeo ao componente 1q (C1q) e/ou receptor Fc lambda (FcÀR) e/ou que reduz substancialmente ou elimina a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular através de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[00496] 36. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 35, em que cada polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência polipeptídica de imunoglobulina (Ig) compreendendo um polipeptídeo com pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 125 aas contíguos (pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200 ou pelo menos 220 aas contíguos) de peso. Sequência Fc de IgG1 (SEQ ID NO:71).

[00497] 37. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 36, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende uma substituição de qualquer um, dois ou mais de aas 234, 235, 236, 237, 238 e 239 (234-LLGGPS-239).

[00498] 38. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 36 ou 37, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende uma substituição em qualquer um, dois ou mais de N297, P331, D270, K322 e/ou P329.

[00499] 39. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 36-38, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende uma substituição de N297 (N77 da SEQ ID NO:71) por um aa diferente de asparagina (por exemplo, alanina para dar aN297A tal como na SEQ ID NO:74).

[00500] 40. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 36-38, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende uma substituição de L234 e/ou L235 (L14 e L15 na SEQ ID NO:71) por uma aa diferente de leucina (por exemplo, alanina, L234A e/ou L235A).

[00501] 41. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de 39, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende substituições de L234A e/ou L235A (ver, por exemplo, SEQ ID NO:75).

[00502] 42. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 36-41, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende P331 (P111 da SEQ ID NO:71)) substituído por um aa diferente de prolina (por exemplo, serina para uma substituição de P331S).

[00503] 43. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 36-38, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende substituições em L234 e/ou L235 e uma substituição de P331.

[00504] 44. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 43, em que a sequência polipeptídica de imunoglobulina compreende (i) substituições L234F, L235E e P331S ou (ii) L234A, L235A e P331S.

[00505] 45. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 20-44, compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica de um par de dimerização interespecífica selecionado do grupo que consiste em sequências KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s e A107 (ver, por exemplo, Tabela 1).

[00506] 46. O complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 4 e 22-44, em que a sequência de dimerização interespecífica e uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte são um par de sequências que são selecionadas do grupo que consiste em pares de sequências KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW- RVTs-s e A107 (ver, por exemplo, Tabela 1).

[00507] 47. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que um do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo compreendem uma sequência polipeptídica de IgG1 interespecífica (por exemplo, uma sequência da SEQ ID NO:71) compreendendo uma substituição T366Y e a outra uma substituição Y407T, ou substituições correspondentes em outras sequências de cadeia pesada de imunoglobulina interespecífica (por exemplo, sequências interespecíficas compreendendo sequências de cadeia pesada IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00508] 48. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que um do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo compreendem uma sequência polipeptídica de IgG1 interespecífica (por exemplo, uma sequência da SEQ ID NO:71) compreendendo uma substituição de T366W e as outras substituições de T366S, L368A e Y407V, ou substituições correspondentes em outras sequências de cadeia pesada de imunoglobulina interespecífica (por exemplo, sequências interespecíficas compreendendo sequências de cadeia pesada de IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00509] 49. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que um do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo compreendem uma sequência polipeptídica de IgG1 interespecífica (por exemplo, uma sequência da SEQ ID NO:71) compreendendo substituições Y349C, T366S, L368A, e Y407V e as outras substituições S354C e T366W, ou substituições correspondentes em outras sequências de cadeia pesada de imunoglobulina interespecífica (por exemplo, sequências interespecíficas compreendendo sequências de cadeia pesada IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[00510] 50. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que o primeiro polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com uma substituição de sequência T146W KiH e o segundo polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com substituições de sequência T146W, L148A e Y187V KiH, em que os scaffolds compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a pelo menos 170 (por exemplo, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos 227) aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71 e, opcionalmente, compreende substituições em um ou mais de: L14 e L15 (por exemplo, L14A/L15A “LALA” ou L14F/L15E); N77 (por exemplo, N77A); P111 (por exemplo, P111S); L131 (por exemplo, L131K); T146 (por exemplo, T146S); P175 (por exemplo, P175V); F185 (por exemplo, F185R); Y187 (por exemplo, Y187A); e K189 (por exemplo, K189Y) conforme numerado na SEQ ID NO:71.

[00511] 51. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que o primeiro polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com uma substituição de sequência T146W KiH e o segundo polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com substituições de sequência T146S, L148A e Y187V KiH, em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170 (por exemplo, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227) aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de FCY (N297, por exemplo, N297A ou N297G na numeração de Kabat). Ver, por exemplo, Figura 2D SEQ ID NOs: 77 e 78, 52. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que o primeiro polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com substituições T146W e S134C KiHs-s, e o segundo polipeptídeo compreende um scaffold IgG1 com substituições T146S, L148A, Y187V e Y129C KiHs-s, em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170 (por exemplo, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227) aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; com nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold do primeiro e segundo polipeptídeos compreendendo as substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou a substituição (N297 na numeração Kabat) N77 para remover a função efetora ao bloquear as interações com receptores de FCY (por exemplo, substituições N297A ou N297G na numeração Kabat).

[00512] 53. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 46, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos são selecionados de: um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições S144H e F185A e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições Y129T e T174F; um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições T130V, L131Y, F185A e Y187V e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições 130V, T146L, K172L e T174W; um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições K140D, D179M e Y187A e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições E125R, Q127R, T146V e K189V; um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições K189D e K172D e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições D179K e E136K; um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições K140E e K189W e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições Q127R, D179V e F185T; um primeiro polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições K140E, K189W e Y129C e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições Q127R, D179V, F185T e S134C; e um primeiro polipeptídeo compreendendo um andaime de IgG1 com substituições K150E e K189W e um segundo polipeptídeo compreendendo um scaffold de IgG1 com substituições E137N, D179V e F185T; em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 170 (por exemplo, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 210, pelo menos 220 ou todos os 227) aas contíguos da IgG1 da SEQ ID NO:71; e em que nenhuma, uma ou ambas as sequências aa de scaffold do primeiro e do segundo polipeptídeo compreendem substituições L14 e L15 (por exemplo, L234A e L235A “LALA” na numeração de Kabat) e/ou substituição N77 (N297 na numeração de Kabat) para remover a função efetora bloqueando interações com receptores FCY (por exemplo, substituições N297A ou N297G na numeração de Kabat).

[00513] 54. O construto de TGF-β mascarado dos aspectos 20, em que o polipeptídeo de scaffold compreende uma sequência de dimerização interespecífica selecionada do grupo que consiste em: (i) um domínio CH1 de cadeia pesada de Ig (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO:85); (ii) uma sequência de região constante de cadeia Ig K (por exemplo, SEQ ID NO:86); e (iii) uma sequência de região constante de cadeia Ig À (por exemplo, SEQ ID NO:87); em que o scaffold compreende uma sequência com pelo menos 80% (85%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 aas contíguos da SEQ ID NOs: 85, 86 e/ou 87, respectivamente. Ver Figuras 2J e 2K. O domínio Ig CH1 e/ou a sequência da cadeia Ig K opcionalmente compreendem suas respectivas substituições MD13.

[00514] 55. O complexo de TGF-β mascarado do aspecto 22, em que o polipeptídeo de scaffold de um do primeiro e do segundo polipeptídeos compreende um domínio CH1 da cadeia pesada de Ig (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO:85); e o outro do primeiro e do segundo polipeptídeos compreende uma sequência da região constante da cadeia Ig k (por exemplo, SEQ ID NO:86 compreendendo opcionalmente substituições MD13) ou uma sequência da região constante da cadeia Ig À (por exemplo, SEQ ID NO:87); em que os scaffold compreendem uma sequência com pelo menos 80% (85%, 90%. 95%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100) aas contíguos da SEQ ID NOs: 85, 86 e/ou 87, respectivamente. Ver Figuras 2J e 2K.

[00515] 56. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-56, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas ou pelo menos três) sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente.

[00516] 57. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 56, em que os ligantes independentemente selecionados têm um comprimento de cerca de 1 aa a cerca de 25 aa, (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aa de comprimento).

[00517] 58. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 56, em que os ligantes independentemente selecionados têm um comprimento de cerca de 25 a cerca de 35 aa de comprimento (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 aa de comprimento).

[00518] 59. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 56, em que os ligantes independentemente selecionados têm um comprimento de cerca de 35 a cerca de 50 aa de comprimento (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, 46, 47, 48, 49 ou 50, aa de comprimento).

[00519] 60. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 56 a 59, em que pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois ou pelo menos três) dos ligantes independentemente selecionados compreende um (i) glicina ou uma sequência contendo poliglicina com cerca de 2 a cerca de 50 resíduos de glicina contíguos; (ii) polímero de glicina-serina (por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:126), (GGGGS)n SEQ ID NO:136 e (GGGS)n (SEQ ID NO:127), em que n é um número inteiro de pelo menos um (por exemplo, 1-10, 10-20 ou 20-30); ou (iii) polímero de glicina-alanina ou polímero de alanina-serina (por exemplo, com um comprimento de 1-10, 10-20 ou 20-30 aa).

[00520] 61. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 56 a 59, em que pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois ou pelo menos três) dos ligantes independentemente selecionados compreende uma sequência aa selecionada do grupo que consiste em: GGSG (SEQ ID NO:128), GGSGG (SEQ ID NO:129), GSGSG (SEQ ID NO:130), GSGGG (SEQ ID NO:131), GGGSG (SEQ ID NO:132), GSSSG (SEQ ID NO:133), GSGS (SEQ ID NO:134), GSSSSS (SEQ ID NO:135), GGGGS SEQ ID NO:136 e semelhantes.

[00521] 62. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 56 a 59, em que pelo menos um dos ligantes independentemente selecionados compreende um resíduo de cisteína (por exemplo, uma sequência aa de ligante GCGASGGGGSGGGGS SEQ ID NO:137) que pode ou forma uma ligação dissulfeto com um resíduo de cisteína presente em um segundo polipeptídeo (por exemplo, em um ligante do segundo polipeptídeo) do construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00522] 63. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente são selecionadas do grupo que consiste em: PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL- 6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 sequências polipeptídicas modificadas e variantes de qualquer uma destas (por exemplo, variantes com afinidade reduzida para seu receptor em relação ao peso correspondente. sequência polipeptídica MOD).

[00523] 64. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente são selecionadas do grupo que consiste em: PD-L1, FAS-L, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-10, IL-21, IL-23 MOD sequências polipeptídicas modificadas e variantes de qualquer uma delas (por exemplo, variantes com afinidade reduzida para seu receptor em relação ao peso correspondente. sequência polipeptídica MOD).

[00524] 65. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente são selecionadas do grupo que consiste em: sequências polipeptídicas MOD PD- L1, FAS-L, IL-2, IL-10 e variantes de qualquer uma destas (por exemplo, variantes com afinidade reduzida para seu receptor em relação ao peso correspondente. sequência polipeptídica MOD).

[00525] 66. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) das sequências polipeptídicas MOD é uma sequência polipeptídica MOD de IL-2 ou sequência polipeptídica MOD de IL-2 variante: (i) ter pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos da SEQ ID NO:9; ou (ii) ter pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos da SEQ ID NO:13-27.

[00526] 67. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequências polipeptídicas MOD selecionadas do grupo que consiste em sequências polipeptídicas MOD PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 e variantes de qualquer uma destas (por exemplo, variantes com afinidade reduzida para seu receptor em relação ao peso correspondente. sequência polipeptídica MOD).

[00527] 68. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 de tipo selvagem ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD PD-L1 ou PD-L2 ou sequência polipeptídica MOD PD-L1 ou PD-L2 variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor PD1 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00528] 69. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 de tipo selvagem ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica FAS-L MOD ou sequência polipeptídica FAS-L MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor Fas em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00529] 70. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 de tipo selvagem ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-1 ou sequência polipeptídica MOD IL-1 variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-1 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00530] 71. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-4 MOD ou sequência polipeptídica de IL-4 MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-4 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00531] 72. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-6 MOD ou sequência polipeptídica de IL-6 MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-6 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00532] 73. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-7 MOD ou sequência polipeptídica de IL-7 MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-7 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00533] 74. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-10 MOD ou sequência polipeptídica de IL-10 MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-10 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00534] 75. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-15 MOD ou sequência polipeptídica de IL-15 MOD variante (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-15 em relação à sequência de tipo selvagem correspondente).

[00535] 76. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-2 ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-21 (por exemplo, uma sequência de SEQ ID NO:58 ou 60) ou variante IL-21 (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-21 em relação à sequência de peso correspondente) sequência polipeptídica MOD.

[00536] 77. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 62, em que uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente compreendem: (i) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) Sequência polipeptídica MOD IL-2 (por exemplo, compreendendo a sequência da SEQ ID NO:9) ou sequência polipeptídica MOD IL-2 variante (por exemplo, sequência polipeptídica MOD IL-2 variante do aspecto 66); e (ii) pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica IL-23 MOD (por exemplo, uma sequência de SEQ ID NO:63 ou 65) ou variante IL-23 (por exemplo, com afinidade reduzida para o receptor de IL-23 em relação à sequência de peso correspondente) sequência polipeptídica MOD.

[00537] 78. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 63 a 77, em que quando o polipeptídeo/complexo polipeptídico de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante, o polipeptídeo IL-MOD variante (por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:9) compreende uma substituição em qualquer um dentre dois ou todos de N88, F42 e/ou H16.

[00538] 79. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 78, em que pelo menos uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreende uma substituição de F42A, F42T, H16A ou H16T.

[00539] 80. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 78, em que pelo menos uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreende: substituições (i) F42A e H16A; (ii) F42T e H16A; (iii) F42A e H16T; ou (iv) F42T e H16T.

[00540] 81. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 78, em que pelo menos uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreende: substituições (i) N88R, F42A e H16A; (ii) N88R, F42T e H16A; (iii) N88R, F42A e H16T; ou (iv) N88R, F42T e H16T.

[00541] 82. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 81, em que a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β (“TβR”) que compreende um fragmento de ectodomínio de um TβR tipo I (TβRI), tipo II (TβRII) ou tipo III (TβRIII).

[00542] 83. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou 154) de aas contíguos do ectodomínio da isoforma A de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:117.

[00543] 84. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140 ou 143) de aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:119.

[00544] 85. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140 ou 143) de aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:120.

[00545] 86. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência do ectodomínio TβRII compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência polipeptídica da isoforma B de TβRII que compreende: o fragmento do ectodomínio da SEQ ID NO:120; a sequência de deleção Δ14(delta 14) aa do ectodomínio TβRII na SEQ ID NO:121; a sequência de deleção Δ25 (delta 25) aa do terminal N estabelecida na SEQ ID NO:122; ou uma sequência com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 118) de aas contíguo de qualquer uma dessas sequências polipeptídicas da isoforma B de TβRII.

[00546] 87. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 83-86, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma substituição de qualquer um, dois, três, quatro ou todos os cinco de F30, D32, S52, E55 e/ou D118 (por exemplo, com alanina ou arginina).

[00547] 88. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 83-87, compreendendo: uma substituição D118A ou D118 R (ver, por exemplo, SEQ ID NO:123 para o ectodomínio TβRII com uma deleção Δ25 N-terminal e uma substituição D118); ou uma substituição D118A ou D118R e uma, duas, três ou todas as quatro substituições F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00548] 89. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 87, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma deleção N- terminal de até 14 aas (uma deleção de Δ14 aa) da SEQ ID NO:119 ou SEQ ID NO:120 (ver, por exemplo, sequência na SEQ ID NO:121) e uma substituição de D118 (por exemplo, D118A ou D118R); ou uma sequência com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 118) de aas contíguos de qualquer uma dessas sequências polipeptídicas de TβRII.

[00549] 90. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 89, compreendendo ainda uma, duas, três ou todas as quatro de uma substituição F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00550] 91. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 87, em que a sequência de ectodomínio de TβRII compreende uma deleção N- terminal até 25 aas (uma deleção de Δ25 aa) da SEQ ID NO:119 ou substituição da SEQ ID NO:120 e D118 (por exemplo, D118A ou D118R, ver SEQ ID NO:123); ou uma sequência com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100) aas contíguos de qualquer uma dessas sequências polipeptídicas de TβRII.

[00551] 92. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 91, compreendendo ainda uma, duas, três ou todas as quatro de uma substituição F30A, D32N, S52L e/ou E55A.

[00552] 93. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência polipeptídica de TβR compreende uma sequência de ectodomínio de TβRI.

[00553] 94. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 93, em que a sequência de ectodomínio de TβRI compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90 ou 93) de aas contíguos da SEQ ID NO:115.

[00554] 95. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 82, em que a sequência polipeptídica de TβR compreende uma sequência de ectodomínio de TβRIII.

[00555] 96. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 95, em que a sequência de ectodomínio de TβRIII compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ou 600) aas contíguos de (aas 27-787 da isoforma A SEQ ID NO:124 ou aas 27-786 da isoforma B SEQ ID NO:125).

[00556] 97. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com o polipeptídeo compreendendo pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110) contígua à forma madura de um polipeptídeo de TGF-β1 humano, um polipeptídeo de TGF-β2 humano ou um polipeptídeo TGF-β3 humano.

[00557] 98. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β1 compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas contíguos da SEQ ID NO:105 (por exemplo, aas 279-390 da SEQ ID NO:106).

[00558] 99. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β1 com uma substituição C77S compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa contígua a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas da SEQ ID NO:107.

[00559] 100. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β2 compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas contíguos da (SEQ ID NO:108) (por exemplo, aas 302-413 da SEQ ID NO:109).

[00560] 101. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β2 com uma substituição C77S compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa contígua a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas da SEQ ID NO:110.

[00561] 102. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β3 compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas contíguos da SEQ ID NO:111 (por exemplo, aas 301-412 da SEQ ID NO:112).

[00562] 103. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1 a 96, em que a sequência polipeptídica de TGF-β é um polipeptídeo de TGF-β3 com uma substituição C77S compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa a pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou 112) aas contíguas da SEQ ID NO:113.

[00563] 104. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 97-103, em que na sequência polipeptídica de TGF- β compreende uma substituição em uma ou mais das posições 25, 92 e/ou 94 da sequência polipeptídica de TGF-β madura (ver, por exemplo, SEQ ID NO:112 na FIG. 3 e FIG. 4).

[00564] 105. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 100-101, em que na sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma substituição em uma ou mais das posições 25, 92 e/ou 94 da sequência polipeptídica de TGF-β madura (ver, por exemplo, SEQ ID NO:112 na FIG. 3 e FIG. 4). 106. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 97-105 em que na sequência polipeptídica de TGF-β compreende: (i) um aa diferente de Lys ou Arg na posição 25 (ii) um aa diferente de Ile ou Val na posição 92; e/ou (iii) um aa diferente de Lys ou Arg na posição 94 (por exemplo, com base na SEQ ID NO:108 ou SEQ ID NO:110).

[00565] 107. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-106, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado tem a forma de qualquer uma das estruturas A-F na FIG. 1.

[00566] 108. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 107, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado é um polipeptídeo de TGF-β mascarado com a forma de estrutura A na FIG. 1.

[00567] 109. O polipeptídeo TGF-β mascarado do aspecto 108, compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD IL-2 de tipo selvagem ou variante.

[00568] 110. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 107, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado é um complexo de TGF-β mascarado com a forma de estrutura B na FIG. 1.

[00569] 111. O polipeptídeo TGF-β mascarado do aspecto 110, compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD IL-2 de tipo selvagem ou mutante.

[00570] 112. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 107, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado é um complexo de TGF-β mascarado interespecífico com a forma de estrutura C na FIG. 1.

[00571] 113. O polipeptídeo TGF-β mascarado do aspecto 112, compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD IL-2 tipo selvagem ou mutante.

[00572] 114. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 107, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado é um complexo de TGF-β mascarado interespecífico com a forma de estrutura D ou E na FIG. 1.

[00573] 115. O polipeptídeo TGF-β mascarado do aspecto 114, compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD IL-2 tipo selvagem ou mutante.

[00574] 116. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 107, em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado é um complexo de TGF-β mascarado interespecífico com a forma de estrutura F na FIG. 1.

[00575] 117. O polipeptídeo TGF-β mascarado do aspecto 116, compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mais) sequências polipeptídicas MOD IL-2 tipo selvagem ou mutante.

[00576] 118. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:117) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou 154) aas contíguos do ectodomínio da isoforma A de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:117; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:9).

[00577] 119. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:119) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 143) aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:119; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:9).

[00578] 120. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:120) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 129) aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:120; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:9).

[00579] 121. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:117) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou 154) aas contíguos do ectodomínio da isoforma A de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:117; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreendendo uma sequência aa com pelo menos 80% (pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) de aas contíguos da SEQ ID NO:9.

[00580] 122. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:119) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 143) aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:119; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreendendo uma sequência aa com pelo menos 80% (pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) de aas contíguos da SEQ ID NO:9.

[00581] 123. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 107-117, em que: a sequência polipeptídica de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TGF-β3 em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:111) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110 ou pelo menos 112) aas contíguos da sequência de TGF-β3 estabelecida na SEQ ID NO:111; a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica de TβRII que compreende uma sequência polipeptídica de TβRII em peso (por exemplo, compreendendo a sequência de SEQ ID NO:120) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 90 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 129) aas contíguos do ectodomínio da isoforma B de TβRII estabelecido na SEQ ID NO:120; e em que o construto ou complexo de TGF-β mascarado compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 variante compreendendo uma sequência aa com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) de aas contíguos da SEQ ID NO:9.

[00582] 124. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-123, em que a sequência polipeptídica de TGF- β3 compreende uma substituição de C77S.

[00583] 125. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-124, em que a sequência polipeptídica de TβRII compreende um Δ14 N-terminal e modificações de sequência D118A ou D118R, ou um Δ25 N-terminal e modificações de sequência D118A ou D118R.

[00584] 126. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-125, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 compreende uma substituição aa em H16 ou uma substituição aa em F42.

[00585] 127. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-125, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 compreende uma substituição aa em H16 e F42.

[00586] 128. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 125-127, em que as substituições em H16 e F42 são selecionadas do grupo que consiste em: H16A, H16T, F42A e F42T (por exemplo, H16A e F42A ou H16T e F42A).

[00587] 129. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-128, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 compreende ainda uma substituição de N88R aa.

[00588] 130a. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 121-129a em que: a sequência polipeptídica de TGF-β3 compreende uma substituição de C77S; a sequência polipeptídica de TβRII compreende modificações de sequência N-terminal Δ14 e D118A ou D118R ou modificações de sequência N-terminal Δ25 e D118A ou D118R; e a sequência polipeptídica MOD IL-2 compreende uma substituição aa em H16 e F42.

[00589] 130b. O construto ou complexo de TGF-β mascarado do aspecto 130a, em que as substituições em H16 e F42 são uma substituição de H16A e F42A ou substituições de H16T e F42A.

[00590] 131. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-130b compreendendo ainda uma sequência polipeptídica de tipo selvagem ou MOD variante selecionada do grupo que consiste em: PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 e IL-23.

[00591] 132. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-130b compreendendo uma sequência polipeptídica de tipo selvagem ou MOD variante selecionada do grupo que consiste em: PD-L1, FAS-L, IL-10.

[00592] 133. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-132, em que o polipeptídeo/complexos de TGF-β compreendem um polipeptídeo TGF-β variante com afinidade reduzida para a sequência do polipeptídeo de mascaramento (por exemplo, polipeptídeo do receptor TGF-β) pelo menos 10% menos (por exemplo, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos) em relação a um polipeptídeo TGF-β sem as variações de sequência.

[00593] 134. O construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-133, em que o polipeptídeo/complexo de TGF-β compreende uma sequência polipeptídica de TβR com uma ou mais variações de sequência (por exemplo, uma ou mais deleções, inserções ou substituições aa) com afinidade reduzida para o polipeptídeo de TGF-β (pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou mais de 95% menos) em relação ao peso correspondente da sequência polipeptídica de TβR sem as variações de sequência.

[00594] 135. O complexo de TGF-β mascarado PSM-4033-4039.

[00595] 136. Um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-135 ou que codifica um complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 4 e 6-135.

[00596] 137. Um método para induzir células Treg em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou uma célula, tecido ou fluido corporal do mesmo, o método compreendendo administrar a um sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-135.

[00597] 138. O método do aspecto 137, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica MOD IL-2 tipo selvagem ou variante.

[00598] 139. O método do aspecto 137, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende (i) uma sequência polipeptídica MOD IL-2 tipo selvagem ou variante e (ii) uma sequência polipeptídica de PL-L1 tipo selvagem ou variante.

[00599] 140. O método de qualquer um dos aspectos 137-139, em que o um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados são administrados antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de qualquer um ou mais de vitamina D (por exemplo, 1α, 25-di-hidroxi vitamina D3 ou um análogo de vitamina D (por exemplo, vitamina D3), um inibidor de mTOR (por exemplo, rapamicina) e/ou um ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico).

[00600] 141. O método de qualquer um dos aspectos 137-140, em que a administração leva a um aumento no número de células Treg FoxP3+ (por exemplo, qualquer uma ou mais células T reguladoras induzidas (iTregs); células Treg derivadas do timo (tTreg) e/ou células Treg periféricas (pTreg)) em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de células Treg no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento (por exemplo, um sujeito ou uma média de dois ou mais sujeitos) que são combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00601] 142. O método do aspecto 141, em que o número de células Treg (por exemplo, células FoxP3+, iTregs, tTregs e/ou pTregs) aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de Tregs em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00602] 143. Um método para induzir células Th9 em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal destr, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00603] 144. O método do aspecto 143, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-4 MOD tipo selvagem ou variante.

[00604] 145. O método de qualquer um dos aspectos 143-144, em que a administração leva a um aumento no número de células Th9 em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de células Th9 no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00605] 146. O método do aspecto 145, em que o número de células Th9 aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de Th9 em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00606] 147. Um método para induzir células Th17 em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal deste, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00607] 148. O método do aspecto 147, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-6 MOD tipo selvagem ou variante.

[00608] 149. O método de qualquer um dos aspectos 147-148, em que a administração leva a um aumento no número de células Th17 em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de células Th17 no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00609] 150. O método do aspecto 149, em que o número de células Th17 aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de Th17 em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00610] 151. Um método para induzir células Thf em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal deste, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00611] 152. O método do aspecto 151, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma sequência polipeptídica IL-21 e/ou IL-23 MOD tipo selvagem ou variante.

[00612] 153. O método do aspecto 152, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma IL-21 tipo selvagem ou variante e pelo menos uma sequência polipeptídica de IL-23 MOD tipo selvagem ou variante.

[00613] 154. O método de qualquer um dos aspectos 151-153, em que a administração leva a um aumento no número de células Thf em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação ao número de Thf no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00614] 155. O método do aspecto 154, em que o número de células Thf aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de Thf em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00615] 156. Um método para inibir a ação de células Th1 em um sujeito mamífero (ou um tecido ou fluido corporal deste), o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00616] 157. O método do aspecto 156, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-4 MOD tipo selvagem ou variante.

[00617] 158. O método de qualquer um dos aspectos 156-157, em que a administração leva a uma inibição da liberação mediada por Th1 de interferon y e/ou TNF em (ou concentração resultante em) um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) fluido de um sujeito em relação à quantidade: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de interferon y e/ou TNF no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00618] 159. O método do aspecto 149, em que a quantidade de interferon y e/ou TNF em um volume de tecido ou fluido corporal é diminuído em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação a quantidade de interferon y e/ou TNF em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00619] 160. Um método para inibir a ação e/ou proliferação de células Th2 em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal deste, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00620] 161. O método do aspecto 160, em que a administração leva a uma inibição da liberação mediada por Th2 de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 em (ou concentração resultante em) um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) fluido de um sujeito em relação à quantidade: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade o tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00621] 162. O método do aspecto 161, em que a quantidade de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 em um volume de tecido ou fluido corporal é diminuída em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) em relação à quantidade de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 no tecido, ou o fluido corporal do grupo de controle combinado que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00622] 163. Um método para inibir a ação de células linfoides inatas tipo II (células ILC2) em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal deste, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados opcionalmente compreendem uma ou mais sequências polipeptídicas de IL-10 tipo selvagem ou variantes selecionadas independentemente (por exemplo, uma forma monomérica como IL-10M1).

[00623] 164. O método do aspecto 160, em que a administração leva a uma inibição da liberação mediada por células ILC2 de IL-5 e/ou IL-13 em (ou concentração resultante em) um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) fluido de um sujeito em relação à quantidade: (i) antes ou na ausência da administração do tratamento com um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade o tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00624] 165. O método do aspecto 164, em que a quantidade de IL-5 e/ou IL-13 em um volume de tecido ou fluido corporal é diminuída em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) em relação à quantidade de IL-5 e/ou IL-13 em um volume de tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio de IL-5 e/ou IL-13 no volume de tecido, ou o fluido corporal do grupo de controle combinado que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00625] 166. O método do aspecto 164, em que a quantidade de IL-5 e/ou IL-13 em um volume de tecido ou fluido corporal é diminuída em pelo menos 25%, em relação à quantidade de IL-5 e/ou IL-13 em um volume de tecido, ou o fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio de IL-5 e/ou IL-13 no volume de tecido ou fluido corporal do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00626] 167. Um método para de suporte ao desenvolvimento e/ou sobrevida de células assassinas naturais T invariantes (iNKT) em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal deste, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00627] 168. O método do aspecto 167, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma sequência polipeptídica MOD tipo selvagem ou variante.

[00628] 169. O método de qualquer um dos aspectos 167-168, em que a administração leva a um aumento no número de células iNKT em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação ao número de células iNKT no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00629] 170. O método do aspecto 169, em que o número de células iNKT aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) em relação ao número de células iNKT em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00630] 171. O método do aspecto 169, em que o número de células iNKT aumenta em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 25 em relação ao número de células iNKT em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00631] 172. Um método para bloquear um aumento no número de células T CD4+ ou reduzir o número de células T CD4+ em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00632] 173. O método do aspecto 172, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma sequência polipeptídica MOD de tipo selvagem ou variante além da sequência polipeptídica de TGF-β.

[00633] 174. O método de qualquer um dos aspectos 172-173, em que a administração leva a uma diminuição no número de células T CD4+ em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação ao número de células T CD4+ no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00634] 175. O método do aspecto 174, em que o número de células CD4+ diminui em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de células CD4+ em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00635] 176. O método do aspecto 174, em que o número de células CD4+ diminui em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 25% em relação ao número de células CD4+ em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00636] 177. Um método para bloquear um aumento no número de células T CD8+ ou reduzir o número de células T CD4+ em um sujeito mamífero (por exemplo, um humano) ou um tecido ou fluido corporal do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00637] 178. O método do aspecto 172, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma sequência polipeptídica MOD de tipo selvagem ou variante além da sequência polipeptídica de TGF-β.

[00638] 179. O método de qualquer um dos aspectos 172-173, em que a administração leva a uma diminuição no número de células T CD8+ em um volume de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue ou linfa) de um sujeito em relação ao número dessas células: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação ao número de células T CD8+ no tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento controle (por exemplo, a média de um grupo de indivíduos) combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00639] 180. O método do aspecto 174, em que o número de células CD8+ diminui em um volume de tecido ou fluido corporal em pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais) em relação ao número de células CD8+ em um volume do tecido ou do fluido corporal antes da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou em relação ao valor médio do grupo de controle correspondente que não recebeu um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00640] 181. Um método para fornecer tratamento ou profilaxia de uma ferida, uma reação alérgica, uma doença ou distúrbio, o método compreendendo administrar a um sujeito (por exemplo, um humano) em necessidade do mesmo (i) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134 e/ou (ii) um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134.

[00641] 182. O método, de acordo com o aspecto 181, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas ou pelo menos três) sequências polipeptídicas MOD IL-2 selecionadas independentemente de tipo selvagem ou variantes.

[00642] 183. O método, de acordo com o aspecto 182, em que o polipeptídeo MOD IL-2 de tipo selvagem ou variante selecionado independentemente compreende o polipeptídeo IL-2 da SEQ ID NO:9 ou uma variante deste.

[00643] 184. O método do aspecto 183, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 variante selecionada independentemente compreende uma sequência com: (i) pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, pelo menos 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos da SEQ ID NO:9; ou (ii) pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 80 (por exemplo, pelo menos 90, 100, 110, 120, 130 ou 133) aas contíguos de qualquer uma da SEQ ID NOs:15-27.

[00644] 185. O método de qualquer um dos aspectos 182-184, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 variante independentemente selecionada compreende uma substituição em qualquer um, dois ou todos os três de N88, F42 e/ou H16.

[00645] 186. O método de qualquer um dos aspectos 182-185, em que a sequência polipeptídica MOD IL-2 variante independentemente selecionada compreende uma substituição ou par de substituições selecionadas do grupo que consiste em: (i) F42A; (ii) F42T; (iii) H16A; (iv) H16T; (v) F42A e H16A; (vi) F42T e H16A; (vii) F42A e H16T; ou (viii) substituições F42T e H16T.

[00646] 187. O método de qualquer um dos aspectos 181-186, em que os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendem pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequências polipeptídicas PD-L1 selecionadas independentemente de tipo selvagem ou variantes.

[00647] 188. O método do aspecto 187, em que a sequência polipeptídica PD-L1 variante selecionada independentemente compreende sequências polipeptídicas com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 170 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 180, 190 ou 200 aa contíguos) da SEQ ID NO:2.

[00648] 189. O método de qualquer um dos aspectos 181-188, em que pelo menos um dos um ou mais polipeptídeos TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-10 de tipo selvagem ou variante selecionada independentemente (por exemplo, um isômero monomérico tal como IL-10M1).

[00649] 190. O método do aspecto 189, em que a sequência polipeptídica de IL-10 de tipo selvagem ou variante selecionada independentemente compreende uma sequência polipeptídica com pelo menos 80% (pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 50 aa contíguas (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 ou pelo menos 160) aa contíguas das SEQ ID NOs: 50 ou 51 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa quando a sequência é uma sequência variante de IL- 10); e em que a sequência polipeptídica de IL-10 variante compreende opcionalmente uma inserção de 5-7 aa entre N49 e K50 da SEQ ID NO:51, ou na localização equivalente nas SEQ ID NOs:49 ou 50 (por exemplo, IL-10M1 GGGSGG inserida na SEQ ID NO:51 entre aa 49 e aa 50).

[00650] 191. O método de qualquer um dos aspectos 181-190, em que pelo menos um dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente compreende uma sequência polipeptídica FasL de tipo selvagem ou variante selecionada independentemente.

[00651] 192. O método do aspecto 191, em que a sequências polipeptídica de FasL de tipo selvagem ou variante independentemente selecionada compreende pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aa a pelo menos 50 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 140, pelo menos 160, ou pelo menos 180 aa contíguos) da SEQ ID NO: 144 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

[00652] 193. O método de qualquer um dos aspectos 181-192, em que o um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados são administrados antes, simultaneamente, combinados com ou após a administração de qualquer um, dois ou todos os três de vitamina D (por exemplo, 1 α,25-di-hidroxi vitamina D3), ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico) e/ou rapamicina.

[00653] 194. O método de qualquer um dos aspectos 181-193, em que a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em: doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante, encefalomielite autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, infertilidade autoimune-associada, púrpura trombocitopênica autoimune, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulonefrite crescêntica, glomerulonefrite proliferativa), doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, doença conectiva mista, esclerose múltipla, miastenia gravis (MG), pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgar), anemia perniciosa, polimiosite, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo 1 (T1D), vasculite e vitiligo.

[00654] 195. O método de qualquer um dos aspectos 181-193, em que a doença autoimune é T1D ou doença celíaca.

[00655] 196. O método de qualquer um dos aspectos 181-193, em que a doença autoimune é diferente de T1D ou doença celíaca.

[00656] 197. O método de qualquer um dos aspectos 181-193, em que o método é um método de tratamento ou profilaxia de uma reação alérgica.

[00657] 198. O método do aspecto 197, em que a reação alérgica é uma reação a um alérgeno de amendoim, noz de árvore, pólen vegetal, látex, veneno de abelha ou veneno de vespa.

[00658] 199. O método de qualquer um dos aspectos 181-190, em que o método é um método para fornecer tratamento ou profilaxia para uma queimadura ou ferida

[00659] 200. O método do aspecto 199, em que a ferida é uma abrasão, avulsão, incisão, laceração ou punção da epiderme ou mucosa.

[00660] 201. O método do aspecto 200, em que o i) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134, e/ou (ii) um ou mais ácidos nucleicos que codificam o um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente de acordo com qualquer um dos aspectos 1-134, é administrado antes, durante e/ou após a formação da ferida.

[00661] 202. O método de qualquer um dos aspectos 199-201, em que a queimadura e/ou ferida ocorre durante, ou é o resultado de, um procedimento cirúrgico ou outro procedimento médico.

[00662] 203. O método de qualquer um dos aspectos 199-202, em que um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados selecionados independentemente são administrados ao sítio da ferida ou queimadura.

[00663] 204. O método de qualquer um dos aspectos 199-203, em que a administração de um construto ou complexo de TGF-β mascarado (uma quantidade eficaz) e/ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) que codificam o construto de TGF-β mascarado ou o fechamento de feridas de velocidades complexas (reduzem o tempo até o fechamento), reduzem o tempo de cicatrização ou reduzem a formação de cicatrizes em relação a um sujeito ou ferida não tratado.

[00664] 205. O método do aspecto 181, em que pelo menos um dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas ou pelo menos três) sequências polipeptídicas de IL-4 selecionadas independentemente de tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31) ou variantes.

[00665] 206. O método do aspecto 205, em que as sequências polipeptídicas IL-4 variantes compreendem uma sequência polipeptídica com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aa com pelo menos 80 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 100 ou 110 aa contíguos) da SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

[00666] 207. O método de qualquer um dos aspectos 205-206, em que a doença ou distúrbio é uma infecção por helmintos.

[00667] 208. O método do aspecto 181, em que pelo menos um dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas ou pelo menos três) sequências polipeptídicas de IL-6 selecionadas independentemente de tipo selvagem (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO:35) ou variantes.

[00668] 209. O método do aspecto 208, em que as sequências polipeptídicas IL-6 variantes compreendem uma sequência polipeptídica com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aa com pelo menos 80 aa contíguos (por exemplo, pelo menos 100 ou 110 aa contíguos) da SEQ ID NO: 35 (por exemplo, que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aa).

[00669] 210. O método de qualquer um dos aspectos 204-209, em que a doença ou distúrbio é uma infecção bacteriana e/ou fúngica (por exemplo, no intestino).

[00670] 211. O método, de acordo com o aspecto 181, em que pelo menos um dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas ou pelo menos três) sequências polipeptídicas IL-21 e/ou IL-23 selecionadas independentemente de tipo selvagem ou variantes.

[00671] 212. O método do aspecto 209, em que a pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica MOD IL-21 compreende (i) um polipeptídeo da sequência da SEQ ID NO:58 ou 60) ou (ii) uma sequência polipeptídica com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 50 (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 ou pelo menos 110) de aa contígua da SEQ ID NO:58 ou 60 e que tem pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa.

[00672] 213. O método do aspecto 211 ou 212, em que a pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas) sequência polipeptídica de IL-23 MOD compreende (i) um polipeptídeo da sequência da SEQ ID NO:63 ou 65) ou (ii) uma sequência polipeptídica com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade de sequência aa com pelo menos 50 (por exemplo, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 140, pelo menos 160, pelo menos 180, pelo menos 200, pelo menos 220, pelo menos 240, pelo menos 260, pelo menos 280, pelo menos 300, pelo menos 320 ou pelo menos 340) aas contíguos da SEQ ID NO:63 e/ou 65, e que têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção aa.

[00673] 214. O método de qualquer um dos aspectos 211-213, em que a doença ou distúrbio é uma incapacidade de produzir anticorpos de alta afinidade ou quantidades suficientes de anticorpos de alta afinidade.

[00674] 215. Método para induzir tolerância a um sujeito mamífero, o método que compreende administrar ao sujeito: (i) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer um dos aspectos 1-136, (ii) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer um dos aspectos 1-136, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-2 de tipo selvagem ou variante; (iii) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer um dos aspectos 1-136, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de FasL de tipo selvagem ou variante; ou (iv) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados, ou um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer um dos aspectos 1-136, em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de IL-2 de tipo selvagem ou variante, e em que pelo menos um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreende uma sequência polipeptídica de FasL de tipo selvagem ou variante ou uma sequência polipeptídica de IL-10 de tipo selvagem ou variante.

[00675] 216. O método de qualquer um dos aspectos 137-215, compreendendo ainda a administração de uma droga anti-inflamatória não esteroide (NSAID) (por exemplo, inibidores de Cox-1 e/ou Cox-2, tais como Celecoxib, Diclofenac, Diflunisal, Etodolac, Ibuprofeno, Indometacina, Cetoprofeno e Naproxeno) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00676] 217. O método de qualquer um dos aspectos 137-216, compreendendo ainda a administração de um corticosteroide (por exemplo, Cortisona, Dexametasona, Hidrocortisona, Etametasonab, Fludrocortisona, Metilprednisolona, Prednisona, Prednisolona e Triancinolona) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00677] 218. O método de qualquer um dos aspectos 137-217, compreendendo ainda a administração de um agente que bloqueia uma ou mais ações do fator de necrose tumoral alfa (por exemplo, um anti-TNF alfa, como golimumabe, infliximabe, certolizumabe, adalimumabe ou um receptor chamariz de TNF alfa, como etanercepte) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00678] 219. O método de qualquer um dos aspectos 137-218, compreendendo ainda a administração de um agente que se liga ao receptor de IL-1 competitivamente com IL-1 (por exemplo, anakinra) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Este aspecto pode ser sujeito à condição de que um agente que se liga ao receptor de IL-1 competitivamente com IL-1 não seja administrado se qualquer um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados ao sujeito compreender um polipeptídeo de IL-1.

[00679] 220. O método de qualquer um dos aspectos 137-219, compreendendo ainda a administração de um agente que se liga ao receptor de IL-6 e inibe a IL-6 de sinalizar através do receptor (por exemplo, tocilizumabe) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados. Este aspecto pode estar sujeito à condição de que um agente que se liga ao receptor de IL-6 não seja administrado se qualquer um dos um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados administrados ao sujeito compreender um polipeptídeo de IL-6.

[00680] 221. O método de qualquer um dos aspectos 137-220, compreendendo ainda a administração de um agente que se liga a receptores CD80 ou CD86 e inibe a proliferação de células T e/ou a resposta imune de células B (por exemplo, abatacept) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00681] 222. O método de qualquer um dos aspectos 137-221, compreendendo ainda a administração de um agente que se liga a CD20 resultando em morte de células B (por exemplo, rituximabe) antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados.

[00682] 223. O método de qualquer um dos aspectos 137-222, em que o sujeito mamífero é selecionado de: humanos, caninos bovinos, felinos, roedores, murinos, caprinos, símios, ovinos, equinos, lapinos, suínos, etc. sujeitos.

[00683] 224. O método de qualquer um dos aspectos 137-223, em que o sujeito é um humano (por exemplo, um paciente humano ou um sujeito humano em necessidade de tratamento ou profilaxia).

[00684] 225. Um método de distribuição de um polipeptídeo de TGF-β ou um polipeptídeo de TGF-β e um polipeptídeo imunomodulador (MOD) a uma célula, compreendendo o contato da célula com (i) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de qualquer um dos aspectos 1-134, (ii) um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma ou mais sequências MOD de tipo selvagem ou variantes selecionadas independentemente de qualquer um dos aspectos 1-134, ou (iii) um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados de qualquer um dos aspectos 135-136, opcionalmente, codificando um ou mais MODs de tipo selvagem ou variantes selecionados independentemente.

[00685] 226. Um método de produção de células que expressam um construto ou complexo de TGF-β mascarado, o método compreendendo a introdução de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, vetor(es) de expressão) que codifica um construto ou complexo de TGF-β mascarado de qualquer um dos aspectos 1-134 nas células (por exemplo, uma célula de mamífero in vitro) e, opcionalmente, a seleção de células compreendendo a totalidade ou parte de um ou mais ácidos nucleicos não integrados e/ou integrados em pelo menos um cromossomo celular (por exemplo, seleção de antibiótico seguida de análise para determinar se qualquer um dos um ou mais ácidos nucleicos se integraram em um cromossomo celular).

[00686] 227. O método do aspecto 224, em que a célula é uma célula de uma linhagem celular de mamífero selecionada das células HeLa, células CHO, células 293, células Vero, células NIH 3T3, células Huh-7, células BHK, PC12, células COS, células COS-7, células RAT1, células L de camundongo, células de rim embrionário humano (HEK) e células HLHepG2.

[00687] 228. Uma célula que expressa transitoriamente ou de forma estável um construto ou complexo de TGF-β mascarado preparado pelo método do aspecto 226 ou 227.

[00688] 229. A célula do aspecto 228, em que as células expressam de cerca de 25 a cerca de 350 mg/litro ou mais (por exemplo, de cerca de 25 a cerca de 100, de cerca de 100 a cerca de 200, de cerca de 200 a cerca de 300, de cerca de 300 a cerca de 350 mg/litro, ou superior a 350 mg/litro) do construto ou complexo de TGF-β mascarado sem redução substancial (menos de 5%, 10% ou 15% de redução) na viabilidade em relação a células idênticas que não expressam o construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00689] 230. O método de qualquer um dos aspectos 138-142, em que a administração dos construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo uma sequência polipeptídica MOD IL-2 de tipo selvagem ou variante resulta na modulação de uma ou mais células T (por exemplo, células T inflamatórias, como células Th1, Th2, Th17 e/ou Th22) no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal.

[00690] 231. O método do aspecto 230, em que uma ou mais células T são células Th1 e a modulação é avaliada por uma redução no número de células Th1, uma redução na expressão ou secreção de interferon Y pelas células Th1 ou o nível de interferon y no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de interferon y no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento (por exemplo, um sujeito ou uma média de dois ou mais sujeitos) que são combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00691] 232. O método do aspecto 230, em que uma ou mais células T são células Th2, e a modulação é avaliada por uma redução no número de células Th2, uma redução na expressão ou secreção de IL-4, IL-5 e/ou IL-13 pelas células Th2, ou o nível de L-4, IL-5 e/ou IL-13 no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de L-4, IL-5, e/ou IL-13 no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento (por exemplo, um sujeito ou uma média de dois ou mais sujeitos) que são combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF- β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00692] 233. O método do aspecto 230, em que uma ou mais células T são células Th17, e a modulação é avaliada por uma redução no número de células Th17, uma redução na expressão ou secreção de IL-17, e/ou IL-22 pelas células Th17, ou o nível de IL-17 e/ou IL-22 no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de IL-17 e/ou IL-22 no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento (por exemplo, um sujeito ou uma média de dois ou mais sujeitos) que são combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF-β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00693] 234. O método do aspecto 230, em que uma ou mais células T são Th22, célula e modulação são avaliadas por uma redução no número de células Th22, uma redução na expressão ou secreção de pelo menos duas ou IL-22, IL-13 e/ou TNF-alfa pelas células Th22, ou o nível de IL-22, IL-13 e/ou TNF-alfa no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal: (i) antes ou na ausência da administração de um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados; ou (ii) em relação à quantidade de IL-22, IL-13, e TNF-alfa no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal de um grupo de tratamento (por exemplo, um sujeito ou uma média de dois ou mais sujeitos) que são combinados com o sujeito (por exemplo, um ou mais de estado de doença, idade, sexo, altura, peso e/ou hábito de fumar), mas que não receberam TGF- β ou um construto ou complexo de TGF-β mascarado.

[00694] 235. O método do aspecto 234, em que o método compreende ainda avaliar a expressão, secreção de um ou mais de IL-4, IL-17 e/ou interferon y, ou os níveis de um ou mais de IL-4, IL-17 e/ou interferon y no sujeito, célula, tecido ou fluido corporal.

[00695] 236. O método de qualquer um dos aspectos 230-235, em que as células T são células T espectadoras.

[00696] 237. O método de qualquer um dos aspectos 230-236, em que o um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarados são administrados antes, durante (administração simultânea ou combinada) ou após a administração de qualquer um ou mais de vitamina D (por exemplo, 1α, 25-di-hidroxi vitamina D3 ou um análogo de vitamina D (por exemplo, vitamina D3), um inibidor de mTOR (por exemplo, rapamicina) e/ou um ácido retinoico (por exemplo, todo o ácido trans retinoico).

[00697] 238. O método de qualquer um dos aspectos 230-237, em que os construtos ou complexos de TGF-β mascarados compreendendo um IL-2 MOD de tipo selvagem ou variante têm uma estrutura estabelecida na FIG. 1 estruturas A a F.

[00698] 239. O método do aspecto 238, em que a região Fc carece de sequências efetoras de imunoglobulina (ligação do componente 1q do complemento reduzido (“C1q”) em comparação com a proteína de tipo selvagem e, consequentemente, uma redução na capacidade de participar na citotoxicidade dependente do complemento).

VI. Exemplos

[00699] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a fornecer aos versados na técnica uma divulgação e descrição mais completas de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção, nem pretendem representar que os experimentos abaixo sejam todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo indicação contrária, as partes são partes em peso, peso molecular é a peso molecular ponderal médio, temperatura é em graus Celsius e pressão é atmosférica ou próxima. Abreviaturas padrão podem ser usadas, por exemplo, bp, par(es) de base; kb, quilobase(s); μl, microlitro(s); pl, picolitro(s); s ou seg, segundo(s); min, minuto(s); h ou h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobase(s); bp, par(es) de base; nt, nucleotídeo(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea(mente); wt. tipo selvagem e semelhantes.

A. Exemplo 1: 1. Construtos de TGF-β Mascarados de Cadeia Polipeptídica Única

[00700] A expressão estável de uma cadeia polipeptídica única intacta apresentando uma proteína TGF-β mascarada foi demonstrada preparando um ácido nucleico que codifica os componentes desejados e conduzindo a expressão usando um vetor de expressão para uma célula de mamífero. Os ácidos nucleicos codificam polipeptídeos compreendendo, do terminal N ao C: uma sequência polipeptídica MOD (por exemplo, uma Sequência polipeptídica de IL-2, tal como SEQ ID NO:20, ou uma variante desse polipeptídeo de IL-2 contendo substituições em H16 e/ou F42; uma sequência polipeptídica de scaffold Fc de IgG1 contendo substituições L234A e L235A juntamente com substituições que impedem a dimerização de Fc, um receptor TGF-β tipo II (por exemplo, uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-βRII com variações de sequência D32N e/ou D118A) e uma sequência polipeptídica de TGF-β (por exemplo, wt. TGF-β3 ou uma variante de sequência C77S). Um esquema tendo a estrutura geral das proteínas expressas é mostrado na FIG. 1 como estrutura A, um exemplo do qual é mostrado na Fig. 7A como construto 3470 (SEQ ID NO:146), outro exemplo de tal sequência aa de polipeptídeo é construto N° 3472 alinhado com os elementos marcados é mostrado na FIG. 7G como SEQ ID NO:157. Depois de construir o ácido nucleico em um plasmídeo adequado para expressão de proteína de mamífero (por exemplo, em células de Ovário de Hamster Chinês ou CHO), as proteínas foram expressas e purificadas usando cromatografia de separação de tamanho e proteína A.

[00701] Além da construção e isolamento dos construtos 3470 e 3472, dois construtos de TGF-β mascarados de cadeia polipeptídica única adicionais, 3466 e 3468 foram preparados. O construto 3470, juntamente com os construtos 3472, 3466 e 3468 (numerados como (i) a (iii) abaixo) demonstram a viabilidade de preparar proteínas TGF-β mascaradas de cadeia única, que não dimerizam substancialmente, particularmente através da associação Fc clássica. Os polipeptídeos compreendem, do terminal N ao C, as seguintes sequências polipeptídicas: (i) de tipo selvagem Substituições de IL-2-IgG Fc-TβRIlΔ25(D32N, D118A)-TGF-β3 (C77S) (FIG. 7G, Construto N° 3472) SEQ ID NO:157; (ii) IL-2 (H16T, F42A)-IgG Fc-TβRII Δ25(D118)-TGF-β3 (C77S) (FIG. 7H, Construto n° 3466) SEQ ID NO:158; e (iii) IL-2 (H16T, F42A)-IgG Fc- TβRII Δ25(D32N, D118)- TGF-β3 (C77S) (FIG 7I, Construto N.° 3468) SEQ ID NO:159.

[00702] Conforme indicado acima, os construtos de TGF-β mascarados de cadeia polipeptídica única podem compreender substituições que impedem a dimerização da região Fc, por exemplo, em L131 (por exemplo, L131K), T146 (por exemplo, T146S), P175 (por exemplo, P175V), F185 (por exemplo, F185R), Y187 (por exemplo, Y187A) e K189 (por exemplo, K189Y) numerados como na sequência de IgG1 da SEQ ID NO:71. Os construtos acima mencionados em (i) a (iii) compreendem L131K, T146S, P175V, F185R, Y187A e K189Y conforme numerado na sequência de IgG1 da SEQ ID NO:71.

2. Cadeia Polipeptídica Heterodimérica

[00703] A expressão estável de um complexo de TGF-β mascarado composto por dois polipeptídeos demonstrou construtos de TGF-β mascarados preparando um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de TGF-β e um segundo ácido nucleico que codifica uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β e expressando os polipeptídeos usando vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, sistemas de expressão de plasmídeo em células CHO). O primeiro polipeptídeo compreendendo, por exemplo, uma sequência polipeptídica MOD (por exemplo, uma sequência polipeptídica de IL-2 wt. ou variante), uma sequência polipeptídica de scaffold de IgG Fc (por exemplo, um KiH Fc) e uma sequência polipeptídica de TGF-β (por exemplo, wt. ou variante de sequência contendo TGF-β1 ou TGF-β3 wt.) (ver, por exemplo, a FIG 7J, construto 3618). O segundo polipeptídeo compreendendo, por exemplo, uma sequência polipeptídica MOD (por exemplo, uma sequência polipeptídica de IL-2 wt. ou variante), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG Fc (por exemplo, a contraparte da sequência KiH do primeiro polipeptídeo) e uma sequência polipeptídica do receptor tipo II de TGF-β (TGF-β RII) (wt. ou com variações de sequência) (ver, por exemplo, a FIG. 7J, construto 3621). Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada na FIG. 1 como estrutura D. Expressão e purificação (proteína A e separação de tamanho por cromatografia) de um desses pares de polipeptídeos, (iv.a) e (iv.b), compreendendo, do terminal N ao C, as seguintes sequências polipeptídicas: (iv.a) IL-2 (MOD wt.)- knob-in-hole Fc (por exemplo, “knob” Fc)-TGF-β3(wt.) ver a FIG 7J, construto 3618 (SEQ ID NO:148); e (iv.b) IL-2 (MOD wt.)- knob-in-hole Fc (por exemplo, “hole” Fc)- TβRII (D32N) ver a FIG 7J, construto 3621 (SEQ ID) NO:160.

[00704] No construto (iv.a) ou (iv.b), o polipeptídeo de IL-2 pode compreender substituições em H16 e/ou H42, tais como substituições H16T e F42A ou substituições H16A e F42A.

3. Atividade de Construtos de TGF-β Mascarados

[00705] Várias concentrações dos complexos e construtos polipeptídicos de TGF-β mascarados purificados (por exemplo, construtos (i) a (iii) e o complexo polipeptídico (vi.a) e (vi.b) preparados nas partes 1 e 2 deste exemplo) foram testadas quanto à sua capacidade de induzir células CD4 não expostas a produzir FoxP3. Para os ensaios, células CD4 não expostas 105 foram plaqueadas em poços contendo 5 μg/ml de anti-CD3 ligado com 1 μg/ml de anti-CD28 e os complexos ou construtos polipeptídicos de TGF-β mascarados, conforme indicado. Após cinco dias em cultura, o número de células positivas duplas CD4+ FoxP3 foi avaliado usando anti-CD4 marcado com fluorescência e anti-FoxP3 por citometria de fluxo. Os controles que fornecem estimulação por TGF-β3 ou TGF-β3 e IL-2 100 U/ml humana recombinante também foram executados em paralelo.

[00706] Na FIG. 6 em A, uma comparação de um construto de TGF-β mascarado com a estrutura geral mostrada na FIG.1 em A compreendendo IL- 2-IgG Fc (mFc)-TβRII wt. com uma substituição D32N -TGF-β3 foi testada quanto à expressão de FoxP3 em comparação com o efeito de TGF-β3 wt. na presença ou ausência de IL-2. Os resultados mostrados na FIG. 6 em A indicam que TGF-β3 wt. não estimula eficazmente FoxP3 sob as condições de teste, mas que a suplementação de IL-2 wt. pode levar à expressão de FoxP3.

[00707] Na FIG. 6 em B, uma comparação de um construto de TGF-β mascarado (i), (ii) e (iii) das partes 1 e 2 deste exemplo, e complexo de TGF-β mascarado compreendendo polipeptídeos (iv.a) e (iv.b) foram testados quanto à expressão de FoxP3 em comparação com o efeito de TGF-β3 wt. na presença de IL-2. Os resultados mostrados na FIG. 6 em B indicam que os construtos e complexos de TGF-β mascarados com IL-2 wr. são mais potentes do que aqueles com a substituição de IL-2 H16T e F42A. As substituições em H16T e F42A mudam a potência dos complexos mascarados por uma ordem de magnitude de cerca de 5 nanomolar a cerca de 50 nanomolar sem alteração substancial na eficácia máxima com base no número de células que expressam FoxP3. Como com os resultados mostrados na FIG 6 em A, os construtos e complexos de TGF-β mascarados e foram mais eficazes na indução de células T para produzir FoxP3 do que IL-2 e TGF-β3.

[00708] Um exemplo do bloqueio e separação de células com base em CD4+ e FoxP3 é mostrado na FIG. 6 em C. Os resultados que demonstram uma indução de FoxP3 em células expostas a um construto de TGF-β mascarado a 1.000 nM mostram um aumento de aproximadamente 30 vezes na expressão de FoxP3 sobre células expostas a 0,1 nM do mesmo construto.

B. Exemplo 2 1. Scaffolds que não são interespecíficos

[00709] Esta seção descreve sequências de TGF beta mascaradas que não empregam estruturas interespecíficas e, consequentemente, são monoméricas ou, se dimerizadas, não formam preferencialmente heterodímeros com uma sequência de contraparte

a. Construtos de TGF-β Mascarados de Cadeia Polipeptídica Única

[00710] Ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo compreendendo, do terminal N ao C, uma sequência polipeptídica MOD: uma sequência polipeptídica de IL-2 wt. (SEQ ID NO:20), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc wt. IgG1 aas 11-215 (Δ10) tendo substituições L234A e L235A (“LALA”), L351K, T366S, P395V, F405R, Y407A e K409Y, uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-β RII de aa 26 a 136 aas da proteína madura com uma substituição D118A (*D119A ver a observação na FIG 5B) e uma sequência polipeptídica de isoforma 1 de TGF-β tipo 3 humana com uma substituição C77S. Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada na FIG. 1 como estrutura A (SEQ ID NO:146). A proteína foi purificada por proteína A e cromatografia de tamanho.

b. Complexo polipeptídico homodimérico

[00711] Ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo compreendendo, do terminal N ao C, uma sequência polipeptídica MOD (IL-2 SEQ ID NO:20 com substituições H16T e F42A), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, IgG1 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)), uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-β RII de aa 26 a 136 aas da proteína madura com uma substituição D118A (*D119A ver a observação na FIG 5B) e uma sequência polipeptídica de isoforma 1 de TGF-β tipo 3 humana com uma substituição C77S. Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada na FIG. 1 como estrutura B. A sequência de ácido aa correspondente alinhada com os elementos marcados é mostrada na FIG. 7B (SEQ ID NO:147). A proteína foi purificada por proteína A e cromatografia de tamanho.

2. Complexos de TGF-β mascarados heterodiméricos com polipeptídeos de scaffold interespecíficos a. Complexos de TGF-β mascarados heterodiméricos com scaffolds interespecíficos, cada um tendo polipeptídeos MOD de IL-2

[00712] A expressão estável de um complexo de TGF-β mascarado composto por dois polipeptídeos demonstrou construtos de TGF-β mascarados preparando um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de TGF-β e um segundo ácido nucleico que codifica uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β e expressando os polipeptídeos usando vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, sistemas de expressão de plasmídeo em células CHO).

[00713] O primeiro polipeptídeo compreendendo, um polipeptídeo de IL-2 wt. (SEQ ID NO:20), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 1-225 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)) e uma substituição T366W KiH “knob” e uma sequência polipeptídica de isoforma 1 TGF-β tipo 3 humana com uma substituição C77S.

[00714] O segundo polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de IL-2 wt. (SEQ ID NO:20), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 1-225 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)), e substituições T366S, L368A e Y407V KiH “hole”, e uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-β RII de aa 26 a 136 aas da proteína madura com uma substituição D118A. Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada na FIG. 1 como estrutura D. As sequências de ácido aa correspondentes estão alinhadas com os elementos marcados mostrados na FIG. 7C. A expressão e purificação (proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho) fornece o complexo de heterodímero.

b. Complexos de TGF-β mascarados heterodiméricos com scaffolds interespecíficos com uma cadeia única tendo polipeptídeos MOD

[00715] A expressão estável de um complexo de TGF-β mascarado composto por dois polipeptídeos demonstrou construtos de TGF-β mascarados preparando um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de TGF-β e um segundo ácido nucleico que codifica uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β e expressando os polipeptídeos usando vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, sistemas de expressão de plasmídeo em células CHO).

[00716] O primeiro polipeptídeo compreendendo, um polipeptídeo de IL-2 wt. (SEQ ID NO:20), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 1-225 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”) e uma substituição T366W (knob) e uma sequência polipeptídica de isoforma 1 TGF-β tipo 3 humana com uma substituição C77S.

[00717] O segundo polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 1-225 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)), e substituições T366S, L368A e Y407V “hole”, e uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-β RII de aa 26 a 136 aas da proteína madura com uma substituição D118A.

[00718] Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada na FIG. 1 como estrutura E. A sequência ácida aa correspondente alinhada com os elementos marcados é mostrada na FIG. 7D. A expressão e purificação (proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho) fornece o complexo de heterodímero.

c. Complexos de TGF-β mascarados heterodiméricos com estabilização polipeptídica de scaffold interespecífico com uma cadeia única tendo polipeptídeos MOD

[00719] A expressão estável de um complexo de TGF-β mascarado composto por dois polipeptídeos demonstrou construtos de TGF-β mascarados preparando um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de TGF-β e um segundo ácido nucleico que codifica uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β e expressando os polipeptídeos usando vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, sistemas de expressão de plasmídeo em células CHO).

[00720] O primeiro polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de IL-2 (SEQ ID NO 20 com substituições H16T e F42A), uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 wt. 1-225 tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)) e uma substituição T366W (knob), uma sequência polipeptídica de isoforma B de TGF-β RII de aa 26 a 136 aas da proteína madura com uma substituição D118A e uma sequência polipeptídica de isoforma 1 de TGF-β tipo 3 humana com uma substituição C77S.

[00721] O segundo polipeptídeo compreendendo uma sequência polipeptídica de scaffold IgG1 Fc (por exemplo, resíduos IgG1 1-225 wt. tendo substituições L234A e L235A (“LALA”)), e substituições T366S, L368A e Y407V “hole”.

[00722] Uma estrutura esquemática da proteína expressa é mostrada em uma variação da estrutura na FIG. 1 como estrutura F, mas sem quaisquer sequências polipeptídicas imunomoduladoras no segundo polipeptídeo. A sequência de ácido aa correspondente alinhada com os elementos marcados é mostrada na FIG. 7E. A expressão e purificação (proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho) fornece o complexo de heterodímero.

C. Exemplo 3 Expressão e purificação

[00723] Os ácidos nucleicos que codificam um construto de TGF-β mascarado de ácidos nucleicos que codificam dois complexos de TGF-β mascarados foram preparados (ver FIG. 8). As amostras dos complexos foram preparadas por transfecção de células ExpiCHO com os construtos de ácido nucleico e permitindo que as células expressassem os polipeptídeos. Os polipeptídeos foram purificados por cromatografia de proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purificadas foram submetidas a SDS-PAGE e os géis resultantes foram corados com azul de Coomassie. NR = amostras não reduzindo ou não reduzidas, e R = amostras reduzidas (redução com um agente redutor de dissulfeto).

D. Exemplo 4 Atividade biológica e afinidade entre o polipeptídeo de mascaramento e TGF-β

[00724] Uma série de construtos de TGF-β mascarados foi preparada para demonstrar a disponibilidade biológica de TGF-β e que sua capacidade de interagir com TβRII é inversamente proporcional à afinidade do polipeptídeo de mascaramento para a sequência polipeptídica de TGF-β. Os construtos eram da estrutura de forma A na FIG. 1 e, do terminal N ao terminal C, o MOD é um polipeptídeo IL-2; o scaffold é um polipeptídeo de IgG; o receptor de mascaramento é um polipeptídeo de TβRII da SEQ ID NO. 119 com aas 1-25 N-terminal (Δ25) deletado e uma substituição D118A (e que compreende a substituição adicional E55A, D32N ou S52L, conforme indicado) e uma sequência polipeptídica de TGF-β3.

[00725] A interação dos construtos de TGF-β mascarados com TβRII foi avaliada usando um ensaio de captura no qual uma fusão de TβRII-Ig Fc foi capturada nos poços de uma placa de microtitulação e várias concentrações dos quatro construtos foram aplicadas aos poços. Depois de enxaguar os construtos não ligados, o construto ligado foi detectado e medido usando anti IL-2 marcado com biotina seguido por peroxidase de rabanete de cavalo de estreptavidina e detecção colorimétrica (3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina) a 450 nm. Os resultados, que são mostrados na FIG. 9, indicam que o construto Δ25 - D118A teve a menor afinidade para o TβRII (fusão de TβRII-Ig). A adição de um E55A, D32N ou S52L, com impactos cada vez maiores da constante de dissociação para complexos de TGF- β3-TβRII, fornece complexos com afinidade crescente para TβRII exógena (a fusão de TβRII-Ig neste caso).

E. Exemplo 5 Atividade biológica do complexo de TGF-β mascarado heterodimérico (PSM-4033-4039) com estabilização polipeptídica de scaffold interespecífico, com uma cadeia única tendo um polipeptídeo MOD de IL-2 variante

[00726] Um complexo de TGF-β mascarado, PSM-4033-4039, conforme mostrado na FIG. 10A, foi preparado. O complexo compreende o primeiro e segundo polipeptídeos 4033 e 4039 mostrados nas FIGS. 10B e 10C, respectivamente. Uma série de experimentos foi então realizada com PSM-4033-4039.

Experimento 1: Indução de Foxp3+ iTregs a partir de células T CD4+ humanas não expostas periféricas.

[00727] As células T CD4+ não expostas foram separadas do sangue humano e plaqueadas com CD3 anti-humano (5 ug/mL), CD28 anti-humano (1 ug/mL) e uma dose crescente de PSM-4033-4039 ou uma dose única de TGFb3 recombinante e IL-2 como controle positivo. Após 5 dias em cultura, as células foram avaliadas por citometria de fluxo para expressão do fator de transcrição Foxp3. n = 2, stdev. Os resultados, fornecidos na FIG. 11 mostram uma indução significativa de FoxP3 em células expostas ao PSM-4033-4039 em concentrações de até 1.000 nM. Estes resultados são semelhantes aos mostrados na FIG. 6B com outros construtos e complexos de TGF-β mascarados, demonstrando ainda que os construtos e complexos de TGF-β3 mascarados divulgados neste documento podem efetuar uma indução significativa de FoxP3, que é um regulador mestre da expressão gênica em Tregs, incluindo Tregs naturais e induzidas, e central para a identidade e função de Treg.

Experimento 2: A supressão da proliferação de células T por PSM-4033- 4039 induziu Foxp3+ iTregs.

[00728] As células T reguladoras Foxp3+ induzidas por PSM-4033- 4039 (iTreg) foram cultivadas em diferentes razões em relação às células T convencionais (Tresponder) e estimuladas com CD3 anti-humano (1 ug/mL) e células mononucleares do sangue periférico tratadas com mitomicina C (PBMCs). A proliferação foi avaliada por citometria de fluxo após quatro dias pela diluição do corante violeta de traço celular (CTV) em células Tresponder. Os dados, mostrados na FIG. 12, representam uma média de três doadores, plaqueados em duplicata cada. As células T reguladoras induzidas por TGF-β3 e IL-2 ou células T CD4+ periféricas totais foram usadas no lugar de iTregs, como controles. A supressão é definida como % menos de diluição de CTV em comparação com nenhum controle iTreg adicionado (média de 78% de CTV diluído). Os resultados deste experimento demonstram que as células T reguladoras Foxp3+ induzidas pelos construtos e complexos de TGF-β3 mascarados divulgados neste documento, por exemplo, PSM-4033- 4039, podem suprimir a proliferação de células T ativadas por reticulação e coestimulação de CD3, fornecidas por células apresentadoras de antígeno em PBMCs.

[00729] Uma característica definidora das Tregs além de sua expressão do fator de transcrição, Foxp3, é sua capacidade de suprimir a ativação e a função de outros leucócitos. Este experimento demonstra que iTregs induzidas por construtos e complexos de TGF-β3 mascarados divulgados neste documento podem realmente suprimir a proliferação de células T ativadas por reticulação e coestimulação de CD3, fornecidas por células apresentadoras de antígeno em PBMCs.

Experimento 3: Indução da expressão de Foxp3+ a partir de células T CD4+periféricas humanas por PSM-4033-4039.

[00730] As células T CD4+ totais foram separadas do sangue humano e plaqueadas com CD3 anti-humano (5 ug/mL), CD28 anti-humano (1 ug/mL) e uma dose crescente de PSM-4033-4039. Após 5 dias em cultura, as células foram avaliadas por citometria de fluxo para expressão do fator de transcrição Foxp3. n = 2. Os dados são ilustrados na FIG. 13A.

[00731] Para determinar qual tipo de célula em uma mistura de tipos de células T CD4+ poderia se diferenciar em células que expressam Foxp3, diferentes populações foram classificadas e tratadas com PSM-4033-4039 individualmente. Consequentemente, as células T CD4+ não expostas, totais e de memória para um doador diferente dos doadores da FIG. 13A foram classificadas e cultivadas da mesma maneira que acima, com ou sem PSM- 4033-4039 (300 nM), e Foxp3 foi avaliado por citometria de fluxo no dia 5. Os dados são ilustrados na FIG. 13B.

[00732] As células T CD4+ totais, que foram diferenciadas em células que expressam Foxp3 neste experimento, representam células T periféricas não expostas e de memória, uma mistura de tipos de células que mascararam construtos e complexos de TGF-β3 divulgados neste documento, por exemplo, PSM-4033-4039, encontraria quando administrados in vivo. Estes dados mostram que, mesmo em uma população de células T mistas, construtos e complexos de TGF-β3 mascarados divulgados neste documento, por exemplo, PSM-4033-4039, podem aumentar a frequência de células que expressam Foxp3, um regulador mestre de uma expressão gênica que define células T reguladoras. Os resultados mostrados na FIG. 13B mostram que PSM-4033-4039 pode induzir as células T CD4+ de memória a se diferenciar em células Foxp3+, mesmo que a uma frequência mais baixa do que as células T CD4+ não expostas.

Experimento 4: Indução de Foxp3+ iTregs por PSM-4033-4039 a partir de células T CD4+ ativadas por uma reação de linfócitos alogênicos.

[00733] As células T CD4+ periféricas totais foram separadas do sangue humano e plaqueadas com DCs derivadas de monócitos alogênicos (moDCs) para induzir a proliferação de células T. As células T foram misturadas com moDCs autólogas como um controle, e ambas as combinações de doadores alogênicos ou autólogos foram tratadas com anti- CD3 solúvel (1 ug/mL) como um controle adicional. As células T foram marcadas com corante violeta de traço celular (CTV) para rastrear as células que responderam à ativação alogênica. A proliferação e a expressão de Foxp3 foram analisadas por citometria de fluxo no dia 5, e a frequência de células proliferadas que expressam Foxp3 é plotada nas FIGS 14A e B. Duas combinações de doadores são mostradas. n = 2, stdev. Entre outras coisas, os resultados demonstram o uso potencial dos construtos e complexos de TGF- β3 mascarados divulgados neste documento, por exemplo, PSM-4033-4039, para o tratamento de doença de enxerto versus hospedeiro que ocorre em pacientes com transplante de medula óssea ou células-tronco.

Experimento 5: Experimento PK em camundongos usando PSM-4033- 4039.

[00734] PSM-4033-4039 foi administrado por via intravenosa como doses únicas a camundongos Balb/c a 0,1, 1 ou 10 mg/kg. As amostras de soro periférico foram então coletadas 5 minutos, 2, 8, 24 e 72 horas após a dose. As concentrações séricas de PSM-4033-4039 foram então determinadas usando um ensaio de ligação ao ligante que capturou a molécula usando um anticorpo anti-IL2 e detectou a molécula usando um anticorpo anti-TGFB3. Os resultados fornecidos na FIG. 15 mostram que os construtos e complexos de TGF-β3 mascarados divulgados neste documento, por exemplo, PSM- 4033-4039, podem permanecer presentes no soro em concentrações biologicamente relevantes por mais de 72 horas após a administração. A sequência do construto 4033 é fornecida na Fig. 10B (SEQ ID NO:191) e a sequência do construto 4039 é fornecida na FIG. 10C (SEQ ID NO:192).

[00735] Embora a presente divulgação tenha sido descrita com referência às modalidades específicas da mesma, deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem afastamento do verdadeiro espírito e escopo da divulgação. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para que adaptem uma situação, material, composição da matéria, etapa ou etapas do processo particular ao objetivo, espírito e escopo da presente divulgação. Todas essas modificações são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações anexadas a este documento.

Claims

1. Complexo de TGF-β, caracterizadopelo fato de que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo como um heterodímero, em que: (i) o primeiro polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica, b) uma sequência polipeptídica de mascaramento compreendendo opcionalmente uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ou uma sequência polipeptídica anti-TGF-β, c) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente; e (ii) o segundo polipeptídeo compreende a) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica de contraparte à sequência de dimerização interespecífica no primeiro polipeptídeo, b) uma sequência polipeptídica de TGF-β, c) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente, e d) opcionalmente, uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente; em que a sequência polipeptídica de mascaramento e a sequência polipeptídica de TGF-β se ligam umas às outras; em que a sequência de ligação interespecífica e a sequência de ligação interespecífica de contraparte interagem entre si (por exemplo, se ligam de forma covalente ou não covalente) no heterodímero; e em que o primeiro polipeptídeo TGF-β mascarado e/ou o segundo polipeptídeo compreendem opcionalmente uma ou mais sequências polipeptídicas ligantes selecionadas independentemente.

2. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que: o primeiro polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C, a) uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente, a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica e a sequência polipeptídica de mascaramento; ou b) uma sequência polipeptídica de scaffold compreendendo uma sequência de dimerização interespecífica e a sequência polipeptídica de mascaramento (por exemplo, sequência polipeptídica do receptor TGF-β); e o segundo polipeptídeo compreende, do terminal N ao terminal C, uma ou duas (ou mais) sequências MOD selecionadas independentemente, a sequência polipeptídica de scaffold compreendendo a sequência de dimerização interespecífica de contraparte e a sequência polipeptídica de TGF-β.

3. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a(s) sequência(s) polipeptídica(s) de scaffold é(são) selecionada(s) do grupo que consiste em sequências polipeptídicas de Fc de Ig e variantes destas, opcionalmente em que as sequências polipeptídicas de Fc de Ig incluem mutações que reduzem a ligação do polipeptídeo ao componente 1q (C1q) do complemento e/ou ao receptor Fc lambda (FcÀR) e/ou reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade do polipeptídeo de Ig de induzir a lise celular, por exemplo, através da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

4. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências polipeptídicas MOD selecionadas independentemente são selecionadas do grupo que consiste em: sequências polipeptídicas MOD PD- L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 e variantes de qualquer uma destas.

5. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das sequências polipeptídicas MOD é uma sequência polipeptídica MOD de IL-2 wt. ou sequência polipeptídica MOD de IL-2 variante, (i) com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa com pelo menos 80, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133 aas contíguos da SEQ ID NO:9; ou (ii) com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aa ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 80, 90, 100, 110, 120, 130 ou 133 aas contíguos de uma das SEQ ID NOs: 13-27.

6. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência polipeptídica de mascaramento é uma sequência polipeptídica do receptor TGF-β ("TβR") que compreende um fragmento de ectodomínio de um TβR tipo I (TβRI), tipo II (TβRII) ou tipo III (TβRIII).

7. Complexo de TGF-β mascarado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o complexo é formado a partir da combinação do construto polipeptídico 4033 (SEQ. ID. NO.:191) e construto polipeptídico 4039 (SEQ. ID. NO.:192).

8. Um ou mais ácidos nucleicos, caracterizados pelo fato de que codificam um complexo de TGF-β mascarado, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.

9. Uso de um ou mais complexos de TGF-β mascarados, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, ou um ácido nucleico, como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para induzir células Treg em um sujeito mamífero ou tratar uma doença ou condição em um sujeito.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em: doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante, encefalomielite autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, infertilidade autoimune-associada, púrpura trombocitopênica autoimune, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis (MG), pênfigo, anemia perniciosa, polimiosite, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo 1 (T1D), doença celíaca, vasculite e vitiligo.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um complexo formado a partir da combinação do constructo de polipeptídeo 4033 (SEQ ID NO:191) e do constructo de polipeptídeo 4039 (SEQ ID NO:192).

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais células hospedeiras geneticamente modificadas, em que as células hospedeiras geneticamente modificadas compreendem, individual ou coletivamente, um ou mais ácidos nucleicos, como definidos na reivindicação 8.

13. Método para produzir uma construção ou complexo de TGF-β mascarado, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma composição de células hospedeiras geneticamente modificadas como definida na reivindicação 12 sob condições tais que as células hospedeiras geneticamente modificadas produzam o complexo de TGF-β.

14. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende um ou mais construtos ou complexos de TGF-β mascarado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam um complexo de TGF-β mascarado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de ser para uso no tratamento de uma condição ou doença autoimune.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizadapelo fato de ser para uso no tratamento de uma condição ou doença autoimune selecionada do grupo que consiste em: doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante, encefalomielite autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, infertilidade autoimune-associada, púrpura trombocitopênica autoimune, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite, doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis (MG), pênfigo, anemia perniciosa, polimiosite, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatóide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes tipo 1 (DT1), doença celíaca, vasculite e vitiligo.

17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizadapelo fato de que o medicamento compreende um complexo formado a partir da combinação da construção polipeptídica 4033 (SEQ. ID. NO.:191) e da construção polipeptídica 4039 (SEQ. ID. NO.:192).

18. Uso de um ou mais complexos de TGF-β mascarados como definidos com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou um ácido nucleico como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para modular a atividade de células imunes.

19. Método para entrega de um polipeptídeo TGF-β e opcionalmente pelo menos um polipeptídeo MOD a células que expressam em sua membrana superficial um TβR, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender: contatar uma população de células com uma quantidade de um complexo de TGF-β mascarado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

20. Complexo de TGF-β, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o complexo tem a forma de estrutura D ou E: