JP2023539195A - 組換えトランスフォーミング増殖因子（ｔｇｆ）－ベータ単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスおよびその使用 - Google Patents

Abstract

ＴＧＦ－β受容体Ｉのホモ二量体形成および動員を妨げるように操作されたＴＧＦ－βの組換え型をコードする腫瘍溶解性ウイルスが記載される。操作されたＴＧＦ－βミニ単量体は、ドミナントネガティブＴＧＦ－β阻害剤として機能する。ＴＧＦ－βミニ単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、免疫抑制性の腫瘍微小環境を阻害するがん免疫療法のために使用することができる。提供されるのは、組換えＴＧＦ－β単量体、例えばヒト組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスである。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年８月２７日に出願された米国仮出願番号第６３／０７０，９６５号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

分野
本開示は、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害剤として機能する組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスに関する。本開示はさらに、がん免疫療法のためのＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスの使用に関する。
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＧＭ０５８６７０およびＣＡ１７２８８６の政府支援によりなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

背景
ＴＧＦ－βは、細胞増殖、遊走、分化、およびアポトーシスを含む細胞プロセスに対して多様な生物学的影響を有する多機能性サイトカインである。３つの哺乳動物ＴＧＦ－βアイソフォーム、ＴＧＦ－β１、－β２および－β３は、Ｉ型（ＴβＲＩ）およびＩＩ型（ＴβＲＩＩ）セリン／スレオニンキナーゼ受容体から構成される細胞表面受容体複合体を通じてその機能を発揮する。受容体活性化は、ＳＭＡＤタンパク質、ならびにＲａｓ、ＲｈｏＡ、ＴＡＫ１、ＭＥＫＫ１、ＰＩ３Ｋ、およびＰＰ２Ａを含む他の下流の標的の両方を誘導して、全面的なＴＧＦ－β応答をもたらす（RobertsおよびWakefield、Proc Natl Acad Sci USA １００巻：８６２１～８６２３頁、２００３年；DerynckおよびZhang、Nature ４２５巻：５７７～５８４頁、２００３年；Massague、Cell １３４巻：２１５～２３０頁、２００８年）。

RobertsおよびWakefield、Proc Natl Acad Sci USA １００巻：８６２１～８６２３頁、２００３年 DerynckおよびZhang、Nature ４２５巻：５７７～５８４頁、２００３年 Massague、Cell １３４巻：２１５～２３０頁、２００８年

要旨
ホモ二量体形成およびシグナル伝達を妨げるように操作されているトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスを開示する。組換えの操作された単量体ＴＧＦ－βは、ＴβＲＩの動員を妨げ、それによって下流のシグナル伝達を遮断することによってＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害剤として機能する。単量体ＴＧＦ－βをコードするワクシニアウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスは、例えばがん免疫療法剤として使用することができる。

提供されるのは、組換えＴＧＦ－β単量体、例えばヒト組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスである。ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β２（本明細書において配列番号２として記載される）の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換（または代替的に、システインからアルギニンへの置換）およびヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失を含む。ＴＧＦ－β単量体は、例えばヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β２、またはヒトＴＧＦ－β３単量体であり得る。

一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換、および／またはヒトＴＧＦ－β２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換をさらに含むヒトＴＧＦ－β２単量体である。他の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β１（本明細書において配列番号１として記載される）の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；ヒトＴＧＦ－β１の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；および／またはヒトＴＧＦ－β１の残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換をさらに含むヒトＴＧＦ－β１単量体である。他の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β３（本明細書において配列番号３として記載される）の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換；ヒトＴＧＦ－β３の残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換；および／またはヒトＴＧＦ－β３の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換をさらに含むヒトＴＧＦ－β３単量体である。一部の例では、ＴＧＦ－β単量体は、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。一部の例では、単量体は、単量体の凝集を減少させる少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。一部の例では、単量体は、単量体のフォールディングを改善する少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。

代替の実施形態では、提供されるのは、Ｄａｎ ａｎｄ Ｃｅｒｕｂｕｓに関連するタンパク質（ＰＲＤＣ）のシスチンノット領域を含むように改変されたヒト組換えＴＧＦ－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスである。一部の例では、ＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号１１を含む、または配列番号１１からなる。

一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノウイルスである。

また、提供されるのは、本明細書に開示されたヒト組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物である。

さらに提供されるのは、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を対象に投与することによって、対象におけるがんを処置する方法、およびがんを有する対象における腫瘍の成長または転移を阻害する方法である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、頭頸部がん、または膵臓がんである。

本発明の前述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付図面を参照して進められる以下の詳細な記述からより明らかになるであろう。

図１Ａ～１Ｅ：シングルセルＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）は、腫瘍溶解性ウイルスが、劇的な免疫浸潤を誘導するが、これらは代謝抑制および免疫学的抑制に屈することを明らかにする。（図１Ａ）実験のセットアップ。Ｐｔｅｎ欠損、Ｂｒａｆ^{Ｖ６００Ｅ}クローン２４黒色腫を有するマウスを、ＰＢＳまたは腫瘍溶解性の二重欠失（ＴＫおよびＶＧＦ欠失）ＶＶのいずれかによって処置した。例としての腫瘍成長曲線を示す。１２日目に、腫瘍がまだ退縮していないときに、ＣＤ４５＋細胞をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに供した。（図１Ｂ）両方の処置群から配列決定した全ての細胞のＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）クラスタリング。（図１Ｃ）ＶＶが劇的な腫瘍微小環境のリモデリングを誘導することを明らかにする、処置によって破壊された細胞のＵＭＡＰ。丸は、新規腫瘍浸潤性Ｔ細胞を示す。（図１Ｄ）新規Ｔ細胞浸潤物中のＴＧＦ－β応答遺伝子。（図１Ｅ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞がなおも代謝不全に屈することを示す、ＰＢＳまたはＶＶ処置腫瘍におけるミトコンドリア質量測定。 図１Ａ～１Ｅ：シングルセルＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）は、腫瘍溶解性ウイルスが、劇的な免疫浸潤を誘導するが、これらは代謝抑制および免疫学的抑制に屈することを明らかにする。（図１Ａ）実験のセットアップ。Ｐｔｅｎ欠損、Ｂｒａｆ^{Ｖ６００Ｅ}クローン２４黒色腫を有するマウスを、ＰＢＳまたは腫瘍溶解性の二重欠失（ＴＫおよびＶＧＦ欠失）ＶＶのいずれかによって処置した。例としての腫瘍成長曲線を示す。１２日目に、腫瘍がまだ退縮していないときに、ＣＤ４５＋細胞をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに供した。（図１Ｂ）両方の処置群から配列決定した全ての細胞のＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）クラスタリング。（図１Ｃ）ＶＶが劇的な腫瘍微小環境のリモデリングを誘導することを明らかにする、処置によって破壊された細胞のＵＭＡＰ。丸は、新規腫瘍浸潤性Ｔ細胞を示す。（図１Ｄ）新規Ｔ細胞浸潤物中のＴＧＦ－β応答遺伝子。（図１Ｅ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞がなおも代謝不全に屈することを示す、ＰＢＳまたはＶＶ処置腫瘍におけるミトコンドリア質量測定。

図２Ａ～２Ｂ：ＴＧＦ－β２の操作されたミニ単量体は、ＴＧＦβＲシグナル伝達のドミナントネガティブ阻害剤として作用する。（図２Ａ）ミニ単量体ＴＧＦ－βがどのように機能するかの概略図。非改変ＴＧＦ－βは二量体として作用し、ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩを動員してシグナルを伝達する（左）。ジスルフィド架橋を維持するシステイン残基を突然変異させ、ＲＩと接触する重要な「ヒール」ヘリックスを構造情報に基づき除去すると、ＴＧＦβＲＩＩの結合能を保持するが、ＲＩ動員を妨げるミニ単量体ＴＧＦ－βを生成する（右）。（図２Ｂ）ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、またはミニ単量体分子（ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ、ｄｎＴＧＦβ２^ｍｍとも呼ばれる）の様々な濃度によって処置したＨＥＫ－２９３ＴＧＦレポーター細胞系におけるルシフェラーゼアッセイ、これはｄｎＴＧＦβ２^ｍｍが、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３の活性を阻害できることを明らかにする。

図３Ａ～３Ｃ：ｄｎＴＧＦβ２^ｍｍは、腫瘍溶解性ウイルスによって送達することができ、優れた抗腫瘍活性を有する。（図３Ａ）対照ウイルスまたはＶＶ－ｄｎＴＧＦβ２^ｍｍを２４、４８、または７２時間感染させたＢ１６黒色腫細胞におけるＴＧＦ－βのイムノブロット。非還元ゲルは、１０ｋＤａでバンドを示し、これはミニ単量体の概算のサイズである。（図３Ｂ）組換えＴＧＦ－βおよび対照（Ｃ）またはｄｎＴＧＦβ２^ｍｍ発現ウイルス感染細胞からの上清を１０倍希釈で使用するＴＧＦ－βレポーターアッセイ。（図３Ｃ）２．５×１０^６ＰＦＵのＶＶ^ｃｔｒｌまたは操作されたｄｎＴＧＦβ２^ｍｍ発現ＶＶによって処置したＢ１６黒色腫の腫瘍成長曲線。

図４Ａ～４Ｅ：操作されたＴＧＦ－β単量体ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（配列番号７）と、ＴＧＦ－β２（配列番号２）（図４Ａ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）（図４Ｂ）、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８＿１７（配列番号１０）（図４Ｃ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）（図４Ｄ）、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１２）（図４Ｅ）との配列比較。配列の差を、２つの整列させた配列の下の数字によって示し、数値の同一性は差の性質を示す。配列同一性を星印で示す。図４Ａの配列の下に示されるのは、ＴＧＦ－β３－（ＴβＲＩＩ）_２－（ＴβＲＩ）_２複合体（ＰＤＢ ２ＰＪＹ）（左）およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＴβＲＩＩ複合体（ＰＤＢ ５ＴＸ４）（右）の構造であり、主な構造特色の一部を示す。 図４Ａ～４Ｅ：操作されたＴＧＦ－β単量体ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（配列番号７）と、ＴＧＦ－β２（配列番号２）（図４Ａ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）（図４Ｂ）、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８＿１７（配列番号１０）（図４Ｃ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）（図４Ｄ）、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１２）（図４Ｅ）との配列比較。配列の差を、２つの整列させた配列の下の数字によって示し、数値の同一性は差の性質を示す。配列同一性を星印で示す。図４Ａの配列の下に示されるのは、ＴＧＦ－β３－（ＴβＲＩＩ）_２－（ＴβＲＩ）_２複合体（ＰＤＢ ２ＰＪＹ）（左）およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＴβＲＩＩ複合体（ＰＤＢ ５ＴＸ４）（右）の構造であり、主な構造特色の一部を示す。 図４Ａ～４Ｅ：操作されたＴＧＦ－β単量体ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（配列番号７）と、ＴＧＦ－β２（配列番号２）（図４Ａ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）（図４Ｂ）、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８＿１７（配列番号１０）（図４Ｃ）、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）（図４Ｄ）、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１２）（図４Ｅ）との配列比較。配列の差を、２つの整列させた配列の下の数字によって示し、数値の同一性は差の性質を示す。配列同一性を星印で示す。図４Ａの配列の下に示されるのは、ＴＧＦ－β３－（ＴβＲＩＩ）_２－（ＴβＲＩ）_２複合体（ＰＤＢ ２ＰＪＹ）（左）およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＴβＲＩＩ複合体（ＰＤＢ ５ＴＸ４）（右）の構造であり、主な構造特色の一部を示す。

図５Ａ～５Ｆ：親タンパク質、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（図５Ｄ～５Ｆ）と比較したｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（図５Ａ～５Ｃ）のアミド^１Ｈ－^１５Ｎ １－ｂｏｎｄシフト相関ＮＭＲスペクトル。スペクトルを、ｐＨ４．６（図５Ａおよび５Ｄ）、またはｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液中、３７℃で緩衝液中にＣＨＡＰＳの非存在下（図５Ｂおよび５Ｅ）または最終濃度１０ｍＭとなるようにＣＨＡＰＳを添加して（図５Ｃおよび５Ｆ）記録した。

図６Ａ～６Ｃ：ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７のアミド^１Ｈ－^１５Ｎ １－ｂｏｎｄシフト相関ＮＭＲスペクトル。スペクトルを、ｐＨ４．６（図６Ａ）、またはｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液中、３７℃で緩衝液中にＣＨＡＰＳの非存在下（図６Ｂ）または最終濃度１０ｍＭとなるようにＣＨＡＰＳを添加して（図６Ｃ）記録した。

図７Ａ～７Ｄ：ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（図７Ａ～７Ｃ）のアミド^１Ｈ－^１５Ｎ １－ｂｏｎｄシフト相関ＮＭＲスペクトル、および未変性ゲル電気泳動によって検出したＴβＲＩＩに対する結合（図７Ｄ）。スペクトルを、ｐＨ４．８（図７Ａ）またはｐＨ６．０（図７Ｂ～７Ｃ）の１０ｍＭリン酸緩衝液中、３７℃で記録した。図７Ｂおよび図７Ｃは、シグナルをプロットする等高線レベルのみが異なる（図７Ｂは、図７Ｃのパネルと比較してノイズにより近い等高線レベルでプロットされる）。図７Ｄに示す未変性ゲルは、２μｇのＴβＲＩＩ単独（最も左側のレーン）、または指定されたモル比（＋Ａおよび＋Ｂはそれぞれ、ＴβＲＩＩ：操作されたＴＧＦ－β単量体の１：１または２：１モル比のいずれかを示す）で添加された操作されたＴＧＦ－β単量体のいずれかを泳動させることによって実施された。

図８：等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって検出したときの、操作されたＴＧＦ－ベータ単量体（ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－左、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－中央、およびｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７－右）の、ＴＧＦ－βＩＩ型受容体、ＴβＲＩＩに対する結合。上のパネルは、３回の反復滴定の未加工サーモグラムを表し、下のパネルは、１：１結合等温線（平滑曲線）に全体をフィットさせた３回の反復滴定に関する積分した熱量（データ点）を表す。フィットさせたパラメーターを、下の表に提供する。

図９Ａ～９Ｄ：操作されたＴＧＦ－ベータ単量体の阻害能を互いに比較して評価するためのＨＥＫ－２９３細胞ベースのＣＡＧＡ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－βレポーターアッセイ。ＴＧＦ－β ＣＡＧＡ－Ｌｕｃレポーターを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞を、示される操作されたＴＧＦ－ベータ単量体の指定された濃度によって３０分間処置した後、１０ｐＭ ＴＧＦ－β３の添加によって刺激した。細胞を１４時間後に回収し、ルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。（図９Ａ）ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（配列番号７）、ＩＣ_５０ ５８．２３ｎＭ。（図９Ｂ）ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）、ＩＣ_５０ ５３．２９ｎＭ。（図９Ｃ）ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１０）、ＩＣ_５０ １１１．０ｎＭ。（図９Ｄ）ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）、ＩＣ_５０ ２８２．５ｎＭ。示されたデータ点およびエラーバーは、３連測定の平均値および標準偏差に対応する。平滑曲線は、標準的な用量反応阻害等温線に対するフィットに対応する。フィットさせたＩＣ_５０値を示す。

図１０：ｍｍＴＧＦβバリアント１（ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７）を発現するワクシニアウイルス（ＶＶ）は、耐性がんモデルにおいて優れた有効性を示す。（上）Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）系ＭＥＥＲサブクローンを接種した。７日目、マウスに、対照ＶＶ（ＶＶ^Ｃｔｒｌ）、またはｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（ＶＶ^{ｍｍＴＧＦβ（ｖａｒ１）}またはＶＶ^{ｍｍＴＧＦβｉ}とする）（配列番号１２）を発現するように操作されたＶＶのいずれかの２．５×１０^５ＰＦＵの腫瘍内注射を行った。対照ウイルスは、わずかな治癒効果を有したが、ＶＶ^{ｍｍＴＧＦβ（ｖａｒ１）}によって処置したマウスの半数が、完全な応答を示し、長期間持続する生存利益を示した。（中央）Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに黒色腫系クローン２４（ＣＬ２４）を接種した。７日目に、マウスに、ＶＶ対照（ＶＶ^Ｃｔｒｌ）またはｍｍＴＧＦβｉを発現するＶＶの２．５×１０^５ＰＦＵを投与した。ＶＶ^{ｍｍＴＧＦβｉ}の投与は、処置した動物の４０％において完全な応答をもたらした。（下）抗ＰＤ１を添加すると、ＣＬ２４モデルにおいてＶＶ^{ｍｍＴＧＦβｉ}の腫瘍阻害効果を増強した。

配列表
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基に関して標準的な文字略語およびアミノ酸に関して３文字コードを使用して示される。各核酸配列の１つのみの鎖を示すが、相補鎖も、表示される鎖を参照して含まれると理解される。配列表は、参考として本明細書中に援用される、２０２１年８月２７日に作成された１０．８ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されている。添付の配列表において：
配列番号１は、野生型ヒトＴＧＦ－β１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型ヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型ヒトＴＧＦ－β３のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ｍｍＴＧＦ－β１と称する操作されたヒトＴＧＦ－β１単量体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ｍｍＴＧＦ－β２と称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ｍｍＴＧＦ－β３と称する操作されたヒトＴＧＦ－β３単量体のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍと称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ヒトＩＬ－２シグナル配列のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒと称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７と称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣと称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７と称する操作されたヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列である。

詳細な説明
Ｉ．略号
ＣＨＡＰＳ ３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート
ＣＫＧＦ シスチンノット増殖因子フォールド
ＨＮＳＣＣ 頭頸部扁平上皮癌
ＨＳＱＣ 異核種単一量子相関
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ｏＶＶ 腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
ＰＲＤＣ Ｄａｎ ａｎｄ Ｃｅｒｕｂｕｓに関連するタンパク質
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ シングルセルＲＮＡ配列決定
ＴＧＦ－β トランスフォーミング増殖因子β
ＴβＲＩ トランスフォーミング増殖因子－β１型受容体
ＴβＲＩＩ トランスフォーミング増殖因子－β２型受容体
ＴＫ チミジンキナーゼ
ＶＧＦ ウイルス増殖因子
ＶＶ ワクシニアウイルス

ＩＩ．用語
特に断りのない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishers, 2009；およびMeyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, published by Wiley-VCH in 16 volumes, 2008；および他の類似の参考文献に見出すことができる。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、単数ならびに複数の両方を指す。例えば、「抗原」という用語は、単一または複数の抗原を含み、「少なくとも１個の抗原」という語句と等価であると考えることができる。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。特に断りのない限り、核酸またはポリペプチドに関して与えられたあらゆる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されたものと類似または同等の多くの方法および材料が使用され得るが、特定の好適な方法および材料を本明細書に記載する。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。

様々な実施形態の概説を容易にするために、以下に用語の説明を提供する：

投与：任意の有効な経路により、対象に治療剤（例えば、ＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルス）などの薬剤を提供する、または与えること。例示的な投与経路としては、注射または注入（腫瘍内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、静脈内、前立腺内、脳室内、線条体内、頭蓋内および脊髄など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

異種の：別個の遺伝源または種に由来すること。

単離された（isolated）：核酸、タンパク質（抗体を含む）、オルガネラまたは組換えウイルスなどの「単離された」生物学的成分は、成分が存在する環境（細胞など）における他の生物学的成分、すなわち、他の染色体ＤＮＡおよびＲＮＡならびに染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、およびオルガネラから実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。該用語はまた、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸またはタンパク質も包含する。単離されたとは、絶対的な純度を必要とするのではなく、少なくとも５０％単離された、例えば少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらに９９．９％単離されたタンパク質、ペプチド、核酸分子、またはウイルスを含み得る。

黒色腫：メラノサイト（色素メラニンを作製する細胞）を起源とするがんの形態。メラノサイトは、皮膚に主に見出されるが、腸および眼にも存在する。本明細書で使用される場合、「黒色腫」は、任意のステージの黒色腫、または任意のサブタイプの黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫、悪性黒子、表皮内黒色腫、粘膜黒色腫、およびぶどう膜黒色腫を指す。

改変：核酸配列またはタンパク質配列の変化。例えば、アミノ酸配列改変は、例えば置換、挿入、および欠失、またはその組合せを含む。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書における一部の実施形態では、改変（置換、挿入、または欠失など）は、タンパク質の特定の活性の低減または増強などの機能の変化をもたらす。置換による改変は、少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入される改変である。アミノ酸置換は典型的に、単一残基の置換であるが、複数の異なる位置で同時に起こり得る。置換、欠失、挿入、またはそのいずれかの組合せを組み合わせて、最終的な突然変異体配列に到達してもよい。これらの改変は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの改変によって調製され、それによって改変をコードするＤＮＡを産生することができる。既知の配列を有するＤＮＡにおける既定の部位で挿入、欠失、および置換突然変異を作製するための技術は、公知である。「改変された」タンパク質、核酸、またはウイルスは、上記で概要される１つまたは複数の改変を有するものである。

単量体：他の分子単位と結合して二量体またはポリマーを形成することができる単一分子単位（タンパク質など）。本開示との関連において、「ＴＧＦ－β単量体」は、野生型バージョンが他のＴＧＦ－β単量体に結合して二量体を形成することができる、単一ＴＧＦ－βポリペプチド鎖である。本明細書におけるいくつかの実施形態において、組換えＴＧＦ－β単量体は、二量体化を防ぐように操作されている。

新生物、悪性腫瘍、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂の結果生じる組織または細胞の異常増殖である。新生物の増殖は、腫瘍をもたらす可能性がある。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤する腫瘍および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。

血液の腫瘍の例としては、白血病が挙げられ、これらは急性白血病（１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病、および骨髄異形成を含む。

固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん（基底膜乳癌、乳管癌、および小葉乳癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、髄様甲状腺癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫など）が挙げられる。一例では、腫瘍は頭頸部がん、例えば頭頸部の扁平上皮癌であり、口腔、咽頭、喉頭、副鼻腔、および鼻腔、および唾液腺に起こり得る。一部の例では、頭頸部がんは、ヒト乳頭腫ウイルス陽性、例えばＨＰＶ１６型陽性である。

腫瘍溶解性ウイルス：腫瘍細胞において優先的に複製し、腫瘍細胞を殺滅する任意のウイルス。この用語は、天然に存在する腫瘍溶解性ウイルスならびに腫瘍細胞を標的として殺滅するように設計された組換えウイルスを含む。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、および水疱性口内炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Raja et al., J Immunother Cancer 6: 140, 2018を参照されたい）。

膵臓がん：膵臓組織で始まるがん。膵臓がんは、典型的に急速に広がり、初期段階で検出されることはほとんどなく、診断されたほとんどの患者において不良な予後をもたらす。最も一般的なタイプの膵臓がんは、膵腺癌であり、これは膵臓がん症例のおよそ８５％を占める。

ペプチドまたはポリペプチド：単量体がアミド結合を通じて連結しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸である場合、Ｌ－光学異性体またはＤ－光学異性体のどちらかが使用され得、Ｌ－異性体が好ましい。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、任意のアミノ酸配列を包含し、修飾グロブリンタンパク質を含む修飾配列を含むことが意図される。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質、および組換えによりまたは合成的に産生されるものを含むことが特に意図される。

保存的アミノ酸置換は、なされた場合、元のタンパク質の特性を妨げることが最も少ない、すなわち、タンパク質の構造および特に機能が保存され、そのような置換により大幅に変更されない置換である。保存的置換の例を以下に示す。

保存的置換は、（ａ）例えば、シート構造もしくはヘリックス構造としての、置換エリアのポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を概ね維持する。

一般に、タンパク質特性に最大の変化をもたらすことが予想される置換は、非保存的な、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンに（または、によって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（または、によって）置換される；（ｃ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジンが、負電荷残基、例えば、グルタミンまたはアスパラギン酸に（または、によって）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を持たないもの、例えば、グリシンに（または、によって）置換される変化となる。

薬学的に許容可能な担体：本開示において有用な薬学的に許容可能な担体（媒体）は、従来通りである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21^st Edition (2005)は、１つまたは複数の治療化合物、分子、または薬剤（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）の薬学的送達にとって好適である組成物および製剤を記載する。

一般的に、担体の性質は、使用される特定の投与方法に依存する。例えば、非経口製剤は通常、媒体として水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等などの薬学的および生理学的に許容可能な流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）に関して、従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）などの微量の非毒性補助物質を含有し得る。

疾患の予防（preventing）、処置（treating）または改善（ameliorating）：疾患の「予防」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置」は、疾患または病態が発症し始めた後に、腫瘍負荷の低減（例えば、腫瘍の体積またはサイズの減少）または転移物のサイズの数（number of size）の減少など、疾患または病態の徴候または症状を改善する治療介入を指す。「改善」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。

組換え：組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有する、または２つの、さもなければ別々の配列セグメントの人工的組合せにより作られた配列を有するものである。この人工的組合せは、核酸の単離されたセグメントの化学合成または人工的操作により、例えば、遺伝子操作技法によりしばしば達成される。組換えという用語は、天然の核酸分子またはタンパク質の一部の付加、置換、または欠失により変更されている核酸、タンパク質およびウイルスを含む。

対象：ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリーである脊椎生物を含む、生きている多細胞生物。

治療有効量：処置されている対象において所望の効果を得るのに十分な、化合物または組成物、例えば組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスの分量。例えば、これは、細胞におけるＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害または遮断するのに必要な量であってもよい。他の例では、これは、腫瘍の成長を阻害または抑制するために必要な量であってもよい。一実施形態では、治療有効量は、腫瘍を除去するために、腫瘍のサイズを低減させるために、または腫瘍の転移を妨げるために、例えば処置前のサイズ／体積／数と比較して、例えば腫瘍サイズおよび／もしくは体積を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％低減させるため、ならびに／または転移の数および／もしくはサイズ／体積を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくはさらに１００％低減させるために必要な量である。一実施形態では、治療有効量は、例えば組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスによる処置を行わない同じがんを有する対象の生存期間と比較して、対象の生存期間を、例えば少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、または少なくとも５年延長させるために必要な量である。対象に投与するとき、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示されている標的組織濃度（例えば、腫瘍における）を達成する投与量が一般的に使用される。

導入遺伝子：異なる生物（腫瘍溶解性ウイルスなど）のゲノムに挿入されている遺伝子。導入遺伝子はまた、異種遺伝子とも呼ばれ得る。本開示の文脈では、導入遺伝子は、例えば、ケモカイン、サイトカイン、腫瘍関連抗原、免疫共刺激分子、免疫チェックポイント阻害剤、自殺遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス促進タンパク質、または抗血管新生タンパク質をコードし得る。

トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）：増殖、細胞分化、およびいくつかの他の細胞機能を制御する、分泌された多機能性タンパク質。多くの細胞がＴＧＦ－βを合成し、ほとんど全ての細胞がＴＧＦ－βの受容体を発現する。用語「ＴＧＦ－β」は、それぞれ、遺伝子ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３によりコードされる３つの異なるタンパク質アイソフォーム、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を指す。

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路：細胞増殖、分化およびアポトーシスなどの多くの細胞プロセスに関与するシグナル伝達経路。ＴＧＦ－β経路のメンバーには、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型およびＴＧＦ－β受容体ＩＩ型が挙げられるが、これらに限定されない。

ＴＧＦ－β受容体：用語「ＴＧＦ－β受容体」は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型（ＴβＲＩ、ＴＧＦＢＲ１によりコードされる）およびＴＧＦ－β受容体ＩＩ型（ＴβＲＩＩ、ＴＧＦＢＲ２によりコードされる）を含む。ＴＧＦ－β受容体は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。Ｉ型およびＩＩ型ＴＧＦ－β受容体は、ＴＧＦ－βに結合するとヘテロ二量体複合体を形成し、細胞表面から細胞質へＴＧＦ－βシグナルを伝達する。

ワクシニアウイルス：二本鎖ＤＮＡゲノム（約１９０ｋｂ）を有する大きいエンベロープウイルス。ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のメンバーである。本明細書における一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株である。

ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
免疫療法は、がん処置の状況を劇的に変化させた（Ribas and Wolchok, Science 359(6382):1350-1355, 2018）。最も顕著には、Ｔ細胞上の共阻害性「チェックポイント」分子のモノクローナル抗体媒介遮断の使用は、印象的な臨床結果をもたらし、複数の適応におけるＦＤＡの承認および２０１８年にノーベル医学賞をもたらした。これらの薬剤は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞を再活性化することによって作用し、それらを生産的に分化させて、腫瘍細胞を溶解する。しかし、これらの薬剤の成功は、腫瘍の突然変異負荷（Hellmann et al., N Engl J Med 378(22):2093-2104, 2018）、既に存在するＴ細胞浸潤物、および高いＰＤ－Ｌ１発現を含む、がん細胞に対して休眠中のくすぶっている免疫応答を有する患者に依存する。そのため、これらの治療から利益を受けるのはごく少数の患者のみである。しかし、大多数は、ほとんどまたは全く免疫浸潤物を有しない免疫学的に「コールド」の腫瘍を有する。これらの患者において免疫応答を再燃させるためには、免疫浸潤および抗原放出を刺激するための他のモダリティを使用しなければならない。

腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍微小環境をたきつけ抗腫瘍免疫を刺激するための魅力的な手段を表す（Bommareddy et al., Nat Rev Immunol 18(8):498-513, 2018；Ribas et al., Cell 170(6):1109-1119, 2017）。腫瘍溶解性ウイルスの背後にある基本的な概念は、増殖性の形質転換様状態を促進するために典型的に使用されるウイルス遺伝子を除去することによって、溶解性ウイルスを操作して、形質転換細胞を複製させることが必要であり得る（Raja et al., J Immunother Cancer 6(1):140, 2018）。遺伝子操作戦略は、これらのウイルスを腫瘍細胞に選択的に感染させ、複製させ、腫瘍細胞を免疫原性的に溶解するように操作することができる（Raja et al., J Immunother Cancer 6(1):140, 2018）。このように、これらの薬剤はまた、強い抗ウイルス免疫応答を引き入れる能力ならびに患者を自身の腫瘍に対してワクチン接種する能力も有する。より重要なことに、これらのウイルスは、それらが腫瘍細胞において選択的に複製することから、腫瘍微小環境に遺伝子カーゴを送達する機会を提供する。実際に、ＦＤＡが承認した腫瘍溶解性ウイルスＴ－ｖｅｃは、樹状細胞の浸潤および成熟を刺激するためにＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含有する（Ott and Hodi, Clin Cancer Res 22(13):3127-3131, 2016）。腫瘍溶解性ウイルスは、免疫浸潤、新規抗腫瘍免疫、ならびに治療応答を強化するために新規遺伝子コード薬剤の送達を提供する。このように、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍の細胞傷害性、免疫療法、およびがんの遺伝子治療を方向付けるための手段を提供する。

本開示は、ＴＧＦ－βシグナル伝達のドミナントネガティブ阻害剤として機能するＴＧＦ－βの単量体型をコードする腫瘍溶解性ウイルスを記載する。提供されるのは、配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換、またはシステインからアルギニンへの置換；および配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失を有する組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスである。これらの改変は、ＴＧＦ－β単量体が二量体を形成するのを妨げる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物ＴＧＦ－β単量体である。特定の例では、ＴＧＦ－β単量体はヒトＴＧＦ－β単量体である。

一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β２単量体である。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；および／または配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換をさらに含む。これらの置換は、単量体の正味電荷を増加させる。

一部の実施形態では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。一部の例では、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換は、配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および／または配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換を含む。

一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換を含む。

特定の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号７を含む、または配列番号５または配列番号７からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

一部の実施形態では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、単量体の凝集を低減させる、および／またはフォールディングを改善する少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、またはさらに含む。一部の例では、単量体の凝集を低減させる、および／またはフォールディングを改善する少なくとも１個のアミノ酸置換は、配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；および／または配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換を含む。

特定の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換を含む。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号９を含む、または配列番号９からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

他の特定の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；および配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換を含む。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号１０を含む、または配列番号１０からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

他の特定の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換を含む。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号１２を含む、または配列番号１２からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

代替の実施形態では、提供されるのは、ＰＲＤＣのシスチンノット領域を含むように改変されたヒト組換えＴＧＦ－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスである。一部の例では、ＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号１１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の例では、ＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号１１を含む、または配列番号１１からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β２単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ヒトＴＧＦ－β１単量体である。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β１単量体は、配列番号１の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；配列番号１の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；および／または配列番号１の残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換をさらに含む。これらの置換は、単量体の正味電荷を増加させる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β１単量体は、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。

一部の例では、ヒトＴＧＦ－β１単量体のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β１単量体のアミノ酸配列は、配列番号４を含む、または配列番号４からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β１単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体はヒトＴＧＦ－β３単量体である。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β３単量体は、配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換；配列番号３の残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換；および／または配列番号３の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換をさらに含む。これらの置換は、単量体の正味電荷を増加させる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β３単量体は、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。

一部の例では、ヒトＴＧＦ－β３単量体のアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例では、ヒトＴＧＦ－β３単量体のアミノ酸配列は、配列番号６を含む、または配列番号６からなる。一部の例では、ヒトＴＧＦ－β３単量体は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。

一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、シグナル配列、例えば異種シグナル配列をさらに含む。一部の例では、異種シグナル配列はＩＬ－２シグナル配列である。特定の例では、ＩＬ－２シグナル配列は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、または配列番号８のアミノ酸配列からなる。他の例では、異種シグナル配列は、アルブミン、トリプシノーゲン－２、免疫グロブリンカッパ、ＣＤ３３、またはヒト分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のシグナル配列である。

腫瘍溶解性ウイルスは、任意の天然のまたは操作された腫瘍溶解性ウイルスであり得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである。一部の例では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、例えばワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株である。特定の例では、腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子の改変およびウイルス増殖因子（ＶＧＦ）をコードする遺伝子の改変を有するワクシニアウイルスである。例えば、改変は、遺伝子の完全な欠失、遺伝子の部分的欠失、異種核酸配列の遺伝子への挿入、または遺伝子の一部の異種核酸配列との置換（例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第７，２０８，３１３号を参照されたい）であり得る。一部の例では、ＴＧＦ－β単量体をコードする核酸配列は、ＴＫをコードする遺伝子またはＶＧＦをコードする遺伝子に挿入される。特定の例では、核酸配列は、シグナル配列、例えばＩＬ－２シグナル配列を有するＴＧＦ－β単量体をコードする。

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤とを含む組成物である。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスを含む腫瘍細胞、例えばがん細胞、例えば膵臓がん細胞、黒色腫細胞、または頭頸部がん細胞（ＨＮＳＣＣなど）である。さらに提供されるのは、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物の治療有効量を対象に投与することによって、対象におけるがんを処置する方法である。本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物の治療有効量を対象に投与することによって、がんを有する対象における腫瘍の成長または腫瘍の転移を阻害する方法もまた、提供される。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、前立腺内、または腫瘍内注射によって投与される。一部の実施形態では、がんは、乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、膀胱がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、皮膚がん（悪性黒色腫など）、頭頸部がん、または甲状腺がんである。特定の例では、がんは、黒色腫、頭頸部がん、または膵臓がんである。

ＩＶ．腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を標的として殺滅することが可能である天然または改変ウイルスである。多くの場合、免疫療法のために設計された腫瘍溶解性ウイルスは、抗腫瘍応答を促進するために、腫瘍の指向性を増強するように、正常細胞に対するビルレンスを低減させるように、および／または１つまたは複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子改変される（Raja et al., J Immunother Cancer 6:140, 2018；Zheng et al., Mol Ther Oncolytics 15:234-247, 2019）。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬＫ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２４など）、ケモカイン（ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＤＣＸＣＬ４Ｌ１、およびＣＸＣＬ１０など）、腫瘍関連抗原（ＣＥＡ、ＰＳＡ、ｈＤＣＴ、およびＣＬＮＤ６など）、免疫共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、および４－１ＢＢ）、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３など）、自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶ－ＴＫ、ＣＤ、ニトロレダクターゼ、およびシトクロムＰ４５０）、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、ＰＴＥＮ、ｐ１６、Ｒｂ、およびＭｎＳＯＤなど）、アポトーシス促進性タンパク質（アポプチン、ラクタプチン、ＴＲＡＩＬ、およびＳＭＡＣなど）または抗血管新生タンパク質（ＶＥＧＩ、ＶＥＧＦＲ－Ｉ－Ｉｇ、抗ＶＥＧＦ抗体、バキュロスタチン、およびＦＧＦＲ）を発現するように操作することができる（概説に関しては、Zheng et al., Mol Ther Oncolytics 15:234-247, 2019を参照されたく；同様に、参考として本明細書中に援用される、米国特許出願公開第２０１９／０３３０６５５号、および第２０２０／００００８６２号も参照されたい）。本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスは、上記の導入遺伝子、または抗腫瘍応答を増強するように設計された別の導入遺伝子の１つまたは複数をコードし得る。

本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスは、本来腫瘍溶解性であることが公知であるか、または腫瘍溶解特性を保有するように改変された複数の異なるタイプのウイルスのいずれか１つに基づき得る。腫瘍溶解性ウイルスとしては、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、および鶏痘ウイルスなど）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１など）、アデノウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、セネカバレーウイルス、またはそのキメラ型（ポリオウイルス／ライノウイルス、およびアデノウイルス／ＨＳＶなど）（Raja et al., J Immunother Cancer 6:140, 2018；Zheng et al., Mol Ther Oncolytics 15:234-247, 2019）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書における一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルスは、任意の株、例えば、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、またはＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅのウイルスであり得る。一部の例では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、その各々が正常な細胞においてウイルス複製を促進するために役割を果たす１つまたは複数の遺伝子改変、例えばチミジンキナーゼをコードする遺伝子（Ｊ２Ｒ）、リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子（１４ＬおよびＦ４Ｌ）、および／またはワクシニアウイルス増殖因子をコードする遺伝子（ＶＧＦ）の突然変異または欠失を含有する。改変され得る他のワクシニアウイルス遺伝子は、Ａ５６Ｒ遺伝子（ヘマグルチニンをコードする）、１つまたは複数のインターフェロン調節遺伝子、Ｂ１３Ｒ遺伝子（カスパーゼ－１阻害剤をコードする）、またはＦ２Ｌ遺伝子（ウイルスｄＵＴＰアーゼをコードする）（例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許出願公開第２０１９／０３３０６５５号、および第２０２０／００１９７４５７号を参照されたい）を含む。

一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株である。特定の例では、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株は、ＴＫをコードする遺伝子の改変、およびＶＧＦをコードする遺伝子の改変を含む。例えば、改変は、遺伝子の完全な欠失、遺伝子の部分的欠失、異種核酸配列の遺伝子への挿入、または遺伝子の一部の異種核酸配列との置換であり得る（例えば、参考として本明細書中に援用される、McCart et al., Cancer Res 61(24):8751-8757, 2001；および米国特許第７，２０８，３１３号を参照されたい）。特定の非限定的な例では、ＩＬ－２シグナル配列を有するＴＧＦ－β単量体をコードする核酸配列は、ＴＫをコードする遺伝子に挿入される。

Ｖ．腫瘍溶解性ウイルスの医薬組成物および投与
本明細書に提供されるのは、組換えＴＧＦ－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物である。組成物は、製剤、およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの投与にとって好適である。必要に応じて、組成物は、本開示の腫瘍溶解性ウイルスの１つまたは複数と、薬学的に許容可能な担体とを含む。好適な担体、およびその製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press (2012)に記載されている。薬学的に許容可能な担体は、生物学的またはそれ以外で望ましくないことがない材料を含み、例えば、材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬組成物中の他の成分と有害に相互作用することなく対象に投与される。対象に投与されるとき、担体は、活性成分の分解を最小限にするようにおよび対象における有害な副作用を最小限にするように、必要に応じて選択される。

腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、公知の方法に従って、例えば静脈内投与、例えばボーラスまたは一定期間にわたる持続的注入によって投与される。投与は、局所または全身であり得る。組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、皮下、腔内、経皮、肝臓内、頭蓋内、脳脊髄内、関節滑液嚢内、腫瘍内、噴霧化／吸入、前立腺内、または気管支鏡を介した点滴注入を含むいくつかの投与経路のいずれかを介して投与することができる。したがって、組成物は、局所処置または全身処置が望ましいか否か、および処置される領域に応じて複数の方法で投与される。

一部の実施形態では、投与のための組成物は、薬学的に許容可能な担体、例えば水性担体中に本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスを含む。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水等が使用され得る。これらの溶液は滅菌であり、一般的に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の滅菌技法により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場合、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等）などの薬学的に許容可能な補助物質を含有してもよい。これらの製剤における活性薬剤の濃度は大きく異なり得、選択される特定の投与方法および対象のニーズに従って、主として流体体積、粘度、体重等に基づき選択される。

腫瘍溶解性ウイルスの医薬製剤は、所望の程度の純度を有する腫瘍溶解性ウイルスを、必要に応じた薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。

許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存料、低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミンまたはゼラチン、または親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；およびアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、感染単位またはウイルス粒子の任意の適切な濃度によって製剤化することができる。

腫瘍溶解性ウイルスは、単独または他の好適な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧化」され得る）に作製することができる。エアロゾル製剤は、加圧された許容可能な発射薬、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の中に入れることができる。

非経口投与、例えば関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路にとって好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、溶解剤、濃化剤、安定化剤、および保存料を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。提供される方法では、組成物は、例えば静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、または髄腔内に投与することができる。一部の例では、非経口投与、腫瘍内投与、または静脈内投与が、投与方法である。化合物の製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中に示すことができる。

注射溶液および懸濁液は、以前記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。医薬調製物は、単位剤形であり得る。そのような形態では、調製物は、活性成分の適切な量を含有する単位用量へと細分される。したがって、医薬組成物は、投与方法に応じて多様な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与にとって好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、およびロゼンジが挙げられるが、これらに限定されない。

治療応用において、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、有効な量または用量で対象に投与される。組成物の１回または複数回投与を必要に応じて投与してもよい。「患者」または「対象」は、ヒトおよび他の動物の両方を含み、特に哺乳動物を含む。したがって、方法は、ヒトの治療および獣医学応用の両方に適用可能である。

腫瘍溶解性ウイルスの有効量は、個体毎に決定され、使用される特定の腫瘍溶解性ウイルス；個体の体格、年齢、性別、および全身健康状態に少なくとも部分的に基づく。例えば、ヒトに投与する場合、存在する増殖しつつある細胞または新生物のタイプ、サイズ、および数に応じて、少なくとも１０^３プラーク形成単位（ＰＦＵ）、例えば少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、または少なくとも１０^１２ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス、例えばおよそ１０^３～１０^１２ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルスが使用される。有効量は、約１．０ｐｆｕ／ｋｇ体重～約１０^１５ｐｆｕ／ｋｇ体重（例えば、約１０^２ｐｆｕ／ｋｇ体重～約１０^１３ｐｆｕ／ｋｇ体重）であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、１回用量または複数回用量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれより多くの用量）で投与される。複数の用量を同時にまたは連続して（例えば、数日間または数週間にわたって）投与することができる。

一部の実施形態では、提供される方法は、１つまたは複数の治療剤、例えばがん、例えば乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、膀胱がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、皮膚がん（悪性黒色腫など）、頭頸部がん（ＨＮＳＣＣなど）、または甲状腺がんを処置するための１つまたは複数の薬剤を、対象に投与することを含む。

腫瘍溶解性ウイルスの投与は、他の抗がん剤の投与、または治療的処置（腫瘍の外科的切除など）を伴い得る。任意の好適な抗がん剤を、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与することができる。例示的な抗がん剤としては、化学療法剤、例えば分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物応答修飾剤、抗ホルモン剤（例えば、抗アンドロゲン）、ＣＤＫ阻害剤、および抗血管新生剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗がん処置は、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的とする他の抗体（例えば、生物製剤）を含む。

アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。

代謝拮抗剤の非限定的な例としては、葉酸アナログ（メトトレキサートなど）、ピリミジンアナログ（５－ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリンアナログ、例えばメルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。

天然物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ－アスパラギナーゼなど）が挙げられる。

その他の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知である、シス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩなど）、置換ウレア（ヒドロキシウレアなど）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質ホルモン抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。

ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、およびメゲストロール酢酸エステルなど）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、およびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）、およびアンドロゲン（テステロンプロピオン酸エステル、およびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン、例えばドセタキセル）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６が挙げられるが、一部のより新規の薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン、およびカルシトリオールが挙げられる。

使用することができる免疫調節剤の非限定的な例としては、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．）、ＳＫ＆Ｆ１０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。

一部のタイプのがんの別の一般的な処置は、外科的処置、例えばがんまたはその一部の外科的切除である。処置の別の例は、外科的切除の前に腫瘍を根絶するのをまたは縮小させるのを助けるための放射線療法、例えば、放射活性材料またはエネルギー（体外照射療法など）の腫瘍部位への投与である。

ＣＤＫ（サイクリン依存的キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する薬剤である。提供される方法に使用するためのＣＤＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＡＧ－０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ、ｉｎｄｉｓｕｌａｍ、Ｐ１４４６Ａ－０５、ＰＤ－０３３２９９１、およびＰ２７６－００（例えば、Lapenna et al., Nature Reviews, 8:547-566, 2009を参照されたい）が挙げられる。他のＣＤＫ阻害剤としては、ＬＹ２８３５２１９、パルボシクリブ、ＬＥＥ０１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、汎ＣＤＫ阻害剤ＡＴ７５１９、セリシクリブ、ＣＹＣ０６５、ブチロラクトンＩ、ヒメニアルジシン、ＳＵ９５１６、ＣＩＮＫ４、ＰＤ０１８３８１２、またはファスカプリシンが挙げられる。

一部の例では、ＣＤＫ阻害剤は、広域阻害剤（フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＳＮＳ－０３２、ＡＴ７５１９、ＡＧ－０２４３２２、（Ｓ）－ロスコビチン、またはＲ５４７など）である。他の例では、ＣＤＫ阻害剤は、特異的阻害剤（ファスカプリシン、リュビジン、プルバラノールＡ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ－２５９、ＳＵ９５１６、ＰＤ０３３２９９１、またはＰ－２７６－００など）である。

一例では、追加の治療剤は、１つまたは複数の免疫調節剤、例えば、ＰＤ－１のアンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、またはＴ細胞アゴニスト（４－１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニスト、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＧＩＴＲ）のアゴニストなど）、またはその組合せを含む。一例では、抗がん剤は、Ｔ細胞アゴニスト、例えば４－１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニスト、またはＧＩＴＲのアゴニスト（免疫チェックポイントタンパク質、例えば上記のタンパク質の１つに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、これらのタンパク質の１つのリガンド、またはこれらのタンパク質の１つのアプタマーなど）を含む。一例では、追加の治療剤は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合して、拮抗する抗体、例えばアテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ－９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＭＥＤＩ－０６８０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＭＧＡ－２７１、インドキシモド、エパカドスタット、ＢＭＳ－９８６０１６、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＥＤＩ－４７３７、ＭＫ－４１６６、ＢＭＳ－６６３５１３、ＰＦ－０５０８２５６６（ＰＦ－２５６６）、リリルマブ、またはデュルバルマブを含む。一例では、追加の治療剤は、４－１ＢＢのアゴニスト、例えば抗体、例えばＰＦ－０５０８２５６６（ウトミルマブ）、またはＢＭＳ－６６３５１３（ウレルマブ）、またはリガンド（例えば、４－１ＢＢＬまたはＳＡ－４－１ＢＢＬ）を含む。一例では、追加の治療剤は、ＯＸ４０のアゴニスト、例えばｍＡｂ（例えば、ＰＦ－０４５１８６００、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６３８３、ＭＯＸＲ０９１６、ＢＭＳ９８６１７８、またはＧＳＫ３１７４９９８）、またはリガンド（例えば、ＯＸ４０Ｌ）を含む。一例では、追加の治療剤は、アゴニストＧＩＴＲ、例えばｍＡｂ、例えばＤＴＡ－１、ＴＲＸ５１８、ＭＫ－４１６６、ＭＫ－１２４８、ＡＭＧ２２８、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＧＷＮ３２３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＫ－３０２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、またはＢＭＳ－９８６１５６を含む。一例では、追加の治療剤は、ＧＩＴＲのアゴニスト、例えばＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、例えば天然のＧＩＴＲＬ、または多価ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質、例えばＭＥＤＩ１８７３を含む。一例では、追加の治療剤は、抗ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ）を含む。一例では、追加の治療剤は、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、および／または他の治療的モノクローナル抗体を含む。

薬剤および投与量の選択は、処置される所定の疾患に基づいて決定することができる。薬剤または組成物の組合せを、同時期に（例えば、混合物として）、個別にしかし同時に（例えば、個別の静脈内経路を介して）、または連続的に（例えば、１つの薬剤を最初に投与した後に、第２の薬剤を投与する）投与することができる。したがって、組合せという用語は、２つまたはそれより多くの薬剤または組成物の同時期、同時、または連続的投与を指すために使用される。

ＶＩ．例示的な実施形態
実施形態１． 配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンまたはシステインからアルギニンへの置換；
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
を含む、ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２． 配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンまたはシステインからアルギニンへの置換；および
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失
を含む、ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態３． 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β２単量体である、実施形態２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態４． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）に対する前記単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む、実施形態３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態５． ＴβＲＩＩに対する前記単量体の親和性を高める前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および／または
配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
を含む、実施形態４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態６． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態７． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号７を含む、または配列番号７からなる、実施形態１～６のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態８． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、前記単量体の凝集を低減するおよび／またはフォールディングを改善する少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、またはさらに含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態９． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；および／または
配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換
を含む、実施形態８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１０． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
を含む、実施形態９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１１． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号９を含む、または配列番号９からなる、実施形態１０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１２． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；および
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換
を含む、実施形態９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１３． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１０を含む、または配列番号１０からなる、実施形態１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１４． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
を含む、実施形態９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１５． 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１２を含む、または配列番号１２からなる、実施形態１３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１６． ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１１を含む、または配列番号１１からなる腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１７． 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β１単量体である、実施形態１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１８． 前記ヒトＴＧＦ－β１単量体が、
配列番号１の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号１の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号１の残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換；または
配列番号１の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換、残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換、および残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換
をさらに含む、実施形態１７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態１９． 前記ヒトＴＧＦ－β１単量体のアミノ酸配列が、配列番号４を含む、または配列番号４からなる、実施形態１７または実施形態１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２０． 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β３単量体である、実施形態２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２１． 前記ヒトＴＧＦ－β３単量体が、
配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換；
配列番号３の残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換；
配列番号３の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換；または
配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換、残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換、および残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換
をさらに含む、実施形態２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２２． 前記ヒトＴＧＦ－β３単量体のアミノ酸配列が、配列番号６を含む、または配列番号６からなる、実施形態２０または実施形態２１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２３． 前記ＴＧＦ－β単量体がシグナル配列をさらに含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２４． 前記シグナル配列が、配列番号８のアミノ酸配列を含むＩＬ－２シグナル配列である、実施形態２３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２５． ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２６． ワクシニアウイルスである、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２７． 前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子の改変、およびウイルス増殖因子（ＶＧＦ）をコードする遺伝子の改変を含む、実施形態２６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２８． 前記ＴＫをコードする遺伝子の改変が、前記遺伝子の完全または部分的な欠失を含む、実施形態２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態２９． 前記ＴＫ遺伝子の少なくとも一部が前記ＴＧＦ－β単量体をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２７または実施形態２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態３０． 前記ＶＧＦをコードする遺伝子の改変が、前記遺伝子の完全または部分的な欠失を含む、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルス。

実施形態３１． 実施形態１～３０のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。

３実施形態２． 対象におけるがんを処置する方法であって、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは実施形態３１に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

実施形態３３． がんを有する対象における腫瘍の成長または腫瘍の転移を阻害する方法であって、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは実施形態３１に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

実施形態３４． 前記がんが黒色腫、頭頸部がん、または膵臓がんである、実施形態３２または実施形態３３に記載の方法。

以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、記載された特定の特徴または実施形態に本開示を限定すると解釈されるべきではない。

（実施例１）
組換えＴＧＦ－βミニ単量体
二量体形成することができないヒトＴＧＦ－βの組換え型を、ＷＯ２０１８／０９４１７３号（その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されているように設計した。具体的には、α－ヘリックス３およびいくつかの隣接残基（各タンパク質の残基５２～７１に対応する）の欠失、および残基７７でシステインからセリンへの置換を有する、ヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β２、およびヒトＴＧＦ－β３の組換え型を作製した。欠失の長さは、β鎖４と５とを架橋する非拘束性ループを形成するために、β鎖４の最後の残基（Ｇｌｙ－４８）とβ鎖５の最初の残基（Ｃｙｓ－７７／Ｓｅｒ－７７）の間に十分な数の残基を残すように選択した。加えて、ループ形成残基の２つ（ＴＧＦ－β２）または３つ（ＴＧＦ－β１、および－β３）のいずれかを、全長のＴＧＦ－β１、－β２、および－β３単量体に関するｐＨ７．０での総正味電荷をそれぞれ、－０．９、＋１．１、および＋４．４から－３．１、＋３．９、および＋６．１へと増加させるように置換した。これらの改変を有するＴＧＦ－βタンパク質は、本明細書において「ミニ単量体」と呼ばれ、ｍｍＴＧＦ－β１、ｍｍＴＧＦ－β２、およびｍｍＴＧＦ－β３と称される。ＴＧＦ－βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に対するその親和性を高める７つのアミノ酸置換を有する追加のＴＧＦ－β２ミニ単量体を設計した；このミニ単量体は、本明細書において「ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ」または「ｄｎＴＧＦβ２^ｍｍ」と呼ばれる。野生型ＴＧＦ－βおよび本明細書に開示されたバリアントＴＧＦ－βミニ単量体の説明を表１に提供する。タンパク質の配列を、配列番号１～７に記載する（および以下に示す）。単一のアミノ酸置換および欠失の位置は、対応する野生型ＴＧＦ－βタンパク質と比較した位置である。

配列番号1 - TGF-β1 ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS

配列番号2 - TGF-β2 ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSKVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS

配列番号3 - TGF-β3 ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

配列番号4 - mmTGF-β1 ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYRASKSPSCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS

配列番号5 - mmTGF-β2 ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYRASKSPSCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS

配列番号6 - mmTGF-β3 ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYEESDSPSCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

配列番号7 - mmTGF-β2-7M
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYRASKSPSCVSQDLEPLTIVYYVGRKPKVEQLSNMIVKSCKCS

一部の実施形態では、上記の配列のいずれも、Ｎ末端メチオニン（Ｍ）残基を含む。

本明細書における一部の実施形態では、ＴＧＦ－β単量体は、ＩＬ－２シグナル配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号８）などのＮ末端シグナル配列を含む。

（実施例２）
腫瘍溶解性ウイルスを使用する腫瘍微小環境の代謝的モジュレーション
免疫は、腫瘍微小環境内で多くの障壁に直面し、これらの中心にあるのは、腫瘍の独自の代謝状況である（Scharping and Delgoffe, Vaccines (Basel) 4(4):46, 2016）。がん細胞が増殖すると、それらは、乳酸などの毒性の副産物の蓄積を引き起こしながら、栄養および酸素の局所環境を枯渇させる。したがって、浸潤する免疫細胞は、腫瘍微小環境内で免疫および代謝の抑制の両方に耐えなければならない（Najjar et al., JCI Insight 4(5):e124989, 2019）。代謝のサポートは、がんの治癒的免疫療法にとって極めて重要であると考えられている。腫瘍に浸潤するＴ細胞は、非常に代謝的に不利であっても腫瘍に浸潤し、自身がグルコースを取り込む能力を抑制し、機能的なミトコンドリア質量を失う（Scharping et al., Immunity 45(2):374-388, 2016）。加えて、いくつかの免疫療法モダリティは、養子細胞治療のミトコンドリアリプログラミング（Scharping et al., Immunity 45(2):374-388, 2016）、ならびにチェックポイント遮断の薬理学的（Scharping et al., Cancer Immunol Res 5(1):9-16, 2016）および免疫療法的（Menk et al., J Exp Med 215(4):1091-1100, 2018）な代謝の増強を含む代謝的手段を通して改善することができる。腫瘍溶解性ウイルス免疫療法は、免疫刺激剤（ＧＭ－ＣＳＦなど）ではなくて代謝モジュレーターを遺伝子コードすることによって改善することができる。腫瘍微小環境においてレプチン発現を特異的に強化する、アディポカインであるレプチンをコードする遺伝子が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに挿入された（Rivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。腫瘍浸潤性Ｔ細胞は、高レベルのレプチン受容体を発現することから、それらは、このウイルスによる処置の際に代謝リプログラミングシグナルを受ける。実際に、レプチンが、マウス黒色腫および膵臓がんモデルにおいて新規腫瘍浸潤性Ｔ細胞に作用し、ミトコンドリア活性を増強し、強固な抗腫瘍免疫および長期記憶を促進することが見出された。さらに、これらの試験の過程で、腫瘍溶解ウイルスによって誘導された免疫浸潤物の完全な特徴付けが、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって初めて説明された。これらの試験は、腫瘍溶解性ウイルスが、がんにおける免疫学的環境の強固なリモデリングを誘導するが、これらの新規Ｔ細胞外来物は、なおもＴＧＦ－βシグナル伝達を介して免疫学的抑制、ならびに低酸素に対する曝露および持続的な抗原刺激を通して代謝抑制を経験することを明らかにした。

本明細書に開示された実施例は、腫瘍微小環境に代謝のモジュレーションを送達するために腫瘍溶解性ウイルスをどのように使用することができるかを記載する。腫瘍溶解性ウイルスは、それらが感染する腫瘍細胞に「形質導入」し、薬剤そのものを使用して、腫瘍に遺伝子治療を送達することができる。ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株の腫瘍溶解型（チミジンキナーゼおよびウイルス増殖因子遺伝子を欠如する）（McCart et al., Cancer Res 61(24):8751-8757, 2001）を、これらの試験のために使用した。ワクシニアウイルスは、それが自身のポリメラーゼをコードし、細胞質において複製し、低酸素条件下で良好に複製することから有効な腫瘍溶解性ウイルスであり、その大きいゲノムは、それが複数の導入遺伝子を発現するように十分に操作され得ることを意味する（Yang et al., J Cancer Res Clin Oncol 144(12):2433-2440, 2018）。

ｓｃＲＮＡｓｅｑを使用して、腫瘍溶解性ウイルス感染の直接の結果を確認した（Rivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。具体的には、ＣＤ４５＋浸潤物を、腫瘍溶解性ＶＶ（ｏＶＶ）またはＰＢＳ対照による感染の７日後にプロファイルを調べた（図１Ａおよび１Ｂ）。この分析は、腫瘍微小環境の顕著なリモデリングを明らかにし、ＣＤ４５＋浸潤物がクローン性に異なる新規エフェクター／メモリーＴ細胞によって支配されることを明らかにした（図１Ｃ、およびRivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。しかし、このウイルスによって処置した腫瘍は最終的に逃れて、拘束されずに成長したことから、その新規浸潤物は最終的に無効であった。したがって、ｏＶＶは、腫瘍を刺激し、新規浸潤物を促進することができるが、作用時に他の阻害機構が存在する。７日間浸潤物のより深い解析を行うと、それらのＴ細胞がエフェクター／メモリー様であるが、それらがまた、ＴＧＦ－βシグナル伝達と整合するトランスクリプトームシグネチャーも含有したことが明らかとなった（図１Ｄ）。さらに、代謝解析から、これらのＴ細胞がなおも不十分な代謝に屈したことが明らかとなった（図１Ｅ）（Rivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。

したがって、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍炎症およびＴ細胞浸潤を刺激することができるが、主にＴ細胞駆動性のその新規浸潤物は、完全な応答を妨げる代謝的および免疫学的障壁を経験する。以下の実施例では、腫瘍溶解性ウイルスを使用して、これらの障壁を和らげるように作用する遺伝子構築物を発現させる。

（実施例３）
新規ＴＧＦ－β阻害剤の腫瘍溶解性ウイルスによる送達を使用する、腫瘍微小環境内のＴＧＦ－βシグナル伝達の操作された標的化
ＴＧＦ－βは、がん内部の強力な免疫抑制シグナルを表し、複数の経路を通して抗腫瘍免疫を阻害するように作用する（Ungefroren, Expert Opin Ther Targets 23(8):679-693, 2019；Derynck and Budi, Sci Signal 12(570):eaav5183, 2019）。ＴＧＦ－βシグナル伝達のシグネチャーは、ｏＶＶ誘発性の浸潤物においても非常に明白であったため、ＴＧＦ－βによって強化された抑制性環境を標的とすることができる薬剤を作製するステップを行った。しかし、標的としてのその魅力的なプロファイルにもかかわらず、安全かつ有効なＴＧＦ－β阻害剤は、なおもとらえどころがないままである（Connolly et al., Int J Biol Sci 8(7):964-978, 2012；Akhurst, Cold Spring Harb Perspect Biol 9(10):a022301, 2017）。多面発現サイトカインとして、その活性を全身性に阻害することはリスクがないわけではなく、受容体の活性の標的化をねらいとするキナーゼ阻害剤は、重度のオフターゲット作用を有する（Connolly et al., Int J Biol Sci 8(7):964-978, 2012；Akhurst, Cold Spring Harb Perspect Biol 9(10):a022301, 2017）。強力な遺伝子コードされた阻害剤は、薬剤が、感染した腫瘍細胞によってのみ発現され、したがって、腫瘍微小環境に限定されることから、腫瘍溶解性ウイルスにおいてコードされる場合に良好に認容されると推論された。

この目標を念頭において、遺伝子コードされたＴＧＦ－β阻害剤の抗腫瘍活性（Kim et al., J Biol Chem 292(17):7173-7188, 2017）を評価した。この阻害剤は、ジスルフィド結合媒介二量体形成にとって極めて重要なシステインを欠如する（したがって、単量体として存在する）が、「ヒール」ヘリックスを反転ループで置き換えて、ＴＧＦ－β受容体Ｉ（ＴβＲＩ）の動員を妨げもする、操作されたＴＧＦ－β２分子である（実施例１を参照されたい）。したがって、この「ミニ単量体」は、単量体としてのＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）に１対１でかつ強力に結合し、ＴβＲＩの動員を妨げる。このようにして、これは、ドミナントネガティブとして作用する（図２Ａ）（Kim et al., J Biol Chem 292(17):7173-7188, 2017）。実際に、ミニ単量体は、高い親和性で受容体に結合し、その自身のシグナル伝達活性を有しない（図２Ｂ）。加えて、これは、レポーター細胞系においてＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３シグナル伝達を強力に阻害する（図２Ｂ）。ＩＬ－２シグナルペプチド（配列番号８）を有する操作された構築物を、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのＴＫ座にクローニングした。腫瘍細胞のウイルス感染は、ミニ単量体ＴＧＦ－βの発現を誘導し（図３Ａ）、それらの腫瘍細胞からの上清は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を抑制した（図３Ｂ）。Ｂ１６黒色腫での治療として使用するとき、ＶＶ－ｄｎＴｇｆｂ２^ｍｍは、より強力な抗腫瘍応答を誘導した（図３Ｃ）。

（実施例４）
腫瘍溶解性ウイルスコードＴＧＦ－β阻害（ＶＶ－ｄｎＴｇｆｂ２^ｍｍ）の免疫学的および環境上の結果
多面発現サイトカインとして、ＴＧＦ－βを標的とすることは、腫瘍微小環境内で多くの因子に影響を及ぼし得る（Derynck and Budi, Sci Signal 12(570):eaav5183, 2019）。したがって、ウイルス送達ＴＧＦ－β阻害の免疫学的結果を理解するために、いくつかの直交性アプローチを使用した。これらの試験に関して、黒色腫および膵臓がん細胞系を、不活性腫瘍と比較して免疫学的に活性なモデルとして使用する。Ｂ１６またはクローン２４（Ｐｔｅｎ／Ｂｒａｆマウスモデルにおいて作製された黒色腫から作製された細胞系； Najjar et al., JCI Insight 4(5):e124989, 2019）黒色腫、またはＰａｎｃ０２膵臓腫瘍を有するマウスに、対照腫瘍溶解ウイルスまたはｄｎＴＧＦβ２^ｍｍを発現するウイルスのいずれかの２．５×１０^６ＰＦＵを腫瘍内注射する。

腫瘍微小環境の「地理」を、オリゴタグ付け抗体を利用する高度に多重化されたイメージング技術（ｃｏ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｅｘｉｎｇ、またはＣＯＤＥＸ）、および単一のセクションにおいて数十個の抗体を繰り返し撮像する塩基付加イメージング（Goltsev et al., Cell 174(4):968-981, 2018）を使用して問い合わせる。この技術を使用して、複数の免疫および間質サブセットの位置および状態を調べる。抗ワクシニアおよび抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｍａｄ３抗体は、感染細胞の同定およびｉｎ ｓｉｔｕのＴＧＦ－βシグナル伝達に及ぼす影響の評価も可能にする。

ｓｃＲＮＡｓｅｑを使用して、このウイルス操作によって誘導される細胞および転写の変化を決定する。全腫瘍ホモジネートまたはＣＤ４５＋濃縮分画を使用し、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラーを使用して対照の腫瘍溶解ウイルスならびに対照の注射と比較する（Rivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。

これらの知見を、高度に多重化されたフローサイトメトリーを使用して確認し、さらに問い合わせ、ＶＶ－ｄｎＴｇｆｂ２^ｍｍ療法後の腫瘍浸潤物の品質を免疫学的にプロファイリングおよび機能的に評価する。

（実施例５）
クローン２４およびＰａｎｃ０２モデルにおけるＶＶ－ｄｎＴｇｆｂ２^ｍｍの治療結果
ＴＧＦ－β標的化腫瘍溶解性ウイルスの治療有効性を、ｏＶＶに対して部分的に応答するが免疫学的／代謝的に操作された株にはより完全に応答する、注射可能な黒色腫（クローン２４）および膵臓がん（Ｐａｎｃ０２）モデルにおいて試験する（Rivadeneira et al., Immunity 51(3):548-560, 2019）。３～４ｍｍの腫瘍を有するマウスに、ＶＶ－ｄｎＴｇｆｂ２^ｍｍまたは対照腫瘍溶解性ウイルスのいずれかの２．５×１０^６ＰＦＵを１回腫瘍内注射する。腫瘍の成長を、デジタルキャリパーを使用して追跡し、生存を、屠殺時（腫瘍がいずれかの方向に１５ｍｍに達するとき）のＩＡＣＵＣガイドラインに基づいて計算する。

完全な応答を経験するマウスでは、生存マウスを３～４週間維持した後、親腫瘍（ウイルス処置なし）を再度注射する。同時に、未処置マウスの第２のコホートに親腫瘍を注射する。マウスが腫瘍に対する免疫学的記憶を有するとき、マウスは、腫瘍を拒絶するか、または未処置マウスコホートと比較して腫瘍の成長に抵抗する。

追加の実験は、複数回のウイルス注射、およびマウスが２つの同一の腫瘍を有するが、１つのみにウイルスを注射する腫瘍モデルを使用する。

（実施例６）
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのＴＧＦ－β２単量体の追加の改変
本実施例は、ＴＧＦ－β単量体のｉｎ ｖｉｖｏ送達を増強する改変を評価する試験を記載する。ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍの４つのバリアントを作製し、これらを表２に記載する。単一のアミノ酸置換および欠失の位置は、配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２と比較した位置である。

配列番号9 - mmTGF-β2-7M2R
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYRASKSPRCRSQDLEPLTIVYYVGRKPKVEQLSNMIVKSCKCS

配列番号10 - mmTGF-β2-2M-Del8-17
ALDAAYVFRNVQDNCALRPLYIDFRRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYRASKSPSCVSQDLEPLTILYYIGRTPKIEQLSNMIVKSCKCS

配列番号11 - mmTGF-β2-7M-PRDC
KEVLASSQEALVVTERKYLKSDWCKLRPLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYNANFCYGQCNSFYIPRHVKKEEDSFQSSAFCVSQDLEPLTIVYYVGRKPKVEQLSNMIVKSCRCMSV

配列番号12 - mmTGF-β2-7M2R-Del8-17
ALDAAYVFRNVQDNCALRPLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYRASKSPRCRSQDLEPLTIVYYVGRKPKVEQLSNMIVKSCKCS

一部の実施形態では、上記の配列のいずれもＮ末端メチオニン（Ｍ）残基を含む。

凝集傾向の消失または低減
ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍが凝集する傾向を消失または低減させる改変を最初に調べた。操作されたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ単量体が野生型ＴＧＦ－β２より凝集する傾向がかなり低いことは以前示されたが、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍはそれにもかかわらず、何らかの凝集傾向を保持する（Kim et al., J Biol Chem 292(17):7173-7188, 2017）。これは、未変性洗浄剤３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）の非存在下（図５Ｄ、５Ｅ）またはその存在下（図５Ｆ）のいずれかで記録したとき、二次元^１Ｈ－^１５Ｎ ＮＭＲシフト相関（ＨＳＱＣ、異核種単一量子相関）スペクトルによって検出されるアミド骨格^１Ｈ－^１５Ｎシグナルの出現からも明白であった。ＣＨＡＰＳの非存在下では、骨格アミドシグナルは強度が大きく変動し、特にタンパク質の溶解度がｐＨ４．６での溶解度と比較して低減されることが公知であるｐＨ７．２では、一部がわずかに検出可能であった。シグナル強度のこのタイプの変動は、より高次の凝集体が一過性に形成されることによって引き起こされる。そのような凝集体の形成は、タンパク質の回転相関時間（τ_ｃ）を延長し、したがってＮＭＲシグナルを広げ、シグナル強度を減少させる。ｐＨ４．６または７．２のいずれかで増加濃度のＣＨＡＰＳを添加すると、多くのシグナルの強度の改善、したがって観察されたスペクトルにおけるこれらの均一性の増加をもたらすことが観察されている（図５Ｆ）。シグナル強度の改善は、ＣＨＡＰＳの濃度に依存し、約１０ｍＭの濃度まで実質的な改善が起こった。

ＣＨＡＰＳがｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍの凝集の低減において果たす役割は、これまで野生型ＴＧＦ－βホモ二量体では二量体界面の一部であったフィンガーの基部であると記載されることが多い分子の領域に留まる一部の疎水性残基を通しての凝集の一過性の形成が原因であり得るという仮説を立てた（図４Ａ）。凝集の形成にはほとんど影響を有しないことが見出されたいくつかの置換を試験したところ、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍにおける２つの残基のアルギニンへの置換－Ｓ５７ＲおよびＶ５９Ｒ（図４Ｂ）が、凝集傾向の有意な低減をもたらした。２つの残基がアルギニンで置き換えられたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍのこのバリアントは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）と称される。低減された凝集傾向の証拠は、ｐＨによらず、または未変性ＣＨＡＰＳを添加したか否かによらず、このバリアントについてかなりより均一なＮＭＲシグナル強度が観察されたことであった（図５Ａ～５Ｃ）。

フォールディングを改善するための改変
ＴＧＦ－βタンパク質は、シスチンノット増殖因子フォールド（ＣＫＧＦ）を有すると分類される単量体から形成される（Hinck et al., Cold Spring Harb Prospect Biol 8(12):a022103, 2016）。このフォールドは、ＴＧＦ－βファミリーの全てのタンパク質に存在するが、ヒトにおける多くの他のシグナル伝達タンパク質およびシグナル伝達タンパク質アンタゴニストにも見出される。これらとしては、シグナル伝達タンパク質血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、および神経増殖因子（ＮＧＦ）、およびアンタゴニスト、例えばノギン、スクレロスチン、およびＤａｎ ａｎｄ Ｃｅｒｕｂｕｓに関連するタンパク質（ＰＲＤＣ）が挙げられる。ＴＧＦ－βファミリーのタンパク質は、それらが全てＮ末端プロドメインを有するという点においてＣＫＧＦタンパク質の中では独自である。プロドメインの役割はなおも研究中であるが、それらが多くのタンパク質ファミリーにとって調節的役割を有することは公知である（Hinck et al., Cold Spring Harb Prospect Biol 8(12):a022103, 2016）。この調節は、時に増殖因子ドメイン（ＧＦＤ）がＩ型およびＩＩ型受容体に結合する能力を完全に遮断するために十分な（ナノモル濃度からナノモル下濃度の）親和性で、プロドメインがＧＦＤに結合することにより生じる。一部のプロドメイン、例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３のプロドメインのみが、非常に高い親和性でＧＦＤに結合し、それらが活性化されるまでそれらを不活性型（潜在型）で維持するが、このこともまた、ＧＦＤの適切なフォールディングにとって必要である。ＴＧＦ－βのＧＦＤは、他のＣＫＧＦタンパク質と同様に、３つのジスルフィドによって安定化された構造モチーフであるシスチンノットによって特徴付けられる（Schwarz, Biol Chem 398(12): 1295-1308, 2017）。３つのジスルフィドは、互いに空間的に非常に近くに存在し、したがってその形成は複雑であり、正確な１つに加えて多くの起こり得る代替の位相幾何学的配置が存在する。

これは、シスチンノットならびに８－１７ジスルフィド（配列番号２と比較して残基７および１６でシステインに対応する）として公知である１つの追加のジスルフィドを保持することから、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍに関連する。ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍタンパク質を産生する１つの方法は、それを不溶性封入体の形態で細菌において発現させ、タンパク質をリフォールディングして、ジスルフィドの天然の対を形成することである（Huang and Hinck, Methods Mol Biol 1344:63-92, 2016）。それにもかかわらず、全体的なフォールディング収率は、その８個のシステイン残基のミスフォールディングおよび不適切な対形成の結果として形成する凝集体によって制限される。ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍタンパク質はまた、真核生物宿主において分泌型タンパク質としてタンパク質を発現することによって産生することもできる。これによって、タンパク質は、小胞体（ＥＲ）およびゴルジを通過し、したがって内因性のジスルフィド交換およびグリコシル化機構、ならびにジスルフィドに富むタンパク質のフォールディングを促進するために真核細胞に固有のシャペロンによってフォールディングを促進する。しかし、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍの発現のためにこの方法を使用する試みは、ミスフォールディングされたジスルフィド結合凝集体の形成をもたらした。これはおそらく、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍが、そのプロドメインに結合および相互作用しないと予測されるほど野生型ＴＧＦ－βと比較して劇的に改変されていたために起こった。

したがって、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍのフォールディングを改善することをねらいとする改変を調べた。フォールディングを改善するために、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍの４つのジスルフィドの各々を、１回に１つのジスルフィドの割合で除去した。これを行うために、各ジスルフィドを形成する２つのシステインを、バリン－アラニン対によって置換した後、改変タンパク質を、以前の手順（Kim et al., J Biol Chem 292(17):7173-7188, 2017）に従って発現させ、リフォールディングさせ、および精製した。天然にフォールディングされたタンパク質を達成する可能性を増強するために、操作されたＴＧＦ－β２単量体の状況で置換を作製したが、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍの場合の７つの置換の代わりに、単に２つの必須の残基をＴＧＦ－β１の残基に変化させた。ＴＧＦ－β２は、ＴＧＦ－β１よりはるかに高い効率でフォールディングすることが公知であるために、これらのバリアントはなおも高い親和性でＴβＲＩＩに結合するが、改善された効率でフォールディングすると予想された（Huang and Hinck, Methods Mol Biol 1344:63-92, 2016）。結果は、このバックグラウンドにおいて、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１０；図４Ｃ）として設計されたバリンおよびアラニンによって置換された８－１７ジスルフィドを形成するシステインを有するバリアントが、天然にフォールディングされたが（図６Ａ～６Ｃ）、１６－５９、４５－９０、および４９－９２を除去された他の３つのジスルフィドを有するバリアントは非天然のフォールディングであったことを示した。ＣＨＡＰＳの非存在下ではＮＭＲシグナル強度に、凝集を示唆する顕著に有意な変動が存在するが、これらの相違は、ＣＨＡＰＳを添加すると弱められた（図６Ａ～６Ｃ）。８－１７ジスルフィドがタンパク質のフォールディングを破壊することなく除去され得るという事実は、タンパク質が細菌において産生されてｉｎ ｖｉｔｒｏでリフォールディングされるか、またはタンパク質が真核細胞において分泌タンパク質として産生されるかによらず、これが、フォールディングの有意な改善をもたらし得ることを示している。

調べた第３のタイプの改変もまた、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍのフォールディングの改善をねらいとした。選択された戦略は、単量体として天然に産生され、フォールディングのためのプロドメインを有しないまたはプロドメインに依存しない一部のＣＫＧＦタンパク質、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストＰＲＤＣが存在するという事実を利用することであった。ＰＲＤＣのフォールディングにおける潜在的改善を利用するが高親和性ＴβＲＩＩ結合を保持するために、ＴβＲＩＩの結合の原因となる領域であるｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍのフィンガー１－２および３－４領域が、ＰＲＤＣのシスチンノット領域にグラフトされたキメラｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ：ＰＲＤＣ構築物を作製した。この構築物は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１；図４Ｄ）と称され、これをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｍｍＴＧＦ－β２７Ｍのために使用したものと類似の様式でリフォールディングさせ（Kim et al., J Biol Chem 292(17):7173-7188, 2017）、および高分解能カチオン交換クロマトグラフィーを使用して均一になるまで精製した。ＮＭＲ解析を通して、このタンパク質は、^１Ｈ次元における７．９～８．５ｐｐｍに対応するランダムコイル領域の十分に外のアミドシグナルの分散によって証明されるように、天然にフォールディングされることが示された（図７Ａ～７Ｃ）。このことは、ＰＲＤＣのシスチンノット領域がｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍのフィンガー領域と共に良好に組み込まれ、設計が成功したことを示している。

ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントの結合特性
細胞およびｉｎ ｖｉｖｏで機能的であるために、任意の設計されたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントの前提条件は、それが高い親和性でＴβＲＩＩに結合することである。本明細書に記載されるｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアント（ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１０）、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１））がＴβＲＩＩに結合する能力を評価するために、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）および未変性ゲルを使用した。ＩＴＣ結合実験を、増加量のＴβＲＩＩをｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）、またはｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１０）に注入し、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（配列番号７）を参照対照として使用して実施した。これらの滴定は、大きい負のエンタルピーおよびほぼ１：１の結合化学量論を有する容易に検出可能な等温線を生じた（図８）。積分した熱量を１：１結合モデルにフィットさせると、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２ＲおよびｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７に関してそれぞれ、７５．１ｎＭおよび８０．１ｎＭのＴβＲＩＩ結合の解離定数（Ｋ_Ｄ）を生じた（図８）。これらのＫ_Ｄは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ（６０．５ｎＭ）に関して決定された値の実験誤差内であり、凝集を低減させるため、またはフォールディングを改善するために導入された置換が、タンパク質がＴβＲＩＩに結合する能力に有害な効果を有さなかったことを示している。

あるいは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）の結合を、未変性ゲルを使用して評価した。複合体の検出は、２つのタンパク質が約１時間である電気泳動の時間の尺度と同等の時間の尺度で結合したままである必要があることから、これらは、高親和性結合を示しているが、Ｋ_Ｄの定量的測定を提供しない。未変性ゲルは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣが全て、ゲルの長さのおよそ４分の１移動するバンドを形成したが、ＴβＲＩＩは、ゲルのほぼ全長にわたって移動することを示した（図７Ｄ）。これは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣが単独ではゲルに入らないという以前の知見と共に、これらのタンパク質の３つ全てが高い親和性でＴβＲＩＩに結合することを示唆している。これは、ｍｍＴＧＦ－β２－７ＭおよびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２ＲバリアントのＩＴＣ結果と整合し、これがまたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣにも当てはまることを示している。

ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントの阻害特性
ｉｎ ｖｉｖｏで機能的であるためには、任意の設計されたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントが、細胞におけるＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害するはずである。これを、本開示のｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアント、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ（配列番号９）、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１０）、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣ（配列番号１１）に関して評価するために、細胞にルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＴＧＦ－β ＣＡＧＡエンハンサーエレメントを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３ ＴＧＦ－βルシフェラーゼレポーター細胞系を使用した。このアッセイによる阻害能を評価するために、細胞を９６ウェルプレートに播種し、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣの様々な濃度を添加し、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍを対照として使用した。３０分後、ＴＧＦ－βシグナル伝達を、ＴＧＦ－β３を最終濃度１０ｐＭで添加することによって刺激し、１２時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を評価した。得られた結果は、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ、ｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７、およびｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣが各々、ＴＧＦ－β３によって誘導されたシグナル伝達を強力に阻害したことを示し、フィットさせたＩＣ_５０値はそれぞれ、５３ｎＭ、１１１ｎＭ、および２８３ｎＭであった。ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２ＲおよびｍｍＴＧＦ－β２－２Ｍ－Ｄｅｌ８－１７の値はいずれも、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍに関して測定された値の２倍以内であり、このことは、これらのタンパク質がいずれもｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍとほぼ同程度に有効である（ＩＣ_５０ ５８ｎＭ）ことを示した。さらに強力であるｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣのＩＣ_５０は２８３ｎＭであり、これはｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍと比較して約５分の１に低下している。これは、ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ－ＰＲＤＣが機能的なＴＧＦ－β阻害剤であるが、その効力は、２つのフィンガー領域の方向の何らかの小さい変化によりわずかに損なわれ得ることを示している。

まとめ
本明細書に開示されたｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントは、その凝集傾向を低減させ、およびそのフォールディング傾向を増加させる置換を有する。ｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントは各々、培養細胞において高い親和性でＴβＲＩＩに結合する能力およびＴＧＦ－β３シグナル伝達を強力に阻害する能力を保持することが示された。したがって、本開示のｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍバリアントは、それがｉｎ ｖｉｖｏで投与される能力を改善し、したがってＴＧＦ－β媒介疾患の進行を減衰させるための治療介入に関する新規道筋を提供する属性を備えている。

（実施例７）
ｍｍＴＧＦ－β２バリアントを発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、耐性がんモデルにおいて優れた有効性を示す
ｍｍＴＧＦβ２バリアントｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（配列番号１２）（「バリアント１」または「ｖａｒ１」とも呼ばれる）を発現するワクシニアウイルス（ＶＶ）を、２つの耐性がんモデルにおいて試験した。第１のモデルは頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞系のＭＥＥＲサブクローン（ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ）であり、これは腫瘍溶解性ウイルス療法に対して耐性である。第２のモデルは、黒色腫細胞系のクローン２４（ＣＬ２４黒色腫；Ｐｔｅｎ欠損Ｂｒａｆ^{Ｖ６００Ｅ}）であり、これは腫瘍溶解性ウイルスまたは抗ＰＤ１などの免疫療法に応答しない。

第１の試験では、Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに１×１０^５個のＭＥＥＲ細胞を皮下に接種し、７日後、マウスに対照ＶＶまたはｍｍＴＧＦ－β２－７Ｍ２Ｒ－Ｄｅｌ８－１７（ＶＶ^{ｍｍＴＧＦβ（ｖａｒ１）}）（配列番号１２）を発現するように操作したＶＶのいずれかの２．５×１０^５ＰＦＵを腫瘍内注射した。図１０（上の列）に示すように、対照ウイルスは、わずかな治癒効果を有したが、ＶＶ^{ｍｍＴＧＦβ（ｖａｒ１）}によって処置したマウスの半数は、完全な応答を示し、長期間持続する生存利益を示した。

第２の試験では、Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに１×１０^５個のＣＬ２４細胞を皮下に接種し、７日後にマウスにＶＶ対照またはＶＶ^{ｍｍＴＧＦβ（ｖａｒ１）}の２．５×１０^５ＰＦＵを投与した。図１０（中央の列）に示すように、ＴＧＦβを標的とすることは、この侵襲性黒色腫モデルにおける動物の４０％において完全な応答をもたらした。抗ＰＤ１を添加すると、ＣＬ２４モデルにおいて腫瘍阻害効果を増強し（図１０、下の列）、ＶＶ、抗ＰＤ１、およびＴＧＦβの阻害の間で有意な相乗作用をもたらした。

本開示の主題の原理を適用できる多くの考えられる実施形態に鑑みて、この例示された実施形態は、本開示の単なる例であり、本開示の範囲を限定すると解釈してはならないと認識すべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および技術思想に包含される全てを特許請求する。

Claims (34)

1. ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンまたはシステインからアルギニンへの置換；
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
   配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
   配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
   配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
   配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
   を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
2. ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
   配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンまたはシステインからアルギニンへの置換；および
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失
   を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
3. 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β２単量体である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
4. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）に対する前記単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
5. ＴβＲＩＩに対する前記単量体の親和性を高める前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、
   配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
   配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および／または
   配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
   を含む、請求項４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
6. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；
   配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
   配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
   配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
   配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
   配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
   配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
   配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
   を含む、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
7. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号７を含む、または配列番号７からなる、請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
8. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、前記単量体の凝集を低減するおよび／またはフォールディングを改善する少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、またはさらに含む、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
9. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
   配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
   配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
   配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；および／または
   配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換
   を含む、請求項８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
10. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
    配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
    配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
    配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
    配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
    配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
    配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
    配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
    を含む、請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
11. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号９を含む、または配列番号９からなる、請求項１０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
12. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
    配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換；
    配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
    配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
    配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
    配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；および
    配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換
    を含む、請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
13. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１０を含む、または配列番号１０からなる、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
14. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体が、
    配列番号２に記載されるヒトＴＧＦ－β２のアミノ酸残基５２～７１に対応するα３ヘリックスの欠失；
    配列番号２の残基７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからバリンへの置換；
    配列番号２の残基１６に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアラニンへの置換；
    配列番号２の残基２５に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基２６に対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからリジンへの置換；
    配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
    配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基７９に対応するアミノ酸残基におけるバリンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基８９に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからバリンへの置換；
    配列番号２の残基９２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換；
    配列番号２の残基９４に対応するアミノ酸残基におけるリジンからアルギニンへの置換；
    配列番号２の残基９５に対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換；および
    配列番号２の残基９８に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからバリンへの置換
    を含む、請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
15. 前記ヒトＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１２を含む、または配列番号１２からなる、請求項１３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
16. ヒト組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β２単量体をコードする腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ＴＧＦ－β２単量体のアミノ酸配列が、配列番号１１を含む、または配列番号１１からなる腫瘍溶解性ウイルス。
17. 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β１単量体である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
18. 前記ヒトＴＧＦ－β１単量体が、
    配列番号１の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；
    配列番号１の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
    配列番号１の残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換；または
    配列番号１の残基５２に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換、残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換、および残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換
    をさらに含む、請求項１７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
19. 前記ヒトＴＧＦ－β１単量体のアミノ酸配列が、配列番号４を含む、または配列番号４からなる、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
20. 前記ＴＧＦ－β単量体がヒトＴＧＦ－β３単量体である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
21. 前記ヒトＴＧＦ－β３単量体が、
    配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換；
    配列番号３の残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換；
    配列番号３の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換；または
    配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換、残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換、および残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換
    をさらに含む、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
22. 前記ヒトＴＧＦ－β３単量体のアミノ酸配列が、配列番号６を含む、または配列番号６からなる、請求項２１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
23. 前記ＴＧＦ－β単量体がシグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
24. 前記シグナル配列が、配列番号８のアミノ酸配列を含むＩＬ－２シグナル配列である、請求項２３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
25. ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
26. ワクシニアウイルスである、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
27. 前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子の改変、およびウイルス増殖因子（ＶＧＦ）をコードする遺伝子の改変を含む、請求項２６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
28. 前記ＴＫをコードする遺伝子の改変が、前記遺伝子の完全または部分的な欠失を含む、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
29. 前記ＴＫ遺伝子の少なくとも一部が前記ＴＧＦ－β単量体をコードする核酸で置き換えられる、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
30. 前記ＶＧＦをコードする遺伝子の改変が、前記遺伝子の完全または部分的な欠失を含む、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
31. 請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
32. 対象におけるがんを処置する方法であって、請求項３１に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
33. がんを有する対象における腫瘍の成長または腫瘍の転移を阻害する方法であって、請求項３１に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
34. 前記がんが黒色腫、頭頸部がん、または膵臓がんである、請求項３２に記載の方法。

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