KR20150090919A - 결합제를 사용한 면역요법 - Google Patents
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Abstract
인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 결합제 및 사용 방법이 개시된다. 결합제는 야생형 폴리오바이러스 수용체 (PVR)에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 가용성 PVR 변이체를 포함할 수 있다. 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하며, 이는 암과 같은 질환의 치료 방법에 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 12월 4일 출원된 미국 가출원 번호 61/733,177 및 2013년 3월 15일 출원된 미국 가출원 번호 61/789,268을 우선권 주장하며, 상기 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역 반응을 조절하는 작용제, 예컨대 가용성 수용체, 항체 및 소분자, 뿐만 아니라 암과 같은 질환의 치료를 위한 상기 작용제의 사용 방법에 관한 것이다.
면역요법의 기초는 선천성 면역 반응 및 적응 면역 반응 둘 다를 포함하는 면역계의 조작이다. 면역요법의 목적은 "외래 물질", 예를 들어 병원체 또는 종양 세포에 대한 면역 반응을 제어함으로써 질환을 치료하는 것이다. 이것은 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 방법 또는 특이적 면역 반응을 억제하거나 감소시키는 방법을 포함할 수 있다. 면역계는 T-세포, B-세포, 자연 킬러 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포를 포함하는 매우 많은 세포 유형으로 구성된 매우 복잡한 계이다. 이들 세포는 그 과정을 위해 많은 수용체 및 가용성 인자를 이용하는 것을 포함하는, 그의 상호작용의 제어를 위한 복잡하고 민감한 시스템을 갖는다. 세포는 반응을 계속 점검하고 비제어된 면역 반응의 부정적 결과 (예를 들어, 자가면역 질환)를 허용하지 않기 위해 활성화 및 억제 메카니즘 둘 다를 이용한다.
암 면역감시의 개념은 면역계가 종양 세포를 인식하고, 면역 반응을 시작하고, 종양의 발생 및/또는 진행을 억제할 수 있다는 이론을 기초로 한다. 그러나, 많은 암성 세포가 면역계를 회피하여 억제되지 않은 종양 성장을 허용하는 메카니즘을 발달시켰음이 명백하다. 암 면역요법은 종양 세포를 사멸시키고 종양 성장을 억제하는 보다 효과적인 반응을 달성하기 위해 면역계를 활성화 및/또는 부스팅할 수 있는 작용제의 개발에 주력하고 있다.
본 발명은 면역 반응을 조절하는 결합제, 예컨대 가용성 수용체, 폴리펩티드, 항체 및 소분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 결합제를 포함하는 조성물, 예컨대 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 결합제 투여를 필요로 하는 대상체에게 결합제를 투여하는 방법을 추가로 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 결합제를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합제"는 가용성 수용체, 폴리펩티드, 항체, 소분자 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리오바이러스 수용체 (PVR) 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리오바이러스 수용체 (PVR) 변이체를 포함하는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는, 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는, 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 또한 인간 CD96의 세포외 도메인에도 결합하는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는, 인간 TIGIT의 세포외 도메인 및 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지만 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는, 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 야생형 PVR에 비해 인간 CD226의 세포외 도메인에 감소된 결합을 보이는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는, 인간 TIGIT의 세포외 도메인 및 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지만, 야생형 PVR에 비해 인간 CD226의 세포외 도메인에 감소된 결합을 보이는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 하나 이상의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 IgV 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 본질적으로 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지고, 여기서 IgV 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 인간 PVR의 아미노산 서열은 관련 기술분야에 알려져 있고, 서열 1로서 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 40-143에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 60-90 및/또는 아미노산 125-133에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 및 85에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 72에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 82에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 72 및 아미노산 82에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 포함하는 PVR의 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 IgV 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 본질적으로 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지는 PVR의 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 IgV 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드도 인간 CD96의 세포외 도메인에 또한 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 40-143에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 60-90 및/또는 아미노산 125-133에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 및 85에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 72에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 82에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 PVR의 아미노산 72 및 아미노산 82에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 변이체 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 TIGIT-결합제를 제공하고, 여기서 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 변이체 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 TIGIT-결합제를 제공하고, 여기서 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVR의 아미노산 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 또는 85에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-결합제는 변이체 인간 PVRL2의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL2의 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVRL2에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-결합제는 변이체 인간 PVRL3의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL3의 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVRL3에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-결합제는 변이체 인간 PVRL4의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL4의 하나 이상의 Ig-유사 도메인은 야생형 PVRL4에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
각각의 상기 언급한 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 결합제는 비-PVR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 비-PVR 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 비-PVR 폴리펩티드에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 펩티드 링커를 사용하여 비-PVR 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 인간 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 본질적으로 인간 Fc 영역으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 인간 Fc 영역으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 인간 Fc 영역은 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 및 서열 48로 이루어진 군으로부터 선택된다.
각각의 상기 언급한 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 결합제는 1가이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 2가이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 단일특이적이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 이중특이적이다.
각각의 상기 언급한 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 결합제는 이종다량체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 이종이량체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 작용제는 TIGIT에 결합하는 제1 폴리펩티드 및 제2 표적에 결합하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 작용제는 TIGIT에 결합하는 제1 폴리펩티드 및 면역 반응 자극제를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 작용제는 본원에 기재된 PVR 변이체를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 면역 반응 자극제를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 15 (IL-15), CD80, CD86, 항-CD3 항체, 항-CTLA-4 항체, 및/또는 항-CD28 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 작용제는 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 인간 IgG2 CH3 도메인을 포함하고, 제1 IgG2 CH3 도메인의 서열 40의 위치 249 및 288에 상응하는 위치의 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체되고, 제2 IgG2 CH3 도메인의 서열 40의 위치 236 및 278에 상응하는 위치의 아미노산은 리신으로 대체된다.
각각의 상기 언급한 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 결합제는 세포-매개 면역을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 T-세포 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 세포용해 T-세포 (CTL) 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 자연 킬러 (NK) 세포 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD96-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD96 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 신호전달 및 CD96 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD226 신호전달을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 신호전달을 억제하고, CD96 신호전달을 억제하지만, CD226 신호전달은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 신호전달을 억제하고, CD96 신호전달을 억제하고, CD226 신호전달을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하고, PVR과 CD96 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하지만, PVR과 CD226 사이의 상호작용은 억제하거나 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL3과 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL4와 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 대상체 (예를 들어, 인간)에게 본원에 기재된 결합제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하고/하거나 종양 성장을 억제하는 방법이 또한 제공된다.
각각의 상기 언급한 측면, 뿐만 아니라 본원의 다른 부분에 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 또는 결합제는 단리된다. 특정 실시양태에서, 가용성 수용체, 폴리펩티드, 또는 결합제는 실질적으로 순수하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 결합제를 포함하거나 생산하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 모노클로날 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 활성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 자극에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 종양 또는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 병원체이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 바이러스 감염 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 CD226-양성 세포를 유효량의 본원에 기재된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포는 T-세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 B-세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 NK 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 T-세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, T-세포 및/또는 NK 세포의 활성화를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 T-세포 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CTL의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 가용성 수용체는 (i) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, (ii) CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하는 것인, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 가용성 수용체는 (i) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, (ii) CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, (iii) CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는 것인, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포를 유효량의 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포를 유효량의 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 가용성 수용체는 (i) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, (ii) CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, (iii) CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는 것인, 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, TIGIT 신호전달을 억제하며, CD226 신호전달을 억제하지 않는 것인, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종양이 참조 샘플 또는 미리 결정된 PVR 수준에 비해 상승된 PVR 발현 수준을 갖는지 결정하고, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
각각의 상기 언급한 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 면역 반응 자극제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-3, IL-12, IL-15, IL-1, IL-2, CD80, CD86, 항-CD3 항체, 항-CTLA-4 항체 및 항-CD28 항체로 이루어지나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체가 참조 샘플 또는 미리 결정된 PVR 수준에 비해 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 종양을 갖는지 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 상승된 PVR 발현 수준을 가지면 대상체가 치료를 위해 선택되는 것인, 본원에 기재된 결합제를 사용한 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 측면 또는 실시양태를 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 분류의 측면에서 기재하는 경우, 본 발명은 전체로서 나열된 전체 군뿐만 아니라, 개별 군 및 주요 군의 모든 가능한 하위군의 각각의 구성원, 및 또한 하나 이상의 군 구성원이 존재하지 않는 주요 군을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에 하나 이상의 임의의 군 구성원의 명백한 배제도 고려한다.
도 1. PVR 패밀리의 구성원의 N-말단 Ig 도메인의 정렬.
도 2. PVR 패밀리 구성원, 막-결합된 디코이 수용체 및 가용성 수용체의 다이어그램.
도 3. PVR 패밀리 구성원 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. (A) HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 CD226-Fc, TIGIT-Fc, 또는 CD96-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. (B) HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-CFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 PVR-Fc, PVRL1-Fc, PVRL2-Fc, PVRL3-Fc, 또는 PVRL4-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. 특이적 결합은 각각의 FACS 플롯 상의 어두운 원형 오버레이 내의 신호의 존재에 의해 표시된다. (C) PVR 패밀리의 상이한 구성원 사이의 관찰된 결합 상호작용의 개략도.
도 4. PVR 변이체 (도 4A) 및 PVRL2 변이체 (도 4B)의 라이브러리 내의 잠재적인 변형을 위해 선택되는 특이적 아미노산 잔기 (볼드체)를 보여주는 인간 PVR (서열 17) 및 인간 PVRL2 (서열 23)의 N-말단 IgV 도메인의 서열.
도 5. PVR 변이체와 TIGIT, CD96 및 CD226 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVR S72N 변이체-CD4TM-GFP, 또는 PVR Q82K 변이체-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 TIGIT-Fc, CD96-Fc, CD226-Fc 융합 단백질, TIGIT-Fc와 CD226-Fc 융합 단백질의 조합, 또는 CD96-Fc와 CD226-Fc 융합 단백질의 조합과 혼합하였다.
도 6. 자연 킬러 세포 세포독성 검정. 인간 NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 전처리하였다. 표적 세포 (HEK-293T 세포 또는 K562 세포)를 12:1의 이펙터:표적 비로 NK 세포와 혼합된 10 μΜ 칼세인 AM으로 표지하였다. 상청액을 수거하고, 칼세인 방출을 485 nm의 여기 및 535 nm의 방출에서 형광계로 정량하였다.
도 7. 자연 킬러 세포독성 검정. HEK-293T 또는 A549 세포를 플레이트 내에 시딩하고, 전면성장까지 밤새 성장시켰다. NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 전처리하고, 인간 IL-2와 함께 또는 그 없이 표적 세포에 첨가하였다. 배양 상청액을 24시간 후에 수거하고, ELISA (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스)에 의해 IFN-감마 함량에 대해 분석하였다.
도 8. PVR 변이체와 TIGIT, CD226, 및 PVRL3 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVR S72N 변이체-CD4TM-GFP, PVR Q82K 변이체-CD4TM-GFP, 또는 PVR Q82K+S72N 이중 변이체-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 가용성 TIGIT-Fc, CD226-Fc, 또는 PVRL3-Fc 융합 단백질과 혼합한 후, PE-접합된 항-인간 Fc 이차 항체로 염색하였다. 이어서, 융합 단백질 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
도 2. PVR 패밀리 구성원, 막-결합된 디코이 수용체 및 가용성 수용체의 다이어그램.
도 3. PVR 패밀리 구성원 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. (A) HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 CD226-Fc, TIGIT-Fc, 또는 CD96-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. (B) HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-CFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 PVR-Fc, PVRL1-Fc, PVRL2-Fc, PVRL3-Fc, 또는 PVRL4-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. 특이적 결합은 각각의 FACS 플롯 상의 어두운 원형 오버레이 내의 신호의 존재에 의해 표시된다. (C) PVR 패밀리의 상이한 구성원 사이의 관찰된 결합 상호작용의 개략도.
도 4. PVR 변이체 (도 4A) 및 PVRL2 변이체 (도 4B)의 라이브러리 내의 잠재적인 변형을 위해 선택되는 특이적 아미노산 잔기 (볼드체)를 보여주는 인간 PVR (서열 17) 및 인간 PVRL2 (서열 23)의 N-말단 IgV 도메인의 서열.
도 5. PVR 변이체와 TIGIT, CD96 및 CD226 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVR S72N 변이체-CD4TM-GFP, 또는 PVR Q82K 변이체-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 가용성 TIGIT-Fc, CD96-Fc, CD226-Fc 융합 단백질, TIGIT-Fc와 CD226-Fc 융합 단백질의 조합, 또는 CD96-Fc와 CD226-Fc 융합 단백질의 조합과 혼합하였다.
도 6. 자연 킬러 세포 세포독성 검정. 인간 NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 전처리하였다. 표적 세포 (HEK-293T 세포 또는 K562 세포)를 12:1의 이펙터:표적 비로 NK 세포와 혼합된 10 μΜ 칼세인 AM으로 표지하였다. 상청액을 수거하고, 칼세인 방출을 485 nm의 여기 및 535 nm의 방출에서 형광계로 정량하였다.
도 7. 자연 킬러 세포독성 검정. HEK-293T 또는 A549 세포를 플레이트 내에 시딩하고, 전면성장까지 밤새 성장시켰다. NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 전처리하고, 인간 IL-2와 함께 또는 그 없이 표적 세포에 첨가하였다. 배양 상청액을 24시간 후에 수거하고, ELISA (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스)에 의해 IFN-감마 함량에 대해 분석하였다.
도 8. PVR 변이체와 TIGIT, CD226, 및 PVRL3 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVR S72N 변이체-CD4TM-GFP, PVR Q82K 변이체-CD4TM-GFP, 또는 PVR Q82K+S72N 이중 변이체-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 가용성 TIGIT-Fc, CD226-Fc, 또는 PVRL3-Fc 융합 단백질과 혼합한 후, PE-접합된 항-인간 Fc 이차 항체로 염색하였다. 이어서, 융합 단백질 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
본 발명은 면역 반응을 조절하는 폴리펩티드, 가용성 수용체 및 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 신규 작용제를 제공한다. 작용제는 세포 상호작용 및 면역 반응 신호전달에 관여하는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원인 수용체의 효능제 및 길항제를 포함한다. 관련 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 상기 작용제를 포함하는 조성물, 및 상기 작용제의 제조 방법도 제공된다. 면역 반응을 조절하는 작용제의 스크리닝 방법이 제공된다. 신규 작용제의 사용 방법, 예컨대 면역 반응의 활성화 방법, 면역 반응의 자극 방법, 면역 반응의 촉진 방법, 면역 반응의 증가 방법, 자연 킬러 (NK) 세포 및/또는 T-세포의 활성화 방법, NK 세포 및/또는 T-세포의 활성 증가 방법, NK 세포 및/또는 T-세포의 활성 촉진 방법, 종양 성장의 억제 방법, 및/또는 암 치료 방법이 추가로 제공된다.
I. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 많은 용어 및 문구가 아래에 규정된다.
본원에 사용된 용어 "효능제" 및 "효능성"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로, 실질적으로 유도하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시킬 수 있는 작용제를 나타내거나 기재한다. 용어 "효능제"는 단백질의 활성을 부분적으로 또는 완전히 유도하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시키는 임의의 작용제를 포함하도록 본원에서 사용된다. 적합한 효능제는 구체적으로 효능제 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체, 다른 융합 단백질, 폴리펩티드, 및 소분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "길항제" 및 "길항성"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로, 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시킬 수 있는 작용제를 나타내거나 기재한다. 용어 "길항제"는 단백질의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시키는 임의의 작용제를 포함하도록 본원에서 사용된다. 적합한 길항제는 구체적으로 길항제 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체, 다른 융합 단백질, 폴리펩티드, 및 소분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "조절" 및 "조절하다"는 생물학적 활성의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조절은 활성을 자극하거나 억제하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가 또는 감소, 결합 특성의 변화, 또는 단백질의 활성, 경로, 시스템 또는 다른 관심 생물학적 표적과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가용성 수용체"는 세포로부터 가용성 형태로 분비될 수 있는 수용체의 제1 막횡단 도메인 앞에 위치하는 세포외 단편을 지칭한다. 용어 "가용성 수용체"는 전체 세포외 도메인, 또는 세포외 도메인의 단편을 포함하는 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩티드 (예를 들어, PVR 성분)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생물활성에 불리한 영향을 주지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이어서는 안되고, 면역 반응을 유발하지 않아야 한다.
용어 "선택적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합하다"는 결합제가 관련된 및 무관한 단백질을 비롯한 다른 물질보다 빈번하게, 신속하게, 긴 지속기간으로, 큰 친화도로 또는 이들 특성의 일부 조합으로 에피토프, 단백질 또는 표적 분자와 반응하거나 또는 회합하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하다"는 예를 들어 결합제가 단백질 또는 표적에 약 0.1 mM 이하, 보다 통상적으로는 약 1 μM 미만의 KD로 결합하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하다"는 결합제가 표적에 적어도 약 0.1 μM 이하, 적어도 약 0.01 μM 이하 또는 적어도 약 1 nM 이하의 KD로 결합하는 것을 의미한다. 상이한 종에서의 상동 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 종에서의 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 단백질의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내의 상동성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 결합제는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 독점적 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 특정 실시양태에서 결합제는 하나 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제 상의 동일한 항원-결합 부위가 다중 표적에 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 예에서 항체는, 각각 2개 이상의 단백질 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 대안적 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 특이성이 상이한 2개 이상의 항원-결합 부위를 포함한다. 비제한적 예로서, 이중특이적 항체는 하나의 단백질 상의 에피토프를 인식하는 1개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 제2 단백질 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의 상이한 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 또한, 이 용어는 천연적으로, 또는 개입에 의해, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 정의에는 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 포함)를 함유하는 폴리펩티드 및 관련 기술분야에 공지된 다른 변형도 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원을 기초로 할 수 있기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩티드는 단일쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않으면서 최대 대응을 위해 (필요한 경우, 갭을 도입하여) 비교 및 정렬하는 경우에, 동일하거나 또는 명시적인 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 획득하는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들은 BLAST, ALIGN, 메갈라인(Megalign), 베스트핏(BestFit), GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package) 및 이들의 변형을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2개의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은, 최대 대응을 위해 비교 및 정렬하는 경우에, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의한 측정시에 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시양태에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 길이가 적어도 약 10개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40-60개 잔기, 적어도 약 60-80개 잔기 또는 이들 사이의 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다. 일부 실시양태에서, 60-80개 잔기보다 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개 잔기에 걸쳐 동일성이 존재하고, 일부 실시양태에서는, 비교되는 서열들의 전체 길이, 예컨대 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 걸쳐 서열들이 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 규정되어 있으며, 이는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 티로신의 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 가용성 수용체 및/또는 항체의 서열에서의 보존적 치환은 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 가용성 수용체 또는 항체가 표적 결합 부위에 결합하는 것을 무효로 하지 않는다. 결합을 배제하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포 내에 전달할 수 있고, 대체로 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 가용성 수용체, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 가용성 수용체, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 가용성 수용체, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 가용성 수용체, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수하거나 (즉, 오염물을 함유하지 않음), 적어도 90% 순수하거나, 적어도 95% 순수하거나, 적어도 98% 순수하거나 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 선천성 면역계 및 적응 면역계 둘 다로부터의 반응을 포함한다. 이것은 T-세포 및 B-세포 반응 (예를 들어, 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응), 및 면역계의 다른 세포, 예컨대 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포 등으로부터의 반응을 모두 포함한다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 것인 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 모세포종, 육종 및 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양" 및 "신생물"은 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 유발된, 양성 (비-암성) 또는 전암성 병변을 비롯한 악성 (암성)의 임의의 조직 덩어리를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 새로운 위치에서의 유사한 암성 병변의 발생과 함께 암이 원래 부위로부터 신체의 다른 영역으로 확산 또는 이전되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는, 인접 세포와의 부착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 일차 질환 부위로부터 이동하여 인접 신체 구조를 침습하는 것이다.
용어 "암 줄기 세포" 및 "CSC" 및 "종양 줄기 세포" 및 "종양 개시 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 (1) 광범위한 증식 능력을 갖고; (2) 분화 세포가 감소된 증식 또는 발달 잠재성을 갖는 것인 하나 이상의 유형의 분화 세포 자손을 생성하는 비대칭 세포 분열이 가능하고; (3) 자기-재생 또는 자기-유지를 위한 대칭 세포 분열이 가능한 암 또는 종양으로부터의 세포를 지칭한다. 이들 특성은 종양을 형성하는데 실패하는 대다수의 종양 세포에 비해, 적절한 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이식시에 종양 또는 암을 형성하거나 확립하는 능력을 암 줄기 세포에 부여한다. 암 줄기 세포는 카오스 방식으로 분화에 대한 자기-재생을 겪고, 이 때문에 돌연변이가 발생할 때 시간에 따라 변화할 수 있는 비정상적 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 대부분의 암 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포, 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 비롯하여, 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 전체 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 재생 및 분화 능력이 결여된 세포만 지칭하여 이러한 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하는 경우에 용어 "비-종양발생"에 의해 수식될 것이다.
본원에 사용된 용어 "종양발생"은 자기-재생 (추가의 종양발생 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 모든 다른 종양 세포를 발생시키는 증식 (분화 및 이에 따라 비-종양발생 종양 세포를 발생시킴)의 특성을 비롯한 암 줄기 세포의 기능적인 특징을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "종양발생성"은 적절한 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이식시에 촉지성 종양을 형성하는, 종양으로부터의 무작위 세포 샘플의 능력을 지칭한다.
용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 되는, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 인간 대상체에 대한 언급시에 상호교환적으로 사용된다.
용어 "제약상 허용되는"은 인간을 비롯한 동물에서의 사용에 대해 미국 연방 정부 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되었거나 또는 승인가능하거나, 또는 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거된 물질을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트" 또는 "허용되는 제약 담체"는 하나 이상의 본 개시내용의 결합제 (예를 들어, 항체)와 함께 대상체에 투여될 수 있고, 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료 효과를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 비독성인 부형제, 담체 또는 아주반트를 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량" 또는 "치료 효과"는 대상체, 예컨대 포유동물에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 결합제, 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암 또는 종양의 경우에, 치료 유효량의 작용제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 항체)는 치료 효과를 가지며, 따라서 면역 반응을 부스팅하고, 항-종양 반응을 부스팅하고, 면역 세포의 세포용해 활성을 증가시키고, 면역 세포에 의해 종양 세포의 사멸을 증가시키고, 종양 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력을 감소시킬 수 있거나; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 암 세포 집단을 감소시킬 수 있거나; 주변 장기 내로의 암 세포 침윤 (예를 들어, 연조직 및 골 내로의 암 확산 포함)을 억제하거나 또는 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 전이를 억제하고 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 성장을 억제하고 정지시킬 수 있거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선할 수 있거나; 또는 이러한 효과들의 조합이 가능하다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한", 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"은 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/하거나, 둔화시키고/시키거나, 그의 증상을 줄이고/줄이거나 그의 진행을 중단시키는 치료 수단, 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지하거나 또는 둔화시키는 예방적 또는 방지 수단 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 이는 이미 장애를 앓고 있는 이; 장애를 앓기 쉬운 이; 및 장애가 방지되어야 하는 이를 포함한다. 암 또는 종양의 경우에, 환자가 하기 중 하나 이상을 나타내면 대상체가 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된 것이다: 면역 반응의 증가, 항-종양 반응의 증가, 면역 세포의 세포용해 활성 증가, 면역 세포에 의한 종양 세포의 사멸 증가, 암 세포 수의 감소 또는 암 세포의 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연조직 및 골 내로의 암 세포 확산을 비롯한 주변 장기 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 억제 또는 부재; 암 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질의 개선; 종양발생성 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도 감소; 또는 이들 효과들의 일부 조합.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
실시양태가 본원에서 "포함하는"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에도, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"의 표현으로 기재되지만 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한, 실시양태가 본원에서 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에도, "~로 이루어진"의 표현으로 기재되지만 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략" 값 또는 파라미터의 언급은 값 또는 파라미터에 대한 실시양태를 포함한다 (및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용되는 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A (단독); 및 B(단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 각각의 실시양태를 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. 결합제
본 발명은 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리, 특히 PVR 패밀리의 구성원에 결합하는 작용제를 제공한다. PVR 패밀리는 폴리오바이러스 수용체 (PVR), 폴리오바이러스 수용체-관련 단백질 1 (PVRL1), 폴리오바이러스 수용체-관련 단백질 2 (PVRL2), 폴리오바이러스 수용체-관련 단백질 3 (PVRL3), 폴리오바이러스 수용체-관련 단백질 4 (PVRL4), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체 (TIGIT), CD226, 및 CD96을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 단백질은 모두 일반적으로 구조 및 기능 둘 다에 관련된다. 수용체는 전형적으로 하나 이상의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인을 함유하는 세포외 도메인 (ECD), 단일 막횡단 도메인, 및 세포질 테일로 이루어지는 I형 막횡단 단백질이다. 수용체는, 통상적으로 반대쪽 세포 표면 상의 다른 Ig-유사 도메인에 결합하고 (동종친화성 상호작용) 또한 인테그린 및 탄수화물과 상호작용하는 (이종친화성 상호작용) 그의 N-말단 Ig-유사 도메인을 통해 상호작용을 매개한다 (Wong et al., 2012, Int. J. Cell Biol.; epub).
인간 폴리오바이러스 수용체 (PVR)는 3개의 세포외 Ig-유사 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 테일을 함유하는 70 kD 단백질이다. Ig-유사 도메인은 N-말단 V-형 도메인, 이어서 2개의 C2-형 도메인을 포함한다. PVR은 주로 내피 세포, 단핵구, 상피 세포, 및 중추신경계 세포에서 발견된다. PVR은 CD226, CD96, PVRL3, 및 비트로넥틴과의 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용에 관여한다. PVR은 CD155, 넥틴-유사 5, 및 NECL-5로도 알려져 있다.
인간 폴리오바이러스 수용체-관련 단백질 1-4 (PVRL1-4)는 모두 PVR에 유사한 구조, 즉, N-말단 V-형 도메인을 포함하는 3개의 Ig-유사 도메인, 이어서 2개의 C2-형 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 테일을 갖는다. PVRL1은 내피 세포, 상피 세포, 뉴런 세포, 거핵구, 및 CD34-양성 줄기 세포에서 광범하게 발현된다. PVRL1은 단순 포진 바이러스 (HSV-1 및 HSV-2)에 대한 수용체로서 기능하고, 세포 연접부의 형성에 관여한다. PVRL1은 또한 CD111, 넥틴-1, HVEC, HLGR, 및 PRR1로도 알려져 있다. PVRL1과 유사하게, PVRL2는 내피 세포, 상피 세포, 뉴런 세포, 거핵구, 및 CD34-양성 줄기 세포에서 광범하게 발현되고, HSV에 대한 수용체로서 기능한다. 또한, 이것은 세포 연접부의 형성에 관여하고, CD226 및 다른 PVR 패밀리 구성원과 상호작용한다. PVRL2는 또한 CD112, 넥틴-2, HVEB 및 PRR2로도 알려져 있다. PVRL3 및 PVRL4는 대부분의 정상 세포에서 단지 약하게 발현되는 것으로 보이지만, PVRL1 및 PVRL2와 유사하게, PVRL3 및 PVRL4는 세포 연접부의 형성에 관여한다. 또한, PVRL4는 홍역 바이러스의 수용체로서 확인되었다. PVRL3은 또한 CD113 및 넥틴-3으도 알려져 있고, PVRL4는 또한 넥틴-4, LNIR, 및 PRR4로도 알려져 있다.
CD226은 2개의 C2-형 도메인을 포함하는 2개의 Ig-유사 도메인, 이어서 막횡단 도메인, 및 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하는 세포질 테일을 함유하는 ~65 kD 당단백질이다. CD226은 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포, T-세포, 거핵구, 및 B-세포의 하위세트의 표면에서 관찰되었다. CD226은 PVR 및 PVRL2에 결합하고, NK 세포 및 T-세포의 활성화에 관여하는 것으로 보인다. 상기 수용체는 또한 DNAM-1, PTA-1, 및 TLiSA1로도 알려져 있다.
TIGIT는 하나의 Ig-유사 V-형 도메인, 이어서 막횡단 도메인, 및 2개의 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유하는 세포질 테일을 함유하는 26 kD 단백질이다. TIGIT는 NK 세포 및 대부분의 활성화된 T-세포의 표면에서 관찰되었지만, 항원 미노출 림프구에서는 낮거나 음성이다. TIGIT는 PVR, PVRL2, PVRL3, 및 PVRL4에 결합하고, T-세포와 NK 세포 둘 다에 대해 억제 기능을 갖는 것으로 보인다. 상기 수용체는 또한 VSIG9, Vstm3, 및 WUCAM으로도 알려져 있다.
CD96은 2개의 V-형 도메인 및 하나의 C2-형 도메인을 포함하는 3개의 Ig-유사 도메인, 이어서 막횡단 도메인, 및 ITIM 모티프를 함유하는 세포질 테일을 함유하는 160 kD 단백질이다. CD96은 NK 세포 및 T-세포의 표면 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CD96은 PVR에 결합하고, CD96의 주요 기능은 PVR을 발현하는 다른 세포에 대한 NK 세포의 부착을 매개하는 것으로 생각된다. 그러나, ITIM의 존재는 CD96이 또한 억제 기능을 가질 수 있음을 제시한다. 상기 수용체는 또한 택틀(tactile)로서 알려져 있다.
인간 PVR, PVRL1-4, TIGIT, CD226, 및 CD96의 전장 아미노산 (aa) 서열은 관련 기술분야에 알려져 있고, 서열 1 (PVR), 서열 2 (PVRL1), 서열 3 (PVRL2), 서열 4 (PVRL3), 서열 5 (PVRL4), 서열 6 (TIGIT), 서열 7 (CD96), 및 서열 8 (CD226)로서 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형 단백질"에 상응하는 아미노산 위치에 대한 언급은 신호 서열을 포함하는 전장 아미노산 서열의 넘버링을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 이중특이적 결합제이다. 특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 PVR 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 단백질은 야생형 단백질의 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 부가를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVR 변이체는 본질적으로 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지고, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인 및 하나의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 인간 PVR의 N-말단 IgV 도메인 및 2개의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 40-143에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 60-90에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 125-133에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 60-90 및 125-133에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 및 85에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 72에 상응하는 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 82에 상응하는 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 야생형 PVR의 아미노산 72 및 82에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 PVRL1 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 인간 PVRL1의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL1 변이체는 인간 PVRL1의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL1 변이체는 본질적으로 인간 PVRL1의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 인간 PVRL1의 N-말단 IgV 도메인 및 하나의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 인간 PVRL1의 N-말단 IgV 도메인 및 2개의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1의 아미노산 41-144에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1의 아미노산 61-93에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1의 아미노산 126-134에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL1 변이체는 야생형 PVRL1의 아미노산 61-93 및 126-134에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 PVRL2 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 인간 PVRL2의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL2 변이체는 인간 PVRL2의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL2 변이체는 본질적으로 인간 PVRL2의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지고, 여기서 PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 인간 PVRL2의 N-말단 IgV 도메인 및 하나의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 인간 PVRL2의 N-말단 IgV 도메인 및 2개의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2의 아미노산 45-160에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2의 아미노산 64-97에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2의 아미노산 142-150에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 야생형 PVRL2의 아미노산 64-97 및 142-150에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 PVRL3 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 인간 PVRL3의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL3 변이체는 인간 PVRL3의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL3 변이체는 본질적으로 인간 PVRL3의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지고, 여기서 PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 인간 PVRL3의 N-말단 IgV 도메인 및 하나의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 인간 PVRL3의 N-말단 IgV 도메인 및 2개의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3의 아미노산 68-168에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3의 아미노산 86-117에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3의 아미노산 150-158에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL3 변이체는 야생형 PVRL3의 아미노산 86-117 및 150-158에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 PVRL4 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 인간 PVRL4의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL4 변이체는 인간 PVRL4의 N-말단 IgV 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, PVRL4 변이체는 본질적으로 인간 PVRL4의 N-말단 IgV 도메인으로 이루어지고, 여기서 PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 인간 PVRL4의 N-말단 IgV 도메인 및 하나의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 인간 PVRL4의 N-말단 IgV 도메인 및 2개의 IgC2 도메인을 포함하고, 여기서 PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4의 아미노산 42-147에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4의 아미노산 62-94에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4의 아미노산 129-137에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL4 변이체는 야생형 PVRL4의 아미노산 62-94 및 129-137에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, TIGIT, CD96, 및 CD226에 대한 세포외 도메인 (ECD)은 서열 9-16 (예측된 신호 서열 미함유)으로서 제공된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 ECD 도메인에 상응하는 정확한 아미노산에 대한 이해가 상이할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 ECD의 N-말단 및/또는 C-말단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산만큼 연장되거나 단축될 수 있다. 이것은 또한 ECD 내의 개별 Ig-형 도메인에도 적용된다.
인간 TIGIT 및 인간 CD96은 그의 ITIM을 통해 그의 활성을 매개하는 억제 수용체이고, 면역 반응을 억제하는 능력을 갖는 것으로 생각된다. 이와 반대로, 인간 CD226은 ITAM을 통해 그의 활성을 매개하는 활성화 수용체이고, 면역 반응을 활성화하는 능력을 갖는 것으로 생각된다. TIGIT, CD96 및 CD226은 모두 NK 세포 및 T-세포에서 발현된다. 3개의 모든 수용체는 PVR에 결합하는 것으로 밝혀졌고, TIGIT가 CD96 및 CD226에 비해 PVR에 대한 가장 높은 친화도를 갖는다. 많은 상황에서, TIGIT의 억제 효과가 우세하고, 항원 자극 (예를 들어, 종양, 바이러스, 감염)에 대한 면역 반응이 감소하거나 억제되는 것으로 보인다. 이론에 매이지 않지만, 억제 수용체 TIGIT 및/또는 CD96의 조작을 통해 강한 면역 반응이 활성화 및/또는 증가될 수 있음이 제시된다. 예를 들어, 강한 면역 반응은 TIGIT와 특이적으로 상호작용하지만 신호전달을 활성화하지 않는 결합제 (즉, "차단제")를 사용하여 달성할 수 있고, 여기서 결합제는 CD226에 결합하고/하거나 CD226의 활성화에 영향을 주지 않고, 따라서 예를 들어 NK 세포 및/또는 T-세포의 활성 증가를 허용한다. 면역 반응은 결합제가 TIGIT 및 CD96으로부터 임의의 억제성 신호전달을 활성화하지 않으면서 상기 분자 둘 다와 특이적으로 상호작용하면 강화될 수 있다. 이것은 CD226 신호전달이 우세하도록 허용하여 강한 또는 보다 강한 면역 반응을 유발할 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용을 방해하지만, PVR과 CD226 사이의 상호작용은 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 방해하지만, PVR과 CD226 사이의 상호작용은 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 방해하지만, PVR과 CD226 사이의 상호작용은 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 결합제는 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용, PVR과 CD96 사이의 상호작용을 방해하고, PVR과 CD226 사이의 상호작용은 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL2 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 결합제는 PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용을 방해하고, PVRL2와 CD226 사이의 상호작용은 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 특이적으로 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 결합하고, CD96의 세포외 도메인에 결합하고, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 결합제는 TIGIT 및 CD96에 특이적으로 결합하고, CD226에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL2 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 결합제는 TIGIT에 특이적으로 결합하고, CD226에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다).
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인 및 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합) 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고), PVR과 CD226 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인 및 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합) 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고) PVR과 CD226 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체는 인간 TIGIT의 세포외 도메인 및 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합) 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고) PVR과 CD226 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 PVRL2 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVRL2 변이체를 포함하는 가용성 수용체는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합) 및 PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고) PVR과 CD226 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지만 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않는 (또는 약하게 결합하는) PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않은 (또는 약하게 결합하는) PVR 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 본원에 기재된 PVR 변이체이다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체는 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하지만 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않은 (또는 약하게 결합하는) PVRL2 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 본원에 기재된 PVRL2 변이체이다. 일부 실시양태에서, PVRL2 변이체는 서열 38을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지만, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고) PVRL2와 CD226 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 PVRL3 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 PVRL4 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVRL3과 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, PVRL4와 TIGIT 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 억제하거나 방해한다.
일부 실시양태에서, 결합제는 변이체 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 TIGIT-결합제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 변이체 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 CD96-결합제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 변이체 인간 PVR의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하는 TIGIT 및 CD96-결합제이다. 일부 실시양태에서, TIGIT-결합제는 변이체 인간 PVR을 포함하고, CD226에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다).
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 융합 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 하이브리드 단백질이다. 특정 실시양태에서, 결합제, 예컨대 가용성 수용체 또는 폴리펩티드는 비-PVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 인간 Fc 영역, 단백질 태그 (예를 들어, myc, FLAG, GST), 다른 내인성 단백질 또는 단백질 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-PVR 폴리펩티드에 연결된 PVR 패밀리 구성원 ECD 또는 그의 단편 (예를 들어, Ig-유사 도메인), 또는 ECD와 제2 폴리펩티드 사이의 임의의 링커 영역을 포함하는 임의의 다른 유용한 단백질 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 인간 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 본질적으로 인간 Fc 영역으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 인간 Fc 영역으로 이루어진다. Fc 영역은 이뮤노글로불린의 부류 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 중 임의의 것으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 아미노산 변이를 함유하는 야생형 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 돌연변이된 또는 변형된 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산이 N-말단 단부에서 말단절단된다 (예를 들어, 힌지 도메인 내에서). 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산이 C-말단 단부에서 말단절단된다 (예를 들어, C-말단 리신 상실). 일부 실시양태에서, 힌지 도메인 내의 아미노산은 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 저해하도록 변경된다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 저해하도록 상이한 아미노산으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 저해하도록 세린으로 대체된다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 이종다량체 또는 이종이량체 분자의 형성을 촉진하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-PVR 폴리펩티드는 본질적으로 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 적어도 PVR 변이체 ECD (또는 PVRL1-4 변이체 ECD)의 단편 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체 ECD (또는 그의 단편)의 C-말단은 이뮤노글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, PVR 변이체 ECD (또는 그의 단편)은 Fc 영역에 직접 연결된다 (즉, 개재하는 펩티드 링커 부재). 일부 실시양태에서, PVR 변이체 ECD (또는 그의 단편)는 펩티드 링커를 통해 Fc 영역에 연결된다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, PVR 변이체 ECD 또는 그의 단편)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 생물활성에 불리한 영향을 주지 않아야 한다. 링커는 항원성이어서는 안되고, 면역 반응을 유발하지 않아야 한다. 적합한 링커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 종종 글리신과 세린 잔기의 혼합물을 포함하고, 종종 입체 비방해된 아미노산을 포함한다. 유용한 링커에 혼입될 수 있는 다른 아미노산은 트레오닌 및 알라닌 잔기를 포함한다. 링커의 길이는 예를 들어 1-50개 아미노산, 1-22개 아미노산, 1-10개 아미노산, 1-5개 아미노산 또는 1-3개 아미노산일 수 있다. 링커는 SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n (여기서, n은 1-7임), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), ESGGGGVT (서열 33), LESGGGGVT (서열 34), GRAQVT (서열 35), WRAQVT (서열 36) 및 ARGRAQVT (서열 37)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 링커는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, PVR 변이체 ECD 또는 그의 일부)의 C-말단 또는 제2 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역)의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 개재 펩티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 26, 서열 27, 또는 서열 28을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 29, 서열 43, 또는 서열 44를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 30을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 31을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 45 또는 서열 46을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 47 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 19를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 20을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 30 또는 서열 31을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다.
일부 실시양태, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 링커에 의해 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 30 또는 서열 31을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 링커에 의해 제2 폴리펩티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 19 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 19 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 30 또는 서열 31을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 19 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 링커에 의해 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 서열 19 또는 서열 21을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 30 또는 서열 31을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 링커에 의해 제2 폴리펩티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38에 대해 적어도 80% 동일한 제1 폴리펩티드, 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 결합제는 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38에 대해 적어도 80% 동일한 제1 폴리펩티드 및 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 또는 서열 48을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 링커에 의해 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 38에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다.
수용체 단백질은 일반적으로 단백질의 수송을 지시하는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열 (신호 펩티드 또는 리더 서열로서도 칭함)은 신생 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이들은 폴리펩티드를 소포체를 향해 표적화하고, 단백질을 그의 목적지, 예를 들어 소기관의 내강, 내막, 세포 외막, 또는 분비를 통해 세포 외부로 선별하여 도입한다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 소포체로 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터 신호 서열의 절단은 대체로 아미노산 서열 내의 특이적 부위에서 발생하고, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 의존적이다. 대체로 하나의 특이적 절단 부위가 존재하지만, 하나 초과의 절단 부위가 신호 펩티다제에 의해 인식되고/되거나 사용되어 폴리펩티드의 비-균일한 N-말단을 생성한다. 예를 들어, 신호 서열 내의 상이한 절단 부위의 사용은 상이한 N-말단 아미노산과 함께 발현된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 상이한 N-말단을 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, N-말단의 길이는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 균일하고, 즉, 폴리펩티드는 동일한 N-말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 등)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 하나의 절단 부위가 우세하여 하나의 N-말단을 갖는 실질적으로 균일한 폴리펩티드를 생성하도로고 허용하는 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 천연 (예를 들어, PVR 패밀리 구성원) 신호 서열이 아니다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 천연 또는 비변경된 Fc 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 융합 단백질과 비교할 때 요구되는 생화학적 특성, 예컨대 감소된 혈청 반감기, 증가된 혈청 반감기, 또는 증가된 표적 세포 국재화를 제공하도록 본 발명의 결합제의 일부가, 적어도 Fc 영역의 일부가 결실되거나 다른 방식으로 변경된 융합 단백질을 포함할 것임을 이해할 것이다. Fc 영역에 대한 변형은 1개 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 변형된 융합 단백질은 2개의 중쇄 불변 도메인 (CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 또는 힌지 영역에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 CH2 도메인이 제거될 수 있다 (ΔCH2 구축물). 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역 도메인에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개 aa 잔기)에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 CH3 도메인을 힌지 영역 또는 제1 폴리펩티드에 직접 연결하도록 조작된다. 다른 실시양태에서, 펩티드 스페이서가 제1 폴리펩티드의 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (변형되거나 또는 변형되지 않음)이 5-20개 아미노산 스페이서에 의해 제1 폴리펩티드의 힌지 영역에 연결된 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 부가하여, 불변 도메인의 조절 요소가 유리되고 접근가능하게 유지되거나, 또는 힌지 영역이 가요성으로 유지되도록 보장할 수 있다. 그러나, 일부 경우에는 아미노산 스페이서가 면역원성으로 입증되어 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있음에 주목해야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 부가된 임의의 스페이서는 융합 단백질의 원하는 생물학적 품질을 유지하도록 비교적 비-면역원성일 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 불변 도메인의 부분 결실, 또는 수 개 또는 심지어 단일 아미노산의 치환만을 가질 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜 표적 세포 국재화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 특이적 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1q 결합)을 제어하는 1개 이상의 불변 영역 도메인의 일부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능은 그대로 유지시키면서 결합제의 선택된 특징 (예를 들어, 혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 융합 단백질의 불변 영역은 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 융합 단백질의 입체형태 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서, 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 바람직한 특징, 예컨대 이펙터 기능의 감소 또는 증가를 증진시키거나 또는 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착 부위를 제공하도록 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함한다.
불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 또는 IgM 항체 (항원에 결합된)의 Fc 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 또한, Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 다양한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체, 예컨대 IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)이 존재한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 변경된 이펙터 기능을 제공하며, 이는 결과적으로 투여된 작용제의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역 도메인의 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 작용제의 Fc 수용체 결합을 감소시켜, 표적 세포 국재화를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 불변 영역 변형은 작용제의 혈청 반감기를 증가 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 부착 부위를 제거하도록 변형된다.
특정 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 Fc 영역과 통상 연관되는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 작용제는 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제는 이펙터 기능을 갖지 않는다.
본 발명은 또한 이종이량체 분자를 포함한다. 일반적으로 이종이량체 분자는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 적어도 2개의 표적에 결합할 수 있다. 표적은 예를 들어 단일 세포 상의 2개의 상이한 수용체 또는 2개의 별개의 세포 상의 2개의 상이한 표적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자의 하나의 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, TIGIT에 결합하는 것)를 포함하고, 이종이량체 분자의 하나의 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 하나의 표적에 결합할 수 있고, 또한 "비-결합" 기능을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서,이종이량체 분자의 하나의 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, TIGIT에 결합하는 것)를 포함하고, 이종이량체 분자의 하나의 폴리펩티드는 면역 반응 자극제이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "면역 반응 자극제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 임의의 면역계 성분의 활성화를 유도하거나 활성을 증가시킴으로써 면역계를 직접 또는 간접적으로 자극하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 면역 반응 자극제는 시토카인, 및 종양 항원을 포함하는 다양한 항원, 및 병원체로부터 유래된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF)), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 면역억제 기능을 차단하는 항체 (예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), 톨(toll)-유사 수용체 (예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원 (예를 들어, CD80, CD86)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 보다 강한 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 제1 표적 (예를 들어, TIGIT) 및 제2 표적, 예컨대 백혈구 상의 이펙터 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28, 또는 CD80) 또는 Fc 수용체 (예를 들어, CD64, CD32, 또는 CD16)에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 개별 작용제에 비해 향상된 효능을 갖는다. 임의의 작용제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 시토카인)가 독특한 약동학적 특성 (PK) (예를 들어, 순환 반감기)을 가질 수 있음은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 2개의 활성제 및/또는 폴리펩티드의 PK를 동조화하는 능력을 갖고, 여기서 2개의 개별 작용제 및/또는 폴리펩티드는 상이한 PK 프로파일을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 공통 영역 (예를 들어, 종양 및/또는 종양 환경)에서 2개의 작용제 및/또는 폴리펩티드의 작용을 집중하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 공통 표적 (예를 들어, 종양 또는 종양 세포)에 2개의 작용제 및/또는 폴리펩티드의 작용을 집중하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 2개의 작용제 및/또는 폴리펩티드의 작용을 하나 초과의 생물학적 경로 또는 하나 초과의 면역 반응의 측면에 대해 표적화하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 작용제 중의 하나 및/또는 폴리펩티드 단독보다 감소된 독성 및/또는 부작용을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 2개의 개별 작용제 및/또는 폴리펩티드의 혼합물에 비해 감소된 독성 및/또는 부작용을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 증가된 치료 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 분자는 2개의 개별 작용제 및/또는 폴리펩티드의 혼합물, 또는 단일 작용제로서의 작용제 및/또는 폴리펩티드에 비해 증가된 치료 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 결합제는 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인을 포함하고, 이들 각각은 변형되어 이종다량체 또는 이종이량체의 형성을 촉진하는 것인 다중이량체 분자이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 놉스-인투-홀스(knobs-into-holes) 기술을 이용하여 변형된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 변경된 정전기 상호작용을 유도하는 아미노산의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 변경된 소수성/친수성 상호작용을 유도하는 아미노산의 변화를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0123532 참조).
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 (a) 서열 39의 위치 253 및 292에 상응하는 위치의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG1 불변 영역, 및 서열 39의 240 및 282에 상응하는 위치의 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG1 불변 영역; (b) 서열 40의 위치 249 및 288에 상응하는 위치의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG2 불변 영역, 및 서열 40의 위치 236 및 278에 상응하는 위치의 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG2 불변 영역; (c) 서열 41의 위치 300 및 339에 상응하는 위치의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG3 불변 영역, 및 서열 41의 위치 287 및 329에 상응하는 위치의 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG3 불변 영역; 및 (d) 서열 42의 위치 250 및 289에 상응하는 위치의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG4 불변 영역, 및 서열 42의 위치 237 및 279에 상응하는 위치의 아미노산이 리신으로 대체된 제2 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 이종이량체 분자이다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 인간 IgG2 CH3 도메인을 포함하고, 하나의 IgG2 CH3 도메인의 서열 40의 위치 249 및 288에 상응하는 위치의 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체되고, 다른 IgG2 CH3 도메인의 서열 40의 위치 236 및 278에 상응하는 위치의 아미노산은 리신으로 대체된다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 서열 39의 위치 253 및 292에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG1 불변 영역 (여기서, 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨) 및 서열 39의 위치 240 및 282에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG1 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 이종이량체 분자이다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 서열 40의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨) 및 서열 40의 위치 236 및 278에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 서열 41의 위치 300 및 339에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG3 불변 영역 (여기서, 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨) 및 서열 41의 위치 287 및 329에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG3 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 서열 42의 위치 250 및 289에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG4 불변 영역 (여기서, 아미노산은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨) 및 서열 42의 위치 237 및 279에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG4 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 서열 40의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 글루타메이트로 대체됨) 및 위치 236 및 278에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 위치 249 및 288에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 아스파르테이트로 대체됨) 및 위치 236 및 278에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역 (여기서, 아미노산은 리신으로 대체됨)을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 1가이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 1가인 이종이량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 1가인 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 2가이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 단일특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 이중특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 다중특이적이다.
일부 실시양태에서, 결합제는 본원에 기재된 가용성 수용체 및/또는 폴리펩티드에 실질적으로 상동성이다. 이들 결합제는 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉 하나 이상의 아미노산의 유사한 아미노산으로의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 동일한 일반적인 부류 내에서의 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어 1개의 산성 아미노산의 또 다른 산성 아미노산으로의 치환, 1개의 염기성 아미노산의 또 다른 염기성 아미노산으로의 치환, 또는 1개의 중성 아미노산의 또 다른 중성 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 결합제는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하여 그에 결합할 수 있다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 내에 (예를 들어, 인간 TIGIT 상의 2개의 에피토프) 또는 상이한 분자 상에 (예를 들어, TIGIT 상의 하나의 에피토프 및 CD96 상의 하나의 에피토프) 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 모노클로날 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 제1 항원 표적 (예를 들어, TIGIT)뿐만 아니라, 제2 항원 표적, 예컨대 백혈구 상의 이펙터 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28, 또는 CD80) 또는 Fc 수용체 (예를 들어, CD64, CD32, 또는 CD16)를 특이적으로 인식하고 그에 결합하여, 제1 항원 표적을 발현하는 세포에 대해 세포 방어 메카니즘을 집중시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포독성제를 특정 표적 항원을 발현하는 세포로 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성 핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 아암을 갖는다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]; [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol., 121:120]; [Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152:5368]; 미국 특허 5,731,168; 및 미국 특허 공개 2011/0123532 참조). 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 2가 초과의 특이성을 갖는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60).
일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 TIGIT의 세포외 도메인 및 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이고, 여기서 제1 및 제2 항원-결합 부위의 경쇄는 동일하다.
일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 TIGIT의 신호전달을 차단하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 인간 CD96의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 TIGIT의 신호전달 및 CD96의 신호전달을 차단하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 관련 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 사용될 수 있는 면역검정은 비아코어(Biacore) 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯(Western blot), 방사성 면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역 확산 검정, 응집 검정, 보체-고정 검정, 면역방사능측정 검정, 형광 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 검정은 통상적인 것이고, 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조).
예를 들어, 표적, 예컨대 TIGIT에 대한 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)의 특이적 결합은 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. ELISA 검정은 항원을 제조하고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합된 결합제를 웰에 첨가하고, 일정 기간 동안 인큐베이션하고, 항원에 결합된 결합제의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 검출가능한 화합물에 접합되지 않고, 대신에 결합제 (예를 들어, PE-접합된 항-Fc 항체)를 인식하는 검출가능한 화합물에 접합되는 항체가 웰에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에, 결합제가 웰에 코팅되고, 코팅된 웰에 대한 항원의 첨가 후에 검출가능한 화합물에 접합된 항체를 첨가할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 검출되는 신호를 증가시키도록 변형될 수 있는 파라미터, 및 관련 기술분야에 공지된 ELISA의 다른 변형에 관하여 잘 알고 있을 것이다.
또 다른 예에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)의 표적에 대한 특이적 결합은 FACS를 사용하여 측정할 수 있다. FACS 스크리닝 검정은 융합 단백질 (예를 들어, TIGIT-CD4TM)로서 항원을 발현하는 cDNA 구축물을 생성하고, 구축물로 세포를 형질감염시키고, 항원을 세포의 표면에 발현시키고, 결합제를 형질감염된 세포와 혼합하고, 일정 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 결합제에 의해 결합된 세포는 결합제를 인식하는 검출가능한 화합물 (예를 들어, PE-접합된 항-Fc 항체)에 접합된 이차 항체 및 유동 세포측정기를 사용하여 확인될 수 있다. FACS 스크리닝 검정은 하나 초과의 수용체, 예를 들어 TIGIT 및 CD96에 결합하는 결합제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. FACS 스크리닝 검정은 결합제가 수용체에 결합하지 않거나 수용체에 약하게 결합함을 보여주기 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 검출되는 신호를 최적화하도록 변형될 수 있는 파라미터, 및 스크리닝 (예를 들어, 차단제에 대한 스크리닝)을 강화할 수 있는 FACS의 다른 변형에 관하여 잘 알고 있을 것이다.
결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)의 표적 (예를 들어, TIGIT)에 대한 결합 친화도 및 결합제/표적 상호작용의 오프 레이트는 경쟁적 결합 검정에 의해 측정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 일례는 표지된 항원 (예를 들어, 3H 또는 125I), 또는 이의 단편 또는 변이체를 증가되는 양의 미표지 표적의 존재 하에 관심 결합제와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 표적에 결합된 결합제를 검출하는 것을 포함하는 방사성 면역검정이다. 표적 (TIGIT)에 대한 결합제의 친화도 및 결합 오프 레이트는 스캐차드(Scatchard) 플롯 분석에 의한 데이터로부터 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비아코어 동역학 분석을 사용하여 표적 (TIGIT)에 결합하는 결합제의 결합 온 레이트 및 오프 레이트를 결정한다. 비아코어 동역학적 분석은 칩 표면에 대해 표적 (예를 들어, TIGIT)이 고정된 칩으로부터의 결합제의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 TIGIT에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT에 약 1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT에 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT에 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 또한 CD96에 약 1 μΜ 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 또한 CD96에 약 1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 또한 CD96에 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 또한 CD96에 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT와 마우스 TIGIT 둘 다에 약 10 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT와 마우스 TIGIT 둘 다에 약 1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT와 마우스 TIGIT 둘 다에 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 CD226에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제는 인간 CD226에 높은 KD로 결합한다 (약한 결합).
일부 실시양태에서, 결합제의 TIGIT에 대한 해리 상수는 비아코어 칩에 고정된 적어도 일부의 TIGIT 세포외 도메인을 포함하는 TIGIT 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 CD96에 대한 해리 상수는 비아코어 칩에 고정된 적어도 일부의 CD96 세포외 도메인을 포함하는 CD96 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 CD226에 대한 해리 상수 또는 CD226에 대한 결합의 결여는 비아코어 칩에 고정된 적어도 일부의 CD226 세포외 도메인을 포함하는 CD226 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다.
일부 실시양태에서, 결합제는 인간 TIGIT에 약 1 μΜ 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 반수 최대 유효 농도 (EC50)로 결합한다. 특정 실시양태에서, 결합제는 또한 인간 CD96에 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 EC50으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96에 결합하고 면역 반응을 조절한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 면역 반응을 활성화 및/또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 세포-매개 면역을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 선천 세포-매개 면역을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 적응 세포-매개 면역을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 T-세포 활성을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 세포용해 T-세포 (CTL) 활성을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 NK 세포 활성을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 림포킨-활성화된 킬러 세포 (LAK) 활성을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 종양 세포 사멸을 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 종양 성장의 억제를 증가시키거나, 촉진하거나, 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT에 결합하고, TIGIT 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 TIGIT에 결합하고, TIGIT 신호전달을 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TiGIT-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 CD96에 결합하고, CD96 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 CD96에 결합하고, CD96 신호전달을 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD96-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT 및 CD96에 결합하고, TIGIT 신호전달 및 CD96 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 TIGIT 및 CD96에 결합하고, TIGIT 신호전달을 차단하고, CD96 신호전달을 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT-매개 신호전달의 길항제 및 CD96-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT에 결합하고 TIGIT 신호전달을 억제하지만, CD226에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고), CD226 신호전달을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT 및 CD96에 결합하고, TIGIT 및 CD96 신호전달을 억제하지만, CD226에 결합하지 않고 (또는 약하게 결합하고), CD226 신호전달을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT에 결합하고, TIGIT 신호전달을 억제하고, CD226 신호전달을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT 및 CD96에 결합하고, TIGIT 및 CD96 신호전달을 억제하고, CD226 신호전달을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 CD226 신호전달을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 결합제는 본원에 기재된 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 TIGIT에 결합하고, TIGIT 활성을 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 본원에 기재된 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 TIGIT에 결합하고, TIGIT 활성을 차단하고, 또한 CD96에 결합하고, CD96 활성을 차단한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 본원에 기재된 PVR 변이체를 포함하는 가용성 수용체를 포함하고, 여기서 PVR 변이체는 TIGIT에 결합하고, CD226 활성을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 인간 CD226의 효능제 (직접 또는 간접적으로)이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD226의 효능제이고, 면역 반응을 활성화하고/하거나 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD226의 효능제이고, NK 세포 및/또는 T-세포의 활성 (예를 들어, 세포용해 활성 또는 시토카인 생산)을 활성화하고/하거나 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 결합제는 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96의 길항제 (직접 또는 간접적으로)이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96의 길항제이고, 면역 반응을 활성화하고/하거나 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96의 길항제이고, NK 세포 및/또는 T-세포의 활성 (예를 들어, 세포용해 활성 또는 시토카인 생산)을 활성화하고/하거나 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 결합제는 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 NK 세포의 활성화를 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)는 T-세포의 활성화를 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 결합제에 의한 NK 세포 및/또는 T-세포의 활성화는 NK 세포 및/또는 T-세포의 활성화 수준을 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 증가시킨다.
결합제 (또는 후보 결합제)가 면역 반응을 조절하는지 결정하기 위한 시험관내 및 생체내 검정은 관련 기술분야에 알려져 있거나 또는 개발되고 있다. 일부 실시양태에서, T-세포 활성화를 검출하는 기능적 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, T-세포의 집단은 본원에 기재된 결합제의 존재 또는 부재 하에 PVR을 발현하는 방사선 조사된 동종이형 세포로 자극될 수 있다. TIGIT 및/또는 CD96 신호전달을 차단하는 작용제는 증식 및 세포 주기 진행, IL-2 생산, 및/또는 CD25 및 CD69의 상향조절에 의해 측정시에 T-세포 활성화의 증가를 야기할 것이다. 일부 실시양태에서, NK 세포 활성을 검출하는 기능 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, PVR을 발현하는 표적 세포의 집단은 본원에 기재된 결합제의 존재 또는 부재 하에 NK 세포와 동시 배양될 수 있다. TIGIT 및/또는 CD96 신호전달을 차단하는 작용제는 NK 세포에 의해 사멸되는 표적 세포의 백분율의 증가를 유도할 것이다.
특정 실시양태에서, 결합제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 생체내에서 (예를 들어, 이종이식편 마우스 모델에서, 및/또는 암이 있는 인간에서) 종양 성장을 억제할 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합제는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식편 모델에서 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식편 모델에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도는 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배 또는 약 1000배만큼 감소된다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소는 동물 모델을 사용하여 제한 희석 검정에 의해 결정된다. 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소를 결정하기 위한 제한 희석 검정의 이용에 관한 추가 예 및 지침은 예를 들어 국제 공개 번호 WO 2008/042236; 미국 특허 공개 번호 2008/0064049; 및 미국 특허 공개 번호 2008/0178305에서 찾을 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합제는 하나 이상의 다음 효과를 갖는다: 종양 세포의 증식 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양발생성 감소, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양발생성 감소, 종양 세포의 세포 사멸 촉발, 세포 접촉-의존성 성장 억제 증가, 종양 세포 아폽토시스 증가, 상피 중간엽 이행 (EMT) 감소, 또는 종양 세포의 생존 감소. 일부 실시양태에서, 결합제는 하나 이상의 다음 효과를 갖는다: 바이러스 감염 억제, 만성 바이러스 감염 억제, 바이러스 부하 감소, 바이러스-감염된 세포의 세포 사멸 촉발, 또는 바이러스-감염된 세포의 수 또는 백분율 감소.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제의 마우스, 시노몰거스 원숭이, 또는 인간에서의 순환 반감기는 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 또는 적어도 약 2주이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 마우스, 시노몰거스 원숭이, 또는 인간에서의 순환 반감기가 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 또는 적어도 약 2주인 IgG (예를 들어, IgG1 또는 IgG2) 융합 단백질이다. 작용제, 예컨대 폴리펩티드 및 가용성 수용체의 반감기를 증가시키는 (또는 감소시키는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 융합 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 pH 6.0에서 항체의 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 pH-의존성 결합을 증가시키는 Fc 영역에서의 돌연변이의 도입을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2005/0276799, 2007/0148164, 및 2007/0122403 참조). Fc 영역이 결여된 가용성 수용체의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 PEG화와 같은 기술을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 TIGIT 및/또는 CD96에 결합하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 대한 유의한 효과를 보이지 않으면서 변할 수 있음은 관련 기술분야에서 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 TIGIT 및/또는 CD96에 대한 실질적인 결합 활성을 보이는 폴리펩티드의 변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.
폴리펩티드, 그의 유사체 및 변이체는 정상적으로는 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 유도체화된 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기, 및/또는 흡수를 개선할 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에서 볼 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법 내지 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 서열은 재조합 기술을 사용하여 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 또는 합성함으로써 구축된다. 임의로, 서열은 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이유발되어 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-5066] 및 미국 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로, 그리고 관심 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택함으로써 설계될 수 있다. 표준 방법은 관심있는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열이 역-번역 유전자를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드가 합성된 후, 라이게이션될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립체에 대해 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
조립된 후 (합성, 부위-지정 돌연변이유발, 또는 또 다른 방법에 의해), 관심 특정 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내에 삽입되고, 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적절한 조립체는 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열분석, 제한 효소 맵핑, 및/또는 발현에 의해 확인될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 본원에 기재된 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래한 적합한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 결합제의 폴리펩티드 쇄을 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래된 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전적 요소 또는 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 요소, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 대체로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서 복제할 수 있는 능력 및 형질전환체의 인식을 촉진하기 위한 선택 유전자가 추가로 도입될 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 관련된 경우 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현된 경우 폴리펩티드에 대해 DNA에 작동가능하게 연결되며; 프로모터는 서열의 전사를 제어하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 허용되도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 효모 발현 시스템에서의 사용을 위해 의도된 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현된 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로 후속적으로 최종 생성물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 절단될 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존한다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 대한 유용한 발현 벡터는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 대한 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9를 비롯한 이. 콜라이(E. coli)로부터의 플라스미드, 및 그의 유도체, 및 보다 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대 M13 및 다른 필라멘트형 단일-가닥 DNA 파지를 포함한다.
폴리펩티드 (또는 표적으로서 사용하기 위한 단백질)의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기 기재된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY]에 기재되어 있다. 항체 생산을 비롯하여 단백질 생산 방법에 대한 추가의 정보는 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0187954; 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501; 및 국제 특허 공개 번호 WO 2004/009823에서 볼 수 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현은, 이들 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고 적절하게 변경되고 생물학적으로 기능적이기 때문에 바람직할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 COS-7 (원숭이 신장-유래), L-929 (뮤린 섬유모세포-유래), C127 (뮤린 유선 종양-유래), 3T3 (뮤린 섬유모세포-유래), CHO (차이니즈 햄스터 난소-유래), HeLa (인간 자궁경부암-유래), BHK (햄스터 신장 섬유모세포-유래), HEK-293 (인간 배아 신장-유래) 세포주 및 이들 세포주의 변이체를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사 요소, 예컨대 복제 기점, 적합한 프로모터 및 발현될 유전자에 연결된 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
곤충 세포 배양 시스템 (예를 들어, 바큘로바이러스)에서의 재조합 단백질의 발현은 또한 정확하게 폴딩되고 생물학적으로 기능적인 단백질의 강력한 생산 방법을 제공한다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47]를 참조한다).
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 결합제를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 융합 단백질을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 가용성 수용체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이중특이적 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이종이량체 단백질을 생산한다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 방법을 포함한다. 친화도 태그, 예컨대 헥사-히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 열, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 단백질에 부착되어 적절한 친화도 칼럼 상의 통과에 의한 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 단리된 단백질은 단백질분해, 질량 분광측정법 (MS), 핵 자기 공명 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 x-선 결정학을 비롯한 기술을 사용하여 물리적으로 특징지을 수 있다.
일부 실시양태에서, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 발현 시스템으로부터의 상청액은 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 후, 농축액은 적합한 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기재가 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 단백질 정제에 흔히 사용되는 다른 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적합한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 히드록시아파타이트 매질이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 결합제를 추가로 정제하기 위해 사용될 수 있다. 상기 정제 단계의 일부 또는 모두가, 다양한 조합으로 균일한 재조합 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 배양물에서 생산된 재조합 단백질은 예를 들어, 세포 펠릿으로부터의 초기 추출, 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환, 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 냉동-해동 주기, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
폴리펩티드를 정제하기 위한 관련 기술분야에 공지된 방법은 또한 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005에 기재된 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 G, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인, 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드의 확인 및 생산을 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304]; [Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27]; [Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658]; [Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76]; 및 [Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 파지 디스플레이 기술이 결합 폴리펩티드를 생산하고/하거나 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포 디스플레이 기술이 결합 폴리펩티드를 생산하고/하거나 확인하기 위해 사용될 수 있다.
추가로, 그의 혈청 반감기를 변경시키도록 (또는 감소시키도록) 폴리펩티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이는 폴리펩티드 내의 적절한 영역의 돌연변이에 의해 샐비지 수용체 결합 에피토프를 폴리펩티드 내에 도입하거나, 또는 펩티드 태그를 에피토프에 도입한 후, 단부 또는 중간에서 폴리펩티드에 융합시킴으로써 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) 달성될 수 있다.
이종접합체 분자도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 폴리펩티드로 이루어진다. 이러한 분자는 예를 들어 원치 않는 세포, 예컨대 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위해 제안되었다. 또한, 가교제를 수반하는 것을 비롯하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 이종접합체 분자를 시험관내에서 제조할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 제조할 수 있다. 이에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 다수의 접합 (즉, 면역접합체 또는 방사성 접합체) 또는 비-접합 형태 중 임의의 하나에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 악성 또는 암 세포를 제거하기 위한 CDC 및 ADCC를 포함하는 대상체의 천연 방어 메카니즘을 이용하기 위해 비-접합 형태로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 소분자이다. 용어 "소분자"는 일반적으로 정의에 의해 펩티드/단백질이 아닌 저분자량 유기 화합물을 의미한다. 본원에 기재된 소분자 결합제는 고 친화도로 TIGIT 및/또는 CD96에 결합하고 TIGIT 및/또는 CD96과 PVR 사이의 상호작용을 방해거나 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소분자는 TIGIT 및/또는 CD96과 PVR 사이의 상호작용을 방해하거나 차단하고, TIGIT 신호전달을 파괴하지만, CD226 신호전달을 파괴하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 세포독성제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 메토트렉세이트, 아드리아미신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 방사성 접합체 또는 방사성 접합된 결합제를 생산하기 위한 방사성 동위원소이다. 다양한 방사성 핵종이 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re 및 212Bi를 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사성 접합된 결합제의 생산을 위해 이용가능하다. 결합제의 접합체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코테센, 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 메이탄시노이드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합제는 메르탄신 (DM1)에 접합된다. 결합제 및 세포독성제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리디이디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 이기능성 단백질-커플링제를 사용하여 제조될 수 있다.
III. 폴리뉴클레오티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하며; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있으며, 단일-가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 및 일부 실시양태에서, 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 및 일부 실시양태에서, 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 혼성화는 고 엄격성 조건 하에 수행된다. 고 엄격성 조건은 통상의 기술자에게 알려져 있고, (1) 세척용으로 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.1% 소듐 도데실 술페이트와 함께 15 mM 염화나트륨/1.5 mM 시트르산나트륨 (1x SSC)을 사용하는 것; (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50% (v/v) 포름아미드를 42℃에서 5x SSC (0.75 M NaCl, 75 mM 시트르산나트륨) 중 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제와 함께 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5x SSC, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고, 55℃에서 50% 포름아미드를 함유하는 0.2x SSC 중에서 세척한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1x SSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 이용하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비에 도움을 주는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 서열)에 동일한 리딩 프레임 내에 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질(preprotein)이고, 폴리펩티드의 성숙 형태를 형성하기 위한 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙 단백질인 전구단백질(proprotein) 및 추가의 5' 아미노산 잔기를 코딩할 수 있다. 프로서열(prosequence)을 갖는 성숙 단백질은 전구단백질이고, 단백질의 불활성 형태이다. 프로서열이 절단된 후, 활성 성숙 단백질이 잔류한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 허용하는 마커 서열에 동일한 리딩 프레임 내에 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 pQE-9 벡터에 의해 제공되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주 (예를 들어, COS-7 세포)가 사용될 경우 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 서열은 다른 친화도 태그와 함께 사용될 수 있는 서열 DYKDDDDK (서열 32)의 펩티드인 FLAG-태그이다.
본 발명은 추가로 예를 들어, 단편, 유사체, 및/또는 유도체를 코딩하는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 및 일부 실시양태에서, 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드라는 문구는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열에 동일함을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해, 참조 서열에서의 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열에서의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 많은 뉴클레오티드가 참조 서열 내에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 서열에서 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 군 중 하나에 배치되는, 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 이들 말단 위치 사이의 어느 부위에서든 발생할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 다에서의 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가, 또는 결실을 초래하지만 코딩되는 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경하지는 않는 변경을 함유한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 침묵 치환을 포함한다 (유전자 코드의 축중성에 기인함). 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위하여 (즉, 인간 mRNA에서의 코돈을 박테리아 숙주, 예컨대 이. 콜라이가 선호하는 것으로 바꾸기 위하여) 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열의 비-코딩 또는 코딩 영역에 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 발현 (또는 발현 수준)을 조절하거나 변경하도록 생산된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 생산된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 감소시키도록 생산된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 코딩되는 폴리펩티드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 코딩되는 폴리펩티드의 감소된 발현을 갖는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변이체가 (코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바꾸지 않으면서) 이종다량체 분자의 생산을 증가시키도록 생산된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변이체가 (코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바꾸지 않으면서) 이중특이적 항체의 생산을 증가시키도록 생산된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
IV. 사용 방법 및 제약 조성물
본 발명의 결합제는 치유적 치료 방법, 예컨대 암에 대한 면역요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 용도에서 유용하다. 특정 실시양태에서, 결합제는 면역 반응을 활성화하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증가시키고/시키거나, 증진시키기 위해, 종양 성장을 억제하기 위해, 종양 부피를 감소시키기 위해, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키기 위해 및/또는 종양의 종양발생성을 감소시키기 위해 유용하다. 본 발명의 결합제는 또한 병원체, 예컨대 바이러스에 대한 면역요법을 위해 유용하다. 특정 실시양태에서, 결합제는 면역 반응을 활성화하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증가시키고/시키거나, 증진시키기 위해, 바이러스 감염을 억제하기 위해, 바이러스 감염을 감소시키기 위해, 바이러스 감염 세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 및/또는 바이러스 감염 세포의 사멸을 증가시키기 위해 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 면역 반응의 효능제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD96의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및 CD96의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CD226의 효능제이다.
본 발명은 본원에 기재된 결합제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 활성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 세포-매개 면역의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 CTL 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 T-세포 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가, 및/또는 증진은 CTL 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 자극의 결과이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 암이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 병원체이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 바이러스 감염 세포이다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD226-양성 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 CD226-양성 세포를 유효량의 본원에 기재된 결합제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포는 T-세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 B-세포이다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 세포용해 활성의 증가에 의해 입증된다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 표적 세포의 사멸 증가에 의해 입증된다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 종양 세포의 사멸 증가에 의해 입증된다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 종양 성장의 억제에 의해 입증된다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 바이러스 감염의 억제에 의해 입증된다. 일부 실시양태에서, CD226-양성 세포의 활성 증가는 바이러스 감염 세포의 사멸 증가에 의해 입증된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 결합제를 사용하여 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 세포 혼합물을 결합제와 시험관내에서 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, T-세포 또는 NK 세포)와 혼합된 불멸화 세포주 또는 암 세포주는 결합제가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 환자 샘플, 예컨대 예를 들어 조직 생검, 흉막 삼출액, 또는 혈액 샘플로부터 단리되고, 면역 세포 (예를 들어, T-세포 및/또는 NK 세포)와 혼합되고, 결합제가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 면역 세포의 활성을 증가시키고/시키거나, 촉진하고/하거나, 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 종양 또는 종양 세포를 결합제와 생체내에서 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포를 결합제와 접촉시키는 것은 동물 모델에서 시작된다. 예를 들어, 결합제는 동계 종양이 있는 마우스에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 마우스에서 면역 세포의 활성을 증가시키고/시키거나, 촉진하고/하거나, 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 종양 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 종양 성장을 예방하기 위해 종양 세포를 동물 내에 도입함과 동시에 또는 그 직후에 투여된다 ("예방 모델"). 일부 실시양태에서, 결합제는 종양이 특정 크기로 성장한 후에 치료제로서 투여된다 ("치료 모델"). 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다.
특정 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양이 존재하거나 또는 종양이 존재하여 제거한 적이 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내의 암 줄기 세포의 빈도는 결합제의 투여에 의해 감소한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 치료 유효량의 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 종양 내의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, PVR은 종양 세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, TIGIT는 NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, CD96은 NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, CD226은 NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, PVR은 종양 세포 상에서 발현되고, TIGIT 및 CD226은 NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, PVR은 종양 세포 상에서 발현되고, TIGIT, CD96, 및 CD226은 NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된다.
또한, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 종양발생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 종양발생성은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 감소된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 결합제의 사용을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 결합제의 투여에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종, 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다.
본 발명은 추가로 치료 유효량의 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96의 세포외 도메인에 결합하고, 면역 반응을 증가시키고, 암의 성장을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT에 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및 CD96에 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT에 결합하고, CD226에는 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및 CD96에 결합하고, CD226에는 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다.
본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 대상체 (예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암성 종양을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양이 제거되었다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 신경내분비암, 방광암, 교모세포종, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 호지킨 림프종, 다발성 골수종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (T-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 및 피부 T-세포 림프종 (CTCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 세포를 유효량의 본원에 기재된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 TIGIT 및/또는 CD96 신호전달을 불활성화하거나, 방해하거나 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포용해성 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CTL이다. 일부 실시양태에서, 세포는 NK 세포이다. 특정 실시양태에서, 방법은 생체내 방법이고, 여기서 세포를 결합제와 접촉시키는 단계는 치료 유효량의 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 TIGIT 및/또는 CD96 신호전달을 방해하고/하거나, 억제하고/하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다.
본 발명은 또한 세포를 유효량의 본원에 기재된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 CD226 신호전달을 활성화 또는 향상시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포용해성 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CTL이다. 일부 실시양태에서, 세포는 NK 세포이다. 특정 실시양태에서, 방법은 생체내 방법이고, 여기서 세포를 결합제와 접촉시키는 단계는 치료 유효량의 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 CD226 신호전달을 활성화하고/하거나 촉진하고/하거나 유도하고/하거나 향상시키고/시키거나 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다.
세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스로 감염된 세포) 상에서 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 일부 구성원의 과발현 또는 이상 노출은 수용체가 면역계에 의한 감시 ("면역감시")에 대한 표적으로서 작용하도록 허용할 수 있다. 예를 들어, 상피 세포 생물학의 중심 특징은 상피 세포가 단일-세포층으로 존재한다는 것이다. 따라서, 이들은 3개의 구별되는 표면, 즉, 루멘에 노출된 정단 표면, 기저막과 상호작용하는 기저측막, 및 인접한 세포 사이에 상호작용 영역을 형성하는 "세포간 표면"을 갖는다. 이론에 매이지 않지만, 본 발명자들은 Ig 슈퍼패밀리의 구성원의 일부가, 직접적인 세포-세포 소통을 가능하게 하는 유망한 영역일 것이므로 상기 제3 표면, 즉, 세포간 표면에 일반적으로 제한되는 것으로 생각한다.
많은 단백질이 세포-대-세포 상호작용 및 미세환경과 세포 상호작용에 관여한다. 이들 단백질의 일부는 세포간 막 영역 내에 체류하는 것으로 알려져 있다; 예를 들어, 부착 연접부에 기여하는 카드헤렌, 간극 연접부에 기여하는 코넥신, 및 치밀 연접부에 기여하는 클라우딘 및 오클루딘. 이들 단백질에 추가로, 다른 단백질이 치밀 연접부 및 부착 연접부에 의해 형성된 정단 연접부 복합체 내에 체류하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 정상 세포 아키텍처 내에서, Ig 슈퍼패밀리 구성원 (예를 들어, 수용체)는 세포간 표면에서 발현될 것이고, 본원에 기재된 결합제에 의해 검출되지 않을 것이다. 그러나, 변경된 세포 형태학을 갖는 세포 또는 정상 세포 아키텍처를 상실한 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스로 감염된 세포)는 단백질/수용체, 예를 들어 PVR, PVRL2, 및/또는 PVRL3의 이상 노출을 가질 수 있고, 따라서, 이들 세포가 본원에 기재된 결합제를 사용한 감시에 의해 검출가능하도록 만든다.
또한, 세포의 표면 상에서 PVR 패밀리 구성원의 과발현은 그 세포를 반대 수용체를 발현하는 세포 (예를 들어, CTL 및/또는 NK 세포)에 대한 더 우수한 표적으로 만들 수 있다. 흥미롭게도, 인간 PVR 및 PVRL2는 결장직장암, 위암, 난소암, 신경모세포종, 골수성 백혈병, 및 다발성 골수종을 포함한 특정 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Masson et al., 2001, Gut, 49:236-240]; [Tahara-Hanaoka et al., 2006, Blood, 107:1491-1496]; [Carlsten et al., 2007, Cancer Res., 67:1317-1325]; [Castriconi et al., 2004, Cancer Res., 64:9180-9184]; [Pende et al., 2005, Blood, 105:2066-2073]; [El-Sherbiny et al., 2007, Cancer Res., 67:8444-8449]) 참조).
따라서, 본 발명은 대상체가 참조 샘플 내의 PVR의 발현 또는 미리 결정된 PVR 수준에 비해 상승된 PVR 수준을 갖는 종양을 갖는지 결정하는 것을 포함하는, 결합제를 사용하는 치료를 위해 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용될 때, "참조 샘플"은 정상 조직, 동일한 조직 유형의 비-암성 조직, 동일한 조직 유형의 종양 조직, 및 상이한 조직 유형의 종양 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 종양 내의 PVR 발현 수준을 정상 조직 내의 PVR 발현 수준에 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 내의 PVR 발현 수준을 동일한 조직 유형의 비-암성 조직 내의 PVR 발현 수준에 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 내의 PVR 발현 수준을 동일한 조직 유형의 종양 내의 PVR 발현 수준에 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 내의 PVR 발현 수준을 상이한 조직 유형의 종양 내의 PVR 발현 수준에 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 내의 PVR 발현 수준을 미리 결정된 PVR 수준에 비교한다. 일부 실시양태에서, PVR 발현 수준의 결정은 치료에 앞서 이루어진다. 일부 실시양태에서, PVR 발현 수준의 결정은 면역조직화학에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 종양이 참조 샘플 내의 PVR의 발현 또는 미리 결정된 수준에 비해 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 결합제를 투여한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 종양이 참조 샘플 내의 PVR 발현 수준에 비해 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 결합제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 종양이 미리 결정된 PVR 수준에 비해 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 결합제를 투여한다.
일부 실시양태에서, 종양이 상승된 PVR 수준을 갖는 경우에, 대상체를 TIGIT 및/또는 CD96에 특이적으로 결합하는 결합제를 사용하는 치료를 위해 선택한다. 일부 실시양태에서, 치료를 위해 선택되는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 결합제를 투여한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양이 제거되었다.
본 발명은 또한 대상체가 동일한 유형의 조직 또는 참조 샘플 내의 PVR 발현에 비해 PVR의 이상 발현을 갖는 종양을 갖는지 결정하는 것을 포함하는, 결합제를 사용하는 치료를 위해 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양이 PVR의 이상 발현을 갖는 경우에, 대상체를 TIGIT 및/또는 CD96에 특이적으로 결합하는 결합제를 사용한 치료를 위해 선택한다. 일부 실시양태에서, 치료를 위해 선택되는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 결합제를 투여한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양이 제거되었다.
본 발명은 또한 대상체가 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 종양을 갖는지 결정하는 것을 포함하고, 여기서 종양이 상승된 PVR 발현 수준을 갖는 경우에 대상체를를 치료를 위해 선택하는, 본원에 기재된 결합제를 사용한 치료를 위해 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법은 종양이 상승된 PVR 발현 수준을 갖는지 결정하고, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 (a) 적어도 부분적으로, 대상체가 상승된 PVR 수준을 갖는 암을 갖는 것에 기반하여 치료를 위해 대상체를 선택하고, (b) 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제를 투여하는 것을 포함한다.
세포, 종양, 또는 암에서 PVR 핵산 발현 수준을 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들 방법은 PCR-기반 검정, 마이크로어레이 분석, 및 뉴클레오티드 서열분석 (예를 들어, 넥스트젠(NextGen) 서열분석)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포, 종양, 또는 암에서 PVR 단백질 발현 수준을 결정하는 방법은 웨스턴 블롯 분석, 단백질 어레이, ELISA, 면역조직화학 (IHC), 및 FACS를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
종양 또는 암이 상승된 PVR 발현 수준을 갖는지 결정하는 방법에서는 다양한 샘플을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 종양 또는 암이 있는 대상체에서 취한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 신선한 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 포르말린-고정 파라핀-포매 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 용해물로 가공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 DNA 또는 RNA로 가공된다.
본 발명은 본원에 기재된 결합제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 면역요법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 제제는 본 발명의 정제된 결합제를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비-독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체, 예컨대 Zn-단백질 복합체; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London).
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위한 많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 네뷸라이저에 의한 것을 포함한, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의한 폐 투여, 기관내 및 비강내 투여; 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내 (예를 들어, 주사 또는 주입)을 포함한 비경구 투여, 또는 두개내 (예를 들어, 경막내 또는 심실내) 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 그러한 제제는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 정제와 같은 고체 조성물에서, 주요 활성 성분은 제약상 담체와 혼합된다. 통상적인 타정 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검 및 희석제 (예를 들어, 물)를 포함한다. 이들을 사용하여 본 발명의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제화 조성물을 형성할 수 있다. 그 후에, 고체 예비제제화 조성물을 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분한다. 제제 또는 조성물의 정제, 환제 등은 연장 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공하기 위해 코팅되거나 달리 화합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분에 의해 덮인 내부 조성물을 포함할 수 있다. 추가로, 2가지 성분은 붕해에 저항하고 내부 성분이 무손상으로 위를 통해 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 하는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질을 그러한 장용층 또는 코팅에 사용할 수 있고, 그러한 물질은 많은 중합체성 산, 및 중합체성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 결합제는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 그러한 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기재된 바와 같이 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에서 또는 마크로에멀젼 내에서 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조한다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 리포솜과 복합체화된 본 발명의 결합제를 포함한다. 리포솜의 생산 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발에 의해 생산할 수 있다. 리포솜을 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 지속-방출 제제를 생산할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 결합제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 여기서 매트릭스는 성형 제품 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락타이드, L-글루탐산과 7-에틸에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사용 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제를 투여하는 것에 추가로, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 면역 반응 자극제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF)), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 면역억제 기능을 차단하는 항체 (예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), 톨-유사 수용체 (예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원 (예를 들어, CD80, CD86)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 면역 반응 자극제는 결합제의 투여에 앞서, 그와 동시에, 및/또는 후속적으로 투여될 수 있다. 결합제 및 면역 반응 자극제(들)을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 1, 2 또는 3가지 이상의 면역 반응 자극제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제를 투여하는 것에 추가로, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 치료제는 결합제의 투여에 앞서, 그와 동시에, 및/또는 후속적으로 투여될 수 있다. 결합제 및 추가의 치료제(들)을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 1, 2 또는 3가지 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
2가지 이상의 치료제들을 사용한 조합 요법에서는 요구되는 것은 아니지만 종종 상이한 작용 메카니즘에 의해 작용하는 작용제들을 사용한다. 상이한 작용 메카니즘을 갖는 작용제들을 사용한 조합 요법은 상가적 또는 상승작용적 효과를 야기할 수 있다. 조합 요법은 단독요법에 사용되는 것보다 더 낮은 용량의 각각의 작용제를 허용하여, 독성 부작용을 감소시키고/시키거나 작용제(들)의 치료 지수을 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암세포가 발달할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 미치는 (예를 들어, 반응을 향상시키거나 활성화하는) 치료제 및 종양/암세포에 영향을 미치는 (예를 들어, 억제하거나 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합은 상가적 또는 상승작용적 결과를 야기한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 결합제의 치료 지수의 증가를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 치료 지수의 증가를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 결합제의 독성 및/또는 부작용의 감소를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 독성 및/또는 부작용의 감소를 일으킨다.
유용한 부류의 치료제는 예를 들어, 항튜불린 작용제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 착물 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 항대사물, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물, 항유사분열제, 토포이소머라제 억제제, 또는 혈관신생 억제제이다.
본원에 기재된 결합제와 조합으로 투여할 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 화학요법제와 조합으로 또는 화학요법제의 칵테일과 조합으로 본 발명의 결합제를 투여하는 것을 수반한다. 결합제를 사용한 치료는 화학요법제의 투여 이전에, 그와 동시에 또는 그에 후속적으로 수행할 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제 내에 또는 별개의 제제를 사용하는 동시-투여, 또는 임의의 순서로, 그러나 일반적으로 모든 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 그러한 화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 기술자가 경험적으로 결정하는 바와 같이 사용할 수 있다. 그러한 화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)); 및 임의의 상기한 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 화학요법제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐, 예컨대 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 임의의 상기한 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보플라틴이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸, 및 임의의 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은 정상 생화학적 반응에 요구되는 대사체와 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈 및 임의의 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하고 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 겜시타빈이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하고 이에 제한되지는 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알부민-결합 파클리탁셀 (아브락산(ABRAXANE)), DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대체 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제, 또는 유사분열 키나제, 예컨대 오로라(Aurora) A 또는 Plk1의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 파클리탁셀이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2 (ErbB2), 및/또는 VEGF을 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양-연관 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와 본 발명의 결합제의 조합 투여를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 게피티닙 (이레사(IRESSA)), 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)), 수니티닙 (수텐트(SUTENT)), 라파타닙, 반데타닙 (작티마(ZACTIMA)), AEE788, CI-1033, 세디라닙 (레센틴(RECENTIN)), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)) 및 파조파닙 (GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 억제제와 조합으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Hippo 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR/AKR 경로의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 생물학적 분자, 예컨대 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양-연관 항원에 대한 항체와 본 발명의 결합제의 조합 투여를 수반할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 β-카테닌 신호전달을 억제하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관신생 억제제 (예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)인 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)), 라무시루맙, 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)), 페르투주맙 (옴니타르그(OMNITARG)), 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX))이다.
또한, 본원에 기재된 결합제를 사용하는 치료는 다른 생물학적 분자, 예컨대 하나 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과의 조합 치료를 포함할 수 있거나, 종양의 수술적 제거, 암 세포의 제거, 또는 치료 의사가 필요한 것으로 여기는 임의의 다른 요법을 동반할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결합제는 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴 (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어지나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 성장 인자와 조합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료는 방사선 치료와 조합으로 본 발명의 결합제의 투여를 수반한다. 결합제를 사용한 치료는 방사선 요법 이전에, 그와 동시에 또는 후속적으로 수행할 수 있다. 그러한 방사선 요법에 대한 투여 스케줄은 숙련된 진료의가 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항바이러스 요법과 조합으로 본 발명의 결합제의 투여를 수반한다. 결합제를 사용한 치료는 항바이러스 요법 이전에, 그와 동시에 또는 후속적으로 수행할 수 있다. 조합 요법에 사용되는 항바이러스 약물은 대상체가 감염된 바이러스에 따라 결정될 것이다.
조합 투여는 단일 제약 제제 내에 또는 별개의 제제를 사용하는 동시-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 이전에 제2 치료제를 사용하는 치료를 받은 환자에게 투여될 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 결합제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 동시에 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제 (예를 들어, 화학요법제)를 사용하는 치료 과정을 받는 동안 결합제 (예를 들어, 가용성 수용체)를 투여받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 제2 치료제를 사용하는 치료의 1년 이내에 투여될 것이다. 특정한 별도의 실시양태에서, 결합제는 제2 치료제를 사용하는 임의의 치료의 10, 8, 6, 4, 또는 2개월 내에 투여될 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 결합제는 제2 치료제를 사용하는 임의의 치료의 4, 3, 2, 또는 1주 내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 제2 치료제를 사용하는 임의의 치료의 5, 4, 3, 2, 또는 1일 내에 투여될 것이다. 2개 (또는 그 이상)의 작용제 또는 치료는 겨우 수 시간 또는 수 분 내에 (즉, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 결합제의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 결합제가 치료 또는 예방 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상력 등에 따라, 모두 치료의사의 재량에 따라 결정된다. 결합제는 1회, 또는 수 일 내지 수 개월 지속하는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 (예를 들어, 종양 크기의 감소) 투여될 수 있다. 최적 투여 스케줄은 환자 신체 내의 약물 축적의 측정치로부터 계산할 수 있고, 개별 작용제의 상대적인 효력에 따라 변할 것이다. 투여 의사는 최적 투여량, 투여 방법, 및 반복 비율을 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 0.01 ㎍ 내지 100 mg/kg 체중, 0.1 ㎍ 내지 100 mg/kg 체중, 1 ㎍ 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 80 mg/kg 체중, 10 mg 내지 100 mg/kg 체중, 10 mg 내지 75 mg/kg 체중, 또는 10 mg 내지 50 mg/kg 체중이다. 특정 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 0.1 mg 내지 약 20 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 0.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 1 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 1.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 2 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 2.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 7.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 10 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 12.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 투여량은 약 15 mg/kg 체중이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 매일, 매주, 매달, 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회 제공된다.
일부 실시양태에서, 결합제는 초기의 보다 높은 "부하" 용량에 이어, 1회 이상의 보다 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 또한 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 초기 용량에 이어, 추가의 용량 (또는 "유지" 용량)을 매주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 또는 매달 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 격주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 투여 요법은 3주 동안 3회 초기 용량에 이어, 예를 들어 동일한 양의 격주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제는 부작용 및/또는 독성을 일으킬 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성이 너무 심각하여, 특정 작용제를 치료 유효 용량으로 투여하는 것이 불가능할 수 있다. 일부 경우에, 약물 요법을 중단해야 하고, 다른 작용제를 시도할 수 있다. 그러나, 동일한 치료제 부류 내의 많은 작용제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내고, 이것은 환자가 요법을 중단하거나, 가능한 경우에 치료제와 연관된 불쾌한 부작용을 겪어야 하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 작용제를 투여하기 위해 간헐적 투여 전략을 이용하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 결합제를 대상체에게 투여하는 방법을 제공하고, 이것은 결합제, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효 용량의 결합제를, 치료 유효 용량의 화학요법제와 조합으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 하나의 또는 두 작용제를 모두 간헐적 투여 전략에 따라 투여한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 결합제를 약 2주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 결합제를 약 3주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 결합제를 약 4주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제를 간헐적 투여 전략을 이용하여 투여하고, 화학요법제를 매주 투여한다.
V. 스크리닝
본 발명은 면역 반응을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 면역 반응을 조절하는, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체, 소분자, 화합물, 또는 다른 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 후보 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응을 조절하는 후보 작용제를 스크리닝하는 방법은 작용제가 면역 반응 세포에 대해 효과를 갖는지 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 조절하는 후보 작용제를 스크리닝하는 방법은 작용제가 면역 세포의 활성을 증가시킬 수 있는지 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 조절하는 후보 작용제를 스크리닝하는 방법은 작용제가 세포용해성 세포, 예컨대 CTL 및/또는 NK 세포의 활성을 증가시킬 수 있는지 결정하는 것을 포함한다.
VI. 결합제를 포함하는 키트
본 발명은 본원에 기재된 결합제를 포함하고 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 적어도 하나의 정제된 결합제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출 검정을 수행하기 위해 필요하고/하거나 충분한 모든 성분, 예컨대 모든 대조물, 검정을 수행하기 위한 지시, 및 분석 및 결과 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 함유한다. 통상의 기술자는 본 발명의 개시된 결합제가 관련 기술분야에 잘 알려진 확립된 키트 형식 중 하나에 쉽게 포함될 수 있음을 쉽게 알 것이다.
결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 화학요법제이다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 혈관신생 억제제이다.
본원의 실시양태는 다음 비제한적인 실시예를 참조로 추가로 규정될 수 있고, 상기 실시예는 본원의 특정 항체의 제조 및 본원의 항체의 사용 방법을 상세히 기재한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 물질 및 방법 모두에 대한 많은 변형이 본원의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1
PVR 패밀리 구축물
막 고정 단백질 및 가용성 수용체를 포함하는 PVR 패밀리 구성원 TIGIT, CD96, CD226, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVR, 및 PVR 변이체의 단백질 구축물을 제조하였다 (도 2). 막횡단 및 세포질 도메인은 인간 CD4 막횡단 도메인 및 세포내 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 대체되므로, 각각의 막 고정 수용체는 신호전달에 관하여 비-기능적이도록 설계되었다. 막 고정 단백질 구축물은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 인간 PVR 패밀리 단백질의 세포외 도메인 (ECD)의 적어도 하나의 도메인을 CD4의 막횡단 도메인 및 C-말단 GFP 단백질 태그에 라이게이션함으로써 생성하였다. 이들 구축물을 "PVR 패밀리 구성원"-CD4TM-GFP, 예를 들어 PVR-CD4TM-GFP로서 칭한다. 가용성 수용체는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 연결된 ECD의 적어도 하나의 도메인을 포함하도록 설계되었다. 가용성 수용체 PVR 패밀리 단백질 구축물은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 인간 PVR 패밀리 구성원 단백질의 ECD 영역을 인간 IgG1의 Fc 도메인에 라이게이션함으로써 생성하였다. 이들 구축물을 "PVR 패밀리 구성원"-Fc, 예를 들어 CD226-Fc로서 칭한다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 구축물 내에 사용된 임의의 제시된 단백질의 ECD 영역은 ECD를 포함하거나, ECD의 단편, 예를 들어 단지 IgV 도메인을 포함할 수 있다. 또한, ECD 또는 Ig 도메인인 것으로 여겨지는 것은 도메인의 아미노 단부, 카르복실 단부, 또는 두 단부에서 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산이 상이할 수 있다. 이들 융합 단백질은 PVR 패밀리 구성원의 결합 상호작용을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
생성된 구축물은 표 2의 PVR 패밀리 구성원으로부터 ECD 영역, 또는 그의 단편을 포함한다.
<표 2>
실시예 2
PVR 패밀리 구성원 사이의 결합 상호작용
PVR 패밀리의 구성원 사이의 결합 상호작용을 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. 각각의 패밀리 구성원은 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 수용체의 ECD의 적어도 하나의 도메인을 함유하는 Fc 융합 단백질로서, 및 또한 세포내 녹색 형광 (GFP) 단백질 태그 및 인간 CD4 막횡단 영역에 융합된 수용체의 ECD의 적어도 하나의 도메인을 함유하는 막 고정 형태로서 모두 발현되었다 (실시예 1 참조).
개별 잠재적 결합 상호작용은 HEK-293T 세포를 특이적 막 고정 수용체 (PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, 또는 PVRL4)를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시킨 후, 형질감염된 세포에 결합하는 특이적 수용체-Fc 융합 단백질 (CD96, TIGIT, 또는 CD226)의 능력을 검사함으로써 평가하였다. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터 일시적으로 형질감염시킨 후, 후속적으로 가용성 CD226-Fc, TIGIT-Fc, 또는 CD96-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. 추가로, 개별 잠재적 결합 상호작용은 HEK-293T 세포를 특이적 막 고정 수용체 (PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, 또는 PVRL4)를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시킨 후, 형질감염된 세포에 결합하는 특이적 수용체-Fc 융합 단백질 (PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, 또는 PVRL4)의 능력을 검사함으로써 평가하였다. HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, 또는 PVRL4-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 후속적으로 가용성 PVR-Fc, PVRL1-Fc, PVRL2-Fc, PVRL3-Fc, 또는 PVRL4-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. 결합은 세포를 피토에리트린 (PE)에 접합된 항-인간 Fc 항체로 후속적으로 염색하고 유동 세포측정법을 이용하여 분석함으로써 검출하였다.
도 3A에 제시된 바와 같이, 막 고정 PVR은 가용성 수용체 CD226, TIGIT 및 CD96에 의해 결합되었다. 추가로, 가용성 수용체 CD226은 PVRL2에 약하게 결합하였고, 가용성 수용체 TIGIT는 PVRL2, PVRL3, 및 PVRL4에 결합하였다. 도 3B에 제시된 바와 같이, 가용성 수용체 PVR은 PVRL3에 결합하고, 가용성 수용체 PVRL1은 PVRL3 및 PVRL4에 결합하고; 가용성 수용체 PVRL3은 PVRL1, PVRL2 및 PVR에 결합하고; 가용성 수용체 PVRL4는 PVRL1에 결합하였다. 양성 결합 상호작용을 원으로 강조하였다. PVR 패밀리의 상이한 구성원 사이에서 관찰된 결합 상호작용의 개략도를 또한 제시한다 (도 3C). 상기 분석 동안 관찰된 지시된 결합 상호작용의 일부는 새로운 것으로 보인다.
실시예 3
PVR 변이체의 생성
TIGIT에 결합된 PVR의 결정 구조는 이전에 개시되었다 (문헌 [Stengel et al., 2012, PNAS, 109:5399-5404] 참조). 구조를 검사하고, TIGIT 결합에 중요하지 않지만 CD226 또는 CD96의 결합에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 것으로 보이는 PVR 내의 잔기를 선택하였다. 이들 잔기를 도 4에 강조하였다. 변이체 인간 PVR N-말단 IgV 도메인 분자의 cDNA 발현 라이브러리를 설계하고 생성하였고, 여기서 아미노산 위치 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 및 85 (서열 18)를 20개의 모든 아미노산으로 개별적으로 치환하였다. cDNA 발현 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 및 CD4 막횡단 도메인에 융합된 PVR의 N-말단 IgV 도메인을 코딩하였다. 발현 벡터 플라스미드는 또한 박테리아 암피실린 내성 유전자를 함유하였다. 변이체 PVR 분자의 cDNA 라이브러리를, 암피실린 내성이 결핍되는 100배 과량의 비관련 벡터의 존재 하에 CAP-T 세포 내로 형질감염시켰다. CAP-T 세포는 SV40 거대 T 항원을 안정하게 발현하는 불멸화 양막세포 세포주이다 (세벡 파마슈티칼스(CEVEC Pharmaceuticals), 독일 쾰른). 상기 전략은 세포당 형질감염된 독특한 PVR 변이체 플라스미드의 수를 감소시키도록 설계되었다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 형광 표지된 TIGIT-Fc, CD96-Fc, CD226-Fc, TIGIT-Fc와 CD226-Fc의 조합, 또는 CD96-Fc와 CD226-Fc의 조합과 함께 인큐베이션하였다. TIGIT 또는 CD96에 대한 결합을 나타내지만 CD226에 대한 결합이 결핍된 세포를 단리하기 위해, 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 분석하였다. 플라스미드를 단리된 세포로부터 회수하고, 박테리아를 형질감염시키기 위해 사용하였고, 박테리아를 암피실린-함유 플레이트 상에 도말하였다. 개별 콜로니로부터 플라스미드를 서열결정하고 분석하였다. 상기 방식으로, TIGIT, CD96 및 CD226에 대한 PVR의 상대적인 결합을 가능하게 하는 아미노산 치환을 확인하였다.
도 5는 2개의 그러한 아미노산 변이체의 결합 패턴을 보여준다. PVR 변이체 S72N (세린에서 아스파라긴으로)은 야생형 PVR에 비해 TIGIT 또는 CD96에 대한 결합에 유의하게 영향을 미치지 않았지만, PVR 변이체 S72N은 야생형 PVR에 비해 CD226에 대한 결합이 실질적으로 감소되었다. 또 다른 변이체인 PVR 변이체 Q82K (글루타민에서 리신으로)은 TIGIT 및 CD226의 존재 하에 상이한 결합 패턴으로, 야생형 PVR에 비해 TIGIT에 대한 증가된 결합을 가졌다. 이것은 TIGIT가 이용가능한 변이체 PVR에 대한 결합에 대해 CD226과 보다 효과적으로 경쟁하도록 허용할 수 있다.
실시예 4
자연 킬러 (NK) 세포 세포독성 검정
인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562 및 인간 폐 선암종 세포주 A549을 5% CO2의 가습 분위기 내에서 37℃에서 10% (v/v) 소태아 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (깁코(Gibco))을 보충한 RPMI 1640 배양 배지 (깁코/라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내에서 배양하였다. K562 세포를 제조자의 권장사항에 따라 아막사(Amaxa) 뉴클레오펙터(Nucleofector) 장치 및 뉴클레오펙터 키트 V (론자(Lonza), 스위스 바젤)를 사용하는 전기천공을 통해 GFP, 인간 PVR, 또는 인간 PVR 변이체 (4 ㎍ DNA/2 x 106개 세포)로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 GFP 양성에 대한 유동 세포측정법에 의해 평가할 때 통상적으로 60-70%이다. A549 세포를 제조자의 지시에 따라 FuGENE 6 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 동일한 구축물 (3 ㎍ DNA/1 x 106개 세포)로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 통상적으로 >95%이다.
일차 인간 NK 세포는 로제트셉(RosetteSep) NK 세포 풍부화 칵테일 (스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies), 캐나다 브리티시 콜럼비아 밴쿠버)과 함께 30분 인큐베이션에 이어 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리 (스템 셀 테크놀로지스)에 의해 신선한 말초 혈액 버피 코트 (스탠포드 블러드 센터(Stanford Blood Center), 미국 캘리포니아주 팔로알토)로부터 직접 단리하였다. 인간 NK 세포를 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린, 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 보충한 L-글루타민-미함유 RPMI 1640 배지 내에서 배양하였다. 단리된 NK 세포는 유동 세포측정법에 의해 통상적으로 >98% CD56+CD3-이었다. NK 세포주 NK-92는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 미국 버지니아주 매나사스)으로부터 구입하고, 20% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 150 U/ml 재조합 인간 IL-2를 함유하는 RPMI 1640 내에 유지하였다.
NK-92 세포 또는 일차 인간 NK 세포를 300 U/ml 재조합 인간 IL-2 (페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주 록키힐)와 함께 또는 그 없이 96-웰 V자형-바닥 플레이트 내에 도말하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 일부 실험에서, NK-92 세포 또는 일차 NK 세포를 NKp30, NKp46, 또는 NKG2D에 대한 특이적 차단 항체 (바이오레전드(Biolegend), 미국 캘리포니아주 샌디에고) 10 ㎍/ml, 또는 동등량의 이소형-매칭된 폴리클로날 인간 IgG (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 세포독성 검정에서 사용하였다. 표적 세포 (GFP, 인간 PVR, 또는 인간 PVR 변이체로 형질감염된 K562 또는 A549 세포)를 10 μΜ 칼세인 AM (라이프 테크놀로지스)으로 37℃에서 1시간 동안 표지한 후, 다양한 이펙터:표적 비 (50:1-3:1)로 NK 세포와 합하였다. 37℃에서 4시간 인큐베이션 후에, 세포 미함유 상청액을 수거하고, 칼세인 방출을 485 nm의 여기 및 535 nm의 방출에서 형광계로 정량하였다. 특이적 세포 용해의 백분율을 다음과 같이 결정하였다: % 용해 = 100 x (ER-SR)/(MR-SR), 여기서 ER, SR, 및 MR은 각각 실험적, 자발적, 및 최대 칼세인 방출을 나타낸다. 자발적 방출은 배지 단독에서 (즉, 이펙터 세포의 부재 하에) 표적 세포에 의해 방출된 형광인 반면, 최대 방출은 동일 부피의 10% SDS로 표적 세포를 용해시킴으로써 결정된다.
일부 실험에서, NK 세포 세포독성은 가용성 인간 PVR-Fc 또는 인간 PVR-Fc 변이체의 존재 하에 평가하였다. 일차 인간 NK 세포 또는 NK-92 세포를 10 ㎍/ml의 PVR-Fc 또는 인간 PVR-Fc 변이체를 첨가하여, 상기 기재한 바와 같이 도말하였다. K562 세포 또는 A549 세포에 대한 NK 세포 용해를 상기 기재한 바와 같이 분석하였다.
새로 단리된 일차 인간 NK 세포를 300 IU/ml 재조합 인간 IL-2 (페프로테크, 미국 뉴저지주 록키힐)와 함께 또는 그 없이 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 30분 동안 4℃에서 HBSS 내에서 예비-처리하였다. NK 세포를 세척하고, 추가의 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 또는 PVR-Fc WT를 보충한 배지 내에 재현탁시키고, 96-웰 V자형-바닥 플레이트 내에 도말하였다. 표적 세포 (HEK-293T 세포 또는 K562 세포)를 10 μΜ 칼세인 AM (라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 2시간 동안 37℃에서 표지한 후, 12:1의 이펙터:표적 비로 NK 세포와 혼합하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 미함유 상청액을 수거하고, 칼세인 방출을 485 nm의 여기 및 535 nm의 방출에서 형광계로 정량하였다. 특이적 세포 용해의 백분율을 상기 기재한 바와 같이 결정하였다.
NK 세포는 비처리 NK 세포 또는 야생형 PVR로 처리한 NK 세포에 비해, PVR 변이체 Q82K로 처리할 때 표적 세포를 사멸시키는 증가된 능력을 나타냈다 (도 6). 모든 샘플 내에 IL-2의 첨가에 따라 세포 용해가 증가하였다.
NK 활성화 및/또는 활성은 또한 검정 동안 NK 세포에 의해 생산되는 IFN-감마의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 96-웰 편평-바닥 배양 플레이트의 웰에 HEK-293T 또는 A549 세포를 5 x 104개 표적 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 표적 세포를 전면성장까지 밤새 성장시켰다. 새로 단리된 인간 NK 세포를 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 Q82K (회색 막대), PVR-Fc 야생형 대조군 (흑색 막대), 또는 배지 단독 (백색 막대)으로 30분 동안 4℃에서 HBSS 내에서 예비-처리하였다. 이어서, NK 세포를 세척하고, 추가의 30 ㎍/ml의 PVR-Fc 변이체 또는 PVR-Fc WT를 보충한 배지 내에 재현탁시키고, 300 IU/ml 인간 IL-2를 함유하는 배지 내에서 표적 세포에 2 x 105개 세포/웰로 첨가하였다. 이중 세트의 세포를 인간 IL-2를 함유하지 않은 배지 내에 설정하였다. 배양 상청액을 24시간 후에 수거하고, ELISA (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스)에 의해 IFN-감마 함량에 대해 분석하였다.
IL-2의 부재 하에, NK 세포는 매우 제한된 양의 IFN-감마를 생산하였고, 상이한 샘플들 사이에 차이는 거의 없는 것으로 나타났다. 이와 반대로, IL-2의 존재 하에, NK 세포는 PVR-Fc 야생형 또는 비처리 대조군에 비해, PVR-Fc 변이체 Q82K로 예비-처리할 때 더 높은 수준의 IFN-감마를 생산하였다 (도 7).
실시예 5
PVR 변이체와 TIGIT, CD226 및 PVRL3 사이의 결합 상호작용의 FACS 분석
HEK-293T 세포를 PVR-CD4TM-GFP, PVR S72N 변이체-CD4TM-GFP, PVR Q82K 변이체-CD4TM-GFP, 또는 PVR Q82K+S72N 이중 변이체-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 가용성 TIGIT-Fc, CD226-Fc 또는 PVRL3-Fc 융합 단백질과 혼합한 후, PE-접합된 항-인간 Fc 이차 항체로 후속적으로 염색하였다. 이어서, 융합 단백질 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
결과는 이중 돌연변이체 PVR 융합 단백질이 모 야생형 PVR에 비해 TIGIT에 대한 개선된 결합을 나타내지만, CD226에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않음을 보여준다 (도 8). PVR 변이체는 모 야생형 PVR에 비해 PVRL3에 대해 대등하거나 다소 개선된 결합을 가졌다. 따라서, 면역 반응 (예를 들어 종양에 대한)을 향상시키는 것에 추가로, PVR 변이체는 정상적인 치밀 연접부 아키텍처를 파괴하여 종양 상에 노출된 PVRL3에 결합하고 종양 세포를 면역감시에 대해 표적화함으로써 종양에 우선적으로 국소화하는 능력을 가질 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이고, 그에 관한 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제시될 것이며, 이들은 본원의 취지 및 범위 내에 또한 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 등록 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 둘 다 포함)은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 또는 등록 번호/데이터베이스 서열이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 서열은 다음과 같다:
SEQUENCE LISTING
<110> OncoMed Pharmaceuticals, Inc.
Gurney, Austin L.
Takada Axelrod, Fumiko
<120> IMMUNOTHERAPY WITH BINDING AGENTS
<130> 2293.099PC02
<140> To be assigned
<141> 2013-12-04
<150> 61/789,268
<151> 2013-03-15
<150> 61/733,177
<151> 2012-12-04
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
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Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala
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Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr
405 410 415
Arg
<210> 2
<211> 517
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gln Val
20 25 30
Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val
35 40 45
Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile Thr Gln
50 55 60
Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg
85 90 95
Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser
100 105 110
Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr
115 120 125
Phe Pro Thr Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala
130 135 140
Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys
145 150 155 160
Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn
165 170 175
Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu
180 185 190
Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile
195 200 205
Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu
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Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr
225 230 235 240
Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly
245 250 255
Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp
260 265 270
Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly
290 295 300
Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn
305 310 315 320
Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe
325 330 335
Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val
340 345 350
Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu
355 360 365
Ile Val Val Gly Gly Ile Val Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr
370 375 380
Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu
405 410 415
Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly
420 425 430
Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala
450 455 460
Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly
465 470 475 480
Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp
485 490 495
Leu Ala Glu Asn Met Val Ser Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys
500 505 510
Lys Glu Trp Tyr Val
515
<210> 3
<211> 538
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr
340 345 350
Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala
355 360 365
Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln
370 375 380
Gln Arg Lys Glu Gln Thr Leu Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu
405 410 415
Ala Gln Glu Met Pro Ser Gln Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu
435 440 445
Gln Glu Met Pro Arg Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser
450 455 460
Gly Pro Leu His Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val
465 470 475 480
Pro Pro Gly Pro Pro Ala Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp
485 490 495
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Ile
500 505 510
Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys
515 520 525
Gly Phe Val Met Ser Arg Ala Met Tyr Val
530 535
<210> 4
<211> 549
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Ile Ile Ala Ser Val Val Gly Gly Ala Leu Phe Ile
405 410 415
Val Leu Val Ser Val Leu Ala Gly Ile Phe Cys Tyr Arg Arg Arg Arg
420 425 430
Thr Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Ala Lys Asn Tyr Ile Pro Pro Ser Asp
435 440 445
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450 455 460
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Leu Ile Arg Lys Asp Tyr Leu Glu Glu Pro Glu Lys Thr Gln Trp Asn
485 490 495
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515 520 525
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
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Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly
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35 40 45
Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu
145 150 155 160
Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser
180 185 190
Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe
195 200 205
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His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln
245 250 255
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Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu
305 310 315 320
Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln
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Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val
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Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln
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420 425 430
Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu
435 440 445
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Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro
485 490 495
Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
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<211> 244
<212> PRT
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Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
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Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
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Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 7
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Glu Lys Lys Trp Lys Tyr Cys Ala Val Tyr Tyr Ile Ile Gln Ile
1 5 10 15
His Phe Val Lys Gly Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn
20 25 30
Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln
35 40 45
Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys
50 55 60
Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu
85 90 95
Asn Gly Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu
130 135 140
Trp Asn Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu
145 150 155 160
Ile Pro Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr
165 170 175
Tyr Ala Trp Ser Val Glu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Trp Val Leu Leu
180 185 190
Ser Lys Gly Ile Lys Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser
195 200 205
Gln Asn His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys
210 215 220
Leu Gly Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp
225 230 235 240
Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile
245 250 255
Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro
260 265 270
Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe
275 280 285
Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe
290 295 300
Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr
305 310 315 320
Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val
325 330 335
Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr
340 345 350
Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn
355 360 365
Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser
370 375 380
Thr Asp Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro
385 390 395 400
Ser Pro Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser
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420 425 430
Pro Ser Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asn Gly Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val
500 505 510
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Leu Pro Tyr His Glu Met Glu Thr Leu
580 585
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<211> 336
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn
20 25 30
Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val
35 40 45
Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr
100 105 110
Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp
115 120 125
Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro
130 135 140
Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val
145 150 155 160
Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu
165 170 175
Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro
180 185 190
Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val
195 200 205
Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val
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Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Gly Gly
245 250 255
Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile Ile Val
260 265 270
Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr
275 280 285
Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile
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305 310 315 320
Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
325 330 335
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<212> PRT
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<400> 9
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1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
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Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
180 185 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
195 200 205
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210 215 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225 230 235 240
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245 250 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
260 265 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
275 280 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
290 295 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met Ser Arg Asn
305 310 315
<210> 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Val Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Val Val Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile
20 25 30
Thr Gln Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val
35 40 45
Ala Ile Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg
50 55 60
Glu Arg Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg
65 70 75 80
Leu Ser Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Glu Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr
165 170 175
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180 185 190
Ser Leu Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser
195 200 205
Leu Thr Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe
210 215 220
Asp Gly Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys
225 230 235 240
Ala Asp Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn
245 250 255
Gly Ser Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe
260 265 270
Lys Gly Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala
275 280 285
Thr Asn Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr
290 295 300
Glu Phe Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly
305 310 315 320
Pro Val Pro Thr Ala
325
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gln Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu
20 25 30
Tyr Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His
35 40 45
Gln Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser
50 55 60
Pro Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser
65 70 75 80
Thr Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu
85 90 95
His Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala
100 105 110
Thr Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile
115 120 125
Ala Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln
130 135 140
Asp Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro
145 150 155 160
Ala Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr
165 170 175
Gln Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Pro Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val
275 280 285
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Gly Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn
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Thr Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly
325
<210> 12
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn
1 5 10 15
Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile
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Ser Trp Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His
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65 70 75 80
Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe
85 90 95
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Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly
115 120 125
Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val
130 135 140
Ala His Ile Asp Trp Glu Gly Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu
165 170 175
Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys
180 185 190
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195 200 205
Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe
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225 230 235 240
Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp
245 250 255
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260 265 270
Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly
275 280 285
Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr
290 295 300
Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile
305 310 315 320
Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr
325 330 335
Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp Thr Ile Ala Thr
340 345
<210> 13
<211> 318
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly
20 25 30
Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu
50 55 60
Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys
85 90 95
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Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu
115 120 125
Glu Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu
165 170 175
Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys
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Val Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile
195 200 205
Leu His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp
210 215 220
Gln Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu
225 230 235 240
Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly
245 250 255
Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro
260 265 270
Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn
275 280 285
Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro
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Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser
305 310 315
<210> 14
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
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115 120 125
Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala
130 135 140
<210> 15
<211> 496
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp
1 5 10 15
Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met
20 25 30
Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His
35 40 45
Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu
50 55 60
Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu
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Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile
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130 135 140
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195 200 205
Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His
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Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys
225 230 235 240
Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr
245 250 255
Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe
260 265 270
Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp
275 280 285
Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp
290 295 300
Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys
305 310 315 320
Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro
325 330 335
Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe
340 345 350
Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp Pro Pro Leu Ser Val Thr
355 360 365
Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser Val Ser Pro
370 375 380
Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Val Asp Val Ser Ala
385 390 395 400
Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser Asn Ser Ser Met Thr Thr
405 410 415
Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Lys Lys
420 425 430
Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Gly
435 440 445
Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr Ser Thr Ala Arg Ala
450 455 460
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465 470 475 480
Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys Pro Lys Asp Gly Met Ser
485 490 495
<210> 16
<211> 236
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn Met Ser
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val Glu Trp
20 25 30
Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser Pro Thr
35 40 45
His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg Asn Ala
65 70 75 80
Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro
85 90 95
Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp Ser Phe
100 105 110
Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro Gly Lys
115 120 125
Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val Gln Ala
130 135 140
Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro Arg Gln
165 170 175
Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val Ile Pro
180 185 190
Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu Gln Ala
195 200 205
Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val Ala Glu
210 215 220
Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala
225 230 235
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
Arg Val Leu Ala
115
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant 1 Human PVR - N-terminal IgV domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(47)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(55)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(58)
<223> x can be any amino acid
<400> 18
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Xaa Trp Xaa Arg His Gly Glu Xaa Xaa Xaa Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant 2 Human PVR - N-terminal IgV domain
<400> 19
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Asn Gly Ser Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant 3 Human PVR - N-terminal IgV domain
<400> 20
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
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20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
35 40 45
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Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant 4 Human PVR - N-terminal IgV domain
<400> 21
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1 5 10 15
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20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Asn Gly Ser Met
35 40 45
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65 70 75 80
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Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Val Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Val Val Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile
20 25 30
Thr Gln Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val
35 40 45
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50 55 60
Glu Arg Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg
65 70 75 80
Leu Ser Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe
85 90 95
Ala Thr Phe Pro Thr Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val
100 105 110
Met Ala
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn
1 5 10 15
Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile
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His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val
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Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe
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<213> Homo sapiens
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Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp
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Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly
20 25 30
Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
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Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu
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Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys
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Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro
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<213> Homo sapiens
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Pro Gly Lys
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<213> Homo sapiens
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Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Homo sapiens
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Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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<213> Homo sapiens
<400> 30
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 33
Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 34
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 35
Gly Arg Ala Gln Val Thr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 36
Trp Arg Ala Gln Val Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 37
Ala Arg Gly Arg Ala Gln Val Thr
1 5
<210> 38
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant human PVRL2 - N-terminal IgV domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(49)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(57)
<223> x can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(60)
<223> x can be any amino acid
<400> 38
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
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Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
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Ile Ser Leu Val Xaa Trp Xaa Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn Xaa Xaa
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Xaa Val Ala Ala Phe His Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Phe Pro Ser Pro
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Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
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Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
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Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
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Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
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<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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<210> 40
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
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Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 41
<211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 42
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 43
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 44
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 45
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Lys Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 46
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Lys Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 47
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 48
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
Claims (25)
- 폴리오바이러스 수용체 (PVR) 변이체를 포함하며, 여기서 PVR 변이체는 야생형 PVR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 인간 CD226의 세포외 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하는 것인, 단리된 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 인간 CD96의 세포외 도메인에 또한 결합하는 폴리펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이
(a) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 40-143;
(b) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 60-90 및/또는 아미노산 125-133;
(c) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 65, 67, 72, 73, 74, 81, 82, 84 및 85;
(d) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 72;
(e) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 82; 또는
(f) 야생형 PVR (서열 1)의 아미노산 72 및 아미노산 82
에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드. - 제1항 또는 제2항에 있어서, PVR 변이체가 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 수용체인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PVR 변이체가 비-PVR 폴리펩티드에 연결되는 것인 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 비-PVR 폴리펩티드가 인간 Fc 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 또는 이종이량체 단백질인 폴리펩티드.
- 제8항에 있어서, 이종이량체 단백질이 면역 반응 자극제를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 세포-매개 면역을 증가시키고/시키거나;
(b) T-세포 활성을 증가시키고/시키거나;
(c) 세포용해 T-세포 (CTL) 활성을 증가시키고/시키거나;
(d) 자연 킬러 (NK) 세포 활성을 증가시키고/시키거나;
(e) TIGIT-매개 신호전달의 길항제이고/이거나;
(f) CD96-매개 신호전달의 길항제이고/이거나;
(g) TIGIT 신호전달을 억제하고/하거나;
(h) CD96 신호전달을 억제하고/하거나;
(i) CD226 신호전달을 증가시키고/시키거나;
(j) PVR과 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하고/하거나;
(k) PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하고/하거나;
(l) PVR과 CD226 사이의 상호작용을 억제하지 않고/않거나;
(m) PVR과 TIGIT 사이의 상호작용 및 PVR과 CD96 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하고, PVR과 CD226 사이의 상호작용을 억제하지 않고/않거나;
(n) PVRL2와 TIGIT 사이의 상호작용, PVRL3과 TIGIT 사이의 상호작용 및/또는 PVRL4와 TIGIT 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하는 폴리펩티드. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하거나 생산하는 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 대상체에서 면역 반응을 활성화하거나 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
- 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
- 제16항에 있어서, 암이 결장직장암, 난소암, 췌장암, 폐암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
- 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한,
PVR 변이체를 포함하며,
(i) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(ii) CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(iii) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(iv) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는
가용성 수용체의 용도. - 대상체에서 종양 성장을 억제하기 위한 의약의 제조를 위한,
PVR 변이체를 포함하며,
(i) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(ii) CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(iii) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하거나;
(iv) TIGIT와 PVR 사이의 상호작용을 억제하고, CD96과 PVR 사이의 상호작용을 억제하며, CD226과 PVR 사이의 상호작용은 억제하지 않는
가용성 수용체의 용도. - 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 적어도 하나의 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 것인 용도.
- 제20항에 있어서, 추가의 치료제가 면역 반응 자극제인 용도.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제인 용도.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 추가의 치료제가 항체인 용도.
- T-세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, B-세포 및/또는 세포용해 T-세포 (CTL)를 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 활성을 증가시키는 방법.
- 종양 또는 종양 세포를 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제하는 방법.
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