TW201925223A - 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含ICOSL變異體之免疫調節蛋白及編碼此類蛋白之核酸。該等免疫調節蛋白為多種免疫學及腫瘤學病況提供治療效用。本文提供製造及使用此類蛋白之組合物及方法。

Description

變異型ICOS　配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
本發明係關於用於在癌症及免疫疾病治療中調節免疫反應之治療組合物。在一些態樣中，本發明係關於ICOS配位體(ICOSL)之特定變異體，其對於同源結合配位體蛋白質ICOS或CD28中之一者或兩者展現改良之結合，諸如改良之親和性或選擇性。
藉由干預發生於由抗原呈遞細胞(APC)或靶細胞及淋巴細胞形成且在其之間的免疫突觸(IS)中之過程而調節免疫反應在醫學上越來越感興趣。在機理上，IS中之細胞表面蛋白質可涉及多個蛋白質標靶與其所結合之單一蛋白質之協同且通常同時的相互作用。IS相互作用與兩個細胞之接合緊密關聯地發生，且此結構中之單一蛋白質可與相同細胞(順式)上之蛋白質以及相關細胞(反式)上之蛋白質相互作用(可能同時)。儘管已知可調節IS之治療劑，但仍需要改良之治療劑。提供免疫調節蛋白，包括滿足此類需要的能夠表現於細胞上之可溶性蛋白質或跨膜免疫調節蛋白。
本文提供變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其含有ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中之一或多個胺基酸修飾，其中ICOSL參考多肽為截短之細胞外域，其包含參看SEQ ID NO: 32所闡述ICOSL細胞外域序列之胺基酸1-112及C端截短至少25個胺基酸之連續胺基酸序列。在一些實施例中，相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變與ICOS或CD28之胞外域之結合性。在一些實施例中，相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
在任何此類實施例中之一些中，C端截短至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125個胺基酸殘基。在一些實施例中，ICOSL參考多肽在闡述為SEQ ID NO: 32之胺基酸204-209的蛋白酶裂解位點中改變或不具有該蛋白酶裂解位點。在一些實例中，ICOSL參考多肽含有SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
本文提供含有ICOSL參考多肽中之一或多個胺基酸修飾之變異型ICOSL配位體(ICOSL)多肽，其中ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。本文亦提供含有ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中之一或多個胺基酸修飾之變異型ICOSL配位體(ICOSL)多肽，其中ICOSL參考多肽在參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209之一或多個胺基酸中改變。在一些實施例中，相比於ICOSL參考多肽與一或多個結合配位體之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與其結合配位體中之一或多者之結合。在一些實施例中，相比於ICOSL參考多肽與一或多個結合配位體之結合，變異體ICOSL多肽對其結合配位體中之一或多者展現出經提高結合性。
在任何所提供實施例中之一些中，改變(例如修飾)包括參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209之一或多個連續胺基酸之缺失。在一些情況下，ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 600-605中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 600-605中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
在任何所提供實施例中之一些中，改變(例如修飾)包括對應於SEQ ID NO: 32中所闡述之位置的位置207及208中之一者或兩者處之至少一個胺基酸取代。在一些實例中，至少一個胺基酸取代為N207A、N207G或L208G，或其保守性胺基酸取代。
在任何所提供實施例中之一些中，參考ICOSL多肽含有SEQ ID NO: 623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，參考ICOSL多肽由SEQ ID NO: 623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽在自細胞表現時展現減少之蛋白質水解性裂解。在一些實例中，細胞為哺乳動物細胞。在一些情況下，細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株或其衍生物。
在任何此類實施例中之一些中，胺基酸修飾為胺基酸取代、插入或缺失。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、148、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、S121G、V122A、V122M、F120S、S126T、S126R、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A、N227K，或其保守性胺基酸取代。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾在對應於52、57或100之位置的位置。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V。在一些實例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M/ C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52D、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自F120S/Y152H/N201S、E111del、Y33del、N168Q/N207Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N84Q/N119Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q或F138L/L203P。
在任何此類實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、H115X、I143T、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100K、Q100M、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q133H、R221I、R75Q、S54A、S54P、T113E、T225A、V110D、V122A、Y146C、Y152C、A117T、A20V、A71T、A91G、A91G、AE88D、C140del、C198R、D158G、D77G、D90K、E117G、E135K、E16V、E81A、E88D、E90A、F120I、F120S、F138L、F172S、F27C、F92Y、G72R、H115R、H115X、H129P、H94E、I118V、I127T、I143T、I143V、I154F、I218N、I218T、I224V、K156M、K169E、K36G、K42E、K89R、K92R、K93R、L102R、L161P、L166Q、L173S、L203F、L203P、L208P、L209P、L40M、L70Q、L70R、L74Q、L80P、L96I、L98F、M10I、M10V、N115Q、N119Q、N122S、N144D、N155X、N168Q、N168X、N178S、N194D、N207Q、N207X、N227K、N25S、N30D、N52V、N57A、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、N63S、N84Q、Q100G、Q100N、Q100V、R221G、S109G、S109N、S114T、S121G、S126R、S126T、S130G、S132F、S13G、S18R、S192G、S212G、S25G、S54A、S54P、S99G、T113E、T120S、T130A、T139S、T190A、T199S、T225A、T41I、V107I、V110A、V110D、V11E、V122A、V122M、V193M、V210A、W153R、Y146C、Y152C或Y152H。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自N52S、N52H、N52D、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R、H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P; 或 N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140del/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/D158G、N52D/Q133H、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A、L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S、L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A、T41I/A91G、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N178S、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、AE88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R、K36G/L40M、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/F120S/N227K、N52S/N194D、N52S/F120S、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/Q100R、N52H/S121G/C198R、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R221I、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/H115R/F172S/C198R、N119Q、N207Q、N52Q/N207X、N168X/N207X、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N119Q N155X、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N207Q、N119Q/N155Q/N168Q、N52H/N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N155X/N168X、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P。在一些實施例中，相比於參考ICOSL多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多個胺基酸修飾係選自C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100E、Q100G、Q100K、Q100M、Q100P、Q100R、Q100S、Q133H、S212G、S54A、S54P、T113E、V110D、V122A、Y146C、Y152C或T225A。
在一些實例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N52S/E90A/H115R或N30D/K42E/N52S/H115R。在一些實施例中，相比於參考ICOSL多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS及CD28胞外域展現出經提高結合性。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽含有SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽含有IgV域或其特異性結合片段、IgC域或其特異性結合片段或兩者之任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽在ICOSL參考多肽或其特異性結合片段中含有一或多個胺基酸修飾，其對應於參看SEQ ID NO: 32選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52K、N52L、N52M、N52R、N52T、N52V、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V之胺基酸修飾。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57F/Q100S、N52A,/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/ N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在任何所提供實施例中之一些中，ICOSL參考多肽為哺乳動物ICOSL或其特異性結合片段。在一些實例中，ICOSL參考多肽為人類ICOSL或其特異性結合片段。
在任何所提供實施例中之一些中，ICOSL參考多肽含有(i) SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(iii)一部分包含IgV域或IgC域或其特異性結合片段之(i)或(ii)或兩者。在一些實施例中，IgV域或IgC域之特異性結合片段之長度為至少50、60、70、80、90、100、110或更多個胺基酸；或IgV域之特異性結合片段之長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸19-129之IgV域之長度的至少80%及/或IgC域之特異性結合片段之長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸141-227之IgC域之長度的至少80%。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含IgV域或其特異性片段及IgC域或其特異性片段。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽含有SEQ ID NO: 638-685中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 638-685中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 638-685中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 638-685中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽含有IgV域或其特異性結合片段。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有SEQ ID NO: 686-781中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 686-781中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 686-781中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 686-781中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在任何所提供實施例中之一些中，IgV域或其特異性結合片段為變異型ICOSL多肽之唯一ICOSL部分。在一些實例中，IgC域或其特異性結合片段為變異型ICOSL多肽之唯一ICOSL部分。
在任何所提供實施例中之一些中，相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合。在一些態樣中，相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。在一些實例中，結合性提高超過1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
在任何此類實施例中之一些中ICOS為人類ICOS。在一些實施例中，CD28為人類CD28。
在任何所提供實施例中之一些中，相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對CTLA-4胞外域展現出經降低結合。在一些實例中，結合減少大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。在一些實施例中，CTLA-4為人類CTLA-4。
在任何所提供實施例中之一些中，改變(增加或減少)之結合為改變(增加或減少)之結合親和力。在任何此類實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸修飾，視情況為胺基酸取代、插入及/或缺失。在一些情況下，變異型ICOSL多肽與ICOSL參考多肽展現至少或至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽為可溶性蛋白質。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽不具有跨膜域及細胞內信號傳導域；及/或當自細胞表現時，變異型ICOSL多肽不表現於細胞表面上。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽另外含有跨膜域。在一些情況下，跨膜域含有胺基酸序列，該序列闡述為SEQ ID NO: 5之殘基257-277或其與SEQ ID NO: 5之殘基257-277展現至少85%序列一致性之功能變異體。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽另外含有連接至跨膜域之細胞質信號傳導域。在一些情況下，細胞質信號傳導域含有胺基酸序列，該序列闡述為SEQ ID NO: 5之殘基278-302或其與SEQ ID NO: 5之殘基278-302展現至少85%序列一致性之功能變異體。
在任何所提供實施例中之一些中，相比於ICOSL參考序列，變異型ICOSL多肽為去糖基化或部分去糖基化的。
本文提供含有所提供變異型ICOSL多肽及半衰期延長部分中之任一者之免疫調節蛋白。在一些實施例中，半衰期延長部分包含多聚化域、白蛋白、白蛋白結合性多肽、Pro/Ala/Ser (PAS)、人絨毛膜促性腺激素之β次單位之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、長的無特定結構親水性胺基酸序列(XTEN)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合性小分子或其組合。在一些情況下，半衰期延長部分為或包含Pro/Ala/Ser (PAS)且變異型ICOSL多肽為PAS化的(PASylated)。在一些實施例中，半衰期延長部分含有SEQ ID NO: 904中闡述之序列。
在任何所提供實施例中之一些中，半衰期延長部分為或含有多聚化域。在一些情況下，多聚化域選自免疫球蛋白、白胺酸拉鏈、異白胺酸拉鏈或鋅指之Fc區。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至多聚化域。
在任何所提供實施例中之一些中，免疫調節蛋白為含有連接至第一多聚化域之第一變異型ICOSL多肽及連接至第二多聚化域之第二變異型ICOSL多肽的多聚體，其中第一及第二多聚化域相互作用以形成包含第一及第二變異型ICOSL多肽之多聚體。在一些情況下，多聚體為二聚體。
在任何所提供實施例中之一些中，第一變異型ICOSL多肽及第二變異型ICOSL多肽相同。在一些實施例中，二聚體為均二聚體。在一些情況下，二聚體為雜二聚體。
在任何所提供實施例中之一些中，多聚化域為或含有免疫球蛋白之Fc區。在一些實施例中，Fc區具有免疫球蛋白G1 (IgG1)或免疫球蛋白G2 (IgG2)蛋白質。在一些實例中，免疫球蛋白為人類及/或Fc區為人類。在一些實施例中，Fc區含有SEQ ID NO: 227中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 227展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。在一些態樣中，Fc區含有SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 226展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。在一些實施例中，Fc區展現一或多種效應物功能。在一些實施例中，相比於野生型Fc區，Fc區展現一或多種減弱之效應物功能，視情況其中野生型人類Fc屬於人類IgG1。
在任何所提供實施例中之一些中，一或多種效應物功能係選自抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性、計劃性細胞死亡及細胞吞噬作用。在一些實施例中，相比於野生型Fc區，Fc區為包含一或多個胺基酸取代之變異型Fc區。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型Fc區之一或多個胺基酸取代係選自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實施例中，變異型Fc區另外含有胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些態樣中，Fc區含有SEQ ID NO: 476-478中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 476-478中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。在一些實施例中，Fc區含有K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
在任何所提供實施例中之一些中，Fc區含有SEQ ID NO: 632-634中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 632-634中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
在任何所提供實施例中之一些中，Fc區含有SEQ ID NO: 474或637中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 474或637中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
本文提供免疫調節蛋白含有(a)在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中含有一或多個胺基酸修飾之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合；及(b)相比於野生型人類IgG1含有選自N297G/K447del、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/K447del或L234A/L235E/G237A/K447del之胺基酸取代的變異型Fc區，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些情況下，免疫調節蛋白為二聚體。在一些實施例中，變異型Fc區另外含有胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實例中，Fc區含有SEQ ID NO: 632-634中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 632-634中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。在一些實施例中，Fc區含有SEQ ID NO: 474或637中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 474或637中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至變異型Fc區。在一些實例中，連接子含有1至10個胺基酸。在一些實施例中，連接子選自AAA、G4S (SEQ ID NO: 636)、(G4 S)2 (SEQ ID NO:229)或GSGGGGS連接子(SEQ ID NO: 635)。在一些實施例中，連接子為(G4 S)3 (SEQ ID NO: 228)。
本文提供免疫調節蛋白，其含有連接至包含免疫球蛋白超級家族(IgSF)域之第二多肽的變異型ICOSL多肽中之任一者。在一些情況下，IgSF域親和力經修飾且相比於未經修飾或野生型IgSF域展現改變的與其同源結合配位體中之一或多者之結合。在一些實施例中，相比於未經修飾或野生型IgSF域，IgSF域對其同源結合配位體中之一或多者展現出經提高結合性。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽為第一ICOSL變異型多肽且第二多肽之IgSF域為來自本文提供之第二變異型ICOSL多肽之IgSF域，其中第一及第二ICOSL變異體為相同或不同。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽能夠特異性結合至CD28或ICOS且第二多肽之IgSF域能夠結合至除ICOSL變異型多肽特異性結合之結合配位體以外的結合配位體。在一些實施例中，IgSF域來自B7家族之成員。
在任何所提供實施例中之一些中，IgSF域為結合至腫瘤上表現之配位體的腫瘤定位部分或為結合至發炎性環境之細胞或組織上表現之配位體的發炎性定位部分。在一些情況下，配位體為B7H6。在一些實例中，IgSF域來自NKp30。
在任何所提供實施例中之一些中，IgSF域為或包含IgV域。在一些情況下，變異型ICOSL多肽為或含有IgV域。
在任何所提供實施例中之一些中，免疫調節蛋白包含連接至變異型ICOSL多肽或包含IgSF域之第二多肽中之一者或兩者的多聚化域。在一些情況下，多聚化域為Fc域或其具有減弱之效應物功能的變異體。
在任何所提供實施例中之一些中，免疫調節蛋白為二聚體。在一些情況下，免疫調節蛋白為均二聚體。在一些態樣中，免疫調節蛋白為雜二聚體。
本文提供含有所提供變異型ICOSL多肽中之任一者或所提供免疫調節蛋白及異質部分中之任一者之結合物。在一些情況下，變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至異質部分。在一些實施例中，靶向部分為蛋白質、肽、核酸、小分子或奈米粒子。在一些實例中，靶部分為蛋白質或肽。在一些實施例中，結合物為融合蛋白。
提供含有所提供變異型ICOSL多肽中之任一者或所提供免疫調節蛋白及異質部分中之任一者之融合蛋白。在一些情況下，部分為特異性結合至細胞表面上之分子的靶向部分。在一些實例中，靶向部分特異性結合至免疫細胞表面上之分子。在一些實施例中，免疫細胞為抗原呈遞細胞或淋巴細胞。在一些情況下，靶向部分為結合至腫瘤表面上之分子的腫瘤定位部分。
在任何所提供實施例中之一些中，靶向部分結合至分子HER1/EGFR、HER2/ERBB2、CD20、CD25 (IL-2Rα受體)、CD33、CD52、CD133、CD206、CEA、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6、癌症抗原125 (CA125)、α-胎蛋白(AFP)、Lewis Y、TAG72、Caprin-1、間皮素、PDGF受體(PDGFR；諸如PDGF-R α)、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2受體、血管內皮生長因子(VEGF)、CD30、EpCAM、EphA2、磷脂肌醇蛋白聚醣-3、gpA33、黏蛋白、CAIX、PSMA、葉酸結合蛋白、神經節苷脂(諸如GD2、GD3、GM1及GM2)、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR2、VEGF-A、整合素αVβ3、整合素α5β1、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、AFP、BCR複合物、CD3、CD18、CD44、CTLA-4、gp72、HLA-DR 10 β、HLA-DR抗原、IgE、MUC-1、nuC242、PEM抗原、金屬蛋白酶、Ephrin受體、Ephrin配位體、HGF受體、CXCR4、CXCR4、鈴蟾素受體、SK-1抗原、Bcr-abl、RET、MET、TRKB、TIE2、ALK、ROS、EML4-ALK、ROS1、BRAFV600E、SRC、c-KIT、mTOR、TSC1、TSC2、BTK、KIT、BRCA、CDK 4/6、JAK1、JAK2、BRAF、FLT-3、MEK1、MEK2、SMO或B7-H6 (NCR3LG1)。在一些態樣中，靶向部分結合至PD-L1。
在任何所提供實施例中之一些中，靶向部分為抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，抗體係選自西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Ado-trastuzumab emtansine)、托西莫單抗(Tositumomab)(Bexxar®)、利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan、Mabthera)、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)、達利珠單抗(Daclizumab)(Zenapax)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)(Mylotarg)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、CEA掃描Fab片段、OC125單株抗體、ab75705、B72.3、貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、伯舒替尼(Bosutinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、克卓替尼(Crizotinib)、達拉非尼(Dabrafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、迪奴圖單抗(Dinutuximab)(UnituxinTM )、埃羅替尼(Erlotinib)、依維莫司(Everolimus)、依魯替尼(Ibrutinib)、伊馬替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、奧拉帕尼(Olaparib)、奧拉單抗(Olaratumab)(LartruvoTM )、帕泊昔布(Palbociclib)、帕佐泮尼(Pazopanib)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)(Perjeta®)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)(Cyramza®)、瑞戈非尼(Regorafenib)、蘆可替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦羅莫司(Temsirolimus)、曲美替尼(Trametinib)、凡德他尼(Vandetanib)、維羅非尼(Vemurafenib)、維莫德吉(Vismodegib)、巴利昔單抗(Basiliximab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、納武單抗(Nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、匹立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011)、AMP-224、MSB001078C、或MEDI4736、BMS-935559、LY3300054、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab)或為其抗原結合片段。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之N端。在一些情況下，變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之C端。
在任何所提供實施例中之一些中，結合物為二價、四價、六價或八價。在一些實施例中，異質部分為或含有用於偵測或純化變異型ICOSL多肽之標記。
本文提供單價融合蛋白，其含有變異型ICOSL多肽，該多肽在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中含有一或多個胺基酸修飾，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域的結合；及用於偵測或純化變異型ICOSL多肽之標記。在一些實施例中，用於偵測或純化之標記選自聚組胺酸(His)標籤、FLAG標籤、Myc標籤或螢光蛋白標籤。
在任何所提供實施例中之一些中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、148、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置含有一或多個胺基酸修飾。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置含有一或多個胺基酸修飾。
在一些情況下，一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N52K、S54A、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、S121G、V122A、V122M、F120S、S126T、S126R、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A、N227K，或其保守性胺基酸取代。在一些情況下，一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R、S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
在任何所提供實施例中之一些中，ICOSL參考多肽含有(i) SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(iii)一部分包含IgV域或IgC域或其特異性結合片段之(i)或(ii)或兩者。
在任何所提供實施例中之一些中，ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 196、545、600-605及623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 32、196、545、600-605及623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
提供編碼所提供變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白中之任一者的核酸分子。在一些情況下，核酸分子為合成核酸。在一些實例中，核酸分子為cDNA。
提供含有所提供核酸分子中之任一者的載體。在一些情況下，載體為表現載體。在一些實施例中，載體為哺乳動物表現載體或病毒載體。
提供含有所提供載體中之任一者的細胞。在一些情況下，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物。
提供一種產生含有變異型ICOSL多肽中之任一者之免疫調節蛋白的方法，其包括在宿主細胞中表現蛋白質之條件下將所提供核酸分子或載體中之任一者引入至宿主細胞中。在一些實例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在一些情況下，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞或其衍生物。在一些實施例中，方法進一步包括自細胞分離或純化蛋白質。
提供藉由所提供方法中之任一者產生之蛋白質。
提供包含含有所提供變異型ICOSL多肽中之任一者之蛋白質或免疫調節蛋白的組合物，其中組合物中至少95%、96%、97%、98%、99%之蛋白質或免疫調節蛋白之個別序列具有相同序列長度，視情況其中組合物為包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些實施例中，蛋白質或免疫調節蛋白係純化自中國倉鼠卵巢細胞或其衍生物。
提供聚核苷酸，其含有編碼含有所提供跨膜域之變異型ICOSL多肽的核酸及一或多種編碼重組抗原受體之一或多條鏈的核酸。在一些情況下，重組抗原受體為嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，編碼變異型ICOSL多肽的核酸及一或多種編碼重組受體之一或多條鏈的核酸中之每一者由編碼自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸分離。
在一些實例中，聚核苷酸含有編碼變異型ICOSL多肽的核酸、編碼自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸及編碼CAR的核酸。在一些實例中，聚核苷酸包含編碼變異型ICOSL多肽的核酸、編碼第一自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸、編碼工程改造TCRα鏈或工程改造TCRβ鏈中之一者的核酸、編碼第二自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸及編碼工程改造TCRα鏈或工程改造TCRβ鏈中之另一者的核酸。在一些態樣中，編碼之第一及第二自體裂解肽相同。在一些實施例中，自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽為T2A、P2A、E2A或F2A。
提供含有所提供聚核苷酸中之任一者的載體。在一些情況下，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
提供含有所提供聚核苷酸或載體中之任一者的工程改造細胞。亦提供含有所提供變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白中之任一者的工程改造細胞。
提供含有所提供核酸分子或載體中之任一者的工程改造細胞。在一些情況下，編碼變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白之核酸編碼信號肽。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白不含跨膜域及/或不表現於細胞表面上。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白分泌自工程改造細胞。在一些態樣中，工程改造細胞包含含有跨膜域之變異型ICOSL多肽。在一些態樣中，變異型ICOSL多肽表現於細胞表面上。
在一些實施例中，細胞為免疫細胞。在一些情況下，免疫細胞為抗原呈遞細胞(APC)或淋巴細胞。在一些實例中，工程改造細胞為初生細胞。在一些情況下，細胞為哺乳動物細胞。在一些情況下，細胞為人類細胞。在一些實施例中，淋巴細胞為T細胞。在一些實例中，工程改造細胞為APC且APC為人工APC。
在任何所提供實施例中之一些中，工程改造細胞另外含有嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體。
提供傳染媒介物，其含有編碼所提供變異型ICOSL多肽或所提供免疫調節蛋白、所提供融合蛋白之核酸分子。在一些情況下，編碼之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白不含跨膜域及/或不表現於其所表現之細胞的表面上。在一些實施例中，編碼之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白在其表現時分泌自傳染媒介物。在一些情況下，編碼之變異型ICOSL多肽包含跨膜域。
在任何所提供實施例中之一些中，編碼之變異型ICOSL多肽表現於其所表現之細胞的表面上。在一些情況下，傳染媒介物為細菌或病毒。在一些實施例中，病毒為溶瘤病毒。在一些實例中，溶瘤病毒為腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、水皰性氣孔病毒(Vesticular Stomatic virus)、里奧病毒(Reovirus)、新城雞瘟病毒(Newcastle Disease virus)、小病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒(vesticular stomatitis virus；VSV)、科沙奇病毒(Coxsackie virus)或牛痘病毒。
在任何所提供實施例中之一些中，病毒特異性靶向樹突狀細胞(DC)及/或為樹突狀細胞向性的。在一些情況下，病毒為藉由經修飾之辛得比斯病毒(Sindbis virus)包膜產物假型化之慢病毒載體。在一些實施例中，傳染媒介物另外含有核酸分子，其編碼導致靶細胞死亡或可加強或增強免疫反應之另一基因產物。在一些實施例中，該另一基因產物選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、免疫檢查點抑制劑、抗體、細胞介素、生長因子、抗原、細胞毒性基因產物、促凋亡基因產物、抗凋亡基因產物、細胞基質降解基因、用於組織再生或將人類體細胞再程式化為多能性之基因。
提供醫藥組合物，其含有變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物或融合蛋白中之任一者或所提供工程改造細胞或傳染媒介物中之任一者。在一些實施例中，醫藥組合物含有醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物為無菌的。
在一些實施例中，提供在小瓶中含有醫藥組合物之製品。在一些情況下，小瓶經密封。
提供含有所提供組合物及使用說明書中之任一者的套組。亦提供含有所提供製品及使用說明書中之任一者的套組。
提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包括向個體投與醫藥組合物。亦提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包括投與工程改造細胞。在一些情況下，工程改造細胞對個體而言為自體的。在一些實施例中，工程改造細胞對個體而言為同種異體的。
在一些實施例中，調節免疫反應治療個體之疾病或病況。在一些態樣中，免疫反應增加。
在一些實施例中，含有連接至腫瘤定位部分之變異型ICOSL多肽的免疫調節蛋白或結合物係投與至個體。在一些情況下，腫瘤定位部分為或包含識別腫瘤抗原之結合分子。在一些實施例中，結合分子含有抗體或其抗原結合片段或包含野生型IgSF域或其變異體。在一些實施例中，免疫調節蛋白或結合物或融合蛋白係投與至個體。在一些實施例中，為跨膜免疫調節蛋白之變異型ICOSL多肽係投與至個體。在一些情況下，含有為跨膜免疫調節蛋白之變異型ICOSL多肽的工程改造細胞係投與至個體。在一些實施例中，疾病或病況為腫瘤或癌症。在一些實例中，疾病或病況選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液學惡性病、肝癌、腦癌、腎癌、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨胳癌、頭頸癌、胃腸癌、生殖細胞癌或內分泌及神經內分泌癌症。在一些實施例中，免疫反應減弱。
在任何所提供實施例中之一些中，可溶之變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白係投與至個體。在一些實施例中，可溶免疫調節蛋白為免疫調節Fc融合蛋白。在一些實施例中，所提供變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白係投與至個體。在一些實施例中，含有分泌型變異型ICOSL多肽之工程改造細胞係投與至個體。在一些實施例中，所提供工程改造細胞係投與至個體。在一些實施例中，編碼變異型ICOSL多肽(其係分泌型免疫調節蛋白)的傳染媒介物視情況在其中傳染媒介物感染腫瘤細胞或免疫細胞且由經感染細胞分泌分泌型免疫調節蛋白之條件下，投與至個體。在一些實施例中，疾病或病況為發炎性或自體免疫性疾病或病況。在一些實例中，疾病或病況為抗中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、血管炎、自體免疫皮膚病、移植、風濕性疾病、發炎性胃腸道疾病、發炎性眼病、發炎性神經疾病、發炎性肺病、發炎性內分泌疾病或自體免疫性血液學疾病。在一些情況下，疾病或病況係選自發炎性腸病、移植、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2017年10月18日申請的名稱為「變異型ICOS配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法」之美國臨時專利申請案62/574,161之優先權，其內容以全文引用之方式併入。
序列表以引用之方式併入
本申請案與電子格式之序列表一起提交。序列表提供為2018年10月13日創建的名稱為761612002242SeqList.txt之檔案，其大小為1,655,996位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入。
本文提供免疫調節蛋白，其為或包含展現結合至至少一種靶配位體同源結合配位體(亦稱作反結構蛋白)之活性的ICOS配位體(ICOSL)之變異體或突變體或其特異性結合片段。在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽含有一或多個胺基酸修飾(例如胺基酸取代、缺失或添加)。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾(例如胺基酸取代、缺失或添加)在參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域(例如IgV)中。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽展現改變的，諸如與至少一種同源結合配位體，諸如ICOS、CD28或CTLA-4中之至少一者之提高或降低結合活性或親和力。在一些實施例中，免疫調節蛋白為可溶的。在一些實施例中，免疫調節蛋白為能夠表現於細胞表面上之跨膜免疫調節蛋白。在一些實施例中，本文亦提供一或多種其他免疫調節蛋白，其為含有本文提供之變異型ICOSL多肽及一或多個其他部分或多肽之結合物或融合物。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽及免疫調節蛋白調節免疫學免疫反應，諸如增強或減弱之免疫反應。在一些實施例中，本文提供之變異型ICOSL多肽及免疫調節蛋白可用於治療與失調之免疫反應相關的疾病或病況。
在一些實施例中，所提供變異型ICOSL多肽經由與協同刺激信號傳導分子之相互作用調節T細胞活化。一般而言，抗原特異性T細胞活化需要兩個相異信號。第一信號係藉由T細胞受體(TCR)與存在於抗原呈遞細胞(APC)上之主要組織相容性複合體(MHC)相關抗原之相互作用提供。第二信號與TCR接合協同刺激且為避免T細胞細胞凋亡或惰能所必需。
在一些實施例中，在正常生理條件下，T細胞介導之免疫反應經藉由T細胞受體(TCR)之抗原識別引發且藉由協同刺激及抑制信號(例如免疫檢查點受體)之平衡調節。免疫系統依賴於免疫檢查點受體來預防自體免疫性(即自體耐受性)及保護組織在免疫反應期間，例如在針對病原感染之攻擊期間免受過度損害。然而，在一些情況下，此等免疫調節蛋白可在包括腫瘤之疾病及病況中失調，作為躲避免疫系統之機制。
在一些實施例中，在已知T細胞協同刺激受體中包括CD28，其為均存在於APC上之配位體B7-1 (CD80)及B7-2 (CD86)之T細胞協同刺激受體。此等相同配位體亦可以比針對CD28更大的親和力結合至抑制T細胞受體CTLA4 (細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)；結合至CTLA-4用以下調免疫反應。ICOS (誘導性協同刺激因子)為結合至APC上之ICOS配位體(ICOSL)的另一T細胞協同刺激受體。在一些情況下，亦已知CD28及CTLA-4與ICOSL在一結合位點相互作用，該結合位點重疊於ICOSL與T細胞協同刺激受體ICOS之結合(Yao等人 (2011) Immunity, 34:729-740)。儘管CD28及ICOS為相關CD28家族活化受體且共用一些胞內信號傳導基元，但CD28與ICOS之間的協同刺激效應不同。舉例而言，CD28表現於未活化及活化T細胞兩者上且其信號傳導對於IL-2產生及後續T細胞效應物功能重要。ICOS一般直至T細胞活化之後才表現於T細胞表面上，且活化T細胞上經由ICOS之信號傳導支持特化T細胞亞群分化。因此，在一些情況下，藉由CD28及ICOS之協同刺激產生重疊及互補效應。
在一些態樣中，T細胞表現協同刺激分子CD28及ICOS，其分別與CD80/CD86及ICOSL在抗原呈遞細胞(APC)上相互作用。在淋巴器官中，專業APC (亦即樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞)表現CD80、CD86及ICOSL且接合CD28+/ICOS+ T細胞。在一些實施例中，活化T細胞可隨後分化為效應細胞，諸如CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、IL-17A/F分泌CD4+ Th17細胞或CD4+濾泡輔助(TFH )細胞。表現TFH 之CD40L接合淋巴毛囊中之B細胞且釋放細胞介素(例如IL-21)，誘導將B細胞分化為抗體(Ab)分泌漿細胞。漿細胞可在人體內產生組織破壞抗體，例如類風濕性因子(RF)及抗瓜胺酸化肽抗體(ACPA)，及在小鼠體內產生抗膠原蛋白(CII)抗體，其可在關節及其他組織中形成免疫複合體及沈積物。ICOSL亦可表現於非專業APC上，導致非淋巴組織中之T細胞活化及對組織及關節之進一步破壞。
在一些態樣中，CD4+Th1-、Th9-及Th17細胞藉由在多發性硬化症及實驗性自體免疫性腦脊髓炎兩者中增加CNS內之發炎而表明為多發性硬化症(MS)之關鍵促成因素，且CD4+ICOS+CXCR5+ T濾泡輔助細胞在復發緩解型PBMC中增加且與繼發進展型MS中之疾病進展相關。在一些實施例中，在繼發進展型MS之腦脊髓液細胞中存在顯著增加之ICOS基因表現，且觀測到總單核球及表現ICOSL之單核球之百分比增加。ICOSL亦表現於非專業APC上，導致非淋巴組織中之T細胞活化及另外的組織損傷。
在所提供變異型ICOSL多肽中包括當經參考ICOSL多肽之IgSF域之一或多個胺基酸修飾修飾時對於CD28及/或ICOS展現增強之結合親和力的多肽。在一些情況下，所提供變異體中之ICOS結合的總體增加小於CD28結合中之增加，因為相比於CD28，野生型ICOSL已對於ICOS展示基本上更大結合親和力。亦提供所提供變異型多肽之各種型式。如本文所示，替代型式可促進免疫反應之操縱，且因此促進治療應用。舉例而言，在本文中顯示遞送可溶型式之增強型ICOSL蛋白質藉由抑制CD28及/或ICOS信號傳導而拮抗T細胞活化。在其他實例中，將變異型ICOSL分子繫栓至表面藉由提供共刺激信號而促進T細胞活化。提供各種繫栓策略以定位T細胞共刺激信號之遞送，包括但不限於直接塗佈至塑膠、使用另一變異型IgSF域來定位至盤結合或細胞表面表現之蛋白質標靶，或將變異型ICOSL融合至腫瘤特異性單株抗體。
在一些實施例中，相比於其他治療，藉由所提供變異型ICOSL多肽及免疫調節多肽達成之免疫信號傳導之調節提供治療發炎性及自體免疫性病症及其他疾病及病況的優勢。在一些情況下，干預及改變兩種受體之協同刺激效應之療法受限於空間定向要求以及藉由免疫突觸之限制強加之尺寸限制。在一些態樣中，現有治療藥物，包括抗體藥物可能不能夠與參與調節此等相互作用之多個靶蛋白同時相互作用。另外，在一些情況下，現有治療藥物可僅具有拮抗能力，但不促效免疫反應。另外，獨立地靶向此兩個受體中之一者或另一者之藥物之間的藥物動力學差異可在整個處理過程中恰當地維持此類藥物組合之所需血液濃度中產生困難。
在一些實施例中，所提供變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白調節(例如增加或減少)藉由協同刺激受體CD28或ICOS誘導之免疫活性。因此，在一些實施例中，所提供多肽藉由提供變異型ICOSL (誘導性協同刺激因子配位體)而克服此等限制，變異型ICOSL具有改變(例如增加或減少)的針對CD28及ICOS兩者，及在一些情況下針對CTLA-4之結合親和力，進而促效或拮抗藉由受體之互補協同刺激效應。亦提供製造及使用此等變異型ICOSL之方法。
在一些態樣中，所提供分子亦可比其他可溶治療蛋白試劑更有效。舉例而言，已顯示阿巴西普(abatacept)(CTLA-4-Fc)干擾T細胞協同刺激以減弱自體免疫疾病情況下之T細胞反應，諸如用於治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎及幼年特發性關節炎，貝拉西普(belatacept)，一種變異型CTLA-4-Fc分子，用於移植排斥反應。然而，此等CTLA-4-Fc蛋白質結合至CD80及CD86且阻止此等協同刺激配位體僅接合及觸發CD28。本文提供之變異型ICOSL多肽在一些情況下對於CD28及ICOS兩者展現結合親和力及增強之活性。
此外，使變異型多肽以各種組態型式化以(取決於情境)拮抗或促效免疫反應之能力基於變異型ICOSL對於結合配位體相同的經增加結合及活性而在治療應用中提供靈活性。在一些實施例中，可針對所需治療應用選擇特定型式。舉例而言，如所描述，包含變異型ICOSL多肽之免疫調節多肽將以例如Fc-融合蛋白之型式提供，以拮抗或阻斷其同源結合配位體，例如ICOS及/或CD28之活性。在一些實施例中，經由CD28或ICOS阻斷或抑制協同刺激信號傳導可適用於抑制免疫反應，其可適用於治療發炎性或自體免疫病症(例如多發性硬化症或腦部炎症)，或器官移植。舉例而言，將變異型ICOSL蛋白繫栓至表面可遞送局部共刺激信號，其在一些態樣中可用於靶向腫瘤組織以將局部協同刺激遞送至腫瘤浸潤性T細胞。大部分原發性腫瘤不具有諸如CD80、CD86或ICOSL之協同刺激分子表現，且因此T細胞抗腫瘤反應可遭受不具有協同刺激危害(Yu等人 (1998) Int. Immunol. 10:791-797)。藉由使用腫瘤定位部分，諸如定位至B7H6腫瘤細胞之Nkp30或腫瘤特異性抗體將協同刺激域定位至腫瘤細胞，T細胞反應可在不存在表現腫瘤之協同刺激蛋白的情況下增強。本說明書中提及之所有出版物，包括專利、專利申請科學論文及資料庫出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，其程度如同各個別出版物，包括專利、專利申請案、科學論文或資料庫確切地且個別地指示為以引用的方式併入。若本文所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所述之定義相反或另外不一致，則以本文所闡述之定義為準，而非以以引用方式併入本文中的定義為準。
本文使用之章節標題僅出於組織目的而不應被視為限制所述標的物。
I. 定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學術語意欲具有與一般熟習所主張標的物所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，出於清楚起見及/或方便參考，在本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中通常所理解存在實質性差異。
除非在特定情況下另外限制，否則本說明書通篇使用之術語定義如下。除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語、首字母縮寫詞及縮寫一般具有與本發明所涉及之領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。除非另外指明，否則化學及生物化學名稱之縮寫及符號係根據IUPAC-IUB命名法。除非另外指明，否則所有數值範圍包括界定範圍之值以及中間的所有整數值。
如在免疫球蛋白超級家族域之上下文中所用之術語「親和力經修飾」意謂哺乳動物免疫球蛋白超級家族(IgSF)域具有改變之胺基酸序列(相對於對應野生型親本或未經修飾的IgSF域)，以使其相比於親本野生型或未經修飾的(亦即，親和力未經修飾之) IgSF對照域針對其同源結合配位體(或者「反結構」)中之至少一者具有經提高或經降低結合親和力或親合力。此上下文中包括親和力經修飾之ICOSL IgSF域。在一些實施例中，親和力經修飾之IgSF域可在參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域中含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸差異，諸如胺基酸取代。結合親和力或親合力之增加或減少可使用熟知結合分析，諸如流動式細胞測量術測定。Larsen等人, American Journal of Transplantation, 第5卷: 443-453 (2005)。亦參見Linsley等人, Immunity, 第1卷: 793-801 (1994)。蛋白質針對其同源結合配位體之結合親和力或親合力的增加為大於野生型IgSF域對照至少10%，且在一些實施例中大於野生型IgSF域對照值至少20%、30%、40%、50%、100%、200%、300%、500%、1000%、5000%或10000%的值。蛋白質針對其同源結合配位體中之至少一者之結合親和力或親合力的減少為不大於對照之90%但不小於野生型IgSF域對照值之10%，且在一些實施例中不大於野生型IgSF域對照值之80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%但不小於10%的值。親和力經修飾之蛋白質藉由胺基酸殘基之取代、添加或缺失在一級胺基酸序列中改變。術語「親和力經修飾之IgSF域」不視為對於產生親和力經修飾之IgSF域之任何特定起始組合物或方法強加任何條件。因此，本發明之親和力經修飾之IgSF域不限於接著藉由親和力修飾之任何特定方法轉化為親和力經修飾之IgSF域的野生型IgSF域。親和力經修飾之IgSF域多肽可例如如下地產生：自野生型哺乳動物IgSF域序列資訊開始，接著對於結合至其同源結合配位體進行電腦模擬，且最後重組或化學合成以產生主題親和力經修飾之IgSF域組合物。在另一替代實例中，親和力經修飾之IgSF域可藉由野生型IgSF域之定點誘變產生。因此，親和力經修飾之IgSF域表示產物且不一定為藉由任何給定方法產生之產物。可採用包括重組方法、化學合成或其組合之多種技術。
如本文所用之術語「同種異體」意謂自一個生物體移除且接著輸注或授受性轉移至相同物種之基因不同之生物體中的細胞或組織。在本發明的一些實施例中，物種為鼠類或人類。
如本文所用之術語「自體」意謂自相同生物體移除細胞或組織，其隨後輸注或授受性轉移至該相同生物體。自體細胞或組織可藉由例如重組DNA方法改變，以使其不再與自生物體移除之天然細胞或天然組織基因上相同。舉例而言，天然自體T細胞可藉由重組DNA技術基因工程改造以變為表現跨膜免疫調節蛋白及/或嵌合抗原受體(CAR)之自體工程改造細胞，其在一些情況下包含對T細胞或TIL (腫瘤浸潤性淋巴細胞)進行工程改造。工程改造細胞接著輸注至患者中，天然T細胞分離自該患者。在一些實施例中，生物體為人類或鼠類。
如本文所用之術語「結合親和力」及「結合親合力」分別意謂蛋白質在特異性結合條件下針對其反結構之特異性結合親和力及特異性結合親合力。在生物化學動力學中，親合力係指諸如ICOSL與其反結構ICOS及/或CD28之間的個別非共價結合相互作用之多個親和力的累積強度。因此，親合力不同於親和力，其描述單一相互作用之強度。含有親和力經修飾之ICOSL IgSF域之變異型ICOSL與其反結構之結合親和力的增加或衰減係相對於未經修飾的ICOSL，諸如含有天然或野生型IgSF域，諸如IgV域之未經修飾的ICOSL之結合親和力測定。測定結合親和力或親合力之方法為此項技術中已知。參見例如Larsen等人, American Journal of Transplantation, 第5卷: 443-453 (2005)。在一些實施例中，本發明之變異型ICOSL (亦即含有親和力經修飾之IgSF域的ICOSL蛋白質)以產生相比於諸如實例6中所述之結合分析中之野生型ICOSL對照大至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之平均螢光強度(MFI)值的結合親和力特異性結合至CD28及/或ICOS (藉由流動式細胞測量術來量測)。
術語「生物半衰期」係指物質，諸如包含本發明之變異型ICOSL之免疫調節多肽損失一半其藥理學或生理學活性或濃度所需之時間的量。生物半衰期可藉由物質之消除、分泌、降解(例如酶)，或吸收及濃縮於某些身體器官或組織中而影響。在一些實施例中，生物半衰期可藉由測定物質之血漿濃度達到一半其穩態水準所需之時間(「血漿半衰期」)來評估。可用於衍生及增加本發明之多肽之生物半衰期的結合物為此項技術中已知的且包括但不限於聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、XTEN (延伸重組肽；參見WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂質(醯化)及聚-Pro-Ala-Ser (PAS)、聚麩胺酸(麩胺醯化)。
如本文所用之術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指表現於包含至少胞外域、跨膜域及胞內域之哺乳動物細胞上之人工(亦即，人造)跨膜蛋白。視情況，CAR蛋白質包括「間隔子」，其共價連接胞外域與跨膜域。間隔子通常為經由肽鍵連接胞外域與跨膜域之多肽。CAR通常表現於哺乳動物淋巴細胞上。在一些實施例中，CAR表現於哺乳動物細胞，諸如T細胞或腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)上。表現於T細胞上之CAR在本文中稱為「CAR T細胞」或「CAR-T」。在一些實施例中，CAR-T為T輔助細胞、細胞毒性T細胞、自然殺手T細胞、記憶T細胞、調節T細胞或γ δ T細胞。當臨床上用於例如授受細胞轉移時，對患者之腫瘤具有抗原結合特異性之CAR-T通常經工程改造以表現於獲自患者之天然T細胞上。表現CAR之工程改造T細胞接著輸注回患者中。CAR-T因此通常為自體CAR-T，而同種異體CAR-T包括於本發明之範疇內。CAR之胞外域包含在生理條件下與靶抗原，諸如腫瘤特異性抗原特異性結合之抗原結合區，諸如抗體或其抗原結合片段(例如scFv)。在特異性結合後，事件(亦即，信號轉導)之生物化學鏈導致CAR-T之免疫活性的調節。因此，舉例而言在藉由CAR-T之抗原結合區特異性結合至其靶抗原後可導致T細胞活性之免疫活性的變化，如由細胞毒性、增殖或細胞介素產生之變化所反映。CAR-T活化後的信號轉導係在一些實施例中藉由參與天然哺乳動物T細胞之信號轉導的CD3-ζ鏈(「CD3-z」)達成。CAR-T可進一步包含多個信號傳導域，諸如CD28、41BB或OX40，以另外調節T細胞之免疫調節反應。CD3-z包含稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)的保守基元，其參與T細胞受體信號轉導。
當參看在活體外分析中藉由存在兩個或多於兩個本發明之變異型ICOSL誘導之細胞介素產生所用之術語「共同地」或「共同的」意謂無關於藉由個別變異型ICOSL誘導之細胞介素產生的總體細胞介素表現量。在一些實施例中，分析之細胞介素為諸如實例6及實例7中所述之活體外初生T細胞分析中之IFN-γ。
參看多肽，諸如參看變異型ICOSL之IgSF域的術語「同源結合配位體」(可與「反結構」互換使用)係指參考多肽在特異性結合條件下特異性結合之至少一個分子(通常為天然哺乳動物蛋白質)。在一些態樣中，含有親和力經修飾之IgSF域的變異型ICOSL特異性結合至對應天然或野生型ICOSL之反結構，但以增加或減小之親和力。所識別且在特異性結合條件下特異性結合至其同源受體之配位體物種為該受體之反結構或同源結合配位體之實例。「同源細胞表面結合配位體」為表現於哺乳動物細胞表面上之同源結合配位體。「細胞表面分子物種」為免疫突觸(IS)之配位體之同源結合配位體，且表現於諸如哺乳動物細胞之細胞上且藉由該等細胞表現，形成免疫突觸。
如本文所用，「結合物」、「結合」或其語法變化形式係指兩種或多於兩種化合物藉由此項技術中已知之任何接合或連接方法接合或連接在一起，導致形成另一化合物。其亦可指藉由將兩種或多於兩種化合物接合或連接在一起產生之化合物。舉例而言，直接地或間接地連接至一或多種化學部分或多肽之變異型ICOSL多肽為例示性結合物。此類結合物包括融合蛋白，藉由化學結合物產生之彼等及藉由任何其他方法產生之彼等。
如本文所用之術語「競爭性結合」意謂蛋白質能夠特異性結合至至少兩種同源結合配位體，但一種同源結合配位體之特異性結合抑制，諸如阻止或杜絕第二同源結合配位體之同時結合。因此，在一些情況下，蛋白質不可能同時結合兩種同源結合配位體。一般而言，競爭性結合子對於特異性結合含有相同或重疊結合位點，但此並非必要條件。在一些實施例中，由於第二同源結合配位體之特異性結合，競爭性結合造成蛋白質與其同源結合配位體中之一者之特異性結合的可量測抑制(部分或完全)。已知多種定量競爭性結合之方法，諸如ELISA (酶聯結免疫吸附劑分析)分析。
如本文所用之術語「保守性胺基酸取代」意謂其中胺基酸殘基經具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之側鏈R基團的另一胺基酸殘基取代之胺基酸取代。具有類似化學特性之側鏈的胺基酸組之實例包括1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。
參看蛋白質之位置，諸如「對應於」所揭示序列(諸如序列表中所闡述)中之核苷酸或胺基酸位置之核苷酸或胺基酸位置之引述的術語「對應於」係指在基於結構序列比對或使用標準比對算法，諸如GAP算法與所揭示序列比對後鑑別之核苷酸或胺基酸位置。舉例而言，對應殘基可藉由如本文中所描述之結構比對方法將參考序列與SEQ ID NO: 32 (ECD域)中闡述或SEQ ID NO: 196或545 (IgV域)中所闡述之序列進行比對而測定。藉由比對該等序列，熟習此項技術者可例如使用保守及一致胺基酸殘基作為引導來鑑別對應殘基。
如本文所用之術語「減少」或「減弱」或「抑制」意謂減少統計顯著量。減少可為對照值，諸如非零對照值之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
如在降低哺乳動物淋巴細胞之免疫活性的情況下在本文所用之術語「降低(decreased/reduced)」意謂相比於對照，諸如未治療之對照或其中使用未經修飾的或非變異型對照之治療用於相同條件下之對照，降低淋巴細胞之一或多種活性。降低之活性可指以下中之一或多者：細胞週期抑制、降低之細胞存活率、減少之細胞增殖、減少之細胞介素產生或降低之T細胞細胞毒性，諸如以統計顯著量。在一些實施例中，提及的降低之免疫活性意謂相比於在不存在治療的情況下減少干擾素γ (IFN-γ)產生，諸如以統計顯著量。在一些實施例中，可在混合淋巴細胞反應(MLR)分析中評估免疫活性。進行MLR分析之方法為此項技術中已知的。Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56。評估淋巴細胞活性之其他方法為此項技術中已知的，包括如本文所述之任何分析。在一些實施例中，增強可為相比於對照值，諸如未治療之對照值或非零對照值減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
術語「衍生物」或「衍生化」係指藉由將蛋白質直接地或間接地共價連接至組合物以改變諸如生物半衰期、生物可用性、免疫原性、溶解度、毒性、效能或功效之特徵，同時保留或增強其治療效益之蛋白質修飾。本發明之免疫調節多肽之衍生物在本發明之範疇內且可藉由例如糖基化、PEG化、脂質化或Fc融合製得。
如本文所用，域(通常為三個或更多個，一般5或7個或更多個胺基酸，諸如10至200個胺基酸殘基之序列)係指之結構上及/或功能上不同於分子之其他部分且可鑑別的一部分分子，諸如蛋白質或編碼核酸。舉例而言，域包括可在由一或多個結構基元構成之蛋白質內獨立地形成摺疊結構及/或藉助於功能活性，諸如結合活性識別之多肽鏈的彼等部分。蛋白質可具有一個或多於一個相異域。舉例而言，域可藉由一級序列或結構與相關家族成員之同源性，諸如與基元之同源性來鑑別、界定或區分。在另一實例中，域可藉由其功能，諸如與生物分子，諸如同源結合配位體相互作用之能力區分。域獨立地可展現生物功能或活性，使得獨立或融合至另一分子之域可進行活動，諸如結合。域可為胺基酸之線性序列或胺基酸之非線性序列。許多多肽含有複數個域。此類域為吾人所知，且可由熟習此項技術者鑑別。為了在本文中進行例證，提供了定義，但應理解，藉由名稱識別特定域完全在此項技術之技能範圍內。必要時，可採用適當軟體來鑑別域。
如本文所用之術語「胞外域」係指處於囊泡膜外部之膜蛋白(諸如跨膜蛋白)區域。胞外域通常包含特異性結合至配位體或細胞表面受體之結合域，諸如經由特異性結合至配位體或細胞表面受體之結合域。細胞跨膜蛋白之胞外域替代地稱為細胞外域。
術語「有效量」或「治療有效量」係指本發明之治療組合物，包括蛋白質組合物或細胞組合物之數量及/或濃度，其在單獨(亦即，呈單一療法形式)或與額外治療劑組合離體(藉由與來自患者之細胞接觸)或活體內(藉由向患者投於)投與時產生疾病進展之統計顯著降低，例如藉由改善或消除疾病之症狀及/或病因。有效量可為減輕、減少或緩解至少一種與疾病或病症相關之症狀或生物反應或效應、預防疾病或病症進展或改善患者之生理功能的量。在細胞療法之情況下，有效量為藉由授受細胞療法向患者投與之細胞的有效劑量或數目。在一些實施例中，患者為哺乳動物，諸如非人類靈長類動物或人類患者。
如本文所用之術語「胞內域」係指一些膜蛋白，諸如跨膜蛋白中發現之區域，其擴展至由細胞表面膜界定之內部空間中。在哺乳動物細胞中，胞內域為膜蛋白之細胞質區。在細胞中，胞內域與細胞內成分相互作用且可在信號轉導中起作用，且因此在一些情況下可為細胞內信號傳導域。細胞跨膜蛋白之胞內域替代地稱為細胞質域，其在一些情況下可為細胞質信號傳導域。
如在增加哺乳動物淋巴細胞之免疫活性的情況下在本文所用之術語「增強」或「增加」意謂相比於對照，諸如未治療之對照或其中使用未經修飾的或非變異型對照之治療用於相同條件下之對照，增加淋巴細胞之一或多種活性。增加之活性可為增加細胞存活、細胞增殖、細胞介素產生或T細胞細胞毒性中之一或多者，諸如增加統計顯著量。在一些實施例中，提及的增加之免疫活性意謂增加干擾素γ (IFN-γ)產生，諸如增加統計顯著量。在一些實施例中，可在混合淋巴細胞反應(MLR)分析中評估免疫活性。進行MLR分析之方法為此項技術中已知的。Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56。評估淋巴細胞活性之其他方法為此項技術中已知的，包括如本文所述之任何分析。在一些實施例中，增強可為比非零對照值大至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%或500%之增加。
如本文所用之術語「工程改造細胞」係指已藉由人工干預，諸如藉由重組DNA方法或病毒轉導遺傳修飾之哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為免疫細胞，諸如淋巴細胞(例如T細胞、B細胞、NK細胞)或抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)。細胞可為來自患者之初生細胞或可為細胞株。在一些實施例中，本發明之工程改造細胞包含本文提供之變異型ICOSL。在一些實施例中，變異型ICOSL為表現於工程改造細胞上的跨膜免疫調節蛋白(在下文中稱為「TIP」)。在一些實施例中，TIP含有細胞外域或其含有連接至跨膜域(例如ICOSL跨膜域)之IgV域的一部分，及視情況存在之細胞內信號傳導域。在一些情況下，TIP型式化為含有異源細胞質信號傳導域或胞內域之嵌合受體。在一些實施例中，工程改造細胞能夠表現及分泌如本文所述之免疫調節蛋白。在提供之工程改造細胞中亦包括另外含有工程改造T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)之細胞。
如本文所用之術語「工程改造T細胞」係指T細胞，諸如T輔助細胞、細胞毒性T細胞(或者，細胞毒性T淋巴細胞或CTL)、自然殺手T細胞、調節T細胞、記憶T細胞或γ δ T細胞，其已藉由人工干預，諸如藉由重組DNA方法或病毒轉導方法遺傳修飾。工程改造T細胞包含本發明之變異型ICOSL跨膜免疫調節蛋白(TIP)或分泌免疫調節蛋白(SIP)，其表現於T細胞上且經工程改造以調節工程改造T細胞自身，或表現於T細胞上之變異型ICOSL特異性結合之哺乳動物細胞的免疫活性。工程改造T細胞可包含本發明之變異型ICOSL分泌免疫調節蛋白(SIP)，其藉由T細胞表現及/或分泌且經工程改造以調節工程改造T細胞自身，或表現於變異型ICOSL當藉由T細胞分泌時特異性結合之哺乳動物細胞的免疫活性。
術語「工程改造T細胞受體」或「工程改造TCR」係指經工程改造而以所需親和力特異性結合至經選擇、選殖及/或隨後引入至T細胞群體中，常用於授受性免疫療法之主要組織相容性複合體(MHC)/肽靶抗原之T細胞受體(TCR)。相比於工程改造TCR，CAR經工程改造而以MHC非依賴性方式結合靶抗原。
如本文所用之術語「表現於……上」係參考表現於細胞，諸如哺乳動物細胞表面上之蛋白質使用。因此，蛋白質表示為膜蛋白。在一些實施例中，表現之蛋白質為跨膜蛋白。在一些實施例中，蛋白質與諸如藥物或可偵測標籤之小分子部分結合。表現於細胞表面上之蛋白質可包括細胞表面蛋白質，諸如表現於哺乳動物細胞上之細胞表面受體。
術語「半衰期延長部分」係指相比於未如此與該部分結合之蛋白質的半衰期，延長哺乳動物血清中循環之蛋白質之半衰期的多肽融合物或化學結合物部分。在一些實施例中，半衰期延長大於或大於約1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些實施例中，相比於無半衰期延長部分之蛋白質，半衰期在活體內投藥之後延長大於6小時、大於12小時、大於24小時、大於48小時、大於72小時、大於96小時或大於1週。半衰期係指蛋白質損失一半其濃度、量或活性所需之時間的量。半衰期可例如藉由使用ELISA分析或活性分析來測定。例示性半衰期延長部分包括Fc域、多聚化域、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、XTEN (延伸重組肽；參見WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂質(醯化)及聚-Pro-Ala-Ser (PAS)及聚麩胺酸(麩胺醯化)。
如本文所用之術語「免疫突觸(immunological synapse/immune synapse)」意謂表現MHC I (主要組織相容性複合體)或MHC II之哺乳動物細胞，諸如抗原呈遞細胞或腫瘤細胞，與哺乳動物淋巴細胞，諸如效應T細胞或自然殺手(NK)細胞之間的界面。
免疫球蛋白分子(亦稱為Fc多肽)之Fc (片段可結晶)區或域在很大程度上對應於免疫球蛋白重鏈之恆定區，且負責各種功能，包括抗體之效應物功能。Fc域含有免疫球蛋白分子之鉸鏈域的一部分或全部加上CH2及CH3域。Fc域可形成藉由一或多個二硫鍵接合之兩條多肽鏈的二聚體。在一些實施例中，Fc為展現降低之(例如降低大於30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大)活性以促進效應物功能的變異型Fc。在一些實施例中，提及的Fc區中之胺基酸取代係藉由EU編號系統，除非參看特定SEQ ID NO描述。EU編號為已知的且係根據最近更新的IMGT Scientific Chart (IMGT®，the international ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org/ IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (創建於2001年5月17日，最近更新：2013年1月10日)及如在Kabat, E.A.等人 Sequences of Proteins of Immunological interest. 第5版 US Department of Health and Human Services, NIH公開號91-3242 (1991)中報導之EU索引。
免疫球蛋白Fc融合物(「Fc-融合物」)，諸如免疫調節Fc融合蛋白為包含可操作地連接於免疫球蛋白之Fc區之一或多個多肽(或一或多個小分子)的分子。Fc-融合物可包含例如抗體(其促進效應物功能及藥代動力學)及變異型ICOSL之Fc區。免疫球蛋白Fc區可間接地或直接地連接至一或多種變異型ICOSL或小分子(融合配位體)。各種連接子為此項技術中已知的且可視情況用於連接Fc與融合配位體以產生Fc-融合物。相同物種之Fc-融合物可二聚以形成Fc-融合均二聚體，或使用不相同物種以形成Fc-融合雜二聚體。在一些實施例中，Fc為哺乳動物Fc，諸如鼠類或人類Fc。
術語「宿主細胞」係指可用於表現由重組表現載體編碼之蛋白質的細胞。宿主細胞可為原核生物，例如大腸桿菌，或其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物細胞(例如菸草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或融合瘤。宿主細胞之實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物，諸如Veggie CHO及生長於無血清培養基中之相關細胞株或CHO菌株DX-B11，其為DHFR缺陷型的。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞(例如人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)。
如本文所用之術語「免疫球蛋白」(縮寫為「Ig」)係指包括五種人類類別之抗體中之任一者的哺乳動物免疫球蛋白：IgA (其包括子類IgA1及IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)及IgM。術語亦包括小於全長之免疫球蛋白，無論完全或部分合成(例如重組或化學合成)或天然產生的，諸如抗原結合片段(Fab)、含有VH 及VL 之可變片段(Fv)、含有在一條鏈中連接在一起的VH 及VL 之單鏈可變片段(scFv)以及其他抗體V區片段，諸如Fab'、F(ab)2 、F(ab')2 、dsFv雙功能抗體、Fc及Fd多肽片段。雙特異性抗體(均雙特異性及雜雙特異性)包括於術語之含義內。
如本文所用之術語「免疫球蛋白超級家族」或「IgSF」意謂參與細胞識別、結合或黏附過程之細胞表面及可溶性蛋白質之組。分子基於與免疫球蛋白(亦即，抗體)之共用結構特徵而分類為此超級家族之成員；其全部具有稱為免疫球蛋白域或摺疊之域。IgSF之成員包括細胞表面抗原受體、免疫系統之輔受體及共刺激分子、參與抗原呈遞至淋巴細胞之分子、細胞黏附分子、某些細胞介素受體及細胞內肌肉蛋白。其通常與免疫系統中之作用相關。免疫突觸中之蛋白質通常為IgSF之成員。IgSF亦可基於諸如功能之共用特性分為「子族」。此類子族通常由4至30個IgSF成員組成。
如本文所用之術語「IgSF域」或「免疫球蛋白域」或「Ig域」係指IgSF蛋白之結構域。Ig域以免疫球蛋白分子命名。其含有約70-110個胺基酸且根據其尺寸及功能分類。Ig域具有特徵性Ig摺疊，其具有由反向平行β股之兩個薄片形成的夾心樣結構。夾心內側上的疏水性胺基酸之間的相互作用及形成於B與F股中之半胱胺酸殘基之間的高度保守二硫鍵使Ig摺疊穩定。Ig域的一端具有稱作互補決定區的部分，其對於抗體針對其配位體的特異性重要。Ig樣域可分類(歸類)為：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大部分Ig域為可變域(IgV)或恆定域(IgC)。具有9個β股之IgV域一般長於具有7個β股之IgC域。IgSF之一些成員的Ig域類似於胺基酸序列中之IgV域，又與IgC域尺寸類似。此等稱作IgC2域，而標準IgC域稱作IgC1域。T細胞受體(TCR)鏈在細胞外部分中含有兩個Ig域；一個IgV域在N端處且一個IgC1域鄰近於細胞膜。ICOSL含有兩個Ig域：IgV及IgC。
如本文所用之術語「IgSF物種」意謂具有相同或基本上相同一級胺基酸序列之IgSF成員蛋白質的集合。各哺乳動物免疫球蛋白超級家族(IgSF)成員定義屬於IgSF成員的所有IgSF物種之獨特標識。因此，各IgSF家族成員相對於其他IgSF家族成員獨特且相應地，特定IgSF家族成員之各物種相對於另一IgSF家族成員之物種獨特。儘管如此，相同IgSF物種之分子之間的變化可歸因於轉譯後修飾，諸如糖基化、磷酸化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙醯化及脂質化中之差異而出現。另外，歸因於基因多形性的單一IgSF物種內之微小序列差異構成單一IgSF物種內之另一變化形式，歸因於例如蛋白質水解性裂解的IgSF物種之野生型截短形式亦如此。「細胞表面IgSF物種」為表現於細胞(一般為哺乳動物細胞)表面上的IgSF物種。
如本文在諸如T細胞之哺乳動物淋巴細胞之情況下所用之術語「免疫活性」係指細胞存活、細胞增殖、細胞介素產生(例如干擾素-γ)或T細胞細胞毒性活性中之一或多者。在一些情況下，免疫活性可意謂細胞介素，諸如趨化因子或介白素之細胞表現。用於測定免疫活性之增強或抑制的分析包括量測培養上清液中之干擾素-γ細胞介素水準的MLR (混合淋巴細胞反應)分析(Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56)、SEB (葡萄球菌腸毒素B) T細胞刺激分析(Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56)及抗CD3 T細胞刺激分析(Li及Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104)。由於T細胞活化係與IFN-γ細胞介素之分泌相關聯，偵測來自此等活體外人類T細胞分析之培養上清液中之IFN-γ水準可使用商業ELISA套組分析(Wu等人, Immunol Lett 2008年4月15日; 117(1): 57-62)。誘導免疫反應導致相對於靜息淋巴細胞之免疫活性增加。如本文所提供之免疫調節蛋白，諸如含有親和力經修飾之IgSF域的變異型ICOSL多肽可相對於野生型IgSF成員或IgSF域對照在一些實施例中增加或在替代實施例中減少初生T細胞分析中之IFN-γ (干擾素-γ)表現。熟習此項技術者將認識到，用於測定IFN-γ表現增加之初生T細胞分析的型式將不同於用於IFN-γ表現減少之分析的型式。在分析本發明之免疫調節蛋白或親和力經修飾之IgSF域減少初生T細胞分析中之IFN-γ表現的能力中，可如實例6中所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)分析。便利地，本發明之親和力經修飾之IgSF域之可溶形式可用於測定其拮抗且因此減少MLR中之IFN-γ表現的能力(同樣如實例6中所述)。或者，在分析本發明之免疫調節蛋白或親和力經修飾之IgSF域增加初生T細胞分析中之IFN-γ表現的能力中，可使用共固定化分析。在共固定化分析中，在一些實施例中藉由抗CD3抗體提供之T細胞受體信號與共固定化親和力經修飾之IgSF域，諸如變異型ICOSL結合用於測定相對於野生型IgSF域對照增加IFN-γ表現之能力。分析工程改造細胞之免疫活性，包括評估變異型ICOSL跨膜免疫調節蛋白之活性的方法為此項技術中已知的且包括但不限於抗原刺激後擴增T細胞、在不存在再刺激的情況下維持T細胞擴增及適當動物模型中之抗癌活性的能力。分析亦包括評估細胞毒性之分析，包括標準51 Cr釋放分析(參見例如Milone等人, (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464)或基於流動之細胞毒性分析，或基於阻抗之細胞毒性分析(Peper等人 (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198)。
「免疫調節多肽」或「免疫調節蛋白」為調節免疫活性之多肽或蛋白分子。「調節(modulation/modulating)」免疫反應意謂提高或降低免疫活性。免疫調節蛋白可為單一多肽鏈或藉由例如鏈間二硫鍵彼此共價結合之至少兩條多肽鏈的多聚體(二聚體或更高階多聚體)。因此，單體、二聚及高階多聚多肽在定義術語之範疇內。多聚多肽可為均多聚體(相同多肽鏈)或雜多聚體(不相同多肽鏈)。本發明之免疫調節蛋白包含變異型ICOSL。
如本文所用之術語「增加」意謂增加統計顯著量。增加可大於非零對照值至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%或更大。
ICOSL (誘導性協同刺激因子配位體；CD275)之「同功異型物」為胺基酸序列不同之複數個天然存在之ICOSL多肽中之一者。同功異型物可為由單一基因表現之RNA轉錄物之剪接變體的產物，或產生功能類似蛋白質之高度類似但不同的基因諸如可產生自基因複製的表現產物。如本文所用，術語ICOSL之「同功異型物」亦指ICOSL基因之不同對偶基因(例如ICOSLG)的產物。
如本文所用之術語「淋巴細胞」意謂哺乳動物免疫系統中之白細胞的三種亞型中之任一者。其包括自然殺手細胞(NK細胞)(其在細胞介導之細胞毒性先天免疫性中起作用)、T細胞(用於細胞介導之細胞毒性適應性免疫性)及B細胞(用於體液、抗體驅動之適應性免疫性)。T細胞包括：T輔助細胞、細胞毒性T細胞、自然殺手T細胞、記憶T細胞、調節T細胞或γ δ T細胞。先天淋巴細胞(ILC)亦包括於淋巴細胞之定義內。
術語「哺乳動物」或「患者」特定包括提及的以下中之至少一者：人類、黑猩猩、恆河猴、食蟹獼猴、狗、貓、小鼠或大鼠。
如本文所用之術語「膜蛋白」意謂在生理條件下直接地或間接地附接至脂質雙層的蛋白質。形成膜之脂質雙層可為生物膜，諸如真核(例如哺乳動物)細胞膜或諸如脂質體上發現之人工(亦即，人造)膜。膜蛋白附接至脂質雙層可藉助於共價附接，或藉助於非共價相互作用，諸如疏水性或靜電相互作用。膜蛋白可為整合膜蛋白或外周膜蛋白。為外周膜蛋白之膜蛋白非共價附接至脂質雙層或非共價附接至整合膜蛋白。外周膜蛋白與脂質雙層形成臨時附接，使得在哺乳動物中之生理條件範圍內，外周膜蛋白可與脂質雙層締合及/或自其解離。相比於外周膜蛋白，整合膜蛋白與膜之脂質雙層形成基本永久附接，使得在哺乳動物中之生理條件範圍內，整合膜蛋白不自其與脂質雙層之附接解離。膜蛋白可藉助於脂質雙層之一個層與膜形成附接(單境)，或藉助於膜之兩個層附接(多境)。僅與一個脂質雙層相互作用之整合膜蛋白為「整合單境蛋白」。與兩個脂質雙層相互作用之整合膜蛋白為「整合多境蛋白」或者在本文中稱為「跨膜蛋白」。
如在免疫反應，諸如哺乳動物免疫反應的情況下在本文所用之術語「調節(modulating/modulate)」係指由於投與包含本發明之變異型ICOSL之免疫調節多肽或由於投與表現免疫調節蛋白，諸如本發明之變異型ICOSL跨膜免疫調節蛋白之工程改造細胞而發生的現有或潛在免疫反應之任何改變，諸如增加或減少。因此，其係指相比於在不投與包含變異型ICOSL之免疫調節蛋白或表現此類免疫調節多肽之細胞的情況下發生或存在的免疫反應的免疫反應之改變，諸如增加或減少。此類調節包括免疫細胞之免疫活性程度的任何誘導、活化、抑制或改變。免疫細胞包括B細胞、T細胞、NK (自然殺手)細胞、NK T細胞、專業抗原呈遞細胞(APC)及非專業抗原呈遞細胞，及發炎性細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、單核球、嗜酸性球及嗜鹼性球)。調節包括賦予現有免疫反應、發展中之免疫反應、潛在免疫反應之任何變化，或誘導、調節、影響或回應於免疫反應之能力。調節包括作為免疫反應之一部分的免疫細胞中之基因、蛋白質及/或其他分子之表現及/或功能的任何改變。調節免疫反應或調節免疫活性包括例如以下各者：免疫細胞之消除、缺失或螯合；誘導或產生可調節其他細胞(諸如自體反應性淋巴細胞、抗原呈遞細胞或發炎性細胞)之功能能力的免疫細胞；在免疫細胞中誘導無反應狀態(亦即，惰能)；增強或抑制免疫細胞之活性或功能，包括但不限於改變藉由此等細胞表現之蛋白質的模式。實例包括改變的某些類別之分子之產生及/或分泌，諸如細胞介素、趨化因子、生長因子、轉錄因子、激酶、協同刺激分子或其他細胞表面受體或此等調節事件之任何組合。調節可例如藉由初生T細胞分析中相對於野生型ICOSL對照之IFN-γ (干擾素γ)表現的改變(參見Zhao及Ji, Exp Cell Res. 2016年1月1日; 340(1) 132-138)。調節可例如藉由相對於經野生型ICOSL跨膜蛋白工程改造之細胞，工程改造細胞之免疫活性的改變，諸如工程改造細胞之細胞毒性活性的改變或工程改造細胞之細胞介素分泌的改變來評估。
如本文所用之術語「分子物種」意謂具有相同或基本上相同一級胺基酸序列之蛋白質的集合。各哺乳動物免疫球蛋白超級家族(IgSF)成員界定相同或基本上相同分子物種之集合。因此，舉例而言，人類ICOSL為IgSF成員且各人類ICOSL分子為ICOS之分子物種。相同分子物種之分子之間的變化可歸因於轉譯後修飾，諸如糖基化、磷酸化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙醯化及脂質化中之差異而出現。另外，歸因於基因多形性的單一分子物種內之微小序列差異構成單一分子物種內之另一變化形式，歸因於例如蛋白質水解性裂解的單一分子物種之野生型截短形式亦如此。「細胞表面分子物種」為表現於哺乳動物細胞表面上的分子物種。兩個或多於兩個不同物種之蛋白質，其各自僅僅存在於形成IS之兩個哺乳動物細胞中之一者上或僅僅存在於另一者上(但不存在於兩者上)，稱為彼此呈「順式」或「順式組態」。兩個不同物種之蛋白質，其中之第一個僅僅存在於形成IS之兩個哺乳動物細胞中之一者上且其中之第二個僅僅存在於形成IS之兩個哺乳動物細胞中之第二者上，稱為呈「反式」或「反式組態」。各自存在於形成IS之兩個哺乳動物細胞中之兩者上的兩個不同物種之蛋白質在此等細胞上呈順式及反式組態。
術語「多聚化域」係指促進多肽分子與一或多個額外多肽分子之穩定相互作用的胺基酸序列，該一或多個額外多肽分子各含有互補多聚化域(例如第一多聚化域及第二多聚化域)，其可為相同或不同多聚化域。在互補多聚化域之間的相互作用，例如第一多聚化域與第二多聚化域之間的相互作用形成穩定蛋白質-蛋白質相互作用以產生多肽分子與額外多肽分子之多聚體。在一些情況下，多聚化域相同且與自身相互作用以在兩條多肽鏈之間形成穩定蛋白質-蛋白質相互作用。一般而言，多肽直接地或間接地接合至多聚化域。例示性多聚化域包括免疫球蛋白序列或其部分、白胺酸拉鏈、疏水性區、親水性區及相容蛋白質-蛋白質相互作用域。多聚化域例如可為免疫球蛋白恆定區或域，諸如Fc域或其來自IgG之部分，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD及IgM及其經修飾形式。
術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換地使用以指呈單股或雙股形式之核酸殘基(例如去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)聚合物。除非明確限制，否則術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物且與其具有類似結合特性且以與天然存在之核苷酸類似之方式代謝的核酸。除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補核苷酸序列以及明確指示之序列(「參考序列」)。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生如下序列來達成，其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代。術語核酸或聚核苷酸涵蓋由基因編碼之cDNA或mRNA。
如本文所用之術語「非競爭性結合」意指蛋白質同時特異性結合至少兩個同源結合配位體之能力。因此，蛋白質能夠同時結合至至少兩種不同同源結合配位體，但結合相互作用不必持續相同持續時間，使得在一些情況下，蛋白質僅特異性結合至同源結合配位體中之一者。在一些實施例中，結合發生於特異性結合條件下。在一些實施例中，同時結合使得一種同源結合配位體之結合基本上不抑制與第二同源結合配位體之同時結合。在一些實施例中，非競爭性結合意謂第二同源結合配位體結合至其於蛋白質上之結合位點不移動第一同源結合配位體結合至其於蛋白質上之結合位點。評估非競爭性結合之方法為此項技術中熟知的，諸如Perez de La Lastra等人, Immunology, 1999年4月: 96(4): 663-670中所述之方法。在一些情況下，在非競爭性相互作用中，第一同源結合配位體特異性結合在不與第二同源結合配位體之相互作用位點重疊之相互作用位點處，使得第二同源結合配位體之結合不直接干擾第一同源結合配位體之結合。因此，藉由第二同源結合配位體之結合對同源結合配位體之結合的任何效應係經由除直接干擾第一同源結合配位體之結合以外的機制。舉例而言，在酶-受質相互作用的情況下，非競爭性抑制劑結合至除酶之活性位點以外的位點。非競爭性結合涵蓋無競爭性結合相互作用，其中第二同源結合配位體特異性結合於不與第一同源結合配位體之結合重疊但僅在第一相互作用位點由第一同源結合配位體佔據時結合至第二相互作用位點的相互作用位點處。
術語「醫藥組合物」係指適合於哺乳動物個體，通常人類中之醫藥用途的組合物。醫藥組合物通常包含有效量的活性劑(例如包含變異型ICOSL之免疫調節多肽或表現變異型ICOSL跨膜免疫調節蛋白之工程改造細胞)及載劑、賦形劑或稀釋劑。載劑、賦形劑或稀釋劑通常分別為醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指經由肽鍵連接之兩個或多於兩個胺基酸之分子鏈。術語不指產物之特定長度。因此，「肽」及「寡肽」包括於多肽之定義內。術語包括多肽之轉譯後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似者。術語亦包括其中包括一或多種胺基酸類似物或非典型或非天然胺基酸(因為可使用已知蛋白質工程改造技術合成或以重組方式表現)之分子。另外，蛋白質可為衍生化的。
如本文所用之術語「初生T細胞分析」係指量測干擾素-γ (「IFN-γ」)表現之活體外分析。多種此類初生T細胞分析為此項技術中已知的，諸如實例7中所述之分析。在一較佳實施例中，使用之分析為抗CD3共固定化分析。在此分析中，初生T細胞係藉由與或不與額外重組蛋白一起固定之抗CD3刺激。培養上清液在通常為24-72小時之時間點收穫。在另一實施例中，使用之分析為MLR。在此分析中，初生T細胞係用同種異體APC刺激。培養上清液在通常為24-72小時之時間點收穫。人類IFN-γ水準係藉由標準ELISA技術在培養上清液中量測。商業套組係購自供應商且分析係根據製造商之推薦進行。
如應用於諸如編碼本發明之免疫調節蛋白之核酸的術語「純化」一般表示如藉由此項技術中熟知之分析技術所測定，基本上不含其他組分之核酸或多肽(例如純化多肽或聚核苷酸在經受密度梯度離心之電泳凝膠、層析溶離液及/或介質中形成離散帶)。舉例而言，在電泳凝膠中產生基本上一個帶之核酸或多肽為「純化的」。本發明之純化核酸或蛋白質之純度為至少約50%，通常純度為至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、99%或更大(例如以重量計或以莫耳計之%)。
術語「重組」指示已藉由人工干預人工(亦即，非天然地)改變之材料(例如核酸或多肽)。改變可對存在於天然環境或狀態中或自其天然環境或狀態移除之材料進行。舉例而言，「重組核酸」為例如在選殖、親和力修飾、DNA改組或其他熟知分子生物程序期間藉由重組核酸製得之核酸。「重組DNA分子」由藉助於此類分子生物技術接合在一起的DNA片段組成。如本文所用之術語「重組蛋白」或「重組多肽」係指使用重組DNA分子表現之蛋白質分子。「重組宿主細胞」為含有及/或表現重組核酸或以其他方式藉由基因工程改造改變，諸如藉由將細胞引入至編碼重組蛋白，諸如本文提供之跨膜免疫調節蛋白之核酸分子中的細胞。真核生物中之轉錄控制信號包含「啟動子」及「增強子」元件。啟動子及增強子由特異性地與參與轉錄之細胞蛋白質相互作用之DNA序列的短陣列組成。啟動子及增強子元件已自包括酵母菌、昆蟲及哺乳動物細胞及病毒中之基因的多種真核來源分離(類似控制元件，亦即啟動子為發現於原核生物中)。特定啟動子及增強子之選擇取決於待用於表現所關注蛋白質之細胞類型。如本文所用之術語「以可操作組合」、「以可操作次序」及「可操作地連接」係指核酸序列以使得產生能夠導引給定基因之轉錄及/或所需蛋白質分子之合成之核酸分子的方式或定向來連接。
如本文所用之術語「重組表現載體」係指含有可操作地連接之編碼序列在特定宿主細胞中之表現必需之所需編碼序列及適當核酸序列的DNA分子。原核生物中之表現必需之核酸序列包括啟動子、視情況存在之操縱序列、核糖體結合位點及可能的其他序列。已知真核細胞可利用啟動子、強化子以及終止及聚腺苷酸化信號。分泌性信號肽序列亦可視情況由可操作地連接於重組蛋白，諸如重組融合蛋白之編碼序列的重組表現載體編碼，以使得表現之融合蛋白可藉由重組宿主細胞分泌，以在必要時更容易地自細胞分離融合蛋白。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因組中的載體。在載體中包括病毒載體，諸如慢病毒載體。
術語「選擇性」係指相比於對於另一受質，諸如主體蛋白質之不同同源結合配位體的特異性結合，主體蛋白質或多肽對於特異性結合一種受質，諸如一種同源結合配位體之偏好。選擇性可反映為主體蛋白質及第一受質，諸如第一同源結合配位體之結合活性(例如結合親和力)(例如Kd1 )與相同主體蛋白質與第二同源結合配位體之結合活性(例如結合親和力)(例如Kd2 )之比。
如本文所用之術語「序列一致性」係指分別在核苷酸或胺基酸水準之基因或蛋白質之間的序列一致性。「序列一致性」為胺基酸水準之蛋白質之間的一致性之量度及核苷酸水準之核酸之間的一致性之量度。蛋白質序列一致性可藉由在序列比對時比較各序列中之給定位置之胺基酸序列而測定。類似地，核酸序列一致性可藉由在序列比對時比較各序列中之給定位置之核苷酸序列而測定。用於比較之序列比對方法為此項技術中熟知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。BLAST算法在兩個序列之間計算序列一致性百分比且進行類似性之統計分析。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information (NCBI))網站公開獲得。
如參考蛋白質在本文所用之術語「可溶」意謂蛋白質不為膜蛋白。一般而言，可溶性蛋白質僅含有IgSF家族成員受體之細胞外域，或其含有一或多個IgSF域或其特異性結合片段之一部分，但不含跨膜域及/或不能夠表現於細胞表面上。在一些情況下，蛋白質之溶解度可藉由直接地或經由連接子間接地連接或附接至Fc域而改良，其在一些情況下亦可改良蛋白質之穩定性及/或半衰期。在一些態樣中，可溶性蛋白質為Fc融合蛋白。
如關於多肽或核酸在本文所用之術語「物種」意指具有相同或基本上相同序列之分子集。相同物種之多肽之間的變化可歸因於轉譯後修飾，諸如糖基化、磷酸化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙醯化及脂質化中之差異而出現。在胺基末端或羧基末端與全長物種相差(或編碼差異)不超過1、2或3個胺基酸殘基之多肽之略微截短序列視為單一物種。此類微觀非均質性為所製造蛋白質之常見特徵。
如參考全長野生型哺乳動物ICOSL多肽或其IgV或IgC域在本文所用之術語「特異性結合片段」意指具有IgV及/或IgC域之子序列且在活體外及/或活體內特異性結合至哺乳動物ICOS及/或哺乳動物CD28，諸如人類或鼠類ICOS或CD28之多肽。在一些實施例中，ICOSL IgV或ICOSL IgC之特異性結合片段為全長野生型序列之序列長度的至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。特異性結合片段可在序列中改變以形成本發明之變異型ICOSL。
如本文所用之術語「特異性結合」意指蛋白質在特異性結合條件下結合至靶蛋白以使得其親和力或親合力為足夠統計尺寸之隨機肽或多肽集合之相同蛋白質之平均親和力或親合力的至少5倍大，但視情況至少10、20、30、40、50、100、250或500倍大，或甚至至少1000倍大的能力。歸因於標靶與非標靶(例如旁系同源物或直系同源物)之間的結構構形類似性，特異性結合蛋白不必排他性地結合至單一靶分子，而可特異性結合至非靶分子。熟習此項技術者將認識到，特異性結合至在不同動物物種(亦即，直系同源物)中具有相同功能之分子或與靶分子具有基本上相同抗原決定基之非靶分子(例如旁系同源物)為可能的，且不減損結合特異性，其係相對於獨特非標靶(例如隨機多肽)之統計學有效集合測定。因此，本發明之多肽可由於交叉反應而特異性結合至靶分子之超過一個相異物種。固相ELISA免疫分析或Biacore量測可用於測定兩個蛋白質之間的特異性結合。一般而言，兩個結合蛋白之間的相互作用之解離常數(Kd )小於1×10- 5 M，且通常低至1×10- 12 M。在本發明之某些實施例中，兩個結合蛋白之間的相互作用之解離常數為1×10- 6 M、1×10- 7 M、1×10- 8 M、1×10- 9 M、1×10- 10 M或1x10- 11 M。
參看表現多肽之哺乳動物細胞的術語「表面表現(surface expresses)」、「表面表現(surface expression)」或「表現於表面上」意謂多肽表現為膜蛋白。在一些實施例中，膜蛋白為跨膜蛋白。
如本文所使用，參看例如合成核酸分子或合成基因或合成肽之「合成」係指藉由重組方法及/或藉由化學合成方法產生之核酸分子或多肽分子。
如本文所用之術語「靶向部分」係指共價或非共價連接至，或物理上囊封包含本發明之變異型ICOSL之多肽的組合物。在一些實施例中，靶向部分對於靶分子，諸如表現於細胞上之靶分子具有特異性結合親和力。通常，靶分子侷限於特定組織或細胞類型。靶向部分包括：抗體、抗原結合片段(Fab)、含有VH 及VL 之可變片段(Fv)、含有在一條鏈中連接在一起之VH 及VL 之單鏈可變片段(scFv)以及其他抗體V區片段，諸如Fab'、F(ab)2 、F(ab')2 、dsFv雙功能抗體、奈米抗體、可溶受體、受體配位體、親和力成熟受體或配位體以及小分子(＜500道爾頓)組合物(例如特異性結合受體組合物)。靶向部分亦可共價或非共價附接至囊封本發明之多肽之脂質體的脂膜。
如本文所用之術語「跨膜蛋白」意指基本上或完全涵括脂質雙層，諸如發現於諸如哺乳動物細胞之生物膜中，或諸如脂質體之人工構築體中之彼等脂質雙層的膜蛋白。跨膜蛋白包含跨膜域(「跨膜域」)，跨膜蛋白藉由跨膜域整合於脂質雙層中且藉此整合在生理條件下為熱力學穩定的。跨膜域一般可經由任何數目之市售生物資訊軟體應用程式，基於其相對於與水性環境(例如)相互作用之蛋白質區較高的疏水性預測自其胺基酸序列。跨膜域通常為涵括膜之疏水性α螺旋。跨膜蛋白可穿過脂質雙層之兩個層一次或多次。跨膜蛋白包括本文所述之所提供跨膜免疫調節蛋白。除跨膜域以外，本發明之跨膜免疫調節蛋白進一步包含胞外域，且在一些實施例中包含胞內域。
如本文所用之術語疾病或病症之「治療(treating/treatment/therapy)」意謂藉由單獨或與如本文所述之另一化合物組合投與本發明之治療組合物(例如含有免疫調節蛋白或工程改造細胞)而減緩、遏止或逆轉疾病或病症進展，如藉由臨床或診斷症狀之減少、中止或消除來證明。「治療」亦意謂急性或慢性疾病或病症之症狀的嚴重度減輕或復發率降低，例如在復發或緩解自體免疫疾病病程的情況下，或在自體免疫疾病之發炎性態樣的情況下為發炎減輕。如在癌症的情況下在本文所用，術語癌症之「治療」或「抑制(inhibit/inhibiting/inhibition)」係指以下中之至少一者：腫瘤生長速率之統計顯著降低、腫瘤生長中止，或腫瘤之尺寸、質量、代謝活性或體積之減小，如藉由諸如(但不限於)實體腫瘤反應評估標準(RECIST)或無進展存活期(PFS)或總存活期(OS)之統計顯著增加的指標所量測。如在本發明之上下文中所用之疾病或病症之「預防(Preventing/prophylaxis/prevention)」係指單獨或與另一化合物組合投與本發明之免疫調節多肽或工程改造細胞以預防疾病或病症或疾病或病症之一些或所有症狀之出現或起始或降低疾病或病症起始之可能性。
如本文所用之術語「腫瘤特異性抗原」或「TSA」係指主要存在於哺乳動物個體之腫瘤細胞上，但一般未發現於哺乳動物個體之正常細胞上之反結構。腫瘤特異性抗原不必為腫瘤細胞獨佔的，但具有腫瘤特異性抗原之特定哺乳動物之細胞的百分比足夠高或腫瘤表面上之腫瘤特異性抗原之水準足夠高，使得其可藉由諸如本發明之免疫調節多肽的抗腫瘤治療劑靶向，且自腫瘤之效應提供哺乳動物之預防或治療。在一些實施例中，在來自具有腫瘤之哺乳動物之細胞的隨機統計樣品中，至少50%顯示TSA之細胞為癌性的。在其他實施例中，至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%顯示TSA之細胞為癌性的。
如參看變異型ICOSL所用之術語「變異型」(亦為「經修飾」或「突變型」)意謂ICOSL，諸如藉由人工干預產生之哺乳動物(例如人類或鼠類)ICOSL。變異型ICOSL為相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL具有改變之胺基酸序列的多肽。變異型ICOSL為與參考ICOSL，諸如野生型ICOSL同功異型物序列不同於一或多個修飾，諸如一或多個胺基酸取代、缺失、添加或其組合的多肽。出於本文之目的，變異型ICOSL含有至少一個親和力經修飾之域，藉此一或多個胺基酸差異出現於IgSF域(例如IgV域)中。變異型ICOSL可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸差異，諸如胺基酸取代。變異型ICOSL多肽一般與對應參考(例如未經修飾的ICOSL)或野生型，例如SEQ ID NO: 5之序列、其成熟序列或其含有其細胞外域或IgSF域之一部分展現至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽與對應參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL，諸如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 196或545中所闡述之參考ICOSL展現至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性。非天然存在之胺基酸以及天然存在之胺基酸包括於容許取代或添加之範疇內。變異型ICOSL不限於任何特定製造方法且包括例如重新化學合成、重新重組DNA技術或其組合。本發明之變異型ICOSL特異性結合至哺乳動物物種之CD28、ICOS及/或CTLA-4。在一些實施例中，改變之胺基酸序列導致相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL蛋白質改變(亦即，增加或減少)的針對ICOS及/或CD28之結合親和力或親合力。結合親和力或親合力之增加或減少可使用熟知結合分析，諸如流動式細胞測量術測定。Larsen等人, American Journal of Transplantation, 第5卷: 443-453 (2005)。亦參見Linsley等人, Immunity, 第1(9)卷: 793-801 (1994)。變異型ICOSL針對ICOS及/或CD28之結合親和力或親合力之增加為大於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL至少5%，且在一些實施例中大於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL對照值至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%的值。ICOSL針對ICOS及/或CD28之結合親和力或親合力之減少為不大於野生型對照值95%，且在一些實施例中不大於野生型ICOS及/或CD28對照值之可偵測結合親和力或親合力80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%，或無可偵測結合親和力或親合力的值。變異型ICOSL藉由胺基酸殘基之取代、添加或缺失在一級胺基酸序列中改變。在變異型ICOSL之情況下的術語「變異型」不視為對於產生變異型ICOSL之任何特定起始組合物或方法強加任何條件。變異型ICOSL可例如如下地產生：自參考ICOSL或野生型哺乳動物ICOSL序列資訊開始，接著對於結合至ICOS及/或CD28進行電腦模擬，且最後重組或化學合成以產生本發明之變異型ICOSL。在另一替代實例中，變異型ICOSL可藉由參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL之定點誘變產生。因此，變異型ICOSL表示組合物且不一定為由任何給定方法產生之產物。可採用包括重組方法、化學合成或其組合之多種技術。
如本文所用之術語「野生型」或「天然」或「原生」係與諸如核酸分子、蛋白質(例如ICOSL)、IgSF成員、宿主細胞及其類似者之生物材料結合使用，係指發現於自然界中且未藉由人工干預修飾之彼等。
II. 變異型ICOSL多肽
本文提供展現改變(增加或減少)的針對ICOSL同源結合配位體中之一或多者之結合活性或親和力的變異型ICOSL多肽。在一些實施例中，ICOSL同源結合配位體為CD28、ICOS或CTLA-4中之一或多者。在一些實施例中，相對於野生型或未經修飾的ICOSL多肽或含有免疫球蛋白超級家族(IgSF)域或其特異性結合片段之野生型或未經修飾的ICOSL之一部分，變異型ICOSL多肽在免疫球蛋白超級家族(IgSF)域(IgD)中含有一或多個胺基酸修飾，諸如一或多個取代(或者，「突變」或「置換」)、缺失或添加。因此，所提供變異型ICOSL多肽為或包含變異型IgD (在下文中稱作「vIgD」)，其中一或多個胺基酸修飾(例如取代)係在IgD處。
在一些實施例中，IgD包含IgV域或IgC (例如IgC2)域或IgV域或IgC (例如IgC2)域之特異性結合片段，或其組合。在一些實施例中，IgD可僅為IgV、IgV及IgC之組合，包括整個細胞外域(ECD)，或ICOSL之Ig域之任何組合。表2提供對應於ICOSL之IgV或IgC區之例示性殘基。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有IgV域或IgC域或其特異性結合片段，其中胺基酸修飾(例如取代)中之至少一者係在IgV域或IgC域或其特異性結合片段處。在一些實施例中，藉助於改變之結合活性或親和力，IgV域或IgC域為親和力經修飾之IgSF域。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)ICOSL序列之序列，變異體在一或多個IgSF域中經修飾。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)ICOSL序列為野生型ICOSL。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL具有天然ICOSL或其直系同源物之序列。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL為或包含ICOSL之細胞外域(ECD)或其含有一或多個IgSF域之一部分(參見表2)。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之細胞外域包含一或多個IgV域及IgC域。然而，變異型ICOSL多肽不必包含一或多個IgV域及IgC域兩者。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含或基本上由IgV域或其特異性結合片段組成。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含或基本上由IgC域或其特異性結合片段組成。在一些實施例中，變異型ICOSL為可溶的且不具有跨膜域。在一些實施例中，變異型ICOSL進一步包含跨膜域且在一些情況下亦包含細胞質域。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列為哺乳動物ICOSL序列。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列可為哺乳動物ICOSL，其包括但不限於人類、小鼠、食蟹獼猴或大鼠。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列為人類。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列具有(i)SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列或其缺乏信號序列之成熟形式，(ii)與SEQ ID NO: 5展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列或其成熟形式，或(iii)為一部分含有IgV域或IgC域或其特異性結合片段之(i)或(ii)。
在一些實施例中，參考ICOSL序列為或包含ICOSL之細胞外域或其一部分。在一些實施例中，參考或野生型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，或其直系同源物。
在一些情況下，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽可包含(i)SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，或(iii)為包含IgV域或IgC域之(i)或(ii)之序列的特異性結合片段。
在一些實施例中，參考ICOSL多肽包含截短之細胞外域，其包含參看SEQ ID NO: 32中闡述之參考ICOSL細胞外域序列的C端截短。在一些實施例中，C端截短至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125個胺基酸殘基。在一些實施例中，C端截短至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35個胺基酸殘基。在一些實施例中，包含C端截短之ICOSL多肽不含野生型ICOSL中從截短點之C端以上之連續胺基酸殘基。因此，在所提供ICOSL參考序列中，為彼等比野生型ICOSL之完整細胞外域(例如SEQ ID NO: 32中所闡述)更短之序列。在一些實施例中，包含C端截短之ICOSL多肽不含或不融合至細胞外域以上的ICOSL域之胺基酸殘基。
在一些實施例中，ICOSL參考多肽在一或多個蛋白酶裂解位點中經改變，諸如突變或缺失。如本文所發現，野生型ICOSL多肽含有蛋白酶裂解位點，其在一些情況下在表現於例如中國倉鼠卵巢細胞之細胞中時導致蛋白質裂解，進而產生多個物種，包括不同長度或尺寸之物種的非均質產物。舉例而言，ICOSL多肽之裂解可發生於SEQ ID NO: 32之殘基207與208之間的LQQN/LT蛋白酶裂解位點處(「/」指示潛在裂解位點)。在一些實施例中，ICOSL參考多肽在如闡述為SEQ ID NO: 32之胺基酸204-209之蛋白酶裂解位點中改變或不具有該蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，相比於野生型或非截短ICOSL多肽，截短ICOSL多肽對蛋白酶裂解更具抗性。不具有全部或一部分LQQN/LT蛋白酶裂解位點之例示性截短之ICOSL多肽ECD截短(指示為截短#2、#3、#4、#5、#6、#7或#8)提供於SEQ ID NO: 600-606中。
截短#2：

截短#3：

截短#4：

截短#5：

截短#6：

截短#7：

截短#8：
在一些實施例中，ICOSL參考多肽在參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209之一或多個胺基酸中改變。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置207及/或208之參考ICOSL或其特異性結合片段中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自N207A、N207G、L208G之胺基酸修飾，例如取代，或其保守胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為N207A/L208G或N207G/L208G。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽之全長參考ECD或截短參考ECD經修飾以含有一或多個選自N207A、N207G、L208G之胺基酸修飾，例如取代，或保守性胺基酸修飾。具有一或多個修飾之例示性全長或截短參考ECD闡述於SEQ ID NO: 607-628中。在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之位置之裂解位點N207及/或L208處含有突變之例示性參考序列闡述於SEQ ID NO: 624-628中。在一些情況下，所提供修飾可減少ICOSL多肽之蛋白酶裂解，諸如可發生於LQQN/LT蛋白酶裂解位點處之裂解。
在一些實施例中，以上截短及修飾策略之組合可用於參考ICOSL ECD序列中。在一些實施例中，修飾，例如取代係在截短之參考ICOSL多肽，諸如SEQ ID NO: 600-606中闡述之例示性參考ICOSL序列中作出。在潛在蛋白酶裂解位點N207及/或L208處具有修飾之例示性變異型ICOSL多肽序列闡述於SEQ ID NO: 607-628中。在一些實施例中，相比於野生型ICOSL多肽，諸如含有SEQ ID NO: 32中闡述之ECD序列，變異型ICOSL多肽展現減少的蛋白酶裂解。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽包含IgV域或IgC域，或其特異性結合片段。在一些實施例中，含有IgV域之ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 196中所闡述之胺基酸序列(對應於SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基19-129)，或其直系同源物。
在一些實施例中，含有IgV域之參考ICOSL多肽含有至少參看SEQ ID NO: 32中所闡述之編號的胺基酸1-112、1-113、1-114、1-115、1-116、1-117、1-118、1-119、1-120、1-121、1-122。在一些實施例中，含有IgV域之ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列(對應於SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基19-140)，或其直系同源物。在一些實施例中，IgV域為ICOSL參考多肽之唯一IgSF域。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之IgV域可含有(i)SEQ ID NO: 196或545中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 196或545具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，或(iii) SEQ ID NO: 196或545中所闡述之胺基酸序列之特異性結合片段或(i)或(ii)之序列的特異性結合片段。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)IgV域能夠結合一或多種ICOSL同源結合蛋白，諸如CD28、ICOS或CTLA-4中之一或多者。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之IgC域包含闡述為SEQ ID NO: 5之殘基141-227的胺基酸序列，或其直系同源物。舉例而言，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之IgC域可含有(i)闡述為SEQ ID NO: 5之殘基141-227的胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 5之殘基141-227具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，或(iii)(i)或(ii)。在一些實施例中，參考IgV域能夠結合一或多種ICOSL同源結合蛋白。
在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽含有ICOSL之特異性結合片段，諸如IgV域或IgC域之特異性結合片段。在一些實施例中，特異性結合片段可結合CD28、ICOS及/或CTLA-4。特異性結合片段之胺基酸長度可為至少50個胺基酸，諸如至少60、70、80、90、100或110個胺基酸。在一些實施例中，IgV域之特異性結合片段含有長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸19-129的IgV域之長度之至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的胺基酸序列。在一些實施例中，IgC域之特異性結合片段包含長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸141-227的IgC域之長度之至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的胺基酸序列。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含ECD域、截短ECD域或其包含一或多個親和力經修飾之IgSF域的一部分。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽可包含IgV域或IgC域，其中IgSF域(IgV或IgC)或IgV域之特異性結合片段或IgC域之特異性結合片段中之一或多者含有一或多個胺基酸修飾(例如取代)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽可包含IgV域及IgC域，或IgV域之特異性結合片段及IgC域之特異性結合片段。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含全長IgV域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含全長IgC域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含IgV域之特異性結合片段。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含IgC域之特異性結合片段。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含全長IgV域及全長IgC域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含全長IgV域及IgC域之特異性結合片段。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含IgV域之特異性結合片段及全長IgC域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含IgV域之特異性結合片段及IgC域之特異性結合片段。
在此類實施例中之任一者中，變異型ICOSL多肽之一或多個胺基酸修飾(例如取代)可位於任何一或多個ICOSL多肽域中。舉例而言，在一些實施例中，一或多個胺基酸取代位於變異型ICOSL多肽之細胞外域(ECD)中，諸如SEQ ID NO: 32中所闡述。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代位於IgV域或IgV域之特異性結合片段中。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾(例如取代)位於IgC域或IgC域之特異性結合片段中。
一般而言，多肽之各種屬性中之每一者分別揭示於下文(例如可溶、分泌型及膜結合多肽；ICOSL針對CD28、ICOS及CTLA-4之親和力；每條多肽鏈之變化數目；連接之多肽鏈的數目；每個變異型ICOSL之胺基酸改變的數目及性質等)。然而，如熟習此項技術者將瞭解，任何特定多肽可包含此等獨立屬性之組合。應理解，提及之胺基酸，包括闡述為用於描述IgSF域之域組織之SEQ ID NO的特定序列僅為達成說明之目的且不意欲限制所提供實施例之範疇。應理解，多肽及其域之描述係基於同源性分析及與類似分子之比對在理論上得出。因此，精確基因座可變化，且不必對於各蛋白質相同。因此，特定IgSF域，諸如特定IgV域或IgC域可長或短若干個胺基酸(諸如一、二、三或四個)。
另外，如下文所論述之本發明的各種實施例在如上文所揭示之定義術語之含義內頻繁提供。特定定義中所述之實施例因此解釋為在定義術語用於論述本文所述之各種態樣及屬性時以引用的方式併入。因此，標題、各種態樣及實施例之呈現次序及各獨立屬性之獨立揭示不意欲限制本發明之範疇。
A. 例示性修飾
本文提供變異型ICOSL多肽，其含有參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽中所含之IgSF域中之至少一個親和力經修飾之IgSF域(例如IgV或IgC)或其特異性結合片段，使得變異型ICOSL多肽相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽展現改變(增加或減少)的針對一或多種配位體ICOS、CD28或CTLA-4之結合活性或親和力。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有不同於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽對照序列的針對CD28、ICOS及/或CTLA-4之結合親和力，如藉由例如固相ELISA免疫分析、流動式細胞測量術或Biacore分析所測定。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽針對CD28、ICOS及/或CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽相對於參考(未經修飾的)或野生型ICOSL多肽針對CD28、ICOS及/或CTLA-4具有經降低結合親和力。CD28、ICOS及/或CTLA-4可為哺乳動物蛋白質，諸如人類蛋白質或鼠類蛋白質。
針對同源結合配位體中之每一者的結合親和力為獨立的；亦即，在一些實施例中，變異型ICOSL多肽相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，針對CD28、ICOS及/或CTLA-4中之一者、兩者或三者具有經提高結合親和力，及針對CD28、ICOS及CTLA-4中之一者、兩者或三者具有經降低結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CTLA-4具有經降低結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及ICOS具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經提高結合親和力及針對ICOS具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及ICOS具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經降低結合親和力及針對ICOS具有經提高結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經提高結合親和力及針對CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經降低結合親和力及針對CTLA-4具有經提高結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOS多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS及CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS具有經提高結合親和力及針對CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS及CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對ICOS具有經降低結合親和力及針對CTLA-4具有經提高結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28、ICOS及CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及ICOS具有經提高結合親和力及針對CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及CTLA-4具有經提高結合親和力及針對ICOS具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28及ICOS具有經降低結合親和力及針對CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經降低結合親和力及針對ICOS及CTLA-4具有經提高結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經提高結合親和力及針對ICOS及CTLA-4具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28、CTLA-4及ICOS具有經降低結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽針對CD28具有經降低結合親和力及針對ICOS及CTLA-4具有經提高結合親和力。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽對照，具有增加或更大的針對CD28、ICOS及/或CTLA-4之結合親和力的變異型ICOSL多肽針對CD28、ICOS及/或CTLA-4之結合親和力將增加至少約5%，諸如至少約10%、15%、20%、25%、35%或50%。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之結合親和力增加為大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此等實例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽與變異型ICOSL多肽具有相同序列，除了其不含一或多個胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽對照，針對CD28、ICOS及/或CTLA-4具有經减小或經降低結合親和力的變異型ICOSL多肽針對CD28、ICOS及/或CTLA-4之結合親和力將減少至少約5%，諸如至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽之結合親和力減少為大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此等實例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽與變異型ICOSL多肽具有相同序列，除了其不含一或多個胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，針對CD28、ICOS及/或CTLA-4之前述實施例中任一者之平衡解離常數(Kd )可小於1×10- 5 M、1×10- 6 M、1×10- 7 M、1×10- 8 M、1×10- 9 M、1×10- 10 M或1×10- 11 M或1×10- 12 M。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有增加或更大的針對CD28之結合親和力。在一些實施例中，相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽對照，具有增加或更大的針對CD28之結合親和力的變異型ICOSL多肽針對CD28之結合親和力將增加至少約25%，諸如至少約30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，具有增加或更大的針對CD28之結合親和力的變異型ICOSL多肽具有小於200 pM、300 pM、400 pM、500 pM或600 pM的針對CD28之平衡解離常數(Kd )。在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL，變異型多肽以增加的選擇性特異性結合至ICOS、CD28或CTLA4中之一者的胞外域。在一些實施例中，增加之選擇性係針對CD28。在一些實施例中，增加之選擇性包含相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽針對一種同源結合配位體相對於另一種同源結合配位體之結合比，變異型ICOSL多肽針對選自ICOS、CD28及CTLA4之一種同源結合配位體相對於另一種同源結合配位體之更大結合比。在一些實施例中，比率大至少或至少約1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更大。
參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列不一定必須用作產生本文所述之變異型ICOSL多肽的起始組合物。因此，使用術語「修飾」，諸如「取代」不暗示本發明實施例限於製造變異型ICOSL多肽之特定方法。變異型ICOSL多肽可例如藉由重新肽合成製得且因此未必需要在改變編碼修飾，例如取代之密碼子之意義上的修飾，諸如「取代」。此原理亦延伸至術語胺基酸殘基之「添加」及「缺失」，其同樣不暗示特定製造方法。設計或產生變異型ICOSL多肽之方法不限於任何特定方法。然而，在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL編碼核酸係誘變自參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL遺傳物質且篩選所需特異性結合親和力及/或IFN-γ表現或其他功能活性之誘導。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽係使用任何數目之公開可用的資料庫處可用的蛋白質或核酸序列重新合成且接著進行後續篩選。國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)提供此類資訊且其網站為經由網際網路公開可訪問的(如同如先前所論述之UniProtKB資料庫)。
除非另外說明，否則如在整個本發明中所指示，胺基酸修飾係藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之序列參考ECD之位置編號的胺基酸位置編號指定。在熟習此項技術者之技能水準內的為鑑別ICOSL多肽，包括其含有其IgSF域(例如IgV)之部分中之修飾，例如胺基酸取代的對應位置，諸如藉由參考序列(例如SEQ ID NO: 196、545、600-628)與SEQ ID NO: 32之比對。在整個本發明中之修飾清單中，胺基酸位置指定於中間，且對應參考(例如未經修飾的或野生型)胺基酸列於該編號之前且鑑別之變異型胺基酸取代列於該編號之後。若修飾為位置之缺失，則指定為「del」，且若修飾為該位置處之插入，則指定為「ins」。在一些情況下，插入以指定於中間之胺基酸位置列出，且對應參考胺基酸列於該編號之前及之後，且鑑別之變異型胺基酸插入列於未經修飾的(例如野生型)胺基酸之後。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。一或多個胺基酸修飾，例如取代可在參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL序列之胞外域(細胞外域)中。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代在IgV域或其特異性結合片段中。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代在IgC域或其特異性結合片段中。在變異型ICOSL多肽之一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代中之一些在IgV域或其特異性結合片段中，且一或多個胺基酸修飾，例如取代中之一些在IgC域或其特異性結合片段中。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸修飾，例如取代。修飾，例如取代可在IgV域或IgC域中。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在IgV域或其特異性結合片段中具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在IgC域或其特異性結合片段中具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽與參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽或其特異性結合片段，諸如與SEQ ID NO: 32、196或545之胺基酸序列具有至少約85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、77、78、75、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之參考ICOSL或其特異性結合片段中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之參考ICOSL或其特異性結合片段中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，此類變異型ICOSL多肽展現改變的與CD28、ICOS及/或CTLA-4中之一或多者之結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽對CD28、ICOS及/或CTLA-4展現出經提高結合親和力。在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽對CD28、ICOS或CTLA-4展現出經降低結合親和力。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、Y47H、T43A、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126T、S126R、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140D、C140del、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190S、T190A、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A、N227K或其保守性胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
保守性胺基酸修飾，例如取代為除參考(例如未經修飾的)或野生型胺基酸以外，與經取代之胺基酸屬於相同胺基酸類別的任何胺基酸。胺基酸類別為脂族(甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)、羥基或含硫(絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸及甲硫胺酸)、環狀(脯胺酸)、芳族(苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、鹼性(組胺酸、離胺酸及精胺酸)及酸性/醯胺(天冬胺酸、麩胺酸鹽、天冬醯胺及麩醯胺酸)。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y,R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T、Q100V、G103E、L102R、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126T、S126R、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140D、C140del、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H,W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A或N227K。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/G103E、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/Q100P、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、Q100R、F138L/L203P、N57Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、L203P、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115Q/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q/N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q、N52H/N84Q/N207Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q、F138L/L203P、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P、S54F/V193A或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之突變中之任一者。表1亦參看參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL或例示性變異型ICOSL多肽之細胞外域(ECD)或IgV域之SEQ ID NO提供例示性序列。如所指示，對應於給定域之精確基因座或殘基可變化，諸如取決於用於對域進行鑑別或分類之方法。另外，在一些情況下，給定域(例如IgV)之相鄰N端及/或C端胺基酸亦可包括於變異型IgSF多肽之序列中，以確保域在表現時之恰當摺疊。因此，應理解，表1中之SEQ ID NOS之例證不應理解為限制性的。舉例而言，變異型ICOSL多肽之特定域，諸如ECD域可比各別SEQ ID NO中所闡述之胺基酸序列長或短若干個胺基酸，諸如長或短1-10個，例如1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之突變中之任一者。在一些實例中，在含有SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列之參考ICOSL、含有SEQ ID NO: 196或545中所闡述之ICOSL之IgV域之參考ICOSL或含有SEQ ID NO: 600-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列之經截短及/或修飾之參考ICOSL中作出突變。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中之任一者)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含多肽序列，其與表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中之任一者)展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中之任一者)之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中之任一者)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含多肽序列，其與表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中之任一者)展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之細胞外域(ECD)序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中之任一者)之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中之任一者)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含多肽序列，其與表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中之任一者)展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中之任一者)之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含多肽序列，其與表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者)展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含表1中所列出之IgV序列中之任一者(亦即SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者)之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸取代。
以「X」指定之突變指示指定位置含有SEQ ID NO: 32之對應位置中所闡述之Q或野生型殘基。
在一些實施例中，相比於諸如包含SEQ ID NO: 32、196或545中闡述之序列的參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽對CD28胞外域展現出經提高親和力。在一些實施例中，相比於諸如包含SEQ ID NO: 32、196或545中闡述之序列的參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL，ICOSL多肽對ICOS胞外域展現出經提高親和力。在一些實施例中，相比於諸如包含SEQ ID NO: 32、196或545中闡述之序列之參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL，ICOSL多肽對CD28胞外域及ICOS胞外域展現出經提高親和力。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有對應於位置52、54或57之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自N52H、N52D、N52Q、N52S、N52Y、N52K、S54A、S54P或N57Y之一或多個胺基酸修飾，例如取代，或其保守性胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自N52H、N52D、N52S、N52K或N57Y之一或多個胺基酸修飾，例如取代，或其保守性胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，除對應於位置52、54或57之位置處之胺基酸修飾，例如取代以外，變異型ICOSL多肽可含有一或多個其他胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個其他胺基酸修飾，例如取代係在對應於10、11、13、16、18、20、25、27、30、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置處。在一些實施例中，一或多個其他胺基酸修飾，例如取代係在參看SEQ ID NO: 32對應於10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置處。
在一些實施例中，變異型ICOSL含有一或多個選自以下之其他胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、T43A、Y47H、N52H、N52D、N52S、N52Y、N52K、N52Q、S54A、S54P、N57D、N57Y、R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100R、Q100K、Q100P、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126T、S126R、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140del、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A、N227K，或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL含有一或多個選自以下之其他胺基酸修飾，例如取代：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R、S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
在上文所述之任何變異型ICOSL多肽之一些實施例中，變異型ICOSL多肽進一步包含對應於SEQ ID NO: 32之位置140之一或多個胺基酸缺失。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自以下之一或多個胺基酸修飾，例如取代：N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140del/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y/Q100P、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52S/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52H/I143T、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q、N52H/N84Q/N207Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R或N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置52、57或100之參考ICOSL或其特異性結合片段中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T或Q100V之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52D、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有參看SEQ ID NO: 32選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52K、N52L、N52M、N52R、N52T、N52V、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自以下之一或多個胺基酸修飾，例如取代：N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52Y/N57Y/F138L/L203P、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52H/N57Y/Q100R/L102R /V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R、N52H/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/V152C/K156M/C198R、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52S/E90A、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、N52H/N57Y/Q100P或N52S/N194D。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R或N52H/N57Y/Q100R/C198R之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R及N52H/N57Y/Q100P之一或多個胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自N52H/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52H/K92R、N52H/C140del/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y/Q100P、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52K/L208P或N52H/I143T之一或多個胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾係選自F120S/Y152H/N201S、E111del、Y33del、N168Q/N207Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N84Q/N119Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q或F138L/L203P。
在一些實施例中，相比於諸如包含SEQ ID NO: 32、196或545中闡述之序列的參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽展現結合CD28或ICOS之胞外域中之一者的提高結合親和力且展現結合至CD28或ICOS之胞外域中之另一者的降低結合親和力。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽對ICOS展現出經提高結合親和力。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代係在對應於16、30、42、52、54、57、75、90、92、100、102、110、113、115、120、122、133、138、143、146、152、156、158、172、194、198、203、208、221、224或225之位置處。在一些實施例中，變異型ICOSL含有一或多個選自以下之胺基酸取代：C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、H115X、I143T、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100K、Q100M、Q100P、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q133H、R221I、R75Q、S54A、S54P、T113E、T225A、V110D、V122A、Y146C、Y152C，或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸取代：N52S、N52H、N52D、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R 、N57Y/F138L/L203P、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R、H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽對ICOS展現出經提高結合親和力且對CD28展現出經降低結合親和力。在一些實施例中，一或多個其他胺基酸取代係在對應於52、57、80、100、130、152、161或198之位置處。在一些實施例中，變異型ICOSL含有選自以下之一或多個胺基酸取代：N52S、N52H、N52Y、N52H、N57Y、L80P、Q100P Q100R、Q100K、V110D、S130G、Y152C、L161P、L161M、C198R、R221G，或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸取代：N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52Y/N57Y/Y152C、N52H/L161P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/L80P、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M/ C198R。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽對CD28展現出經提高結合親和力。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代係在對應於10、11、13、16、18、20、25、27、30、36、40、41、42、52、54、57、63、70、71、72、74、77、80、81、84、88、89、90、91、92、93、94、96、98、99、100、102、107、109、110、113、114、115、117、118、119、120、121、122、126、127、129、130、132、133、135、138、139、140、143、144、146、152、153、154、155、156、158、161、166、168、169、172、173、178、190、192、193、194、198、199、201、203、207、208、209、212、218、221、224、225或227的位置處。
在一些實施例中，變異型ICOSL含有一或多個選自以下之胺基酸取代：A117T、A20V、A71T、A91G、A91G、AE88D、C140del、C198R、D158G、D77G、D90K、E117G、E135K、E16V、E81A、E88D、E90A、F120I、F120S、F138L、F172S、F27C、F92Y、G72R、H115R、H115X、H129P、H94E、I118V、I127T、I143T、I143V、I154F、I218N、I218T、I224V、K156M、K169E、K36G、K42E、K89R、K92R、K93R、L102R、L161P、L166Q、L173S、L203F、L203P、L208P、L209P、L40M、L70Q、L70R、L74Q、L80P、L96I、L98F、M10I、M10V、N115Q、N119Q、N122S、N144D、N155X、N168Q、N168X、N178S、N194D、N207Q、N207X、N227K、N25S、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、N63S、N84Q、Q100A、Q100E、Q100G、Q100K、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、Q133H、R221G、R221I、S109G、S109N、S114T、S121G、S126R、S126T、S130G、S132F、S13G、S18R、S192G、S212G、S25G、S54A、S54P、S99G、T113E、T120S、T130A、T139S、T190A、T199S、T225A、T41I、V107I、V110A、V110D、V11E、V122A、V122M、V193M、V210A、W153R、Y146C、Y152C、Y152H，或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸取代：N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140del/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/D158G、N52D/Q133H、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A、L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S、L70Q/E81A/A91G/ I118V/T120S/I127T/T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V /T120S/T130A、T41I/A91G、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N178S、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、AE88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R、K36G/L40M、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/F120S/N227K、N52S/N194D、N52S/F120S、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/Q100R、N52H/S121G/C198R、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R221I、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/H115R/F172S/C198R、N119Q、N207Q、N52Q/N207X、N168X/N207X、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N119Q N155X、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N207Q、N119Q/N155Q/N168Q、N52H/N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N155X/N168X、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽對CD28展現出經提高結合親和力且對ICOS展現出經降低結合親和力。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代係在對應於52、75或203之位置處。在一些實施例中，變異型ICOSL含有選自N52S、R75Q、L203F或L203P之一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有胺基酸取代N52S/R75Q/L203P。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置16、30、42、52、57、90、100、102、110、115、120、122、138、143、152、156、172、194、198、203、221或224之參考ICOSL或其特異性結合片段中之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自以下之一或多個胺基酸修飾，例如取代：E16V、N30D、K42E、N52H、N52Y、N52S、N57Y、E90A、Q100R、Q100P、L102R、V110D、H115R、F120S、V122A、F138L、I143V、I143T、H152C、K156M、F172S、N194D、C198R、L203P、R221I或I224V。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置115、172或198之參考ICOSL或其特異性結合片段中之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自H115R、F172S或C198R之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R或N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R。在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽展現潛在增強之蛋白質溶解度或增強之蛋白質表現(『溶解度突變』)。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 435-470中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含與SEQ ID NO: 435-470中所闡述之細胞外域(ECD)中之任一者展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代的多肽序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 435-470中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽對CD28展現出經提高結合親和力且對ICOS展現出經提高結合親和力。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代係在對應於16、30、42、52、54、57、90、92、100、102、110、113、115、120、122、133、138、143、146、152、156、158、172、194、198、203、208、212、224或225之位置處。在一些實施例中，變異型ICOSL含有一或多個選自以下之胺基酸取代：C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100E、Q100G、Q100K、Q100M、Q100P、Q100R、Q100S、Q133H、S212G、S54A、S54P、T113E、T225A、V110D、V122A、Y146C、Y152C，或其保守性胺基酸取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有一或多個選自以下之胺基酸取代：N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置52、57、100、138、198或203之參考ICOSL或其特異性結合片段中之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自N52H、N52Y、N57Y、Q100R、Q100P、F138L、C198R或L203P之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為Q100R、F138L/L203P、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、Q100R/F138L或L203P。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 427-433中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含與SEQ ID NO: 427-433中所闡述之細胞外域(ECD)中之任一者展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代的多肽序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 427-433中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 434中闡述之IgV序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含與SEQ ID NO: 434中所闡述之細胞外域(ECD)中之任一者展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代的多肽序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 434中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽在參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置52、84、91、119、155、168、207之參考ICOSL或其特異性結合片段中具有一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自A91S、N52H、N52Q、N84Q、N119Q、N155H、N155Q、N168Q、N207Q之一或多個胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾，例如取代為N84Q、N119Q、N168Q、N207Q、N52Q、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q 、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q、N52H/N84Q/N207Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q或A91S/N119Q/N168Q/N207Q。在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL多肽，變異型ICOSL多肽展現潛在減少之糖基化。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 387-424、427-433、435-470中闡述之IgV序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含與SEQ ID NO: 387-424、427-433、435-470中所闡述之細胞外域(ECD)中之任一者展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代的多肽序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 387-424、427-433、435-470中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 425-426中闡述之IgV序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含與SEQ ID NO: 425-426中所闡述之細胞外域(ECD)中之任一者展現至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性，諸如至少96%一致性、97%一致性、98%一致性或99%一致性且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代的多肽序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 425-426中所闡述之細胞外域(ECD)序列中之任一者之特異性結合片段且含有不存在於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL中之胺基酸修飾，例如取代。
III. 變異型多肽之型式
包含本文提供之變異型ICOSL之免疫調節多肽可以多種方式型式化，包括呈可溶性蛋白質、膜結合蛋白、分泌蛋白、結合物或融合物形式或藉由工程改造細胞或傳染媒介物來表現，如本文中其他地方所描述。在一些態樣中，包含ICOSL之一或多個vIgD之免疫調節多肽或包含多個IgSF域之免疫調節多肽均可以多種方式型式化。
在一些實施例中，可針對所需治療應用選擇特定型式。在一些情況下，包含變異型ICOSL多肽之免疫調節多肽將以拮抗或阻斷其同源結合配位體，例如CD28之活性的型式提供。在一些實施例中，CD28之拮抗作用可適用於治療發炎或自體免疫性。在一些情況下，包含變異型ICOSL多肽之免疫調節多肽將以促效或刺激其同源結合配位體，例如CD28之活性之型式提供。在一些實施例中，CD28之促效作用可適用於治療腫瘤學適應症。熟習此項技術者可易於測定特定型式之活性，諸如針對拮抗或促效一或多種特定同源結合配位體。本文中，包括實例中提供評估此類活性之例示性方法。
在一些實施例中，可溶免疫調節多肽，諸如含有vIgD之變異型ICOSL可囊封於脂質體內，該脂質體自身可與所提供結合物(例如靶向部分)中之任一者或任何組合結合。在一些實施例中，本發明之可溶或膜結合免疫調節多肽為去糖基化的。在更特定實施例中，變異型ICOSL序列為去糖基化的。在更特定實施例中，變異型ICOSL之一或多個IgV及/或IgC (例如IgC2)域為去糖基化的。
所提供型式之非限制性實例描述於圖13A-13C中且進一步描述於下文。
A. 可溶多肽
在一些態樣中，提供包含ICOSL之vIgD的免疫調節多肽。在一些實施例中，含有變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白為可溶性蛋白質。熟習此項技術者應瞭解，細胞表面蛋白質通常具有細胞內域、跨膜域及細胞外域(ECD)且此類蛋白質之可溶形式可使用細胞外域或其免疫活性子序列製得。因此，在一些實施例中，含有變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白不具有跨膜域或跨膜域之一部分。在一些實施例中，含有變異型ICOSL之免疫調節蛋白不具有細胞內(細胞質)域或細胞內域之一部分。在一些實施例中，含有變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白僅包含含有ECD域之vIgD部分或其含有一或多個IgV域及/或IgC (例如IgC2)域之一部分或其含有胺基酸修飾之特異性結合片段。
在一些實施例中，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽可包括一或多種變異型ICOSL多肽。在一些態樣中，一或多個額外IgSF域，諸如一或多個額外vIgD可連接至如本文所提供之ICOSL之vIgD。在一些態樣中，包含ICOSL之一或多個vIgD之免疫調節多肽或包含多個IgSF域之免疫調節多肽均可依諸如第III章節之子章節C中所述之多種方式型式化。
在一些實施例中，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽可包括一或多種本發明之變異型ICOSL多肽。在一些實施例中，本發明之多肽將包含恰好1、2、3、4、5個變異型ICOSL序列。在一些實施例中，變異型ICOSL序列中之至少兩者為相同變異型ICOSL序列。
在一些實施例中，所提供免疫調節多肽包含ICOSL之兩個或多於兩個vIgD序列。多肽鏈內之多個變異型ICOSL多肽可彼此相同(亦即，相同物種)或為不相同(亦即，不同物種)變異型ICOSL序列。除單一多肽鏈實施例以外，在一些實施例中，本發明之多肽中之兩者、三者、四者或更多者可彼此共價或非共價附接。因此，本文提供單體、二聚及高階(例如3、4、5或更多)多聚蛋白。舉例而言，在一些實施例中恰好兩個本發明之多肽可彼此共價或非共價附接以形成二聚體。在一些實施例中，經由鏈間半胱胺酸二硫鍵進行附接。包含兩個或多於兩個本發明多肽的組合物可為相同物種或基本上相同物種之多肽(例如均二聚體)或不同物種之多肽之(例如雜二聚體)。如上所指出，具有複數個連接之本發明多肽之組合物可在各多肽鏈中具有一或多個相同或不同的本發明變異型ICOSL多肽。
在一些態樣中，一或多個額外IgSF域，諸如一或多個額外vIgD，可連接至如本文所提供之ICOSL之vIgD(在下文中稱作「堆疊」或「堆疊之」免疫調節蛋白)。在一些實施例中，所提供免疫調節蛋白之模組化型式可為工程改造或產生免疫調節蛋白提供靈活性，以調控多個反結構(多個同源結合配位體)之活性。在一些實施例中，此類「堆疊」分子可以可溶型式提供，或在一些情況下可提供為膜結合或分泌蛋白。
在一些實施例中，免疫調節蛋白可含有本文提供之變異型ICOSL多肽中之任一者，其直接地或間接地連接至一或多個其他免疫球蛋白超級家族(IgSF)域(「堆疊之」免疫調節蛋白構築體且亦稱作「II型」免疫調節蛋白)。在一些態樣中，此可產生獨特多域免疫調節蛋白，其結合兩個或多於兩個，諸如三個或多於三個同源結合配位體，進而提供免疫突觸之多靶向調節。
在一些實施例中，免疫調節蛋白包含變異型ICOSL域與未發現於野生型IgSF家族成員中之另一IgSF家族成員(例如哺乳動物IgSF家族成員)之一或多個其他親和力經修飾及/或親和力未經修飾之IgSF域序列的組合(「非野生型組合」)及/或配置(「非野生型配置」或「非野生型排列」)。在一些實施例中，免疫調節蛋白含有2、3、4、5或6個免疫球蛋白超級家族(IgSF)域，其中IgSF域中之至少一者為根據所提供描述之變異型ICOSL IgSF域(ICOSL之vIgD)。
在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域，額外IgSF域之序列可為含有一或多個胺基酸修飾，例如取代之經修飾之IgSF域。在一些實施例中，IgSF域可為親和力未經修飾(例如野生型)或親和力已經修飾的。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域可來自小鼠、大鼠、食蟹獼猴或人類來源，或其組合。在一些實施例中，額外IgSF域可為表2中所闡述之IgSF家族成員之IgSF域。在一些實施例中，額外IgSF域可為相比於表2中所闡述之IgSF家族成員中所包含之IgSF域，含有一或多個胺基酸修飾，例如取代之親和力經修飾之IgSF域。
在一些實施例中，額外IgSF域為選自以下之家族之IgSF家族成員中所包含之親和力經修飾或親和力未經修飾之IgSF域：信號調節蛋白(SIRP)家族、表現於骨髓細胞樣上之觸發受體(TREML)家族、癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM)家族、唾液酸結合Ig樣凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白家族、B7家族、CD28家族、含V-集合及免疫球蛋白域(VSIG)家族、V-集合跨膜域(VSTM)家族、主要組織相容性複合體(MHC)家族、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM)家族、白血球免疫球蛋白樣受體(LIR)、黏附分子(Nec)家族、黏附分子樣(NECL)家族、脊髓灰白質炎病毒受體相關(PVR)家族、天然細胞毒性觸發受體(NCR)家族、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白(TIM)家族或殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)家族。在一些實施例中，額外IgSF域獨立地衍生自選自由以下組成之群的IgSF蛋白質：CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD274 (PD-L1、B7-H1)、PDCD1LG2(PD-L2、CD273)、ICOSLG(B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2)、CD276(B7-H3)、VTCN1(B7-H4)、CD28、CTLA4、PDCD1(PD-1)、ICOS、BTLA(CD272)、CD4、CD8A(CD8-α)、CD8B(CD8-β)、LAG3、HAVCR2(TIM-3)、CEACAM1、TIGIT、PVR(CD155)、PVRL2(CD112)、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1(CD200R)及NCR3 (NKp30)。
表2之第一欄提供特定IgSF成員之名稱，且視情況提供該成員之一些可能的同義詞之名稱。第二欄提供UniProtKB資料庫(經由網際網路在uniprot.org處可訪問之公開可用資料庫)之蛋白質標識符，或在一些情況下，提供Genbank編號。通用蛋白質資源(UniProt)為蛋白質序列及註解資料之全面資源。UniProt資料庫包括UniProt知識庫(UniProtKB)。UniProt為歐洲生物資訊研究所(EMBL-EBI)、瑞士生物資訊研究所SIB與蛋白質資訊資源(PIR)之間的合作且主要由來自美國國家衛生研究院(NIH)之撥款支持。GenBank為NIH基因序列資料庫，所有公開可用的DNA序列之註釋集合(Nucleic Acids Research, 2013年1月;41(D1):D36-42)。第三欄提供指定IgSF域所位於之區域。區域指定為範圍，其中域包括界定該範圍之殘基。第3欄亦指示指定IgSF區域之IgSF域類別。第4欄提供指示額外域所位於之區域(信號肽，S；細胞外域，E；跨膜域，T；細胞質域,C)。應理解，域之描述可取決於用於對該域進行鑑別或分類之方法而變化，且可不同地鑑別自不同來源。表2中對應於域之殘基的描述僅用於例證且可長或短若干個胺基酸(諸如一、二、三或四個)。第5欄指示對於一些所列IgSF成員，其同源細胞表面結合配位體中之一些。
在一些實施例中，除了含有變異型ICOSL多肽以外，所提供之免疫調節蛋白亦含有至少1、2、3、4、5或6個額外免疫球蛋白超級家族(IgSF)域，諸如表2中所闡述之IgSF家族成員之IgD域。
在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少一個額外IgSF域(例如第二IgSF域)。在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少兩個額外IgSF域(例如第二及第三IgSF域)。在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少三個額外IgSF域(例如第二、第三及第四)。在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少四個額外IgSF域(例如第二、第三、第四及第五)。在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少五個額外IgSF域(例如第二、第三、第四、第五及第六)。在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少六個額外IgSF域(例如第二、第三、第四、第五、第六及第七)。在一些實施例中，免疫調節蛋白中之IgSF域中之每一者不同。在一些實施例中，額外IgSF域中之至少一者與免疫調節蛋白中之至少一個其他IgSF域相同。在一些實施例中，IgSF域中之每一者係來自或衍生自不同IgSF家族成員。在一些實施例中，IgSF域中之至少兩者係來自或衍生自相同IgSF家族成員。
在一些實施例中，額外IgSF域包含IgV域或一或多個IgC (例如IgC2)域，或IgV域之特異性結合片段或一或多個IgC (例如IgC2)域之特異性結合片段。在一些實施例中，額外IgSF域為或包含全長IgV域。在一些實施例中，額外IgSF域為或包含一或多個全長IgC (例如IgC2)域。在一些實施例中，額外IgSF域為或包含IgV域之特異性結合片段。在一些實施例中，額外IgSF域為或包含一或多個IgC (例如IgC2)域之特異性結合片段。在一些實施例中，免疫調節蛋白含有至少兩個來自單一(相同)IgSF成員之額外IgSF域。舉例而言，在一些態樣中，免疫調節蛋白含有IgSF成員之ECD或其部分，該IgSF成員含有全長IgV域及一或多個全長IgC (例如IgC2)域或其特異性結合片段。
在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少一個額外IgSF域(例如第二IgSF域，或在一些情況下，以及第三IgSF域)，其中至少一個額外(例如第二或第三)IgSF域為SEQ ID NO: 1-27及341中之任一者中所闡述之胺基酸序列中所包含之參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域或其特異性結合片段中所闡述之IgSF域。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域為IgV域或IgC域，諸如IgC1或IgC2域。
在一些實施例中，除了含有變異型ICOSL多肽以外，所提供之免疫調節蛋白亦含有至少一個額外IgSF域(例如一個，或在一些情況下，亦含有第三親和力經修飾之IgSF域，諸如此類)，其中至少一個額外IgSF域為相比於參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域中之IgSF域，諸如表2中所闡述之IgSF家族成員中之IgSF域，含有一或多個胺基酸修飾(例如取代、缺失或突變)之vIgD。在一些實施例中，額外，例如第二或第三親和力經修飾之IgSF域與SEQ ID NO: 1-27及341中之任一者中所闡述之胺基酸序列中所包含之參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域或其特異性結合片段包含至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域為IgV域或IgC域，諸如IgC1或IgC2域。在一些實施例中，額外，例如第二或第三IgSF域為親和力經修飾之IgV域及/或IgC域。在一些實施例中，一或多個額外IgSF域親和力經修飾之IgSF域，其含有IgV域及/或一或多個IgC (例如IgC2)域，或IgV域之特異性結合片段及/或一或多個IgC (例如IgC2)域之特異性結合片段，其中IgV及/或IgC域含有胺基酸修飾(例如取代)。在一些實施例中，一或多個額外親和力經修飾之IgSF域含有IgV域，該IgV域含有胺基酸修飾(例如取代)。在一些實施例中，一或多個額外親和力經修飾之IgSF域包括存在於對應參考IgSF家族成員之ECD或ECD之一部分中的IgSF域，諸如全長IgV域及一或多個全長IgC (例如IgC2)域，或其特異性結合片段，其中IgV及IgC中之一者或兩者含有胺基酸修飾(例如取代)。在一些實施例中，變異型IgSF域多肽之特定域或特定域中之每一者(例如額外，例如第二或第三IgSF域)可比各別SEQ ID NO中所闡述之胺基酸序列長或短若干個胺基酸，諸如長或短1-10個，例如1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
在一些實施例中，所提供之免疫調節蛋白含有至少一個額外(例如第二IgSF域，或在一些情況下，以及第三IgSF域，諸如此類)或第二IgSF域，其為相比於除ICOSL以外之參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域之IgSF域(例如IgV)含有一或多個胺基酸取代之vIgD。
在一些實施例中，相比於參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域中之IgSF域，諸如表2中所闡述之IgSF家族成員中之IgSF域，額外或第二IgSF域含有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，額外或第二親和力經修飾之IgSF域與SEQ ID NO: 1-27中之任一者中所闡述之胺基酸序列中所包含之參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域或其特異性結合片段包含至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性。在一些實施例中，參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域為IgV域或IgC域，諸如IgC1或IgC2域。在一些實施例中，額外或第二IgSF域為親和力經修飾之IgV域或IgC域。表3-5提供例示性多肽，其含有一或多個可用於本文提供之堆疊構築體中的親和力經修飾之IgSF域。
在一些實施例中，一或多個額外IgSF域(例如第二IgSF域)為結合或識別腫瘤抗原之另一IgSF家族成員之IgSF域(例如IgV)。在此類實施例中，IgSF家族成員充當腫瘤定位部分，進而使得ICOSL之vIgD非常接近於腫瘤微環境中之免疫細胞。在一些實施例中，額外IgSF域(例如第二IgSF域)為NKp30之IgSF域，NKp30結合或識別腫瘤細胞上表現之B7-H6。在一些實施例中，至少一個額外(例如第二)IgSF域，例如NKp30為含有一或多個胺基酸修飾(例如取代、缺失或添加)之vIgD。在一些實施例中，相比於參考IgSF域(例如NKp30)，一或多個胺基酸修飾增加針對B7-H6之結合親和力及/或選擇性，諸如增加至少或至少約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。




存在於「堆疊之」免疫調節蛋白構築體(無論非野生型組合或非野生型配置)中之此類親和力未經修飾或親和力經修飾之IgSF域的數目為至少2、3、4或5個且在一些實施例中恰好為2、3、4或5個IgSF域(藉此測定親和力經修飾之IgSF域的數目忽略其任何非特異性結合分數序列及/或其基本上免疫非活性之分數序列)。
在本文提供之堆疊之免疫調節蛋白的一些實施例中，IgSF域的數目為至少2，其中親和力經修飾之IgSF域的數目及親和力未經修飾之IgSF域的數目各獨立地為至少0、1、2、3、4、5或6。因此，親和力經修飾之IgSF域的數目及親和力未經修飾之IgSF域的數目(親和力經修飾之IgSF域:親和力未經修飾之IgSF域)可分別恰好或至少為2:0 ( 親和力經修飾:野生型)、0:2、2:1、1:2、2:2、2:3、3:2、2:4、4:2、1:1、1:3、3:1、1:4、4:1、1:5或5:1。
在堆疊之免疫調節蛋白之一些實施例中，親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域中之至少兩者為相同IgSF域。
在一些實施例中，本文提供之堆疊之免疫調節蛋白包含至少兩個來自單一IgSF成員但呈非野生型配置(或者，「排列」)之親和力經修飾及/或親和力未經修飾之IgSF域。非野生型配置或排列之一個說明性實例為相對於IgSF域序列充當如本文所提供之變異型IgSF域之來源的野生型ICOSL中發現之彼等，包含非野生型次序之親和力經修飾及/或親和力未經修飾之IgSF域序列的免疫調節蛋白。因此，在一個實例中，免疫調節蛋白可包含在跨膜域近端之IgV及在跨膜域遠端之IgC，即使以親和力未經修飾及/或親和力經修飾之形式。本文提供之免疫調節蛋白中存在親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之非野生型組合及非野生型配置兩者亦在所提供主題之範疇內。
在堆疊之免疫調節蛋白之一些實施例中，親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域為不相同(亦即，不同)IgSF域。不相同親和力經修飾之IgSF域在特異性結合條件下特異性結合不同同源結合配位體，且無關於對其進行工程改造之參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF域是否相同而為「不相同」的。因此，舉例而言免疫調節蛋白中至少兩個不相同IgSF域之非野生型組合可包含至少一個源自一ICOSL且來源為該ICOSL所特有的IgSF域序列，及至少一個源自並非ICOSL之另一IgSF家族成員且來源為該IgSF家族成員所特有的第二IgSF域序列，其中免疫調節蛋白之IgSF域呈親和力未經修飾及/或親和力經修飾之形式。然而，在替代實施例中，兩個不相同IgSF域來源於相同IgSF域序列，但至少一個為親和力經修飾的，使其特異性結合至不同同源結合配位體。
堆疊之免疫調節蛋白多肽鏈中之複數個親和力為經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域不必彼此直接共價連接。在一些實施例中，一或多個胺基酸殘基之中間跨度將親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域彼此間接共價連接。連接可經由N端至C端殘基。
在一些實施例中，連接可經由不位於親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之N端或C端的胺基酸殘基之側鏈進行。因此，連接可經由末端或內部胺基酸殘基或其組合進行。
在一些實施例中，兩個或多於兩個IgSF域，包括ICOSL之vIgD及來自另一IgSF家族成員之一或多個額外IgSF域(例如第二或第三變異型IgSF域)為共價或非共價連接的。在一些實施例中，兩個或多於兩個IgSF域直接地或間接地連接，諸如經由連接子。在一些實施例中，一或多個胺基酸殘基之中間跨度將IgSF域彼此間接共價鍵聯。連接可經由N端至C端殘基。在一些實施例中，連接可經由不位於IgSF域之N端或C端的胺基酸殘基之側鏈進行。因此，連接可經由末端或內部胺基酸殘基或其組合進行。
在一些實施例中，免疫調節蛋白含有至少兩個IgSF域，各直接地或經由連接子間接地連接。在一些實施例中，免疫調節蛋白含有至少三個免疫調節蛋白，各直接地或經由連接子間接地連接。各種組態展示於圖 16A 及 16B 中。
在一些實施例中，一或多個「肽連接子」連接ICOSL之vIgD及一或多個額外IgSF域(例如第二或第三變異型IgSF域)。在一些實施例中，肽連接子可為單一胺基酸殘基或更大長度。在一些實施例中，肽連接子具有至少一個胺基酸殘基，但長度不超過20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，連接子為(以單字母胺基酸密碼)：GGGGS (「4GS」；SEQ ID NO: 636)，或4GS連接子之多聚體，諸如2、3、4或5個4GS連接子之重複序列。在一些實施例中，肽連接子為分別如SEQ ID NO: 229及228中所闡述之(GGGGS)2 或(GGGGS)3 。在一些實施例中，連接子亦可單獨包括一系列丙胺酸殘基或外加另一肽連接子(諸如4GS連接子或其多聚體)。在一些實施例中，各系列中之丙胺酸殘基的數目為：2、3、4、5或6個丙胺酸。在一些實施例中，連接子為剛性連接子。舉例而言，連接子為α-螺旋形連接子。在一些實施例中，連接子為(以單字母胺基酸密碼)：EAAAK或EAAAK連接子之多聚體，諸如2、3、4或5個EAAAK連接子之重複序列，諸如SEQ ID NO: 629(1×EAAAK)、SEQ ID NO: 630 (3×EAAAK)或SEQ ID NO: 631 (5×EAAAK)中所闡述。在一些實施例中，連接子可進一步包括藉由選殖及/或自限制位點引入之胺基酸，例如連接子可包括如藉由使用限制位點BAMHI引入之胺基酸GS (以單字母胺基酸密碼)。在一些實施例中，連接子(以單字母胺基酸密碼)為GSGGGGS (SEQ ID NO: 635)。在一些實例中，連接子為2×GGGGS後接三個丙胺酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO: 230)。
在一些實施例中，親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域係藉由在第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之N端及/或C端處插入之「野生型肽連接子」連接。在一些實施例中，存在插入於第一IgSF域之N端處的前導肽連接子及/或插入於第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之C端處的第一尾部序列。在一些實施例中，存在插入於第二IgSF域之N端處的第二前導肽連接子及/或插入於第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之C端處的第二尾部序列。當第一及第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域衍生自相同親本蛋白且沿相同定向連接時，第一與第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之間的野生型肽連接子未經複製。舉例而言，當第一尾部野生型肽連接子及第二前導野生型肽連接子相同時，II型免疫調節蛋白不包含第一尾部野生型肽連接子或第二前導野生型肽連接子。
在一些實施例中，II型免疫調節蛋白包含插入於第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之N端處的第一前導野生型肽連接子，其中第一前導野生型肽連接子在親本IgSF域與緊鄰的前一個域(諸如信號肽或IgSF域)之間包含至少5個(諸如至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個中之任一者)連續胺基酸，其來自衍生第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之野生型蛋白質中之中間序列。在一些實施例中，第一前導野生型肽連接子在親本IgSF域與緊鄰的前一個域(諸如信號肽或IgSF域)之間包含衍生第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域的野生型蛋白質中之整個中間序列。
在一些實施例中，II型免疫調節蛋白進一步包含插入於第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之C端處的第一尾部野生型肽連接子，其中第一尾部野生型肽連接子在親本IgSF域與緊隨的域(諸如IgSF域或跨膜域)之間包含至少5個(諸如至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個中之任一者)連續胺基酸，其來自衍生第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之野生型蛋白質中之中間序列。在一些實施例中，第一尾部野生型肽連接子在親本IgSF域與緊隨的域(諸如IgSF域或跨膜域)之間包含衍生第一親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域的野生型蛋白質中之整個中間序列。
在一些實施例中，II型免疫調節蛋白包含插入於第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之N端處的第二前導野生型肽連接子，其中第二前導野生型肽連接子在親本IgSF域與緊鄰的前一個域(諸如信號肽或IgSF域)之間包含至少5個(諸如至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個中之任一者)連續胺基酸，其來自衍生第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之野生型蛋白質中之中間序列。在一些實施例中，第二前導野生型肽連接子在親本IgSF域與緊鄰的前一個域(諸如信號肽或IgSF域)之間包含衍生第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域的野生型蛋白質中之整個中間序列。
在一些實施例中，II型免疫調節蛋白進一步包含插入於第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之C端處的第二尾部野生型肽連接子，其中第二尾部野生型肽連接子在親本IgSF域與緊隨的域(諸如IgSF域或跨膜域)之間包含至少5個(諸如至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個中之任一者)連續胺基酸，其來自衍生第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域之野生型蛋白質中之中間序列。在一些實施例中，第二尾部野生型肽連接子在親本IgSF域與緊隨的域(諸如IgSF域或跨膜域)之間包含衍生第二親和力未經修飾及/或親和力經修飾之IgSF域的野生型蛋白質中之整個中間序列。
含有CD80 IgSF域之II型蛋白質之例示性前導序列及尾部序列闡述於SEQ ID NO: 231及SEQ ID NO: 232中。含有ICOSL IgSF域之II型蛋白質之例示性前導序列及尾部序列闡述於SEQ ID NO: 233及234中。含有CD86 IgSF域之II型蛋白質之例示性前導序列及尾部序列闡述於SEQ ID NO: 236-238中之任一者中。含有NKp30 IgSF域之II型蛋白質之例示性野生型連接子序列闡述於SEQ ID NO: 235中。
1. 單價
本文提供含有單價變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白。在一些實施例中，單價免疫調節蛋白之變異型ICOSL多肽直接地或間接地連接至另一部分。在一些實施例中，另一部分為蛋白質、肽、小分子或核酸。在一些實施例中，單價免疫調節蛋白為融合蛋白。
在一些實施例中，部分為半衰期延長分子。例示性的此類半衰期延長分子包括但不限於白蛋白、白蛋白結合性多肽、Pro/Ala/Ser (PAS)、人絨毛膜促性腺激素之β次單位之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、長的無特定結構親水性胺基酸序列(XTEN)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合性小分子或其組合。
在一些實施例中，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽可包括由胺基酸Pro、Ala及Ser組成之構形無序多肽序列(參見例如WO2008/155134；SEQ ID NO: 904)。在一些情況下，胺基酸重複序列為至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸殘基，其中各重複序列包含(一個)Ala、Ser及Pro殘基。因此，本文提供為PAS化蛋白之免疫調節蛋白，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至Pro/Ala/Ser (PAS)。在一些實施例中，可使用一或多種額外連接子結構。
在一些實施例中，部分會促進變異型ICOSL多肽之偵測或純化。在一些情況下，免疫調節多肽包含直接地或間接地連接至ICOSL多肽之N端及/或C端之標籤或融合域，例如親和力或純化標籤。各種適合之多肽標籤及/或融合域為吾人所知，且包括但不限於聚組胺酸(His)標籤、FLAG標籤(SEQ ID NO: 865)、Myc標籤及螢光蛋白標籤(例如EGFP，闡述於SEQ ID NO: 858、859或896中)。在一些情況下，免疫調節多肽包含有包含至少六個組胺酸殘基之變異型ICOSL (SEQ ID NO: 864中所闡述)。在一些情況下，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽進一步包含部分之各種組合。舉例而言，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽進一步包含一或多個聚組胺酸標籤及FLAG標籤。
在一些實施例中，ICOSL多肽連接至諸如SEQ ID NO: 472中所闡述的保持於單價形式之經修飾之免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)。
2. 二價
在一些實施例中，含有變異型ICOSL之免疫調節蛋白為多價，諸如二價。在態樣中，免疫調節蛋白直接地或經由連接子間接地連接至多聚化域。在一些態樣中，多聚化域增加分子之半衰期。
兩個或多於兩個變異型ICOSL多肽之相互作用可藉由其直接地或間接地連接至任何本身能夠相互作用以形成穩定結構之部分或其他多肽來促進。舉例而言，獨立的編碼之變異型ICOSL多肽鏈可藉由多聚化接合，從而藉由多聚化域介導多肽之多聚化。通常，多聚化域提供在第一變異型ICOSL多肽與第二變異型ICOSL多肽之間形成穩定蛋白質-蛋白質相互作用。均多聚體或雜多聚體多肽可產生自獨立變異型ICOSL多肽之共表達。第一及第二變異型ICOSL多肽可相同或不同。
在一些實施例中，多聚化域包括任何能夠形成穩定蛋白質-蛋白質相互作用之多聚化域。多聚化域可經由免疫球蛋白序列(例如Fc域；參見例如國際專利公開案第WO 93/10151及WO 2005/063816 US號；美國公開案第2006/0024298號；美國專利案第5,457,035號)；白胺酸拉鏈(例如來自核轉化蛋白fos及jun或原癌基因c-myc或來自氮之一般控制(GCN4))(例如Busch及Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40；Gentz等人, (1989) Science, 243:1695-1699)；疏水區；親水區；或在均二聚體或雜多聚體之嵌合分子之間形成分子間二硫鍵之游離硫醇。另外，多聚化域可包括包含突起之胺基酸序列，其與包含孔之胺基酸序列互補，諸如美國專利第5,731,168號；國際專利公開案第WO 98/50431號及第WO 2005/063816號；Ridgway等人 (1996) Protein Engineering, 9:617-621中所描述。此類多聚化區域可經工程改造以使得空間相互作用不僅促進穩定相互作用，且另外促進自嵌合單體之混合物形成雜二聚體(相比於均二聚體)。一般而言，藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來自第一多肽之界面之小型胺基酸側鏈來構築突起。相同或相似大小與突起的補償性凹穴視情況藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大型胺基酸側鏈而產生於第二多肽之界面上。例示性多聚化域描述於下文。
變異型ICOSL多肽可在任何位置接合，但通常經由其N端或C端接合至多聚化域之N端或C端以形成嵌合多肽。連接可為直接的或經由連接子間接的。另外，嵌合多肽可為融合蛋白或可由化學鍵形成，諸如經由共價或非共價相互作用。舉例而言，當製備含有多聚化域之嵌合多肽時，編碼變異型ICOSL多肽之全部或一部分的核酸能夠直接地或間接地或視情況經由連接子域可操作地連接於編碼多聚化域序列之核酸。在一些情況下，構築體編碼嵌合蛋白，其中變異型ICOSL多肽之C端接合至多聚化域之N端。在一些情況下，構築體可編碼嵌合蛋白，其中變異型ICOSL多肽之N端接合至多聚化域之N端或C端。
多肽多聚體含有兩個嵌合蛋白，其藉由直接地或間接地將兩個相同或不同變異型ICOSL多肽直接地或間接地連接至多聚化域而產生。在一些實例中，其中多聚化域為多肽，編碼變異型ICOSL多肽及多聚化域之基因融合物插入至適當表現載體中。所得嵌合或融合蛋白可表現於經重組表現載體轉化之宿主細胞中，且允許裝配為多聚體，其中多聚化域相互作用以形成多價多肽。多聚化域與變異型ICOSL多肽之化學鍵聯可使用異雙官能連接子實現。
所得嵌合多肽，諸如融合蛋白及自其形成之多聚體可藉由任何適合之方法純化，諸如藉由蛋白A或蛋白G管柱上之親和性層析法。當兩個編碼不同多肽之核酸分子轉型至細胞中時，將出現均二聚體及雜二聚體形成。表現之條件可經調節，以使得雜二聚體形成比均二聚體形成更有利。
免疫球蛋白域
在一些實施例中，免疫調節蛋白包含附接至免疫球蛋白之Fc區的變異型ICOSL多肽(產生「免疫調節Fc融合物」，諸如「ICOSL-Fc變異型融合物」，亦稱為ICOSL vIgD-Fc融合物)。在一些實施例中，ICOSL-Fc變異型融合物亦包含一或多個額外IgSF域，諸如連接至ICOSL之vIgD的一或多個額外vIgD。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽或額外IgSF域之附接係在Fc之N端處。在一些實施例中，變異型ICOSL或額外IgSF域多肽之附接係在Fc之C端處。在一些實施例中，兩個或多於兩個ICOSL或額外IgSF域變異型多肽(相同或不同)在N端處及C端處獨立地附接。
在一些實施例中，Fc為鼠類或人類Fc。在一些實施例中，Fc為哺乳動物或人類IgGl、lgG2、lgG3或lgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc衍生自IgG1，諸如人類IgG1。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 226展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc區含有一或多個修飾以改變(例如減弱)其正常功能中之一或多者。一般而言，Fc區負責效應物功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，外加抗原結合能力，其為免疫球蛋白之主要功能。另外，存在於Fc區中之FcRn序列藉由結合至活體內FcRn受體而增加活體內半衰期來起調節血清中之IgG水準的作用。在一些實施例中，此類功能可在與所提供Fc融合蛋白一起使用之Fc中減弱或改變。
在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾可引入至本文提供之ICOSL-Fc變異型融合物之Fc區中，進而產生Fc區變異體。在一些實施例中，Fc區變異體具有減弱的效應物功能。存在可改變效應物功能的Fc序列之變化或突變的多個實例。舉例而言，WO 2000/42072、WO2006/019447、WO2012/125850、WO2015/107026、US2016/0017041及Shields等人J Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)描述具有提高或減少的與FcR之結合的例示性Fc變異體。彼等出版物之內容以引用之方式特別併入本文中。
在一些實施例中，所提供變異型ICOSL-Fc融合物包含展現減弱的效應物功能之Fc區(亦稱為惰性Fc或無效應Fc)，其使得該Fc區為ICOSL-Fc變異型融合物之活體內半衰期重要但某些效應物功能(諸如CDC及ADCC)為不必要或有害之應用的所需候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保ICOSL-Fc變異型融合物缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初生細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu . Rev . Immunol . 9:457-492 (1991)之第464頁之表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人Proc . Nat ' l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人,Proc . Nat ' l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人,J . Exp . Med . 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.；及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.)。適用於此類分析之效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，所關注分子之ADCC活性可活體內評估，例如在諸如揭示於Clynes等人Proc . Nat ' l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)中之動物模型中。亦可進行C1q結合分析以證實ICOSL-Fc變異型融合物不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J . Immunol . Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S.及M. J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S. B.等人,Int ' l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006))進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定。
具有減弱的效應物功能之ICOSL-Fc變異型融合物包括根據EU編號，Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之彼等(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括根據EU編號，具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或多於兩者處之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
在一些實施例中，ICOSL-Fc變異型融合物之Fc區具有一Fc區，其中位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325及329 (藉由EU編號指定)處之胺基酸中之任何一或多者經相比於天然Fc區之不同胺基酸取代。Fc區之此類改變不限於上述改變，且包括例如以下各者：諸如去糖基化鏈(N297A及N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1- E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A及IgG4-L236E之改變，其描述於Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691中；諸如WO 2008/092117中所述之G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R及N325LL328R之改變；位置233、234、235及237 (藉由EU編號指示)處之胺基酸插入；及WO 2000/042072中所述之位點處之改變。
描述具有提高或降低的與FcR之結合的某些Fc變異體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312、WO2006/019447及Shields等人,J . Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中，提供一種包含變異型Fc區之ICOSL-Fc變異型融合物，該變異型Fc區包含一或多個增加半衰期及/或改良與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的胺基酸取代。具有增加的半衰期及改良的與FcRn之結合之抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)或WO2015107026中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該一或多個取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之彼等：根據EU編號之238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
在一些實施例中，ICOSL-Fc變異型融合物之Fc區包含根據EU編號之一或多個胺基酸取代E356D及M358L。在一些實施例中，ICOSL-Fc變異型融合物之Fc區包含根據EU編號之一或多個胺基酸取代C220S、C226S及/或C229S。在一些實施例中，ICOSL變異型融合物之Fc區包含一或多個胺基酸取代R292C及V302C。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
在一些實施例中，野生型IgG1 Fc可為具有異型之SEQ ID NO: 226中所闡述之Fc，該異型含有根據EU編號在位置356及358處之殘基Glu (E)及Met (M)(例如f異型)。在其他實施例中，野生型IgG1 Fc含有人類G1m1異型之胺基酸，諸如在位置356及358處含有Asp (D)及Leu (L)之殘基，例如如SEQ ID NO: 927中所闡述。因此，在一些情況下，本文提供之Fc可含有胺基酸取代E356D及M358L以復原異型G1 m1之殘基(例如α異型)。在一些態樣中，野生型Fc係藉由一或多個胺基酸取代修飾以降低效應活性或使得Fc對於Fc效應物功能呈惰性。例示性無效應或惰性突變包括本文所述之彼等。在可包括於本文提供之構築體之Fc中之無效應突變中包括根據EU編號之L234A、L235E及G237A。在一些實施例中，野生型Fc藉由移除一或多個半胱胺酸殘基，諸如藉由在根據EU編號之位置220處將半胱胺酸殘基置換為絲胺酸殘基(C220S)而進一步修飾。具有減弱的效應物功能之例示性惰性Fc區闡述於SEQ ID NO: 633或477及SEQ ID NO: 474或637中，其分別基於SEQ ID NO: 226或SEQ ID NO: 927中所闡述之異型。在一些實施例中，用於本文提供之構築體中之Fc區可另外缺乏C端離胺酸殘基。
在一些實施例中，在Fc區中作出導致降低之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的改變，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人,J . Immunol . 164: 4178-4184 (2000)中所述。
在一些實施例中，提供包含有包含一或多個胺基酸修飾之變異型Fc區的ICOSL-Fc變異型融合物，其中變異型Fc區衍生自IgG1，諸如人類IgG1。在一些實施例中，變異型Fc區衍生自SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc展現減弱的效應物功能。在一些實施例中，Fc含有至少一個胺基酸取代，其為根據SEQ ID NO: 226之編號的N82G (對應於根據EU編號之N297G)。在一些實施例中，Fc另外含有至少一個胺基酸取代，其為根據SEQ ID NO: 226之編號的R77C或V87C (對應於根據EU編號之R292C或V302C)。在一些實施例中，變異型Fc區進一步包含根據SEQ ID NO: 226之編號的C5S胺基酸修飾(對應於根據EU編號之C220S)。舉例而言，在一些實施例中，變異型Fc區包含以下胺基酸修飾：根據EU編號之V297G及以下胺基酸修飾C220S、R292C或V302C中之一或多者(對應於參看SEQ ID NO: 226之N82G及以下胺基酸修飾C5S、R77C或V87C中之一或多者)，例如Fc區包含SEQ ID NO: 476中闡述之序列。在一些實施例中，變異型Fc區包含胺基酸修飾C220S、L234A、L235E或G237A中之一或多者，例如Fc區包含SEQ ID NO: 477中闡述之序列。在一些實施例中，變異型Fc區包含胺基酸修飾C220S、E233P、L234V、L235A、G236del或S267K中之一或多者，例如Fc區包含SEQ ID NO: 478中闡述之序列。在一些實施例中，變異型Fc包含胺基酸修飾C220S、L234A、L235E、G237A、E356D或M358L中之一或多者，例如Fc區包含SEQ ID NO: 474中闡述之序列。
在一些實施例中，Fc區不具有對應於SEQ ID NO: 56中所闡述之參考(例如未經修飾的)或野生型Fc之位置232的C端離胺酸(對應於根據EU編號之K447del)。在一些實施例中，由於C端離胺酸可在生物合成期間不同地移除，C端離胺酸殘基之移除在蛋白質表現於細胞中時產生更均質產物。在一些態樣中，此類Fc區可另外包括一或多個額外修飾，例如胺基酸取代，諸如如所描述之任何胺基酸取代。例示性的此類Fc區闡述於SEQ ID NO: 632、633、634或637中。
在一些實施例中，提供一種包含變異型Fc區之ICOSL-Fc變異型融合物，其中變異型Fc包含SEQ ID NO: 474、476、477、478、507、632、633、634或637中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 474、476、477、478、507、632、633、634或637中之任一者中所闡述之胺基酸序列展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc展現減弱的效應物功能。
在一些實施例中，Fc衍生自IgG2，諸如人類IgG2。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID NO: 227中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 227展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc包含SEQ ID NO: 505中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 505展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IgG4 Fc為其中人類IgG4之CH3域經人類IgG1之CH3結構域取代且其展現經抑制之聚集體形成的穩定Fc；其中人類IgG4之CH3及CH2域分別經人類IgG1之CH3及CH2域取代之抗體；或其中人類IgG4之由Kabat等人提出之EU索引中指示之位置409處之精胺酸經離胺酸取代且其展現經抑制之聚集體形成的抗體(參見例如美國專利第8,911,726號)。在一些實施例中，Fc為含有S228P突變之IgG4，已顯示其預防治療抗體與內源性IgG4之間藉由Fab臂交換的重組(參見例如Labrijin等人 (2009) Nat. Biotechnol., 27(8)767-71)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID NO: 506中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 506展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽直接連接至Fc序列。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽間接連接至Fc序列，諸如經由連接子。在一些實施例中，一或多個「肽連接子」連接變異型ICOSL多肽及Fc域。在一些實施例中，肽連接子可為單一胺基酸殘基或更大長度。在一些實施例中，肽連接子具有至少一個胺基酸殘基，但長度不超過20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子為三個丙胺酸(AAA)。在一些實施例中，連接子為(以單字母胺基酸密碼)：GGGGS (「4GS」；SEQ ID NO: 636)或4GS連接子之多聚體，諸如2、3、4、5或6個4GS連接子之重複序列，諸如SEQ ID NO: 229 (2×GGGGS)或SEQ ID NO: 228 (3×GGGGS)中所闡述。在一些實施例中，連接子為剛性連接子。舉例而言，連接子為α-螺旋形連接子。在一些實施例中，連接子為(以單字母胺基酸密碼)：EAAAK或EAAAK連接子之多聚體，諸如2、3、4或5個4GS連接子之重複序列，諸如SEQ ID NO: 629 (EAAAK)或SEQ ID NO: 630 (3×EAAAK)或SEQ ID NO: 631 (5×EAAAK)中所闡述。在一些實施例中，連接子以一或多個EAAAK單元起始且可藉由添加A、AA、AAA、AAAA、EAAAA及EAAAK序列而延長。在一些實施例中，連接子可進一步包括藉由選殖及/或自限制位點引入之胺基酸，例如連接子可包括如藉由使用限制位點BAMHI引入之胺基酸GS (以單字母胺基酸密碼)。在一些實施例中，連接子(以單字母胺基酸密碼)為GSGGGGS (SEQ ID NO: 635)。在一些實例中，連接子為2×GGGGS後接三個丙胺酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO: 230)。
在一些實施例中，變異型ICOSL-Fc融合蛋白為由兩個連接至Fc域之變異型ICOSL Fc多肽形成之二聚體。在一些特定實施例中，ICOSL-Fc變異型融合多肽之相同或基本上相同物種(允許3個或更少N端或C端胺基酸序列差異)將二聚以產生均二聚體。在一些實施例中，二聚體為均二聚體，其中兩個變異型ICOSL Fc多肽相同。或者，ICOSL-Fc變異型融合多肽之不同物種可二聚以產生雜二聚體。因此，在一些實施例中，二聚體為雜二聚體，其中兩個變異型ICOSL Fc多肽不同。
在一些實施例中，提供含有變異型ICOSL多肽之變異型ICOSL-Fc融合蛋白，該變異型ICOSL多肽包括如第II部分中所述之直接地或間接地連接至Fc區之參考ICOSL中之一或多個胺基酸修飾。在一些實施例中，ICOSL-Fc融合物之變異型ICOSL在SEQ ID NO: 545中所闡述之參考IgV域之胺基酸序列中含有一或多個胺基酸修飾。在特定情況下，此類免疫調節蛋白含有變異型ICOSL多肽，該變異型ICOSL多肽含有IgV域，諸如SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者中所闡述之IgV域，或與SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性且含有各別SEQ ID NO之一或多個胺基酸修飾的IgV域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有對CD28或ICOS展現出經提高結合親和力之IgSF域(例如IgV域)，諸如本文所述之胺基酸修飾中之任一者。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有IgSF域(例如IgV域)，其含有一或多個胺基酸修飾，例如參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置52、57或100之參考ICOSL或特異性結合片段中之取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自以下之一或多個胺基酸修飾，例如取代：N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T或Q100V。例示性的此類變異型分子包括如本文所述之任何變異型分子。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52H/N57Y/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 565中所闡述之IgV域)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52D (例如為或包括SEQ ID NO: 548中所闡述之IgV域)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52H/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 567中所闡述之IgV域)，在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52L/N57H/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 761中所闡述之IgV域)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52H/N57Y/Q100P (例如為或包括SEQ ID NO: 570中所闡述之IgV域)。
在一些實施例中，變異型ICOSL之IgSF域(例如IgV)融合至Fc多肽。在特定實施例中，Fc多肽為展現減弱的效應物功能之人類IgG1 Fc區之變異體，諸如如所描述之任何變異體。在一些實施例中，Fc區為含有胺基酸修飾N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A之人類IgG1，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實施例中，變異型IgG1 Fc區另外含有胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實施例中，Fc區含有K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些態樣中，Fc區含有SEQ ID NO: 474、476、477、478、633或637中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 474、476、477、478、633或637中之任一者展現至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有各別SEQ ID NO之胺基酸取代之胺基酸序列的序列。變異型ICOSL IgSF (例如IgV)多肽與Fc之間的連接可經由肽連接子，諸如如所描述之任何肽連接子。在一些實施例中，連接子為GGGGS (「4GS」；SEQ ID NO: 636)、SEQ ID NO: 229 (2×GGGGS)或SEQ ID NO: 228 (3×GGGGS)。
在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 636中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 637中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 636中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 474中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 636中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 477中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 636中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 633中所闡述之Fc多肽。
在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 229中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 637中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 229中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 474中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 229中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 477中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 229中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 633中所闡述之Fc多肽。
在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 228中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 637中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 228中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 474中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 228中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 477中所闡述之Fc多肽。在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL-Fc融合蛋白，其含有SEQ ID NO: 565中所闡述之變異型ICOSL IgV域、SEQ ID NO: 228中所闡述之連接子及SEQ ID NO: 633中所闡述之Fc多肽。
在一些實施例中，提供一種變異型ICOSL IgSF Fc融合蛋白，其具有SEQ ID NO: 928中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 928展現至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之胺基酸序列。在一些實施例中，變異型ICOSL IgSF Fc融合蛋白結合至CD28及ICOS，諸如以相比於參考(野生型)ICOSL-Fc融合蛋白增加之結合親和力。在一些實施例中，相比於具有野生型人類IgG1之Fc的融合物，變異型ICOSL IgSF Fc融合物展現減弱的Fc效應物功能。
在一些實施例中，提供一種多域堆疊免疫調節蛋白，其中兩個或多於兩個IgSF域，包括ICOSL之vIgD及來自另一IgSF家族成員之一或多個額外IgSF域(例如第二變異型IgSF域)連接或附接至Fc以形成Fc融合物，其在表現於細胞中時可在一些態樣中產生二聚多域堆疊免疫調節蛋白。因此，亦提供二聚多域免疫調節蛋白。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽及一或多個額外IgSF域直接地或間接地獨立連接至Fc區之N端或C端。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽及一或多個額外IgSF域中之至少一者直接地或間接地連接，且變異型ICOSL中之一者或及一或多個額外IgSF域中之一者亦直接地或間接地連接至Fc區之N端或C端。在一些實施例中，Fc區之N端或C端連接至變異型ICOSL多肽或一或多個額外IgSF域且Fc區之N端或C端中之另一者連接至ICOSL變異體或另一個一或多個額外IgSF域中之另一者。在一些實施例中，與Fc之連接係經由肽連接子，例如上文所述之肽連接子。在一些實施例中，變異型ICOSL與第二IgSF域之間的連接係經由肽連接子，例如上文所述之肽連接子。在一些實施例中，變異型ICOSL與一或多個額外IgSF域之間的連接係經由肽連接子，例如上文所述之肽連接子。在一些實施例中，ICOSL之vIgD、一或多個額外IgSF域及Fc域可以如圖 16A 及 16B 中所描繪之多種組態中之任一者連接在一起。在一些實施例中，ICOSL-Fc變異型融合物可另外含有信號肽，諸如包含於SEQ ID NO: 59中所闡述之胺基酸序列中的例示性信號肽。例示性組態描述於實例中。
在一些實施例中，堆疊之免疫調節蛋白為由兩個免疫調節Fc融合多肽形成之二聚體。亦提供編碼堆疊之免疫調節蛋白中之任一者的核酸分子。在一些實施例中，二聚多域堆疊免疫調節蛋白可藉由堆疊免疫調節Fc區多肽之表現，或在一些情況下共表現而產生於細胞中，諸如下文所進一步描述。
在一些實施例中，二聚多域堆疊免疫調節蛋白對於各Fc次單位為二價，對於各次單位為單價，或對於一個次單位為二價且對於其他次單位為四價。
在一些實施例中，二聚多域堆疊免疫調節蛋白為均二聚多域堆疊Fc蛋白。在一些實施例中，二聚多域堆疊免疫調節蛋白包含第一堆疊免疫調節Fc融合多肽及第二堆疊免疫調節Fc融合多肽，其中第一及第二多肽相同。在一些實施例中，多肽之Fc部分可為如上文所述之任何Fc。
在一些實施例中，多域堆疊分子包含含有變異型ICOSL及第二融合IgSF域之第一Fc融合多肽，以及含有變異型ICOSL及第二IgSF域之第二Fc多肽。在一些實施例中，多域堆疊分子包含含有變異型ICOSL及第二IgSF域及第三IgSF域之第一Fc融合多肽，以及含有變異型ICOSL、第二IgSF域及第三IgSF域之第二Fc融合多肽。在一些實施例中，第一及/或第二融合多肽之Fc部分可為如上文所述之任何Fc。在一些實施例中，第一及第二融合多肽之Fc部分或區相同。
在一些實施例中，提供免疫調節蛋白，其為ICOSL-NKp30多域堆疊，含有變異型ICOSL多肽中之任一者及NKp30之一或多個IgF域，例如野生型或未經修飾的NKp30，諸如SEQ ID NO: 929中所闡述之IgV域或SEQ ID NO: 215中所闡述之ECD或其結合部分，或其結合部分。在一些實施例中，提供免疫調節蛋白，其含有變異型ICOSL多肽中之任一者及含有SEQ ID NO: 215或929中闡述之野生型或未經修飾的序列中之一或多個胺基酸修飾之變異型NKp30之一或多個IgSF域。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾(例如取代)包括L30V、A60V、S64P、S86G中之一或多者，諸如1、2、3或4個此類胺基酸修飾。在一些態樣中，多域堆疊多肽之變異型NKp30為或包括變異型IgV域，諸如SEQ ID NO: 504、930、931、932或933中之任一者中所闡述之變異型IgV域，或與SEQ ID NO: 504、930、931、932或933中之任一者具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性且含有各別SEQ ID NO之一或多個胺基酸修飾的IgV域。在一些態樣中，多域堆疊多肽之變異型NKp30為或包括變異型ECD域，諸如SEQ ID NO: 215、216、217、218或219中之任一者中所闡述之變異型ECD，或與SEQ ID NO: 215、216、217、218或219中之任一者具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性且含有各別SEQ ID NO之一或多個胺基酸修飾的ECD域。
在ICOSL-NKp30多域堆疊之此類實施例中之任一者中，變異型ICOSL多肽可包括第II部分中所述之含有變異型IgSF域(例如IgV或ECD)之任何多肽，諸如包括表1中所闡述之胺基酸修飾中之任一者。在一些情況下，此類免疫調節蛋白含有變異型ICOSL多肽，其含有ECD域，諸如SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中之任一者中所闡述之ECD域，或與SEQ ID NO: 109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中之任一者具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性且含有各別SEQ ID NO之一或多個胺基酸修飾的ECD域。在特定情況下，此類免疫調節蛋白含有變異型ICOSL多肽，其含有IgV域，諸如SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者中所闡述之IgV域，或與SEQ ID NO: 197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中之任一者具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性且含有各別SEQ ID NO之一或多個胺基酸修飾的IgV域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有對CD28或ICOS展現出經提高結合親和力的IgSF域(例如IgV域)，諸如本文所述之任何IgSF域。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有IgSF域(例如IgV域)，其含有一或多個胺基酸修飾，例如參看SEQ ID NO: 32之編號對應於位置52、57或100之參考ICOSL或特異性結合片段中之取代。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽具有選自以下之一或多個胺基酸修飾，例如取代：N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T或Q100V。例示性的此類變異型分子包括如本文所述之任何變異型分子。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽含有胺基酸修飾N52D (例如為或包括SEQ ID NO: 548中所闡述之IgV域)、N52H/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 567中所闡述之IgV域)、N52H/N57Y/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 565中所闡述之IgV域)，或N52L/N57H/Q100R (例如為或包括SEQ ID NO: 761中所闡述之IgV域)。
在一些實施例中，提供之多域堆疊免疫調節蛋白，諸如ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節蛋白融合至Fc多肽。在特定實施例中，Fc多肽為展現減弱的效應物功能之人類IgG1 Fc區之變異體，諸如如所描述之任何變異體。在一些實施例中，Fc區為含有胺基酸修飾N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A之人類IgG1，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實施例中，變異型IgG1 Fc區另外含有胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些實施例中，Fc區含有K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。在一些態樣中，Fc區含有SEQ ID NO: 474、476、477、478、633或637中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 474、476、477、478、633或637中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有各別SEQ ID NO之胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
例示性的此類組態闡述於圖16A至16B中且描述於本文中。在一些實施例中，所提供ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節多肽中之任一者可含有具有以下結構之多肽的兩個複本：變異型ICOSL IgSF (例如IgV，諸如SEQ ID NO: 548、565、567或761中所闡述)-連接子1-變異型NKp30 IgSF (例如IgV，諸如SEQ ID NO: 504中所闡述)-連接子2-Fc。在一些實施例中，所提供ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節多肽中之任一者可含有具有以下結構之多肽的兩個複本：變異型ICOSL IgSF (例如IgV，諸如SEQ ID NO: 548、565、567或761中所闡述)-連接子1-變異型NKp30 IgSF (例如IgV，諸如SEQ ID NO: 504中所闡述)-連接子1-變異型NKp30 IgSF (例如IgV，諸如SEQ ID NO: 504中所闡述)-連接子2-Fc。在一些實施例中，連接子1及連接子2為肽連接子，諸如如所描述之任何肽連接子。在一些實施例中，連接子1及連接子2相同。在一些實施例中，連接子1及連接子2不同。在一些實施例中，連接子1為3× GGGGS (SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，連接子2為GSGGGS (SEQ ID NO: 635)。
例示性ICOSL-NKp30多域堆疊具有SEQ ID NO: 912、914、916、918、920、922、924或926中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 912、914、916、918、920、922、924或926中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之胺基酸序列。
在一些實施例中，所提供ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節蛋白中之任一者結合至ICOS及/或CD28且結合至B7-H6。在一些實施例中，所提供ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節蛋白提供能夠鄰近於表現ICOS及/或CD28之免疫細胞(例如T細胞)定位腫瘤之結合分子。在一些實施例中，此類ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節蛋白可用於藉由將ICOS及/或CD28協同刺激受體在腫瘤微環境中接合於T細胞上而增加免疫反應。在一些情況下，此類ICOSL-NKp30多域堆疊免疫調節蛋白或其醫藥組合物可用於治療腫瘤或癌症。
在一些實施例中，多域堆疊分子為雜二聚體，包含兩種不同Fc融合多肽，例如第一及第二Fc多肽，其中至少一者為含有至少一個變異型ICOSL多肽之Fc融合多肽及/或至少一者為含有第二IgSF域(例如第二變異型IgSF域)之Fc多肽。在一些實施例中，第一或第二Fc融合多肽另外含有第三IgSF域(例如第三變異型IgSF域)。在一些實施例中，多域堆疊分子包含含有變異型ICOSL之第一Fc融合多肽及含有第二IgSF域之第二Fc融合多肽，其中在一些情況下，第一或第二Fc融合多肽另外含有第三IgSF域。在一些實施例中，多域堆疊分子包含含有變異型ICOSL、第二IgSF域且在一些情況下含有第三IgSF域之第一Fc融合多肽，以及不連接至變異型ICOSL多肽或額外IgSF域之第二Fc融合多肽。在一些實施例中，第一及第二融合多肽之Fc部分或區相同。在一些實施例中，第一及第二融合多肽之Fc部分或區不同。在一些實施例中，多域堆疊分子包含含有1、2、3、4或更多個變異型ICOSL多肽及/或1、2、3、4或更多個額外IgSF域之第一融合Fc多肽，其中第一堆疊Fc融合多肽中之IgSF域之總數目大於2、3、4、5、6或更大。在此類實施例之一個實例中，第二堆疊Fc融合多肽含有1、2、3、4或更多個變異型ICOSL多肽及/或1、2、3、4或更多個第二IgSF域，其中第二堆疊Fc融合多肽中之IgSF域之總數目大於2、3、4、5、6或更大。在此類實施例之另一實例中，第二Fc融合多肽不連接至變異型ICOSL多肽或額外IgSF域。
在一些實施例中，雜二聚體堆疊分子含有第一堆疊免疫調節Fc融合多肽及第二堆疊免疫調節Fc融合多肽，其中第一及第二多肽不同。在一些實施例中，雜二聚體堆疊分子包含含有Fc區及第一變異型ICOSL多肽及/或第二IgSF域(例如第二變異型IgSF域)之第一Fc多肽融合物，以及含有Fc區及第一變異型ICOSL多肽或第二IgSF域中之另一者的第二Fc多肽融合物。在一些實施例中，雜二聚體堆疊分子包含含有Fc區及第一變異型ICOSL多肽及/或第二IgSF域(例如第二變異型IgSF域)之第一Fc多肽融合物，以及含有第一變異型ICOSL多肽及第二IgSF域(例如第二變異型IgSF域)兩者，但定向或組態與第一Fc區不同的第二Fc多肽融合物。在一些實施例中，第一及/或第二Fc融合多肽亦含有第三IgSF域(例如第三變異型IgSF域)。
在一些實施例中，第一及第二堆疊免疫調節Fc融合多肽中之一者或兩者之Fc域包含修飾(例如取代)，使得Fc分子之界面經修飾以便於及/或促進雜二聚。在一些實施例中，修飾包括將突起(杵)引入至第一Fc多肽中及將凹穴(臼)引入至第二Fc多肽中，使得突起可定位於凹穴中以促進第一及第二含Fc多肽之複合。靶向置換及/或修飾以在多肽中產生突起或凹穴之胺基酸通常為與第二多肽之界面中的一或多個胺基酸相互作用或接觸之界面胺基酸。
在一些實施例中，對於其中Fc序列為序列之N端部分的構築體，胺基酸序列在Fc序列之前添加。在一些情況下，對於其中Fc序列為序列之N端部分的構築體，胺基酸序列HMSSVSAQ (SEQ ID NO: 475)緊鄰在Fc序列之前添加。在一些實施例中，雜二聚體堆疊分子含有第一Fc多肽融合物，其含有Fc區(杵)及第一變異型ICOSL多肽及/或第二IgSF域(例如第二變異型IgSF域)，及第二Fc多肽融合物，其含有Fc區(臼)及緊鄰第一及第二Fc多肽融合物之兩個Fc區添加之填充序列HMSSVSAQ (SEQ ID NO: 475)。
在一些實施例中，經修飾以含有突起(杵)胺基酸之第一多肽包括用一胺基酸置換天然或原始胺基酸，該胺基酸具有至少一條自第一多肽之界面突出且因此可定位於第二多肽之相鄰界面之補償性凹穴(臼)中的側鏈。最通常地，置換胺基酸為具有比原始胺基酸殘基更大的側鏈體積之胺基酸。熟習此項技術者知曉如何測定及/或評估胺基酸殘基之特性以鑑別對於產生突起而言為理想置換胺基酸之彼等者。在一些實施例中，用於形成突起之置換殘基為天然存在之胺基酸殘基且包括例如精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)。在一些實例中，鑑別用於置換之原始殘基為具有小側鏈之胺基酸殘基，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
在一些實施例中，經修飾以含有凹穴(臼)之第二多肽為如下多肽：包括用具有至少一條自第二多肽之界面凹入且因此能夠容納來自第一多肽之界面之對應突起之側鏈的胺基酸置換天然或原始胺基酸。最通常地，置換胺基酸為具有比原始胺基酸殘基更小的側鏈體積之胺基酸。熟習此項技術者知曉如何測定及/或評估胺基酸殘基之特性以鑑別對於形成凹穴而言為理想置換殘基之彼等者。一般而言，用於形成凹穴之置換殘基為天然存在之胺基酸且包括例如丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一些實例中，鑑別用於置換之原始胺基酸為具有大側鏈之胺基酸，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。
舉例而言，人類IgG1之CH3界面涉及位於四個反向平行β-股上之各域上的十六個殘基，各域自各表面埋藏1090 Å2 (參見例如Deisenhofer等人 (1981) Biochemistry, 20:2361-2370；Miller等人, (1990) J Mol. Biol., 216, 965-973；Ridgway等人, (1996) Prot. Engin., 9: 617-621；美國專利第5,731,168號)。修飾CH3域以產生突起或凹穴描述於例如美國專利第5,731,168號；國際專利申請WO98/50431及WO 2005/063816；及Ridgway等人, (1996) Prot. Engin., 9: 617-621中。在一些實例中，修飾CH3域以產生突起或凹穴通常靶向位於兩個中心反向平行β-股上之殘基。目標為將產生之突起可藉由突起至周圍溶劑中容納而非藉由配位體CH3域中之補償性凹穴容納之風險降至最低。
在一些實施例中，雜二聚體分子在「杵鏈」之CH3域中含有T366W突變且在「臼鏈」之CH3域中含有T366S、L368A、Y407V突變。在一些情況下，亦可使用CH3域之間的額外鏈間二硫橋鍵(Merchant, A. M.等人, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如藉由將Y349C突變引入至「杵」或「臼」鏈之CH3域中及將E356C突變或S354C突變引入至另一條鏈之CH3域中。在一些實施例中，雜二聚體分子在兩個CH3域中之一者中含有S354C、T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中含有Y349C、T366S、L368A、Y407V突變。在一些實施例中，雜二聚體分子在兩個CH3域中之一者中包含E356C、T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中包含Y349C、T366S、L368A、Y407V突變。在一些實施例中，雜二聚體分子在兩個CH3域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在一些實施例中，雜二聚體分子在兩個CH3域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變。其他杵-臼(knobs-in-holes)技術之實例為此項技術中已知的，例如如由EP 1 870 459 A1所描述。
在一些實施例中，雜二聚體分子之Fc區可另外含有一或多個其他Fc突變，諸如上文所述之任何突變。在一些實施例中，雜二聚體分子含有Fc區，其具有減弱效應物功能之突變。
在一些實施例中，含有CH3突起(杵)或凹穴(臼)修飾之Fc變異體可在任何位置接合至堆疊之免疫調節多肽，但通常經由其N端或C端接合至第一及/或第二堆疊之免疫調節多肽之N端或C端，以便形成融合多肽。連接可為直接的或經由連接子間接的。通常，杵及臼分子係藉由連接至含有CH3突起修飾之Fc變異體的第一堆疊之免疫調節多肽與連接至含有CH3凹穴修飾之Fc變異體的第二堆疊之免疫調節多肽之共表現產生。
亦提供編碼變異型ICOSL-Fc融合蛋白之核酸分子。在一些實施例中，為了產生Fc融合蛋白，編碼變異型ICOSL-Fc融合蛋白之核酸分子插入至適當表現載體中。所得變異型ICOSL-Fc融合蛋白可表現於經表現轉化之宿主細胞中，其中Fc域之間的裝配藉由形成於Fc部分之間的鏈間二硫鍵發生，以產生二聚，諸如二價變異型ICOSL-Fc融合蛋白。
所得Fc融合蛋白可藉由蛋白A或蛋白G管柱上之親和性層析法容易地純化。為了產生雜二聚體，可能需要額外純化步驟。舉例而言，當兩個編碼不同變異型ICOSL多肽之核酸轉型至細胞中時，雜二聚體之形成必須以生物化學方式達成，因為攜有Fc域之變異型ICOSL分子亦將變現為二硫鍵連接的均二聚體。因此，均二聚體可在有利於破壞鏈間二硫鍵，但對鏈內二硫鍵無效的條件下還原。在一些情況下，不同變異型ICOSL Fc單體以等莫耳量混合且經氧化以形成均二聚體及雜二聚體之混合物。此混合物之組分係藉由層析技術分離。或者，此類型之雜二聚體的形成可藉由使用下文所述之杵-臼方法基因工程改造及表現含有變異型ICOSL多肽之Fc融合分子而發生偏差。
B. 變異型多肽及免疫調節蛋白之結合物及融合物
在一些實施例中，本文提供之變異型多肽(其為包含IgSF家族之Ig域之變異體(vIgD)的免疫調節蛋白)可直接地或間接地與部分，諸如效應部分，諸如另一蛋白質結合，諸如直接地或間接地稠合至該部分，以形成結合物(「IgSF結合物」)。在一些實施例中，變異型ICOSL免疫調節蛋白提供為結合物，其中含有ICOSL之vIgD，其直接地或間接地連接至靶向劑或部分，例如連接至特異性結合至配位體(例如抗原)之抗體或其他結合分子，例如以將vIgD靶向或定位至特定環境或細胞，諸如當向個體投與時。在一些實施例中，靶向劑，例如抗體或其他結合分子結合至腫瘤抗原，進而將含有vIgD之變異型ICOSL定位至腫瘤微環境，例如以調節對腫瘤微環境具特異性之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的活性。在一些實施例中，附接可為共價或非共價的，例如經由生物素-抗生蛋白鏈菌素非共價相互作用。在一些實施例中，結合物為直接或經由連接子連接至另一蛋白質或多肽部分之變異型ICOSL多肽的融合蛋白。
在一些實施例中，融合蛋白為ICOSL-Fc變異型融合物，其中前述變異型多肽中之任何兩者或多於兩者可附接至Fc。
在一些實施例中，IgSF結合物，諸如融合蛋白包含野生型(全長或截短)或變異型ICOSL多肽之ECD。在一些實施例中，IgSF結合物，諸如融合蛋白包含IgV域或一或多個IgC (例如IgC2)域，或IgV域之特異性結合片段或一或多個IgC (例如IgC2)域之特異性結合片段。在一些實施例中，IgSF結合物，諸如融合蛋白包含如SEQ ID NO: 196或545中所闡述之ICOSL之IgV域。
在一些實施例中，部分可為靶向部分、小分子藥物(小於500道爾頓莫耳質量之非多肽藥物)、毒素、細胞生長抑制劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、適合於診斷目的之放射性試劑、用於治療目的之放射性金屬離子、前藥活化酶、增加生物半衰期之試劑或診斷劑或可偵測試劑。
在一些實施例中，效應部分為治療劑，如癌症治療劑，其為細胞毒性的、細胞生長抑制的或以其他方式提供一些治療效益。在一些實施例中，效應部分為靶向部分或試劑，諸如靶向細胞表面抗原，例如腫瘤細胞表面上之抗原的試劑。在一些實施例中，效應部分為標記，其可直接或間接地產生可偵測信號。在一些實施例中，效應部分為毒素。在一些實施例中，效應部分為蛋白質、肽、核酸、小分子或奈米粒子。
在一些實施例中，1、2、3、4、5或更多個效應部分(其可相同或不同)結合、連接或融合至變異型多肽蛋白質以形成IgSF結合物。在一些實施例中，此類效應部分可使用此項技術中已知及下文所述之各種分子生物或化學結合及鍵聯方法附接至變異型多肽或免疫調節蛋白。在一些實施例中，連接子，諸如肽連接子、可裂解連接子、不可裂解連接子或幫助結合反應之連接子可用於將效應部分連接或結合至變異型多肽或免疫調節蛋白。
在一些實施例中，IgSF結合物包含以下組分：(蛋白質或多肽)、(L)q 及(效應部分)m ，其中蛋白質或多肽為能夠結合一或多個如所描述之同源反結構配位體的所描述變異型多肽或免疫調節蛋白中之任一者；L為將蛋白質或多肽連接至部分的連接子；m為至少1；q為0或更大；且所得IgSF結合物結合至一或多個反結構配位體。在特定實施例中，m為1至4且q為0至8。在一些實施例中，連接子為肽。在一些實施例中，效應部分為蛋白質或多肽。
在一些實施例中，提供IgSF結合物，其包含與結合至細胞表面分子之靶向劑結合的本文提供之變異型多肽或免疫調節蛋白，例如用於將變異型多肽或免疫調節蛋白靶向遞送至特定細胞。在一些實施例中，靶向劑為具有定位及結合至存在於個體中之正常細胞/組織及/或腫瘤細胞/腫瘤上之分子之能力的分子。換言之，包含靶向劑之IgSF結合物可結合至配位體(直接地或間接地)，其存在於細胞，諸如腫瘤細胞上。預期使用之本發明之靶向劑包括可結合靶細胞或分子之組分的抗體、多肽、肽、適體、其他配位體或其任何組合。
在一些實施例中，靶向劑在向個體投與後結合腫瘤細胞或可在腫瘤細胞附近(例如腫瘤血管或腫瘤微環境)結合。靶向劑可結合至癌細胞表面上之受體或配位體。在本發明之另一態樣中，選擇對非癌性細胞或組織具有特異性之靶向劑。舉例而言，靶向劑可對通常存在於特定細胞或組織上之分子具有特異性。此外，在一些實施例中，相同分子可存在於正常細胞及癌細胞上。各種細胞組分及分子為吾人所知。舉例而言，若靶向劑對EGFR具有特異性，則所得IgSF結合物可靶向表現EGFR之癌細胞以及表現EGFR之正常皮膚表皮細胞。因此，在一些實施例中，本發明之IgSF結合物可藉由兩種獨立機制(靶向癌細胞及非癌細胞)操作。
在本文揭示之本發明之各種態樣中，本發明之IgSF結合物包含靶向劑，其可結合/靶向細胞組分，諸如腫瘤抗原、細菌抗原、病毒抗原、支原體抗原、真菌抗原、朊病毒抗原、來自寄生蟲之抗原。在一些態樣中，細胞組分、抗原或分子可各自用於意指靶向劑之所需標靶。舉例而言，在各種實施例中，靶向劑對組分具有特異性或結合至組分，其包括但不限於表皮成長因子受體(EGFR、ErbB-1、HERl)、ErbB -2 (HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配位體家族；類胰島素生長因子受體(IGFR)家族、IGF結合蛋白(IGFBP)、IGFR配位體家族；血小板衍生生長因子受體(PDGFR)家族、PDGFR配位體家族；纖維母細胞生長因子受體(FGFR)家族、FGFR配位體家族、血管內皮生長因子受體(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受體家族；TRK受體家族；ephrin (EPH)受體家族；AXL受體家族；白血球酪胺酸激酶(LTK)受體家族；TIE受體家族,血管生成素1,2；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(ROR)受體家族，例如ROR1；CD171 (L1CAM)；B7-H6 (NCR3LG1)；PD-L1，腫瘤糖基化抗原，例如sTn或Tn，諸如MUC1之sTn Ag；LHR (LHCGR)；磷脂醯絲胺酸，盤狀域受體(DDR)家族；RET受體家族；KLG受體家族；RYK受體家族；MuSK受體家族； 轉化生長因子-α (TGF-α)受體、TGF-β；細胞介素受體，I類(造血素家族)及II類(干擾素/IL-10家族)受體、腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族(TNFRSF)、死亡受體家族；癌症-睾丸(CT)抗原、譜系特異性抗原、分化抗原、α-輔肌動蛋白-4、ARTCl、斷裂點簇集區-阿貝爾森(Bcr-abl)融合產物、B-RAF、凋亡蛋白酶-5 (CASP-5)、凋亡蛋白酶-8 (CASP-8)、β-索烴素(CTNNBl)、細胞分裂週期27 (CDC27)、週期素依賴性激酶4 (CDK4)、CDKN2A、COA-I、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延長因子2 (ELF2)、Ets變異體基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS (ETC6-AML1)融合蛋白、纖維結合蛋白(FN)，例如纖維結合蛋白之外域A (EDA)、GPNMB、低密度脂質受體/GDP-L岩藻糖: β-D-半乳糖2-α-L-岩藻糖基轉移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2基因組中α2-域之α-螺旋之殘基170處之HLA-A2精胺酸至異白胺酸之交換(HLA-A*201-R170I)、HLA-Al 1、突變熱休克蛋白70-2 (HSP70-2M)、K1AA0205、MART2、突變遍在黑素瘤1、2、3 (MUM-I、2、3)、前列腺酸磷酸酶(PAP)、neo-PAP、I類肌球蛋白、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras (KRAS2)、N-ras (NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SYT-SSXl或-SSX2融合蛋白、磷酸丙糖異構酶、BAGE、BAGK-1、BAGE-2,3,4,5、GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8、GnT-V (異常N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V，MGAT5)、HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-I、LAGE、LAGE-I、黑素瘤上CTL識別之抗原(CAMEL)、MAGE-Al (MAGE-I)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO、MAGE-AI l、MAGE-A12、MAGE-3、MAGE-Bl、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-Cl、MAGE-C2、黏蛋白1 (MUCl)、MART-1/Melan-A (MLANA)、gp100、gpl00/Pmell7 (SILV)、酪胺酸酶(TYR)、TRP-I、HAGE、NA-88、NY-ESO-I、NY-ESO-l/LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-1,2,3,4、TRP2-INT2、癌胚抗原(CEA)、激肽釋放酶4、乳腺球蛋白-A、OAl、前列腺特異性抗原(PSA)、TRP-1/gp75、TRP-2、親脂素、黑素瘤2中不存在之干擾素誘導蛋白(AIM-2)、BING-4、CPSF、細胞週期蛋白Dl、上皮細胞黏附分子(Ep-CAM)、EphA3、纖維母細胞生長因子-5 (FGF-5)、醣蛋白250 (gp250)、EGFR (ERBBl)、HER-2/neu (ERBB2)、介白素13受體α2鏈(IL13Rα2)、IL-6受體、腸道羧基酯酶(iCE)、α-胎蛋白(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUCl、p53 (TP53)、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-I、RNF43、RU2AS、SOXlO、STEAPl、存活素(BIRC5)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、端粒酶、威耳姆士腫瘤基因(WTl)、SYCPl、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIPl、CTAGE-I、CSAGE、MMAl、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15ql4、HCA661、LDHC、MORC、SGY-I、SPOl 1、TPXl、NY-SAR-35、FTHL17、NXF2、TDRDl、TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白個體基因型、本瓊氏蛋白(Bence-Jones protein)、雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、癌症抗原72-4 (CA 72-4)、癌症抗原15-3 (CA 15-3)、癌症抗原27-29 (CA 27-29)、癌症抗原125 (CA 125)、癌症抗原19-9 (CA19-9)、β-人絨毛膜促性腺激素、β-2微球蛋白、鱗狀細胞癌抗原、神經元特異性烯醇酶、熱休克蛋白gp96、GM2、沙格司亭(sargramostim)、CTLA-4、707丙胺酸脯胺酸(707-AP)、藉由T細胞4識別之腺癌抗原(ART-4)、癌胚抗原肽-1(CAP-I)、鈣活化氯離子通道-2 (CLCA2)、親環素B (Cyp-B)、人類印戒腫瘤-2 (HST-2)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要衣殼抗原、其他)、埃-巴二氏病毒(EBV)蛋白(EBV潛伏膜蛋白-LMPl、LMP2；其他)、B型或C型肝炎病毒蛋白及HIV蛋白。
在一些實施例中，靶向劑對組分具有特異性或結合至組分，其包括但不限於HER1/EGFR、HER2/ERBB2、CD20、CD25 (IL-2Rα受體)、CD33、CD52、CD133、CD206、CEA、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6、癌症抗原125 (CA125)、α-胎蛋白(AFP)、Lewis Y、TAG72、Caprin-1、間皮素、PDGF受體(PDGFR；諸如PDGF-R α)、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2受體、血管內皮生長因子(VEGF)、CD30、EpCAM、EphA2、磷脂肌醇蛋白聚醣-3、gpA33、黏蛋白、CAIX、PSMA、葉酸結合蛋白、神經節苷脂(諸如GD2、GD3、GM1及GM2)、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR2、VEGF-A、整合素αVβ3、整合素α5β1、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、AFP、BCR複合物、CD3、CD18、CD44、CTLA-4、gp72、HLA-DR 10 β、HLA-DR抗原、IgE、MUC-1、nuC242、PEM抗原、金屬蛋白酶、Ephrin受體、Ephrin配位體、HGF受體、CXCR4、CXCR4、鈴蟾素受體、SK-1抗原、Bcr-abl、RET、MET、TRKB、TIE2、ALK、ROS、EML4-ALK、ROS1、BRAFV600E、SRC、c-KIT、mTOR、TSC1、TSC2、BTK、KIT、BRCA、CDK 4/6、JAK1、JAK2、BRAF、FLT-3、MEK1、MEK2、SMO或B7-H6 (NCR3LG1)。
在一些實施例中，IgSF結合物經由其靶向劑將結合腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤微環境之細胞組分，進而經由免疫反應之調節(例如藉由活化協同刺激分子或抑制免疫細胞活化之負調節分子)、存活信號(例如生長因子或細胞介素或激素受體拮抗劑)之抑制、死亡信號之活化及/或免疫介導性細胞毒性，諸如經由抗體依賴性細胞毒性促進靶向細胞之殺死。此類IgSF結合物可經由若干機制起作用以預防、減少或消除腫瘤細胞，以促進將結合之效應部分遞送至腫瘤標靶，諸如經由IgSF結合物之受體介導之內飲作用；或此類結合物可募集、結合及/或活化免疫細胞(例如NK細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞)。此外，在一些情況下，前述路徑中之一或多者可在投與一或多種本發明之IgSF結合物時操作。
在一些實施例中，IgSF結合物經由其靶向劑將定位至，諸如結合至腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤微環境之細胞組分，進而在腫瘤附近調節免疫反應之細胞。在一些實施例中，靶向劑促進將結合之IgSF (例如vIgD)遞送至腫瘤標靶，以便與其同源結合配位體相互作用以改變攜有同源結合配位體之免疫細胞(例如NK細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞)的信號傳導。在一些實施例中，局部遞送促效或刺激協同刺激受體。
在一些實施例中，靶向劑為免疫球蛋白。如本文所用，術語「免疫球蛋白」包括天然或人工單價或多價抗體，包括但不限於多株、單株、多特異性、人類、人類化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現文庫產生之片段、單鏈Fv (scFv)；抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如本發明抗體之抗Id抗體)及以上中之任一者的抗原決定基結合片段。如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有免疫特異性結合抗原之抗原結合位點的分子。本發明之免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2)或子類之免疫球蛋白分子。
在一些實施例中，IgSF結合物經由其靶向部分將結合腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤微環境之細胞組分，進而經由免疫反應之調節(例如藉由活化協同刺激分子或抑制免疫細胞活化之負調節分子)、存活信號(例如生長因子或細胞介素或激素受體拮抗劑)之抑制、死亡信號之活化及/或免疫介導性細胞毒性，諸如經由抗體依賴性細胞毒性促進靶向細胞之凋亡。此類IgSF結合物可經由若干機制起作用以預防、減少或消除腫瘤細胞，以促進將結合之效應部分遞送至腫瘤標靶，諸如經由IgSF結合物之受體介導之內飲作用；或此類結合物可募集、結合及/或活化免疫細胞(例如NK細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞)。
在一些實施例中，IgSF結合物經由其抗體靶向部分將結合腫瘤細胞、腫瘤血管或腫瘤微環境之細胞組分，進而調節免疫反應(例如藉由活化協同刺激分子或抑制免疫細胞活化之負調節分子)。在一些實施例中，此類結合物可識別、結合及/或調節(例如抑制或活化)免疫細胞(例如NK細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞)。
本發明之抗體靶向部分包括抗體片段，其包括但不限於Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv (sdFv)及包含VL或VH域之片段。抗原結合抗體片段，包括單鏈抗體可單獨或與以下中之全部或一部分組合包含可變區：鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域。本發明中亦包括抗原結合片段，其亦包含可變區與鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域之任何組合。本發明中亦包括Fc片段、抗原-Fc融合蛋白及Fc靶向部分結合物或融合產物(Fc-肽、Fc-適體)。本發明之抗體靶向部分可來自任何動物來源，包括鳥類及哺乳動物。在一個態樣中，抗體靶向部分為人類、鼠類(例如小鼠及大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞。另外，此類抗體可為動物抗體之人類化型式。本發明之抗體靶向部分可為單特異性、雙特異性、三特異性或更大多特異性。
在各種實施例中，抗體/靶向部分經由Fc (抗體中)及Fc受體(免疫細胞上)之間的相互作用及經由本文提供之結合之變異型多肽或免疫調節蛋白募集、結合及/或活化免疫細胞(例如NK細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞)。在一些實施例中，抗體/靶向部分經由本文提供之結合之變異型多肽或免疫調節蛋白識別或結合腫瘤試劑且定位至腫瘤細胞，以促進腫瘤附近之免疫細胞的調節。
可併入至IgSF結合物中之抗體之實例包括但不限於抗體，諸如西妥昔單抗(Cetuximab)(IMC-C225；Erbitux®)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)(Herceptin®)、利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan®；MabThera®)、貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、阿侖單抗(Alemtuzumab)(Campath®；Campath-1H®；Mabcampath®)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)(Perjeta®)、帕尼單抗(Panitumumab)(ABX-EGF；Vectibix®)、蘭比珠單抗(Ranibizumab)(Lucentis®)、布突默單抗(Ibritumomab)、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®)、托西莫單抗(Tositumomab)、碘I 131托西莫單抗(BEXXAR®)、卡托莫西單抗(Catumaxomab)(Removab®)、迪奴圖單抗(Dinutuximab)(UnituxinTM )、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、吉妥珠單抗奧佐米星(ozogamicine)(Mylotarg®)、阿巴西普(Abatacept)(CTLA4-Ig；Orencia®)、貝拉西普(Belatacept)(L104EA29YIg；LEA29Y；LEA)、伊匹單抗(Ipilimumab)(MDX-010；MDX-101)、曲美單抗(Tremelimumab)(替西單抗(ticilimumab)；CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(Aflibercept)(VEGF Trap，AVE005)、沃洛昔單抗(Volociximab)(M200)、F200、MORAb-009、SS1P (CAT-5001)、西妥木單抗(Cixutumumab)(IMC-A12)、馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD72000)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)(h-R3)、紮魯姆單抗(Zalutumumab)(HuMax-EGFR)、萊西單抗(Necitumumab)IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004、mAb-425、Panorex@ (17-1A)(鼠類單株抗體)；Panorex@ (17-1A)(嵌合鼠類單株抗體)；IDEC-Y2B8(鼠類，抗CD2O MAb)；BEC2(抗個體基因型MAb，模擬GD抗原決定基)(具有BCG)；奧拉單抗(Olaratumab)(LartruvoTM )；奧科立姆(Oncolym)(Lym-1單株抗體)；SMART MI95 Ab、人類化13' I LYM-I (奧科立姆)、Ovarex (B43.13，抗個體基因型小鼠MAb)、雷莫蘆單抗(Cyramza®)；MDX-210 (人類化抗HER-2雙特異性抗體)；結合至腺癌上之EGP40 (17-1A)扁平細胞瘤抗原的3622W94 MAb；抗VEGF、賽尼哌(Zenapax)(SMART Anti-Tac (IL-2受體)；SMART MI95 Ab、人類化Ab、人類化)；MDX-210 (人類化抗HER-2雙特異性抗體)；MDX-447 (人類化抗EGF受體雙特異性抗體)；NovoMAb-G2 (扁平細胞瘤特異性Ab)；TNT (組蛋白抗原之嵌合MAb)；TNT (組蛋白抗原之嵌合MAb)；Gliomab-H (單株-人類化Ab)；GNI-250 Mab；EMD-72000 (嵌合EGF拮抗劑)；LymphoCide (人類化LL2抗體)；及MDX-260雙特異性標靶GD-2、ANA Ab、SMART IDlO Ab、SMART ABL 364 Ab或ImmuRAIT-CEA。如藉由前述清單所說明，習知製造特定靶抗原決定基之抗體。
在一些實施例中，所提供結合物，包括融合分子之抗體或抗原結合片段為西妥昔單抗、帕尼單抗、紮魯姆單抗、尼妥珠單抗、曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物、托西莫單抗(Bexxar®)、利妥昔單抗(Rituxan，Mabthera)、替伊莫單抗(Zevalin)、達利珠單抗(Zenapax)、吉妥珠單抗(Mylotarg)、阿侖單抗、CEA掃描Fab片段、OC125單株抗體、ab75705、B72.3、貝伐單抗(Avastin®)、阿法替尼、阿西替尼、伯舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克卓替尼、達拉非尼、達沙替尼、迪奴圖單抗(UnituxinTM )、埃羅替尼、依維莫司、依魯替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、樂伐替尼、尼羅替尼、奧拉帕尼、奧拉單抗(LartruvoTM )、帕泊昔布、帕佐泮尼、帕妥珠單抗(Perjeta®)、雷莫蘆單抗(Cyramza®)、瑞戈非尼、蘆可替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦羅莫司、曲美替尼、凡德他尼、維羅非尼、維莫德吉、巴利昔單抗、伊匹單抗、納武單抗、派立珠單抗、MPDL3280A、匹立珠單抗(CT-011)、AMP-224、MSB001078C或MEDI4736、BMS-935559、LY3300054、阿特珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗或為其抗原結合片段。
在一些實施例中，PD-L1抗體或其抗原結合片段可併入至IgSF結合物中。可併入至IgSF結合物中之PD-L1抗體之實例包括但不限於諸如BMS-936559、12A4、LY3300054、阿特珠單抗(Tecentriq®)、阿維魯單抗(Bavencio®)、德瓦魯單抗(Imfinzi®)之抗體。參見例如WO2007/005874、WO2017/034916、WO2010/077634、WO2013/079174、WO2011/066389，此等參照案以全文引用之方式併入。在一些實施例中，vIgD直接地或間接地連接至抗PD-L1抗體之輕鏈及/或重鏈之N端或C端。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為BMS-936559、LY3300054、阿特珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗。抗PD-L1抗體阿特珠單抗之例示性輕鏈及重鏈分別闡述於SEQ ID NO: 866及867中。包括抗PD-L1抗體阿特珠單抗之例示性IgSF結合物闡述於SEQ ID NO: 868-895中。
在一些實施例中，抗體靶向部分為含有Fc域之全長抗體，或其抗原結合片段。在一些實施例中，變異型多肽或免疫調節蛋白與抗體靶向部分之Fc部分結合，諸如藉由結合至抗體之Fc部分的N端。
在一些實施例中，vIgD直接地或間接地連接至抗體之輕鏈及/或重鏈之N端或C端。在一些實施例中，連接可經由肽連接子，諸如上文所述之任何肽連接子。在一些實施例中，連接子可進一步包括藉由選殖及/或自限制位點引入之胺基酸。在一些實施例中，連接子可包括藉由限制位點引入之任一端上的額外胺基酸。舉例而言，連接子可包括如藉由使用限制位點AFEI引入之額外胺基酸，諸如SA (以單字母胺基酸密碼)。可構建各種組態。圖 10A - 10C 描繪例示性組態。在一些實施例中，抗體結合物可藉由細胞中抗體之重鏈及輕鏈的共表現產生。
在本發明之一個態樣中，靶向劑為適體分子。舉例而言，在一些實施例中，適體由充當靶向劑之核酸組成。在各種實施例中，本發明之IgSF結合物包含對腫瘤細胞、腫瘤血管及/或腫瘤微環境上之分子具有特異性之適體。在一些實施例中，除靶向模組(序列)以外，適體自身可包含生物學活性序列，其中生物學活性序列可向靶細胞誘導免疫反應。換言之，此類適體分子為兩用試劑。在一些實施例中，本發明之IgSF結合物包含將適體結合至抗體，其中適體及抗體對結合至腫瘤細胞、腫瘤血管、腫瘤微環境及/或免疫細胞上之獨立分子具有特異性。
術語「適體」包括基於特異性結合至特定分子之特性選擇的DNA、RNA或肽。舉例而言，可針對如本文所揭示之結合腫瘤細胞、腫瘤血管、腫瘤微環境及/或免疫細胞中之特定基因或基因產物選擇適體，其中選擇係藉由此項技術中已知之方法作出且為熟習此項技術者所熟悉。
在本發明之一些態樣中，靶向劑為肽。舉例而言，本文提供之變異型多肽或免疫調節蛋白可與肽結合，該肽可與癌細胞或腫瘤細胞之組分結合。因此，本發明之此類IgSF結合物包含肽靶向劑，其結合至腫瘤細胞、腫瘤血管之細胞組分及/或腫瘤微環境之組分。在一些實施例中，靶向劑肽可為整合素之拮抗劑或促效劑。包含α及β次單位之整合素包括熟習此項技術者熟知之多種類型。
在一個實施例中，靶向劑為Vvβ3。整合素Vvβ3表現於多種細胞上且已顯示介導若干生物學相關過程，包括破骨細胞黏附至骨基質、血管平滑肌細胞之遷移及血管生成。適用於整合素之靶向分子包括RGD肽或肽模擬物以及非RGD肽或肽模擬物(參見例如美國專利第5,767,071號及第5,780,426號)，用於其他整合素，諸如V4.βi (VLA-4)、V4-P7 (參見例如美國專利第6,365,619號；Chang等人, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159-163 (2002)；Lin等人, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133-136 (2002))，及其類似物。
在一些實施例中，提供IgSF結合物，其包含與治療劑結合的本文提供之變異型多肽或免疫調節蛋白。在一些實施例中，治療劑包括例如柔紅黴素、小紅莓、甲胺喋呤及長春地辛(Rowland等人, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986)。在一些實施例中，治療劑具有細胞內活性。在一些實施例中，IgSF結合物經內化且治療劑為阻斷細胞之蛋白質合成，在其中導致細胞死亡之細胞毒素。在一些實施例中，治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽的細胞毒素，包括例如白樹素、波甘寧(bouganin)、沙泊寧(saporin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、欖香膠素、白喉毒素、侷限麴菌素、綠膿桿菌外毒素A及其變異體。在一些實施例中，其中治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽的細胞毒素，IgSF結合物必須在結合至靶細胞後內化以使蛋白質對細胞具細胞毒性。
在一些實施例中，提供IgSF結合物，其包含與毒素結合的本文提供之變異型多肽或免疫調節蛋白。在一些實施例中，毒素包括例如細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(Mandler等人,J . Nat . Cancer Inst . 92(19):1573-1581 (2000)；Mandler等人,Bioorganic & Med . Chem . Letters 10:1025- 1028 (2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem . 13:786-791 (2002))、類美登素(EP 1391213；Liu等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8618-8623 (1996))及卡奇黴素(Lode等人,Cancer Res . 58:2928 (1998)；Hinman等人,Cancer Res . 53:3336-3342 (1993))。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制發揮其細胞毒性及細胞生長抑制效應。
在一些實施例中，提供IgSF結合物，其包含與標記結合的本文提供之變異型多肽或免疫調節蛋白，該標記可間接或直接地產生可偵測信號。此等IgSF結合物可用於研究或診斷應用，諸如用於活體內偵測癌症。標記較佳能夠直接或間接地產生可偵測信號。舉例而言，標記可為射線不透的或放射性同位素，諸如3 H、14 C、32 P、35 S、123 I、125 I、131 I；螢光(螢光團)或化學發光(發色團)化合物，諸如螢光異硫氰酸鹽、若丹明或螢光素；酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖或辣根過氧化酶；顯影劑；或金屬離子。在一些實施例中，標記為用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如99 Tc或123 I，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且與抗體結合，例如用於PET成像(WO 2011/056983)。在一些實施例中，可間接偵測IgSF結合物。舉例而言，對IgSF結合物具有特異性且含有可偵測標記之二級抗體可用於偵測IgSF結合物。
IgSF結合物可使用此項技術中已知之任何方法製備。參見例如以全文引用的方式併入本文中之WO 2009/067800、WO 2011/133886及美國專利申請公開案第2014322129號。
IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白可藉由任何變異型多肽或免疫調節蛋白可與效應部分締合或連接至效應部分之方法「附接至」效應部分。舉例而言，IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白可藉由化學或重組方法附接至效應部分。製備融合物或結合物之化學方法為此項技術中已知且可用於製備IgSF結合物。用於結合變異型多肽或免疫調節蛋白及效應部分之方法必須能夠在不干擾變異型多肽或免疫調節蛋白結合至其一或多個反結構配位體之能力的情況下接合變異型多肽或免疫調節蛋白與效應部分。
IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白可間接連接至效應部分。舉例而言，IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白可直接連接至含有若干類型中之一者之效應部分的脂質體。效應部分及/或變異型多肽或免疫調節蛋白亦可結合至固體表面。
在一些實施例中，IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白及效應部分皆為蛋白質且可使用此項技術中熟知之技術結合。存在數百種可結合兩種蛋白質之可用交聯劑。(參見例如「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」, 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor)。交聯劑一般基於可用或插入於變異型多肽或免疫調節蛋白及/或效應部分上之反應性官能基選擇。另外，若不存在反應性基團，則可使用光可活化交聯劑。在某些情況下，可能需要在變異型多肽或免疫調節蛋白與效應部分之間包括間隔子。此項技術已知之交聯劑包括同型雙官能試劑：戊二醛、二亞胺代己二酸二甲酯及雙(重氮聯苯胺)及異型雙官能試劑：間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺及磺酸基-間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺。
在一些實施例中，IgSF結合物之變異型多肽或免疫調節蛋白可經用於效應部分之化學附接的特異性殘基工程改造。此項技術已知的用於分子之化學附接之特異性殘基包括離胺酸及半胱胺酸。交聯劑係基於插入於變異型多肽或免疫調節蛋白上，及在效應部分上可用的反應性官能基而選擇。
IgSF結合物亦可使用重組DNA技術製備。在此情況下，編碼變異型多肽或免疫調節蛋白之DNA序列融合至編碼效應部分之DNA序列，產生嵌合DNA分子。嵌合DNA序列轉染至表現融合蛋白之宿主細胞中。融合蛋白可自細胞培養物回收且使用此項技術中已知之技術純化。
將效應部分(其為標記)附接至變異型多肽或免疫調節蛋白之實例包括Hunter等人, Nature 144:945 (1962)；David等人, Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain等人, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)；Wensel及Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983)；及Colcher等人, 「Use Of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice」, Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986)中所述之方法。
放射性或其他標記可以已知方式併入結合物中。舉例而言，肽可生物合成或可藉由化學胺基酸合成、使用適合胺基酸前驅體(包括例如氟-19替代氫)而合成。如99 Tc或123 I、186 Re、188 Re及111 In之標籤可經由肽中之半胱胺酸殘基附接。釔-90可經由離胺酸殘基附接。IODOGEN方法(Fraker等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))可用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得變異型多肽或免疫調節蛋白及細胞毒性劑之結合物，該等雙功能蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCI)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science 238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之1-對異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核苷酸結合於抗體之例示性螯合劑。參見例如WO94/11026。連接子可為促進細胞中之細胞毒性藥物釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人, Cancer Research52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明之IgSF結合物明確地涵蓋(但不限於)用交聯劑試劑製備之藥物結合物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其市售可得(例如來自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A)。參見第467-498頁, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog。
C. 跨膜及分泌型免疫調節蛋白及工程改造細胞
本文提供表現免疫調節變異型ICOSL多肽之工程改造細胞(或者，「工程改造細胞」)。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽以膜結合形式表現於細胞，諸如免疫細胞(例如T細胞或抗原呈遞細胞)上，進而提供跨膜免疫調節蛋白(在下文中亦稱作「TIP」)。在一些態樣中，變異型ICOSL多肽以分泌型形式表現於細胞，諸如免疫細胞(例如T細胞或抗原呈遞細胞)中，進而產生變異型ICOSL多肽之分泌或可溶形式(在下文中亦稱作「SIP」)，諸如當向個體投與該等細胞時。在一些態樣中，SIP可拮抗分泌其之環境(例如腫瘤微環境)中之同源結合配位體。
1. 跨膜免疫調節蛋白
在一些實施例中，包含變異型ICOSL之免疫調節多肽可為膜結合蛋白。如下文更詳細地描述，免疫調節多肽可為包含變異型ICOSL之跨膜免疫調節多肽，其中含有：含有至少一個親和力經修飾之IgSF域(IgV或IgC)之胞外域、跨膜域及視情況存在之細胞質域。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白可表現於免疫細胞，諸如哺乳動物細胞之表面上，包括淋巴細胞(例如T細胞或NK細胞)或抗原呈遞細胞之表面上。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白表現於哺乳動物T細胞之表面上，包括諸如以下T細胞：T輔助細胞、細胞毒性T細胞(或者細胞毒性T淋巴細胞或CTL)、自然殺手T細胞、調節T細胞、記憶T細胞或γ δ T細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為抗原呈遞細胞(APC)。通常但非排他地，胞外域(或者「細胞外域」)包含本發明之變異型ICOSL之一或多個胺基酸變化(例如胺基酸取代)。因此，舉例而言，在一些實施例中，跨膜蛋白將包含胞外域，其包含本發明之變異型ICOSL之一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，工程改造細胞表現變異型ICOSL多肽，其為可為諸如跨膜蛋白之膜蛋白的跨膜免疫調節多肽(TIP)。在典型實施例中，膜蛋白之胞外域包含本文提供之變異型ICOSL之細胞外域或其IgSF域，其中含有如所描述之至少一個IgSF域中之一或多個胺基酸取代。本文提供之跨膜免疫調節蛋白另外含有連接至胞外域之跨膜域。在一些實施例中，跨膜域產生用於細胞上之細胞表面表現的所編碼蛋白質。在一些實施例中，跨膜域直接連接至胞外域。在一些實施例中，跨膜域經由一或多個連接子或間隔子間接連接至胞外域。在一些實施例中，跨膜域主要含有疏水性胺基酸殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。
在一些實施例中，全長跨膜錨域可用於確保TIP將表現於工程改造細胞，諸如工程改造T細胞之表面上。便利地，此可來自親和力經修飾之特定天然蛋白質(例如ICOSL或其他天然IgSF蛋白質)，且僅以與天然IgSF蛋白質(例如ICOSL)類似之方式融合至第一膜近端域之序列。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白包含對應參考(例如未經修飾的)或野生型IgSF成員之跨膜域，諸如包含於SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列中的跨膜域(表2)。在一些實施例中，膜結合形式包含對應參考(例如未經修飾的)或野生型多肽之跨膜域，諸如對應於SEQ ID NO: 5之殘基257-277。
在一些實施例中，跨膜域為並非天然ICOSL之跨膜域的非天然跨膜域。在一些實施例中，跨膜域衍生自來自另一非ICOSL家族成員多肽之跨膜域，該多肽為膜結合或跨膜蛋白。在一些實施例中，可使用來自T細胞上之另一蛋白質的跨膜錨域。在一些實施例中，跨膜域衍生自CD8。在一些實施例中，跨膜域可另外含有充當間隔域之CD8之細胞外部分。例示性CD8衍生之跨膜域闡述於SEQ ID NO: 246或483或其含有CD8跨膜域之一部分中。在一些實施例中，跨膜域為合成跨膜域。
在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白另外含有連接至跨膜域之胞內域，諸如細胞質信號傳導域。在一些實施例中，細胞質信號傳導域誘導細胞信號傳導。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白之胞內域包含對應參考(例如未經修飾的)或野生型多肽之細胞質域，諸如包含於SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列中的細胞質域(參見表2)。
在一些實施例中，為或包含變異型ICOSL之所提供跨膜免疫調節蛋白包含與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且含有如所描述之包含至少一個親和力經修飾之ICOSL IgSF域之胞外域及跨膜域的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白含有如所描述之IgSF域(例如IgV域)中之任何一或多個胺基酸取代，包括表1中所闡述之任何胺基酸取代。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白可進一步包含如所描述之細胞質域。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白可另外含有信號肽。在一些實施例中，信號肽為野生型IgSF成員之天然信號肽，諸如包含於SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列中(參見例如表2)。
在一些實施例中，提供包含胺基酸取代E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R或N52H/N57Y/Q100P之跨膜免疫調節蛋白。在一些實施例中，所提供跨膜免疫調節蛋白為或包含變異型ICOSL，其包含SEQ ID NO: 257中所闡述之胺基酸序列，但其中在SEQ ID NO: 257中之對應位置處含有胺基取代E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R或N52H/N57Y/Q100P，或與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且含有胺基酸取代E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R或N52H/N57Y/Q100P之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供跨膜免疫調節蛋白，其包含SEQ ID NO: 496或497 (各含有胺基酸取代N52D)、SEQ ID NO: 498或499 (各含有胺基酸取代N52H/N57Y/Q100P)、SEQ ID NO: 500或501 (各含有胺基酸取代E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/C198R)或SEQ ID NO: 502或503 (各含有胺基酸取代N52H/N57Y/Q100R)中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 495-503中之任一者包含至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且含有指定胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，當表現於工程改造細胞中時，此類跨膜免疫調節蛋白表現於細胞之表面上。
亦提供編碼此類跨膜免疫調節蛋白之核酸分子。在一些實施例中，編碼跨膜免疫調節蛋白之核酸分子包含編碼胺基酸序列之核苷酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且含有如所描述之包含至少一個親和力經修飾之IgSF域之胞外域、跨膜域及視情況存在之細胞質域。在一些實施例中，核酸分子可進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列。在一些實施例中，信號肽為對應野生型IgSF成員之天然信號肽(參見例如表2)。
例示性的跨膜免疫調節蛋白為ICOSL TIP，其包含i)SEQ ID NO: 383中所闡述之胺基酸序列，或ii)與SEQ ID NO: 243展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且包含SEQ ID NO: 243中所含之親和力經修飾之域或其中之胺基酸取代的胺基酸序列。亦提供i)SEQ ID NO: 244中所闡述之核苷酸序列，ii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且編碼包含SEQ ID NO: 243之親和力經修飾之域之TIP的序列，或iii)具有簡併密碼子之i)或ii)之序列。
在一些實施例中，提供CAR相關跨膜免疫調節蛋白，其中跨膜免疫調節蛋白之胞內域包含細胞質信號傳導域，其包含至少一個含ITAM (基於免疫受體酪胺酸之活化基元)之信號傳導域。ITAM為保守基元，其發現於涉及免疫細胞之信號轉導的多種蛋白質信號傳導域中，包括涉及T細胞受體信號轉導之CD3-ζ鏈(「CD3-z」)中。在一些實施例中，胞內域包含CD3-ζ信號傳導域。在一些實施例中，CD3-ζ信號傳導域包含SEQ ID NO: 243中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 247展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%且保留T細胞信號傳導活性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR相關跨膜免疫調節蛋白之胞內域可進一步包含協同刺激信號傳導域以進一步調節T細胞之免疫調節反應。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域為CD28、ICOS、41BB或OX40。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域衍生自CD28或4-1BB且包含SEQ ID NO: 484-487中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 484-487展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%且保留T細胞協同刺激信號傳導活性之胺基酸序列。在一些實施例中，所提供CAR相關跨膜免疫調節蛋白具有在親和力經修飾之IgSF域與同源結合配位體或反結構結合時刺激T細胞信號傳導之CAR之特徵。在一些實施例中，親和力經修飾之IgSF域與其反結構之特異性結合可導致T細胞活性之免疫活性變化，如由細胞毒性、增殖或細胞介素產生之變化反映。
在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白不含能夠介導細胞質信號傳導之胞內域。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白不具有野生型或未經修飾的多肽之信號轉導機制且因此其自身不誘導細胞信號傳導。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白不具有對應參考(例如未經修飾的)或野生型多肽之細胞內(細胞質)域或細胞內域之一部分，諸如SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列中所含之細胞質信號傳導域(參見表2)。在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白不含ITIM (基於免疫受體酪胺酸之抑制基元)，諸如包含於某些抑制受體，包括IgSF家族之抑制受體(例如PD-1或TIGIT)中。因此，在一些實施例中，跨膜免疫調節蛋白僅含有胞外域及跨膜域，諸如如所描述之任一者。
2. 分泌免疫調節蛋白及工程改造細胞
在一些實施例中，含有如本文所描述之胺基酸突變中之任何一或多者的ICOSL變異型免疫調節多肽為分泌型的，諸如當自細胞表現時。此類變異型ICOSL免疫調節蛋白不包含跨膜域。在一些實施例中，變異型ICOSL免疫調節蛋白不與半衰期延長部分(諸如Fc域或多聚化域)結合。在一些實施例中，變異型ICOSL免疫調節蛋白包含信號肽，例如抗體信號肽或其他有效信號序列以在細胞外部得到域。當免疫調節蛋白包含信號肽且藉由工程改造細胞表現時，信號肽使得免疫調節蛋白藉由工程改造細胞分泌。一般而言，信號肽，或信號肽之一部分藉由分泌自免疫調節蛋白裂解。免疫調節蛋白可由核酸(其可為之表現載體之一部分)編碼。在一些實施例中，免疫調節蛋白係藉由細胞(諸如免疫細胞，例如初生免疫細胞)表現及分泌。
因此，在一些實施例中，提供進一步包含信號肽之變異型ICOSL免疫調節蛋白。在一些實施例中，本文提供編碼變異型ICOSL免疫調節蛋白之核酸分子，其可操作地連接至編碼信號肽之分泌序列。
信號肽為免疫調節蛋白之N端上的序列，其自細胞傳導分泌免疫調節蛋白之信號。在一些實施例中，信號肽之長度為約5至約40個胺基酸(諸如長度為約5至約7、約7至約10、約10至約15、約15至約20、約20至約25、或約25至約30、約30至約35、或約35至約40個胺基酸)。
在一些實施例中，信號肽為來自對應野生型ICOSL之天然信號肽(參見表6)。在一些實施例中，信號肽為非天然信號肽。舉例而言，在一些實施例中，非天然信號肽為來自對應野生型ICOSL之突變天然信號肽，且可包括一或多個(諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個)取代、插入或缺失。在一些實施例中，非天然信號肽為與野生型IgSF家族成員來自相同IgSF家族之家族成員的信號肽或其突變體。在一些實施例中，非天然信號肽為與野生型IgSF家族成員來自不同IgSF家族之IgSF家族成員的信號肽或其突變體。在一些實施例中，信號肽為來自非IgSF蛋白質家族之信號肽或其突變體，諸如來自免疫球蛋白(諸如IgG重鏈或IgG-κ輕鏈)、細胞介素(諸如介白素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白(例如HSA或白蛋白)、人類天青殺素前蛋白信號序列、螢光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)之信號肽或其他能夠自細胞有效分泌蛋白質之信號肽。例示性信號肽包括表6中所述之任何信號肽。
在分泌型變異型ICOSL免疫調節蛋白之一些實施例中，免疫調節蛋白在表現時包含信號肽，且信號肽(或其一部分)在分泌時自免疫調節蛋白裂解。
在一些實施例中，工程改造細胞表現自細胞分泌之變異型ICOSL多肽。在一些實施例中，此類變異型ICOSL多肽在用於分泌之信號序列之可操作控制下由編碼免疫調節蛋白之核酸分子編碼。在一些實施例中，編碼之免疫調節蛋白在自細胞表現時分泌。在一些實施例中，由核酸分子編碼之免疫調節蛋白不包含跨膜域。在一些實施例中，由核酸分子編碼之免疫調節蛋白不包含半衰期延長部分(諸如Fc域或多聚化域)。在一些實施例中，由核酸分子編碼之免疫調節蛋白包含信號肽。在一些實施例中，本發明之核酸進一步包含編碼分泌或信號肽之核苷酸序列，其可操作地連接於編碼免疫調節蛋白之核酸，進而允許分泌免疫調節蛋白。
3. 細胞及工程改造細胞
本文提供表現所提供免疫調節多肽中之任一者的工程改造細胞。在一些實施例中，工程改造細胞在其表面上表現所提供跨膜免疫調節多肽中之任一者。在一些實施例中，工程改造細胞表現且可或能夠在適合於蛋白質分泌之條件下自細胞分泌免疫調節蛋白。在一些實施例中，免疫調節蛋白表現於淋巴細胞，諸如腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、T細胞或NK細胞之上或之中，或骨髓細胞上。在一些實施例中，工程改造細胞為抗原呈遞細胞(APC)。在一些實施例中，工程改造細胞為工程改造哺乳動物T細胞或工程改造哺乳動物抗原呈遞細胞(APC)。在一些實施例中，工程改造T細胞或APC為人類或鼠類細胞。
在一些實施例中，工程改造T細胞包括但不限於T輔助細胞、細胞毒性T細胞(或者細胞毒性T淋巴細胞或CTL)、自然殺手T細胞、調節T細胞、記憶T細胞或γ δ T細胞。在一些實施例中，工程改造T細胞為CD4+或CD8+。除了MHC之信號以外，工程改造T細胞亦需要協同刺激信號，其在一些實施例中藉由如先前所論述之以膜結合形式表現之變異型ICOSL跨膜免疫調節多肽提供。
在一些實施例中，工程改造APC包括例如表現MHC II之APC，諸如巨噬細胞、B細胞及樹突狀細胞，以及人工APC (aAPC)，包括細胞及非細胞(例如可生物降解聚合微粒)aAPC兩者。人工APC (aAPC)為APC之合成型式，其可以與APC類似之方式起作用，因為其將抗原呈遞至T細胞以及將其活化。抗原呈遞係藉由MHC (I類或II類)進行。在一些實施例中，在諸如aAPC之工程改造APC中，負載至MHC上之抗原在一些實施例中為腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原。負載至MHC上之抗原係藉由T細胞之T細胞受體(TCR)識別，該T細胞在一些情況下可表現ICOS、CD28或其他藉由本文提供之變異型ICOSL多肽識別之分子。可用於工程改造aAPC之材料包括：聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、氧化鐵、脂質體、脂質雙層、瓊脂糖及聚苯乙烯。
在一些實施例中，細胞aAPC可經工程改造以含有用於授受性細胞療法之TIP及TCR促效劑。在一些實施例中，細胞aAPC可經工程改造以含有TIP及TCR促效劑，其用於人類T細胞之離體擴增，諸如在投與之前，例如用於再引入至患者中。在一些態樣中，aAPC可包括表現至少一個抗CD3抗體純系，例如OKT3及/或UCHT1。在一些態樣中，aAPCs可不活化(例如經照射)。在一些實施例中，TIP可包括任何對於T細胞上之同源結合配位體展現結合親和力的變異型IgSF域。
在一些實施例中，本文提供之免疫調節蛋白，諸如跨膜免疫調節蛋白或分泌型免疫調節蛋白共表現或工程改造至表現抗原結合受體，諸如重組受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞中。在一些實施例中，工程改造細胞，諸如工程改造T細胞識別與癌症、發炎性及自體免疫性病症或病毒感染相關之所需抗原。在特定實施例中，抗原結合受體含有特異性結合腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原之抗原結合部分。在一些實施例中，工程改造T細胞為CAR (嵌合抗原受體)T細胞，其含有特異性結合至抗原，諸如腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原之抗原結合域(例如scFv)。在一些實施例中，抗原結合域(例如scFv)對特定抗原，例如CD19具有特異性。例示性的CAR為抗CD19 CAR，諸如含有SEQ ID NO: 482或SEQ ID NO: 245中所闡述之抗CD19 scFv之CAR。在一些實施例中，TIP蛋白質表現於工程改造T細胞受體細胞或工程改造嵌合抗原受體細胞中。在此類實施例中，工程改造細胞共表現TIP及CAR或TCR。在一些實施例中，SIP蛋白質表現於工程改造T細胞受體細胞或工程改造嵌合抗原受體細胞中。在此類實施例中，工程改造細胞共表現SIP及CAR或TCR。
嵌合抗原受體(CAR)為重組受體，其包括抗原結合域(胞外域)、跨膜域及能夠在抗原經結合之後將活化信號誘導或介導至T細胞的胞內信號傳導區(胞內域)。在一些實例中，CAR表現細胞經工程改造以表現細胞外單鏈可變片段(scFv)，其對於連接至包含活化域且在一些情況下，包含協同刺激域之胞內信號傳導部分的特定腫瘤抗原具有特異性。協同刺激域可衍生自例如CD28、OX-40、4-1BB/CD137或誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)。活化域可衍生自例如CD3，諸如CD3 ζ、ε、δ、γ或類似者。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個或更多個協同刺激域。CAR scFv可經設計以靶向表現於與疾病或病況相關之細胞上的抗原，例如腫瘤抗原，諸如CD19，其為藉由B細胞譜系中之細胞表現的跨膜蛋白，包括所有正常B細胞及B細胞惡性病，包括但不限於NHL、CLL及非T細胞ALL。實例CAR+ T細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309及2014/0050708號中，且此等參考文獻以全文引用之方式併入。
在一些態樣中，抗原結合域為抗體或其抗原結合片段，諸如單鏈片段(scFv)。在一些實施例中，抗原表現於腫瘤或癌細胞上。例示性的抗原為CD19。例示性的CAR為抗CD19 CAR，諸如含有SEQ ID NO: 245中所闡述之抗CD19 scFv的CAR。在一些實施例中，CAR另外含有間隔子、跨膜域及細胞內信號傳導域或包含ITAM信號傳導域，諸如CD3ζ信號傳導域之區。在一些實施例中，CAR進一步包括協同刺激信號傳導域。
在一些實施例中，CAR另外含有間隔子或鉸鏈、跨膜域及細胞內信號傳導域(胞內域)，其包含ITAM信號傳導域，諸如CD3ζ信號傳導域。在一些實施例中，CAR進一步包括協同刺激信號傳導域。協同刺激域可衍生自例如CD28、OX-40、4-1BB/CD137或誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個或更多個協同刺激域。CAR scFv可經設計以靶向表現於與疾病或病況相關之細胞上的抗原，例如腫瘤抗原，諸如CD19，其為藉由B細胞譜系中之細胞表現的跨膜蛋白，包括所有正常B細胞及B細胞惡性病，包括但不限於NHL、CLL及非T細胞ALL。實例CAR+ T細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309及2014/0050708號中，且此等參考文獻以全文引用之方式併入。在一些實施例中，當表現於細胞上時，間隔子或鉸鏈存在於抗原結合域與跨膜域之間，諸如在抗原結合域與質膜之間。在一些實施例中，間隔子或鉸鏈衍生自IgG子類(諸如IgG1及IgG4、IgD或CD8 (參見例如Qin等人 (2017) J. Hematol. Oncol., 10:68)。在一些實施例中，間隔子或鉸鏈衍生自IgG1。
在一些實施例中，間隔子及跨膜域為衍生自CD8之鉸鏈及跨膜域，諸如具有SEQ ID NO: 246、483或897中闡述之例示性序列或與SEQ ID NO: 246、483或897展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內域包含CD3-ζ信號傳導域。在一些實施例中，CD3-ζ信號傳導域包含SEQ ID NO: 243中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 247展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性且保留T細胞信號傳導活性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR之胞內域可進一步包含協同刺激信號傳導域或區以進一步調節T細胞之免疫調節反應。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域為或包含協同刺激區，或衍生自CD28、ICOS、41BB或OX40之協同刺激區。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域衍生自CD28或4-1BB且包含SEQ ID NO: 484-487中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 484-487展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性且保留T細胞協同刺激信號傳導活性之胺基酸序列。
本文提供編碼ICOSL多肽且編碼一或多種蛋白質之聚核苷酸，諸如重組抗原受體(例如嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體(TCR))、標記物及一或多種自體裂解肽。在一些實施例中，編碼CAR之構築體另外編碼第二蛋白質，諸如標記物，例如藉由自體裂解肽序列分離自CAR的可偵測蛋白質。在一些實例中，編碼變異型ICOSL多肽之核酸與一或多個為編碼蛋白質之核酸的序列分離，其中蛋白質編碼重組抗原受體(例如CAR或TCR)、標記物、細胞介素或趨化因子。核苷酸序列中之任一者可在載體，諸如病毒載體中。在一些實例中，病毒載體為慢病毒載體或反轉錄病毒載體。
在一些實施例中，自體裂解肽序列為F2A、T2A、E2A或P2A自體裂解肽。對於SEQ ID NO: 250、488、860-862中之任一者或與SEQ ID NO: 250、488、860-862中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列設定T2A自體裂解肽之例示性序列。在一些實施例中，T2A由SEQ ID NO: 249中所闡述之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 249中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之序列編碼。P2A自體裂解肽之例示性序列設定於SEQ ID NO: 863或與SEQ ID NO: 863展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列中。在一些情況下，核酸構築體編碼超過一個P2A自體裂解肽(諸如P2A1及P2A2)，其中核苷酸序列P2A1及P2A2各編碼SEQ ID NO: 863中所闡述之P2A，核苷酸序列可不同以避免序列之間的重組。
在一些實施例中，標記物為可偵測蛋白，諸如螢光蛋白，例如綠色螢光蛋白(GFP)或藍色螢光蛋白(BFP)。螢光蛋白標記物之例示性序列闡述於SEQ ID NO: 489、858、859、903或與SEQ ID NO: 489、858、859、903展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列中。
在一些實施例中，CAR為抗CD19 CAR，其具有SEQ ID NO: 479、490、491、492、898、899、901或902中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 479、490、491、492、898、899、901或902中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR由SEQ ID NO: 248或900中所闡述之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 248或900中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列編碼。
在另一實施例中，工程改造T細胞具有TCR，包括重組或工程改造TCR。在一些實施例中，TCR可為天然TCR。熟習此項技術者將認識到，一般而言，天然哺乳動物T細胞受體包含涉及抗原特異性識別及結合之α及β鏈(或γ及δ鏈)。在一些實施例中，TCR為經修飾之工程改造TCR。在一些實施例中，工程改造T細胞之TCR特異性結合至藉由APC呈遞之腫瘤相關或腫瘤特異性抗原。
在一些實施例中，免疫調節多肽，諸如跨膜免疫調節多肽或分泌型免疫調節多肽可藉由多種策略(諸如重組宿主細胞採用之彼等策略)併入至工程改造細胞，諸如工程改造T細胞或工程改造APC中。此項技術中已知多種將DNA構築體引入至初生T細胞中之方法。在一些實施例中，採用病毒轉導或質體電穿孔。在典型實施例中，編碼免疫調節蛋白之核酸分子或表現載體包含信號肽，其將表現之跨膜免疫調節蛋白定位至細胞膜或用於分泌。在一些實施例中，編碼本發明之跨膜免疫調節蛋白之核酸次選殖至病毒載體，諸如反轉錄病毒載體中，其允許表現於宿主哺乳動物細胞中。表現載體可引入至哺乳動物宿主細胞中，且在宿主細胞培養條件下，免疫調節蛋白表現於表面上或分泌。
在例示性實例中，初生T細胞可離體純化(CD4細胞或CD8細胞或兩者)且經由各種TCR/CD28促效劑，諸如抗CD3/抗CD28塗佈珠粒組成之活化方案刺激。在2或3天活化過程之後，含有免疫調節多肽之重組表現載體可經由技術標準慢病毒或反轉錄病毒轉導方案或質體電穿孔策略穩定地引入至初生T細胞中。可藉由例如流動式細胞測量術，使用與天然親本分子及包含變異型ICOSL之多肽交叉反應的抗-抗原決定基標籤或抗體監測細胞之免疫調節多肽表現。表現免疫調節多肽之T細胞可取決於應用而經由用抗-抗原決定基標籤抗體分選富集或針對高或低表現富集。
在免疫調節多肽表現後，可藉由多種方法分析工程改造T細胞之適當功能。可證實工程改造CAR或TCR共表現以顯示此部分之工程改造T細胞不受免疫調節蛋白之表現顯著影響。一旦證實，標準活體外細胞毒性、增殖或細胞介素分析(例如IFN-γ表現)可用於評估工程改造T細胞之功能。例示性標準端點為培養上清液中之腫瘤株溶解%、工程改造T細胞增殖或IFN-γ蛋白質表現。可選擇相比於對照構築體，導致統計顯著增加之腫瘤株溶解、增加之工程改造T細胞增殖或增加之IFN-γ表現的工程改造構築體。另外，非工程改造，諸如天然初生或內源性T細胞亦可併入至相同活體外分析中以量測表現於工程改造細胞，諸如工程改造T細胞上之免疫調節多肽構築體調節活性，包括在一些情況下在旁鄰、天然T細胞中活化及產生效應物功能之能力。可在內源性T細胞上監測增加之活化標記物(諸如CD69、CD44或CD62L)表現，且增加之增殖及/或細胞介素產生可指示表現於工程改造T細胞上之免疫調節蛋白的所需活性。
在一些實施例中，類似分析可用於比較單獨含有CAR或TCR之工程改造T細胞與含有CAR或TCR及TIP構築體之彼等T細胞的功能。通常，此等活體外分析係藉由將各種比率之工程改造T細胞及含有同源CAR或TCR抗原之「腫瘤」細胞株一起平鋪在培養物中而進行。標準端點為培養上清液中之腫瘤株溶解%、工程改造T細胞增殖或IFN-γ產生。可選擇相比於單獨的相同TCR或CAR構築體，導致統計顯著增加之腫瘤株溶解、增加之工程改造T細胞增殖或增加之IFN-γ產生的工程改造免疫調節蛋白。
可在免疫功能不全小鼠，如不具有小鼠T、NK及B細胞之NSG菌株中分析工程改造人類T細胞。其中CAR或TCR結合異種移植物上之目標反結構且與TIP親和力經修飾之IgSF域共表現之工程改造人類T細胞可以相比於異種移植物不同之細胞數目及比率在活體內授受性轉移。舉例而言，含有螢光素酶/GFP載體之CD19+白血病腫瘤株之移植可經由生物發光或藉由流動式細胞測量術離體監測。在通常實施例中，異種移植物引入至鼠類模型中，若干天後接著引入工程改造T細胞。可分析含有免疫調節蛋白之工程改造T細胞相對於單獨含有CAR或TCR之工程改造T細胞增加之存活期、腫瘤清除率或擴大之工程改造T細胞數目。如同活體外分析，內源性、天然(亦即，非工程改造)人類T細胞可共授受性轉移以查看該群體中之成功抗原決定基擴展，導致較佳存活期或腫瘤清除率。
D. 表現變異型多肽及免疫調節蛋白之傳染媒介物
亦提供傳染媒介物，其含有編碼變異型多肽中之任一者，諸如ICOSL vIgD多肽之核酸，包括本文所述之分泌型或跨膜免疫調節蛋白。在一些實施例中，此類傳染媒介物可將編碼本文所述之變異型免疫調節多肽，諸如ICOSL vIgD多肽之核酸遞送至個體之靶細胞，例如個體之免疫細胞及/或抗原呈遞細胞(APC)或腫瘤細胞。亦提供包含於此類傳染媒介物中之核酸，及/或用於此類傳染媒介物之產生或之核酸，諸如載體及/或質粒，及包含此類傳染媒介物之組合物。在一些實施例中，變異型ICOSL多肽表達於傳染媒介物(例如病毒劑或細菌劑)中，其在投與個體後能夠活體內感染細胞，諸如免疫細胞(例如T細胞或抗原呈遞細胞)或腫瘤，用於在細胞中以TIP或SIP形式遞送或表現變異型多肽。
在一些實施例中，傳染媒介物為微生物(microorganism/microbe)。在一些實施例中，傳染媒介物為病毒或細菌。在一些實施例中，傳染媒介物為病毒。在一些實施例中，傳染媒介物為細菌。在一些實施例中，該等傳染媒介物可遞送編碼任何變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括本文所述之分泌型或跨膜免疫調節蛋白的核酸序列。因此，在一些實施例中，可使個體中藉由傳染媒介物感染或接觸之細胞表現於細胞表面上或分泌變異型免疫調節多肽。在一些實施例中，傳染媒介物亦可將一或多種其他療法或編碼其他療法之核酸遞送至細胞及/或個體內之環境。在一些實施例中，可藉由傳染媒介物遞送之其他療法包括細胞介素或其他免疫調節分子。
在一些實施例中，傳染媒介物，例如病毒或細菌含有編碼任何變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括本文所述之分泌型或跨膜免疫調節蛋白之核酸序列，且藉助於接觸及/或感染個體之細胞，細胞表現由傳染媒介物中所含之核酸序列編碼的變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括分泌型或跨膜免疫調節蛋白。在一些實施例中，傳染媒介物可向該個體投與。在一些實施例中，傳染媒介物可自個體離體引入至細胞。
在一些實施例中，藉由經傳染媒介物感染之細胞表現之變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括跨膜免疫調節蛋白為跨膜蛋白且經表面表現。在一些實施例中，藉由經傳染媒介物感染之細胞表現之變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括分泌型免疫調節蛋白係表現及分泌自細胞。跨膜免疫調節蛋白或分泌免疫調節蛋白可為本文所述之任一者。
在一些實施例中，個體中藉由傳染媒介物靶向之細胞包括腫瘤細胞、免疫細胞及/或抗原呈遞細胞(APC)。在一些實施例中，傳染媒介物靶向腫瘤微環境(TME)中之細胞。在一些實施例中，傳染媒介物將編碼變異型多肽，諸如ICOSL vIgD多肽，包括分泌型或跨膜免疫調節蛋白之核酸遞送至適當細胞(例如APC，諸如在其細胞表面上呈現肽/MHC複合體之細胞，諸如樹突狀細胞)或組織(例如淋巴組織)，其調變免疫反應及/或特定細胞藥用免疫反應，例如CD4及/或CD8T細胞反應，該CD8 T細胞反應可包括細胞毒素T細胞(CTL)反應。在一些實施例中，傳染媒介物靶向APC，諸如樹突狀細胞(DC)。在一些實施例中，藉由本文所述之傳染媒介物遞送之核酸分子包括可操作地連接之編碼序列之表現所必需的適當核酸序列，該等編碼序列編碼特定靶細胞中之變異型免疫調節多肽，例如調節元件，諸如啟動子。
在一些實施例中，含有編碼免疫調節多肽之核酸序列的傳染媒介物亦可含有編碼一或多種額外基因產物，例如細胞介素、前藥轉化酶、細胞毒素及/或可偵測基因產物之核酸序列。例如，在一些實施例中，傳染媒介物為溶瘤病毒且該病毒可包含編碼額外治療性基因產物之核酸序列(參見例如Kirn等人, (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71；Garcia-Aragoncillo等人, (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411；參見美國專利第7,588,767、7,588,771、7,662,398及7,754,221號及美國專利申請第2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917及2011/0064650號。在一些實施例中，額外基因產物可為可導致靶細胞(例如腫瘤細胞)死亡之治療性基因產物或可加強或增強或調節免疫反應之基因產物(例如細胞介素)。例示性基因產物亦包括抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、免疫檢查點抑制劑、抗體、細胞介素、生長因子、抗原、細胞毒性基因產物、促凋亡基因產物、抗凋亡基因產物、細胞基質降解基因、用於組織再生或將人類體細胞再程式化為多能性之基因，及本文所述或熟習此項技術者已知之其他基因。在一些實施例中，額外基因產物為粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。
1. 病毒
在一些實施例中，傳染媒介物為病毒。在一些實施例中，傳染媒介物為溶瘤病毒，或靶向特定細胞，例如免疫細胞之病毒。在一些實施例中，傳染媒介物靶向個體中之腫瘤細胞及/或癌細胞。在一些實施例中，傳染媒介物靶向免疫細胞或抗原呈遞細胞(APC)。
在一些實施例中，傳染媒介物為溶瘤病毒。溶瘤病毒為積聚於腫瘤細胞中且複製於腫瘤細胞中之病毒。藉助於腫瘤細胞中之複製，及視情況遞送編碼本文所述之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽之核酸，腫瘤細胞經溶解，且腫瘤縮小且可消除。溶瘤病毒亦可具有較寬宿主及細胞類型範圍。例如，溶瘤病毒可積聚於免疫赦免細胞或免疫赦免組織，包括腫瘤及/或轉移灶中，且亦包括受傷組織及細胞，因此允許在大範圍之細胞類型中遞送及表現編碼本文所述之變異型免疫調節多肽的核酸。溶瘤病毒亦可以腫瘤細胞特異性方式複製，導致腫瘤細胞溶解及高效腫瘤消退。
例示性溶瘤病毒包括腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、水皰性氣孔病毒(Vesticular Stomatic virus)、里奧病毒(Reovirus)、新城雞瘟病毒(Newcastle Disease virus)、小病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒(vesticular stomatitis virus；VSV)、科沙奇病毒(Coxsackie virus)及牛痘病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒可特異性定殖實體腫瘤，而不感染其他器官，且可用作傳染媒介物以將編碼本文所述之變異型免疫調節多肽之核酸遞送至此類實體腫瘤。
用於遞送編碼本文所述之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽之核酸的溶瘤病毒可為熟習此項技術者已知之彼等中之任一者且包括例如水泡性口炎病毒，參見例如美國專利第7,731,974、7,153,510、6,653,103號及美國專利公開案第2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818號及歐洲專利第1385466、1606411及1520175號；單純疱疹病毒，參見例如美國專利第7,897,146、7,731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968號及美國專利公開案第2014/0154216、2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894、2004/0009604、2004/0063094號，國際專利公開案第WO 2007/052029、WO 1999/038955號；反轉錄病毒，參見例如美國專利第6,689,871、6,635,472、5,851,529、5,716,826、5,716,613號及美國專利公開案第20110212530號；牛痘病毒，參見例如2016/0339066；及腺相關病毒，參見例如美國專利第8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045及6,632,670號。
溶瘤病毒亦包括如下病毒：已經基因改變以減弱其毒性、改善其安全概況、促進其腫瘤特異性，且其亦已具有額外基因，例如細胞毒素、細胞介素、前藥轉化酶以提高病毒之總體功效(參見例如Kirn等人, (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71；Garcia-Aragoncillo等人, (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411；參見美國專利第7,588,767、7,588,771、7,662,398及7,754,221號及美國專利公開案第2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917及2011/0064650號)。在一些實施例中，溶瘤病毒可為已經修飾以使其選擇性複製於癌細胞中，且因此溶瘤之彼等。例如，溶瘤病毒為已經工程改造以具有針對腫瘤療法之經修飾之向性且亦作為基因療法載體之腺病毒。例示性的此類病毒為ONYX-015、H101及Ad5ΔCR (Hallden及Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16:945-58)及TNFerade (McLoughlin等人 (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825-30)，或條件性複製腺病毒Oncorine®。
在一些實施例中，傳染媒介物為經修飾之單純疱疹病毒。在一些實施例中，傳染媒介物為經修飾型式之Talimogene laherparepvec (亦稱為T-Vec、Imlygic或OncoVex GM-CSF)，其經修飾以含有編碼本文所述之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽中之任一者的核酸。在一些實施例中，傳染媒介物為描述於例如WO 2007/052029、WO 1999/038955、US 2004/0063094、US 2014/0154216中之經修飾之單純疱疹病毒，或其變異體。
在一些實施例中，傳染媒介物為靶向投與病毒之個體中之特定細胞類型的病毒，例如靶向免疫細胞或抗原呈遞細胞(APC)之病毒。樹突狀細胞(DC)為用於起始及控制免疫反應之必需APC。DC可捕獲及加工抗原、自周邊遷移至淋巴器官且以主要組織相容複合體(MHC)受限方式將抗原呈遞至靜息T細胞。在一些實施例中，傳染媒介物為可特異性靶向DC以遞送編碼變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽之核酸用於表現於DC中之病毒。在一些實施例中，病毒為慢病毒或其變異體或衍生物，諸如整合缺陷型慢病毒載體。在一些實施例中，病毒為慢病毒，其經假型化以有效結合至及高效感染表現細胞表面標記物樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3捕獲非整合素(DC-SIGN)，諸如DC之細胞。在一些實施例中，病毒為經辛得比斯病毒E2醣蛋白或其修飾形式假型化之慢病毒，諸如描述於WO 2013/149167中之彼等。在一些實施例中，病毒允許將所關注之序列(例如編碼本文所述之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽中之任一者之核酸)遞送及表現至DC。在一些實施例中，病毒包含描述於WO 2008/011636、US 2011/0064763、Tareen等人 (2014) Mol. Ther., 22:575-587中之彼等，或其變異體。例示性的樹突狀細胞向性載體平台為ZVex™。
2. 細菌
在一些實施例中，傳染媒介物為細菌。例如，在一些實施例中，細菌可將編碼本文所述之變異型免疫調節多肽中之任一者，例如變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽之核酸遞送至個體中之靶細胞，諸如腫瘤細胞、免疫細胞、抗原呈遞細胞及/或吞噬細胞。在一些實施例中，細菌可優先靶向個體內之特定環境，諸如腫瘤微環境(TME)，以表現及/或分泌變異型免疫調節多肽，及/或靶向環境中之特定細胞以表現變異型免疫調節多肽。
在一些實施例中，細菌經由細菌介導之質體DNA轉移至哺乳動物細胞(亦稱為「細菌感染(bactofection)」)而將核酸遞送至細胞。舉例而言，在一些實施例中，遺傳物質遞送係經由整個細菌進入靶細胞中而達成。在一些實施例中，自發性或誘導性細菌溶解可導致質體釋放以用於後續真核細胞表現。在一些實施例中，細菌可將核酸遞送至非吞噬細胞哺乳動物細胞(例如腫瘤細胞)及/或吞噬細胞，例如某些免疫細胞及/或APC。在一些實施例中，藉由細菌遞送之核酸可轉移至個體之細胞的細胞核以用於表現。在一些實施例中，核酸亦包括可操作地連接之序列之表現所必需的適當核酸序列，該等序列編碼特定宿主細胞中之變異型免疫調節多肽，例如調節元件，諸如啟動子或增強子。在一些實施例中，為細菌之傳染媒介物可遞送編碼免疫調節蛋白之核酸，該等核酸呈RNA，諸如遞送至靶細胞之細胞質以藉由靶細胞之機構轉譯的預製轉譯勝任型RNA形式。
在一些實施例中，細菌可複製及溶解靶細胞，例如腫瘤細胞。在一些實施例中，細菌可含有及/或釋放靶細胞之細胞質中之核酸序列及/或基因產物，進而殺死靶細胞，例如腫瘤細胞。在一些實施例中，傳染媒介物為可特異性複製於個體中之特定環境，例如腫瘤微環境(TME)中之細菌。舉例而言，在一些實施例中，細菌可特異性複製於厭氧或低氧微環境中。在一些實施例中，存在於特定環境中之條件或因子，例如由TME中之細胞產生之天冬胺酸、絲胺酸、檸檬酸鹽、核糖或半乳糖可充當化學引誘劑以將細菌吸引至該環境。在一些實施例中，細菌可在環境，例如TME中表現及/或分泌本文所述之免疫調節蛋白。
在一些實施例中，傳染媒介物為李氏菌屬(Listeria sp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium sp.)、埃希氏桿菌屬(Escherichia sp.)、梭菌屬(Clostridium sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、志賀桿菌屬(Shigella sp.)、弧菌屬(Vibrio sp.)或耶爾森菌屬(Yersinia sp.)之細菌。在一些實施例中，細菌係選自以下中之一或多者：單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、豬霍亂沙門菌(Salmonella choleraesuis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、諾維氏梭菌(Clostridium novyi)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)及青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)。在一些實施例中，細菌為工程改造細菌。在一些實施例中，細菌為工程改造細菌，諸如Seow及Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767-777；Baban等人 (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394；Patyar等人 (2010) J Biomed Sci 17:21；Tangney等人 (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287；van Pijkeren等人 (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416；WO 2012/149364；WO 2014/198002；US 9103831；US 9453227；US 2014/0186401；US 2004/0146488；US 2011/0293705；US 2015/0359909及EP 3020816中所述之彼等。細菌可經修飾以遞送編碼本文提供之變異型免疫調節多肽、結合物及/或融合物中之任一者的核酸序列，及/或在個體中表現此類變異型免疫調節多肽。
IV. 用於產生多肽或細胞之核酸、載體及方法
本文提供統稱為「核酸」之經分離或重組核酸，其編碼本文提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽之各種所提供實施例中之任一者。在一些實施例中，本文提供之核酸，包括下文所述之所有核酸適用於重組產生(例如表現)本文提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽。在一些實施例中，本文提供之核酸，包括下文所述之所有核酸適用於在細胞，諸如工程改造細胞，例如免疫細胞或傳染媒介物細胞中表現本文提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽。本文提供之核酸可呈RNA形式或呈DNA形式，且包括mRNA、cRNA、重組或合成RNA及DNA，及cDNA。本文提供之核酸通常為DNA分子，且通常為雙股DNA分子。然而，亦提供包含本發明之核苷酸序列中之任一者的單股DNA、單股RNA、雙股RNA及雜交DNA/RNA核酸或其組合。
本文亦提供適用於產生本文提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽的重組表現載體及重組宿主細胞。
本文亦提供工程改造細胞，諸如工程改造免疫細胞，其含有所提供核酸分子中之任一者或變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽中之任一者，諸如跨膜免疫調節多肽或分泌型免疫調節多肽中之任一者。
本文亦提供傳染媒介物，諸如細菌或病毒細胞，其含有所提供核酸分子中之任一者或變異型ICOSL多肽或免疫調節多肽中之任一者，諸如跨膜免疫調節多肽或分泌型免疫調節多肽中之任一者。
在以上所提供實施例中之任一者中，編碼本文提供之變異型多肽或免疫調節多肽之核酸可使用重組DNA及選殖技術引入至細胞中。為此，製備編碼免疫調節多肽之重組DNA分子。製備此類DNA分子之方法為此項技術中熟知的。舉例而言，編碼肽之序列可使用適合之限制酶自DNA切除。或者，DNA分子可使用化學合成技術，諸如亞磷醯胺法合成。另外，可使用此等技術之組合。在一些情況下，重組或合成核酸可經由聚合酶鏈反應(PCR)產生。在一些實施例中，可產生編碼一或多種含有至少一個親和力經修飾之IgSF域，及在一些實施例中，信號肽、跨膜域及/或胞內域(根據所提供描述)之變異型ICOSL多肽的DNA插入序列。此DNA插入序列可選殖至熟習此項技術者已知之適當轉導/轉染載體中。亦提供含有核酸分子之表現載體。
在一些實施例中，表現載體能夠在適合於表現蛋白質之條件下表現適當細胞中之免疫調節蛋白。在一些態樣中，核酸分子或表現載體包含DNA分子，其編碼以可操作方式連接於適當表現控制序列之免疫調節蛋白。在DNA分子插入至載體中之前或之後實現此有效連接之方法已為所熟知。表現控制序列包括啟動子、活化子、增強子、操縱子、核糖體結合位點、起始信號、停止信號、帽信號、聚腺苷酸化信號及轉錄或轉譯控制涉及之其他信號。
在一些實施例中，免疫調節蛋白之表現係藉由啟動子或增強子控制以控制或調節表現。啟動子可操作地連接於編碼變異型多肽或免疫調節蛋白之核酸分子的部分。在一些實施例中，啟動子為組成性活性啟動子(諸如組織特異性組成性活性啟動子或其他組成性啟動子)。在一些實施例中，啟動子為誘導性啟動子，其可回應於誘導劑(諸如T細胞活化信號)。
在一些實施例中，組成性啟動子以可操作方式連接於編碼變異型多肽或免疫調節蛋白之核酸分子。例示性組成性啟動子包括猴空泡病毒40 (SV40)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子、泛素C (UbC)啟動子及EF-1 α (EF1a)啟動子。在一些實施例中，組成性啟動子為組織特異性的。舉例而言，在一些實施例中，啟動子允許在特定組織，諸如免疫細胞、淋巴細胞或T細胞中組成性表現免疫調節蛋白。例示性組織特異性啟動子描述於美國專利第5,998,205號中，包括例如胎蛋白、DF3、酪胺酸酶、CEA、界面活性劑蛋白及ErbB2啟動子。
在一些實施例中，誘導性啟動子以可操作方式連接於編碼變異型多肽或免疫調節蛋白之核酸分子，使得核酸表現可藉由控制適當轉錄誘導因子之存在或不存在而控制。舉例而言，啟動子可為經調節之啟動子及轉錄因子表現系統，諸如公佈之四環素調節之系統或其他可調節系統(參見例如公佈之國際PCT申請第WO 01/30843號)，以允許編碼多肽之經調節之表現。例示性可調節啟動子系統為例如可獲自Clontech (Palo Alto, CA)之Tet-On (及Tet-Off)系統。此啟動子系統允許藉由四環素或四環素衍生物，諸如多西環素控制之經調節之轉殖基因表現。其他可調節啟動子系統為吾人所知(參見例如名稱為「使用單鏈、單體、配位體依賴性多肽開關調節基因表現(Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches)」之公佈之美國申請案第2002-0168714號，其描述含有配位體結合域及轉錄調節域之基因開關，諸如來自激素受體之彼等)。
在一些實施例中，啟動子回應於元件，該元件回應於T細胞活化信號傳導。僅僅作為舉例，在一些實施例中，工程改造T細胞包含編碼免疫調節蛋白之表現載體及可操作地連接以控制免疫調節蛋白之表現的啟動子。工程改造T細胞可例如藉由經由工程改造T細胞受體(TCR)嵌合抗原受體(CAR)之信號傳導活化，且因此經由反應性啟動子觸發免疫調節蛋白之表現及分泌。
在一些實施例中，誘導性啟動子以可操作方式連接於編碼免疫調節蛋白之核酸分子，使得免疫調節蛋白回應於活化T細胞核因子(NFAT)或活化B細胞之核因子κ-輕鏈增強子(NF-κB)而表現。舉例而言，在一些實施例中，誘導性啟動子包含用於NFAT或NF-κB之結合位點。舉例而言，在一些實施例中，啟動子為NFAT或NF-κB啟動子或其功能變異體。因此，在一些實施例中，核酸使得能夠控制免疫調節蛋白之表現，同時亦降低或消除免疫調節蛋白之毒性。特定言之，包含本發明之核酸的工程改造免疫細胞僅在細胞(例如藉由細胞表現之T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR))藉由抗原特異性刺激及/或細胞(例如細胞之鈣信號傳導路徑)藉由例如豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)/離子黴素非特異性刺激時表現及分泌免疫調節蛋白。因此，免疫調節蛋白之表現及，在一些情況下，分泌可經控制以僅在需要其之時間或地點(例如在引起感染性疾病之藥劑存在下，或在腫瘤位點處)發生，此可減少或避免非所需免疫調節蛋白相互作用。
在一些實施例中，編碼本文所述之免疫調節蛋白之核酸包含編碼NFAT啟動子、NF-κB啟動子或其功能變異體的適合之核苷酸序列。如本文所用之「NFAT啟動子」意指一或多個對連接至最小啟動子之元件起反應之NFAT。「NF-κB啟動子」係指一或多個對連接至最小啟動子之元件起反應之NF-κB。在一些實施例中，基因之最小啟動子為最小人類IL-2啟動子或CMV啟動子。對元件起反應之NFAT可包含例如對元件起反應之NFAT1、NFAT2、NFAT3及/或NFAT4。NFAT啟動子、NF-κB啟動子或其功能變異體可包含任何數目的結合基元，例如至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、或至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個或至多十二個結合基元。
在其上具有DNA分子之所得重組表現載體用於轉化適當宿主。此轉化可使用此項技術中熟知之方法進行。在一些實施例中，本文提供之核酸進一步包含編碼可操作地連接於編碼免疫調節多肽之核酸之分泌或信號肽的核苷酸序列，使得所得可溶免疫調節多肽回收自培養基、宿主細胞或宿主細胞周質。在其他實施例中，選擇適當表現控制信號以允許免疫調節多肽之膜表現。此外，市售套組以及合同製造公司亦可用於製造本文提供之工程改造細胞或重組宿主細胞。
在一些實施例中，在其上具有DNA分子之所得表現載體用於轉化，諸如轉導適當細胞。引入可使用此項技術中熟知之方法進行。例示性方法包括轉移編碼受體之核酸的方法，包括經由病毒，例如反轉錄病毒或慢病毒；轉導、轉座子及電穿孔。在一些實施例中，表現載體為病毒載體。在一些實施例中，核酸係藉由慢病毒或反轉錄病毒轉導方法轉移至細胞中。
大多數公開可用及熟知的哺乳動物宿主細胞，包括哺乳動物T細胞或APC中之任一者可用於製備多肽或工程改造細胞。細胞選擇取決於由此項技術識別之多種因素。此等包括例如與所選表現載體之相容性、由DNA分子編碼之肽的毒性、轉化速率、肽回收簡易性、表現特徵、生物安全性及成本。此等因素之平衡必須被並非所有細胞可同樣有效地表現特定DNA序列之理解觸動。
在一些實施例中，宿主細胞可為多種真核細胞，諸如酵母細胞，或哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)或HEK293細胞。在一些實施例中，宿主細胞為懸浮細胞且多肽係在培養懸浮液，諸如培養懸浮CHO細胞，例如CHO-S細胞中工程改造或產生。在一些實例中，細胞株為DHFR缺陷型(DHFR-) CHO細胞株，諸如DG44及DUXB11。在一些實施例中，細胞為麩醯胺酸合成酶(GS)缺陷型的，例如CHO-S細胞、CHOK1 SV細胞及CHOZN((R)) GS-/-細胞。在一些實施例中，CHO細胞，諸如懸浮CHO細胞可為CHO-S-2H2細胞、CHO-S-純系14細胞或ExpiCHO-S細胞。
在一些實施例中，自CHO細胞表現所提供ICOSL多肽產生所產生蛋白質之更均質組合物。在一些實施例中，相比於含有完全ECD參考序列及/或含有蛋白酶裂解位點(例如LQQN/LT)之ICOSL多肽，所提供ICOSL多肽在蛋白質自CHO細胞表現時產生更均質產物。在一些實施例中，含有本文產生之ICOSL變異型多肽之所產生蛋白質之組合物的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%具有相同胺基酸長度或為相同尺寸。評估尺寸均質性之技術包括高效液相層析(HPLC)、尺寸排阻層析、SDS page或定序。
在一些實施例中，宿主細胞亦可為原核細胞，諸如在大腸桿菌之情況下。轉化之重組宿主係在多肽表現條件下培養，且接著純化以獲得可溶性蛋白質。重組宿主細胞可在習知醱酵條件下培養以表現所需多肽。此類醱酵條件為此項技術中所熟知。最後，本文提供之多肽可藉由此項技術中熟知之多種方法中之任一者回收及純化自重組細胞培養物，包括硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析及親和性層析。蛋白質再摺疊步驟可視需要用於完成成熟蛋白之組態。最後，高效液相層析(HPLC)可用於最終純化步驟。
在一些實施例中，細胞為免疫細胞，諸如結合製備工程改造細胞在上文所述之任何免疫細胞。在一些實施例中，此類工程改造細胞為初生細胞。在一些實施例中，工程改造細胞對個體而言為自體的。在一些實施例中，工程改造細胞對個體而言為同種異體的。在一些實施例中，工程改造細胞係獲自個體，諸如藉由白血球清除術，且離體轉化以用於表現免疫調節多肽，例如跨膜免疫調節多肽或分泌型免疫調節多肽。
亦提供編碼本文所述之傳染媒介物中所含之變異型免疫調節多肽中之任一者的核酸。在一些實施例中，傳染媒介物將核酸遞送至個體中之細胞，及/或准許在細胞中表現編碼之變異型多肽。亦提供用於產生、生產或修飾此類傳染媒介物之核酸。舉例而言，在一些實施例中，提供含有編碼變異型免疫調節多肽之核酸的載體及/或質體，用於產生傳染媒介物、遞送至個體中之細胞及/或在個體中之細胞中表現變異型免疫調節多肽。
在一些實施例中，所提供核酸為含有編碼變異型免疫調節多肽之核酸序列的重組病毒或細菌載體。在一些實施例中，重組載體可用於產生含有編碼變異型免疫調節多肽之核酸序列的傳染媒介物及/或遞送至個體中之靶細胞以藉由靶細胞表現。在一些實施例中，重組載體為表現載體。在一些實施例中，重組載體包括產生及/或生產傳染媒介物及表現於靶細胞中所需之適當序列。
在一些實施例中，重組載體為質體或黏質體。如本文所述之含有編碼變異型免疫調節多肽之核酸序列的質體或黏質體易於使用此項技術中熟知之標準技術構築。為了產生傳染媒介物，載體或基因組可以質體形式構築，該質體形式可隨後轉染至包裝或生產細胞株或宿主細菌中。重組載體可使用此項技術中已知之重組技術中之任一者產生。在一些實施例中，載體可包括原核複製起點及/或基因，其表現賦予可偵測或可選擇標記物諸如耐藥性以用於在原核系統中進行傳播及/或選擇。
在一些實施例中，重組載體為病毒載體。例示性重組病毒載體包括慢病毒載體基因組、痘病毒載體基因組、牛痘病毒載體基因組、腺病毒載體基因組、腺病毒相關病毒載體基因組、疱疹病毒載體基因組及α病毒載體基因組。病毒載體可為活、減毒、複製條件性或複製缺陷性、非致命性(缺陷性)、複製勝任型病毒載體，及/或經修飾以表現異源基因產物，例如本文提供之變異型免疫調節多肽。用於產生病毒之載體亦可經修飾以改變病毒之減毒，其包括任何增加或減少轉錄或轉譯負荷之方法。
可用之例示性病毒載體包括經修飾之牛痘病毒載體參見例如Guerra等人, J. Virol. 80:985-98 (2006)；Tartaglia等人, AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992)；Gheradi等人, J. Gen. Virol. 86:2925-36 (2005)；Mayr等人, Infection 3:6-14 (1975); Hu等人, J. Virol. 75: 10300-308 (2001)；美國專利第5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615及7,368,116號)；腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體(參見例如Molin等人, J. Virol. 72:8358-61 (1998)；Narumi等人, Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998)；Mercier等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004)；美國專利第6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296號)；反轉錄病毒載體，包括基於鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、嗜親性反轉錄病毒、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)、人類免疫不全病毒(HIV)及組合之彼等(參見例如Buchscher等人, J. Virol. 66:2731-39 (1992)；Johann等人, J. Virol. 66: 1635-40 (1992)；Sommerfelt等人, Virology 176:58-59 (1990)；Wilson等人, J. Virol. 63:2374-78 (1989) ；Miller等人, J. Virol. 65:2220-24 (1991)；Miller等人, Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990) ；Kolberg, NIH Res. 4:43 1992；Cornetta等人, Hum. Gene Ther. 2:215 (1991))；慢病毒載體，包括基於人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、貓類免疫缺陷病毒(FIV)、馬類感染性貧血病毒、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)及梅迪/維斯那病毒(maedi/visna virus)(參見例如Pfeifer等人, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211 (2001)；Zufferey等人, J. Virol. 72: 9873, 1998；Miyoshi等人, J. Virol. 72:8150, 1998；Philpott及Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007；Engelman等人, J. Virol. 69: 2729, 1995；Nightingale等人, Mol. Therapy, 13: 1121, 2006；Brown等人, J. Virol. 73:9011 (1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams等人, J. Virol. 77: 11150, 2003；Powell等人, J. Virol. 70:5288, 1996)或其任何變異體，及/或可用於產生上文所述之病毒中之任一者的載體。在一些實施例中，重組載體可在包裝細胞株中包括調節序列，諸如啟動子或增強子序列，其可調節病毒基因組之表現，諸如在RNA病毒之情況下(參見例如美國專利第5,385,839及5,168,062號)。
在一些實施例中，重組載體為表現載體，例如准許在遞送至靶細胞，例如個體中之細胞，例如腫瘤細胞、免疫細胞及/或APC中時表現編碼基因產物之表現載體。在一些實施例中，傳染媒介物中所含之重組表現載體能夠在適合於表現蛋白質之條件下表現個體之靶細胞組織免疫調節蛋白。
在一些態樣中，核酸或表現載體包含核酸序列，其編碼以可操作方式連接於適當表現控制序列之免疫調節蛋白。在編碼免疫調節蛋白之核酸序列插入至載體中之前或之後實現此有效連接之方法已為所熟知。表現控制序列包括啟動子、活化子、增強子、操縱子、核糖體結合位點、起始信號、停止信號、帽信號、聚腺苷酸化信號及轉錄或轉譯控制涉及之其他信號。啟動子能夠可操作地連接於編碼免疫調節蛋白之核酸序列部分。在一些實施例中，啟動子為靶細胞中之組成性活性啟動子(諸如組織特異性組成性活性啟動子或其他組成性啟動子)。舉例而言，重組表現載體亦可包括淋巴組織特異性轉錄調節元件(TRE)，諸如B淋巴細胞、T淋巴細胞或樹突狀細胞特異性TRE。淋巴組織特異性TRE為此項技術中已知的(參見例如Thompson等人, Mol. Cell. Biol. 12:1043-53 (1992)；Todd等人, J. Exp. Med. 177:1663-74 (1993)；Penix等人, J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993))。在一些實施例中，啟動子為誘導性啟動子，其可回應於誘導劑(諸如T細胞活化信號)。在一些實施例中，遞送至個體中之靶細胞，例如腫瘤細胞、免疫細胞及/或APC之核酸能夠可操作地連接於上文所述之調節元件中之任一者。
在一些實施例中，載體為細菌載體，例如細菌質體或黏質體。在一些實施例中，細菌載體經由細菌介導之質體DNA轉移至哺乳動物細胞(亦稱為「細菌感染」)遞送至靶細胞，例如腫瘤細胞、免疫細胞及/或APC。在一些實施例中，遞送之細菌載體亦含有用於表現於靶細胞中之適當表現控制序列，諸如啟動子序列及/或增強子序列，或上文所述之任何調節或控制序列。在一些實施例中，細菌載體含有用於在傳染媒介物，例如細菌中表現及/或分泌編碼之變異型多肽的適當表現控制序列。
在一些實施例中，本文提供之多肽亦可藉由合成方法製得。固相合成為製造個別肽之較佳技術，因為其為製造較小肽之最具有成本效益的方法。舉例而言，熟知固相合成技術包括使用保護基、連接子及固相載體，以及特定保護及脫保護反應條件、連接子裂解條件、使用清除劑及固相肽合成之其他態樣。肽可隨後組裝為如本文所提供之多肽。
V. 評估變異型多肽及免疫調節蛋白之活性免疫調節的方法
在一些實施例中，本文提供之變異型ICOSL多肽(例如其全長及/或特異性結合片段或結合物、堆疊構築體或融合物)展現出調節T細胞活化之免疫調節活性。在一些實施例中，ICOSL多肽相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL對照可調節初生T細胞分析中之IFN-γ表現。在一些情況下，調節IFN-γ表現相對於對照可增加或減少IFN-γ表現。測定特異性結合及IFN-γ表現之分析為此項技術中熟知的且包括量測培養上清液中之干擾素-γ細胞介素水準的MLR (混合淋巴細胞反應)分析(Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56)、SEB (葡萄球菌腸毒素B) T細胞刺激分析(Wang等人, Cancer Immunol Res. 2014年9月: 2(9):846-56)及抗CD3 T細胞刺激分析(Li及Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104)。
在一些實施例中，變異型ICOSL多肽相對於野生型ICOSL對照在一些實施例中會增加或在替代實施例中會減少初生T細胞分析中之IFN-γ (干擾素-γ)表現。在所提供多肽含有可溶變異型ICOSL序列之一些實施例中，多肽相對於野生型ICOSL對照會增加初生T細胞分析中之IFN-γ表現，及在替代實施例中會減少IFN-γ表現。在所提供多肽含有多個變異型ICOSL序列之一些實施例中，多肽相對於野生型ICOSL對照會增加初生T細胞分析中之IFN-γ表現，及在替代實施例中會減少IFN-γ表現。
熟習此項技術者將認識到，用於測定IFN-γ表現增加之初生T細胞分析的型式可不同於用於IFN-γ表現減少之分析的型式。在分析變異型ICOSL在初生T細胞分析中降低IFN-γ表現的能力中，可如實例6中所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)分析。在一些情況下，變異型ICOSL之可溶形式可用於如同實例6中所述地測定變異型ICOSL在MLR中拮抗且因此降低IFN-γ表現的能力。
或者，在分析變異型ICOSL於初生T細胞分析中提高IFN-γ表現的能力中，可如實例6中所述地使用共固定化分析。在共固定化分析中，在一些實施例中藉由抗CD3抗體提供之TCR信號與共固定化變異型ICOSL結合使用以測定相對於ICOSL對照增加IFN-γ表現之能力。在一些情況下，在一定程度上多聚化以提供多價結合之變異型ICOSL之可溶形式可用於如同實例6中所述地測定變異型ICOSL在MLR中促效且因此提高IFN-γ表現的能力。
在一些實施例中，在分析變異型ICOSL調節(提高或降低) IFN-γ表現之能力中，可使用T細胞報告子分析。在一些實施例中，T細胞為Jurkat T細胞株或衍生自Jurkat T細胞株。在報告子分析中，亦產生報告子細胞株(例如Jurkat報告子細胞)以過表現為變異型IgSF域多肽之同源結合配位體的抑制性受體。在一些實施例中，報告子T細胞亦含有報告子構築體，該報告子構築體含有對可操作地連接於報告子之T細胞活化起反應的誘導性啟動子。在一些實施例中，報告子為螢光或發光報告子。在一些實施例中，報告子為螢光素酶。在一些實施例中，啟動子對CD3信號傳導起反應。在一些實施例中，啟動子為NFAT啟動子。在一些實施例中，啟動子對協同刺激信號傳導，例如CD28協同刺激信號傳導起反應。在一些實施例中，啟動子為IL-2啟動子。
在報導子分析之態樣中，報告子細胞株經刺激，諸如藉由與表現抑制性受體之野生型配位體，例如ICOSL的抗原呈遞細胞(APC)共培育。在一些實施例中，APC為人工APC。人工APC已為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，人工APC係衍生自一或多種哺乳動物細胞株，諸如K562、CHO或293細胞。
在一些實施例中，Jurkat報告子細胞與在變異型IgSF域分子或免疫調節蛋白，例如變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白存在下過度表現抑制性配位體之人工APC共培育。在一些實施例中，報告子表現經監測，諸如藉由測定細胞之發光或螢光。在一些實施例中，其抑制性受體與配位體之間的正常相互作用導致報告子信號之抑制或減少，諸如相比於對照，例如藉由共培育對照T細胞及APC (其中不存在抑制性受體與配位體相互作用)，例如不過表現ICOSL之APC的報告子表現。在一些實施例中，本文提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白拮抗相互作用，例如當以可溶形式提供時呈變異型ICOSL-Fc形式或當自APC表現時呈分泌型免疫調節蛋白形式，進而導致相比於不存在變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白之報告子信號增加。在一些情況下，如本文所提供之變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白之某些型式可提供促效活性，進而相比於不存在變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白減少報告子表現。
使用恰當對照為為熟習此項技術者已知，然而，在前述實施例中，對照通常涉及使用參考ICOSL，諸如來自衍生或產生變異型ICOSL之相同哺乳動物物種的野生型天然ICOSL同功異型物。無論與ICOS及CD28中之一者或兩者之結合親和力增加或減少，在一些實施例中，變異型ICOSL將相對於野生型ICOSL對照在初生T細胞分析中增加IFN-γ表現，且在替代實施例中減少IFN-γ表現。
在一些實施例中，變異型ICOSL相對於參考(例如未經修飾的)或野生型ICOSL對照增加IFN-γ表現(亦即，蛋白質表現)至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在其他實施例中，變異型ICOSL相對於野生型或未經修飾的ICOSL對照減少IFN-γ表現(亦即蛋白質表現)至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在一些實施例中，野生型ICOSL對照為鼠類ICOSL，諸如通常將用於與野生型鼠類ICOSL序列相比，序列經改變之變異型ICOSL。在一些實施例中，野生型ICOSL對照為人類ICOSL，諸如通常將用於與野生型人類ICOSL序列，諸如包含SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 196或545之胺基酸序列的ICOSL序列相比，序列經改變之變異型ICOSL。
VI. 醫藥調配物
本文提供含有本文所述之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物、工程改造細胞或傳染媒介物中之任一者的組合物。醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。舉例而言，醫藥組合物可含有一或多種賦形劑，其用於改變、維持或保持例如組合物之pH、容積滲透濃度、黏度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透。在一些態樣中，熟習此項技術者理解含有細胞之醫藥組合物可不同於含有蛋白質之醫藥組合物。
在一些實施例中，醫藥組合物為固體，諸如粉末、膠囊或錠劑。舉例而言，醫藥組合物之組分可經凍乾。在一些實施例中，固體醫藥組合物在投與之前在液體中復原或溶解。
在一些實施例中，醫藥組合物為液體，例如溶解於水溶液(諸如生理鹽水或林格氏溶液(Ringer's solution))中之變異型ICOSL多肽。在一些實施例中，醫藥組合物之pH在約4.0與約8.5之間(諸如在約4.0與約5.0之間、在約4.5與約5.5之間、在約5.0與約6.0之間、在約5.5與約6.5之間、在約6.0與約7.0之間、在約6.5與約7.5之間、在約7.0與約8.0之間或在約7.5與約8.5之間)。
在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之賦形劑，例如填充劑、黏合劑、包衣、防腐劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、著色劑、溶劑、緩衝劑、螯合劑或穩定劑。醫藥學上可接受之填充劑之實例包括纖維素、磷酸氫二鈣、碳酸鈣、微晶纖維素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇、預膠凝化澱粉、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉。醫藥學上可接受之黏合劑之實例包括聚乙烯吡咯啶酮、澱粉、乳糖、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、明膠、蔗糖、聚乙二醇、甲基纖維素或纖維素。醫藥學上可接受之包衣之實例包括羥丙基甲基纖維素(HPMC)、蟲膠、玉米蛋白或明膠。醫藥學上可接受之崩解劑之實例包括聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素或羥基乙酸澱粉鈉。醫藥學上可接受之潤滑劑之實例包括聚乙二醇、硬脂酸鎂或硬脂酸。醫藥學上可接受之防腐劑之實例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。醫藥學上可接受之甜味劑之實例包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨醇。醫藥學上可接受之緩衝劑之實例包括碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或酒石酸鹽。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含用於產物之控制或持續釋放之試劑，諸如可注射微球體、生物易侵蝕粒子、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂質體。
在一些實施例中，醫藥組合物為無菌的。滅菌可藉由經由無菌過濾膜過濾或輻射來實現。當組合物經凍乾時，可於凍乾及復水之前或之後使用此方法進行滅菌。非經腸投與之組合物可以凍乾形式儲存或儲存於溶液中。另外，非經腸組合物通常置放於具有無菌接取口之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
在一些實施例中，提供含有跨膜免疫調節蛋白，包括表現之此類跨膜免疫調節蛋白之工程改造細胞的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物及調配物包括一或多種視情況存在之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此類組合物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。本發明組合物較佳調配用於靜脈內投與。
在一些實施例中，醫藥組合物含有傳染媒介物，該等傳染媒介物含有編碼免疫調節變異型多肽之核酸序列。在一些實施例中，醫藥組合物含有適合於向適合於治療之個體投與之劑量的傳染媒介物。在一些實施例中，醫藥組合物含有單個或多個劑量的為病毒之傳染媒介物，該單個或多個劑量為約或約1×105 至約1×1012 噬菌斑形成單位(pfu)、1×106 至1×1010 Pfu或1×107 至1×1010 Pfu (各包括端點)，諸如至少或至少約或約1×106 、1×107 、1×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 pfu或約1×1010 pfu。在一些實施例中，醫藥組合物可含有之病毒濃度為或為約105 至約1010 pfu/mL，例如5×106 至5×109 或1×107 至1×109 pfu/mL，諸如至少或至少約或約106 pfu/mL、107 pfu/mL、108 pfu/mL或109 pfu/mL。在一些實施例中，醫藥組合物含有單個或多個劑量的為細菌之傳染媒介物，該單個或多個劑量為約或約1×103 至約1×109 菌落形成單位(cfu)、1×104 至1×109 cfu或1×105 至1×107 cfu (各包括端點)，諸如至少或至少約或約1×104 、1×105 、1×106 、1×107 、1×108 或1×109 cfu。在一些實施例中，醫藥組合物可含有之細菌濃度為或為約103 至約108 cfu/mL，例如5×105 至5×107 或1×106 至1×107 cfu/mL，諸如至少或至少約或約105 cfu/mL、106 cfu/mL、107 cfu/mL或108 cfu/mL。
此類調配物可例如呈適合於靜脈內輸注之形式。醫藥學上可接受之載劑可為醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，其涉及將所關注之細胞自身體之組織、器官或部分攜帶或傳輸至身體之另一組織、器官或部分。舉例而言，載劑可為液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料其某一組合。載劑之各組分必須為「醫藥學上可接受的」，此係因為其必須與調配物之其他成分相容。其亦必須適合於與其可遇到的身體之任何組織、器官或部分接觸，意謂其必須無過度超過其治療益處之毒性、刺激、過敏性反應、免疫原性或任何其他併發症的風險。
在一些實施例中，醫藥組合物係投與至個體。一般而言，醫藥組合物之劑量及投與途徑係根據個體之身材及狀況，根據標準藥學實踐而確定。舉例而言，治療有效劑量可最初在細胞培養分析中或在諸如小鼠、大鼠、家兔、狗、豬或猴的動物模型中估算。動物模型亦可用於確定投與之適當濃度範圍及途徑。此類資訊可隨後用於確定適用於在人體內投與之劑量及途徑。精確劑量將根據與需要治療之個體相關之因素確定。調節劑量及投與以提供充足量之活性化合物或維持所需效果。可考慮之因素包括疾病病況之嚴重度、個體之一般健康狀況、個體之年齡、體重及性別、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之反應。
視特定調配物之半衰期及清除率而定，長效醫藥組合物可每隔3至4天、每週或每兩週投與。給藥頻率將視所用調配物中之分子的藥物動力學參數而定。通常，投與組合物直至達到達成所需效應之劑量。組合物可因此以單次劑量或隨時間推移的多次劑量(處於相同或不同濃度/劑量)形式投與，或以連續輸注形式投與。通常對適當劑量作出進一步改進。可經由使用適當劑量-反應資料來確定適當劑量。可監測多種用於治療效應之生物標記物或生理標記物，包括T細胞活化或增殖、細胞介素合成或產生(例如TNF-α、IFN-γ、IL-2之產生)、各種活化標記物(例如CD25、IL-2受體)之誘導、發炎、關節腫脹或觸痛、C反應蛋白之血清水準、抗膠原蛋白抗體產生及/或T細胞依賴性抗體反應。
在一些實施例中，醫藥組合物係經由任何途徑向個體投與，包括經口、經皮、藉由吸入、靜脈內、動脈內、肌肉內、直接施用至傷口部位、施用至手術部位、腹膜內、藉由栓劑、皮下、皮內、經皮、藉由噴霧、胸膜內、腦室內、關節內、眼內或脊椎內。
在一些實施例中，醫藥組合物之劑量為單次劑量或重複劑量。在一些實施例中，每天一次、每天兩次、每天三次或每天四次或更多次向個體給予劑量。在一些實施例中，在一週內給予約1或多個(諸如約2個或更多個、約3個或更多個、約4個或更多個、約5個或更多個、約6個或更多個或約7個或更多個)劑量。在一些實施例中，經數天、數週、數月或數年之時程給予多個劑量。在一些實施例中，療程為約1或多個劑量(諸如約2個或更多個劑量、約3個或更多個劑量、約4個或更多個劑量、約5個或更多個劑量、約7個或更多個劑量、約10個或更多個劑量、約15個或更多個劑量、約25個或更多個劑量、約40個或更多個劑量、約50個或更多個劑量或約100個或更多個劑量)。
在一些實施例中，醫藥組合物之投與劑量為每kg個體身體質量約1 µg蛋白質或更大(諸如每kg個體身體質量約2 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約5 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約10 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約25 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約50 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約100 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約250 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約500 µg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約1 mg蛋白質或更大、每kg個體身體質量約2 mg蛋白質或更大或每kg個體身體質量約5 mg蛋白質)。
在一些實施例中，投與治療量之細胞組合物。通常，待投與之本發明組合物的精確量可由醫師考慮年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移程度及患者(個體)狀況之個體差異而確定。一般可陳述包含如本文所述之工程改造細胞，例如T細胞之醫藥組合物可以每公斤體重104 至109 個細胞，諸如每公斤體重105 至106 個細胞(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量投與。工程改造細胞組合物，諸如T細胞組合物亦可以此等劑量投與多次。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。特定患者之最優劑量及治療方案可由熟習醫藥技術者藉由監測患者之疾病跡象及相應調節治療而容易地確定。
已知多種確定投與本發明之治療組合物是否充分地調節免疫活性之方法，該等方法藉由消除、隔離或不活化介導或能夠介導非所需免疫反應之免疫細胞；誘導、產生或激活介導或能夠介導保護性免疫反應之免疫細胞；改變免疫細胞之物理或功能特性；或此等效應之組合。調節免疫活性之措施之實例包括但不限於檢查存在或不存在免疫細胞群體(使用流動式細胞測量術、免疫組織化學、組織學、電子顯微法、聚合酶鏈反應(PCR))；量測免疫細胞之功能能力，包括回應於信號增殖或分裂之能力或抗性(諸如使用基於用抗CD3抗體刺激之後的3H-胸苷併入之T細胞增殖分析及肽掃描分析、抗T細胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、負載有肽或蛋白質抗原之PMA (12-豆蔻酸佛波醇13-乙酸酯)抗原呈遞細胞；B細胞增殖分析)；量測殺死或溶解其他細胞之能力(諸如細胞毒性T細胞分析)；量測細胞介素、趨化因子、細胞表面分子、抗體及其他細胞產物(例如藉由流動式細胞測量術、酶聯免疫吸附分析、西方墨點分析、蛋白質微陣列分析、免疫沈澱分析)；量測免疫細胞或免疫細胞內之信號傳導路徑之活化的生物化學標記物(例如酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化之蛋白質印跡及免疫沈澱分析、多肽裂解及蛋白質複合物之形成或解離；蛋白質陣列分析；DNA轉錄、使用DNA陣列之剖析或消減雜交)；量測藉由凋亡、壞死或其他機制之細胞死亡(例如磷脂結合蛋白V染色、TUNEL分析、量測DNA梯度變化之凝膠電泳、組織學；螢光凋亡蛋白酶分析、凋亡蛋白酶受質之西方墨點分析)；量測由免疫細胞產生之基因、蛋白質及其他分子(例如北方墨點分析、聚合酶鏈反應、DNA微陣列、蛋白質微陣列、2維凝膠電泳、西方墨點分析、酶聯免疫吸附分析、流動式細胞測量術)；及量測臨床症狀或結果，諸如自體免疫性、神經退化性及其他涉及自我蛋白質或自我多肽之疾病(臨床評分、使用額外療法之需求、功能狀態、成像研究)，例如在多發性硬化症的情況下藉由量測復發率或疾病嚴重性(使用一般熟習此項技術者已知之臨床評分)，在I型糖尿病的情況下量測血糖，或在類風濕性關節炎的情況下量測關節發炎。
VII. 製品及套組
本文亦提供在適合之包裝中包含本文所述之醫藥組合物的製品。適用於本文所述之組合物(諸如眼用組合物)之包裝為此項技術中已知的，且包括例如小瓶(諸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封聚酯薄膜或塑膠袋)及其類似物。該等製品可進一步經滅菌及/或密封。
另外提供包含本文所述之醫藥組合物(或製品)的套組，其可進一步包含關於使用組合物之方法，諸如本文所述之用途的說明書。本文所描述之套組亦可包括自商業及使用者觀點看所需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及附有關於執行本文所描述之任何方法之說明的藥品說明書。
VIII. 治療應用
本文所述之醫藥組合物(包括包含本文所述之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物、工程改造細胞及傳染媒介物之醫藥組合物)可用於多種治療應用，諸如治療疾病。舉例而言，在一些實施例中，醫藥組合物用於治療哺乳動物之發炎性或自體免疫性病症、癌症、器官移植、病毒感染及/或細菌感染。醫藥組合物可調節(例如增加或減少)免疫反應以治療疾病。
此類方法及用途包括治療方法及用途，例如包含向患有疾病、病況或病症之個體投與分子或工程改造細胞，或含有其之組合物。在諸如所描述之一些情況下，疾病或病症為自體免疫或發炎疾病或病症。在諸如所描述之一些情況下，疾病或病症為腫瘤或癌症。在一些實施例中，分子或工程改造細胞以實現疾病或病症治療之有效量投與。用途包括在此類方法及治療中，及在製備藥物以進行此類治療方法中使用含有變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物、工程改造細胞及傳染媒介物之分子。在一些實施例中，方法係藉由向患有或疑似患有疾病或病況之個體投與變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物、工程改造細胞及傳染媒介物，或包含其之組合物來進行。在一些實施例中，該等方法由此治療個體之疾病或病況或病症。
在一些實施例中，所提供方法適用於治療性投與本文所述之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白、結合物、工程改造細胞及傳染媒介物。在熟習此項技術者之技能水準內的為鑒於所提供揭示內容，視免疫反應調節之類型，例如所需之增加或減少來為適應症選擇型式。
在一些實施例中，投與刺激免疫反應的本文提供之醫藥組合物，其可例如適用於治療癌症、病毒感染或細菌感染。在一些實施例中，醫藥組合物含有變異型ICOSL多肽，其型式為展現其同源結合配位體CD28或ICOS之促效活性及/或經由CD28或ICOS刺激或引發協同刺激信號傳導。結合此類治療應用使用之ICOSL多肽之例示性型式包括例如免疫調節蛋白或變異型ICOSL多肽及IgSF域之「堆疊」或其結合至腫瘤抗原之變異體(例如Nkp30或親和力經修飾之變異體)(亦稱作「腫瘤定位IgSF域」)、含有連接至腫瘤靶向部分(亦稱作腫瘤定位部分)之變異型ICOSL多肽的結合物、表現跨膜免疫調節蛋白或包含編碼跨膜免疫調節蛋白之核酸分子之傳染媒介物的工程改造細胞，諸如用於表現感染細胞(例如腫瘤細胞或APC，例如樹突狀細胞)中之跨膜免疫調節蛋白。
包含工程改造細胞之醫藥組合物及本文所描述之方法可用於授受細胞轉移應用。在一些實施例中，包含工程改造細胞之細胞組合物可用於相關方法以例如調節免疫治療方法之免疫活性，該免疫治療方法用於治療例如哺乳動物癌症或在其他實施例中用於治療自體免疫病症。採用之方法一般包含在容許特異性結合親和力經修飾之IgSF域及調節哺乳動物細胞之免疫活性的條件下使本發明之TIP與哺乳動物細胞接觸之方法。在一些實施例中，免疫細胞(諸如腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、T細胞(包括CD8+或CD4+ T細胞)或APC)經工程改造以表現為膜蛋白及/或如本文所述之可溶變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或結合物。工程改造細胞可隨後接觸哺乳動物細胞，諸如APC、第二淋巴細胞或腫瘤細胞，其中免疫活性之調節在容許親和力經修飾之IgSF域特異性結合至哺乳動物細胞上之反結構以使得可在哺乳動物細胞中調節免疫活性之條件下為所需的。細胞可在活體內或離體接觸。
在一些實施例中，工程改造細胞為自體細胞。在其他實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，細胞為重新輸注至分離其之哺乳動物中的自體工程改造細胞。在一些實施例中，細胞為輸注至哺乳動物中之同種異體工程改造細胞。在一些實施例中，細胞收穫自患者之血液或腫瘤，經工程改造以表現多肽(諸如如本文所述之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或結合物)，在活體外培養系統中擴增(例如藉由刺激細胞)及重新輸注至患者中以介導腫瘤破壞。在一些實施例中，方法係藉由授受細胞轉移進行，其中表現TIP之細胞(例如T細胞)輸注回患者。在一些實施例中，本發明之治療組合物及方法用於治療患有癌症，諸如淋巴瘤、淋巴白血病、骨髓白血病、子宮頸癌、神經母細胞瘤或多發性骨髓瘤之哺乳動物患者。
在一些實施例中，醫藥組合物可用於抑制哺乳動物癌細胞(諸如人類癌細胞)生長。一種治療癌症之方法可包括向患有癌症之個體投與有效量的本文所述之醫藥組合物中之任一者。可投與有效量的醫藥組合物以抑制、中斷或逆轉癌症進展。
可藉由本文所述之醫藥組合物及治療方法治療之癌症包括但不限於黑素瘤、膀胱癌、血液學惡性病(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、腦癌、腎癌、乳癌、胰臟癌(腺癌)、結腸直腸癌、肺癌(小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、脾癌、胸腺癌或血細胞癌(亦即，白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨胳癌、頭頸癌、胃腸癌、生殖細胞癌或內分泌及神經內分泌癌症。在一些實施例中，癌症為尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)。在一些實施例中，癌症選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌及血液學惡性病。在一些實施例中，癌症為淋巴瘤、淋巴白血病、骨髓白血病、子宮頸癌、神經母細胞瘤或多發性骨髓瘤。
人類癌細胞可在活體內或離體治療。之人類患者之離體治療中，含有癌細胞之組織或流體係在身體外部治療且接著將組織或流體再引入回患者中。在一些實施例中，癌症係在人類患者活體內藉由向患者投與治療組合物來治療。
在一些實施例中，醫藥組合物以單一療法形式(亦即，作為單一藥劑)或以組合療法形式(亦即，與一或多種額外抗癌劑，諸如化學治療藥物、癌症疫苗或免疫檢查點抑制劑組合投與。在一些實施例中，醫藥組合物亦可與放射療法一起投與。
在一些實施例中，醫藥組合物以單一療法形式(亦即，作為單一藥劑)或以組合療法形式(亦即，與一或多種額外抗癌劑，諸如化學治療藥物、癌症疫苗或免疫檢查點抑制劑組合投與。在一些實施例中，醫藥組合物亦可與放射療法一起投與。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑阻斷PD-1與PD-L1及/或PD-L2之相互作用。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為特異性結合PD-1、PD-L1或PD-L2之抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體，諸如納武單抗(nivolumab)或派立珠單抗(pembrolizumab)或其抗原結合片段。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑阻斷CTLA-4或為其拮抗劑，諸如為抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段。在本發明之一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為曲美單抗(tremelimumab)或伊匹單抗(ipilimumab)。
在一些實施例中，醫藥組合物抑制免疫反應，其可適用於治療發炎性或自體免疫性病症，或器官移植。在一些實施例中，醫藥組合物含有變異型ICOSL多肽，其型式為展現其同源結合配位體CD28或ICOS之拮抗活性及/或經由CD28或ICOS阻斷或抑制協同刺激信號傳導。結合此類治療應用使用之ICOSL多肽之例示性型式包括例如可溶之變異型ICOSL多肽(例如變異型ICOSL-Fc融合蛋白)；免疫調節蛋白或變異型ICOSL多肽及另一IgSF域之「堆疊」，包括其為Fc融合物之可溶形式；表現分泌型免疫調節蛋白之工程改造細胞；或包含編碼分泌型免疫調節蛋白之核酸分子的傳染媒介物，諸如用於表現及分泌感染細胞(例如腫瘤細胞或APC，例如樹突狀細胞)中之分泌型免疫調節蛋白。
在一些實例中，發炎性或自體免疫性病症為抗中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、血管炎、自體免疫皮膚病、移植、風濕性疾病、發炎性胃腸道疾病、發炎性眼病、發炎性神經疾病、發炎性肺病、發炎性內分泌疾病或自體免疫性血液學疾病。
在一些實施例中，可藉由本文所述之醫藥組合物治療之發炎性及自體免疫性病症為阿狄森氏病(Addison's Disease)、過敏、斑禿、阿茲海默氏症(Alzheimer's)、抗中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、僵直性脊椎炎、抗磷脂症候群(休斯症候群(Hughes Syndrome))、哮喘、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性內耳疾病、自體免疫淋巴增生症候群、自體免疫心肌炎、自體免疫卵巢炎、自體免疫睾丸炎、無精子症、白塞氏病(Behcet's Disease)、伯傑氏病(Berger's Disease)、大皰性類天疱瘡、心肌病、心血管疾病、脂肪痢/乳糜瀉、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性特發性多神經炎、慢性發炎性脫髓鞘、多神經根神經病(CIDP)、慢性復發性多發性神經病(格-巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome))、徹奇-斯全司症候群(Churg-Strauss Syndrome；CSS)、瘢痕性類天疱瘡、冷凝集素病(CAD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、CREST症候群、克羅恩氏病(Crohn's disease)、皮炎、疱疹樣病、皮肌炎、糖尿病、盤狀狼瘡、濕疹、後天大皰性表皮鬆懈、原發性混合型冷球蛋白血症、伊凡氏症候群(Evan's Syndrome)、突眼症、纖維肌痛、古巴士德氏症候群(Goodpasture's Syndrome)、格雷夫氏病(Graves' Disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、免疫增殖性疾病或病症、發炎性腸病(IBD)、間質性肺病、幼年型關節炎、幼年特發性關節炎(JIA)、川崎氏病(Kawasaki's Disease)、蘭伯特-伊頓重肌無力症候群(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、扁平苔癬、狼瘡性腎炎、淋巴細胞性垂體炎、梅尼埃氏病(Ménière's Disease)、米勒菲什症候群(Miller Fish Syndrome)/急性播散性腦脊髓脊神經根病、混合型結締組織疾病、多發性硬化症(MS)、肌肉性風濕、肌痛性腦脊髓炎(ME)、重症肌無力、眼部發炎、落葉型天疱瘡、尋常天疱瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺症候群(惠特克氏症候群(Whitaker's syndrome))、風濕性多肌痛、多發性肌炎、原發性無γ球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化/自體免疫膽管病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、雷諾氏現象(Raynaud's Phenomenon)、萊特爾氏症候群(Reiter's Syndrome)/反應性關節炎、再狹窄、風濕熱、風濕性疾病、類肉瘤病、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、硬皮病、修格蘭氏症候群(Sjörgen's Syndrome)、僵人症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、全身性硬皮病、高安氏動脈炎(Takayasu arteritis)、顳動脈炎/巨大細胞動脈炎、甲狀腺炎、1型糖尿病、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑病、間質性腸病或韋格納氏肉芽腫病(Wegener's Granulomatosis)。在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症選自間質性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎及牛皮癬。
在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症為慢性自體免疫疾病。在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症為修格蘭氏症候群(pSS)或全身性紅斑狼瘡(SLE)。在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症為發炎性腸病(IBD)。在一些實例中，發炎性或自體免疫性病症為克羅恩氏病。在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症為IBD相關疾病或病症，例如間質性肺病(ILD)。在一些實施例中，發炎性或自體免疫性病症為牛皮癬性關節炎或類風濕性關節炎。在一些實施例中，投與醫藥組合物以調節自體免疫性病況。舉例而言，抑制免疫反應有利於用於抑制接受者對來自供體之組織、細胞或器官移植體之排斥反應的方法中。因此，在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物係用於限制或預防移植物相關或移植體相關疾病或病症，諸如移植物抗宿主疾病(GvHD)。在一些實施例中，醫藥組合物用於抑制移植之骨髓、器官、皮膚、肌肉、神經元、胰島或實質細胞之自體免疫性排斥反應。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療牛皮癬性關節炎(PsA)。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療類風濕性關節炎(RA)。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV) Fc融合蛋白用於治療GVHD。在一些實施例中，GVHD為急性GVHD (aGVHD)。在一些情況下，aGVHD出現於同種異體造血幹細胞移植(HSCT)及/或供體免疫細胞相對於宿主組織之反應之後。在一些情況下，aGVHD體現於皮膚、肝臟或胃腸道中。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療與器官移植相關之自體免疫性病況。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療發炎性腸病(IBD)。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療克羅恩氏病。在一些實施例中，克羅恩氏病可包括來自克羅恩氏結腸炎、克羅恩氏腸炎、克羅恩氏回腸炎或克羅恩氏小腸結腸炎之亞型。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療全身性紅斑狼瘡(SLE)。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物，諸如本文提供之變異型ICOSL IgSF (例如IgV)Fc融合蛋白用於治療修格蘭氏症候群。
IX. 例示性實施例
在提供之實施例中包括：
1. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中包含一或多個胺基酸修飾，其中ICOSL參考多肽為包含連續胺基酸序列之截短細胞外域，該序列參看SEQ ID NO: 32中闡述之ICOSL細胞外域序列包含胺基酸1-112及至少25個胺基酸之C端截短。
2. 如實施例1之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合。
3. 如實施例1或實施例2之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
4. 如實施例1至3中任一項之變異型ICOSL多肽，其中C端截短至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125個胺基酸殘基。
5. 如實施例1至4中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽在闡述為SEQ ID NO: 32之胺基酸204-209的蛋白酶裂解位點中改變或不具有該蛋白酶裂解位點。
6. 如實施例1至5中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列。
7. 如實施例1至5中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
8. 一種變異型ICOSL配位體(ICOSL)多肽，其包含ICOSL參考多肽中之一或多個胺基酸修飾，其中ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
9. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中包含一或多個胺基酸修飾，其中ICOSL參考多肽在參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209之一或多個胺基酸中改變。
10. 如實施例8或實施例9之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與一或多種結合配位體之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與其結合配位體中之一或多者之結合。
11. 如實施例8或實施例9之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與一或多種結合配位體之結合，變異型ICOSL多肽對其結合配位體中之一或多者展現出經提高結合。
12. 如實施例9至11中任一項之變異型ICOSL多肽，其中改變包含參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209之一或多個連續胺基酸之缺失。
13. 如實施例1至6及9至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 600-605中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
14. 如實施例1至6及9至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 600-605中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
15. 如實施例1至6及9至14中任一項之變異型ICOSL多肽，其中改變包含對應於SEQ ID NO: 32中所闡述之位置之位置207及208中之一者或兩者處之至少一個胺基酸取代。
16. 如實施例15之變異型ICOSL多肽，其中至少一個胺基酸取代為N207A、N207G或L208G，或其保守性胺基酸取代。
17. 如實施例9至16中任一項之變異型ICOSL多肽，其中參考ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
18. 如實施例9至17中任一項之變異型ICOSL多肽，其中參考ICOSL多肽由SEQ ID NO: 623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
19. 如實施例5-7及9-18中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽在自細胞表現時展現減少之蛋白質水解性裂解，視情況相比於自相同細胞表現時之變異型ICOSL多肽之全長細胞外域。
20. 如實施例19之變異型ICOSL多肽，其中該細胞為哺乳動物細胞。
21. 如實施例19或實施例20之變異型ICOSL多肽，其中細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株或其衍生物。
22. 如實施例1至21中任一項之變異型ICOSL多肽，其中胺基酸修飾為胺基酸取代、插入或缺失。
23. 如實施例1至22中任一項之變異體，其中一或多個胺基酸修飾係在參看SEQ ID NO:32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置。
24. 如實施例1至23中任一項之變異體，其中一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
25. 如實施例1至24中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係在對應於位置52、57或100之位置。
26. 如實施例1至25中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N52K、S54A、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V。
27. 如實施例1至26中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52D、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/ N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
28. 如實施例1至24中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自F120S/Y152H/N201S、E111del、Y33del、N168Q/N207Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N84Q/N119Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q或F138L/L203P。
29. 如實施例1至28中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、H115X、I143T、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100D、Q100E、Q100K、Q100M、Q100P、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q133H、R221I、R75Q、S54A、S54P、T113E、T225A、V110D、V122A、Y146C或Y152C；或
A117T、A20V、A71T、A91G、A91G、AE88D、C140del、C198R、D158G、D77G、D90K、E117G、E135K、E16V、E81A、E88D、E90A、F120I、F120S、F138L、F172S、F27C、F92Y、G72R、H115R、H115X、H129P、H94E、I118V、I127T、I143T、I143V、I154F、I218N、I218T、I224V、K156M、K169E、K36G、K42E、K89R、K92R、K93R、L102R、L161P、L166Q、L173S、L203F、L203P、L208P、L209P、L40M、L70Q、L70R、L74Q、L80P、L96I、L98F、M10I、M10V、N115Q、N119Q、N122S、N144D、N155X、N168Q、N168X、N178S、N194D、N207Q、N207X、N227K、N25S、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N57A、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、N63S、N84Q、Q100A、Q100E、Q100G、Q100K、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、Q133H、R221G、R221I、S109G、S109N、S114T、S121G、S126R、S126T、S130G、S132F、S13G、S18R、S192G、S212G、S25G、S54A、S54P、S99G、T113E、T120S、T130A、T139S、T190A、T199S、T225A、T41I、V107I、V110A、V110D、V11E、V122A、V122M、V193M、V210A、W153R、Y146C、Y152C或Y152H。
30. 如實施例1至29中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自N52S、N52H、N52D、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R 、N57Y/F138L/L203P、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R、H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P；或
N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140del/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/D158G、N52D/Q133H、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/E117G/ I118V/T120S/T130A、L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S、L70Q/E81A/A91G/ I118V/T120S/I127T/ T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V /T120S/T130A、T41I/A91G、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/ N178S、E88D/K89R/D90K/A91G/ F92Y/K93R、AE88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R、K36G/L40M、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/F120S/N227K、N52S/N194D、N52S/F120S、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/Q100R、N52H/S121G/C198R、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R221I、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R、N52S/H115R/F172S/C198R、N119Q、N207Q、N52Q/N207X、N168X/N207X、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N119Q N155X、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N207Q、N119Q/N155Q/N168Q、N52H/N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N155X/N168X、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G或N52T/N57K/Q100P。
31. 如實施例1至30中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於參考ICOSL多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
32. 如實施例1至31中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自C198R、D158G、E16V、E90A、F120S、F138L、F172S、H115R、I143V、I224V、K156M、K42E、K92R、L102R、L203P、L208P、N194D、N30D、N52A、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52Y、N57F、N57H、N57L、N57M、N57S、N57V、N57W、N57Y、Q100A、Q100E、Q100G、Q100K、Q100M、Q100P、Q100R、Q100S、Q133H、S212G、S54A、S54P、T113E、V110D、V122A、Y146C、Y152C或T225A。
33. 如實施例1至33中任一項之變異型ICOSL多肽，其中一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N52S/E90A/H115R或N30D/K42E/N52S/H115R。
34. 如實施例1至33中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於參考ICOSL多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS及CD28胞外域展現出經提高結合性。
35. 如實施例1至34中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
36. 如實施例1至34中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
37. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其包含IgV域或其特異性結合片段、IgC域或其特異性結合片段或兩者，其中變異型ICOSL多肽在ICOSL參考多肽或其特異性結合片段中含有一或多個胺基酸修飾，該一或多個胺基酸修飾對應於參看SEQ ID NO:32選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52K、N52L、N52M、N52R、N52T、N52V、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V之胺基酸修飾。
38. 如實施例37之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57F/Q100S、N52A,/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
39. 如實施例37或實施例38之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽為哺乳動物ICOSL或其特異性結合片段。
40. 如實施例37至39中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽為人類ICOSL或其特異性結合片段。
41. 如實施例37至40中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOSL參考多肽包含(i) SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(iii)一部分包含IgV域或IgC域或其特異性結合片段之(i)或(ii)或兩者。
42. 如實施例37至41中任一項之變異型ICOSL多肽，其中：
IgV域或IgC域之特異性結合片段之長度為至少50、60、70、80、90、100、110或更多個胺基酸；或
IgV域之特異性結合片段之長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸19-129之IgV域之長度的至少80%及/或IgC域之特異性結合片段之長度為闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸141-227之IgC域之長度的至少80%。
43. 如實施例37至42中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含IgV域或其特異性片段及IgC域或其特異性片段。
44. 如實施例37至43中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 638-685、905、908中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 638-685、905、908中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
45. 如實施例37至43中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 638-685、905、908中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 638-685、905、908中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
46. 如實施例37至43中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含IgV域或其特異性結合片段。
47. 如實施例37至43及46中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含SEQ ID NO: 686-781、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 686-781、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
48. 如實施例37至43及46中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽由以下各者組成：SEQ ID NO: 686-781、907、910中之任一者中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 686-781、907、910中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
49. 如實施例37至43及46至48中任一項之變異型ICOSL多肽，其中IgV域或其特異性結合片段為變異型ICOSL多肽之唯一ICOSL部分。
50. 如實施例37至42中任一項之變異型ICOSL多肽，其中IgC域或其特異性結合片段為變異型ICOSL多肽之唯一ICOSL部分。
51. 如實施例37至50中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合。
52. 如實施例37至51中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
53. 如實施例1至52中任一項之變異型ICOSL多肽，其中結合性提高超過1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
54. 如實施例1至53中任一項之變異型ICOSL多肽，其中ICOS為人類ICOS。
55. 如實施例1至54中任一項之變異型ICOSL多肽，其中CD28為人類CD28。
56. 如實施例1至55中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於參考ICOSL多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽對CTLA-4胞外域展現出經降低結合。
57. 如實施例56之變異型ICOSL多肽，其中結合減少大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
58. 如實施例1至57中任一項之變異型ICOSL多肽，其中CTLA-4為人類CTLA-4。
59. 如實施例1至58中任一項之變異型ICOSL多肽，其中改變(增加或減少)之結合為改變(增加或減少)之結合親和力。
60. 如實施例1至59中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸修飾，視情況為胺基酸取代、插入及/或缺失。
61. 如實施例1至60中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽與ICOSL參考多肽展現至少或至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
62. 如實施例1至61中任一項之變異型ICOSL多肽，其為可溶性蛋白質。
63. 如實施例1至62中任一項之變異型ICOSL多肽，其中：
變異型ICOSL多肽不具有跨膜域及細胞內信號傳導域；及/或
當自細胞表現時，變異型ICOSL多肽不表現於細胞表面上。
64. 如實施例1至61中任一項之變異型ICOSL多肽，其中變異型ICOSL多肽進一步包含跨膜域。
65. 如實施例之變異型ICOSL多肽64、其中跨膜域包含闡述為SEQ ID NO: 5之殘基257-277或其與SEQ ID NO: 5之殘基257-277展現至少85%序列一致性之功能變異體的胺基酸序列。
66. 如實施例64或實施例65之變異型ICOSL多肽，其進一步包含連接至跨膜域之細胞質信號傳導域。
67. 如實施例66之變異型ICOSL多肽，其中細胞質信號傳導域包含闡述為SEQ ID NO: 5之殘基278-302或其與SEQ ID NO: 5之殘基278-302展現至少85%序列一致性之功能變異體的胺基酸序列。
68. 如實施例1至67中任一項之變異型ICOSL多肽，相比於ICOSL參考序列，其為去糖基化或部分去糖基化的。
69. 一種免疫調節蛋白，其包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽及半衰期延長部分。
70. 如實施例69之免疫調節蛋白，其中半衰期延長部分包含多聚化域、白蛋白、白蛋白結合性多肽、Pro/Ala/Ser (PAS)、人絨毛膜促性腺激素之β次單位之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、長的無特定結構親水性胺基酸序列(XTEN)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合性小分子或其組合。
71. 如實施例69或實施例70之免疫調節蛋白，其中半衰期延長部分為或包含Pro/Ala/Ser (PAS)且變異型ICOSL多肽為PAS化的。
72. 如實施例71之免疫調節蛋白，其中半衰期延長部分包含SEQ ID NO: 904中闡述之序列。
73. 如實施例69或實施例70之免疫調節蛋白，其中半衰期延長部分為或包含多聚化域。
74. 如實施例73之免疫調節蛋白，其中多聚化域選自免疫球蛋白、白胺酸拉鏈、異白胺酸拉鏈或鋅指之Fc區。
75. 如實施例73或實施例74之免疫調節蛋白，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至多聚化域。
76. 如實施例73至75中任一項之免疫調節蛋白，其中免疫調節蛋白為包含連接至第一多聚化域之第一變異型ICOSL多肽及連接至第二多聚化域之第二變異型ICOSL多肽的多聚體，其中第一及第二多聚化域相互作用以形成包含第一及第二變異型ICOSL多肽之多聚體。
77. 如實施例76之免疫調節蛋白，其中多聚體為二聚體。
78. 如實施例76或實施例77之免疫調節蛋白，其中第一變異型ICOSL多肽及第二變異型ICOSL多肽相同。
79. 如實施例77或實施例78之免疫調節蛋白，其中二聚體為均二聚體。
80. 如實施例77之免疫調節蛋白，其中二聚體為雜二聚體。
81. 如實施例73至80中任一項之免疫調節蛋白，其中多聚化域為或包含免疫球蛋白之Fc區。
82. 如實施例81之免疫調節蛋白，其中Fc區具有免疫球蛋白G1 (IgG1)或免疫球蛋白G2 (IgG2)蛋白質。
83. 如實施例81或實施例82之免疫調節蛋白，其中免疫球蛋白為人類及/或Fc區為人類。
84. 如實施例81至83中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含SEQ ID NO: 227中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 227展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。
85. 如實施例81至84中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 226展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。
86. 如實施例81至85中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區展現一或多種效應物功能。
87. 如實施例81至86中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區相比於野生型Fc區展現一或多種減弱之效應物功能，視情況其中野生型人類Fc屬於人類IgG1。
88. 如實施例86或實施例87之免疫調節蛋白，其中一或多種效應物功能係選自抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性、計劃性細胞死亡及細胞吞噬作用。
89. 如實施例87或實施例88之免疫調節蛋白，其中相比於野生型Fc區，Fc區為包含一或多個胺基酸取代之變異型Fc區。
90. 如實施例89之免疫調節蛋白，其中變異型Fc區之一或多個胺基酸取代係選自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
91. 如實施例90之免疫調節蛋白，其中變異型Fc區另外包含胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
92. 如實施例87至91中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含SEQ ID NO: 476-478中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 476-478中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
93. 如實施例87至92中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
94. 如實施例87至92及93中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含SEQ ID NO: 632-634中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 632-634中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
95. 一種免疫調節蛋白，其包含：
(a) 在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中含有一或多個胺基酸修飾之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合；及
(b) 相比於野生型人類IgG1含有選自N297G/K447del、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/K447del或L234A/L235E/G237A/K447del之胺基酸取代的變異型Fc區，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
96. 如實施例95之免疫調節蛋白，其為二聚體。
97. 如實施例95或實施例96之免疫調節蛋白，其中變異型Fc區另外包含胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
98. 如實施例95至97中任一項之免疫調節蛋白，其中Fc區包含SEQ ID NO: 632-634中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 632-634中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性且含有胺基酸取代之胺基酸序列的序列。
99. 如實施例95至98中任一項之免疫調節蛋白，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至變異型Fc區。
100. 如實施例75及實施例99之免疫調節蛋白，其中連接子包含1至10個胺基酸。
101. 如實施例100之免疫調節蛋白，其中連接子選自AAA、G4S (SEQ ID NO: 636)、(G4 S)2 (SEQ ID NO:229)或GSGGGGS連接子(SEQ ID NO: 635)。
102. 一種免疫調節蛋白，其包含連接至包含免疫球蛋白超級家族(IgSF)域之第二多肽的如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽。
103. 如實施例102之免疫調節蛋白，其中IgSF域親和力經修飾且相比於未經修飾或野生型IgSF域展現改變的與其同源結合配位體中之一或多者之結合。
104. 如實施例103之免疫調節多肽，其中相比於未經修飾或野生型IgSF域，IgSF域對其同源結合配位體中之一或多者展現出經提高結合。
105. 如實施例102至104中任一項之免疫調節多肽，其中變異型ICOSL多肽為第一ICOSL變異型多肽且第二多肽之IgSF域為來自如實施例1至68中任一項之第二變異型ICOSL多肽之IgSF域，其中第一及第二ICOSL變異體為相同或不同。
106. 如實施例102至105中任一項之免疫調節蛋白，其中變異型ICOSL多肽能夠特異性結合至CD28或ICOS且第二多肽之IgSF域能夠結合至除ICOSL變異型多肽特異性結合之結合配位體以外的結合配位體。
107. 如實施例106之免疫調節多肽，其中IgSF域來自B7家族之成員。
108. 如實施例102至104及106中任一項之免疫調節多肽，其中IgSF域為結合至腫瘤上表現之配位體的腫瘤定位部分或為結合至發炎性環境之細胞或組織上表現之配位體的發炎性定位部分。
109. 如實施例108之免疫調節多肽，其中配位體為B7H6。
110. 如實施例108或實施例109之免疫調節多肽，其中IgSF域來自NKp30。
111. 如實施例102至110中任一項之免疫調節多肽，其中IgSF域為或包含IgV域。
112. 如實施例102至111中任一項之免疫調節多肽，其中變異型ICOSL多肽為或包含IgV域。
113. 如實施例102至112中任一項之免疫調節蛋白，其中免疫調節蛋白包含連接至變異型ICOSL多肽或包含IgSF域之第二多肽中之一者或兩者的多聚化域。
114. 如實施例113之免疫調節蛋白，其中多聚化域為Fc域或其具有減弱之效應物功能的變異體。
115. 如實施例102至114中任一項之免疫調節蛋白，其為二聚體。
116. 如實施例115之免疫調節蛋白，其為均二聚體。
117. 如實施例116之免疫調節蛋白，其為雜二聚體。
118. 一種結合物，其包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽或如實施例69至117中任一項之免疫調節蛋白及異質部分。
119. 如實施例118之結合物，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至異質部分。
120. 如實施例118或實施例119中任一項之結合物，其中靶向部分為蛋白質、肽、核酸、小分子或奈米粒子。
121. 如實施例118至120中任一項之結合物，其中靶部分為蛋白質或肽。
122. 如實施例121之結合物，其中結合物為融合蛋白。
123. 一種融合蛋白，其包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽或如實施例69至117中任一項之免疫調節蛋白及異質部分。
124. 如實施例118至123中任一項之結合物或融合蛋白，其中該部分為特異性結合至細胞表面上之分子的靶向部分。
125. 如實施例124之結合物或融合蛋白，其中靶向部分特異性結合至免疫細胞表面上之分子。
126. 如實施例125之結合物或融合蛋白，其中免疫細胞為抗原呈遞細胞或淋巴細胞。
127. 如實施例124之結合物或融合蛋白，其中靶向部分為結合至腫瘤表面上之分子的腫瘤定位部分。
128. 如實施例124至127中任一項之結合物或融合蛋白，其中靶向部分結合至分子HER1/EGFR、HER2/ERBB2、CD20、CD25 (IL-2Rα受體)、CD33、CD52、CD133、CD206、CEA、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6、癌症抗原125 (CA125)、α-胎蛋白(AFP)、Lewis Y、TAG72、Caprin-1、間皮素、PDGF受體(PDGFR；諸如PDGF-R α)、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2受體、血管內皮生長因子(VEGF)、CD30、EpCAM、EphA2、磷脂肌醇蛋白聚醣-3、gpA33、黏蛋白、CAIX、PSMA、葉酸結合蛋白、神經節苷脂(諸如GD2、GD3、GM1及GM2)、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR2、VEGF-A、整合素αVβ3、整合素α5β1、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、AFP、BCR複合物、CD3、CD18、CD44、CTLA-4、gp72、HLA-DR 10 β、HLA-DR抗原、IgE、MUC-1、nuC242、PEM抗原、金屬蛋白酶、Ephrin受體、Ephrin配位體、HGF受體、CXCR4、CXCR4、鈴蟾素受體、SK-1抗原、Bcr-abl、RET、MET、TRKB、TIE2、ALK、ROS、EML4-ALK、ROS1、BRAFV600E、SRC、c-KIT、mTOR、TSC1、TSC2、BTK、KIT、BRCA、CDK 4/6、JAK1、JAK2、BRAF、FLT-3、MEK1、MEK2、SMO或B7-H6 (NCR3LG1)。
129. 如實施例124至128中任一項之結合物或，其中靶向部分結合至PD-L1。
130. 如實施例124至129中任一項之結合物或融合蛋白，其中靶向部分為抗體或抗原結合片段。
131. 如實施例130之結合物或融合蛋白，其中抗體係選自西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Ado-trastuzumab emtansine)、托西莫單抗(Tositumomab)(Bexxar®)、利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan、Mabthera)、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)、達利珠單抗(Daclizumab)(Zenapax)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)(Mylotarg)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、CEA掃描Fab片段、OC125單株抗體、ab75705、B72.3、貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、伯舒替尼(Bosutinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、克卓替尼(Crizotinib)、達拉非尼(Dabrafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、迪奴圖單抗(Dinutuximab)、埃羅替尼(Erlotinib)、依維莫司(Everolimus)、依魯替尼(Ibrutinib)、伊馬替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、奧拉帕尼(Olaparib)、奧拉單抗(Olaratumab)、帕泊昔布(Palbociclib)、帕佐泮尼(Pazopanib)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、瑞戈非尼(Regorafenib)、蘆可替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦羅莫司(Temsirolimus)、曲美替尼(Trametinib)、凡德他尼(Vandetanib)、維羅非尼(Vemurafenib)、維莫德吉(Vismodegib)、巴利昔單抗(Basiliximab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、納武單抗(Nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、匹立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011)、AMP-224、MSB001078C、或MEDI4736、BMS-935559、LY3300054、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab)或為其抗原結合片段。
132. 如實施例130或實施例131之結合物或融合蛋白，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之N端。
133. 如實施例130或實施例131之結合物或融合蛋白，其中變異型ICOSL多肽直接地或經由連接子間接地連接至抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之C端。
134. 如實施例118至133中任一項之結合物或融合蛋白，其中結合物為二價、四價、六價或八價。
135. 如實施例118至123中任一項之結合物或融合蛋白，其中異質部分為或包含用於偵測或純化變異型ICOSL多肽之標記。
136. 一種單價融合蛋白，其包含：
(a) 在ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中含有一或多個胺基酸修飾之變異型ICOSL多肽，其中相比於ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，變異型ICOSL多肽展現改變的與ICOS或CD28之胞外域之結合；及
(b) 用於偵測或純化變異型ICOSL多肽之標記。
137. 如實施例135或實施例136之結合物或融合蛋白，其中用於偵測或純化之標記選自聚組胺酸(His)標籤、FLAG標籤、Myc標籤或螢光蛋白標籤。
138. 如實施例95至101中任一項之免疫調節蛋白或如實施例136或實施例137之融合蛋白，其中變異型ICOSL多肽包含一或多個胺基酸修飾，該一或多個胺基酸修飾在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置。
139. 如實施例138之免疫調節蛋白或融合蛋白，其中一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
140. 如實施例138或實施例139之免疫調節蛋白或融合蛋白，其中ICOSL參考多肽包含(i) SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(iii)一部分包含IgV域或IgC域或其特異性結合片段之(i)或(ii)或兩者。
141. 如實施例138至140中任一項之免疫調節蛋白或融合蛋白，其中ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 196、545、600-605及623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
142. 如實施例138至141中任一項之免疫調節蛋白或融合蛋白，其中ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 32、196、545、600-605及623-628中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成。
143. 一種核酸分子，其編碼如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽、如實施例69至117及118至142中任一項之免疫調節蛋白或如實施例123至142中任一項之融合蛋白。
144. 如實施例143之核酸分子，其為合成核酸。
145. 如實施例143或實施例144之核酸分子，其為cDNA。
146. 一種載體，其包含如實施例143至145中任一項之核酸分子。
147. 如實施例146之載體，其為表現載體。
148. 如實施例146或實施例147之載體，其中載體為哺乳動物表現載體或病毒載體。
149. 一種細胞，其包含如實施例146至148中任一項之載體。
150. 如實施例149之細胞，其為哺乳動物細胞。
151. 如實施例149或實施例150之細胞，其為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物。
152. 一種產生包含變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白之方法，其包含在細胞中表現蛋白質之條件下將如實施例143至145中任一項之核酸分子或如實施例146至148中任一項之載體引入至宿主細胞中。
153. 如實施例152之方法，其中宿主細胞為哺乳動物細胞。
154. 如實施例153之方法，其中哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞或其衍生物。
155. 如實施例152至154中任一項之方法，其進一步包含自細胞分離或純化蛋白質。
156. 一種藉由如實施例152至155中任一項之方法產生之蛋白質。
157. 一種包含蛋白質之組合物，該蛋白質包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽或如實施例69至117中任一項之免疫調節蛋白，其中組合物中至少95%、96%、97%、98%、99%之蛋白質或免疫調節蛋白之個別序列具有相同序列長度，視情況其中組合物為包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
158. 如實施例157之組合物，其中蛋白質或免疫調節蛋白係純化自中國倉鼠卵巢細胞或其衍生物。
159. 一種聚核苷酸，其包含編碼如實施例64至68中任一項之包含跨膜域之變異型ICOSL多肽的核酸及一或多種編碼重組抗原受體之一或多條鏈的核酸。
160. 如實施例159之聚核苷酸，其中重組抗原受體為嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體(TCR)。
161. 如實施例159或實施例160之聚核苷酸，其中編碼變異型ICOSL多肽的核酸及一或多種編碼重組受體之一或多條鏈的核酸中之每一者由編碼自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸分離。
162. 如實施例161之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼變異型ICOSL多肽的核酸、編碼自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸及編碼CAR的核酸。
163. 如實施例161之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼變異型ICOSL多肽的核酸、編碼第一自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸、編碼工程改造TCRα鏈或工程改造TCRβ鏈中之一者的核酸、編碼第二自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸及編碼工程改造TCRα鏈或工程改造TCRβ鏈中之另一者的核酸。
164. 如實施例163之聚核苷酸，其中編碼之第一及第二自體裂解肽相同。
165. 如實施例160至163中任一項之聚核苷酸，其中自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽為T2A、P2A、E2A或F2A。
166. 一種載體，其包含如實施例159至165中任一項之聚核苷酸。
167. 如實施例166之載體，其中該載體為病毒載體。
168. 如實施例167之載體，其中該病毒載體為反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
169. 一種工程改造細胞，其包含如實施例159至165中任一項之聚核苷酸或如實施例166至168中任一項之載體。
170. 一種工程改造細胞，其包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽、如實施例69至117中任一項之免疫調節蛋白或如實施例123至142中任一項之融合蛋白。
171. 一種工程改造細胞，其包含如實施例143至145中任一項之核酸分子或如實施例146至148中任一項之載體。
172. 如實施例169至171中任一項之工程改造細胞，其中編碼變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白之核酸編碼信號肽。
173. 如實施例169至172中任一項之工程改造細胞，其中變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白不包含跨膜域及/或不表現於細胞表面上。
174. 如實施例169至173中任一項之工程改造細胞，其中變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白分泌自工程改造細胞。
175. 如實施例169至171中任一項之工程改造細胞，其中工程改造細胞包含如實施例64至68中任一項之包含跨膜域之變異型ICOSL多肽。
176. 如實施例169至171及175中任一項之工程改造細胞，其中變異型ICOSL多肽表現於細胞表面上。
177. 如實施例169至176中任一項之工程改造細胞，其中該細胞為免疫細胞。
178. 如實施例177之工程改造細胞，其中免疫細胞為抗原呈遞細胞(APC)或淋巴細胞。
179. 如實施例169至178中任一項之工程改造細胞，其為初生細胞。
180. 如實施例169至179中任一項之工程改造細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
181. 如實施例169至180中任一項之工程改造細胞，其中該細胞為人類細胞。
182. 如實施例169至181中任一項之工程改造細胞，其中該淋巴細胞為T細胞。
183. 如實施例178之工程改造細胞，其中工程改造細胞為APC且APC為人工APC。
184. 如實施例169至183中任一項之工程改造細胞，其進一步包含嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體。
185. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽、如實施例69至117中任一項之免疫調節蛋白、如實施例118至142中任一項之結合物或融合蛋白或如實施例169至184中任一項之工程改造細胞或如實施例216至227之傳染媒介物。
186. 如實施例185之醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑。
187. 如實施例185或186之醫藥組合物，其中醫藥組合物為無菌的。
188. 一種製品，其在小瓶中包含如實施例185至187中任一項之醫藥組合物。
189. 如實施例188之製品，其中小瓶經密封。
190. 一種套組，其包含如實施例157至158及185至187中任一項之組合物，及使用說明書。
191. 一種套組，其包含如實施例189及190之製品，及使用說明書。
192. 一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向個體投與如實施例157至158及185至187中任一項之醫藥組合物。
193. 一種調節個體之免疫反應的方法，其包含投與如實施例169至184中任一項之工程改造細胞。
194. 如實施例193之方法，其中工程改造細胞對個體而言為自體的。
195. 如實施例193之方法，其中工程改造細胞對個體而言為同種異體的。
196. 如實施例193至195中任一項之方法，其中調節免疫反應治療個體之疾病或病況。
197. 如實施例193至196中任一項之方法，其中免疫反應增加。
198. 如實施例192、196及197中任一項之方法，其中包含連接至腫瘤定位部分之變異型ICOSL多肽的免疫調節蛋白或結合物係投與至個體。
199. 如實施例198之方法，其中腫瘤定位部分為或包含識別腫瘤抗原之結合分子。
200. 如實施例199之方法，其中結合分子包含抗體或其抗原結合片段或包含野生型IgSF域或其變異體。
201. 如實施例192及196至200中任一項之方法，其中如實施例102至117中任一項之免疫調節蛋白或如實施例118至142中任一項之結合物或融合蛋白係投與至個體。
202. 如實施例193至197中任一項之方法，其中為跨膜免疫調節蛋白之變異型ICOSL多肽係投與至個體。
203. 如實施例193至197及202中任一項之方法，其中包含如實施例64至68中任一項之為跨膜免疫調節蛋白之變異型ICOSL多肽的工程改造細胞係投與至個體。
204. 如實施例192至203之方法，其中疾病或病況為腫瘤或癌症。
205. 如實施例192至204中任一項之方法，其中疾病或病況係選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液學惡性病、肝癌、腦癌、腎癌、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨胳癌、頭頸癌、胃腸癌、生殖細胞癌或內分泌及神經內分泌癌症。
206. 如實施例192至196中任一項之方法，其中免疫反應減弱。
207. 如實施例192至196及206中任一項之方法，其中可溶之變異型ICOSL多肽或免疫調節蛋白係投與至個體。
208. 如實施例207之方法，其中可溶免疫調節蛋白為免疫調節Fc融合蛋白。
209. 如實施例192至196及206至208中任一項之方法，其中如實施例1至63及68中任一項之變異型ICOSL多肽、如實施例70至101中任一項之免疫調節蛋白或如實施例136及137之融合蛋白係投與至個體。
210. 如實施例192至196及206至208中任一項之方法，其中包含分泌型變異型ICOSL多肽之工程改造細胞係投與至個體。
211. 如實施例192至196、206至208及210中任一項之方法，其中如實施例169至174及177至184中任一項之工程改造細胞係投與至個體。
212. 如實施例192至196、206至208及210中任一項之方法，其中編碼變異型ICOSL多肽(其係分泌型免疫調節蛋白)的傳染媒介物視情況在其中傳染媒介物感染腫瘤細胞或免疫細胞且由經感染細胞分泌分泌型免疫調節蛋白之條件下，投與至該個體。
213. 如實施例192至196及206至212中任一項之方法，其中疾病或病況為發炎性或自體免疫性疾病或病況。
214. 如實施例192至196及206至213中任一項之方法，其中疾病或病況為抗中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、血管炎、自體免疫皮膚病、移植、風濕性疾病、發炎性胃腸道疾病、發炎性眼病、發炎性神經疾病、發炎性肺病、發炎性內分泌疾病或自體免疫性血液學疾病。
215. 如實施例213或實施例214之方法，其中疾病或病況選自發炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。
216. 一種傳染媒介物，其包含編碼如實施例1至68中任一項之變異型ICOSL多肽或如實施例69-117中任一項之免疫調節蛋白，或如實施例123至142中任一項之融合蛋白的核酸分子。
217. 如實施例216之傳染媒介物，其中編碼之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白不包含跨膜域及/或不表現於其所表現之細胞的表面上。
218. 如實施例216或實施例217之傳染媒介物，其中編碼之變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白在其表現時分泌自傳染媒介物。
219. 如實施例218之傳染媒介物，其中編碼之變異型ICOSL多肽包含跨膜域。
220. 如實施例216、實施例217或實施例219之傳染媒介物，其中編碼之變異型ICOSL多肽表現於其所表現之細胞的表面上。
221. 如實施例216至220中任一項之傳染媒介物，其中傳染媒介物為細菌或病毒。
222. 如實施例221之傳染媒介物，其中病毒為溶瘤病毒。
223. 如實施例222之傳染媒介物，其中溶瘤病毒為腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、水皰性氣孔病毒、里奧病毒、新城雞瘟病毒、小病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒(VSV)、科沙奇病毒或牛痘病毒。
224. 如實施例222之傳染媒介物，其中病毒特異性靶向樹突狀細胞(DC)及/或為樹突狀細胞向性的。
225. 如實施例224之傳染媒介物，其中病毒為藉由經修飾之辛得比斯病毒包膜產物假型化之慢病毒載體。
226. 如實施例216至225中任一項之傳染媒介物，其進一步包含核酸分子，該核酸分子編碼導致靶細胞死亡或可加強或增強免疫反應之另一基因產物。
227. 如實施例226之傳染媒介物，其中該另一基因產物選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、免疫檢查點抑制劑、抗體、細胞介素、生長因子、抗原、細胞毒性基因產物、促凋亡基因產物、抗凋亡基因產物、細胞基質降解基因、用於組織再生或將人類體細胞再程式化為多能性之基因。
X. 實例
包括以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲限制本發明之範疇。
實例1 實例1 產生IgSF域之突變型DNA構築體
實例1描述產生用於轉譯及表現於作為酵母展示庫之酵母菌之表面上的人類ICOSL IgSF域之突變型DNA構築體。
A. 簡併文庫
產生編碼ICOSL至ECD域至變異體的突變型DNA構築體。構築體係基於含有如下ECD域之SEQ ID NO: 32中闡述之序列野生型人類ICOSL而產生：
對於靶向特異性殘基以藉由簡併密碼子完全或部分隨機化之文庫，編碼SEQ ID NO: 32之DNA以長度為至多80個鹼基對(bp)之一組重疊寡核苷酸之形式訂購自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)。為了產生ECD之不同變異體的文庫，寡核苷酸在所需胺基酸位置含有編碼各種胺基酸取代所需之簡併密碼子，諸如特異性混合鹼基集。簡併密碼子係使用URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/處之算法產生。
一般而言，突變及簡併密碼子之位置係選自所關注之標靶-配位體對之同源性模型(ICOSL)以鑑別配位體接觸殘基，諸如與配位體相互作用之靶側鏈殘基，以及蛋白質相互作用界面處之殘基。此分析係使用URL: spdbv.vital-it.ch)處可用之結構查看器進行。
文庫設計中之下一步驟為比對人類、小鼠、大鼠及猴ICOSL序列以鑑別保守殘基。基於此分析，保守靶殘基係藉由簡併密碼子突變，其中僅指定保守胺基酸變化，加上野生型殘基。不保守之殘基係更強勢地突變，但亦包括野生型殘基。使用亦編碼野生型殘基之簡併密碼子以避免靶蛋白之過度誘變。出於相同原因，每次僅靶向至多20個位置用於誘變。此等殘基為接觸殘基及非接觸界面殘基之組合。
寡核苷酸溶解於無菌水中，以等莫耳比率混合，加熱至95℃後維持五分鐘且緩慢冷卻至室溫以進行結合。分別結合至ECD之起點及末端之ECD特異性寡核苷酸引物接著用於產生PCR產物。與pBYDS03選殖載體之經修飾型式(Life Technologies USA)重疊40-50 bp，超出且包括BamH1及Kpn1選殖位點之ECD特異性寡核苷酸接著用於擴增來自前一步驟之100 ng PCR產物以產生總共5 μg DNA。兩種PCR均為藉由使用OneTaq 2× PCR主混合物(New England Biolabs, USA)之聚合酶鏈反應(PCR)。第二PCR產物係使用PCR純化套組(Qiagen, Germany)純化且再懸浮於無菌去離子水中。
為了製備文庫插入，載體pBYDS03之經修飾酵母展示型式用BamHI及KpnI限制酶(New England Biolabs, USA)消化且大型載體片段經凝膠純化且溶解於無菌去離子水中。用於下一步驟之電穿孔就緒DNA係藉由在總體積為50 μl之去離子水及無菌水中混合12 μg用於每一電穿孔之文庫DNA與4 μg線性化載體而產生。產生靶向文庫之替代方式為藉由含有簡併密碼子之寡核苷酸進行目標ECD之定點誘變(Multisite kit, Agilent, USA)。此方法用於產生僅靶向用於誘變之特定靶蛋白伸長部的子文庫。在此等情況下，子文庫在前進至選擇步驟之前混合。一般而言，文庫大小在10E7至10E8個純系範圍內，除了子文庫僅在10E4至10E5範圍內。對於ICOSL產生大文庫及子文庫。
B. 隨機文庫
亦構築隨機文庫以鑑別含有ECD域的SEQ ID NO: 32中所闡述之ICOSL之ECD的變異體。編碼野生型ECD之DNA係在經修飾之酵母展示載體pBYDS03之BamHI與KpnI限制位點之間選殖。DNA接著經Genemorph II套組(Agilent, USA)誘變以在每個文庫變異體產生平均三至五個胺基酸變化。經誘變DNA接著藉由二步PCR擴增且如關於靶向文庫在上文所述地進一步處理。
實例2將 DNA 文庫引入至酵母菌中
實例2描述將ICOSL DNA文庫引入至酵母菌中。
為了將簡併及隨機文庫DNA引入至酵母菌中，酵母菌菌株BJ5464 (ATCC.org；ATCC編號208288)之電穿孔感受態細胞經製備且基本上如所描述地用來自以上步驟之電穿孔就緒DNA在Gene Pulser II (Biorad, USA)上電穿孔(Colby, D.W.等人 2004 Methods Enzymology 388, 348-358)。唯一例外為經轉化之細胞在非誘導最小選擇性SCD-Leu培養基中生長以容納經修飾質體pBYDS03攜載之LEU2可選擇標記物。一公升SCD-Leu培養基由14.7公克檸檬酸鈉、4.29公克單水合檸檬酸、20公克右旋糖、6.7公克酵母氮源基礎及1.6公克無白胺酸之酵母菌合成丟棄培養基補充物組成。培養基在使用之前使用0.22 μm真空過濾裝置過濾滅菌。
如下測定文庫尺寸：將新鮮回收細胞之連續稀釋液平鋪於SCD-Leu瓊脂盤上且接著自來自每盤產生至少50個菌落之平鋪的單一菌落數目外推文庫尺寸。一般而言，基於此稀釋分析，文庫尺寸範圍為10E8至10E9個轉化體。電穿孔培養物之剩餘部分在SCD-Leu中生長至飽和且來自此培養物之細胞再次繼代培養(例如1/100)至新鮮SCD-Leu中以使未轉化細胞之分率最小化。為了維持文庫多樣性，使用含有比計算之文庫尺寸多至少10×個細胞的接種物進行此繼代培養步驟。來自第二飽和培養物之細胞再懸浮於含有無菌25% (重量/體積)甘油之新鮮培養基中達到10E10/mL之密度且冷凍及儲存於-80℃下(冷凍文庫儲備)。
如下測定文庫尺寸：將新鮮回收細胞之稀釋液平鋪於SCD-Leu瓊脂盤上且接著自來自每盤產生至少50個菌落之平鋪的單一菌落數目外推文庫尺寸。
為了自含有兩個或多於兩個不同文庫純系之細胞分離質體，對應於10倍文庫尺寸之多種細胞係獲自隔夜SCD-Leu培養物且1/100繼代培養至新鮮SCD-Leu培養基中且生長隔夜。來自此隔夜培養物之細胞再懸浮於無菌25% (重量/體積)甘油中達到10E10/mL之密度且冷凍及儲存於-80℃下(冷凍文庫儲備)。
實例3 酵母菌選擇
實例3描述選擇表現親和力經修飾之ICOSL變異體的酵母菌。
等於至少10倍文庫尺寸之多種細胞自個別文庫儲備解凍、在非誘導SCD-Leu培養基中懸浮至0.1×10E6個細胞/毫升且生長隔夜。次日，等於10倍文庫尺寸之多種細胞在2000 RPM下離心兩分鐘且在誘導SCDG-Leu培養基中再懸浮至0.5×10E6個細胞/毫升。一公升SCDG-Leu誘導培養基由溶解於水中且經由0.22 μm過濾膜裝置滅菌之5.4公克Na2 HPO4 、8.56公克NaH2 PO4 •H2 0、20公克半乳糖、2.0公克右旋糖、6.7公克Difco酵母氮源基礎及1.6公克無白胺酸之酵母菌合成丟棄培養基補充物組成。培養物在20℃下生長兩天以誘導文庫蛋白質於酵母細胞表面上之表現。
細胞用磁性珠粒處理以減少非結合子且富集所有能夠結合其外源重組反結構蛋白質之ICOSL變異體。此後接著為二至三輪使用外源反結構蛋白質染色之流動式細胞測量術分選以富集顯示改良之結合子的酵母細胞部分。藉由流動式細胞測量術之磁性珠粒富集及選擇基本上如Miller, K.D. Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, 2008年7月中所述。
藉由ICOSL文庫，靶配位體蛋白質如下源自R&D Systems (USA)：人類rCD28.Fc (亦即，重組CD28-Fc融合蛋白)、rCTLA4.Fc及rICOS.Fc。磁性抗生蛋白鏈菌素珠粒係獲自New England Biolabs, USA。對於反結構蛋白質之生物素標記，使用生物素標記套組目錄號21955，Life Technologies, USA。對於兩色流動式細胞測量術分選，使用Becton Dickinson FACS Aria II分選儀。ICOSL顯示水準係藉由經Alexafluor 488 (Life Technologies, USA)標記之抗血球凝集素抗體監測。配位體結合Fc融合蛋白rCD28.Fc、rCTLA4.Fc或rICOS.Fc係藉由PE結合之人類Ig特異性山羊Fab (Jackson ImmunoResearch, USA)偵測。雙重酵母菌係使用正向散射(FSC)/側面散射(SSC)參數門控輸出，且分選閘門係基於在FL1中具有更受限標籤表現結合之FL4中偵測的較高配位體結合。
關於較高特異性結合親和力分析來自流動式細胞測量術分選之酵母菌輸出。分選輸出酵母菌經擴增及再誘導以表現其編碼之特定IgSF親和力經修飾之域變異體。此群體可接著藉由流動式細胞測量術相比於親本、野生型酵母菌菌株，或任何其他所選輸出，諸如珠粒輸出酵母菌群體。
對於ICOSL，第二分選輸出(F2)係藉由用抗HA (血球凝集素)標籤表現及抗人類Fc繼發於偵測配位體結合對各群體雙重染色而關於各rICOS.Fc、rCD28.Fc及rCTLA4.Fc之結合與親本ICOSL酵母菌相比。
在針對結合至ICOS選擇之ICOSL酵母菌變異體的情況下，F2分選輸出在用5.6 nM rICOS.Fc染色時給出997之平均螢光強度(MFI)值，而親本ICOSL菌株MFI在用相同濃度之rICOS.Fc染色時量測於397處。此表示此F2選擇之純系集合中之平均結合提高大致三倍，且預測來自該集合之個別純系在單獨測試時將具有大幅改良之MFI/親和力。
在針對結合至CD28選擇之ICOSL酵母菌變異體的情況下，F2分選輸出在用100 nM rCD28.Fc染色時給出640之MFI值，而親本ICOSL菌株MFI在用相同濃度之rCD28.Fc染色時量測於29處(22倍提高)。在針對結合至CTLA4選擇之ICOSL酵母菌變異體的情況下，F2分選輸出在用100 nM rCTLA4.Fc染色時給出949之MFI值，而親本ICOSL菌株MFI在用相同濃度之rCTLA4.Fc染色時量測於29處(32倍提高)。
重要的是，在FL1上用抗HA標籤抗體量測時之上文所述之所有F2輸出的MFI相比於野生型菌株不增加且有時下降，指示增加之結合不隨酵母菌表面上之所選變異體之增加的表現而變，且證實僅選擇具有高配位體結合之中至低表現子的門控策略。
所選變異型ICOSL ECD域如下所述地另外型式化為融合蛋白且測試結合及功能活性。
實例4作為 Fc - 融合物且以各種免疫調節蛋白類型重新型式化選擇輸出
實例4描述以含有融合至Fc分子的ICOSL之親和力經修飾之(變異型)細胞外域(ECD)(變異型ECD-Fc融合分子)的免疫調節蛋白形式重新格式化實例3中鑑別之選擇輸出。
來自最終流動式細胞測量術ICOSL分選之輸出細胞在SCD-Leu培養基中生長至最終密度。來自各輸出之質體DNA係使用酵母菌質體DNA分離套組(Zymo Research, USA)分離。對於Fc融合物，具有添加的適合於選殖為所選Fc融合載體之限制位點之PCR引物用於自質體DNA批量擴增，質體DNA為突變標靶ECD製備編碼DNA。在限制消化之後，PCR產物接合至適當Fc融合載體，接著如由供應商所指導地化學轉化為菌株大腸桿菌XL1 Blue (Agilent, USA)或NEB5α (New England Biolabs, USA)。例示性的Fc融合載體為pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen, USA)。
轉化反應之稀釋液平鋪於含有100 μg/mL卡本西林(carbenicillin)之LB-瓊脂(Teknova, USA)上以產生單一菌落。至多96個來自各轉化之菌落接著在96孔盤中在LB培養液(Teknova目錄號L8112)中於37℃下生長至飽和隔夜且提供來自各孔之小等分試樣用於ECD插入物之DNA定序，以鑑別所有純系這種突變。用於DNA定序之樣品製備係使用由服務提供商(Genewiz; South Plainfield, NJ)提供之方案進行。在移除用於DNA定序之樣品之後，接著將甘油添加至其餘培養物以使最終甘油含量為25%且盤儲存於-20℃下以在未來用作母盤(參見下文)。或者，用於DNA定序之樣品係藉由使用拋棄式96孔複製器(VWR, USA)自生長液體培養物複製平鋪至固體瓊脂盤上而產生。將此等盤培育隔夜以產生生長塊且將盤提供至Genewiz以根據其說明書進行DNA定序。在一些情況下，進行再定序以驗證突變。
在分析Genewiz產生之DNA定序資料之後，自母盤回收所關注之純系且在含有100 μg/mL卡本西林之5 mL液體LB培養液(Teknova, USA)中單獨生長至飽和且2 mL之各培養物接著用於使用諸如Pureyield套組(Promega, USA)之標準套組製備大致10 μg各純系之小規模純化質體DNA。鑑別所關注之純系一般包括以下步驟。首先，自Genewiz網站下載DNA序列資料檔案。接著手動管理所有序列以使其起始於ECD編碼區之開端。管理序列接著使用可獲自URL: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/之適合之程式批量轉譯。轉譯序列接著使用可獲自URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html之適合之程式比對。或者，使用Ugene軟體(http://ugene.net)處理Genewiz序列以產生比對。
所關注之純系接著使用以下標準鑑別：1.)相同純系在比對中出現至少兩次及2.)突變在比對中且較佳在相異純系中出現至少兩次。滿足此等標準中之至少一者的純系為最可能由於改良之結合而已藉由分選過程富集之純系。
為了產生為含有具有至少一個親和力經修飾之域之ICOSL之ECD之Fc融合蛋白(例如變異型ICOSL ECD-Fc)的重組免疫調節蛋白，產生編碼核酸分子以編碼如下設計之蛋白質：信號肽，接著為變異型(突變型)ICOSL ECD，接著為三個丙胺酸之連接子(AAA)，接著為參看SEQ ID NO: 226中所闡述之野生型人類IgG1 Fc含有突變N82G (對應於根據EU編號之N297G)之人類IgG1 Fc。此例示性Fc亦含有根據EU編號之穩定化半胱胺酸突變R77C及V87C及半胱胺酸殘基在位置220處置換為絲胺酸殘基(C220S)(參看SEQ ID NO: 226中所闡述之野生型人類IgG1 Fc對應於位置5 (C5S)(根據EU編號分別對應於R292C、V302C及C220S)。在一些情況下，有助於AAA連接子序列之NotI選殖位點經缺失以產生ICOSL ECD及Fc之開端的直接融合物。由於構築體不包括任何可與半胱胺酸形成共價鍵之抗體輕鏈，相比於SEQ ID NO: 226中所闡述之野生型或未經修飾的Fc，人類IgG1 Fc亦含有半胱胺酸殘基在位置5處置換為絲胺酸殘基(C5S)。
實例5 Fc-融合物之表現及純化
實例5描述如以上實例中所述之含有變異型ECD ICOSL之Fc融合蛋白的高通量表現及純化。
重組變異型Fc融合蛋白係使用Expi293表現系統(Invitrogen, USA)產生自懸浮適應性人類胚胎腎(HEK)293細胞。4 µg來自前一步驟之各質體DNA同時添加至200 µL Opti MEM (Invitrogen, USA)，同時10.8 µL ExpiFectamine單獨添加至另一200 µL Opti-MEM。在5分鐘之後，200 µL 質體DNA與200 µL ExpiFectamine混合且另外再培育20分鐘，隨後將此混合物添加至細胞。一千萬個Expi293細胞在體積為3.4 ml之Expi293培養基(Invitrogen, USA)中分配至無菌10 ml、錐底、24深孔生長盤(Thomson Instrument Company, USA)之獨立孔中。盤在設定為95%濕度及8% CO2 之哺乳動物細胞培養恆溫箱中在120 RPM下震盪5天。在5天培育後，細胞經粒化且保留培養上清液。
蛋白質係使用高通量96孔蛋白A純化套組，使用製造商的方案(目錄號45202，Life Technologies, USA)純化自上清液。所得溶離份係使用Zeba 96孔旋轉脫鹽盤(目錄號89807，Life Technologies, USA)，使用製造商的方案緩衝液交換至PBS中。純化之蛋白質係使用280 nm吸光率藉由Nanodrop儀器(Thermo Fisher Scientific, USA)量測來定量，且蛋白質純度係藉由在變性及還原條件下將5 μg蛋白質負載於NUPAGE預澆鑄之聚丙烯醯胺凝膠(Life Technologies, USA)上及後續凝膠電泳來評估。蛋白質使用標準考馬斯染色(standard Coomassie staining)觀測於凝膠中。
實例6評估含親和力成化 IgSF 域之分子的結合及活性
A. 與細胞表現之反結構的結合
此實例描述來自以上實施例之純化蛋白之Fc-融合物結合研究以評估ICOSL域變異型免疫調節蛋白針對同源結合配位體之特異性及親和力。
為了產生表現同源結合配位體之細胞，人類CD28及ICOS中之每一者之全長哺乳動物表面表現構築體設計於pcDNA3.1表現載體(Life Technologies)中且源自Genscript, USA。使用上文所述之瞬時轉染系統(Life Technologies, USA)在產生用於表現全長哺乳動物表面配位體之經轉染HEK293細胞上進行結合研究。作為對照，亦評估於模擬(未經轉染)細胞之結合。確定實驗所需之細胞數目，且使用製造商推薦的方案進行適當30 mL規模轉染。對於各CD28、ICOS或模擬30 mL轉染，7500萬個Expi293F細胞與30 μg表現構築體DNA及1.5 ml稀ExpiFectamine 293試劑一起培育48小時，此時收穫細胞用於染色。
對於藉由流動式細胞測量術染色，200,000個適當瞬時轉染或陰性對照(模擬)細胞平鋪於96孔圓底盤中。細胞經快速離心且再懸浮於染色緩衝液(PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)、1% BSA (牛血清白蛋白)及0.1%疊氮化鈉)中20分鐘以阻斷非特異性結合。隨後，細胞再次離心且再懸浮於50 μL含有100 nM至1 nM變異型免疫調節蛋白之染色緩衝液中，其取決於各候選CD80變異型Fc、ICOSL變異型Fc或堆疊IgSF變異型Fc融合蛋白之實驗。在冰上進行初級染色45分鐘，隨後在染色緩衝液中洗滌細胞兩次。PE結合之抗人類Fc (Jackson ImmunoResearch, USA)在50 μL染色緩衝液中以1:150稀釋且添加至細胞且再在冰上培育30分鐘。將二級抗體洗滌兩次，細胞固定於4%甲醛/PBS中，且在FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson, USA)或Hypercyt流式細胞儀(Intellicyte, USA)上分析樣品。
用Cell Quest Pro軟體(Becton Dickinson, USA)或Hypercyt流式細胞儀(Intellicyte, USA)對於各轉染物及陰性親本株計算平均螢光強度(MFI)。
B. 生物活性表徵
此實例另外描述人類初生T細胞活體外分析中之Fc融合變異蛋白生物活性表徵。
1. 混合淋巴細胞反應(MLR)
可溶rICOSL.Fc生物活性係在人類混合淋巴細胞反應(MLR)中測試。人類初生樹突狀細胞(DC)係藉由在Ex-Vivo 15培養基(Lonza, Switzerland)中用500 U/mL rIL-4(R&D Systems, USA)及250 U/mL rGM-CSF (R&D Systems, USA)活體外培養自PBMC (BenTech Bio, USA)分離之單核球7天而產生。10,000個成熟DC及100,000個純化之同種異體CD4+ T細胞(BenTech Bio, USA)與ICOSL變異型Fc融合蛋白及對照在96孔圓底盤中在200 μl最終體積之Ex-Vivo 15培養基中共培養。在第5天，使用人類IFN-γ Duoset ELISA套組(R&D Systems, USA)分析培養上清液中之IFN-γ分泌。光學密度係藉由VMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, USA)量測且相對於IFN-γ Duo-set套組(R&D Systems, USA)中所包括之滴定rIFN-γ標準品定量。第二MLR方案由藉由在Ex-Vivo 15培養基(Lonza, Switzerland)中用50 ng/mL rIL-4(R&D Systems, USA)及80 ng/mL rGM-CSF (R&D Systems, USA)活體外培養自PBMC (BenTech Bio, USA)分離之單核球7天而產生之人類初生樹突狀細胞(DC)組成。在第3及5天，移除一半培養基且經含有50 ng/mL rIL-4及80 ng/mL rGM-CSF之新鮮培養基替換。為了完全誘導DC成熟，脂多醣(LPS)(InvivoGen Corp., USA)在第6天以100 ng/mL添加至DC培養物且再培育細胞24小時。大致10,000個成熟DC及100,000個純化之同種異體CD3+ T細胞(BenTech Bio, USA)在96孔圓底盤中在200 μl最終體積之Ex-Vivo 15培養基中與ICOSL變異型Fc融合蛋白及對照共培養。在第4-5天，使用人類IFN-γ Duoset ELISA套組(R&D Systems, USA)分析培養上清液中之IFN-γ分泌。光學密度係在BioTek Cytation Multimode Microplate Reader (BioTek Corp., USA)上量測且相對於IFN-γ Duo-set套組(R&D Systems, USA)中所包括之滴定rIFN-γ標準品定量。
2. 抗CD3共固定化分析
在抗CD3共固定化分析中測定ICOSL融合變異體之協同刺激生物活性。1 nM或10 nM小鼠抗人類CD3 (OKT3，Biolegends, USA)用1 nM至80 nM rICOSL.Fc變異型蛋白質在PBS中稀釋。將此混合物添加至組織培養物處理之平底96孔盤(Corning, USA)中隔夜以促進刺激性蛋白質與盤之孔的黏附。次日，自盤洗除非結合蛋白質且在最終體積為200 µl之Ex-Vivo 15培養基(Lonza, Switzerland)中將100,000個純化之人類泛T細胞(BenTech Bio, US)或人類T細胞純系BC3 (Astarte Biologics, USA)添加至各孔。在一些情況下，人類泛T細胞係用0.25 μM羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CFSE，ThermoFisher Scientific, USA)標記。培養細胞3天，隨後收穫培養上清液且用如上所述之Duoset ELISA套組(R&D Systems, USA)量測人類IFN-γ水準。細胞增殖係藉由進入分裂之輸入細胞的%測定，其如藉由經由LSR II (BD, USA)上之流式細胞分析，用螢光結合抗CD4、抗CD8抗體(BD, USA)染色之細胞或總T細胞之CFSE稀釋所量測。
C. 結果
例示性測試變異體之結合及活性研究之結果顯示於表7中，其指示相對於各別同源結構ICOS及CD28，在親和力成熟篩選中選擇之ICOSL之ECD中之例示性IgSF域胺基酸取代(置換)。在表中，例示性胺基酸取代係藉由對應於各別參考(例如未經修飾的)ECD序列的胺基酸位置編號指示如下。舉例而言，表7中之參考(例如未經修飾的)ECD序列(WT ICOSL)為SEQ ID NO: 32中闡述之(例如未經修飾的) ICOSL ECD序列。胺基酸位置指示於中間，且對應參考(例如未經修飾的或野生型)胺基酸列於該編號之前且鑑別之變異型胺基酸取代列於該編號之後。第2欄闡述各變異型ECD-Fc融合分子之變異型ECD的SEQ ID NO標識符。
亦顯示結合活性，其如藉由各變異型Fc-融合分子結合至經轉染以表現同源配位體之細胞之平均螢光強度(MFI)值，及相比於不含胺基酸取代之對應參考(例如未經修飾的) ECD-Fc融合分子與相同細胞表現之反結構配位體之結合的MFI之比所量測。變異型Fc-融合分子調節T細胞活性之功能活性亦基於i)藉由與抗CD3共固定化之指定變異型ECD-Fc融合分子或ii)藉由MLR分析中之指定變異型ECD-Fc融合分子產生的培養上清液中IFN-γ之計算水準(pg/mL)顯示。表亦描繪在兩個功能分析中相比於對應參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fc的由各變異型ECD-Fc產生之IFN-γ之比。
如所示，選擇導致鑑定多種親和力經修飾以對於至少一種，且在一些情況中超過一種同源反結構配位體展現增加之結合的ICOSL IgSF域變異體。另外，結果顯示變異型分子之親和力修飾亦展現改良之活性(取決於分子型式增加及/或減少之免疫活性)。舉例而言，相比於不含胺基酸置換之參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fc分子，配位體之共固定化可能提供與細胞之多價相互作用以聚集或增加親合力以有利於促效活性及增加T細胞活化。然而，當分子提供為溶液中之二價Fc分子時，相同IgSF域變異體相比於不含胺基酸置換之參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fv分子展現拮抗活性以減少T細胞活化。
*：對於WT ICOSL使用346 pg/mL IFN-γ計算之親本比
基本上如上文所述地重複結合分析，除了亦相對於表現全長人類CTLA4之細胞評估結合。亦基本上如上文所述地在抗CD3共固定化分析中進一步評估ICOSL變異型Fc融合蛋白。結果確認鑑定多種對於至少一種，且在一些情況下超過一種同源配位體展現增加之結合親和力的ICOSL IgSF域變異體。另外，結果顯示變異型分子之親和力修飾亦在共固定化分析中展現改良之活性。
實例7額外親和力經修飾之 IgSF 域
此實例描述額外親和力經修飾之CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)及NKp30免疫調節蛋白之設計、產生及篩選，該等免疫調節蛋白為在免疫活化及抑制兩者中展示雙重作用之免疫突觸(IS)的其他組分。此等實例展示IgSF域之親和力修飾產生可用來增加及減少免疫活性之蛋白質。此操作亦描述與變異型親和力經修飾之ICOSL成對融合(亦即，堆疊)以形成II型免疫調節蛋白以獲得免疫調節活性之彼等域的各種組合。
轉譯及表現為酵母展示文庫之人類CD80、CD86及NKp30 IgSF域之突變型DNA構築體基本上如實例1中所述地產生。對於靶向靶蛋白之特定殘基以完全或部分藉由簡併密碼子隨機化之文庫，用於人類CD80 (SEQ ID NO: 28)及NKp30 (SEQ ID NO: 54)之胞外域(ECD)之編碼DNA係以長度為至多80個鹼基對(bp)之一組重疊寡核苷酸之形式訂購自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)。或者，殘基係藉由基本上如實例1中所述之定點靶向誘變突變。或者，構築隨機文庫以基本上如實例1中所述地鑑別CD80 (SEQ ID NO: 28)、CD86 (SEQ ID NO: 29)及NKp30 (SEQ ID NO: 54)之ECD之變異體。
基本上如實例2中所述地將靶向及隨機文庫DNA引入至酵母菌中以產生酵母菌文庫。文庫用於基本上如實例3中所述地選擇表現CD80、CD86及NKp30之親和力經修飾之變異體的酵母菌。基本上如實例3中所述地處理細胞以減少非結合子且富集能夠結合其外源重組反結構蛋白質之CD80、CD86或NKp30變異體。舉例而言，分別針對CD28、CTL-4及PD-L1中之每一者選擇顯示靶向或隨機CD80文庫之酵母菌。此後接著為二至三輪使用外源反結構蛋白質染色之流動式細胞測量術分選以富集顯示改良之結合子的酵母細胞部分。藉由流動式細胞測量術之磁性珠粒富集及選擇係基本上如Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2及Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, 2008年7月中所述。
藉由CD80、CD86及NKp30文庫，靶配位體蛋白質如下地源自R&D Systems (USA)：人類rCD28.Fc (亦即，重組CD28-Fc融合蛋白)、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc及rB7H6.Fc。基本上如實例3中所述地進行兩色流動式細胞測量術。針對較高特異性結合親和力分析來自流動式細胞測量術分選之酵母菌輸出。分選輸出酵母菌經擴增及再誘導以表現其編碼之特定IgSF親和力經修飾之域變異體。此群體可接著藉由流動式細胞測量術相比於親本、野生型酵母菌菌株，或任何其他所選輸出，諸如珠粒輸出酵母菌群體。
在針對結合至B7-H6選擇之NKp30酵母菌變異體的情況下，F2分選輸出在用16.6 nM rB7H6.Fc染色時給出533之MFI值，而親本NKp30菌株MFI在用相同濃度之rB7H6.Fc染色時量測於90處(6倍提高)。
在鑑別之NKp30變異體中包括參看對應於SEQ ID NO: 54中所闡述之位置之NKp30細胞外域中之位置含有突變L30V/A60V/S64P/S86G之變異體。在鑑別之CD86變異體中包括參看對應於SEQ ID NO: 29中所闡述之位置之CD86細胞外域中之位置含有突變Q35H/H90L/Q102H之變異體。在鑑別之CD80變異體中包括表8中所闡述且進一步描述於下文之變異體。
如同ICOSL，在FL1上用抗HA標籤抗體量測時之上文所述之所有F2輸出的MFI相比於野生型菌株不增加且有時下降，指示增加之結合不隨酵母菌表面上之所選變異體之增加的表現而變，且證實僅選擇具有高配位體結合之中至低表現子的門控策略。
基本上如實例4中所述地將例示性選擇輸出重新格式化為含有融合至Fc分子之CD80之親和力經修飾之(變異型)細胞外域(ECD)(變異型ECD-Fc融合分子)的免疫調節蛋白且基本上如實例5中所述地表現及純化Fc-融合蛋白。
接著基本上如實例6中所述地評估例示性CD80 Fc-融合變異體與細胞表現之反結構的結合。為了產生表現同源結合配位體之細胞，基本上如實例6中所述地產生人類CD28、CTLA4及PD-L1中之每一者之全長哺乳動物表面表現構築體。基本上如實例6中所述地進行結合研究及流動式細胞測量術。另外，基本上如實例6中所述地藉由混合淋巴細胞反應(MLR)或抗CD3共固定化分析表徵Fc-融合變異蛋白之生物活性。
例示性測試變異體之結合及活性研究的結果顯示於表8及9中。特定言之，表8指示相對於各別同源結構CD28，在親和力成熟篩選中選擇之CD80之ECD中之例示性IgSF域胺基酸取代(置換)。表9指示相對於各別同源結構PD-L1，在親和力成熟篩選中選擇之CD80之ECD中之例示性IgSF域胺基酸取代(置換)。如上所述，對於各表，例示性胺基酸取代係藉由對應於各別參考(例如未經修飾的)ECD序列之胺基酸位置編號指示如下。舉例而言，表8及9中之參考(例如未經修飾的)ECD序列為SEQ ID NO: 28中闡述之未經修飾的CD80 ECD序列。胺基酸位置指示於中間，且對應參考(例如未經修飾的)胺基酸列於該編號之前且鑑別之變異型胺基酸取代列於該編號之後。第2欄闡述各變異型ECD-Fc融合分子之變異型ECD的SEQ ID NO標識符。
亦顯示結合活性，其如藉由各變異型Fc-融合分子結合至經工程改造以表現同源反結構配位體之細胞之平均螢光強度(MFI)值，及相比於不含胺基酸取代之對應參考(例如未經修飾的) ECD-Fc融合分子與相同細胞表現之反結構配位體之結合的MFI之比所量測。變異型Fc-融合分子調節T細胞活性之功能活性亦基於i)藉由與抗CD3共固定化之指定變異型ECD-Fc融合分子或ii)藉由MLR分析中之指定變異型ECD-Fc融合分子產生的培養上清液中IFN-γ之計算水準(pg/mL)顯示。表亦描繪在兩個功能分析中相比於對應參考(例如未經修飾的)ECD-Fc的由各變異型ECD-Fc產生之IFN-γ之比。
如所示，選擇導致鑑定多種親和力經修飾以對於至少一種，且在一些情況中超過一種同源反結構配位體展現增加之結合的CD80 IgSF域變異體。另外，結果顯示變異型分子之親和力修飾亦展現改良之活性(取決於分子型式增加及減少之免疫活性)。舉例而言，相比於不含胺基酸置換之參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fc分子，配位體之共固定化可能提供與細胞之多價相互作用以聚集或增加親合力以有利於促效活性及增加T細胞活化。然而，當分子提供為溶液中之二價Fc分子時，相同IgSF域變異體相比於不含胺基酸置換之參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fv分子展現拮抗活性以減少T細胞活化。

實例8產生及評估含有不同親和力經修飾之域的堆疊分子
此實例描述產生為堆疊構築體之其他免疫調節蛋白，該等堆疊構築體含有至少兩個不同的來自鑑別之變異型ICOSL多肽之親和力經修飾之域及一或多個連接在一起且融合至Fc之額外變異型CD80、CD86、ICOSL及NKp30分子。
針對一或多種反結構配位體親和力經修飾之上文所述之所選變異型分子用於產生含有兩個或多於兩個親和力經修飾之IgSF域的「堆疊」分子(亦即，II型免疫調節蛋白)。堆疊構築體基因塊(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)形式獲得，該等基因塊以使得堆疊能夠藉由使用吉布森組裝(Gibson assembly)套組(New England Biolabs, USA)之標準吉布森組裝融合至Fc的格式編碼該堆疊。
產生所有堆疊之編碼核酸分子以編碼如下設計之蛋白質：信號肽，接著為所關注之第一變異型IgV，接著為由三個GGGGS (G4S)基元組成之15個胺基酸連接子(SEQ ID NO: 228)，接著為所關注之第二IgV，接著為兩個GGGGS連接子(SEQ ID NO: 229)，接著為三個丙胺酸(AAA)，接著為如上文所述之人類IgG1 Fc。為了使各堆疊中之IgV域之正確摺疊的機率最大化，第一IgV前面為在野生型蛋白質中通常存在於此IgV與信號肽之間的所有殘基(前導序列)。類似地，第一IgV後面為在野生型蛋白質中通常將其連接至下一Ig域(通常為IgC域)之所有殘基或若此類第二IgV域不存在，則為將其連接至跨膜域之殘基(托尾序列)。相同設計原理適用於第二IgV域，除了當兩個IgV域衍生自相同親本蛋白質(例如與另一ICOSL IgV堆疊之ICOSL IgV)時，未複製兩者之間的連接子。
表10闡述例示性堆疊構築體之設計。表10中所示之例示性堆疊分子含有如所指示之Ig域(例如IgV域)且另外含有如上文所述之拖尾序列。在表中，以下組分依序呈現：信號肽(SP；SEQ ID NO: 225)、Ig域1 (例如Ig1)、拖尾序列1 (TS1)、連接子1 (LR1；SEQ ID NO: 228)、Ig域2 (Ig2)、拖尾序列2 (TS2)、連接子2 (LR2；SEQ ID NO: 230)及Fc域(含有C5S/R77C/N82G/V87C胺基酸取代之SEQ ID NO: 226)。在一些情況下，前導序列1 (LS1)在信號肽與IgV1之間且在一些情況下，前導序列2 (LS2)在連接子與IgV2之間。
基本上如實例5中所述地自含有至少一個親和力經修飾之IgV域的CD80、CD86、ICOSL或Nkp30產生含有變異型IgV域之各種組合之變異型IgV堆疊之Fc融合分子的高通量表現及純化。亦基本上如實例6中所述地藉由抗CD3共固定化分析評估變異型IgV堆疊之Fc融合分子與各別反結構之結合及功能活性。舉例而言，堆疊IgSF Fc融合蛋白之協同刺激生物活性係在與上文類似之固定化抗CD3分析中測定。在此情況下，4 nM抗CD3 (OKT3，Biolegend, USA)與4 nM至120 nM之人類rB7-H6.Fc (R&D Systems, USA)或人類rPD-L1.Fc (R&D Systems, USA)在組織培養物處理之96孔盤(Corning, USA)上共固定化隔夜。次日，用PBS洗除非結合蛋白質且將100,000個純化之泛T細胞在100 µl Ex-Vivo 15培養基(Lonza, Switzerland)中添加至各孔。堆疊之IgSF域隨後以8 nM至40 nM範圍內之濃度以100 µl之體積添加，總體積為200 µl。培養細胞3天，隨後收穫培養上清液且用如上所述之Duoset ELISA套組(R&D Systems, USA)量測人類IFN-γ水準。
結果闡述於表11-13中。特定言之，表11闡述含有NKp30 IgV域及ICOSL IgV域之變異型IgV堆疊之Fc融合分子之結合及功能活性結果。表12及13闡述含有變異型ICOSL IgV域及變異型CD80 IgV或CD86 IgV域之變異型IgV堆疊之Fc融合分子之結合及功能活性結果。
對於表11-13中之每一者，第1欄指示堆疊之、親和力經修飾之或野生型(WT)域之結構組織及定向開始於胺基端(N端)域，接著為中間WT或親和力經修飾之域，其位於C端人類IgG1 Fc域之前。第2欄闡述各別「堆疊」分子中所包含之各IgV域之序列的SEQ ID NO標識符。第3欄顯示結合配位體，來自第1欄之指定親和力經修飾之堆疊域係針對該等結合配位體選擇。
亦顯示結合活性，其如藉由各堆疊分子結合至經轉染以表現各種反結構配位體之細胞之平均螢光強度(MFI)值，及相比於不含胺基酸取代之參考(例如未經修飾的) IgV域與相同細胞表現之反結構配位體之結合的MFI之比所量測。變異型堆疊分子調節T細胞活性之功能活性亦如實例6中所述地基於藉由溶液中之指定變異型堆疊分子及與抗CD3共固定化之適當配位體產生的培養上清液中IFN-γ之計算水準(pg/mL)顯示。表亦描繪共固定化分析中相比於對應參考(例如未經修飾的)堆疊分子的由各變異型堆疊分子產生之IFN-γ之比。
如所示，結果顯示有可能產生堆疊分子，其含有至少一個相比於含有各別參考(例如野生型或未經修飾的)IgV域之對應堆疊分子，對於至少一種同源反結構配位體展現增加的親和力經修飾之結合活性之變異型IgSF域。在一些情況下，來自分子中之一種變異型IgSF域或兩者之組合的堆疊分子對於超過一種同源反結構配位體展現增加之結合。結果亦顯示堆疊分子中之IgV域之次序可在一些情況下改變改良之結合活性的程度。在一些情況下，功能T細胞活性亦在評估於靶向共固定化分析中時改變。


實例9表現跨膜免疫調節蛋白之工程改造細胞的產生及分析
產生工程改造T細胞，其中包含含有如上文所述之變異型CD80之細胞外域(ECD)或ICOSL親和力經修飾之IgSF域的跨膜免疫調節蛋白(TIP)與嵌合抗原受體(CAR)共表現。TIP亦含有對應野生型CD80或ICOSL跨膜蛋白序列之跨膜域及細胞質域。工程改造細胞之免疫調節活性係相比於僅表現CAR之細胞或共表現對應野生型CD80或ICOSL跨膜蛋白與CAR之細胞。
例示性CD80-TIP為變異型CD80，其具有在參看SEQ ID NO: 28中所闡述之CD80細胞外域中之位置對應於I67T/L70Q/A91G/T120S之IgV及IgC域中含有胺基酸突變之親和力經修飾之IgSF域及對應於SEQ ID NO: 1之殘基243-288之跨膜域及細胞質域。例示性CD80-TIP之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 241中且由SEQ ID NO: 242中所闡述之核苷酸序列編碼。對應野生型CD80跨膜蛋白具有如SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基35-288所闡述之胺基酸序列且由SEQ ID NO: 251中所闡述之胺基酸序列編碼。
例示性ICOSL-TIP為變異型ICOSL，其具有在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之ICOSL細胞外域中之位置對應於N52H/I143T之IgV域中含有胺基酸突變之親和力經修飾之IgSF域及對應於SEQ ID NO: 5之殘基257-302之跨膜域及細胞質域。例示性ICOSL-TIP之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 243中且由SEQ ID NO: 244中所闡述之核苷酸序列編碼。對應野生型ICOSL跨膜蛋白具有如SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基19-302所闡述之胺基酸序列且由SEQ ID NO: 252中所闡述之胺基酸序列編碼。
含有親和力經修飾之域的TIP或含有對應親和力未經修飾之IgSF域之野生型跨膜蛋白在T細胞中與含有CD3ζ細胞內信號傳導域之第1代嵌合抗原受體(CAR)共表現。第1代CAR包括對CD19 (SEQ ID NO: 245)具有特異性之scFv、衍生自CD8 (SEQ ID NO: 246)之鉸鏈及跨膜域及衍生自CD3ζ (SEQ ID NO: 47中所闡述)之細胞內信號傳導域。編碼CD19 scFv-CD3ζ CAR之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO: 248中且CD19 scFv-CD3ζ CAR之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 479中。
產生僅編碼CAR或亦編碼藉由自體裂解T2A序列(SEQ ID NO: 250且由SEQ ID NO: 249中所闡述之核苷酸序列編碼)與CAR分離之例示性TIP或野生型跨膜蛋白中之一者的核酸分子。例示性構築體含有表14中所闡述之核酸序列。作為對照，亦產生編碼另外含有CD28協同刺激域之第2代CAR之核酸構築體(CD19 scFv-CD28-CD3ζ)。
核酸分子個別地選殖至慢病毒載體中，其用於轉導自獲自三個不同健康供體之人類PBMC樣品分離的T細胞。在共轉染HEK293細胞與載體及慢病毒包裝構築體之後產生含有核酸序列之慢病毒粒子。慢病毒粒子藉由超速離心收集自培養基且藉由qRT-PCR滴定。人類外周血液單核細胞(PBMC)係使用密度沈降分離自三個正常血液供體。PBMC用抗CD3及抗CD28抗體及IL-2培養隔夜，接著以5:1之感染倍率經慢病毒製劑轉導。編碼對照第2代CAR之慢病毒載體僅用於轉導來自一個供體之細胞。
在培養兩週(14天)之後，細胞在與靶抗原表現細胞共培養後使用Acea Real-Time Cell Analyzer (RTCA)分析細胞毒性，RTCA量測96孔微電子盤(E-盤)之培養基中之阻抗變化，且以實時曲線顯示細胞數目及形態變化。CD19表現HeLa靶細胞(HeLa-CD19)接種至96孔E-盤中且使用RTCA系統監測各單層之阻抗24小時。工程改造T細胞以10:1之效應細胞:靶細胞比添加至孔中且再監測孔48小時。結果顯示及記錄為自量測之電阻抗變化得出之細胞指數(CI)值且接著藉由所有時間點處之所有孔之CI讀數除以同一時間(基準時間)處之個別孔之CI值比率轉化以獲得表示基準時間處之百分比值的標準化細胞指數值(參見Zhang等人 「Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigence®System with RTCA Package.」Bioconductor . 2016年5月3日, bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/RTCA/inst/doc/aboutRTCA.pdf. 2016年9月9日接入)。在此分析中，單層之阻抗的減少反映靶細胞藉由轉導細胞殺死。
結果顯示在表現第1代CAR之細胞中觀測禱相比於未轉導T細胞減少之阻抗，儘管表現第1代CAR之細胞之阻抗減少程度小於表現第2代CAR之細胞。表現第1代CAR之細胞中減少之阻抗一般繼續直至分析之前8個小時，同時僅第2代CAR表現細胞在此後繼續減少阻抗。
如圖 1 中所示，在一個供體中，相比於僅表現第1代CAR之細胞，共表現TIP或對應野生型跨膜蛋白與第1代CAR之細胞中之每一者展現較大阻抗減少，指示較大細胞毒性活性。另外，結果顯示相對於共表現含有親和力未經修飾之IgSF域之對應野生型CD80或ICOSL跨膜蛋白的CAR表現細胞，共表現CD80-TIP或ICOSL-TIP之CAR表現細胞中之細胞毒性活性較大。此等TIP工程改造細胞之觀測結果顯示共表現CD80-TIP或ICOSL-TIP與CAR之細胞中之細胞毒性活性展現增加的調節抗原特異性T細胞，諸如CAR表現T細胞之細胞毒性免疫反應之活性。
在其他兩個供體中，相比於表現對應野生型CD80跨膜蛋白之細胞，表現CD80-TIP之細胞不導致較大減少之阻抗。在一個供體中，存在之細胞不足以藉由野生型跨膜蛋白構築體轉導，儘管在此供體中，ICOS-L TIP相比於其他測試之構築體給出最佳細胞毒性。在另一供體中，相比於表現對應野生型ICOS-L跨膜蛋白之細胞，表現ICOS-L-TIP之細胞不導致較大減少之阻抗。在測試細胞中，共表現CD80-TIP、ICOSL-TIP或對應野生型跨膜蛋白與CAR之所有細胞比僅表現第1代CAR之細胞展現更大細胞毒性活性。供體中觀測之結果的差異可與供體中之T細胞之差異、細胞表面上之各種工程改造蛋白質之表現量的差異、用於此例示性分析以評估細胞殺死之特定條件(例如評估第14天轉導細胞、評估單一效應細胞:靶細胞比)或其他因素相關。
實例10評估 ICOSL IgSF 域變異體之結合及活性
額外ECD ICOSL變異體基本上如上文所述地藉由酵母菌選擇方法鑑別且用於如實例5中所述地產生ECD-Fc融合蛋白。基本上如實例6中所述地進行結合研究以評估ICOSL域變異型免疫調節蛋白針對同源結合配位體之特異性及親和力。
A. 結合及功能表徵
基本上如實例6中所述地評估細胞表現之全長同源結合配位體CD28、ICOS及CTLA-4之結合。亦基本上如實例6中所述地在抗CD3共固定化分析或人類混合淋巴細胞反應(MLR)中評估ECD ICOSL變異體之生物活性，除了對於共固定化分析，協同刺激活性係藉由用10 nM盤結合抗CD3及40 nM ICOSL Fc變異型蛋白質之混合物培養人類T細胞而測定。
表15描繪抗CD3共固定化分析或MLR分析中之額外ICOSL IgSF域變異體結合至細胞表現之反結構及生物活性之例示性結果。表15中描繪之例示性胺基酸取代係藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL ECD序列之胺基酸位置編號指示。胺基酸位置指示於中間，且對應未經修飾的(例如野生型)胺基酸列於該編號之前且鑑別之變異型胺基酸取代列於該編號之後。第2欄闡述各變異型ECD-Fc融合分子之變異型ECD的SEQ ID NO標識符。
表15中之結果描繪結合活性，其如藉由各變異型Fc-融合分子結合至經工程改造以表現同源反結構配位體之細胞之平均螢光強度(MFI)值，及相比於不含胺基酸取代之對應參考(例如未經修飾的)ECD-Fc融合分子與相同細胞表現之反結構配位體之結合的MFI之比所量測。變異型Fc-融合分子調節T細胞活性之功能活性亦基於i)藉由與抗CD3共固定化之指定變異型ECD-Fc融合分子或ii)藉由MLR分析中之指定變異型ECD-Fc融合分子產生的培養上清液中IFN-γ之計算水準(pg/mL)顯示。表亦描繪在兩個功能分析中相比於對應未經修飾的(親本)ECD-Fc的由各變異型ECD-Fc產生之IFN-γ之比。
結果顯示親和力經修飾之ICOSL IgSF域變異體針對至少一種同源反結構配位體改變，包括增加之結合親和力及/或改良之免疫活性。特定言之，與實例6中鑑定之初始成果結果類似，選擇導致鑑定多種額外的親和力經修飾以對於至少一種，且在一些情況下超過一種同源反結構配位體展現增加之結合的ICOSL IgSF域變異體。另外，結果顯示如實例6中所述，變異型分子之親和力修飾亦展現改良之活性(取決於分子型式增加及/或減少之免疫活性)。
B. 抗CD3協同刺激分析中之細胞介素產生
在上文所述之抗CD3協同刺激(共固定化)生物活性分析中進一步評估上文所述之例示性變異型ECD ICOSL Fc-融合分子的細胞介素IL-17刺激。10 nM盤結合抗CD3及40 nM ICOSL Fc變異型蛋白質之混合物與人類T細胞一起培養。收集上清液且藉由ELISA測定IL-17水準。量測藉由與抗CD3共固定化之指定變異型ECD-Fc融合分子及對應未經修飾的(親本)ECD-Fc產生之培養上清液中之IL-17的量(pg/mL)。為進行比較，亦在此表中顯示在與關於例示性變異體在表15中所描繪相同之分析中產生IFN-γ之結果。
結果顯示於表16中，其描繪上清液中量測之IL-17的pg/mL以及相比於對應未經修飾的(野生型)ECD-Fc，由各變異型ECD-Fc產生之IL-17之比(倍數增加)。針對IFN-γ顯示類似結果。亦顯示由細胞產生之總IL-17或IFN-γ細胞介素之%。結果顯示除了協同刺激分析中之IFN-γ以外，變異型分子之親和力修飾展現改變之功能T細胞活性以增加IL-17。


實例11產生表現跨膜免疫調節蛋白之額外工程改造 T 細胞及增殖評估
此實例描述額外工程改造T細胞之產生，其中包含含有ICOSL親和力經修飾之IgSF域之細胞外域(ECD)的跨膜免疫調節蛋白(絨尖)與嵌合抗原受體(CAR)共表現。特定言之，產生TIP以包括參看SEQ ID NO: 32中所闡述之ICOSL細胞外域中之位置含有胺基酸突變N52D、N52H/N57Y/Q100P、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/C198R或N52H/N57Y/Q100R之例示性變異型ICOSL之ECD。TIP亦含有對應於SEQ ID NO: 5之殘基257-302的對應野生型ICOSL跨膜蛋白序列之跨膜域及細胞質域。具有或不具有其信號肽之TIP的序列為如下：N52D (SEQ ID NO: 496及497)；N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 498及499)；E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/C198R (SEQ ID NO: 500及501)及N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 502及503)。為進行比較，全長跨膜野生型ICOSL (SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基19-302)亦表現於細胞中。具有或不具有其信號肽之野生型TIP的序列闡述於SEQ ID NO: 494及495中。編碼TIP之核酸亦包括藉由自體裂解T2A序列與TIP分離的編碼綠色螢光蛋白(GFP)之序列。
含有親和力經修飾之域的TIP或含有對應親和力未經修飾之IgSF域的野生型跨膜蛋白與嵌合抗原受體(CAR)共表現於T細胞中。編碼CAR之核苷酸序列依序編碼：CD8信號序列(SEQ ID NO: 481)、抗CD19 scFv (SEQ ID NO: 482)、衍生自CD8之鉸鏈/跨膜區(SEQ ID NO: 483)、衍生自4-1BB之協同刺激信號傳導域(SEQ ID NO: 484)及CD3ζ信號傳導域(SEQ ID NO: 247)。所得抗CD19 CAR具有SEQ ID NO: 490中所闡述之胺基酸序列。編碼CAR之核酸亦包括藉由自體裂解T2A序列(SEQ ID NO: 488中所闡述)與CAR分離的編碼藍色螢光蛋白(BFP；SEQ ID NO: 489)之序列。
分別產生僅編碼CAR之核酸分子或編碼例示性TIP或野生型ICOSL中之一者之核酸分子所選殖為之病毒載體構築體。編碼CAR之病毒載體及編碼TIP或野生型ICOSL之病毒載體共轉導至T細胞中。為進行轉導，初生T細胞係藉由1:1珠粒:細胞比之抗CD3及抗CD28珠粒(Dynal)活化且在100 IU/mL之IL-2存在下在37℃下培育2天。接著收穫T細胞且在8 µg/mL凝聚胺存在下經400 µL CAR病毒上清液及400 µL TIP病毒上清液轉導。細胞在1000 g下在30℃下培育30分鐘。細胞接著經轉移且在37℃下培育隔夜。在培育之後，收集細胞且移除病毒上清液。細胞藉由完全培養基及50 IU/mL之IL-2再懸浮。細胞經擴增，每兩天用IL-2及培養基補充，持續總共6天。珠粒使用磁體自細胞移除且在增殖分析中評估之前計數。例示性轉導T細胞中之TIP及CAR之例示性表現圖譜顯示於圖2A中。
為了評估CAR T細胞及CAR-TIP T細胞回應於抗原之增殖，細胞用cell trace far red染料標記。表現CD19之Nalm6靶細胞自1.5:1靶細胞:T細胞比起始且藉由具有8點稀釋度之1:2稀釋液滴定。將標記之CAR T細胞或CAR-TIP T細胞添加至Nalm6細胞且培育培養物4天，隨後藉由流動式細胞測量術分析細胞。收集上清液且在細胞介素釋放分析中進一步評估。
如圖 2B 中所示，CAR+初生T細胞以劑量依賴型方式增殖為CD19+ NALM6細胞。相比於僅CAR之T細胞，共表現CAR及野生型ICOSL或例示性ICOSL TIP中之一者之T細胞相比於僅表現CAR之T細胞展現增強之增殖。CAR及含有N52H/N57Y/Q100P、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R或N52H/N57Y/Q100R變異型ICOSLECD之TIP之共表現比共表現CAR及野生型ICOSL之T細胞展現更大增殖，指示表現於初生T細胞上之TIP提供改良之共刺激信號以增強T細胞增殖。
實例12純化 ICOSL IgSF 域變異體之純化及評估
純化策略用於實例6及10中所述之例示性候選成果結果。衍生自293細胞株之人類細胞(Expi293)經表現構築體瞬時轉染且ECD ICOSL Fc融合分子表現於細胞中。Fc融合蛋白接著藉由親和力層析(MabSelect SuRe)用蛋白A自上清液純化。此初始純化步驟之後接著為製備型尺寸排阻層析(SEC)步驟以進一步純化蛋白質(Superdex200 16×60)。來自兩個純化步驟之樣品經保留且藉由分析型SEC比較。在蛋白A純化之後測定蛋白質濃度。所得純化蛋白質亦在高效液相層析(HPLC)上藉由分析型SEC分析以評估純度。
純化樣品中之%主峰經測定且相比於初始蛋白A步驟中純化之蛋白質(%主峰Prot A集合)相對於藉由蛋白A繼之以製備型SEC純化之蛋白質(%主峰SEC集合T=D0)。如表17中所示，額外SEC步驟基本上增加純化蛋白質之蛋白質純度。為了進一步評估蛋白質之穩定性，將藉由製備型SEC純化之蛋白質留在室溫下24小時且接著評估根據HPLC之%主峰(%主峰SEC集合T=D24)且相比於D0樣品。確定D0相對於D24處之%主峰的變化(▲%主峰SEC集合)。如表17中所示，大部分測試之例示性變異型ECD ICOSL Fc融合分子此時展現%主峰之極小變化，指示出現極少蛋白質變異體聚集。


實例13評估純化 ICOSL IgSF 域變異型成功結果之協同刺激生物活性
基本上如實例6中所述地藉由MLR評估如實例12中所述純化之例示性ECD ICOSL Fc融合分子之生物活性。10 nM或40 nM ICOSL Fc變異型蛋白質之混合物在10 nM抗CD3存在下結合至96孔盤隔夜。盤經洗滌且經96小時添加100,000個CFSE標記之泛T細胞。收集上清液，且藉由ELISA來量測IFN-γ及IL-17水準。
藉由抗CD3與例示性測試變異體(10 nM及40 nM ICOSL Fc)之協同刺激誘導之細胞介素分泌的結果顯示於圖 3A 及 3B 中，其指示ICOSL之ECD中之例示性IgSF域胺基酸取代(置換)。圖 3A 及 3B 中之條形圖分別描繪上清液中藉由ELISA之分泌IFN-γ及IL-17的量(pg/mL)。相比於藉由抗CD3與WT ICOSL之協同刺激誘導之水準的藉由抗CD3與測試變異體之協同刺激誘導之細胞介素釋放水準係藉由水平線指示。結果顯示變異型分子之親和力修飾展現調節功能T細胞活性之活性，包括在協同刺激分析中基本上增加IFN-γ及IL-17分泌。在一些變異體中觀測到增加之免疫活性。
實例14評估純化 ICOSL IgSF 域變異型成功結果之增殖
評估如實例12中所述純化之例示性變異型ECD ICOSL Fc融合分子共刺激抗CD3誘導之T細胞增殖的能力。初生T細胞係用羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CFSE)標記。10 nM或40 nM變異型ECD ICOSL Fc或野生型ECD ICOSL蛋白質之混合物在10 nM抗CD3存在下結合至96孔盤隔夜，且接著添加標記之T細胞且培育3天。作為對照，亦在結合之抗CD3及IgG或單獨的IgG存在下評估增殖。細胞針對CD4或CD8表面標記物染色且總T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖係藉由流動式細胞測量術評估CFSE稀釋來測定。
40 nM及10 nM ICOSL下測試之例示性變異體之結果分別闡述於圖 4A 及圖 4B 中。如圖 4A 中所示，幾乎所有測試之變異型ECD ICOSL Fc融合分子誘導大於WT對照之增殖。如圖 4B 中所示，增殖之差異在10 nM處更明顯，其中某些變異體甚至在此較低濃度下提供最大增殖。
實例15評估純化之 ICOSL IgSF 域變異型成功結果之結合及活性
使用基本上如實例6或實例10中所述至方法評估如實例12中所述純化之例示性變異型ECD ICOSL Fc融合分子的結合及功能活性。
A. 流動式細胞測量術結合分析
衍生自293細胞株之人類細胞(Expi293)經CD28、CTLA-4 ICOS轉染或模擬轉染。細胞接著與滴定自100,000 pM至46 pM之ECD ICOSL Fc融合分子或野生型ECD ICOSL-Fc一起培育，且結合係如實例6中所述地使用PE結合之抗人類Fc觀測。結合係藉由流動式細胞測量術評估且平均螢光強度(MFI)及針對信號呈陽性之細胞的百分比(%)係使用Cell Quest Pro軟體(Becton Dickinson, USA)測定。測定給出半最大MFI反應(MFI EC50)或%陽性細胞(% (+) EC50)之ICOSL-Fc的濃度。
表18闡述結果。表18中描繪之ICOSL胺基酸取代係藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL ECD序列之胺基酸位置編號指示。對於一些值(例如結合至CD28之WT)，不可能獲得EC50，因此1000000 pM出於資料格式化目的任意指定。與獲自如以上實例10中所述之前述結合分析的結果類似，觀測到變異型ICOSL ECD-Fc融合分子針對至少一種同源反結構配位體改變之結合親和力。
B. ForteBio結合分析
受體與ICOSL域變異型免疫調節蛋白之間的蛋白質-蛋白質相互作用係使用Fortebio結合分析進一步評估。ICOS、CD28及CTLA-4受體個別地負載至抗人類捕獲感測器(ForteBio Octet AHC)上且野生型未經修飾的ICOSL ECD-Fc融合分子、野生型PD-L2 ED-Fc融合分子或變異型ICOSL Fc-融合分子係在4點滴定中結合至受體。各滴定經全域擬合以計算各蛋白質之締合(k合 )及解離(K離 )。測定藉由變異型ICOSL ECD-Fc融合分子測試之各受體之抗人類捕獲感測器的負載反應。解離常數(KD)經計算且相比於野生型以確定倍數提高值(倍數imp.)。
與ICOS之結合結果闡述於表19中，與CD28之結合結果闡述於表20中且與CTLA-4之結合結果闡述於表21中。表19-21中描繪之胺基酸取代藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考未經修飾的ICOSL ECD序列之胺基酸位置編號指示。




C. 共固定化分析
基本上如實例6中所述地在抗CD3共固定化分析中測定ICOSL融合變異體之協同刺激生物活性。大致0.37 nM、1.3 nM或10 nM小鼠抗人類CD3 (OKT3，Biolegends, USA)與10 nM或40 nM變異型ICOSL ECD Fc或野生型ICOSL ECD-Fc一起在PBS中稀釋。將此混合物添加至組織培養物處理之平底96孔盤隔夜以促進刺激性蛋白質與盤之孔的黏附。次日，自盤洗除非結合蛋白質且將100,000個純化之人類泛T細胞添加至各孔。培養細胞3天，隨後收穫培養上清液且藉由ELISA套組量測人類IFN-γ水準。
表22闡述在抗CD3共固定化分析中在各種條件下由細胞產生之IFN-γ的量(pg/mL)。在表中，例示性變異型ECD ICOSL-Fc融合物之胺基酸取代係藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之未經修飾的ICOSL ECD序列之胺基酸位置編號指示且闡述各變異型ICOSL ECD-Fc融合分子之變異型ECD之對應SEQ ID NO標識符。顯示相比於在對應未經修飾的(野生型)ECD-Fc存在下，在功能分析中在各變異型ICOSL ECD-Fc存在下產生之IFN-γ之比(倍數↑WT)。如所示，變異型ICOSL-ECD-Fc分子之協同刺激信號傳導相比於野生型ICOSL基本上更大。
D. 用於評估生物反應性抑制之混合淋巴細胞反應
基本上如實例6中所述地在混合淋巴細胞反應(MLR)中測定藉由融合變異體之T細胞活性調節。人類單核球在IL-4及GM-CSF存在下培育6天且持續最終24小時藉由添加LPS成熟化為樹突狀細胞。1×104 個樹突狀細胞及1×105 個人類CFSE標記之T細胞經每孔平鋪且在稀釋於PBS中之三種不同濃度(40 nM、13.3 nM或4.4 nM)之野生型或重組變異型ICOSL ECD-Fc分子存在下培育4天。相同濃度之人類IgG、PD-L2-Fc或貝拉西普(含有L104E及A29Y突變之CTLA4-Fc)係用作對照。收穫上清液且IFN-γ反應藉由ELISA表徵。
圖 5 描繪各種條件下之IFN-γ產生。在野生型ICOSL存在下由細胞產生之IFN-γ之水準係藉由水平線闡述。未在陰性對照蛋白質PD-L2-Fc存在下觀測到IFN-γ產生之抑制。相比之下，大部分測試ICOSL變異體在MLR中展現一定程度的IFN-γ產生之抑制。某些變異體展現IFN-γ之大幅抑制，其中培養物中產生之IFN-γ極低至不可偵測，甚至在4.4 nM之最低測試濃度下。在4.4 nM變異型ECD ICOSL-Fc存在下之MLR抑制%闡述於表23中。在表中，負值指示分析中之發炎性效應。
E. 藉由流動式細胞測量術評估增殖及細胞內細胞介素標記物
在野生型或重組變異型ICOSL ECD-Fc分子存在下培育4天的來自如上文所述之MLR研究之羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CFSE)標記之泛T細胞係藉由在高爾基體抑制劑(Golgi/Block/Plug)存在下用豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)/離子黴素再刺激6小時而進一步測試細胞介素水準。亦再刺激與人類IgG、抗CD28、抗ICOSL、PD-L2-Fc或貝拉西普(含有L104E及A29Y突變之CTLA4-Fc)一起培育的來自MLR研究之T細胞。T細胞針對CD4或CD8表面標記物染色、經固定、經滲透且針對如表24及25中所闡述之各種細胞介素細胞內染色。
對於特定細胞內細胞介素呈陽性之CD4+及CD8+ T細胞之百分比(%)分別顯示於表24中。結果顯示多種變異型ICOSL ECD-Fc分子能夠抑制一或多種細胞介素，包括在一些情況下，大多數細胞介素。計算總評分及平均評分以評估經此分析中檢查之參數測試之個別分子的總和效應。亦評估增殖且如藉由CFSE稀釋所測定已分裂之細胞的百分比亦顯示於表24及25中。在提供之結果中，結果顯示某些變異體顯示與貝拉西普相當或更好的活性，尤其來自CD8+細胞。

實例16評估 B-T 細胞共培養物中之細胞介素產生
B細胞及CD4+ T細胞係純化自相同供體且用CSFE標記且以1:1細胞比率以每孔各5×104 個細胞平鋪於96孔盤中。變異型ICOSL ECD-Fc融合分子或貝拉西普以每孔40 nM之最終濃度添加。細胞為未刺激的或與100 ng/mL葡萄球菌腸毒素B (SEB)、1 μg/mL美洲商陸有絲分裂原(PWM)或兩者一起以200微升/孔之最終體積在37℃下培育7天。
細胞經收穫且針對以下B及T細胞譜系標記物(IgM、IgD、CD38、CD138、CD27、CD19、CD4、CD3)表面染色。藉由流動式細胞測量術評估增殖且使用LEGENDplex人類Th細胞介素偵測套組(Biolegend, USA)針對IL-5、IL-13或IL-21細胞介素分析培養上清液。
如圖 6A 中所示，相比於無蛋白質對照，當在變異型ICOSL ECD Fc-融合分子存在下培育時，B/T細胞共培養物中之分裂B細胞的數目減少。測試之例示性變異體之拮抗效應程度與CTLA-4-Ig貝拉西普(L104E、A29Y)類似。同樣，如圖 6B - 6D 中所示，相比於無蛋白質對照以及含有野生型ICOSL對照之培養物，變異型ICOSL ECD Fc-融合分子活體外抑制初生人類B細胞/T細胞共培養物中之細胞介素產生。相比於貝拉西普，例示性測試之變異型ICOSL ECD Fc-融合分子在一些情況下在阻斷細胞介素產生中更有效。
實例17評估移植物抗宿主疾病 ( GvHD ) 模型中之存活率及疾病活性
在移植物抗宿主疾病(GvHD)模型中評估例示性ICOSL變異型ECD-Fc蛋白質之活性。雌性NSG小鼠(n=10/組)經照射(100 rad)且在第1天皮下投與10 mg γ球蛋白。在第0天，小鼠接受1千萬個人類外周血液單核細胞(PBMC)及100 µg WT-ICOSL ECD Fc、變異型ICOSL ECD Fc分子N52H/I143T (SEQ ID NO: 135中所闡述之ECD)、變異型ICOSL ECD Fc分子N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中所闡述之ECD)、75 µg貝拉西普(CTLA-4-Ig L104E/A29Y；美國專利申請公開案第US20160271218號)或生理鹽水(作為對照)之腹膜內注射給藥。在第15天，移植之人類CD45+細胞係藉由流動式細胞測量術表型分型。在研究於第35天終止之後，評估存活率、體重損失及疾病活性之終點量測結果。
圖 7A 顯示用生理鹽水、WT ICOSL-ECD Fc、變異型ICOSL ECD-Fc分子或貝拉西普治療之GVHD小鼠之存活率。觀測到相比於投與生理鹽水或WT ICSOL ECD-Fc之小鼠，投與變異型ICOSL ECD-Fc N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中所闡述之ECD)之小鼠之存活率的顯著差異(根據Mantel-Cox及Gehan-Breslow-Wilcoxon測試，p ＜0.0001)。圖 7B 顯示研究過程中用生理鹽水、WT ICOSL ECD-Fc、變異型ICOSL ECD-Fc分子或貝拉西普治療之小鼠之體重損失之間的類似差異。
在研究期間一週三次地測定疾病活性指數(DAI)且評估小鼠之體重損失、姿勢、活動性、毛皮及皮膚外觀的評分。研究過程中之疾病級別顯示於圖 7C 中。接受ICOSL Fc變異型N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中闡述之ECD)或貝拉西普之治療組顯示顯著改良之DAI評分。亦藉由流動式細胞測量術評估在研究之第14天外周血中之人類T細胞的百分比。根據治療組對量測結果求平均值且誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。圖 7D 顯示血液中之活CD3+/CD4+或CD3+/CD8+細胞之百分比。相比於生理鹽水治療組，接受具有N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中闡述之ECD)之變異型ICOSL ECD Fc或貝拉西普的治療組顯示顯著不同的CD4+ T細胞水準(根據不成對T測試分別為p=0.008及0.006)。此研究表明變異型ICOSL Fc變異蛋白在活體內建模期間對人類初生T細胞及GVHD之治療效應。
藉由額外變異型ICOSL ECD-Fc融合分子進行類似研究，包括變異型ICOSL ECD-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (SEQ ID NO: 365中所闡述之ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO: 291中所闡述之ECD)及N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288中所闡述之ECD)。亦測試N52H/Q100R (SEQ ID NO: 285中所闡述之ECD)，其在如以上所示之活體外MLR研究中具有降低之活性。如上文所描述地治療NSG小鼠(n=9/組)。在此研究中，用ICOSL-Fc或貝拉西普給藥自第0天至第37天每週繼續3次且存活小鼠在地49天終止。為了測定組之間的存活比例之統計差異，使用Mantel-Cox (秩和)測試分析資料。所得存活曲線顯示於圖 7E 中。相比於生理鹽水及WT ICOSL-Fc，貝拉西普及ICOSL-Fc變異體N52H/N57Y/Q100R/C198R (SEQ ID NO: 365中所闡述之ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO: 291中所闡述之ECD)及N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288中所闡述之ECD)顯著延長存活期(p＜0.001)。對於實驗時程標繪平均DAI評分，其中最後觀測(亦即在終止當天收集之平均評分)在關於在計劃的研究最後一天(第49天)之前終止之彼等組的圖示上結轉。隨時間推移之資料(亦即DAI評分)的組間顯著差異係針對『治療』效應使用雙向重複量測變異數分析來測定。所得DAI評分顯示於圖 7F 中。根據關於DAI評分之雙因素變異數分析，相比於生理鹽水及WT ICOSL-Fc，貝拉西普及ICOSL-Fc變異體N52H/N57Y/Q100R/C198R (SEQ ID NO: 365中所闡述之ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO: 291中所闡述之ECD)及N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288中所闡述之ECD)顯著降低DAI評分(p＜0.001)，且在貝拉西普與具有N52H/N57Y/Q100R/C198R之ICOSL-Fc變異體之間(p=0.035)。
在一些情況下，相比於用貝拉西普治療，變異型ICOSL-Fc之活性改良。投與ICOSL-Fc變異體在與貝拉西普相當或更好的水準保護免受GVHD之效應，如藉由增強之存活率及減弱之疾病發展證明。此模型中之活性與活體外活性相關，因為WT ICOSL-Fc及具有突變N52H/Q100R (SEQ ID NO: 285中所闡述之ECD)之變異型ICOSL-Fc在此模型中並非如此有效。
實例18藉由堆疊分子活化之評估
基本上如實例8中所述地產生及評估含有作為定位域(指示為「L」)之NKp30 IgV域及作為協同刺激域之ICOSL IgV域(指示為「C」)的堆疊之變異型IgV Fc融合蛋白。特定言之，此實驗中測試之構築體包括：(1)具有變異型IgV Fc融合蛋白(vIgD C-L)之堆疊構築體，其含有由共同NKp30變異體(SEQ ID NO: 143)之Ig構成之NKp30與ICOSL變異體N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中所闡述之ECD及SEQ ID NO: 201中所闡述之IgV)之IgV域；(2)具有NKp30野生型域Ig域(SEQ ID NO: 214)及野生型ICOSL (WT C-L)(SEQ ID NO: 196)之V域之堆疊構築體；(3)具有野生型ICOSL IgV域(WT C域；SEQ ID NO: 196)之構築體，及(3)具有野生型NKp30域(WT L域；SEQ ID NO: 214)之構築體。
CD32+ K562細胞經工程改造以穩定表現細胞表面上之B7-H6。細胞接著用絲裂黴素處理且在不存在10 nM抗CD3及存在100、33、11或3.7 nM之堆疊變異體或對照域之情況下與泛T細胞一起平鋪。培養細胞3天，隨後收穫培養上清液且使用ELISA量測人類IFN-γ水準。
如圖 8A 中所示，變異型及野生型協同刺激定位域堆疊均能夠定位至工程改造K562細胞且遞送協同刺激信號至泛T細胞以誘導IFN-γ分泌。具有變異型IgV Fc融合蛋白(vIgD C-L)之堆疊構築體在所有測試濃度下顯示增加之功能活性結果，而個別域組分在不彼此組合時不具有效應。
實例19活體內評估遲發型過敏
在小鼠遲發型過敏(DTH)模型中活體內評估變異型ICOSL ECD-Fc融合分子之消炎活性。遲發型過敏免疫反應引發於卵白蛋白(OVA)致敏小鼠中且評估攻擊之後的反應。測試之變異型ICOSL ECD-Fc融合分子含有具有以下胺基酸取代之變異型ECD：N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 113中所闡述之ECD)、N52H/Q100R (SEQ ID NO: 285中所闡述之ECD)或N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO: 291中所闡述之ECD)。變異體融合至含有根據EU編號之突變C220S/L234A/L235E/G237A之Fc主鏈(指示為Fc#1)SEQ ID NO: 477中所闡述)或含有根據EU編號之突變C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K之Fc主鏈(指示為Fc#2)SEQ ID NO: 478中所闡述)，具有或不具有G4S (GGGGS；SEQ ID NO: 636)連接子。表26闡述測試之構築體：
為進行致敏，8週齡雌性BALB/c小鼠在第0天在尾巴根部處皮下注射100 µg在西格瑪佐劑(Sigma Adjuvant)(100 µL；目錄號S6322-1VL)中乳化之OVA。在第1及4天，小鼠藉由腹膜內注射投與變異型ICOSL ECD-Fc融合蛋白、75 µg CTLA-4 Fc (阿巴西普)或作為陰性對照之PBS。在第7天在OVA攻擊之前二至三小時，小鼠另外藉由腹膜內注射投與作為對照之PB、75 µg CTLA-4 Fc (獲自Orencia之阿巴西普)或指定變異型ICOSL多肽。阿巴西普及變異型ICOSL-Fc融合分子係以莫耳當量給藥。
關於OVA攻擊，在治療性治療之後2-3小時在氣體異氟醚麻醉下於左耳耳廓中遞送含10 µg OVA之10 µL體積之PBS的皮內注射液。在OVA攻擊之前量測基線耳厚度。
在第8天，使用Mitutoyo測徑規在異氟醚麻醉下量測耳厚度且測定OVA攻擊之前及之後的耳厚度變化。如圖 9 中所示，相比於PBS對照，用指定變異型ICOSL ECD-Fc融合分子治療之小鼠顯示顯著較少OVA誘導之耳部腫脹(根據單因素變異數分析＜0.0001)。用阿巴西普治療之小鼠的耳厚度相比於測試之指定變異型ICOSL ECD-Fc融合分子中之任一者之間或變異型ICOSL治療之間不存在顯著差異。此等結果展示變異型ICOSL分子可減少活體內免疫反應。
實例20含變異型 ICOSL IgSF 域之分子之產生以及結合及活性評估
產生額外含變異型ICOSL IgSF (例如ECD)域之分子，如下所述。在下表中之每一者中，表指示變異型ICOSL之ECD中之胺基酸取代，如藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL細胞外域(ECD)序列中之胺基酸位置的胺基酸位置編號指示。在一些情況下，移除變異型ICOSL ECD-Fc之AAA連接子序列係藉由「ΔAAA」指示。第2欄闡述變異型ECD-Fc融合分子中包含之各變異型ECD域之SEQ ID NO標識符。
A. 額外變異體之產生 1. 溶解度變異體
自含有包括E16V、N30D、K42E、N52H、N52Y、N52S、N57Y、E90A、Q100R、Q100P、L102R、V110D、H115R、F120S、V122A、F138L、I143V、I143T、H152C、K156M、F172S、N194D、C198R、L203P、R221I、I224V之突變的突變體集合，突變H115R、F172S及C198R鑑別為可潛在地增強蛋白質溶解度或增強蛋白質表現之突變(『溶解度突變』)。此三個突變(H115R、F172S及C198R)藉由定點誘變隨機引入至相同純系集中以產生含有此等溶解度突變中之一或多者的衍生物集合。由於定點誘變反應係藉由與彙集之親本純系反應之彙集之誘變寡核苷酸在單一反應中進行，一些純系亦含有一些來自其他親本純系之突變。產生之變異體含有3至10個呈各種組合之不同胺基酸突變，如表27A中所概述。
2. 返回變異體
包括實例6中所述之所選變異體中鑑定之N52H、N52Y、N57Y、Q100R、Q100P、F138L、C198R、L203P之特定例示性突變在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之位置的參考(例如野生型)ICOSL之ECD中進一步組合以產生額外組合變異體。產生之變異體含有1至3個呈如表27B中所闡述之各種組合的不同胺基酸突變。
3. 糖基化變異體
選自N52H、N52Q、N84Q、N119Q、N155H、N155Q、N168Q、N207Q之例示性糖基化突變在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之位置的參考(例如野生型)ICOSL之ECD中以各種排列組合以產生額外組合變異體。產生之變異體含有1至5個呈如表27C中所闡述之各種組合的不同胺基酸突變。指定為「X」之突變指示所指示位置處之N或Q。
B. 與細胞表現之反結構的結合
額外變異體係如實例4中所述地型式化為Fc-融合蛋白。在結合研究中評估變異型Fc-融合分子以評估ICOSL域變異型免疫調節蛋白針對同源結合配位體之特異性及親和力。經同源結合配位體人類CD28、ICOS及CTLA4轉染之Expi293細胞如實例6中所述地用於結合研究。MFI係針對各轉染子測定且相比於對應未經修飾的(親本)ECD-Fc。
例示性變異型ICOSL ECD-Fc融合分子之結合結果顯示於表28A-C中。如表28A-C中所示，藉由特定突變之各種組合產生之ICOSL IgSF (例如ECD)域針對至少一種，且在一些情況下超過一種同源反結構配位體展現增加之結合。
C. 經由抗CD3共固定化分析之生物活性表徵
亦如實例6中所述地在抗CD3共固定化分析中評估產生之變異型Fc-融合分子之協同刺激生物活性。表28A-C描繪相比於分析中之對應未經修飾的(野生型)ICOSL ECD-Fc，由各變異型ECD-Fc產生之IFN-γ之比。以「X」指定之突變指示所指示位置處對應於SEQ ID NO: 32之所指示位置之Q或野生型殘基。如所示，產生之變異型Fc-融合分子展現改良之活性以提高免疫活性。




實例21產生及評估具有 HER2 靶向 抗體之融合分子
此實例描述產生及評估與腫瘤靶向劑結合以形成結合物(「vIgD結合物」)之變異型ICOSL ECD-Fc融合分子。
ICOSL vIgD (N52H/N57Y/Q100P；SEQ ID NO: 201中所闡述)僅V域藉由中間GGGSGGGS連接子融合至HER2靶向抗體之輕鏈(圖 10A )及重鏈(圖 10B )之胺基及羧基末端。vIgD結合物之例示性組態顯示於圖 10C 中。
為了評估HER2結合，HER2 DNA或模擬Expi293轉染體用滴定量的含有變異型ICOSL結合物(vIgD N52H/N57Y/Q100P結合物)之HER2靶向抗體以100 pM至100 nM之濃度染色。亦測試對照蛋白質，包括野生型ICOSL ECD-Fc融合物、野生型PD-L2 IgV-Fc融合物及在N52H/N57Y/Q100P處具有突變之變異型ICOSL ECD-Fc融合分子。如實例6中所述地對於各轉染子測定平均螢光強度(MFI)或陽性細胞%。相比於Expi293細胞中觀測之內源性水準之HER2表現，如圖 11A - 11B 中所示產生之所有IgSF結合物保留與HER2之結合。類似地，vIgD結合物亦顯示與ICOSL之同源結合配位體(包括CD28、CTLA-4及ICOS)之結合。
亦如實例6中所述地表徵人類初生T細胞活體外分析之蛋白質生物活性及增殖。vIgD結合物在10 nM抗CD3存在下以30-0.1 nM結合至96孔盤隔夜。盤經洗滌且將100,000個CFSE標記之泛T細胞添加至盤且培育72小時。藉由ELISA分析上清液中之IFNγ水準。如圖 12 中所示，相比於親本野生型ICOSL ECD-Fc融合分子結合物，具有指定組態之vIgD結合物顯示較大IFNγ分泌及增殖。
實例22初生人類 T 細胞之 Nanostring 轉錄簽名
組織培養盤塗佈有10 nM抗CD3與40 nM Fc-對照蛋白質、野生型ICOSL-Fc、野生型CD80-Fc、此兩種蛋白質或具有如所指示之突變的變異型ICOSL Fc-融合蛋白。純化之人類T細胞接著平鋪於蛋白質塗佈盤上且在37℃下培育。來自上文所述之各治療組之培養物在24、48及72小時處收穫且由各細胞樣品製備總RNA。RNA轉移至Nanostring且癌症免疫晶片用於定量各樣品中之750個基因的轉錄物。轉錄值係使用Nanostring之專用軟體標準化，該軟體允許比較治療組之間及各種時間點之轉錄水準。如圖 18 及圖 19 中所示，相比於野生型CD80 ECD-Fc、野生型ICOSL ECD-Fc或兩者之組合，測試之變異型ICOSL ECD-Fc多肽顯示改變的發炎活性。
實例23產生及評估具有 HER2 靶向 抗體之融合分子
亦表徵與表現VmAb及HER2之靶細胞共培養之人類T細胞的增殖。經CFSE標記之泛T細胞在VmAb或對照蛋白質存在下經顯示細胞表面抗CD3單鏈Fv (OKT3)及HER2之K562衍生之人工靶細胞刺激72小時。增殖係藉由對CD4+ 或CD8+ 染色T細胞之CFSE-稀釋之流式細胞分析來量測。改變靶細胞數目或所用VmAb之濃度來分析Vmab。在第一分析中，K562靶細胞以2500至78個細胞/孔滴定且添加至100,000個T細胞以達到40至1280:1之效應細胞:靶細胞(E:T)範圍。VmAb、親本IgSF域或WT ICOSL係以1000 pM添加。在第二分析中，K562靶細胞以625個細胞/孔添加至100,000個T細胞以達到160:1之效應細胞:靶細胞。VmAb或對照蛋白質經滴定且以3000至37 pM添加。如圖20A 及20B 中所示，分析之兩種組態展示含有vIgD結合物之VmAb相比於親本抗體、親本IgSF域或WT ICOSL提供優良增殖。另外，vIgD結合物在低E:T比(1280:1)下或在低蛋白質濃度(37 pM)下介導增殖。
實例24產生及評估表現跨膜免疫調節蛋白及 T 細胞受體 之工程改造細胞
此實例描述在人類T細胞中藉由例示性重組E6特異性T細胞受體(TCR)表現各種含變異型ICOSL IgSF域之跨膜免疫調節蛋白(TIP)及T細胞增殖評估。
人類HLA-A2+ T細胞在第0天用抗CD3/抗CD28活化珠粒(ThermoFisher Scientific, USA)活化且在第1天用對HPV E6具特異性之TCR (WO 2015/009606中所述)及各種含有變異型ICOSL IgSF域之跨膜免疫調節蛋白(TIP)轉導。例示性ICOSL-TIP具有親和力經修飾之IgSF域，其含有參看SEQ ID NO: 32中所闡述之ICOSL細胞外域中之位置對應於E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R或N52H/N57Y/Q100R之胺基酸突變。ICOSL TIP亦包括對應於SEQ ID NO: 5之殘基257-302之跨膜域及細胞質域。為進行比較，T細胞亦與HPV E6 TCR及WT CD80-TIP (闡述為SEQ ID NO: 1之胺基酸35-288且由SEQ ID NO: 251中所闡述之核苷酸序列編碼)或WT ICOSL-TIP (闡述為SEQ ID NO: 5之胺基酸19-302且由SEQ ID NO: 252中所闡述之核苷酸序列編碼)共轉導。為進行轉導，細胞經病毒載體構築體轉導，該病毒載體構築體中插入有編碼TIP及TCRα及TCRβ鏈序列之聚核苷酸，各藉由編碼P2A核糖體跳躍序列之序列(SEQ ID NO: 863)彼此分隔，以在工程改造細胞中共表現TIP及含有TCRα及TCRβ鏈之TCR。特定言之，核酸構築體具有以下結構：ICOSL-P2A1-TCRβ-P2A2-TCRα，其中核苷酸序列P2A1及P2A2各編碼SEQ ID NO: 863中所闡述之P2A，但核苷酸序列不同以避免序列之間的重組。
作為對照，T細胞經模擬轉導或僅經例示性E6 TCR轉導。
T細胞活化珠粒在第3天移除且細胞介素IL-2、IL-7及IL-15係添加至培養物。在轉導後第6天，TIP及TCR之細胞表面表現係藉由流動式細胞測量術評估，其中35-65%之工程改造細胞對於TCR及TIP呈雙陽性。TCR表現細胞在HPV E6肽存在下擴增以產生對TCR/TIP呈＞90%雙陽性之細胞群體(如在第14天評估)。在第14天，工程改造細胞與HPV感染細胞鱗狀細胞癌細胞株UPCI:SCC152 (ATCC® CRL-3240™；HPV+、HLA-A2+)、表皮樣癌CaSki細胞(ATCC®編號CRL-1550™；HPV+、HLA-A2+)或鱗狀細胞癌SiHa細胞(ATCC® HTB-35™；HPV+、HLA-A2-)一起培育。工程改造細胞之增殖係在與靶細胞之共培養起始之後第3天評估。如圖 21 中所示，在兩個HPV+細胞株中觀測到經E6 TCR工程改造之T細胞增加之增殖，但在HPV-SiHa株中不顯著。共表現變異型ICOSL TIPS之工程改造細胞回應於HLA-A2+HPV+標靶SCC152及Caski細胞株具有增加之增殖。
實例25Fc- 融合體免疫調節蛋白之產生及評估
含變異型ICOSL IgSF (例如ECD)域之分子基本上如實例4中所述地型式化為Fc-融合蛋白，除了使用各種連接子及Fc分子。為了產生為含有具有至少一個親和力經修飾之域之ICOSL之ECD之Fc融合蛋白(例如變異型ICOSL ECD-Fc)的免疫調節蛋白，產生編碼核酸分子以編碼如下設計之蛋白質：直接地或經由連接子間接地連接至惰性人類IgG1 Fc之變異型(突變型)ECD。特定言之，產生之免疫調節蛋白不含有連接子(無)或含有AAA或G4S (SEQ ID NO: 636)連接子。惰性人類IgG1 Fc含有根據EU編號如下之突變：C220S/R292C/N297G/V302C (SEQ ID NO: 476)、C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (SEQ ID NO: 478)、C220S/L234A/L235E/G237A (SEQ ID NO: 477)或其異型。包括置換C220S因為所得蛋白質不包括可與半胱胺酸形成共價鍵之抗體輕鏈。重組變異型Fc融合蛋白基本上如實例5中所述地在293細胞中產生且藉由蛋白A純化。
在結合研究中評估變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白以評估與同源結合配位體之結合。經同源結合配位體人類CD28、ICOS及CTLA4轉染之Expi293細胞係如實例6中所述地用作結合研究中之靶細胞。變異型ICOSL Fc融合免疫調節蛋白與表現各結合配位體之靶細胞之結合的MFI經測定且相比於對應未經修飾的(野生型)ICOSL ECD-Fc與相同靶細胞之結合。亦基本上如實例6中所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)測定藉由變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白之T細胞活性調節。
含有各種連接子及Fc區之例示性變異型ICOSL ECD-Fc融合免疫調節蛋白之結合結果顯示於表29中。表指示變異型ICOSL之ECD中之胺基酸取代，如藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL細胞外域(ECD)序列胺基酸位置的胺基酸位置編號指示。第1欄亦闡述變異型ICOSL Fc融合物中所包含之各變異型ECD域之SEQ ID NO標識符。第2欄指示用於Fc融合蛋白之連接子及連接子之SEQ ID NO標識符。第3欄闡述根據EU編號之Fc中之突變及變異型ICOSLFc融合蛋白中包含之Fc之SEQ ID NO標識符。
如表29中所示，在測試之變異型ICOSL Fc融合蛋白中針對結合至同源結合配位體觀測到類似結果。此等結果指示具有不同Fc分子或不同連接子之Fc融合物之型式不影響ICOSL IgSF域變異體與其同源結合配位體之結合。另外，相比於不含胺基酸取代之參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fc分子，所有Fc融合物型式當提供為MLR反應中溶液中之二價Fc分子時展現拮抗活性以減少T細胞活化。在一些情況下，未在上清液中量測到可偵測IFN-γ，與完全阻斷協同刺激配位體同源結合配位體與其配位體之相互作用以誘導IFN-γ分泌一致。
實例26 變異型ICOSL分子在CHO細胞中之表現
作為如實例5中所述地在Expi293細胞中表現變異型ICOSL Fc融合蛋白之替代方案，懸浮中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO-S)用於產生各種ICOSL分子。DNA構築體用於轉染細胞，該構築體編碼藉由GSGGGGS連接子(SEQ ID NO: 635)連接至含有SEQ ID NO: 477中所闡述之根據EU編號之突變C220S/L234A/L235E/G237A之惰性Fc或SEQ ID NO: 637中所闡述之其異型的含有變異型(突變型)ECD N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO: 291)之例示性變異型ICOSL IgSF (例如ECD)Fc融合蛋白。
ExpiCHO-S細胞，及使用ExpiCHO™表現系統進行轉染之試劑購自ThermoFisher Scientific (目錄號A29133)。細胞係根據製造商之推薦方案解凍及擴增。在至少2次繼代之後，細胞在轉染前分裂24小時且使其擴增至高密度。細胞接著稀釋至用於轉染之細胞數目，用ExpiFectamine™ CHO試劑形成DNA複合物且添加至細胞。在DNA複合物添加之後的一天，ExpiCHO™進料及ExpiFectamine™ CHO增強劑係添加至培養物，其接著置於32℃恆溫箱中。監測細胞活力及細胞質量且在活力降至低於80%時收穫培養物。培養物接著在低速下離心以移除細胞團塊，且清除之上清液經0.2 μm無菌過濾。如實例5中所述地純化蛋白質。
A.蛋白質分析
純化之變異型ICOSLFc融合蛋白在SDS-PAGE上運行且藉由蛋白質染色分析。在產生自CHO細胞之細胞中觀測到多重帶，但未自293細胞觀測到，其與當表現於CHO細胞中時發生ICOSL之蛋白質水解性削減之觀測結果一致。表30A描繪完整、單削減及雙削減蛋白質之分子量，其基於如藉由SDS-PAGE觀測之胺基酸序列及潛在碳水化合物計算。觀測到ExpiCHO-S衍生之細胞中表現之ICOSL Fc-融合蛋白之蛋白質水解，如由存在具有較低分子量之減少/非減少削減物種(單削減及雙削減)指示。基於觀測帶之尺寸及質譜分析，此等結果與對應於序列LQQN/LT (「/」指示潛在裂解位點)之ICOSL ECD中之潛在裂解位點一致，進而導致ECD之莖區之前的裂解及Fc融合蛋白之一條或兩條鏈中之序列之Fc部分的移除。觀測之蛋白酶裂解可在產生於CHO細胞中時產生異源蛋白質產物。另外，對於表現為跨膜免疫調節蛋白之型式，發生於某些細胞中之蛋白酶裂解可導致可溶性蛋白質自細胞釋放，進而減少工程改造細胞上細胞表面表現形式之變異蛋白質。
實例27產生含 ICOSL IgSF 域之分子之蛋白質水解抗性變異體
為了使得變異型ICOSL多肽在表現於細胞，諸如CHO細胞中時對蛋白質水解具抗性，產生各種額外形式之變異型ICOSL多肽。產生ICOSL ECD的以下額外經修飾之參考序列：(1)不具有LQQN/LT蛋白酶裂解位點之全部或一部分的各種ECD截短(稱為Trunc #4、#5、#6、#7或#8)；(2)在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之位置之裂解位點N207及/或L208處含有突變之ICOSL變異型參考序列；或含有IgV域作為分子之唯一IgSF域的僅ICOSL之IgV參考序列(SEQ ID NO: 545中所闡述，對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸1-122)。在一些情況下，在ICOSL ECD參考序列中採用以上策略之組合。下表30B闡述各種產生之參考序列。
參看SEQ ID NO: 32中所闡述之編號的例示性突變N52H/N57Y/Q100R/F172S引入至各種參考序列中。由於SEQ ID NO: 545中所闡述之參考ICOSL IgV不含對應於F172S之位置，變異型ICOSL IgV不含突變F172S。產生之變異型ICOSL多肽型式化為Fc融合蛋白，其含有經由(G4 S)2連接子(SEQ ID NO: 229)連接至惰性Fc的產生之參考ICOSL IgSF域，該惰性Fc含有根據SEQ ID NO: 633中所闡述之EU編號的突變C220S/L234A/L235E/G237A/K447del，或SEQ ID NO: 637中所闡述之其異型。
A. 蛋白質水解評估
編碼上文所述之變異型ICOSL Fc-融合分子之DNA構築體經轉染至中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO-S)中。ICOSL Fc-融合蛋白接著如實例5中所述地藉由親和性層析法用蛋白A自上清液純化。純化之蛋白質係藉由分析型SEC分析。
根據SEC，完整蛋白質顯示為單峰，而經削減之蛋白質顯示為多個峰，包括低分子量物質。與實例26中所述之SDS-PAGE結果一致，在變異型ICOSL ECD Fc-融合蛋白表現於ExpiCHO-S衍生之細胞中時觀測到如藉由SEC評估之蛋白質水解，如由顯示於圖 22A 中之多個峰指示。如圖 22B - 22G 中所示，藉由使用經修飾之參考ICOSL多肽(其中假定ECD蛋白酶裂解位點經移除或突變)產生之變異型ICOSL Fc融合蛋白之SEC分析觀測到單峰，指示出現減少的蛋白質裂解。然而，在一個純化批次中，藉由使用SEQ ID NO: 604 (Trunc. #5)中所闡述之參考ICOSL多肽產生之變異型ICOSLFc融合蛋白之SEC分析觀測到低分子量物質，儘管不清楚這一批中存在此等物質之原因。如圖 22G 中所示，僅使用ICOSL IgV之參考序列產生之變異型ICOSL Fc-融合蛋白之SEC分析亦未觀測到低分子量物質之產生，及因此未觀測到蛋白質水解。
B. 結合及活性
比較蛋白質之結合及活性，該蛋白質在CHO細胞中轉染編碼上文所述之各種參考序列之變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白的DNA構築體之後產生及純化。在一些情況下，隨後發現如下評估之純化純系含有超出上文所述之突變的額外突變，咸信其不影響測試蛋白質之免疫調節活性。
基本上如上文所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)評估所得純化之變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白與同源結合配位體之結合及T細胞活性之調節。表30C指示如藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL細胞外域(ECD)序列中之胺基酸位置的胺基酸位置編號指定之ICOSL參考序列中之胺基酸取代，且闡述各ICOSL參考序列之SEQ ID NO標識符。如所示，所有測試型式之結合及MLR拮抗劑活性總體上類似。
C. 表現於293 (Expi293)或CHO細胞中之蛋白質的結合及活性
在表現於293 (Expi293)或CHO細胞中之後評估基於上文所述之ICOSL參考序列產生之變異型ICOSL Fc融合蛋白的結合及活性。另外，如表30D中所闡述之例示性ICOSL參考序列中之編碼例示性IgSF域ICOSL變異體N52H/N57Y/Q100R/C198R或N52H/Q100R之DNA構築體亦連接至根據SEQ ID NO: 477中所闡述之EU編號含有突變C220S/L234A/L235E/G237A之惰性Fc，且在藉由DNA構築體轉染293或CHO細胞之後產生及純化。另外，例示性變異型免疫調節蛋白產生為單體，其中細胞經編碼變異型ICOSL ECD參考序列中之變異體的DNA構築體轉染，但不與Fc序列融合。
基本上如上文所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)評估所得純化之變異型ICOSL Fc-融合蛋白或變異型ICOSL單體與同源結合配位體之結合及T細胞活性之調節。表30D指示如藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL細胞外域(ECD)序列中之胺基酸位置的胺基酸位置編號指定之變異型ICOSL之參考序列中之胺基酸取代，且闡述各參考ICOSL序列之SEQ ID NO標識符。第3欄指示用於產生ICOSL蛋白質之細胞類型(ExpiCHO-S或Expi293)。如表30D中所示，結果指示基本上類似之結合及活性，無論變異型ICOSL免疫調節蛋白產生於CHO或293細胞中。
實例28產生 ICOSL IgSF 域變異體之 NNK 變異體文庫及評估結合及活性
產生額外含變異型ICOSL IgSF域之分子，其在參看SEQ ID NO: 32中所闡述之位置的位置52、57及100處具有突變。變異體產生之NNK文庫，其中K=T或G，使得編碼密碼子編碼所有潛在胺基酸，但阻止編碼兩個停止殘基TAA及TGA。基本上如實例2中所述地將NNK文庫DNA引入至酵母菌中以產生酵母菌文庫。文庫用於基本上如實例3中所述地選擇表現親和力經修飾之ICOSL變異體的酵母菌。
所選含變異型ICOSL IgSF域之分子基本上如實例4中所述地另外型式化為Fc-融合蛋白，除了含有經由GSGGGGS連接子 (SEQ ID NO: 635)連接至惰性Fc之產生之ICOSL IgSF域，該惰性Fc含有根據SEQ ID NO: 633中所闡述之EU編號之突變C220S/L234A/L235E/G237A/K447del，或SEQ ID NO: 637中所闡述之其異型。
在結合研究中評估變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白以評估與同源結合配位體之結合。經同源結合配位體人類CD28、ICOS及CTLA4轉染之Expi293細胞用作如實例6中所述之結合研究中之靶細胞。100 nM變異型ICOSL Fc融合免疫調節蛋白與表現各結合配位體之靶細胞之結合的MFI經測定且與對應參考(例如未經修飾的或野生型)ICOSL IgV-Fc與相同靶細胞之結合比較。亦如實例6中所述地在抗CD3 (10 mM)共固定化分析中評估產生之ICOSL變異型Fc-融合分子之協同刺激生物活性。亦基本上如實例6中所述地使用混合淋巴細胞反應(MLR)以1 nM ICOSL-Fc測定藉由變異型ICOSL Fc-融合免疫調節蛋白之T細胞活性調節。測定自一式三份孔之IFN-γ分泌。
例示性變異型ICOSL IgV-Fc融合分子基於MLR分析中之協同刺激生物活性或活性之結合及功能活性的結果顯示於表31中。下表指示變異型ICOSL中之胺基酸取代，其如藉由對應於SEQ ID NO: 32中闡述之各別參考(例如未經修飾的)ICOSL細胞外域(ECD)序列中之胺基酸位置的胺基酸位置編號指示。第2欄闡述變異型IgV-Fc融合分子中包含之各變異型IgV域之SEQ ID NO標識符。如所示，以位置52、57及100處之特定突變之各種組合產生之ICOSL IgSF (例如IgV)域變異體對於至少一種，且在一些情況下超過一種同源結合配位體展現改變之結合。表之最後兩欄亦描繪變異型Fc-融合分子基於i)藉由與抗CD3共固定化之指定變異型IgV-Fc融合可溶分子或ii)藉由MLR分析中之指定變異型IgV-Fc融合分子產生的培養上清液中之IFN-γ之計算水準(pg/mL)調節T細胞活性之功能活性。表亦描繪在兩個功能分析中相比於對應參考(例如未經修飾的或野生型)ECD-Fc的由各變異型ECD-Fc產生之IFN-γ之比。變異型Fc-融合蛋白亦展現改變之免疫活性。一些變異型分子之協同刺激信號傳導相比於野生型ICOSL基本上更大。某些變異體展現IFN-γ之大幅抑制，其中在MLR分析中培養物中產生之IFN-γ極低至不可偵測。
實例29評估表現跨膜免疫調節蛋白 ( TIP ) 之 K562 細胞
K562細胞經工程改造以表現跨膜免疫調節蛋白(TIP)，其含有融合至SEQ ID NO: 5中所闡述之WT人類ICOSL之天然跨膜域及細胞內域的vIgD ICOSL域之ECD。例示性變異型ICOSL-TIP具有親和力經修飾之IgSF域，其含有參看SEQ ID NO: 32中所闡述之ICOSL細胞外域中之位置對應於N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288)、N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283)或E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 300)之胺基酸突變。
K562細胞(ATCC)經CFSE標記以在共培養分析中更好地與T細胞區分。純化之初生人類T細胞經Cell Trace Far Red (均獲自Thermo-Fisher)標記且與抗CD3抗體共平鋪於96孔圓底組織培養盤中。為了向T細胞提供TCR信號，抗CD3抗體在一定濃度範圍內以可溶型式包括，該濃度範圍允許此刺激抗體經由經細胞表現之Fc-受體CD32的K562呈現。細胞經培育72小時且CD4+ (圖 23A )及CD8+ (圖 23B )之增殖經監測且報導為相對於抗CD3濃度之分裂細胞的%。各點表示一式三份孔之平均值，且誤差條顯示標準差。
野生型K562細胞當與可溶抗CD3抗體共培育時刺激T細胞以劑量依賴型方式增殖，而K562細胞在不存在抗CD3的情況下並非如此。如圖 23A 及 23B 中所示，WT ICOSL TIP於表面上之表現增強反應，但在K562細胞表現變異型ICOSL TIP時效應更大，指示表現於細胞表面上之此等分子對於T細胞提供優良協同刺激。
實例30評估融合分子與 HER2 靶向 抗體之結合及協同刺激功能
含有突變N52H/N57Y/Q100R之例示性變異型ICOSL ECD融合至例示性抗HER2抗體曲妥珠單抗之重鏈或輕鏈之N端或C端，如以圖 24A - 24F 中顯示之各種組態所描繪。圖解於圖 24A - 24F 中的編碼構築體中之每一者的VmAb DNA經轉染至HEK-293細胞中且分泌蛋白係藉由蛋白A及尺寸排阻層析純化。隨後評估所得V-mAb蛋白質之適當結合特性保留。HEK-293細胞經HER2、CD28或ICOS表現載體瞬時轉染且各轉染子接著與個別V-mAb蛋白質加上二級抗體一起培育以偵測結合試劑。如圖 24A 中所示，所有V-mAb保留HER2結合，但結合量值略微減小。此外，V-mAb與CD28轉染細胞之結合在很大程度上完整，儘管一些形式顯示某一結合減少(圖 24A )。此資料指示融合至抗體重鏈及/或輕鏈以形成融合蛋白之ICOSL變異體在很大程度上保留反結構及抗體結合活性。
為了測試VmAb是否可驅動T細胞之靶特異性協同刺激，使用轉染細胞系統，其包括用於量測協同刺激之T細胞報告子株。具有IL-2啟動子螢光素酶報告子之Jurkat細胞用於評估協同刺激功能。為了刺激細胞，K562細胞經工程改造以用作人工抗原呈遞細胞。特定言之，K562細胞經編碼抗CD3抗體OKT3之單鏈Fv型式之慢病毒轉導，伴以或不伴以經指導HER2表現之獨立慢病毒的轉導。呈現具有或不具有表面HER2表現之細胞表面抗CD3單鏈Fv (OKT3)的K562細胞以2×104 個細胞/孔平鋪於Jurkat分析緩衝液(RPMI1640+5% FBS)中。靶細胞與滴定自20,000 pM至6 pM之V-mAb或對照蛋白質一起在室溫下培育20分鐘。表現IL-2螢光素酶報導基因之Jurkat效應細胞(Promega)以1×105 個細胞/孔添加以使每孔之最終體積達到100 μl。靶細胞及Jurkat細胞在37℃下培育5小時。盤自恆溫箱移出且適應室溫15分鐘。將100 µL細胞溶解及螢光素酶受質溶液(BioGlo螢光素酶試劑，Promega)添加至各孔且盤在定軌震盪器上培育10分鐘。使用Cytation 3成像讀取器(BioTek Instruments)以1秒/孔積分時間量測發光。針對各測試樣品測定相對發光值(RLU)且報導。
如圖 24B 中所示，包含天然曲妥珠單抗對螢光素酶誘導無影響。類似地，包括變異型ICOSL-Fc蛋白質N52H/N57Y/Q100R (不融合至曲妥珠單抗)並不影響反應(圖 24B )。然而，包括多個V-mAb在HER2+ K562/OKT3細胞存在下提供顯著共刺激信號，其比不具有HER2表現之K562/OKT3穩定得多(圖 24C - 24F )。在一些情況下，信號誘導於不具有HER2之K562/OKT3細胞中，但此最可能歸因於V-mAb之Fc域允許CD32介導之V-mAb呈遞。結果指示變異型ICOSL多肽與抗體之融合可用於遞送局部T細胞共刺激信號。
實例31產生含有 ICOSL 及 NKp30 親和力經修飾之域的堆疊分子
此實例描述自上文所述之經鑑別變異型ICOSL多肽及經鑑別變異型NKp30多肽產生為含有親和力經修飾之IgV域之多域堆疊構築體的免疫調節蛋白。特定言之，例示性變異型ICOSL IgV (SEQ ID NO: 548中所闡述之N52D；SEQ ID NO: 567中所闡述之N52H/Q100R；SEQ ID NO: 565中所闡述之N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO: 761中所闡述之N52L/N57H/Q100R)，及例示性變異型NKp30 IgV分子L30V/A60V/S64P/S86G (SEQ ID NO: 504)以各種組態連接在一起且融合至惰性Fc (含有人類IgG1 Fc中之突變L234A、L235E及L235E，例如SEQ ID NO: 637中所闡述)。產生含有相同Fc次單位之均二聚堆疊構築體，其中變異型ICOSL IgV及變異型NKp30 IgV經由GSGGGS (SEQ ID NO: 635)及/或3× GGGGS (SEQ ID NO: 228)肽連接子不同地連接至Fc區之N端或C端。其他連接子及Fc區亦適合於產生堆疊分子。例示性的產生之堆疊闡述於下文。
編碼免疫調節蛋白之核酸分子亦含有編碼例示性信號肽MGSTAILALLLAVLQGVSA (SEQ ID NO: 225中所闡述)之殘基。編碼所關注之Fc融合蛋白之表達構建體使用製造商之商業Expifectamine試劑及培養基暫時表現於獲自Invitrogen之Expi293 HEK293細胞中。收穫上清液且蛋白質經捕獲且使用AKTA蛋白質純化系統自蛋白A管柱溶離。
編碼核酸分子經設計以按表32中顯示之次序產生呈各種序列組態之均二聚堆疊。
實例32評估與細胞表現之反結構之結合及含 ICOSL 及 NKp30 域之堆疊分子之生物活性
此實例描述結合研究以顯示實例31中產生之例示性ICOSL/NKp30堆疊免疫調節蛋白針對同源結合配位體之特異性及親和力。亦在人類初生T細胞活體外分析中評估實例31中產生之例示性ICOSL/NKp30堆疊免疫調節蛋白以用於生物活性表徵。
A. 與細胞表現之反結構之結合
對具有同源結合配位體之穩定或瞬時細胞表面表現之細胞進行ICOSL/NKp30堆疊結合研究，該等同源結合配位體對ICOSL域變異型免疫調節蛋白或NKp30-Fc具有特異性。
為了評估與變異型ICOSL域之結合配位體之結合，使用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，其經慢病毒轉導以表面表現全長人類CD28、CTLA-4或ICOS。
為了產生表現NKp30之同源結合配位體之細胞，含有人類B7-H6之全長哺乳動物表面表現構築體選殖至pcDNA3.1表現載體(Life Technologies)中。使用Expi293F瞬時轉染系統(Life Technologies, USA)進行結合研究。簡言之，對於30 mL轉染，大致7500萬個Expi293F細胞與30 μg表現構築體DNA及1.5 mL稀ExpiFectamine 293試劑一起培育48小時，此時收穫細胞用於染色。
關於流式細胞分析，給定穩定細胞株、瞬時轉染或適當陰性對照之200,000個細胞平鋪於96孔圓底盤中。細胞經快速離心且懸浮於染色緩衝液(PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)、1% BSA (牛血清白蛋白)及0.1%疊氮化鈉)中20分鐘以阻斷非特異性結合。隨後，細胞再次離心且懸浮於50 μL含有100 nM至32 pM之ICOSL/NKp30堆疊或對照蛋白質之染色緩衝液中。進行初級染色45分鐘，隨後在染色緩衝液中洗滌細胞兩次。結合蛋白質係藉由在50 μL染色緩衝液中以1:150稀釋之PE結合之抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch, USA)偵測且培育30分鐘。在最終培育之後，細胞洗滌兩次以移除非結合之結合抗體，固定於2%甲醛/PBS中，且在LSRII (Becton Dickinson, USA)流式細胞儀上分析。藉由FlowJo版本10軟體(FlowJo LLC, USA)對於各樣品計算平均螢光強度(MFI)。
對於所有ICOSL-NKp30 Fc融合蛋白或對照評估如藉由MFI所量測之結合活性。如圖 25A - 25D 中所示，例示性堆疊蛋白質以高親和力結合ICOSL及NKp30之同源蛋白質。
B. 評估含親和力成熟IgSF域之分子的生物活性
可溶ICOSL/NKp30堆疊蛋白質生物活性在用於在初生人類T細胞中誘導細胞介素產生的與B7-H6+細胞之共培養物中測試。內源性表現B7-H6之K562細胞經慢病毒轉導以表現產生K562/OTK3標靶之細胞表面抗人類CD3單鏈Fv (OKT3)。人類初生T細胞在200 μL最終體積之Ex-Vivo 15培養基中與滴定自100 nM至49 pM之ICOSL/Nkp30堆疊或對照蛋白質以2.5或10:1之效應細胞:靶細胞(E:T)比共培養。在第3-5天，分析終止且使用IL-2及TNF-α ELISA MAX套組(Biolegend, USA)關於IL-2或TNF-α測試培養上清液。光學密度量測於BioTek Cytation Multimode Microplate Reader (BioTek Corp., USA)上且相對於ELISA套組中包括之滴定rIL-2及rTNF-α標準品定量。
例示性測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質之生物活性研究結果顯示於圖 26A 及 26B 中，其闡述培養上清液中之IL-2或TNF-α的計算水準(pg/mL)。此分析中在例示性ICOSL/NKp30堆疊蛋白質存在下之培育導致初生人類T細胞中增加水準之B7-H6依賴性細胞介素誘導。
例示性測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質之生物活性研究結果顯示於圖 26A 及 26B 中，其闡述培養上清液中之IL-2或IFN-γ的計算水準(pg/mL)。各堆疊蛋白質之序列標識符(SEQ ID NO)闡述於圖 26A 及 26B 中。此分析中在例示性ICOSL/NKp30堆疊蛋白質存在下之培育導致初生人類T細胞中增加水準之B7-H6依賴性細胞介素誘導，其藉由相比於僅親本ICOSL或NKp30之蛋白質，ICOSL/NKp30堆疊之細胞介素產生增加來展示。
C. 評估增殖
亦表徵與ICOSL/NKp30堆疊蛋白質及B7-H6+細胞共培養之人類T細胞的增殖。CFSE標記之人類初生T細胞在ICOSL/NKp30堆疊蛋白質或對照蛋白質存在下以2.5至10:1之E:T比經K562/OKT3刺激3-5天。例示性ICOSL/NKp30堆疊蛋白質在200 μL最終體積之Ex-Vivo 15培養基中滴定自100 nM至49 pM。增殖藉由使用如上文所述之LSRII流式細胞儀及Flowjo軟體對CD4+或CD8+染色T細胞進行CFSE-稀釋之流式細胞分析來量測。
如圖27 中所示，例示性測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質以B7H6依賴性方式共刺激初生人類CD4+ T細胞之增殖，藉由相比於僅親本ICOSL或NKp30之蛋白質，ICOSL/NKp30堆疊之增殖增加來展示。
實例33評估腫瘤模型中呈組合形式之含 ICOSL 及 NKp30 域之堆疊分子及抗 PD - 1 抗體
此實例描述如實例31中所述產生之例示性ICOSL/NKp30堆疊蛋白質之抗腫瘤活性的評估，單獨或與攜帶B7-H6+ CT26結腸癌細胞之小鼠中之抗小鼠PD-1單株抗體(mPD-1 mAb)組合評估。
向小鼠皮下植入大致0.3×105 個B7-H6+ CT26腫瘤細胞。腫瘤生長至第13天且小鼠經分期且量測平均腫瘤體積(80至120 mm3 )。在腫瘤細胞植入後第6天開始用電子測徑規二維地量測腫瘤。量測腫瘤體積，且測定中值腫瘤體積。自分析排除具有最小起始腫瘤(約75 mm3 )之每組三隻小鼠。
如圖 28 中所示，相比於用Fc對照(單獨的ICOSL或NKp30、單獨的ICOSL/NKp30堆疊或單獨的抗小鼠PD-1 mAb)治療之組，測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質及mPD-1 mAb之組合隨時間推移顯著降低腫瘤生長(中值腫瘤體積)。未觀測到任何具有親本CT26 (B7-H6陰性)腫瘤之治療組的過度生長差異。如圖 28 中所示之組合之抗腫瘤活性與測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質及抗PD-1抗體之組合比單獨的個別試劑更好之發現一致。
實例34在 CIA 模型中評估 ICOSL IgV - Fc 融合分子之給藥及活體內效應
在具有預防性或治療劑給藥之膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)模型中評估變異型ICOSL IgV-Fc融合分子之消炎活性。變異型ICOSL IgV-Fc融合分子在疾病發作之前或恰好在疾病發作之後給藥最多4次。測試之變異型ICOSL IgV-Fc融合分子含有融合至惰性Fc (含有人類IgG1 Fc中之突變L234A、L235E及L235E，例如SEQ ID NO: 637中所闡述)之變異型ICOSL IgV，該變異型ICOSL IgV具有如SEQ ID NO: 570中所闡述之N52H/N57Y/Q100P或如SEQ ID NO: 565中所闡述之N52H/N57Y/Q100R。
為了誘導關節發炎，小鼠在第18或21天在尾部注射雞或牛膠原蛋白II/CFA乳液且在第0天注射雞或牛膠原蛋白II/IFA乳液(『加打(boost)』)。關於預防性給藥，給與小鼠投加具有四個劑量之變異型ICOSL IgV-Fc融合分子(N52H/N57Y/Q100P)，在疾病發病之前的加打當天開始。關於治療劑/延遲治療，給與小鼠變異型ICOSL IgV-Fc融合分子(N52H/N57Y/Q100R)，在觀測之爪評分大於一時開始，且給藥每兩天發生，持續總共四個劑量。作為對照，亦測試僅Fc之分子及CTLA-4-Fc (阿巴西普)分子。測定基於發紅或腫脹之爪評分。亦收集血清以量測抗膠原蛋白(CII IgG)抗體及IL-6及TNFα促炎性細胞介素。來自引流淋巴結之細胞經收集，針對CD4、CD8、CD44或T濾泡輔助(TFH )細胞之標記物(CD25-CD4+PD-1+CXCR5+)染色。圖 29A - 29D 顯示預防性給藥之結果。預防性給藥治療中用變異型ICOSL IgV-Fc融合分子治療之小鼠在類風濕性關節炎之CIA小鼠模型中顯示經抑制之疾病，如藉由較低總爪評分(圖 29A )及減少之所偵測CII IgG (圖 29B )所示。*p＜0.05，針對ICOSL IgV-Fc相對於阿巴西普，**p＜0.001，針對ICOSL IgV-Fc相對於PBS (根據雙因素重複量測變異數分析)。亦相比於Fc對照在用變異型ICOSL IgV-Fc融合分子治療之小鼠中觀測到較低水準之血清細胞介素(圖 29C )及CD44+活化T細胞或TFH 細胞(圖 29D )；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001 (根據單因素變異數分析)。引流淋巴結中之B細胞分率亦在ICOSL IgV-Fc治療組相對於Fc對照組中顯著減少(p＜0.05)(圖 29E )。
圖 30A - 30D 顯示延遲給藥之結果。相比於其他組，包括阿巴西普對照，變異型ICOSL-IgV Fc導致最低平均總爪評分(圖30A)及體重之最大百分比變化(圖30B)。如圖30C及圖30D中所示，血清細胞介素亦在用變異型ICOS IgV-Fc治療之小鼠的治療劑CIA模型中經抑制。根據斯圖登氏不成對T測試(Student's unpaired t-test)之組間統計顯著性：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。在圖30C及圖30D中，點線水平線指示各細胞介素之分析定量下限(LLOQ)。
共同地，此等資料證明CD28及ICOS路徑在發炎性關節炎中起重要作用。特定言之，變異型ICOSL雙重CD28/ICOS拮抗劑之優良活性與需要阻斷兩種路徑且僅藉由單一路徑阻斷達成部分益處之觀測結果一致。
實例35在 EAE 模型中評估 ICOSL IgV - Fc 融合分子之活體內效應
在授受性轉移實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中評估變異型ICOSL IgV-Fc融合分子之消炎活性。測試之變異型ICOSL IgV-Fc融合分子含有融合至惰性Fc (含有人類IgG1 Fc中之突變L234A、L235E及L235E)之變異型ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO: 565)。
向雌性C57BL/6小鼠皮下注射MOG35 - 55 /CFA乳液。在11天之後，獲得脾細胞且用MOG35 - 55 肽、IL-12及抗IFNγ培養。在培養後三天，經由腹膜內注射遞送致腦炎性T細胞(第0天)。在第0天起始每隔一天給與小鼠變異型ICOSL IgV-Fc融合分子，持續總共五個劑量。作為對照，亦測試僅Fc之分子及CTLA-4-Fc分子(阿巴西普)。在T細胞注射後的20天內，小鼠經稱重、監測且如表33中所述地評估EAE評分。在研究結束時，收集血清用於分析促炎性細胞介素，且收集來自引流淋巴結之細胞用於流式細胞分析。
如圖 31A 中所示，用變異型ICOSL IgV-Fc融合分子治療之小鼠在EAE小鼠模型中抑制疾病，如藉由變異型ICOSL IgV-Fc融合分子相比於對照之較低EAE評分，*p＜0.0001(根據單因素變異數分析曲線下面積(AUC)))所示。
對於腹股溝淋巴結T細胞之流式細胞分析，細胞用活力染料染色且用抗CD44、抗CD62L、抗CD4、抗CD8分析且評估活的未處理(CD62L+CD44-)及T效應 記憶(Tem)(CD62L-CD44+)CD4+及CD8+ T細胞之百分比。如圖 31C 中所示，CD4+及CD8+ Tem細胞藉由用變異型ICOSL IgV-Fc融合分子處理而減少(****p＜0.0001；***p＜0.001，根據單因素變異數分析)。
在第0天(第1劑量後2小時)及第6天(第4劑量之前1小時)評估血清細胞介素。如圖 31D 中所示，測試之變異型ICOSL IgV-Fc融合分子導致在第0天，血清中之促炎性細胞介素(包括IL-5、IL-10、IL-12p70及TNFα)減少。在第6天，相比於Fc對照，藉由用變異型ICOSL IgV-Fc融合分子治療降低IFN-γ及IL-6之血清水準。
實例36
移植物抗宿主疾病 ( GvHD ) 模型中之變異型 ICOSL - IgV Fc 的 劑量範圍研究
在移植物抗宿主疾病(GVHD)之小鼠模型中用20、100或500 µg變異型ICOSL IgV-Fc分子進行劑量範圍研究，該分子含有融合至惰性Fc (含有人類IgG1 Fc中之突變L234A、L235E及L235E，例如SEQ ID NO: 637中所闡述)之變異型ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO: 565)。變異型ICOSL IgV-Fc分子之活性係相比於貝拉西普(CTLA-4-FcL104E/A29Y；美國專利申請公開案第US2016/0271218號)。
在第1天向雌性NSG小鼠(針對第1組，n=5/組，無治療；針對治療組2-7，n=10/組)皮下投與10 mg γ球蛋白且接著照射(100 cGy/rad)。在第0天(照射後24小時內)，給與第2-7組中之小鼠如表34 中所闡述之測試物，且接著所有小鼠在給藥後經由尾部靜脈接受靜脈內注射之1×107 個人類PBMC。
疾病活性指數(DAI)係藉由在研究期間一週三次地評估小鼠且基於小鼠之體重損失、姿勢、活動性、毛皮及皮膚外觀來測定。在研究於第42天終止之後，評估存活率、體重損失及疾病活性之終點量測結果。產生表示存活至研究終點之動物之百分比的Kaplan-Meier存活圖且藉由Mantel-Cox及Gehan-Breslow-Wilcox測試(95% CI)分析存活曲線比較。血液/血清樣品在研究結束時(第42天)收集自存活小鼠且藉由流動式細胞測量術評估細胞之T細胞標記物，包括小鼠或人類標記物CD4、CD8、CD28、ICOS、活化或耗盡標記物(PD-1、Ki67)及FoxP3 (Treg之標記物)。亦評估血清促炎性細胞介素(例如IFN-γ、IL-10、IL-12(p70)、IL-17A、IL-4、IL-5及TNFα)之水準。
圖 32A - 32B 顯示根據各給藥時程治療之GVHD小鼠之存活率及DAI評分。如所示，相比於用貝拉西普治療之小鼠，所有測試劑量水準下之測試之變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)顯著增強存活率(圖 32A )及降低疾病評分(圖 32B )(亦即在第42天分別為100%相對於40%存活率；根據Mantel-Cox秩和測試，p ＜0.01)。值得注意的是，單次劑量(100 µg)投與變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)導致與重複給與100 µg貝拉西普類似之疾病保護。
在研究結束時收集之血液之流式細胞分析展示測試之變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)有效地抑制轉移之人類T細胞的擴增，如藉由減小之人類細胞/小鼠細胞之比(圖 33A )及極大減少之總T細胞計數(圖 33B )所觀測。如圖 33C - 33F 中所示，在針對ICOS (圖 33C - 33D )及CD28 (圖 33E - 33F )共染色之CD4+及CD8+ T細胞之研究結束時收集之血液之流動式細胞測量術染色展示在用變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)治療之組中基本上無染色，但表現ICOS之CD4+及CD8+ T細胞在貝拉西普治療之小鼠中可易於偵測。此等結果與ICOSL IgV-Fc治療之小鼠中不具有剩餘的T細胞一致，且亦與變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)結合其靶分子CD28及ICOS及藉由流動式細胞測量術抗體阻斷其偵測之能力一致。變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)於少數剩餘人類T細胞上之結合係藉由使用抗人類IgG Fc之偵測確認。值得注意的是，儘管大部分轉移之人類T細胞起初表現CD28且僅10-20%為ICOS+，但在研究終止/結束時在生理鹽水或貝拉西普治療之小鼠中剩餘的活化T細胞為＞80% ICOS+。
T細胞之活化或耗盡標記物之存在亦在用變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)治療之組中抑制，如藉由PD1於CD4+及CD8+ T細胞中之較低表現及CD4+ T細胞中減少之Ki67表現證明(圖34A-3B)。相比於貝拉西普，效應T細胞與Treg之比在用變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)治療之組中保持穩定(圖 34C )。相比於貝拉西普，血清促炎性細胞介素亦在用變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)治療之組中經抑制(圖 35A - 35D )。
亦進行藥物動力學(PK)分析以監測變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)之血清暴露。使用抗人類ICOSL mAb捕捉抗體及Fc特異性小鼠抗人類IgG作為偵測試劑，使用定量PK ELISA量測小鼠血清樣品中之測試物濃度。
GVHD模型中觀測之變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)之血清暴露比獨立研究中測定之正常小鼠之血清暴露低45%(圖 35E )。GvHD模型中變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)之較長終末半衰期可歸因於GvHD中較晚時間點處減少之標靶(CD28、ICOS)(由於人類T細胞消失)，及/或歸因於正常小鼠中之抗藥物抗體(ADA)形成，其可干擾藥物暴露。變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)相比於正常小鼠具有較低血清暴露之觀測結果可歸因於GvHD模型中之靶介導藥物處置(TMDD)(亦即相比於小鼠直系同源物，其針對人類CD28及ICOS之較高親和力)，及/或歸因於用於此模型之NOD/SCID (NSG)小鼠中不具有FcRn。
共同地，此等結果與相比於貝拉西普，變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)展現強力拮抗活性(甚至在僅單次劑量下)及優良活性之觀測結果一致。此觀測結果可歸因於變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)展現ICOS+ T細胞之優良控制，該等T細胞另外逃避單一ICOS或CD28路徑阻斷，諸如藉由CD28路徑拮抗劑貝拉西普所達成。
實例37
評估 CD4 + CD45RBhigh 誘導性結腸炎模型中之變異型 ICOSL - IgV Fc
評估在CD4+CD45RBhigh誘導性結腸炎模型中，含有融合至惰性Fc (含有人類IgG1 Fc中之突變L234A、L235E及L235E，例如SEQ ID NO: 637中所闡述)之變異型ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO: 565)的例示性變異型ICOSL IgV-Fc對疾病發展之效應。
CD4+CD45RBhigh供體細胞係藉由自獲自15隻雄性BALB/C供體小鼠之脾細胞懸浮液之陰性選擇富集。在第0天，30萬個CD4+CD25-CD45RBhigh (Treg耗盡)供體細胞靜脈內注射至免疫缺陷C.B17 (SCID)小鼠(n=12或21/組)中以誘導結腸炎。作為對照，30萬個未在此模型中誘導結腸炎發展之CD4+細胞(含有Treg細胞)注射至SCID小鼠受體(n=12)中。在細胞轉移當天，向各組中之小鼠給與變異型ICOSL-IgV Fc或僅Fc或媒劑對照。表 35 概括測試組之治療方案。
每週三次地評估體重(在第0天開始獲取)及糞便硬度分數(在第10天開始獲取)。每日疾病活性指數(DAI)係計算自體重及糞便評分。在研究於第42天終止之後，收集結腸用於長度及重量測定及組織學分析。使用雙尾斯圖登氏t測試評估變異型ICOSL-IgV Fc治療組相比於媒劑組之最終體重及最終結腸重量及長度之統計分析。使用威爾科克森非參數T測試(Wilcoxon's non-parametric T test)比較糞便評分及DAI評分。
DAI結果顯示於表36 (DAI)及圖 36A 中，結腸量測結果顯示於表37中，且結腸組織學結果顯示於表38及圖 36B 中。如所示，在此模型中，測試之變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)展現顯著降低之結腸炎發展，其與此雙重CD28/ICOS拮抗劑有效地治療發炎性腸病(IBD)之效用一致。


本發明不意欲限制在特定揭示之實施例的範疇中，提供該等實施例以例如說明本發明之各種態樣。對所描述之組合物及方法的各種修改將由本文中之描述及教示而變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下加以實踐且意欲屬於本發明之範疇內。
圖 1 描繪反映細胞在與靶抗原表現細胞共培養之後的細胞毒性殺死活性之阻抗結果，該等細胞經單獨的抗CD19嵌合抗原受體(CAR)或例示性跨膜免疫調節TIP (CD80-TIP或ICOSL-TIP)或對應CD80或ICOSL野生型跨膜蛋白工程改造。阻抗係使用Acea Real-Time Cell Analyzer (RTCA)評估，其量測96孔微電子盤(E-盤)之培養基中之阻抗變化。
圖 2A 描繪初生T細胞經編碼CAR及TIP蛋白質之病毒有效地轉導。初生人類T細胞經抗CD3加上抗CD28珠粒活化48小時且接著經編碼具有BFP報告子之抗CD19 CAR之慢病毒，加上編碼具有GFP報告子之ICOSL TIP之第二慢病毒轉導。FAC圖顯示y軸上之BFP表現及x軸上之GFP表現及屬於各象限之T細胞之百分比經指示。結果顯示培養物包括僅經CAR轉導之細胞(左上象限)、僅經TIP轉導之細胞(右下象限)、經兩種病毒轉導之細胞(右上象限)及未經任一者轉導之細胞(左下方)。在圖 2B 中，表現於CAR T細胞上之TIP對CAR T細胞提供協同刺激。具有或不具有TIP共轉導之CAR T細胞用Cell-Trace Far Red標記且與CD19+NALM6細胞株一起培育以接合CAR。增殖係藉由稀釋出螢光染料之CAR表現細胞的百分比評估。相比於無TIP之細胞或經野生型ICOSL轉導之細胞，經突變TIP轉導之細胞顯示增加之CAR+ T細胞增殖。缺乏CAR表現之模擬轉導之細胞未能在此分析中增殖。
圖 3A - 3B 經由細胞介素釋放展示當與抗CD3共固定化時野生型(WT)或變異型ICOSL之協同刺激能力。10 nM抗CD3與40 nM (箭頭)或10 nM WT或變異型ICOSL一起濕塗佈至96孔平底聚苯乙烯組織培養盤之孔。添加100,000個純化之CD4+ 及CD8+ (泛)T細胞且在72小時後收穫上清液用於細胞介素釋放之ELISA分析。圖 3A 顯示IFN-γ且圖 3B 顯示自泛T細胞分泌之IL-17蛋白質水準。圖代表來自泛T細胞協同刺激之典型IFN-γ及IL-17反應。
圖 4A -4B 經由增殖展示與抗CD3共固定化時野生型(WT)或變異型ICOSL之協同刺激能力。CFSE標記之泛T細胞在如先前所述之抗CD3及ICOSL塗佈盤中培育72小時。細胞經收穫、洗滌、用螢光結合之抗CD4或抗CD8抗體染色且藉由流動式細胞測量術分析。使用未刺激對照CFSE標記之T細胞設定門控及細胞計數器電壓。增殖係藉由自對照之CFSE稀釋測定。圖 4A 顯示40 nM ICOSL協同刺激之後的總增殖(箭頭)、CD4+ (實心條)及CD8+ 細胞(影線條)T細胞之%。圖 4B 顯示10 nM ICOSL協同刺激之後的總泛T細胞增殖之%。圖代表來自泛T細胞協同刺激之典型增殖性反應。
圖 5 描繪人類混合淋巴細胞Reation(MLR)中之ICOSL vIgD候選功能。ICOSL變異體及其突變列於x軸上，連同野生型ICOSL、陰性對照PDL2-Fc及人類IgG，以及陽性對照基準分子CTLA-Ig貝拉西普。跨越圖之線表示陰性對照培養物之上清液中偵測之IFN-γ的基線量。對於各ICOSL變異體候選物或對照物，測試三種不同濃度，以箭頭指示40 nM培養物中之蛋白質的最高濃度。大多數ICOSL變異體候選物相比於貝拉西普在所有三種測試濃度下顯示優良拮抗活性，如藉由彼等培養物中之較低IFN-γ濃度反映。
圖 6A - 6D 描繪B-T共培養分析中可溶ICOSL Fc-融合蛋白對B及T細胞反應之抑制。圖 6A 描繪T細胞驅動之B細胞增殖的可溶ICOSL Fc-融合蛋白抑制。來自單一供體之純化CD4+ T細胞及B細胞經CFSE標記且在存在或不存在具有或不具有指定ICOSL Fc-融合蛋白之指定有絲分裂原的情況下以1:1比率共培育。細胞經100 ng/mL之葡萄球菌腸毒素B (SEB)、1 mg/mL之美洲商陸有絲分裂原(PWM)或兩者刺激。ICOSL Fc-融合蛋白以40 nM之最終濃度包括在內且培養物經培育7天且經受FACS分析。分裂B細胞之數目測定自稀釋細胞之CFSE的培養物中之細胞的數目。測試所有ICOSL Fc-融合蛋白，除了野生型減少B細胞增殖。圖 6B - 6D 顯示ICOSL Fc-融合蛋白抑制B-T共培養物中之細胞介素T細胞細胞介素產生。來自上文所述之培養物的上清液在第7天收穫且使用LEGENDplex Human Th Cytokine Panel (Biolegend)分析細胞介素含量。IL-5 (圖 6B )、IL-13 (圖 6C )及IL-21(圖 6D )之T細胞產生藉由包括ICOSL Fc-融合蛋白而減少。
圖 7A - 7F 描繪移植物抗宿主疾病(GVHD)小鼠模型中之不同端點，其中人類PBMC細胞授受性轉移至免疫缺陷NSG鼠類宿主中。圖 7A 顯示治療動物之存活曲線。在鹽水對照動物中觀測到侵襲性疾病過程及後續死亡，在用野生型ICOSL-Fc以及N52H/I143T ICOSL變異體治療之動物中觀測到類似存活率。變異型N52H/N57Y/Q100P具有與臨床基準貝拉西普類似的經改良之存活率。圖 7B 顯示體重損失中之類似趨勢，其中ICOSL變異體N52H/N57Y/Q100P與用貝拉西普治療之動物展現類似體重維持，儘管所有其他組經歷快速重量損失。圖 7C 顯示來自標準化GVHD疾病活性指數(DAI)觀測之臨床評分，再次顯示用ICOSL變異型N52H/N57Y/Q100P治療之動物中與臨床基準貝拉西普類似的較低評分，而其他動物組經歷較高DAI評分。圖 7D 描繪在第14天量測的來自實驗動物之血液中之CD4及CD8百分比之流動式細胞測量術量測結果。實驗組之間的CD8細胞之百分比在很大程度上相同，然而，用ICOSL變異體N52H/N57Y/Q100P及貝拉西普治療之動物相比於其他實驗組具有較低CD4細胞之百分比。
圖 7E 描繪測試額外ICOSL變異體分子之類似實驗的存活曲線。圖 7F 描繪來自測試額外ICOSL變異體分子之類似實驗的臨床評分。
圖 8 顯示藉由指定變異型堆疊分子vIgD C-L傳達之局部協同刺激活性，其中C表示ICOSL協同刺激域且L表示NKp30定位域。在此分析中，表現定位表面蛋白B7-H6之靶K562細胞在抗CD3存在下與人類T細胞一起培養且T細胞活化係藉由培養上清液中之IFN-γ水準評估。包括單獨的抗CD3或不包括堆疊變異型Fc分子不誘導T細胞活化。類似地，僅以單獨的野生型定位NKp30域或單獨的野生型協同刺激ICOSL域作為Fc融合蛋白培養之細胞不導致T細胞活化。含有野生型型式之協同刺激域及定位域之堆疊域在最高測試濃度下誘導可量測IFN-γ，然而，變異型定位協同刺激堆疊在最高濃度下誘導高超過兩倍的IFN-γ水準，且仍觀測為濃度之IFN-γ水準經向下滴定。
圖 9 概括遲發型過敏(DTH)之標準模型之小鼠的耳厚度變化。經卵白蛋白致敏且隨後用相同蛋白質在耳中刺激之PBS治療之動物顯示最高水準之量測耳部腫脹。用臨床基準阿巴西普治療之小鼠在耳刺激後具有略微減少之耳部腫脹。相比於阿巴西普，所有五個ICOSL變異體治療組展示相等或改良之耳部腫脹減少。
圖 10A - 10C 描繪與抗體(V-Mab)結合之變異型IgSF域(vIgD)之各種例示性組態。圖 10A 顯示各種組態，其中vIgD直接地或間接地連接至抗體之輕鏈的N端及/或C端。圖 10B 顯示各種組態，其中vIgD直接地或間接地連接至抗體之重鏈的N端及/或C端。圖 10C 描繪當圖 10A 之輕鏈及圖 10B 之重鏈共表現於細胞中時之所得V-Mab組態。
圖 11A - 11B 展示V-Mab針對同源結合配位體之特異性。結合分析係對經DNA瞬時轉染之Expi293細胞進行，用於人類HER2、CD28、CTLA-4或ICOS之哺乳動物表面表現。200,000轉染細胞與100,000 pM至100 pM親本抗體(C1)或各種V-Mab(C2-9)一起培育。移除非結合抗體，藉由螢光結合之抗人類IgG偵測結合抗體，且藉由流動式細胞測量術分析細胞之MFI及百分比陽性(基於Fc對照)。圖 11A 顯示V-Mab與HER2轉染體在與親本抗體類似之水準下之結合。在所有V-Mab中觀測到與模擬轉染之細胞的結合，但WT ICOSL除外，其歸因於Expi293親本細胞上之低內源性HER2表現量。圖 11B 顯示親本IgSF域(N52H/N57Y/Q100P)與其同源配位體之結合藉由V-Mab維持或增加(C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9)。
圖 12 表明當與抗CD3共固定化時之V-Mab協同刺激及增殖能力。10 nM抗CD3與30 nM至3 nM親本抗體、V-Mab或Fc對照一起濕塗佈至96孔平底聚苯乙烯組織培養盤之孔。持續72小時添加CFSE標記之泛T細胞。IFN-γ分泌係藉由ELISA量測且總T細胞增殖係藉由CFSE-稀釋之流式細胞分析來量測。IgSF域(N52H/N57Y/Q100P)之IFN-γ分泌及增殖大於WT ICOSL。相比於親本IgSF，V-Mab展示增加之細胞介素及增殖協同刺激能力。
圖 13A - 13C 描繪所提供變異型IgSF域分子之各種型式。圖 13A 描繪可溶分子，包括：(1)融合至Fc鏈之變異型IgSF域(vIgD)；(2)含有第一變異型IgSF域(第一vIgD)及第二IgSF域，諸如第二變異型IgSF域(第二vIgD)之堆疊分子；(3)含有第一變異型IgSF域(vIgD)及靶向腫瘤抗原之IgSF域，諸如NKp30 IgSF域之腫瘤靶向IgSF分子；及(4)連接至抗體(V-Mab)之變異型IgSF域(vIgD)。圖 13B 描繪表現於細胞表面上的跨膜免疫調節蛋白(TIP)，其含有變異型IgSF域(vIgD)，例如變異型ICOSL。在例示性實施例中，跨膜結合vIgD之同源結合配位體為協同刺激受體，例如CD28，且含有vIgD (例如ICOSL vIgD)之TIP促效協同刺激受體，使得TIP在表現協同刺激受體之細胞中誘導正信號。圖 13C 描繪分泌免疫調節蛋白(SIP)，其中變異型IgSF域(vIgD)，例如變異型ICOSL分泌自細胞，諸如第一T細胞(例如CAR T細胞)。在例示性實施例中，分泌vIgD之同源結合配位體為活化受體，例如CD28，其可表現於第一細胞(例如T細胞，諸如CAR T細胞)上及/或第二細胞(例如T細胞；內源性或工程改造，諸如CAR T細胞)上。在SIP與其同源結合配位體結合後，阻斷經由活化受體之信號傳導。在所有情況下，vIgD可為僅V域(IgV)、V域(IgV)及C域(IgC)之組合，包括整個細胞外域(ECD)，或IgSF超級家族成員之Ig域之任何組合。
圖 14 描繪融合至Fc (vIgD-Fc)之變異型IgSF域(vIgD)之活性的例示性示意圖，其中vIgD為ICOSL之IgSF域的變異體。如所示，ICOSL之可溶vIgD與其同源結合配位體相互作用以分別阻斷CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2)或ICOSL與CD28或ICOS之相互作用，進而阻斷藉由CD28及/或ICOS協同刺激受體之協同刺激。
圖 15 描繪將變異型IgSF域(vIgD)定位至腫瘤細胞之堆疊分子的例示性示意圖。以此型式，堆疊分子含有第一變異型IgSF域(第一vIgD)及第二IgSF域(例如第二vIgD)，其中第二IgSF域(例如第二vIgD)為結合至腫瘤抗原之腫瘤靶向IgSF域。例示性腫瘤靶向IgSF域為NKp30之IgSF域，其結合至腫瘤抗原B7-H6。在此繪圖中，vIgD為ICOSL之IgSF域的變異體。如所示，腫瘤靶向IgSF域與腫瘤細胞之表面的結合將第一vIgD定位於腫瘤細胞表面上，第一vIgD可在該表面上與其表現於相鄰免疫細胞(例如T細胞)表面上之同源結合配位體中之一或多者(例如CD28或ICOS)相互作用以刺激協同刺激受體。
圖 16A 描繪含有第一變異型IgSF域(第一vIgD)，例如變異型ICOSL，及第二IgSF域，諸如第二變異型IgSF域(第二vIgD)之堆疊分子的各種例示性組態。如所示，第一vIgD及第二IgSF域獨立地直接或間接連接至Fc區之N端或C端。為了產生均二聚Fc分子，Fc區為能夠藉由細胞中之個別Fc區之共表現與匹配之Fc次單位形成均二聚體之Fc區。為了產生雜二聚Fc分子，個別Fc區含有突變(例如CH3域中之「杵-臼(knob-into-hole)」突變)，使得當個別Fc區共表現於細胞中時相比於均二聚體，雜二聚體之形成有利。
圖 16B 描繪含有第一變異型IgSF域(第一vIgD)、第二IgSF域，諸如第二變異型IgSF域(第二vIgD)及第三IgSF域，諸如第三變異型IgSF域(第三vIgD)之堆疊分子的各種例示性組態。如所示，第一vIgD、第二IgSF及第三IgSF域獨立地直接或間接連接至Fc區之N端或C端。為了產生均二聚Fc分子，Fc區為能夠藉由細胞中之個別Fc區之共表現與匹配之Fc區形成均二聚體之Fc區。
圖 17 描繪與抗體(V-Mab)結合之變異型IgSF域(vIgD)之活性的例示性示意圖，其中抗體(例如抗HER2抗體)結合至腫瘤細胞表面上之抗原。在此繪圖中，vIgD為ICOSL之IgSF域的變異體。如所示，抗體與腫瘤細胞表面的結合將vIgD定位於腫瘤細胞表面上，vIgD可在該表面上與其表現於相鄰免疫細胞(例如T細胞)表面上之同源結合配位體中之一或多者相互作用以促效受體信號傳導。在如所示之例示性實施例中，變異型IgSF域(vIgD)為ICOSL之IgSF域的變異體。ICOSL vIgD與CD28或ICOS協同刺激受體之結合提供促效劑或共刺激信號。
圖 18 描繪當培育10 nM抗CD3與40 nM Fc-對照蛋白質、野生型ICOSL-Fc、野生型CD80-Fc、此兩種蛋白質或具有如所指示之突變的變異型ICOSL Fc-融合蛋白時之初生人類T細胞之Nanostring轉錄簽名。來自樣品之總RNA由收穫之細胞製備且RNA係轉移至Nanostring且Cancer Immune晶片用於定量各樣品中之750個基因的轉錄物。改變之轉錄物包括水準高於或低於診斷之彼等，包括所指出之轉錄物。
圖 19 描繪在各種免疫調節蛋白存在下持續指定時間進行如圖18中所述之培育後的例示性轉錄物之轉錄水準。
圖 20A 至 20B 展示當與表現HER2之標靶共培養時之VmAb介導之T細胞增殖。經CFSE標記之泛T細胞在VmAb或對照蛋白質存在下經顯示細胞表面抗CD3單鏈Fv (OKT3)及HER2之K562衍生之人工靶細胞活化。增殖係藉由CD4+ (左圖)或CD8+ (右圖)染色T細胞上之CFSE-稀釋之流式細胞分析來量測。在圖 20A 中，K562細胞經滴定且與T細胞以40至1280:1之效應細胞:靶細胞(E:T)比平鋪。VmAb、親本IgSF域或WT ICOSL以1000 pM添加。在圖 20B 中，K562細胞以160:1之E:T比添加至T細胞。VmAb或對照蛋白質經滴定且以3000至37 pM添加。
圖 21 描繪經初生人類T細胞中之各種含IgSF域之跨膜免疫調節蛋白(TIP)及例示性重組E6特異性TCR轉導之T細胞的增殖研究。
圖 22A - 22G 顯示含有各種參考序列中產生之突變N52H/N57Y/Q100R/F172S之變異型ICOSL Fc-融合分子，諸如截短之ICOSL ECD Fc-融合物、僅ICOSL IgV域之Fc-融合物及/或參看SEQ ID NO: 32中闡述之參考ICOSL細胞外域(ECD)序列在N207G/L208G處具有突變之ICOSL變異型Fc融合蛋白中之蛋白質水解的SEC分析。分子係使用ExpiCHO-S衍生之細胞表現。
圖 23A - 23B 描繪經表現含有ECD之變異型ICOSL TIP之K652細胞刺激之CD4及CD8人類T細胞的增殖，該ECD含有具有對應於N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288)、N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283)及E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 300)之胺基酸突變的親和力經修飾之IgSF。
圖 24A 描繪V-mAb與HER2及CD28之結合。圖 24B - 24F 描繪使用轉染細胞系統，使用具有IL-2啟動子螢光素酶報告子之Jurkat細胞之T細胞之VmAb協同刺激的結果，顯示V-mAb在HER2+ K562/OKT3細胞存在下提供顯著協同刺激信號。
圖 25A - 25D 描繪堆疊Fc-融合分子與表現同源結合配位體B7H6 (圖 25A )、ICOS (圖 25B )、CD28 (圖 25C )及CTLA-4 (圖 25D )之細胞的結合。
圖 26A - 26B 描繪例示性測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質之生物活性研究。
圖 27 描繪如藉由CD4+或CD8+染色T細胞上之CFSE-稀釋之流式細胞分析所量測的藉由ICOSL/NKp30堆疊蛋白質誘導之增殖。
圖 28 描繪測試之ICOSL/NKp30堆疊蛋白質及mPD-1 mAb之組合的抗腫瘤效應。
圖 29A - 29E 描繪在膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)模型中預防性給與例示性ICOSL IgV-Fc融合分子之消炎活性，包括平均總爪評分(圖 29A )、偵測之CII IgG (圖 29B )、血清細胞介素水準(圖 29C )、CD44+活化T細胞或TFH 細胞(圖 29D )及引流淋巴結中之B細胞分率(圖 29E )。
圖 30A - 30D 描繪在膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)模型中延遲給與例示性ICOSL IgV-Fc融合分子之消炎活性，包括平均總爪評分(圖 30A )及血清細胞介素水準(圖 30C - 30D )。
圖 31A - 31D 描繪在實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中延遲給與例示性ICOSL IgV-Fc融合分子之消炎活性，包括EAE評分(圖 31A )、腹股溝淋巴結T細胞之流式細胞分析(圖 31C )及促炎性細胞介素(圖 31D )。
圖 32A - 32B 描繪用各種劑量(20、100或500 µg)之變異型ICOSL IgV-Fc分子治療之移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠之存活率及DAI評分。
圖 33A - 33F 描繪來自在研究結束時在收集之血液(圖 33A )或總T細胞計數(圖 33B )中之人類細胞/小鼠細胞之移植物抗宿主疾病(GvHD)比之流式細胞分析，及來自用各種劑量(20、100或500 µg)之變異型ICOSL IgV-Fc分子治療之移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠之ICOS+ CD4+或CD8+細胞(圖 33C - 33D )或CD28+ CD4+或CD8+細胞(圖 33E - 33F )之評估的結果。
圖 34A - 34B 描繪來自用各種劑量(20、100或500 µg)之變異型ICOSL IgV-Fc分子治療之移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠之T細胞之活化或耗盡標記物的表現。
圖 34C 描繪來自用各種劑量(20、100或500 µg)之變異型ICOSL IgV-Fc分子治療之移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠之T效應細胞(Teff)與T調節細胞(Treg)之比。
圖 35A - 35D 描繪來自用各種劑量(20、100或500 µg)之變異型ICOSL IgV-Fc分子治療之移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠之血清促炎性細胞介素。圖 35E 描繪相比於正常小鼠在GVHD模型中之變異型ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R)之血清暴露。
圖 36A 描繪來自用例示性變異型ICOSL IgV-Fc治療對疾病活性指數(DAI)之DAI結果且圖36B 描繪組織學結果，該DAI計算自CD4+CD45RBhigh誘導性結腸炎模型中之體重及糞便評分。

Claims (171)

  1. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其包含ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中之一或多個胺基酸修飾，其中該ICOSL參考多肽為截短之細胞外域，其包含參看SEQ ID NO: 32所闡述ICOSL細胞外域序列之胺基酸1-112及C端截短至少25個胺基酸之連續胺基酸序列。
  2. 如請求項1之變異型ICOSL多肽，其中相比於該ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，該變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
  3. 如請求項1或2之變異型ICOSL多肽，其中該C端截短至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125個胺基酸殘基。
  4. 如請求項1至3中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽已改變或缺失SEQ ID NO: 32胺基酸204-209所闡述的蛋白酶裂解位點。
  5. 如請求項1至4中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至4中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
  7. 一種變異型ICOSL配位體(ICOSL)多肽，其包含ICOSL參考多肽中之一或多個胺基酸修飾，其中該ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
  8. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其包含ICOSL參考多肽之免疫球蛋白超級家族(IgSF)域中之一或多個胺基酸修飾，其中該ICOSL參考多肽係改變參看SEQ ID NO: 32對應於胺基酸204-209中之一或多個胺基酸。
  9. 如請求項1至8中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係在對應於位置52、57或100之位置。
  10. 如請求項1至9中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、N52K、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57Y、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V。
  11. 如請求項1至10中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52D、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、 N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
  12. 如請求項1至11中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57Y/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52T/N57H/Q100S、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52G/N57V、N52L/N57V、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52S、N52H、N52D、N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N57Y、N52S/C198R、N52S/T113E、S54A、N52D/S54P、N52K/L208P、N52H/I143T、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、Q100R、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、N52H、N57Y、N57Y/Q100P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52S/E90A/H115R、N52S/E90A/H115R或N30D/K42E/N52S/H115R。
  13. 如請求項1至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其包含一或多個胺基酸修飾N52H/Q100R。
  14. 如請求項13之變異型ICOSL多肽，其中該變異型ICOSL多肽具有SEQ ID NO: 567中闡述之序列。
  15. 如請求項1至13中任一項之變異型ICOSL多肽，其包含一或多個胺基酸修飾N52H/N57Y/Q100R。
  16. 如請求項15之變異型ICOSL多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO: 565中闡述之序列。
  17. 如請求項1至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其包含一或多個胺基酸修飾N52L/N57H/Q100R。
  18. 如請求項17之變異型ICOSL多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO: 761中闡述之序列。
  19. 如請求項1至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其包含胺基酸修飾N52D。
  20. 如請求項19之變異型ICOSL多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO: 548中闡述之序列。
  21. 如請求項8至12中任一項之變異型ICOSL多肽，其中： 該改變包含一或多個連續胺基酸之缺失，其對應參看SEQ ID NO: 32胺基酸204-209；或 該改變包含至少一個胺基酸取代，其對應於SEQ ID NO: 32中所闡述之位置207及208中之一或兩處。
  22. 如請求項21之變異型ICOSL多肽，其中該至少一個胺基酸取代為N207A、N207G或L208G，或其保守性胺基酸取代。
  23. 如請求項1至22中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於由相同細胞表現時之該變異型ICOSL多肽之全長細胞外域，該變異型ICOSL多肽在由細胞表現時展現減少之蛋白質水解性裂解。
  24. 如請求項1至8及21至23中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係在參看SEQ ID NO: 32對應於選自10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227之位置的位置。
  25. 如請求項1至8及21至24中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R、S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K，或其保守性胺基酸取代。
  26. 如請求項1至8及21至25中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自F120S/Y152H/N201S、E111del、Y33del、N168Q/N207Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N84Q/N119Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119QN155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q或F138L/L203P。
  27. 如請求項1至8及21至25中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M, C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N52Q/N168Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
  28. 一種變異型ICOS配位體(ICOSL)多肽，其包含IgV域或其特異性結合片段、IgC域或其特異性結合片段，或兩者，其中該變異型ICOSL多肽在ICOSL參考多肽或其特異性結合片段中包含一或多個胺基酸修飾，該一或多個胺基酸修飾對應於參看SEQ ID NO:32選自N52A、N52C、N52D、N52G、N52K、N52L、N52M、N52R、N52T、N52V、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、Q100A、Q100D、Q100G、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100S、Q100T或Q100V之胺基酸修飾。
  29. 如請求項28之變異型ICOSL多肽，其中該一或多個胺基酸修飾係選自N52A/N57F/Q100S、N52A,/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
  30. 如請求項28或29之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽包含(i) SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列，(ii)與SEQ ID NO: 32具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(iii) (i)或(ii)之一部分，其包含IgV域或IgC域或其特異性結合片段，或兩者。
  31. 如請求項28至30中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含IgV域或其特異性結合片段。
  32. 如請求項28至31中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該IgV域或其特異性結合片段為該變異型ICOSL多肽之唯一ICOSL部分。
  33. 如請求項28至32中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽包含SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列。
  34. 如請求項28至32中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOSL參考多肽由SEQ ID NO: 545中所闡述之胺基酸序列組成。
  35. 如請求項1至34中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於該ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，該變異型ICOSL多肽對ICOS或CD28胞外域展現出經提高結合性。
  36. 如請求項1至34中任一項之變異型ICOSL多肽，其中相比於該ICOSL參考多肽與相同胞外域之結合，該變異型ICOSL多肽對ICOS及CD28胞外域展現出經提高結合性。
  37. 如請求項1至36中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該結合性提高超過1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
  38. 如請求項1至37中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該ICOS為人類ICOS。
  39. 如請求項1至37中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該CD28為人類CD28。
  40. 如請求項1至39中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸修飾，視情況為胺基酸取代、插入及/或缺失。
  41. 如請求項1至40中任一項之變異型ICOSL多肽，其為可溶性蛋白質。
  42. 如請求項1至41中任一項之變異型ICOSL多肽，其中： 該變異型ICOSL多肽缺少跨膜域及細胞內信號傳導域；及/或 當該變異型ICOSL多肽係表現自細胞時，其不會表現於該細胞表面上。
  43. 如請求項1至40中任一項之變異型ICOSL多肽，其中該變異型ICOSL多肽進一步包含跨膜域。
  44. 如請求項43之變異型ICOSL多肽，其進一步包含連接至該跨膜域之細胞質信號傳導域。
  45. 一種免疫調節蛋白，其包含如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽及半衰期延長部分。
  46. 如請求項45之免疫調節蛋白，其中該半衰期延長部分包含多聚化域、白蛋白、白蛋白結合性多肽、Pro/Ala/Ser (PAS)、人絨毛膜促性腺激素之β次單位之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、長的無特定結構親水性胺基酸序列(XTEN)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合性小分子或其組合。
  47. 如請求項45或46之免疫調節蛋白，其中該半衰期延長部分為多聚化域或包含多聚化域。
  48. 如請求項47之免疫調節蛋白，其中該多聚化域為免疫球蛋白之Fc區或包含免疫球蛋白之Fc區。
  49. 如請求項47或48之免疫調節蛋白，其中該變異型ICOSL多肽直接連接或經由連接子間接連接該多聚化域。
  50. 如請求項47至49中任一項之免疫調節蛋白，其中該免疫調節蛋白為包含連接至第一多聚化域之第一變異型ICOSL多肽及連接至第二多聚化域之第二變異型ICOSL多肽的多聚體，其中該第一及第二多聚化域相互作用以形成包含該第一及第二變異型ICOSL多肽之多聚體。
  51. 如請求項50之免疫調節蛋白，其中該多聚體為二聚體。
  52. 如請求項50或51之免疫調節蛋白，其中該第一變異型ICOSL多肽與該第二變異型ICOSL多肽相同。
  53. 如請求項51或52之免疫調節蛋白，其中該二聚體為均二聚體。
  54. 如請求項51之免疫調節蛋白，其中該二聚體為雜二聚體。
  55. 如請求項48至54中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區為人類IgG1或變異型Fc區，相比於野生型人類IgG1，該變異型Fc區包含一或多個胺基酸取代。
  56. 如請求項48至55中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 226展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。
  57. 如請求項48至56中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區展現一或多種效應物功能。
  58. 如請求項48至56中任一項之免疫調節蛋白，其中相比於Fc或野生型人類IgG1，該Fc區展現出一或多種經減弱之效應物功能。
  59. 如請求項58之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含一或多個選自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A之胺基酸取代，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  60. 如請求項59之免疫調節蛋白，其中該變異型Fc區另外包含胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  61. 如請求項59或60之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  62. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 476或SEQ ID NO: 632中所闡述之胺基酸序列。
  63. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 478或SEQ ID NO: 634中所闡述之胺基酸序列。
  64. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 477中所闡述之胺基酸序列。
  65. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 633中所闡述之胺基酸序列。
  66. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 474中所闡述之胺基酸序列。
  67. 如請求項59至61中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 637中所闡述之胺基酸序列。
  68. 如請求項49至67中任一項之免疫調節蛋白，其中該變異型ICOSL多肽係經由連接子連接至該Fc區。
  69. 如請求項49至68中任一項之免疫調節蛋白，其中該連接子包含1至10個胺基酸。
  70. 如請求項49至69中任一項之免疫調節蛋白，其中該連接子為AAA。
  71. 如請求項49至69中任一項之免疫調節蛋白，其中該連接子為G4S (SEQ ID NO: 636)。
  72. 如請求項49至69中任一項之免疫調節蛋白，其中該連接子為(G4S)2 (SEQ ID NO:229)。
  73. 如請求項49至69中任一項之免疫調節蛋白，其中該連接子為GSGGGGS連接子(SEQ ID NO: 635)。
  74. 一種免疫調節蛋白，其包含連接至第二多肽之如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽，該第二多肽包含免疫球蛋白超級家族(IgSF)域。
  75. 如請求項74之免疫調節多肽，其中相比於未經修飾或野生型IgSF域，該第二多肽之該IgSF域對其同源結合配位體中之一或多者展現出經提高結合性。
  76. 如請求項74或75之免疫調節蛋白，其中該變異型ICOSL多肽能夠特異性結合至CD28或ICOS且該第二多肽之該IgSF域能夠結合至除了該ICOSL變異型多肽特異性結合之結合配位體以外的結合配位體。
  77. 如請求項75至76中任一項之免疫調節多肽，其中該第二多肽之該IgSF域為腫瘤定位部分，其結合至表現在腫瘤上之配位體，或為發炎性定位部分，其結合至表現在發炎性環境之細胞或組織上之配位體。
  78. 如請求項77之免疫調節多肽，其中該配位體為B7H6。
  79. 如請求項77或78之免疫調節多肽，其中該IgSF域來自NKp30。
  80. 如請求項75至79中任一項之免疫調節多肽，其中該第二多肽之該IgSF域為IgV域或包含IgV域。
  81. 如請求項75至80中任一項之免疫調節多肽，其中該第二多肽之該IgSF域具有SEQ ID NO: 504中闡述之序列。
  82. 如請求項75至81中任一項之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽為IgV域或包含IgV域。
  83. 如請求項75至82中任一項之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含胺基酸修飾N52H/Q100R。
  84. 如請求項83之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽具有SEQ ID NO: 567中闡述之序列。
  85. 如請求項75至83中任一項之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含胺基酸修飾N52H/N57Y/Q100R。
  86. 如請求項85之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽具有SEQ ID NO: 565中闡述之序列。
  87. 如請求項75至82中任一項之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含之胺基酸修飾為N52L/N57H/Q100R。
  88. 如請求項87之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽具有SEQ ID NO: 761中闡述之序列。
  89. 如請求項75至82中任一項之免疫調節多肽，其中該變異型ICOSL多肽包含之胺基酸修飾為N52D。
  90. 如請求項89之免疫調節多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO: 548中闡述之序列。
  91. 如請求項75至90中任一項之免疫調節蛋白，其中該免疫調節蛋白包含多聚化域，該多聚化域連接至該變異型ICOSL多肽或包含該IgSF域之該第二多肽中之一者或兩者。
  92. 如請求項91之免疫調節蛋白，其中該多聚化域為Fc區。
  93. 如請求項75至92中任一項之免疫調節蛋白，其為二聚體。
  94. 如請求項93之免疫調節蛋白，其為均二聚體。
  95. 如請求項93之免疫調節蛋白，其為雜二聚體。
  96. 如請求項92至95中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區為人類IgG1或變異型Fc區，相比於野生型人類IgG1，該變異型Fc區包含一或多個胺基酸取代。
  97. 如請求項92至96中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 226中所闡述之胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 226展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之變異體。
  98. 如請求項92至97中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區展現一或多種效應物功能。
  99. 如請求項92至97中任一項之免疫調節蛋白，其中相比於Fc或野生型人類IgG1，該Fc區展現出一或多種經減弱之效應物功能。
  100. 如請求項99之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含一或多個選自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A之胺基酸取代，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  101. 如請求項100之免疫調節蛋白，其中該變異型Fc區進一步包含胺基酸取代C220S，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  102. 如請求項100或101之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含K447del，其中殘基係根據Kabat之EU索引編號。
  103. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 476或SEQ ID NO: 632中所闡述之胺基酸序列。
  104. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 478或SEQ ID NO: 634中所闡述之胺基酸序列。
  105. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 477中所闡述之胺基酸序列。
  106. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 633中所闡述之胺基酸序列。
  107. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 474中所闡述之胺基酸序列。
  108. 如請求項100至102中任一項之免疫調節蛋白，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 637中所闡述之胺基酸序列。
  109. 如請求項100至108中任一項之免疫調節蛋白，其中該變異型ICOSL多肽及該第二多肽之該IgSF域係藉由連接子連接。
  110. 如請求項109之免疫調節蛋白，其中該連接子為3× GGGGS (SEQ ID NO: 228)。
  111. 如請求項91至110中任一項之免疫調節蛋白，其中該多聚化域係經由連接子連接至以下之一者或兩者：該變異型ICOSL多肽或包含該IgSF域之該第二多肽。
  112. 如請求項111之免疫調節蛋白，其中該連接子為GSGGGGS (SEQ ID NO: 635)。
  113. 一種結合物，其包含如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽或如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白，及異質部分。
  114. 如請求項113之結合物，其中該結合物為融合蛋白。
  115. 如請求項113或114之結合物，其中該部分為特異性結合至細胞表面上之分子的靶向部分。
  116. 如請求項115之結合物，其中該靶向部分特異性結合至免疫細胞表面上之分子。
  117. 如請求項116之結合物，其中該免疫細胞為抗原呈遞細胞或淋巴細胞。
  118. 如請求項124之結合物，其中該靶向部分為結合至腫瘤表面上之分子的腫瘤定位部分。
  119. 如請求項113至118中任一項之結合物，其中該靶向部分為抗體或抗原結合片段。
  120. 如請求項119之結合物，其中該抗體係選自西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Ado-trastuzumab emtansine)、托西莫單抗(Tositumomab)(Bexxar®)、利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan，Mabthera)、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)、達利珠單抗(Daclizumab)(Zenapax)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)(Mylotarg)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、CEA掃描Fab片段、OC125單株抗體、ab75705、B72.3、貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、伯舒替尼(Bosutinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、克卓替尼(Crizotinib)、達拉非尼(Dabrafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、迪奴圖單抗(Dinutuximab)、埃羅替尼(Erlotinib)、依維莫司(Everolimus)、依魯替尼(Ibrutinib)、伊馬替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、奧拉帕尼(Olaparib)、奧拉單抗(Olaratumab)、帕泊昔布(Palbociclib)、帕佐泮尼(Pazopanib)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、瑞戈非尼(Regorafenib)、蘆可替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦羅莫司(Temsirolimus)、曲美替尼(Trametinib)、凡德他尼(Vandetanib)、維羅非尼(Vemurafenib)、維莫德吉(Vismodegib)、巴利昔單抗(Basiliximab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、納武單抗(Nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、匹立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011)、AMP-224、MSB001078C、或MEDI4736、BMS-935559、LY3300054、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab)或為其抗原結合片段。
  121. 一種單價融合蛋白，其包含： (a) 如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽；及 (b) 用於偵測或純化該變異型ICOSL多肽之標記。
  122. 如請求項121之融合蛋白，其中該用於偵測或純化之標記選自聚組胺酸(His)標籤、FLAG標籤、Myc標籤或螢光蛋白標籤。
  123. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽、如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白或如請求項114至122中任一項之融合蛋白。
  124. 一種載體，其包含如請求項123之核酸分子。
  125. 一種細胞，其包含如請求項123之核酸分子或如請求項124之載體。
  126. 一種產生包含變異型ICOSL多肽之免疫調節蛋白的方法，其包含在宿主細胞中表現蛋白質之條件下，將如請求項123之核酸分子或如請求項124之載體引入至該細胞中。
  127. 如請求項126之方法，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  128. 如請求項126或127之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物。
  129. 如請求項128之方法，其中該宿主細胞為CHO DG44。
  130. 如請求項126至129中任一項之方法，其進一步包含自該細胞分離或純化該蛋白質。
  131. 一種藉由如請求項126至130中任一項之方法產生之蛋白質。
  132. 一種包含蛋白質之組合物，該蛋白質包含如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽或如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白，其中該組合物中該蛋白質或該免疫調節蛋白之至少95%、96%、97%、98%、99%之個別序列具有相同序列長度。
  133. 如請求項132之組合物，其中該蛋白質或免疫調節蛋白係自中國倉鼠卵巢細胞或其衍生物中純化。
  134. 一種聚核苷酸，其包含以下之核酸：編碼如請求項43或44之包含跨膜域之變異型ICOSL多肽的核酸及一或多種編碼重組抗原受體之一或多條鏈的核酸。
  135. 如請求項134之聚核苷酸，其中該重組抗原受體為嵌合抗原受體(CAR)或工程改造之T細胞受體(TCR)。
  136. 如請求項124或135之聚核苷酸，其中該編碼變異型ICOSL多肽的核酸及該一或多種編碼重組受體之一或多條鏈的核酸中之每一者係由編碼自體裂解肽或造成核糖體跳躍之肽的核酸分離。
  137. 一種工程改造細胞，其包含如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽、如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白或如請求項114至122中任一項之融合蛋白。
  138. 如請求項137之工程改造細胞，其中： 該編碼變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白之核酸編碼信號肽； 該變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白不包含跨膜域及/或不表現於該細胞之表面上；及/或 該變異型ICOSL多肽、免疫調節蛋白或融合蛋白係由該工程改造細胞分泌。
  139. 如請求項137之工程改造細胞，其中該工程改造細胞包含如請求項43或44之包含跨膜域之變異型ICOSL多肽。
  140. 如請求項137至139中任一項之工程改造細胞，其中該細胞為免疫細胞。
  141. 如請求項140之工程改造細胞，其中該免疫細胞為抗原呈遞細胞(APC)或淋巴細胞。
  142. 如請求項137至141中任一項之工程改造細胞，其為初生人類細胞。
  143. 如請求項137至142中任一項之工程改造細胞，其進一步包含嵌合抗原受體(CAR)或工程改造T細胞受體。
  144. 一種傳染媒介物，其包含編碼如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽或如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白或如請求項114至122中任一項之融合蛋白的核酸分子。
  145. 如請求項144之傳染媒介物，其中該傳染媒介物為細菌或病毒。
  146. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至44中任一項之變異型ICOSL多肽、如請求項45至112中任一項之免疫調節蛋白、如請求項113至122中任一項之結合物或融合蛋白或如請求項137至143中任一項之工程改造細胞或如請求項144或145之傳染媒介物。
  147. 如請求項146之醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  148. 一種製品，其在小瓶中包含如請求項146或147之醫藥組合物。
  149. 一種套組，其包含如請求項146或147之組合物或如請求項148之製品，及使用說明書。
  150. 一種調節個體免疫反應之方法，其包含向該個體投與如請求項146或147之醫藥組合物。
  151. 一種調節個體免疫反應之方法，其包含投與如請求項137至143中任一項之工程改造細胞。
  152. 如請求項151之方法，其中該等工程改造細胞為該個體之自體來源。
  153. 如請求項152之方法，其中該等工程改造細胞為該個體之同種異體來源。
  154. 如請求項150至153中任一項之方法，其中調節該免疫反應治療該個體之疾病或病況。
  155. 一種治療個體疾病或病況之方法，該方法包含向該個體投與如請求項146或147之醫藥組合物。
  156. 如請求項151至155中任一項之方法，其中該免疫反應在該個體中提高。
  157. 如請求項150及154至156中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含有包含連接至腫瘤定位部分之變異型ICOSL多肽的免疫調節蛋白或結合物。
  158. 如請求項157之方法，其中該腫瘤定位部分為識別腫瘤抗原之結合分子或包含識別腫瘤抗原之結合分子。
  159. 如請求項150及154至158中任一項之方法，其中包含如請求項77至112中任一項之免疫調節蛋白或如請求項113至122中任一項之結合物或融合蛋白的醫藥組合物，係投與至該個體。
  160. 如請求項150至158中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含工程改造細胞，該工程改造細胞包含之變異型ICOSL多肽為如請求項43或44之跨膜免疫調節蛋白。
  161. 如請求項150至160中任一項之方法，其中該疾病或病況為腫瘤或癌症。
  162. 如請求項150至161中任一項之方法，其中該疾病或病況係選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液學惡性病、肝癌、腦癌、腎癌、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨胳癌、頭頸癌、胃腸癌、生殖細胞癌或內分泌及神經內分泌癌症。
  163. 如請求項150至155中任一項之方法，其中該免疫反應減弱。
  164. 如請求項150至155及163中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含之變異型ICOSL多肽免疫調節蛋白為免疫調節Fc融合蛋白。
  165. 如請求項150至155、163及164中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含如請求項1至43中任一項之變異型ICOSL多肽或如請求項45至76中任一項之免疫調節蛋白。
  166. 如請求項150至155及163中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含有包含分泌型變異型ICOSL多肽之工程改造細胞，其投與至該個體。
  167. 如請求項150至155、163及166中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含如請求項137或138之工程改造細胞。
  168. 如請求項150至155及163中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含編碼變異型ICOSL多肽(其係分泌型免疫調節蛋白)之傳染媒介物，其視情況在其中該傳染媒介物感染腫瘤細胞或免疫細胞且由該經感染細胞分泌該分泌型免疫調節蛋白之條件下，投與至該個體。
  169. 如請求項150至155及163至168中任一項之方法，其中該疾病或病況為發炎性或自體免疫性疾病或病況。
  170. 如請求項150至155及163至169中任一項之方法，其中該疾病或病況為抗中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、血管炎、自體免疫皮膚病、移植、風濕性疾病、發炎性胃腸道疾病、發炎性眼病、發炎性神經疾病、發炎性肺病、發炎性內分泌疾病或自體免疫性血液學疾病。
  171. 如請求項169或170之方法，其中該疾病或病況係選自發炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。
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