BR112020007542A2 - proteínas imunomoduladoras ligantes de icos variantes e composições e métodos relacionados - Google Patents

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BR112020007542A2
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Lawrence Evans
Michael Kornacker
Ryan Swanson
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Alpine Immune Sciences, Inc.
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Abstract

a presente invenção refere-se a proteínas imunomoduladoras compreendendo variantes de icosl e ácidos nucleicos codificando tais proteínas. as proteínas imunomoduladoras proveem utilidade terapêutica para uma variedade de condições imunológicas e oncológicas. composições e métodos para produção e uso de tais proteínas são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTE-
ÍNAS IMUNOMODULADORAS LIGANTES DE ICOS VARIANTES E COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELACIONADOS". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de pa- tente provisório U.S. No. 62/574.161, depositado em 18 de outubro de 2017, intitulado "VARIANT ICOS LIGAND IMMUNOMODULATORY PROTEINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS", cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totali- dade.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. A Listagem de Sequên- cia é provida como um arquivo intitulado 761612002240SeqList.txt, criado em 13 de outubro de 2018, que é de 1.655.996 bytes de tama- nho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequência é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
CAMPO
[0003] A presente invenção refere-se a composições terapêuticas para modulação de resposta imune no tratamento de câncer e doen- ças imunológicas. Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se a variantes particulares de Ligante de ICOS (ICOSL) que exibem liga- ção aperfeiçoada, tal como afinidade de ligação ou seletividade aper- feiçoada com uma ou ambas as proteínas contrapartes de ligação cognatas ICOS ou CD28.
ANTECEDENTES
[0004] Modulação da resposta imune através de intervenção nos processos que ocorrem na sinapse imunológica (IS) formada por e en- tre células apresentando antígeno (APCs) ou células-alvo e linfócitos é de interesse médico grande. Mecanisticamente, proteínas de superfí- cie celular na IS podem envolver a interação coordenada e frequente- mente simultânea de alvos de proteína múltiplos com uma proteína única à qual eles se ligam. Interações de IS ocorrem em associação Íntima com a junção de duas células, e uma proteína única nesta es- trutura pode interagir com ambas uma proteína na mesma célula (cis) bem como uma proteína na célula associada (trans), provavelmente ao mesmo tempo. Embora sejam conhecidos agentes terapêuticos que podem modular a IS, agentes terapêuticos aperfeiçoados são neces- sários. São providas proteínas imunoterapêuticas, incluindo proteínas solúveis ou proteínas imunomoduladoras de transmembrana capazes de ser expressas em células, o que satisfaz tais necessidades.
SUMÁRIO
[0005] É provido aqui um polipeptídeo Ligante de ICOS (ICOSL) variante contendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é um domínio extracelular truncado compreendendo uma sequência contí- gua de aminoácidos compreendendo aminoácidos 1-112 e um trunca- mento C-terminal de pelo menos 25 aminoácidos com referência à se- quência de domínio extracelular de ICOSL mostrada na SEQ ID NO:
32. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o poli- peptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada ao(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de refe- rência ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s). Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL varian- te exibe ligação aumentada com o(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s).
[0006] Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, o trun-
camento C-terminal é de pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125 aminoácidos. Em algumas de qual- quer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em ou não tem um sítio de clivagem de protease mostrado como aminoácidos 204-209 de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de referência ICOSL contém a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 545. Em alguns aspectos, o po- lipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
[0007] É provido aqui um polipeptídeo Ligante de ICOS (ICOSL) variante contendo uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545. É também provido aqui um polipeptídeo Ligante de ICOS (ICOSL) variante contendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) de um poli- peptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em um ou mais aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 204-209 com referência à SEQ ID NO: 32. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL va- riante exibe ligação alterada com um ou mais de sua(s) contraparte(s) de ligação comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para a uma ou mais contraparte(s) de ligação. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL varian- te exibe ligação aumentada com uma ou mais de sua(s) contraparte(s) de ligação comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para a uma ou mais contraparte(s) de ligação.
[0008] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a alteração (por exemplo, modificação) inclui uma deleção de um ou mais aminoácidos contíguos correspondendo aos aminoácidos 204- 209 com referência à SEQ ID NO: 32. Em alguns casos, o polipeptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de aminoácidos mos- trada em qualquer um de SEQ ID NOS: 600-605. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 600-605.
[0009] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a alteração (por exemplo, modificação) inclui pelo menos uma substitui- ção de aminoácido em uma ou ambas as posições 207 e 208 corres- pondendo às posições mostradas na SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos, a pelo menos uma substituição de aminoácido é N207A, N207G e L208G ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
[0010] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL de referência contém a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 623-628. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL de referência consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qual- quer uma de SEQ ID NOS: 623-628.
[0011] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante exibe clivagem proteolítica reduzida quando expresso a partir de uma célula. Em alguns exemplos, a célula é uma célula de mamífero. Em alguns casos, a célula é uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou um derivado da mesma.
[0012] Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, a modi- ficação de aminoácido é uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido estão em uma posição correspondendo à(s) posição(ões) selecionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74,75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à SEQ ID NO:32. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de ami- noácido estão em uma posição correspondendo à(s) posição(ões) se- lecionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à SEQ ID NO:32.
[0013] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de M10OV, M10I, VI11E, S13G, E16V, S18R, A2OV, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, O37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R61S, R61C, Y62F, L67P, AT1IT, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L961, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, LI102R, G103E, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110D, V11ON, V110A, E1l11del, T113E, H115R, H115Q, V116A,
A117T, N119Q, F120l, S121G, V122A, V1I22M, F120S, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,1143V, 1143T, N1I44D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, NI55H, N155Q, K156M, D158G, L161P, LI161M, L166Q, N1I68Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V1I93M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, 1218T, 1218N, E220G, R221G, R2211, 1224V, T225A, N227K ou uma substituição de aminoácido con- servativa do mesmo.
[0014] Em alguma de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de M10OV, M10I, VI11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R268S, F27C, F27S, N30D, Y33del, O37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L961, V97A, LO8F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1O07A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E1l11del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N1190, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, NI55H, N155Q, K1I156M, D158G, L161M, L1I61P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, VI93M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T2258S, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
[0015] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido estão em uma posição correspondendo à(s) posição(ões) 52, 57 ou 100. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T ou Q100V. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T ou Q100V. Em alguns exemplos, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52Y/N57Y/ F138L/ L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/ C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y /Q100P, N528S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/ Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/1143T, N528/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/ Q133H, N52S/ N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/ L96F/L98F/ Q100R/ G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/ Q100R/V110D, N52H/ N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/ Q100R, N52H/N57Y/L74Q/ Q100R/VI10D, N52H/Q100R, N52H/ S121G, A2ZOV/N52H/N57Y/ Q100R/S109G, N52H/N57Y/R618/Q100R/ V110D/L173S, N52H/ N57Y/Q100R/V1I22A, N52H/N57Y/Q100R/
F1728S, N52H/N57Y, N528/ F120S, N52S/V97A, N528S/G72R, N528S/ ATIT/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/VIO7TA/FI20S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ Y152C/K156M/C198R, O37R/ N52H/N57Y/Q100R/V11ON/S142F/ C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/ F1728/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L961/ S109N/L1660Q, S18R/N528S/F93L/1143V/R221G, A2OT/N52D/Y146C/ Q164L, V11E/N30D/N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/ 12187, N52S/H94E/L961/V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/8126T/ W153R/1218N, M10V/S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/ N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/ T2258S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/F1728S/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ E135K/L1738/C198R, N52H/N57Y/VI10A/C198R/R2211, M101/S813G/ N52H/N57 Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/VI93M/C198R, N52H/ N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V11O0N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/ C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9OA, N3OD/K42E/N52S, N528S/F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V1I1O0D/H115R/C198R, — N528S/S54P, —T38P/N52S/N57D, N52H/ C140del/ T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/ R75Q/ Q100P/V110D, N52H/N57 Y/LT4Q/V110D/S192G, N52H/S121G/ C198R, N528S/F120S/N227K, N528S/A7 IT/A117T/T190A/C198R, T43A/ N52H/N57 Y/L74Q/D89G/V110D/F172S8, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/ S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/N154F/C198R/ R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q,
N52Q/ zZN84Q/N1I68Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/ N84Q/N1I55Q/N168Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, — N52Q/N84Q/ N119Q/N207Q, —N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y IF138L/L203P, —“Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728/C198R, N52H/V122A/ F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/N194D, — N52H/ N57Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57 Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N52S/ ESOA/H115R, N30D/K42E N528S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/ C198R/R2211, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N528S/ H115R/F172S/N194D, — N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, — N528S/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/ Q100P HI1II5R/F1I728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728S, — N52H/Q100R/ F1728/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/Q1008S, N52A/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/ N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/ N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/
Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q1008S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/ N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/ Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/ N57L/Q1008S, N52R/N57W/0100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/ N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578S/Q100G, N52S/N57L/ Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
[0016] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, NB528S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/ L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N528/Y152H, N52D/VI51A, — N52H/1143T, —N528/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, — N528/D158G, — N52D/Q133H, N52S/N57Y/ H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/ G103E/F120S, N528/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/ V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57 Y/LT4Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S8121G, A2ZOV/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57 Y/R618/Q100R/ V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/ F1728S, N52H/N57Y, N528S/F120S, N52S/V97A, N528S/G72R, N528S/ ATIT/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/ S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F1728/S192G/C198R,
F27S/N52H/N57Y/VI1ON, — N52S/H94E/L961/S109N/L166Q, —S18R/ N52S/F93L/I143V/R221G, A2Z2OT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/ N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N528S/H94E/L961/ V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S8126T/W153R/1218N, M10OV/ S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N528S/F120S/ N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/T2258S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/ L1738S/C198R, N52H/N57Y/V1I10A/C198R/R2211, M101I/S13G/N52H/ N57Y/D77G/V110A/H129P/1143V/F1728S/VI93M,C198R, — N52H/N57Y/ R61C/ Y62F/Q100R/V11ON/F1208S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9OA, N30D/K42E/N52S, N52S/ F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/ L102R/V110D/H115R/C198R, N528S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/ R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/ C198R, N528S/F120S/N227K, N528S/A71IT/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57 Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V1071/V110D/1154F/ C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/ N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/ N1550Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/ N207Q0, N52Q/N84Q/NI5SSQ/NI68Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/ N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, — N52Y/F138L/L203P, — N57Y/Q100R/ C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/
H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/143V/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728/C198R, N52H/V122A/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/1224V, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, N528S/E9O0A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221], N30D/K42E/N528S/H115R/ C198R, N30D/K42E/N528S/H115R/F172S/N194D, N528S/H115R/ F1208S/143V/C198R, N528S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100P/C198R, — N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/ Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F172S, N52H/Q100R/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/ Q100S, N52A/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/0100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S, N52S/N57M/Q1008, N52S/N57Y/Q1008, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008, N52R/N57W/0100K,
N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/ Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/ Q100P, N52V/ N57T/Q100L, N57Q/Q100P ou R26S/N52H/ N57Y/VI10D/T137A/ C198R.
[0017] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são N52H/Q100R. Em al- gumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO:567.
[0018] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são N52H/N57Y/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptí- deo ICOSL variante contém a sequência mostrada na SEQ ID NO:565.
[0019] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são N52L/N57H/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém a sequência mostrada na SEQ ID NO: 761.
[0020] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido é N52D. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL varian- te contém a sequência mostrada na SEQ ID NO: 548.
[0021] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido é N52H/N57Y/Q100P. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém a sequência mostrada na SEQ ID NO: 570.
[0022] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/NI168Q0, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N1I55Q/N168Q, N84Q/N1I68Q/N207Q, N84Q/
N155H/N2070, N1I55Q/NI68Q/N207Q, N119Q N1I55Q/N1680Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N1I55Q/N168Q, N84Q/N155Q/ N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q/N207Q ou F138L/L203P.
[0023] Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, 11437, 1143V, 1224V, KI56M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T, Q133H, R2211l, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, A117T, A20V, A71T, A91G, A91G, AES8D, C140del, C198R, D1I58G, D77G, D90K, E1176G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120l, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, 1118V, 1127T, 1143T, 1143V, 1154F, 1218N, 1218T, 1224V, KI56M, K169E, K366G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L961, L9BF, M10I, M1OV, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N168Q, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52V, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N578S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N840, Q100G, Q100N, Q100V, R221G, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S212G, S256G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T411, V1O7I, VI1OA, V11O0D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C ou Y152H.
[0024] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre
N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N528/C198R, N528S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, N528S/ R75Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/ Q100R/ V122A, N52H/N57Y/Q100R/F1728, N52H/N57Y/Q100R, N528S/ N194D, — N52H/N57Y/Q100R/L102R/V1I10D/H115R/C198R, —N528S/ E90A, N528/F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52Y/ — N57Y/Q100P/ F1728, — E16V/N52H/N57Y/Q100R/VI10D/H115R/Y152C/ — K156M/ F1728S/C198R, N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, N52H/ N57Y/ Q100P/C198R, — N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/ Q100R/ H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, Q100R, N52Y/ F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/L102R, H1II5R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F1728S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/ N43T F1728S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/C198R, N528S/E9OA/H115R, N30D/K42E/N52S/ H115R/C198R/R2211, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R, N30D/K42E/ N528S/H115R/F172S/N194D, N30D/K42E/N528S/H115R, N528S/E90A/ H115R, N30D/K42E/N528S/H115R, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/
Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/ N57W/Q100P, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/ Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/ N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ou N52T/N57K/Q100P; ou N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/ Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N528S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N528S/Y152H, N52H/1143T, N528/L80P, N528S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/ M18V/T1208S/T130A, L7OR/A91G/1118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/ ES81A/A91G/1118V/T1208S/1127T/ T130A, N638S/L7OQ/A91G/S114T/ 118V /T1208S/T130A, T411/A91G, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/ K93R/N122S/N178S, E8SD/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, AESSD/ K89R/D90K/ A91IG/F92Y/K93R, K3S6G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/ V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N528/F1208S/ N227K, N52S/N194D, N528/F1208S, N528/G72R, N528S/AT1T/A117T/ T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/ C198R/R221G, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, V11E/N30D/N52H/ N57Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N528S/H94E/L961/V122M, N52H/N57 Y/H94E/L961/F1201/S126T/W153R/1218N, M10V/S18R/ N30D/N528/S126R/T1398S/L203F, — S25G/N30D/N528S/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F1728/C198R, — S25G/F27C/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/ R221], M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/ V193M,C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R,
N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728S/C198R, N52S/H94E/L98F/ Q100R, N528/E90A, N528S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, N52Y/ N57Y/Q100P/F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, — N52S/H115R/F1208S/143V/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/ C1I98R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/ Q100R/ H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52S/H94E/L961/ S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/ S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A2ZOV/N52H/N57Y/ Q100R/S109G, — N52H/N57Y/Q100P/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/ L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/1224V, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R HI1I1I5R/F1728/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R — F1I72S/NI94D, — N52H/N57Y/H115R/F1728S/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/1143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/ K42E/N528/H115R/C198R R2211l, N528/E9OA/H115R, N30D/K42E/ N528S/H115R, N52S/H115R/F1728S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/ N207X, NI68X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X,
N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N1I55Q/N168Q, N52H/ N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q1008S, N52A/ N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/ Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S, N52S/N57M/Q1008S, N52S/N57Y/Q1008S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/Q1008, N52R/N57W/0100K, N52R/N57W, — N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ou N52T/N57K/Q100P. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada com o ectodomínio de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de referência ao mesmo ecto- domínio.
[0025] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionados de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, 1143V, 1224V, KI56M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, V110D, V122A, Y146C, Y152C ou T225A.
[0026] Em alguns exemplos, a uma ou mais modificações de ami- noácido são selecionadas dentre N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/Q100P,
N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S, N52S/N57M/Q1008, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q1008, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/0100K, N52R/N57W, — N52G/N57V, —N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N528/C198R, N528/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/11437, N528S/D158G, — N52D/Q133H, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/ 82126, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57 Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/ H115R/C198R, N528S/E90A, N52S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ Y152C/K156M/F1728S/C198R, N528S/H115R/F1208/1143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/ H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, —N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/ F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/L102R — H1II5R/F1728/C198R, —N52H/N57Y/Q100R/H115R F1728S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/
Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, — N52H/Q100R/H115R/ NM43T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E90A/ H115R ou N30D/K42E/N52S/H115R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante exibe liga- ção aumentada ao ectodomínio de ICOS e CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de referência aos mesmos ectodomí- nios.
[0027] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém a sequência de aminoácidos mos- trada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910, ou uma sequência de aminoá- cidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, o polipeptídeo ICOSL variante consiste na sequência de aminoá- cidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840- 843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qual- quer uma de SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-
853, 855, 857, 907, 910.
[0028] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas do polipeptídeo Ligante ICOS (ICOSL) variante contendo um domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específico do mesmo, ou ambos, o polipeptídeo ICOSL variante contém uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo de referência ICOSL ou um fragmento de ligação es- pecífica do mesmo correspondendo às modificações de aminoácido selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G6G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q1008S, Q100T ou Q100V com refe- rência à SEQ ID NO:32. Em algumas de qualquer uma das modalida- des providas, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecio- nadas dentre N52A/N57F/Q1008, N52A,/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/ N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S, N52S/N57M/Q1008S, N52S/N57Y/Q1008S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008S, N52R/N57W/0100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q1008S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G6G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, —N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
[0029] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL é um ICOSL de mamífero ou um fra- gmento de ligação específica do mesmo. Em alguns exemplos, o poli- peptídeo de referência ICOSL é um ICOSL humano ou um framgneto de ligação específica do mesmo.
[0030] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL contém (i) a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32; ou (ili) uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica do mesmo ou ambos. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o fragmento de ligação específica do domínio IgV ou domínio IgC tem um comprimento de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou mais aminoácidos; ou o fragmento de ligação específica do domínio IgV contém um comprimento que é pelo menos 80% do comprimento do domínio de IgV mostrado como aminoácidos 19-129 de SEQ ID NO: 5 e/ou o fragmento de ligação específico do domínio IgC compreende um comprimento que é pelo menos 80% do comprimento do domínio IgC mostrado como aminoácidos 141-227 de SEQ ID NO: 5. Em algu- mas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende o domínio IgV ou um fragmento especifi- co do mesmo e o domínio IgC ou um fragmento específico do mesmo.
[0031] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém a sequência de aminoácidos mos- trada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 638-685, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qual- quer uma das SEQ ID NOS: 638-685. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 638-685, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo me- nos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 638-
685.
[0032] Em qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém o domínio IgV ou um fragmento de ligação es- pecífica do mesmo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém a sequência de ami- noácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL va- riante consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781.
[0033] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção ICOSL do polipeptídeo ICOSL variante. Em alguns exemplos, o domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção ICOSL do polipeptídeo ICOSL variante.
[0034] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada ao ectodomínio de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referên- cia ICOSL para o mesmo ectodomínio. Em alguns aspectos, o polipep- tídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada ao(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referên-
cia ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s). Em alguns exemplos, a ligação é aumentada mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 ve- zes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes.
[0035] Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, o ICOS é um ICOS humano. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o CD28 é um CD28 humano.
[0036] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação diminuída ao ectodomínio de CTLA-4 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de refe- rência para o mesmo ectodomínio. Em alguns exemplos, a ligação é diminuida mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 ve- zes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes. Em qualquer uma das modalidades providas, o CTLA-4 é um CTLA-4 humano.
[0037] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a ligação alterada (aumentada ou diminuída) é afinidade de ligação alte- rada (aumentada ou diminuída). Em algumas de quaisquer tais moda- lidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende até 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácido, opcionalmente substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido. Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL variante exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipeptí- deo de referência ICOSL.
[0038] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é uma proteína solúvel. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL varian- te não tem um domínio de transmembrana e domínio de sinalização intracelular; e/ou quando expresso a partir de uma célula, o polipeptí-
deo ICOSL variante não é expresso na superfície da célula.
[0039] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém ainda domínio de transmembra- na. Em alguns casos, o domínio de transmembrana contém a sequên- cia de aminoácidos mostrada como resíduos 257-277 de SEQ ID NO: ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com resíduos 257-277 de SEQ ID NO: 5. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém ainda um domínio de sinalização citoplásmico ligado ao domínio de transmembrana. Em alguns casos, o domínio de sinalização citoplásmico contém a sequência de aminoácidos mostra- da como resíduos 278-302 de SEQ ID NO: 5 ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com resíduos 278-302 de SEQ ID NO: 5.
[0040] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é desglicosilado ou parcialmente desgli- cosilado comparado com a sequência de referência de ICOSL.
[0041] É provida aqui uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um do polipeptídeo ICOSL variante e uma porção de prolon- gamento de meia-vida. Em algumas de qualquer uma das modalida- des providas, a porção de prolongamento de meia-vida compreende um domínio de multimerização, albumina, um polipeptídeo de ligação de albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C-terminal (CTP) da su- bunidade beta de gonadotropina coriônica humana, polietileno glicol (PEG), sequências hidrofílicas não estruturadas longas de aminoáci- dos (XKTEN), hidroxietil amido (HES), uma molécula pequena de liga- ção à albumina ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, a porção de prolongamento de meia-vida é ou compreende Pro/Ala/Ser (PAS) e o polipeptídeo ICOSL variante é PASilado. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a porção de prolongamento de meia-vida contém a sequência mostrada na SEQ ID NO: 904.
[0042] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a porção de prolongamento de meia-vida é ou contém um domínio de multimerização. Em alguns casos, o domínio de multimerização é se- lecionado de uma região Fc de uma imunoglobulina, um zíper de leu- cina, um zíper de isoleucina ou um dedo-de-zinco. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL varian- te é ligado, diretamente ou indiretamente através de um ligante, ao domínio de multimerização.
[0043] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína imunomoduladora é um multímero contendo um primeiro poli- peptídeo ICOSL variante ligado a um primeiro domínio de multimeriza- ção e um segundo polipeptídeo ICOSL variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que os primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreen- dendo o primeiro e o segundo polipeptídeo ICOSL variante. Em alguns casos, o multímero é um dímero.
[0044] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o primeiro polipeptídeo ICOSL variante e o segundo polipeptídeo ICOSL variante são iguais. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o dímero é um homodímero. Em alguns casos, o dímero é um heterodímero.
[0045] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio de multimerização é ou contém uma região Fc de uma imuno- globulina. Em qualquer uma de qualquer uma das modalidades provi- das, a região Fc é de uma proteína imunoglobulina G1 (I9gG1) ou uma imunoglobulina G2 (IgG2). Em alguns exemplos, a proteína imunoglo- bulina é humana e/ou a região Fc é humana. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 227 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 227. Em alguns aspectos, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 226 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 226. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc exibe uma ou mais funções efetoras. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc exibe uma ou mais função efetora reduzida com- parado com uma região Fc do tipo selvagem, opcionalmente em que o Fc humano do tipo selvagem é de IgG1 humana.
[0046] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a uma ou mais função efetora é selecionada dentre citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxidez dependente de comple- mento, morte de célula programada e fagocitose celular. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc é uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido comparado com a região Fc do tipo selvagem.
[0047] Em alguns de qualquer um dos exemplos providos, a uma ou mais substituições de aminoácido da região Fc variante são seleci- onadas de N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/ L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, a região Fc variante contém ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em alguns aspectos, a região Fc contém a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 476-478 ou uma sequência de aminoácido que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 476-478 e contém as substituições de aminoácido. Em algumas de qualquer uma das moda- lidades providas, a região Fc contém K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
[0048] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc contém a sequência de sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 632-634 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qual- quer uma de SEQ ID NOS: 632-634 e contém as substituições de ami- noácido.
[0049] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 474 ou 637 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 474 ou 637 e con- tém as substituições de aminoácido.
[0050] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 478 ou SEQ ID NO: 634. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 477. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 633. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 474. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, a região Fc contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 637.
[0051] É provida aqui uma proteína imunomoduladora contendo (a) um polipeptídeo ICOSL variante contendo uma ou mais modifica- ções de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina
(I9SF) de um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada com o(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referên- cia ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s); e (b) uma região Fc variante contendo substituições de aminoácido selecionadas de N297G/K447del, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/K447del ou L234A/L235E/G237A/K447del comparado com IgG1 humana do tipo selvagem, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em alguns casos, a proteína imunomoduladora é um dímero. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc variante contém ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em alguns exemplos, a região Fc contém a sequência de se- quência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 632-634 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS:632-634 e contém as substituições de aminoácido. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a região Fc contém a sequência de sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 474 ou 637, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NOS: 474 ou 637 e contém as substituições de aminoácido.
[0052] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente através de um ligante, à região Fc variante. Em alguns exemplos, o ligante contém 1 a 10 aminoácidos. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o ligante é selecionado de ligante AAA, G4S (SEQ ID NO: 636), (G1S)2 (SEQ ID NO: 229) ou GSGGGGS (SEQ ID
NO: 635). Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o ligante é (G14S); (SEQ ID NO: 228).
[0053] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o ligante ÉAMAA. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, o ligante éG4S (SEQ ID NO:636). Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o ligante é (G4S)2 (SEQ ID NO:229). Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o ligante é GSGGGGS (SEQ ID NO: 635).
[0054] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas de uma proteína de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão de ICOSL variante-Fc, o polipeptídeo ICOSL variante é ou compreende um do- mínio IgV. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém modificações de aminoácido N52H/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 567. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém modificações de aminoácido N52H/N57Y/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 565. Em algumas de qualquer uma das modalidades pro- vidas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52L/N57H/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 761. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende modifi- cações de aminoácido N52H/N57Y/Q100P. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 570. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante que compreende a modificação de aminoácido é N52D. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo tem a se- quência mostrada em SEQ ID NO: 548.
[0055] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, é provida uma proteína de fusão de ICOSL variante-Fc que tem a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 928. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, é provida uma proteína de fusão de ICOSL variante-Fc que tem uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 928.
[0056] Em modalidades particulares, as proteínas imunomodulado- ras providas, tais como proteínas de fusão, por exemplo, proteínas de fusão de ICOSL variante-Fcs, se ligam a CD28 e ICOS. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ICOSL variante-Fc exibe afinida- de de ligação aumentada com CD28 e/ou ICOS comparado com prote- ína de fusão de ICOSL do tipo selvagem humana-Fc, por exemplo, contendo uma porção IgV de ICOSL mostrada na SEQ ID NO: 545 |i- gada através de um ligante, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 229, a uma região Fc. Em tal exemplo, a região Fc é um Fc inerte ou com menos ação efetora contendo as mutações L234A, L235E e L235E em um Fc de IgG1 humana, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 637.
[0057] É provida aqui uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes ligados a um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio da superfamília da imuno- globulina (I9SF). Em alguns casos, o domínio I9SF é modificado na afinidade e exibe ligação alterada a um ou mais de suas contraparte(s) de ligação congnatas comparado com o domínio IgSF não modificado ou do tipo selvagem. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio IgSF exibe ligação aumentada a uma ou mais de duas contraparte(s) de ligação cognata(s) comparado com o domínio IgSF não modificado ou do tipo selvagem.
[0058] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é um primeiro polipeptídeo variante ICOSL e o domínio I9SF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF de um segundo polipeptídeo ICOSL variante provido aqui, em que as primeira e segunda variantes de ICOSL são iguais ou diferentes.
[0059] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é capaz de se ligar especificamente a CD28 ou ICOSL e o domínio I9SF do segundo polipeptídeo é capaz de se ligar a uma contraparte de ligação que não uma especificamente ligada pelo polipeptídeo variante ICOSL. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio I9SF é de um membro da família B7.
[0060] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio I9SF é uma porção de localização de tumor que se liga a um ligante expresso em um tumor ou é uma porção de localização infla- matória que se liga a um ligante expresso em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório. Em alguns casos, o ligante é B7H6. Em al- guns exemplos, o domínio IgSF é de NKp30.
[0061] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio I9gSF do segundo polipeptídeo é ou compreende um domínio IlgV. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domí- nio I9gSF do segundo polipeptídeo é uma molécula de NKp30 variante contendo L30V/A6GOV/S64P/S86G. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio IgSF do segundo polipeptídeo tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 504.
[0062] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o domínio IgSF é ou compreende um domínio IgV. Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL variante é ou contém um domínio IgV.
[0063] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante é ou compreende um domínio IgV. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém modificações de aminoácido N52H/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptí- deo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 567. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptí- deo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52H/ N57Y/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 565. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoáci- do N52L/N57H/Q100R. Em algumas de qualquer uma das modalida- des providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostra- da na SEQ ID NO: 761. Em algumas de qualquer uma das modalida- des providas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52H/N57Y/Q100P. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 570. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante compreende a mo- dificação de aminoácido N52D. Em algumas de qualquer uma das mo- dalidades providas, o polipeptídeo tem a sequência mostrada em SEQ ID NO:548.
[0064] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína imunomoduladora compreende um domínio de multimeriza- ção ligado a um ou ambos do polipeptídeo ICOSL variante ou o se- gundo polipeptídeo compreendendo o domínio I9gSF. Em alguns casos, o domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante do mesmo com função efetora reduzida.
[0065] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína imunomoduladora é dimérica. Em alguns casos, a proteína imunomoduladora é homodimérica. Em alguns aspectos, a proteína imunomoduladora é heterodimérica.
[0066] É provido aqui um conjugado contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes providos ou qualquer uma da proteína imunomoduladora provida e uma porção heteróloga. Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, à porção heteróloga. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a porção de direcionamento é uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopar- tícula. Em alguns exemplos, a porção-alvo é uma proteína ou um pep- tídeo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o con- jugado é uma proteína de fusão.
[0067] É provida uma proteína de fusão contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes providos ou qualquer uma da proteína imunomoduladora provida e uma porção heteróloga. Em alguns casos, a porção é uma porção de direcionamento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula. Em alguns exemplos, a porção de direcionamento se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula imune. Em algumas de qualquer uma as mo- dalidades providas, a célula imune é uma célula apresentando antíge- no ou um linfócito. Em alguns casos, a porção de direcionamento é uma porção de localização de tumor que se liga a uma molécula na superfície de um tumor.
[0068] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a porção de direcionamento se liga a uma molécula HER1I/EGFR, HER2/ ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAMG, antíge- no de câncer 125 (CA125), alfa-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF (PDGFR; tal como PDGF-R a), PD-1, PD-L1, CTLA-A, receptor de IL-2, fator de crescimento endo- telial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de ligação a folato, gangliosídeos (tais como GD2, GD3, GM1 e GM2), receptor VEGF (VEGFR),VEGFR?2, VEGF-A, integrina aVB3, integrina a5B1, ERBB3, MET, IGFI1R, EPHA3S, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complexo de BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 6, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinases, re- ceptor de Efrina, Ligantes de Efrina, receptor de HGF, CXCRA, CXCRA, receptor de Bombesina, antígeno SK-1, Bcr-abl, RET, MET, TRHKB, TIE2, ALK, ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mMTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO ou B7-H6 (NCR3LG1). Em alguns aspec- tos, a porção de direcionamento se liga a PD-L1.
[0069] Em algumas de qualquer uma das modalidades provides, a porção de direcionameto é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno. Em algumas de qualquer uma das modalidades provides, o anticorpo é selecionado de cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Ado-trastuzumab entansina, Tositumomab (Bexxar O), Rituximab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetano (Ze- valin), Daclizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, fragmento Fab de varredura por CEA, anticorpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin O), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ceritinib, Crizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab (Unituxin!Y), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvati- nib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo!Y), Palbociclib, Pazopanib, Pertuzumab (Perjeta&), Ramucirumab (CyramzaO), Regorafenib, Ruxo- litinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Ve- murafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembro- lizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT-011), AMP-224, MSB001078C ou MEDI4736, BMS-935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ou durvalumab ou é um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0070] Em algumas de qualquer uma das modalidades provides, o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, ao terminal N da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno. Em alguns casos, o po- lipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, ao terminal C da cadeia pesada e/ou leve do anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno.
[0071] Em algumas de qualquer uma das modalidades provides, o conjugado é divalente, tetravalente, hexavalente ou octavalente. Em algumas de qualquer uma das modalidades provides, a porção heteró- loga é ou contém um marcador para detecção ou purificação do poli- peptídeo ICOSL variante.
[0072] É provida aqui uma proteína de fusão monovalente conten- do um polipeptídeo ICOSL variante contendo uma ou mais modifica- ções de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada ao(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s); e um marcador para de- tecção ou purificação do polipeptídeo ICOSL variante. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o marcador para detecção ou purificação é selecionado de um marcador poli-histidina (His), um marcador FLAG, um marcador Myc ou um marcador proteína fluores- cente.
[0073] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém uma ou mais modificações de aminoácido em uma posição correspodendo à(s) posicação(ões) sele- cionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47,
52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à SEQ ID NO:32. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante contém uma ou mais modificações de aminoácido que estão em uma posição correspondendo à(s) posi- ção(ões) selecionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com re- ferência à SEQ ID NO:32.
[0074] Em alguns casos, a uma ou mais modificações de aminoá- cido são selecionadas de M1O0V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A2ZOV, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, O37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N52K, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R618S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R750Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L961, V97A, LO98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1O07A, V1O07I, S109G, S109N, V110D, V11ON, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, S121G, V122A, V122M, F120S, S1261T, S126R, H129P,
S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,1143V, 1143T, N144D, Y146C, V1I151A, Y152C, Y152H,W153R, 154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, L161P, LI161M, L1660, N168Q, F1728S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S8212G, D217V, 1218T, 1218N, E220G, R221G, R2211, 1224V, T225A, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em alguns casos, a uma ou mais modificações de aminoácido são se- lecionadas de M10V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A2OV, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N528, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L961, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1IO7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11ON, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S81267, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N1I44D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, LI161P, Q164L, LI166Q, N1I68Q, F172S, L1738S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, VISSM, N1I94D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T2258, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
[0075] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL contém (i) a sequência de aminoáci-
dos mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32; ou (ili) uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica dos mesmos ou ambos.
[0076] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de amino- ácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 195, 545, 600-605 e 623-628. Em alguns aspectos, o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 32, 196, 545, 600-605 e 623-628.
[0077] É provida uma molécula(s) de ácido nucleico codificando qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes providos, proteínas imunomoduladoras ou proteínas de fusão. Em alguns casos, a(s) mo- lécula de ácido nucleico é ácido nucleico sintético. Em alguns exem- plos, a(s) molécula de ácido nucleico é cDNA.
[0078] É provido um vetor contendo qualquer uma da molécula(s) de ácido nucleico provida. Em alguns casos, o vetor é um vetor de ex- pressão. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o vetor é um vetor de expressão de mamífero ou um vetor viral.
[0079] É provida uma célula contendo qualquer um dos vetores providos. Em alguns casos, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a célula é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou um derivado da mes- ma.
[0080] É provido um método de produção de uma proteína imu- nomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL varian- tes, incluindo introdução de qualquer uma das moléculas de ácido nu- cleico providas ou vetores em uma célula hospedeira sob condições para expressar a proteína na célula. Em alguns exemplos, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em alguns casos, a célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês ou um derivado da mesma. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o método inclui ainda isolamento ou purificação da proteína a partir da célula.
[0081] É provida uma proteína produzida através de qualquer um dos métodos providos.
[0082] É provida uma composição contendo uma proteína conten- do qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes providos, ou prote- íÍnas imunomoduladoras, em que pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das sequências individuais da proteína ou da proteína imunomo- duladora na composição têm um comprimento de sequência idêntico, opcionalmente em que a composição é uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algu- mas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína ou proteí- na imunomoduladora é purificada a partir de Células de Ovário de Hamster Chinês ou um derivado das mesmas.
[0083] É provido um polinucleotídeo contendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo ICOSL variante contendo um domínio de transmembrana provido e um ou mais ácido nucleico codificando uma ou mais cadeia de um receptor de antígeno recombinante. Em alguns casos, o receptor de antígeno recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T engenheirado (TCR). Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, cada um do áci- do nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante e do um ou mais ácido nucleico codificando uma ou mais cadeia do receptor re- combinante é separado por um ácido nucleico codificando um peptí- deo de autoclivagem ou um peptídeo que causa salto de ribossomo.
[0084] Em alguns exemplos, o polinucleotídeo contém o ácido nu- cleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante, um ácido nucleico codificando um peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo e um ácido nucleico codificando um CAR. Em al- guns exemplos, o polinucleotídeo compreende o ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo ICOSL variante, um ácido nucleico codificando um primeiro peptídeo de autoclivagem e um peptídeo que causa pulo de ribossomo, um ácido nucleico codificando uma de uma cadeia TCRalfa engenheirada ou uma cadeia TCbeta engenheirada, um ácido nucleico codificando um segundo peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo, e um ácido nucleico codifican- do a outra da cadeia TCRalfa engenheirada ou a cadeia TORbeta en- genheirada. Em alguns aspectos, o primeiro e o segundo peptídeo de autoclivagem codificado são iguais. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o peptídeo de autoclivagem ou o peptídeo que causa salto de ribossomo é um T2A, um P2A, um E2A ou um F2A.
[0085] É provido um vetor contendo qualquer um dos polinucleotí- deos providos. Em alguns casos, o vetor é um vetor viral. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o vetor viral é um vetor retroviral ou um vetor lentiviral.
[0086] É provida uma célula engenheirada contendo qualquer um dos polinucleotídeos ou vetores providos. É também provida uma célu- la engenheirada contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL vari- antes, proteínas imunomoduladoras ou proteínas de fusão providos.
[0087] É provida uma célula engenheirada contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico ou os vetores providos. Em alguns casos, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão codifica um peptídeo de sinal. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão não contém um domínio de transmembrana e/ou não é ex- presso na superfície da célula. Em algumas de qualquer uma das mo-
dalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomo- duladora ou proteína de fusão é secretado a partir da célula engenhei- rada. Em alguns aspectos, a célula engenheirada contém um polipep- tídeo ICOSL variante contendo um domínio de transmembrana. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ICOSL variante é expresso na superfí- cie da célula.
[0088] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a célula é uma célula imune. Em alguns casos, a célula imune é uma célula apresentando antígeno (APC) ou um linfócito. Em alguns exem- plos, a célula engenheirada é uma célula primária. Em alguns casos, a célula é uma célula de mamífero. Em alguns casos, a célula é uma cé- lula humana. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o linfócito é uma célula T. Em alguns exemplos, a célula engenheirada é uma APC e a APC é uma APC artificial.
[0089] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a célula engenheirada contém ainda um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T engenheirado.
[0090] É provido um agente infeccioso contendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo ICOSL variante provido ou uma proteína imunomoduladora provida, uma proteína de fusão provi- da. Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL variante codificado, prote- íÍna imunomoduladora ou proteína de fusão não contém um domínio de transmembrana e/ou não é expressa na superfície de uma célula em que ela é expressa. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante codificado, proteína imuno- moduladora ou proteína de fusão é secretado a partir do agente infec- cioso quando ele é expresso. Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um domínio de transmembrana.
[0091] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o polipeptídeo ICOSL variante codificado é expresso na superfície de uma célula em que ele é expresso. Em alguns casos, o agente infecci- oso é uma bactéria ou um vírus. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o vírus é um vírus oncolítico. Em alguns exem- plos, o vírus oncolítico é um adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do herpes, Vírus Herpes Simplex, Vírus Estomático Vesticular, Reoví- rus, vírus da Doença de New Castle, parvovírus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesticular (VSV), vírus Coxsackie ou um vírus Vac- cinia.
[0092] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o vírus se direciona especificamente a células dendríticas (DCs) e/ou é trópico de célula dendrítica. Em alguns casos, o vírus é um vetor lenti- viral que é pseudotipificado com um produto de envelope do vírus Sin- dbis modificado. Em algumas de qualquer uma das modalidades pro- vidas, o agente infeccioso contém ainda uma molécula de ácido nu- cleico codificando um produto de gene adicional que resulta em morte de uma célula-alvo ou que pode aumentar ou reforçar uma resposta imune. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, o produto de gene adicional é selecionado de um agente anticâncer, agente metastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imu- nomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imune, um anticor- po, uma citocina, um fator de crescimento, um antígeno, um produto de gene citotóxico, um produto de gene proapoptótico, um produto de gene antiapoptótico, um gene degradante de matriz celular, genes pa- ra regeneração de tecido ou uma reprogramação de células somáticas humanas para pluripotência.
[0093] É provida uma composição farmacêutica contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes, proteínas imunomoduladoras, conjugados ou proteínas de fusão ou qualquer uma das células enge- nheiradas ou agentes infecciosos providos. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a composição farmacêutica contém um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a composição farmacêutica é estéril.
[0094] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, é provido um artigo de fabricação contendo a composição farmacêutica em um frasco. Em alguns casos, o frasco é vedado.
[0095] É provido um Kkit contendo qualquer uma das composições e instruções providas para uso. É também provido um kit contendo qualquer um dos artigos de fabricação providos e instruções para uso.
[0096] É provido um método de modulação de uma resposta imu- ne em um indivíduo, incluindo administração da composição farmacêu- tica ao indivíduo. É também provido um método de modulação de uma resposta imune em um indivíduo incluindo administrar as células en- genheiradas. Em alguns casos, as células engenheiradas são autólo- gas ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades pro- vidas, as células engenheiradas são alogênicas para o indivíduo.
[0097] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a modulação da resposta imune trata uma doença ou condição no indi- víduo. Em alguns aspectos, a resposta imune é aumentada.
[0098] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, uma proteína imunomoduladora ou conjugado contendo um polipeptí- deo ICOSL variante ligado a uma porção de localização de tumor é administrada ao indivíduo. Em alguns casos, a porção de localização de tumor é ou compreende uma molécula de ligação que reconhece um antígeno de tumor. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a molécula de ligação contém um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou compreende um domínio IgSF do tipo selvagem ou variante do mesmo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína imunomoduladora ou o conjuga- do ou proteína de fusão é administrado ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, um polipeptídeo ICOSL vari-
ante que é uma proteína imunomoduladora de transmembrana é ad- ministrado ao indivíduo. Em alguns casos, a célula engenheirada con- tendo um polipeptídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomo- duladora de transmembrana é administrada ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a doença ou condição é um tumor ou câncer. Em alguns exemplos, a doença ou condição é selecionada de melanoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga, um mal hematológico, câncer de fígado, câncer de cérebro, câncer renal, câncer de mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de ba- ço, câncer de próstata, câncer testicular, câncer ovariano, câncer ute- rino, carcinoma gástrico, um câncer músculo-esqueletal, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer gastrintestinal, um câncer de célula germinativa ou um câncer endócrino e neuroendócrino. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a resposta imune é dimi- nuída.
[0099] Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, um polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomoduladora que é solúvel é administrado ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a proteína imunomoduladora solúvel é uma pro- teína de fusão de Fc imunomoduladora. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, um polipeptídeo ICOSL variante provido, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão é administrado ao in- divíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, uma célula engenheirada contendo um polipeptídeo ICOSL variante secre- tável é administrada ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, uma célula engenheirada provida é administra- da ao indivíduo. Em algumas de qualquer uma das modalidades provi- das, um agente infeccioso codificando um polipeptídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomoduladora secretável é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula de tumor ou célula imune e a proteína imunomodu- ladora secretável é secretada a partir da célula infectada. Em algumas de qualquer uma das modalidades providas, a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune. Em alguns exem- plos, a doença ou condição é uma vasculite associada a anticorpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença in- flamatóriag astrintestinal, uma doença inflamatória do olho, uma doen- ça inflamatória neurológica, uma doença inflamatória pulmonar, uma doença inflamatória endócrina ou uma doença hematológica autoimu- ne. Em alguns casos, a doença ou condição é selecionada de doença inflamatória do intestino, transplante, doença de Crohn, colite ulcerati- va, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou psoríase.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00100] AFIG.1 mostra resultados de impedância refletindo a ativi- dade de morte citotóxica de células engenheiradas com um receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19 sozinho ou com um imuno- modulador de transmembrana exemplar TIP (CD80-TIP ou ICOSL-TIP) ou a proteína de transmembrana do tipo selvagem CD80 ou ICOSL correspondente seguindo cocultura com células expressando antígeno alvo. A impedância foi avaliada usando o Acea Real-Time Cell Analy- zer (RTCA), que mede as variações de impedância nos meios de cul- tura de uma placa microeletrônica de 96 cavidades (placa E).
[00101] AFIG.2A mostra que células T primárias são transduzidas eficazmente com vírus codificando ambas as proteínas CAR e TIP. Células T humanas primárias ativadas 48 horas com esferas anti-CD3 mais anti-CD28 e foram então transduzidas com um Lentivírus codifi- cando um CAR anti-CD19 com um repórter BFP, mais um segundo Lentivírus codificando um TIP ICOSL com um repórter GFP. O gráfico FACs mostra expressão de BFP no eixo y e expressão de GFP no eixo x e a porcentagem de células T que se encaixam em cada quadrante é indicada. Os resultados mostram que as culturas incluem células transduzidas apenas com CAR (quadrante esquerdo superior), células transduzidas apenas com TIP (quadrante direito inferior), células transduzidas com ambos os vírus (quadrante direto superior) e células que não foram transduzidas com nenhum (esquerdo inferior). Na FIG. 2B, TIPs expressos em células CAR-T proveem coestimulação para as células CAR-T. Células CAR-T com ou sem cotransdução de TIP fo- ram marcadas com Cell-Trace Far Red e incubadas com a linhagem de célula NALM6 CD19+ para atrair o CAR. Proliferação foi avaliada através da porcentagem de células expressando CAR que tinham dilu- ído o corante fluorescente. As células transduzidas com TIPs mutados mostraram uma proliferação aumentada de células T CAR+ compara- do com aquelas sem TIPs ou aquelas transduzidas com ICOSL do tipo selvagem. Células falso-transduzidas que não tinham expressão de CAR falharam em proliferar neste ensaio.
[00102] As FIGS.3A-3B demostram, através de liberação de citoci- na, a capacidade coestimuladora de ICOSL do tipo selvagem (WT) ou variante quando coimobilizado com anti-CD3. Anti-CD3 10 nM foi re- vestido úmido nas cavidades de placas de cultura de tecido de poliesti- reno de fundo plano de 96 cavidades com 40 nM (setas) ou 10 nM de ICOSL WT ou variante. 100.000 células de células T CD4* e CD8* pu- rificadas (pan) foram adicionadas e sobrenadante foi coletado 72 horas depois para análise ELISA quanto à liberação de citocina. A FIG. 3A mostra níveis de proteína IFN-gama e a FIG. 3B mostra de IL-17 se- cretadas de células T pan. Os gráficos são representativos de respos- tas de IFN-gana e IL-17 típicas de coestimulação de célula T pan.
[00103] As FIGS. 4A-4B demostram, através de proliferação, a ca- pacidade coestimuladora de ICOSL do tipo selvagem (WT) ou variante quando coimobilizado com anti-CD3. Células T pan marcadas com
CFSE foram incubadas em placas revestidas com anti-CD3 e ICOSL conforme anteriormente descrito por 72 horas. As células foram cole- tadas, lavadas, tingidas com anticorpos anti-CD4 ou anti-CD8 fluores- centemente conjugados e analisadas traves de citometria de fluxo. Tensões de portas e citômetro foram ajustadas usando células T mar- cadas com CFSE controle não estimuladas. Proliferação foi determi- nada através de diluição de CFSE do controle. A FIG. 4A mostra por- centagem de proliferação de células T total (setas), CD4* (barra sólida) e células CD8* (barra hachurada) seguindo coestimulação com ICOSL 40 nM. A FIG. 4B mostra porcentagem de proliferação de célula T pan total seguindo coestimulação com ICOSL 10 nM. Os gráficos são re- presentativos de resposta proliferativa típica de coestimulação de célu- la T pan.
[00104] AFIG.5 mostra função de candidato a vigD ICOSL em uma Reação-de Linfócito-Mista (MLR). Variantes de ICOSL e suas muta- ções são listadas no eixo x, junto com ICOSL do tipo selvagem, con- troles negativos PDL2-Fc e IgG humana, bem como a molécula de re- ferência controle positiva CTLA-Ig Belatacepte. A linha através do grá- fico representa a quantidade de linha basal de IFN-gama detectada nos sobrenadantes de culturas controle negativas. Para cada candida- to a variante de ou controle ICOSL, três concentrações diferentes fo- ram testadas com setas indicando a concentração mais alta de proteí- na em culturas a 40 nM. A maioria dos candidatos a variante de ICOSL mostram atividade antagonística superior em todas as três concentra- ções testadas comparado com belatacepte conforme refletido pela concentração menor de IFN-gama nessas culturas.
[00105] As FIGS. 6A-6D mostram a inibição de proteínas de fusão de ICOSL solúve-Fc em respostas de células B e T em um ensaio de cocultura B-T. A FIG. 6A mostra inibição de proteínas de fusão de ICOSL solúvel-Fc de proliferação de célula B acionada por célula T.
Células T CD4+ e células B purificadas de um único doador foram marcadas com CFSE e coincubadas em uma razão 1:1 na presença ou ausência dos mitógenos indicados com ou sem as proteínas de fu- são de ICOSL-Fc indicadas. As células foram estimuladas com a ente- rotoxina B Staph (SEB) a 100 ng/ml, mitógeno Pokweed (PWM) a 1 mg/ml ou ambos. Proteínas de fusão de ICOSL-Fc foram incluídas em uma concentração final de 40 nM e culturas foram incubadas por 7 di- as e submetidas à análise FACS. O número de células B divididas foi determinado a partir do número de células nas culturas que tinham di- luído seu CFSE. Todas as proteínas de fusão de ICOSL-Fc testadas exceto a do tipo selvagem reduziram proliferação de célula B. As FIGS. 6B-6D mostram que proteínas de fusão de ICOSL-Fc inibiram produção de citocina por célula T de citocina em coculturas B-T. So- brenadantes das culturas descritas acima foram coletados no dia 7 e analisados quanto ao teor de citocina usando LEGENDplex Human Th Cytokine Panel (Biolegend). Produção por célula T de IL-5 (FIG. 6B), IL-13 (FIG. 6C) e IL-21 (FIG. 6D) é atenuada por inclusão de proteínas de fusão de ICOSL-Fc.
[00106] As FIGS. 7A-7F mostram pontos finais diferentes em um modelo de camundongo de Doença Enxerto versus Hospedeiro (GVHD) onde células PBMC humanas foram adotivamente transferi- das para hospedeiros murinos NSG imunodeficientes. A FIG. 7A mos- tra curvas de sobrevivência dos animais tratados. Curso de doença agressivo e subsequente mortalidade foram observados nos animais controle com solução salina, com sobrevivência similar observada nos animais tratados com ICOSL do tipo selvagem-Fc, bem como a varian- te de ICOSL N52H/1143T. A variante N52H/N57Y/Q100P tinha taxas de sobrevivência aperfeiçoadas comparável à referência clínica bela- tacepte. A FIG. 7B mostra tendências similares em perda de peso cor- poral, com variante de ICOSL N52H/N57Y/Q100P demonstrando ma-
nutenção de peso similar aos animais tratados com belatacepte, em- bora todos os outros grupos tenham tido perda de peso rápida. A FIG. 7C mostra scores clínicos de observações de Índice de Atividade de Doença (DAI) GVHD padronizado, novamente mostrando scores me- nores em animais tratados com variante de ISCOL N52H/N57Y/Q100P que são comparáveis à referência clínica belatacepte enquanto os ou- tros grupos de animais tiveram scores de DAI maiores. A FIG. 7D mos- tra uma medição citométrica de fluxo de porcentagens de CD4 e CD8 em sangue de animais experimentais medidas no dia 14. A porcenta- gem de células CD8 entre grupos experimentais foi boa parte igual, no entanto, animais tratados com variante de ICOSL N52H/N57Y/Q100P e belatacepte tiveram porcentagens menores de células CD4 compa- rado com os outros grupos experimentais.
[00107] A FIG.7E mostra curvas de sobrevivência de um experi- mento similar testando moléculas variantes de ICOSL adicionais. À FIG. 7F mostra scores clínicos de um experimento similar testando moléculas variantes de ICOSL adicionais.
[00108] AFIG.8 mostra atividade coestimuladora localizada trans- mitida pela molécula de empilhamento variante indicada C-L vIgD, on- de C representa um domínio coestimulador de ICOSL e L representa um domínio de localização de NKp30. Neste ensaio, células K562 alvo expressando a proteína de superfície de localização, B7-H6, foram cul- turadas na presença de anti-CD3 com células T humanas e ativação de célula T foi avaliada através de níveis de IFN-gama em sobrena- dantes de cultura. Inclusão de anti-CD3 sozinha ou quaisquer molécu- las Fc variantes de empilhamento não induziu ativação de célula T. Similarmente, células culturadas com apenas o domínio NKp30 de lo- calização do tipo selvagem sozinho ou o domínio de ICOSL coestimu- lador do tipo selvagem sozinho como proteínas de fusão de Fc não resultou em ativação de célula T. Um domínio empilhado contendo a versão do tipo selvagem de ambos o domínio coestimulador e domínio de localização induziu IFN-gama mensurável na concentração mais alta testada, no entanto, um empilhamento coestimulador de localiza- ção de variante induziu mais de duas vezes os níveis de IFN-gama na concentração mais alta, e níveis de IFN-gama que foram ainda obser- vados como as concentrações foram titulados para menos.
[00109] A FIG.9 sumariza mudanças em espessura da orelha de camundongos de um modelo padrão de Hipersensibilidade do Tipo Retardada (DTH). Animais tratados com PBS sensibilizados com al- bumina e subsequentemente provocados na orelha com a mesma pro- teína mostram o nível mais alto de inchaço na orelha medido. Os ca- mundongos tratados com referência clínica Abatacepte têm inchaço na orelha ligeiramente reduzido seguindo provocação da orelha. Todos os cinco grupos de tratamento com variante de ICOSL demonstraram re- duções iguais ou aperfeiçoadas em inchaço na orelha comparado com Abatacepte.
[00110] As FIGS. 10A-10C mostram várias configurações exempla- res de um domínio IgSF variante (vlgD) conjugado a um anticorpo (V- Mab). A FIG. 10A mostra várias configurações em que um vIgD é liga- do, diretamente ou indiretamente, ao terminal N e/ou C da cadeia leve de um anticorpo. A FIG. 10B mostra várias configurações em que um vIgD é ligado, diretamente ou indiretamente, ao terminal N e/ou termi- nal C da cadeia pesada de um anticorpo. A FIG. 10C mostra as confi- gurações de V-Mab resultantes quando uma cadeia leve da FIG. 10A e uma cadeia pesada da FIG. 10B são coexpressas em uma célula.
[00111] As FIGURAS 11A-11B demonstram especificidade de V- Mab para contrapartes de ligação cognatas. Ensaios de ligação foram realizados em células Expi293 transientemente transfectadas com DNA para expressão na superfície de mamífero de HER2, CD28, CTLA-4 ou ICOS humanas. 200.000 células transfectadas foram incu-
badas com 100.000 pM a 100 pM de anticorpo parental (1) ou vários V-Mabs (C2-9). Anticorpo não ligado foi removido, anticorpo ligado de- tectado com IgG anti-humana fluorescentemente marcada e as células foram analisadas através de citometria de fluxo quanto à MFI e por- centagem positiva com base em controles de Fc. A FIG. 11A mostra ligação dos V-Mabs a transfectantes de HER2 em níveis similares ao anticorpo parental. Ligação a células falso transfectadas é observada com todos os V-Mabs, embora não ICOSL WT, devido a níveis baixos de expressão de HER2 endógena em células parentais Expi293. A FIG. 11B mostra que ligação do domínio I9gSF parental (N52H/N57Y/ Q100P) a suas contrapartes cognatas é mantida ou aumentada (C2, C3, C4, C5, C6, C8, C9) por V-Mabs.
[00112] A FIG. 12 demonstra capacidade coestimuladora e prolife- rativa de V-Mab quando coimobilizado com anti-CD3. Anti-CD3 10 nM foi revestido a úmido nas cavidades de placas de cultura de tecido de poliestireno de fundo plano de 96 cavidades com 30 nM a 3 nM de an- ticorpo parental, V-Mabs ou controles de Fc. Células T pan marcadas com CFSE foram adicionadas por 72 horas. Secreção de IFN-gama foi medida através de ELISA e proliferação de célula T total foi medida através de análise citométrica de fluxo de diluição de CFSE. Secreção de IFN-gama e proliferação de domínio IgSF (N52H/N57Y/Q100P) são maiores do que com ICOSL WT. V-Mabs demonstram capacidades proliferativa e coestimuladora de citocina aumentadas com relação a IgSF parental.
[00113] As FIGS.13A-13C mostram vários formatos das moléculas de domínio IgSF variante. A FIG. 13A mostra moléculas solúveis, in- cluindo: (1) um domínio IgSF variante (vlgD) fundido a uma cadeia de Fc; (2) uma molécula de empilhamento contendo um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vIgD) e um segundo domínio IgSF, tal como um segundo domínio IgSF variante (segundo vIgD); (3) uma molécula de IgSF de direcionamento a tumor contendo um primeiro domínio IgSF variante (vlIgD) e um domínio IgSF que se direciona a um antíge- no de tumor, tal como um domínio IGgSF de NKP30; e (4) um domínio IgSF variante (vIgD) ligado a um anticorpo (V-Mab). A FIG. 13B mostra uma proteína imunomoduladora de transmembrana (TIP) contendo um domínio IgSF variante (vIgD), por exemplo, ICOSL variante, expresso na superfície de uma célula. Em uma modalidade exemplar, a contra- parte de ligação cognata do vIgD ligado à transmembrana é um recep- tor coestimulador, por exemplo, CD28, e a TIP contendo o vIgD (por exemplo, vlgD de ICOSL) agoniza o receptor coestimulador de modo que a TIP induz um sinal positivo na célula expressando o receptor coestimulador. A FIG. 13C mostra uma proteína imunomoduladora se- cretada (SIP) em que um domínio IgSF variante (vIgD), por exemplo, ICOSL variante, é secretado de uma célula, tal como uma primeira cé- lula T (por exemplo, célula T CAR). Em uma modalidade exemplar, a contraparte de ligação cognata do vIgD secretado é um receptor de ativação, por exemplo, CD28, que pode ser expresso na primeira célu- la (por exemplo, célula T, tal como célula T CAR) e/ou em uma segun- da célula (por exemplo, célula T; ou endógena ou engenheirada, tal como uma célula T CAR). Quando da ligação da SIP com sua contra- parte de ligação cognata, sinalização através do receptor de ativação é bloqueada. Em todos os casos, o vlgD pode ser um domínio V (IgV) apenas, a combinação do domínio V (IgV) e domínio C (IgC), incluindo o domínio extracelular inteiro (ECD) ou qualquer combinação de domí- nios lg do membro da superfamília de IgSF.
[00114] A FIG. 14 mostra um esquema exemplar da atividade de um domínio IgSF variante (vlgD) fundido a um Fc (vlgD-Fc) em que o vIgD é uma variante de um domínio I9SF de ICOSL. Como mostrado, o vIgD de ICOSL interage com suas contrapartes de ligação cognatas para bloquear interações de CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) ou ICOSL com
CD28 ou ICOS, respectivamente, desta maneira bloqueando coestimu- lação pelos receptores coestimuladores CD28 e/ou ICOS.
[00115] A FIG.15 mostra um esquema exemplar de uma molécula de empilhamento para localização do domínio IgSF variante (vlIgD) pa- ra uma célula de tumor. Neste formato, a molécula de empilhamento contém um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vIgD) e um se- gundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo vIgD) em que o se- gundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo vIgD) é um domínio IgSF direcionado a tumor que se liga a um antígeno de tumor. Um do- mínio IgSF direcionado a tumor exemplar é um domínio IgSF de NKP30, que se liga ao antígeno de tumor B7-H6. Nesta mostra, o vlgD é uma variante de um domínio I9gSF de ICOSL. Como mostrado, liga- ção de domínio IgSF direcionado a tumor à superfície da célula de tu- mor localiza o primeiro vIgD na superfície de célula de tumor onde ele pode interagir com uma ou mais de suas contrapartes de ligação cog- natas (por exemplo, CD28 ou ICOS) expressas na superfície de uma célula imune adjacente (por exemplo, célula T) para estimular o recep- tor coestimulador.
[00116] A FIG. 16A mostra várias configurações exemplares de uma molécula de empilhamento contendo um primeiro domínio I9SF variante (primeiro vIgD), por exemplo, ICOSL variante, e um segundo domínio IgSF, tal como um segundo domínio IgSF variante (segundo vIgD). Como mostrado, o primeiro domínio vIlgD e o segundo IgSF são independentemente ligados, diretamente ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Para geração de uma molécula Fc homodi- mérica, a região Fc é uma que é capaz de formação de um homodíme- ro com uma subunidade Fc compatível através de coexpressão das regiões Fc individuais em uma célula. Para geração de uma molécula Fc heterodimérica, as regiões Fc individuais contêm mutações (por exemplo, mutações "knob-into-hole" no domínio CH3), de modo que formação do heterodímero é favorecida comparado com homodímeros quando as subunidades Fc individuais são coexpressas em uma célu- la.
[00117] A FIG. 16B mostra várias configurações exemplares de uma molécula de empilhamento contendo um primeiro domínio I9SF variante (primeiro vIgD), um segundo domínio IgSF, tal como um se- gundo domínio IgSF variante (segundo vIgD), e um terceiro domínio IgSF, tal como um terceiro domínio IgSF variante (terceiro vlgD). Como mostrado, os domínios primeiro vIgD, segundo IgSF e terceiro IgSF são ligados independentemente, diretamente ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Para geração de uma molécula Fc homodimérica, a região Fc é uma que é capaz de formar um homodí- mero com uma região Fc compatível através coexpressão das regiões Fc individuais em uma célula.
[00118] A FIG. 17 mostra um esquema exemplar da atividade de um domínio IgSF variante (vlgD) conjugado a um anticorpo (V-Mab) em que o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-HER2) se liga a um antígeno na superfície da célula de tumor. Nesta figura, o vlgD é uma variante de um domínio IgSF de ICOSL. Como mostrado, ligação do anticorpo à superfície da célula de tumor localiza o vlgD na superfície da célula de tumor onde ele pode interagir com um ou mais de suas contrapartes de ligação cognatas expressas na superfície de uma cé- lula imune adjacente (por exemplo, célula T) para agonizar sinalização de receptor. Em uma modalidade exemplar como mostrado, o domínio IgSF variante (vlgD) é uma variante de um domínio IgSF de ICOSL. Ligação do vIgD ICOSL a receptores coestimuladores CD28 ou ICOS provê um sinal agonista ou coestimulador.
[00119] AFIG.18 mostra a assinatura transcripcional Nanostring de células T humanas primárias quando incubadas 10 nM anti-CD3 com 40 nM de uma proteína controle de Fc, ICOSL do tipo selvagem-Fc,
CDB80 do tipo selvagem-Fc, ambas essas proteínas, ou proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc com mutações conforme indicado. RNA total de amostras foi preparado a partir de células coletadas e o RNA foi transferido para Nanostring e um Cancer Immune Chip foi usado para quantificar transcritos de 750 genes em cada amostra. Transcri- tos alterados incluíam aqueles cujo nível está acima ou abaixo da linha diagonal, incluindo os transcritos mencionados.
[00120] A FIG.19 mostra níveis de transcrito de transcritos exem- plares quando da incubação como descrito na FIG. 18 para os tempos indicados na presença das várias proteínas imunomoduladoras.
[00121] As FIGS. 20A-20B demonstram proliferação de célula T mediada por VmAb quando culturada com alvos expressando HER?2. Células T pan marcadas com CFSE foram ativadas com células-alvo artificiais derivadas de K562 exibindo Fc de cadeia simples anti-CD3 de superfície celular (OKT3) e HER2 na presença de Vmabs ou prote- ínas controle. Proliferação foi medida através de análise citométrica de fluxo de diluição CFSE em células T tingidas CD4* (painel da esquer- da) ou CD8* (painel da direita). Na FIG. 20A, células K562 foram titu- ladas e plaqueadas com células T para uma razão de efetora:alvo (E:T) de 40 a 1280:1. VmAbs, domínio IgSF parental ou ICOSL WT foram adicionados a 1000 pM. Na FIG. 20B, células K562 foram adici- onadas a células T para uma razão E:T de 160:1. VmAbs ou proteínas controle foram tituladas e adiciondas a 3000 a 37 pM.
[00122] AFIG.21 mostra os estudos de proliferação para células T transduzidas com várias proteínas imunomoduladoras de transmem- brana contendo domínio IgSF (TIPs) e TOCRs específicos de E6 re- combinantes exemplares em células T humanas primárias.
[00123] As FIGS.22A-22G mostram análise SEC de proteólise em moléculas de fusão de ICOSL variante-Fc contendo mutações N52H/N57Y/Q100R/F1728S geradas em várias sequências de referên-
cia, tal como fusão de ECD ICOSL truncado-Fc, uma fusão de Fc úni- co com domínio IgV ICOSL e/ou proteínas de fusão de ICOSL varian- te-Fc com mutações em N207G/L208G com referência à sequência de domínio extracelular (ECD) de ICOSL de referência mostrada na SEQ ID NO: 32. As moléculas foram expressas usando células derivadas de ExpicHO-S.
[00124] As FIGS. 23A-23B mostram a proliferação de células T hu- manas CD4 e CD8 estimuladas com células K652 expressando TIPs ICOSL variante contendo um ECD contendo um IgSF modificado em afinidade com mutações de aminoácido correspondendo àa N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283), e E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 300).
[00125] AFIG.24A mostra ligação de V-mAbs a HER2 e CD28. As FIGS. 24B-24F mostram resultados de coestimulação com VmMAb de células T usando um sistema de célula transfectada usando células Jurkat com um promotor repórter da luciferase de IL-2, mostrando que V-mAbs proveu um sinal coestimulador significante na presença de células HER2+ K562/OKT3.
[00126] As FIGS.25A-25D mostram ligação de moléculas de fusão de Fc de empilhamento a células expressando contrapartes de ligação cognatas B7H6 (FIG. 25A), ICOS (FIG. 25B), CD28 (FIG. 25C) e CTLA-4 (FIG. 25D).
[00127] As FIGS. 26A-26B mostram estudos de bioatividade para proteínas de empilhamento ICOSL/NKp30 testadas exemplares.
[00128] A FIG. 27 mostra proliferação induzida por proteínas de empilhamento ICOSL/NKp30 conforme medido através de análise ci- tométrica de fluxo de diluição de CFSE em células T tingidas com CD4+ ou CD8+.
[00129] AFIG.28 mostra efeitos antitumor da combinação da prote- ína de empilhamento ICOSL/NKp30 testada e mMAb mPD-1.
[00130] As FIGS. 29A-29E mostram atividade anti-inflamatória de dosagem profilática da molécula de fusão de IgV ICOSL-Fc exemplar no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), incluindo resultado de pata de soma média (FIG. 29A), IgG CIl detectada (FIG. 29B), ní- veis de citocina no soro (FIG. 29C, células T ativadas por CD44+ ou células Tru (FIG. 29D) e fração de células B no nó linfático de drena- gem (FIG. 29E).
[00131] As FIGS. 30A-30D mostram atividade anti-inflamatória de dosagem retardada da molécula de fusão de IgV ICOSL-Fc no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), incluindo resultado de pata de soma média (FIG. 30A) e níveis de citocina no soro (FIGS. 30C-30D).
[00132] As FIGS. 31A-31D mostram atividade anti-inflamatória de dosagem retardada da molécula de fusão de IgV ICOSL-Fc exemplar no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE), incluindo resultado de EAE (FIG. 31A), análise citométrica de fluxo de células T de nó linfático inguinal (FIG. 31C) e citocinas proinflamatórias (FIG. 31D).
[00133] As FIGS. 32A-32B mostram resultado de sobrevivência e DAI de camundongos com Doença Enxerto-versus-Hospedeiro (GvHD) tratados com várias doses (20, 100 ou 500 ug) de uma molé- cula de IgV ICOSL variante-Fc.
[00134] As FIGS.33A-33F mostram resultados de análise citométri- ca de fluxo de razão de Doença Enxerto-versus-Hospedeiro (GvHD) de células humanas/células de camundongo em sangue coletado (FIG. 33A) ou em contagem de célula T total (FIG. 33B) no final do estudo, e avaliação de células ICOS+ CD4+ ou CD8+ (FIG. 33C-33D) ou células CD28+ CD4+ ou CD8+ (FIGS. 33E-33F) de camundongos com Doen- ça Enxerto-versus-Hospedeiro (GvHD) tratados com várias doses (20,
100 ou 500 ug) de uma molécula de IgV ICOSL variante-Fc.
[00135] As FIGS. 34A-34B mostram expressão de marcadores de ativação ou exaustão de células T de camundongos com Doença En- xerto-versus-Hospedeiro (GvHD) tratados com várias doses (20, 100 ou 500 ug) de uma molécula de IgV ICOSL variante-Fc.
[00136] AFIG.34C mostra a razão de células T efetoras (Tef) para células T reguladoras (Treg) de camundongos com Doença Enxerto- versus-Hospedeiro (GvHD) tratados com várias doses (20, 100 ou 500 vg) de uma molécula de IgV ICOSL variante-Fc.
[00137] As FIGS. 35A-35D mostram citocinas proinflamatórias do soro de camundongos com Doença Enxerto-versus-Hospedeiro (GvHD) tratados com várias doses (20, 100 ou 500 ug) de uma molé- cula de IgV ICOSL variante-Fc. A FIG. 35E mostra exposição a soro de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) no modelo de GVHD comparado com camundongos normais.
[00138] A FIG.36A mostra resultados de DAI e a FIG. 36B mostra resultados de histologia de tratamento com uma IgV ICOSL variante- Fc exemplar sobre índice de atividade de doença (DAI) calculado a partir do peso corporal e scores de fezes em um modelo de colite in- duzida por CD4+CD45RBalto.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00139] São providas aqui proteínas imunomoduladoras que são ou compreendem variantes ou mutantes de ligante de ICOS (ICOSL) ou fragmentos de ligação específicos dos mesmos que exibem atividade para se ligar a pelo menos uma contraparte de ligação cognata de li- gante alvo (também chamada proteína de contraestrutura). Em algu- mas modalidades, os polipeptídeos ICOSL variantes contêm uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, dele- ções ou adições de aminoácido) comparado com um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva-
gem. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de ami- noácido (por exemplo, substituições, deleções ou adições de aminoá- cido) são em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe atividade de ligação ou afinidade alterada, tal como aumentada ou diminuída, com pelo menos uma contraparte de ligação cognata, tal como pelo menos um de ICOD, CD28 ou CTLA-4. Em algumas modalidades, as proteínas imu- nomoduladoras são solúveis. Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras são proteínas imunomoduladoras de transmem- brana capazes de ser expressas na superfície de células. Em algumas modalidades, são também providas aqui uma ou mais outras proteínas imunomoduladoras que são conjugados ou fusões contendo um poli- peptídeo ICOSL variante provido aqui e uma ou mais outra porção ou polipeptídeo.
[00140] Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL varian- tes e as proteínas imunomoduladoras modulam uma resposta imune imunológica, tal como uma resposta imune aumentada ou diminuída. Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL variantes e proteí- nas imunomoduladoras providos aqui podem ser usados para o trata- mento de doenças ou condições que estão associadas com uma res- posta imune desregulada.
[00141] Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL variantes providos modulam a ativação de célula T através de interações com moléculas de sinalização coestimuladoras. Em geral, ativação de célu- la T específica de antígeno requer dois sinais distintos. O primeiro si- nal é provido pela interação do receptor de célula T (TOR) com antíge- nos associados ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) presentes em células apresentando antígeno (APCs). O segundo sinal é coestimulador para atração de TCR e necessário para evitar apopto- se ou anergia de célula T.
[00142] Em algumas modalidades, sob condições fisiológicas nor- mais, a resposta imune mediada por célula T é iniciada por reconhe- cimento de antígeno pelo receptor de célula T (TOR) e é regulada por um equilíbrio de sinais coestimuladores e inibidores (por exemplo, re- ceptores de ponto de checagem imune). O sistema imune se baseia em receptores de ponto de checagem imune para prevenir autoimuni- dade (isto é, autotolerância) e proteger tecidos de dano excessivo du- rante uma resposta imune, por exemplo, durante um ataque contra uma infecção patogênica. Em alguns casos, no entanto, essas proteí- nas imunomoduladoras podem ser desreguladas em doenças e condi- ções, incluindo tumores, como um mecanismo para evadir o sistema imune.
[00143] Em algumas modalidades, dentre os receptores coestimu- ladores de célula T conhecidos está CD28, que é o receptor coestimu- lador de célula T para os ligantes B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) ambos estão presentes em APCs. Esses mesmos ligantes também se ligam ao receptor de célula T inibidor CTLA-4 (proteína 4 associada a linfóci- to T citotóxico) com maior afinidade do que para CD28; a ligação a CTLA-4 age para modular para baixo a resposta imune. ICOS (coesti- mulador induzível) é um outro receptor coestimulador de célula T que se liga a ligante de ICOS (ICOSL) em APCs. Em alguns casos, CD28 e CTLA-4 também são conhecidas interagir com ICOSL em um sítio de ligação que se sobrepõe com a ligação de ICOSL ao receptor coesti- mulador de célula T ICOS (Yao e outros (2011) Immunity, 34:729-740). Embora CD28 e ICOS sejam receptores de ativação da família CD28 relacionados e compartilhem alguns motivos de sinalização intracelu- lar, efeitos coestimuladores entre CD28 e ICOS diferem. Por exemplo, CD28 é expressa em ambas as células T não ativadas e ativadas e sua sinalização é importante para produção de IL-2 e subsequente função efetora de célula T. ICOS geralmente não é expresso na super- fície de células T até após ativação de célula T, e sinalização através de ICOS em células T ativadas apoia diferenciação de subconjunto de célula T especializada. Desta maneira, em alguns casos, coestimula- ção por CD28 e ICOS provê sobreposição e efeitos complementares.
[00144] Em alguns aspectos, as células T expressam as moléculas coestimuladoras CD28 e ICOS, que interagem com CD80/CD86 e ICOS, respectivamente, em células apresentando antígeno (APC). Em órgãos linfoides, APC profissional (isto é, células dendríticas, macrófa- gos e células B) expressam CD80, CD86 e ICOSL e envolvem células T CD28+/ICOS+. Em algumas modalidades, células T ativadas podem então diferenciar em células efetoras tais como células T citotóxicas CD8+ (CTL), células Th17CDA4+ secretando IL-17A/F ou células auxili- ares foliculares CD4+ (Trx). CD40L expressando Trn envolve células B em folículos linfoides e libera citocinas (por exemplo, I1L-21) induzindo diferenciação de células B para células de plasma secretanto anticorpo (Ab). Células de plasma podem produzir anticorpos de dano a tecido, por exemplo, fator reumatoide (RF) e anticorpos de peptídeo anticitru- lina (ACPA) em humanos, e anticorpos anticolágeno (CIl) em camun- dongos, que podem formar complexos imunes e depósitos nas articu- lações e outros tecidos. ICOSL pode também ser expresso em APCs não profissionais, levando à ativação de célula T em tecidos não linfoi- des e mais dano aos tecidos e articulações.
[00145] Em alguns aspectos, células CD4+Th1-, Th9- e TH17 são implicadas como contribuintes-chaves para esclerose múltipla (MS) através do aumento da inflamação dentro do SNC em ambas esclero- se múltipla e encefalomielite autoimune experimental e células auxilia- res foliculares CD4+ICOS+CXCR5 são aumentadas em PBMC em re- lapso-remissão e se relacionam com progressão de doença em MS progressiva secundária. Em algumas modalidades, há expressão de gene ICOS significantemente aumentada em células de fluido cere- broespinhal, em MS progressiva secundária e uma porcentagem au- mentada de monócitos totais e monócitos expressando ICOSL é ob- servada. ICOSL também expresso em APCs não profissionais, levan- do à ativação de célula T em tecidos não linfoides e dano a tecido adi- cional.
[00146] Dentre os polipeptídeos ICOSL variantes providos estão polipeptídeos que, quando modificados por uma ou mais modificações de aminoácido de um domínio IgSF de um polipeptídeo ICOSL de refe- rência, exibem afinidade de ligação aumentada com CD28 e/ou ICOS. Em alguns casos, o aumento total em ligação a ICOS em variantes providas é menos do que o aumento em ligação a CD28 porque ICOSL do tipo selvagem já demonstra substancialmente mais afinida- de de ligação com ICOS do que CD28. São também providos vários formatos dos polipeptídeos variantes providos. Como mostrado aqui, formatos alternativos podem facilitar a manipulação da resposta imune e, desta maneira, a aplicação terapêutica. Por exemplo, administração de proteínas ICOSL melhoradas em formatos solúveis é mostrada aqui antagonizar ativação de célula T através da inibição da sinalização de CD28 e/ou ICOS. Em outros exemplos, ligação das moléculas de ICOSL variante a uma superfície facilita ativação de célula T ao prover um sinal coestimulador. Várias estratégias de ligação são providas pa- ra localizar administração de um sinal coestimulador de célula T inclu- indo, mas não limitado a, revestimento direto a plástico, uso de um ou- tro domínio IgSF variante para localizar em um alvo de proteína ligado à placa ou expresso na superfície celular, ou fusão do ICOSL variante a um anticorpo monoclonal específico de tumor.
[00147] Em algumas modalidades, a modulação de sinalização imune obtida pelos polipeptídeos ICOSL variantes providos e polipep-
tídeos imunomoduladores oferece vantagens para tratamento de dis- túrbios inflamatórios e autoimunes e outras doenças e condições com- parado com outros tratamentos. Em alguns casos, terapias para inter- vir e alterar os efeitos coestimuladores de ambos os receptores são limitadas pelas exigências de orientação espacial bem como limitações de tamanho impostas pelos confins da sinapse imunológica. Em al- guns aspectos, fármacos terapêuticos existentes, incluindo fármacos de anticorpo, podem não ser capazes de interagir simultaneamente com as proteínas-alvo múltiplas envolvidas em modulação dessas inte- rações. Ainda, em alguns casos, fármacos terapêuticos existentes po- dem ter apenas a habilidade em antagonizar, mas não agonizar, uma resposta imune. Ainda, diferenças farmacocinéticas entre fármacos que se direcionam independentemente a um ou outro desses dois re- ceptores podem criar dificuldades em manter apropriadamente uma concentração desejada no sangue de tais combinações de fármaco durante o curso de tratamento.
[00148] Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL varian- tes ou proteínas imunomoduladoras providos modulam (por exemplo, aumentam ou diminuem) atividade imunológica induzida por recepto- res coestimuladores CD28 ou ICOS. Desta maneira, em algumas mo- dalidades, os polipeptídeos providos superam essas limitações ao pro- ver ICOSL variante (ligante coestimulador induzível) com afinidades de ligação alteradas (por exemplo, aumentadas ou diminuídas) com am- bos CD28 e ICOS, e, em alguns casos, CTLA-4, desta maneira agoni- zando ou antagonizando os efeitos complementares de coestimulação por receptores. Métodos de produção e uso desses ICOSL variantes são também providos.
[00149] Em alguns aspectos, as moléculas providas também podem ser mais eficazes do que outros agentes de proteína terapêuticos so- lúveis. Por exemplo, abatacepte (CTLA-4-Fc) foi mostrado interferir com coestimulação de célula T para atenuar respostas de célula T em ambientes de doença autoimune, tal como para o tratamento de artrite reumatoide, artrite psoriática e artrite idiopática juvenil, e belatacepte, uma molécula de CTLA variante-4-Fc, para rejeição de transplante. Essas proteínas CTLA-4-Fc, no entanto, se ligam a CD80 e CD86 e evitam que esses ligantes coestimuladores se envolvam e disparem apenas CD28. Polipeptídeos ICOSL variantes providos aqui, em al- guns casos, exibem afinidade de ligação e atividade aumentada para ambos CD28 e ICOS.
[00150] Ainda, a habilidade de formatar os polipeptídeos variantes em várias configurações para, dependendo do contexto, antagonizar ou agonizar uma resposta imune, oferece flexibilidade em aplicações terapêuticas com base nas mesmas ligação e atividade aumentadas de um ICOSL variante para contrapartes de ligação. Em algumas mo- dalidades, o formato particular pode ser escolhido para a aplicação terapêutica desejada. Por exemplo, como descrito, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um polipepetídeo ICOSL variante é provido em formato, por exemplo, como uma proteína de fusão de Fc, para antagonizar ou bloquear atividade de sua contraparte de ligação cognata, por exemplo, ICOS e/ou CD28. Em algumas modalidades, bloqueio ou inibição de sinalização coestimuladora por meio de CD28 ou ICOS pode ser útil para suprimir uma resposta imune, que pode ser útil no tratamento de distúrbios inflamatórios ou autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla ou inflamação cerebral) ou transplante de órgão. Como um exemplo, ligação de proteínas ICOSL variante a uma superfície pode administrar um sinal coestimulador localizado que, em alguns aspectos, pode ser usado para se direcionar a tecido de tumor para administrar coestimulação localizada para células T de infiltração em tumor. A maioria dos tumores primários carece de expressão de moléculas coestimuladoras tal como CD80, CD86 ou ICOSL, e então respostas antitumor de célula T podem ser comprometidas por uma falta de coestimulação (Yu e outros (1998) /nt. Immunol. 10:791-797). Ao localizar domínios coestimuladores em células de tumor usando uma porção de localização de tumor, tal como NKp30 localizada em células de tumor B7H6 ou um anticorpo específico de tumor, respostas de célula T podem ser melhoradas na ausência de proteínas coestimu- ladoras expressas em tumor.
[00151] Todas as publicações, incluindo patentes, pedidos de pa- tente e artigos científicos e bancos de dados, mencionadas no presen- te pedido são aqui incorporadas a título de referência em sua totalida- de para todos os propósitos até o mesmo ponto como se cada publi- cação individual, incluindo patente, pedido de patente, artigo científico ou bancos de dados, fosse especificamente e individualmente indicada ser incorporada a título de referência. Se uma definição mostrada aqui for contrária a ou de outro modo inconsistente com uma definição mos- trada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que são aqui incorporados a título de referência, a definição mostrada aqui prevalece em relação à definição que é incorporada aqui a título de referência.
[00152] Os cabeçalhos de seção usados aqui são para propósitos de organização apenas e não pretendem ser limitantes da matéria ob- jeto descrita. |. DEFINIÇÕES
[00153] A menos que de outro modo definido, todos os termos da técnica, notações e outros termos técnicos e científicos ou terminolo- gia usados aqui pretendem ter o mesmo significado como é comumen- te compreendido por um versado comum na técnica à qual a matéria objeto reivindicada pertence. Em alguns casos, termos com significa- dos comumente compreendidos são definidos aqui para clareza e/ou para referência de leitura, e a inclusão de tais definições aqui não deve ser necessariamente considerada representar uma diferença substan- cial do que é geralmente compreendido na técnica.
[00154] Os termos usados em todo o presente pedido são definidos como segue a menos que de outro modo limitado em casos especiífi- cos. Como usado no relatório e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. A menos que de outro mo- do definido, todo os termos técnicos e científicos, acrônimos e abrevi- ações usados aqui têm o mesmo significado como geralmente conhe- cido por um versado comum na técnica à qual a invenção pertence. À menos que de outro modo indicado, abreviações e símbolos para no- mes químicos e bioquímicos são de acordo com a nomenclatura IUPAC-IUB. A menos que de outro modo indicado, todas as faixas nu- méricas são inclusivas de valores definindo a faixa bem como todos os valores inteiros entre eles.
[00155] O termo "com afinidade modificada" como usado no contex- to de um domínio da superfamília da imunoglobulina significa um do- mínio da superfamília da imunoglobulina de mamífero (I9SF) tendo uma sequência de aminoácido alterada (em relação ao domínio IgSF parental ou não modificado do tipo selvagem correspondente) de mo- do que ele tenha uma afinidade ou avidez de ligação aumentada ou diminuída com pelo menos uma de suas contrapartes de ligação cog- natas (alternativamente "contraestruturas") comparado com o domínio controle IgSF do tipo selvagem ou não modificado parental (isto é, sem afinidade modificada). Incluído neste contexto está um domínio IgSF ICOSL com afinidade modificada. Em algumas modalidades, o domí- nio I9SF com afinidade modificada pode conter 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais diferenças de aminoácido, tais como substituições de aminoácido, em um domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
Um aumento ou diminuição em afini- dade ou avidez de ligação pode ser determinado usando ensaios de ligação bem conhecidos tal como citometria de fluxo.
Larsen e outros, American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Vide tam- bém Linsley e outros, Immunity, Vol. 1: 793-801 (1994). Um aumento em afinidade ou avidez de ligação de proteína à sua(s) contraparte(s) de ligação cognata(s) é para um valor pelo menos 10% maior do que aquele do controle do domínio IgSF do tipo selvagem e em algumas modalidades pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000% ou 10000% maior do que aquele do valor con- trole de domínio IgSF do tipo selvagem.
Uma diminuição em afinidade ou avidez de ligação de uma proteína com pelo menos uma de sua contraparte de ligação cognata é para um valor não mais do que 90% do controle, mas não menos do que 10% do valor controle de domínio IgSF do tipo selvagem, e em algumas modalidades não mais do que 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% mas não menos do que 10% do valor controle de domínio IgSF do tipo selvagem.
Uma proteína com afinidade modificada é alterada em sequência de aminoácido pri- mária através de substituição, adição ou deleção de resíduos de ami- noácido.
O termo "domínio I9SF com afinidade modificada" não deve ser considerado como impondo qualquer condição para qualquer com- posição de partida particular ou método através do qual o domínio IgSF com afinidade modificada foi criado.
Desta maneira, os domínios IgSF com afinidade modificada da presente invenção não são limita- dos a domínios IgSF do tipo selvagem que são então transformados para um domínio IgSF com afinidade modificada por qualquer proces- so particular de modificação de afinidade.
Um polipeptídeo de domínio IgSF com afinidade modificada pode, por exemplo, ser gerado partindo de informação de sequência de domínio I9gSF de mamífero do tipo sel- vagem, então modelado in silico para ligação à sua contraparte de |li-
gação cognata e finalmente recombinantemente ou quimicamente sin- tetizado para prover a composição de matéria de domínio IISF com afinidade modificada. Em apenas um exemplo alternativo, um domínio IgSF com afinidade modificada pode ser criado por mutagênese dire- cionada a sítio de um domínio I9SF do tipo selvagem. Desta maneira, domínio I9gSF com afinidade modificada denota um produto e não ne- cessariamente um produto produzido por qualquer dado processo. Uma variedade de técnicas incluindo métodos recombinantes, síntese química, ou combinações dos mesmos, pode ser empregada.
[00156] O termo "alogeneico" como aqui usado significa uma célula ou tecido que é removido de um organismo e então infundido ou adoti- vamente transferido para um organismo geneticamente diferente da mesma espécie. Em algumas modalidades da invenção, a espécie é murino ou humano.
[00157] O termo "autólogo" como aqui usado significa uma célula ou tecido que é removido do mesmo organismo para o qual ele é mais tarde infundido ou adotivamente transferido. Uma célula ou tecido au- tólogo pode ser alterado através de, por exemplo, metodologias de DNA recombinante, de maneira que ele não é mais geneticamente idêntico à célula nativa ou tecido nativo que é removido do organismo. Por exemplo, uma célula T autóloga nativa pode ser geneticamente engenheirada através de técnicas de DNA recombinante para se tor- nar uma célula engenheirada autóloga expressando uma proteína imunomoduladora de transmembrana e/ou um receptor de antígeno quimérico (CAR), o que em alguns casos envolve engenharia de uma célula T ou TIL (linfócito de infiltração em tumor). As células engenhei- radas são então infundidas em um paciente do qual a célula T nativa foi isolada. Em algumas modalidades, o organismo é humano ou muri- no.
[00158] Os termos "afinidade de ligação" e "avidez de ligação" co-
mo aqui usado significam a afinidade de ligação específica e avidez de ligação específica, respectivamente, de uma proteína com sua contra- estrutura sob condições de ligação específicas. Em cinética bioquímica avidez refere-se à resistência acumulada de afinidades múltiplas de interações de ligação não covalente individuais, tal como entre ICOLS e sua contraestrutura ICOS e/ou CD28. Desta maneira, avidez é distin- ta de afinidade, que descreve a resistência de uma interação única. Um aumento ou atenuação em afinidade de ligação de um ICOSL va- riante contendo um domínio I9SF com afinidade modificada com sua contraestrutura é determinada em relação à afinidade de ligação do ICOSL não modificado, tal como um ICOSL não modificado contendo o domínio IgSF nativo ou do tipo selvagem, tal como domínio IgV. Mé- todos para determinação de afinidade ou avidez de ligação são conhe- cidos na técnica. Vide, por exemplo, Larsen e outros, American Jour- nal of Transplantation, Vol. 5: 443-453 (2005). Em algumas modalida- des, um ICOSL variante da invenção (isto é, uma proteína ICOSL con- tendo um domínio I9gSF com afinidade modificada) se liga especifica- mente a CD28 e/ou ICOS medido através de citometria de fluxo com uma afinidade de ligação que provê um valor de Intensidade de Fluo- rescência Média (MFI) pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior do que um controle de ICOSL do tipo selvagem em um ensaio de ligação tal como descrito no Exemplo 6.
[00159] O termo "meia-vida biológica" refere-se à quantidade de tempo que leva para uma substância, tal como um polipeptídeo imu- nomodulador compreendendo um ICOSL variante da presente inven- ção, perder metade de sua atividade ou concentração farmacológica ou fisiológica. Meia-vida biológica pode ser influenciada por elimina- ção, excreção, degradação (por exemplo, enzimática) da substância ou absorção e concentração em certos órgãos ou tecidos do corpo. Em algumas modalidades, meia-vida biológica pode ser avaliada atra-
vés da determinação do tempo que leva para a concentração da subs- tância no plasma sanguíneo atingir metade de seu nível de estado uni- forme ("meia-vida no plasma"). Conjugados que podem ser usados para derivatizar e aumentar a meia-vida biológica de polipeptídeos da invenção são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limita- dos a, polietileno glicol (PEG), amido de hidroxietila (HES), XTEN (peptídeos recombinantes estendidos; vide WO2013130683), albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), lipídeos (aci- lação) e poli-Pro-Ala-Ser (PAS), ácido poliglutâmico (glutamilação).
[00160] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" como aqui usado refere-se a uma proteína de transmembrana artificial (isto é, feita pelo homem) expressa em uma célula de mamífero compreen- dendo pelo menos um ectodomínio, uma transmembrana e um en- dodomínio. Opcionalmente, a proteína CAR inclui um "espaçador" que se liga covalentemente o ectodomínio ao domínio de transmembrana. Um espaçador é frequentemente um polipeptídeo ligando o ectodomí- nio ao domínio de transmembrana através de ligações peptídicas. O CAR é tipicamente expresso em um linfócito de mamífero. Em algu- mas modalidades, o CAR é expresso em uma célula de mamífero tal como uma célula T ou um linfócito de infiltração em tumor (TIL). Um CAR expresso em uma célula T é referido aqui como uma "célula T de CAR" ou "CAR-T". Em algumas modalidades, a CAR-T é uma célula auxiliar T, uma célula T citotóxica, uma célula T assassina natural, uma célula T de memória, uma célula T reguladora ou uma célula T gama delta. Quando usada clinicamente em, por exemplo, transferên- cia de célula adotiva, uma CAR-T com especificidade de ligação de antígeno para o tumor do paciente é tipicamente engenheirada para expressar em uma célula T nativa obtida do paciente. A célula T enge- nheirada expressando o CAR é então infundida de volta no paciente. À CAR-T é então frequentemente uma CAR-T autóloga embora CAR-T alogeneica esteja incluída no escopo da invenção. O ectodomínio de um CAR compreende uma região de ligação de antígeno, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo (por exem- plo, scFv), que se liga especificamente sob condições fisiológicas com um antígeno alvo, tal como um antígeno específico de tumor. Quando da ligação específica uma cadeia de eventos bioquímicos (isto é, transdução de sinal) resulta em modulação da atividade imunológica da CAR-T. Desta maneira, por exemplo, quando da ligação específica pela região de ligação de antígeno da CAR-T a seu antígeno alvo pode levar a mudanças na atividade imunológica da atividade de célula T conforme refletido por mudanças em citotoxidez, proliferação ou pro- dução de citocina. Transdução de sinal quando da ativação de CAR-T é obtida em algumas modalidades pela cadeia CD3-zeta ("CD3-z") que está envolvida em transdução de sinal em células T de mamífero nati- vas. CAR-Ts podem compreender ainda domínios de sinalização múl- tiplos tal como CD28, 41BB ou OX40, para modular mais a resposta imunomoduladora da célula T. CD3-z compreende um motivo conser- vado conhecido como um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) que está envolvido em transdução de sinal de receptor de célula T.
[00161] O termo "coletivamente" ou "coletivo", quando usando em referência à produção de citocina induzida pela presença de dois ou mais ICOSL variantes da invenção em um ensaio in vitro, significa o nível de expressão de citocina total sem importar a produção de citoci- na induzida pelo ICOSL variante individual. Em algumas modalidades, a citocina sendo ensaiada é IFN-gama em um ensaio de célula T pri- mária in vitro tal como descrito no Exemplo 6 e no Exemplo 7.
[00162] O termo "contraparte de ligação cognata" (usado intercomu- tavelmente com "contraestrutura") em referência a um polipeptídeo, tal como em referência a um domínio IgSF de um ICOSL variante, refere-
se a pelo menos uma molécula (tipicamente uma proteína de mamífe- ro nativa) à qual o polipeptídeo de referência se liga especificamente sob condições de ligação específicas. Em alguns aspectos, um ICOSL variante contendo um domínio IgSF com afinidade modificada se liga especificamente à contraestrutura do ICOSL nativo ou do tipo selva- gem correspondente, mas com afinidade aumentada ou atenuada. Uma espécie de ligante reconhecida e se ligando especificamente a seu receptor cognato sob condições de ligação específicas é um exemplo, de uma contraestrutura ou contraparte de ligação cognata daquele receptor. Uma "contraparte de ligação de superfície de célula cognata" é uma contraparte de ligação cognata expressa em uma su- perfície de célula de mamífero. Uma "espécie molecular de superfície celular" é uma contraparte de ligação cognata de ligantes da sinapse imunológica (IS), expressa em e por células, tais como células de ma- miífero, formando a sinapse imunológica.
[00163] “Como aqui usado, "conjugado", "conjugação" ou suas vari- ações gramaticais referem-se à união ou ligação de dois ou mais com- postos resultando na formação de um outro composto, através de mé- todos de união ou ligação conhecidos na técnica. Ele refere-se tam- bém a um composto que é gerado unindo ou ligando dois ou mais compostos. Por exemplo, um polipeptídeo ICOSL variante ligado dire- tamente ou indiretamente a uma ou mais porções químicas ou polipep- tídeo é um conjugado exemplar. Tais conjugados incluem proteínas de fusão, aquelas produzidas por conjugados químicos e aquelas produ- zidas através de quaisquer outros métodos.
[00164] O termo "ligação competitiva" como aqui usado significa que uma proteína é capaz de se ligar especificamente a pelo menos duas contrapartes de ligação cognatas, mas que ligação específica de uma contraparte de ligação cognata inib, tal como previne ou preclude, ligação simultânea da segunda contraparte de ligação cognata. Desta maneira, em alguns casos, não é possível que uma proteína se ligue às duas contrapartes de ligação cognatas ao mesmo tempo. Em geral, ligantes competitivos contêm o mesmo sítio de ligação ou sobrepostos para ligação específica, mas isso não é uma exigência. Em algumas modalidades, ligação competitiva causa uma inibição mensurável (par- cial ou completa) de ligação específica de uma proteína a uma de sua contraparte de ligação cognata devido à ligação específica de uma se- gunda contraparte de ligação cognata. Uma variedade de métodos é conhecida para quantificar ligação competitiva tais como ensaios ELI- SA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima).
[00165] O termo "substituição de aminoácido conservativa" como aqui usado significa uma substituição de aminoácido em quem um re- síduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas simila- res (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Exemplos de grupos de aminoácido que têm cadeias laterais com propriedades químicas simi- lares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leu- cina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxila alifáticas: serina e treo- nina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadei- as laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais áci- das: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativa são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
[00166] O termo "correspondendo a" com referência às posições de uma proteína, tal como menção que posições de nucleotídeo ou ami- noácido "correspondem a" posições de nucleotídeos ou aminoácido em uma sequência revelada, tal como mostrado na Listagem de se- quência, refere-se a posições de nucleotídeo ou aminoácido identifica-
das quando do alinhamento com a sequência revelada com base em alinhamento de sequência estrutural ou usando um algoritmo de ali- nhamento padrão, tal como o algoritmo GAP. Por exemplo, resíduos correspondentes podem ser determinados através de alinhamento de uma sequência de referência com a sequência mostrada na SEQ ID NO:32 (domínio ECD) ou mostrada na SEQ ID NO:196 ou 545 (domí- nio IgV) através de métodos de alinhamento estrutural como descrito aqui. Ao alinhar as sequências, um versado na técnica pode identificar resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos de aminoá- cido conservados e idênticos como guias.
[00167] O termo "diminuir" ou "atenuar" ou "suprimir" como aqui usado significa diminuir uma quantidade estatisticamente significante. Uma diminuição pode ser pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de um valor-controle, tal como um va- lor-controle não zero.
[00168] O termo "diminuído" ou "reduzido" como aqui usado no con- texto de diminuição de atividade imunológica de um linfócito de mamí- fero significa diminuir uma ou mais atividades do linfócito, comparado com um controle, tal como um controle não tratado ou um controle em que um tratamento usando um controle não modificado ou não varian- te foi empregado sob as mesmas condições. Uma atividade diminuída pode se referir a uma ou mais de inibição de ciclo celular, sobrevivên- cia de célula reduzida, proliferação de célula reduzida, produção de citocina reduzida ou citotoxidez de célula T reduzida, tal como uma quantidade estatisticamente significante. Em algumas modalidades, referência à atividade imunológica reduzida significa reduzir produção de interferon gama (IFN-gama) comparado com na ausência de trata- mento, tal como uma quantidade estatisticamente significante. Em al- gumas modalidades, a atividade imunológica pode ser avaliada em um ensaio de reação de linfócito mista (MLR). Métodos de condução de ensaios de MLR são conhecidos na técnica. Wang e outros, Cancer Immunol. Res. 2014; Set: 2(9):846-56. Outros métodos de avaliação de atividades de linfócitos são conhecidos na técnica, incluindo um en- saio como aqui descrito. Em algumas modalidades uma melhoria pode ser uma diminuição em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, comparado com um valor controle, tal como um valor controle não relacionado ou um valor controle não zero.
[00169] O termo "derivados" ou "derivatizados" refere-se à modifi- cação de uma proteína ligando-a covalentemente, diretamente ou indi- retamente, a uma composição de modo a alterar características tais como meia-vida biológica, biodisponibilidade, imunogenicidade, solubi- lidade, toxidez, potência ou eficácia enquanto retendo ou aumentando seu benefício terapêutico. Derivados de polipeptídeos imunomodulado- res da invenção estão dentro do escopo da invenção e podem ser fei- tos através de, por exemplo, glicosilação, peguilação, lipidação ou fu- são Fc.
[00170] Como usado aqui, domínio (tipicamente uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 6 ou mais aminoácidos, tais como 10 a 200 resíduos de aminoácido) refere-se a uma porção de uma molécu- la, tal como uma proteína ou ácido nucleico de codificação, que é es- truturalmente e/ou funcionalmente distinta de outras porções da molé- cula e é identificável. Por exemplo, domínios incluem aquelas porções de uma cadeia de polipeptídeo que pode formar uma estrutura inde- pendentemente dobrada dentro de uma proteína formada de um ou mais motivos estruturais e/ou que é reconhecida em virtude de uma atividade funcional, tal como atividade de ligação. Uma proteína pode ter um, ou mais de um, domínios distintos. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido ou distinguido por homologia da se- quência primária ou estrutura com membros da família relacionados,
tal como homologia com motivos. Em um outro exemplo, um domínio pode ser distinguido por sua função, tal como uma habilidade em inte- ragir com uma biomolécula, tal como uma contraparte de ligação cog- nata. Um domínio pode independentemente exibir uma função ou ati- vidade biológica de modo que o domínio independentemente ou fundi- do a uma outra molécula pode realizar uma atividade, tal como, por exemplo, ligação. Um domínio pode ser uma sequência linear de ami- noácidos ou uma sequência não linear de aminoácidos. Muitos poli- peptídeos contêm uma pluralidade de domínios. Tais domínios são conhecidos, e podem ser identificados por aqueles versados na técni- ca. Para exemplificação aqui, são providas definições, mas é compre- endido que está dentro da habilidade na técnica reconhecer domínios particulares pelo nome. Se necessário software apropriado pode ser empregado para identificar domínios.
[00171] O termo "ectodomínio" como aqui usado refere-se à região de uma proteína de membrana, tal como uma proteína de transmem- brana, que se encontra fora da membrana vesicular. Ectodomínios compreendem frequentemente domínios de ligação que se ligam es- pecificamente a ligantes ou receptores de superfície celular, tal como através de um domínio de ligação que se liga especificamente ao |i- gante ou receptor de superfície celular. O ectodomínio de uma proteí- na de transmembrana celular é alternativamente referido como um domínio extracelular.
[00172] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeutica- mente eficaz" referem-se a uma quantidade e/ou concentração de uma composição terapêutica da invenção, incluindo uma composição de proteína ou composição de célula, que quando administrada ex vivo (através de contato com uma célula de um paciente) ou in vivo (atra- vés de administração a um paciente) ou sozinha (isto é, como uma monoterapia) ou em combinação com agentes terapêuticos adicionais,
provê uma diminuição estatisticamente significante em progressão de doença como, por exemplo, através da melhora ou eliminação de sin- tomas e/ou a causa da doença. Uma quantidade eficaz pode ser uma quantidade que atenua, diminui ou alivia pelo menos um sintoma ou resposta biológica ou efeito associado com uma doença ou distúrbio, previne progressão da doença ou distúrbio ou melhora o funcionamen- to físico do paciente. No caso de terapia celular, a quantidade eficaz é uma dose ou número de células eficaz administrado a um paciente através de terapia de célula adotiva. Em algumas modalidades o paci- ente é um mamífero tal como um primata não humano ou paciente humano.
[00173] O termo "endodomínio" como aqui usado refere-se à região encontrada em algumas proteínas de membrana, tais como proteínas de transmembrana, que se estende para o espaço interior definido pe- la membrana de superfície celular. Em células de mamífero, o en- dodomínio é a região citoplásmica da proteína de membrana. Em célu- las, o ectodomínio interage com constituintes intracelulares e pode de- sempenhar um papel em transdução de sinal e, assim, em alguns ca- sos, pode ser um domínio de sinalização intracelular. O endodomínio de uma proteína de transmembrana celular é alternativamente referido como um domínio citoplásmico, que, em alguns casos, pode ser um domínio de sinalização citoplásmico.
[00174] Os termos "elevado" e "aumentado" como usado aqui no contexto de aumento da atividade imunológica de um linfócito de ma- miífero significam aumentar uma ou mais atividades do linfócito, com- parado com um controle, tal como um controle não tratado ou um con- trole em que um tratamento usando um controle não modificado ou não variante foi empregado sob as mesmas condições. Uma atividade aumentada pode ser uma ou mais de aumento da sobrevivência celu- lar, proliferação celular, produção de citocina ou citotoxidez de célula
T, tal como em uma quantidade estatisticamente significante. Em al- gumas modalidades, referência à atividade imunológica aumentada significa aumentar produção de interferon gama (IFN-gama), tal como em uma quantidade estatisticamente significante. Em algumas modali- dades, a atividade imunológica pode ser avaliada em um ensaio de reação de linfócito misto (MLR). Métodos de condução de ensaios MLR são conhecidos na técnica. Wang e outros, Cancer Immunol Res. Set 104; 2(9):846-56. Outros métodos de avaliação das atividades de linfócitos são conhecidos na técnica, incluindo qualquer ensaio como descrito aqui. Em algumas modalidades um aumento pode ser um aumento de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%,100%, 200%, 300%, 400% ou 500% maior do que um valor controle não zero.
[00175] O termo "célula engenheirada" como aqui usado refere-se a uma célula de mamífero que foi geneticamente modificada por inter- venção humana tal como através de métodos de DNA recombinante ou transdução viral. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune, tal como um linfócito (por exemplo, célula T, célula B, célula NK) ou uma célula apresentando antígeno (por exemplo, célula dendrí- tica). A célula pode ser uma célula primária de um paciente ou pode ser uma linhagem celular. Em algumas modalidades, uma célula en- genheirada da invenção compreende um ICOSL variante provido aqui. Em algumas modalidades, o ICOSL variante é uma proteína imuno- moduladora de transmembrana (daqui em diante referida como "TIP") que é expressa na célula engenheirada. Em algumas modalidades, a TIP contém o domínio extracelular ou uma porção do mesmo contendo o domínio IgV ligado a um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana de ICOSL) e, opcionalmente, um do- mínio de sinalização intracelular. Em alguns casos, a TIP é formatada como um receptor quimérico contendo um domínio de sinalização cito- plásmico heterólogo ou endodomínio. Em algumas modalidades, uma célula engenheirada é capaz de expressar e secretar uma proteína imunomoduladora como descrito aqui. Dentre as células engenheira- das providas estão também células contendo ainda um receptor de célula T engenheirado (TCR) ou receptor de antígeno quimérico (CAR).
[00176] Otermo "célulaT engenheirada" como aqui usado refere-se a uma célula T tal como uma célula T auxiliar, célula T citotóxica (al- ternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL), célula T assassina natu- ral, célula T reguladora, célula T de memória ou célula T gama delta, que foi geneticamente modificada por intervenção humana tal como através de métodos de DNA recombinante ou métodos de transdução viral. Uma célula T engenheirada compreende uma proteína imuno- moduladora de transmembrana ICOSL variante (TIP) ou proteína imu- nomoduladora secretada (SIP) da presente invenção que é expressa na célula T e é engenheirada para modular a atividade imunológica da célula T engenheirada em sim, ou uma célula de mamífero à qual o ICOSL variante expresso na célula T se liga especificamente. Uma cé- lula T engenheirada pode compreender uma proteína imunomodulado- ra (SIP) secretada por ICOSL variante da presente invençao que é ex- pressa por e/ou secretada pela célula T e é engenheirada para modu- lar atividade imunológica da própria célula T engenheirada, ou uma célula de mamífero à qual o ICOSL variante quando secretado pela célula T, se liga especificamente.
[00177] O termo "receptor de célula T engenheirado" ou "TCR en- genheirado" refere-se a um receptor de célula T (TCR) engenheirado para se ligar especificamente com uma afinidade desejada a um com- plexo principal de histocompatibilidade (MHC)/antígeno alvo de peptí- deo que é selecionado, clonado e/ou subsequentemente introduzido em uma população de células T, frequentemente usado para imunote- rapia adotiva. Em contraste com TCRs engenheiradas, CARs são en-
genheirados para se ligar a antígenos alvo de uma maneira indepen- dente do MHC.
[00178] O termo "expresso" como aqui usado é usado em referên- cia a uma proteína expressa na superfície de uma célula, tal como uma célula de mamífero. Desta maneira, a proteína é expressa como uma proteína de transmembrana. Em algumas modalidades, a proteí- na expressa é uma proteína de transmembrana. Em algumas modali- dades, a proteína é conjugada a uma porção de molécula pequena tal como um fármaco ou marcador detectável. Proteínas expressas na superfície de uma célula podem incluir proteínas de superfície celular tais como receptores de superfície celular que são expressos em célu- las de mamífero.
[00179] O termo "porção de prolongamento de meia-vida" refere-se a uma porção de uma fusão de polipeptídeo ou conjugado químico que prolonga a meia-vida de uma proteína circulando no soro sanguíneo de um mamífero comparado com a meia-vida da proteína que não é então conjugada à porção. Em algumas modalidades, a meia-vida é prolongada em mais do que ou mais do que cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes ou 6,0 vezes. Em algumas modalidades, a meia-vida é prolongada mais de 6 horas, mais de 12 horas, mais de 24 horas, mais de 48 horas, mais de 72 horas, mais de 96 horas ou mais de 1 semana após administração in vivo comparado com a proteína sem a porção de prolongamento de meia-vida. A meia- vida refere-se à quantidade de tempo que leva para a proteína perder metade de sua concentração, quantidade ou atividade. Meia-vida pode ser também determinada, por exemplo, usando um ensaio ELISA ou um ensaio de atividade. Porções de prolongamento de meia-vida exemplares incluem um domínio Fc, um domínio de multimerização, polietileno glicol (PEG), amido de hidroxietila (HES), XTEN (peptídeos recombinantes prolongados; vide WO2013130683), albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), lipídeos (acilação) e poli-Pro-Ala-Ser (PAS) e ácido poliglutâmico (glutamilação).
[00180] O termo "sinapse imunológica" ou "sinapse imune" como aqui usado significa a interface entre uma célula de mamífero que ex- pressa MHC | (complexo principal de histocompatibilidade) ou MHC 1, tal como uma célula apresentando antígeno ou célula de tumor, e um linfócito de mamífero tal como uma célula T efetora ou célula Assassi- na Natural (NK).
[00181] Uma região Fc (fragmento cristalizável) ou domínio de uma molécula de imunoglobulina (também chamado um polipeptídeo Fc) corresponde em grande parte à região constante da cadeia pesada da imunoglobulina, e é responsável por várias funções, incluindo a(s) fun- ção(ões) efetora(as) do anticorpo. O domínio Fc contém parte ou todo de um domínio de dobra de uma molécula de imunoglobulina mais um domínio CH2 ou CH3. O domínio Fc pode formar um dímero de duas cadeias de polipeptídeo unidas por uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc variante que exibe atividade reduzida (por exemplo, reduzida mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) para facilitar uma função efetora. Em algumas modalidades, referência a substituições de aminoácido em uma região Fc é através do sistema de numeração EU a menos que descrito com referência a uma SEQ ID NO. específica. Numeração EU é conhecida e está de acordo com o IMGT Scientific Chart mais recentemente atua- lizado (IMGTS, the international ImnMunoGeneTics information systemº http://www .imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.htm | (criado: 17 de maio de 2001, última atualização: 10 de Jan de 2013) e o Índice EU como relatado em Kabat, E.A. e outros. Sequences of Pro- teins of Immunological interest. 5º ed. US Department of Health and Human Services, publicação NIH No. 91-3242 (1991).
[00182] Uma fusão de Fc de imunoglobulina ("fusão-Fc"), tal como uma proteína de fusão de Fc imunomoduladora, é uma molécula com- preendendo um ou mais polipeptídeos (ou uma ou mais moléculas pe- quenas) operativamente ligados a uma região Fc de uma imunoglobu- lina. Uma fusão-Fc pode compreender, por exemplo, a região Fc de um anticorpo (que facilita funções efetoras e farmacocinética) e um ICOSL variante. Uma região Fc de imunoglobulina pode ser ligada in- diretamente ou diretamente a um ou mais ICOSL variante ou molécu- las pequenas (contrapartes de fusão). Vários ligantes são conhecidos na técnica e podem ser opcionalmente usados para ligar um Fc a uma contraparte de fusão para gerar uma fusão-Fc. Fusões-Fc de espécies idênticas podem ser dimerizadas para formar homodímeros de fusão- Fc ou usando espécies não idênticas para formar heterodímero de fu- são-Fc. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc de mamífero tal como um Fc de murino ou humano.
[00183] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula que po- de ser usada para expressar uma proteína codificada por um vetor de expressão recombinante. Uma célula hospedeira pode ser um procari- onte, por exemplo, E. coli, ou ela pode ser um eucarionte, por exem- plo, um eucarionte de célula única (por exemplo, uma levedura ou ou- tro fungo), uma célula de planta (por exemplo, uma célula de planta de tabaco ou tomate), uma célula animal (por exemplo, uma célula huma- na, uma célula de macaco, uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundongo ou uma célula de inseto) ou um hibridoma. Exemplos de células hospedeiras incluem células de ovário de hams- ter Chinês (CHO) ou seus derivados tal como CHO Veggie ou linha- gens de célula relacionadas que crescem em meio livre de soro ou |li- nhagem CHO DX-B11, que é deficiente em DHFR. Em algumas moda- lidades, uma célula hospedeira é uma célula de mamífero (por exem- plo, uma célula humana, uma célula de macaco, uma célula de hams- ter, uma célula de rato, uma célula de camundongo ou uma célula de inseto).
[00184] O termo "imunoglobulina" (abreviado "Ig") como aqui usado refere-se a uma proteína imunoglobulina de mamífero incluindo qual- quer uma das cinco classes humanas de anticorpo: IgA (que inclui subclasses IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que inclui subclasses IgG1, Ig9G2, I9gG3 e IgG4) e IgM. O termo é também inclusivo de imunoglobu- linas que são menos do que o comprimento integral, sejam totalmente ou parcialmente sintéticas (por exemplo, síntese recombinante ou química) ou produzidas naturalmente, tal como fragmento de ligação de antígeno (Fab), fragmento variável (Fv) contendo Vr e V., o frag- mento variável de cadeia única (scFv) contendo Vx e V. ligados em conjunto em uma cadeia, bem como outros fragmentos de região V de anticorpo, tais como Fab', F(ab)2, F(ab')2, diacorpo dsFv, Fc, e frag- mentos de polipeptídeo Fd. Anticorpos biespecíficos, homobiespecifi- cos e heterobiespecíficos, estão incluídos no significado dos mesmos.
[00185] O termo "superfamília da imunoglobulina" ou "lgSF" como aqui usado significa o grupo de proteínas de superfície celular ou solú- veis que estão envolvidas nos processos de reconhecimento, ligação ou adesão de células. As moléculas são categorizadas como membros desta superfamília com base em características estruturais comparti- lhadas com imunoglobulinas (isto é, anticorpos); elas todas possuem um domínio conhecido como um domínio ou dobra da imunoglobulina. Membros da IgSF incluem receptores de antígeno de superfície celu- lar, moléculas correceptoras e coestimuladoras do sistema imune, mo- léculas envolvidas em apresentação de antígeno a linfócitos, molécu- las de adesão celular, certos receptores de citocina e proteínas mus- culares intracelulares. Elas são comumente associadas com papéis no sistema imune. Proteínas na sinapse imunológica são frequentemente membros da IgSF. IgSF pode ser também classificada em "subfamí- lias" com base em propriedades compartilhadas tal como função. Tais subfamílias tipicamente consistem em 4 a 30 membros IgSF.
[00186] O termo "domínio IQgSF" ou "domínio da imunoglobulina" ou "domínio Ig" como aqui usado refere-se a um domínio estrutural de proteínas IgSF. Domínios Ig são nomeados após as moléculas de imunoglobulina. Eles contêm cerca de 70-110 aminoácidos e são ca- tegorizados de acordo com seu tamanho e função. Domínios lg pos- suem uma dobra de lg característica, que tem uma estrutura do tipo sanduíche formada por duas folhas de filamentos beta antiparalelo. Interações entre aminoácidos hidrofóbicos no lado interno do sanduí- che e ligações dissulfeto altamente conservadas formadas entre resí- duos cisteína nos filamentos B e F estabilizam a dobra de lg. Uma ex- tremidade do domínio lg tem uma seção chamada a região de deter- minação de complementaridade que é importante para a especificida- de de anticorpos para seus ligantes. Os domínios do tipo Ig podem ser classificados (em classes) como: IgV, IgC1, IgC2 ou Igl. A maioria dos domínios |g ou são variáveis (IQgV) ou constantes (Igc). Domínios IgV com 9 filamentos beta são geralmente mais longos do que os domínios IgC com 7 filamentos beta. Domínios lg de alguns membros da IgSF lembram domínios IgV na sequência de aminoácido, ainda são simila- res em tamanho aos domínios IgC. Esses são chamados domínios IgC2, enquanto domínio IgC padrão são chamados domínios IgC1. Cadeias de receptor de célula T (TCR) contêm dois domínios Ig na porção extracelular; um domínio IgV no terminal N e um domínio IgC1 adjacente à membrana celular. ICOSL contém dois domínios Ig: IgV e I1gC.
[00187] O termo "espécie da IgSF" como aqui usado significa um conjunto de proteínas de membro da IgSF com sequência de aminoá- cido primária idêntica ou substancialmente idêntica. Cada membro da superfamília de imunoglobulina de mamífero (I9SF) define uma identi- dade única de todas as espécies da IgSF que pertencem àquele membro da IgSF. Desta maneira, cada membro da família ISF é úni- co de outros membros da família IISF e, desta maneira, cada espécie de um membro da família IQSF particular é única da espécie de um outro membro da família IISF. Não obstante, variação entre moléculas que são da mesma espécie de IgSF pode ocorrer devido a diferenças em modificação pós-traducional tais como glicosilação, fosforilação, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipidação. Ainda, diferenças pequenas em sequência dentro de uma espécie de IgSF única devido a polimorfismos de gene constituem uma outra forma de variação dentro de uma espécie de IgSF única assim como as formas truncadas do tipo selvagem de espécies de IgSF devido a, por exem- plo, clivagem proteolítica. Uma "espécie de IgSF de superfície celular" é uma espécie de IgSF expressa na superfície de uma célula, geral- mente, uma célula de mamífero.
[00188] O termo "atividade imunológica" como usado aqui no con- texto de linfócitos de mamífero tais como células T refere-se a um ou mais de sobrevivência celular, proliferação celular, produção de citoci- na (por exemplo, interferon-gama) ou atividades citotóxicas de célula T. Em alguns casos, uma atividade imunológica pode significar a ex- pressão celular de citocinas, tais como quimiocinas ou interleucinas. Ensaios para determinação do aumento ou supressão de atividade imunológica incluem os ensaios MLR (reação de linfócitos mistos) me- dindo níveis de citocina interferon-gama em sobrenadantes de cultura (Wang e outros, Cancer Immunol Res. Set 2014: 2(9):846-56), ensaio de estimulação de célula TSEB (enterotoxina B staphylococcal) (Wang e outros, Cancer Immunol Res. Set 2014: 2(9):846-56) e ensaios de estimulação de célula T anti-CD3 (Li e Kurlander, J. Transl. Med. 2010: 8: 104). Uma vez que ativação de célula T está associada com secre- ção de citocina IFN-gama, detecção de níveis de IFN-gama em sobre- nadantes de cultura desses ensaios de célula T humana in vitro pode ser ensaiada usando kits de ELISA comerciais (Wu e outros, Immunol Lett, 15 de abril de 2008; 117(1): 57-62). Indução de uma resposta imune resulta em um aumento em atividade imunológica em relação a linfócitos quiescentes.
Uma proteína imunomoduladora, tal como um polipeptídeo ICOSL variante contendo um domínio de IgSF com afini- dade modificada, como provido aqui pode em algumas modalidades aumentar ou, em modalidades alternativas, diminuir expressão de IFN- gama (interferon-gama) em um ensaio de célula T primária em relação a um membro da IgSF do tipo selvagem ou controle de domínio IgSF.
Aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que o formato do en- saio de célula T primária usado para determinar um aumento em ex- pressão de IFN-gama diferirá daquele empregado para ensaiar uma diminuição em expressão de IFN-gama.
Em ensaio da habilidade de uma proteína imunomoduladora ou domínio I9gSF com afinidade modi- ficada da invenção em diminuir expressão de IFN-gama em ensaio de célula T primária, um ensaio de Reação de Linfócito Misto (MLR) pode ser usado como descrito no Exemplo 6. Convenientemente, uma forma solúvel de um domínio IgSF com afinidade modificada da invenção pode ser empregada para determinar sua habilidade em antagonizar e desta maneira diminuir a expressão de IFN-gama em um MLR da mesma maneira que descrito no Exemplo 6. Alternativamente, no en- saio da habilidade de uma proteína imunomoduladora ou domínio IgSF com afinidade modificada da invenção em aumentar expressão de IFN-gama em um ensaio de célula T primária, um ensaio de coimobili- zação pode ser usado.
Em um ensaio de coimobilização, um sinal de receptor de célula T, provido em algumas modalidades por anticorpo anti-CD3, é usado em conjunto com um domínio IgSF com afinidade modificada coimobilizado, tal como um ICOSL variante, para determi- nar a habilidade em aumentar expressão de IFN-gama em relação a um controle de domínio I9SF do tipo selvagem.
Métodos para ensaiar a atividade imunológica de células engenheiradas, incluindo avaliar a atividade de uma proteína imunomoduladora de transmembrana ICOSL variante, são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, a habilidade em expandir células T seguindo estimulação com antígeno, sustentar expansão de célula T na ausência de reesti- mulação e atividades anticâncer em modelos animais apropriados. Os ensaios também incluem ensaios para avaliar citotoxidez, incluindo um ensaio de liberação de Cr padrão (vide, por exemplo, Milone e ou- tros, (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464) ou ensaios de citotoxi- dez baseados em fluxo ou um ensaio de citotoxidez baseado em im- pedância (Peper e outros (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198).
[00189] Um "polipeptídeo imunomodulador" ou "proteína imunomo- duladora" é um polipeptídeo ou molécula de proteína que modula ativi- dade imunológica. Por "modulação" ou "modulando" uma resposta imune quer dizer que atividade imunológica é ou aumentada ou dimi- nuída. Uma proteína imunomoduladora pode ser uma cadeia de poli- peptídeo única ou um multímero (dímeros ou multímeros de ordem maior) de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo covalentemente ligadas uma à outra através de, por exemplo, ligações dissulfeto inter- cadeia. Desta maneira, polipeptídeos monoméricos, dimérico e multi- mérico de ordem superior estão dentro do escopo do termo definido. Polipeptídeos multiméricos podem ser homomultiméricos (de cadeias de polipeptídeo idênticas) ou heteromultiméricos (de cadeias de poli- peptídeo não idênticas). Uma proteína imunomoduladora da invenção compreende um ICOSL variante.
[00190] O termo "aumenta" como aqui usado significa aumentar em uma quantidade estatisticamente significante. Um aumento pode ser pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% ou mais do que um valor controle não zero.
[00191] Uma "isoforma" de ICOSL (ligante coestimulador induzível; CD275) é um de uma pluralidade de polipeptídeos ICOSL de ocorrên- cia natural que diferem em sequência de aminoácido. Isoformas po- dem ser o produto de variantes de união de um transcrito de RNA ex- presso por um gene único, ou o produto de expressão de genes alta- mente similares, mas diferentes, provendo uma proteína funcionalmen- te similar tal como pode ocorrer de duplicação de gene. Como aqui usado, o termo "isoforma" de ICOSL também se refere ao produto de alelos diferentes de um gene de ICOSL (por exemplo, ICOSLG).
[00192] O termo "linfócito" como aqui usado significa qualquer um de três subtipos de células brancas do sangue no sistema imune de um mamífero. Eles incluem células assassinas naturais (células NK) (que funcionam em imunidade citotóxica inata, mediada por célula), células T (para imunidade adaptativa, mediada por célula) e células B (para imunidade adaptativa direcionada por anticorpo, humoral). Célu- las T incluem: células T auxiliares, células T citotóxicas, células T as- sassinas naturais, células T de memória, células T reguladoras ou cé- lulas T gama-delta. Células linfoides inatas (ILC) estão também incluí- das na definição de linfócito.
[00193] O termo "mamífero" ou "paciente" inclui especificamente referência a pelo menos um de um: humano, chimpanzé, macaco rhe- Sus, macaco cynomolgus, cachorro, gato, camundongo ou rato.
[00194] O termo "proteína de membrana" como aqui usado significa uma proteína que, sob condições fisiológicas, é ligada diretamente ou indiretamente a uma bicamada de lipídeo. Uma bicamada de lipídeo que forma uma membrana pode ser uma membrana biológica tal como uma membrana de célula eucariótica (por exemplo, mamífero) ou uma membrana artificial (por exemplo, feita pelo homem) tal como aquela encontrada em um lipossoma. Ligação de uma proteína de membrana à bicamada de lipídeo pode ser por meio de ligação covalente ou por meio de interações não covalentes tais como interações hidrofóbicas ou eletrostáticas. Uma proteína de membrana pode ser uma proteína integral de membrana ou uma proteína periférica de membrana. Prote- íÍnas de membrana que são proteínas periféricas de membranas são ligadas não covalentemente à bicamada de lipídeo ou ligadas não co- valentemente a uma proteína integral de membrana. Uma proteína pe- riférica de membrana forma uma ligação temporária à bicamada de lipídeo de modo que sob a gama de condições que são fisiológicas em um mamífero, proteína periférica de membrana pode se associar e/ou dissociar da bicamada de lipídeo. Em contraste com proteínas periféri- cas de membrana, proteínas integrais de membrana formam uma liga- ção substancialmente permanente com a bicamada de lipídeo da membrana de maneira que sob a gama de condições que são fisioló- gicas em um mamífero, proteínas integrais de membrana não se dis- sociam de sua ligação à bicamada de lipídeo. Uma proteína de mem- brana pode formar uma ligação à membrana por meio de uma camada da bicamada de lipídeo (monotópica) ou ligada por meio de ambas as camadas da membrana (politópica). Uma proteína integral de mem- brana que interage com apenas uma bicamada de lipídeo é uma "pro- teína monotópica integral". Uma proteína integral de membrana que interage com ambas as bicamadas de lipídeo é uma "proteína integra politópica" alternativamente aqui referida como uma "proteína de transmembrana".
[00195] O termo "modulação" ou "modular" como usado aqui no contexto de uma resposta imune, tal como uma resposta imune de mamífero, refere-se a qualquer alteração, tal como um aumento ou uma diminuição, de respostas imunes existentes ou potenciais que ocorrem como um resultado de administração de um polipeptídeo imu- nomodulador compreendendo um ICOSL variante da presente inven- ção ou como um resultado de administração de células engenheiradas que expressam uma proteína imunomoduladora, tal como uma proteí- na imunomoduladora de transmembrana ICOSL variante da presente invenção.
Desta maneira, ele refere-se a uma alteração, tal como um aumento ou diminuição, de uma resposta imune comparado com a resposta imune que ocorre ou está presente na ausência da adminis- tração da proteína imunomoduladora compreendendo o ICOSL varian- te ou células expressando tal polipeptídeo imunomodulador.
Tal modu- lação inclui qualquer indução, ativação, supressão ou alteração em grau ou extensão de atividade imunológica de uma célula imune.
Célu- las imunes incluem células B, células T, células NK (assassinas natu- rais), células T NK, células apresentando antígeno profissionais (APCs), e células apresentando antígeno não profissionais, e células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos, monócitos, eosinófilos e basófi- los). Modulação inclui qualquer mudança feita em uma resposta imune existente, uma resposta imune em desenvolvimento, uma resposta imune potencial ou a capacidade em induzir, regular, influenciar ou responder a uma resposta imune.
Modulação inclui qualquer alteração na expressão e/ou função de genes, proteínas e/ou outras moléculas em células imunes como parte de uma resposta imune.
Modulação de uma resposta imune ou modulação de atividade imunológica inclui, por exemplo, o que segue: eliminação, deleção ou sequestro de células imunes; indução ou geração de células imunes que podem modular a capacidade funcional de outras células tais como linfócitos autorreati- vos, células apresentando antígeno ou células inflamatórias; indução de um estado não responsivo em células imunes (isto é, anergia); au- mento ou supressão da atividade ou função de células imunes incluin- do, mas não limitado a, alteração do padrão de proteínas expressas por essas células.
Exemplos incluem produção e/ou secreção alterada de certas classes de moléculas tais como citocinas, quimiocinas, fato- res de crescimento, fatores de transcrição, cinases, moléculas coesti-
muladoras ou outros receptores de superfície celular ou qualquer combinação desses eventos moduladores. Modulação pode ser avali- ada, por exemplo, através de uma alteração em expressão de IFN- gama (interferon-gama) em relação ao controle ICOSL do tipo selva- gem em ensaio de célula T primária (vide, Zhao e Ji, Exp Cell Res. 1 de janeiro de 2016; 340(1) 132-138). Modulação pode ser avaliada, por exemplo, através de uma alteração de uma atividade de imunoglo- bulina de células engenheiradas, tal como uma alteração em atividade citotóxica de células engenheiradas ou uma alteração em secreção de citocina de células engenheiradas em relação a células engenheiradas com uma proteína de transmembrana ICOSL do tipo selvagem.
[00196] O termo "espécie molecular" como aqui usado significa um conjunto de proteínas com sequência de aminoácido primária idêntica ou substancialmente idêntica. Cada membro da superfamília da imu- noglobulina (I9SF) de mamífero define uma coleção de espécies mole- culares idênticas ou substancialmente idênticas. Desta maneira, por exemplo, ICOSL humano é um membro da IgSF e cada molécula de ICOSL humana é uma espécie de molécula de ICOSL. Variações entre moléculas que são da mesma espécie molecular podem ocorrer devi- do a diferenças em modificação pós-traducional tais como glicosilação, fosforilação, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipida- ção. Ainda, diferenças pequenas em sequência dentro de uma única espécie molecular devido a polimorfismo de gene constituem uma ou- tra forma de variação dentro de uma espécie molecular única da mes- ma maneira que as formas truncadas do tipo selvagem de uma espé- cie molecular única devido a, por exemplo, clivagem proteolítica. Uma "espécie molecular de superfície celular" é uma espécie molecular ex- pressa na superfície de uma célula de mamífero. Duas ou mais espé- cies diferentes de proteína, cada uma delas está presente exclusiva- mente em uma ou exclusivamente na outra (mas não ambas) as duas células de mamífero que formam a IS, são ditas estar em "cis" ou "con- figuração cis" uma com a outra. Duas espécies diferentes de proteína, a primeira delas está exclusivamente presente em uma das duas célu- las de mamífero formando a IS e a segunda delas está presente ex- clusivamente na segunda das duas células de mamífero formando a IS, são ditas estar em "trans" ou "configuração trans". Duas espécies diferentes de proteína, cada uma das quais está presente em ambas as células de mamífero formando a IS, estão em ambas as configura- ções cis e trans nessas células.
[00197] O termo "domínio de multimerização" refere-se a uma se- quência de aminoácidos que promove interação estável de uma molé- cula de polipeptídeo com uma ou mais moléculas de polipeptídeo adi- cionais, cada uma contendo um domínio de multimerização comple- mentar (por exemplo, um primeiro domínio de multimerização e um segundo domínio de multimerização), que pode ser um domínio de di- merização igual ou um diferente. As interações entre domínios de mul- timerização complementares, por exemplo, interação entre um primei- ro domínio de multimerização e um segundo domínio de multimeriza- ção, formam uma interação proteína-proteína estável para produzir um multímero da molécula de polipeptídeo com a molécula de polipeptí- deo adicional. Em alguns casos, o domínio de multimerização é igual e interage com ele mesmo para formar uma interação proteína-proteína estável entre duas cadeias de polipeptídeo. Em geral, um polipeptídeo é unido diretamente ou indiretamente ao domínio de multimerização. Domínios de multimerização exemplares incluem as sequências de imunoglobulina ou porções das mesmas, zíperes de leucina, regiões hidrofóbicas, regiões hidrofílicas e domínios de interação proteína- proteína compatíveis. O domínio de multimerização, por exemplo, po- de ser uma região ou domínio constante da imunoglobulina tal como, por exemplo, o domínio Fc ou porções do mesmo de IgG, incluindo subtipos I9G1, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA, IgE, 1gD e IgM e suas formas modificadas.
[00198] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados intercomutavelmente para se referir a um polímero de resíduos de áci- do nucleico (por exemplo, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotí- deos) em ou forma de filamento simples ou duplo. A menos que espe- cificamente limitado, os termos compreendem ácidos nucleicos con- tendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais e que têm propri- edades de ligação similares a ele e são metabolizados de uma manei- ra similar a nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também compreende implicitamente suas variantes conservadoramente modifi- cadas (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequên- cias de nucleotídeo complementares bem como a sequência explici- tamente indicada (uma "sequência de referência"). Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser obtida através da gera- ção de sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxinosina. O termo ácido nucleico ou polinucleotídeo compreende CDNA ou mRNA codificado por um gene.
[00199] O termo "ligação não competitiva" como aqui usado signifi- ca a habilidade de uma proteína em se ligar especificamente simulta- neamente a pelo menos duas contrapartes de ligação cognatas. Desta maneira, a proteína é capaz de se ligar a pelo menos duas contrapar- tes de ligação cognatas ao mesmo tempo, embora a interação de liga- ção não precise ser da mesma duração de modo que, em alguns ca- sos, a proteína é especificamente ligada a apenas uma das contrapar- tes de ligação cognatas. Em algumas modalidades, a ligação ocorre sob condições de ligação específicas. Em algumas modalidades, a li- gação simultânea é tal de modo que ligação de uma contraparte de ligação cognata não inib substancialmente ligação simultânea a uma segunda contraparte de ligação cognata. Em algumas modalidades, ligação não competitiva significa que ligação de uma segunda contra- parte de ligação cognata a seu sítio de ligação na proteína não deslo- ca a ligação de uma primeira contraparte de ligação cognata para seu sítio de ligação na proteína. Métodos de avaliação de ligação não competitiva são bem conhecidos na técnica tal como o método des- crito em Perez de La Lastra e outros, Immunology, Abril de 1999: 96(4): 663—670. Em alguns casos, em interações não competitivas, a primeira contraparte de ligação cognata se liga especificamente em um sítio de interação que não se sobrepõe com o sítio de interação da segunda contraparte de ligação cognata de maneira que ligação da segunda contraparte de ligação cognata não interfere diretamente com a ligação da primeira contraparte de ligação cognata. Desta maneira, qualquer efeito de ligação da contraparte de ligação cognata através da ligação da segunda contraparte de ligação cognata é através de um mecanismo que não interferência direta com a ligação da primeira con- traparte de ligação cognata. Por exemplo, no contexto de interação de enzima-substrato, um inibidor não competitivo se liga a um sítio outro que não o sítio ativo da enzima. Ligação não competitiva compreende interações de ligação não competitiva em que uma segunda contrapar- te de ligação cognata se liga especificamente em um sítio de interação que não se sobrepõe com a ligação da primeira contraparte de ligação cognata, mas se liga ao segundo sítio de interação apenas quando o primeiro sítio de interação é ocupado pela primeira contraparte de liga- ção cognata.
[00200] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma com- posição adequada para uso farmacêutico em um indivíduo mamífero, frequentemente um humano. Uma composição farmacêutica compre- ende tipicamente uma quantidade eficaz de um agente ativo (por exemplo, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante ou células engenheiradas expressando uma proteína de imunomoduladora de transmembrana ICOSL variante) e um veícu- lo, excipiente ou diluente. O veículo, excipiente ou diluente é tipica- mente um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, respectivamente.
[00201] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados aqui in- tercomutavelmente e referem-se a uma cadeia molecular de dois ou mais aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. Os termos não se referem a um comprimento específico do produto. Desta ma- neira, "peptídeos" e "oligopeptídeos" estão incluídos na definição de polipeptídeo. Os termos incluem modificações pós-traducionais do po- lipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e simi- lar. Os termos também incluem moléculas em que um ou mais análo- gos de aminoácido ou aminoácidos não canônicos ou não naturais es- tão incluídos como podem ser sintetizados, ou expressos recombinan- temente usando técnicas de engenharia de proteína conhecidas. Ain- da, proteínas podem ser derivatizadas.
[00202] O termo "ensaio de célula T primária" como aqui usado re- fere-se a um ensaio in vitro para medir expressão de interferon-gama ("IFN-gama"). Uma variedade de tais ensaios de célula T primária é conhecida na técnica, tal como aquela descrita no Exemplo 7. Em uma modalidade preferida, o ensaio usado é um ensaio de coimobilização anti-CD3. Neste ensaio, células T primárias são estimuladas por anti- CD3 imobilizado com ou sem proteínas recombinantes adicionais. So- brenadantes de cultura são coletados nos pontos de tempo, geralmen- te 24-72 horas. Em uma outra modalidade, o ensaio usado é MLR. Neste ensaio, células T primárias são estimuladas com APC alogenei- ca. Sobrenadantes de cultura são coletados em pontos de tempo, ge- ralmente 24-72 horas. Níveis de IFN-gama humano são medidos em sobrenadantes de cultura através de técnicas ELISA padrão. Kits co- merciais estão disponíveis de vendedores e o ensaio é realizado de acordo com a recomendação do fabricante.
[00203] O termo "purificado" conforme aplicado a ácidos nucleicos, tal como codificando proteínas imunomoduladoras da invenção, ge- ralmente significa um ácido nucleico ou polipeptídeo que é substanci- almente livre de outros componentes conforme determinado através de técnicas analíticas bem conhecidas no campo (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma faixa diferente em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submeti- do à centrifugação de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que dá origem a essencialmente uma faixa em um gele eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou proteína purificado da invenção é pelo menos cerca de 50% puro, geralmente pelo menos cerca de75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso ou em uma base molar).
[00204] O termo "recombinante" indica que o material (por exemplo, um ácido nucleico ou um polipeptídeo) foi artificialmente (isto é, não naturalmente) alterado por intervenção humana. A alteração pode ser realizada no material dentro de, ou removido de, seu ambiente natural ou estado. Por exemplo, um "ácido nucleico recombinante" é um que é feito através da recombinação de ácidos nucleicos, por exemplo, du- rante clonagem, modificação de afinidade, embaralhamento de DNA ou outros procedimentos biológicos moleculares bem conhecidos. Uma "molécula de DNA recombinante" é compreendida de segmentos de DNA unidos por meios de tais técnicas biológicas moleculares. O termo "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombinante" como aqui usado refere-se a uma molécula de proteína que é expressa usando uma molécula de DNA recombinante. Uma "célula hospedeira recombinante" é uma célula que contém e/ou expressa um ácido nu-
cleico recombinante ou que é de outra maneira alterada através de engenharia genética, tal como através de introdução na célula de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína recombinante, tal como uma proteína imunomoduladora de transmembrana provida aqui. Sinais de controle transcripcional em eucariontes compreendem ele- mentos "promotores" e "potencializadores". Promotores e potencializa- dores consistem em arranjos curtos de sequências de DNA que inte- ragem especificamente com proteínas celulares envolvidas em trans- crição. Elementos promotores e potencializadores foram isolados de uma variedade de fontes eucarióticas incluindo genes em células de levedura, inseto e mamífero e vírus (elementos controle análogos, isto é, promotores, são também encontrados em procariontes). A seleção de um promotor e potencializador particular depende de qual tipo de célula deve ser usado para expressar a proteína de interesse. Os ter- mos "em combinação operável", "em ordem operável" e "operavelmen- te ligado" como aqui usado referem-se à ligação de sequências de ácido nucleico em tal maneira ou orientação que a molécula de ácido nucleico capaz de direcionamento da transcrição de um dado gene e/ou a síntese de uma molécula de proteína desejada é produzida.
[00205] O termo "vetor de expressão recombinante" como aqui usado refere-se a uma molécula de DNA contendo uma sequência de codificação desejada e sequências de ácido nucleico apropriadas ne- cessárias para a expressão da sequência de codificação operavelmen- te ligada em uma célula hospedeira particular. Sequências de ácido nucleico necessárias para expressão em procariontes incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de liga- ção de ribossomo e possivelmente outras sequências. Células eucarió- ticas são conhecidas utilizar promotores, potencializadores e sinais de terminação e poliadenilação. Uma sequência de peptídeo sinal secre- tor pode também, opcionalmente, ser codificada pelo vetor de expres-
são recombinante, operavelmente ligada à sequência de codificação para a proteína recombinante, tal como uma proteína de fusão recom- binante, de modo que a proteína de fusão expressa pode ser secreta- da pela célula hospedeira recombinante, para isolamento mais fácil da proteína de fusão a partir da célula, se desejado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico de autorreplicação bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. Dentre os vetores estão vetores virais, tais como vetores lentivirais.
[00206] O termo "seletividade" refere-se a à preferência de uma proteína objeto, ou polipeptídeo, para ligação específica de um subs- trato, tal como uma contraparte de ligação cognata, comparado com ligação específica com um outro substrato, tal como uma contraparte de ligação cognata diferente da proteína objeto. Seletividade pode ser refletida como uma razão da atividade de ligação (por exemplo, afini- dade de ligação) de uma proteína objeto e um primeiro substrato, tal como uma primeira contraparte de ligação cognata (por exemplo, Ka1) e a atividade de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) da mesma proteína objeto com uma segunda contraparte de ligação cognata (por exemplo, Ka2).
[00207] O termo "identidade de sequência" como aqui usado refere- se à identidade de sequência entre genes ou proteínas no nível de nu- cleotídeo ou aminoácido, respectivamente. "Identidade de sequência" é uma medida de identidade entre proteínas no nível de aminoácido e uma medida de identidade entre ácidos nucleicos no nível de nucleotí- deo. A identidade de sequência de proteína pode ser determinada comparando a sequência de aminoácido em uma dada posição em cada sequência quando as sequências são alinhadas. Similarmente, a identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada com- parando a sequência de nucleotídeo em uma dada posição em cada sequência quando as sequências são alinhadas. Métodos para o ali- nhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O algoritmo BLAST calcula a identidade de sequência per- centual e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização de análise BLAST está publi- camente disponível através do website do National Center for Bio- technology Information (NCBI).
[00208] O termo "solúvel" como usado aqui em referência a proteí- nas significa que a proteína não é uma proteína de membrana. Em ge- ral, uma proteína solúvel contém apenas o domínio extracelular de um receptor membro da família I9SF, ou uma porção da mesma contendo um domínio ou domínios IgSF ou fragmentos de ligação específicos do mesmo, mas não contém o domínio de transmembrana e/ou não é ca- paz de ser expresso na superfície de uma célula. Em alguns casos, solubilidade de uma proteína pode ser aperfeiçoada através de ligação ou união, diretamente ou indiretamente através de um ligante, a um domínio Fc, que, em alguns casos, também pode aperfeiçoar a estabi- lidade e/ou meia-vida da proteína. Em alguns aspectos, uma proteína solúvel é uma proteína de fusão de Fc.
[00209] O termo "espécie" como aqui usado com relação a polipep- tídeos ou ácidos nucleicos significa um conjunto de moléculas com se- quências idênticas ou substancialmente idênticas. Variação entre poli- peptídeos que são da mesma espécie pode ocorrer devido a diferen- ças em modificação pós-traducional tais como glicosilação, fosforila- ção, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipidação. Se- quências levemente truncadas de polipeptídeos que diferem (ou codifi- cam uma diferença) da espécie de comprimento integral no terminal amino ou terminal carbóxi em não mais do que 1, 2 ou 3 resíduos de aminoácido são consideradas ser de uma espécie única. Tais micro-
heterogeneidades são uma característica comum de proteínas fabrica- das.
[00210] O termo "fragmento de ligação específica" como aqui usado em referência a um polipeptídeo ICOSL de mamífero do tipo selvagem de comprimento integral ou um domínio IgV ou IgC do mesmo significa um polipeptídeo tendo uma subsequência de um domínio IgV e/ou IgC e que se liga especificamente in vitro e/ou in vivo a uma ICOS de ma- miífero e/ou CD28 de mamífero tal como uma ICOS ou CD28 humana ou de mamífero. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica de IgV ICOSL ou IgC ICOSVL é pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do comprimento de sequência da sequência do tipo selvagem de comprimento integral. O fragmento de ligação específica pode ser alterado em sequência para formar um ICOSL variante da invenção.
[00211] O termo "se liga especificamente" como aqui usado signifi- ca a habilidade de uma proteína, sob condições de ligação especiífi- cas, em se ligar a uma proteína alvo de modo que sua afinidade ou avidez seja pelo menos 5 vezes tão grande, mas opcionalmente pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 ou 500 vezes tão grande, ou até mesmo pelo menos 1000 vezes tão grande quanto a afinidade ou avi- dez média da mesma proteína com uma coleção de peptídeos ou poli- peptídeos aleatórios de tamanho estatístico suficiente. Uma proteína se ligando especificamente não precisa se ligar exclusivamente a uma molécula-alvo única, mas pode se ligar especificamente a uma molé- cula não alvo devido à similaridade em conformação estrutural entre o alvo e não alvo (por exemplo, parálogos ou ortólogos). Aqueles de ha- bilidade reconhecerão que ligação específica a uma molécula tendo a mesma função em uma espécie diferente de animal (isto é, ortólogos) ou a uma molécula não alvo tendo um epítopo substancialmente simi- lar à molécula-alvo (por exemplo, parálogos) é possível e não desvir-
tua da especificidade de ligação que é determinada em relação a uma coleção estatisticamente válida de não alvos únicos (por exemplo, po- lipeptídeos aleatórios). Desta maneira, um polipeptídeo da invenção pode se ligar especificamente a mais de uma espécie distinta de molé- culas alvo devido à reatividade cruzada. Imunoensaios ELISA de fase sólida ou medições Biacore podem ser usados para determinar ligação específica entre duas proteínas. Em geral, interações entre duas prote- ínas de ligação têm constantes de dissociação (Ka) de menos do que 1x10º M e frequentemente tão baixas quanto 1x10? M. Em certas modalidades da presente invenção, interações entre duas proteínas de ligação têm constantes de dissociação de 1xX10º M, 1x107 M, 1x108 M, 1xX10º M, 1xX10º M ou 1x10º M.
[00212] O termo "expressa na superfície" ou "expressão na superfí- cie" ou "expresso sobre a superfície" em referência a uma célula de mamífero expressando um polipeptídeo significa que o polipeptídeo é expresso como uma proteína de membrana. Em algumas modalida- des, a proteína de membrana é uma proteína de transmembrana.
[00213] Como aqui usado, "sintético", com referência a, por exem- plo, uma molécula de ácido nucleico sintética ou um gene sintético ou um peptídeo sintético refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptídeo que é produzida através de métodos recom- binantes e/ou através de métodos de síntese química.
[00214] O termo "porção de direcionamento" como aqui usado refe- re-se a uma composição que é covalentemente ou não covalentemen- te ligada a, ou encapsula fisicamente, um polipeptídeo compreenden- do um ICOSL variante da presente invenção. Em algumas modalida- des, a porção de direcionamento tem afinidade de ligação específica com uma molécula-alvo tal como uma molécula-alvo expressa sobre uma célula. Tipicamente, a molécula-alvo está localizada em um tipo de tecido ou célula específico. Porções alvo incluem: anticorpos, frag-
mento de ligação a antígeno (Fab), fragmento variável (Fv) contendo Vr e V1, o fragmento variável de cadeia simples (scFv) contendo Vr e VL ligados em conjunto em uma cadeia, bem como outros fragmentos de região V de anticorpo, tais como Fab” , F(ab)2, F(ab” )>, diacorpo dsFv, nanocorpos, receptores solúveis, ligantes de receptor, receptores ou li- gantes amadurecidos em afinidade, bem como composição de molé- cula pequena (<500 dáltons) (por exemplo, composições de receptor de ligação específico). Porções alvo podem ser também unidas cova- lentemente ou não covalentemente à membrana de lipídeo de lipos- somos que encapsulam um polipeptídeo da presente invenção.
[00215] O termo "proteína de transmembrana" como aqui usado significa uma proteína de membrana que substancialmente ou comple- tamente abrange uma bicamada de lipídeo tais como aquelas bicama- das de lipídeo encontradas em uma membrana biológica tal como uma célula de mamífero ou em um construto artificial tal como um liposso- mo. A proteína de transmembrana compreende um domínio de trans- membrana ("domínio de transmembrana") através do qual ele é inte- grado à bicamada de lipídeo e através do qual a integração é termodi- namicamente estável sob condições fisiológicas. Domínios de trans- membrana são geralmente previsíveis de sua sequência de aminoáci- do através de qualquer número programas de software de bioinformá- tica comercialmente disponíveis com base em sua hidrofobicidade ele- vada em relação a regiões da proteína que interagem com ambientes aquosos (por exemplo, citosol, fluido extracelular). Um domínio de transmembrana é frequentemente uma hélice alfa hidrofóbica que abrange a membrana. Uma proteína de transmembrana pode passar através de ambas as camadas da bicamada de lipídeo uma vez ou múltiplas vezes. Uma proteína de transmembrana inclui as proteínas imunomoduladoras de transmembrana providas descritas aqui. Em adição ao domínio de transmembrana, uma proteína imunomoduladora de transmembrana da invenção compreende ainda um ectodomínio e, em algumas modalidades, um endodomínio.
[00216] O termo "tratando", "tratamento" ou "terapia" de uma doen- ça ou distúrbio como aqui usado significa deixar mais lento, parar ou reverter a progressão da doença ou distúrbio, como evidenciado por diminuição, parada ou eliminação de sintomas ou clínicos ou de diag- nóstico, através da administração de uma composição terapêutica (por exemplo, contendo uma proteína imunomoduladora ou células enge- nheiradas) da invenção ou sozinha ou em combinação com um outro composto como descrito aqui. "Tratando", "tratamento" ou "terapia" também significa uma diminuição na severidade de sintomas em uma doença ou distúrbio agudo ou crônico ou uma diminuição na taxa de relapso como, por exemplo, no caso de um curso de doença autoimu- ne relapsante ou remitente ou uma diminuição em inflamação no caso de um aspecto inflamatório de uma doença autoimune. Como aqui usado no contexto de câncer, o termo "tratamento" ou "inibir", "inibin- do" ou "inibição" de câncer refere-se a pelo menos um de: uma dimi- nuição estatisticamente significante na taxa de crescimento de tumor, uma parada do crescimento de tumor ou uma redução no tamanho, massa, atividade metabólica ou volume do tumor, conforme medido através de critérios padrão tal como, mas não limitado a, Critérios de Avaliação de Resposta para Tumores Sólidos (RECIST), ou um au- mento estatisticamente significante em sobrevivência livre de progres- são (PFS) ou sobrevivência total (OS). "Prevenindo", "profilaxia" ou "prevenção" de uma doença ou distúrbio como usado no contexto da presente invenção refere-se à administração de um polipeptídeo imu- nomodulador ou células engenheiradas da invenção, ou sozinhos ou em combinação com um outro composto, para prevenir a ocorrência ou início de uma doença ou distúrbio ou alguns ou todos os sintomas de uma doença ou distúrbio ou diminuir a probabilidade do início de uma doença ou distúrbio.
[00217] O termo "antígeno específico de tumor" ou "TSA" como usado aqui refere-se a uma contraestrutura que está presente princi- palmente em células de tumor de um indivíduo mamífero, mas geral- mente não encontrada em células normais do indivíduo mamífero. Um antígeno específico de tumor não precisa ser exclusivo para células de tumor, mas a porcentagem de células de um mamífero particular que têm o antígeno específico de tumor é suficientemente alta ou os níveis de antígeno específico de tumor na superfície do tumor são suficien- temente altos de modo que ele pode ser alvo de agentes terapêuticos antitumor, tais como polipeptídeos imunomoduladores da invenção, e proveem prevenção ou tratamento do mamífero dos efeitos do tumor. Em algumas modalidades, em uma amostra estatística aleatória de células de um mamífero com um tumor, pelo menos 50% das células exibindo um TSA são cancerosos. Em outras modalidades, pelo me- nos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% das células exibindo um TSA são cancerosos.
[00218] O termo "variante" (também "modificado" ou "mutante") conforme usado em referência a um ICOSL variante significa um ICOSL, tal como um ICOSL de mamífero (por exemplo, humano ou murino) criado por intervenção humana. O ICOSL variante é um poli- peptídeo tendo uma sequência de aminoácido alterada, em relação a um ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo sel- vagem. O ICOSL variante é um polipeptídeo que difere de um ICOSL de referência, tal como uma sequência da isoforma ICOSL do tipo sel- vagem, em uma ou mais modificações, tais como uma ou mais substi- tuições, deleções, adições de aminoácido ou combinações das mes- mas. Para os presentes propósitos, o ICOSL variante contém pelo menos um domino com afinidade modificada, de maneira que uma ou mais das diferenças de aminoácido ocorrem em um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV). Um ICOSL variante pode conter 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais diferenças de aminoácido, tais como substitui- ções de aminoácido.
Um polipeptídeo ICOSL variante geralmente exi- be pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem, tal como com a sequência de SEQ ID NO: 5, uma sequência madura da mesma ou uma porção da mesma contendo o domínio extracelular ou um domínio IgSF da mes- ma.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante exibe pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identi- dade de sequência com um ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem , tal como um ICOSL de referência mostrado na SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:196 ou 545. Aminoácidos de ocorrência não natural bem como aminoácidos de ocorrência natu- ral estão incluídos no escopo de substituições ou adições permissí- veis.
Um ICOSL variante não é limitado a nenhum método particular de produção e inclui, por exemplo, síntese química de novo, técnicas de DNA recombinante de novo ou uma combinação das mesmas.
Um ICOSL variante da invenção se liga especificamente a CD28, ICOS e/ou CTLA-4 de uma espécie de mamífero.
Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido alterada resulta em uma afinidade ou avi- dez de ligação alterada (isto é, aumentada ou diminuída) com ICOS e/ou CD28 comparado com a proteína ICOSL de referência (por exemplo, não modificada) ou do tipo selvagem.
Um aumento ou dimi- nuição em afinidade ou avidez de ligação pode ser determinado usan- do ensaios de ligação bem conhecidos tal como citometria de fluxo.
Larsen e outros, American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453
(2005). Vide também, Linsley e outros, Immunity, Vol. 1(9): 793-801 (1994). Um aumento em afinidade ou avidez de ligação de ICOSL va- riante com ICOS e/ou CD28 é para um valor pelo menos 5% maior do que aquele do ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem e em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% maior do que aquele do valor controle de ICOSL de referência (não modificado) ou do tipo selvagem. Uma dimi- nuição em afinidade ou avidez de ligação de ICOSL com ICOS e/ou CD28 é para um valor de não mais do que 95% dos valores controle do tipo selvagem, e em algumas modalidades não mais do que 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, ou nenhuma afinidade ou avidez de ligação detectável dos valores controle de ICOS e/ou CD28 do tipo selvagem. Um ICOSL variante é alterado em sequência de aminoácido primária através de substituição, adição ou deleção de re- síduos de aminoácido. O termo "variante" no contexto de ICOSL vari- ante não deve ser considerado como impondo nenhuma condição para nenhuma composição ou método de partida particular através do qual o ICOSL variante é criado. Um ICOSL variante pode, por exemplo, ser gerado partindo de informação de sequência de ICOSL de referência ou ICOSL de mamífero do tipo selvagem, então modelado in silico pa- ra ligação a ICOS e/ou CD28, e finalmente recombinantemente ou quimicamente sintetizado para fornecer um ICOSL variante da presen- te invenção. Em apenas um exemplo alternativo, um ICOSL variante pode ser criado através de mutagênese direcionada a sítio de um ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem. Desta maneira, ICOSL variante denota uma composição e não necessariamente um produto produzido por qualquer dado processo. Uma variedade de técnicas incluindo métodos recombinantes, síntese química, ou combinações dos mesmos, pode ser empregada.
[00219] O termo "tipo selvagem" ou "natural" ou "nativo" como aqui usado é usado em conexão com materiais biológicos tais como molé- culas de ácido nucleico, proteínas (por exemplo, ICOSL), membros da IgSF, células hospedeiras, e similar, refere-se àqueles que são encon- trados na natureza e não modificados por intervenção humana. Il. POLIPEPTÍDEOS ICOSL VARIANTES
[00220] São providos aqui polipeptídeos ICOSL variantes que exi- bem atividade ou afinidade de ligação alterada (aumentada ou diminu- ída) com uma ou mais de uma contraparte de ligação cognata de ICOSL. Em algumas modalidades, a contraparte de ligação cognata de ICOSL é um ou mais de CD28, ICOS ou CTLA-4. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante contém uma ou mais modifica- ções de aminoácidos, tais como uma ou mais substituições (alternati- vamente, "mutações" ou "substituições"), deleções ou adição, em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) (I9D) em relação a um polipeptídeo ICOSL do tipo selvagem ou não modificado ou uma porção de um ICOSL do tipo selvagem ou não modificado contendo um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) ou um fragmen- to de ligação específica do mesmo. Desta maneira, um polipeptídeo ICOSL variante provido é ou compreende um IgD variante (daqui em diante chamado "vIgD") em que a uma ou mais modificações de ami- noácido (por exemplo, substituições) estão em um IgD.
[00221] Em algumas modalidades, o ID compreende um domínio IgV ou um domínio IgC (por exemplo, IgC2) ou fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC (por exemplo, IgC2) ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o IgD pode ser um IgV apenas, a combinação do IgV e IgC, incluindo o domínio extra- celular inteiro (ECD), ou qualquer combinação de domínios lg de ICOSL. A Tabela 2 provê resíduos exemplares que correspondem a regiões de IgV ou IgC de ICOSL. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo ICOSL variante contém um domínio IgV ou um domínio IgC ou fragmentos de ligação específicos do mesmo em que a pelo menos uma das modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) es- tá no domínio IgV ou no domínio IgC ou um fragmento de ligação es- pecífica do mesmo. Em algumas modalidades, em virtude da atividade ou afinidade de ligação alterada, o domínio IgV ou domínio IgC é um domínio IgSF com afinidade modificada.
[00222] Em algumas modalidades, a variante é modificada em um ou mais domínios I9SF em relação à sequência de uma sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado). Em algumas mo- dalidades, a sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) é um ICOSL do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem tem a sequência de um ICOSL nativo ou um ortólogos da mesma. Em algumas modalidades, o ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou tipo selvagem é ou compreende o domínio extracelular (ECD) de ICOSL ou uma porção do mesmo contendo um ou mais do- mínio IgSF (vide Tabela 2). Em algumas modalidades, o domínio ex- tracelular de um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem compreende um domínio IgV e um domínio IgC ou domínios. No entanto, o polipeptídeo ICOSL variante não precisa compreende ambos o domínio IgV e o domínio IgC ou domínios. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende ou consiste essencialmente no domínio IgV ou um frag- mento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende ou consiste essencialmente no domínio IgC ou fragmentos de ligação específicos do mesmo. Em algumas modalidades, o ICOSL variante é solúvel e não tem um do- mínio de transmembrana. Em algumas modalidades, o ICOSL variante compreende ainda um domínio e transmembrana e, em alguns casos, também um domínio citoplásmico.
[00223] Em algumas modalidades, a sequência de ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é uma se- quência de ICOSL de mamífero. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem pode ser um ICOSL de mamífero que inclui, mas não é limi- tado a, ser humano, camundongo, macaco cynomolgus ou rato. Em algumas modalidades, a sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é humana.
[00224] Em algumas modalidades, a sequência de ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem tem (i) a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:5 ou uma forma ma- dura da mesma sem a sequência de sinal, (ii) uma sequência de ami- noácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identi- dade de sequência com SEQ ID NO:5 ou a forma madura da mesma ou (iii) uma porção de (i) ou (ii) contendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo.
[00225] Em algumas modalidades, a sequência de ICOSL de refe- rência é ou compreende um domínio extracelular do ICOSL ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL de referência ou do tipo selvagem compreende a sequência de aminoáci- do mostrada na SEQ ID NO:32 ou um ortólogos da mesma.
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI
ARTPSVNIGCCIENVLLOQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKN AAT (SEQ ID NO:32)
[00226] Em alguns casos, o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem pode compreender (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32 ou (iii) um frag- mento de ligação específico da sequência de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou um domínio IgC.
[00227] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL de refe- rência compreende um domínio extracelular truncado compreendendo um truncamento C-terminal com referência à sequência de domínio extracelular de ICOSL de referência mostrada na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o truncamento C-terminal é de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125 resíduos de aminoácido. Em algumas modalida- des, o truncamento C-terminal é de pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL compreendendo um truncamento C-terminal não contém, além do terminal C do ponto de truncamento, resíduos de aminoácido contíguos de um ICOSL do tipo selvagem. Desta maneira, dentre as sequências de referência de ICOSL providas estão aquelas que são mais curtas do que o domínio extracelular inteiro de um ICOSL do tipo selvagem, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL compreendendo um truncamento C-terminal não contém ou não é fundido aos resíduos de aminoácido de um domínio ICOSL além do domínio extracelular.
[00228] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado, tal como mutado ou deletado, em um ou mais sítio de clivagem de protease. Como aqui verificado, polipeptídeo ICOSL do tipo selvagem contém um sítio de clivagem de protease que, em al-
guns casos, resulta em clivagem da proteína quando da expressão em células, por exemplo, células de Ovário de Hamster Chinês, dessa maneira resultando em um produto heterogêneo de espécies múltiplas, incluindo espécies de comprimentos ou tamanhos diferentes. Por exemplo, clivagem do polipeptídeo ICOSL pode ocorrer no sítio de cli- vagem de protease LOQN/LT entre os resíduos 207 e 208 de SEQ ID NO: 32 ("/" indica sítio de clivagem potencial). Em algumas modalida- des, o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em ou carece de um sítio de clivagem mostrado como aminoácidos 204-209 de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL truncado é mais resistente à clivagem de protease comparado com um polipeptí- deo ICOSL do tipo selvagem ou não truncado. Truncamentos de ECD de polipeptídeo ICOSL truncado exemplares sem toda ou uma porção do sítio de clivagem de protease LOQN/LT (designados Truncamentos H2, H3, H4, H5, 46, 7 ou H8) são providos nas SEQ ID NOS: 600-606. Truncamento H2:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLQQNL (SEQ ID NO: 600) Truncamento *3:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLQOQNLTVGSOQO (SEQ ID NO: 601) Truncamento 4:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLQOQN (SEQ ID NO: 602) Truncamento t5:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLOO (SEQ ID NO: 603) Truncamento 6:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLL (SEQ ID NO: 604) Truncamento t7:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIEN (SEQ ID NO: 605) Truncamento *8:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT
CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLQQNLT (SEQ ID NO: 606)
[00229] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em um ou mais aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 204-209 com referência à SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modifi- cação de aminoácido, por exemplo, substituição em um ICOSL de re- ferência ou fragmento de ligação específica do mesmo corresponden- do à(s) posição(ões) 207 e/ou 208 com referência à numeração de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, subs- tituição, selecionada de N207A, N207G, L208G, ou uma modificação de aminoácido conservativa, por exemplo, substituição da mesma. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, é N207A/L208G ou N207G/L208G. Em algumas modalidades, os ECDs de referência de comprimento integral ou ECDs de referência truncados do polipeptídeo ICOSL variante são modifica- dos para conter uma ou mais modificações de aminoácido, por exem- plo, substituições, selecionadas e N207A, N207G, L208G ou uma mo- dificação de aminoácido conservativa. ECDs de referência de compri- mento integral ou truncados com uma ou mais modificações são mos- trados nas SEQ ID NOs: 607-628. Sequências de referência exempla- res contendo mutações no sítio de clivagem N207 e/ou L208 com refe- rência a posições são mostradas na SEQ ID NO: 32 são mostradas nas SEQ ID NOs: 624-628. Em alguns casos, as modificações provi- das podem reduzir a clivagem por protease do polipeptídeo ICOSL, tal como clivagem que pode ocorrer no sítio de clivagem por protease LQQN/LT.
[00230] Em algumas modalidades, combinações das estratégias de truncamento e modificação acima podem ser empregadas em uma se- quência de ECD de ICOSL de referência. Em algumas modalidades, as modificações, por exemplo, substituições, são feitas em um polipep- tídeo ICOSL de referência truncado tal como sequência de ICOSL de referência exemplar mostrada nas SEQ ID NOs: 600-606. Sequências de polipeptídeo ICOSL variante exemplares com modificações no(s)
sítio(s) de clivagem por protease potencial(ais) N207 e/ou N208 são mostradas nas SEQ ID NOs: 607-628. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe clivagem por protease diminuída comparado com polipeptídeo ICOSL do tipo selvagem, tal como con- tendo a sequência de ECD mostrada na SEQ ID NO: 32.
[00231] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem compreende um domínio IgV ou um domínio IgC ou um fragmento de ligação espe- cífica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referên- cia ICOSL contendo um domínio IgV compreende a sequência de ami- noácido mostrada na SEQ ID NO: 196 (correspondendo aos resíduos de aminoácido 19-129 de SEQ ID NO: 5) ou um ortólogo do mesmo. DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVY- VYWQTSESKTVVTYHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGML- RGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQOSLGFQEVLSVE (SEQ |D NO:196)
[00232] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL de refe- rência contendo o domínio IgV contém pelo menos os aminoácidos 1- 112, 1-113, 1-114, 1-115, 1-116, 1-117, 1-118, 1-119, 1-120, 1-121, 1- 122, com referência à numeração mostrada na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de referência ICOSL contendo um domínio IgV compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 545 (correspondendo aos resíduos de aminoácido 19-140 de SEQ ID NO: 5) ou um ortólogo do mesmo. Em algumas modalida- des, o domínio IgV é o único domínio IgSF do polipeptídeo de referên- cia ICOSL.
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT
YHIPQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSV (SEQ ID NO: 545)
[00233] Em algumas modalidades, o domínio IgV do polipeptídeo
ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem pode conter (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 196 ou 545, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo me- nos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 196 ou 545 ou (iii) um fragmento de ligação específica da sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 196 ou 545 ou um frag- mento de ligação específica de uma sequência de (i) ou (ii). Em algu- mas modalidades, o domínio IgV de referência (por exemplo, não mo- dificado) é capaz de se ligar a uma ou mais proteínas de ligação cog- natas de ICOSL, tal como uma ou mais de CD28, ICOS ou CTLA-4.
[00234] Em algumas modalidades, o domínio IgC do polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem compreende a sequência de aminoácido mostrada como resíduos 141-227 de SEQ ID NO: 5 ou um ortólogo da mesma. Por exemplo, o domínio IgC do polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem pode conter (i) a sequência de ami- noácidos dos resíduos mostrados 141-227 de SEQ ID NO: 5, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com os resíduos 141-227 de SEQ ID NO: 5 ou (ii), (i) ou (ii). Em algumas modalidades, o domínio IgV de referência é capaz de se ligar a uma ou mais proteínas de ligação cognatas de ICOSL.
[00235] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ICOSL de re- ferência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem contém um fragmento de ligação específica de ICOSL, tal como um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC. Em algumas modalidades o fragmento de ligação específica pode se ligar a CD28, ICOS e/ou CTLA-4. O fragmento de ligação específica pode ter um comprimento de aminoácido de pelo menos 50 aminoácidos, tal como pelo menos 60, 70, 80, 90, 100 ou 110 aminoácidos. Em algumas mo- dalidades, o fragmento de ligação específica do domínio IgV contém uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% do comprimento do domínio IgV mostrado como aminoácidos 19- 129 de SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, o fragmento de liga- ção específica do domínio IgC compreende uma sequência de amino- ácido que é pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% do comprimento do domínio IgC mostrado como aminoácidos 141-227 de SEQ ID NO:5.
[00236] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende o domínio ECD, um domínio ECD truncado ou uma por- ção do mesmo compreendendo um ou mais domínios IgSF com afini- dade modificada. Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL variantes podem compreender um domínio IgV ou um domínio IgC, em que um ou mais dos domínios IgSF (IgV ou IgC) ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou um fragmento de ligação especí- fica do domínio IgC contém a uma ou mais modificações de aminoáci- do (por exemplo, substituições). Em algumas modalidades, os polipep- tídeos ICOSL variantes podem compreender um domínio IgV e um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV e um fragmento de ligação específica do domínio IgC. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um domínio IgV de comprimento integral. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um domínio IgC de comprimento integral. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgC. Em algumas modalidades, o po-
lipeptídeo ICOSL variante compreende um domínio IgV de comprimen- to integral e um domínio IgC de comprimento integral. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um domínio IgV de comprimento integral e um fragmento de ligação específica de um domínio IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL va- riante compreende um fragmento de ligação específica de um domínio IgV e um domínio IgC de comprimento integral. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de um domínio IgV e um fragmento de ligação es- pecífica de um domínio IgC.
[00237] Em qualquer uma de tais modalidades, a uma ou mais mo- dificações de aminoácido (por exemplo, substituições) dos polipeptí- deos ICOSL variantes podem estar localizadas em qualquer um ou mais dos domínios de polipeptídeo ICOSL. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido estão locali- zadas no domínio extracelular (ECD) do polipeptídeo ICOSL variante, tal como mostrado na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido estão localizadas no domínio IgV ou fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas mo- dalidades, uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) estão localizadas no domínio IgC ou fragmento de liga- ção específica do domínio IgC.
[00238] Em geral, cada um dos vários atributos de polipeptídeos é separadamente revelado abaixo (por exemplo, polipeptídeos solúveis, secretáveis e ligados à membrana, afinidade de ICOSL com CD28, ICOS e CTLA-4, número de variações por cadeia de polipeptídeo, nú- mero de cadeias de polipeptídeo ligadas, o número e a natureza de alterações de aminoácido por ICOSL variante, etc). No entanto, como ficará claro para o versado na técnica, qualquer polipeptídeo particular pode compreender uma combinação desses atributos independentes.
É compreendido que referências a aminoácidos, incluindo a uma se- quência específica mostrada como SEQ ID NO. usada para descrever organização de domínio de um domínio IgSF, são para propósitos ilus- trativos apenas e não pretendem limitar o escopo das modalidades providas. É compreendido que polipeptídeos e a descrição de seus domínios são teoricamente derivados com base em análise de homo- logia e alinhamentos com moléculas similares. Desta maneira, o local exato pode variar, e não é necessariamente o mesmo para cada prote- ína. Desta maneira, o domínio IgSF específico, tal como domínio IgV ou domínio IgC específico, pode ser de vários aminoácidos (tal como um, dois, três ou quatro) mais longo ou mais curto.
[00239] Ainda, várias modalidades da invenção como discutido abaixo são frequentemente providas dentro do significado de um termo definido como revelado acima. As modalidades descritas em uma defi- nição particular devem ser então interpretadas como sendo incorpora- das a título de referência quando o termo definido é utilizado em dis- cussão dos vários aspectos e atributos descritos aqui. Desta maneira, os cabeçalhos, a ordem de apresentação dos vários aspectos e moda- lidades e a descrição separada de cada atributo independente não pretendem ser uma limitação do escopo da presente invenção. A. Modificações Exemplares
[00240] São providos aqui polipeptídeos ICOSL variantes contendo pelo menos um domínio IgSF com afinidade modificada (por exemplo, IgV ou IgC) ou um fragmento de ligação específica do mesmo em um domínio IgSF contido em um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem ou não modificado de maneira que o polipeptídeo ICOSL variante exibe atividade ou afinida- de de ligação alterada (aumentada ou diminuída) com um ou mais |i- gantes COS, CD28 ou CTLA-4 comparado com um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva-
gem. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação com CD28, ICOS e/ou CTLA-4 que difere daquela de uma sequência controle de polipeptídeo ICOSL de referên- cia (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem conforme de- terminado através de, por exemplo, imunoensaio ELISA de fase sólida, ensaios de citometria de fluxo ou Biacore. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28, ICOS e/ou CTLA-4. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28, ICOS e/ou CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. O CD28, ICOS e/ou o CTLA-4 podem ser uma proteína de mamífero, tal como uma proteína humana ou uma proteína de murino.
[00241] Afinidades de ligação com cada uma das contrapartes de ligação cognatas são independentes, isto é, em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumen- tada com um, dois ou três de CD28, ICOS e/ou CTLA e uma afinidade de ligação diminuída com um, dois ou três de CD28, ICOS e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00242] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante tem uma afinidade de ligação aumentada com ICOS, com relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante em uma afinidade de ligação aumentada com CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí-
deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exem- plo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem afinidade de ligação diminuída com ICOS, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exem- plo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CTLA-A4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00243] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e ICOS, em rela- ção a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modifi- cado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e uma afinidade de ligação diminuída com ICOS, em relação a um poli- peptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e ICOS, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e uma afinidade de ligação aumentada com ICOS, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00244] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e uma afinidade de ligação diminuída com CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e CTLA-, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e uma afini- dade de ligação aumentada com CTLA-4, em relação a um polipeptí- deo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo sel- vagem.
[00245] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com ICOS e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com ICOS e uma afinidade de ligação diminuída com CLTA-A4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com ICOS e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com ICOS e uma afinidade de ligação aumentada com CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00246] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28, ICOS e CTLA-A, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e ICOS e uma afinidade de ligação diminuída com CTLA-A4,
em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28 e CTLA-, e uma afinidade de ligação diminuída com ICOS, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e ICOS, e uma afinidade de ligação aumentada com CTLA-A, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28 e uma afinidade de ligação aumentada com ICOS e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada com CD28, e uma afinidade de ligação diminuída com ICOS e CTLA-4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28, CTLA-4 e ICOS, em relação a um polipeptídeo ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação diminuída com CD28, e uma afinidade de ligação aumenta- da com ICOS e CTLA-A4, em relação a um polipeptídeo ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00247] Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante com afinidade de ligação aumentada ou maior com CD28, ICOS e/ou CLTA-4 terá um aumento em afinidade de ligação com relação ao con- trole de polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modifica- do) ou do tipo selvagem de pelo menos cerca de 5%, tal como pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 35% ou 50% para a CD28, ICOS e/ou CTLA-4. Em algumas modalidades, o aumento em afinida- de de ligação com relação ao polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes 40 vezes ou 50 vezes. Em tais exemplos, o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem tem a mesma sequência que o polipeptí- deo ICOSL variante exceto que ele não contém a uma ou mais modifi- cações de aminoácido (por exemplo, substituições).
[00248] Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante com afinidade de ligação reduzida ou diminuída com CD28, ICOS e/ou CTLA-A4 terá diminuição em afinidade de ligação com relação ao con- trole de polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modifica- do) ou do tipo selvagem de pelo menos 5%, tal como pelo menos cer- ca de 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da CD28, ICOSL e/ou CTLA-4. Em algumas modalidades, a diminui- ção em afinidade de ligação em relação ao polipeptídeo ICOSL de re- ferência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes 40 vezes ou 50 vezes. Em tais exemplos, o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem tem a mesma sequên- cia que o polipeptídeo ICOSL variante exceto que ele não contém a uma ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, substituições.
[00249] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Ka) de qualquer uma das modalidades acima para CD28, ICOS e/ou CTLA-4 pode ser menos do que 1xX10º M, 1x106 M, 1107 M, 1xX108 M, 1xX10º M, 1xX10º M ou 1xX10- IM ou 1xX10 2 M.
[00250] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma afinidade de ligação aumentada ou maior com CD28. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante com afinidade de ligação aumentada ou maior com CD28 terá um aumento em afinidade de ligação com relação ao controle de polipeptídeo ICOSL de referên- cia (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem de pelo menos cerca de 25%, tal como pelo menos cerca de 30%, 40%, 50% ou 60% com CD28. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante com afinidade de ligação aumentada ou maior com CD28 tem uma constante de dissociação de equilíbrio (Ka) de menos do que 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM ou 600 pM com CD28. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo variante se liga especificamente ao ectodomínio de um de ICOS, CD28 ou CTLA-4 com seletividade aumentada com- parado com o ICOSL não modificado. Em algumas modalidades, a se- letividade aumentada é para CD28. Em algumas modalidades, a sele- tividade aumentada compreende uma razão maior de ligação do poli- peptídeo ICOSL variante a uma contraparte de ligação cognata seleci- onada dentre ICOS, CD28 e CLTA-4 versus uma outra da contraparte de ligação cognata comparado com a razão de ligação do polipeptídeo ICOSL não modificado a a uma ou mais contraparte de ligação cogna- ta versus a uma outra da contraparte de ligação. Em algumas modali- dades, a razão é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,5 vez, 2,0-fold, 3,0-fold, 4,0-fold, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, vezes, 40 vezes, 50 vezes ou mais.
[00251] A sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não modificada) ou do tipo selvagem não tem necessariamente que ser usada como uma composição de partida para gerar polipeptídeos ICOSL variantes descritos aqui. Desta maneira, uso do termo "modifi- cação", tal como "substituição", não implica que as presentes modali- dades são limitadas a um método particular de produção de polipeptí- deos ICOSL. Polipeptídeos ICOSL variantes podem ser feitos, por exemplo, através de síntese de peptídeo de novo e desta maneira não requerem necessariamente uma modificação, tal como uma "substitui- ção", no sentido de alteração de um códon para codificar a modifica- ção, por exemplo, substituição. Este princípio também se estende aos termos "adição" e "deleção" de um resíduo de aminoácido que da mesma maneira não implica em um método particular de produção. O meio através do qual os polipeptídeos ICOSL variantes são projetados ou criados não é limitado a nenhum método particular. Em algumas modalidades, no entanto, um ácido nucleico de codificação de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é mutagenizado a partir de material genético de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem e avaliado quando à afinidade de ligação específica desejada e/ou indução de expressão de IFN-gama ou outra atividade funcional. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante é sintetizado de novo utilizando se- quências de proteína e ácido nucleico disponíveis em qualquer número de bancos de dados publicamente disponíveis e então subsequente- mente avaliado. O National Center for Biotechnology Information provê tal informação e seu website é publicamente acessível pela internet como é o banco de dados UniProtKB como anteriormente discutido.
[00252] A menos que de outro modo declarado, como indicado ao longo do presente pedido, a(s) modificação(ões) de aminoácido é de- signada pelo número da posição do aminoácido correspondendo à numeração de posições de sequência do ECD de referência mostrada na SEQ ID NO:32. Está dentro do nível de um versado na técnica identificar a posição correspondente de uma modificação, por exem- plo, substituição de aminoácido, em um polipeptídeo ICOSL, incluindo porção do mesmo contendo um domínio IgSF (por exemplo, IgV) do mesmo, tal como através de alinhamento de uma sequência de refe- rência (por exemplo, SEQ ID NOs: 196, 545, 600-628) com SEQ ID
NO:32. Na listagem de modificações ao longo da descrição, a posição de aminoácido é indicada no meio, com o aminoácido não modificado de referência correspondente (por exemplo, não modificado ou do tipo selvagem) listado antes do número e a substituição de aminoácido va- riante identificada listada após o número. Se a modificação for uma deleção da posição um "del" é indicado e se a modificação for uma in- serção na posição um "ins" é indicado. Em alguns casos, uma inserção é listada com a posição do aminoácido indicada no meio, com o ami- noácido de referência correspondente listado antes e após o número e a inserção de aminoácido variante identificada listada após o aminoá- cido não modificado (por exemplo, tipo selvagem).
[00253] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, substitui- ção em uma sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não modificada) ou do tipo selvagem. A uma ou mais modificação de ami- noácido, por exemplo, substituição, pode ser no ectodomínio (domínio extracelular) da sequência de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição está no domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algu- mas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição está no domínio IgG ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades do polipeptídeo ICOSL variante, algumas da uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição está no domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, e alguma da uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, está no domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
[00254] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou modificações de aminoácido, isto é, substituição. A modificação, por exemplo, substituição, pode ser no domínio IgV ou no domínio IgC.. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácido no domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácido no domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem ou fragmen- to de ligação específica do mesmo, tal como com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO:32, 196 ou 545.
[00255] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à posição 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 77, 78, 75, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à(s) posição(ões) 10, 11,13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67,
71,72, 74, 77, 78, 75, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo corres- pondendo à(s) posição(ões) 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com re- ferência à numeração de SEQ ID NO:32.
[00256] Em algumas modalidades, tais polipeptídeos ICOSL varian- tes exibem afinidade de ligação alterada com um ou mais de CD28, ICOS e/ou CTLA-4 comparado com o polipeptídeo ICOSL de referên- cia (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afini- dade aumentada com CD28, ICOS e/ou CTLA-4 comparado com um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante exibe afinidade de ligação diminuída com CD28, ICOS e CTLA-4 comparado com um polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00257] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui-
ção selecionada de M10V, M10I, VI1TE, S13G, E16V, S18R, A20OV, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, QO37R, K42E, Y47H, T43A, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, LOG, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1O07A, V1O07I, S109G, S109N, V110D, V11ON, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S1261T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F,1143V, 1143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, NI55H, N155Q, K156M, D158G, L161P, LI61M, L1660, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190S, T190A, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S8212G, D217V, 1218T, 1218N, E220G, R221G, R221I|, 1224V, T225A, N227K ou uma modificação de aminoácido conservativa, por exemplo, substituição do mesmo.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de M1O0V, M10I, VI11TE, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, O37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M,
Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, LI102R, G103E, V107A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11ON, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120l, F120S, S121G, V122A, V1I22M, S126R,8126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N144D, Y146C, V1I151A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L1660Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R221], R221K, 1224V, T225A, T2258S, N227K ou uma substituição de aminoá- cido conservativa do mesmo.
[00258] Uma modificação de aminoácido conservativa, por exem- plo, substituição, é qualquer aminoácido que se encaixe na mesma classe de aminoácidos que os aminoácidos substituídos, que não o aminoácido de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. As classes de aminoácido são alifático (glicina, alanina, va- lina, leucina e isoleucina), contendo hidroxila ou enxofre (serina, ciste- ína, treonina e metionina), cíclico (prolina), aromático (fenilalanina, ti- rosina, triptofano), básico (histidina, lisina e arginina) e ácido/amida (aspartato, glutamato, asparagina e glutamina).
[00259] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção, selecionada de M10V, M10I, VI1TE, S13G, E16V, S18R, A20OV, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y,R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F,
L961, V97A, LO8F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, G103E, L102R, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110D, V11ON, V110A, E1l11del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N1190, F120l, F120S, S121G, V122A, V1I22M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F, 1143V, 1143T, N144D, Y146C, VI151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, NI55H, N155Q, K156M, D158G, L161P, LI61M, L1660, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S8212G, D217V, 1218T, 1218N, E220G, R221G, R2211, 1224V, T225A ou N227K.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de M1OV, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A2ZOV, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, O37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N570Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L961, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11O0N, E1l11del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120l, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N1I44D, Y146C, V1I51A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V1I93A, VI93M, N194D, C198R,
N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T225S, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
[00260] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, é N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/ C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/ Q100P, N52S/G103E, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/ C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/ H129P/C198R, N52H/L161P/ C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/ V151A, N52H/1143T, N528S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/ L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/ Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/ F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/ V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/ Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/ Q100P, N52H/N57Y/R618S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/ V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N528/F1208S, N528S/ V97A, N528S/G72R, N52S/A7T1T/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/ V1O07A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V1I10D/S132F/M175T, E16V/N 52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/ N57Y/Q100R/V11ON/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/ F1728/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/VI11ON, N528S/H94E/ L96I/ S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, AZOT/N52D/ Y146C/ Q164L, V1IIE/N3O0D/N52H/N57Y/H94E/L96//L98F/N1I94D/ — V210A/ 1218T, N528S/H94E/L961/V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/ S126T/ W153R/1218N, M10V/S18R/N30D/N528S/S126R/T139S/L203F, S25G/ N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N528S/L67P/Q100K/D217G/ R221K/
T2258, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/V110D/F1728/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/ Q100R/ V110D/E135K/L1738S/C198R, — N52H/N57Y/VI10A/C198R/ — R221I, M10I/S13G/N52H/N57 Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728/ — V193M, C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F1208S/ C198R, N52H/ N57Y/Q100R/VI110D/H115R/C198R, — N52H/N57Y/ — Q100R/V110D/ N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E90A, N30D/ K42E/N528S, N52S/F1208S/1143V/1224V, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/ C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/NI94D, N52H/ N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N528S/S54P, T38P/N528S/ N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/ Q100R/C198R, N52H/ N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/ L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N528S/F120S/N227K, N528S/A7 1T/A117T/T190A/ C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/ V1I10D/F172S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/ — N57Y/Q100R/V1IO7I/V110D/ N54F/C198R/R221G, Q100R, F138L/ L203P, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/ L203P, Q100R/F138L, L203P, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/143V/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ H115R/F1728S/C198R, N52H/V1I22A/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728S/N194D, N52H/ N57Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/ Q100R/H115R/143T/F1728, N52H/ — N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, — E16V/N52H/N57Y/Q100R/ — V1I10D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, N52S/E9O0A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221], N30D/K42E/N528S/H115R/
C198R, N30D/K42E/N528S/H115R/F1728/ N194D, N52S/H115R/ F1208S/143V/C198R, N528S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/ F172S/C198R, N52H/ N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/ C198R, N52H/Q100R/ H115R/F172S, N52H/Q100R/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115Q/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R /F1728S/ C198R, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/ N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/ N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/ N84Q/N207Q, N84Q/ N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/ N155H/N207Q, N155Q/ N168Q/N207Q, N119Q/NISSQ/NI68Q, N119Q/ N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N1I55H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/ N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/ N168Q/N207Q, N52Q/ N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/ N168Q, N52Q/ N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/ N155Q/N1I68Q, N84Q/ N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/ N1I55Q/N207Q, N52Q/N84Q/ N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q/N207Q, N52A/N57F/ Q100S, N52A/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/ Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/ Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/0100P, N52Q/N57F, N52Q0/ N578/Q100A, N52R/ N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/ Q1008S, N52S/N57A/ Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q1008, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N528S/ N57Y/ Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/ N57Y/ Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/ Q100R, N52L/ N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/ N57F/ Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/ Q1008,
N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/ N57E/ Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/ N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/ N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
[00261] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/ N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/ T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N528S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/ S54P, N52K/L208P, N528S/Y152H, N52D/V151A, N52H/1143T, N528/ L80P, F120S/Y1I52H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, — N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, — N52S/N57Y/ H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N528/G103E, N52H/F78L/ Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57 Y/R75Q/Q100R/ V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/ Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57 Y/ R618/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F1728, N52H/N57Y, N528/F120S, N52S/V97A, N528/G72R, N528S/A71T/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V1I0O7A/F120S, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/ S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F1728/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/VI1ON, — N52S/H94E/L961/S109N/L166Q, —S18R/ N52S/F93L/I143V/R221G, A2Z2OT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/ N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N528S/H94E/L961/ V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S8126T/W153R/1218N, M10OV/ S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N528S/F120S/ N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/T2258S, N52H/N57Y/
Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/ L1738S/C198R, N52H/N57Y/V1I10A/C198R/R2211, M101I/S13G/N52H/ N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/VI93M,C198R, N52H/N57Y/ R61C/Y62F/Q100R/V11O0N/F1208S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9OA, N30D/K42E/N52S, N52S/ F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N528S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/ T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57 Y/LT4Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/ F120S/N227K, N528S/AT1IT/A117T/TI190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/ L74Q/D89G/V110D/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/N154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/ N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/NI168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/ N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/ N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/ N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/ N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/ N168Q/N207Q, “N52Q/N84Q/NI55Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N168Q, N84Q/N119Q/N1I55Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, —N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/ N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, — N84Q/ N119Q/N1I55Q/N168Q/N207Q, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/
N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/ F1728/C198R, — N52H/V122A/F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S, N52H/N57Y/ Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/143T/F172S, N52H/N57Y/ Q100P/H115R/F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/F1728, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N528/E90A/H115R, N30D/K42E N528S/H115R, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R/R221]l, N30D/K42E/ N528S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F1728S/N194D, N528S/ H115R/F120S/143V/C198R, — N52S/H115R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, — N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F172S, N52H/Q100R/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/ Q100S, N52A/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/0100P, N52Q/N57F, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/ Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/ N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/ Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/ N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/ Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N571L/Q1008S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/
Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/ N57T/Q100L, N57Q/Q100P, S54F/VI9SA ou R26S/N52H/N57Y/ V110D/T137A/C198R.
[00262] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das mutações listadas na Tabela 1. A Ta- bela 1 também provê sequências exemplares através de referência à SEQ ID NO. para o domínio extracelular (ECD) ou domínio IgV de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem ou polipeptídeos ICOSL variantes exemplares. Como indicado, o local exato ou resíduos correspondendo a um dado domínio podem variar, tal como dependendo dos métodos usados para identificar ou classificar o domínio. Também, em alguns casos, aminoácidos N- e/ou C-terminais adjacentes de um dado domínio (por exemplo, IgV) podem ser também incluídos em uma sequência de um polipeptídeo IgSF va- riante, de modo a assegurar dobra apropriada do domínio quando ex- presso. Desta maneira, é compreendido que a exemplificação das SEQ ID NOs. na Tabela 1 não deve ser considerada como limitante. Por exemplo, o domínio particular, tal como o domínio ECD, de um po- lipeptídeo ICOSL variante pode ser de vários aminoácidos mais longo ou mais curto, tal como 1-10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 amino- ácidos mais longo ou mais curto, do que a sequência de aminoácidos mostrada na respectiva SEQ ID NO.
[00263] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das mutações listadas na Tabela 1. Em alguns exemplos, as mutações são feitas em um ICOSL de referência contendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, um ICOSL de referência que contém o domínio IgV de ICOSL mostra- do nas SEQ ID NOs: 196 ou 545 ou um ICOSL de referência que é truncado e/ou modificado contendo a sequência de aminoácidos mos-
trada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 600-628. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS:109-142, 239, 280-325, 364- 381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipep- tídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identi- dade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exem- plo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação es- pecífica de qualquer uma das sequências de domínio (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma de SEQ ID NOS:109-142, 239, 280- 325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-635) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00264] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualguer uma das SEQ ID NOs: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424,427-433, 435-470, 638-685, 905, 908). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92%
de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de iden- tidade com qualquer uma das sequências do domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualguer uma das SEQ ID NOs: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424,427-433, 435-470, 638-685, 905, 908) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exem- plo, substituição(ões) não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de domínio extra- celular (ECD) listadas na Tabela 1 (qualquer uma das SEQ ID NOs: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424,427-433, 435-470, 638-685, 905-908) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00265] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma se- quência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pe- lo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo me- nos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOs:197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma de SEQ ID NOs:197- 199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546- 599, 686-857) e contém a(s) substituição(ões) de aminoácido não pre- sente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00266] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOs: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de iden- tidade com qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOs: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910) e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o po- lipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação espe- cífica de qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (qualquer uma das SEQ ID NOs: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910) e contém a(s) substituição(ões) de aminoácido não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva-
gem.
[00267] “Mutações designadas com um "X" indicam que a posição designada contém um Q ou o resíduo do tipo selvagem mostrado na posição correspondente de SEQ ID NO: 32.
N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/ 142 789. 560 [ais a
E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ 300 795. 796 ste o
Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/ 301 797.798 aerea
N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/ 303 799. 800 setar
V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L961/L98F/N194D/ 308 807, 808 atoa a
N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S126TW153R/ 310 810, 811 A sem o
S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/ 316 819, 820 ae
M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/ 318 823, 824 Lnsnmeasmentera
N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/ 319 825, 826 ESA RA Ra
N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/N154F/C198R/ 381 835. 836 [ta
E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ 795. 796 Lisa | ss | |
ETR e e) gr e me) Er e 5)
[00268] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade aumentada com o ectodomínio de CD28 comparado com o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modifica-
do) ou do tipo selvagem, tal como compreendendo a sequência mos- trada na SEQ ID NO:32,196 ou 545. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL exibe afinidade aumentada com o ectodomínio de ICOS comparado com o ICOSL de referência (por exemplo, não modi- ficado) ou do tipo selvagem, tal como compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO:32,196 ou 545. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL exibe afinidade aumentada com o ectodomínio de CD28 e o ectodomínio de ICOS comparado com o ICOSL de referên- cia (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem, tal como com- preendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO:32,196 ou 545.
[00269] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção correspondendo à posição 52, 54 ou 57. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo ICOS variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de N52H, N52D, N52Q, N528S, N52Y, N52K, S54A, S54P ou N57Y ou uma modificação de aminoácido conservativa, por exemplo, substituição do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição seleciona- da de N52H, N52D, N52S, N52K ou N57Y ou uma modificação de aminoácido conservativa, por exemplo, substituição do mesmo.
[00270] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante pode conter uma ou mais modificação de aminoácido adicional, por exemplo, substituição em adição a uma modificação de aminoácido, por exemplo, substituição em uma posição correspondendo à posição 52, 54 ou 57. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido adicional, por exemplo, substituição, é em uma posição correspondendo à 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 113, 115, 116, 117, 119, 120,
121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227. Em algumas modalidades, a uma ou mais modi- ficação de aminoácido adicional, por exemplo, substituição, é em uma posição correspondendo a 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com re- ferência à SEQ ID NO:32.
[00271] Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição seleci- onada de M10V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52H, N52D, N52S, N52Y, N52K, N52Q, S54A, S54P, N57D, N57Y, R618S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G6G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L961, V97A, L98F, S99G, Q100R, Q100K, Q100P, L102R, G103E, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110D, V11ON, V110A, E1l11del, T113E, H115R, H1150Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F1208S,S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, S142F,1143V, 1143T, N1I44D, Y146C, V1I51A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, KI56M, D158G, L161P, L1I61M, L1660, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S8212G, D217V, 1218T, 1218N, E220G, R221G, R221I|, 1224V, T225A, N227K ou uma substituição de aminoácido conservative do mesmo.
Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais mo- dificação de aminoácido adicional, por exemplo, substituição selecio- nada de M1O0V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G6G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, 037R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N520, N52R, N528S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L740Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, LI102R, G103E, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11ON, E1l11del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F1208S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N1I44D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, LI161M, LI161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V1I93M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T2258S, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
[00272] Em algumas modalidades de qualquer um dos polipeptí- deos ICOSL variantes descritos acima, o polipeptídeo ICOSL variante compreende ainda uma ou mais deleções de aminoácido correspon- dendo à posição 140 de SEQ ID NO:32.
[00273] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/
C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N528S/C198R, N52Y/ N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/ T113E, N528S/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/1143T, N528/ R75Q/L203P, N528/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N528S/S54P, T38P/ N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/ N57Y/R7T5Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/ S121G/C198R, N528/F120S/N227K, N528S/A/TIT/A117T/ T190A/ C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/ N57Y/ Q100R/V110D/S132F/M175T, — N52H/N57Y/Q100R/V10O7I/ —V110D/ N54F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/NI68Q, N52Q/N840, N52Q/ N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/ N119Q/NI155Q, — N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/ N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N1I68Q/N207Q, N52Q/ N84Q/N155Q, — N52Q/N84Q/N168Q, — N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, — N52Q/ N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, — N52Y/ F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, —N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ N43V/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728S/ C198R, “N52H/V1I22A/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728S, — N52H/N57Y/Q100R/F1728, — N52H/Q100R/H115R/ N43T/F1728S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/ F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N52S/
E9O0A/H115R, N30D/K42E/N528S/H115R, N30D/K42E/N528S/H115R/ C198R/R2211, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/ H115R/F1728S/N194D, — N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, — N528S/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, — N52H/N57Y/ Q100P HI1II5R/F1I728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/ Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F1728S/ C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728S/C198R ou N52H/N57Y/Q100R/ F1728S/C198R.
[00274] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à(s) posição(ões) 52, 57 ou 100 com referên- cia à numeração de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoáci- do, por exemplo, substituição selecionada de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N528S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ou Q100V. Em algumas modalidades, a uma ou mais modifi- cação de aminoácido, por exemplo, substituição, é N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, NB52S8/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/ L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/1143T, N528S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/ D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/ N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F1208S, N52H/F78L/Q100R,
N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/ N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, AZ2OV/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/ Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F1728, N52H/N57Y, N528/F120S, N52S/V97A, N528/G72R, N528S/A71T/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V1I0O7A/F120S, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/ S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F1728/S192G/C198R,
F27S/N52H/N57Y/VI1ON, — N52S/H94E/L961/S109N/L166Q, —S18R/ N52S/F93L/I143V/R221G, A2Z2OT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/ N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N528S/H94E/L961/ V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S8126T/W153R/1218N, M10OV/ S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N528S/F120S/ N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/T2258S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/ L1738S/ C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R2211], M10I/S13G/N52H/ N57Y/ D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/V1I93M,C198R, N52H/N57Y/ R61C/ Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9OA, N30D/K42E/N52S, N52S/ F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V1I1O0D/H115R/C198R, — N528S/S54P, —T38P/N52S/N57D, N52H/ C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57 Y/R75Q/ Q100P/V110D, N52H/N57 Y/LT4Q/V110D/S192G, N52H/S121G/
C198R, N528S/F120S/N227K, N528S/A71IT/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57 Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/V1071/V110D/N154F/ C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/ N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/ N168Q/N207Q, “N52Q/N84Q/NI55Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N168Q0, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N1I55Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, —N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ N43V/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728S/ C198R, “N52H/V1I22A/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728S, — N52H/N57Y/Q100R/F1728, — N52H/Q100R/H115R/ N43T/F1728S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/ F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N52S/ ESOA/H115R, N30D/K42E N528S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/ C198R/R221l, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N528S IH115R/F1728S/N194D, — N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, — N528S/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/ Q100P HI1II5R/F1I728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728S, — N52H/Q100R/ F1728/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/Q1008S, N52A/N57H/Q1008, N52A/
N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S, N52S/N57M/Q1008, N52S/N57Y/Q1008, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008, N52R/N57W/0100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q1008S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, — N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
[00275] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido é selecionada dentre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/ N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/ T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N528S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/ S54P, N52K/L208P, N528S/Y152H, N52D/VIS1A, N52H/11437T, N528S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N528S/R75Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, — N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, — N52S/N57Y/ H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N528/G103E, N52H/F78L/ Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57 Y/R75Q/Q100R/ V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/ Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57 Y/ R618/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F1728, N52H/N57Y, N528/F120S, N52S/V97A, N528/G72R,
N528S/A71T/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V1I0O7A/F120S, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/ S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F1728/S192G/C198R,
F27S/N52H/N57Y/VI1ON, — N52S/H94E/L961/S109N/L166Q, —S18R/ N52S/F93L/I143V/R221G, A2Z2OT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/ N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N528S/H94E/L961/ V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S8126T/W153R/1218N, M10OV/ S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N528S/F120S/ N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/T2258S, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/ L1738S/C198R, N52H/N57Y/V1I10A/C198R/R2211, M101I/S13G/N52H/ N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/VI93M,C198R, N52H/N57Y/ R61C/Y62F/Q100R/V11O0N/F1208S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9OA, N30D/K42E/N52S, N52S/ F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/ L102R/V110D/H115R/C198R, N528S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57 Y/R75Q/ Q100P/V110D, N52H/N57 Y/LT4Q/V110D/S192G, N52H/S121G/ C198R, N528S/F120S/N227K, N528S/A71IT/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57 Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V1071/V110D/1154F/ C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/ N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/
N1550Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/ N207Q0, N52Q/N84Q/NI5SSQ/NI68Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/ N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, — N52Y/F138L/L203P, — N57Y/Q100R/ C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/143V/ F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728/C198R, N52H/V122A/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/1224V, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/ Q100R/H115R/143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/ F1728S/C198R, N528/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/ K42E/N528S/H115R/C198R/R221l, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F1728S/N194D, N528S/H115R/F1208S/1143V/ C198R, N52S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/ C198R, —“N52H/N57Y/Q100P/H115R, —N52H/N57Y/Q100P/H115R/ C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/ Q100R/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/ Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/ Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/0Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/ Q100P, N52R/N57Y/Q1008S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/ N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/
Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/ N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/ Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/ N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/ Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/ Q100P ou R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R.
[00276] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G6G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100S, Q100T ou Q100V com refe- rência à SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido é selecionada dentre N52A/N57F/Q1008S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/ Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/ N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/ N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/ Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/ N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/ Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/0100K, N52R/ N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/ N578S/Q100G6G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
[00277] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52Y/N57Y/F138L/L203P, V11E/N30D/N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N52H/ N57Y/Q100R/L102R —/VIIOD/HII5R/C198R, N52H/N57Y/Q100R, N52H/Q100R, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, —N52H/ N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/V1I52C/K156M/C198R, N30D/K42E/N52S, N528S/F1208S/1143V/1224V, N528/E90A, N52H/N57Y/VI10A/C198R/ R2211, N52H/N57Y/Q100P ou N52S/N194D.
[00278] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/C198R. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R e N52H/ N57Y/Q100P.
[00279] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, substitui- ção selecionada de N52H/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52H/K92R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52K/L208P ou N52H/1143T.
[00280] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido é selecionada dentre F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N1689Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q,
N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N1I55H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q, N84Q/N1I55Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ou F138L/L203P.
[00281] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade de ligação aumentada para ligação de um dos ecto- domínios de CD28 ou ICOS e exibe afinidade de ligação diminuída pa- ra ligação ao outro dos ectodomínios de CD28 ou ICOS comparado com o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modifica- do) ou do tipo selvagem, tal como compreendendo a sequência mos- trada na SEQ ID NO:32, 196 ou 545.
[00282] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade de ligação aumentada com ICOS. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais substituição de aminoácido está em uma posi- ção correspondendo a 16, 30, 42, 52, 54, 57, 75, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 221, 224 ou 225. Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais substituições de aminoácido seleciona- das de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, 1143T, 1143V, 1224V, KI56M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R2211, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N52S, N52H, N52D, — N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y1I46C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N528S/C198R, N52S/T113E,
S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, N52S/R750Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F1728, N52H/N57Y/Q100R, N52S/NI94D, N52H/N57Y/ Q100R/L102R/V1I10D/H115R/C198R, — N528S/E90A, — N528S/F120S/ N43V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F1728S, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N528S/H115R/ F1208S/143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/ Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/ Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R , N57Y/F138L/L203P, —N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/ Q100R/H115R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728S, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, —N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ N43V/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/L102R, — H115R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q1I00R/H115R F172S/NI94D, N52H/N57Y/ H115R/F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/ N57Y/ H1II15R, N52H/QO100R/H115R/1143T F172S, N52H/N57Y/ Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ C198R, N52S/ESOA/H115R, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R/R221], N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, — N30D/K42E/N52S/H115R/F1728S/ N194D, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/ESOA/H115R, N30D/K42E/ N528S/H115R, N52A/N57H/Q1008, N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S /Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008S,
N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/ N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ou N52T/N57K/Q100P.
[00283] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade de ligação aumentada para ICOS e exibe afinidade de ligação diminuída para CD28. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituição de aminoácido adicional está em uma posição cor- respondendo à 52, 57, 80 100, 130, 152, 161 ou 198. Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N52S, N52H, N52Y, N52H, N57Y, L80P, Q100P Q100R, Q100K, V110D, S130G, Y152C, L161P, LI61IM, C198R, R221G, ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52Y/N57Y/Y152C, N52H/L161P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/L80P, A2OV/N52H/ N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R618S/Q100R/V110D/L173S, N52H/ N57Y/ Q100R/V107I/V1I10D/S132F/I154F/C198R/R221G, O37R/ N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/ N57Y/Q100R/VI110D/C198R, F27S/N52H/N57Y/VI1ON, S1I8R/N52S/ F93L/143V/R221G, A2ZOT/N52D/Y146C/Q164L, N52H/N57Y/H94E/ L961/F1201/S126T/W153R/1218N, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/ C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/V1I93M/C1 98R.
[00284] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSI variante exibe afinidade de ligação aumentada com CD28. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais substituição de aminoácido está em uma posi- ção correspondendo a 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 36, 40, 41,
42, 52, 54, 57, 63, 70, 71, 72, 74, 77, 80, 81, 84, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 102, 107, 109, 110, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 143, 144, 146, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 169, 172, 173, 178, 190, 192, 193, 194, 198, 199, 201, 203, 207, 208, 209, 212, 218, 221,224, 225 ou 227.
[00285] Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais substituições de aminoácido selecionado de A117T, A20OV, AT1T, A91G, A91G, AE88D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120l, F120S, F138L, F1728S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, 1118V, 127T, 1143T, 1143V, N154F, 1218N, 12187, 1224V, KI56M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L96I, L98F, M10I, M1OV, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N1680, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N578S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, Q133H, R221G, R221I, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S136G, S18R, S192G, S212G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T411, V1O7I, VI110A, V110D, V11E, V122A, V1I22M, VI93M, V210A, W1I53R, Y146C, Y152C, Y152H ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/ Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C,
N528S/Y152C, N528S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/ C198R, N52H/LI61P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N528S/Y152H, N52H/1143T, N528/L80P, N52S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70OQ/A91G/E117G/ 1118V/T1208S/ T130A, L7O0R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L7OQ/E81A/A91G/ N18V/T1208/1127T/ T130A, N638S/L70Q/A91G/S114T/118V /T1208S/ TI130A, T411/A091G, E8S8D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/ N178S, ESSD/K89R/D90K/A91G/ F92Y/K93R, AESSD/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R, K36G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/ N57Y/Q100R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R, N528S/F120S/N227K, N528S/ N194D, N528/F120S, N528/G72R, N528S/A7 1IT/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G, E16V/ N52H/N57 Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/C198R, V11E/N30D/N52H/N57 Y/H94E/L961/ L98F/N1I94D/V210A/1218T, — N52S/H94E/L961/V122M, — N52H/N57Y/ H94E/L961/F1201/S126T/W153R/1218N, M10V/S18R/N30D/N52S/ S126R/T1398S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57 Y/VI10A/C198R/R2211, M10I/ S13G/N52H/N57 Y/D77G/V110A/H129P/1143V/F1728S/V193M,C198R,
N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E90A, N528/F1208S/I143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ — F172S/C198R, N52Y/N57Y/ Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, — N52S/H115R/F1208S/143V/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, — N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/
H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52S/H94E/L961/ S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/ S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A2ZOV/N52H/N57Y/ Q100R/S109G, — N52H/N57Y/Q100P/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/ L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/1224V, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R HI1I1I5R/F1728/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R — F1I72S/NI94D, — N52H/N57Y/H115R/F1728S/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/1143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/K42E/ N528S/H115R/C198R R221l, N528S/E9OA/H115R, N30D/K42E/N52S/ H115R, N52S/H115R/F1728/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N168X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X, N52Q/ N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N1I55Q/N168Q, N52H/N84Q/ N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/ Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/ Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/0Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/ Q100P, N52R/N57Y/Q1008S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/ N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/ Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K,
N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/ N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/ Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ou N52T/N57K/Q100P.
[00286] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade de ligação aumentada com CD28 e exibe afinidade de ligação diminuída com ICOS. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituição de aminoácido está em uma posição corresponden- do a 52, 75 ou 203. Em algumas modalidades, o ICOSL variante con- tém uma ou mais substituição de aminoácido selecionada de N52S, R75Q, L203F ou L203P. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem as substituições de aminoácido N52S/R75Q/ L203P.
[00287] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácidos, por exemplo, substitui- ção em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à posição 16, 30, 42, 52, 57, 90, 100, 102, 110, 115, 120, 122, 138, 143, 152, 156, 172, 194, 198, 203, 221 ou 224 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modifica- ção de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N52S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F1208S, V122A, F138L, 1143V, 1143T, H152C, K156M, F172S, N194D, C198R, L203P, R2211 ou 1224V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modifi- cação de aminoácido, por exemplo, substituição em um ICOSL não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspon- dendo à posição 115, 172 ou 198 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL vari- ante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, subs-
tituição selecionada de H115R, F1728S ou C198R. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, é N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ L102R/H115R/F1728/C198R, — N52H/V122A/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728S/ C198R, —N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/ Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/ F1728S/C198R, N528S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/ K42E/N528S/H115R/C198R/R2211l, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F1208/1143V/ C198R, N52S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/ C198R, —“N52H/N57Y/Q100P/H115R, —N52H/N57Y/Q100P/H115R/ C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/ Q100R/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728S/C198R ou N52H/ N57Y/Q100R /F1728/C198R. Em algumas modalidades, os polipeptí- deos ICOSL variantes exibem solubilidade de proteína potencialmente aumentada ou expressão de proteína aumentada (mutações de solu- bilidade) comparado com o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00288] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mostradas nas SEQ ID NOs:435-470. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identida- de, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer um do do- mínio extracelular (ECD) mostrado nas SEQ ID NOS:435-470 e con- tém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substitui- ção(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mos- tradas nas SEQ ID NOS:435-470 e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) do tipo selvagem.
[00289] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante exibe afinidade de ligação aumentada com CD28 e exibe afinidade de ligação aumentada com ICOS. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituição de aminoácido está em uma posição corresponden- do a 16, 30, 42, 52, 54, 57, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 212, 224 ou 225. Em algumas modalidades, o ICOSL variante contém uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, 1143V, 1224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N578S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/ Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/ N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/ Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/ C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/ V122A, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/ N194D, — N52H/N57Y/Q100R/L102R/VI1O0D/H115R/C198R, — N52S/ E90A, N528S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728/C198 R, N52S/H115R/F120S/143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/ C198R, —“N52H/N57Y/Q100P/H115R, —N52H/N57Y/Q100P/H115R/ C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/ Q100R/H115X/F1728S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F172S8, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, —Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, —N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F1728/C198R, N52H/
N57Y/Q100R/H115R — F1I72S/NI94D, N52H/N57Y/H115R/F1728S/ C198R, —N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N528S/E90A/ H115R, N528/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R.
[00290] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à posição 52, 57, 100, 138, 198 ou 203 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de ami- noácido, por exemplo, substituição selecionada de N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R ou L203P. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, é Q100R, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L ou L203P.
[00291] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mostradas em SEQ ID NOS:427-433. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identida- de, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer um do do- mínio extracelular (ECD) mostrado nas SEQ ID NOS:427-433 e con- tém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substitui- ção(ões) presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modi- ficado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo
ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mostra- das em SEQ ID NOS: 427-433 e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões), não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende a sequência de IgV mostrada em SEQ ID NO:434. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identida- de, 98% de identidade ou 99% de identidade com a sequência de IgV mostrada em SEQ ID NO:434 e contém a(s) modificação(ões) de ami- noácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica da sequência de IgV mostrada em SEQ ID NO:434 e contém a(s) substituição(ões) de aminoácido pre- sente(s) no ICOSL do tipo selvagem ou não modificado.
[00292] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substitui- ção em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo à(s) posição(ões) 52, 84, 91, 119, 155, 168, 207 com referência à numeração de SEQ ID NO:32. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modifica- ção de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de A91S, N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição, é N84Q, N119Q, N168Q, N207Q, N520Q,
N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q /N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N840, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q0, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/ N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/ N207Q, N1I55Q/N1I68Q/N207Q, N119Q N155Q/NI68Q, N119Q/ N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/ N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/ N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/ N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/ N168Q, N52Q/N84Q/ N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/ N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ou A91S/N119Q/N168Q/N207Q. Em algumas modalidades, os polipeptí- deos ICOSL variantes exibem glicosilação potencialmente reduzida comparado com o polipeptídeo ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
[00293] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mostradas em SEQ ID NOS: 387-424, 427-433, 435-470. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identi- dade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer um do domínio extracelular (ECD) mostrado nas SEQ ID NOS:387-424, 427-433, 435-470 e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de domínio extracelular (ECD) mostradas em SEQ ID NOS: 387-424, 427- 433, 435-470 e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substituição(ões) não presente(s) no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende qualquer uma das sequências de IgV mostradas nas SEQ ID NOS:425-426. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma sequência de polipeptídeo que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências de IgV mostradas nas SEQ ID NOS:425-426 e contém a(s) modificação(ões) de aminoácido, por exemplo, substitui- ção(ões) não presentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo ICOSL variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de I|gV mostradas nas SEQ ID NOS:425-426 e contém a(s) substituição(ões) de aminoácido não pre- sentes no ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem.
Ill. FORMATO DE POLIPEPTÍDEOS VARIANTES
[00294] O polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante provido aqui pode ser formatado em uma variedade de manei- ras, incluindo como uma proteína solúvel, uma proteína ligada à mem- brana, proteína secretada, conjugado ou fusão ou para expressão por uma célula engenheirada ou agente infeccioso como descrito em outro lugar aqui. Em alguns aspectos, ambos os polipeptídeos imunomodu-
ladores compreendendo um ou mais vIgD de ICOSL ou polipeptídeos imunomoduladores compreendendo domínios IgSF múltiplos podem ser formatos em uma variedade de maneiras.
[00295] Em algumas modalidades, o formato particular pode ser escolhido para a aplicação terapêutica desejada. Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante provido em um formato para antagonizar ou bloquear ativida- de de sua contraparte de ligação cognata, por exemplo, CD28. Em al- gumas modalidades, antagonismo de CD28 pode ser útil para tratar inflamação ou autoimunidade. Em alguns casos, um polipeptídeo imu- nomodulador compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante é pro- vido em um formato para agonizar ou estimular atividade de sua con- traparte de ligação cognata, por exemplo, CD28. Em algumas modali- dades, agonismo de CD28 pode ser útil para tratamento de indicações de oncologia. Um versado na técnica pode prontamente determinar a atividade de um formato particular, tal como para antagonização ou agonização de uma ou mais contraparte de ligação cognata específica. Métodos exemplos para avaliação de tais atividades são providos aqui, incluindo nos exemplos.
[00296] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodula- dor solúvel, tal como um ICOSL variante contendo um vIgD, pode ser encapsulado dentro de um lipossomo que pode ele mesmo ser conju- gado a qualquer um de ou uma combinação dos conjugados providos (por exemplo, uma porção de direcionamento). Em algumas modalida- des, os polipeptídeos imunomoduladores solúveis ou ligados à mem- brana da invenção são desglicosilado. Em modalidades mais específi- cas, a sequência de ICOSL variante é desglicosilada. Em modalidades ainda mais específicas, o domínio ou domínios IgV e/ou IgC (por exemplo, IgC2) do ICOSL variante é/são desglicosilados.
[00297] Exemplos não limitantes de formatos providos são descritos nas FIGS. 13a-13C e descritos mais abaixo. A. POLIPEPTÍDEOS SOLÚVEIS
[00298] Em alguns aspectos, são providos polipeptídeos imunomo- duladores compreendendo um vIgD de ICOSL. Em algumas modalida- des, a proteína imunomoduladora contendo um polipeptídeo ICOSL variante é uma proteína solúvel. Aqueles de habilidade compreende- rão que proteínas da superfície celular tipicamente têm um domínio intracelular, de transmembrana e extracelular (ECD) e que uma forma solúvel de tais proteínas pode ser feita usando o domínio extracelular ou uma subsequência imunologicamente ativa do mesmo. Desta ma- neira, em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora conten- do um polipeptídeo ICOSL variante carece de um domínio de trans- membrana ou uma porção do domínio de transmembrana. Em algu- mas modalidades, a proteína imunomoduladora contendo um ICOSL variante carece do domínio intracelular (citoplásmico) ou uma porção do domínio intracelular. Em algumas modalidades, a proteína imuno- moduladora contendo o polipeptídeo ICOSL variante contém apenas a porção vIgD contendo o domínio ECD ou uma porção do mesmo con- tendo um domínio IgV e/ou IgC (por exemplo, IgC2) ou domínios ou fragmentos de ligação específica dos mesmos contendo a(s) modifica- ção(ões) de aminoácido.
[00299] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodula- dor compreendendo um ICOSL variante pode incluir um ou mais poli- peptídeos ICOSL variantes. Em alguns aspectos, um ou mais domínio IgSF adicional, tal como um ou mais vIgD adicional, pode ser ligado a um vIlgD de ICOSL como provido aqui. Em alguns aspectos, ambos os polipeptídeos imunomoduladores compreendendo um ou mais vlgD de ICOSL ou polipeptídeos imunomoduladores compreendendo domínios IgSF múltiplos podem ser formatados em uma variedade de maneiras, tal como descrito na subseção C da Seção Ill.
[00300] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodula- dor compreendendo um ICOSL variante pode incluir um ou mais poli- peptídeos ICOSL variantes da invenção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo da invenção compreenderá exatamente 1, 2, 3,4, 5 sequências de ICOSL variante. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências de ICOSL variante são sequências de ICOSL idênticas.
[00301] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador provido compreende duas ou mais sequências de vIgD de ICOSL. Po- lipeptídeos ICOSL variantes múltiplos dentro da cadeia de polipeptídeo podem ser sequências de ICOSL variante idênticas (isto é, da mesma espécie) umas às outras ou ser não idênticas (isto é, espécies diferen- tes). Em adição a modalidades de cadeia de polipeptídeo simples, em algumas modalidades, dois, três, quatro ou mais dos polipeptídeos da invenção podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados uns aos outros. Portanto, proteínas monoméricas, diméricas e de or- dem superior (por exemplo, 3, 4, 5 ou mais) são providas aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, exatamente dois polipeptídeos da invenção podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados um ao outro para formar um dímero. Em algumas modalidades, liga- ção é feita através de ligações dissulfeto de cisteína intercadeia. Com- posições compreendendo dois ou mais polipeptídeos da invençao po- dem ser de uma espécie idêntica ou espécies substancialmente idênti- cas de polipeptídeo (por exemplo, um homodímero) ou de espécies não idênticas de polipeptídeos (por exemplo, um heterodímero). Uma composição tendo uma pluralidade de polipeptídeos ligados da inven- ção pode, como mencionado acima, ter um ou mais polipeptídeos ICOSL variantes da invenção idênticos ou não idênticos em cada ca- deia de polipeptídeo.
[00302] Em alguns aspectos, um ou mais domínio IgSF adicional,
tal como um ou mais vIgD adicional, pode ser ligado a um vIlgD de ICOSL como aqui provido (daqui em diante chamada uma proteína imunomoduladora "de empilhamento" ou "empilhada"). Em algumas modalidades, o formato modular das proteínas imunomoduladoras providas provê flexibilidade para engenharia ou geração de proteínas imunomoduladoras para modulação da atividade de contraestruturas múltiplas (contrapartes de ligação cognatas múltiplas). Em algumas modalidades, tais como moléculas "de empilhamento" podem ser pro- vidas em um formato solúvel ou, em alguns casos, podem ser providas como proteínas ligadas à ou secretadas pela membrana.
[00303] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras podem conter qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes provi- dos aqui ligados, diretamente ou indiretamente, a um ou mais outro domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) (construto de prote- ína imunomoduladora "de empilhamento" e também chamada uma proteína imunomoduladora do "Tipo II"). Em alguns aspectos, isso po- de criar proteínas imunomoduladoras de multidomínio únicas que se ligam a dois ou mais, tais como três ou mais, contrapartes de ligação cognatas, desta maneira provendo uma modulação de multidireciona- mento da sinapse imune.
[00304] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora compreende uma combinação (uma "combinação do tipo não selva- gem") e/ou disposição (uma "disposição do tipo não selvagem" ou "permuta do tipo não selvagem") de um domínio ICOSL variante com uma ou mais outras sequências de domínio I9gSF com afinidade modi- ficada e/ou sem afinidade modificada de um outro membro da família IgSF (por exemplo, um membro da família IISF de mamífero) que não são encontradas em membros da família IISF do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém 2, 3,4, 5 ou 6 domínios da superfamília da imunoglobulina (I9SF), onde pelo menos um do domínio IgSF é um domínio I9SF ICOSOL variante (vligD de ICOSOL) de acordo com a descrição provida.
[00305] Em algumas modalidades, as sequências dos domínios IgSF adicionais podem ser um domínio IgSF modificado que contém uma ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, substituições, comparado com um domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o domínio IgSF pode ser sem afinidade modificada (por exemplo, do tipo selva- gem) ou ter tido afinidade modificada. Em algumas modalidades, o domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem pode ser de camundongo, rato, macaco cynomolgus, ou ori- gem humana, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalida- des, os domínios IgSF adicionais podem ser um domínio I9gSF de um membro da família IISF mostrado na Tabela 2. Em algumas modali- dades, o domínio IgSF adicional pode ser um domínio I9SF com afini- dade modificada contendo uma ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, substituições, comparado com um domínio IgSF contido em um membro da família IISF mostrado na Tabela 2.
[00306] Em algumas modalidades, o domínio IGSF adicional é um domínio I9SF com afinidade modificada ou sem afinidade modificada contido em um membro da família IQSF de uma família selecionada de Família de Proteína Reguladora de Sinal (SIRP), Família de Receptor de Disparo Expresso em Células Mieloides (TREML), Família de Molé- cula de Adesão de Célula relacionada a Antígeno Carcinoembriônico (CEACAM), Família de Lectina do tipo Ig de Ligação a Ácido Siálico (SIGLEC), Família Butirofilina, Família B7, Família CD28, Família de Contendo Domínio V-set e da Imunoglobulina (VSIG), Família de Do- mínio de Transmembrana V-set (VSTM), Família do Complexo da His- tocompatibilidade principal (MHC), Família de molécula de sinalização de ativação linfocítica (SLAM), Receptor do tipo imunoglobulina de leucócito (LIR), Família de nectina (Nec), Família do tipo nectina (NECL), Família relacionada a receptor de poliovírus (PVR), Família de receptor de disparo de citotoxidez natural (NCR), Família da imunoglo- bulina e mucina de célula T (TIM) ou Família de receptores do tipo imunoglobulina de célula assassina (KIR). Em algumas modalidades, os domínios IgSF adicionais são independentemente derivados de uma proteína IgSF selecionada do grupo consistindo em CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1ILG2(PD-L2, CD273), ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276(B7-H3), VTON1(B7- H4), CD28, CTLA-4, PDCD1(PD-1), ICOS, BTLA(CD272), CD4, CD8A (CD8-alpha), CD8B(CD8-beta), LAG3, HAVCR2(TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR(CD155), PVRL2(CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1(CD200R) e NC R3 (NKp30).
[00307] A primeira coluna da Tabela 2 provê o nome e, opcional- mente, o nome de alguns possíveis sinônimos para este membro IgSF particular. A segunda coluna provê o identificador de proteína do ban- co de dados UniProtKB, um banco de dados publicamente disponível acessível através da internet em uniprot.org.or, em alguns casos, o Número GenBank. O Universal Protein Resource (UniProt) é um recur- so compreensível para sequência de proteína e dados de anotação. Os bancos de dados UniProt incluem o UniProt Knowledgebase (Uni- ProtKB). UniProt é uma colaboração entre o European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), o SIB Swiss Institute of Bioinformatics e o Protein Information Resource (PIR) e apoiado principalmente por uma conces- são do U.S. National Institutes of Health (NIH). O GenBank é o banco de dados de sequência genética NIH, uma coleção anotada de todas as sequências de DNA publicamente disponíveis (Nucleic Acids Rese- arch, 2013 Jan;41(D1):D36-42). A terceira coluna provê a região onde o domínio IgSF indicado está localizado. A região é específica como uma faixa onde o domínio é inclusivo dos resíduos definindo a faixa. A coluna 3 também indica a classe de domínio IgSF para a região IgSF especificada.
A coluna 4 provê a região onde os domínios adicionais indicais estão localizados (peptídeo de sinal, S; domínio extracelular, E; domínio de transmembrana, T; domínio citoplásmico, C). É compre- endido que descrição de domínios pode variar dependendo dos méto- dos usados para identificar ou classificar o domínio, e pode ser identi- ficado diferentemente de fontes diferentes.
A descrição de resíduos correspondendo a um domínio na Tabela 2 é para exemplificação apenas e podem ser de vários aminoácidos (tais como um, dois, três ou quatro) mais longos ou mais curtos.
A coluna 5 indica alguns dos membros da IgSF listados, algumas de suas contrapartes de ligação de superfície celular cognatas.
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[00308] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras pro-vidas, em adição a conter um polipeptídeo ICOSL variante, tam- bém contêm pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 domínios da superfamília da imunoglobulina (I9SF) adicionais, tal como um domínio ID de um membro da família IISF mostrado na Tabela 2.
[00309] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora provida contém pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, segundo domínio I9SF). Em algumas modalidades, a proteína imuno- moduladora provida contém pelo menos dois domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo e terceiro domínios I9gSF). Em algumas moda- lidades, a proteína imunomoduladora provida contém pelo menos três domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro e quarto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora provida con- tém pelo menos quatro domínios IgSF adicionais (por exemplo, se- gundo, terceiro, quarto e quinto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora provida contém pelo menos cinco domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora provida contém pelo menos seis domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo, ter- ceiro, quarto, quinto, sexto e sétimo). Em algumas modalidades cada um dos domínios IgSF na proteína imunomoduladora é diferente. Em algumas modalidades, pelo menos um domínio IgSF adicionado é igual a pelo menos um outro domínio IgSF na proteína imunomodula- dora. Em algumas modalidades, cada um dos domínios IgSF é de ou derivado de um membro da família IgSF diferente. Em algumas moda- lidades, pelo menos dois dos domínios IgSF são de ou derivados do mesmo membro da família IGSF.
[00310] Em algumas modalidades, o domínio IQSF adicional com- preende um domínio IgV ou um domínio ou domínios IgC (por exem- plo, Ig02), ou um fragmento de ligação específico do domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2). Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um domínio IgV de comprimento integral. Em algumas modalidades, o domínio IGSF adicional é ou compreende um domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2) de comprimento integral. Em al- gumas modalidades, o domínio IQgSF adicionado é ou compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas modali- dades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios IgC (por exemplo, I1gC2). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos dois domínios IgSF adicionais a partir de um único membro IgSF (mesmo). Por exemplo, em alguns aspectos, a proteína imuno- moduladora contém um ECD ou porção do mesmo de um membro IgSF contendo um domínio IgV de comprimento integral e um domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2) de comprimento integral ou fra- gmentos de ligação específica dos mesmos.
[00311] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras providas contêm pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, um segundo ou, em alguns casos, também um terceiro domínio IgSF) em que pelo menos um domínio IgSF adicionado, por exemplo, se- gundo ou terceiro, é um domínio IISF mostrado em um domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem ou um fragmento de ligação específica do mesmo contido na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-27 e
341. Em algumas modalidades, o domínio I9SF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é um domínio IgV ou um domínio IgC, tal como um domínio IgC1 ou IgC2.
[00312] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras providas, em adição a conter um polipeptídeo ICOSL variante, também contém pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, um ou,
em alguns casos, também um terceiro domínio IISF com afinidade modificada) e outros) em que pelo menos um domínio IgSF adicional é um vIlgD que contém uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituição, deleção ou mutação) comparado com um do- mínio IgSF em um domínio IgSF de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem, tal como um domínio IgSF em um membro da família IISF mostrado na Tabela 2. Em algumas modali- dades, o domínio IQgSF adicional, por exemplo, segundo ou terceiro com afinidade modificada, compreende pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem ou um fragmento de |i- gação específico do mesmo contido na sequência de aminoácidos mos- trada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-27 e 341. Em algumas mo- dalidades, o domínio IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem é um domínio IgV ou um domínio IgC, tal como um domínio IgC1 ou IgC2. Em algumas modalidades, o domínio I9gSF adici- onal, por exemplo, segundo ou terceiro, é um domínio IgV e/ou domínio IgC com afinidade modificada.
Em algumas modalidades, o um ou mais domínio IgSF adicional é um domínio IGgSF com afinidade modificada que contém um domínio IgV e/ou domínio ou domínios IgC (por exem- plo, IgC2), ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV e/ou fragmento de ligação específica do domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2), em que o domínio IgV e/ou IgC contém a(s) modifica- ção(ões) de aminoácido (por exemplo, substituição(ões)). Em algumas modalidades, o um ou mais domínio I9gSF com afinidade modificada adicional contém um domínio IgV contendo a(s) modificação(ões) de aminoácido (por exemplo, substituição(ões)). Em algumas modalida- des, o um ou mais domínio IgSF com afinidade modificada adicional inclui domínios I9gSF presentes no ECD ou uma porção do ECD do membro da família ISSF de referência correspondente, tal como um domínio IgV de comprimento integral e um domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2) de comprimento integral, ou fragmentos de ligação específica do mesmo, em que um ou ambos do IgV e IgC contém a(s) modificação(ões) de aminoácido (por exemplo, substituição(ões)). Em algumas modalidades, o domínio particular ou cada um dos domínios particulares (por exemplo, domínio IgSF adicional, por exemplo, segun- do ou terceiro) de um polipeptídeo de domínio IgSF variante pode ser vários aminoácidos mais longo ou mais curto, tal como 1-10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos mais longo ou mais curto, do que a sequência de aminoácidos mostrada na respectiva SEQ ID NO.
[00313] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora provida contém pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, segundo ou, em alguns casos, também um terceiro domínio IgSF e assim por diante) ou segundo que é um vIgD que contém uma ou mais substituições de aminoácido comparado com um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um domínio I9SF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem diferente de ICOSL.
[00314] Em algumas modalidades, o segundo domínio IgSF ou adi- cional contém uma ou mais substituições de aminoácido comparado com um domínio I9SF em uma referência (por exemplo, não modifica- do) ou domínio IgSF do tipo selvagem, tal como um domínio I9gSF em um membro da familia IISF mostrado na Tabela 2. Em algumas moda- lidades, o segundo domínio IgSF ou adicional com afinidade modifica- da compreende pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um domínio IgSF de referência (por exemplo, não mo- dificado) ou do tipo selvagem ou um fragmento de ligação específica do mesmo contido na sequência de aminoácidos mostrada em qual- quer uma das SEQ ID NOS: 1-27. Em algumas modalidades, o domí-
nio I9gSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem é um domínio IgV ou um domínio lg, tal como um domínio I9gC1 ou IgC2. Em algumas modalidades, o segundo domínio IgSF ou adici- onal é um domínio IgV ou domínio IgC com afinidade modificada. As Tabelas 3-5 proveem polipeptídeos exemplares contendo um ou mais domínios I9SF com afinidade modificada que podem ser usados em construtos de empilhamento providos aqui.
[00315] Em algumas modalidades, o um ou mais domínio IgSF adi- cional (por exemplo, segundo domínio IgSF) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) ou um outro membro da família IISF que se liga ou re- conhece um antígeno de tumor. Em tais modalidades, o membro da família IISF serve como uma porção de localização de tumor, desta maneira trazendo o vIlgD ou ICOSL em proximidade maior com células imunes no microambiente do tumor. Em algumas modalidades, o do- mínio IgSF adicional (por exemplo, segundo domínio I9SF) é um domínio IgSF de NKP30, que se liga a ou reconhece B7-H6 expresso em uma cé- lula de tumor. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio IgSF adicional(por exemplo, segundo), por exemplo, NKP30, é um vIlgD que contém uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substi- tuições, deleções ou adições). Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácido aumentam afinidade e/ou seletividade de ligação com B7-H6 comparado com domínio IgSF de referência, por exemplo, NKP30, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes 40 vezes ou 50 vezes.
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E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/
N149S
R29D/Y31L/Q33H/K36G/M381/T41A/M42T/M43R/ 94 183
M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/
L148S/N149S
E24G/R29D/Y31L/033H/K36G/M381/T41A/M43R/ 95 184
M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/
R941L/H96R/N1498S/C182S
R29D/Y31L/Q33H/K36G/M381/T41A/MA3SR/M47T/ Lcrvieamemao memos |O |
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R29H/Y31H/T41G/Y87 N/ES8SG/K89E/D90N/A91G/ 105 192 [Rs
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Mutação(ões) SEQ ID NO ECD | SEQ ID NO Domí- |[SEQ ID NO Domí-| uv ore Meme
[00316] O número de tais domínios IGSF sem afinidade modificada ou com afinidade modificada presentes em um construto de proteína imunomoduladora "empilhada" (sejam combinações não tipo selvagem ou arranjos não tipo selvagem) é pelo menos 2, 3, 4 ou 5 e em algu- mas modalidades exatamente 2, 3, 4 ou 5 domínios IgSF (onde deter- minação do número de domínios I9SF com afinidade modificada des- considerando quaisquer sequências fracionais de ligação não específi- cas dos mesmos e/ou sequências fracionais substancialmente imuno- logicamente inativas dos mesmos).
[00317] Em algumas modalidades de uma proteína imunomodula- dora empilhada provida aqui, o número de domínios IgSF é pelo me- nos 2 onde o número de domínios IgSF com afinidade modificada e sem afinidade modificada é cada um independentemente pelo menos: O, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Desta maneira, o número de domínios I9ISF com afinidade modificada e o número de domínios IgSF não com afinidade modificada, respectivamente, (domínio IISF com afinidade modifica- da:domínio IgSF sem afinidade modificada), pode ser exatamente ou pelo menos: 2:0 (com afinidade modificada: tipo selvagem), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 ou 5:1.
[00318] Em algumas modalidades de uma proteína imunomodula- dora empilhada, pelo menos dois dos domínios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada são domínios IgSF idênti- Cos.
[00319] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora empilhada provida aqui compreende pelo menos dois domínios IgSF com afinidade modificada e/ou sem afinidade modificada de um mem- bro da IgSF único mas em um arranjo do tipo não selvagem (alternati- vamente, "permuta"). Um exemplo ilustrativo de um arranjo do tipo sel- vagem ou permutação é uma proteína imunomoduladora compreen- dendo uma ordem do tipo não selvagem de sequências de domínio IgSF com afinidade modificada e/ou sem afinidade modificada em re- lação àquelas encontradas no ICOSL do tipo selvagem cujas sequên- cias do domínio IgSF serviram como a fonte dos domínios IgSF varian- tes como provido aqui. Desta maneira, em um exemplo, a proteína imunomoduladora pode compreender um IgV proximal e um IgC distal ao domínio de transmembrana embora em uma forma sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada. A presença, em uma prote- ína imunomoduladora provida aqui, de ambas as combinações de tipo não selvagem e arranjos do tipo não selvagem de domínios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada está também den- tro do escopo da matéria objeto provida.
[00320] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora empilhada, os domínios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afi- nidade modificada são domínios IgSF não idênticos (isto é, diferentes). Domínios IgSF com afinidade modificada não idênticos se ligam espe-
cificamente, sob condições de ligação específicas, a contrapartes de ligação cognatas diferentes e são "não idênticos" sem importar se os domínios IgSF do tipo selvagem ou não modificado dos quais eles fo- ram engenheirados são iguais ou não. Desta maneira, por exemplo, uma combinação do tipo não selvagem de pelo menos dois domínios IgSF não idênticos em uma proteína imunomoduladora pode compre- ender pelo menos uma sequência de domínio IgSF cuja origem é de e única para um ICOSL, e pelo menos uma de uma segunda sequência de domínio IgSF cuja origem é de e única para um outro membro da família IISF que não é ICOSL, onde os domínios IgSF da proteína imunomoduladora estão em forma sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada. No entanto, em modalidades alternativas, os dois domínios IgSF não idênticos se originam da mesma sequência de domínio I9SF, mas pelo menos um tem afinidade modificada de ma- neira que eles se ligam especificamente a contrapartes de ligação cognatas diferentes.
[00321] Uma pluralidade de domínios I9SF sem afinidade modifica- da e/ou com afinidade modificada em uma cadeia de polipeptídeo de proteína imunomoduladora empilhada não precisa ser covalentemente ligada diretamente um ao outro. Em algumas modalidades, uma ex- tensão interveniente de um ou mais resíduos de aminoácido liga indi- retamente covalentemente os domínios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada uns aos outros. A ligação pode ser através dos resíduos N-terminais a C-terminais.
[00322] Em algumas modalidades, a ligação pode ser feita através de cadeias laterais de resíduos de aminoácido que não estão localiza- das no terminal N ou terminal C do domínio I9SF sem afinidade modi- ficada e/ou com afinidade modificada. Desta maneira, ligações podem ser feitas através de resíduos de aminoácido terminais ou internos ou combinações dos mesmos.
[00323] Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios IgSF, incluindo um vIgD de ICOSL e um ou mais domínio adicional (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) de um outro membro da fa- mília IQSF, são ligados covalentemente ou não covalentemente. Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios IgSF são ligados dire- tamente ou indiretamente, tal como através de um ligante. Em algu- mas modalidades, uma extensão interveniente de um ou mais resí- duos de aminoácido liga indiretamente covalentemente domínios IgSF uns aos outros. A ligação pode ser através dos resíduos N-terminais a C-terminais. Em algumas modalidades, a ligação pode ser feita atra- vés de cadeias laterais de resíduos de aminoácido que não estão loca- lizados no terminal N ou terminal C do(s) domínio(s) I9SF. Desta ma- neira, ligações podem ser feitas através de resíduos de aminoácido terminais ou internos ou combinações dos mesmos.
[00324] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos dois domínios IgSF, cada um ligado diretamente ou indiretamente por meio de um ligante. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos três proteínas imuno- moduladoras, cada uma ligada diretamente ou indiretamente por meio de um ligante. Várias configurações são mostradas nas FIGS. 16A e 16B.
[00325] Em algumas modalidades, um ou mais "ligantes de peptí- deo" ligam o vIgD de ICOSL e um ou mais domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo ou terceiro domínio IgSF variante). Em algu- mas modalidades, um ligante de peptídeo pode ser um resíduo de aminoácido único ou mais de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo tem pelo menos um resíduo de aminoácido, mas não é mais do que 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,7,6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante flexível. Em algumas modalidades,
o ligante é (em código de aminoácido de uma letra): GGGGS ("4GS"; SEQ ID NO: 636) ou multímeros do ligante 4GS, tais como repetições de 2, 3, 4 ou 5 ligantes 4GS. Em algumas modalidades, o ligante pep- tídico é (GGGGS), ou (GGGGS); como mostrado nas SEQ ID NOS: 229 e 228, respectivamente. Em algumas modalidades, o ligante pode também incluir uma série de resíduos alanina sozinhos ou em adição a um outro ligante peptídico (tal como um ligante 4GS ou multímero do mesmo). Em algumas modalidades, o número de resíduos alanina em cada série é: 2, 3, 4, 5 ou 6 alaninas. Em algumas modalidades, o |li- gante é um ligante rígido. Por exemplo, o ligante é um ligante a-helical. Em algumas modalidades, o ligante é (em código de aminoácido de uma letra): EAMAK ou multímeros do ligante EAAAK, tais como repeti- ções de 2, 3, 4 ou 5 ligantes EAAAK, tal como mostrado na SEQ ID NO: 629 (1XxEAAAK), SEQ ID NO: 630 (3XEAAAK) ou SEQ ID NO: 631 (SXEAAAK). Em algumas modalidades, o ligante pode incluir ainda aminoácidos introduzidos através de clonagem e/ou a partir de um sí- tio de restrição, por exemplo, o ligante pode incluir aminoácidos GS (em código de aminoácido de uma letra) conforme introduzido pelo uso do sítio de restrição BAMHI. Em algumas modalidades, o ligante (em código de aminoácido de uma letra) é GSGGGGS (SEQ ID NO: 635). Em alguns exemplos, o ligante é a 2xkGGGGS seguido por três alani- nas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 230).
[00326] Em algumas modalidades, os domínios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada são ligados por "ligantes peptídicos do tipo selvagem" inseridos no terminal N e/ou terminal C de um segundo domínio IgSF sem afinidade modificada e/ou com afi- nidade modificada. Em algumas modalidades, existe presente um |i- gante peptídico primeiro (leading) inserido no terminal N do primeiro domínio I9SF e/ou uma primeira sequência final (trailing) inserida no terminal C do primeiro domínio I9gSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada. Em algumas modalidades, está presente um segundo primeiro ligante peptídico inserido no terminal N do se- gundo domínio IgSF e/ou segunda sequência final inserida no terminal C do segundo domínio I9SF sem afinidade modificada e/ou com afini- dade modificada. Quando os primeiro e segundo domínios IISF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada são derivados da mesma proteína parental e são conectados na mesma orientação, |i- gantes peptídicos do tipo selvagem entre os primeiro e segundo domí- nios IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada não são duplicados. Por exemplo, quando o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem final e o segundo primeiro ligante peptídico do tipo selvagem são iguais, a proteína imunomoduladora do Tipo Il não com- preende nem o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem final nem o segundo primeiro ligante peptídico do tipo selvagem.
[00327] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora do Tipo Il compreende um primeiro ligante peptídico do tipo selvagem in- serido no terminal N do primeiro domínio I9SF sem afinidade modifica- da e/ou com afinidade modificada, onde o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais) aminoáci- dos consecutivos da sequência interveniente na proteína do tipo sel- vagem a partir da qual o primeiro domínio IgSF sem afinidade modifi- cada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente precedente (tal como um peptídeo de sinal ou um domínio I9SF). Em algumas modalidades, o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem compreende a sequência interveni- ente inteira na proteína do tipo selvagem da qual o primeiro domínio IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é deri- vado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente prece- dente (tal como um peptídeo de sinal ou um domínio IgSF).
[00328] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora do Tipo Il compreende ainda um primeiro ligante peptídico do tipo selva- gem final inserido no terminal C do primeiro domínio sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada, onde o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem final compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na pro- teína do tipo selvagem da qual o primeiro domínio I9SF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e imediatamente seguindo o domínio (tal como um do- mínio I9gSF ou um domínio de transmembrana). Em algumas modali- dades, o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem final compreende a sequência interveniente inteira na proteína do tipo selvagem a partir da qual o primeiro domínio I9SF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o do- mínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um do- mínio de transmembrana).
[00329] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora do Tipo Il compreende ainda um segundo primeiro ligante peptídico do tipo selvagem inserido no terminal N do segundo domínio IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada, onde o segundo primeiro ligante peptídico do tipo selvagem compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveni- ente na proteína do tipo selvagem da qual o segundo domínio IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente precedente (tal como um peptídeo de sinal ou um domínio I9SF). Em algumas modalidades, o segundo primeiro ligante peptídico do tipo selvagem compreende a sequência interveniente inteira na proteína do tipo sel-
vagem da qual o segundo domínio IgSF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente precedente (tal como um peptídeo de sinal ou um domínio IgSF).
[00330] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora do Tipo Il compreende ainda um segundo ligante peptídico do tipo selva- gem final inserido no terminal C do segundo domínio I9gSF sem afini- dade modificada e/ou com afinidade modificada, onde o segundo |i- gante peptídeo do tipo selvagem final compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o segundo domínio I9SF sem afinidade modificada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio de transmembrana). Em algu- mas modalidades, o segundo ligante peptídico do tipo selvagem final compreende a sequência interveniente inteira na proteína do tipo sel- vagem a partir da qual o segundo domínio I9SF sem afinidade modifi- cada e/ou com afinidade modificada é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio de transmembrana).
[00331] Exemplar de uma primeira sequência e sequência final para uma proteína Tipo Il contendo um domínio I9ISF CD80 é mostrado na SEQ ID NO:231 e SEQ ID NO:232. Exemplar de uma primeira se- quência e sequência final para uma proteína do Tipo Il contendo um domínio IgSF ICOSL é mostrado nas SEQ ID NOS:233 e 234. Exem- plar de uma primeira sequência e uma sequência final para uma prote- ína do Tipo Il contendo um domínio IgSF CD86 é mostrado em qual- quer uma de SEQ ID NOS:236-238. Exemplar de uma sequência |i- gante do tipo selvagem para uma proteína Tipo Il contendo um domí-
nio I9gSF NKp30 é mostrado na SEQ ID NO: 235.
1. Monovalente
[00332] São providas aqui proteínas imunomoduladoras contendo um polipeptídeo ICOSL variante que é monovalente. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante da proteína imunomodulado- ra monovalente é lligado, diretamente ou indiretamente, a uma porção adicional. Em algumas modalidades, a porção adicional é uma proteí- na, peptídeo, molécula pequena ou ácido nucleico. Em algumas moda- lidades, a proteína imunomoduladora monovalente é uma proteína de fusão.
[00333] Em algumas modalidades, a porção é uma molécula de prolongamento de meia-vida. Exemplos de tais moléculas de prolon- gamento de meia-vida incluem, mas não estão limitados a, albumina, um polipeptídeo de ligação à albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptí- deo C-terminal (CTP) da subunidade beta de gonadotropina coriônica humana, polietileno glicol (PEG), sequências hidrofílicas não estrutu- radas de aminoácidos (XTEN), amido de hidroxietila (HES), uma molé- cula pequena de ligação à albumina ou uma combinação dos mesmos.
[00334] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante pode incluir sequências de poli- peptídeo conformacionalmente desordenadas compostas dos aminoá- cidos Pro, Ala e Ser (vide, por exemplo, WO2008/155134; SEQ ID NO: 904). Em alguns casos, a repetição de aminoácido é pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais resíduos de aminoácido, em que cada repetição compreende (um) resíduo(s) Ala, Ser e Pro. Portanto, é pro- vida aqui uma proteína imunomoduladora que é PASilada em que o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, a Pro/Ala/Ser (PAS). Em algumas modalida- des, uma ou mais estruturas ligantes adicionais podem ser usadas.
[00335] Em algumas modalidades, a porção facilita a detecção ou purificação do polipeptídeo ICOSL variante. Em alguns casos, o poli- peptídeo imunomodulador compreende um marcador ou domínio de fusão, por exemplo, marcador de afinidade ou purificação, ligado, dire- tamente ou indiretamente, ao terminal N e/ou c do polipeptídeo ICOSL. Vários marcadores e/ou domínios de fusão de polipeptídeo são conhe- cidos, e incluem, mas não estão limitados a, marcador de poli-histidina (His), um marcador de FLAG (SEQ ID NO: 865), um marcador de Myc e marcadores de proteína fluorescente (por exemplo, EGFP, mostrado nas SEQ ID NOS: 858, 859 ou 896). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante compreende pe- lo menos seis resíduos histidina (mostrado na SEQ ID NO: 864). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante compreende ainda várias combinações de porções. Por exemplo, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um ICOSL variante compreende ainda um ou mais marcador de poli- histidina e marcador de FLAG.
[00336] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL é ligado a uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (Fc) modi- ficada que permanece em forma monovalente tal como mostrado na SEQ ID NO: 472.
2. Bivalente
[00337] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contendo um ICOSL variante é multivalente, tal como bivalente. Em aspectos, a proteína imunomoduladora é ligada, diretamente ou indire- tamente por meio de um ligante, a um domínio de multimerização. Em alguns aspectos, o domínio de multimerização aumenta a meia-vida da molécula.
[00338] Interação de dois ou mais polipeptídeos ICOSL variantes pode ser facilitada por sua ligação, ou diretamente ou indiretamente, a qualquer porção ou outro polipeptídeo que seja por si só capaz de inte- ragir para formar uma estrutura estável. Por exemplo, cadeias de poli- peptídeo ICOSL variante codificado separadas podem ser unidas por multimerização, em que multimerização dos polipeptídeos é mediada por um domínio de multimerização. Tipicamente, o domínio de multi- merização provê a formação de uma interação proteína-proteína está- vel entre o primeiro polipeptídeo ICOSL variante e um segundo poli- peptídeo ICOSL variante. Polipeptídeos homo- e heteromultiméricos podem ser gerados a partir da coexpressão de polipeptídeos ICOSL variantes separados. Os primeiro e segundo polipeptídeos ICOSL va- riantes podem ser iguais ou diferentes.
[00339] Em algumas modalidades, um domínio de multimerização inclui qualquer um capaz de formar uma interação proteína-proteína estável. Os domínios de multimerização podem interagir por meio de uma sequência de imunoglobulina (por exemplo, domínio Fc; vide, por exemplo, Pub. de Patente Internacionais Nos. WO 93/10151 e WO 2005/063816 US; Pub. U.S. No. 2006/0024298; Pat. U.S. No. 5.457.035); zíper de leucina (por exemplo, de proteínas de transformação nuclear fos e jun ou o proto-oncogene myc ou de Controle Geral de Nitrogênio (GCN4)) (por exemplo, Busch and Sassone-Corsi (1990) Trends Ge- netics, 6:36-40; Gentz e outros, (1989) Science, 243:1695-1699); uma região hidrofóbica; uma região hidrofílica; ou um tiol livre que forma uma ligação dissulfeto intermolecular entre as moléculas quiméricas de um homo- ou heteromultímero. Ainda, um domínio de multimeriza- ção pode incluir uma sequência de aminoácido compreendendo uma protuberância complementar a uma sequência de aminoácido compre- endendo um orifício, tal como é descrito, por exemplo, na Pat. U.S.
5.731.168; Pub. de Patente Internacional. Nos. WO 98/50431 e WO 2005/063816; Ridgway e outros (1996) Protein Engineering, 9:617-
621. Tal região de multimerização pode ser engenheirada de modo que interações estéricas não promovam apenas interação estável, mas também promovam a formação de heterodímeros com relação a homodiímeros a partir de uma mistura de monômeros quiméricos. Em geral, protuberâncias são construídas através da substituição de ca- deias laterais de aminoácido pequenas da interface do primeiro poli- peptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou tripto- fano). Cavidades compensadoras de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são opcionalmente criadas na interface do segundo polipeptídeo substituindo cadeias laterais de aminoácido grandes com umas menores (por exemplo, alanina ou treonina). Domínios de multi- merização exemplares são descritos abaixo.
[00340] O polipeptídeo ICOSL variante pode ser unido em qualquer lugar, mas tipicamente por meio de seu terminal N ou C, ao terminal N ou C de um domínio de multimerização para formar um polipeptídeo quimérico. A ligação pode ser direta ou indireta por meio de um ligan- te. Também, o polipeptídeo quimérico pode ser uma proteína de fusão ou pode ser formado por ligação química, tal como através de intera- ções covalentes ou não covalentes. Por exemplo, quando preparando um polipeptídeo quimérico contendo um domínio de multimerização, ácido nucleico codificando todo ou parte de um polipeptídeo ICOSL variante pode ser operavelmente ligado a ácido nucleico codificando a sequência de domínio de multimerização, diretamente ou indiretamen- te ou opcionalmente por meio de um domínio ligante. Em alguns ca- sos, o construto codifica uma proteína quimérica onde o terminal C do polipeptídeo ICOSL variante é unido ao terminal N do domínio de mul- timerização. Em alguns casos, um construto pode codificar uma prote- íÍna quimérica onde o terminal N do polipeptídeo ICOSL variante é uni- do ao terminal N ou C do domínio de multimerização.
[00341] Um multímero de polipeptídeo contém duas proteínas qui- méricas criadas por ligação, diretamente ou indiretamente, de dois dos mesmos polipeptídeos ICOSL variantes ou diferentes diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização. Em alguns exemplos, onde o domínio de multimerização é um polipeptídeo, uma fusão de gene codificando o polipeptídeo ICOSL variante e domínio de multime- rização é inserida em um vetor de expressão apropriado. A proteína quimérica ou de fusão resultante pode ser expressa em células hos- pedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e permitidas se reunir em multímeros, onde os domínios de multimeriza- ção interagem para formar polipeptídeos multivalentes. Ligação quími- ca de domínios de multimerização a polipeptídeos ICOSL variantes pode ser realizada usando ligantes heterobifuncionais.
[00342] Os polipeptídeos quiméricos resultantes, tais como proteí- nas de fusão, e multímeros formados a partir dos mesmos, podem ser purificados através de qualquer método adequado tal como por exem- plo, por cromatografia por afinidade em colunas de Proteína A ou Pro- teína G. Onde duas moléculas de ácido nucleico codificando polipeptí- deos diferentes são transformadas em células, formação de homo- e heterodímeros ocorrerá. Condições para expressão podem ser ajusta- das de modo que formação de heterodímero é favorecida com relação à formação de homodímero.
Domínio de Imunoglobulina
[00343] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora compreende um polipeptídeo ICOSL variante ligado a uma região Fc de uma imunoglobulina (fornecendo uma "fusão Fc imunomoduladora", tal como uma "fusão de ICOSL variante-Fc", também chamada uma fusão vlgD-Fc ICOSL). Em algumas modalidades, a fusão de ICOSL variante-Fc também compreende um ou mais domínio(s) IgSF adicio- nal(ais), tal como um ou mais vIgD adicional ligado a um vIlgD de ICOSL. Em algumas modalidades, a ligação do polipeptídeo ICOSL variante ou domínio IgSF adicional está no terminal N do Fc. Em al-
gumas modalidades, a ligação do polipeptídeo ICOSL variante ou do- mínio IgSF adicional está no terminal C do Fc. Em algumas modalida- des, dois ou mais polipeptídeos variantes ICOSL ou domínios IgSF adicionais (igual ou diferente) são independentemente ligados no ter- minal N e no terminal C.
[00344] Em algumas modalidades, o Fc é Fc de murino ou humano. Em algumas modalidades, o Fc são regiões Fc de I9gG1, I9gG2, I9G3 ou IgG4 de mamífero ou humanos. Em algumas modalidades, o Fc é de- rivado de IgG1, tal como IgG1 humana. Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 226 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
226.
[00345] Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações para alterar (por exemplo, reduzir) uma ou mais de suas funções normais. Em geral, a região Fc é responsável por funções efe- toras, tal como citotoxidez dependente do complemento (CDC) e cito- toxidez celular dependente de anticorpo (ADCC), em adição à capaci- dade de ligação a antígeno, que é a principal função das imunoglobuli- nas. Ainda, a sequência de FcRn presente na região Fc desempenha um papel de regulagem do nível de IgG no soro aumentando da meia- vida in vivo através de conjugação a um receptor FCcRn in vivo. Em al- gumas modalidades, tais funções podem ser reduzidas ou alteradas em um Fc para uso com as proteínas de fusão de Fc providas.
[00346] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácido uma ou mais modificações de aminoácido podem ser in- troduzidas na região Fc de uma fusão de ICOSL variante-Fc provida aqui, dessa maneira gerando uma variante de região Fc. Em algumas modalidades, a variante da região Fc tem função efetora diminuída. Há muitos exemplos de mudanças ou mutações nas sequências de Fc que podem alterar a função efetora. Por exemplo, WO 2000/42072, WO2006/019447, WO2012/125850, WO2015/107026, US2016/0017041 e Shields e outros. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) descrevem va- riantes de Fc exemplares com ligação melhorada ou diminuída com FcRs. Os teores dessas publicações são especificamente aqui incor- porados a título de referência.
[00347] Em algumas modalidades, as fusões Fusão de ICOSL vari- ante-Fc providas compreendem uma região Fc que exibe funções efe- toras reduzidas (também chamadas Fc inerte ou Fc sem efetor), o que faz dela um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida da fusão de ICOSL variante-Fc in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (tais como CDC e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Ensaios de citotoxidez in vitro e/ou in vivo podem ser con- duzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação de receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que a fusão de ICOSL variante-Fc não tenha ligação a FcyR (desta maneira provavelmente sem atividade ADCC), mas retém habilidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcyRlIll apenas, en- quanto monócitos expressam FcyRI, FeyRII e FeyRiIll. Expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Pat. U.S. No.
5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, |. e outros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, |. e outros, Proc. Nat! Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); Pat. U.S. No. 5.821.337 (vide Bruggemann, M. e outros, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alter- nativamente, métodos de ensaio não radioativos podem ser emprega-
dos (vide, por exemplo, ensaio de citotoxidez não radioativo ACTITY para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; e CytoTox 96'” non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, Wis.). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mono- nucleares de sangue periférico (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da mo- lécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um mo- delo animal tal como revelado em Clynes e outros, Proc. Nat'! Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1ig podem ser também realizados para confirmar que a fusão de ICOSL variante-Fc é incapaz de se ligar a C1g e, portanto, não tem atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a Ciq e C3c no WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. e outros, Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M. S. e M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Determinações de ligação a FcRn e elimina- ção/meia-vida in vivo podem ser também realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S. B. et al., Int. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
[00348] Fusões de ICOSL variante-Fc com função efetora reduzida incluem aquelas com substituição de um ou mais resíduos de região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 pela numeração EU (Pat. U.S. No. 6.737.056). Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais de posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327 pela numeração EU, incluindo o chamado mutante de Fc "DANA" com substituição de resíduos 265 e 297 para alanina (Pat. U.S. No. 7.332.581).
[00349] Em algumas modalidades, a região Fc de fusões variantes ICOSL-Fc tem uma região Fc em que qualquer um ou mais de aminoáci-
dos nas posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 e 329 (indicado pela numeração EU) são substituídos com aminoácidos dife- rentes comparado com a região Fc nativa. Tais alterações de região Fc não são limitadas às alterações descritas acima e incluem, por exem- plo, alterações tais como cadeias desglicosiladas (N297A e N297Q), IgG1-N297G, IgG1-L234A/L235A, IgG1-L234A/L235E/G237A, IgG1- AS25A/A330S/P331S, — IgG1-C2268/C2298S, —IgG1-C2268/C229S/ E233P/L234V/L235A, IgG1- E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, I9QG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/AS31S, —IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descritas em Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; alterações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R e N325LL328R descritas no WO 2008/092117; inser- ções de aminoácido nas posições 233, 234, 235 e 237 (indicação pela numeração EU); e alterações nos sítios descritos no WO 2000/042072.
[00350] Certas variantes de Fc com ligação melhorada ou diminuída com FcRs são descritas (vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.737.056; WO 2004/056312, WO2006/019447 e Shields e outros, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
[00351] Em algumas modalidades, é provida uma fusão de ICOSL variante-Fc compreendendo uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido que aumentam meia-vida e/ou melhoram a ligação ao receptor Fc neonatal (FCcRn). Anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação melhorada a FcRn são descri- tos na US2005/0014934A1 (Hinton e outros) ou WO2015107026. Es- ses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substi- tuições na mesma que melhoram a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes de Fc incluem aqueles com substituições em um ou mais re- síduos de região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434 por nu-
meração EU, por exemplo, substituição de resíduo 434 na região Fc (Pat. U.S. No. 7.371.826).
[00352] Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão de ICOSL variante-Fc compreende uma ou mais substituições de amino- ácido ES56D e M358L pela numeração EU. Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão de ICOSL variante-Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácido C220S8S, C2268S e/ou C2298S pela nu- meração EU. Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão vari- ante ICOSL compreende uma ou mais substituições de aminoácido R292C e V302C. Vide também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Pat. U.S. No. 5.648.260; Pat. U.S. No. 5.624.821; e WO 94/29351 com relação a outros exemplos de variantes de região Fc.
[00353] Em algumas modalidades, o Fc IgG1 do tipo selvagem po- de ser o Fc mostrado na SEQ ID NO: 226 tendo um alotipo contendo resíduos Glu (E) e Met (M) nas posições 356 e 358 pela numeração EU (por exemplo, alotipo f). Em outras modalidades, o Fc IgG1 do tipo selvagem contém aminoácidos do alotipo G1m1 humano, tais como resíduos contendo Asp (D) e Leu (L) nas posições 356 e 358, por exemplo, como mostrado na SEQ ID NO: 927. Portanto, em alguns casos, um Fc provido aqui pode conter substituições de aminoácido E356D e M358L para reconstituir resíduos de alotipo G1im1 (por exemplo, alotipo alfa). Em alguns aspectos, um Fc do tipo selvagem é modificado por uma ou mais substituições de aminoácido para reduzir a atividade efetora ou tornar o Fc inerte para função efetora de Fc. Mu- tações de ausência de efetor ou inertes exemplares incluem aquelas descritas aqui. Dentre as mutações de ausência de efetor que podem ser incluídas em um Fc de construtos providos aqui são L234A, L235E e G237A pela numeração EU. Em algumas modalidades, um Fc do tipo selvagem é modificado mais pela remoção de um ou mais resíduo cisteína, tal como através da substituição dos resíduos cisteína por um resíduo serina na posição 220 (C2208S) pela numeração EU. Regiões Fc inertes exemplares tendo função efetora reduzida são mostradas na SEQ ID NO: 633 ou 477 e SEQ ID NO: 474 ou 637, que são base- adas em alótipos mostrados na SEQ ID NO: 226 ou SEQ ID NO: 927, respectivamente. Em algumas modalidades, uma região Fc usada em um construto provido aqui pode ainda ter ausente um resíduo lisina C- terminal.
[00354] Em algumas modalidades, são feitas alterações na região Fc que resultam em ligação a C1qg diminuída e/ou Citotoxidez Depen- dente do Complemento (CDC), por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie e outros, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[00355] Em algumas modalidades, é provida uma fusão de ICOSL variante-Fc compreendendo uma região Fc variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido, em que a região Fc varian- te é derivada de IgG1, tal como I9gG1 humana. Em algumas modalida- des, a região Fc variante é derivada da sequência de aminoácido mos- trada na SEQ ID NO: 226. Em algumas modalidades, o Fc exibe fun- ção efetora reduzida. Em algumas modalidades, o Fc contém pelo menos uma substituição de aminoácido que é N82G pela numeração SEQ ID NO: 226 (correspondendo a N297G pela numeração EU). Em algumas modalidades, o Fc contém ainda pelo menos uma substitui- ção de aminoácido que é R77C ou V87C pela numeração de SEQ ID NO: 226 (correspondendo a R292C ou V302C pela numeração EU). Em algumas modalidades, a região Fc variante compreende ainda uma modificação de aminoácido C5S pela numeração de SEQ ID NO: 226 (correspondendo a C2208 pela numeração EU). Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc variante compreende as modifica- ções de aminoácido que seguem: V297G e uma ou mais das modifica- ções de aminoácido que seguem C220S, R292C ou V302C pela nu-
meração EU (correspondendo a N82G e uma ou mais das modifica- ções de aminoácido que seguem C5S, R77C ou V87C com referência à SEQ ID NO: 226), por exemplo, a região Fc compreende a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 476. Em algumas modalidades, a região Fc variante compreende uma ou mais das modificações de aminoácido C2208S, L234A, L235E ou G237A, por exemplo, a região Fc compre- ende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 477. Em algumas modali- dades, a região Fc variante compreende uma ou mais das modifica- ções de amino ácido C220S, E233P, L234V, L235A, G236del ou S267K, por exemplo, a região Fc compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 478. Em algumas modalidades, o Fc variante compre- ende uma ou mais das modificações de aminoácido C220S, L234A, L235E, G237A, ES56D ou M358L, por exemplo, a região Fc compre- ende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 474.
[00356] Em algumas modalidades, a região Fc não tem a lisina C- terminal correspondendo à posição 232 do Fc de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem mostrado na SEQ ID NO: 56 (correspondendo a K447del pela numeração EU). Em algumas modalidades, devido à lisina C-terminal poder ser removida diferenci- almente durante biossíntese, remoção do resíduo lisina C-terminal re- sulta em um produto mais homogêneo quando a proteína é expressa em células. Em alguns aspectos, tal região Fc pode incluir ainda uma ou mais modificações adicionais, por exemplo, substituições de ami- noácido, tal como qualquer uma descrita. Exemplar de tal região Fc é mostrado na SEQ ID NO: 632, 633, 634 ou 637.
[00357] Em algumas modalidades, é provida uma fusão de ICOSL variante-Fc compreendendo uma região Fc variante em que o Fc vari- ante compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634 ou 637 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634 ou 637. Em algumas modalidades, o Fc exibe função efetora reduzida.
[00358] Em algumas modalidades, o Fc é derivado de IgG2, tal co- mo IgG2 humana. Em algumas modalidades, o Fc compreende a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 227 ou uma sequên- cia de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 227.
[00359] Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 505 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 505. Em algumas modalidades, o Fc IgG4 é um Fc estabilizado em que o domínio CH3 de IgG4 humana é substituído com o domínio CH3 de IgG1 humana e que exibe forma- ção de agregado inibida, um anticorpo em que os domínios CH3 e CH2 de IgG4 humana são substituídos com os domínios CH3 e CH2 de IgG1 humana, respectivamente, ou um anticorpo em que arginina na posição 409 indicada no índice EU proposto por Kabat e outros de IgG4 humana é substituído com lisina e que exibe formação de agre- gado inibida (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 8.911.726). Em al- gumas modalidades, o Fc é uma IgG4 contendo a mutação S228P, que foi mostrada evitar recombinação entre um anticorpo terapêutico e IgG4 endógena por troca de braço Fab (vide, por exemplo, Labrijin e outros (2009) Nat. Biotechnol., 27(8)767-71). Em algumas modalida- des, o Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 506 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:
506.
[00360] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante é diretamente ligado à sequência de Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante é ligado indiretamente à sequência de Fc, tal como por meio o de um ligante. Em algumas modalidades, um ou mais "ligantes de peptídeo" ligam o polipeptídeo ICOSL variante do domínio Fc. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo pode ser um resíduo de aminoácido único ou maior em comprimento. Em algu- mas modalidades, o ligante de peptídeo tem pelo menos um resíduo de aminoácido, mas não é mais do que 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido de com- primento. Em algumas modalidades, o ligante é de três alaninas (AAA). Em algumas modalidades, o ligante é (em código de aminoáci- do de uma letra): GGGGS ("4GS"; SEQ ID NO:636) ou multímeros do ligante 4GS, tais como repetições de 2, 3, 4, 5 ou 6 ligantes 4GS, tal como mostrado na SEQ ID NO: 229 (2xGGGGS) ou SEQ ID NO: 228 (39XGGGGS). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante rígido. Por exemplo, o ligante é um ligante a-helical. Em algumas modalida- des, o ligante é (em um código de aminoácido de uma letra): EMAAK ou multímeros do ligante EAAAK, tais como as repetições de 2, 3,4 o ligantes 4GS, tal como mostrado na SEQ ID NO: 629 (EAAAK) ou SEQ ID NO: 630 (3XxEAAAK) ou SEQ ID NO: 631 (5xEAAAK). Em al- gumas modalidades, os ligantes começam com uma ou mais unidades EAAAK e podem ser alongados pela adição de sequências A, AA, AAA, AAAA, EAAAA e EAAAK. Em algumas modalidades, o ligante pode incluir ainda aminoácidos introduzidos por clonagem e/ou a partir de um sítio de restrição, por exemplo, o ligante pode incluir os aminoá- cidos GS (em código de aminoácido de uma letra) conforme introduzi- do pelo uso do sítio de restrição BAMHI. Em algumas modalidades, o ligante (em código de aminoácido de uma letra) é GSGGGGS (SEQ ID NO: 635). Em alguns exemplos, o ligante é um 2xG6GGGS seguido por três alaninas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 230).
[00361] Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ICOSL variante-Fc é um dímero formado por dois polipeptídeos ICOSL varian- te Fc ligados a um domínio Fc. Em algumas modalidades específicas, espécies idênticas ou substancialmente idênticas (permitindo 3 ou me- nos diferenças de sequência de aminoácido N-terminal ou C-terminal) de polipeptídeos de fusão de ICOSL variante-Fc serão dimerizadas para criar um homodímero. Em algumas modalidades, o dímero é um homodímero em que os dois polipeptídeos ICOSL variante-Fc são iguais. Alternativamente, espécies diferentes de polipeptídeos de fusão de ICOSL variante-Fc podem ser dimerizadas para prover um hetero- dímero. Desta maneira, em algumas modalidades, o dímero é um he- terodímero em que os dois polipeptídeos ICOSL variante-Fc são dife- rentes.
[00362] Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão de ICOSL variante-Fc contendo um polipeptídeo ICOSL variante que inclui uma ou mais modificações de aminoácido em um ICOSL de refe- rência como descrito na Seção || que é ligado, diretamente ou indire- tamente, a uma região Fc. Em alguns casos, o terminal C do polipeptí- deo ICOSL variante é unido ao terminal N da região Fc. Em algumas modalidades, o ICOSL variante de uma fusão ICOSL-Fc contém uma ou mais modificações de aminoácido na sequência de aminoácidos do domínio IgV de referência mostrado na SEQ ID NO: 545. Em casos particulares, tal proteína imunomoduladora contém polipeptídeo ICOSL variante contendo um domínio IgV, tal como um domínio IgV mostrado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910, ou um domínio IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma das SEQ ID NOS: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 e contém a uma ou mais modificações de aminoácido da respectiva SEQ ID NO.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem um do- mínio IgSF (por exemplo, domínio IgV) que exibe afinidade de ligação aumentada com CD28 ou ICOS, tal como qualquer uma das modifica- ções de aminoácido descritas aqui.
Em algumas modalidades, o poli- peptídeo ICOSL variante tem um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV) contendo uma ou mais modificação de aminoácido, por exemplo, substituição em um ICOSL de referência ou fragmento de ligação es- pecífica, correspondendo à(s) posição(ões) 52, 57 ou 100 com refe- rência à numeração de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modificação de aminoá- cido, por exemplo, substituição selecionada de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N528S, N52T7, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ou Q100V.
Exemplar de tais moléculas variantes incluem qual- quer uma como aqui descrito.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de aminoácido N52H/N57Y/ Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 565). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de aminoácido N52D (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 548). Em algumas modali- dades, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de ami- noácido N52H/Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mos- trado na SEQ ID NO: 567). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de aminoácido N52L/N57H/
Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 761). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de aminoácido N52H/N57Y/Q100P (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 570).
[00363] Em modalidades particulares de tais proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc, o polipeptídeo Fc é uma variante de uma região Fc IgG1 humana que exibe funções efetoras reduzidas, tal como qualquer uma como descrito. Em algumas modalidades, a região Fc é uma IgG1 humana que contém as modificações de aminoácido N297G, E233P/ L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o re- síduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc IgG1 variante contém ainda a substituição de aminoácido C220S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc con- tém K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em alguns aspectos, a região Fc contém a sequência de sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 474, 476, 477, 478, 633 ou 637 ou uma sequência de aminoáci- dos que exibe pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 474, 476, 477, 478, 633 ou 637 e contém as substituições de aminoácido da respectiva SEQ ID NO. A ligação entre o polipeptídeo I9SF ICOSL variante (por exemplo, IgV) e o Fc pode ser por meio de um ligante de peptídeo, tal como qualquer um descrito. Em algumas modalidades, o ligante é GGGGS ("4GS", SEQ ID NO: 636), SEQ ID NO: 229 (2xGGGGS) ou SEQ ID NO: 228 (3XGGGGS). Em exemplos particulares, o terminal C do polipeptídeo ICOSL varian- te é unido ao terminal N da região Fc, de modo que a ordem de com- ponente é ICOSL variante-ligante-Fc.
[00364] Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão
ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO: 565, um |li- gante mostrado na SEQ ID NO: 636 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 637. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO: 565, um ligante mostrado na SEQ ID NO: 636 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 474. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL varian- te-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO: 565, um ligante mostrado na SEQ ID NO: 636 e um poli- peptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 477. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO: 565, um ligante mostrado na SEQ ID NO: 636 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 633.
[00365] Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um |i- gante mostrado na SEQ ID NO: 229 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 637. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um ligante mostrado na SEQ ID NO:229 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 474. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL varian- te-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um ligante mostrado na SEQ ID NO: 229 e um poli- peptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 477. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo,
ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um ligante mostrado na SEQ ID NO:229 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 633.
[00366] Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um |i- gante mostrado na SEQ ID NO:228 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 637. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um ligante mostrado na SEQ ID NO: 228 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 474. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL varian- te-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO:565, um ligante mostrado na SEQ ID NO:228 e um poli- peptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 477. Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão ICOSL variante-Fc, por exemplo, ICOSL variante-ligante-Fc, contendo um domínio IgV ICOSL variante mostrado na SEQ ID NO: 565, um ligante mostrado na SEQ ID NO:228 e um polipeptídeo Fc mostrado na SEQ ID NO: 633.
[00367] Em algumas modalidades, é provida uma proteína de fusão de IgSF ICOSL variante-Fc que tem a sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 928, ou uma sequência de aminoácidos que exi- be pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a SEQ ID NO:928. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IgSF ICOSL variante-Fc se liga a CD28 e ICOS, tal como com afinidade de ligação aumentada comparado com a proteína de fusão ICOSL de referência (tipo selvagem)-Fc. Em algumas modalida- des, a fusão IgSF ICOSL variante-Fc exibe função efetora de Fc redu- zida comparado com fusão com um Fc de uma IgG1 humana do tipo selvagem.
[00368] Em algumas modalidades, é provida uma proteína imuno- moduladora de empilhamento de multidomínio em que dois ou mais domínios IgSF, incluindo um vIgD de ICOSI e um ou mais domínios IgSF adicionais (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) de um outro membro da família IQSF, são ligados ou presos a um Fc para formar uma fusão de Fc, que, quando da expressão em uma célula podem, em alguns aspectos, produzir uma proteína imunomoduladora de empilhamento de multidomínio quimérica. Portanto, são também providas proteínas imunomoduladoras de multidomínio diméricas.
[00369] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante e um ou mais domínio IQgSF são independentemente ligados, diretamen- te ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante e pelo menos um do um ou mais domínio IgSF adicional são ligados, diretamente ou indire- tamente, e um do ICOSL variante e um do um ou mais domínio IgSF adicional é também ligado, diretamente ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Em algumas modalidades, o terminal N ou C da região Fc é ligado ao polipeptídeo ICOSL variante ou um ou mais domínio IgSF adicional e o outro do terminal N ou C da região Fc é li- gado à outra da variante de ICOSL ou um outro do um ou mais domí- nio I9SF adicional. Em algumas modalidades, ligação ao Fc é através de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, ligação entre o ICOSL vari- ante e o segundo domínio IgSF é através de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, ligação entre o ICOSL variante e o um ou mais domínio IgSF adicional é por meio de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico, tal como acima descrito. Em algumas modalidades, o vIgD de ICOSL, o um ou mais domínios IgSF adicionais, e o domínio
Fc podem ser ligados juntos em qualquer uma de várias configurações como mostrado na FIG. 16A e na FIG. 16B. Em algumas modalidades, a fusão de ICOSL variante-Fc pode conter ainda um peptídeo de sinal, tal como um peptídeo de sinal exemplar como contido na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 59 ou 225. Configurações exemplares são descritas nos Exemplos.
[00370] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora empilhada é um dímero formado por dois polipeptídeos de fusão Fc imunomoduladores. São também providas moléculas de ácido nucleico codificando qualquer uma das proteínas imunomoduladoras empilha- das. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de empi- lhamento de multidomínio dimérica pode ser produzida em células através de expressão, ou em alguns casos coexpressão, de polipeptí- deos de região: Fc imunomoduladores de empilhamento, tal como descrito mais abaixo.
[00371] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de empilhamento de multidomínio dimérica é divalente para cada subuni- dade Fc, monovalente para cada subunidade ou divalente para uma subunidade e trivalente para a outra.
[00372] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de empilhamento de multidomínio dimérica é uma proteína Fc de empi- lhamento de multidomínio homodimérica. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de empilhamento de multidomínio dimérica compreende um primeiro polipeptídeo de fusão de Fc imunomodulador de empilhamento e um segundo polipeptídeo de fusão de Fc imuno- modulador de empilhamento em que o primeiro em o segundo polipep- tídeos são iguais. Em algumas modalidades, a porção Fc do polipeptí- deo pode ser qualquer Fc como acima descrito.
[00373] Em algumas modalidades, a molécula de empilhamento de multidomínio contém um primeiro polipeptídeo de fusão Fc contendo um ICOSL variante e um segundo domínio IgSF de fusão e um segun- do polipeptídeo Fc contendo o ICOSL variante e o segundo domínio IgSF. Em algumas modalidades, a molécula de empilhamento de mul- tidomínio contém um primeiro polipeptídeo de fusão Fc contendo um ICOSL variante e um segundo domínio IgSF, e um terceiro domínio IgSF e um segundo polipeptídeo de fusão Fc contendo o ICOSL vari- ante, o segundo domínio IgSF e o terceiro domínio I9SF. Em algumas modalidades, a porção Fc do primeiro e/ou segundo polipeptídeo de fusão pode ser qualquer Fc como acima descrito. Em algumas modali- dades, a porção ou região Fc do primeiro e segundo polipeptídeo de fusão é igual.
[00374] Em algumas modalidades, é provida uma proteína imuno- moduladora que é uma pilha de multidomínio ICOSL-NKp30 contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes e um ou mais domí- nios IgF de NKp30, por exemplo, NKp30 do tipo selvagem ou não mo- dificada, tal como um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 929 ou um ECD ou uma porção de ligação do mesmo mostrada na SEQ ID NO: 215 ou uma porção de ligação do mesmo. Em algumas modalida- des, é provida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um do polipeptídeo ICOSL variante e um ou mais domínios I9SF de uma NKp30 variante contendo uma ou mais modificações de aminoácido na sequência do tipo selvagem ou não modificada mostrada na SEQ ID NO: 215 ou 929. Em algumas modalidades, a uma ou mais modifica- ções de aminoácido (por exemplo, substituições) incluem um ou mais de L30V, AGOV, S64P, S86G, tal como 1, 2, 3 ou 4 de tais modifica- ções de aminoácido. Em alguns aspectos uma NKp30 variante dos polipeptídeos de empilhamento de multidomínio é ou inclui um domínio lgV variante, tal como um domínio IgV variante mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 504, 930, 931, 932 ou 933 ou um domínio IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma das SEQ ID NOS:504, 930, 931, 932 ou 933 e contém a uma ou mais modificações de aminoácido da respectiva SEQ ID NO. Em alguns aspectos, uma NKp30 variante dos polipeptídeos de empilhamento de multidomínio é ou inclui um domínio ECD variante, tal como um ECD variante mostra- do em qualquer uma das SEQ ID NOS: 215, 216, 217, 218 ou 219 ou um domínio ECD que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma de SEQ ID NOS: 215, 216, 217, 218 ou 219 e contém a uma ou mais modificações de aminoácido da respectiva SEQ ID NO.
[00375] Em qualquer uma de tais modalidades de uma pilha de mul- tidomínio de ICOSL-NKp30, o polipeptídeo ICOSL variante pode incluir qualquer um descrito na Seção Il contendo um domínio IgSF variante (por exemplo, IgV ou ECD), tal como incluindo qualquer uma das mo- dificações de aminoácido mostradas na Tabela 1. Em alguns casos, tal proteína imunomoduladora contém um polipeptídeo ICOSL variante contendo um domínio ECD, tal como um domínio ECD mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387- 424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908 ou um domínio ECD que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma das SEQ ID NOS: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908 e contém a uma ou mais modificações de aminoá- cido da respectiva SEQ ID NO. Em casos particulares, tal proteína imunomoduladora contém um polipeptídeo ICOSL variante contendo um domínio IgV, tal como um domínio IgV mostrado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 ou um domínio IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma de SEQ ID
NOS: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 e contém a uma ou mais modificações de aminoácido da respectiva SEQ ID NO. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante que tem um domínio I9SF (por exemplo, domínio IgV) exibe afinidade de ligação aumentada com CD28 ou ICOS, tal como qualquer um descrito aqui. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV) contendo uma ou mais modificação de aminoá- cido, por exemplo, substituição em um ICOSL de referência ou frag- mento de ligação específica, correspondendo à(s) posição(ões) 52, 57 ou 100 com referência à numeração de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante tem uma ou mais modifi- cação de aminoácido, por exemplo, substituição selecionada de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ou Q100V. Exemplos de tais moléculas varian- tes incluem qualquer uma das descritas aqui. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo ICOSL variante contém as modificações de amino- ácido N52D (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO: 548), N52H/Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO:567), N52H/N57Y/Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IQV mostrado na SEQ ID NO:565) ou N52L/N57H/Q100R (por exemplo, é ou inclui um domínio IgV mostrado na SEQ ID NO:761).
[00376] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras de empilhamento de multidomínio providas, tal como uma proteína imunomoduladora de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30, são fundidas a um polipeptídeo Fc. Em modalidades particulares, o polipeptídeo Fc é uma variante de uma região Fc IgG1 humana que exibe funções efetoras reduzidas, tal como qualquer uma como des- crito. Em algumas modalidades, a região Fc é uma IgG1 humana que contém as modificações de aminoácido N297G, E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numera- do de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc IgG1 variante contém ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc contém K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em alguns aspectos, a região Fc contém a sequência de sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 474, 476, 477, 478, 633 ou 637 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 474, 476, 477, 478, 633 ou 637 e contém as substituições de aminoá- cido da respectiva SEQ ID NO.
[00377] Exemplos de tais configurações são mostrados nas FIGS. 16A-16B e descritos aqui. Em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30 providos pode conter duas cópias de um polipeptídeo tendo a estrutura: IISF ICOSL variante (por exemplo, IgV, tal como mostrado na SEQ ID NO: 548, 565, 567 ou 761) — ligante 1 — IgSF NKp30 variante (por exemplo, IgV, tal como mostrado na SEQ ID NO: 504) — ligante 2 - Fc. Em algumas modalidades, qualquer um dos poli- peptídeos imunomoduladores de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30 providos pode conter duas cópias de um polipeptídeo tendo a estrutura: IISF ICOSL variante (por exemplo, IgV, tal como mostrado na SEQ ID NO: 548, 565, 567 ou 761) — ligante 1 — IgSF NKp30 variante (por exemplo, IgV, tal como mostrado na SEQ ID NO:
504) — ligante 1 — IISF NKp30 variante (por exemplo, IgV tal como mostrado na SEQ ID NO: 504) — ligante 2 — Fc. Em algumas modali- dades, ligante 1 e ligante 2 são ligantes peptídicos, tal como qualquer um descrito. Em algumas modalidades, ligante 1 e ligante 2 são iguais. Em algumas modalidades, ligante 1 e ligante 2 são diferentes. Em al- gumas modalidades, ligante 1 é 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228). Em algumas modalidades, ligante 2 é GSGGGS (SEQ ID NO: 635).
[00378] Pilhas de multidomínio de ICOSL-NKp30 exemplares têm a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 ou 926 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com qualquer uma da SEQ ID NOS: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 ou 926.
[00379] Em algumas modalidades, qualquer uma das proteínas imunomoduladoras de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30 providas se liga a ICOS e/ou CD28 e se liga a B/7-H6. Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30 providas proveem uma molécula de liga- ção capaz de localização de tumor adjacente a uma célula imune que expressão ICOS e/ou CD28 (por exemplo, uma célula T). Em algumas modalidades, tais proteínas imunomoduladoras de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30 podem ser usadas para aumentar uma resposta imune através de envolvimento de receptores coestimulado- res de ICOS e/ou CD28 em células T em um microambiente de tumor. Em alguns casos, tais proteínas imunomoduladoras de empilhamento de multidomínio ICOSL-NKp30, ou composições farmacêuticas das mesmas, podem ser usadas para tratar um tumor ou câncer.
[00380] Em algumas modalidades, a molécula de empilhamento de multidomínio é heterodimérica, compreendendo dois polipeptídeos de fusão Fc diferentes, por exemplo, um primeiro e um segundo polipep-
tídeo, onde pelo menos um é um polipeptídeo de fusão Fc contendo pelo menos um polipeptídeo ICOSL variante e/ou pelo menos um é um polipeptídeo Fc contendo um segundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo o domínio IgSF variante). Em algumas modalidades, o primei- ro ou segundo polipeptídeo de fusão Fc contém ainda um terceiro do- mínio IgSF (por exemplo, terceiro domínio I9SF variante). Em algumas modalidades, a molécula de empilhamento de multidomínio contém um primeiro polipeptídeo de fusão Fc contendo um ICOSL variante e um segundo polipeptídeo de fusão Fc contendo um segundo domínio IgSF, em que, em alguns casos, um primeiro ou segundo polipeptídeo de fusão contém ainda um terceiro domínio I9SF.
Em algumas modali- dades, a molécula de empilhamento de multidomínio contém um pri- meiro polipeptídeo de fusão Fc contendo um ICOSL variante, um se- gundo domínio IgSF e, em alguns casos, um terceiro domínio IgSF e um segundo polipeptídeo de fusão que não é ligado nem ao polipeptí- deo ICOSL variante nem um domínio IgSF adicional.
Em algumas mo- dalidades, a porção ou região Fc do primeiro e do segundo polipeptí- deo de fusão é igual.
Em algumas modalidades, a porção ou região Fc do primeiro e do segundo polipeptídeo de fusão é diferente.
Em algu- mas modalidades, a molécula de empilhamento de multidomínio con- tém um primeiro polipeptídeo Fc de fusão contendo 1, 2, 3 ou 4 ou mais polipeptídeos ICOSL variantes e/ou 1, 2, 3, 4 ou mais domínios IgSF adicionais, onde o número total de domínios IgSF no primeiro po- lipeptídeo de fusão Fc de empilhamento é mais do que 2, 3, 4, 5, 6 ou mais.
Em um exemplo de tal modalidade, o segundo polipeptídeo de fusão Fc de empilhamento contém 1, 2, 3, 4 ou mais polipeptídeos ICOSL variantes e/ou 1, 2, 3, 4 ou mais segundos domínios IgSF, on- de o número total de domínios IgSF no segundo polipeptídeo de fusão Fc de empilhamento é maior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais.
Em um outro exemplo de tal modalidade, o segundo polipeptídeo de fusão Fc não é ligado nem a um polipeptídeo ICOSL variante nem domínio I9SF adicional.
[00381] Em algumas modalidades, a molécula de empilhamento heterodimérica contém um primeiro polipeptídeo de fusão de Fc imu- nomodulador de empilhamento e um segundo polipeptídeo de fusão de Fc imunomodulador de empilhamento em que primeiro e segundo polipeptídeos são diferentes. Em algumas modalidades, uma molécula de empilhamento heterodimérica contém uma primeira fusão de poli- peptídeo Fc contendo uma região Fc e um primeiro polipeptídeo ICOSL variante e/ou segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) e uma segunda fusão de polipeptídeo contendo uma região Fc e o outro do primeiro polipeptídeo ICOSL variante ou o segundo domínio IgSF. Em algumas modalidades, uma molécula de empilhamento heterodimérica contém uma primeira fusão de polipeptí- deo Fc contendo uma região Fc e um primeiro polipeptídeo ICOSL va- riante e/ou segundo domínio I9SF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) e uma segunda fusão de polipeptídeo Fc contendo am- bos o primeiro polipeptídeo ICOSL variante e o segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) mas em uma orienta- ção ou configuração diferente da primeira região Fc. Em algumas mo- dalidades, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo de fusão Fc também contém um terceiro domínio IgSF (por exemplo, terceiro domínio IgSF variante).
[00382] Em algumas modalidades, o domínio Fc de um ou ambos dos primeiro e segundo polipeptídeos de fusão de Fc imunomodulado- res empilhados compreende uma modificação (por exemplo, substitui- ção) de modo que a interface da molécula Fc é modificada para facili- tar e/ou promover heterodimerização. Em algumas modalidades, modi- ficações incluem introdução de uma protuberância (knob) em um pri- meiro polipeptídeo Fc e uma cavidade (hole) em um segundo polipep-
tídeo Fc de modo que a protuberância é posicionável na cavidade para promover complexação dos primeiro e segundo polipeptídeos conten- do Fc. Aminoácidos direcionados para substituição e/ou modificação para criar protuberâncias ou cavidades em um polipeptídeo são tipi- camente aminoácidos de interface que interagem ou contatam com um ou mais aminoácidos na interface de um segundo polipeptídeo.
[00383] Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos é adicionada precedendo a sequência de Fc para construtos em que a sequência de Fc é a porção N-terminal da sequência. Em alguns ca- sos, a sequência de aminoácidos HMSSVSAQ (SEQ ID NO:475) é adicionada imediatamente precedendo a sequência de Fc para cons- trutos em que a sequência de Fc é a porção N-terminal da sequência. Em algumas modalidades, uma molécula de empilhamento heterodi- mérica contém uma primeira fusão de polipeptídeo Fc contendo uma região Fc (knob) e um primeiro polipeptídeo ICOSL variante e/ou Se- gundo domínio IgSF (por exemplo, Segundo domínio IgSF variante) e uma segunda fusão de polipeptídeo Fc contendo uma região Fc (hole) e uma sequência stuffer HMSSVSAQ (SEQ ID NO:475) adicionada imediatamente precedendo ambas as regiões Fc da primeira e da se- gunda fusão de polipeptídeo Fc.
[00384] Em algumas modalidades, um primeiro polipeptídeo que é modificado para conter aminoácidos de protuberância (hole) incluem substituições de um aminoácido nativo ou original com um aminoácido que tem pelo menos uma cadeia lateral que se projeta a partir da inter- face do primeiro polipeptídeo e é então posicionável em uma cavidade compensadora (hole) em uma interface adjacente de um segundo po- lipeptídeo. Mais frequentemente, o aminoácido de substituição é um que tem um volume de cadeia lateral maior do que o resíduo de ami- noácido original. Um versado na técnica sabe como determinar e/ou avaliar as propriedades de resíduos de aminoácido para identificar aqueles que são aminoácidos de substituição ideais para criar uma protuberância. Em algumas modalidades, os resíduos de substituição para a formação de uma protuberância são resíduos de aminoácido de ocorrência natural e incluem, por exemplo, arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W). Em alguns exemplos, o resíduo ori- ginal identificado para substituição é um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral pequena tal como, por exemplo, alanina, aspa- ragina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina.
[00385] Em algumas modalidades, um segundo polipeptídeo que é modificado para conter uma cavidade (hole) é um que inclui substitui- ção de um aminoácido nativo ou original com um aminoácido que tem pelo menos uma cadeia lateral que é recuada a partir da interface do segundo polipeptídeo e então é capaz de acomodar uma protuberân- cia correspondente da interface de um primeiro polipeptídeo. Mais fre- quentemente, o aminoácido de substituição é um que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original. Um versado na técnica sabe como determinar e/ou avaliar as propriedades de resíduos de aminoácido para identificar aqueles que são resíduos de substituição ideais para a formação de uma cavidade. Em geral, os resíduos de substituição para a formação de uma cavidade são ami- noácidos de ocorrência natural e incluem, por exemplo, alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). Em alguns exemplos, o aminoáci- do original identificado para substituição é um aminoácido que tem uma cadeia lateral grande tal como, por exemplo, tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.
[00386] A interface CH3 de IgG1 humana, por exemplo, envolve dezesseis resíduos em cada domínio localizado em quatro filamentos B antiparalelos que cobre 1090 À2 de cada superfície (vide, por exem- plo, Deisenhofer e outros (1981) Biochemistry, 20:2361-2370; Miller e outros, (1990)J. Mol. Biol.,216, 965-973; Ridgway e outros,
(1996) Prot. Engin., 9: 617-621; Pat. U.S. No. 5.731.168). Modificações de um domínio CH3 para criar protuberâncias ou cavidades são des- critas, por exemplo, na Pat. U.S. No. 5.731.168; Pedidos de Patente Internacionais WO98/50431 e WO 2005/063816; e Ridgway e outros, (1996) Prot. Engin., 9: 617-621. Em alguns exemplos, modificações de um domínio CH3 para criar protuberâncias ou cavidades são tipica- mente direcionadas a resíduos localizados nos dois filamentos B anti- paralelos centrais. O objetivo é minimizar o risco que as protuberân- cias que são criadas sejam acomodadas através de protrusão no sol- vente circundante ao invés de serem acomodadas por uma cavidade compensadora no domínio CH3 contraparte.
[00387] Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica con- tém uma mutação T366W do domínio CH3 da "cadeia de protuberân- cias" e mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH da "cadeia de cavidades". Em alguns casos, uma ponte dissulfeto intercadeia adicio- nal entre os domínios CH3 pode ser também usada (Merchant, A. M. e outros, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo, através da introdução de uma mutação Y349C no domínio CH3 da cadeia de "protuberância" ou "cavidade" e uma mutação E356C ou uma mutação S354C no domínio CH3 da outra cadeia. Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica contém mutações S354C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações Y349C, T366S, L368A, Y470V no ou- tro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, a molécula he- terodimérica compreende mutações E356C, T366W m um dos dois domínios CH3 e mutações Y349C, T366S, L368A, Y470V no outro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, as moléculas hetero- diméricas compreendem mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações E356C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, a molécula heterodimé- rica compreende mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios
CH3 e mutações S354C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois do- mínios CH3. Exemplos de outras tecnologias knobs-into-holes são co- nhecidos na técnica, por exemplo, como descrito pela EP 1 870 459 Al.
[00388] Em algumas modalidades, as regiões Fc da molécula hete- rodimérica podem conter adicionalmente uma ou mais outra mutação de Fc, tal como qualquer uma descrita acima. Em algumas modalida- des, a molécula de heterodímero contém uma região Fc com uma mu- tação que reduz a função efetora.
[00389] Em algumas modalidades, uma variante de Fc contendo modificações de protuberância (kKnob) ou cavidade (hole) em CH3 po- de ser unida a um polipeptídeo imunomodulador empilhado em qual- quer lugar, mas tipicamente através de seu terminal N ou C, ao termi- nal N ou C de um primeiro e/ou segundo polipeptídeo imunomodulador empilhado, de modo a formar um polipeptídeo de fusão. A ligação po- de ser direta ou indireta através de um ligante. Tipicamente, uma mo- lécula de protuberância e cavidade é gerada através de coexpressão de um primeiro polipeptídeo imunomodulador empilhado ligado a uma variante de Fc contendo modificação(ões) na protuberância de CH3 com um segundo polipeptídeo imunomodulador empilhado ligado a uma variante de Fc contendo modificação(ões) na cavidade de CH3.
[00390] São também providas moléculas de ácido nucleico codifi- cando a proteína de fusão de ICOSL variante-Fc. Em algumas modali- dades, para produção de uma proteína de fusão de Fc, uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de ICOSL varian- te-Fc é inserida em um vetor de expressão apropriado. A proteína de fusão de ICOSL variante-Fc resultante pode ser expressa nas células hospedeiras transformadas com a expressão onde montagem entre domínio Fc ocorre por ligações dissulfeto intercadeia formadas entre as porções Fc para prover proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc,
diméricas, tais como divalentes.
[00391] As proteínas de fusão de Fc resultantes podem ser facil- mente purificadas através de cromatografia por afinidade nas colunas de Proteína A ou Proteína G. Para a geração de heterodímeros, eta- pas adicionais para purificação podem ser necessárias. Por exemplo, onde dois ácidos nucleicos codificando polipeptídeos ICOSL variantes diferentes são transformados em células, a formação de heterodíme- ros deve ser bioquimicamente obtida uma vez que moléculas ICOSL variantes carregando o domínio Fc serão expressas como homodíme- ros ligados a dissulfeto também. Portanto, homodímeros podem ser reduzidos sob condições que favorecem o rompimento de dissulfetos intercadeia, mas não afetam dissulfetos intracadeia. Em alguns casos, monômeros de Fc ICOSOL variante diferentes são misturados em quantidades equimolares e oxidados para formar uma mistura de ho- mo- e heterodímeros. Os componentes dessa mistura são separados através de técnicas cromatográficas. Alternativamente, a formação desse tipo de heterodímero pode ser influenciada engenheirando ge- neticamente e expressando moléculas de fusão de Fc que contêm um polipeptídeo ICOSL variante usando métodos knob-into-hole descritos abaixo. B. Conjugados e Fusões de Polipeptídeos Variantes e Proteínas Imunomoduladoras
[00392] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes provi- dos aqui, que são proteínas imunomoduladoras compreendendo vari- antes de um domínio lg da família IQSF (vIgD), podem ser conjugados com , tal como fundidos diretamente ou indiretamente a, uma porção, tal como uma porção efetora, tal como uma outra proteína, diretamen- te ou indiretamente, para formar um conjugado ("conjugado de IgSF"). Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora ICOSL va- riante é provida como um conjugado em que está contido um vIgD de
ICOSL ligado, diretamente ou indiretamente, a um agente ou porção de direcionamento, por exemplo, a um anticorpo ou outras moléculas de ligação que se ligam especificamente a um ligante, por exemplo, um antígeno, por exemplo, para direcionamento ou localização do vIgD para um ambiente ou célula específico, tal como quando adminis- trado a um indivíduo. Em algumas modalidades, o agente de direcio- namento, por exemplo, anticorpo ou outra molécula de ligação, se liga a um antígeno de tumor, dessa maneira localizando o ICOSL variante contendo o vIgD no microambiente do tumor, por exemplo, para modu- lar a atividade de linfócitos de infiltração em tumor (TILs) específicos para o microambiente do tumor. Em algumas modalidades, a ligação pode ser covalente ou não covalente, por exemplo, através de uma interação não covalente de biotina-estreptavidina. Em algumas moda- lidades, o conjugado é uma proteína de fusão de um polipeptídeo ICOSL variante ligado, diretamente ou por meio de um ligante, a uma outra porção de proteína ou polipeptídeo.
[00393] Em algumas modalidades a proteína de fusão é uma fusão de ICOSL variante-Fc, em que quaisquer dois ou mais dos polipeptí- deos variantes acima podem ser ligados a um Fc.
[00394] Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF, tal como proteína de fusão, compreende o ECD de um tipo selvagem (compri- mento integral ou truncado) ou um polipeptídeo ICOSL variante. Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF, tal como proteína de fu- são, compreende um domínio IgV ou um domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2), ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios IgC (por exemplo, IgC2). Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF, tal como proteína de fusão, compreende um domínio IgV de ICOSL como mostrado na SEQ ID NO: 196 ou 545.
[00395] Em algumas modalidades, a porção pode ser uma porção de direcionamento, um fármaco de molécula pequena (fármaco não polipeptídico de menos de 500 Dáltons de massa molar), uma toxina, um agente citostático, um agente citotóxico, um agente imunossupres- sor, um agente radioativo adequado para propósitos de diagnóstico, um fon de metal radioativo para propósitos terapêuticos, uma enzima de ativação de profármaco, um agente que aumenta a meia-vida bio- lógica ou um agente de diagnóstico ou detectável.
[00396] Em algumas modalidades a porção efetora é um agente terapêutico, tal como um agente terapêutico para câncer, que é ou ci- totóxico, citostático ou de outro modo provê algum benefício terapêuti- co. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma porção ou agen- te de direcionamento, tal como um agente que se direciona a um antí- geno de superfície celular, por exemplo, um antígeno na superfície de uma célula de tumor. Em algumas modalidades, a porção efetora é um marcador, que pode gerar um sinal detectável, ou diretamente ou indi- retamente. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma toxina. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma proteína, peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopartícula.
[00397] Em algumas modalidades, 1, 2,3,4,5 ou mais porções efe- toras, que podem ser iguais ou diferentes, são conjugadas, ligadas ou fundidas ao polipeptídeo variante ou proteína para formar um conjuga- do de IgSF. Em algumas modalidades, tais porções efetoras podem ser ligadas ao polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora usando vários métodos de conjugação e ligação biológicos e químicos moleculares conhecidos na técnica e descritos abaixo. Em algumas modalidades, ligantes tais como ligantes peptídicos, ligantes cliváveis, ligantes não cliváveis ou ligantes que auxiliam na reação de conjuga- ção podem ser usados para ligar ou conjugar as porções efetoras ao polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora.
[00398] Em algumas modalidades, o conjugado de I9gSF compreen-
de os componentes que seguem: (proteína ou polipeptídeo), (L) e (porção efetora)»m onde a proteína ou polipeptídeo é qualquer um dos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras descritos ca- pazes de ligação de um ou mais ligantes de contraestrutura cognatos como descrito; L é um ligante para ligação da proteína ou polipeptídeo à porção; m é pelo menos 1; q é O ou mais; e o conjugado de IgSF re- sultante se liga a um ou mais ligantes de contraestrutura. Em modali- dades particulares, m é 1a4e 1é 0 a 8. Em algumas modalidades, o ligante é um peptídeo. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma proteína ou polipeptídeo.
[00399] Em algumas modalidades, é provido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomodulado- ra provido aqui conjugado com um agente de direcionamento que se liga a uma molécula de superfície celular, por exemplo, para adminis- tração direcionada do polipeptídeo variante ou proteína imunomodula- dora a uma célula específica. Em algumas modalidades, o agente de direcionamento é uma molécula(s) que tem a habilidade em se locali- zar e se ligar a uma molécula presente em uma célula/tecido normal e/ou célula de tumor/tumor em um indivíduo. Em outras palavras, con- jugados de I9SF compreendendo um agente de direcionamento po- dem se ligar a um ligante (diretamente ou indiretamente), que está presente em uma célula, tal como uma célula de tumor. Os agentes de direcionamento da invenção compreendidos para uso incluem anticor- pos, polipeptídeos, peptídeos, aptâmeros, outros ligantes, e qualquer combinação dos mesmos, que podem se ligar a um componente de uma célula ou molécula-alvo.
[00400] Em algumas modalidades, o agente de direcionamento se liga a uma célula(s) de tumor ou pode se ligar na vizinhança de uma célula(s) de tumor (por exemplo, vasculatura de tumor ou microambi- ente de tumor) seguindo administração ao indivíduo. O agente de dire-
cionamento pode se ligar a um receptor ou ligante na superfície da cé- lula de câncer. Em um outro aspecto da invenção, um agente de dire- cionamento é selecionado, o qual é específico para uma célula ou te- cido não canceroso. Por exemplo, um agente de direcionamento pode ser específico para uma molécula presente normalmente em uma célu- la ou tecido particular. Ainda, em algumas modalidades, a mesma mo- lécula pode estar presente em células normais e cancerosas. Vários componentes celulares e moléculas são conhecidos. Por exemplo, se um agente de direcionamento é específico para EGFR, o conjunto de IgSF resultante pode se direcionar a células de câncer expressando EGFR bem como células epidermais de pele normais expressando EGFR. Desta maneira, em algumas modalidades, um conjugando de IgSF da invenção pode operar através de dois mecanismos separados (direcionamento a células de câncer e não câncer).
[00401] Em vários aspectos da invenção revelada aqui um conjuga- do de IgSF da invenção compreende um agente de direcionamento que pode se ligar/direcionar a um componente celular, tal como um antígeno de tumor, um antígeno bacteriano, um antígeno viral, um an- tígeno de micoplasma, um antígeno fúngico, um antígeno de príon, um antígeno de um parasita. Em alguns aspectos, um componente celular, antígeno ou molécula pode ser cada um usado para destinar um alvo desejado para um agente de direcionamento. Por exemplo, em várias modalidades, um agente de direcionamento é específico para ou se liga a um componente, que inclui, mas não é limitado a, receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR, ErbB-1, HERI), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HERA4, família de ligante de EGFR; família de receptor de fator de crescimento do tipo insulina, proteínas de ligação a IGF (IGFBPs), família de ligante de IGFR; família de re- ceptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), família de ligante de PDGFR; família de receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR), família de ligante de FGFR, receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), família de VEGF; família de receptor de HGF; família de receptor de TRK; família de receptor de efrina (EPH); família de receptor de AXL; família de receptor de leucó- cito tirosina cinase (LTK); família de receptor de TIE, angiopoietina 1,2; família de receptor de receptor órfão do tipo tirosina cinase receptora (ROR), por exemplo, ROR1; CD171 (LICAM); B7-H6 (NCR3LG1); PD- L1, antígeno de glicosilação de tumor, por exemplo, sTn ou Tn, tal co- mo sTn Ag de MUC1; LHR (LHCGR); fosfatidilserina, família de recep- tor de domínio de discoidina (DDR); família de receptor de RET; famí- lia de receptor de KLG; família de receptor de RYT; família de receptor de MuSK,; receptores de fator-a de crescimento transformante (TGF-a), TGF-B; receptores de citocina, receptores de Classe | (família hemato- poietina) e Classe |l (família interferon/IL-10), superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNF) (TNFRSF), família de receptor de morte; antígeno de câncer/testículos (CT), antígenos específicos de linhagem, antígenos de diferenciação, alfa-actinina-4, ARTCI, produtos de fusão de região de agrupamento de ponto de interrupção-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, caspase-5 (CASP-5), caspase-8 (CASP-8), B- catenina (CTNNBI), ciclo de divisão celular 27 (CDC27), cinase de- pendente da ciclina 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, proteína de fusão dek- can, EFTUD-2, Fator de alongamento 2 (ELF2), proteína de fusão do gene variante Ets 6/gene da leucemia mieloide aguda 1 ETS (ETC6- AML1), fibronectina (FN), por exemplo, o extradomínio A (EDA) de fi- bronectina, GPNMB, proteína de fusão de receptor de lipídeo de baixa densidade/GDP-L fucose: B-D-galactose 2-a-L-fucosiltransferase (LDLR/FUT), HLA-A2. Troca de arginina para isoleucina no resíduo 170 da hélice a do domínio a2 no gene HLA-A2 (HLA-A*201-R170I), HLA-AI 1, proteína de choque térmico 70-2 mutada (HSP70-2M), K1AA0205, MART2, melanoma ubíquo mutado 1, 2, 3 (MUM-, 2, 3),
fosfatase ácida prostática (PAP), neo-PAP, Classe | da miosina, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusão pml-RARa, PRDX5, PTPRÉK, K- ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPD)|, prote- ína de fusão SYT-SSXI ou -SSX2, Triosefosfato Isomerase, BAGE, BAGK- 1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (N-acetil gluco- saminil transferase aberrante V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM- HN-Il, LAGE, LAGE-I, antígeno reconhecido por CTL em melanoma (CAMEL), MAGE-AI (MAGE-I)) MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-AA, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-AIO, MAGE-AI |, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-BI, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE- Cl, MAGE-C2, mucina 1 (MUCI), MART-1/Melan-A (MLANA), gp100, gp100/ Pmell7 (SILV), tirosinase (TYR), TRP-l, HAGE, NA-88, NY-ESO-I, NY-ESO-I/LAGE-2, SAGE, Spl7, SSX-1,2,3,4, TRP2-INT2, antígeno carcino-embriônico (CEA), Calicreína 4, mamaglobina-A, OA, antígeno específico da próstata (PSA) TRP- 1/ gp75, TRP-2, adipofili- na, proteína induzível por interferon ausente em melanoma 2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciclina DI, molécula de adesão de célula epitelial (Ep- CAM), EphA3, fator de crescimento de fibroblasto-5 (FGF-5), glicopro- teína 250 (gp250), EGFR (ERBBI), HER-2/neu (ERBB2), cadeia a2 do receptor da interleucina 13 (IL13Ra2), receptor de IL-6, carboxil este- rase intestinal (ICE), alfa-feto proteína (AFP), M-CSF, mdm-2, MUCI, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-I, RNF43, RU2AS, SOXIO, STEAPI, survivina (BIRC5), transcriptase reversa da telomerase hu- mana (hTERT), telomerase, gene do tumor de Wilms (WTI), SYCPI, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIPI, CTAGE-I, CSAGE, MMAI, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15qgl4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-l, SPOI 1, TPXI, NY-SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRDI, TEX15, FATE, TPTE, idiotipos de imunoglobulina, proteína Bence- Jones, receptores de estrogênio (ER), receptores de androgênio (AR), CD40, CD30, CD20, CD19, CD33, antígeno de câncer 72-4 (CA 72-4),
antígeno de câncer 15-3 (CA 15-3), antígeno de câncer 27- 29 (CA 27- 29), antígeno de câncer 125 (CA 125), antígeno de câncer 19-9 (CA 19-9), gonadotropina coriônica humana B, B-2 microglobulina, antígeno de carcinoma de célula escamosa, enolase específica de neurônio, proteína de choque térmico gp96, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanina prolina (707-AP), antígeno de adenocarcinoma reconhecido por células T 4 (ART- 4), peptídeo-1 de antígeno carcinoembriogênico (CAP-I), canal-2 de cloreto ativado por cálcio (CLCA2), ciclofilina B (Cyp-B), tumor em anel de sinete humano-2 (HST-2), proteínas do ví- rus papiloma humano (HPV), (HPV-E6, HPV-E7, antígenos do capsí- deo maior ou menor, outros), proteínas do vírus Epstein-Barr (EBV) (EBV proteínas de membrana latentes - LMPI, LMP2; outras), proteí- nas do vírus da Hepatite B ou C e proteínas do HIV.
[00402] Em algumas modalidades, um agente de direcionamento é específico para ou se liga a um componente que inclui, mas não está limitado a, HERIV/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de |IL- 2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAMN3, CEACAM5, CEACAMG6, antígeno de câncer 125 (CA125), alfa- fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF (PDGFR; tal como PDGF-R a), PD-1, PD-L1, CTLA-A4, recep- tor de IL-2, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de ligação de folato, gangliosídeos (tais como GD2, GD3, GM1 e GM?2), receptor de VEGF (VEGFR),VEGFR2, VEGF-A, aVB3integrina, a5Bilintegrina, ERBB3, MET, IGFIR, EPHA3, TRAILR1I, TRAILR?2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complexo de BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 B, antígeno de HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno de PEM, metaloproteinases, receptor de Etfrina, li- gantes de Efrina, receptor de HGF, CXCR4, CXCRA, receptor de Bombesina, antígeno de SK-1, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK,
ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1I, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO ou B7-H6 (NCR3LG1).
[00403] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através de seu agente de direcionamento, se ligará a um componente celular de uma célula de tumor, vasculatura de tumor ou microambiente de tumor, desta maneira promovendo morte de células direcionadas atra- vés de modulação da resposta imune (por exemplo, através da adição de moléculas coestimuladoras ou inibição de moléculas reguladoras negativas de ativação de célula imune), inibição de sinais de sobrevi- vência (por exemplo, fator de crescimento ou citocina ou antagonistas de receptor de hormônio), ativação de sinais de morte e/ou citotoxidez imunomediada, tal como através de citotoxidez celular dependente de anticorpo. Tais conjugados de IgSF podem funcionar através de vários mecanismos para prevenir, reduzir ou eliminar células de tumor, tal como para facilitar administração de porções efetoras conjugadas ao alvo de tumor, tal como através de endocitose mediada por receptor do conjugado de IgSF; ou tais conjugados podem recrutar, se ligar e/ou ativar células imunes (por exemplo, células NK, monóci- tos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B). Além disso, em alguns casos uma ou mais das vias acima podem operar quando da administração de um ou mais conjugados de IgSF da invenção.
[00404] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através de seu agente de direcionamento, será localizado para, tal como se ligar a, um componente celular de uma célula de tumor, vasculatura de tumor ou microambiente de tumor, desta maneira modulando células da resposta imune na vizinhança do tumor. Em algumas modalidades, o agente de direcionamento facilita administração do IgSF conjugado (por exemplo, vIgD) ao alvo de tumor, de modo a interagir com sua contraparte de ligação cognata para alterar sinalização de células imu-
nes (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendriíti- cas, células T, células B) carregando a contraparte de ligação cognata. Em algumas modalidades, administração localizada agoniza ou esti- mula o receptor coestimulador.
[00405] Em algumas modalidades, o agente de direcionamento é uma imunoglobulina. Como aqui usado, o termo "imunoglobulina" inclui anticorpos mono- ou polivalentes naturais ou artificiais incluindo, mas não limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, seres humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, Fc de cadeia simples (scFv); anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-ld a anticorpos da invenção), e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos acima. O termo "anticorpo", como aqui usado, refere- se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que liga imunoespecificamente um an- tígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, 1gD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécu- la de imunoglobulina.
[00406] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através de sua porção de direcionamento a anticorpo, se ligará a um compo- nente celular de uma célula de tumor, vasculatura de tumor ou micro- ambiente de tumor, desta maneira promovendo apoptose de células direcionadas através da modulação da resposta imune (por exemplo, através da ativação de moléculas coestimuladoras ou inibição de mo- léculas reguladoras negativas de ativação de célula imune), inibição de sinais de sobrevivência (por exemplo, fator de crescimento ou citocina ou antagonistas de receptor de hormônio), ativação de sinais de morte e/ou citotoxidez imunomediada, tal como através de citotoxidez celular dependente de anticorpo. Tais conjugados de IgSF podem funcionar através de vários mecanismos para prevenir, reduzir ou eliminar célu- las de tumor, de modo a facilitar administração de porções efetoras conjugadas ao alvo de tumor, tal como através de endocitose mediada por receptor do conjugado de IgSF; ou tais conjugados podem recru- tar, se ligar e/ou ativar células imunes (por exemplo, células NK, mo- nócitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B).
[00407] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através de sua porção de direcionamento a anticorpo, se ligará a um compo- nente celular de uma célula de tumor, vasculatura de tumor ou micro- ambiente de tumor, desta maneira modulando a resposta imune (por exemplo, através de ativação de moléculas coestimuladoras ou inibi- ção de moléculas reguladoras negativas de ativação de célula imune). Em algumas modalidades, tais conjugados podem reconhecer, ligar e/ou modular (por exemplo, inibir ou ativar) células imunes (por exem- plo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B).
[00408] “Porções de direcionamento a anticorpo da invenção inclu- em fragmentos de anticorpo que incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv) e fragmentos compre- endendo ou um domínio VL ou VH. Fragmentos de anticorpo de liga- ção a antígeno, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem com- preender a(s) região(ões) variável(eis) sozinha ou em combinação com a totalidade ou uma porção do que segue: região de dobra, domí- nios CH1, CH2 e CH3. Também incluídos na invenção estão fragmen- tos de ligação a antígeno também compreendendo qualquer combina- ção de região(ões) variável com uma região de dobra, domínios CH1, HC2 e CH3. Também incluídos na invenção estão fragmentos Fc, pro-
teínas de fusão de antígeno-Fc e conjugados de Fc-porção de direcio- namento ou produtos de fusão (Fc-peptídeo, Fc-aptâmero). As por- ções de direcionamento a anticorpo da invenção podem ser de qual- quer origem animal incluindo aves ou mamíferos. Em um aspecto, as porções de direcionamento a anticorpo são humanas, murino (por exemplo, camundongo e rato), burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho- da-índia, camelo, cavalo ou galinha. Ainda, tais anticorpos podem ser versões humanizadas de anticorpos animais. As porções de direcio- namento a anticorpo da invenção podem ser monoespecíficas, biespe- cíficas, triespecíficas ou de multiespecificidade maior.
[00409] Em várias modalidades, um anticorpo/porção de direciona- mento recruta, liga e/ou ativa células imunes (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas) através de interações en- tre Fc (em anticorpos) e receptores de Fc (em células imunes) e atra- vés de polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras conju- gados providos aqui. Em algumas modalidades, um anticorpo/porção de direcionamento reconhece ou se liga a um agente de tumor por meio de e se localiza na célula de tumor pelos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras conjugados providos aqui para facili- tar modulação de células imunes na vizinhança do tumor.
[00410] Exemplos de anticorpos que podem ser incorporados a conjugados de IgSF incluem, mas não estão limitados a, anticorpos tais como Cetuximab (IMC-C225; Erbituxº), Trastuzumab (Herceptinº), Rituximab (Rituxanº; MabTheraº), Bevacizumab (Avastinº), Alem- tuzumab (Campathº; Campath-1Hº; Mabcampathº), Pertuzumab (Per- jetaº), Panitumumab (ABX-EGF; Vectibixº), Ranibizumab (Lucentisº), Ibritumomab, Ibritumomab tiuxetano, (Zevalinº), Tositumomab, lodo | 131 Tositumomab (BEXXARº), Catumaxomab (Removabº), Dinutuxi- mab (Unituxin'"), Gemtuzumab, Gemtuzumab eozogamicina (Mylo- targº), Abatacepte (CTLA-4-Ig; Orenciaº), Belatacepte (L104EA29YIg;
LEA29Y; LEA), Ipilimumab (MDX-010; MDX-101), Tremelimumab (tici- limumab; CP-675,206), PRS-010, PRS-050, Aflibercepte (VEGF Trap, AVEOOS), Volociximab (M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), Cixutumumab (IMC-A12), Matuzumab (EMD72000), Nimotuzumab (h- R3), Zalutumumab (HuMax-EGFR), Necitumumab IMC-11F8, mAb806 / ch806, Sym004, mAb-425, Panorex (& (17-1A) (anticorpo monoclional de murino); Panorex (Q (17-1A) (anticorpo monoclonal de murino qui- mérico); IDEC- Y2B8 (murino, MAb anti- CD20); BEC2 (MAb anti- idiotípico, imita o epítopo GD) (com BCG); Olaratumab (Lartruvo”"Y); Oncolym (anticorpo monoclonal Lym-1); SMART MI95 Ab, 13' | LYM-I humanizado (Oncolym), Ovarex (B43.13, Mab de camundongo anti- idiotípico); Ramucirumab (CyramzaO); MDX-210 (anticorpo biespeciífi- co anti-HER-2 humanizado); 3622W94 MAb que se liga a EGP40 (17- 1A) antígeno pancarcinoma em adenocarcinomas; Anti-VEGF, Zena- pax (SMART Anti-Tac (receptor de IL-2); SMART MI95 Ab, Ab humani- zado, humanizado); MDX-210 (anticorpo biespecífico anti-HER-2 hu- manizado); MDX-447 (anticorpo biespecífico de receptor anti-EGF hu- manizado); NovoMAb-G2 (Ab específico de pancarcinoma); TNT (MAb quimérico para antígenos de histona); TNT (MAb quimérico para antí- genos de histona); Gliomabe-H (Monoclon s - Abs Humanizado); Mab GNI-250; EMD-72000 (antagonista de EGF quimérico); LymphoCide (anticorpo LL2 humanizado); e MDX-260 biespecífico, alvos GD-2, Ab ANA, Ab SMART IDIO, Ab SMART ABL 364 ou IMmMuRAIT-CEA. Como ilustrado pela lista acima, é convencional produzir anticorpos para um epítopo- alvo particular.
[00411] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno dos conjugados providos, incluindo moléculas de fusão, é cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, tras- tuzumab, Ado-trastuzumab entansina, Tositumomab (Bexxar O), Ritu- ximab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetano (Zevalin), Daclizu-
mab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, fragmento Fab de varredura de CEA, anticorpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin O), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozan- tinib, Ceritinib, Crizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab (Unitu- xin'M), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilo- tinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo"Y), Palbociclib, Pazopanib, Per- tuzumab (Perjeta&O), Ramucirumab (CyramzaO), Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafe- nib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT-011), AMP-224, MSBOO01078C ou ME- DI4736, BMS-935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ou durva- lumab ou é um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[00412] Em algumas modalidades, anticorpos para PD-L1 ou frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser incorporados aos conjugados de IgSF. Exemplos de anticorpos para PD-L1 que podem ser incorporados a conjugados de IgSF incluem, mas não estão limita- dos a, anticorpos tais como BMS-936559, 12A4, LY3300054, Atezoli- zumab (Tecentrig&), Avelumab (BavencioO), Durvalumab (ImfinziO). Vi- de, por exemplo, WO2007/005874, WO2017/034916, WO2010/077634, WO?2013/079174, WO2011/066389, essas referências são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o vIgD é ligado, diretamente ou indiretamente, ao terminal N ou C da ca- deia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-PD-L1. Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-PD-L1 é BMS-936559, LY3300054, atezoli- zumab, avelumab ou durvalumab. Cadeia leve e cadeia pesada exem- plares de um anticorpo anti-PD-L1 atezolizumab são mostradas nas SEQ ID NO: 866 e 867, respectivamente. Conjugados de IgSF exem- plares que incluem o anticorpo anti-PD-L1 Atezolizumab é mostrado nas SEQ ID NOS: 868-895.
[00413] Em algumas modalidades, a porção de direcionamento a anticorpo é um anticorpo de comprimento integral, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, contendo um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora é conjugado à porção Fc da porção de direcionamento a anticorpo, tal como através de conjugado ao terminal N da porção Fc do anticorpo.
[00414] Em algumas modalidades, o vIgD é ligado, diretamente ou indiretamente, ao terminal N ou C da cadeia leve e/ou pesada do anti- corpo. Em algumas modalidades, ligação pode ser através de um |i- gante de peptídeo, tal como qualquer um descrito acima. Em algumas modalidades, o ligante pode incluir ainda aminoácidos introduzidos através de clonagem e/ou a partir de um sítio de restrição. Em algu- mas modalidades, o ligante pode incluir aminoácidos adicionais em qualquer extremidade introduzido por um sítio de restrição. Por exem- plo, o ligante pode incluir aminoácidos adicionais tal como SA (em có- digo de aminoácido de uma letra) como introduzido pelo uso do sítio de restrição AFEI. Várias configurações podem ser construídas. As FIGURAS 10A-10C mostram configurações exemplares. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser produzido através de coexpressão das cadeias pesada e leve do anticorpo em uma célula.
[00415] Em um aspecto da invenção, o agente de direcionamento é uma molécula de aptâmero. Por exemplo, em algumas modalidades, o aptâmero é compreendido de ácidos nucleicos que funcionam como um agente de direcionamento. Em várias modalidades, um conjugado de IgSF da invenção compreende um aptâmero que é específico para uma molécula em uma célula de tumor, vasculatura de tumor e/ou um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, o aptâmero em si pode compreender uma sequência biologicamente ativa, em adição ao módulo de direcionamento (sequência) onde a sequência biologica- mente ativa pode induzir uma resposta imune à célula-alvo. Em outras palavras, tal molécula de aptâmero é um agente de uso duplo. Em al-
gumas modalidades, um conjunto de IgSF da invenção compreende conjugação de um aptâmero a um anticorpo, onde o aptâmero e o an- ticorpo são específicos para ligação a moléculas separadas em uma célula de tumor, vasculatura de tumor, microambiente de tumor e/ou células imunes.
[00416] O termo "aptâmero" inclui DNA, RNA ou peptídeos que são selecionados com base em propriedades de ligação específicas a uma molécula particular. Por exemplo, um aptâmero(s) pode ser seleciona- do para ligação a um agente ou produto de gene particular em uma célula de tumor, vasculatura de tumor, microambiente de tumor e/ou uma célula imune, como aqui revelado, onde seleção é feita através de métodos conhecidos na técnica e familiares a um versado na técnica.
[00417] Em alguns aspectos da invenção o agente de direciona- mento é um peptídeo. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou pro- teínas imunomoduladoras providos aqui podem ser conjugados a um peptídeo que pode se ligar com um componente deum câncer ou célu- las de tumor. Desta maneira, tais conjugados de IgSF da invenção compreendem agentes de direcionamento a peptídeo que se ligam a um componente celular de uma célula de tumor, vasculatura de tumor e/ou um componente de um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, peptídeos de agente de direcionamento podem ser um antagonista ou agonista de uma integrina. Integrinas, que compreen- dem uma subunidade alfa e uma beta, incluem vários tipos bem co- nhecidos de um versado na técnica.
[00418] Em uma modalidade, o agente de direcionamento é VvB3. Integrina VvB3 é expressa em uma variedade de células e foi mostrada mediar vários processos biologicamente relevantes, incluindo adesão de osteoclastos à matriz óssea, migração de células de músculo liso vasculares e angiogênese. Moléculas de direcionamento adequadas para integrinas incluem peptídeos RGD ou peptidomiméticos bem co-
mo peptídeos não-RGD ou peptidomiméticos (vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.767.071 e 5.780.426) para outras integrinas tal como VA4.Bi (VLA-4), V4-P7 (vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.365.619; Chang e outros, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159-163 (2002); Lin e outros, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133-136 (2002)) e simi- lar.
[00419] Em algumas modalidades, é provido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomodulado- ra providos aqui conjugados com um agente terapêutico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico inclui, por exemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland e outros, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986). Em algumas modalidades, o agente terapêutico tem uma atividade intracelular. Em algumas mo- dalidades, o conjugado de IgSF é internalizado e o agente terapêutico é uma citotoxina que bloqueia a síntese de proteína da célula, desta maneira levando à morte celular. Em algumas modalidades, o agente terapêutico e uma citotoxina compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de inativação de ribossomo incluindo, por exemplo, gelonina, bouganina, saporina, ricina, cadeia da ricina A, briodina, toxina da dif- teria, restrictocina, exotoxina A de Pseudomonas e variantes das mesmas. Em algumas modalidades, onde o agente terapêutico é uma citotoxina compreendendo um polipeptídeo tendo uma atividade de inativação de ribossomo, o conjugado de IgSF deve ser internalizado quando da ligação à célula-alvo a fim de que a proteína seja citotóxica para as células.
[00420] Em algumas modalidades, é provido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomodulado- ra providos aqui conjugados com uma toxina. Em algumas modalida- des, a toxina inclui, por exemplo, toxinas bacterianas tais como toxina da difteria, toxinas de planta tal como ricina, toxinas de molécula pe-
quena tais como geldanamicina(Mandler e outros, J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000); Mandler e outros, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000); Mandler e outros, Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), maitansinoides (EP 1391213; Liu e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)) e calicheamicina (Lode e outros, Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman e outros, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxi- cos e citostáticos através de mecanismos incluindo ligação à tubulina, ligação a DNA ou inibição de topoisomerase.
[00421] Em algumas modalidades, é provido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomodulado- ra providos aqui conjugados com um marcador, que pode gerar um sinal detectável, indiretamente ou diretamente. Esses conjugados de IgSF podem ser usados para aplicações de pesquisa ou diagnóstico, tal como para a detecção in vivo de câncer. O marcador é preferivel- mente capaz de produzir, diretamente ou indiretamente, um sinal de- tectável. Por exemplo, o marcador pode ser radio-opaco ou um radioi- sótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 1231, 1251, 1311; um composto fluorescente (fluoróforo) ou quimioluminescente (cromóforo), tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; uma enzima, tal como fosfatase alcalina, B-galactosidase ou peroxidase de rábano sil- vestre; um agente de imagem; ou um fon de metal. Em algumas moda- lidades, o marcador é um átomo radioativo para estudos de cintigrafia, por exemplo, 99Tc ou 1231, ou um marcador giratório para imagem de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como ima- gem de ressonância magnética (MRI), tal como zircônio-89, iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro. Zircônio-89 pode ser complexado com vários agentes de quelação de metal e conjugado a anticorpos, por exemplo, para imagem PET (WO 2011/0569830. Em algumas modali-
dades, o conjugado de IgSF é detectável indiretamente. Por exemplo, um anticorpo secundário que é específico para o conjugado de IgSF e contém um marcador detectável pode ser usado para detectar o con- jugado de IgSF.
[00422] Os conjugados de IgSF podem ser preparados usando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, WO 2009/067800, WO 2011/133886 e Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2014322129, incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
[00423] Os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser "ligados" à porção efetora atra- vés de qualquer meio pelo qual os polipeptídeos variantes ou proteí- nas imunomoduladoras podem ser associados com a, ou ligados à porção efetora. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados à porção efetora através de meios químicos ou recombinantes. Meios químicos para preparação de fusões ou conjugados são conhecidos na técnica e podem ser usados para preparar o conjugado de IgSF. O método usado para conjugar os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e porção efetora devem ser capazes de unir os po- lipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras com a porção efetora sem interferir com a habilidade dos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras em se ligar a seus um ou mais ligantes de contraestrutura.
[00424] Os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados indiretamente à porção efetora. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou proteínas imuno- moduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados diretamente a um lipossomo contendo a porção efetora de um de vários tipos. A(s) porção(ões) efetora(s) e/ou os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras podem ser também ligados a uma superfície sóli- da.
[00425] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF e a porção efetora são ambos proteínas e podem ser conjugados usando técnicas bem conhecias no campo. Há várias centenas de reticulantes disponí- veis que podem conjugar duas proteínas. (Vide, por exemplo, "Che- mistry of Protein Conjugation and Crosslinking," 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). O reticulante é geralmente escolhido com ba- se nos grupos funcionais reativos disponíveis ou inseridos nos polipep- tídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e/ou porção efetora. Ainda, se não houver quaisquer grupos reativos, um reticulante fotoati- vável pode ser usado. Em certos casos, pode ser desejável incluir um espaçador entre os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomodu- ladoras e a porção efetora. Agentes de reticulação conhecidos na téc- nica incluem os agentes homobifuncionais; glutaraldeído, dimetiladipi- midato e Bis(diazobenzidina) e os agentes heterobifuncionais; m Ma- leimidobenzoil-N-Hidroxissuccinimida e Sulfo-m Maleimidobenzoil-N- Hidroxissuccinimida.
[00426] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser engenheirados com resíduos específicos para ligação química da por- ção efetora. Resíduos específicos usados para ligação química de mo- léculas conhecidos na técnica incluem lisina e cisteína. O reticulante é escolhido com base nos grupos funcionais reativos inseridos nos poli- peptídeos variante ou proteínas imunomoduladoras, e disponíveis na porção efetora.
[00427] “Um conjugado de IgSF pode ser também preparado usando técnicas de DNA recombinante. Em tal caso uma sequência de DNA codificando os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras é fundida a uma sequência de DNA codificando a porção efetora, re- sultando em uma molécula de DNA quimérico. A sequência de DNA quimérico é transfectada para uma célula hospedeira que expressa a proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser recuperada da cultura celular e purificada usando técnicas conhecidas no campo.
[00428] Exemplos de ligação de uma porção efetora, que é um marcador, aos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras incluem os métodos descritos em Hunter e outros, Nature 144:945 (1962); David e outros, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain e outros, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel e Meares, Radioimmunoimaging And Ra- dioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); e Colcher e outros, "Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986).
[00429] O radio- ou outros marcadores podem ser incorporados ao conjugado de modos conhecidos. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese de aminoá- cido química usando precursores de aminoácidos adequados envol- vendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tal como 99Tc ou 1231, 186Re, 188Re e 111Ih podem ser ligados através de um resíduo cisteína no peptídeo. Ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo lisina. O método IODOGEN (Fraker e outros, Biochem. Bi- ophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)) pode ser usado para incorpo- rar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
[00430] “Conjugados dos polipeptídeos variantes ou proteínas imu- nomoduladoras e um agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-
(N-maleimidometil) cicloexano-1 -carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dime- tila HCI), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeí- dos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p- azidobenzoil)nexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diiso- cianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1 ,5- difluor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e outros, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-p-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopen- taacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente de quela- ção exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide, por exemplo, WO94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari e outros, Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. No. 5.208.020) pode ser usado.
[00431] Os conjugados de IgSF da invenção compreendem expres- samente, mas não estão limitados a, conjugados de fármaco prepara- dos com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC- SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo- EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A). Vide páginas 467-498, 2003-2004 Applica- tions Handbook and Catalog.
C. Proteínas Imunomoduladoras de Transmembrana e Secretáveis e Células Engenheiradas
[00432] São providas aqui células engenheiradas que expressam os polipeptídeos ICOSL variantes imunomoduladores (alternativamen- te, "células engenheiradas"). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ICOSL variante é expresso em uma célula, tal como uma célula imune (por exemplo, célula T ou célula apresentando antígeno), em forma ligada à membrana, dessa maneira provendo uma proteína imunomo- duladora de transmembrana (daqui em diante chamada uma "TIP"). Em alguns aspectos, o polipeptídeo ICOSL variante é expresso em uma célula, tal como uma célula imune (por exemplo, célula T ou célu- la apresentando antígeno), em forma secretável para dessa maneira produzir uma forma solúvel secretada do polipeptídeo ICOSL variante (daqui em diante também chamado "SIP"), tal como quando as células são administradas a um indivíduo. Em alguns aspectos, um SIP pode antagonizar uma contraparte de ligação cognata no ambiente (por exemplo, microambiente de tumor) em que ele é secretado.
1. Proteínas Imunomoduladoras de Transmembrana
[00433] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodula- dor compreendendo um ICOSL variante pode ser uma proteína ligada à membrana. Como descrito em mais detalhes abaixo, o polipeptídeo imunomodulador pode ser um polipeptídeo imunomodulador de trans- membrana compreendendo um ICOSL variante em que está contido: um ectodomínio contendo pelo menos um domínio IgSF com afinidade modificada (IQV ou IgC), um domínio de transmembrana e, opcional- mente, um domínio citoplásmico. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana pode ser expressa na superfície de uma célula imune, tal como uma célula de mamífero, incluindo na superfície de um linfócito (por exemplo, célula T ou célula NK) ou célu- la apresentando antígeno. Em algumas modalidades, a proteína imu-
nomoduladora de transmembrana é expressa na superfície de uma célula T de mamífero, incluindo células T tais como: célula T auxiliar, célula T citotóxica (alternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL); uma célula T assassina natural, uma célula T reguladora, uma célula T de memória ou uma célula T gama delta. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula apresentando antígeno (APC). Tipi- camente, mas não exclusivamente, o ectodomínio (alternativamente, "domínio extracelular") compreende a uma ou mais variações de ami- noácido (por exemplo, substituições de aminoácido) do ICOSL variante da invenção. Desta maneira, por exemplo, em algumas modalidades uma proteína de transmembrana compreenderá um ectodomínio que compreende uma ou mais substituições de aminoácido de um ICOSL variante da invenção.
[00434] Em algumas modalidades, as células engenheiradas ex- pressam polipeptídeos ICOSL variantes que são polipeptídeos imuno- moduladores de transmembrana (TIPs) que podem ser uma proteína de membrana tal como uma proteína de transmembrana. Em modali- dades típicas, o ectodomínio de uma proteína de membrana compre- ende um domínio extracelular ou domínio IISF do mesmo de um ICOSL variante provido aqui em que está contida uma ou mais substi- tuições de aminoácido em pelo menos um domínio IgSF como des- crito. As proteínas imunomoduladoras de transmembrana providas aqui contêm ainda um domínio de transmembrana ligado ao ectodo- mínio. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana resulta em uma proteína codificada para expressão na superfície celular em uma célula. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é ligado diretamente ao ectodomínio. Em algumas modalidades, o domí- nio de transmembrana é ligado indiretamente ao ectodomínio através de um ou mais ligantes ou espaçadores. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana contém predominantemente resíduos de aminoácido hidrofóbicos, tais como leucina e valina.
[00435] Em algumas modalidades, um domínio âncora de trans- membrana de comprimento integral pode ser usado para assegurar que os TIPs serão expressos na superfície da célula engenheirada, tal como célula T engenheirada. Convenientemente, este poderia ser de uma proteína nativa particular que está sendo modificada na afinidade (por exemplo, ICOSL ou outra proteína IgSF nativa) e simplesmente fundido à sequência do primeiro domínio de transmembrana proximal de uma maneira similar à proteína I9gSF nativa (por exemplo, ICOSL). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmem- brana compreende um domínio de transmembrana do membro da IgSF de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem correspondente, tal como um domínio de transmembrana contido na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5 (Tabela 2). Em algumas modalidades, a forma ligada à membrana compreende um domínio de transmembrana do polipeptídeo de referência (por exem- plo, não modificado) ou do tipo selvagem, tal como correspondendo a resíduos 257-277 de SEQ ID NO: 5.
[00436] Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é um domínio de transmembrana não nativo que não é o domínio de transmembrana de ICOSL nativo. Em algumas modalidades, o domí- nio de transmembrana é derivado de um domínio de transmembrana de um outro polipeptídeo membro da família não ICOSL que é ligado à transmembrana ou é uma proteína de transmembrana. Em algumas modalidades, um domínio âncora de transmembrana de uma outra proteína em células T pode ser usado. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é derivado de CD8. Em algumas modali- dades, o domínio de transmembrana pode conter ainda uma porção extracelular de CD8 que serve com um domínio espaçador. Um domí- nio de transmembrana derivado de CD8 exemplar é mostrado na SEQ
ID NO: 246 ou 438 ou uma porção da mesma contendo o domínio de transmembrana CD8. Em algumas modalidades, o domínio de trans- membrana é um domínio de transmembrana sintético.
[00437] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana contém ainda um endodomínio, tal como um domínio de sinalização citoplásmico, ligado ao domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplásmico induz sinalização celular. Em algumas modalidades, o endodomínio da pro- teína imunomoduladora de transmembrana compreende o domínio ci- toplásmico do polipeptídeo de referência (por exemplo, não modifica- do) ou do tipo selvagem correspondente, tal como um domínio cito- plásmico contido na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 5 (vide Tabela 2).
[00438] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora de transmembrana provida que é ou compreende um ICOSL variante compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 257 e contém um ectodomínio compreendendo pelo menos um domínio IgSF ICOSL com afinidade modificada como descrito e um domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, a proteína imunomodula- dora de transmembrana contém qualquer uma ou mais substituições de aminoácido em um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV) como descrito, incluindo qualquer mostrado na Tabela 1. Em algumas moda- lidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana pode com- preender ainda um domínio citoplásmico como descrito. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana pode conter ainda um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, o peptí- deo de sinal é um peptídeo de sinal nativo de membro da IgSF do tipo selvagem, tal como contido na sequência de aminoácidos mostrada na
SEQ ID NO:5 (vide, por exemplo, Tabela 2).
[00439] Em algumas modalidades, são providas proteínas imuno- moduladoras de transmembrana compreendendo as substituições de aminoácido — E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/ C198R, N52H/N57Y/Q100R ou N52H/N57Y/Q100P. Em algumas mo- dalidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana provida é ou compreende um ICOSL variante compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:257, mas em que está contida substituições de aminoácido E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R ou N52H/N57Y/Q100P nas posições correspondentes na SEQ ID NO:257 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 257 e contém as substituições de amino- ácido E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R ou N52H/N57Y/Q100P.
[00440] Em algumas modalidades, são providas proteínas imuno- moduladoras de transmembrana compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO:496 ou 497 (cada uma contendo a substituição de aminoácido N52D), SEQ ID NO:498 ou 499 (cada uma contendo as substituições de aminoácido N52H/N57Y/Q100P), SEQ ID NO: 500 ou 501 (cada uma contendo as substituições de aminoácido E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K1I56M/C198R) — ou SEQ ID NO: 502 ou 503 (cada uma contendo as substituições de ami- noácido N52H/N57Y/Q100R) ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 495-503 e que contém as substi- tuições de aminoácido indicadas. Em algumas modalidades, quando expressas em uma célula engenheirada, tais proteínas imunomodula-
doras de transmembrana são expressas na superfície da célula.
[00441] É também provida uma molécula de ácido nucleico codifi- cando tais proteínas imunomoduladoras de transmembrana. Em algu- mas modalidades, uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína imunomoduladora de transmembrana compreende uma se- quência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 257 e contém um ectodomínio compreendendo pelo menos um domínio IgSF com afinidade modificada como descrito, um domínio de transmembrana e, opcionalmente, um domínio citoplásmi- co. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos codificando um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é o peptídeo de sinal nativo do membro da IgSF do tipo selvagem corres- pondente (vide, por exemplo, Tabela 2).
[00442] “Exemplar de uma proteína imunomoduladora de trans- membrana é TIP ICOSL compreendendo i) a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO:38 ou ii) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:243 e que compreende o domínio com afinidade mo- dificada contido na SEQ ID NO:243 ou as suas substituições de ami- noácido. É também provida i) uma sequência de nucleotídeos mostra- da na SEQ ID NO:244, ii) uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 244 e que codifica um TIP que compreende o domínio com afinidade modificada de SEQ ID NO: 243 ou iii) uma sequência de i) ou ii) tendo códons de- generados.
[00443] Em algumas modalidades, são providas proteínas imuno- moduladoras de transmembranas relacionadas a CAR em que o en- dodomínio de uma proteína imunomoduladora de transmembrana compreende um domínio de sinalização citoplásmico que compreende pelo menos um domínio de sinalização contendo ITAM (motivo de ati- vação baseado em tirosina imunorreceptora). ITAM é um motivo con- servado encontrando em vários domínios de sinalização de proteína envolvidos em transdução de sinal de células imunes, incluindo na ca- deia CD3-zeta ("CD3-z") envolvida em transdução de sinal de receptor de célula T.
Em algumas modalidades, o endodomínio compreende um domínio de sinalização CD3-zeta.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3-zeta compreende a sequência de amino- ácidos mostrada na SEQ ID NO:243 ou uma sequência de aminoáci- dos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com SEQ ID NO:247 e retém a atividade de sinalização de célula T.
Em algumas modalidades, o endodomínio de uma proteína imunomoduladora de transmembrana relacionada a CAR pode com- preender ainda um domínio de sinalização coestimulador para modular mais as respostas imunomoduladoras da célula T.
Em algumas moda- lidades, o domínio de sinalização coestimulador é CD28, ICOS, 41BB ou OX40. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coesti- mulador é um derivado de CD28 ou 4-1BB e compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS:484-487 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:484-487 e retém a atividade de sinalização coestimuladora de célula T.
Em algumas mo- dalidades, as proteínas imunomoduladoras de transmembrana relacio- nadas a CAR providas têm características de CARs para estimular si-
nalização de célula T quando da ligação de um domínio IgSF com afi- nidade modificada a uma contraparte de ligação cognata ou contraes- trutura. Em algumas modalidades, quando de ligação específica pelo domínio I9SF com afinidade modificada à sua contraestrutura pode levar a mudanças na atividade imunológica da atividade de célula T conforme refletido por mudanças em citotoxidez, proliferação ou pro- dução de citocina.
[00444] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmembrana não contém um endodomínio capaz de mediar sinali- zação citoplásmica. Em algumas modalidades, a proteína imunomodu- ladora de transmembrana não tem o mecanismo de transdução de si- nal do polipeptídeo do tipo selvagem ou não modificado e então não induz sozinho sinalização celular. Em algumas modalidades, a proteí- na imunomoduladora de transmembrana não tem um domínio intrace- lular (citoplásmico) ou uma porção do domínio intracelular do polipep- tídeo de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selva- gem, tal como um domínio de sinalização citoplásmico contido na se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:5 (vide Tabela 2). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de transmem- brana não contém um ITIM (motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptora), tal como contido em certos receptores inibidores, incluindo receptores inibidores da família IISF (por exemplo PD-1 ou TIGIT). Desta maneira, em algumas modalidades, a proteína imuno- moduladora de transmembrana apenas contém o ectodomínio e o do- mínio de transmembrana, tal como qualquer um como descrito.
2. Proteínas Imunomoduladoras Secretadas e Células Engenhei- radas
[00445] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador variante ICOSL contendo qualquer uma ou mais das mutações de aminoácido como aqui descrito é secretável, tal como quando expres-
so a partir de uma célula. Tal proteína imunomoduladora ICOSL vari- ante não compreende um domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora ICOSL variante é não con- jugada a uma porção de prolongamento de meia-vida (tal como um domínio Fc ou um domínio de multimerização). Em algumas modalida- des, a proteína imunomoduladora ICOSL variante compreende um peptídeo de sinal, por exemplo, um peptídeo de sinal de anticorpo ou outra sequência de sinal eficiente para obter domínios fora da célula. Quando a proteína imunomoduladora compreende um peptídeo de si- nal e é expressa por uma célula engenheirada, o peptídeo de sinal faz com que a proteína imunomoduladora seja secretada pela célula en- genheirada. Em geral, o peptídeo de sinal, ou uma porção do peptídeo de sinal, é clivado da proteína imunomoduladora com secreção. A pro- teína imunomoduladora pode ser codificada por um ácido nucleico (que pode ser parte de um vetor de expressão). Em algumas modali- dades, a proteína imunomoduladora é expressão e secretada por uma célula (tal como uma célula imune, por exemplo, uma célula imune primária).
[00446] Desta maneira, em algumas modalidades, são providas proteínas imunomoduladoras ICOSL variantes que compreende ainda um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, é provida aqui uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora ICOSL operavelmente conectada a uma sequência de secreção codifi- cando o peptídeo de sinal.
[00447] Um peptídeo de sinal é uma sequência no terminal N de uma proteína imunomodulador que sinaliza secreção da proteína imu- nomoduladora a partir de uma célula. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é de cerca de 5 a cerca de 40 aminoácidos de com- primento (tal como cerca de 5 a cerca de 7, cerca de 7 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 15, cerca de 15 a cerca de 20, cerca de 20 a cerca de 25 ou cerca de 25 a cerca de 30, cerca de 30 a cerca de 35 Ou cerca de 35 a cerca de 40 aminoácidos de comprimento).
[00448] Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é um peptí- deo de sinal nativo do ICOSL do tipo selvagem correspondente (vide Tabela 6). Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é um peptí- deo de sinal não nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, o peptídeo de sinal não ativo é um peptídeo de sinal nativo mutante do ICOSL do tipo selvagem correspondente, e pode incluir uma ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais) substituições, inserções ou deleções. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal não ativo é um peptídeo de sinal ou mutante do mesmo de um membro da famí- lia da mesma família de IgSF que o membro da família de IQgSF do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal não nativo é um peptídeo de sinal ou mutante do mesmo de um membro da família de IgSF de uma família de IgSF diferente do membro da família de IgSF do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é um peptídeo de sinal ou mutante do mesmo de uma família de prote- ína não IgSF, tal como um peptídeo de sinal de uma imunoglobulina (tal como cadeia pesada de IgG ou cadeia leve de IgG-kappa), uma citocina (tal como interleucina-2 (IL-2) ou CD33), uma proteína de al- bumina do soro (por exemplo, HSA ou albumina), uma sequência de sinal de preproteína azurocidina humana, uma luciferase, um tripsinó- geno (por exemplo, quimiotripsinógeno ou tripsinógeno) ou outro pep- tídeo de sinal capaz de secretar eficientemente uma proteína de uma célula. Peptídeos de sinal exemplares incluem qualquer um descrito na Tabela 6.
o = z fF) Z 12 É a = & a la 8 o [E [8 |€ O o 18 [3 [2 18 lo jo |£$ É lo O o | & 18 2 [< [8 [9 [3/3 [2 | O E 3 = 2/8 58 É </o 223 És <8 = uu x Ta | a Bro EEEREESERASBEL| uu e = [a £ 5 Jó lo és |S S |> [IS |$ [8 ja ja |< |5 [2 [2 | E E < 3/3 |3 3 à |X 3 |O jo E 3 | & 3 & 3 2 E 3 é 5 jm E é 3 $ 343/53 2 |S SBB: ESFEREEEREE EE o E x o iEESEEEREREEE NENE E E |€ 2 [3/4 = E 2 [3/8 É > /& > E 2 9 = e 2 É 3 0 (o |3 o jo 3 |EÉ à |€ 2 3 3 | 3 3/2 2X | 3 3 /Z 2 |2 |& 2 3 2 > > [2 2 2 | 3 o É |O |E |u |u é já já | jw | A [A | JO |€ |< |O [2 A = > | 2 = 2 | > | > | > | 2 | 2 [> | > | > | > | 2 2 2 |>2 o - Ss
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[00449] Em algumas modalidades de uma proteína imunomodula- dora ICOSL variante secretável, a proteína imunomoduladora compre- ende um peptídeo de sinal quando expressa, e o peptídeo de sinal (ou uma porção do mesmo) é clivado da proteína imunomoduladora quan- do da secreção.
[00450] Em algumas modalidades, as células engenheiradas ex- pressam um polipeptídeo ICOSL variante que é secretado a partir da célula. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo ICOSL variante é codificado por uma molécula de ácido nucleico codificando uma prote- ína imunomoduladora sob o controle operável de uma sequência de sinal para secreção. Em algumas modalidades, a proteína imunomo- duladora codificada é secretada quando expressa a partir de uma célu- la. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada pela molécula de ácido nucleico não compreende um domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, a proteína imunomodula- dora codificada pela molécula de ácido nucleico não compreende uma porção de prolongamento de meia-vida (tal como um domínio Fc ou um domínio de multimerização). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada pela molécula de ácido nucleico compre- ende um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, um ácido nu- cleico da invenção compreende ainda sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo secretor ou de sinal operavelmente ligado ao áci- do nucleico codificando uma proteína imunomoduladora, desta manei- ra permitindo secreção da proteína imunomoduladora.
3. Células e Células de Engenharia
[00451] São providas aqui células engenheiradas expressando qualquer um do polipeptídeo imunomodulador provido. Em algumas modalidades, as células engenheiradas expressam em sua superfície qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores de transmembrana providos. Em algumas modalidades, as células engenheiradas expres-
sam e são capazes de ou têm a habilidade de secretar a proteína imu- nomoduladora a partir das células sob condições adequadas para se- creção da proteína. Em algumas modalidades, a proteína imunomodu- ladora é expressa em um linfócito tal como um linfócito de infiltração em tumor (TIL), célula T ou célula NK ou em uma célula mieloide. Em algumas modalidades, as células engenheiradas são células apresen- tando antígeno (APCs). Em algumas modalidades, as células enge- nheiradas são células T de mamífero engenheiradas ou células apre- sentando antígeno de mamífero engenheiradas (APCs). Em algumas modalidades, as células T ou APCs engenheiradas são células huma- nas ou de mamífero.
[00452] Em algumas modalidades, células T engenheiradas inclu- em, mas não estão limitadas a, célula T auxiliar, célula T citotóxica (al- ternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL), célula T assassina natu- ral, célula T reguladora, célula T de memória ou célula T gama delta. Em algumas modalidades, as células T engenheiradas são CD4+ ou CD8+. Em adição ao sinal do MHC, células T engenheiradas também requerem um sinal coestimulador que em algumas modalidades é pro- vido por um polipeptídeo imunomodulador de transmembrana ICOSL variante expresso em forma ligada à membrana como discutido anteri- ormente.
[00453] Em algumas modalidades, as APCs engenheiradas inclu- em, por exemplo, APCs expressando MHC 1I tais como macrófagos, células B e células dendríticas, bem como APCs artificiais (aAPCs) incluindo ambas aAPCs celulares e acelulares (por exemplo, micropar- tículas poliméricas biodegradáveis). APCs artificiais (aAPCs) são ver- sões sintéticas de APCs que podem agir de uma maneira similar a APCs uma vez que elas apresentam antígenos para células T bem como as ativa. Apresentação de antígeno é realizada pelo MHC (Clas- se | ou Classe |I). Em algumas modalidades, em APCs engenheiradas tais como aAPCs, o antígeno que é carregado no MHC é, em algumas modalidades, um antígeno específico de tumor ou um antígeno asso- ciado a tumor. O antígeno carregado no MHC é reconhecido por um receptor de célula T (TOR) de uma célula T, que, em alguns casos, pode expressar ICOS, CD28 ou outra molécula reconhecida pelos po- lipeptídeos ICOSL variantes providos aqui. Materiais que podem ser usados para engenheirar uma aAPC incluem: ácido poli(glicólico), áci- do poli(láctico-co-glicólico), ferro-óxido, lipossomos, bicamadas de lipí- deo, sefarose e poliestireno.
[00454] Em algumas modalidades um aAPC celular pode ser enge- nheirado para conter um agonista de TIP e TOR que é usado em tera- pia celular adotiva. Em algumas modalidades, uma aAPC celular pode ser engenheirada para conter um agonista de TIP e TCR que é usado em expansão ex vivo de células T humanas, tal como antes da admi- nistracao, por exemplo, para reintrodução no paciente. Em alguns as- pectos, a aAPC pode incluir expressão de pelo menos um clone de anticorpo anti-CD3, por exemplo, tal como, por exemplo, OKT3 e/ou UCHT1. Em alguns aspectos, as aAPCs podem ser inativadas (por exemplo, irradiadas). Em algumas modalidades, a TIP pode incluir qualquer domínio IgSF variante que exiba afinidade de ligação com uma contraparte de ligação cognata em uma célula T.
[00455] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora provida aqui, tal como uma proteína imunomoduladora de transmem- brana ou uma proteína imunomoduladora secretável, é coexpressa ou engenheirada em uma célula que expressa um receptor de ligação a antígeno, tal como um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou receptor de célula T (TOR). Em algumas modalidades, a célula engenheirada, tal como uma célula T engenhei- rada, reconhece um antígeno desejado associado com câncer, distúr- bios inflamatórios e autoimunes, ou uma infecção viral. Em modalida-
des específicas, o receptor de ligação a antígeno contém uma porção de ligação a antígeno que se liga especificamente a um antígeno es- pecífico de tumor ou um antígeno associado a tumor. Em algumas modalidades, a célula T engenheirada é uma célula T de CAR (recep- tor de antígeno quimérico) que contém um domínio de ligação de antí- geno (por exemplo, scFv) que se liga especificamente a um antígeno, tal como um antígeno específico de tumor ou antígeno associado a tumor. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígeno (por exemplo, scFv) é específico para um antígeno particular, por exemplo, CD19. Exemplos de um CAR é um CAR anti-CD19, tal como um CAR contendo um scFv anti-CD19 mostrado na SEQ ID NO:482 ou SEQ ID NO:245. Em algumas modalidades, a proteína TIP é expressa em uma célula receptora de célula T engenheirada ou uma célula receptora de antígeno quimérico engenheirada. Em modalidades do tipo, a célula engenheirada coexpressa a TIP e o CAR ou TCR. Em algumas moda- lidades, a proteína SIP é expressa em uma célula receptora de célula T engenheirada ou uma célula receptora de antígeno quimérica enge- nheirada. Em tais modalidades, a célula engenheirada coexpressa o SIP e 0 o CAR ou TCR.
[00456] Receptores de antígeno quiméricos (CARs) são receptores recombinantes que incluem um domínio de ligação a antígeno (ecto- domínio), um domínio de transmembrana e uma região de sinalização intracelular (endodomínio) que é capaz de induzir ou mediar um sinal de ativação para a célula T após o antígeno ser ligado. Em alguns exemplos, células expressando CAR são engenheiradas para expres- sar um fragmento variável de cadeia simples extracelular (scFv) com especificidade para um antígeno de tumor particular ligado a uma par- te de sinalização intracelular compreendendo um domínio de ativação e, em alguns casos, um domínio coestimulador. O domínio coestimu- lador pode ser derivado de, por exemplo, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 ou coestimulador de célula T induzível (ICOS). O domínio de ativação pode ser derivado de, por exemplo, CD3, tal como CD3 zeta, épsilon, delta, gama ou similar. Em certas modalidades, o CAR é projetado pa- ra ter dois, três, quatro ou mais domínios coestimuladores. O scFv de CAR pode ser projetado para se direcionar a um antígeno expresso em uma célula associado com uma doença ou condição, por exemplo, um antígeno de tumor, tal como, por exemplo, CD19, que é uma prote- ína de transmembrana expressa por células na linhagem de célula B, incluindo todas as células B normais e males de célula B, incluindo, mas não limitado a, NHL, CLL e ALL de célula não T. Terapias e cons- trutos para célula T CAR+ exemplares são descritos nas Publicações de Patente U.S. Nos. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 e 2014/0050708, e essas referências são incorporadas a título de refe- rência em sua totalidade.
[00457] Em alguns aspectos, o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, tal como um fragmento de cadeia simples (scFv). Em algumas modalidades, o antí- geno é expresso em uma célula de tumor ou câncer. Exemplo de um antígeno é CD19. Exemplo de um CAR é um CAR anti-CD19, tal como um CAR contendo um scFv anti-CD19 mostrado na SEQ ID NO: 245. Em algumas modalidades, o CAR contém ainda um espaçador, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular ou região compreendendo um domínio de sinalização ITAM, tal como um domínio de sinalização CD3zeta. Em algumas modalidades, o CAR inclui ainda um domínio de sinalização coestimulador.
[00458] Em algumas modalidades, o CAR contém ainda um espa- çador ou dobra, um domínio de transmembrana e um domínio de sina- lização intracelular (endodomínio) compreendendo um domínio de si- nalização ITAM, tal como um domínio de sinalização CD3-zeta.. Em algumas modalidades, o CAR inclui ainda um domínio de sinalização coestimulador. O domínio coestimulador pode ser derivado de, por exemplo, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 ou estimulador de célula T in- duzível (ICOS). Em certas modalidades, o CAR é projetado para ter dois, três, quatro ou mais domínios coestimuladores. O scFv car pode ser projetado para se direcionar a um antígeno expresso em uma célu- la associado com uma doença ou condição, por exemplo, um antígeno de tumor, tal como, por exemplo, CD19, que é uma proteína de trans- membrana expressa por células na linhagem de célula B, incluindo to- das as células B normais e males de célula B, incluindo, mas não limi- tado a, NHL, CLL e ALL não célula T. Exempos de terapias e constru- tos de célula T CAR+ são descritos nas Publicações de Patente U.S. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 e 2014/0050708, e es- sas referências são incorporadas a título de referência em sua totali- dade. Em algumas modalidades, o espaçador ou dobra está presente entre o domínio de ligação de antígeno e o domínio de transmembra- na, tal como entre o domínio de ligação de antígeno e membrana plasmática quando expresso em uma célula. Em algumas modalida- des, o espaçador ou dobra é derivado de subclasse de IgG (tal como IgG1 e IgG4, IgD ou CD8 (vide, por exemplo, Qin e outros (2017) J. Hematol. Oncol., 10:68). Em algumas modalidades, o espaçador ou dobra é derivado de IgG1.
[00459] Em algumas modalidades, o espaçador e domínio de transmembrana são a dobra e o domínio de transmembrana derivados de CD8, tal como tendo uma sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO:246, 483 ou 897 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:246, 483 ou -897. Em algumas modalidades, o domínio de si- nalização CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos mostra- da na SEQ ID NO:243 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:247 e retém a atividade de sinalização de célula T. Em algumas modalidades, o endodomínio de um CAR pode compre- ende ainda um domínio ou região de sinalização coestimulador para modular mais as respostas imunomoduladoras da célula T. Em algu- mas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador é ou com- preende uma região coestimuladora, ou é derivado de uma região co- estimuladora, de CD28, ICOS, 41BB ou OX40. Em algumas modalida- des, o domínio de sinalização coestimulador é um derivado de CD28 ou 4-1BB e compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS:484-487 ou uma sequência de aminoá- cidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com as SEQ ID NOS:484-487 e retém a atividade de si- nalização coestimuladora de célula T.
[00460] É provido aqui um polinucleotídeo codificando um polipeptí- deo ICOSL e codificando uma ou mais proteínas, tal como um receptor de antígeno recombinante (por exemplo, receptor de antígeno quiméri- co (CAR) ou receptor de célula T engenheirado (TCR)), um marcador e um ou mais peptídeos de autoclivagem. Em algumas modalidades, o construto codificando o CAR codifica ainda uma segunda proteína, tal como um marcador, por exemplo, proteína detectável, separada do CAR por uma sequência de peptídeo de autoclivagem. Em alguns exemplos, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante é separado da uma ou mais sequências que é um ácido nucleico codi- ficando uma proteína, em que a proteína codifica um receptor de antí- geno recombinante (por exemplo, CAR ou TCR), um marcador, uma citocina ou uma quimiocina. Qualquer uma das sequências de nucleo- tídeo pode ser um vetor, tal como um vetor viral. Em alguns exemplos,
o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.
[00461] Em algumas modalidades, a sequência de peptídeo de au- toclivagem é um peptídeo de autoclivagem F2A, T2A, E2A ou P2A. Sequências exemplares de um peptídeo de autoclivagem T2A são mostradas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 250, 488, 860-862 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 250, 488, 860-862. Em algumas modalidades, o T2A é codifica- do pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:249 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 249. Uma sequência exemplar de um peptídeo de autoclivagem P2A é mostrada na SEQ ID NO: 863 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NOS: 863. Em alguns casos, um construto de ácido nucleico que codifica mais de um peptídeo de autoclivagem P2A (tal como um P2A1 e P2A2), em que as sequências de nucleotídeo P2A1 e P2A2 codificam cada uma o P2A mostrado na SEQ ID NO:863, a sequência de nucleotídeo pode ser diferente para evitar recombinação entre se- quências.
[00462] Em algumas modalidades, o marcador é uma proteína de- tectável, tal como uma proteína fluorescente, por exemplo, uma prote- ína verde fluorescente (GFP) ou uma proteína azul fluorescente (BFP). Sequências exemplares de um marcador de proteína fluorescente são mostradas na SEQ ID NO:489, 858, 859, 903 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de iden-
tidade de sequência com SEQ ID NO: 489, 858, 859, 903.
[00463] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-CD19 que tem a sequência de aminoácidos mostradas em qualquer uma de SEQ ID NO: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 ou 902 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de iden- tidade de sequência com qualquer uma da SEQ ID NOS: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 ou 902. Em algumas modalidades, o CAR é codificado por uma sequência de nucleotideos mostrada na SEQ ID NO: 248 ou 900 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 248 ou 900.
[00464] Em uma outra modalidade, a célula T engenheirada possui um TCR, incluindo um TCR recombinante ou engenheirado. Em algu- mas modalidades, o TOR pode ser um TCR nativo. Aqueles versados na técnica reconhecerão que geralmente receptores de célula T de mamífero nativos compreendem uma cadeia alfa e uma beta (ou uma cadeia gama e uma delta) envolvidas em reconhecimento e ligação específicos de antígeno. Em algumas modalidades, o TOR é um TCR engenheirado que é modificado. Em algumas modalidades, o TOR de uma célula T engenheirada se liga especificamente a um antígeno as- sociado a tumor ou específico de tumor apresentado por uma APC.
[00465] Em algumas modalidades, os polipeptídeos imunomodula- dores, tais como polipeptídeos imunomoduladores de transmembrana ou polipeptídeos imunomoduladores secretáveis, podem ser incorpo- rados em células engenheiradas, tais como células T engenheiradas ou APCs engenheiradas, através de uma variedade de estratégias tais como aquelas empregadas para células hospedeiras recombinantes. Uma variedade de métodos para introduzir um construto de DNA em células T primárias é conhecida na técnica. Em algumas modalidades, transdução viral ou eletroporação de plasmídeo é empregada. Em mo- dalidades típicas, a molécula de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora, ou o vetor de expressão, compreende um peptídeo de sinal que localiza as proteínas imunomoduladoras de transmem- brana expressas para a membrana celular ou para secreção. Em al- gumas modalidades, um ácido nucleico codificando uma proteína imu- nomoduladora de transmembrana da invenção é subclonados em um vetor viral, tal como um vetor retroviral, que permite expressão na célu- la de mamífero hospedeira. O vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira de mamífero e, sob condições de cultura de célula hospedeira, a proteína imunomoduladora é expressa na superfí- cie ou é secretada.
[00466] Em um exemplo, células T primárias podem ser purificadas ex vivo (células CD4 ou células CD8 ou ambas) e estimuladas com um protocolo de ativação consistindo em vários agonistas de TOR/CD28, tais como esferas revestidas com anti-CD3/anti-CD28. Após um pro- cesso de ativação de 2 ou 3 dias, um vetor de expressão recombinan- te contendo um polipeptídeo imunomodulador pode ser estavelmente introduzido nas células T primárias através de protocolos de transdu- ção lentiviral ou retroviral padrão ou estratégias de eletroporação de plasmídeo. As células podem ser monitoradas quanto à expressão de polipeptídeo imunomodulador através de, por exemplo, citometria de fluxo usando marcador antiepítopo ou anticorpos que reagem cruzado com molécula parental nativa e polipeptídeos compreendendo ICOSL variante. Células T que expressam o polipeptídeo imunomodulador podem ser enriquecidas através de separação com anticorpos marca- dores antiepítopo ou enriquecidas para expressão alta ou baixa de- pendendo da aplicação.
[00467] “Quando da expressão de polipeptídeo imunomodulador, a célula T engenheirada pode ser ensaiada quanto à função apropriada através de uma variedade de meios. A coexpressão de CAR ou TCR engenheirado pode ser validada para mostrar que esta parte da célula T engenheirada não foi significantemente impactada pela expressão da proteína imunomoduladora. Uma vez validada, ensaios de citotoxi- dez, proliferação ou citocina in vitro padrão (por exemplo, expressão de IFN-gama) podem ser usados para avaliar a função de células T engenheiradas. Pontos finais padrão exemplares são lise percentual da linhagem de tumor, proliferação de célula T engenheirada ou ex- pressão de proteína IFN-gama em sobrenadantes de cultura. Um construto engenheirado que resulta em lise aumentada estatisticamen- te significante de linhagem de tumor, proliferação aumentada da célula T engenheirada ou expressão de IFN-gama aumentada com relação ao construto controle pode ser selecionado. Ainda, células T não en- genheiradas, tais como primárias nativas ou endógenas, poderiam também ser incorporadas ao mesmo ensaio in vitro para medir a habi- lidade do construto de polipeptídeo imunomodulador expresso nas cé- lulas engenheiradas, tais como células T engenheiradas, em modular atividade, incluindo, em alguns casos, ativar e gerar função efetora por células T nativas, espectadoras. Expressão aumentada de marcadores de ativação tal como CD69, CD44 ou CD62L poderia ser monitorada em células T endógenas, e proliferação e/ou produção de citocina au- mentada poderia indicar atividade desejada da proteína imunomodula- dora expressa nas células T engenheiradas.
[00468] Em algumas modalidades, os ensaios similares podem ser usados para comparar a função de células T engenheiradas contendo o CAR ou TCR sozinho àqueles contendo o CAR ou TCR e um cons- truto de TIP. Tipicamente, esses ensaios in vitro são realizados pla- queando várias razões da célula T engenheirada e uma linhagem de célula de "tumor" contendo o antígeno de CAR ou TCR cognato juntos em cultura. Pontos finais padrão são lise percentual da linhagem de tumor, proliferação da célula T engenheirada ou produção de IFN- gama em sobrenadantes de cultura. Uma proteína imunomoduladora engenheirada que resultou em lise estatisticamente significante au- mentada de linhagem de tumor, proliferação aumentada da célula T engenheirada ou produção de IFN-gama aumentada com relação ao mesmo construto de TOR ou CAR sozinho pode ser selecionada.
[00469] Células T humanas engenheiradas podem ser analisadas em camundongos imunocomprometido, tal como a linhagem NSG, que não tem células T, NK e B de camundongo. Células T humanas enge- nheiradas em que o CAR ou TCR se liga a uma contraestrutura-alvo no xenoenxerto e é coexpresso com o domínio IgSF com afinidade modificada com TIP podem ser adotivamente transferidas in vivo em números e razões de célula diferentes comparado com o xenoenxerto. Por exemplo, enxerto de linhagens de tumor de leucemia CD19+ con- tendo um vetor de luciferase/GFP pode ser monitorado através de bio- luminescência ou ex vivo através de citometria de fluxo. Em uma mo- dalidade comum, o xenoenxerto é introduzido no modelo de murino, seguido por células T engenheiradas vários dias depois. Células T en- genheiradas contendo a proteína imunomoduladora podem ser ensai- adas quanto à sobrevivência aumentada, eliminação do tumor ou nú- meros de células T engenheiradas expandidos em relação a células T engenheiradas contendo o CAR ou TCR sozinho. Como no ensaio in vitro, células T humanas nativas, endógenas, poderiam ser transferi- das coadotivamente para procurar por disseminação de epítopo bem- sucedida naquela população, resultando em melhor sobrevivência ou eliminação de tumor. D. Agentes Infecciosos Expressando Polipeptídeos Variantes e Proteínas Imunomoduladoras
[00470] São também providos agentes infeccioso que contêm áci-
dos nucleicos codificando qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomodu- ladoras secretáveis ou de transmembrana descritas aqui. Em algumas modalidades, tais agentes infecciosos podem administrar os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos imunomoduladores variantes descritos aqui, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, a uma célula-alvo em um indivíduo, por exemplo, célula imune e/ou célula apresentando antígeno (APC) ou célula de tumor em um indivíduo. São também pro- vidos ácidos nucleicos contidos em tais agentes infecciosos, e/ou áci- dos nucleicos para geração ou modificação de tais agentes infeccio- sos, tais como vetores ou e/ou plasmídeos, e composições contendo tais agentes infecciosos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante é expresso em um agente infeccioso (por exemplo, agente viral ou bacteriano) que, quando da administracao a um indiví- duo, é capaz de infectar uma célula in vivo, tal como uma célula imune (por exemplo, célula T ou célula apresentando antígeno) ou tumor, pa- ra administracao ou expressão do polipeptídeo variante como uma TIP ou uma SIP na célula.
[00471] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um micro- organismo ou um micróbio. Em algumas modalidades, o agente infec- cioso é um vírus ou uma bactéria. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria. Em algumas modalidades, os agentes infecciosos po- dem administrar sequências de ácido nucleico codificando qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou de transmem- brana, descritas aqui. Desta maneira, em algumas modalidades, a cé- lula em um indivíduo que é infectado ou contatado pelos agentes in- fecciosos pode ser feita expressar na superfície celular ou secretar os polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em algumas modalidades,
o agente infeccioso também pode administrar um ou mais agentes te- rapêuticos ou ácidos nucleicos codificando outros agentes terapêuticos à célula e/ou um ambiente dentro do indivíduo. Em algumas modalida- des, outros agentes terapêuticos que podem ser administrados pelos agentes infecciosos incluem citocinas ou outras moléculas imunomo- duladoras.
[00472] Em algumas modalidades, o agente infeccioso, por exem- plo, vírus ou bactéria, contém sequências de ácido nucleico que codifi- cam qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou de transmembrana, descritas aqui, e em virtude de contato e/ou infecção de uma célula no indivíduo, a célula expressa os polipeptídeos varian- tes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imuno- moduladoras secretáveis ou de transmembrana, codificados pelas se- quências de ácido nucleico contidas no agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso pode ser administrado ao indivíduo. Em algumas modalidades, o agente infeccioso pode ser introduzido nas células a partir do indivíduo ex vivo.
[00473] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomodulado- ras de transmembrana, expressos pela célula infectada pelo agente infeccioso é uma proteína de transmembrana e é expressa na superfí- cie. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomoduladoras se- cretáveis, expressos pela célula infectada pelo agente infeccioso são expressos e secretados a partir da célula. A proteína imunomodulado- ra de transmembrana ou proteína imunomoduladora secretada pode ser qualquer uma descrita aqui.
[00474] Em algumas modalidades, as células no indivíduo que são direcionadas pelo agente infeccioso incluem uma célula de tumor, uma célula imune e/ou uma célula apresentando antígeno (APC). Em algu- mas modalidades, o agente infeccioso se direciona a uma célula no microambiente do tumor (TME). Em algumas modalidades, o agente infeccioso administra os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos vIgD ICOSL, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou de transmembrana, a uma célula apropriada (por exemplo, uma APC, tal como uma célula que exibe um complexo de peptídeo/MHC em sua superfície celular, tal como uma célula dendrítica) ou tecido (por exemplo, tecido linfoide) que modula uma resposta imune e/ou uma resposta imune mediada por célula es- pecífica, por exemplo, resposta de célula T CD4 e/ou CD8, resposta de célula T CD8 que pode incluir uma resposta de célula T citotóxica (CTL). Em algumas modalidades, o agente infeccioso se direciona a uma APC, tal como uma célula dendrítica (DC). Em algumas modali- dades, a molécula de ácido nucleico administrada pelos agentes infec- ciosos descritos aqui inclui sequências de ácido nucleico apropriadas necessárias para a expressão das sequências de codificação opera- velmente ligadas codificando os polipeptídeos imunomoduladores va- riantes, em particular uma célula-alvo, por exemplo, elementos regula- dores tais como promotores.
[00475] Em algumas modalidades, o agente infeccioso que contém sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos imunomo- duladores pode também conter sequências de ácido nucleico que codi- ficam um ou mais produtos de gene adicionais, por exemplo, citocinas, enzimas de conversão de profármaco, citotoxinas e/ou produtos de gene detectáveis. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico e o vírus pode incluir sequências de ácido nucleico codificando os produtos de gene terapêuticos adicionais (vide, por exem- plo, Kirn e outros, (2009) Nat. Rev. Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo e outros, (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:403-411; vide Pat. U.S. Nos.
7.588.767, 7.588.771, 7.662.398 e 7.754.221 e Publ. Pat. U.S. Nos. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/ 0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/ 0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 e 2011/0064650. Em algu- mas modalidades, o produto de gene adicional pode ser um produto de gene terapêutico que pode resultar em morte da célula-alvo (por exemplo, células de tumor) ou produto de gene que pode aumentar ou reforçar ou regular uma resposta imune (por exemplo, citocina). Produ- tos de gene exemplares também incluem um agente anticâncer, um agente antimetastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imunomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imune, um anti- corpo, uma citocina, um fator de crescimento, um antígeno, um produ- to de gene citotóxico, um produto de gene proapoptótico, um produto de gene antiapoptótico, um gene degradante da matriz celular, genes para regeneração de tecido e reprogramação de células somáticas humanas para pluripotência, e outros genes descritos aqui ou conhe- cidos de um versado na técnica. Em algumas modalidades, o produto de gene adicional é Fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GM-CSF).
1. Vírus
[00476] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico ou um vírus que se direciona a células particulares, por exemplo, células imunes. Em algumas modalidades, o agente infeccioso se direciona a uma célula de tumor e/ou célula cancerosa no indivíduo. Em algumas modalidades, o agente infeccioso se direciona a uma célula imune ou uma célula apresentando antígeno (APC).
[00477] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico. Vírus oncolíticos são vírus que acumulam nas células de tumor e replicam em células de tumor. Em virtude de replicação na cé-
lula de tumor, e administração opcional de ácidos nucleicos codifican- do polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores descritos aqui, células de tumor são lisadas, e o tumor encolhe e pode ser eliminado. Vírus oncolíticos podem também ter uma ampla gama de hospedeiro e tipo de célula. Por exemplo, vírus oncolítico pode acumular em células imunoprivilegiadas ou tecidos imunoprivilegiados, incluindo tumores e/ou metástases, e também incluindo tecidos e célu- las feridos, desta maneira permitindo a administração e expressão de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos imunomoduladores vari- antes descritos aqui em uma ampla gama de tipos de célula. Vírus on- colíticos podem também replicar de uma maneira específica de célula de tumor, resultando em lise de célula de tumor e regressão de tumor eficiente.
[00478] Vírus oncolíticos exemplares incluem adenovírus, vírus adenoassociados, herpes vírus, Vírus Herpes Simplex, vírus Estomáti- co Vesticular, Reovírus, vírus da Doença de Newcastle, parvovírus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesticular (VSV), vírus de Cox- sackie e vírus Vaccinica. Em algumas modalidades, vírus oncolíticos podem colonizar especificamente tumores sólidos, embora não infec- tando outros órgãos, e podem ser usados como um agente infeccioso para administrar os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos imu- nomoduladores descritos aqui a tais tumores sólidos.
[00479] Vírus oncolíticos para uso em administração de ácidos nu- cleicos codificando polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores descritos aqui podem ser qualquer um daqueles conhecidos de um versado na técnica e incluem, por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 7.731.974,
7.153.510, 6.653.103 e Pub. Pat. U.S. Nos. 2010/0178684, 2010/ 0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 e Pat. EP Nos. 1385466, 1606411 e 1520175; vírus herpes simples.
Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 7.897.146, 7.731.952, 7.550.296,
7.537.924, 6.723.316, 6.428.968 e Pub. Pat. U.S. Nos. 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/ 0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/ 0039894, 2004/0009604, 2004/0063094, Pub. De Patente Internacio- nais Nos. WO 2007/052029, WO 1999/038955; retrovírus, vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 6.689.871, 6.635.472, 5.851.529, 5.716.826,
5.716.613 e U.S. Pub. Pat. No. 20110212530; vírus vaccínia. Vide, por exemplo, 2016/0339066 e vírus adenoassociados. Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 8.007.780, 7.968.340, 7.943.374, 7.906.111, 7.927.585,
7.811.814, 7.662.627, 7.241.447, 7.238.526, 7.172.893, 7.033.826,
7.001.765, 6.897.045 e 6.632.670.
[00480] Vírus oncolíticos também incluem vírus que foram geneti- camente alterados para atenuar sua virulência, aperfeiçoar seu perfil de segurança, aumentar sua especificidade de tumor e eles foram equipados com genes adicionais, por exemplo, citotoxinas, citocinas, enzimas de conversão de profármaco para aperfeiçoar a eficácia total dos vírus (vide, por exemplo, Kirn e outros, (2009) Nat. Rev. Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo e outros, (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:403-411; vide Pat. U.S. Nos. 7.588.767, 7.588.771, 7.662.398 e 7,754,221 e Publ. Pat. U.S. Nos. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/ 0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/ 0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/ 0136917 e 2011/0064650). Em algumas modalidades, os vírus oncolí- ticos podem ser aqueles que foram modificados de modo que eles re- plicam seletivamente em células cancerosas e, desta maneira, são on- colíticos. Por exemplo, o vírus oncolítico é um adenovírus que foi en- genheirado para ter tropismo modificado para terapia de tumor e tam- bém como vetores de terapia de gene. Exemplo de tal são ONYX-015, H101 e Ad5ACR (Hallden e Portella (2012) Expert. Opin. Ther. Tar-
gets, 16:945-58) e TNFerade (McLoughlin e outros (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825-30) ou um adenovírus condicionalmente replicativo On- corineº.
[00481] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus herpes simplex modificado. Em algumas modalidades, o agente infec- cioso é uma versão modificada de Talimogene laherparepvec (também conhecido como T-Vec, Imlygic ou OncoVex GM-CSF), que é modifi- cado para conter ácidos nucleicos codificando qualquer um dos poli- peptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores des- critos aqui. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus herpes simplex modificado que é descrito, por exemplo, nos WO 2007/ 052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216 ou suas variantes.
[00482] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus que se direciona a um tipo particular de células em um indivíduo ao qual é administrado o vírus, por exemplo, um vírus que se direcionada a células imunes ou células apresentando antígeno (APCs). Células dendríticas (DCs) são APCs essenciais para o início e controle de res- postas imunes. DCs podem capturar e processar antígenos, migrar da periferia para um órgão linfoide e apresentar os antígenos a células T em repouso de uma maneira restrita ao complexo principal de histo- compatibilidade (MHC). Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus que pode especificamente se direcionar a DCs para admi- nistrar ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo ICOSL variante ou polipeptídeos imunomoduladores para expressão em DCs. Em algu- mas modalidades, o vírus é um lentivírus ou uma variante ou derivado do mesmo, tal como um vetor lentiviral deficiente em integração. Em algumas modalidades, o vírus é um lentivírus que é pseudotipificado para se ligar eficientemente a e infectar produtivamente células ex- pressando a não integrina aderida à molécula de adesão intercelular-3 específica de células dendríticas (DC-SIGN), tais como DCs. Em al- gumas modalidades, o vírus é um lentivírus pseudotipificado com uma glicoproteína do vírus Sindbis E2 ou forma modificada da mesma, tais como aqueles descritos no WO 2013/149167. Em algumas modalida- des, o vírus permite administração e expressão de uma sequência de interesse (por exemplo, um ácido nucleico codificando qualquer um dos polipeptídeos ICOSL ou polipeptídeos imunomoduladores descri- tos aqui) a uma DC. Em algumas modalidades, o vírus inclui aqueles descritos nos WO 2008/011636, US 2011/0064763, Tareen e outros (2014) Mol. Ther., 22:575-587 ou suas variantes. Exemplos de uma plataforma de célula dendrítica-vetor trópico é ZVex'Y.
2. Bactérias
[00483] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bac- téria. Por exemplo, em algumas modalidades, as bactérias podem ad- ministrar ácidos nucleicos codificando qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes descritos aqui, por exemplo, polipeptídeo ICOSL variante ou polipeptídeo imunomodulador, a uma célula-alvo no indivíduo, tal como uma célula de tumor, uma célula imune, uma célula apresentando antígeno e/ou uma célula fagocítica. Em algumas moda- lidades, a bactéria pode ser preferivelmente direcionada a um ambien- te específico dentro de um indivíduo, tal como um microambiente de tumor (TME), para expressão e/ou secreção dos polipeptídeos imuno- moduladores variantes e/ou direcionar células específicas no ambiente para expressão dos polipeptídeos imunomoduladores variantes.
[00484] Em algumas modalidades, a bactéria administra os ácidos nucleicos às células através de transferência mediada por bactéria de DNA de plasmídeo a células de mamífero (também referidas como "bactofecção"). Por exemplo, em algumas modalidades, administração de material genético é obtida através da entrada da bactéria inteira em células-alvo. Em algumas modalidades, lise bacteriana espontânea ou induzida pode levar à liberação de plasmídeo para expressão de célula eucariótica subsequente. Em algumas modalidades, a bactéria pode administrar ácidos nucleicos a células de mamífero não fagocíticas (por exemplo, células de tumor) e/ou a células fagocíticas, por exem- plo, certas células imunes e/ou APCs. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos administrados pela bactéria podem ser transferidos para o núcleo da célula no indivíduo para expressão. Em algumas mo- dalidades, os ácidos nucleicos também incluem sequências de ácido nucleico apropriadas necessárias para a expressão das sequências operavelmente ligadas codificando os polipeptídeos imunomodulado- res variantes em uma célula hospedeira particular, por exemplo, ele- mentos reguladores tais como promotores ou aumentadores. Em al- gumas modalidades, o agente infeccioso que é uma bactéria pode administrar ácidos nucleicos codificando as proteínas imunomodulado- ras na forma de um RNA, tal como um RNA competente em tradução pré-produzido administrado ao citoplasma da célula-alvo para tradução pelo mecanismo da célula-alvo.
[00485] Em algumas modalidades, a bactéria pode replicar e lisar as células-alvo, por exemplo, células de tumor. Em algumas modalida- des, a bactéria pode conter e/ou liberar sequências de ácido nucleico e/ou produtos de gene no citoplasma das células-alvo, desta maneira matando a célula-alvo, por exemplo, célula de tumor. Em algumas mo- dalidades, o agente infeccioso é bactéria que pode replicar especifi- camente em um ambiente particular no indivíduo, por exemplo, micro- ambiente de tumor (TME). Por exemplo, em algumas modalidades, a bactéria pode replicar especificamente em microambientes anaeróbi- cos ou hipóxicos. Em algumas modalidades, condições ou fatores pre- sentes em ambientes particulares, por exemplo, aspartato, serina, ci- trato, ribose ou galactose produzidos por células no TME, podem agir como quimioatraentes para atrair a bactéria para o ambiente. Em al-
gumas modalidades, a bactéria pode expressar e/ou secretar as prote- ínas imunomoduladoras descritas aqui no ambiente, por exemplo, TME.
[00486] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bac- téria que é uma Listeria sp., uma Bifidobacterium sp., uma Escherichia sp., uma Closteridium sp., uma Salmonella sp., uma Shigella sp., uma Vibrio sp. ou uma Yersinia sp. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada dentre um ou mais de Listeria monocytogenes, Salmonel- la typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Vibrio chole- ra, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Clostridium novyi, Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium adolescentis. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria engenheirada. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria engenheirada tais como aquelas descritas em, por exemplo, Seow e Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767—7T7T; Baban e outros (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394; Patyar e ou- tros (2010) J. Biomed. Sci. 17:21; Tangney e outros (2010) Bioengine- ered Bugs 1:4, 284-287; van Pijkeren e outros (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/0293705; US 2015/0359909 e EP 3020816. A bactéria pode ser modificada para administrar sequências de ácido nucleico codificando qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes, conjugados e/ou fusões providos aqui, e/ou expressar tais polipeptídeos imunomoduladores variantes no indivíduo. IV. ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES E MÉTODOS PARA PRODU-
ÇÃO DOS POLIPEPTÍDEOS OU CÉLULAS
[00487] São providos aqui ácidos nucleicos isolados ou recombi- nantes coletivamente referidos como "ácidos nucleicos" que codificam qualquer uma das várias modalidades providas dos polipeptídeos
ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores providos aqui. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos providos aqui, incluindo todos os descritos abaixo, são úteis em produção recombinante (por exemplo, expressão) de polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptí- deos imunomoduladores providos aqui. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos providos aqui, incluindo todos os descritos abaixo, são úteis em expressão de polipeptídeos ICOSL variantes ou polipep- tídeos imunomoduladores providos aqui em células, tal como em célu- las engenheiradas, por exemplo, células imunes, ou células de agente infeccioso. Os ácidos nucleicos providos aqui podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA, e incluem mRNA, cRNA, RNA e DNA recom- binantes ou sintéticos e cDNA. Os ácidos nucleicos providos aqui são tipicamente moléculas de DNA, e geralmente moléculas de DNA de fila- mento duplo. No entanto, DNA de filamento único, RNA de filamento simples, RNA de filamento duplo e ácidos nucleicos de DNA/RNA híbrido ou combinações dos mesmos compreendendo qualquer uma das se- quências de nucleotídeo da invenção também são providos.
[00488] São também providos aqui vetores de expressão recombi- nantes e células hospedeiras recombinantes úteis em produção dos polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores providos aqui.
[00489] São também providas aqui células engenheiradas, tais co- mo células imunes engenheiradas, contendo qualquer uma das molé- culas de ácido nucleico providas ou qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores, tais como qual- quer um dos polipeptídeos imunomoduladores de transmembrana ou polipeptídeos imunomoduladores secretáveis.
[00490] São também providos aqui agentes infecciosos, tais como células bacterianas ou virais, contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico providas ou qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes ou polipeptídeos imunomoduladores, tal como qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores de transmembrana ou polipeptí- deos imunomoduladores secretáveis.
[00491] Em qualquer uma das modalidades providas acima, os áci- dos nucleicos codificando os polipeptídeos variantes ou polipeptídeos imunomoduladores providos aqui podem ser introduzidos em células usando técnicas de DNA recombinante e clonagem. Para fazer isso, a molécula de DNA recombinante codificando um polipeptídeo imuno- modulador é preparada. Métodos de preparação de tais moléculas de DNA são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências codifi- cando os peptídeos poderiam ser excisadas de DNA usando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, e molécula de DNA poderia ser sintetizada usando técnicas de síntese química, tal como o método de fosforamidita. Também, uma combinação dessas técnicas poderia ser usada. Em alguns casos, um ácido nucleico recombinante ou sinté- tico pode ser gerado através de reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas modalidades, o inserto de DNA pode ser gerado codificando um ou mais polipeptídeos ICOSL variantes contendo pelo menos um domínio IgSF com afinidade modificada e, em algumas mo- dalidades, um peptídeo de sinal, um domínio de transmembrana e/ou um endodomínio de acordo com a descrição provida. Este inserto de DNA pode ser clonado em um vetor de transdução/transfecção apro- priado como é conhecido daqueles de habilidade na técnica. São tam- bém providos vetores de expressão contendo as moléculas de ácido nucleico.
[00492] Em algumas modalidades, os vetores de expressão são capazes de expressão das proteínas imunomoduladoras em uma célu- la apropriada sob condições adequadas para expressão da proteína. Em alguns aspectos, molécula de ácido nucleico ou um vetor de ex- pressão compreende a molécula de DNA que codifica a proteína imu-
nomoduladora operativamente ligada a sequências de controle de ex- pressão apropriadas. Métodos de realização desta ligação operativa, ou antes ou após a molécula de DNA ser inserida no vetor, são bem conhecidos. Sequências de controle de expressão incluem promoto- res, ativadores, potencializadores, operadores, sítios de ligação ribos- somal, sinais de início, sinais de parada, sinais de cap, sinais de polia- denilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução.
[00493] Em algumas modalidades, expressão da proteína imuno- moduladora é controlada por um promotor ou potencializador para controlar ou regular expressão. O promotor é operavelmente ligado à porção da molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo vari- ante ou proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, o pro- motor é um promotor constitutivamente ativo (tal como um promotor constitutivamente ativo específico de tecido ou outro promotor constitu- tivo). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível, que pode ser responsivo a um agente de indução (tal como um sinal de ativação de célula T).
[00494] Em algumas modalidades, um promotor constitutivo é ope- ravelmente ligado à molécula de ácido nucleico codificando o polipep- tídeo variante ou proteína imunomoduladora. Promotores constitutivos exemplares incluem o promotor do vírus de vacuolização Simiano 40 (SV40), o promotor do citomegalovírus (CMV), o promotor da ubiquiti- na C (UbC) e o promotor EF-1 alfa (EF1a). Em algumas modalidades, o promotor constitutivo é específico de tecido. Por exemplo, em algu- mas modalidades, o promotor permite expressão constitutiva da prote- íÍna imunomoduladora em tecidos específicos, tais como células imu- nes, linfócitos ou células T. Promotores específicos de tecido exempla- res são descritos na Patente U.S. No. 5.998.205, incluindo, por exem- plo, uma fetoproteína, DF3, tirosinase, CEA, proteína tensoativa e promotores ErbB2.
[00495] Em algumas modalidades, um promotor induzível é opera- velmente ligado à molécula de ácido nucleico codificando o polipeptí- deo variante ou proteína imunomoduladora de modo que expressão do ácido nucleico é controlável pelo controle da presença ou ausência do indutor de transcrição apropriado. Por exemplo, o promotor pode ser um sistema de expressão de promotor e fator de transcrição regulado, tais como os sistemas regulados por tetraciclina publicados ou outros sistemas reguláveis (vide, por exemplo, Pedido PCT Internacional pu- blicado No. WO 01/30843), para permitir expressão regulada do poli- peptídeo codificado. Um sistema de promotor regulável exemplar é o sistema Tet-On (e Tet-Off) disponível, por exemplo, da Clontech (Palo Alto, CA). Este sistema de promotor permite a expressão regulada do transgene controlado por tetraciclina ou derivados de tetraciclina, tal como doxiciclina. Outros sistemas de promotor reguláveis são conhe- cidos (vide, por exemplo, Pedido U.S. publicado No. 2002-0168714, intitulado "Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Mono- meric, Ligand Dependent Polypeptide Switches", que descreve comu- tadores de gene que contêm domínios de ligação de ligante e domí- nios de regulagem transcripcional, tais como aqueles de receptores de hormônio).
[00496] Em algumas modalidades, o promotor é responsivo a um elemento responsivo à sinalização de ativação de célula T. Apenas a título de exemplo, em algumas modalidades, uma célula T engenhei- rada compreende um vetor de expressão codificando a proteína imu- nomoduladora e um promotor operativamente ligado para controlar expressar da proteína imunomoduladora. A célula T ativada pode ser ativada, por exemplo, por sinalização através de um receptor de célula T engenheirado (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR), e desta maneira disparando expressão e secreção da proteína imuno-
moduladora através do promotor responsivo.
[00497] Em algumas modalidades, um promotor induzível é operati- vamente ligado à molécula de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora de modo que a proteína imunomoduladora é ex- pressa em resposta a um fator nuclear de células T ativadas (NFAT) ou potencializador da cadeia leve kappa de fator nuclear de células B ativadas (NF-KB). Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor induzível compreende um sítio de ligação para NFAT ou NF-KB. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor é um promotor de NFAT ou NF-«B ou uma variante funcional do mesmo. Desta maneira, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos tornam possível contro- lar a expressão de proteína imunomoduladora enquanto também redu- zindo ou eliminando a toxidez da proteína imunomoduladora. Em parti- cular, células imunes engenheiradas compreendendo os ácidos nu- cleicos da invenção expressam e secretam a proteína imunomodula- dora apenas quando a célula (por exemplo, um receptor de célula T (TOR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) expresso pela cé- lula) é especificamente estimulada por um antígeno e/ou a célula (por exemplo, a via de sinalização de cálcio da célula) é não especifica- mente estimulada por, por exemplo, acetato de miristato de forbol (PMA)/lonomicina. Desta maneira, a expressão e, em alguns casos, secreção, de proteína imunomoduladora pode ser controlada para ocorrer apenas quando e onde ela for necessária (por exemplo, na presença de um agente causador de doença infecciosa, câncer ou em um sítio de tumor), o que pode diminuir ou evitar interações de proteí- na imunomoduladora indesejada.
[00498] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando uma proteína imunomoduladora descrita aqui compreende uma se- quência de nucleotídeo adequada que codifica um promotor de NFAT, promotor de NF-KB ou uma variante funcional do mesmo. "Promotor de
NFAT" como aqui usado significa um ou mais elementos responsivos a NFAT ligados a um promotor mínimo. "Promotor de NF-KB" refere-se a um ou mais elementos responsivos a NF-KB ligados a um promotor mínimo. Em algumas modalidades, o promotor mínimo de um gene é um promotor de IL-3 humano mínimo ou um promotor de CMV. O ele- mento responsivo a NFAT pode compreender, por exemplo, elementos responsivos a NFAT1, NFAT2, NFAT3 e/ou NFATA4. O promotor de NFAT, promotor de NF-KB ou uma variante funcional do mesmo pode compreender qualquer número de motivos de ligação, por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cin- co ou pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze ou até doze motivos de liga- ção.
[00499] O vetor de expressão recombinante resultante tendo a mo- lécula de DNA nele é usado para transformar um hospedeiro apropria- do. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem co- nhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um ácido nucleico provido aqui compreende ainda sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo secretor ou de sinal operavelmente ligado ao ácido nu- cleico codificando um polipeptídeo imunomodulador de modo que um polipeptídeo imunomodulador solúvel resultante é recuperado do meio de cultura, célula hospedeira ou periplasma de célula hospedeira. Em outras modalidades, os sinais de controle de expressão apropriados são escolhidos para permitir expressão na membrana de um polipeptí- deo imunomodulador. Ainda, kits comercialmente disponíveis bem co- mo companhias de fabricação sob encomenda podem também ser uti- lizados para produzir células engenheiradas ou células hospedeiras recombinantes providas aqui.
[00500] Em algumas modalidades, o vetor de expressão resultante tendo a molécula de DNA nele é usado para transformar, tal como transduzir, uma célula apropriada. A introdução pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares in- cluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos codificando os receptores, incluindo via viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução, transposon e eletroporação. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é transferido para células através de métodos de transdução lentiviral ou retroviral.
[00501] “Qualquer uma de um grande número de células hospedei- ras de mamífero publicamente disponíveis e bem conhecidas, incluin- do células T de mamífero ou APCs, pode ser usado na preparação dos polipeptídeos ou células engenheiradas. A seleção de uma célula é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica. Esses inclu- em, por exemplo, compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, toxidez dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, característi- cas de expressão, biossegurança e custos. Um equilíbrio desses fato- res deve ser alcançado com a compreensão que nem todas as células podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma sequência de DNA particular.
[00502] Em algumas modalidades, as células hospedeiras podem ser uma variedade de células eucarióticas, tal como em células de le- vedura, ou com células de mamífero tal como células de ovário de hamster Chinês (CHO) ou HEK293. Em algumas modalidades, a célu- la hospedeira é uma célula em suspensão e o polipeptídeo é enge- nheirado ou produzido em suspensão culturada, tal como em células CHO em suspensão culturadas, por exemplo, células CHO-S. Em al- guns exemplos, a linhagem celular é uma linhagem de célula CHO que é deficiente em DHFR (DHFR-), tal como DG44 ou DUXB11. Em al- gumas modalidades, a célula é deficiente em glutamina sintase (GS),
por exemplo, células CHO-S, células CHOK1 SV e células CHOZN ((R)) GS-/-. Em algumas modalidades, as células CHO, tais como célu- las CHO em suspensão, podem ser células CHO-S-2H2, células CHO- S-clone 14 ou células ExpiCHO-S.
[00503] Em algumas modalidades, expressão dos polipeptídeos ICOSL providos a partir de células CHO resulta em uma composição mais homogênea de proteínas produzidas. Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL providos resultam em um produto mais homo- gêneo quando as proteínas são expressas a partir de células CHO comparado com polipeptídeos ICOSL contendo a sequência de refe- rência de ECD integral e/ou contendo o sítio de clivagem de protease (por exemplo, LOQN/LT). Em algumas modalidades, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da composição de pro- teínas produzidas contendo um polipeptídeo variante ICOSL produzido aqui têm o mesmo comprimento de aminoácido ou são do mesmo ta- manho. Técnicas para avaliar homogeneidade de tamanho incluem cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de exclusão de tamanho, SDS page ou sequenciamento.
[00504] Em algumas modalidades, células hospedeiras também podem ser células procarióticas, tal como com E. coli. O hospedeiro recombinante transformado é culturado sob condições de expressão de polipeptídeo, e então purificado para obter uma proteína solúvel. Células hospedeiras recombinantes podem ser culturadas sob condi- ções de fermentação convencionais de modo que os polipeptídeos de- sejados sejam expressos. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os polipeptídeos providos aqui po- dem ser recuperados e purificados a partir de culturas de célula re- combinante através de qualquer um de vários métodos bem conheci- dos na técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio ou eta- nol, extração ácida, cromatografia de troca de ânion ou cátion, croma-
tografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de afinidade. Etapas de redobra de proteína podem ser usadas, conforme desejado, na conclusão da configuração da proteína madura. Finalmente, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada nas etapas de purificação finais.
[00505] Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune, tal como qualquer uma descrita acima em conexão com preparação de células engenheiradas. Em algumas modalidades, tais células enge- nheiradas são células primárias. Em algumas modalidades, as células engenheiradas são autólogas para o indivíduo. Em algumas modalida- des, as células engenheiradas são alogeneicas para o indivíduo. Em algumas modalidades, as células engenheiradas são obtidas de um indivíduo, tal como através de leucaferese, e transformadas ex vivo para expressão do polipeptídeo imunomodulador, por exemplo poli- peptídeo imunomodulador de transmembrana ou polipeptídeo imuno- modulador secretável.
[00506] São também providos ácidos nucleicos codificando qual- quer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes contidos em agentes infecciosos descritos aqui. Em algumas modalidades, os agentes infecciosos administram os ácidos nucleicos a uma célula no indivíduo e/ou permitem a expressão dos polipeptídeos variantes codi- ficados na célula. São também providos ácidos nucleicos que são usados para gerar, produzir ou modificar tais agentes infecciosos. Por exemplo, em algumas modalidades, são providos vetores e/ou plasmí- deos que contêm ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos imu- nomoduladores variantes, para geração dos agentes infecciosos, ad- ministração às células em um indivíduo e/ou expressão dos polipeptí- deos imunomoduladores variantes nas células no indivíduo.
[00507] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos providos são vetores virais ou bacterianos recombinantes contendo sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos imunomoduladores. Em algumas modalidades, os vetores recombinantes podem ser usados para produzir um agente infeccioso que contém sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos imunomoduladores e/ou a ser administrado a uma célula-alvo no indivíduo para expressão pela célu- la-alvo. Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor de expressão. Em algumas modalidades, o vetor recombinante inclui se- quências apropriadas necessárias para geração e/ou produção de um agente infeccioso e expressão na célula-alvo.
[00508] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um plasmídeo ou cosmídeo. Sequências de ácido nucleico contendo plasmídeo ou cosmídeo codificando os polipeptídeos imunomodulado- res variantes, como aqui descrito, são prontamente construídas usan- do técnicas padrão bem conhecidas no campo. Para geração do agen- te infeccioso, o vetor ou genoma pode ser construído em uma forma de plasmídeo que pode ser então transfectado para uma linhagem de célula de empacotamento ou produtora ou uma bactéria hospedeira. Os vetores recombinantes podem ser gerados usando qualquer uma das técnicas recombinantes conhecidas no campo. Em algumas mo- dalidades, os vetores podem incluir uma origem de replicação proca- riótica e/ou um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecionável tal como uma resistência a fármaco para propagação e/ou seleção em sistemas procarióticos.
[00509] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor viral. Vetores virais recombinantes exemplares incluem um genoma de vetor lentiviral, genoma de vetor de poxvírus, genoma do vetor do vírus vaccínia, genoma de vetor de adenovírus, genoma de vetor do vírus associado a adenovírus, genoma do vetor do herpes vírus e genoma do vetor de alfa vírus. Vetores virais podem ser vivos, atenuados, con- dicionais em replicação ou deficientes em replicação, não patogênicos
(defectivos), vetor viral competente em replicação e/ou é modificado para expressar um produto de gene heterólogo, por exemplo, os poli- peptídeos imunomoduladores variantes providos aqui. Vetores para geração de vírus também podem ser modificados para alterar atenua- ção do vírus, o que inclui qualquer método de aumento ou diminuição da carga transcripcional ou traducional.
[00510] Vetores virais exemplares que podem ser usados incluem vetores de vírus vaccínia modificados (vide, por exemplo, Guerra e ou- tros, J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia e outros, AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992); Gheradi e outros, J. Gen. Vi- rol. 86:2925-36 (2005); Mayr e outros, Infection 3:6-14 (1975), Hu e outros, J. Virol. 75: 10300-308 (2001); Patentes U.S. Nos. 5.698.530,
6.998.252, 5.443.964, 7.247.615 e 7.368.116); vetor de adenovírus ou vetores de vírus associado a adenovírus (vide, por exemplo, Molin e outros, J. Virol. 72:8358-61 (1998); Narumi e outros, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998); Mercier e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004); Patentes U.S. Nos. 6.143.290;
6.596.535; 6.855.317; 6.936.257; 7.125.717; 7.378.087; 7.550.296); vetores retrovirais incluindo aqueles baseados em vírus da leucemia de murino (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), retroví- rus ecotrópico, vírus da imunodeficiência simiano (SIV), vírus da imu- nodeficiência humana (HIV) e combinações (vide, por exemplo, Bu- chscher e outros, J. Virol. 66:2731-39 (1992); Johann e outros, J. Virol. 66: 1635-40 (1992); Sommerfelt e outros, Virology 176:58-59 (1990); Wilson e outros, J. Virol. 63:2374-78 (1989); Miller e outros, J. Virol. 65:2220-24 (1991); Miller e outros, Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990); Kol- berg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta e outros, Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)); vetores lentivirais incluindo aqueles baseados em Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1), HIV-2, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infecciosa equina, Vírus da Imunodefici-
ência do Símio (SIV) e vírus maedi/visna (vide, por exemplo, Pfeifer e outros, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211 (2001); Zufferey e outros, J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi e outros, J. Virol. 72:8150, 1998; Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; En- gelman e outros, J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale e outros, Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown e outros, J. Virol. 73:9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams e ou- tros, J. Virol. 77: 11150, 2003; Powell e outros, J. Virol. 70:5288, 1996) ou qualquer variantes dos mesmos e/ou vetores que podem ser usa- dos para gerar qualquer um dos vírus descritos acima. Em algumas modalidades, o vetor recombinante pode incluir sequências regulado- ras, tais como sequências promotoras ou potencializadoras, que po- dem regular a expressão do genoma viral, tal como no caso para vírus de RNA, na linhagem de célula de empacotamento (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.385.839 e 5.168.062).
[00511] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão que permite ex- pressão do produto de gene codificado quando administrado à célula- alvo, por exemplo, uma célula no indivíduo, por exemplo, uma célula de tumor, uma célula imune e/ou uma APC. Em algumas modalidades, os vetores de expressão recombinantes contidos no agente infeccio- sos são capazes de expressão das proteínas imunomoduladoras na célula-alvo no indivíduo, sob condições adequadas para expressão da proteína.
[00512] Em alguns aspectos, ácidos nucleicos ou um vetor de ex- pressão compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína imunomoduladora operativamente ligada a sequências de controle de expressão apropriadas. Métodos de realização desta liga- ção operativa, ou antes ou após a sequência de ácido nucleico codifi- cando a proteína imunomoduladora ser inserida no vetor, são bem co-
nhecidos. Sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, potencializadores, operadores, sítios de ligação ribosso- mal, sinais de início, sinais de parada, sinais de cap, sinais de poliade- nilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução. O promotor pode ser operavelmente ligado à porção da se- quência de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivamen- te ativo na célula-alvo (tal como um promotor constitutivamente ativo específico para tecido ou outro promotor constitutivo). Por exemplo, o vetor de expressão recombinante pode também incluir elementos re- guladores transcripcionais específicos para tecido linfoide (TRE) tal como um linfócito B, linfócito T ou TRE específico para célula dendríti- ca. TRE específico para tecido linfoide são conhecidos na técnica (vi- de, por exemplo, Thompson e outros, Mol. Cell. Biol. 12:1043-53 (1992); Todd e outros, J. Exp. Med. 177:1663-74 (1993); Penix e ou- tros, J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993)). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível, que pode ser responsivo a um agente de indução (tal como um sinal de ativação de célula T). Em al- gumas modalidades, ácidos nucleicos administrados à célula-alvo no indivíduo, por exemplo, célula de tumor, célula imune e/ou APC, po- dem ser operavelmente ligados a qualquer um dos elementos regula- dores descritos acima.
[00513] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor bacteriano, por exemplo, um plasmídeo ou cosmídeo bacteriano. Em algumas modalidades, o vetor bacteriano é administrado à célula-alvo, por exemplo, células de tumor, células imunes e/ou APCs, através de transferência mediada por bactéria de DNA de plasmídeo para células de mamífero (também referida como "bactofecção"). Em algumas mo- dalidades, o vetor bacteriano administrado também contém sequên- cias de controle de expressão apropriadas para expressão nas célu-
las-alvo, tal como uma sequência promotora e/ou sequências poten- cializadores, ou quaisquer sequências reguladoras ou de controle des- critas acima. Em algumas modalidades, o vetor bacteriano contém se- quências de controle de expressão apropriadas para expressão e/ou secreção dos polipeptídeos variantes codificados no agente infeccioso, por exemplo, a bactéria.
[00514] Em algumas modalidades, os polipeptídeos providos aqui também podem ser feitos através de métodos sintéticos. Síntese de fase sólida é a técnica preferida de produção de peptídeos individuais uma vez que ela é o método de custo mais eficaz de produção de pep- tídeos pequenos. Por exemplo, técnicas de síntese de fase solida bem conhecidas incluem o uso de grupos de proteção, ligantes e apoios de fase sólida, bem como condições de reação de proteção e desprote- ção especificas, condições de clivagem de ligante, uso de sequestran- tes e outros aspectos de síntese de peptídeo de fase sólida. Os peptí- deos podem então ser montados nos polipeptídeos como aqui provido. V. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE IMUNOMODU-
LAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS ICOSL VARIANTES E PROTEÍNAS IMUNOMODULADORAS
[00515] Em algumas modalidades, os polipeptídeos ICOSL varian- tes providos aqui (por exemplo, fragmentos ou conjugados de ligação de comprimento integral e/ou específicos, construtos de empilhamento ou suas fusões) exibem atividade imunomoduladora para modular ati- vação de célula T. Em algumas modalidades, polipeptídeos ICOSL modulam expressão de IFN-gama em um ensaio de célula T primária em relação a um controle de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem. Em alguns casos, modulação de ex- pressão de IFN-gama pode aumentar ou diminuir a expressão de IFN- gama em relação ao controle. Ensaios para determinar ligação especí- fica e expressão de IFN-gama são bem conhecidos na técnica e inclu-
em os ensaios MLR (reação de linfócitos mistos) medindo níveis de citocina interferon-gama em sobrenadantes de cultura (Wang e outros, Cancer Immunol Res. Set 2 014: 2(9):846-56), ensaio de estimulação de célula T SEB (enterotoxina B staphylococcal) (Wang e outros, Can- cer Immunol Res. Sep 2014: 2(9):846-56) e ensaios de estimulação de célula T anti-CD3 (Li e Kurlander, J. Transl. Med. 2010: 8: 104).
[00516] Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante pode em algumas modalidades aumentar ou, em modalidades, alter- nativas, diminuir expressão de IFN-gama (interferon-gama) em um en- saio de célula T primária em relação a um controle de ICOSL do tipo selvagem. Em algumas modalidades dos polipeptídeos providos con- tendo uma sequência de ICOSL variante solúvel, o polipeptídeo pode aumentar a expressão de IFN-gama e, em modalidades alternativas, diminuir a expressão de IFN-gama em ensaio de célula T primária em relação a um controle de ICOSL do tipo selvagem. Em algumas moda- lidades dos polipeptídeos providos contendo sequências de ICOSL variantes múltiplas, o polipeptídeo pode aumentar a expressão de IFN- gama e, em modalidades alternativas, diminuir expressão de IFN- gama em um ensaio de célula T primária em relação a um controle de ICOSL do tipo selvagem.
[00517] Aqueles versados reconhecerão que o formato do ensaio de célula T primária usado para determinar um aumento em expressão de IFN-gama pode diferir daquele empregado para ensaiar uma dimi- nuição em expressão de IFN-gama. Em ensaio da habilidade de um ICOSL variante em diminuir expressão de IFN-gama em um ensaio de célula T primária, um ensaio do e Reação de Linfócitos Mistos (MLR) pode ser usado como descrito no Exemplo 6. Em alguns casos, uma forma solúvel de um ICOSL variante pode ser empregada para deter- minar a habilidade do ICOSL variante em antagonizar e desta maneira diminuir a expressão de IFN-gama em um MLR como da mesma ma-
neira descrito no Exemplo 6.
[00518] —Alternativamente, em ensaio quanto à habilidade de um ICOSL variante em aumentar a expressão de IFN-gama em um ensaio de célula T primária, um ensaio de coimobilização pode ser usado co- mo descrito no Exemplo 6. Em um ensaio de coimobilização, um sinal de TCR, provido em algumas modalidades por anticorpo anti-CD3, é usado em conjunto com um ICOSL variante coimobilização para de- terminar a habilidade em aumentar a expressão de IFN-gama em rela- ção a um controle de ICOSL. Em alguns casos, uma forma solúvel de um ICOSL variante que é multimerizada para um grau para prover |i- gação multivalente pode ser empregada para determinar a habilidade do ICOSL variante em agonizar e desta maneira aumentar a expres- são de IFN-gama em um MLR como da mesma maneira descrito no Exemplo 6.
[00519] Em algumas modalidades, em ensaio da habilidade de um ICOSL variante para modular um aumento ou diminuição de expressão de IFN-gama um ensaio repórter de célula T pode ser usado. Em al- gumas modalidades, a célula T é uma linhagem de célula T Jurkat ou é derivada de linhagens de célula T Jurkat. Em ensaios repórteres, a linhagem de célula repórter (por exemplo, célula repórter Jurkat) é também gerada para superexpressar um receptor inibidor que é a con- traparte de ligação cognata do polipeptídeo de domínio IgSF variante. Em algumas modalidades, as células T repórteres também contém um construto repórter contendo um promotor induzível responsivo à ativa- ção de célula T operavelmente ligado a um repórter. Em algumas mo- dalidades, o repórter é um repórter fluorescente ou luminescente. Em algumas modalidades, o repórter é luciferase. Em algumas modalida- des, o promotor é responsivo à sinalização de CD3. Em algumas mo- dalidades, o promotor é um promotor de NFAT. Em algumas modali- dades, o promotor é responsivo à sinalização coestimuladora, por exemplo, sinalização coestimuladora de CD28. Em algumas modalida- des, o promotor é um promotor de IL-2.
[00520] Em aspectos de um ensaio repórter, uma linhagem de célu- la repórter é estimulada, tal como através de coincubação com células apresentando antígeno (APCs) expressando o ligante do tipo selva- gem do receptor inibidor, por exemplo, ICOSL. Em algumas modalida- des, as APCs são APCs artificiais. APCs artificiais são bem conheci- das de um versado na técnica. Em algumas modalidades, APCs artifi- ciais são derivados de uma ou mais linhagem de célula de mamífero, tais como células K562, CHO ou 293.
[00521] Em algumas modalidades, as células repórteres Jurkat são coincubadas com APCs artificiais superexpressando o ligante inibidor na presença da molécula de domínio IgSF variante ou proteína imu- nomoduladora, por exemplo, polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, expressão de repórter é monitorada, tal como através da determinação da luminescência ou fluorescência das células. Em algumas modalidades, interações nor- mais entre seu receptor inibidor e ligante resultam em uma repressão de ou diminuição no sinal de repórter, tal como comparado com con- trole, por exemplo, expressão de repórter por coincubação de células T-controle e APCs em que a interação receptor inibidor e ligante não está presente, por exemplo, APCs que não superexpressam ICOSL. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ICOSL variante ou proteí- na imunomoduladora provido aqui antagoniza a interação, por exem- plo, quando provido em forma solúvel como um ICOSL variante-Fcou quando expresso a partir de APC como uma proteína imunomodulado- ra secretável, desta maneira resultando em um aumento no sinal de repórter comparado com a ausência do polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomoduladora. Em alguns casos, certos formatos de um polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomoduladora con-
forme aqui provido podem prover uma atividade agonista, dessa ma- neira diminuindo expressão de repórter comparado com a ausência do polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomoduladora.
[00522] Uso de controles apropriados é conhecido daqueles de ha- bilidade na técnica, no entanto, nas modalidades mencionadas acima, o controle envolve tipicamente uso do ICOSL de referência, tal como um tipo nativo de isoforma de ICOSL nativa da mesma espécie de mamífero da qual o ICOSL variante foi derivado ou desenvolvido. Sem importar se a afinidade de ligação ou com um ou ambos de ICOS e CD28 é aumentada ou diminuída, um ICOSL variante em algumas modalidades aumentará a expressão de IFN-gama e, em modalidades alternativas, diminui expressão de IFN-gama em um ensaio de célula T primária em relação a um controle ICOSL do tipo selvagem.
[00523] Em algumas modalidades, um ICOSL variante aumenta a expressão de IFN-gama (isto é, expressão de proteína) em relação a um controle de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) ou do tipo selvagem em pelo menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Em outras modalidades, um ICOSL variante diminui a expressão de IFN-gama (isto é, expressão de prote- ína) em relação a um controle de ICOSL do tipo selvagem ou não mo- dificado em pelo menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Em algumas modalidades, o controle de ICOSL do tipo selvagem é ICOSL de murino, tal como seria tipicamente usado para um ICOSL variante alterado em sequência daquela de uma se- quência de ICOSL de murino do tipo selvagem. Em algumas modali- dades, o controle de ICOSL do tipo selvagem é ICOSL humano, tal como seria tipicamente usado para um ICOSL variante alterado em sequência daquela de uma sequência de ICOSL humana do tipo sel- vagem tal como uma sequência de ICOSL compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO:196 ou 545.
VI. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[00524] São providas aqui composições contendo qualquer um dos polipeptídeos ICOSL variantes, proteínas imunomoduladoras, conju- gados, células engenheiradas ou agentes infecciosos descritos aqui. À composição farmacêutica pode compreender ainda um excipiente far- maceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter um ou mais excipientes para modificação, manutenção ou preservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição, em alguns as- pectos, um versado na técnica compreende que uma composição far- macêutica contendo células pode diferir de uma composição farma- cêutica contendo uma proteína.
[00525] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um sólido, tal como um pó, cápsula ou comprimido. Por exemplo, os componentes da composição farmacêutica podem ser liofilizados. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica solida é reconstitu- ída ou dissolvida em um líquido antes da administração.
[00526] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido, por exemplo, polipeptídeos ICOSL variantes dissolvidos em uma solução aquosa (tal como solução salina fisiológica ou solu- ção de Ringer). Em algumas modalidades, o pH da composição far- macêutica é entre cerca de 4,0 e cerca de 8,5 (tal como entre cerca de 4,0 e cerca de 5,0, entre cerca de 4,5 e cerca de 5,5, entre cerca de 5,0 e cerca de 6,0, entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5, entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, entre cerca de 7,0 e cerca de 8,0 ou entre cerca de 7,5 e cerca de 8,5).
[00527] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma carga, ligante, revestimento, conservante, lubrificante, agente sa-
borizante, agente adoçante, agente de coloração, um solvente, um agente de tamponamento, um agente de quelação ou estabilizador. Exemplos de cargas farmaceuticamente aceitáveis incluem celulose, fosfato de cálcio dibásico, carbonato de cálcio, celulose microcristalina, sacarose, lactose, glicose, manitol, sorbitol, maltol, amido pré- gelatinizado, amido de milho ou amido de batata. Exemplos de ligantes farmaceuticamente aceitáveis incluem polivinilpirrolidona, amido, lac- tose, xilitol, sorbitol, maltitol, gelatina, sacarose, polietileno glicol, metil celulose ou celulose. Exemplos de revestimentos farmaceuticamente aceitáveis incluem hidroxipropil metilcelulose (HPMC), verniz, zeína da proteína do milho ou gelatina. Exemplos de desintegrantes farmaceuti- camente aceitáveis incluem polivinilpirrolidona, carboximetil celulose ou amido glicolato de sódio. Exemplos de lubrificantes farmaceutica- mente aceitáveis incluem polietileno glicol, estearato de magnésio ou ácido esteárico. Exemplos de conservantes farmaceuticamente aceitá- veis incluem metil parabenos, etil parabenos, propil parabeno, ácido benzoico ou ácido sórbico. Exemplos de agentes adoçantes farmaceu- ticamente aceitáveis incluem sacarose, sacarina, aspartame ou sorbi- tol. Exemplos de agentes de tamponamento farmaceuticamente acei- táveis incluem carbonatos, citratos, gluconatos, acetatos, fosfatos ou tartratos.
[00528] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente para a liberação controlada ou susten- tada do produto, tais como microesferas injetáveis, partículas bioerosí- veis, compostos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), es- feras ou lipossomos.
[00529] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é estéril. Esterilização pode ser realizada através de filtragem em mem- branas de filtragem estéreis ou radiação. Onde a composição é liofili- zada, esterilização usando este método pode ser conduzida ou antes ou seguindo a liofilização e reconstituição. A composição para admi- nistração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em solução. Ainda, composições parentais geralmente são postas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00530] Em algumas modalidades, são providas composições far- macêuticas contendo as proteínas imunomoduladoras de transmem- brana, incluindo células engenheiradas expressando tais proteínas imunomoduladoras de transmembrana. Em algumas modalidades, as composições e formulações farmacêuticas incluem um ou mais veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável opcional. Tais composições podem compreender tampões tal como solução salina tamponada neu- tra, solução salina tamponada com fosfato e similar; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; po- lipeptídeos ou aminoácidos tal como glicina; antioxidantes; agentes de quelação tal como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hi- dróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são preferivelmente formuladas para administração intrave- nosa.
[00531] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica con- tém agentes infecciosos contendo sequências de ácido nucleico codifi- cando os polipeptídeos variantes imunomoduladores. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém uma dose de agen- tes infecciosos adequada para administração a um indivíduo que é adequada para tratamento. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um agente infeccioso que é um vírus, em uma quantidade de dosagem única ou múltipla, ou entre cerca de entre ou entre cerca de 1x10º e cerca de 1x10º? unidades de formação de pla- ca (pfu), 1x10º e 1x10*º pfu ou 1x107 e 1x10º pfu, cada uma inclusi-
ve, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de ou em cerca de 1x106, 1x107, 1x108, 1x10ºº, 2x10º, 3x10º, 4x10º, 5x10ºpfu ou cerca de 1x10*º pfu. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter uma concentração de vírus de a partir de cerca de 10º a cerca de 10º pfu/mL, por exemplo, 5x10º a 5x10º ou 1x107 a 1x10º pfu/mL, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de ou em cerca de 106 pfu/mL, 107 pfu/mL, 108 pfu/mL ou 10º pfu/mL. Em algumas moda- lidades, a composição farmacêutica contém um agente infeccioso que é uma bactéria, em uma quantidade de dosagem única ou múltipla, entre cerca de entre ou entre cerca de 1x10º e cerca de 1x10º unida- des de formação de colônia (cfu), 1x10º e 1x10º cfu ou 1x10º e 1x107 cfu, cada uma inclusive, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de ou em cerca de 1x10º, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108 ou 1x10º cfu. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter uma concentração bacteriana de a partir de cerca de 10º a cerca de 10º cfu/mL, por exemplo, 5x10º a 5x107 ou 1x106º a 1x107 cfu/mL, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de ou em cerca de 10º cfu/mL, 106 cfu/mL, 107 cfu/mL ou 108 cfu/mL.
[00532] Tal formulação pode, por exemplo, estar em uma forma adequada para infusão intravenosa. Um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um material, composição ou veículo farmaceutica- mente aceitável que está envolvido na realização ou transporte de cé- lulas de interesse de um tecido, órgão ou porção do corpo para um outro tecido, órgão ou porção do corpo. Por exemplo, o veículo pode ser uma carga liquida ou sólida, diluente, excipiente, solvente ou mate- rial encapsulante ou alguma combinação dos mesmos. Cada compo- nente do veículo deve ser "farmaceuticamente aceitável" pelo fato de que deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Ele deve ser também adequado para contato com qualquer tecido, ór- gão ou porção do corpo que ele possa encontrar, significando que ele não deve ter um risco de toxidez, irritação, resposta alergia, imunoge- nicidade ou qualquer outra complicação que ultrapasse excessivamen- te seus benefícios terapêuticos.
[00533] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um indivíduo. Em geral, dosagens e vias de adminis- tração da composição farmacêutica são determinadas de acordo com o tamanho e a condição do indivíduo, de acordo com prática farmacêu- tica padrão. Por exemplo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente ou em ensaios de cultura celular ou em modelos animais tais como camundongos, ratos, coelhos, cachorros, porcos ou macacos. Um modelo animal pode ser também usado para determinar a faixa de concentração e a via de administração apropriadas. Tal in- formação pode então ser usada para determinar doses e vias para administração úteis em humanos. A dosagem exata será determinada à luz de fatores relacionados ao indivíduo necessitando tratamento. Dosagem e administração são ajustadas para prover níveis suficientes do composto ativo ou manter o efeito desejado. Fatores que podem ser levados em consideração incluem a severidade do estado de do- ença, a saúde geral do indivíduo, a idade, peso e gênero do indivíduo, hora e frequência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reação e resposta à terapia.
[00534] Composições farmacêuticas de ação longa podem ser ad- ministradas a cada 3 a 4 dias, toda semana ou a cada duas semanas dependendo da meia-vida e taxa de eliminação da formulação particu- lar. A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacociné- ticos da molécula na formulação usada. Tipicamente, uma composição é administrada até que uma dosagem que obtenha o efeito desejado seja atingida. A composição pode então ser administrada como uma dose única, ou como doses múltiplas (em concentrações/dosagens iguais ou diferentes) com o tempo ou como uma infusão contínua. Re-
finamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente feito. Do- sagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados. Vários biomarcadores ou marcadores fisiológicos para efeito terapêutico podem ser monitorados incluindo ativação ou proliferação de célula T, síntese ou produção de citocina (por exemplo, produção de TNF-a, IFN-y, IL-2), indução de vários mar- cadores de ativação (por exemplo, receptor de CD25, IL-2), inflama- ção, inchaço e sensibilidade nas articulações, nível de proteína C- reativa no soro, produção de anticorpo anticolágeno e/ou resposta(s) de anticorpo dependentes de célula T.
[00535] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um indivíduo através de qualquer via, incluindo oral- mente, transdermalmente, através de inalação, intravenosamente, in- tra-arterialmente, intramuscularmente, aplicação direta a um sítio de ferida, aplicação a um sítio cirúrgico, intraperitonealmente, através de supositório, intraperitonealmente, através de supositório, subcutanea- mente, intradermalmente, transcutaneamente, através de nebulização, intrapleuralmente, intraventricularmente, intra-articularmente, intraocu- larmente ou intraespinalmente.
[00536] Em algumas modalidades, a dosagem da composição far- macêutica é uma dose única ou uma dose repetida. Em algumas mo- dalidades, a doses são dadas a um indivíduo uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia ou quatro ou mais vezes por dia. Em algumas modalidades, cerca de 1 ou mais (tal como cerca de 2 ou mais, cerca de 3 ou mais, cerca de 4 ou mais, cerca de 5 ou mais, cer- ca de 6 ou mais ou cerca de 7 ou mais) doses são dadas em uma se- mana. Em algumas modalidades, doses múltiplas são dadas durante o curso de dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, um curso de tratamento é cerca de 1 ou mais doses (tal como cerca de 2 ou mais doses, cerca de 3 ou mais doses, cerca de 4 ou mais doses,
cerca de 5 ou mais doses, cerca de 7 ou mais doses, cerca de 10 ou mais doses, cerca de 15 ou mais doses, cerca de 25 ou mais doses, cerca de 40 ou mais doses, cerca de 50 ou mais doses ou cerca de 100 ou mais doses).
[00537] Em algumas modalidades, uma dose administrada da com- posição farmacêutica é cerca de 1 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais (tal como cerca de 2 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 5 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 10 ug de pro- teína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 25 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 50 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cer- ca de 100 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 250 ug de proteína por kg de massa corporal do indiví- duo ou mais, cerca de 500 ug de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 1 mg de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais, cerca de 2 mg de proteína por kg de massa cor- poral do indivíduo ou mais ou cerca de 5 mg de proteína por kg de massa corporal do indivíduo ou mais).
[00538] Em algumas modalidades, uma quantidade terapêutica de uma composição celular é administrada. Tipicamente, quantidade pre- cisa das composições da presente invenção a serem administradas pode ser determinada por um médico com consideração de diferentes individuais em idade, peso, tamanho do tumor, grau de infecção ou metástase e condição do paciente (indivíduo). Pode ser geralmente declarado que uma composição farmacêutica compreendendo células engenheiradas, por exemplo, células T, como aqui descrito pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso cor- pora, tal como 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. Composições de célula enge-
nheirada, tais como composições de célula T, podem ser também ad- ministradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser ad- ministradas usando técnicas de infusão que são comumente conheci- das em imunoterapia (vide, por exemplo, Rosenberg e outros, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). A dosagem e o regime de tratamen- to ótimos para um paciente particular podem ser prontamente determi- nados por um versado na técnica de medicina através do monitora- mento do paciente quanto a sinais de doença e ajuste do tratamento adequadamente.
[00539] É conhecida uma variedade de meios para determinação se administração de uma composição terapêutica da invenção modula suficientemente atividade imunológica através de eliminação, seques- tro ou inativação de células imunes mediando ou capazes de media- ção de uma resposta imune indesejada; indução, geração ou ativação de células imunes que fazem a mediação ou são capazes de mediar uma resposta imune protetora; mudança das propriedades físicas ou funcionais de células imunes; ou uma combinação desses efeitos. Exemplos de medições da modulação de atividade imunológica inclu- em, mas não estão limitados a, exame da presença ou ausência de populações de célula imune (usando citometria de fluxo, imunoisto- química, histologia, microscopia eletrônica, reação em cadeia de poli- merase (PCR)); medição da capacidade funcional de células imunes incluindo habilidade ou resistência a proliferar ou dividir em resposta a um sinal (tal como usando ensaios de proliferação de célula T e análi- se pepscan com base em incorporação de 3H-timidina seguindo esti- mulação com anticorpo anti-CD3, anticorpo de receptor anticélula-T, anticorpo anti-CD28, ionóforos de cálcio, células apresentando antíge- no para PMA (12-miristato 13-acetato de forbol) carregadas com um peptídeo ou antígeno de proteína; ensaios de proliferação de célula B); medição da habilidade em matar ou lisar outras células (tais como en-
saios de célula T citotóxica); medições das citocinas, quimiocinas, mo- léculas de superfície celular, anticorpos e outros produtos das células (por exemplo, através de citometria de fluxo, ensaios imunoabsorven- tes ligados à enzima, análise Western blot, análise de microarranjo de proteína, análise de imunoprecipitação); medição de marcadores bio- químicos de ativação de células imunes ou vias de sinalização dentro de células imunes (por exemplo, análise Western blot e imunoprecipi- tação de fosforilação de tirosina, serina ou treonina, clivagem de pep- tídeo e formação ou dissociação de complexos de proteína; análise de arranjo de proteína; traçado de perfil transcripcional de DNA usando arranjos de DNA ou hibridização subtrativa); medições de morte celu- lar através de apoptose, necrose ou outros mecanismos (por exemplo, tingimento com anexina V, ensaios TUNEL, eletroforese em gel para medir DNA /addering, histologia; ensaios de caspase fluorgênica, aná- lise Western blot de substratos de caspase); medição dos genes, pro- teínas e outras moléculas produzidas por células imunes (por exemplo, análise Northern blot, reação em cadeia da polimerase, microarranjos de DNA, microarranjos de proteína, eletroforese em gel 2-dimensional, análise Western blot, ensaios imunoabsorventes ligados à enzima, ci- tometria de fluxo); e medição de sintomas clínicos ou resultados tal como melhora de doenças autoimunes, neurodegenerativas e outras envolvendo autoproteínas ou autopolipeptídeos (scores clínicos, ne- cessidades de uso de terapias adicionais, estado funcional, estudos de imagem), por exemplo, através da medição de taxa de relapso ou se- veridade da doença (usando scores clínicos conhecidos do versado comum na técnica) no caso de esclerose múltipla, medição de glicose no sangue no caso de diabetes tipo | ou inflamação nas articulações no caso de artrite reumatoide.
VII. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO E KITS
[00540] São também providos aqui artigos de fabricação compre-
endendo as composições farmacêuticas descritas aqui em embalagem adequada. Embalagem adequada para composições (tais como com- posições oftálmicas) descritas aqui é conhecida na técnica e inclui, por exemplo, frascos (tais como frascos lacrados), recipientes, ampolas, garrafas, jarras, embalagem flexível (por exemplo, bolsas Mylar ou plásticas lacradas) e similar. Esses artigos de fabricação podem ser ainda esterilizados e/ou lacrados.
[00541] São ainda providos kits compreendendo as composições farmacêuticas (ou artigos de fabricação) descritas aqui, que podem compreender ainda instrução(ões) sobre os métodos de uso da com- posição, tais como usos descritos aqui. Os kits descritos aqui podem também incluir outros materiais desejáveis de um ponto de visa co- mercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agu- lhas, seringas e bulas com instruções para realização de quaisquer métodos descritos aqui. VIII. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
[00542] As composições farmacêuticas descritas aqui (incluindo composição farmacêutica compreendendo os polipeptídeos ICOSL va- riantes, as proteínas imunomoduladoras, os conjugados, as células engenheiradas e agentes infecciosos descritos aqui) podem ser usa- das em uma variedade de aplicações terapêuticas, tal como o trata- mento de uma doença. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é usada para tratar distúrbios inflamatórios ou autoimunes, câncer, transplante de órgão, infecções virais e/ou in- fecções bacterianas em um mamífero. As composições farmacêuticas podem modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) uma resposta imune para tratar a doença.
[00543] Taismétodos e usos incluem métodos e usos terapêuticos, por exemplo, envolvendo administração das moléculas ou células en- genheiradas, ou composições contendo as mesmas, a um indivíduo tendo uma doença, condição ou distúrbio. Em alguns casos, tal como descrito, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio autoimune ou inflamatório. Em alguns casos, tal como descrito, a doença ou dis- túrbio é um tumor ou câncer. Em algumas modaliaides, a molécula ou célula engenheirada é administrada em uma quantidade eficaz para realizar tratamento da doença ou distúrbio. Usos incluem usos de mo- léculas contendo um polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomo- duladora, conjugado, célula engenheirada e agentes infecciosos em tais métodos e tratamentos, e na preparação de um medicamento a fim de realizar tais métodos terapêuticos. Em algumas modalidades, os métodos são realizados através da administracao de um polipeptí- deo ICOSL variante, proteína imunomoduladora, conjugado, célula en- genheirada e agente infeccioso, ou composições compreendendo os mesmos, ao indivíduo tendo ou suspeito ter a doença ou condição. Em algumas modalidades, os métodos desta maneira tratam a doença ou condição ou distúrbio no indivíduo.
[00544] Em algumas modalidades, os métodos providos são aplicá- veis à administração terapêutica de polipeptídeos ICOSL variantes, das proteínas imunomoduladoras, dos conjugados, das células enge- nheiradas e dos agentes infecciosos descritos aqui. Está dentro do ní- vel de um versado na técnica, em vista da descrição provida, escolher um formato para a indicação dependendo do tipo de modulação da resposta imune, por exemplo, aumento ou diminuição que é desejado.
[00545] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui que estimula a resposta imune é administrada, a qual po- de ser útil, por exemplo, no tratamento de câncer, infecções virais ou infecções bacterianas. Em algumas modalidades, a composição far- macêutica contém um polipeptídeo ICOSL variante em um formato que exibe atividade agonista de sua contraparte de ligação cognata CD28 ou ICOS e/ou que estimula ou inicia a sinalização coestimuladora atra-
vés de CD28 ou ICOS. Formatos exemplares de um polipeptídeo ICOSL para uso em conexão com tais aplicações terapêuticas inclu- em, por exemplo, uma proteína imunomoduladora ou "pilha" de um po- lipeptídeo ICOSL variante e um domínio I9SF ou variante do mesmo que se liga a um antígeno de tumor (por exemplo, NKp30 ou variante de afinidade modificada) (também chamado um !domínio IgSF de loca- lização de tumor"), um conjugado contendo um polipeptídeo ICOSL variante ligado a uma porção de direcionamento a tumor (também chamada uma porção de localização de tumor), uma célula engenhei- rada expressando uma proteína imunomoduladora de transmembrana ou um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nu- cleico codificando uma proteína imunomoduladora de transmembrana, tal como para expressão da proteína imunomoduladora de transmem- brana em uma célula infectada (por exemplo, célula de tumor ou APC, por exemplo, célula dendrítica).
[00546] “Composições farmacêuticas compreendendo células enge- nheiradas e os métodos descritos aqui podem ser usados em aplica- ções de transferência de célula adotiva. Em algumas modalidades, composições celulares compreendendo células engenheiradas podem ser usadas em métodos de associação para, por exemplo, modular a atividade imunológica em uma abordagem de imunoterapia para o tra- tamento de, por exemplo, um câncer de mamífero ou, em outras mo- dalidades, o tratamento de distúrbios autoimunes. Os métodos empre- gados geralmente compreendem um método de contato de um TIP da presente invenção com uma célula de mamífero sob condições que são permissivas para ligação específica do domínio I9SF com afinida- de modificada e modulação da atividade imunológica da célula de mamífero. Em algumas modalidades, células imunes (tais como linfóci- tos de infiltração em tumor (TILs), células T (incluindo células T CD8+ ou CD4+) ou APCs) são engenheiradas para expressar como uma pro-
teína de membrana e/ou como polipeptídeo ICOSI variante solúvel, proteína imunomoduladora ou conjugado como aqui descrito. As célu- las engenheiradas podem então contatar uma célula de mamífero, tal como uma APC, um segundo linfócito ou célula de tumor em que mo- dulação de atividade imunológica é desejada sob condições que são permissivas de ligação específica do domínio IGSF com afinidade mo- dificada a uma contraestrutura na célula de mamífero de modo que atividade imunológica pode ser modulada na célula de mamífero. As células podem ser contatadas in vivo ou ex vivo.
[00547] Em algumas modalidades, as células engenheiradas são células autólogas. Em outras modalidades, as células são alogeneicas. Em algumas modalidades, as células são células autólogas engenhei- radas reinfundidas no mamífero a partir do qual elas foram isoladas. Em algumas modalidades, as células são células alogeneicas enge- nheiradas infundidas no mamífero. Em algumas modalidades, as célu- las são coletadas de sangue ou tumor de um paciente, engenheiradas para expressar um polipeptídeo (tal como o polipeptídeo ICOSL vari- ante, proteína imunomoduladora ou conjugado como aqui descrito), expandidas em um sistema de cultura in vitro (por exemplo, através de estimulação das células) e reinfundidas no paciente para mediar des- truição de tumor. Em algumas modalidades, os métodos são conduzi- dos através de transferência de célula adotiva em que células expres- sando o TIP (por exemplo, uma célula T) são infundidas de volta no paciente. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas e métodos da invençao são usados no tratamento de um paciente mamí- fero de cânceres tal como linfoma, leucemia linfoide, leucemia mieloi- de, câncer cervical, neuroblastoma ou mieloma múltiplo.
[00548] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica po- de ser usada para inibir crescimento de células de câncer de mamífero (tais como células de câncer humano). Um método de tratamento de câncer pode incluir administração de uma quantidade eficaz de qual- quer uma das composições farmacêuticas descritas aqui a um indiví- duo com câncer. A quantidade eficaz da composição farmacêutica po- de ser administrar para inibir, parar ou reverter progressão de cânce- res.
[00549] Os cânceres que podem ser tratados pelas composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, melanoma, câncer de bexiga, males hematoló- gicos (leucemia, linfoma, mieloma), câncer de fígado, câncer de cére- bro, câncer renal, câncer de mama, câncer pancreático (adenocarci- noma), câncer colorretal, câncer de pulmão (câncer de pulmão de pe- quenas células e câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de baço, câncer do timo ou células sanguíneas (isto é, leucemia), cân- cer de próstata, câncer de testículo, câncer ovariano, câncer uterino, câncer gástrico, um câncer músculo-esqueletal, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer gastrintestinal, um câncer de célula germinativa ou um câncer endócrino ou neuroendócrino. Em algumas modalida- des, o câncer é sarcoma de Ewing. Em algumas modalidades, o cân- cer é selecionado de um melanoma, câncer de pulmão, câncer de be- xiga e mal hematológico. Em algumas modalidades, o câncer é um linfoma, leucemia linfoide, leucemia mieloide, câncer cervical, neu- roblastoma ou mieloma múltiplo.
[00550] Células de câncer humanas podem ser tratadas in vivo ou ex vivo. Tratamento ex vivo de um paciente humano, tecido ou fluidos contendo células cancerosas é feito fora do corpo e então o tecido ou fluidos são reintroduzidos de volta no paciente. Em algumas modalida- des, o câncer é tratado em um paciente humano in vivo através da administração da composição terapêutica ao paciente.
[00551] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como uma monoterapia (isto é, como um agente único)
ou como uma terapia de combinação (isto é, em combinação com um ou mais agentes anticâncer adicionais, tal como um fármaco quimiote- rapêutico, uma vacina para câncer ou um inibidor de ponto de checa- gem imune. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode também ser administrada com terapia de radiação.
[00552] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como uma monoterapia (isto é, como um agente único) ou como uma terapia de combinação (isto é, em combinação com um ou mais agentes anticâncer adicionais, tal como um fármaco quimiote- rapêutico, uma vacina para câncer ou um inibidor de ponto de checa- gem imune. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode também ser administrada com terapia de radiação. Em alguns aspectos, o inibidor de ponto de checagem imune bloqueia interações de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2. Em alguns casos, o inibidor de ponto de checagem imune é um anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo que se liga especificamente a PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em alguns casos, o inibidor de ponto de checagem imune é um anti- corpo anti-PD-1, tal como nivolumab ou pembrolizumab ou um frag- mento de ligação a antígeno do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ponto de checagem imune bloqueia ou é um antagonista de CTLA- 4, tal como é um anticorpo anti-CTLA-4 ou fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo. Em alguns aspectos da presente descrição, o inibi- dor de ponto de checagem imune é tremelimumab ou ipilimumab.
[00553] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica su- prime uma resposta imune, que pode ser útil no tratamento de distúr- bios inflamatórios ou autoimunes ou transplante de órgão. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um polipeptídeo ICOSL variante em um formato que exibe atividade antagonista de sua contraparte de ligação cognata CD28 ou ICOS e/ou que bloqueia ou inib sinalização coestimuladora através de CD28 ou ICOS. Formatos exemplares de um polipeptídeo ICOSL para uso em conexão com tais aplicações terapêuticos incluem, por exemplo, um polipeptídeo ICOSL variante que é solúvel (por exemplo, proteína de fusão de ICOSL vari- ante-Fc), uma proteína imunomoduladora ou "pilha" de um polipeptí- deo ICOSL variante e um outro domínio IgSF, incluindo suas formas solúveis que são fusões de Fc, uma célula engenheirada expressando uma proteína imunomoduladora secretável ou um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma pro- teína imunomoduladora secretável, tal como para expressão e secre- ção da proteína imunomoduladora secretável em uma célula infectada (por exemplo, célula de tumor ou APC, por exemplo, célula dendrítica).
[00554] Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou au- toimune é vasculite associada a anticorpo citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença gastrintestinal inflamatória, uma doença inflamatória do olho, uma doença inflamatória neurológica, uma doença inflamatória pulmonar, uma doença endócrina inflamatória ou uma doença autoimune hematológica.
[00555] Em algumas modalidades, os distúrbios inflamatórios e au- toimunes que podem ser tratados pela composição farmacêutica des- crita aqui é Doença de Addison, alergias, alopecia areata, Alzheimer, vasculite associada a anticorpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídeo (Síndrome de Hughes), asma, aterosclerose, artrite reumatoide, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença do ouvido interno autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, miocardite autoimune, ooforite autoimune, orquite autoimune, azoospermia, Doença de Behcet, Do- ença de Berger, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença cardio- vascular, Sprue celíaco/doença celíaca, síndrome da disfunção imune da fadiga crônica (CFIDS), polineurite idiopática crônica, polirradiculo-
neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), polineuropatia relapsante crônica (síndrome Guillain-Barré), síndrome Churg-Strauss (CSS), penfigoide cicatricial, doença da aglutinina fria (CAD), COPD (doença pulmonar obstrutiva crônica), síndrome de CREST, doença de Crohn, dermatite, herpetiformus, dermatomiosite, diabetes, lúpus dis- coide, eczema, epidermólise bolhosa adquirida, crioglobulinemia mista essencial, Síndrome de Evan, exoftalmos, fibromialgia, Síndrome de Goodpasture, Doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, fibrose pul- monar idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), nefropatia IgA, doença ou distúrbio imunoproliferativo, doença inflamatória do in- testino (IBD), doença pulmonar intersticial, artrite juvenil, artrite idiopá- tica juvenil (JIA), Doença de Kawasaki, Síndrome Miastênica de Lam- bert-Eaton, líquen plano, nefrite lúpica, hipofisite linfocítica, Doença de Méniêre, Síndrome de Miller Fish/encefalomielorradiculopatia dissemi- nada aguda, doença do tecido conectivo mista, esclerose múltipla (MS), reumatismo muscular, encefalomielite miálgica (ME), miastenia grave, inflamação ocular, pênfigo foliáceo, pênfigo vulgar, anemia per- niciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares (síndrome de Whitaker), polimialgia reumática, polimiosite, agamaglo- bulinemia primária, cirrose biliar primária/colangiopatia autoimune, psoríase, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, Síndrome de Rei- ter/artrite reativa, restenose, febre reumática, doença reumática, sar- coidose, síndrome de Schmidt, escleroderma, Síndrome de Sjôrgen, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), escle- roderma sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de célula gigante, tireoidite, diabetes Tipo 1, colite ulcerativa, uveite, vas- culite, vitiligo, doença do intestino intersticial ou Granulomatose de Wegener.
Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou autoi- mune é selecionado de doença intestinal intersticial, transplanta, do- ença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, asma, artrite reu-
matoide e psoríase.
Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou autoimune é uma doença autoimune crônica. Em algumas modalidades, o distúrbio in- flamatório ou autoimune é Síndrome de Sjogren (pSS) ou Lúpus Eri- tematoso Sistêmico (SLE). Em algumas modalidades, o distúrbio in- flamatório ou autoimune é uma doença inflamatória do intestino (IBD). Em alguns exemplos, o distúrbio inflamatório ou autoimune é Doenca de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatória ou autoi- mune é uma doença ou distúrbio relacionado à IBD, por exemplo, do- ença intersticial pulmonar (ILD). Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou autoimune é artrite psoriática ou artrite reumatoide. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada para modular uma condição autoimune. Por exemplo, supressão de uma resposta imune pode ser benéfica em métodos para inibição de rejei- ção de um transplante de tecido, célula ou órgão de um doador por um recipiente. Desta maneira, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas aqui são usadas para limitar ou prevenir doen- ças ou distúrbios relacionados a enxerto ou relacionados a transplante, tal como doença enxerto versus hospedeiro (GVHD). Em algumas mo- dalidades, as composições farmacêuticas são usadas para suprimir rejeição autoimune de medula óssea, órgãos, pele, músculo, neurô- nios, ilhotas ou células parenquimais transplantadas ou enxertadas.
[00556] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar artrite psoriá- tica (PSA). Em alguns casos, a PsA afeta uma ou mais articulações, tais como dedos das mãos, dedos dos pés, braços ou pernas, incluin- do cotovelos, punhos, mãos e pés, ou a articulação sacro ilíaca. Em alguns casos, a PsA é leve e/ou afeta quatro ou menos articulações. Em alguns casos, a PsA é moderada e/ou afeta quatro ou mais articu-
lações. Em alguns casos, um indivíduo com PsA pode exibir dor, rigi- dez ou inflamação na espinha ou pescoço, ou em uma ou mais articu- lações.
[00557] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar artrite reuma- toide (RA). Em alguns casos, RA afeta as articulações, revestimento de articulações e/ou estruturas não articulação no corpo (por exemplo, pele, olhos, pulmões, coração, rins, glândulas salivares, tecido nervo- so, medula óssea ou vasos sanguíneos). Em algumas modalidades, RA ou sintomas de RNA são crônicos.
[00558] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar GVHD. Em algumas modalidades, a GVHD é GVHD aguda (aGVHD). Em alguns casos, aGVHD ocorre após transplante de célula-tronco hematopoiéti- ca alogeneica (HSCT) e/ou uma reação de células imunes doadoras contra tecidos de hospedeiro. Em alguns casos, a aGVHD se manifes- ta na pele, fígado ou trato gastrintestinal.
[00559] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar uma condição autoimune associada com um transplante de órgão. Em alguns casos, tratamento da condição autoimune associada com um transplante de órgão pode prolongar a sobrevivência do hospedeiro e órgão trans- plantado. Em algumas modalidades, tratamento da condição autoimu- ne associada com um transplante de órgão inclui profilaxia de ou inibi- ção ou prevenção de rejeições de transplante por um indivíduo que é o recipiente do transplante de órgão.
[00560] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar uma doença inflamatória do intestino (IBD). Em algumas modalidades, uma compo- sição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar doença de Crohn. Em algumas modalidades, a doença de Crohn pode incluir um subtipo de colite de Crohn, enterite de Crohn, ileíte de Crohn ou enterocolite de Crohn.
[00561] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar lúpus erite- matoso sistêmico (SLE). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida aqui, tal como uma proteína de fusão de IgSF (por exemplo, IgV) ICOSL variante Fc provida aqui, é usada para tratar Síndrome de Sjogren. IX. MODALIDADES EXEMPLARES
[00562] Dentre as modalidades providas estão:
1. Um polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL) variante compre- endendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo de referên- cia ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é um domínio extracelular truncado compreendendo uma sequência contíngua de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 1-112 e um truncamento C-terminal de pelo menos 25 aminoácidos com referência à sequência de domínio extracelular de ICOSL mostrada na SEQ ID NO: 32.
2. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 1, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada com o(s) ecto- domínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptí- deo de referência ICOS para o(s) mesmo ectodomínio(s).
3. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 1 ou mo-
dalidade 1, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação au- mentada com o(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOS para o(s) mesmo ectodo- mínio(s).
4. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-3, em que o truncamento C-terminal é de pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125 resíduos de aminoácido.
5. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-4, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em ou não tem um sítio de clivagem por protease mostrado como ami- noácidos 204-109 de SEQ ID NO: 32.
6. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-5, em que o polipeptídeo de referência ICOSL compreen- de a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
7. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-5, em que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
8. O polipeptídeo ICOSL (ICOSL) variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo de refe- rência ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
9. O polipeptídeo ICOS (ICOSL) variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da super- família da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é alterado em um ou mais aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 204-209 com referência à SEQ ID NO: 32.
10. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 8 ou mo-
dalidade 9, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alte- rada com uma ou mais de suas contrapartes de ligação comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para a uma ou mais contrapartes de ligação.
11. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 8 ou mo- dalidade 9, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação au- mentada com uma ou mais de suas contrapartes de ligação compara- do com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para a uma ou mais contrapartes de ligação.
12. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 9-11, em que a alteração compreende uma deleção de um ou mais aminoácidos contíguos correspondendo aos aminoácidos 204-209 com referência à SEQ ID NO: 32.
13. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-6 e 9-12, em que o polipeptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 600-605.
14. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-6 e 9-12, em que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 600-605.
15. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-6 e 9-14, em que a alteração compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma ou ambas posições 207 e 209 correspondendo às posições mostradas na SEQ ID NO: 32.
16. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 15, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido é N207A, N207G ou L208G ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
17. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 9-16, em que o polipeptídeo ICOSL de referência com-
preende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 623-628.
18. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 9-17, em que o polipeptídeo ICOSL de referência consis- te na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 623-628.
19. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 5-7 e 9-18, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe clivagem proteolítica reduzida quando expresso a partir de uma célula, opcionalmente comparado com um domínio extracelular de compri- mento integral do polipeptídeo ICOSL variante quando expresso a par- tir da mesma célula.
20. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 19, em que a célula é uma célula de mamífero.
21. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 19 ou da modalidade 20, em que a célula é uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou um derivado da mesma.
22. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-21, em que a modificação do aminoácido é uma substi- tuição, inserção ou deleção de aminoácido.
23. A variante de qualquer uma das modalidades 1-22, em que a uma ou mais modificações de aminoácido estão em uma posi- ção correspondendo à(s) posição(ões) selecionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71,72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221,224, 225 ou 227 com referência à SEQ ID NO:32.
24. A variante de qualquer uma das modalidades 1-23, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de M10V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R750Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, LO6I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G6G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1IO7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11ON, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F1208S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V1I93A, V1I93M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T2258S, N227K ou uma substi- tuição de aminoácido conservativa do mesmo.
25. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-24, em que a uma ou mais modificações de aminoácido estão em uma posição correspondendo à(s) posição(ões) 52, 57 ou
100.
26. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-25, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N52K, S54A, S54P,
N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N570Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T ou Q100V.
27. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-26, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/ Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N528S/ S130G/Y152C, N528S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/1143T, N52S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52S/ N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/ G103E/F120S, N528S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/ V110D, N52H/N57 Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/ N57Y/L740/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/ N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R618S/Q100R/V110D/L173S, N52H/ N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N528S/ F120S, N52S/V97A, N528S/G72R, N52S/A7T1T/A117T, N528S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57 Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ V116A/L161M/F1728S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L961/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/1143V/R221G, A2ZOT/N52D/Y146C/Q164L, VI1E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L961/L98F/ N194D/V210A/1218T, — N52S/H94E/L961/V122M, N52H/N57Y/H94E/ L961/F1201/S126T/W153R/1218N, M10V/S18R/N30D/N528S/S126R/ T1398S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/ Q100K/D217G/R221K/T2258S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/
T190S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/F1728S/C198R, —S25G/ F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L1738S/C198R, N52H/N57Y/ V110A/C198R/R221l, — M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/ N43V/F1728S/VI93M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/ F1208S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/VI1O0D/H115R/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N528S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E90A, N30D/K42E/N528S, N52S/F1208S/1143V/1224V, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/ C198R, N52S/NI94D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V1I10D/H115R/ C198R, N528S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/ F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/ L74Q/VI10D/S192G, — N52H/S121G/C198R, — N528S/F120S/N227K, N528S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57 Y/LT4Q/D89G/ V110D/F1728, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, — N52D, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/N154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/ N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, —N52H/ N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/ N155Q/N168Q, —“N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N207Q0, N52Q/N84Q/N1I19Q/NI55Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/ N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/ L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/L102R/H115R/F1728/C198R, N52H/V122A/F1728/C198R, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/1224V,
N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/ Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/ F1728S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/ K42E/N528S/H115R/C198R/R2211l, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F1208/1143V/ C198R, N52S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/ H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F1728S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/ Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/ Q100P, N52Q/N57F, N52Q/ N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/ N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/ Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q1008S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/ N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/ Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/ N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/ N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/ Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P ou R26S/N52H/N57 Y/V110D/T137A/C198R.
28. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-24, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre F120S/Y152H/N201S, E1l11del, Y33del,
N168Q/N207Q, “N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N1689Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ou F138L/L203P.
29. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-28, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F1728S, H115R, H115X, 1143T, 1143V, 1224V, KI56M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R2211I, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, ou Y152C; ou A117T, A2OV, A71T, A91G, A91G, AE8S8D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120l, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, 1118V, 1127T, 1143T, 1143V, 1154F, 1218N, 1218T, 1224V, KI56M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L961, L98F, M101I, M1OV, N115Q, N1190Q, N122S, N144D, N1I55X, N168Q, N1I68X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, Q133H, R221G, R221l, S109G, S109N, S114T,
S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S2126G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T411, V1O7I, VI10A, V110D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C ou Y152H.
30. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-29, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N528S/C198R, N528S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, N52S8/R75Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52H/ N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N528S/E90A, N528S/F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52Y/N57Y/ Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, — N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/ Q100R/ H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, Q100R, N52Y/ F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R , N57Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/L102R, —H1II5R/F1728/C198R, —N52H/N57Y/Q100R/ H115R F1I72S/NI94D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/
N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/H115R, — N52H/Q100R/ H115R/1143T F1728S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N528/E9O0A/H115R, N30D/K42E/ N528S/H115R/C198R/R2211, N30D/K42E/N528S/H115R/C198R, N30D/ K42E/N528S/H115R/F1728S/N194D, N30D/K42E/N528S/H115R, N528S/ ESOA/H115R, N30D/K42E/N528S/H115R, N52A/N57H/Q1008S, N52A/ N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/0100P, N52Q/N578/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N528S/ N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/ Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, — N52R/N57W, —N52G/N57P/Q100D, N52G/ N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ou N52T/ N57K/Q100P; ou
N528S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/ N57Y/Q100P, N528S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/ T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N528/Y152H, N52H/ 143T, N528/L80P, N528S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91IG/E117G/ NM 18V/T120S/T130A, L7OR/A91G/1118V/ T120S/T130A/T199S, L7OQ/E81A/A91G/ I118V/T1208S/1127T/ T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/118V /T1208S/T130A, T411/A91G, E88D/ K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N1228S/ N178S, E88D/K89R/D90K/ A91IG/ FO2Y/K93R, AESSD/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R, K36G/ L40M, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/ N57Y/Q100R, N528/F120S/N227K, N52S/NI94D, N528S/F120S, N528/G72R, N52S/AT1IT/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ V1071/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G, E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/
C198R, V11E/N30D/N52H/N57 Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/ 1218T, N52S/H94E/L961/V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S126T/ W153R/1218N, M10V/S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/ N30D/N528/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F1728/C198R, S25G/F27 C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L1738S/C198R, N52H/ N57Y/VI10A/C198R/R221], M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/ H129P/1I143V/F1728S/V193M,C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/ C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N52S/F120S/1143V/ 1224V, N52H/N57 Y/Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728/C198R, N528S/H115R/F1208S/ N43V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/ H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/H115R, — N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, — N52H/ Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728S, N52H/Q100R/H115X/ F1728/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57 Y/Q100R/H115R/F1728, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, N52S/H94E/L961/S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/ C198R, N52H/N57Y/L74Q/VI1I0D/S192G, N52H/Q100R, N52H/ S121G/C198R, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/VIIOD/C198R/S212G, L70Q/A91G/ NMIBA/TI20S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/ Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/ F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/N143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R
H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R — F172S/N194D, N52H/N57 Y/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/1143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R2211, N528/E90A/ H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/H115R/F1728S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N1I68X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/ N207Q, N119Q N1I55X, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/ N155Q/N168Q0, — N52H/N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N1I55X/N1I68X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/ N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/ N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/ N57A/Q100A, — N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/ N57M/Q100S, — N52S/N57Y/Q100S, —N52S/N57Y/Q100M, N52S/ N57Y/Q100V, — N52T/N57H/Q100S, — N52T/N57H/Q100A, N52T/ N57Y/Q100A, — N52V/N57L/Q100A, — N52H/N57Y/Q100K, N52K/ N57Y/Q100R, — N52L/N57H/Q100R, —N52R/N57F/Q100N, N52R IN57F/Q100P, — N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/ N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/ N57V, N528S/N57L/Q100G ou N52T/N57K/Q100P.
31. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-30, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe liga- ção aumentada ao ectodomínio de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de referência para o mesmo ectodomí- nio.
32. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-33, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F1728S, H115R, 1143V, 1224V, KI56M, K42E, K92R, L102R, L203P,
L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N528S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, V110D, V122A, Y146C, Y152C ou T225A.
33. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-33, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/ N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/ Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/ Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N528S/C198R, N528/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, — N528/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F172S8, N52H/N57Y/Q100R, N52S/NI94D, N52H/N57Y/ Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, — N52S/E90A, — N528S/F120S/ V143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52Y/N57Y/Q100P/F1728S, — E16V/ N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N528S/H115R/F1208S/1143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/ C198R, —“N52H/N57Y/Q100P/H115R, —N52H/N57Y/Q100P/H115R/ C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/ Q100R/H115X/F1728S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F172S8, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/C198R, —Q100R,
N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, —N52H/N57Y/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F1728S/ C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F1728/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R — F1I72S/NI94D, N52H/N57Y/H115R/F1728S/ C198R, —N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N528S/E90A/ H115R, N528/E90A/H115R ou N30D/K42E/N52S/H115R.
34. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-33, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada com o ectodomínio de ICOS e CD28 comparado com a ligação ao polipeptídeo ICOSL de referência para os mesmos ectodo- mínios.
35. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 1-34, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma as 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de iden- tidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910.
36. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-34, em que o polipeptídeo ICOSL variante consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 291%%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840- 843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907 ou 910.
37. Um polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL) variante com- preendendo um domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreen- de uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo de referência ICOSL ou um fragmento de ligação específico do mesmo correspondendo às modificações de aminoácido selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q1008S, Q100T ou Q100V, com referência à SEQ ID NO:32.
38. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 37, em que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52A/N57F/Q100S, N52A,/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/ Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/ N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/
Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/ N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/ Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/ Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
39. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 37 ou modalidade38, em que o polipeptídeo ICOSL de referência é um ICOSL de mamífero ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
40. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-39, em que o polipeptídeo de referência ICOSL é um ICOSL humano ou um fragmento de ligação específico do mesmo.
41. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-40, em que o polipeptídeo de referência ICOSL com- preende (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 32; ou (iii) uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica dos mesmos ou ambos.
42. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-41, em que: o fragmento de ligação específica do domínio IgV ou domínio IgG tem um comprimento de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 110, 110 ou mais aminoácidos; ou o fragmento de ligação específica do domínio IgV compreende um comprimenot que é pelo menos 80% do comprimento do domínio IgV mostrado para os aminoácidos 19-129 de SEQ ID NO: e/ou o fragmento de ligação específica do domínio IgC compreende um comprimento que é pelo menos 80% do comprimento do domínio IgC mostrado como aminoácidos 141-227 de SEQ ID NO: 5.
43. O plipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das mo- dalidades 37-42, em que o polipeptídeo ICOSL variante compeende o domínio IgV ou um fragmento específico do mesmo e o domínio IgC ou um fragmento específico do mesom.
44. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreen- de a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 638-685, 905, 908 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 638-685, 905, 908.
45. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43, em que o polipeptídeo ICOSL variante consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 638-685, 905, 908, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 638-685, 905, 908.
46. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreen- de o domínio IgV ou um fragmento de ligação específico do mesmo.
47. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43 e 46, em que o polipeptídeo ICOSL variante com- preende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOS: 686-781, 907, 910, ou uma sequência de aminoáci- dos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781, 907, 910.
48.0 polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43 e 46, em que o polipeptídeo ICOSL variante con- siste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 686-781, 907, 910, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 686-781, 907, 910.
49. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-43 e 46-48, em que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção de ICOSL do polipeptí- deo ICOSL variante.
50. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-42, em que o domínio IgG ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção de ICOSL do polipeptídeo ICOSL variante.
51. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-50, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe liga- ção alterada com o ectodomínio de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para o mesmo ectodomí- nio.
52. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 37-51, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe liga- ção aumentada ao ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para o(s) mesmo(s) ec- todomínio(s).
53. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-52, em que o a ligação é aumentada mais de 1,2-vez, 1,5-vez, 2-vezes, 3-vezes, 4-vezes, 5-vezes, 6-vezes, 7-vezes, 8- vezes, 9-vezes, 10-vezes, 20-vezes, 30-vezes, 40-vezes, 50-vezes ou 60-vezes.
54. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-53, em que o ICOS é um ICOS humano.
55. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-54, em que o CD28 é um CD28 humano.
56. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-55, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe liga- ção diminuída com o ectodomínio de CTLA-4 comparado com a liga- ção do polipeptídeo ICOSL de referência para o mesmo ectodomínio.
57. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 56, em que a ligação é diminuída mais de 1,2-vez, 1,5-vez, 2-vezes, 3-vezes, 4-vezes, 5-vezes, 6-vezes, 7-vezes, 8-vezes, 9-vezes, 10-vezes, 20- vezes, 30-vezes, 40-vezes, 50-vezes ou 60-vezes.
58. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-57, em que o CTLA-4 é um CTLA-4 humano.
59. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-58, em que a ligação alterada (aumentada ou diminuí- da) é afinidade de ligação alterada (aumentada ou diminuída).
60. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-59, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácido, opcionalmente substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido.
61. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-60, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipeptí- deo de referência ICOSL.
62. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-61 que é uma proteína solúvel.
63. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-62, em que: o polipeptídeo ICOSL variante não tem um domínio de transmembrana e domínio de sinalização intracelular; e/ou quando expresso a partir de uma célula, o polipeptídeo ICOSL variante não é expresso na superfície da célula.
64. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-61, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreende ainda um domínio de transmembrana.
65. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 64, em que o domínio de transmembrana compreende a sequência de amino- ácidos mostrada como resíduos 257-277 da SEQ ID NO: 5 ou uma va- riante funcional dos mesmos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com os resíduos 257-277 da SEQ ID NO: 5.
66. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 64 ou modalidade 65 compreendendo ainda um domínio de sinalização cito- plásmico ligado ao domínio de transmembrana.
67. O polipeptídeo ICOSL variante da modalidade 66, em que o domínio de sinalização citoplásmico compreende a sequência de aminoácidos mostrada como resíduos 278-302 de SEQ ID NO: 5 ou uma variante functional dos mesmos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com resíduos 278-302 de SEQ ID NO: 5.
68. O polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-67 que é desglicosilado ou parcialmente desglicosilado comparado com a sequência de referência de ICOSL.
69. A proteína imunomodulador compreendendo o polipep- tídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 e uma porção de prolongamento de meia-vida.
70. A proteína imunomoduladora da modalidade 69, em que a porção de prolongamento de meia-vida compreende um domínio de multimerização, albumina, um polipeptídeo de ligação à albumina,
Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade beta de gonadotropina coriônica humana, polietileno glicol (PEG), sequên- cias hidrofílicas não estruturadas longas de aminoácidos (XTEN), ami- do de hidroxietila (HES), uma molécula pequena de ligação à albumina ou uma combinação dos mesmos.
71. A proteína imunomoduladora da modalidade 69 ou mo- dalidade 70, em que a porção de prolongamento de meia-vida é ou compreende Pro/Ala/Ser (PAS) ou o polipeptídeo ICOSL variante é PASilado.
72. A proteína imunomoduladora da modalidade 71, em que a porção de prolongamento de meia-vida compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 904.
73. A proteína imunomoduladora da modalidade 69 ou mo- dalidade 70, em que a porção de prolongamento de meia-vida é ou comperende um domínio de multimerização.
74. A proteína imunomoduladora da modalidade 73, em que o domínio de multimerização é selecionado de uma região Fc de uma imunoglobulina, um zíper de leucina, um zíper de isoleucina ou um de- do-de-zinco.
75. A proteína imunomoduladora da modalidade 73 ou mo- dalidade 74, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, direta- mente ou indiretamente por meio de um ligante, ao domínio de multi- merização.
76. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 73-75, em que a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo ICOSL variante ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo ICOSL variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e o segundo domínio de multimerização interagem para for- mar um multímero compreendendo o primeiro e o segundo polipeptí-
deo ICOSL variante.
77. A proteína imunomoduladora da modalidade 76, em que o multímero é um dímero.
78. A proteína imunomoduladora da modalidade 76 ou mo- dalidade 77, em que o primeiro polipeptídeo ICOSL variante e o se- gundo polipeptídeo ICOSL variante são iguais.
79. A proteína imunomoduladora da modalidade 77 ou mo- dalidade 78, em que o dímero é um homodímero.
80. A proteína imunomoduladora da modalidade 77, em que o dímero é um heterodímero.
81. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 73-80, em que o domínio de multimerização é ou compreen- de uma região Fc de uma imunoglobulina.
82. A proteína imunomoduladora da modalidade 81, em que a região Fc é de uma proteína imunoglobulina G1 (I9G1) ou uma imunoglobulina G2 (I9G2).
83. A proteína imunomoduladora da modalidade 81 ou mo- dalidade 82, em que a proteína imunoglobulina é humana e/ou a regi- ão Fc é humana.
84. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 81-83, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 227 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 227.
85. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 81-84, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 226 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 226.
86. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo-
dalidades 81-85, em que a região Fc exibe uma ou mais funções efeto- ras.
87. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 81-86, em que a região Fc exibe uma ou mais função efeto- ra reduzida comparado com uma região Fc do tipo selvagem, opcio- nalmente em que a Fc humana do tipo selvagem é de IgG1 humana.
88. A proteína imunomoduladora da modalidade 86 ou mo- dalidade 87, em que a uma ou mais função efetora é selecionada den- tre citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxidez dependente de complemento, morte de célula programada e fagocito- se celular.
89. A proteína imunomoduladora da modalidade 87 ou mo- dalidade 88, em que a região Fc é uma região Fc variante compreen- dendo uma ou mais substituições de aminoácido comparado com a região Fc do tipo selvagem.
90. A proteína imunomoduladora da modalidade 89, em que a uma ou mais substituições de aminoácido da região Fc variante são selecionadas de N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
91. A proteína imunomoduladora da modalidade 90, em que a região Fc variante compreende ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
92. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 87-91, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 476-478 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS:476-478 e contém as substituições de aminoácido.
93. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 87-92, em que a região Fc compreende K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
94. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 87-92 e 93, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 632-634 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS:632-634 e contém as substituições de aminoácido.
95. A proteína imunomoduladora compreendendo: (a) um polipeptídeo ICOSL variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da super- família da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo ICOSL de refe- rência, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada ao(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de referência para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s); e (b) uma região Fc variante compreendendo substitui- ções de aminoácido selecionadas de N297G/K447del, E233P/L234V/ L235A/G236del/S267K/K447del ou L234A/L235E/G237A/K447del comparado com IgG1 humana do tipo selvagem, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
96. A proteína imunomoduladora da modalidade 95 que é um dímero.
97. A proteína imunomoduladora da modalidade 95 ou mo- dalidade 96, em que a região Fc variante compreende ainda a substi- tuição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
98. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 95-97, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 632-634 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOS: 632-634 e contém as substituições de aminoácido.
99. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das mo- dalidades 95-98, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, dire- tamente ou indiretamente por meio de um ligante, à região Fc variante.
100. A proteína imunomoduladora da modalidade 75 e mo- dalidade 99, em que o ligante compreende 1 a 10 aminoácidos.
101. A proteína imunomoduladora da modalidade 100, em que o ligante é selecionado de AAA, G4S8S (SEQ ID NO: 636), (G1S)? (SEQ ID NO:229) ou GSGGGGS linker (SEQ ID NO: 635).
102. Uma proteína imunomoduladora compreendendo o po- lipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 |i- gado a um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio da su- perfamília da imunoglobulina (I9SF).
103. A proteína imunomoduladora da modalidade 102, em que o domínio I9SF é modificado na afinidade e exibe ligação alterada a uma ou mais de suas contrapartes de ligação cognatas comparado ao domínio IgSF não modificado ou do tipo selvagem.
104. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 103, em que o domínio IgSF exibe ligação aumentada a uma ou mais de suas contrapartes de ligação cognatas comparado com o domínio IgSF não modificado ou do tipo selvagem.
105. O polipeptídeo imunomodulador de qualquer uma das modalidades 102-104, em que o polipeptídeo ICOSL variante é um primeiro polipeptídeo ICOSL variante e o domínio IISF do segundo polipeptídeo é um domínio I9gSF de um segundo polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68, em que as primeira e segunda variantes de ICOSL são iguais ou diferentes.
106. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102-105, em que o polipeptídeo ICOSL variante é capaz de se ligar especificamente a CD28 ou ICOS e o domínio IgSF do se- gundo polipeptídeo é capaz de se ligar a uma contraparte de ligação diferente da especificamente ligada pelo polipeptídeo ICOSL variante.
107. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 106, em que o domínio IgSF é de um membro da família B7.
108. O polipeptídeo imunomodulador de qualquer uma das modalidades 102-104 e 106, em que o domínio IgSF é uma porção de localização de tumor que se liga a um ligante expresso em um tumor ou é uma porção de localização inflamatória que se liga a um ligante expresso em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório.
109. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 108, em que o ligante é B7H6.
110. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 108 ou modalidade 109, em que o domínio IgSF é de NKp30.
111. O polipeptídeo imunomodulador de qualquer uma das modalidades 102-110, em que o domínio I9SF é ou compreende um domínio IgV.
112. O polipeptídeo imunomodulador de qualquer uma das modalidades 102-111, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ou compreende um domínio IgV.
113. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102-112, em que a proteína imunomoduladora compre- ende um domínio de multimerização ligado a um ou ambos o polipep- tídeo ICOSL variante ou o segundo polipeptídeo compreendendo o domínio IgSF.
114. A proteína imunomoduladora da modalidade 113, em que o domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante do mesmo com função efetora reduzida.
115. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102-114 que é dimérica.
116. A proteína imunomoduladora da modalidade 115 que é homodimérica.
117. A proteína imunomoduladora da modalidade 116 que é heterodimérica.
118. Um conjugado compreendendo o polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 ou proteína imuno- moduladora de qualquer uma das modalidades 69-117 e uma porção heteróloga.
119. O conjugado da modalidade 118, em que o polipeptí- deo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, à porção heteróloga.
120. O conjugado de qualquer uma da modalidade118 ou modalidade 119, em que a porção de direcionamento é uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopartícula.
121. O conjugado de qualquer uma das modalidades 118- 120, em que a porção-alvo é uma proteína ou peptídeo.
122. O conjugado da modalidade 121, em que o conjugado é uma proteína de fusão.
123. Uma proteína de fusão compreendendo um polipeptí- deo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 ou proteí- na imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69-117 e uma porção heteróloga.
124. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 118-123, em que a porção é uma porção de direcio- namento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula.
125. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 124, em que a porção de direcionamento se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula imune.
126. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 125, em que a célula imune é uma célula apresentando antígeno ou um lin- fócito.
127. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 124, em que a porção de direcionamento é uma porção de localização de tumor que se liga a uma molécula na superfície de um tumor.
128. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 124-127, em que a porção de direcionamento se liga a uma molécula HERI/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEA- CAM3, CEACAM5, CEACAMG, antígeno de câncer 125 (CA125), alfa- fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF (PDGFR), PDGF-R a, PD-1, PD-L1, CTLA-A, receptor de IL- 2, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glipicano-3, goA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de liga- ção a folato, gangliosídeos (tais como GD2, GD3, GM1 e GM2), recep- tor de VEGF (VEGFR),VEGFR2, VEGF-A, aVB3 integrina, a5B1 inte- grina, ERBB3, MET, IGFIR, EPHA3, TRAILR1I, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complex de BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 B, antígeno de HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antí- geno de PEM, metaloproteinases, receptor de Efrina, ligantes de Efri- na, receptor de HGF, CXCR4, CXCRA, receptor de Bombesina, antí- geno de SK-1, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK, ROS, EMLA4- ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mMTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1I, MEK2, SMO ou B7-H6 (NCR3LG1).
129. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 124-128, em que a porção de direcionamento se liga a PD-L1.
130. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 124-129, em que a porção de direcionamento é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno.
131. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 130, cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Ado-trastuzumab entansina, Tositumomab (Bexxar &), Rituximab (Ri- tuxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetano (Zevalin), Daclizumab (Zena- pax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, fragmento Fab de varre- dura de CEA, anticorpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, Bevacizu- mab (Avastin O), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ceritinib, Cri- zotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab, Erlotinib, Everolimus, Ibruti- nib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab, Pal- bociclib, Pazopanib, Pertuzumab, Ramucirumab, Regorafenib, Ruxoliti- nib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemura- fenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizu- mab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT-011), AMP-224, MSBOO01078C ou MEDI4736, BMS-935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ou durvalumab ou é um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
132. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 130 ou modalidade 131, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, ao terminal N de uma cadeia pesada e/ou leve do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno.
133. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 130 ou modalidade 131, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, ao terminal C da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antí-
geno.
134. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 118-133, em que o conjugado é divalente, tetravalen- te, hexavalente ou octavalente.
135. O conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 118-123, em que a porção heteróloga é ou compre- ende um marcador para detecção ou purificação do polipeptídeo ICOSL variante.
136. A proteína de fusão monovalente compreendendo: (a) um polipeptídeo ICOSL variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da super- família da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo ICOSL de refe- rência, em que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação alterada ao(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo ICOSL de referência para o mesmo ectodomínio(s); e (b) um marcador para detecção ou purificação do poli- peptídeo ICOSL variante.
137. O conjugado ou proteína de fusão da modalidade 135 ou modalidade 136, em que o marcador para detecção ou purificação é selecionado de um marcador de poli-histidina (His), um marcador de FLAG, um marcador de Myc ou um marcador de proteína fluorescente.
138. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 95-101 ou a proteína de fusão da modalidade 136 ou modalidade 137, em que o polipeptídeo ICOSL variante compreende uma ou mais modificações de aminoácido que estão em uma posição correspondendo à(s) posição(ões) selecionadas de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71,72, 74,75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152,
153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à SEQ ID NO:32.
139. A proteína imunomoduladora ou proteína de fusão da modalidade 138, em que as uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de M10V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A2ZOV, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, O37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N570Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L961, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1O7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11O0N, E1l11del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120l, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N1I44D, Y146C, V1I51A, Y152C, Y152H, W153R, 1154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V1I93A, VI93M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T225S, N227K ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo.
140. A proteína imunomoduladora ou proteína de fusão da modalidade 138 ou modalidade 139, em que o polipeptídeo ICOSL de referência compreende (i) a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo me-
nos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32; ou (iii) uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica dos mesmos ou ambos.
141. A proteína imunomoduladora ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 138-140, em que o polipeptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 196, 545, 600-605 e 623-628.
142. A proteína imunomoduladora ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 138-141, em que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 32, 196, 545, 600-605 e 623-628.
143. Uma molécula(s) de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68, uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69- 117 e 118-142 ou uma proteína de fusão de qualquer uma das modali- dades 123-142.
144. A(s) molécula(s) de ácido nucleico da modalidade 143 que é um ácido nucleico sintético.
145. A(s) molécula(s) de ácido nucleico da modalidade 143 que é um cDNA.
146. Um vetor compreendendo a(s) molécula(s) de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 143-145.
147. O vetor da modalidade 146 que é um vetor de expres- são.
148. O vetor da modalidade 146 ou modalidade 147, em que o vetor é um vetor de expressão de mamífero ou um vetor viral.
149. Uma célula compreendendo o vetor de qualquer uma das modalidades 146-148.
150. A célula da modalidade 149 que é uma célula de ma- miífero.
151. A célula da modalidade 149 ou modalidade 150 que é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou um derivado da mesma.
152. Um método de produção de uma proteína imunomodu- ladora compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante compreen- dendo introdução da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 143-145 ou vetor de qualquer uma das modalidades 146- 147 em uma célula hospedeira sob condições para expressar a proteí- na na célula.
153. O método da modalidade 152, em que a célula hospe- deira é uma célula de mamífero.
154. O método da modalidade 153, em que a célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês ou um derivado do mesmo.
155. O método de qualquer uma das modalidades 152-154 compreendendo ainda isolamento ou purificação da proteína a partir da célula.
156. Uma proteína produzida através do método de qual- quer uma das modalidades 152-155.
157. Uma composição compreendendo uma proteína com- preendendo um polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 ou uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69-117, em que pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das sequências individuais da proteína ou da proteína imunomo- duladora na composição têm um comprimento de sequência idêntico, opcionalmente em que a composição é uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável.
158. A composição da modalidade 157, em que a proteína ou proteína imunomoduladora é purificada a partir de Células de Ová- rio de Hamster Chinês ou um derivado das mesmas.
159. Um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo ICOSL variante compreendendo um do- mínio de transmembrana de qualquer uma das modalidades 64-68 e um ou mais ácido nucleico codificando uma ou mais cadeia de um re- ceptor de antígeno recombinante.
160. O polinucleotídeo da modalidade 159, em que o recep- tor de antígeno recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T engenheirada (TCR).
161. O polinucleotídeo da modalidade 159 ou modalidade 160, em que cada um do ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante e o um ou mais ácido nucleico codificando uma ou mais cadeia do receptor recombinante é separado por um ácido nu- cleico codificando um peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo.
162. O polinucleotídeo da modalidade 161, em que o poli- nucleotídeo compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante, um ácido nucleico codificando um peptídeo de auto- clivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo e um ácido nu- cleico codificando um CAR.
163. O polinucleotídeo da modalidade 161, em que o poli- nucleotídeo compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante, um ácido nucleico codificando um primeiro peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo, um ácido nucleico codificando uma de uma cadeia TCRalfa engenheirada ou uma cadeia TCRbeta engenheirada, um ácido nucleico codificando um segundo peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo e um ácido nucleico codificando a outra da cadeia TCRalfa engenheirada ou da cadeia TORbeta engenheirada.
164. O polinucleotídeo da modalidade 163, em que o pri- meiro e o segundo polipeptídeo codificado são o mesmo.
165. O polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades 160-163, em que o peptídeo de autoclivagem ou o peptídeo que causa pulo de ribossomo é um T2A, um P2A, um E2A ou um F2A.
166. Um vetor compreendendo o polinucleotídeo de qual- quer uma das modalidades 159-165.
167. O vetor da modalidade 166, em que o vetor é um vetor viral.
168. O vetor da modalidade 167, em que o vetor viral é um vetor retroviral ou um vetor lentiviral.
169. Uma célula engenheirada compreendendo o polinu- cleotídeo de qualquer uma das modalidades 159-165 ou o vetor de qualquer uma das modalidades 166-168.
170. Uma célula engenheirada compreendendo o polipeptí- deo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68, a proteí- na imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69-117 ou a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 123-142.
171. Uma célula engenheirada compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 145-145 ou o ve- tor de qualquer uma das modalidades 146-148.
172. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-171, em que o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão codi- fica um peptídeo de sinal.
173. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-172, em que o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imu- nomoduladora ou proteína de fusão não compreende um domínio de transmembrana e/ou não é expresso na superfície da célula.
174. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-173, em que o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imu- nomoduladora ou proteína de fusão é secretado a partir da célula en-
genheirada.
175. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-171, em que a célula engenheirada compreende um poli- peptídeo ICOSL variante compreendendo um domínio de transmem- brana de qualquer uma das modalidades 64-68.
176. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-171 e 175, em que o polipeptídeo ICOSL variante é ex- presso na superfície da célula.
177. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-176, em que a célula é uma célula imune.
178. A célula engenheirada da modalidade 177, em que a célula imune é uma célula apresentando antígeno (APC) ou um linfóci- to.
179. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-178 que é uma célula primária.
180. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-179, em que a célula é uma célula de mamífero.
181. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-180, em que a célula é uma célula humana.
182. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-181, em que o linfócito é uma célula T.
183. A célula engenheirada da modalidade 178, em que a célula engenheirada é uma APC e a APC é uma APC artificial.
184. A célula engenheirada de qualquer uma das modali- dades 169-183 compreendendo ainda um receptor de antígeno quimé- rico (CAR) ou receptor de célula T engenheirado.
185. Uma composição farmacêutica compreendendo o poli- peptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68, a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69-117, um conjugado ou proteína de fusão de qualquer uma das modalidades
118-142 ou uma célula engenheirada de qualquer uma das modalida- des 169-184 ou um agente infeccioso de uma modalidade 216-227.
186. A composição farmacêutica da modalidade 185 com- preendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável.
187. A composição farmacêutica da modalidade 185 ou 186, em que a composição farmacêutica é estéril.
188. Um artigo de fabricação compreendendo a composi- ção farmacêutica de qualquer uma das modalidades 185-187 em um frasco.
189. O artigo de fabricação da modalidade 188, em que o frasco é vedado.
190. Um kit compreendendo a composição de qualquer uma das modalidades 157-158 e 185-187 e instruções para uso.
191. Um kit compreendendo o artigo de fabricação de acor- do com as modalidades 189 e 190 e instruções para uso.
192. Um método de modulação de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração da composição farmacêu- tica de qualquer uma das modalidades 157-158 e 185-187 ao indiví- duo.
193. Um método de modulação de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administrar as células engenheiradas de qualquer uma das modalidades 169-184.
194. O método da modalidade 193, em que as células en- genheiradas são autólogas para o indivíduo.
195. O método da modalidade 193, em que as células en- genheiradas são alogênicas para o indivíduo.
196. O método de qualquer uma das modalidades 193-195, em que modulação da resposta imune trata uma doença ou condição no indivíduo.
197. O método de qualquer uma das modalidades 193-196,
em que a resposta imune é aumentada.
198. O método de qualquer uma das modalidades 192, 196 e 197, em que uma proteína imunomoduladora ou conjugado compre- endendo um polipeptídeo ICOSL variante ligado a uma porção de loca- lização de tumor é administrada ao indivíduo.
199. O método da modalidade 198, em que a porção de lo- calização de tumor é ou compreende uma molécula de ligação que reconhece um antígeno de tumor.
200. O método da modalidade 199, em que a molécula de ligação compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo ou compreende um domínio IgSF do tipo selvagem ou variante do mesmo.
201. O método de qualquer uma das modalidades 192 e 196-200, em que a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102-117 ou o conjugado ou proteína de fusão de qual- quer uma das modalidades 118-142 é administrado ao indivíduo.
202. O método de qualquer uma das modalidades 193-197, em que o polipeptídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomo- duladora de transmembrana é administrado ao indivíduo.
203. O método de qualquer uma das modalidades 193-197 e 202, em que a célula engenheirada compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomoduladora de transmem- brana de qualquer uma das modalidades 64-68 é administrada ao indi- víduo.
204. O método da modalidade 192-203, em que a doença ou condição é um tumor ou câncer.
205. O método de qualquer uma das modalidades 192-204, em que a doença ou condição é selecionada de melanoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga, um mal hematológico, câncer de fígado, câncer de cérebro, câncer renal, câncer de mama, câncer pancreático,
câncer colorretal, câncer de baço, câncer de próstata, câncer testicu- lar, câncer ovariano, câncer uterino, carcinoma gástrico, um câncer músculoesqueletal, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer gas- trintestinal, um câncer de célula germinativa ou um câncer endócrino ou neuroendócrino.
206. O método de qualquer uma das modalidades 192-196, em que a resposta imune é diminuída.
207. O método de qualquer uma das modalidades 192-196 e 206, em que um polipeptídeo ICOSL variante ou proteína imunomo- duladora que é solúvel é administrado ao indivíduo.
208. O método da modalidade 207, em que a proteína imu- nomoduladora solúvel é uma proteína de fusão de Fc imunomodulado- ra.
209. O método de qualquer uma das modalidades 192-196 e 206-208, em que um polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-63 e 68, a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 70-101 ou a proteína de fusão da modalidade 136 e 137 é administrado ao indivíduo.
210. O método de qualquer uma das modalidades 192-196 e 206-208, em que uma célula engenheirada compreendendo um poli- peptídeo ICOSL variante secretável é administrada ao indivíduo.
211. O método de qualquer uma das modalidades 192-196, 206-208 e 210, em que uma célula engenheirada de qualquer uma das modalidades 169-174 e 177-184 é administrada ao indivíduo.
212. O método de qualquer uma das modalidades 192-196, 206-208 e 210, em que um agente infeccioso codificando um polipep- tídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomoduladora secretável é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula de tumor ou célula imune e a pro- teína imunomoduladora secretável é secretada a partir da célula infec-
tada.
213. O método de qualquer uma das modalidades 192-196 e 206-212, em que a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune.
214. O método de qualquer uma das modalidades 192-196 e 206-213, em que a doença ou condição é uma vasculite associada a anticorpos citoplásmicos antineutrofílicos (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença inflamatória gastrintestinal uma doença inflamatória do olho, uma doença inflamatória neurológica, uma doença inflamatória pulmo- nar, uma doença inflamatória endócrina ou uma doença hematológica autoimune.
215. O método da modalidade 213 ou modalidade 214, em que a doença ou condição é selecionada de doença inflamatória do intestino, transplante, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou psoríase.
216. Um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nucleico codfiicando um polipeptídeo ICOSL variante de qualquer uma das modalidades 1-68 ou uma proteína imunomodulado- ra de qualquer uma das modalidades da proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 69-117 ou a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 123-142.
217. O agente infeccioso da modalidade 216, em que o po- lipeptídeo ICOSL variante codificado, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão não compreende um domínio de transmembrana e/ou não é expresso na superfície de uma célula em que ele é expres- so.
218. O agente infeccioso da modalidade 216 ou modalidade 217, em que o polipeptídeo ICOSL variante codificado, proteína imu- nomoduladora ou proteína de fusão é secretado a partir do agente in-
feccioso quando ele é expresso.
219. O agente infeccioso da modalidade 218, em que o po- lipeptídeo ICOSL variante codificado compreende um domínio de transmembrana.
220. O agente infeccioso da modalidade 216, modalidade 217 ou modalidade 219, em que o polipeptídeo ICOSL variante codifi- cado é expresso na superfície de uma célula em que ele é expresso.
221. O agente infeccioso de qualquer uma das modalidades 216-220, em que o agente infeccioso é uma bactéria ou um vírus.
222. O agente infeccioso da modalidade 221, em que o ví- rus é um vírus oncolítico.
223. O agente infeccioso da modalidade 222, em que o ví- rus oncolítico é um adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do her- pes, Vírus Herpes Simplex, Vírus Estomático Vesticular, Reovírus, ví- rus da Doença de Newcastle, parvovírus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesticular (VSV), vírus Coxsackie ou um vírus Vaccínia.
224. O agente infeccioso da modalidade 222, em que o ví- rus se direciona especificamente a células (DCs) e/ou é trópico de cé- lula dendrítica.
225. O agente infeccioso da modalidade 224, em que o ví- rus é um vetor lentiviral que é pseudotipificado com um produto enve- lope de vírus Sindbis modificado.
226. O agente infeccioso de qualquer uma das modalidades 216-225 compreendendo ainda uma molécula de ácido nucleico codifi- cando um produto de gene adicional que resulta em morte de uma cé- lula-alvo ou que pode aumentar ou reforçar uma resposta imune.
227. O agente infeccioso da modalidade 226, em que o produto de gene adicional é selecionado de um agente anticâncer, um agente antimetastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imunomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imune, um anti-
corpo, uma citocina, um fator de crescimento, um antígeno, um produ- to de gene citotóxico, um produto de gene pró-apoptótico, um produto de gene antiapoptótico, um gene degradante da matriz celular, genes para regeneração de tecido ou uma reprogramação de células somáti- cas humanas para pluripotência. X. EXEMPLOS
[00563] Os exemplos que seguem são incluídos para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1 Exemplo 1 Geração de Construtos de DNA Mutante de Domínios IgSF
[00564] O Exemplo 1 descreve a geração de construtos de DNA mutante de domínios IgSF ICOSL humanos para tradução e expressão na superfície de levedura como bibliotecas de exibição de levedura. A. Bibliotecas Degeneradas
[00565] — Construtos de DNA mutantes codificando uma variante do domínio ECD de ICOSL foram gerados. Os construtos foram gerados com base em uma sequência de ICOSL do tipo selvagem humana mostrada na SEQ ID NO:32 contendo o domínio ECD como segue:
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVT YHIPOQONSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQK FHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT CTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRI ARTPSVNIGCCIENVLLQOQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKN AAT
[00566] Para bibliotecas que direcionam resíduos específicos para aleatorização completa ou parcial com códons degenerados, o DNA codificando SEQ ID NO:32 foi encomendado da Integrated DNA Techno- logies (Coralville, IA) como um conjunto de oligonucleotídeos de sobre- posição de até 80 pares de base (pb) de comprimento. Para gerar uma biblioteca de mutantes diversos do ECD, os oligonucleotídeos continha códons degenerados desejados, tais como conjuntos de base mistos es- pecíficos para codificar várias substituições de aminoácido, nas posições de aminoácido desejadas. Códons degenerados foram gerados usando um algoritmo na URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/.
[00567] Em geral, posições para mutar e degenerar códons foram escolhidas de modelos de homologia (ICOSL) dos pares de alvo- ligante de interesse para identificar resíduos de contato de ligante, tais como resíduos de cadeia lateral-alvo que interagem com o ligante, bem como resíduos que estão na interface de interação de proteína. Esta análise foi realizada usando um visualizador de estrutura disponí- vel em URL: spdbv.vital-it.ch).
[00568] A próxima etapa em projeto de biblioteca foi o alinhamento de sequências de ICOSL humanas, de camundongo, rato e macaco para identificar resíduos conservados. Com base nesta análise, resí- duos alvo conservados foram mutados com códons degenerados que especificavam apenas mudanças de aminoácido conservativas mais o resíduo do tipo selvagem. Resíduos que não foram conservados foram mutados mais agressivamente, mas também incluíam o resíduo do tipo selvagem. Códons degenerados que também codificavam o resí- duo do tipo selvagem foram também implantados para evitar mutagê- nese excessiva de proteína alvo. Pela mesma razão, apenas até 20 posições foram direcionadas para mutagênese de uma vez. Esses re- síduos eram uma combinação de resíduos de contato e resíduos de interface de não contato.
[00569] Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em água estéril, misturados em razões equimolares, aquecidos para 95º C por cinco minutos e lentamente esfriados para a temperatura ambiente para anelamento. Primers de oligonucleotídeo específicos de ECD que ane- laram para o início e final dos ECDs, respectivamente, foram então usados para gerar produto de PCR. Oligonucleotídeos específicos de ECD que se sobrepunham 40-50 pb com uma versão modificada de vetor de clonagem pBYDSO03 (Life Technologies, USA), além de e in- cluindo os sítios de clonagem BamH1 e Kpn1 foram então usados para amplificar 100 ng de produto de PCR da etapa anterior para gerar um total de 5 ug de DNA. Ambas as PCR's eram por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando OneTaq 2x PCR máster mix (New England Biolabs, USA). Os segundos produtos de PCR foram purificados usan- do um kit de purificação de PCR (Qiange, Alemanha) e ressuspensos em água deionizada estéril.
[00570] Para preparar inserção em biblioteca, uma versão de exibi- ção de levedura modificada de vetor pBYDSO03 foi digerida com enzi- mas de restrição BamHI e Kpnl (New England Biolabs, USA) e o frag- mento de vetor grande foi purificado com gel e dissolvido em água deionizada, estéril. DNA pronto para eletroporação para a etapa se- guinte foi gerado misturando 12 ug de DNA de biblioteca para cada eletroporação com 4 ug de vetor linearizado em um volume total de 50 ul de água deionizada e estéril. Um modo alternativo de gerar bibliote- cas direcionadas era realizar mutagênese direcionada a sítio (Multisite kit, Agilent, USA) do ECD alvo com oligonucleotídeos contendo códons degenerados. Esta abordagem foi usada para gerar sub-bibliotecas que se direcionam a apenas extensões de proteína alvo para mutagê- nese. Nesses casos, sub-bibliotecas foram misturadas antes de pros- seguir para as etapas de seleção. Em geral, os tamanhos da biblioteca estavam na faixa de 10E7 a 10E8 clones, exceto que as sub- bibliotecas estavam apenas na faixa de 10E4 a 10E5. Bibliotecas e sub-bibliotecas grandes são geradas para ICOSL.
B. Bibliotecas Aleatórias
[00571] Bibliotecas aleatórias foram também construídas para iden- tificar variantes do ECD de ICOSL mostrado na SEQ ID NO:32 con-
tendo o domínio ECD. DNA codificando o ECD do tipo selvagem foi clonado entre os sítios de restrição BamHI e Kpnl de vetor de exibição de levedura modificado pBYDSO03. O DNA foi então mutagenizado com o kit Genemorph Il (Agilent, USA) para a gerar uma média de três a cinco mudanças de aminoácido por variante de biblioteca. DNA muta- genizado foi então amplificado através de PCR de duas etapas e pro- cessado mais como acima descrito para bibliotecas direcionadas. EXEMPLO 2 Introdução de Bibliotecas de DNA em Levedura
[00572] O Exemplo 2 descreve a introdução de bibliotecas de DNA de ICOSL em levedura.
[00573] Para introduzir DNA de biblioteca degenerado e aleatório em levedura, células competentes em eletroporação de cepa de leve- dura BJ5464 (ATCC.org; número ATCC 208288) foram preparadas e eletroporadas em Gene Pulser Il (Biorad, USA) com o DNA pronto pa- ra eletroporação a partir da etapa acima essencialmente como descrito (Colby, D.W. e outros 2004 Methods Enzymology 388, 348-358). À única exceção é que células transformadas foram cultivadas em meio SCD-Leu seletivo mínimo de não indução para acomodar o marcador selecionável LEU2 carregado pelo plasmídeo pBYDSO03. Um litro de meio SCD-Leu consiste em 14,7 gramas de citrato de sódio, 4,29 gra- mas de monoidrato de ácido cítrico, 20 gramas de dextrose, 6,7 gra- mas de base de nitrogênio de levedura e 1,6 grama de suplemento de meio drop-out sintético de levedura sem leucina. O Meio foi filtrado es- terilizado antes do uso usando um dispositivo de filtro a vácuo de 0,22 um.
[00574] O tamanho da biblioteca foi determinado plaqueando dilui- ções seriais de células recém-recuperadas em placas de ágar SCD- Leu e então extrapolando o tamanho da biblioteca do número de colô- nias simples e plaqueamento que geraram pelo menos 50 colônias por placa. Em geral, os tamanhos da biblioteca variaram de transformante 10E8 a 10E9 com base nesse ensaio de diluição. O restante da cultura eletroporada foi cultivado para saturação em SCD-Leu e células desta cultura foram subculturadas (por exemplo, 1/100) no SCD-Leu fresco mais uma vez para minimizar a fração de células não transformadas. Para manter a diversidade da biblioteca, esta etapa de subcultura foi realizada usando um inóculo que continha pelo menos 10x mais célu- las do que o tamanho da biblioteca calculado. Células da segunda cul- tura saturada foram ressuspensas em meio fresco contendo glicerol estéril 25% (peso/volume) para uma densidade de 10E10/ml e conge- ladas e armazenadas a -80º C (estoque de biblioteca congelado).
[00575] O tamanho da biblioteca foi determinado plaqueando dilui- ções de células recém-recuperadas em placas de ágar SCD-Leu e en- tão extrapolando o tamanho da biblioteca do número de colônias sim- ples de um plaqueamento para gerar pelo menos 50 colônias por pla- ca.
[00576] Para segregar plasmídeo de células que contêm dois ou mais clones de biblioteca diferentes, várias células correspondendo a vezes o tamanho da biblioteca foram obtidas da cultura de SCD- Leu de um dia para o outro e subculturadas 1/100 em meio SCD-Leu fresco e cultivadas de um dia para o outro. As células desta cultura de um dia para o outro foram ressuspensas em glicerol estéril 25% (pe- so/volume) para uma densidade de 10E10/ml e congeladas a -80º C (estoque de biblioteca congelado). EXEMPLO 3 Seleção de Levedura
[00577] O Exemplo 3 descreve a seleção de variantes com afinida- de modificada de expressão de levedura de ICOSL.
[00578] Várias células iguais a pelo menos 10 vezes o tamanho da biblioteca foram descongeladas de estoques de biblioteca individuais,
suspensas em 0,1 x 10E6 células/ml em meio SCD-Leu de não indu- ção e cultivadas de um dia para o outro. No dia seguinte, várias célu- las iguais a 10 vezes o tamanho da biblioteca foram centrifugadas a 2000 RPM por dois minutos e ressuspensas para 0,5 x 10E6 célu- las/ml em meio SCDG-Leu de indução. Um litro do meio de indução SCDG-Leu consistia em 5,4 gramas de Na2HPOaa, 8,56 gramas de NaH2PO4ºH20, 20 gramas de galactose, 2,0 gramas de dextrose, 6,7 gramas de base de nitrogênio de levedura Difco e 1,6 grama de drop- out media sintético de levedura suplementado sem leucina dissolvido em água e esterilizado através de um dispositivo de filtro de membrana de 0,22 um. A cultura foi cultivada por dois dias a 20º C para induzir expres- são de proteínas de biblioteca na superfície da célula de levedura.
[00579] As células foram processadas com esferas magnéticas pa- ra reduzir não ligantes e enriquecer em todas as variantes de ICOSL com a habilidade em se ligar a suas proteínas de contraestrutura re- combinantes exógenas. Isso foi então seguido por duas ou três roda- das de separação de citometria de fluxo usando tingimento de proteína de contraestrutura exógena para enriquecer a fração de células de le- vedura que exibe ligantes aperfeiçoados. Enriquecimento e seleções de esfera magnética através de citometria de fluxo são essencialmente como descrito em Keith D. Miller, 1 Noah B. Pefaur,2 e Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, Julho de 2008.
[00580] Com bibliotecas de ICOSL, proteínas ligantes alvo foram obtidas da R&D Systems (USA) como segue: rCD28.Fc humano (isto é, proteína de fusão CD28-Fc recombinante), rCTLA4.Fc e riICOS.Fc. Esferas de estreptavidina magnéticas foram obtidas da New England Biolabs, USA. Para biotinilação de proteína de contraestrutura, o kit de biotinilação No. 21955, Life Technologies, USA, foi usado. Para sepa- ração citométrica de fluxo, para duas cores, um separador Becton Dickinson FACS Aria Il foi usado. Níveis de exibição de ICOSL foram monitorados com um anticorpo anti-hemaglutinina marcado com Ale- xafluor 488 (Life Technologies, USA). Proteínas de fusão de Fc de li- gação de ligante rCD28.Fc, rCTLA4.Fc ou rlICOS.Fc foram detectadas com Fab de cabra específico para Ig humana conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch, USA). Leveduras em dupleto foram desa- tivadas usando parâmetros de dispersão para a frente (FSC)/dispersão lateral (SSC), e portas de separação foram baseadas em ligação de ligante maior detectada em FL4 que possuía ligação de expressão de marcador mais limitada em FL1.
[00581] “Resultados de levedura das separações citométricas de fluxo foram ensaiadas quando à afinidade de ligação específica maior. Leveduras de resultado de separação foram expandidas e novamente induzidas para expressar as variantes de domínio com afinidade modi- ficada IQgSF particulares que elas codificam. Esta população pode então ser comparada com a linhagem de levedura do tipo selvagem, parental, ou quaisquer outros resultados selecionados, tal como a população de levedura de resultado de esfera, através de citometria de fluxo.
[00582] Para ICOSL, os segundos resultados de separação (F2) foram comparadas com levedura de ICOSL parental quanto à ligação de cada rICOS.Fc, rCD28.Fc e roCTLA4.Fc através de tingimento duplo de cada população com expressão de marcador anti-HA (hemaglutini- na) e o Fc anti-humano secundário para detectar ligação de ligante.
[00583] No caso de variantes de levedura de ICOSL selecionadas quanto à ligação a ICOS, os resultados de separação de F2 fornece- ram valores de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de 997, quando tingidas com rICOS.Fc 5,6 nM, enquanto a MFI de linhagem de ICOSL parental foi medida em 397 quando tingida com a mesma concentração de rlICOS.Fc. Isso representa um aperfeiçoamento mais ou menos de três vezes da ligação média neste grupo de clones sele- cionados F2 e é previsto que clones individuais deste grupo terão
MFI/afinidade muito melhor quando individualmente testados.
[00584] No caso de variantes de levedura de ICOSL selecionadas para ligação a CD28, os resultados de separação de F2 proveram os valores de MFI de 640 quando tingidas com rCD28.Fc 100 nM, en- quanto a MFI da linhagem de ICOSL parental foi medida a 29 quando tingida com a mesma concentração de rCD28.Fc (melhora de 22 ve- zes). No caso de variantes de levedura de ICOSL selecionadas para ligação a CTLA-A4, os resultados de separações de F2 proveram valo- res de MFI de 949 quando tingidas com rCTLA4.Fc 100 nM, enquanto a MFI da linhagem de ICOSL parental foi medida em 29 quando tingi- da com a mesma concentração de rCTLA4.Fc (melhora de 32 vezes).
[00585] — Importante, as MFls de todas os resultados de F2 descritas acima quando medidas com o anticorpo marcador anti-HA em FL1 não aumentaram e algumas vezes diminuíram comparado com as linha- gens do tipo selvagem, indicando que ligação aumentada não era uma função de expressão aumentada das variantes selecionadas na super- fície de levedura, e validaram estratégias de gating para apenas sele- cionar expressões meios a baixo com ligação de ligante alta.
[00586] Domínios ECD de ICOSL variante selecionados foram for- matados mais como proteínas de fusão e testados quanto à ligação e atividade funcional como descrito abaixo. EXEMPLO 4 Reformatação de Resultados de Seleção como Fusões de Fc e em Vários Tipos de Proteína Imunomoduladora
[00587] O Exemplo 4 descreve reformatação de resultados de sele- ção identificados no Exemplo 3 como proteínas imunomoduladoras contendo um domínio extracelular (ECD) com afinidade modificada (variante) de ICOSL fundido a uma molécula de Fc (moléculas de fu- são de ECD variante-Fc).
[00588] Células de resultados de separações de ICOSL citométri-
cas de fluxo finais foram cultivadas para densidade terminal em meio SCD-Leu. DNA de plasmídeo de cada resultado foi isolado usando um kit de isolamento de DNA de plasmídeo de levedura (Zymo Research , USA). Para fusões de Fc, primers de PCR com sítios de restrição adi- cionados adequados para clonagem no vetor de fusão de Fc de esco- lha foram usados para amplificar em batelada a partir das preparações de DNA de plasmídeo os DNA's de codificação para os ECD's alvo mutantes. Após digestão por restrição, os produtos de PCR foram |i- gados em um vetor de fusão de Fc apropriado seguido por transforma- ção química em linhagem XL1 Blue de E. coli (Agilent, USA) ou NEB5alpha (New England Biolabs, USA) como orientado pelo forne- cedor. Exemplar de um vetor de fusão de Fc é pFUSE-hIgG1-Fc2 (In- vivogen, USA).
[00589] Diluições de reações de transformação foram plaqueadas em ágar LB contendo 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, USA) para gerar colônias simples. Até 96 colônias de cada transformação foram então cultivadas em placas de 96 cavidades até saturação de um dia para o outro a 37º C em caldo LB (No. cat. Teknova L8112) e uma alí- quota pequena de cada cavidade foi submetida a sequenciamento de NDA do inserto de ECD a fim de identificar a(s) mutação(ões) em to- dos os clones. Preparação de amostra para sequenciamento de DNA foi realizada usando protocolos providos pelo provedor do serviço (Genewiz; South Plainfield, NJ). Após remoção de amostra para se- quenciamento de DNA, glicerol foi então adicionado às culturas restan- tes para um teor de glicerol final de 25% e as placas foram armazena- das a -20º C para uso futuro como placas máster (vide abaixo). Alter- nativamente, amostras para sequenciamento de DNA foram geradas através de plaqueamento de réplica a partir de culturas líquidas de cul- tivo sobre placas de ágar sólido usando um replicador de 96 cavidades descartável (VWR, USA). Essas placas foram incubadas de um dia para o outro para gerar fragmentos de crescimento e as placas foram submetidas a Genewiz para sequenciamento de DNA seguindo suas especificações. Em alguns casos, ressequenciamento foi realizado pa- ra verificar mutações.
[00590] — Após análise dos dados de sequenciamento de DNA gera- dos por Genewiz, clones de interesse foram recuperados da placa máster e individualmente cultivados para saturação em 5 ml de caldo LB líquido contendo 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, USA) e 2 ml de cada cultura foram então usados para preparação de aproximada- mente 10 ul de DNA de plasmídeo miniprep de cada clone usando um kit padrão tal como o Pureyiel kit (Promega, USA). Identificação de clones de interesse geralmente envolvia as etapas que seguem. Pri- meiro, arquivos de dados de sequência de DNA foram baixados do website da Genewiz. Todas as sequências foram então manualmente organizadas de modo que elas começavam no início da região de co- dificação de ECD. As sequências organizadas foram então traduzidas em batelada usando um programa adequado disponível em URL: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss transeq/. As sequências traduzidas foram então alinhadas usando um programa adequado disponível na URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Alternativamente, as sequências Genewiz foram processadas para gerar alinhamentos usando software Ugene (http://ugene.net).
[00591] Clones de interesse foram então identificados usando os critérios que seguem: 1) clone idêntico ocorre pelo menos duas vezes no alinhamento e 2) uma mutação ocorre pelo menos duas vezes no alinhamento e preferivelmente em clones distintos. Clones que satisfa- zem pelo menos um desses critérios foram clones que foram enrique- cidos pelo processo de separação devido à ligação aperfeiçoada.
[00592] Para gerar proteínas imunomoduladoras recombinantes que são proteínas de fusão de Fc contendo um ECD ou ICOSL com pelo menos um domínio com afinidade modificada (por exemplo, ECD ICOSL variante-Fc), a molécula de ácido nucleico de codificação foi gerada para codificar uma proteína designada como segue: peptídeo de sinal seguido por ECD de ICOSL variante (mutante) seguido por um ligante de três alaninas (AAA) seguido por um Fc IgG1 humana con- tendo a mutação N82G com referência a Fc IgG1 humana do tipo selva- gem mostrado em SEQ ID NO:226 (correspondendo a N297G pela nu- meração EU). Este Fc exemplar também continha mutações de cisteína de estabilização R77C e V87C e substituição do resíduo cisteína para um resíduo serina na posição 220 (C2208S) pela numeração EU (correspon- dendo à posição 5 (CS5) com referência a Fc I9gG1 humana do tipo sel- vagem mostrado na SEQ ID NO:226 (correspondendo a R292C, V302C e C2208S, respectivamente, pela numeração EU). Em alguns casos, o sítio de clonagem Notl que contribui para a sequência de ligante AAA foi deletado para gerar uma fusão direta do ECD ICOSL e o início do Fc. Uma vez que o construto não inclui quaisquer cadeias leve de anticorpo que podem formar uma ligação covalente com uma cisteína, o Fc I9G1 humana também contém substituição dos resíduos cisteína para um resíduo serina na posição 5 (CS5) comparado com o Fc do tipo selva- gem ou não modificado mostrado na SEQ ID NO:226. EXEMPLO 5 Expressão e Purificação de Fusões de Fc
[00593] O Exemplo 5 descreve a expressão e a purificação de alto rendimento de proteínas de fusão de Fc contendo ICOSL ECD varian- te como descrito nos Exemplos acima.
[00594] Proteínas de fusão de Fc variantes recombinantes foram produzidas a partir de células de rim embriônicas humanas (HEK) 293 adaptadas para suspensão usando o sistema de expressão Expi293 (Invitrogen, USA). 4 ug de cada DNA de plasmídeo da etapa anterior foram adicionados a 200 ul de Opti MEM (Invitrogen, USA) ao mesmo tempo que 10,8 ul de ExpiFectamine foram adicionados separadamen- te a outros 200 ul de Opti-MEM. Após 5 minutos, os 200 ul de DNA de plasmídeo foram misturados com os 200 ul de ExpiFectamine e foram incubados mais por mais 20 minutos antes da adição desta mistura a células. Dez milhões de células Expi293 foram despejadas em cavida- des separadas de uma placa de crescimento de 24 cavidades fundas, de fundo cônico, 10 ml estéril (Thomson Instrument Company, USA) em um volume de 3,4 ml de meio Expi293 (Invitrogen, USA). As placas foram agitadas por 5 dias a 120 RPM em uma incubadora de cultura de célula de mamífero ajustada para 95% de umidade e 8% de CO;>. Seguindo uma incubação de 5 dias, as células foram peletizadas e os sobrenadantes de cultura foram retidos.
[00595] Proteínas foram purificadas de sobrenadantes usando um kit de purificação Proteína Ade 96 cavidades de alto rendimento (Nú- mero de catálogo 45202, Life Technologies, USA). Frações de eluição resultantes tiveram o tampão trocado para PBS usando placa de des- salinização giratória de 96 cavidades (Número de catálogo 89807, Life Technologies, USA) usando o protocolo do fabricante. Proteína purifi- cada foi quantificada usando absorbância de 280 nm medida pelo ins- trumento Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, USA) e a pureza da pro- teína foi avaliada através de carregamento de 5 ug de proteína em géis de poliacrilamida, pré-fundidos NUPAGE (Life Technologies, USA) sob condições de desnaturação e redução e subsequente eletro- forese em gel. As proteínas foram visualizadas em gel usando tingi- mento com Coomassie padrão. EXEMPLO 6 Avalição de Ligação e Atividade de Moléculas Contendo Domínio IgSF de Afinidade Amadurecida A. Ligação a Contraestruturas Expressas em Célula
[00596] Esse Exemplo descreve estudos de ligação de fusão de Fc de proteínas purificadas dos Exemplos acima para avaliar especifici- dade e afinidade de proteínas imunomoduladoras variantes de domínio ICOSL com contrapartes de ligação cognatas.
[00597] — Para produzir células expressando contrapartes de ligação cognatas, construtos de expressão de superfície de mamífero de com- primento integral para cada CD28 humana e ICOS foram projetados em vetor de expresso pcDNA3.1 (Life Technologies) e obtidos da Genscript, USA. Estudos de ligação foram realizados em células HEK293 transfectadas geradas para expressar os ligantes de superfí- cie de mamífero de comprimento integral usando o sistema de trans- fecção transiente (Life Technologies, USA) descrito acima. Como um controle, ligação a células falsas (não transfectadas) foi também avali- ada. O número de células necessário para o experimento foi determi- nado, e a escala de 30 ml apropriada de transfecção foi realizada usando o protocolo sugerido pelo fabricante. Para cada transfecção de CD28, ICOS ou falsa de 30 ml, 75 milhões de células Expi293F foram incubadas com 30 ug de DNA de construto de expressão e 1,5 ml de reagente ExpiFectamine 293 diluído por 48 horas, ponto no qual célu- las foram coletadas para tingimento.
[00598] Para tingimento através de citometria de fluxo, 200.000 cé- lulas de transfecção transiente apropriadas ou controle negativo (falso) foram plaqueadas em placas de fundo redondo de 96 cavidades. As células foram submetidas a movimento de rotação para baixo e res- suspensas em tampão de tingimento (PBS (solução salina tamponada com fosfato), BSA 1% (albumina de soro bovino) e azida de sódio 0,1%) por 20 minutos para bloquear ligação não específica. Em segui- da, as células foram centrifugadas novamente e ressuspensas em tampão de tingimento contendo proteína imunomoduladora variante 100 nM a 1 NM, dependendo do experimento de cada proteína de fu- são de variante de CD80 Fc, variante de ICOSL Fc ou variante de
IgSF empilhada Fc candidata em 50 ul. Tingimento primário foi reali- zado em gelo por 45 minutos, antes da lavagem das células em tam- pão de tingimento duas vezes. Fc anti-humano conjugado a PE (Jack- son ImmunoResearch, USA) foi diluído 1:150 em 50 ul de tampão de tingimento e adicionado a células e incubado por mais 30 minutos em gelo. Anticorpo secundário foi retirado com lavagem duas vezes, as células foram fixadas em formaldeído 4%/PBS e as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, USA) ou um citômetro de fluxo Hypercyt (Intellicyte, USA).
[00599] Intensidade de Fluorescência Média (MFI) foi calculada pa- ra cada linhagem parental transfectantes e negativa com software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, USA) ou um citômetro de fluxo Hypercyt (Intellicyte, USA). B. Caracterização de Bioatividade
[00600] Esse exemplo descreve ainda caracterização de bioativida- de de proteína variante de fusão de Fc em ensaios in vitro de célula T primária humana.
1. Reação de Linfócitos Mistos (MLR)
[00601] Bioatividade de rICOSL.Fc solúvel foi testada em uma Rea- ção de Linfócitos Mistos (MLR) humana. Células dendríticas primárias humanas (DC) foram geradas através de cultura de monócitos isola- dos de PBMC (BenTech Bio, USA) in vitro por 7 dias com 500U/ml de riL-4 (R&D Systems, USA) e 250U/ml de rGM-CSF (R&D Systems, USA) em meio Ex-vivo 15 (Lonza, Suíça). 10.000 DC maduras e
100.000 células T CD4+ alogeneicas purificadas (BenTech Bio, USA) foram coculturadas com proteínas de fusão de Fc variantes e controles em placas de fundo redondo de 96 cavidades em volume final de 200 um de meio Ex-Vivo 15. No dia 5, secreção de IFN-gama em sobrena- dantes de cultura foi analisada usando o Human IFN-gamma Duoset ELISA kit (R&D Systems, USA). A densidade óptica foi medida através do VMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, USA) e quanti- ficada contra padrão de rIFN-gama titulado incluído no IFN-gamma Duo-set kit (R&D Systems, USA). Um segundo protocolo de MLR con- sistia em células dendríticas (DC) primárias humanas geradas através de cultura de monócitos isolados de PBMC (BenTech Bio, USA) in vi- tro por 7 dias com 50 ng/mL de riL-4 (R&D Systems, USA) e 80 ng/mL de rGM-CSF (R&D Systems, USA) em meio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suí- ça). Nos dias 3 e 5, metade dos meios foi removida e substituída com meio fresco contendo 50 ng/mL de rIlL-4 e 80 ng/ml de rGM-CSF. Pa- ra induzir maturação completamente, lipopolissacarídeo (LPS) (Invi- voGen Corp., USA) foi adicionado a 100 ng/mL às culturas de DC no dia 6 e as células foram incubadas por mais 24 horas. Aproximada- mente 10.000 DC maduras e 100.000 células T CD3+ alogeneicas pu- rificadas (BenTech Bio, USA) foram coculturadas com proteínas de fusão de ICOSL variantes e e controles em placas de fundo redondo de 96 cavidades em volume final de 200 ul de meio Ex-Vivo 15. Nos dias 4-5, secreção de IFN-gama em sobrenadantes de cultura foi ana- lisada usando o Human IFN-gamma Duoset ELISA kit (R&D Systems, USA). Densidade óptica foi medida em uma BioTek Cytation Multimo- de Microplate Reader (BioTek Corp., USA) e quantificada contra pa- drão de rIFN-gama titulado no IFN-gamma Duo-set kit (R&D Systems, USA).
2. Ensaio de Coimobilização Anti-CD3
[00602] Bioatividade coestimuladora de variantes de fusão de ICOSL foi determinada em ensaios de coimobilização anti-CD3. 1 nM ou 10 nM de CD3 anti-humano (OKT3, Biolegends, USA) foram diluí- dos em PBS com 1 nM a 80 nM de proteínas variantes rICOSL.Fc. Es- ta mistura foi adicionada a placas de 96 cavidades de fundo plano tra- tadas com cultura (Cornin, USA) de um dia para o outro para facilitar aderência das proteínas estimuladoras às cavidades da placa. No dia seguinte, proteína não ligada foi retirada com lavagem das placas e
100.000 células T pan humanas purificadas (BenTech Bio, USA) ou clone de célula T human BC3 (Astarte Biologics, USA) foram adiciona- das a cada cavidade em um volume final de 200 ul de meio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suíça). Em alguns casos, células T pan humanas foram mar- cadas com 0,25 uM de succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE, ThermoFisher Scientific, USA). As células foram culturadas 3 dias antes da coleta de sobrenadantes de cultura e medição dos níveis de IFN-gama humana com Duoset ELISA kit (R&D Systems, USA) como mencionado acima. Proliferação celular foi determinada pela porcentagem de células alimentadas que entraram em divisão confor- me medido por diluição de CFSE em célula tingida com anticorpos an- ti-CDA4, anti-CD8 fluorescentemente conjugados (BD, USA) ou células T totais através de análise citométrica de fluxo em um LSR 1l (BD, USA).
C. Resultados
[00603] Os resultados para os estudos de ligação e atividade para variantes testadas exemplares são mostrados na Tabela 7 que indica substituições de aminoácido de domínio I9SF exemplares (substitui- ções) no ECD de ICOSL selecionado na avaliação quanto à maturação em afinidade contra as respectivas estruturas cognatas ICOS e CD28. Nas Tabelas, as substituições de aminoácido exemplares são planeja- das pelo número de posição de aminoácido correspondendo à respec- tiva sequência de ECD não modificada de referência como segue. Por exemplo, a sequência de ECD não modificada de referência na Tabela 7 (ICOSL WT) é a sequência de ECD ICOSL (por exemplo, não modi- ficada) mostrada na SEQ ID NO:32. A posição de aminoácido é indi- cada no meio, com o aminoácido de referência (por exemplo, não mo- dificado ou do tipo selvagem) correspondente listado antes do número e a substituição de aminoácido variante identificada após o número. À
Coluna 2 mostra o identificador de SEQ ID NO. para o ECD variante para cada molécula de fusão de ECD-Fc variante.
[00604] É também mostrada a atividade de ligação conforme medi- do pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para liga- ção de cada molécula de fusão de Fc variante a células transfectadas para expressar o ligante cognato e a razão da MFI comparado com a ligação da molécula de fusão de ECD-Fc de referência (por exemplo, não modificada) correspondente não contendo a(s) substituição(ões) de aminoácido para o mesmo ligante de contraestrutura expressa na célula. A atividade funcional das moléculas de fusão de Fc variantes para modular a atividade de células T é também mostrada com base nos níveis calculados de IFN-gama em sobrenadantes de cultura (pg/ml) gerados ou i) com a molécula de fusão de ECD-Fc variante in- dicada coimobilizada com anti-CD3 ou ii) com a molécula de fusão de ECD-Fc variante indicada em um ensaio de MLR. A Tabela também mostra a razão de IFN-gama produzido por cada ECD-Fc variante comparado com a ECD-Fc de referência (por exemplo, não modificada ou do tipo selvagem) correspondente em ambos os ensaios funcio- nais.
[00605] Como mostrado, as seleções resultaram na identificação de várias variantes de domínio IISF ICOSL que eram de afinidade modificada para exibir ligação aumentada a pelo menos um, e em al- guns casos mais de um, ligante de contraestrutura cognato. Ainda, os resultados mostraram que modificação de afinidade das moléculas va- riantes também exibiu atividades aperfeiçoadas para ambos aumento e/ou diminuição de atividade imunológica dependendo do formato da molécula. Por exemplo, coimobilização do ligante provavelmente provê uma interação multivalente com a célula para agrupar ou aumentar a avidez para favorecer atividade agonista e aumentar a ativação de cé- lula T comparado com a molécula de EDC-Fc de referência (por exemplo, não modificada ou do tipo selvagem) não contendo a(s) substituição(ões) de aminoácidos.
No entanto, quando a molécula é provida como uma molécula Fc bivalente em solução, as mesmas va- riantes de domínio IgSF exibiram uma atividade antagonista para dimi- nuir ativação de célula T comparado com a molécula ECD-Fc de refe- rência (por exemplo, não modificada ou do tipo selvagem) não conten- do a(s) substituição(ões) de aminoácido.
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[00606] Ensaios de ligação foram substancialmente repetidos como acima descrito, exceto que ligação também foi avaliada contra células expressando CTLA-4 humana de comprimento integral. Proteínas de fusão de Fc variantes ICOSL foram também avaliadas em um ensaio de coimobilização anti-CD3 substancialmente como descrito acima. Os resultados confirmaram identificação de várias variantes de domínio IgSF ICOSL que exibiram afinidade de ligação aumentada com pelo menos um, e em alguns casos mais de um, ligante cognato. Ainda, os resultados mostraram que modificação de afinidade das moléculas va- riantes também exibiu atividades aperfeiçoadas no ensaio de coimobi- lização. EXEMPLO 7 Domínios IgSF com Afinidade Modificada Adicionais
[00607] Esse exemplo descreve o projeto, criação e avaliação de proteínas imunomoduladoras CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e NKp3 com afinidade modificada adicionais, que são outros componentes da si- napse imune (IS) que demonstraram papel duplo em ambas ativação e inibição imune. Esses exemplos demonstram que modificação de afi- nidade de domínios IgSF provê proteínas que podem agir para ambos aumentar e diminuir atividade imunológica. Este trabalho também des- creve as várias combinações desses domínios fundidos em pares (isto é, empilhados) com um ICOSL com afinidade modificada variante para formar uma proteína imunomoduladora do Tipo Il para obter atividade imunomoduladora.
[00608] Construtos de DNA mutantes de domínios IgSF CDB80, CD86 e NKp30 para tradução e expressão como bibliotecas de exibi- ção de levedura foram gerados substancialmente como descrito no Exemplo 1. Para bibliotecas que se direcionam a resíduos específicos de proteína alvo para aleatorização completa ou parcial com códons degenerados, os DNA's de codificação para os domínios extracelula-
res (ECD) de CD80 humana (SEQ ID NO:28) e NKp30 (SEQ ID NO:54) foram encomendados para Integrated DNA Technologies (Co- ralville, IA) como um conjunto de oligonucleotídeos de sobreposição de até 80 pares de base (pb) de comprimento. Alternativamente, os resí- duos foram mutados por mutagênese direcionada direcionada a sítio substancialmente como descrito no Exemplo 1. Alternativamente, bi- bliotecas aleatórias foram construídas para identificar variantes do ECD de CD80 (SEQ ID NO:28, CD86 (SEQ ID NO:29) e NKp30 (SEQ ID NO:54) substancialmente como descrito no Exemplo 1.
[00609] O DNA da biblioteca direcionada e aleatória foi introduzido em levedura substancialmente como descrito no Exemplo 2 para gerar bibliotecas de levedura. As bibliotecas foram usadas para selecionar levedura expressando variantes com afinidade modificada de CD80, CD86 e NKp30 substancialmente como descrito no Exemplo 3. As cé- lulas foram processadas para reduzir não ligantes e enriquecer em va- riantes de CD80, CD86 ou NKp30 com a habilidade em ligar suas pro- teínas de contraestrutura recombinantes exógenas substancialmente como descrito no Exemplo 3. Por exemplo, leveduras que exibiram bi- bliotecas de CD80 direcionadas ou aleatórias foram selecionadas con- tra cada uma de CD28, CTL-4 e PD-L1, separadamente. Isso foi então seguido por duas a três rodadas de separação citométrica de fluxo usando tingimento de proteína de contraestrutura exógena para enri- quecer a fração de células de levedura que exibe ligantes aperfeiçoa- dos. Enriquecimento de esfera magnética e seleções através de cito- metria de fluxo são essencialmente como descrito em Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 e Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry
4.7.1-4.7.30, Julho de 2008.
[00610] Com bibliotecas de CD80, CD86 e NKp30, proteínas ligan- tes alvo foram obtidas da R&D Systems (USA) como segue: rCD28.Fc humana (i.e., proteína de fusão CD28-Fc recombinante), rPDL1.Fc,
rCTLA4.Fc e rB7H6.Fc. Citometria de fluxo de duas cores foi realizada substancialmente como descrito no Exemplo 3. Resultados de levedu- ra das separações citométricas de fluxo foram ensaiadas quanto à afi- nidade de ligação específica maior. Levedura de resultado de separa- ção foram expandidas e novamente induzidas para expressar as vari- antes de domínio com afinidade modificada IgSF particulares que elas codificam. Esta população pode então ser comparada com a linhagem de levedura do tipo selvagem, parental, ou quaisquer outros resultados selecionados, tal como a população de levedura de resultado de esfe- ra, através de citometria de fluxo.
[00611] No caso de variantes de levedura NKp30 selecionadas quanto à ligação a B7-H6, os resultados de separação de F2 forneceu valores MFI de 533 quando tingida com rB7H6.Fc 16,6Nm, enquanto a MF! de linhagem NKp30 foi medida em 90 quando tingida com a mes- ma concentração de rB7H6.Fc (melhora de 6 vezes).
[00612] Dentre as variantes de NKp30 que foram identificadas esta- va uma variante que continha mutações L30V/AGOV/S64P/S86G com referência às posições no domínio extracelular NKp30 correspondendo às posições mostradas em SEQ ID NO:54. Dentre as variantes de CD86 que foram identificadas estava uma variante que continha muta- ções Q35H/H90L/Q102H com referência a posições no domínio extra- celular CD86 correspondendo às posições mostradas na SEQ ID NO:29. Dentre as variantes de CD80 que foram identificadas estavam variantes mostradas na Tabela 8 e descritas mais abaixo.
[00613] “Como com ICOSL, as MFIs de todos os resultados de F2 descritas acima quando medidas com o anticorpo marcador anti-HA em FL1 não aumentaram e algumas vezes diminuíram comparado com linhagens do tipo selvagem, indicando que ligação aumentada não foi uma função de expressão aumentada das variantes seleciona- das na superfície de levedura, e validou estratégias de gating de ape-
nas seleção de expressores médios a baixos com ligação a ligante al- ta.
[00614] Resultados de seleção exemplares foram reformatados como proteínas imunomoduladoras contendo um domínio extracelular (ECD) variante com afinidade modificada de CD80 fundido a uma mo- lécula Fc (ECD variante-moléculas de fusão de Fc) substancialmente como descrito no Exemplo 4 e a proteína de fusão de Fc foi expressa e purificada substancialmente como descrito no Exemplo 5.
[00615] Ligação de variantes de fusão de Fc de CD80 exemplares a contraestruturas expressas em célula foi então avaliada substancial- mente como descrito no Exemplo 6. Para produzir células expressan- do contrapartes de ligação cognatas, construtos de expressão de su- perfície de mamífero de comprimento integral para cada CD28, CLTA- 4 e PD-L1 humano foram produzidos substancialmente como descrito no Exemplo 6. Estudos de ligação e citometria de fluxo foram realiza- dos substancialmente como descrito no Exemplo 6. Ainda, a bioativi- dade da proteína variante de fusão de Fc foi caracterizada por ou rea- ção de linfócitos mistos (MLR) ou ensaio de coimobilização anti-CD3 como descrito no Exemplo 6.
[00616] Os resultados para os estudos de ligação e atividade para variantes exemplares testadas são mostrados nas Tabelas 8 e 9. Em particular, a Tabela 8 indica substituições de aminoácido de domínio IgSF exemplares (substituições) no ECD de CD80 selecionado na ava- liação quanto à maturação em afinidade contra a respectiva estrutura cognata CD28. A Tabela 9 indica substituições de aminoácido de do- mínio I9SF exemplares (substituições) no ECD de CD80 selecionada na avaliação quanto à maturação em afinidade contra a respectiva es- trutura cognata PD-L1. Como acima, para cada Tabela, as substitui- ções de aminoácido exemplares são projetadas pelo número da posi- ção de aminoácido correspondendo à respectiva sequência de ECD
(por exemplo, não modificada) de referência como segue. Por exem- plo, a sequência de ECD (por exemplo, não modificada) de referência nas Tabelas 8 e 9 é a sequência de ECD de CD80 não modificada mostrada na SEQ ID NO:28. A posição de aminoácido é indicada no meio, com o aminoácido (por exemplo, não modificado) de referência correspondente listado antes do número e a substituição de aminoáci- do variante identificada listada após o número. A Coluna 2 mostra o identificador de SEQ ID NO. para o ECD variante para cada molécula de fusão de ECD variante-Fc.
[00617] É também mostrada a atividade de ligação conforme medi- do pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para liga- ção de cada molécula de fusão de Fc variante a células engenheiradas para expressar o ligante de contraestrutura cognata e a razão da MFI comparado com a ligação da molécula de fusão de Fc-ECD de refe- rência (por exemplo, não modificada) correspondente não contendo a(s) substituição(ões) de aminoácido para o mesmo ligante de contra- estrutura expresso em célula. A atividade funcional das moléculas de fusão de Fc variantes para modular a atividade de células T é também mostrada com base nos níveis calculados de IFN-gama em sobrena- dantes de cultura (pg/ml) gerados ou i) com a molécula de fusão de ECD variante-Fc indicada coimobilizada com anti-CD3 ou ii) com a mo- lécula de fusão de ECD variante-Fc indicada em um ensaio de MLR. As Tabelas também mostram a razão de IFN-gama produzido por ca- da ECD variante-Fccomparado com o Fc-ECD de referência (por exemplo, não modificado) correspondente em ambos os ensaios fun- cionais.
[00618] “Como mostrado, as seleções resultaram na identificação de várias variantes de domínio IgSF de CD80 que tiveram afinidade modi- ficada para exibir ligação aumentada a pelo menos um, e em alguns casos mais de um, ligante de contraestrutura cognata. Ainda, os resul-
tados mostraram que modificação da afinidade das moléculas varian- tes também exibiu atividades aperfeiçoadas para ambos aumentar e diminuir a atividade imunológica dependendo do formato da molécula.
Por exemplo, coimobilização do ligante provavelmente provê uma inte- ração multivalente com a célula para agrupar ou aumentar a avidez para favorecer a atividade agonista e aumentar a ativação de célula T comparado com a molécula de Fc-EDC de referência (por exemplo, não modificada ou do tipo selvagem) não contendo a(s) substitui- ção(ões) de aminoácido.
No entanto, quando a molécula é provida como uma molécula bivalente em solução, as mesmas variantes de domínio IgSF exibiram uma atividade antagonista para diminuir ativa- ção de célula T comparado com a molécula de Fc-ECD de referência (por exemplo, não modificada ou do tipo selvagem) não contendo a(s) substituição(ções) de aminoácido.
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EXEMPLO 8 Geração e Avaliação de Moléculas Empilhadas Contendo Domií- nios com Afinidade Modificada Diferentes
[00619] Esse exemplo descreve proteínas imunomoduladoras adi- cionais que foram geradas como construtos de empilhamento conten- do pelo menos dois domínios com afinidade modificada diferentes de polipeptídeos ICOSL variantes identificados e uma ou mais moléculas CD80, CD86, ICOSL e NKp30 variantes adicionais ligadas juntas e fundidas a um Fc.
[00620] — Moléculas variantes selecionadas descritas acima que tive- ram afinidade modificada para um ou mais ligante de contraestrutura foram usadas para gerar molécula "empilhada" (isto é, proteína imu- nomoduladora Tipo II) contendo dois ou mais domínios I9gSF com afi- nidade modificada. Construtos de empilhamento foram obtidos como blocos de gene (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) que codi- ficam a pilha em um formato que permite sua fusão a Fc através de montagem Gibson padrão usando um Gibson assembly kit (New En- gland Biolabs).
[00621] A molécula de ácido nucleico de codificação de todas as pilhas foi gerada para codificar uma proteína projetada como segue: peptídeo de sinal, seguido pelo primeiro IgV variante de interesse, se- guido por um ligante de 15 aminoácidos que é composto de três moti- vos GGGGS(G4S) (SEQ ID NO:228), seguido pelo segundo I|IgV de interesse, seguido por dois ligantes GGGGS (SEQ ID NO:229) seguido por três alaninas (AAA), seguido por um Fc IgG1 humana como des- crito acima. Para maximizar a chance para dobra correta dos domínios IgV em cada pilha, o primeiro IgV foi precedido por todos os resíduos que normalmente ocorrem na proteína do tipo selvagem entre este IgV e o peptídeo de sinal (primeira sequência). Similarmente, o primeiro IgV foi seguido por todos os resíduos que normalmente o conectam na proteína do tipo selvagem ao ou o domínio lg seguinte (tipicamente um domínio IgC) ou se tal segundo domínio IgV estiver ausente, os resí- duos que o conectam ao domínio de transmembrana (sequência final). O mesmo princípio de projeto foi aplicado ao segundo domínio IgV ex- ceto que quando ambos os domínios IgV foram derivados da mesma proteína parental (por exemplo, um IgV ICOSL empilhado com um ou- tro IQV ICOSL), o ligante entre ambos não foi duplicado.
[00622] A Tabela 10 mostra o projeto para construtos de empilha- mento exemplares. As moléculas de empilhamento exemplares mos- tradas na Tabela 10 contêm os domínios lg (por exemplo, domínio IgV) como indicado e ainda sequências finais como acima descrito. Na Ta- bela, os componentes que seguem estão presentes em ordem: peptí- deo de sinal (SP; SEQ ID NO:225), domínio | Ig (por exemplo, 1g1), sequência final 1 (TS1), ligante 1 (LR1; SEQ ID NO:228), domínio 2 Ig (I920, sequência final 2 (TS2), ligante 2 (LR2; SEQ ID NO:230) e do- mínio Fc (SEQ ID NO:226 contendo substituição de aminoácido C5S/R77C/N82G/V87C). Em alguns casos, uma primeira sequência 1 (LS1) está presente entre o peptídeo de sinal e IgV1 e em alguns ca- sos uma primeira sequência 2 (LS2) está presente entre o ligante e Igv2.
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[00623] Expressão e purificação de alto rendimento das moléculas de fusão de Fc com IgV empilhadas variantes contendo várias combi- nações de domínios I|gV variantes de CD80, CD86, ICOSL ou NKp30 contendo pelo menos um domínio IgV com afinidade modificada foram geradas substancialmente como descrito no Exemplo 5. Ligação das moléculas de fusão de IgV variante-empilhada-Fc com as respectivas contraestruturas e atividade funcional por ensaio de coimobilização anti-CD3 foram também avaliadas substancialmente como descrito no Exemplo 6. Por exemplo, bioatividade coestimuladora das proteínas de fusão de Fc com IgSF empilhadas foi determinada em um ensaio anti- CD3 imobilizado similar como acima. Neste caso, 4 nM de anti-CD3 (OKT3, Biolegend, USA) foram coimobilizados com 4 nM a 120 nM de rB7-H6.Fc (R&D Systems, USA) ou rPD-L1.Fc humano (R&D Systems, USA) de um dia para o outro em placas de 96 cavidades tratadas com cultura de tecido (Corning, USA). No dia seguinte a proteína não ligada foi retirada com lavagem com PBS e 100.000 células T pan purificadas foram adicionadas a cada cavidade em 100 ul de meio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suíça). Os domínios I9SF empilhados foram subsequentemen- te adicionados em uma concentração variando de 8 nM a 40 nM em um volume de 100 ul para volume de 200 ul total. As células foram cul- turadas 3 dias antes da coleta dos sobrenadantes de cultura e medi- ção de níveis de IFN-gama humana com Duoset ELISA kit (R&D Sys- tems, USA) como mencionado acima.
[00624] Os resultados são mostrados nas Tabelas 11-13. Especifi- camente, a Tabela 11 mostra resultados de atividade de ligação e fun- cional para moléculas de fusão de Fc com IgV empilhadas variantes contendo um domínio IgV NKp30 e um domínio IgV ICOSL. As Tabe- las 12 e 13 mostram resultados de atividade de ligação e funcional pa- ra moléculas de fusão de Fc com IgV empilhadas variantes contendo um domínio IgV ICOSL variante e um domínio IgV CD80 ou Igv CD86 variante.
[00625] Para cada uma das Tabelas 11-13, a Coluna 1 indica a or- ganização estrutural e orientação dos domínios com afinidade modifi- cada ou tipo selvagem (WT), empilhados, começando com o domínio amino terminal (terminal N), seguido pelo domínio WT ou com afinida- de modificada médio localizado antes dos domínios Fc IgG1 humana C-terminais. A Coluna 2 mostra o identificador de SEQ ID NO. para a sequência de cada um do domínio IgV contido em uma respectiva mo- lécula "de empilhamento". A Coluna 3 mostra as contrapartes de liga- ção contra as quais os domínios empilhados com afinidade modificada indicados da Coluna 2 foram selecionados.
[00626] É também mostrada a atividade de ligação conforme medi- do pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para liga- ção de cada molécula de empilhamento a células transfectadas para expressar vários ligantes de contraestrutura e a razão da MFI compa- rado com a ligação da molécula de empilhamento correspondente con- tendo domínios IgV de referência (por exemplo, não modificados) não contendo a(s) substituição(ões) de aminoácido para o mesmo ligante de contraestrutura expresso em célula. A atividade funcional das mo- léculas de empilhamento variantes em modular a atividade de células T é também mostrada com base nos níveis calculados de IFN-gama em sobrenadantes de cultura (pg/ml) gerados com a molécula de em- pilhamento variante indicada em solução e o ligante apropriado coimo- bilizado com anti-CD3 como descrito no Exemplo 6. A Tabela também mostra a razão de IFN-gama produzido por cada molécula de empi- lhamento variante comparado com a molécula de empilhamento de referência (não modificada) correspondente no ensaio de coimobiliza- ção.
[00627] Como mostrado, os resultados mostraram que era possível gerar moléculas de empilhamento contendo pelo menos um domínio
IgSF variante que exibia atividade de afinidade modificada de ligação aumentada para pelo menos um ligante de contraestrutura cognata comparado com uma molécula de empilhamento correspondente con- tendo o respectivo domínio IgV de referência (por exemplo, do tipo selvagem ou não modificado). Em alguns casos, a molécula de empi- lhamento, ou de um ou uma combinação de ambos domínios IgSF va- riantes na molécula, exibiu ligação aumentada para mais de um ligante de contraestrutura cognata.
Os resultados também mostraram que a ordem dos domínios IgV nas moléculas empilhadas poderia, em al- guns casos, alterar o grau de atividade de ligação aperfeiçoada.
Em alguns casos, atividade de célula T funcional foi também alterada quando avaliada no ensaio de coimobilização direcionado.
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EXEMPLO 9 Geração e Avaliação de Células Engenheiradas Expressando uma Proteína Imunomoduladora de Transmembrana
[00628] “Foram geradas células T engenheiradas em que uma prote- íÍna imunomoduladora de transmembrana (TIP) contendo um domínio extracelular (ECD) contendo ou uma CD80 variante como acima des- crito ou um domínio IgSF com afinidade modificada de ICOSL foi coe- xpressa com um receptor de antígeno quimérico. A TIP também conti- nha um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico da se- quência de proteína de transmembrana de CD80 ou ICOSL do tipo selvagem. A atividade imunomoduladora das células engenheiradas foi comparada com células que apenas expressavam o CAR ou células que coexpressavam a proteína de transmembrana CD80 ou ICOSL do tipo selvagem correspondente com o CAR.
[00629] A CD80-TIP exemplar era uma CD80 variante tendo um domínio IgSF com afinidade modificada contendo mutações de amino- ácido nos domínios IgV e IgC correspondendo a I167T/L70Q/A91G/ T1208S com referência a posições no domínio extracelular de CD80 mostrado na SEQ ID NO:28 e um domínio de transmembrana e cito- plásmico correspondendo aos resíduos 243-288 de SEQ ID NO:1. A sequência de aminoácido da CD80-TIP exemplar é mostrada na SEQ ID NO:241 e é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:242. A proteína de transmembrana CDB80 do tipo selva- gem correspondente tinha uma sequência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácido 35-288 de SEQ ID NO:1 e codificada pela sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:251.
[00630] A ICOS-TIP exemplar era um ICOSL variante tendo um domínio IgSF IgSF com afinidade modificada contendo mutações de aminoácido no domínio IgV correspondendo a N52H/1143T com refe- rência às posições no domínio extracelular de ICOSL mostrado na
SEQ ID NO:32 e um domínio de transmembrana e citoplásmico cor- respondendo aos resíduos 257-302 de SEQ ID NO:5. A sequência de aminoácido da ICOSL-TIP exemplar é mostrada na SEQ ID NO:243 e é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:244. A proteína de transmembrana ICOSL do tipo selvagem cor- respondente tinha uma sequência de aminoácidos mostrada como re- síduos de aminoácido 19-302 de SEQ ID NO:5 e codificada pela se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:252.
[00631] ATIP contendo o domínio com afinidade modificada ou a proteína de transmembrana do tipo selvagem contendo o domínio IgSF sem afinidade modificada correspondente foi coexpressa em cé- lulas T com um receptor de antígeno quimérico de 1º geração (CAR) contendo um domínio de sinalização intracelular CD3zeta. O CAR de 1º geração incluía um scFv específico para CD19 (SEQ ID NO:245), um domínio de dobra e transmembrana derivado de CD8 (SEQ ID NO:246) e um domínio de sinalização intracelular derivado de CD3zeta (mostrado na SEQ ID NO:47). A sequência de nucleotídeo codificando o CAR CD19 scFv — CD3zeta é mostrada na SEQ ID NO:248 e a se- quência de aminoácido do CAR CD19 scFv-CD3zeta é mostrada na SEQ ID NO:479.
[00632] Moléculas de ácido nucleico codificando o CAR sozinho ou também codificando uma das TIPS exemplares ou proteínas de trans- membrana do tipo selvagem separadas do CAR por uma sequência T2A de autoclivagem (SEQ ID NO:250 e codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:249) foram geradas. Construtos exemplares continham sequências de ácido nucleico mostradas na Tabela 14. Como um controle, um construto de ácido nucleico codifi- cando um CAR de 2º geração contendo ainda um domínio coestimula- dor de CD28 foi também gerado (CD19 scFv — CD28 — CD3zeta).
Tabela 14: Construtos de Ácido Nucleico CAR Ligante T2A | TIP (SEQ ID NO) | (SEQID NO) | (SEQID NO) + CD19 scFv — CD3zeta (248) CDB80 tipo sel- + + CD19 scFv - CD3zeta - T2A - B7-1 vagem (248) (249) (251) + + CDB80 TIP CD189 scFv - CD3zeta - T2A B7-1 TIP (248) (249) (242) ICOSL tipo + + CD19 scFv - CD3zeta - T2A ICOSL selvagem (248) (249) (252) CD19 scfv CD3zeta - T2A -|+ + ICOSL TIP ICOSL TIP (248) (249) (244)
[00633] As moléculas de ácido nucleico foram individualmente clo- nadas em um vetor lentiviral, que foi usado para transduzir células T isoladas de amostras de PBMC humana obtidas de três doadores saudáveis diferentes. Partículas de lentivírus contendo as sequências de ácido nucleico foram produzidas após cotransfecção de células HEK293 com os vetores e construtos de empacotamento de lentivírus. As partículas de lentivírus foram coletadas do meio de cultura através de ultracentrifugação e tituladas através de gqRT-PCR. Células mono- nucleares de sangue periférico humanas (PBMC) foram isoladas de três doadores de sangue normais usando sedimentação de densidade. As PBMC foram culturadas de um dia para o outro com anticorpos an- ti-CD3 e anti-CD28 e IL-2, então transduzidos com as preparações de lentivírus em uma multiplicidade de infecção de 5:1. Os vetores lentivi- rais codificando o CAR de 2º geração controle foram apenas usados para transduzir células de um doador.
[00634] “Depois de duas semanas (14 dias) de cultura, as células foram analisadas quanto à citotoxidez seguindo cocultura com células expressando antígeno alvo usando o Acea Real-Time Cell Analyzer
(RTCA), que mede as variações de impedância no meio de cultura de uma placa microeletrônica de 96 cavidades (placa E) e mostra as mu- danças em número de célula e morfologia em um gráfico em tempo real. Células-alvo HeLa expressando CD19 (HeLa-CD19) foram seme- adas em uma placa E de 96 cavidades e a impedância de cada mono- camada foi monitorada por 24 horas usando o sistema RTCA. As célu- las T engenheiradas foram adicionadas às cavidades em uma razão de efetora:alvo de 10:1 e as cavidades foram monitoradas por mais 48 horas. Os resultados são mostrados e registrados como valor de Índi- ce Celular (CI) derivado da mudança em impedância elétrica medida e foram então transformados em razão dividindo as leituras de CI de to- das as cavidades em todos os pontos de tempo pelo valor de CI de cavidades individuais em um mesmo tempo (tempo base) para obter um valor de índice celular normalizado representando a porcentagem do valor no tempo base (vide Zhang e outros "Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigenceºSystem with RTCA Package." Bioconductor. 3 de maio de 2016, bioconductor.org/packages/devel/ bioc/vignettes/RTCA/inst/doc/cerca deRTCA.pdf. Acessado em 9 de setembro de 2016). Neste ensaio, uma diminuição na impedância de uma monocamada reflete morte das células-alvo pelas células trans- duzidas.
[00635] Os resultados mostraram que impedância diminuída foi observada em células expressando o CAR de 1º geração comparado com células T não transduzidas, embora o grau de impedância diminu- ída para células expressando o CAR de 1º geração fossem menos do que células expressando o CAR de 2º geração. A impedância diminuí- da em células expressando o CAR de 1º geração continuou geralmen- te por até as primeiras 8 horas do ensaio, enquanto apenas as células expressando CAR de 2º geração continuaram a diminuir a impedância em seguida.
[00636] Como mostrado na FIG. 1, em um doador, cada uma das células coexpressando a TIP ou proteína de transmembrana do tipo selvagem correspondente com o CAR de 1º geração exibiu uma dimi- nuição maior em impedância, indicando atividade citotóxica maior, comparado com células expressando apenas o CAR de 1º geração. Ainda, os resultados mostraram que a atividade citotóxica foi maior em células expressando CAR que coexpressavam a CD80-TIP ou ICOSL- TIP em relação a células expressando CAR que coexpressavam as proteínas de transmembrana CD80 ou ICOSL do tipo selvagem cor- respondentes contendo um domínio IgSF sem afinidade modificada. Os resultados observados dessas células engenheiradas com TIP mostraram que atividade citotóxica em células coexpressando a CD80- TIP ou ICOSL-TIP com o CAR exibe atividade aumentada para modu- lar a resposta imune citotóxica de células T especificas de antígeno, tais como as células T expressando CAR.
[00637] Nos outros dois doadores, as células expressando a CD80- TIP não resultaram em impedância diminuída maior comparado com células expressando a proteína de transmembrana CD80 do tipo sel- vagem correspondente. No doador, não houve células suficientes para transduzir com o construto de proteína de transmembrana do tipo sel- vagem, embora neste doador o ICOS-L TIP tenha provido a melhor citotoxidez comparado com os outros construtos testados. No outro doador, as células expressando o ICOS-L-TIP não resultaram em im- pedância diminuída maior comparado com células expressando a pro- teína de transmembrana ICOS-L do tipo selvagem correspondente. Nas células testadas, todas as células coexpressando ou um CD80- TIP, ICOSL-TIP ou proteína de transmembrana do tipo selvagem cor- respondente com o CAR exibiram atividade citotóxica maior do que células expressando apenas o CAR de 1º geração. As diferenças nos resultados observadas dentre doadores podem estar relacionadas a diferenças nas célula T dentre os doadores, diferenças em níveis de expressão das várias proteínas engenheiradas na superfície das célu- las, as condições particulares usadas neste ensaio exemplar para ava- liação de morte em células (por exemplo, avaliação de células trans- duzidas no Dia 14, avaliação de uma razão de célula efetora:alvo úni- ca) ou outros fatores. EXEMPLO 10 Avaliação de Ligação e Atividade de Variantes de Domínio IgSF
ICOSL
[00638] Variantes de ICOSL ECD adicionais foram identificadas através do método de seleção de levedura substancialmente como descrito acima e foram usadas para produzir proteínas de fusão de Fc- ECD como descrito no Exemplo 5. Estudos de ligação foram realiza- dos para avaliar especificidade e afinidade de proteínas imunomodula- doras variantes de domínio ICOSL com contrapartes de ligação cogna- tas substancialmente como descrito no Exemplo 6. A. Caracterização de Ligação e Funcional
[00639] Ligação foi avaliada para contrapartes de ligação cognatas de comprimento integral CD28, ICOS e CTLA-4 expressas em células substancialmente como descrito no Exemplo 6. A bioatividade das va- riantes de ICOSL ECD foi também avaliada em um ensaio de coimobi- lização anti-CD3 ou Reação de Linfócitos Mistos (MLR) substancial- mente como descrito no Exemplo 6, exceto que para o ensaio de coi- mobilização, atividade coestimuladora foi determinada através de cul- tura de células T humanas com uma mistura de anti-CD3 ligado à pla- ca 10 nM e proteínas variantes Fc ICOSL 40 nM.
[00640] A Tabela 15 mostra resultados exemplares para as varian- tes de domínio I9SF ICOSL adicionais para ligação a contraestruturas expressas em célula e bioatividade no ensaio de coimobilização anti- CD3 ou ensaio MLR. As substituições de aminoácido exemplares mos-
tradas na Tabela 15 são planejadas pelo número de posição de ami- noácido correspondendo à respectiva sequência de ECD ICOSL não modificada de referência mostrada na SEQ ID NO: 32. A posição do aminoácido é indicada no meio, com o aminoácido não modificado cor- respondente (por exemplo, tipo selvagem) listado antes do número e a substituição de aminoácido variante identificada listada após o núme- ro. A Coluna 2 mostra o identificador de SEQ ID NO. para a ECD vari- ante para cada molécula de fusão de ECD variante-Fc.
[00641] Os resultados na Tabela 15 mostram atividade de ligação conforme medido pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para ligação de cada molécula de fusão de Fc variante a células engenheiradas para expressar o ligante de contraestrutura cognata e a razão do MFI comparado com a ligação da molécula de fusão de Fc- ECD de referência (por exemplo, não modificada) correspondente não contendo a(s) substituição(ões) de aminoácido para o mesmo ligante de contraestrutura expresso na célula. A atividade funcional das molé- culas de fusão de Fc variantes para modular a atividade de células T também é mostrada com base nos níveis calculados de IFN-gama em sobrenadantes de cultura (pg/ml) gerados ou i) com a molécula de fu- são de ECD variante-Fc indicada coimobilizada com anti-CD3 ou ii) com a molécula de fusão de ECD variante-Fc indicada em um ensaio MLR. A Tabela também mostra a razão de IFN-gama produzida por cada ECD variante-Fccomparado com o ECD não modificado (paren- tal)-Fc correspondente em ambos os ensaios funcionais.
[00642] Os resultados mostram afinidade de ligação alterada, inclu- indo aumentada, de variantes de domínio I9ISF ICOSL com afinidade modificada com pelo menos um ligante de contraestrutura cognata e/ou atividade imunológica aperfeiçoada. Especificamente, similar aos melhores identificados no Exemplo 6, as seleções resultaram na identi- ficação de várias variantes de domínio IQSF ICOSL adicionais que tive-
ram afinidade modificada para exibir ligação aumentada com pelo me- nos um, e em alguns casos mais de um, ligante de contraestrutura cognata.
Ainda, os resultados mostraram que modificação de afinidade das moléculas variantes também exibiu atividades aperfeiçoadas para ambos aumento e/ou diminuição de atividade imunológica dependendo do formato da molécula como descrito no Exemplo 6.
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B. Produção de Citocina em Ensaios Coestimuladores Anti-CD3
[00643] “Moléculas de fusão ECD ICOSL variante-Fc exemplares descritas acima foram avaliadas mais quanto à estimulação de citoci- nas IL-17 no ensaio de bioatividade coestimulador anti-CD3 (coimobili- zação) descrito acima. Uma mistura de anti-CD3 ligado à placa 10 nM e proteínas variantes ICOSL Fc 40 nM foi culturada com células T hu- manas. Os sobrenadantes foram coletados e níveis de IL-17 foram de- terminados através de ELISA. A quantidade de IL-17 nos sobrenadan- tes de cultura (pg/ml) gerados com a molécula de fusão de ECD vari- ante-Fc indicada e ECD não modificado (parental)-Fc correspondente coimobilizado com anti-CD3 foi medida. Para comparação, são tam- bém mostrados na Tabela os resultados para produção de IFN-gama no mesmo ensaio como mostrado na Tabela 15 para variantes exem- plares.
[00644] Os resultados são mostrados na Tabela 16, que mostra o pg/mL de IL-17 medido no sobrenadante bem como a razão (razão de aumento) de IL-17 produzida por cada ECD variante-Fccomparado com o Fc-ECD não modificado (tipo selvagem) correspondente. Resul- tados similares são mostrados para IFN-gama. É também mostrada a % de IL-17 ou IFN-gama citocina total produzidas pelas células. Os resultados mostraram que modificação de afinidade das moléculas va- riantes exibiu atividade de célula T funcional alterada para aumentar IL-17 em adição a IFN-gama no ensaio de coestimulação.
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EXEMPLO 11 Geração de Célula T Engenheirada Adicional Expressando uma Proteína Imunomoduladora de Transmembrana e Avaliação de Proliferação
[00645] Esse exemplo descreve a geração de células T engenhei- radas adicionais em que uma proteína imunomoduladora de trans- membrana (TIP) contendo um domínio extracelular (ECD) contendo domínio I9SF com afinidade modificada de ICOSL foi coexpressa com um receptor de antígeno quimérico (CAR). Especificamente, a TIP foi gerada para incluir o ECD de ICOSL variante exemplar contendo mu- tações de aminoácido N52D, N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/ Q100R/V110D/H115R/Y152C/KI56M/C198R ou N52H/N57Y/Q100R com referência às posições no domínio extracelular de ICOSL mostra- do na SEQ ID NO:32. A TIP também continha um domínio de trans- membrana e um domínio citoplásmico da sequência de proteína de transmembrana ICOSL do tipo selvagem correspondente correspon- dendo aos resíduos 257-302 de SEQ ID NO:5. As sequências da TIP com e sem seu peptídeo de sinal são como segue: N52D (SEQ ID NO: 496 e 497); N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 498 e 499); E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 500 e 501) e N5S2H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 502 e 503). Para compara- ção, o ICOSL do tipo selvagem de transmembrana de comprimento integral (resíduos de aminoácido 19-302 de SEQ ID NO:5) também foi expresso em células. A sequência da TIP do tipo selvagem com e sem seu peptídeo de sinal é mostrada nas SEQ ID NOs:494 e 495. O ácido nucleico codificando a TIP também incluía uma sequência codificando uma proteína verde fluorescente (GFP) separada da TIP por uma se- quência T2A de autoclivagem.
[00646] ATIP contendo o domínio com afinidade modificada ou a proteína de transmembrana do tipo selvagem contendo o domínio
IgSF sem afinidade modificada correspondente foram co-expressas em células com um receptor de antígeno quimérico (CAR). A sequên- cia de nucleotídeo codificando o CAR codifica, na ordem: a sequência de sinal de CD8 (SEQ ID NO:481), um scFv anti-CD19 (SEQ ID NO:482), uma região de dobra/transmembrana derivada de CD8 (SEQ ID NO:483), um domínio de sinalização coestimulador derivado de 4- 1BB (SEQ ID NO:484) e um domínio de sinalização CD3zeta (SEQ ID NO:247). O CAR anti-CD19 resultante tem a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO:490. O ácido nucleico codificando o CAR também incluída uma sequência codificando uma proteína fluorescen- te azul (BFP; SEQ ID NO:489) separada do CAR por uma sequência T2A de autoclivagem (mostrada na SEQ ID NO:488).
[00647] Os construtos de vetor viral foram separadamente gerados nos quais foi clonada ou a molécula de ácido nucleico codificando o CAR sozinho ou uma molécula de ácido nucleico codificando uma das TIPS exemplares ou ICOSL do tipo selvagem. O vetor viral codificando o CAR e o vetor viral codificando a TIP ou ICOSL do tipo selvagem foram cotransduzidos em células T. Para transdução, células T primá- rias foram ativadas com esferas anti-CD3 e anti-CD28 (Dynal) em uma razão de esfera:célula 1:1 e incubadas na presença de 100 Ul/mL de IL-2 a 37º C por 2 dias. As células T foram então coletadas e transdu- zidas com 400 uL de sobrenadante viral de CAR e 400 uL de sobrena- dante viral de TIP na presença de 8 ug/mL de polibreno. As células foram espinoculadas a 1000 g por 30 minutos a 30º C. As células fo- ram então transferidas e incubadas de um dia para o outro a 37º C. Após incubação, as células foram coletadas e sobrenadante viral foi removido. As células foram ressuspensas com meio completo e 50 Ul/mL de IL-2. As células foram expandidas, repostas com IL-2 e meio a cada dois dias por um total de 6 dias. As esferas foram removidas das células usando um ímã e contadas antes de serem avaliadas em um ensaio de proliferação. Um perfil de expressão exemplar de uma TIP e CAR em uma célula T transduzida exemplar é mostrado na FIG. 2A.
[00648] Para avaliar proliferação de células T CAR e células T CAR-TIP em resposta a antígeno, as células foram marcadas com Cell Trace Far Red Dye. Células-alvo Nalm6 expressando CD19 foram titu- ladas partindo de razão de célula-alvo:T de 1,5:1 e por diluições 1:2 com diluição de 8 pontos. Células T CAR marcadas ou células T CAR- TIP foram adicionadas a células Nalm6 e a cultura foi incubada por 4 dias antes das células serem analisadas através de citometria de fluxo. O sobrenadante foi coletado e avaliado adicionalmente em ensaio de liberação de citocina.
[00649] Como mostrado na FIG. 2B, células T primárias CAR+ proli- feram de uma maneira dependente da dose para células NALM6 CD19+. Comparado com células T de apenas CAR, células T coex- pressando o CAR e ou ICOSL do tipo selvagem ou uma da TIP ICOSL exemplar exibiram proliferação aumentada comparado com células T expressando apenas CAR. Co-expressão de um CAR e uma TIPO contendo qualquer um do ECD ICOSL variante N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R ou N52H/N57Y/Q100R exibiu proliferação maior do que células T coex- pressando o CAR e ICOSL do tipo selvagem, indicando que TIPs ex- pressas em células T primárias proveram um sinal coestimulador aper- feiçoado para aumentar proliferação de célula T. EXEMPLO 12 Purificação e Avaliação de Variantes de Domínio IgSF ICOSL Puri- ficadas
[00650] Uma estratégia de purificação foi empregada para os me- lhores candidatos exemplares descritos nos Exemplos 6 e 10. Células humanas derivadas da linhagem de célula 293 (Expi293) foram transi-
entemente transfectadas com construto de expressão e a molécula de fusão ECD ICOSL Fc foi expressa nas células. As proteínas de fusão de Fc foram então purificadas dos sobrenadantes com Proteína Aatra- vés de cromatografia de afinidade (MabSelect SuRe). Esta etapa de purificação inicial foi então seguida por uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho preparativa (SEC) para purificar mais as proteí- nas (Superdex200 16x60). As amostras de ambas as etapas de purifi- cação foram retidas e comparadas através de SEC analítica. A con- centração da proteína foi determinada após purificação em Protein A. As proteínas purificadas resultantes foram também analisadas através de SEC analítica em uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para avaliar a pureza.
[00651] O pico principal percentual nas amostras purificadas foi de- terminado e comparado com proteína purificada na etapa da Proteína Ainicial (grupo Prot A de Pico Principal %) versus proteína purificada com Proteína Aseguido por SEC preparativa (grupo de SEC de Pico Principal % T=DO). Como mostrado na Tabela 17, a etapa de SEC adi- cional aumentou substancialmente a pureza da proteína de proteínas purificadas. Para avaliar mais a estabilidade das proteínas, as proteí- nas purificadas através de SEC preparativa foram deixadas em tempe- ratura ambiente por 24 horas e então Pico Principal % por HPLC (gru- po SEC de Pico Principal % T=D24) foi avaliado e comparado com amostra DO. A mudança em Pico Principal % em DO versus D24 foi determinada (Agrupo SEC de Pico Principal %). Como mostrado na Tabela 17, a maioria das moléculas de fusão ECD ICOSL variante-Fc exemplares testadas exibiu pouca mudança em Pico Principal % desta vez, indicando que agregação mínima das variantes de proteína acon- teceu.
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EXEMPLO 13 Avaliação de Bioatividade Coestimuladora de Melhores Variantes de Domínio IgSF ICOSL Purificadas
[00652] — Moléculas de fusão ECD ICOSL Fc exemplares purificadas como descrito no Exemplo 12 foram avaliadas quanto à bioatividade através de MLR substancialmente como descrito no Exemplo 6. Uma mistura de proteínas ICOSL variantes-Fc 10 nM ou 40 nM foi ligada de um dia para o outro a placas de 96 cavidades na presença de anti- CD3 10 nM. As placas foram lavadas e 100.000 células T pan marca- das com CFSE foram adicionadas por 96 horas. Os sobrenadantes foram coletados e níveis de IFN-gama e IL-17 foram medidos através de ELISA.
[00653] “Resultados para a secreção de citocina induzida por coes- timulação de anti-CD3 com variantes testadas exemplares (ICOSL-Fc nM e 40 nM) são mostrados nas FIGs. 3A e 3B, que indica substi- tuições de aminoácido de domino IgSF exemplares no ECD ICOSL. Os gráficos em barra nas FIGs. 3A e 3B mostram a quantidade de IFN-gama e IL-17 secretadas, respectivamente, através de ELISA nos sobrenadantes (pg/mL). O nível de liberação de citocina induzida por coestimulação com anti-CD3 com as variantes testadas comparado com o nível induzido por coestimulação com anti-CD3 com ICOSL WT é indicado pela linha horizontal. Os resultados mostraram que afinida- de modificada das moléculas variantes exibiu atividade para modular atividade de célula T funcional, incluindo aumentar substancialmente secreção de IFN-gama e IL-17 no ensaio de coestimulação. Atividade imunológica aumentada foi observada com algumas variantes. EXEMPLO 14 Avaliação de Proliferação de Melhores Variantes de Domínio IgSF ICOSL Purificadas
[00654] —Moléculas de fusão ECD ICOSL Fc variante exemplares purificadas como descrito no Exemplo 12 foram avaliadas quanto à habilidade em coestimular proliferação induzida por anti-CD3 de célu- las T. Células T primárias foram marcadas com carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE). Uma mistura de proteínas ICOSL ECD vari- ante-Fc 10 nM ou 40 nM ou ICOSL ECD do tipo selvagem foi ligada de um dia para o outro a placas de 96 cavidades na presença de anti- CD3 10 nM e então células T marcadas foram adicionadas e incuba- das por 3 dias. Como um controle, proliferação foi também avaliada na presença de anti-CD3 e IgG ligado ou IgG sozinha. As células foram tingidas para marcadores de superfície de CD4 ou CD8 e proliferação de células T totais, células T CD4+ ou células T CD8+ foi determinada avaliando diluição CFSE através de citometria de fluxo.
[00655] Os resultados são mostrados nas FIG. 4A e FIG. 4B para variantes exemplares testadas no ICOSL 40 nM e 10 nM, respectiva- mente. Como mostrado na FIG. 4A, quase todas as moléculas de fu- são ICOSL ECD variante Fc testadas induziram proliferação maior do que controle WT. Como mostrado na FIG. 4B, diferenças em prolifera- ção foram mais aparentes a 10 nM com certas variantes provendo pro- liferação máxima mesmo nesta concentração menor. EXEMPLO 15 Avaliação de Ligação e Atividade de Melhores Variantes de Domií- nio IgSF ICOSL Purificadas
[00656] —Moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc exemplares purificadas como descrito no Exemplo 12 foram avaliadas quanto à ligação e atividades funcionais usando métodos substancialmente co- mo descrito no Exemplo 6 ou Exemplo 10. A. Ensaios de Ligação Citométrica de Fluxo
[00657] Células humanas derivadas da linhagem de célula 293 (Ex- pi293) foram transfectadas com CD28, CTLA-A4, ICOS ou falso trans- fectadas. As células foram então incubadas com moléculas de fusão
ECD ICOSL Fc ou ICOSL ECD do tipo selvagem Fc que foram titula- das a partir de 100.000 pM a 46 pM, e ligação foi observada usando um Fc anti-humano conjugado a PE como descrito no Exemplo 6. Li- gação foi avaliada através de citometria de fluxo e intensidade de fluo- rescência média (MFI) e porcentagem (%) de células positivas para sina foi determinada usando software Cell Quest Pro (Becton Dickin- son, USA). A concentração de ICOS-Fc que proveu uma resposta de MFI metade-máxima (EC50 de MFI) ou células positivas % (EC50 (+) %) foi determinada.
[00658] A Tabela18 mostra os resultados. As substituições de ami- noácido de ICOSL mostradas na Tabela 18 são designadas por núme- ro de posição de aminoácido correspondendo à respectiva sequência de ECD ICOSL não modificado de referência mostrada na SEQ ID NO:32. Para alguns valores (por exemplo, WT se ligando a CD28) não foi possível obter uma EC50, desta maneira 1000000 pM foi arbitrari- amente escolhido para propósitos de formatação de dados. Similar a resultados obtidos de ensaios de ligação anteriores como descrito no Exemplo 10 acima, afinidade de ligação alterada de molécula de fusão ECD ICOSL variante-Fc com pelo menos um ligante de contraestrutura cognata foi observada.
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B. Ensaio de Ligação ForteBio
[00659] Interações proteína-proteína entre os receptores e proteí- nas imunomoduladoras variantes de domínio de ICOSL foram avalia- das mais usando ensaios de ligação Fortebio. Receptores de ICOS, CD28 e CTLA-4 foram carregados individualmente em sensores de captura anti-humanos (ForteBio Octet AHC) e molécula de fusão de ECD ICOSL não modificado-Fc do tipo selvagem, molécula de fusão de ED PD-L2 do tipo selvagem-Fc ou moléculas de fusão de ICOSL variante-Fc foram ligadas aos receptores em titulações de 4 pontos. Cada titulação foi globalmente ajustada para calcular a associação (Kon) e dissociação (Kais) de cada proteína. Resposta de carregamento de sensores de captura anti-humano de cada receptor sendo testado com a molécula de fusão de ECD ICOSL variante-Fc foi determinada. A constante de dissociação (KD) foi calculada e comparada com tipo selvagem para determinar um valor de razão de aperfeiçoamento (ra- zão aperf.).
[00660] Resultados de ligação a ICOS são mostrados na Tabela 9, a CD28 são mostrados na Tabela 20 e a CTLA-4 são mostrados na Tabela 21. As substituições de aminoácido exemplares mostradas nas Tabelas 19-21 são designadas por número de posição de aminoácido correspondendo à sequência de ECD ICOSL não modificado de refe- rência mostrada na SEQ ID NO:32.
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C. Ensaio de Coimobilização
[00661] Bioatividade coestimuladora de variantes de fusão de ICOSL foi determinada em ensaios de coimobilização anti-CD3 subs- tancialmente como descrito no Exemplo 6. Aproximadamente 0,37 Nm, 1,3 Nm ou 10 Nm de CD3 anti-humano de camundongo (OKT3, Biole- gends, USA) foram diluídos em PBS com ECD ICOSL variante Fc 10 NM ou 40 nM ou ECD ICOSL do tipo selvagem-Fc. Esta mistura foi adicionada a placas de 96 cavidades de fundo plano tratadas com cul- tura de tecido de um dia para o outro para facilitar aderência das prote- ínas estimuladoras às cavidades da placa. No dia seguinte, proteína não ligada foi retirada com lavagem das placas e 100.000 células T pan humanas purificadas foram adicionadas a cada cavidade. As célu- las foram culturadas 3 dias antes da coleta dos sobrenadantes de cul- tura e medição dos níveis de IFN-gama humano com um kit ELISA.
[00662] A Tabela 22 mostra a quantidade de IFN-gama (pg/mL) produzido por células sob as várias condições no ensaio de coimobili- zação anti-CD3. Na Tabela, as substituições de aminoácido de fusões de ECD ICOSL variante Fc exemplares são planejadas pelo número de posição de aminoácido correspondendo à sequência de ECD ICOSL não modificado mostrada na SEQ ID NO:32 e o identificador de SEC ID NO. correspondente para o ECD variante para cada molécula de fusão de ECD ICOSL variante Fc é mostrado. A razão de IFN-gama produzido na presença de cada ECD ICOSL variante Fc no ensaio funcional comparado na presença de Fc ECD não modificado (tipo sel- vagem) correspondente é mostrada (Vezes 1WT). Como mostrado, sinalizações coestimuladoras das moléculas ECD-ICOSL variante-Fc foram substancialmente maiores comparado com ICOSL do tipo sel- vagem.
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D. Reação de Linfócitos Mistos para Avaliação de Supressão de Bior- reatividade
[00663] “Modulação de atividade de célula T por variantes de fusão foi determinada em uma reação de linfócitos mistos (MLR) substanci- almente como descrito no Exemplo 6. Monócitos humanos foram incu- bados por 6 dias na presença de IL-4 e GM-CSF e amadurecidos para células dendríticas com a adição de LPS para as 24 horas finais. 1x10º células dendríticas e 1x10*º células T marcadas com CFSE humanas foram plaqueadas por cavidade e incubadas por 4 dias na presença de três concentrações diferentes (40 nM, 13,3 nM ou 4,4 nM) de molécu- las de ECD ICOSL do tipo selvagem ou variante Fc recombinante dilu- ídas em PBS. As mesmas concentrações de IgG humana, PD-L2-Fc ou Belatacepte (CTLA-4-Fc contendo mutações L104E e A29Y) foram usadas como controle. Os sobrenadantes foram coletados e respostas de IFN-gama foram caracterizadas por ELISA.
[00664] A FIG.5 mostra a produção de IFN-gama sob as várias condições. Os níveis de IFN-gama produzido pelas células na presen- ça de ICOSL do tipo selvagem são mostrados pela linha horizontal. Nenhuma supressão de produção de IFN-gama foi observada na pre- sença de proteína controle negativo PD-L2-Fc. Em contraste, a maioria das variantes de ICOSL testadas exibiu algum grau de inibição de pro- dução de IFN-gama no MLR. Certas variantes exibiram inibição subs- tancial de IFN-gama com pouquíssima a nenhuma IFN-gama detectá- vel produzida nas culturas, mesmo na concentração mais baixa de 4,4 nM testada. A supressão de MLR percentual na presença de 4,4 nM de ICOSL ECD variante Fc é mostrada na Tabela 23. Na Tabela, os valores negativos indicam um efeito inflamatório no ensaio. (ECD) MLR% (4,4nM)
Tabela 23. Dados de bioatividade coestimuladora para ICOSL em MLR Mutação(ões) de ICOSL SEQIDNO | Supressão — de (ECD) MLR% (4,4nM) N52H, N57Y, Q100R, F172S 100,0 N52Y/N57Y/F138L/L203P 100,0 V11E, N30D, N52H, N57Y, H94E, L961, L98F, N194D, | 308 100,0 V210A, 1218T N52H, N57Y, Q100R, L102R, V110D, H115R, C198R 100,0 N52H, N57Y, Q100R, V110D, C198R, S212G N52H, N57Y, 0100P 100,0 E16V, N52H, N57Y, Q100R, V11OD, H115R, Y152C, | 300 100,0 K156M, C198R N52H, N57Y, V110A, C198R, R2211 100,0 E. Avaliação de Proliferação e Marcadores de Citocina Intracelular através de Citometria de Fluxo
[00665] Células T pan marcadas com carboxifluoresceína succini- midil éster (CFSE) de estudos de MLR como acima descrito que ti- nham sido incubadas por 4 dias na presença de moléculas de ECD ICOSL do tipo selvagem ou variante Fc recombinantes foram testadas mais quanto a níveis de citocina através de nova estimulação com acetato de miristato de forbol (PMA)/lonomicina por 6 horas na pre- sença de inibidor de golgi (Golgi/Block/Plug). As células do estudo de MLR que tinham sido incubadas com IgG humana, anti-CD28, anti- ICOSL, LD-L2-Fc ou Belatacepte (CTLA-4-Fc contendo mutações L104E e A29Y) foram também estimuladas novamente. As células T foram tingidas para marcadores de superfície CD4 ou CDB8, fixadas,
permeabilizadas e intracelularmente tingidas para várias citocinas co- mo mostrado nas Tabelas 24 e 25.
[00666] A porcentagem (%) de células T CD4+ e CD8+ que foram positivas para citocinas intracelulares específicas é mostrada na Tabe- la 24, respectivamente. Os resultados mostraram que várias moléculas de ECD ICOSL variante Fc foram capazes de suprimir uma ou mais citocinas, incluindo, em alguns casos, a maioria das citocinas. Um re- sultado total e um resultado médio são calculados para avaliar os efei- tos de soma de moléculas individuais testadas nos parâmetros exami- nados neste ensaio. Proliferação foi também avaliada e a porcentagem de células que tinham se dividido conforme determinado pela diluição de CFSE é também mostrada nas Tabelas 24 e 25. Dentre os resulta- dos providos, os resultados mostram que certas variantes mostram atividade comparável ou melhor do que Belatacepte, particularmente das células CD8+.
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EXEMPLO 16 Avaliação de Produção de Citocina em Cocultura de Célula B-T
[00667] Células B e células T CD4+ foram purificadas do mesmo doador e marcadas com CFSE e plaqueadas em placas de 96 cavida- des em razões celulares 1:1 a 5x10º células de cada um por cavidade. Moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc ou Belatacepte foram adicionadas em uma concentração final de 40 nM por cavidade. As células foram ou estimuladas ou incubadas com 100 ng/ml de entero- toxina B de Staphylococcus (SEB), 1 ug/ml de Pokeweed Mitogen (PWM) ou ambos por 7 dias a 37º C em um volume final de 200 ul/cavidade.
[00668] As células foram coletadas e a superfície tingida para os marcadores de linhagem de células B e T que seguem (I9M, IgD, CD38, CD138, CD27, CD19, CD4, CD3). Proliferação foi avaliada através de citometria de fluxo e sobrenadantes de cultura foram anali- sados quanto a citocinas IL-5, IL-13 ou IL-21 usando um kit de detec- ção de citocina Th humana LEGENDplex (Biolegends, USA).
[00669] — Como mostrado na FIG. 6A, o número de células B em divi- são foi reduzido em coculturas de célula B/T quando incubadas na presença de moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc compara- do com proteínas controle ausentes. O grau de efeito antagonístico para as variantes exemplares testadas foi similar para Belatacepte CTLA-4-Ig (L104E, A29Y). Da mesma maneira, como mostrado nas FIGS. 6B-6D, moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc inibiram produção de citocina em cocultura de célula B/célula T primária in vitro comparado com controles com proteína ausente bem como culturas contendo controle de ICOSL do tipo selvagem. Comparado com Bela- tacepte, moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc testadas exemplares foram mais eficazes em bloqueio de produção de citocina em alguns casos.
EXEMPLO 17 Avaliação de Atividade de Sobrevivência e Doença em Modelo Doença Enxerto-Versus-Hospedeiro (GvHD)
[00670] Proteínas ECD ICOSL variante-Fc exemplares foram avali- adas quanto à atividade em um modelo de doença enxerto-versus- hospedeiro (GvHD). Camundongos NSG fêmeas (n = 10 por grupo) foram irradiados (100 rad) e administrados com 10 mg de gama globu- lina subcutaneamente no Dia -1. No Dia 0, os camundongos recebe- ram 10 milhões de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humanas e dosagem de injeção intraperitoneal ou de 100 ug de ECD ICOSL WT Fc, uma molécula de ECD ICOSL variante Fc (N52H/1143T) (ECD mostrado na SEQ ID NO:135), uma variante de molécula de ECD ICOSL variante Fc N52H/N57Y/Q100P (ECD mos- trado na SEQ ID NO: 113), 75 ug de Belatacepte (CTLA-4-lg L104E/A29Y; Número de Publicação de Pedido de Patente U.S. US20160271218) ou solução salina como controle. No Dia 15, células CD45+ humanas enxertadas foram fenotipadas através de citometria de fluxo. Após o estudo ter terminado no Dia 35, medições de ponto final de sobrevivência, perda de peso corporal e atividade de doença foram avaliadas.
[00671] AFIG.7A mostra a sobrevivência de camundongos GVHD tratados com solução salina, ECD ICOSL WT Fc, as moléculas de ECD ICOSL variante Fc ou Belatacepte. Uma diferença significante na sobrevivência de camundongos administrados com ECD ICOSL vari- ante Fc N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 113) comparado com camundongo administrado com solução salina ou ECD ICOSL WT Fc foi observada (p <0,0001 pelo teste Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon). A FIG. 7B mostra diferenças similares entre a perda de peso corporal de camundongos tratados com solução sali- na, ECD ICOSL WT Fc, as moléculas de ECD ICOSL variante Fc ou
Belatacepte durante o curso do estudo.
[00672] Um índice de atividade de doença (DAI) foi determinado três vezes por semana durante um estudo e avaliado o scoring de per- da de peso, postura, atividade, aparência do pelo e pele do camun- dongo. O grau de doença durante o curso do estudo é mostrado na FIG. 7C. Os grupos de tratamento que receberam variante ICOSL Fc N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 113) ou Belata- cepte mostraram scores de DAI significantemente aperfeiçoados. À porcentagem de células T humanas no sangue periférico no dia 14 do estudo foi também avaliada através de citometria de fluxo. As medi- ções tiveram média tirada por grupo de tratamento e barras de erro representam erro padrão da média (SEM). A FIG. 7D mostra a porcen- tagem de células CD3+/CD4+ ou CD3+/CD8+ vivas no sangue. Gru- pos de tratamento que receberam ECD ICOSL variante Fc com N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 113) ou Belata- cepte mostraram níveis significantemente diferentes de células T CD4+ comparado com o grupo de tratamento com solução salina (p = 0,008 e 0,006, respectivamente, pelo teste t não emparelhado). Este estudo demonstrou o efeito terapêutico da proteína variante ICOSL Fc variante sobre células T humanas primárias e GVHD durante modela- gem in vivo.
[00673] Um estudo similar com moléculas de fusão de ECD ICOSL variante-Fc adicionais foi realizado incluindo Fc-DCD ICOSL variante N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD mostrado na SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S(ECD mostrado na SEQ ID NO: 291) e N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 288). N52H/ Q100R (ECD mostrado na SEQ ID NO: 285), que tinha atividade redu- zida nos estudos de MLR in vitro como mostrado acima, também foi testado. Camundongos NSG (n=9/grupo) foram tratados como acima descrito. Nesse estudo, dosagem com o ICOSL-Fc ou Belatacepte continuou 3 vezes por semana a partir do dia O até o dia 37 e camun- dongos sobreviventes foram terminados no dia 49. Para determinar diferenças estatísticas em proporções de sobrevivência dentre grupos, dados foram analisados usando o teste Mantel-Cox (log-rank). As cur- vas de sobrevivência resultantes são mostradas na FIG. 7E. Belacepte e variantes ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD mostrado na SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/Q100R/F1728 (ECD mostrado na SEQ ID NO: 291) e N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 288) prolongaram significantemente sobrevivência comparado com solução salina e ICOSL WT-Fc (p<0,001). Os scores de DAI médios foram representados em gráfico durante o curso de tempo do experi- mento, com a última observação (isto é, scores médios coletados nos dias de terminação) reportada no gráfico para aqueles grupos termina- dos antes do último dia de estudo planejado (Dia 49). Diferenças signi- ficantes dentre grupos para dados com o tempo (isto é, scores de DAI) foram determinadas usando medições de repetição de 2 vias ANOVA para efeitos de “tratamento. As classificações DAI resultantes são mostradas na FIG. 7F. Belacepte e variantes ICOS-Fc N52H/N57Y/ Q100R/C198R (ECD mostrado na SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/ Q100R/F1728 (ECD mostrado na SEQ ID NO: 291) e N52H/N57Y/ Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 288) reduziram significante- mente os scores de DAI comparado com solução salina e ICOSL WT- Fc (p<0,001) e entre Belatacepte e variante ICOSL-Fc com N52H/ N57Y/Q100R/C198R por ANOVA de 2 vias para scores de DAI (p = 0,035).
[00674] A atividade do ICOS-Fc variante, em algunas casos, foi me- lhorada comparado com o tratamento com belatacepte. Administração de variantes ICOSL-Fc protegidas de efeitos de GVHD, como eviden- ciado por sobrevivência aumentada e desenvolvimento de doença ate- nuado, em níveis comparáveis a ou melhores do que belatacepte. À atividade desse modelo se relacionada com atividade in vitro, uma vez que ICOSL WT-Fc e ICOSL variante-Fc com mutações N52H/Q100R (ECD mostrado na SEQ ID NO: 285) não foram eficazes neste modelo. EXEMPLO 18 Avaliação de Ativação por Moléculas Empilhadas
[00675] Proteínas de fusão de IgV variante Fc empilhadas contendo um domínio IgV NKp30 como um domínio de localização (chamado "L") e um domínio IgV ICOSL como um domínio coestimulador (cha- mado "C") foram geradas e avaliadas substancialmente como descrito no Exemplo 8. Especificamente, os construtos testados neste experi- mento incluem: (1) um construto empilhado com proteína de fusão de IgV variante Fc (vIgD C-L) contendo uma NKp30 composta de lg de variante de NKp30 de consenso (SEQ ID NO:143) com o domínio IgV de variante de ICOSL N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrado na SEQ ID NO: 113 e IgV mostrado na SEQ ID NO:201); (2) um construto empi- lhado com o domínio Ig do domínio do tipo selvagem de NKp30 (SEQ ID NO:214) e domínio V de ICOSL do tipo selvagem (WT C-L) (SEQ ID NO:196); (3) um construto com domínio IgV ICOSL do tipo selvagem (domínio C WT; SEQ ID NO:196) e (3) um construto com o domínio de NKp30 do tipo selvagem (domínio L WT; SEQ ID NO: 214).
[00676] Células K562 CD32+ foram engenheiradas para expressar estavelmente B7-H6 na superfície celular. As células foram então tra- tadas com mitomicina e plaqueadas com células T pan na presença ou ausência de anti-CD3 10 nM e domínios variantes ou controle empi- lhados a 100, 33, 11 ou 3,7 NM. As células foram culturadas 3 dias an- tes da coleta dos sobrenadantes de cultura e medição dos níveis de IFN-gama humano usando um ELISA.
[00677] Como mostrado na FIG. 8A, ambas as pilhas de domínio coestimulador-de localização do tipo selvagem foram capazes de loca- lizar as células K562 engenheiradas e administrar um sinal coestimu-
lador às células T pan para induzir secreção de IFN-gama. O construto empilhado com proteína de fusão de IgV variante Fc (vlIgD C-L) mos- trou resultados de atividade funcional aumentada em todas as concen- trações testadas, enquanto os componentes de domínio individual não tiveram nenhum efeito quando não combinados uns com os outros. EXEMPLO 19 Avaliação de Hipersensibilidade do Tipo Retardada in vivo
[00678] —“Moléculas de fusão de ECD ICOSL variante-Fc foram avali- adas quanto à atividade anti-inflamatória in vivo no modelo de hiper- sensibilidade do tipo retardada em camundongo (DTH). Reações imu- nes de hipersensibilidade do tipo retardada foram elicitadas em ca- mundongos sensibilizados por ovalbumina (OVA) e resposta após pro- vocação foi avaliada. As moléculas de fusão de ECD ICOSL Fc testa- das continham um ECD variante com as substituições de aminoácido que seguem: N52H/N57Y/Q100P (ECD mostrada na SEQ ID NO: 113), N52H/Q100R (ECD mostrada na SEQ ID NO: 285) ou N52H/N57Y/Q100R/F1728S (ECD mostrada na SEQ ID NO: 291). As variantes foram fundidas a ou uma estrutura principal de Fc contendo mutações C220S/L234A/L235E/G237A pela numeração EU (designa- da Fctt1) mostrada na SEQ ID NO:477) ou uma estrutura principal de Fc contendo mutações C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K pela numeração EU (designada Fctt2) mostrada na SEQ ID NO:478) ou com ou sem um ligante G4S (GGGGS; SEQ ID NO: 636). A Tabela 26 mostra os construtos testados: mea santo OO (SEQ ID NO) NO) FESTTEREEA RR rm)
[00679] Para sensibilização, camundongos BALB/c fêmeas de 8 semanas de vida foram injetados subcutaneamente com 100 ug de OVA emulsificada em Adjuvante Sigma (100 uL; número de catálogo S6322-1VL) na base na cauda no dia O. Nos dias 1 e 4, os camundon- gos foram administrados com proteínas de fusão de ECD ICOSL vari- ante Fc, 75 ug de CTLA-4 Fc (abatacepte) ou PBS como controle ne- gativo através de injeção intraperitoneal. No dia 7 duas a três horas antes da provocação com OVA, os camundongos foram ainda admi- nistrados com PBS como um controle, 75 ug de CTLA-4 Fc (abatacep- te da Orencia) ou o polipeptídeo ICOSL variante indicado através de injeção intraperitoneal. Abatacepte ou as moléculas de fusão de ICOSL variante-Fc foram dosados em equivalentes molares.
[00680] Para provocação com OVA, uma injeção intradermal de 10 pg de OVA no pavilhão auricular esquerdo em um volume de 10 ul de PBS foi administrada sob anestesia com gás isoflurano 2-3 horas se- guindo tratamento terapêutico. A espessura da orelha de linha basal foi medida antes da provocação com OVA.
[00681] No dia8,a espessura da orelha foi medida sob anestesia com isoflurano usando medidores Mitutoyo e a mudança em espessu- ra da orelha antes e após provocação com OVA foi determinada. Co- mo mostrado na FIG. 9, os camundongos tratados com as moléculas de fusão de Fc ECD ICOSL variante indicadas mostraram significan- temente menos inchaço da orelha induzido por OVA comparado com controle de PBS (<0,0001 por ANOVA de 1 via). Não houve quaisquer diferenças significantes entre a espessura da orelha para camundon- gos tratados com abatacepte comparado com qualquer uma das molé- culas de fusão de ECD ICOSL Fc variantes indicadas testadas ou en- tre o tratamento com ICOSL variante. Esses resultados demonstram que moléculas de ICOSL variantes podem reduzir as respostas imune in vivo.
EXEMPLO 20 Geração e Avaliação de Ligação e Atividade de Moléculas Con- tendo Domínio IgSF ICOSL Variante
[00682] Moléculas contendo domínio da IgSF (por exemplo, ECD) ICOSL variante adicionais foram geradas, como descrito abaixo. Em cada uma das Tabelas abaixo, a Tabela indica substituições de ami- noácido no ECD do ICOSL variante como designado por número de posição de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido na respectiva sequência de domínio extracelular (ECD) ICOSL de refe- rência (por exemplo, não modificado) mostrada na SEQ ID NO:32. Em alguns casos, a remoção da sequência ligante ARA da ECD ICOSL variante Fc é indicada por "AAAA". A coluna 2 mostra o identificador de SEQ ID NO. para cada domínio ECD variante contido na molécula de fusão de ECD variante Fc. A. Geração de Variantes Adicionais
1. Variantes de Solubilidade
[00683] Da coleção de mutantes contendo as mutações que se- guem incluindo E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N528S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F1208S, V122A, F138L, 1143V, N43T, H152C, KI156M, F1728S, N194D, C198R, L203P, R221], 1224V, as mutações H115R, F1728S e C198R foram identificadas como muta- ções que podem potencialmente aumentar a solubilidade da proteína ou aumentar a expressão da proteína (mutações de solubilidade”). Es- sas três mutações (H115R, F172S e C198R) foram aleatoriamente in- troduzidas por mutagênese direcionada a sítio no mesmo conjunto de clones para gerar uma coleção de derivados que contêm uma ou mais dessas mutações de solubilidade. Devido ao fato que reação de muta- gênese direcionada a sítio ter sido realizada com oligos mutagênicos agrupados reagidos com clones parentais agrupados em uma reação única, alguns dos clones também continham algumas mutações de outros clones parentais. As variantes geradas continham entre 3 a 10 mutações de aminoácido diferentes em várias combinações, como sumarizado na Tabela 27A.
ID NO
2. Retrovariantes
[00684] Mutações exemplares particulares incluindo N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R, L203P identificadas em varian- tes selecionadas descritas no Exemplo 6 foram combinadas mais no ECD do ICOSL de referência (por exemplo, do tipo selvagem) com re- ferência a posições mostradas na SEQ ID NO:32 para gerar variantes de combinação adicionais. As variantes geradas continham entre 1 a 3 mutações de aminoácido diferentes em várias combinações como mostrado na Tabela 27B.
3. Variantes de Glicosilação
[00685] Mutações de glicosilação exemplares selecionadas de N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q foram combinadas em várias permutas no ECD de ICOSL de referência (por exemplo, do tipo selvagem) com referência a posições mostradas na SEQ ID NO:32 para gerar variantes de combinação adicionais. As va- riantes geradas continham entre 1 a 5 mutações de aminoácido dife- rentes em várias combinações como mostrado na Tabela 27C. Muta-
ções designadas com um "X" indicaram ou um N ou Q na posição indi- cada.
B. Ligação a Contraestruturas Expressas em Célula
[00686] As variantes adicionais foram formatadas como proteínas de fusão de Fc como descrito no Exemplo 4. As moléculas de fusão de Fc variantes foram avaliadas em estudos de ligação para avaliar espe- cificidade e afinidade de proteínas imunomoduladoras variantes de domínio de ICOSL com contrapartes de ligação cognatas. Células Ex- pi293 transfectadas com contrapartes de ligação cognatas, CD28 hu- mana, ICOS e CTLA-, foram usadas em estudos de ligação como descrito no Exemplo 6. MF! foi determinado para cada transfectantes e comparado com a ECD Fc não modificado correspondente (parental).
[00687] Resultados para a ligação para moléculas de fusão de ECD ICOSL variante Fc exemplares são mostrados nas Tabelas 28A-C. Como mostrado nas Tabelas 28A-C, variantes de domínio de IgSF (por exemplo, ECD) ICOSL geradas com as várias combinações de mutações especificas exibiram ligação aumentada para pelo menos um, e em alguns casos mais de um, ligante de contraestrutura cogna-
ta. C. Caracterização de Bioatividade com Ensaio de Coimobiliza- ção com Anti-CD3
[00688] A bioatividade coestimuladora de moléculas de fusão de Fc variantes geradas foi também avaliada em ensaios de imobilização com anti-CD3 como descrito no Exemplo 6. As Tabelas 28A-C mos- tram a razão de IFN-gama produzido por cada ECD variante-Fc com- parado com a ECD ICOSL não modificado Fc (tipo selvagem) corres- pondente no ensaio. Mutações designadas com um "X" indicam um Q ou o resíduo do tipo selvagem correspondendo à posição indicada de SEQ ID NO:32 na posição indicada. Como mostrado, moléculas de fusão de Fc variantes geradas exibiram atividades aperfeiçoadas para aumentar a atividade imunológica.
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EXEMPLO 21 Geração e Avaliação de Moléculas de Fusão com Anticorpo de Direcionamento a HER2
[00689] Esse exemplo descreve a geração e avaliação de molécu- las de fusão de ECD ICOSL Fc variante conjugadas com um agente de direcionamento a tumor para formar um conjugado ("conjugado de vIgD").
[00690] O domínio V apenas do vIgD ICOSL (N52H/N57Y/Q100P; mostrado na SEQ ID NO:201) foi fundido aos terminais amino e carbo- xila da cadeia leve (FIG. 10A) e cadeia pesada (FIG. 10B) de um anti- corpo de direcionamento a HER2 com ligantes GGGSGGGS interveni- entes. Configurações exemplares de conjugados de vlgD são mostra- das na FIG. 10C.
[00691] Para avaliar ligação de HER2, DNA de HER?2 ou transfec- tantes de Expi293 falsos foram tingidos com quantidades tituladas de um anticorpo de direcionamento a HER2 contendo o conjugado de ICOSL variante (conjugado de vigD N52H/N57Y/Q100P) em uma con- centração de 100 pM a 100 nM. Proteínas controle, incluindo molécula de fusão de ECD ICOSL Fc do tipo selvagem, fusão de IgV PD-L2 do tipo selvagem Fc e fusão de ECD ICOSL variante Fc com mutações em N52H/N57Y/Q100P, foram também testadas. Intensidade de Fluo- rescência Média (MFI) ou células positivas percentuais foi determinada para cada transfectantes como descrito no Exemplo 6. Todos os con- jugados de IgSF gerados como mostrado nas FIGS. 11A-11B retive- ram ligação a HER2 comparado com o nível endógeno de expressão de HER2 observada em células Expi293. Similarmente, conjugados de vIgD também mostraram ligação a contrapartes de ligação cognatas de ICOSL incluindo CD28, CTLA-4 e ICOS.
[00692] Bioatividade e proliferação de proteína de célula T primária humana em ensaios in vitro foram também caracterizadas como des-
crito no Exemplo 6. Conjugados de vIgD foram ligados de um dia para o outro a placas de 96 cavidades a 30-0,1 nM na presença de anti- CD3 10 nM. As placas foram lavadas e 100.000 células T pan marca- das com CFSE foram adicionadas às placas e incubadas por 72 horas. Níveis de IFN gama em sobrenadante foram ensaiados através de ELISA. Como mostrado na FIG. 12, conjugados de vIgD com as confi- gurações indicadas mostraram secreção e proliferação de IFN gama maiores comparado com conjugado de molécula de fusão de ECD ICOSL Fc do tipo selvagem parental. EXEMPLO 22 Assinatura Transcripcional Nanostring de Células T Humanas Primárias
[00693] Placas de cultura de tecido foram revestidas com anti-CD3 nM e com 40 nM de uma proteína controle Fc, ICOSL do tipo sel- vagem Fc, CD80 do tipo selvagem-Fc, ambas dessas proteínas, ou proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc com mutações como indica- do. Células T humanas purificadas foram então plaqueadas nas placas revestidas com proteína e incubadas a 37º C. Culturas de cada grupo de tratamento descrito acima foram coletadas em 24, 48 e 72 horas e RNA total foi preparado a partir de cada amostra de célula. O RNA foi transferido para Nanostring e um chip Cancer Immune foi usado para quantificar transcritos de gene 750 em cada amostra. Valores de transcrito foram normalizados usando software da proprietária do Na- nostring permitindo comparação de níveis de transcrito entre grupos de tratamento e nos vários pontos de tempo. Como mostrado nas FIG. 18 e FIG. 19, os polipeptídeos ECD ICOSL variantes Fc testados mos- tram atividade inflamatória alterada comparado com ECD CD80 do tipo selvagem-Fc, ECD ICOSL do tipo selvagem-Fc ou uma combinação de ambos.
EXEMPLO 23 Geração e Avaliação de Moléculas de Fusão com Anticorpo de Direcionamento a HER2
[00694] Proliferação de células T humanas coculturadas com VmAbs e células-alvo expressando HER?2 foi também caracterizada. Células T pan marcadas com CFSE foram estimuladas por 72 horas com células-alvo artificiais derivadas de K562 exibindo Fv de cadeia simples anti-CD3 (OKT3) e HER na superfície celular na presença de VmAbs ou proteínas controle. Proliferação foi medida através de análi- se citométrica de fluxo de diluição de CFSE em células T tingidas com CD4+ ou CD8+. VmAbs foram ensaiados variando ou o número de cé- lula-alvo ou a concentração do VmAb utilizado. No primeiro ensaio, células-alvo K562 foram tituladas de 2500 a 78 células/cavidade e adi- cionadas a 100.000 células T para uma faixa de efetora:alvo (E:T) de 40 a 1208:1. VmAbs, domínio IgSF parental ou ICOSL WT foram adi- cionados a 1000 pM. No segundo ensaio, células-alvo K562 foram adi- cionadas a 625 células/cavidade a 100.000 células T para uma razão de efetora:alvo de 160:1. VmAbs ou proteínas controle foram titulados e adicionados a 3000 a 37 pM. Como mostrado nas FIGS. 20A e 20B, ambas as configurações do ensaio demonstram que VmMAbs contendo o conjugado de vIgD proveem proliferação superior comparado com o anticorpo parental, domínio I9gSF parental ou ICOSL WT. Ainda, proli- feração mediada por conjugados de vlgD em razões de E:T baixas (1280:1) ou em concentrações de proteína baixas (37 pM). EXEMPLO 24 Geração e avaliação de Células Engenheiradas Expressando uma Proteína Imunomoduladora de Transmembrana e um Receptor de Célula T
[00695] Esse Exemplo descreve a expressão de várias proteínas imunomoduladoras de transmembrana (TIPs) contendo domínio I9SF
ICOSL variante com um receptor de célula T (TOR) específico para E6 recombinante exemplar em células T humanas e avaliação de prolife- ração de célula T.
[00696] CélulasT HLA-A2+ humanas foram ativadas no Dia O com esferas de ativação anti-CD3/antiCD28 (ThermoFisher Scientific, USA) e transduzidas, no dia 1, com um um TCR específico para HPV 6 (descrito no WO 2015/009606) e várias proteínas imunomoduladoras de transmembrana (TIPs) contendo um domínio I9gSF ICOSL variante. As ICOSL-TIPs exemplares tinham um domínio I9gSF com afinidade modificada contendo mutações de aminoácido correspondendo ou a E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R ou N52H/N57Y/Q100R com referência às posições no domínio extracelu- lar de ICOSL mostrado na SEQ ID NO: 32. As TIPs ICOSL também incluíam um domínio de transmembrana e citoplásmico corresponden- do aos resíduos 257-302 de SEQ ID NO: 5. Para comparação, células T também foram cotransduzidas com o TOR HPV E6 e ou com um CD80 WT-TIP (mostrado como aminoácidos 35-288 de SEQ ID NO: 1 e codificados pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 251) ou um ICOSL WT-TIP (mostrado como aminoácidos 19-302 de SEQ ID NO: 5 e codificados pela sequência de nucleotídeos mos- trada na SEQ ID NO: 252). Para transdução, as células foram transdu- zidas com um construto de vetor viral em que foi inserido um polinu- cleotídeo codificando a TIP e as sequências de cadeia de TCRa e TCRB, separadas umas das outras por uma sequência codificando uma sequência de pulo de ribossomo P2A (SEQ ID NO: 863), para co- expressão da TIP e do TCR contendo a cadeia de TORa e TOCRB nas células engenheiradas. Especificamente, o construto de ácido nucleico tinha a estrutura que segue: ICOSL — P2A1 — TCRB — P2A2 — TCRa, em que as sequências de nucleotídeo P2A1 e P2A2, cada uma, codifi- cavam a P2A mostrada na SEQ ID NO: 863, mas diferiam na sequên-
cia de nucleotídeo para evitar recombinação entre sequências.
[00697] Como um controle, as células T foram falso-transduzidas ou transduzidas com o TCR E6 exemplar apenas.
[00698] As esferas de ativação de célula T foram removidas no dia 3e as citocinas IL-2, IL-7 e IL-15 foram adicionadas à cultura. No dia 6 após transdução, expressão na superfície celular da TIP e TCR foi avaliada através de citometria de fluxo, com 35-65% de células enge- nheiradas duplo positivas para o TCR e TIP. As células expressando TCR foram expandidas na presença de peptídeo HPV E6 para resultar em uma população de células que eram >90% duplo positivas para o TCR/TIP conforme avaliado o dia 14. No dia 14, as células engenhei- radas foram incubadas com células infectadas com HPV, ou uma |i- nhagem de célula de carcinoma de célula escamosa UPCI:SCC152 (ATCCO CRL-32407Y; HPV+, HLA-A2+), células CaSki de carcinoma epidermoide (ATCCO No. CRL-15507Y; HPV+, HLA-A2+) ou células SiHa de carcinoma de célula escamosa (ATCCO HTB-35T"; HPV+, HLA-A2-). Proliferação das células engenheiradas foi avaliada no dia 3 após início de cocultura com células-alvo. Como mostrado na FIG. 21, proliferação aumentada de células T engenheiradas com TCR E6 foi observada nas duas linhagens de célula HPV+, mas não significante- mente na linhagem SiIHA HPV-. As células engenheiradas que coex- pressaram ICOSL TIPS variante tinham proliferação aumentada em resposta às linhagens de célula SCC152 e Caski-alvo HLA-A2+HPV+. EXEMPLO 25 Geração e Avaliação de Proteínas Imunomoduladoras de Fusão de Fc
[00699] —“Moléculas contendo domínio IgSF ICOSL variante (por exemplo, ECD) foram formatadas como proteínas de fusão de Fc substancialmente como descrito no Exemplo 4, exceto que usando vá- rios ligantes e moléculas de Fc. Para gerar proteínas imunomodulado-
ras que são proteínas de fusão de Fc contendo um ECD de ICOSL com pelo menos um domínio com afinidade modificada (por exemplo, ECD ICOSL variante-Fc), a molécula de ácido nucleico de codificação foi gerada para codificar uma proteína projetada como segue: ECD variante (mutante) ligado diretamente ou indiretamente por meio de um ligante a um Fc IgG1 humana inerte. Especificamente, as proteínas imunomoduladoras geradas ou não continham um ligante (nenhum) ou continham um ligante AMA ou G4S (SEQ ID NO: 636). O Fc IgG1 hu- manz inerte continha mutações, pela numeração EU, como se- gue:C220S/R292C/N297G/V302C (SEQ ID NO: 476), C220S/E233P/ L234V/L235A/G236del/S267K (SEQ ID NO: 478), C220S/L234A/L235E/ G237A (SEQ ID NO: 477), ou alotipos das mesmas. A substituição C2208S foi incluída porque as proteínas resultantes não incluíam uma cadeia leve de anticorpo que pode formar uma ligação covalente com uma cisteína. As proteínas de fusão de Fc variantes recombinantes foram produzidas em células 293 e purificadas com Proteína A subs- tancialmente como descrito no Exemplo 5.
[00700] As proteínas imunomoduladoras de fusão ICOSL variante- Fc foram avaliadas em estudos de ligação para avaliar ligação a con- trapartes de ligação cognatas. Células Expi293 transfectadas com con- trapartes de ligação cognatas, CD28 humano, ICOS e CTLAA, foram usadas como células-alvo em estudos de ligação como descrito no Exemplo 6. MFI de ligação de proteínas imunomoduladoras de fusão ICOSL variante Fc para célula-alvo expressando cada contraparte de ligação foi determinado e comparado com a ligação do ECD ICOSL não modificado (tipo selvagem)-Fc correspondente para as mesmas células-alvo. Modulação de atividade de célula T pelas proteínas imu- nomoduladoras de fusão ICOSL variante-Fc foi também determinada usando uma reação de linfócito misto (MLR) substancialmente como descrito no Exemplo 6.
[00701] “Resultados para a ligação de proteínas imunomoduladoras de fusão ECD ICOSL variante-Fc exemplares contendo vários ligantes e regiões Fc são mostrados na Tabela 29. A Tabela indica substitui- ções de aminoácido no ECD do ICOSL variante conforme designado pelo número da posição do aminoácido correspondendo às posições de aminoácido na respectiva sequência de domínio extracelular (ECD) ICOSOL de referência (não modificado) mostrada na SEQ ID NO: 32. A coluna 1 também mostra o identificador de SEQ ID NO para cada domínio ECD variante contido na fusão ICOSL variante Fc. A coluna 2 indica o ligante usado na proteína de fusão de Fc e o identificador SEQ ID NO para o ligante. A coluna 3 mostra as mutações no Fc pela numeração EU e o identificador da SEQ ID NO para o Fc contido na proteína de fusão de ICOSL variante-Fc.
[00702] Como mostrado na Tabela 29, resultados similares foram observados para ligação a contrapartes de ligação cognatas entre as proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc testadas. Esses resultados indicam que o formato da fusão de Fc com moléculas de Fc diferentes ou ligantes diferentes não impactou a ligação das variantes do domínio IgSF ICOSL para sua contraparte de ligação cognata. Ainda, todos os formatos de fusão de Fc, quando providos como moléculas de Fc biva- lentes em solução em uma reação MLR, exibiram uma atividade anta- gonista para diminuir ativação de célula T comparado com a molécula de ECD-Fc de referência (por exemplo, não modificada ou do tipo sel- vagem) não contendo a substituição de aminoácido. Em alguns casos, nenhum IFN-gama detectável foi medido no sobrenadante consistente com bloqueio completo de interações de contrapartes de ligação cog- natas ligantes coestimuladoras com seus ligantes para induzir secre- ção de IFN-gama.
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EXEMPLO 26 Expressão de Moléculas de ICOSL Variante em células CHO
[00703] Como uma alternativa para expressão de proteínas de fu- são de ICOSL variante-Fc em células Expi293 como descrito no Exemplo 5, suspensão de células de ovário de hamster Chinês (Expi- CHO-S) foram usadas para produzir várias moléculas de ICOSL. Um construto de DNA codificando as proteínas de fusão de IgSF (por exemplo, ECD) ICOSL variante Fc contendo o ECD variante (mutante) N52H/N57Y/Q100R/F1728 (SEQ ID NO:291) ligadas a um Fc inerte contendo mutações C220S/L234A/L235E/G237A pela numeração EU mostrada na SEQ ID NO: 477 ou um alotipo das mesmas mostrada na SEQ ID NO: 637, com um ligante GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) foi usado para transfectar células.
[00704] Células ExpiCHO-S, e reagentes para transfecção usando o ExpicHOTY Expression System, foram compradas da ThermoFisher Scientific (No. Cat. A29133). As células foram descongeladas e ex- pandidas de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Apos pelo menos 2 passagens, as células foram separadas 24 horas pré-transfecção e deixadas expander para densidade alta. As células foram então diluídas para o número de células para transfecção, com- plexo de DNA foi formado com o reagent ExpiFectamine!y CHO e adi- cionado às células. No dia após adição de complexo de DNA, o Expi- CHOY alimentado e ExpiFectamine'?y CHO Enhancer foram adiciona- dos à cultura, que foi então posta em uma incubadora a 32 graus C. À viabilidade celular e a massa celular foram monitoradas e a cultura foi coletada quando a viabilidade caiu abaixo de 80%. A cultura foi então centrifugada em velocidade baixa para remover o pélete celular, e o sobrenadante eliminado foi filtrado estéril 0,2 um. Proteína foi purifica- da como descrito no Exemplo 5.
A. Análise de Proteína
[00705] A proteína de fusão de ICOSI variante Fc purificada foi ad- ministrada em SDS-PAGE e analisada através de tingimento de prote- ína. Faixas múltiplas foram observadas em células produzidas a partir de células CHO, mas não a partir de células 293, que está de acordo com a observação que recorte (clipping) de proteólise do ICOSL esta- va ocorrendo quando expresso em células CHO. A Tabela 30A mostra o peso molecular de proteínas intactas, com um recorte e duplo recor- te calculados com base em sequências de aminoácido e carboidratos potenciais conforme observado através de SDS-PAGE. Proteólise das proteínas de fusão ICOSL Fc expressas em células derivadas de Ex- piCHO foi observada, como indicado na presença de ambas as espé- cies recortadas reduzidas/não reduzidas com peso molecular inferior (recorte único e duplo). Com base no tamanho das faixas observadas e análise de Espectrometria de Massa, esses resultados são consis- tentes com um sítio de clivagem potencial em ECD ICOSL correspon- dendo à sequência LOQN/LT ("/" indica sítio de clivagem potencial), dessa maneira resultando em clivagem antes da região espaçadora do ECD e remoção da porção Fc da sequência em uma ou ambas as ca- deias da proteína de fusão de Fc. A clivagem de protease observada pode resultar em um produto de proteína heterogêneo quando produ- zido em células CHO. Também os formatos expressos como proteínas imunomoduladoras de transmembrana, clivagem de protease, ocor- rendo em células, poderiam levar à liberação de proteína solúvel a par- tir de células, dessa maneira reduzindo formas expressas na superfície celular da proteína variante em células engenheiradas.
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EXEMPLO 27 Geração de Variantes Resistentes à Proteólise de Moléculas Con- tendo Domínio IgSF ICOSL
[00706] Para tornar polipeptídeos ICOSL variantes resistentes à proteólise quando da expressão em células, tal como em células CHO, várias formas adicionais de polipeptídeos ICOSL variantes foram ge- radas. As sequências de referência modificadas adicionais que se- guem do ECD ICOSL foram geradas: (1) vários truncamentos de ECD sem todo ou uma porção do sítio de clivagem de protease LOQQN/LT (chamado Trunc No. 4, No. 5, No. 6, No. 7 ou No. 8); sequências de referência variantes de ICOSL contendo mutações no sítio de clivagem N207 e/ou L208 com referência às posições mostradas na SEQ ID NO: 32; ou uma sequência de referência de IgV sozinha ICOSL con- tendo o domínio IgV como o domínio IgSF único da molécula (mostra- da na SEQ ID NO: 545, correspondendo aos aminoácidos 1-122 de SEQ ID NO: 32). Em alguns casos, combinações das estratégias aci- ma foram empregadas em uma sequência de referência de ECD ICOSL. A Tabela 30B abaixo mostra várias sequências de referência geradas.
[00707] As mutações exemplares N52H/N57Y/Q100R/F1728S, com referência à numeração mostrada na SEQ ID NO: 32, foram introduzi- das nas várias sequências de referência. Devido ao IgV ICOSL de re- ferência mostrado na SEQ ID NO: 545 não conter uma posição cor- respondendo a F1728, o IgV ICOSL variante não continha a mutação F1728S. Os polipeptídeos ICOSL variantes gerados foram formatados como uma proteína de fusão de Fc contendo o domínio I9gSF ICOSL de referência gerado ligado por meio de um ligante (G1S) (SEQ ID NO: 229) a um Fc inerte contendo mutações C220S/L234A/L235E/G237A/ K447del pela numeração EU mostrada na SEQ ID NO: 633 ou um alo- tipo das mesmas mostrado na SEQ ID NO: 637.
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A. Avaliação de Proteólise
[00708] Construtos de DNA codificando as moléculas de fusão de ICOSL variante Fc descritas acima foram transfectados em células de ovário de hamster Chinês (ExpiCHO-S). As proteínas de fusão de ICOSL-Fc foram então purificadas a partir de sobrenadantes com Pro- teína A através de cromatografia por afinidade como descrito no Exemplo 5. A proteína purificada foi analisada através de SEC analíti- ca.
[00709] — Através de SEC, proteína intacta exibida como um pico úni- co enquanto proteína recortada exibida como picos múltiplos, incluindo espécies de peso molecular inferior. Consistente com os resultados de SDS-PAGE descritos no Exemplo 26, proteólise conforme avaliado por SEC foi observada quando proteína de fusão de ECD ISOCL variante Fc foi expressa em células derivadas de ExpiCHO, como indicado pe- los picos múltiplos mostrados na FIG. 22A. Como mostrado nas FIGS. 22B-22G, picos únicos foram observados através de análise SEC das proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc geradas usando polipeptí- deos ICOSL de referência modificados em que o sítio de clivagem de protease ECD putativo foi removido ou mutado, indicando que cliva- gem reduzida das proteínas ocorreu. Em um lote de purificação, no entanto, espécies de peso molecular mais baixo foram observadas através de análise SEC da proteína de fusão de ICOSL variante-Fc gerada usando o polipeptídeo ICOSL de referência mostrado na SEQ ID NO: 604 (Trunc. No. 5), embora não fosse clara a razão da presen- ça dessa espécie nesse lote. Como mostrado na FIG. 22G, a geração de espécie de peso molecular menor, e, desta maneira, proteólise, também não foi observada através de análise SEC das proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc geradas usando a sequência de referên- cia sozinha de IgV ICOSL.
B. Ligação e Atividade
[00710] Ligação e atividade de proteína produzida e purificada se- guindo transfecção de construtos de DNA codificando as proteínas imunomoduladoras de fusão de ICOSL variante-Fc em várias sequên- cias de referência descritas acima em células CHO foram comparadas. Em alguns casos, clones purificados conforme avaliado abaixo foram mais tarde verificados conter mutações adicionais além daquelas des- critas acima, que não eram acreditadas impactar a atividade imuno- moduladora das proteínas testadas.
[00711] As proteínas imunomoduladoras de fusão de ICOSL varian- te-Fc purificadas resultantes foram avaliadas quanto à ligação a con- trapartes de ligação cognatas e para modulação de atividade de célula T usando uma reação de linfócitos mistos (MLR) substancialmente como descrito acima. A Tabela 30C indica substituições de aminoácido na sequência de referência de ICOSL conforme designado pelo núme- ro da posição do aminoácido correspondendo às posições de aminoá- cido na respectiva sequência de domínio extracelular de (ECD) ICOSL de referência (por exemplo, não modificada) mostrada na SEQ ID NO: 32 e mostra o identificador SEQ ID NO para cada sequência de refe- rência de ICOSL. Como mostrado, a atividade de ligação e antagonista de MLR era geralmente similar para todos os formatos de teste.
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C. Ligação e Atividade de Proteínas Expressas em Células 293 (Expi293) ou CHO
[00712] As proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc, geradas com base em sequências de referência de ICOSL descritas acima, foram avaliadas quanto à ligação e atividade seguindo expressão em células 293 (Expi293) ou CHO. Ainda, um construto de DNA codificando vari- antes de ICOSL de domínio IISF exemplares N52H/N57Y/Q100R/ C198R ou N52H/Q100R, em sequências de referência de ICOSL exemplares como mostrado na Tabela 30D, também foi ligado a muta- ções contendo Fc inerte C220S/L234A/L235E/G237A pela numeração EU mostrada na SEQ ID NO: 477, e foi produzido e purificado seguin- do transfecção de células 293 ou CHO com os construtos de DNA. Ainda, uma proteína imunomoduladora variante exemplar foi gerada como um monômero em que células foram transfectadas com um construto de DNA codificando a variante na sequência de referência de ECD ICOSL variante, mas sem fusão com uma sequência de Fc.
[00713] As proteínas de fusão de ICOSL variante-Fc purificadas resul- tantes ou monômero de ICOSL variante foram avaliados quanto à ligação a contrapartes de ligação cognatas e quanto à modulação de atividade de célula T usando uma reação de linfócitos mistas (MLR) substancialmente como acima descrito. A Tabela 30D indica substituições de aminoácido na sequência de referência do ICOSL variante conforme designado pelo número da posição do aminoácido correspondendo às posições de ami- noácido na respectiva sequência de domínio extracelular (ECD) de ICOSL de referência (por exemplo, não modificado) mostrada na SEQ ID NO: 32, e mostra o identificador SEQ ID NO para cada sequência de ICOSL de refe- rência. A coluna 3 indica o tipo de célula (EXxpiCHO-S ou Expi293) usado para produzir a proteína ICOSL. Como mostrado na Tabela 30D, os resulta- dos indicam ligação e atividade substancialmente similares, sendo a proteí- na imunomoduladora de ICOSL variante produzida ou não em células CHO ou 293.
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EXEMPLO 28 Geração de Biblioteca Variante de NNK de Variantes de Domínio IgSF ICOSL e Avaliação de Ligação e Atividade
[00714] “Moléculas contendo domínio I9SF ICOSL variante adicio- nais foram geradas com mutações nas posições 52, 57 e 100 com re- ferência às posições mostradas na SEQ ID NO: 32. As variantes foram geradas a partir de uma biblioteca de NNK, onde K=T ou G, de modo que os códons de codificação codificam todos os aminoácidos poten- ciais, mas evitam a codificação de dois resíduos de parada TAA e TGA. O DNA da biblioteca de NNK foi introduzido em levedura subs- tancialmente como descrito no Exemplo 2 para gerar bibliotecas de levedura. As bibliotecas foram usadas para selecionar levedura ex- pressando variantes com afinidade modificada de ICOSL substancial- mente como descrito no Exemplo 3.
[00715] As moléculas contendo domínio I9SF ICOSL variante sele- cionadas foram formatadas mais como uma proteína de fusão de Fc substancialmente como descrito no Exemplo 4 exceto que contendo o domínio IgSF ICOSL gerado ligado por meio de um ligante GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) a mutações contendo Fc inerte C220S/L234A/ L235E/G237A/K447del pela numeração EU mostrada na SEQ ID NO: 633 ou um alotipo das mesmas mostrado na SEQ ID NO: 637.
[00716] As proteínas imunomoduladoras de fusão de ICOSL varian- te-Fc foram avaliadas em estudos de ligação para avaliar ligação a contrapartes de ligação cognatas. Células Expi293 transfectadas com contrapartes de ligação cognatas, CD28 humano, ICOS e CTLAA, fo- ram usadas como células-alvo em estudos de ligação como descrito no Exemplo 6. MFI de ligação de 100 nM de proteínas imunomodula- doras de fusão de ICOSL variante-Fc a células-alvo expressando cada contraparte de ligação foi determinado e comparado quanto à ligação da IgV ICOSL Fc de referência (por exemplo, não modificado ou do tipo selvagem) de referência para a mesma célula-alvo. A bioatividade coestimuladora de moléculas de fusão de ICOSL variante-Fc geradas foi também avaliada em ensaios de coimobilização anti-CD3 (100 mM) como descrito no Exemplo 6. Modulação de atividade de célula T pelas proteínas imunomoduladoras de fusão de ICOSL variante-Fc foi tam- bém determinada usando uma reação de linfócitos mistos (MLR) com ICOSL-Fc 1 nM substancialmente como descrito no Exemplo 6. Secre- ção de IFN-gama a partir de poços em triplicata foi determinada.
[00717] Resultados para ligação e atividade funcional, com base em bioatividade coestimuladora ou atividade em um ensaio de MLR, para moléculas de fusão de IgV ICOSL variante-Fc exemplares são mostra- dos na Tabela 31. A Tabela abaixo indica substituições de aminoácido no ICOSL variante como designado pelo número da posição do ami- noácido correspondendo às posições de aminoácido na respectiva se- quência de domínio extracelular (ECD) ICOSL (por exemplo, não mo- dificado) de referência mostrada na SEQ ID NO: 32. A coluna 2 mostra o identificador SEQ ID NO para cada domínio IgV variante contido na molécula de fusão de IgV variante-Fc. Como mostrado, as variantes de domínio (por exemplo, IgV) IgSF ICOSL geradas com as várias combi- nações de mutações específicas nas posições 52, 57 e 100 exibiram ligação alterada para pelo menos uma, e em alguns casos mais de uma, contraparte de ligação cognata. As duas últimas colunas da Ta- bela também mostram a atividade funcional das moléculas de fusão de Fc variantes para modular a atividade de células T com base nos ní- veis calculados de IFN-gama em sobrenadantes de cultura (pg/mL) gerados ou i) com a molécula solúvel de fusão de IgV variante-Fc indi- cada coimobilizada com anti-CD3 ou ii) com a molécula de fusão de Fc-lgV variante indicada em um ensaio de MLR. A Tabela também mostra a razão de IFN-gama produzido por cada ECD variante-Fc comparado com ECD-Fc de referência (por exemplo, não modificado ou do tipo selvagem) correspondente em ambos ensaios funcionais.
Proteínas de fusão de Fc variantes também exibiram atividade imuno- lógica alterada.
Sinalização coestimuladora de algumas moléculas va- riantes foi substancialmente maior comparado com ICOSL do tipo sel- vagem.
Certas variantes exibiram inibição substancial de IFN-gama com muito pouco IFN-gama a nenhum detectável produzido nas cultu- ras no ensaio MLR.
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EXEMPLO 29 Avaliação de Células K562 Expressando uma Proteína Imunomo- duladora de Transmembrana (TIP)
[00718] Células K562 foram engenheiradas para expressar uma Proteína Imunomoduladora de Transmembrana (TIP) que continha o ECD dos domínios IQVD ICOSL fundidos aos domínios de transmem- brana e intracelular de ICOS humano WT mostrado na SEQ ID NO: 5. A TIP-ICOSL variante exemplar tinha um domínio I9SF com afinidade modificada contendo mutações de aminoácido correspondendo a N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283) ou E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/ C198R (SEQ ID NO: 300) com referência às posições no domínio ex- tracelular ICOSL mostrado na SEQ ID NO: 32.
[00719] Células K562 (ATCC) foram marcadas com CFSE para dis- tingui-las melhor de células T em ensaios de cocultura. Células T hu- manas primárias purificadas foram marcadas com Cell Trade Far Red (ambos da Thermo-Fisher) e coplaqueadas em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 poços com anticorpo anti-CD3. Para prover um sinal de TCR para células T, anticorpo anti-CD3 foi incluído em formato solúvel em uma gama de concentrações que permitiram apresentação por K562 desse anticorpo estimulador através da CD32 receptora-Fc pelas células. As células foram incubadas por 72 horas e proliferação de CD4+ (FIG. 23A) e CD8+ (FIG. 23B) foi monitorada e reportada como porcentagem de células divididas versus concentração anti-CD3. Cada ponto representa a média de poços de triplicata com barras de erro mostrando desvio padrão.
[00720] Células K562 do tipo selvagem estimularam células T a pro- liferar quando coincubadas com anticorpo anti-CD3 solúvel de uma maneira dependente da dose, enquanto células K562 na ausência de anti-CD3 não. Como mostrado nas FIGS. 23A e 23B, expressão de
TIP ICOSL WT sobre a superfície melhorou as respostas, mas os efei- tos foram maiores quando células K562 expressaram TIPS ICOSL va- riante, indicando que essas moléculas expressas nas superfícies de célula proveram coestimulação superior para células T. EXEMPLO 30 Avaliação de Ligação e Função Coestimuladora de Moléculas de Fusão com Anticorpo se Direcionando a HER2
[00721] Um ECD ICOSL variante exemplar, contendo mutações N52H/N57Y/Q100R, foi fundido ou às extremidades N ou C terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo anti-HER2 exemplar, trastuzu- mab, como mostrado nas várias configurações mostradas nas FIGS. 24A-24F. DNA de VmAbs codificando cada um dos construtos diagra- mados nas FIGS. 24A-24F foi transfectado em células HEK-293 e pro- teínas secretadas foram purificadas pela Proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas V-mAb resultantes foram em seguida avaliadas quanto à retenção de propriedades de ligação apro- priadas. Células HEK-293 foram transientemente transfectadas com vetores de expressão de HER2, CD28 ou ICOS e cada transfectantes foi então incubado com proteínas V-mAb individuais mais um anticorpo secundário para detecção de reagentes ligados. Como mostrado na FIG. 24A, ligação a HER?2 foi retida por todas as V-mAbs embora a magnitude da ligação fosse um pouco reduzida. Além disso, ligação de V-mAbs a células transfectadas com CD28 estava na maioria intacta, embora algumas poucas formas mostrassem alguma redução em liga- ção (FIG. 24A). Esses dados indicam que as variantes de ICOSL fun- didas a cadeias pesada e/ou leve de anticorpo para formar proteínas de fusão retiveram muito atividade de ligação de contraestrutura e an- ticorpo.
[00722] Para testar se VmAbs poderiam acionar coestimulação es- pecífica de alvo de células T, um sistema de célula transfectada inclu-
indo uma linhagem repórter de célula T para medição de coestimula- ção foi usado. Células Jurkat com um repórter da luciferase promotor de IL-2 foram usadas para avaliar função coestimuladora. Para estimu- lar as células, células K562 foram engenheiradas para uso como célu- la apresentando antígeno artificial. Especificamente, células K562 fo- ram transduzidas com um lentivírus codificando uma versão de Fv de cadeia simples do anticorpo anti-CD3 OKT3 com ou sem transdução com um lentivírus separado direcionando expressão de HER?2. Células K562 exibindo Fv de cadeia simples anti-CD3 de superfície celular (OKT3) com ou sem expressão de HER2 na superfície foram plaquea- das em Tampão de Ensaio Jurkat (RPMI1640 + FBS5%) a 2x10º célu- la/cavidade. Células-alvo foram incubadas com V-mAbs tituladas a partir de 20.000 pM a 6 pM ou proteínas-controle por 20 minutos em temperatura ambiente. Células efetoras Jurkat expressando um gene repórter da luciferase IL-2 (Promega) foram adicionadas a 1x105 célu- las/poço para trazer o volume final/poço para 100 ul. Células-alvo e Jurkat foram incubadas por 5 horas a 37º C. As placas foram removi- das da incubadora e aclimatadas para temperatura ambiente por 15 minutos. 100 ul de solução de lise celular e substrato de luciferase (Bi- oGlo luciferase reagent, Promega) foram adicionados a cada cavidade e as placas foram incubadas em um agitador orbital por 10 minutos. Luminescência foi medida com um tempo de integração de 1 segundo por poço usando um leitor de imagem Cytation 3 (BioTek Instruments). Valores de luminescência relativa (RLU) foram determinados para ca- da amostra de teste e reportados.
[00723] Como mostrado na FIG. 24B, inclusão de trastuzumab nati- vo não teve nenhum efeito sobre indução de luciferase. Similarmente, inclusão da proteína Fusão de ICOSL variante-Fc N52H/N57Y/Q100R (não fundida a trastuzumabe) não afetou respostas (FIG. 24B). No en- tanto, inclusão de V-mAbs múltiplas proveu um sinal coestimulador significante na presença de células HER2+ K562/OKT3 que era muito mais robusto do que K562/OKT que não tinha a expressão de HER2 (FIGS. 24C-24F). Em alguns casos, sinal foi induzido em células K562/OKT3 sem HER?2, mas isso era mais provável devido ao domínio Fc das V-mAbs permitindo apresentação mediada por CD32 das V- mAbs. Os resultados indicam que fusão de um polipeptídeo ICOSL variante a um anticorpo pode ser usada para administrar um sinal co- estimulador de célula T localizado. EXEMPLO 31 Geração de Moléculas Empilhadas Contendo Domínios com Afi- nidade Modificada de ICOSL e NKp30
[00724] Esse exemplo descreve proteínas imunomoduladoras que foram geradas como construtos de empilhamento de multidomínio con- tendo um domínio IgV com afinidade modificada a partir de polipeptí- deos ICOSL variantes identificados e polipeptídeos NKp30 variantes identificados descritos acima. Especificamente, uma IgV ICOL variante exemplar (N52D como mostrado na SEQ ID NO: 548; N52H/Q100R como mostrado na SEQ ID NO:567; N52H/N57Y/Q100R como mos- trado na SEQ ID NO: 565; N52L/N57H/Q100R como mostrado na SEQ ID NO: 761) e a molécula IgV NKp30 variante exemplar L30V/A60OV/ S64P/S86G (SEQ ID NO: 504) foram ligadas juntas e fundidas em um Fc inerte (contendo mutações L234A, L235E e L235E em um Fc IgG humana, por exemplo, mostradas na SEQ ID NO: 637) em várias con- figurações. Construtos de empilhamento homodiméricos foram gera- dos contendo subunidades de Fc idênticas em que a IgV ICOSL vari- ante e IgV NKp30 variante foram ligadas de várias maneiras ao termi- nal N ou C da região Fc por meio de um ligante peptídico GSGGGS (SEQ ID NO: 635) e/ou 3x GGGGS (SEQ ID NO: 28). Outros ligantes e regiões Fc são também adequados para geração de moléculas de empilhamento. Pilhas exemplares geradas são mostradas abaixo.
[00725] “Molécula de ácido nucleico codificando as proteínas imu- nomoduladoras também continha resíduos codificando o peptídeo de sinal exemplar MGSTAILALLLAVLQGVSA (mostrado na SEQ ID NO: 225). Construtos de expressão codificando proteínas de fusão de Fc de interesse foram transientemente expressas em células HEK293 Expi293 da Invitrogen usando os reagents e meios Expifectamine co- merciais da requerente. Os sobrenadantes foram coletados e proteína foi capturada e eluída a partir de uma coluna de Proteína A usando um Sistema de purificação de proteína AKTA.
[00726] A molécula de ácido nucleico de codificação foi projetada para produzir pilhas homodimérica em várias configurações de se- quências na ordem mostrada na Tabela 32. TABELA 32: descrição de proteínas imunomodualdoras ICOSL/NKp30
SEQ ID NO Proteína (DNA | Descrição SEQ ID NO) ICOSL/NKp30 912 (911) ICOSL variante (SEQ ID NO: 548) - 3x GGGGS Pilha 1 (SEQ ID NO: 228) — NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) — GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) - Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 914 (913) ICOSL variante (SEQ ID NO: 548) - 3x GGGGS Pilha 2 (SEQ ID NO: 228) — NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) — Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 916 (915) ICOSL variante (SEQ ID NO: 567) -— 3x GGGGS Pilha 3 (SEQ ID NO: 228) — NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) — GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) - Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 918 (917) ICOSL variante (SEQ ID NO: 567) -— 3x GGGGS Pilha 4 (SEQ ID NO: 228) — NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) — Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 920 (919) ICOSL variante (SEQ ID NO: 565) - 3x GGGGS
Pilha 5 (SEQ ID NO: 228) — NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) — GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) - Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 922 (921) ICOSL variante (SEQ ID NO: 565) - 3x GGGGS Pilha 6 (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) — Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 924 (923) ICOSL variante (SEQ ID NO: 761) - 3x GGGGS Pilha 7 (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) — GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) - Fc (SEQ ID NO: 637) ICOSL/NKp30 926 (925) ICOSL variante (SEQ ID NO: 761) - 3x GGGGS Pilha 8 (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228) - NKp30 variante (SEQ ID NO: 504 ) - GSGGGGS (SEQ ID NO: 635) — Fc (SEQ ID NO: 637) EXEMPLO 32 Avaliação de Ligação a Contraestruturas Expressas em Célula e Bioatividade de Moléculas de Empilhamento Contendo Domínio de ICOSL e NKp30
[00727] Esse exemplo descreve estudos de ligação para mostrar especificidade e afinidade de proteínas imunomoduladoras de empi- lhamento ICOS/NKp30 exemplares geradas no Exemplo 31 para con- trapartes de ligação cognatas. As proteínas imunomoduladoras de empilhamento ICOSL/NKp30 exemplares geradas no Exemplo 31 também foram avaliadas quanto à caracterização de bioatividade em uma célula T primária humana e ensaio in vitro. A. Ligação à Contraestrutura Expressa em Célula
[00728] Estudos de ligação de empilhamento de ICOSL/NKp30 fo- ram realizados em células com expressão na superfície celular estável ou transiente de contrapartes de ligação cognatas específicas para proteínas imunomoduladoras variantes de domínio ICOSL ou NKp30- Fc.
[00729] Para avaliação de ligação a uma contraparte de ligação de domínios ICOSL variantes, células de ovário de hamster Chinês (CHO) foram usadas, as quais tinham sido transduzidas com lentivírus para expressão na superfície de CD28, CTLA-4 ou ICOS humano de com- primento integral.
[00730] Para produzir células expressando a contraparte de ligação cognata de NKp30, um construto de expressão na superfície de mamí- fero de comprimento integral contendo B7-H6 humano foi clonado em um vetor de expressão de pcDNA3.1 (Life Technologies). Estudos de ligação foram realizados usando o sistema de transfecção transiente Expi293F (Life Technologies, USA). Em suma, para uma transfecção de 30 mL, aproximadamente 75 milhões de células Expi293F foram incubados com 30 ug de DNA de construto de expressão e 1,5 mL de reagente ExpiFectamine 293 diluído por 48 horas, ponto no qual as células foram coletadas para tingimento.
[00731] Para análise citométrica de fluxo, 200.000 células de uma dada linhagem de célula estável, transfecção transiente ou controle negativo apropriado foram plaqueadas em placas de fundo redondo de 96 poços. As células foram giradas e suspensas em tampão de tingi- mento (PBS (solução salina tamponada com fosfato), BSA 1% (albu- mina de soro bovino) e azida de sódio 0,1%) por 20 minutos para blo- quear ligação não específica. Em seguida, as células foram centrifu- gadas novamente e suspensas em tampão de tingimento contendo 100 nM a 32 pM de proteína de empilhamento ou controle ICOSL/ NKp30 em 50 uL. Tingimento primário foi realizado por 45 minutos, antes da lavagem das células em tampão de tingimento duas vezes. Proteína ligada foi detectada com IgG anti-humano conjugado a PE (Jackson ImmunoResearch, USA) diluído 1:150 em 50 ul de tampão de tingimento e incubada por 30 minutos. Após incubação final, as cé- lulas foram lavadas duas vezes para remover anticorpos conjugados não ligados, fixadas em formaldeído 2%/PBS e analisadas em um ci- tômetro de fluxo LSRII (Becton Dickinson, USA). Intensidade de Fluo- rescência Média (MFI) foi calculada para cada amostra com software FlowJo Versão 10 (FlowJo LLC, USA).
[00732] Atividade de ligação conforme medido por MFI foi avaliada para todas as proteínas de fusão ICOSL-NKp30 ou controles. Como mostrado nas FIGS. 25A-25D, proteínas de empilhamento exemplares se ligaram a proteínas cognatas de ambas ICOSL e NKp30 com alta afinidade. B. Avaliação de Bioatividade de Moléculas Contendo Domínio IgSF de Afinidade Amadurecida
[00733] Bioatividade da proteína de empilhamento ICOSL/NKp30 solúvel em uma cocultura com células B7-H6+ para indução de produ- ção de citocina em células T humanas primárias. Células K562 que expressam endogenamente B7-H6 foram transduzidas com lentivírus para expressar Fv de cadeia simples CD3 anti-humano de superfície celular (OKT3) provendo alvos K562/OTK3. Células T primárias huma- nas foram coculturadas para uma razão de efetor para alvo (E:T) de 2,5 ou 10:1 com proteínas de empilhamento ICOSL/Nkp30 ou controle tituladas a partir de 100 nM a 49 pM em 200 uL de volume final de meio Ex-Vivo 15. Nos dias 3-5, o ensaio foi termiando e sobrenadantes de cultura foram testados usando kits IL-2 e TNF-alfa ELISA MAX (Bio- legend, USA). A densidade óptica foi medida em uma BioTek Cytation Multimode Microplate Reader (BioTek Corp., USA) e quantificada con- tra padrões de rlL-2 e rTNF-alfa titulados incluídos nos kits ELISA.
[00734] Os resultados para os estudos de bioatividade para proteí- nas de empilhamento de ICOSL/NKp30 testadas exemplares são mos- trados nas FIGS. 26A e 26B, que mostram os níveis calculados de |L-2 ou IFN-gama em sobrenadantes de cultura (pg/mL). O identificador de sequência (SEQ ID NO) para cada uma das proteínas de empilhamen-
to é mostrado nas FIGS. 26A e 26B. Incubação na presença de proteí- nas de empilhamento de ICOSL/NKp30 exemplares nesse ensaio re- sultou em níveis aumentados de indução de citocina dependente de B7-H6 em células T humanas primárias demonstrado por um aumento em produção de citocina com as pilhas de ICOSL/NKp30 comparado com as proteínas ICOSL ou NKp30 parentais sozinhas. C. Avaliação de Proliferação
[00735] —Proliferação de células T humanas coculturadas com prote- íÍnas de empilhamento de ICOSL/NKp30 e células B7-H6+ foi também caracterizada. Células T primárias humanas marcadas com CFSE fo- ram estimuladas por 3-5 dias com K562/OKT3 em uma razão E:T de 2,5 a 10:1 na presença de proteínas de empilhamento ICOSL/NKp30 ou proteínas-controle. Proteínas-controle ICOSL/NKp30 exemplares foram tituladas a partir de 100 nM a 49 pM em 200 uL de volume final de meio Ex-Vivo 15. Proliferação foi medida através de análise citomé- trica de fluxo de diluição de CFSE em células T tingidas CD4+ ou CD8+ usando citômetro de fluxo LSRII e software Flowjo como acima descrito.
[00736] Como mostrado na FIG. 27, proteínas de empilhamento ICOSL/NKp30 testadas exemplares coestimularam proliferação de cé- lulas T CD4+ humanas primárias de uma maneira dependente de B7H6 demonstrada por um aumento em proliferação da pilha de ICOSL/NKp30 comparado com as proteínas ICOSL ou NKp30 paren- tais sozinhas. EXEMPLO 33 Avaliação de Moléculas de Empilhamento Contendo Domínio de ICOSL e NKp30 em combinação e Anticorpo Anti-PD-1 em Modelo de Tumor
[00737] Esse Exemplo descreve a avaliação de atividade antitumor de proteínas de empilhamento ICOSL/NKp30 exemplares, geradas como descrito no Exemplo 31, avaliadas sozinhas ou em combinação com um anticorpo monoclonal para PD-1 anticamundongo (mMAb mPD- 1) em camundongos carregando células de carcinoma de cólon CT26 B7-H6+.
[00738] Os camundongos foram implantados subcutaneamente com aproximadamente 0,3 x 10º células de tumor CD26 B7-H6+. Os tumores foram cultivados para o dia 13 e os camundongos foram esta- giados e medidos quanto a volumes de tumor médios (80 a 120 mm?º). Os tumores foram medidos com compassos de calibre eletrônicos bi- dimensionalmente começando no dia 6 após implante do tumor. Os volumes do tumor foram medidos e o volume de tumor mediano foi de- terminado. Três camundongos/grupo com os menores tumores iniciais (-75 mm?) foram excluídos da análise.
[00739] “Como mostrado na FIG. 28, a combinação da proteína de empilhamento ICOSL/NKp30 testada e mAb mPD-1 reduziu significan- temente o crescimento do tumor (volumes de tumor médios) com o tempo comparado com grupos tratados com controle de Fc, ou ICOSL ou NKp30 sozinho, empilhamento de ICOSL/NKp30 sozinho ou mAb PD-1 anticamundongo sozinho. Quaisquer diferenças em crescimento de qualquer grupo de tratamento com tumores CT26 parentais (negati- vo para B7-H6) foram observadas. A atividade antitumor da combina- ção como mostrado na FIG. 28 é consistente com a constatação que a combinação da proteína de empilhamento ICOSL/NKp30 e anticorpo anti-PD-1 é melhor do que os reagentes individuais sozinhos. EXEMPLO 34 Avaliação de Dosagem e Efeitos in vivo de Moléculas de Fusão de IgV ICOSL-Fc em um Modelo CIA
[00740] “Moléculas de fusão de IgV ICOSL variante-Fcs foram avali- adas quanto à atividade anti-inflamatória no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) ou com dosagem profilática ou terapêutica. A mo-
lécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc foi dosada em um máximo de 4 vezes ou antes ou logo após o início da doença. A molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc continha um IgV ICOSL variante com N52H/N57Y/Q100P como mostrado na SEQ ID NO: 570 ou N52H/ N57Y/Q100R como mostrado na SEQ ID NO: 565, fundida a um Fc inerte (contendo mutações L234A, L235E e L235E em Fc IgG1 huma- na, por exemplo, mostrada na SEQ ID NO: 637).
[00741] Para indução de inflamação de articulação, os camundon- gos foram injetados no dia -18 ou -21 com uma emulsão de colágeno IV/VCFA de galinha ou bovina na cauda e com uma emulsão de coláge- no II/IFA de galinha ou bovina (“reforço”) no dia 0. Para dosagem profi- lática, os camundongos foram dosados com a molécula de fusão de IgV ICOSL-Fc (N52H/N57Y/Q100P) com quatro doses começando no dia do reforço, antes do início da doença. Para tratamento terapêuti- co/retardado, os camundongos foram dosados com a molécula de fu- são de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) iniciado quando o resultado de pata observado foi maior do que um, e a dosagem ocor- reu a cada dois dias por um total de quatro doses. Como um controle, moléculas apenas de Fc e uma molécula de CTLA-4-Fc (abatacepte) foram também testadas. Resultado de pata baseado em vermelhidão e inchaço foi determinado. Soro foi também coletado para medir anticor- pos anticolágeno (IgG CllI) e citocinas proinflamatórias IL-6 e TNFa. Células de drenagem de nós linfáticos foram coletadas, tingidas para CD4, CD8, CD44 ou marcadores de células T auxiliares foliculares (TrH) (CD25-CD4+PD-1+CXCR5+). As FIGS. 29A-29D mostram resul- tados para dosagem profilática. Os camundongos tratados com a mo- lécula de fusão IgV ICOSL variante-Fc no tratamento de dosagem pro- filático mostraram doença suprimida no modelo de camundongo CIA de artrite reumatoide como mostrado por um resultado de pata de so- ma média menor (FIG. 29A) e IgG CIl detectado diminuído (FIG. 29B).
*p<0,05 para IgV ICOSL-Fc vs. abatacepte **p<0,001 para IgV ICOS- Fc vs. PBS (ANOVA de medições repetidas de 2 vias). Níveis menores de citocinas no soro (FIG. 29C) e células T ativadas CD44+ ou células TrnH (FIG. 29D) foram também observados em camundongos tratados com a molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc comparado com controle de Fc; * p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p< 0,0001 (por ANOVA de 1 via). A fração de células B na drenagem de nó linfático foi também significantemente reduzida no grupo tratado com IgV ICOSL- Fc vs. o grupo controle de Fc (p<0,05) (FIG. 29E).
[00742] As FIGS. 30A-30D mostram resultados para dosagem re- tardada. A IgV ICOSL variante-Fc resultou no resultado de pata de soma média mais baixa (FIG. 30A) e mudança percentual maior em peso corporal (FIG. 30B) comparado com outros grupos, incluindo o controle abatacepte. Como mostrado na FIG. 30C e na FIG. 30D, cito- cinas no soro foram também suprimidas no modelo CIA terapêutico em camundongos tratados com a IgV ICOSL-Fc variante. Significância es- tatística entre os grupos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 pelo teste t não emparelhado de Student. Na FIG. 30C e na FIG. 30D, as linhas hori- zontais pontilhadas indicam o limite de quantificação inferior do ensaio (LLOQ) para cada citocina.
[00743] Juntos, esses dados evidenciam que as vias de CD28 e ICOS desempenham papéis importantes em artrite inflamatória. Em particular, a atividade superior do antagonista de CD28/ICOS duplo de ICOSL variante é consistente com uma observação que bloqueio de ambas as vias é necessário e que apenas benefício parcial é obtido por um bloqueio de única via. EXEMPLO 35 Avaliação de Efeitos in vivo de Moléculas de Fusão de IgV ICOSL- Fc em um Modelo EAE
[00744] “Uma molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc foi avali-
ada quanto à atividade anti-inflamatória em um modelo de encefalomi- elite autoimune experimental de transferência adotiva (EAE). A molé- cula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc testada contendo um IgV ICOSL variante (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fundido a um Fc inerte (contendo mutações L234A, L235E e L235E em um Fc IgG1 humana).
[00745] —“Camundongos fêmeas C57BL/6 foram subcutaneamente injetados com uma emulsão MOG;s5-55/CFA. Depois de 11 dias, células do baço foram obtidas e culturadas com peptídeo MOG35-55, IL-12 e anti-|IFNy. Três dias após a cultura, células T encefalolitogênicas foram administradas através de injeção intraperitoneal (Dia 0). Os camun- dongos foram dosados com molécula de fusão IgV ICOSL variante-Fc dia-sim-dia-não começando no Dia O por um total de cinco doses. Co- mo um controle, apenas moléculas de Fc e uma molécula de CTLA-4- Fc (abatacepte) foram também testadas. Por 20 dias após injeção das células T, os camundongos foram pesados, monitorados e avaliados quanto ao resultado de EAE como descrito na Tabela 33. No final do estudo, soro foi coletado para análise de citocinas proinflamatórias, e as células de drenagem de nós linfáticos foram coletadas para análise citométrica de fluxo. EL Tas RT AA 3 Cauda mole e paralisia completa das pernas traseiras, cauda mole OU com paralisia de uma perna da frente e uma traseira, OU TODOS DE: 1) Inclinação da cabeça grave, 2) Andar sozinho ao longo das bordas da gaiola, 3) Empurrar contra a parede da gaiola, 4) Girar quando pas ra 4 Cauda mole, paralisia da perda traseira completa e per- O leme o US Paralisia completa da perna traseira e da perna da frente, nenhum movimento; OU o Camundongo está rolando espontaneamente na gaiola; OU o Camundongo foi encontrado morto devido à paralisia
[00746] “Como mostrado na FIG. 31A, camundongos tratados com a molécula de fusão IgV ICOSL variante-Fc suprimiram doença no mo- delo de camundongo EAE como mostrado por um resultado de EAE inferior, *p<0,0001 por Área sob a Curva (AUC) ANOVA de 1 via; mo- lécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc comparado com controles.
[00747] Para análise citométrica de fluxo de células T de nó linfático inguinal, as células foram tingidas com corante de viabilidade e ana- lisadas com anti-CD44, anti-CD62L, anti-CD4, anti-CD8 e avaliadas quanto à porcentagem de células T CD4+ e CD8+ puras (CD62L+CD44-) e de memória Tefetora (Tem) (CD62L CD44+) viáveis. Como mostrado na FIG. 31C, células Tem CD4+ e CD8+ foram reduzidas com tratamento com a molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc (****p<0,0001; ***p<0,001 por ANOVA de 1 via).
[00748] Citocinas no soro foram avaliadas no Dia O (2 horas após a 1º dose) e no Dia 6 (1 hora antes da 4º dose). Como mostrado na FIG. 31D, a molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc testada resultou em redução de citocinas proinflamatórias em soro no Dia 0, incluindo IL-5, I1L-10, I1L-12p70 e TNFa. No dia 6, níveis no soro de IFN-gama e IL-6 foram reduzidos por tratamento com a molécula de fusão de IgV ICOSL variante-Fc comparado com controle de Fc.
EXEMPLO 36 Estudo de Variação de Dose de IgV ICOSL variante-Fc em Modelo de Doença Enxerto-Versus-Hospedeiro (GvHD)
[00749] Um estudo de variação de dose foi conduzido com 20, 100 ou 500 ug de uma molécula de IgV ICOSL variante-Fc, contendo um IgV ICOSL variante (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fundido a um Fc inerte (contendo mutações L234A, L235E e L235E em um Fc IgG1 hu- mana, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 637), em um modelo de camundongo de doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). A atividade da molécula de IgV ICOSL variante-Fc foi comparada com belatacepte (CTLA-4-FcL104E/A29Y; Número de Publicação de Pedido de Patente U.S. US2016/027 1218).
[00750] — Camundongos NSG fêmeas (n=5 por grupo para Grupo 1, nenhum tratamento; n=10 por grupo para Grupos 2-7 de tratamento) foram administrados com 10 mg de gama globulina subcutaneamente e então irradiados (100 cGy/rad) no Dia -1. No Dia O (dentro de 24 ho- ras pós-irradiação), os camundongos nos Grupos 2-7 foram dosados com artigos de teste como mostrado na Tabela 34, e então todos os camundongos receberam 1x10” PBMCs humanas injetadas |V por meio da veia da cauda pós-dosagem.
[00751] Um índice de atividade de doença (DAI) foi determinado avaliando os camundongos três vezes por semana durante o estudo e classificação da doença com base na perda de peso corporal, postura, atividade, aparência do pelo e pele dos camundongos. Após o estudo ter terminado no Dia 42, medições de ponto final de sobrevivência, perda de peso corporal e atividade de doença foram avaliadas. Gráfi- cos de sobrevivência Kaplan-Meier representando a porcentagem de animais sobrevivendo até o ponto final do estudo foram gerados e comparações de curva de sobrevivência foram analisadas pelos testes Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcox (CI 95%). Amostras de san-
gue/soro foram coletadas de camundongos sobreviventes no final do estudo (Dia 42) e células foram avaliadas através de citometria de flu- xo para marcadores de células T, incluindo marcadores de camundon- go e humanos, CD4, CD8, CD28, ICOS, marcadores de ativação ou exaustao (PD-1, Ki67) e FoxP3 (um marcador de Tregs). Os níveis de citocinas proinflamatórias de soro (por exemplo, IFN-gama, IL-10, IL- 12 (p70), IL-17A, IL-4, IL-5 e TNFa) também foram avaliados. Tabela 34: Programa de Dosagem Artigos de | Dose | Volume de Início de Via | Programa teste (vg) Dose (ul) Dosagem Nenhum 1 5 n/a na na | n/a n/a tratamento Sobrevivência/DAI 3x por 2 10 Solução salina | n/a 100 semanas 4 semanas 3x vezes por gv ICOSL semana 3 10 500 100 variante-Fc 4 semanas 4 weeks 3x vezes por gv ICOSL 4 10 100 100 semana variante-Fc 4 weeks 3x vezes por gv ICOSL 100 semana variante-Fc 4 semanas 3x vezes por 10 Belatacepte 100 100 semana 4 semanas PK/Survival//DAI Fo gv ICOSL Dia 1 único 7 100 100 Dia 1 variante-Fc
[00752] As FIGS. 32A-32B mostram os scores de sobrevivência e DAI de camundongos GVHD tratados de acordo com cada programa de dosagem. Como mostrado, a IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/ Q100R) testada em todos os níveis de dose testados melhorou a so-
brevivência significantemente (FIG. 32A) e scores de doença reduzi- dos (FIG. 32B) comparado com camundongos tratados com belatacep- te (isto é, 100%, vs. 40% de sobrevivência no Dia 42, respectivamente; p<0,01 pelo teste log rank Mantel-Cox). Notadamente, administração de dose única (100 ug) de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) re- sultou em proteção similar da doença à dosagem repetida de 100 ug de belatacepte.
[00753] Análise citométrica de fluxo de sangue coletado no final do estudo demonstrou que a IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) testada suprimiu efetivamente expressão de células T humanas trans- feridas conforme observado por uma razão reduzida de células huma- nas/células de camundongo (FIG. 33A) e as contagens de célula T to- tais bastante reduzidas (FIG. 33B). Como mostrado nas FIGS. 33C- 33F, tingimento de citometria de fluxo de sangue coletado no final do estudo de células T CD4+ e CD8+ cotingidas para ICOS (FIGS. 33C- 33D) e CD28 (FIGS. 33E-33F) demonstrou essencialmente nenhum tingimento em grupos tratados com IgV ICOSL variante-Fc (N52H/ N57Y/Q100R), embora células T expressando CD4+ e CD8+ expres- sando ICOS fossem prontamente detectáveis em camundongos trata- dos com belatacepte. Esses resultados são consistentes com a falta de células T restantes nos camundongos tratados com IgV ICOSL-Fc, e também com a habilidade da IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/ Q100R) ligar suas moléculas-alvo CD28 e ICOS e bloquear sua detec- ção pelos anticorpos de citometria de fluxo. Ligação de IgV ICOSL va- riante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) nas poucas células T humanas restan- tes foi confirmada através de detecção usando Fc IgG anti-humana. Notadamente, enquanto a maioria das células T humanas transfecta- das incialmente expressaram CD28 e apenas 10-20% eram ICOS+, as células T ativadas restantes nos camundongos tratados com solução salina ou belatacepte no término/final do estudo eram >80% ICOS+.
[00754] A presença de marcadores de ativação ou exaustão de cé- lulas T também foi suprimida em grupos tratados com IgV ICOSL vari- ante-Fc (N52H/N57Y/Q100R), como evidenciado por expressão inferi- or de PD1 em células T CD4+ e CD8+ e expressão de Ki67 diminuída em células T CD4+, (FIGS. 34A-34B). A razão de células T efetoras para Tregs permaneceu estável em grupos tratados com IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) comparado com belatacepte (FIG. 340). Citocinas proinflamatórias do soro também foram suprimidas em grupos tratados com IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) comparado com belatacepte (FIGS. 35A-35D).
[00755] Análise farmacocinética (PK) foi também realizada para monitorar exposição a soro de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/ Q100R). As concentrações de artigo foram medidas em amostras de soro de camundongo usando um ELISA PK quantitativo usando um anticorpo de captura mAb ICOSL anti-humano e uma IgG anti-humano de camundongo específica para Fc como o reagente de detecção.
[00756] A exposição a soro observada de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) no modelo GVHD foi 45% menor do que aquela de camundongos normais, determinado em um estudo separado (FIG. 35E). A meia-vida terminal mais longa de IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) no modelo GvHD pode ser devido ao alvo redu- zido (CD28, ICOS) em pontos de tempo posteriores em GvHD (como as células T humanas desaparecem), e/ou à formação de anticorpo antifármaco (ADA) em camundongos normais, que pode interferir com exposição a fármaco. A observação que IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) tinha exposição a soro menor comparado com camundongos normais pode ser devido à disposição de fármaco me- diada por alvo (TMDD) no modelo GvHD (isto é, sua afinidade maior com CD28 e ICOS humanos comparado com os ortólogos de camun- dongo) e/ou falta de FCRn nos camundongos NOD/SCID (NSG) usa-
dos nesse modelo.
[00757] Juntos, esses resultados são consistentes com a observa- ção que IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) exibe atividade antagonística potente, mesmo com apenas uma dose única, e ativida- de superior a belatacepte. Essa observação pode ser atribuível à IgV ICOSL variante-Fc (N52H/N57Y/Q100R) exibindo controle superior de células T ICOS+, que de outro modo escapa do bloqueio da via de ICOS ou CD28, tal como aquela obtida com o antagonista da via de CD28 belatacepte. EXEMPLO 37 Avaliação de IgV ICOSL variante-Fc em Modelo de Colite induzida por CD4+CD45RB alto
[00758] O efeito da IgV ICOSL variante-Fc exemplar contendo uma IgV ICOSL variante (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fundida a um Fc inerte (contendo mutações L234A, L235E e L235E em um Fc IgG1 humana, por exemplo, mostrada na SEQ ID NO: 637) sobre de- senvolvimento de doença em modelo de colite induzida por CD4+ CDA45RBalto foi avaliado.
[00759] Células doadoras CD4+CD45RBalto foram enriquecidas por seleção negativa a partir de suspensões de baço obtidas de 15 ca- mundongos doadores BALB/C machos. No Dia 0, 0,3 milhão de célu- las doadoras CD4+CD45RBalto (com Treg depletada) foi injetado in- travenosamente em camundongo C.B17 imunodeficiente (SCID) (n=12 ou 21 por grupo) para induzir colite. Como um controle, 0,3 milhão de células CD4+ (contendo células Treg), que não induzem desenvolvi- mento de colite nesse modelo, foi injetado em camundongos SCID re- cipientes (n=12). No dia de transferência de célula, os camundongos em cada grupo foram dosados com IgV ICOSL variante-Fc ou Fc ape- nas ou controles de veículo. A Tabela 35 sumariza o regime de trata- mento para grupos testados.
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[00762] A presente invenção não pretende ser limitada em escopo às modalidades particulares reveladas, que são providas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção.
Várias modificações nas composições e métodos descritos serão aparentes a partir da presente descrição e ensinamentos.
Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do escopo e espírito da invenção e pretendem se encaixar no escopo da presente invenção.

Claims (171)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL) variante, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma ou mais modificações de ami- noácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF) de um polipeptídeo de referência ICOSL, em que o polipeptídeo de refe- rência ICOSL é um domínio extracelular truncado compreendendo uma sequência contígua de aminoácidos compreendendo os aminoá- cidos 1-112 e um truncamento C-terminal de pelo menos 25 aminoáci- dos com referência à sequência de domínio extracelular de ICOSL mostrada na SEQ ID NO: 32.
2. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada com o(s) ectodomínio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOS para o(s) mesmo ectodomínio(s).
3. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o truncamento N-terminal é de pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pe- lo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125 resíduos de aminoácido.
4. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo de referência ICOSL é alterado em ou não tem um sítio de clivagem de protease mostrado como aminoácidos 204-209 de SEQ ID NO: 32.
5. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 545.
6. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
7. Polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL) variante, compreen- dendo uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo de referência ICOSL, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
8. Polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL) variante, compreen- dendo uma ou mais modificações de aminoácido em um domínio da superfamília da imunoglobulina a (I9SF) de um polipeptídeo de refe- rência ICOS, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de referên- cia ICOSL é alterado em um ou mais aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 204 a 209 com referência à SEQ ID NO: 32.
9. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são em uma posição corresponden- do à posição 52, 57 ou 100, com referência à numeração de SEQ ID NO: 32.
10. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N528S, N52T, N52V, N52Y, N52K, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T ou Q100V, com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
11. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52Y/ N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/ C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N528/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N528S/ C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/ C198R, N528S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N528S/Y152H, N52D/ V151A, N52H/1143T, N528/L80P, N52S/R75Q/L203P, N528S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/ L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N528/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/ N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q0/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/ S121G, A2OV/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R618/Q100R/ V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N528/F120S, N52S/V97A, N528S/G72R, N52S/A7T1IT/ A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/ Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V11ON/S142F/ C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/VIIOD/C198R, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/VI1I6A/LI161M/F1728/S192G/C198R, F27S/ N52H/N57Y/VI110N, N528S/H94E/L961/S109N/L166Q, S18R/N528S/ F93L/143V/R221G, A2OT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/ N57Y/H94E/L961/L98F/N194D/V210A/1218T, N52S/H94E/L961/V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S126T/W153R/1218N, M10V/S18R/ N30D/N528/S126R/T1398S/L203F, — S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S8/L67P/Q100K/D217G/R221K/T2258, N52H/N57Y/Q100R/ V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/ C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L1738S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221], M101I/S13G/N52H/N57Y/D77G/ V110A/H129P/I143V/F1728S/VI93M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/ Q100R/VIION/F1208S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/
C198R, —“N52H/N57Y/Q100R/VI1IOD/N1I44D/F1728S/C198R, N528S/ H94E/L98F/Q100R, N528S/E9O0A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/ NM 43V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/ Q100R/C198R, —“N52S/NI94D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/ H115R/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N1I94D, — N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N528/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/ T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N528S/F1208S/ N227K, N528S/ATIT/A117T/TI9O0A/C198R, T43A/N52H/N57Y/LT4Q/ D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V1I10D/N54F/C198R/R221G, N52Q/ N207Q, N1I68Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, — N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/ N84Q/N1I55Q/N168Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, — N52Q/N840Q/ N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/NI55Q, N52Q/N84Q/N119Q/ N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/ F138L/L203P, —Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F1728/C198R, N52H/V122A/ F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/1143T/ F1728S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/VI1OD/H115R/C198R, — E16V/N52H/N57Y/ Q100R/VI1OD/H115R/Y152C/K156M/F1728/C198R, N528S/E90A/
H115R, N3O0D/K42E N528S/H115R, —N30D/K42E/N52S/H115R/ C198R/R221l, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/ H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, N52S/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/ Q100P HI1II5R/FI728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F172S, —N52H/Q100R/ F1728S/C198R, — N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/ Q100R/F1728/C198R, N52A/N57F/Q1008S, N52A/N57H/Q1008S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/ N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/ N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/ Q1008S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/ N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/ Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/ N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/ N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/ Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q0/Q100P ou R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R, com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
12. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q1008S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/Q0100P, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N528S/ N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/
Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N528S/ N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N528S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/ F138L/L203P, —N52H/N57Y/Q100P, N528S/Y1I46C/Y152C, N52H/ C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N528S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/1143T, N528/ D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/VIIOD/C1I98R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/ Q100R, N52S/NI94D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V1I10D/H115R/ C198R, N528S/E90A, N528S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/ F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52Y/ N57Y/Q100P/F1728, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/ K156M/F1728S/C198R, — N52S/H115R/F1208S/143V/C198R, — N52H/ N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/C198R, —N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F1728, N52H/Q100R/H115X/F1728/C198R, N52H/Q100R/ H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F1728S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S, N52H/ N57Y/ Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F1728S/ C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/143V/F1728S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F1728/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R — F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ C198R, —N52H/N57Y/H115R, —N52H/Q100R/H115R/1143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F1728S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/
H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E9O0A/H115R ou N30D/ K42E/N52S/H115R, com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
13. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que com- preende uma ou mais modificações de aminoácido N52H/Q100R.
14. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL varian- te tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 567.
15. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que com- preende uma ou mais modificações de aminoácido N52H/N57Y/ Q100R.
16. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 565.
17. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que com- preende uma ou mais modificações de aminoácido N52L/N57H/ Q100R.
18. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 761.
19. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que com- preende a modificação de aminoácido N52D.
20. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 548.
21. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que:
a alteração compreende uma deleção de um ou mais ami- noácidos contíguos correspondendo aos aminoácidos 204-209 com referência à SEQ ID NO: 32; ou a alteração compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma ou ambas as posições 207 e 208 correspondendo às posições mostradas na SEQ ID NO: 32.
22. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 21, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma substitui- ção de aminoácido é N207A, N207G ou L208G com referência à nu- meração de SEQ ID NO: 32 ou uma substituição de aminoácido con- servativa do mesmo.
23. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante exibe clivagem proteolítica reduzida quando expresso a partir de uma célula comparado com um domínio extracelu- lar de comprimento integral do polipeptídeo ICOSL variante quando expresso a partir da mesma célula.
24. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são em uma posição cor- respondendo à(s) posição(ões) selecionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74,75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ou 227 com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
25. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de M10V, M10I, VITE, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R618S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, LO96I, V97A, LOSF, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G6G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q1008S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V1IO7A, V1O7I, S109G, S109N, V110A, V110D, V11ON, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A1177, N119Q, F120l, F1208S, S121G, V122A, V122M, S126R,S8126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, 1143T, 1143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, WI153R, I154F, N1I55H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, VI93A, VISSM, N1I94D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, 1218N, 1218T, E220G, R221G, R2211, R221K, 1224V, T225A, T2258S, N227K com referência à numeração de SEQ ID NO:32 ou uma substituição de aminoácido con- servativa do mesmo.
26. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre F120S/Y152H/N2018S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/NI68Q, N119Q/N207Q, N119Q/N1I55Q, N84Q/N119Q, N84Q/N1I55Q/N168Q, N84Q/N1I68Q/N207Q, N840Q/ N155H/N207Q0, N1I55Q/NI68Q/N207Q, N119Q N155Q/N1680Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q,
N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/NI55Q/N168Q, N84Q/N155Q/ N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/ N168Q/N207Q ou F138L/L203P, com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
27. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas de mo- dificações de aminoácido N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/ Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/ S130G/Y152C, N528S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N528S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/1143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, — N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/ H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N528S/G103E, N52H/F78L/ Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q0/Q0100R/ V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/ Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/ R618S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/ Q100R/F1728S, N52H/N57Y, N528/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N528/E220G, Y47H/N52S/V1O07A/F120S, N52H/ N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/ S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F1728/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/VI11O0N, — N528S/H94E/L961/S109N/L166Q, S18R/ N528S/F93L/143V/R221G, A2ZOT/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/ N52H/N57Y/H94E/L961//L98F/N194D/V210A/1218T, N52S/H94E/L961/ V122M, N52H/N57Y/H94E/L961/F1201/S8126T/W153R/I218N, M1OV/
S18R/N30D/N528/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N528S/F1208S/ N227K, N30D/N528/L67P/Q100K/D217G/R221K/12258S, N52H/N57Y/ Q100R/VI1OD/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ F1728/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/ C198R, N52H/N57Y/VI10A/C198R/R2211l, M10I/S13G/N52H/N57Y/ D77G/V110A/H129P/I143V/F1728S/VI93M,C198R, N52H/N57Y/R61C/ Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/ H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F1728/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N528S/E9O0A, N30D/K42E/N528S, N52S/ F1208S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/ N57Y/Q100R/C198R, — N52S/N1I94D, — N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S8212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/ V110D/H115R/C198R, N528/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/ T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N528S/F1208S/ N227K, N528S/ATIT/A117T/TI9O0A/C198R, T43A/N52H/N57Y/LT4Q/ D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/N54F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, — N52Q/N119Q/N1I55Q, — N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N1680Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q0, — N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, —N520Q/ N84Q/N119Q/N155Q, — N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, —N52Y/ F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/ F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ F1728S/C198R, — N52H/N57Y/Q100R/H115R/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/143V/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/ L102R/H115R/F1728/C198R, — N52H/V122A/F1728/C198R, — N52H/ N57Y/Q100R/H115R/F1728S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F1728/
C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/ Q100R/H115R/F1728/1224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/1143T/F1728S, N52H/ N57Y/Q100P/H115R/F1728S, N52Y/N57Y/Q100P/F1728S, E16V/N52H/ N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/ V110D/H115R/Y152C/K156M/F1728S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N528S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221], N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, — N30D/K42E/N52S/H115R/F1728S/ N194D, N52S/H115R/F1208S/1143V/C198R, — N52S/H115R/F1728S/ C198R, — N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/ F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F1728S/C198R, N52H/N57Y/ Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/ C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F1728/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/ C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/ Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/ N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/ Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/ N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/ Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/ Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/ N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/ N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q0/Q100P ou R26S/N52H/ N57Y/VI110D/T137A/C198R, com referência à numeração de SEQ ID NO:32.
28. Polipeptídeo ICOS Ligante (ICOSL), compreendendo um domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL variante compre- ende uma ou mais modificações de aminoácido em um polipeptídeo ICOSL de referência ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo às modificações de aminoácido selecionadas de N52A, N52C, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N578S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100S, Q100T ou Q100V com referência à SEQ ID NO:32.
29. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 28, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações de aminoácido são selecionadas dentre N52A/N57F/Q100S, N52A,/N57H/Q1008, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q1008S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N578S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q1008, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q1008, N52S/N57M/Q1008, N52S/N57Y/Q1008, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q1008S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q0100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q1008, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q1008S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N578/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ou N57Q/Q100P.
30. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi-
cação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICSOL de referência compreende (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32; ou (iii) uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica dos mesmos ou ambos.
31. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
32. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que o do- mínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única por- ção de ICOSL do polipeptídeo ICOSL variante.
33. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo de referência ICOSL compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 545.
34. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo de referência ICOSL consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 545.
35. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada com o(s) ectodomí- nio(s) de ICOS ou CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOSL para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s).
36. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante exibe ligação aumentada com o(s) ectodomí-
nio(s) de ICOS e CD28 comparado com a ligação do polipeptídeo de referência ICOS para o(s) mesmo(s) ectodomínio(s).
37. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, 9 a 27, 35 e 36, caracterizado pelo fato de que a ligação é aumentada mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 ve- zes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes.
38. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, 9 a 27, 35, 36 e 37, caracterizado pelo fato de que o ICOS é um ICOS humano.
39. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, 9 a 27, 35, 36, 37 e 38, caracterizado pelo fato de que o CD28 é um CD28 humano.
40. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que polipep- tídeo ICOSL variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácido, opci- onalmente substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido.
41. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que é uma proteína solúvel.
42. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que: o polipeptídeo ICOSL variante não tem um domínio de transmembrana e domínio de sinalização intracelular; e/ou quando expresso a partir de uma célula, o polipeptídeo ICOSL variante não é expresso na superfície da célula.
43. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende ainda um domínio de trans-
membrana.
44. Polipeptídeo ICOSL variante de acordo com a reivindi- cação 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um domí- nio de sinalização citoplásmico ligado ao domínio de transmembrana.
45. Proteína imunomoduladora, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44 e uma porção de prolonga- mento de meia-vida.
46. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 45, caracterizada pelo fato de que a porção de prolongamento de meia-vida compreende um domínio de multimerização, albumina, um polipeptídeo de ligação à albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C- terminal (CTP) da subunidade beta de gonadotropina coriônica huma- na, polietileno glicol (PEG), sequências hidrofílicas não estruturadas longas de aminoácidos (XTEN), hidroxietil amido (HES), uma molécula pequena de ligação à albumina ou uma combinação dos mesmos.
47. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 45 ou 46, caracterizada pelo fato de que a porção de prolonga- mento de meia-vida é ou compreende um domínio de multimerização.
48. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc de uma imunoglobulina.
49. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 47 ou 48, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL va- riante é ligado, diretamente ou indiretamente por meio de um ligante, ao domínio de multimerização.
50. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizada pelo fato de que a pro- teína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo ICOSL variante ligado a um primeiro domínio de multime-
rização e um segundo polipeptídeo ICOSL variante ligado a um se- gundo domínio de multimerização, em que os primeiro e segundo do- mínios de multimerização interagem para formar um multímero com- preendendo o primeiro e o segundo polipeptídeo ICOSL variante.
51. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 50, caracterizada pelo fato de que o multímero é um dímero.
52. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 50 ou 51, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo ICOSL variante e o segundo polipeptídeo ICOSL variante são iguais.
53. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o dímero é um homodí- mero.
54. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 51, caracterizada pelo fato de que o dímero é um heterodímero.
55. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc é uma IgG humana ou é uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido comparado com a IgG1 hu- mana do tipo selvagem.
56. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 226 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO:226.
57. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc exibe uma ou mais funções efetoras.
58. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que a regi-
ão Fc é uma região Fc variante que exibe uma ou mais função efetora reduzida comparado com um Fc de uma IgG1 humana do tipo selva- gem.
59. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 58, caracterizada pelo fato de que a região Fc variante compreen- de uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
60. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 59, caracterizada pelo fato de que a região Fc variante compreen- de ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
61. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 59 ou 60, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
62. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 476 ou SEQ ID NO: 632.
63. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 478 ou SEQ ID NO: 634.
64. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 477.
65. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi-
ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 633.
66. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 474.
67. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 637.
68. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 67, caracterizada pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante é ligado por meio de um ligante à região Fc.
69. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 68, caracterizada pelo fato de que o li- gante compreende 1 a 10 aminoácidos.
70. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69, caracterizada pelo fato de que o li- gante é AAA.
71. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69, caracterizada pelo fato de que o li- gante é G4S (SEQ ID NO:636).
72. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69, caracterizada pelo fato de que o li- gante é (G14S)> (SEQ ID NO:229).
73. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69, caracterizada pelo fato de que o li- gante é ligante GSGGGGS (SEQ ID NO: 635).
74. Proteína imunomoduladora caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma as reivindicações 1 a 44 ligado a um segundo polipeptí- deo compreendendo um domínio da superfamília da imunoglobulina (I9SF).
75. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 74, caracterizado pelo fato de que o domínio IgSF do segundo polipeptídeo exibe ligação aumentada com uma ou mais de sua(s) contraparte(s) de ligação cognata(s) comparado com o domínio IgSF não modificado ou do tipo selvagem.
76. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 74 ou 75, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL va- riante é capaz de se ligar especificamente a CD28 ou ICOSL e o do- mínio I9SF do segundo polipeptídeo é capaz de se ligar a uma contra- parte de ligação diferente da especificamente ligada pelo polipeptídeo ICOSL variante.
77. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 76, caracterizado pelo fato de que o do- mínio I9SF do segundo polipeptídeo é uma porção de localização de tumor que se liga a um ligante expresso em um tumor.
78. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 77, caracterizado pelo fato de que o ligante é B7H6.
79. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 77 ou 78, caracterizado pelo fato de que o domínio IgSF é de NKp30.
80. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 79, caracterizado pelo fato de que o do- mínio IgSF do segundo polipeptídeo é ou compreende um domínio Igv.
81. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 80, caracterizado pelo fato de que o do- mínio IgSF do segundo polipeptídeo tem a sequência mostrada na
SEQ ID NO: 504.
82. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 81, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante é ou compreende um domínio IgV.
83. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 82, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52H/Q100R.
84. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 83, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL varian- te tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 567.
85. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 83, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52H/N57Y/Q100R.
86. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 85, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL varian- te tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 565.
87. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 82, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende modificações de aminoácido N52L/N57H/Q100R.
88. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi- cação 87, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL varian- te tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 761.
89. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 82, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo ICOSL variante compreende a modificação de aminoácido N52D.
90. Polipeptídeo imunomodulador de acordo com a reivindi-
cação 89, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ICOSL varian- te tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 548.
91. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 90, caracterizado pelo fato de que a pro- teína imunomoduladora compreende um domínio de multimerização ligado a um ou ambos do polipeptídeo ICOSL variante ou do segundo polipeptídeo compreendendo o domínio IgSF.
92. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 91, caracterizada pelo fato de que o domínio de multimerização é uma região Fc.
93. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 92, caracterizada pelo fato de que é di- mérica.
94. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 93, caracterizada pelo fato de que é homodimérica.
95. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindica- ção 93, caracterizada pelo fato de que é heterodimérica.
96. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 95, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc é uma IgG1 humana ou é uma região Fc variante compreenden- do uma ou mais substituições de aminoácido comparado com a I9gG1 humana do tipo selvagem.
97. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 96, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 226 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 226.
98. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 97, caracterizada pelo fato de que a regi-
ão Fc exibe uma ou mais funções efetoras.
99. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 97, caracterizada pelo fato de que a regi- ão Fc é uma região Fc variante que exibe uma ou mais função efetora reduzida comparado com um Fc de uma IgG1 humana do tipo selva- gem.
100. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindi- cação 99, caracterizada pelo fato de que a região Fc variante compre- ende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
101. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindi- cação 100, caracterizada pelo fato de que a região Fc variante com- preende ainda a substituição de aminoácido C2208S, em que os resí- duos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
102. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindi- cação 100 ou 101, caracterizada pelo fato de que a região Fc compre- ende K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
103. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:476 ou SEQ ID NO:632.
104. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:478 ou SEQ ID NO:634.
105. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 477.
106. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 633.
107. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 474.
108. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 637.
109. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 108, caracterizada pelo fato de que o po- lipeptídeo ICOSL variante e o domínio IgSF do segundo polipeptídeo são ligados por um ligante.
110. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindi- cação 109, caracterizada pelo fato de que o ligante é 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228).
111. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 110, caracterizada pelo fato de que o domínio de multimerização é ligado por meio de um ligante a um ou ambos do polipeptídeo ICOSL variante ou do segundo polipeptídeo compreendendo o domínio IgSF.
112. Proteína imunomoduladora de acordo com a reivindi- cação 111, caraterizada pelo fato de que o ligante é GSGGGGS (SEQ ID NO: 635).
113. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreen-
de o polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicaçõesreivindicações 1 a 44 ou proteína imunomoduladora co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 112 e uma por- ção heteróloga.
114. Conjugado de acordo com a reivindicação 113, carac- terizado pelo fato de que o conjugado é uma proteína de fusão.
115. Conjugado de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracterizado pelo fato de que a porção é uma porção de direciona- mento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula.
116. Conjugado de acordo com a reivindicação 115, carac- terizado pelo fato de que que a porção de direcionamento se liga es- pecificamente a uma molécula na superfície de uma célula imune.
117. Conjugado de acordo com a reivindicação 116, carac- terizado pelo fato de que a célula imune é uma célula apresentando antígeno ou um linfócito.
118. Conjugado de acordo com a reivindicação 115, carac- terizado pelo fato de que a porção de direcionamento é uma porção de localização de tumor que se liga a uma molécula na superfície de um tumor.
119. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindi- cações115 a 118, caracterizado pelo fato de que a porção de direcio- namento é um fragmento de ligação a anticorpo ou antígeno.
120. Conjugado de acordo com a reivindicação 119, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado de cetuximab, pa- nitumumab, — zalutumumab, — nimotuzumab, trastuzumab, Ado- trastuzumab entansina, Tositumomab (Bexxar &), Rituximab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetano (Zevalin), Daclizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, fragmento Fab de varredura de CEA, anticorpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, Bevacizumab
(Avastin &), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ceritinib, Crizo- tinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab, Erlotinib, Everolimus, Ibruti- nib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab, Palbociclib, Pazopanib, Pertuzumab, Ramucirumab, Regorafenib, Ru- xolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pem- brolizumab, — MPDL3280A, — Pidilizumab —(CT-011)) AMP-224, MSBO001078C ou MEDI4736, BMS-935559, LY 3300054, atezolizumab, avelumab ou durvalumab ou é um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
121. Proteína de fusão monovalente, caracterizada pelo fa- to de que compreende: (a) um polipeptídeo ICOSL variante como definido em qual- quer uma das reivindicaçõesreivindicações 1 a 44; e (b) um marcador para detecção ou purificação do polipeptí- deo ICOSL variante.
122. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que o marcador para detecção ou purifica- ção é selecionado de um marcador poli-histidina (His), um marcador FLAG, um marcador Myc ou um marcador proteína fluorescente.
123. Molécula(s) de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44, uma proteína imunomodula- dora como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 112 ou uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindica- ções 114 a 122.
124. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende (s) molécula(s) de ácido nucleico como definida na reivindicação 123.
125. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a(s) molécula(s) de ácido nucleico como definida na reivindicação 123 ou o vetor como definido na reivindicação 124.
126. Método de produção de uma proteína imunomodulado- ra, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo ICOSL variante, compreendendo introdução da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 123 ou do vetor como definido na rei- vindicação 124 em uma célula hospedeira sob condições para expres- sar a proteína na célula.
127. Método de acordo com a reivindicação 126, caracteri- zado pelo fato de que é uma célula de mamífero.
128. Célula de acordo com a reivindicação 126 ou 127, ca- racterizado pelo fato de que é uma célula de Ovário de Hamster Chi- nês (CHO) ou um derivado da mesma.
129. Célula de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 120 a 128, caracterizada pelo fato de que é CHO DG44.
130. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 126 a 129, caracterizado pelo fato de que compreende ainda iso- lamento ou purificação da proteína a partir da célula.
131. Proteína, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 126 a
130.
132. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma proteína compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44 ou uma pro- teína imunomoduladora como definida em qualquer uma das reivindi- cações 45 a 112, em que pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das sequências individuais da proteína ou da proteína imunomoduladora na composição têm um comprimento de sequência idêntico.
133. Composição de acordo com a reivindicação 132, ca- racterizada pelo fato de que a proteína ou proteína imunomoduladora é purificada a partir de Células de Ovário de Hamster Chinês ou um derivado da mesma.
134. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que com- preende um ácido nucleico codificando um polipeptídeo ICOSL varian- te compreendendo um domínio de transmembrana como definido na reivindicação 43 ou 44 e um ou mais ácido nucleico codificando uma ou mais cadeia de um receptor de antígeno recombinante.
135. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T engenheirado (TCR).
136. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 134 ou 135, caracterizado pelo fato de que cada um do ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo ICOSL variante e um ou mais ácido nucleico co- dificando uma ou mais cadeia do receptor recombinante é separado por um ácido nucleico codificando um peptídeo de autoclivagem ou um peptídeo que causa pulo de ribossomo.
137. Célula engenheirada, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44, a proteína imunomoduladora como de- finida em qualquer uma das reivindicações 45 a 112 ou a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 114 a 122.
138. Célula engenheirada de acordo com a reivindicação 137, caracterizada pelo fato de que: o ácido nucleico codificando o polipeptídeo ICOS variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão codifica um peptídeo de sinal; o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão não compreende um domínio de transmembrana e/ou não é expresso sobre a superfície da célula; e/ou o polipeptídeo ICOSL variante, proteína imunomoduladora ou proteína de fusão é secretado a partir da célula engenheirada.
139. Célula engenheirada de acordo com a reivindicação 137, caracterizada pelo fato de que a célula engenheirada compreen- de um polipeptídeo ICOSL variante compreendendo um domínio de transmembrana como definido na reivindicação 43 ou 44.
140. Célula engenheirada de acordo com qualquer uma das reivindicações 137 a 139, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula imune.
141. Célula engenheirada de acordo com a reivindicação 140, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula apre- sentando antígeno (APC) ou um linfócito.
142. Célula engenheirada de acordo com qualquer uma das reivindicações 137 a 141, caracterizada pelo fato de que é uma célula humana primária.
143. Célula engenheirada de acordo com qualquer uma das reivindicações 137 a 142, caracterizada pelo fato de que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T engenheirada.
144. Agente infeccioso, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um polipep- tídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindica- ções | a 44 ou uma proteína imunomoduladora como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 112 ou a proteína de fusão co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 114 a 122.
145. Agente infeccioso de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o agente infeccioso é uma bactéria ou um vírus.
146. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicaçõesreivindicações 1 a 44, a proteína imu-
nomoduladora como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 112, um conjugado ou proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 113 a 122 ou uma célula engenheirada como definida em qualquer uma das reivindicações 137 a 143 ou um agente infeccioso como definio na reivindicação 144 ou 145.
147. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 146, caracterizada pelo fato de que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
148. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica como definida na reivindica- ção 146 ou 147 em um frasco.
149. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a composição como definida na reivindicação 146 ou 147 ou o artigo de fabricação da reivindicação 148 e instruções para uso.
150. Método de modulação de uma resposta imune em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica como definida na reivindicação 146 ou 147 ao indivíduo.
151. Método de modulação de uma resposta imune em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar as células engenheiradas como definidas em qualquer uma das reivindi- cações 137 a 143 ao indivíduo.
152. Método de acordo com a reivindicação 151, caracteri- zado pelo fato de que as células engenheiradas são autólogas para o indivíduo.
153. Método de acordo com a reivindicação 151, caracteri- zado pelo fato de que as células engenheiradas são alogênicas para o indivíduo.
154. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 153, caracterizado pelo fato de que modulação da resposta imune trata uma doença ou condição no indivíduo.
155. Método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica como definida na reivindicação 146 ou 147 ao indivíduo.
156. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é aumentada no indivíduo.
157. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 e 154 a 156, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma proteína imunomoduladora ou conju- gado compreendendo um polipeptídeo ICOSL variante ligado a uma porção de localização de tumor.
158. Método de acordo com a reivindicação 157, caracteri- zado pelo fato de que a porção de localização de tumor é ou compre- ende uma molécula de ligação que reconhece um antígeno de tumor.
159. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 e 154 a 158, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreendendo a proteína imunomoduladora como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 77 a 112 ou o conjugado ou proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 113 a 120 é administrada ao indivíduo.
160. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 156, caracterizado pelo fato de que a composição farma- cêutica compreende uma célula engenheirada compreendendo um po- lipeptídeo ICOSL variante que é uma proteína imunomoduladora de transmembrana como definido na reivindicação 43 ou 44.
161. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 154 a 160, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é um tumor ou câncer.
162. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 154 a 161, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada de melanoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga, um mal hematológico, câncer de fígado, câncer de cérebro, câncer renal, câncer de mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de ba- ço, câncer de próstata, câncer testicular, câncer ovariano, câncer ute- rino, carcinoma gástrico, um câncer músculo-esqueletal, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer gastrintestinal, um câncer de célula germinativa ou um câncer endócrino ou neuroendócrino.
163. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é di- minuída.
164. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155 e 163, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma proteína imunomoduladora polipeptí- deo ICOSL variante que é uma proteína de fusão de Fc imunomodula- dora.
165. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155, 163 e 164, caracterizado pelo fato de que a composi- ção farmacêutica compreende um polipeptídeo ICOSL variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou uma proteína imunomoduladora como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 76.
166. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155 e 163, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreendendo uma célula engenheirada compreen- dendo um polipeptídeo ICOSL variante secretável é administrada ao indivíduo.
167. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155, 163 e 166, caracterizado pelo fato de que a composi-
ção farmacêutica compreende uma célula engenheirada como definida reivindicação 137 ou 138.
168. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 150 a 155 e 163, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreendendo um agente infeccioso codificando um polipeptídeo ICOSL que é uma proteína imunomoduladora secretável é administrada ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula de tumor ou célula imune e a pro- teína imunomoduladora secretável é secretada a partir da célula infec- tada.
169. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 154 e 155 e 163 a 168, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune.
170. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 154 e 155 e 163 a 169, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma vasculite associada a anticorpos citoplásmicos an- tineutrófilos (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença inflamatória gastrin- testinal, uma doença inflamatória do olho, uma doença inflamatória neurológica, uma doença inflamatória pulmonar, uma doença inflama- tória endócrina ou uma doença hematológica autoimune.
171. Método de acordo com a reivindicação 169 ou 170, ca- racterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada de doença inflamatória do intestino, transplante, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou psoríase.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
KR102536850B1 (ko) 2016-04-15 2023-05-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
KR102758545B1 (ko) 2017-10-10 2025-01-23 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
CN111712515A (zh) 2017-10-18 2020-09-25 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体免疫调节蛋白及相关组合物和方法
US12297253B2 (en) 2018-01-03 2025-05-13 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US12065476B2 (en) 2018-06-15 2024-08-20 Alpine Immune Sciences, Inc. PD-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2022529059A (ja) * 2019-04-17 2022-06-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド バリアントｉｃｏｓリガンド（ｉｃｏｓｌ）融合タンパク質の方法および使用
CN112300280B (zh) * 2019-08-02 2022-10-11 正大天晴康方(上海)生物医药科技有限公司 一种抗pd-1抗体及其医药用途
KR20220052919A (ko) * 2019-08-30 2022-04-28 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드 Tgf 베타 결합 도메인을 포함하는 키메라 사이토카인 수용체
JP7543404B2 (ja) * 2019-11-20 2024-09-02 ジーアイ・セル・インコーポレイテッド Ｔ細胞培養用培地組成物及びこれを用いたｔ細胞の培養方法
CA3174908A1 (en) * 2020-03-09 2021-09-16 Pfizer Inc. Fusion proteins and uses thereof
JP2023525033A (ja) 2020-05-08 2023-06-14 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ａｐｒｉｌおよびｂａｆｆ阻害免疫調節タンパク質、ならびにその使用方法
US20230265190A1 (en) * 2020-08-12 2023-08-24 Migal Galilee Research Institute Ltd Alloreactive immune cell-distancing device and uses thereof for protecting donor-derived cells from allorejection
WO2023214705A1 (ko) * 2022-05-03 2023-11-09 고려대학교 산학협력단 Icos와의 결합력이 향상된 icos-l 변이체

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5443964A (en) 1987-08-10 1995-08-22 Duke University Poxvirus insertion/expression vector
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
DK0584266T3 (da) 1991-05-06 2003-12-29 Us Gov Health & Human Serv Rekombinant virus udtrykkende carcinoembryonalt antigen og fremgangsmåder til anvendelse heraf
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6361770B1 (en) 1994-09-23 2002-03-26 University Of British Columbia Method of enhancing expression of MHC class I molecules bearing endogenous peptides
AU688606B2 (en) 1994-10-03 1998-03-12 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Composition comprising a recombinant virus expressing an antigen and a recombinant virus expressing an immunostimulatory molecule
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US5780426A (en) 1995-06-07 1998-07-14 Ixsys, Incorporated Fivemer cyclic peptide inhibitors of diseases involving αv β3
US5767071A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Ixsys Incorporated Sevenmer cyclic peptide inhibitors of diseases involving αv β3
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
ES2317646T3 (es) 1995-09-08 2009-04-16 Genzyme Corporation Vectores aav mejorados para terapia genica.
US7001765B2 (en) 1996-03-06 2006-02-21 Medigene Ag Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
ES2246069T3 (es) 1997-05-02 2006-02-01 Genentech, Inc. Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.
US5891432A (en) 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
CA2300957A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
AU9397098A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
US20040063094A1 (en) 1998-05-20 2004-04-01 Biovex Limited Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
GB2337755B (en) 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
IL141044A0 (en) 1998-08-07 2002-02-10 Univ Washington Innunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
US6491907B1 (en) 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
US8624010B1 (en) 1999-02-03 2014-01-07 Steven K. Yoshinaga Nucleic acids encoding B7RP1
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
US6365619B1 (en) 1999-07-22 2002-04-02 Novartis Ag Treatment of arteriosclerosis
US6596535B1 (en) 1999-08-09 2003-07-22 Targeted Genetics Corporation Metabolically activated recombinant viral vectors and methods for the preparation and use
ATE366814T1 (de) 1999-09-21 2007-08-15 Genetics Inst Llc Gl50 moleküle, sowie verwendungen derselben
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
AU2584901A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Herpes simplex virus-1 glycoprotein c mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth
DE60115600T2 (de) 2000-01-21 2006-07-20 Biovex Ltd. Virusstämme für die onkolytische behandlung von krebs
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
CA2411828A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Maxygen, Inc. Novel co-stimulatory molecules
US7183376B2 (en) 2000-06-23 2007-02-27 Maxygen, Inc. Variant B7 co-stimulatory molecules
AR035037A1 (es) 2000-07-03 2004-04-14 Bristol Myers Squibb Co Metodos para tratar enfermedades reumaticas al usar una molecula ctla4 soluble
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
US6653103B2 (en) 2001-03-30 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides
HUP0400882A3 (en) 2001-05-11 2011-01-28 Wellstat Biologics Corp Oncolytic virus therapy
AU2002368044A1 (en) 2001-06-22 2004-04-19 Maxygen, Inc. Co-stimulatory molecules
JP2004537305A (ja) 2001-07-11 2004-12-16 ユニバーシティー オブ マイアミ 腫瘍細胞の処置のための組換えｖｓｖ
CN1304559C (zh) 2001-10-09 2007-03-14 杭州康科生物技术有限公司 表达热休克蛋白的溶瘤微生物及其应用
JP4364643B2 (ja) 2001-11-30 2009-11-18 アメリカ合衆国 前立腺特異抗原のペプチドアゴニストおよびその使用
US7235631B2 (en) 2002-02-07 2007-06-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research ICOS mutants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
WO2003082200A2 (en) 2002-03-27 2003-10-09 Baylor College Of Medicine Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
CA2489523A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Wellstat Biologics Corporation Administration of therapeutic viruses
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003268505A1 (en) 2002-09-09 2004-03-29 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
EP1606411B1 (en) 2003-03-27 2008-12-10 Ottawa Health Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and use thereof
US7588767B2 (en) 2003-06-18 2009-09-15 Genelux Corporation Microorganisms for therapy
HUE054805T2 (hu) 2003-09-30 2021-09-28 Univ Pennsylvania Adeno-asszociált vírus (AAV) kládok, szekvenciák, az azokat tartalmazó vektorok és alkalmazásaik
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
JP2007511216A (ja) 2003-11-17 2007-05-10 クルセイド ラボラトリーズ リミテッド 変異ウイルス
GB0326798D0 (en) 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
US20050227324A1 (en) 2003-12-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
WO2005116224A2 (en) 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
WO2006002394A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
EP1810979B1 (en) 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US7550296B2 (en) 2004-12-01 2009-06-23 Bayer Schering Pharma Ag Generation of replication competent viruses for therapeutic use
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
CA2611056C (en) 2005-06-01 2016-06-28 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
CN105483093A (zh) 2005-06-23 2016-04-13 休斯顿大学 Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途
ME02260B (me) 2005-07-01 2016-02-29 Medarex Inc Humana monoklonska antitela za ligand programirane smrti 1 (pd-l1)
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
GB0522476D0 (en) 2005-11-03 2005-12-14 Biovex Ltd Oncolytic herpes virus vectors
ES2439641T3 (es) 2005-12-20 2014-01-24 Bristol-Myers Squibb Company Composiciones y procedimientos de producción de una composición
PT2520168E (pt) 2006-07-21 2014-04-29 California Inst Of Techn Administração de gene alvo para vacinação de células dendríticas
US20090098529A1 (en) 2006-10-16 2009-04-16 Nanhai Chen Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses
US20100178684A1 (en) 2006-12-21 2010-07-15 Woo Savio L C Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
GB2446721B (en) 2007-02-16 2009-03-25 Crusade Lab Ltd Herpes simplex viruses and methods of viral replication
JP5840837B2 (ja) 2007-03-30 2016-01-06 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター 養子移入ｔリンパ球における副刺激リガンドの構成性発現
WO2008156655A2 (en) 2007-06-15 2008-12-24 Genelux Corporation Vaccinia virus vectors encoding a sodium-dependent transporter protein for imaging and/or treatment of tumors
ES2422007T3 (es) 2007-06-21 2013-09-06 Univ Muenchen Tech Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro
US8153595B2 (en) 2007-07-13 2012-04-10 The Johns Hopkins University B7-DC variants immunogenic compositions and methods of use thereof
JP2010533718A (ja) 2007-07-18 2010-10-28 ジェネラックス・コーポレイション 腫瘍溶解性ウイルス治療に付随する副作用の処置もしくは改善用医薬の製造における化学治療剤の使用
CA2700394C (en) 2007-09-26 2017-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US20090136917A1 (en) 2007-10-25 2009-05-28 Szalay Aladar A Systems and methods for viral therapy
WO2009058564A2 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Maxygen, Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
AU2008329518A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Viventia Biotechnologies Inc. Antibodies against a cancer-associated epitope of variant NFKBIB and uses thereof
TR201802323T4 (tr) 2007-12-11 2018-03-21 Univ North Carolina Chapel Hill Polipürin yolu modifiye edilmiş retroviral vektörler.
US8313896B2 (en) 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
US20120052003A9 (en) 2008-05-16 2012-03-01 Szalay Aladar A Microorganisms for preventing and treating neoplasms accompanying cellular therapy
EP2307033A4 (en) 2008-05-29 2012-06-13 Gen Hospital Corp USE OF ONCOLYTIC HERPESVIRUS FOR THE KILLING OF CANCER STEM CELLS
ES2866623T3 (es) 2008-11-24 2021-10-19 Massachusetts Inst Technology Métodos y composiciones para el suministro localizado de nanopartículas a un tumor
MY188826A (en) 2008-12-09 2022-01-06 Genentech Inc Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
US8481297B2 (en) 2009-01-08 2013-07-09 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus
US20150359909A1 (en) 2009-07-16 2015-12-17 University College Cork-National University Of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
EP2283810A1 (en) 2009-07-16 2011-02-16 University College Cork-National University of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
HUE043032T2 (hu) 2009-07-24 2019-07-29 Immune Design Corp Nem-integrálódó lentivírus vektorok
CA2769822C (en) 2009-08-13 2019-02-19 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
CA2775761C (en) 2009-09-30 2018-08-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
NZ628923A (en) 2009-11-24 2016-02-26 Medimmune Ltd Targeted binding agents against b7-h1
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
PL3053932T3 (pl) 2010-02-19 2021-03-08 Xencor, Inc. Nowe immunoadhezyny CTLA4-IG
ES2550060T3 (es) 2010-03-12 2015-11-04 Abbvie Biotherapeutics Inc. Proteínas de CTLA4 y sus usos
KR101860963B1 (ko) 2010-04-23 2018-05-24 제넨테크, 인크. 이종다량체 단백질의 생산
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
SG192010A1 (en) 2011-01-18 2013-08-30 Univ Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
CA2830254C (en) 2011-03-16 2019-09-10 Amgen Inc. Fc variants
NZ616304A (en) 2011-04-08 2016-01-29 Immune Design Corp Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
TWI496886B (zh) 2011-06-24 2015-08-21 Taipei Veteran General Hospital 提升感染性與惡性疾病之治療之免疫反應
WO2013001517A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof for treatment of autoimmune disorders and infection
BR112013033661A2 (pt) 2011-06-30 2017-01-24 Genzyme Corp inibidores de ativação de células t
MX2014003176A (es) 2011-09-16 2015-08-05 Univ Pennsylvania Celulas t diseñadas mediante arn para el tratamiento de cancer.
US8956619B2 (en) 2011-10-25 2015-02-17 University Of Maryland, Baltimore County Soluble CD80 as a therapeutic to reverse immune supression in cancer patients
RS61033B1 (sr) 2011-11-28 2020-12-31 Merck Patent Gmbh Antitela na pd-l1 i njihova upotreba
WO2013130684A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
WO2013149167A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign
WO2013156054A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Universität Stuttgart The igm and ige heavy chain domain 2 as covalently linked homodimerization modules for the generation of fusion proteins with dual specificity
MX355234B (es) 2012-05-11 2018-04-11 Medimmune Ltd Variantes de antigeno 4 del linfocito t citotoxico (ctla-4).
CA2877986A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Orban Biotech Llc Ctla4 fusion proteins for the treatment of diabetes
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2014089113A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
HK1210964A1 (en) 2012-12-04 2016-05-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy with binding agents
WO2014138188A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 The General Hospital Corporation Human ctla4 mutants and use thereof
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
EP2970475A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Biogen MA Inc. Treatment and prevention of acute kidney injury using anti-alpha v beta 5 antibodies
WO2014198002A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Ottawa Hospital Research Institute A bacterium producing an interferon binding protein and uses thereof
WO2014207748A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Alexander Biro Soluble ctla-4 molecules and derivatives thereof for treatment of minimal change disease
GB201311475D0 (en) 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Polypeptides
US9822162B2 (en) 2013-07-15 2017-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human papillomavirus 16 E6 T cell receptors
AU2014319921A1 (en) * 2013-09-11 2016-03-17 Compugen Ltd. Anti-VSTM5 antibodies and the use thereof in therapy and diagnosis
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
US20160340422A1 (en) 2014-01-28 2016-11-24 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
WO2015120363A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Emory University Expression of chimeric polypeptide with variable lymphocyte receptors on immune cells and uses for treating cancer
HRP20200164T1 (hr) 2014-03-28 2020-05-01 Xencor, Inc. Bispecifična protutijela koja se vežu na cd38 i cd3
BR112016023450A2 (pt) 2014-04-25 2017-10-17 Bristol Myers Squibb Co uso de compostos ctla4 para alcançar remissão livre de fármacos em indivíduos com artrite reumatoide precoce
CA2955015A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
EP3552615B8 (en) 2014-07-16 2022-03-02 Transgene Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators
CA2957314A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-11 Baylor Research Institute Antagonistic anti-ox40l antibodies and methods of their use
CA2994927A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity pd-1 agents and methods of use
MY193417A (en) 2014-09-03 2022-10-12 Bavarian Nordic As Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine
US20160145344A1 (en) 2014-10-20 2016-05-26 University Of Southern California Murine and human innate lymphoid cells and lung inflammation
CA2966988A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
EP3020816A1 (en) 2014-11-11 2016-05-18 University College Cork Bacterial mediated gene therapy
WO2016118577A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
CN107708725A (zh) 2015-04-02 2018-02-16 坎库雷有限公司 用于引发免疫应答的剂和组合物
WO2016164428A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor-based antagonists of the programmed cell death 1 (pd-1) pathway
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
PE20181151A1 (es) 2015-07-30 2018-07-17 Macrogenics Inc Moleculas de union a pd-1 y metodos de uso de las mismas
EP3328377A4 (en) 2015-07-31 2019-03-13 Tarveda Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNE ONCOLOGY THERAPIES
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
CA2997217A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Alpine Immune Sciences, Inc. Tunable variant immunoglobulin superfamily domains and engineered cell therapy
RS63490B1 (sr) 2015-10-02 2022-09-30 Symphogen As Anti-pd-1 antitela i kompozicije
KR102536850B1 (ko) 2016-04-15 2023-05-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
IL310729A (en) 2016-04-15 2024-04-01 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2017266905B2 (en) 2016-05-18 2022-12-15 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof
EP3491013A1 (en) 2016-07-28 2019-06-05 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3040296A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
CN111712515A (zh) 2017-10-18 2020-09-25 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体免疫调节蛋白及相关组合物和方法
US12297253B2 (en) * 2018-01-03 2025-05-13 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US12065476B2 (en) 2018-06-15 2024-08-20 Alpine Immune Sciences, Inc. PD-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2022529059A (ja) 2019-04-17 2022-06-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド バリアントｉｃｏｓリガンド（ｉｃｏｓｌ）融合タンパク質の方法および使用

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