JP2004537305A - 腫瘍細胞の処置のための組換えvsv - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(関連出願の相互参照)
本出願は、2001年7月11日出願の米国仮特許出願60/304,125の優先権の利益を主張する(これは、その全体が参考として本明細書中に援用される)。
【0002】
(連邦に援助された研究または開発に関する記述)
適用なし
(発明の分野)
本発明は、一般的に、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、組換えVSVにおいて異種タンパク質を生成する方法、悪性細胞の処置のためのサイトカインまたは自殺遺伝子を含む組換えVSVの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
(発明の背景)
ベシクロウイルス属の水疱性口内炎ウイルス(VSV)は、Rhabdoviridaeファミリーの原型のメンバーであり、そして家畜において自己限定性疾患を引き起こし、そしてヒトにおいて本質的に非病原性である負鎖RNAゲノムを有するエンベロープ型ウイルスである。BalachandranおよびBarber(2000,IUBMB Life 50:135−8)。ラブドウイルスは、単一の、11,000〜12,000ヌクレオチドの負鎖RNAゲノムを有する(RoseおよびSchubert,1987,Rhabdovirus genomes and their products,in The Viruses:The Rhabdoviruses,Plenum Publishing Corp.,NY,129−166頁)。ウイルス粒子は、ゲノムRNAおよびタンパク質からなる、螺旋状のヌクレオカプシドコアを含む。一般的に、3つのタンパク質(N(ゲノムをきっちりと入れるヌクレオカプシド)、P(以前はNSといわれた、元々、非構造的な表示)およびL(大きい))が、ヌクレオカプシドに関連することが見出されている。さらなるマトリクス(M)タンパク質は、(おそらく、膜およびヌクレオカプシドコアの両方と相互作用して)膜エンベロープ内に存在する。単一の糖タンパク質(G)種は、膜にわたり、そしてウイルス粒子の表面にスパイクを形成する。糖タンパク質Gは、細胞への結合および膜融合を担う。VSVゲノムはネガティブセンス(すなわち、コードタンパク質を直接的に生成するmRNAとして機能するRNA配列(ポジティブセンス)に相補的である)であり、そしてラブドウイルスは、ビリオン(Pタンパク質およびLタンパク質から構成される)中にRNA依存性RNAポリメラーゼをコードおよびパッケージングしなければならない(Baltimoreら、1970,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66:572−576)。この酵素は、5〜6個のウイルスタンパク質をコードするサブゲノムmRNAを作製するためのゲノムRNAを転写し、そしてまた、全長のポジティブセンスRNAおよびネガティブセンスRNAを複製する。遺伝子は、ゲノムの3’末端の開始点から連続して転写される。
【0004】
VSV mRNAおよびゲノムの配列は、Gallioneら、1981,J Virol.39:529−535;RoseおよびGallione,1981,J Virol.39:519−528;RoseおよびSchubert,1987,Rhabdovirus genomes and their products,129−166頁、R.R.Wagner(編)、The Rhabdoviruses.Plenum Publishing Corp.,NY;Schubertら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7984−7988に記載される。1996年11月7日に公開されたWO 96/34625は、複製可能なベシクロウイルスの生成および回収のための方法を開示する。2001年1月2日に発行された米国特許第6,168,943号は、組換えベシクロウイルスを作製するための方法を記載する。
【0005】
ほとんどの不死化された組織培養細胞株はVSVに許容性であるが、このウイルスはインターフェロン(IFN)の抗ウイルス作用に感受性である。BalachandranおよびBarber(上記)。PKRおよび機能的INF系を含む初代細胞は、VSV複製に強く許容性ではない。Balachandranら(2000,Immunity 13,129−141)は、IFN誘導性二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)を欠損するマウスがVSV感染に感受性であることを開示する。VSVは、大部分の哺乳動物細胞株において複製が可能であるが、PKR機能またはINFシグナル伝達が欠損しない場合は、初代細胞において十分ではない。このことは、VSV複製を防止するために必要とされる宿主防御機構が、ウイルスに対して許容性の細胞(不死化細胞および悪性細胞を含む)において損なわれることを意味する。BalachandranおよびBarber(上記)。
【0006】
VSV腫瘍崩壊活性は、2000年10月26日に公開されたWO 00/62735;BalachandranおよびBarber、(上記);Stojdlら、(2000,Nature Medicine,第6巻、821−825頁);Balachandranら、(2001,J.of Virol.3473−3479頁);2001年、3月22日に公開されたWO 01/19380;1999年4月22日に公開されたWO 99/18799;および2000年10月26日に公開されたWO 00/62735において開示される。
【0007】
腫瘍細胞の処置するための組成物および方法の開発に対する必要性が存在する。
【0008】
全ての参考文献および特許刊行物は、その全体において参考として本明細書中に援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0009】
(発明の簡単な要旨)
本発明は、組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)発現構築物がインビトロまたはインビボのいずれかで(ウイルス粒子を伴うかまたは伴わずに)細胞内に導入される場合、感染力、複製、転写またはそれらの任意の組み合わせを与えるVSVに基づく組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)発現構築物(ベクター)に関する。VSV構築物は、1つ以上の異種ヌクレオチド配列、特に、サイトカイン(例えば、インターフェロンもしくはインターロイキン)、あるいは他の生物学的に活性な分子(例えば、熱ショックタンパク質gp96、またはチミジンキナーゼ(TK)もしくはシトシンデアミナーゼのような自殺カセット)をコードする遺伝子を発現するように操作される。VSVベクターは、2つ以上の生物学的に活性なタンパク質(例えば、インターフェロンおよびインターロイキンのような2つのサイトカイン、あるいは2つのインターフェロンまたは2つのインターロイキン)をコードする核酸を含み得る。2つ以上のサイトカインは、同一であっても、異なっていてもよい。組換えVSVは、複製コンピテントまたは複製欠損型であり得る。本発明はまた、腫瘍細胞および/または悪性細胞において腫瘍崩壊活性を生成するための方法に関し、この方法は、サイトカイン(例えば、インターフェロン(インターフェロン−βもしくはインターフェロン−γ)、およびインターロイキン(例えば、インターロイキン4もしくはインターロイキン12)を含む)をコードする核酸を含む組換えVSVベクターを、この腫瘍細胞および/または悪性細胞に投与する工程を包含する。
【0010】
本発明は、サイトカインをコードする核酸を含む組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)ベクターを提供し、ここでこの組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞に対して野生型VSVベクターより高い腫瘍崩壊活性を示す。いくつかの例において、サイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ)である。他の例において、サイトカインはインターロイキン(例えば、IL−4またはIL−12)である。いくつかの例において、VSVベクターは、2つ以上のサイトカイン(例えば、2つのインターロイキン)またはインターフェロン(例えば、インターフェロン−β)、およびインターロイキン(例えば、インターロイキン12)を含む。2つ以上のサイトカインは、同一であっても、異なっていてもよい。さらなる例において、VSVベクターは複製欠損型である。なお他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質機能を欠損し、そしてMタンパク質機能および/またはNタンパク質機能もまた欠損し得る。他の例において、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路に欠損を有する細胞である。本発明はまた、インターフェロンをコードする核酸を含む複製欠損型VSVベクターを提供し、ここでこの組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞に対して野生型VSVベクターより高い腫瘍崩壊活性を示す。いくつかの例において、インターフェロンは、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γである。他の例において、VSVベクターはGタンパク質機能を欠損する。さらなる例において、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路に欠損を有する細胞である。さらなる例において、動物は腫瘍細胞を含み、そして他の例において、動物は哺乳動物(例えば、ヒト)である。本発明はまた、本発明のVSVベクター(例えば、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードする核酸を含むVSVベクター)を含むウイルス粒子を提供する。
【0011】
本発明はまた、本発明の組換えVSVベクターをコードする単離された核酸、および本発明の組換えVSVベクターを含む宿主細胞を包含する。本発明はまた、本発明の組換えVSVベクターを作製する方法を提供し、この方法は、VSVが生成される条件下で、上記VSVベクターを含む細胞を増殖させる工程;そして必要に応じて上記VSVを単離する工程を包含する。いくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型であり、そして宿主細胞は、上記VSVベクターが上記宿主細胞において複製可能なように、VSV複製のために必須のVSVタンパク質機能を含む。いくつかの例において、VSVベクターは、サイトカイン(例えば、インターフェロンまたはインターロイキン);自殺遺伝子(例えば、チミジンキナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ)または熱ショックタンパク質(例えば、gp96)のような他の生体タンパク質をコードする核酸を含む。
【0012】
本発明はまた、本発明のVSVベクターまたはウイルス粒子を含む組成物を提供する。いくつかの例において、VSVベクターは、上記組成物が腫瘍細胞と接触される場合、腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるために有効な量で組成物中に存在する。他の例において、この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【0013】
本発明はまた、腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための方法を提供し、この方法は、この細胞と、サイトカインをコードする核酸を含む組換えVSVベクターとを接触させる工程を包含し、上記VSVベクターは、腫瘍細胞に対して、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍崩壊活性を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは複製欠損型である。他の例において、VSVベクターはGタンパク質機能を欠損する。なおさらなる例において、サイトカインはインターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ);あるいはサイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、インターロイキン4またはインターロイキン12))である。さらなる例において、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路に欠損を有する細胞である。なおさらなる例において、上記接触させる工程は、上記腫瘍細胞を含む個体への静脈内注射によってか、または上記腫瘍細胞を含む個体への腫瘍内注射によってである。
【0014】
本発明はまた、腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じる方法を提供し、この方法は、この腫瘍細胞と、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターとを接触させる工程を包含し、上記VSVベクターは、プロドラッグと一緒に投与された場合、腫瘍細胞に対して、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍崩壊活性を示す。この方法のいくつかの例において、この自殺遺伝子はチミジンキナーゼ(TK)をコードし、そしてこのプロドラッグは、ガンシクロビル(ganclyclovir)またはアシクロビルである。他の例において、この自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼをコードし、そしてこのプロドラッグは、5−フルオロシトシンである。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは複製欠損型である。他の例において、VSVベクターはGタンパク質機能を欠損する。この方法のなお他の例において、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路に欠損を有する細胞である。他の例において、上記接触させる工程は、上記腫瘍細胞を含む個体への静脈内注射によってか、または上記腫瘍細胞を含む個体への腫瘍内注射によってである。
【0015】
本発明はまた、腫瘍増殖を抑制する方法を提供し、この方法は、この腫瘍と、サイトカインをコードする核酸を含む組換えVSVベクターとを接触させる工程を包含し、上記VSVベクターは、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターはGタンパク質機能を欠損する。なおさらなる例において、サイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ);あるいはサイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、インターロイキン4またはインターロイキン12)である。本発明はまた、腫瘍の増殖を抑制するための方法を提供し、この方法は、この腫瘍と、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターとを接触させる工程を包含し、上記VSVベクターは、プロドラッグと一緒に投与された場合、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターはGタンパク質機能を欠損する。なおさらなる例において、この自殺遺伝子はチミジンキナーゼをコードし、そしてこのプロドラッグは、ガンシクロビルまたはアシクロビルである。他の例において、この自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼをコードし、そしてこのプロドラッグは、5−フルオロシトシンである。この方法のなお他の例において、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路に欠損を有する細胞である。
【0016】
本発明はまた、個体において腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するための方法を提供し、この方法は、上記個体に、VSVベクターを用いて感染させたか、VSVベクターによって溶解した腫瘍細胞を含む組成物を投与する工程を包含する。いくつかの例において、VSVベクターは、サイトカイン、熱ショックタンパク質または免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの例において、このサイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ);あるいはサイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、インターロイキン4またはインターロイキン12)である。本発明はまた、個体に免疫応答を誘導し得る組成物(VSVベクターを用いて感染させたか、VSVベクターによって溶解した腫瘍細胞を含む)を提供する。いくつかの例において、VSVベクターは、サイトカイン、熱ショックタンパク質または免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む。本発明はまた、腫瘍を対して個体を防御するための方法を提供し、この方法は、個体から得た腫瘍細胞とVSVベクターとを、上記腫瘍細胞を溶解させるのに適した条件下で接触させる工程;および上記個体に上記溶解した戻す工程を包含する。いくつかの例において、VSVベクターは、サイトカイン、熱ショックタンパク質または免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む。
【0017】
本発明はまた、腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための医薬の調製における組成物の使用を提供し、この医薬は、サイトカインをコードする核酸を含む組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)ベクターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有し、上記組換えVSVベクターは、この腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞に対して野生型VSVベクターより高い腫瘍崩壊活性を示す。本発明はまた、腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための医薬の調製における組成物の使用を提供し、この医薬は、インターフェロンをコードする核酸を含む複製欠損型VSVベクターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有し、上記組換えVSVベクターは、この腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞に対して野生型VSVベクターより高い腫瘍崩壊活性を示す。本発明はまた、腫瘍抑制のための医薬の調製における組成物の使用を提供し、この医薬は、サイトカインをコードする核酸を含む複製欠損型VSVベクターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有し、上記組換えVSVベクターは、この腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞に対して野生型VSVベクターより高い腫瘍崩壊活性を示す。本発明はまた、腫瘍抑制のための医薬の調製における組成物の使用を提供し、この医薬は、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有し、上記VSVベクターは、プロドラッグと共に投与された場合、野生型VSVベクターより高い腫瘍抑制を示す。
【0018】
本発明はまた、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードする核酸を含むVSVベクターおよびVSVベクターを使用するための指示書を備えるキットを提供する。
【0019】
サイトカインまたは他の生物学的に活性な分子(例えば、チミジンキナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ)を発現するためのVSV構築物の作製方法および使用方法、ならびにVSV発現構築物を含むウイルスまたは哺乳動物細胞もまた、開示される。本発明はまた、生成するのが困難な、毒性タンパク質または希少なタンパク質を生成する方法を提供する。本発明はまた、標準の(authentic)(すなわち、真核生物の)プロセシングを提供するVSV発現系を用いて真核生物のタンパク質を生成するための方法を提供する。
【0020】
(発明の詳細な説明)
水疱性口内炎ウイルス(VSV)は、5個の遺伝子しか含まない負鎖ウイルスであり、これは、不死化悪性細胞において優先的に複製し、最終的にアポトーシスを引き起こす。VSVウイルスゲノムの略図を、図6に示す。VSVが腫瘍細胞または悪性細胞中で再生する能力は、一部、欠損インターフェロン(IFN)系に対して生じると報告されている。このIFN系は、正常な細胞において機能的であるので、IFN感受性ウイルスであるVSVの効率的な複製は、妨げられる、インビトロおよびインビボノ観察に基づいて、VSVは、正常な細胞への影響が比較的小さいまま、感染した癌細胞において複製し、そして感染した癌細胞を溶解することが実証されている。Stodjら(前出);Fernandezら(2002,J.Virol.76:895−904);Balachandranら(2001,J.Virol.75:3474−9;BalachandranおよびBarber(前出)。
【0021】
腫瘍崩壊剤としてのVSVの使用は、腫瘍治療において現在使用されている他のウイルス送達系(例えば、アデノウイルスおよびレトロウイルス)を越えるいくつかの利点を有する。第1に、VSVは、既知の形質転換能力を有さない。VSVは、遺伝子弱毒型ではなく、これは複製、従って、腫瘍崩壊性抗腫瘍活性に影響を与える。VSVのエンベロープ糖タンパク質(G)は、多数の細胞型に対して高度に向性であり、そしてインビボにおける種々の組織の標的化に効果的であるはずである。VSVは、多種多様な腫瘍形成性細胞において複製し得、かつ例えば、選択的腫瘍サプレッサ遺伝子(例えば、p53)が欠損している細胞のみにおいては、複製し得ない。VSVは、Ras、Mycおよびp53経路(全ての細胞の90%より多くで生じる細胞異常)において欠損を有する腫瘍において、その腫瘍崩壊活性を強力に発揮する。VSVは、遺伝子操作によって、免疫調節性および/またはVSVの抗腫瘍活性するように設計された自殺カセットを含むように改変され得る。
【0022】
本明細書中で開示される実験結果は、サイトカインまたは自殺カセットをコードする核酸を含むVSVベクターが、野生型VSVベクターのみよりも、腫瘍細胞に対する増大した腫瘍崩壊活性を示すことを証明する。本明細書中に開示される実験からの結果は、TKをコードする核酸を含むVSVベクターが、全身または皮下腫瘍に対する腫瘍崩壊活性を示し、そして抗腫瘍T細胞応答を刺激することを証明する。データはまた、動物が1以下のm.o.i.で感染された場合、VSV−IL4またはVSV−TKが、インビボにおいて、非常に攻撃性の黒色腫細胞のアポトーシスを誘導することを証明する。このデータはまた、本明細書中で開示される実施例において、VSV−TKおよびSVS−IL4が、VSV単独よりも優れた腫瘍崩壊活性を示すことを証明する。
【0023】
VSVはまた、IFN−β(図10)またはIFN−γを発現するために首尾良く使用されてきた。IFN応答は腫瘍細胞中では不完全であるため、VSV−IFNは、腫瘍細胞において増殖し得る。従って、VSV−IFNは、腫瘍細胞中でなお複製して、これらの腫瘍細胞を破壊する。腫瘍細胞中での複製の間、VSVは、高レベルのIFNを生成し、このIFNが、周辺細胞に分泌される。IFNは、強力な免疫刺激分子(これらのサイトカインは、樹状細胞およびNK細胞を活性化し得る)であり、これはまた、腫瘍抑制特性を有する。従って、VSV−IFN感染細胞からのIFNの合成は、さらなる抗腫瘍効果を誘導し得、そしてVSVの腫瘍崩壊活性を増大し得る。腫瘍を取りまく正常細胞は、VSV合成IFNにより活性化される(このVSV合成IFNにより誘導されるその抗ウイルス状態を有する)はずであり、不慮のVSV感染に対してさらに保護されるはずである。実際に、VSV−IFNは、VSV単独よりも強力な抗腫瘍活性を発揮するはずであり、そして正常な、すなわち非腫瘍細胞に対して安全であるはずである。本明細書中で開示されるデータは、VSV−IFNが癌細胞を非常に効率的に殺傷し、そして正常細胞はかなり多く保護されることを示す。従って、IFN−βを発現するVSVは、癌細胞に対して特異的であり、正常細胞においてより弱毒性であり、従って、より安全である。本明細書中で記載される実験からの結果は、IFN−βまたはIFN−γをコードする核酸を含むVSVベクターは、癌細胞中で複製し、そしてこの癌細胞を殺傷することを証明する。このデータはまた、VSV−IFN−βおよびVSV−IFN−γが、VSV単独よりも優れた腫瘍崩壊活性を示すことを証明する。
【0024】
本明細書中で開示されるデータは、VSVベクターが、高レベルの生物学的に活性な組換えタンパク質を発現するために使用され得ることを示す。本質的に、ウイルス感染の後、細胞転写および翻訳は妨げられ、そして細胞質資源が、ウイルス遺伝子および任意の付随する異種核酸、さらに強力には、毒性細胞遺伝子またはウイルス遺伝子の制御されない発現に集中する。本明細書中で開示されるデータは、VSVが、腫瘍崩壊活性(例えば、腫瘍細胞の殺傷)を大いに増大し得る遺伝子(例えば、自殺カセットおよび免疫調節カセット)を送達するように改変され得ることを証明する。さらに、VSVは、高い標的特異性および優れたトランスフェクション効果を有する。
【0025】
(一般的技術)
本発明の実施は、他に記載されない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を用い、これらは当業者の技量の範囲内である。このような技術は、以下のような文献に、十分に説明される:「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第2版(Sambrookら、1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編、1984);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshne編、1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.);「Handbook of Experimental Immunology」(D.M.Weir & C.C.Blackwell編);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller & M.P.Calos編、1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編、1987);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994);および「Current Protocols in Immunology」(J.E.Coliganら編、1991)。
【0026】
水疱性口内炎ウイルスに関する一般的な情報については、「Fundamental Virology」第2版、1991、B.N.Fields編、Raven Press,New York,489−503頁;および「Fields Virology」第3版、1995、B.N.Fields編、第1巻、1121−1159頁を参照のこと。
【0027】
本明細書中で使用される場合、「VSV」とは、VSVの任意の株またはVSVの変異形態(例えば、WO01/19380に記載されるもの)をいう。本発明のVSV構築物は、いくつかの形態(ゲノムRNA、mRNA、cDNA、ヌクレオカプシドコア中にカプセル化されたVSV RNAの一部または全て、PEGのような化合物と複合体化したVSV、および非ウイルスタンパク質に結合したVSVが挙げられるが、これらに限定されない)のいずれかであり得る。本発明のVSVベクターは、複製コンピテントVSVベクターおよび複製欠損VSVベクター(例えば、G糖タンパク質を欠くVSVベクター)を包含する。
【0028】
本明細書中で使用される場合、用語「悪性」、「悪性細胞」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」(交換可能に使用される)とは、比較的自律的な増殖を示し、その結果、これらが細胞増殖の制御の有意な欠損により特徴付けられる異常な増殖表現型を示す、細胞をいう。用語「腫瘍」は、転移性腫瘍および非転移性腫瘍を含む。
【0029】
本明細書で使用される場合、「腫瘍崩壊活性」とは、腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の増殖の阻害または抑制;腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の退行;腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の細胞死;あるいはさらなる腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の発生の防止をいう。本明細書中で使用される場合、「腫瘍増殖の阻害または抑制」とは、腫瘍の増殖速度の減少、腫瘍増殖の完全な停止、現存の腫瘍の大きさを退行させること、現存の腫瘍の根絶および/またはVSV含有組成物の投与の際のさらなる腫瘍の発生の防止、すなわち、本発明の方法、をいう。腫瘍増殖の「抑制」は、本発明のVSVと接触しない場合の増殖と比較した場合に減少した増殖状態を示す。腫瘍細胞増殖は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得、これらの手段としては、腫瘍の大きさの測定、腫瘍細胞が3H−チミジン取込みアッセイを使用して増殖するか否かの決定、または腫瘍細胞の計数が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の増殖の「抑制」とは、以下の状態のいずれかまたは全てを意味する:腫瘍増殖の緩徐化、遅延および停止、ならびに腫瘍の縮小化。腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞の「発症の遅延」とは、疾患の発症を、遅延し、妨害し、緩徐化し、遅らせ、安定化しそして/または延期することを意味する。この遅延は、疾患の経歴および/または処置される個体に基づいて、種々の時間の長さであり得る。
【0030】
本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、個体において免疫応答を刺激し得る任意のサイトカインを含む。このようなサイトカインとしては、インターロイキン(インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−12を含むが、これらに限定されない);インターフェロン(インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωおよびインターフェロン−εを含むが、これらに限定されない);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子;および腫瘍壊死因子が挙げられるが、これらに限定されない。「免疫調節性」タンパク質は、免疫系を刺激し得るタンパク質であり、これには、サイトカインおよびケモカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
用語「自殺カセット」または「自殺遺伝子」(本明細書中では交換可能)とは、腫瘍細胞を殺傷するのを助ける遺伝子をいい、これには、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」とは、1つ以上の細胞型の形質転換/トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。VSVベクターは、例えば、「クローニングベクター」(挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計される)、「発現ベクター」(宿主細胞のヌクレオチド配列の発現のために設計される)、または「ウイルスベクター」(組換えウイルスまたはウイルス様粒子の生成を生じる様に設計される)、あるいは「シャトルベクター」(1つより多いタイプのベクターの性質を含む)であり得る。本発明は、サイトカインをコードする核酸を含むVSVベクターを包含し、このサイトカインには、本明細書中で記載されるサイトカイン;ケモカイン(例えば、Mip);同時刺激タンパク質(例えば、B7−1およびB7−2);アンギオスタチン;エンドスタチン;ならびに熱ショックタンパク質(例えば、gp96)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」(本明細書中で交換可能に使用される)とは、任意の長さのヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか)のヌクレオチドのポリマー形態をいう。これらの用語は、一本鎖、二本鎖または三本鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、ゲノムRNA、mRNA、DNA−RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的に改変されたヌクレオチド塩基、生物学的に改変されヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基が挙げられる。このポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基(代表的にRNAまたはDNAで見出され得る場合と同様)、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、このポリヌクレオチドの骨格は、合成サブユニット(例えば、ホスホルアミデート)のポリマーを含み得、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート(P−NH2)または混合ホスホルアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Peyrottesら(1996)Nucleic Acids Res.24:1841−8;Chaturvediら(1996)Nucleic Acids Res.24:2318−23;Schultzら(1996)Nucleic Acids Res.24:2966−73。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用され得る。Braunら(1988)J.Immunol.141:2084−9;Latimerら(1995)Molec.Immunol.32:1057−1064。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して、適切な条件下でこの鎖をアニーリングすることによって、または適切なプライマーと共にDNAポリメラーゼを使用してデノボで相補鎖を合成することによってのいずれかで、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得られ得る。ポリヌクレオチド配列に対する参照(例えば、配列番号に対する参照)もまた、相補配列を含む。
【0034】
以下は、ポリヌクレオチドに非限定的な例である:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ゲノムRNA、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド(例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖)および連結基(例えば、フルオロリボースおよびチオエート)、ならびにヌクレオチドの分枝鎖を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合により、重合の後にさらに改変され得る。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体に結合するための手段の導入である。
【0035】
「転写制御下」とは、当該分野で十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与するかまたは転写を促進するエレメントに作動可能に結合されていることに依存することを示す。「作動可能に連結される」とは、これらのエレメントが機能し得る配置をいう。
【0036】
VSVの場合において、「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝子」または「導入遺伝子」は、野生型VSVには存在しない任意のポリヌクレオチドまたは遺伝子である。
【0037】
VSVの場合において、「異種」プロモーターは、VSVとは関係なく、VSV由来でもないプロモーターである。
【0038】
「宿主細胞」は、本発明のVSVのレシピエントであり得るかまたはレシピエントであった個体の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然、偶発的または意図的な変異および/または変化に起因して元の親細胞と必ずしも完全に同一(形態学的にまたは総DNA相補体において)でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のVSVベクターで、インビボまたはインビトロでトランスフェクト、形質転換または感染された細胞を含む。
【0039】
「複製」および「増殖」は、交換可能に使用され、そして本発明のVSVベクターが再生または増殖する能力をいう。これらの用語は、当該分野で十分に理解されている。本発明の目的のため、複製は、VSVタンパク質の生成に関与し、そして一般に、VSVの再生に関する。複製は、当該分野で標準的なアッセイを使用して測定され得る。「複製」および「増殖」は、ウイルス生産のプロセスに直接的かまたは間接的に関与する任意の活性を含み、これには、ウイルス遺伝子発現;ウイルスタンパク質、核酸または他の成分の産生;完全ウイルスへのウイルス成分のパッケージング;および細胞溶解が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物としては、家畜、競技用動物、げっ歯類、霊長類(例えば、ヒト)、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
「有効量」は、有益な結果または所望の結果(臨床結果を含む)を達成するのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のため、VSVベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和するか、改善するか、安定化するか、逆にするか、遅らせるかまたは遅延するのに十分な量である。
【0042】
「発現」は、転写および/または翻訳を含む。
【0043】
本明細書中で使用される場合、用語「含む(comprising)」およびその同族語は、その包括的な意味で使用される;すなわち、用語「含む(including)」およびその対応する同族語と等価である。
【0044】
「a」、「an」および「the」は、その文脈が明らかにそうでないことを記載していない限り、複数の対象を含む。
【0045】
(VSV)
(VSV配列およびVSV構築物)
RhabdoviridaeファミリーのメンバーであるVSVは、感染細胞の細胞質において複製し、遺伝子組換えも再会合も受けず、公知の形質転換の可能性を有さず、そしてそのゲノムの任意の部分を宿主に組み込まない負鎖ウイルスである。VSVは、ヌクレオカプシド(N)、ポリメラーゼタンパク質(L)および(P)、表面糖タンパク質(G)および周辺マトリクスタンパク質(M)と呼ばれる5種のタンパク質をコードする約11キロベースのゲノムを含む。このゲノムは、ヌクレオカプシド(N)タンパク質で密接に囲われ、そしてまた、ポリメラーゼタンパク質(L)および(P)を含む。細胞の感染の後、このポリメラーゼタンパク質は、ネガティブセンスゲノム由来の5種のサブゲノムウイルスmRNA(これらはウイルスタンパク質をコードする)の転写を開始する。このポリメラーゼタンパク質はまた、子孫ビリオン中へパッケージングされる全長ウイルスゲノムの複製を担う。このマトリクス(M)タンパク質は、RNAゲノム/ヌクレオカプシドコア(RNP)、およびまたグリコシル化(G)タンパク質に結合し、これはスパイク様突出物のアレイにおける外表面から伸長し、そして細胞表面レセプターへの結合および感染プロセスの開始を担う。
【0046】
(G)タンパク質を介する宿主表面上のレセプターへのVSVの結合の後、ウイルスは、この宿主を通過し、皮膜をはがしてRNP粒子を放出する。ポリメラーゼタンパク質(これはウイルスと共に運ばれる)は、ゲノムの3’末端に結合し、次いで、N、P、M、GおよびLをコードする個々のmRNAを合成し、次いでネガティブセンス子孫ゲノムを合成する。新たに合成されたN、PおよびLタンパク質は、細胞質において会合し、そしてRNPコアを形成し、このRNPコアは、MおよびGタンパク質の両方において富む形質膜の領域に結合する。ウイルス粒子は、発芽を形成するか、または子孫ウイルスの放出がその後で起こる。
【0047】
VSVゲノムの概略図を、図6に示す。種々のVSV株の表は、「Fundamental Virology」、第2版(前出)、490頁に示される。WO01/19380および米国特許第6,168,943は、VSVの株としては、Indiana、New Jersey、Piry、Colorado、Coccal、ChandipuraおよびSan Juanが挙げられることを開示している。VSVゲノムの完全ヌクレオチド配列および推定タンパク質配列は、公知であり、Genbank VSVCG、登録番号JO2428;NCBI Seq ID 335873として入手可能であり、そしてRoseおよびSchubert,1987、The Viruses:The Rhabdoviruses,Plenum Press,NY.pp.129−166において公開されている。VSV株の完全配列は、米国特許第6,168,943に示される。VSV New Jersey株は、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能であり、ATCC登録番号VR−159を有する。VSV Indiana株は、ATCCから入手可能であり、ATCC登録番号VR−1421を有する。
【0048】
本発明は、VSVの任意の株(WO01/19380に開示されるVSVの変異体を含む)の使用を包含する。本発明は、任意の形態のVSV(ゲノムRNA、mRNA、cDNAおよびヌクレオカプシドコア中にカプセル化されたVSV RNAの一部または全てが挙げられるが、これらに限定されない)を包含する。本発明は、VSVベクター構築物の形態のVSV、およびウイルス粒子の形態のVSVを包含する。本発明はまた、本明細書中で開示される特定のVSVベクターをコードする核酸を包含する。本明細書中で考察される様に、本発明のVSVベクターは、複製コンピテントVSVベクターおよび複製欠損VSVベクターを包含する。
【0049】
従って、本発明は、サイトカインをコードする核酸を含む組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)ベクターを提供し、ここでこの組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触された場合、野生型VSVベクターよりも、腫瘍細胞に対してより大きな細胞崩壊活性を示す。いくつかの例において、このサイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ)である。他の例において、このサイトカインは、インターロイキン(例えば、IL−4またはIL−12)である。本発明は、1つより多い生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸を含むVSVベクター(例えば、2種のサイトカイン(例えば、インターフェロンおよびインターロイキン);2種のインターフェロン;または2種のインターロイキンをコードする核酸を含むVSVベクター)を包含する。一例において、VSVベクターは、インターフェロン−βおよびインターロイキン−12をコードする核酸を含む。VSVベクターは、熱ショックタンパク質(例えば、gp96)、およびサイトカイン(例えば、インターフェロン)をコードする核酸を含み得る。他の例において、VSVベクターは、複製コンピテントベクターである。さらなる例において、VSVベクターは、複製欠損型ベクターである。さらに他の例において、VSVベクターは、複製に必須のタンパク質機能(例えば、Gタンパク質機能またはMおよび/もしくはNタンパク質機能)を欠く。このVSVベクターは、複製に必須のいくつかのタンパク質機能を欠き得る。他の例において、腫瘍細胞は、黒色腫細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路の欠損を有する細胞である。本発明はまた、インターフェロンをコードする核酸を含む複製欠損VSVベクターを提供し、ここでこの組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触された場合、野生型VSVベクターよりも大きな、腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す。いくつかの例において、インターフェロンは、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γである。他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質を欠く。さらなる例において、腫瘍細胞は、黒色腫細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞または腫瘍抑制経路の欠損を有する細胞を含む。さらなる例において、動物は、腫瘍細胞を含み、そして他の例において、動物は、哺乳動物(例えば、ヒト)である。本発明はまた、本発明のVSVベクター(例えば、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードする核酸を含むVSVベクター)を含むウイルス粒子を提供する。本発明はまた、本発明の組換えVSVベクターをコードする単離された核酸、および本発明の組換えVSVベクターを含む宿主細胞を含む。
【0050】
VSVは、インターフェロン(IFN)の抗ウイルス作用に対して感受性である。I型IFNシグナル伝達が欠損されたマウスを用いる研究において、この動物は、VSVによる致命的な感染に対して感受性になる。データは、機能性IFN系が、ウイルス複製の阻害を担う抗ウイルス遺伝子を誘導するために必要であることを示す。IFNにより誘導される1つの鍵となる抗ウイルス遺伝子は、RNA依存性タンパク質キナーゼ(PKR)と称され、これはVSV胃難船に対する保護に重要であることが示された68kDaのセリン/スレオニンタンパク質キナーゼである。PKRタンパク質および活性の下方制御は、広域なヒト悪性腫瘍において生じる。従って、減少したPKR活性を有する腫瘍細胞は、その正常な対応物よりもVSV感染に対して感受性であることが推定される。WO01/19380。細胞/細胞株におけるPKRの活性を測定するための方法は、当該分野で公知である。表1は、インターフェロンが、rVSVの感染に対して一次細胞を保護するが、形質転換細胞は保護しないことを示す。IFNで24時間予め処置したB16(F10)(マウス黒色腫)、DA−3(マウス乳癌)およびHMVEC(ヒト微小血管内皮細胞;正常細胞)を、WT VSV、VSV−IL−4、VSV−TKまたはVSV−GFPで、0.1pfuのm.o.i.で、18時間感染させた。感染細胞由来の上清を使用して、プラークアッセイにおけるウイルス力価を決定した。
【0051】
(表1.インターフェロンで処置した形質転換細胞および初代細胞におけるウイルス力価)
【0052】
【表1】
VSVは、悪性細胞において優先的に複製する。これは、頸部癌細胞において損傷しているVSV感染を通常は含む宿主防御機構に主に起因し、従って、ウイルスを増加させる。このウイルスは、ウイルス誘導性アポトーシスに関する機構によって悪性腫瘍細胞を破壊する。マウスにおける腫瘍増殖は、VSVの腫瘍内播種または静脈内播種の後に、破壊され得る。表2は、細胞株の列挙、およびこれらの細胞株において複製するVSVの能力を示す。
【0053】
(表2)
【0054】
【表2】
ここで、「hu」とは、ヒト起源をいう。
【0055】
自殺カセットおよび/または免疫調節遺伝子を含む組換えVSVベクターは、アポトーシス性(apoptotic)免疫活性または抗腫瘍性免疫活性を増強することが示されている。IL−4遺伝子またはIL−12遺伝子をコードする核酸を含みそして細胞の感染の後に大容量のIL−4サイトカインまたはIL−12サイトカインを発現する組換えVSVベクターが産生されている。IL−4およびIL−12は、T細胞応答およびB細胞応答を調節する原因となる。理論に束縛されることなく、rVSV−IL4発現構築物またはVSV−IL−12発現構築物は、身体において癌細胞を標的化するべきであり、多くの局在化したIL−4またはIL−12を産生しつつ複製するべきであり、これによって、腫瘍に対する細胞傷害性T細胞および/または抗体応答が刺激され得る。これは、増幅した抗腫瘍性効果を有し得、そしてこの悪性疾患を根絶することを補助し得る。VSV構築物に挿入される他の免疫調節性タンパク質としては、インターフェロン、ケモカイン、エオドスタチン、アンギオスタチン、および熱ショックタンパク質gp96が挙げられる。
【0056】
自殺カセットTK遺伝子を含む組換えVSVが、構築され、この組換えVSVは、細胞のVSV感染の後に多量のチミジンキナーゼを発現する。腫瘍細胞における単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)の発現によって、プロドラック(例えば、ガンシクロビル(gancyclovir)(GCV)およびアシクロビル(ACV))のそれらのモノホフフェート形態(これらは、細胞性キナーゼによってそれらのジホフフェート形態およびトリホスフェート形態へさらにリン酸化される)への変換が可能となる。次いで、このトリホスフェート代謝産物は、DNAに取り込まれそして哺乳動物のDNAポリメラーゼを妨害することによって細胞死を引き起こす。この遺伝子を発現しない隣接腫瘍細胞はまた、GCVの存在下で殺傷され、この現象は、「巻き添え殺傷(bystander killing)」として公知である。この影響は、細胞性コネキシン(コネクソン)およびギャップ接合部(これによって、毒性代謝産物の隣接細胞への移入が可能となる)によって媒介される。本明細書において実証されるように、TKをコードする核酸を含むVSVベクターは、VSVベクター単独に対するより高い殺傷能力を実証する。他の自殺遺伝子(例えば、シトシンデアミナーゼ(これは、5−フルオロシトシン(5−FC)を化学療法剤である5−フルオロウラシル(5−FU)へと代謝し得る細胞を与える))をコードする核酸を含むさらなるVSV構築物は、細胞殺傷を増大し、巻き添え効果が生じている。当業者によって理解されるように、他の自殺遺伝子が使用され得る。自殺遺伝子のVSVベクターへの添加によって、免疫無防備状態である個体にたいするVSV療法の安全性が改善され得る。ウラシルホスホリボシルトランフェラーゼに融合されたシトシンデアミナーゼをコードする核酸を含むVSVベクターを構築した。このVSVベクターは、シトシンデアミナーゼ活性の機能的発現を提示した。
【0057】
インターフェロンならびに特にインターフェロンβおよびインターフェロンγをコードする核酸を含むVSVベクター構築物が産生されている。図10に示されるように、高レベルの機能的INF−βが、INF−βをコードする核酸を含むVSVベクター構築物を含む細胞によって産生されている。図9において示されるように、VSV−IFN−βおよびVSV−IFN−γは、VSB感染の24時間後でのDA−3細胞の細胞死を増大させる。
【0058】
さらに、組換えVSVは、多くの「作製が困難な/毒性の/希少である」タンパク質を効率的に産生する。従って、このようなウイルスは、大量のIL−4、IL−12、IL−2および他のサイトカインまたは他の毒性で作製が困難なタンパク質を作製するのに有用であり得る。従って、本発明は、アンギオスタチン、エンドスタチンをコードする核酸をコードするVSVベクターを含み、熱ショック分子、および免疫同時刺激分子が調製されている。VSVベクターおよびVSVウイルス粒子が、大量に、選択された任意のタンパク質を作製するために生成され得、そして首尾よいバキュロウイルス/昆虫細胞発現系の真核生物バージョンを構成する。VSV系の利点は、高レベルの発現および(昆虫細胞系とは違った)真正(真核生物の)プロセシングを含む。
【0059】
したがって、本発明は、本発明の組換えVSVベクターを作製するための方法を提供し、この方法は、上述のVSVベクターを含む細胞をVSVが産生される条件下で増殖する工程;および必要に応じて上述のVSVを単離する工程を包含する。いくつかの実施例において、このVSVベクターは複製欠損型でありそして宿主細胞は、上述のVSVベクターは上記宿主細胞の中での複製が可能であるようにVSV複製にとって必須のVSVタンパク質を機能を含む。いくつかの実施例において、このVSVベクターはサイトカイン(例えば、インターフェロンまたはインターロイキン)、自殺遺伝子(例えば、チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ)または他の生物学的タンパク質(例えば、熱ショックタンパク質(例えば、gp96)ならびにエンドスタチンおよびアンギオスタチン)をコードする核酸を含む。
【0060】
(VSVを含む、宿主細胞、組成物およびキット)
本発明はまた、本明細書中に記載のVSVベクターまたはVSV粒子を含む(すなわち、形質転換したか、トランスフェクトしたか、または感染した)宿主細胞を提供する。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞(昆虫細胞を含む)の両方は、その宿主における維持について必要な配列(例えば、適切な複製起点)が存在する限り、使用され得る。便利のため、選択マーカーがまた提供される。宿主系は、当該分野で公知であり、そして、本明細書中において詳細に説明する必要はない。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞(例えば、E.coli,B.subtilis,および放線菌)が挙げられる。真核生物宿主細胞の含まれるものとしては、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、植物細胞、C.elegans(または、線形動物)の細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。真菌(酵母を含む)の宿主細胞の例としては、S.cerevisiae、Kluyveromyces lactis(K.lactis)、Candida種(C.albicansおよびC.glabrataを含む)、Aspergillus nidulans、Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)、Pichia pastoris、およびYarrowia lipolyticaが挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、COS細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎(HEK)細胞、およびアフリカミドリザル(African green monkey)細胞が挙げられる。Xenopus laevis卵母細胞または他の両生類起源の細胞もまた、使用される。
【0061】
本発明はまた、本明細書中で記載されるVSVベクターを含有する薬学的組成物を含む組成物もまた含む。このような組成物は、インビボ投与のとき(例えば、形質導入の程度および/または悪性細胞に対する腫瘍細胞崩壊性活性の効果を測定するとき)に有用である。組成物は、本発明のVSVベクターおよび適切な溶媒(例えば、生理学的に受容可能な緩衝液)を含む。これらは、当該分野で公知である。他の実施形態において、これらの組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む。これらの組成物(有効量の本発明のVSVベクターを薬学的に受容可能な賦形剤中に含み得る)は、単位用量形態での個体への全身性投与または局所投与、無菌非経口溶液もしくは懸濁液、無菌であり非経口性ではない溶液あるいは経口溶液または懸濁物、o/wエマルジョンまたはw/oエマルジョンなどにとって適切である。非経口薬物送達および非腸管外(nonparenteral)薬物送達のための処方は、当該分野で公知であり、そしてRemington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition,Mack Publishing(1995)において記載されている。組成物はまた、本発明の凍結乾燥形態および/または再構成形態のVSVベクター(ウイルスとしてパッケージされたものを含む)を含む。
【0062】
本発明はまた、本発明のVSVベクターを含むキットを包含する。これらのキットは、例えば、スクリーニングのためにタンパク質の生成、アッセイおよび生物学的用途(例えば、腫瘍の処置)について使用され得る。これらのキットを使用する処置は、臨床研究機関、実験研究機関、医療従事者または私個人によって実施され得る。
【0063】
本発明のキットは、適切なパッケージ中に、本明細書に記載のVSVベクターを含む。このキットは、必要に応じて、以下を含むがこれに限定されない処置にとって有用なさらなる成分を提供する:緩衝液、顕色試薬(developing reagent)、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、指示書、および解説情報。このキットは、VSVベクターを投与するための指示書を備え得る。
【0064】
(組換えVSVを産生するための方法)
VSVおよび関連するネガティブストランドウイルスの研究は、組換えDNA技術を使用してこのウイルスを直接な遺伝的操作を実施することができないことによって限定されている。DNAからVSVを生成することにおける困難は、完全長ゲノムも抗ゲノムRNAも感染性でないことである。最小の感染単位は、ヌクレオカプシド(N)プロテインの1,250のサブユニットに密に結合したゲノムRNA(Thomasら,1985,J.Virol.54:598−607)およびより少ない量である2つのウイルスコードポリメラーゼポリメラーゼサブユニット(LおよびP)である。ウイルスRNAから感染性ウイルスを再構成するために、まず、VSBポリメラーゼによる転写および複製のためのテンプレートとしての役割を果たすNプロテイン−RNA複合体をアセンブリすることが必要である。よりすくない、インフルエンザウイルスゲノムのネガティブストランド(マイナス鎖)RNAセグメントは、インビトロでヌクレオカプシドにパッケージされ得、次いで、インフルエンザに感染した細胞の中でレスキューされる(Enamiら,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3802−3805;Luytjesら,1989,Cell 59:1107−1113)、インビトロにおけるより大きな真核生物ゲノムRNAをパッケージするための系は、未だに利用可能ではない。
【0065】
DNA由来のミニゲノムまたはRhabdoviruseに由来する小さい欠失RNAの複製および転写のための系(ConzelmannおよびSchnell,1994,J.Virol.68:713−719;Pattnaikら,1992,Cell 69:1011−1120)が記載されている。これらの系において、ウイルスNプロテインおよびポリメラーゼタンパク質を発現する細胞の中で、RNAがヌクレオカプシドにアセンブリされる。これらの系は、感染性ウイルスの全長ゲノムの遺伝的操作を可能にしない。米国特許第6,168,943号によって、組換えベシクロウイルスが導入される動物において複製を可能にする感染性組換えベシクロウイルスの調製方法が開示されている。例えば、米国特許第6,168,943号によって、DNAが抗ゲノムRNAを産生するように転写されそしてこのDNAから産生される抗ゲノムRNAに相補的なゲノムRNAを含むベシクロウイルスが産生される条件下で、適切な宿主細胞中に以下を提供することによってベシクロウイルスが産生されることが記載されている:(a)ベシクロウイルス抗ゲノム(+)RNA(これは、ベシクロウイルスゲノムに相補的である)を産生する(コードする)ように転写され得るDNA、(b)ベシクロウイルス Nプロテインの組換え供給源、(c)ベシクロウイルスPプロテインの組換え供給源、ならびに(d)ベシクロウイルスLプロテインの組換え供給源。
【0066】
あるいは、ゲノムRNAの精製の後に、VSV mRNAは、インビトロで合成され得、そして、cDNAが標準的方法によって調製され、その後、クローニングベクターに挿入される(例えば、RoseおよびGallione,1981,J Virol.39(2):519−528を参照のこと)。VSVまたはVSVの一部分は、オリゴヌクレオチド合成(その配列が既知である場合)または組換え法(例えば、PCRおよび/または制限酵素)を使用して調製され得る。本発明のVSVベクターを作製するために使用されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法のような当該分野における標準的な方法を使用して得られえるか、そして/または生物学的供給源から得られ得る。VSV RNAの個々のcDNAクローンは、遺伝子接合部に及ぶ小さなDNAフラグメントの使用によって連結され得、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応の使用(RT−PCR)の使用によってVSV ゲノム RNA(第6節,下記を参照のこと)から生成され得る(MullisおよびFaloona,1987,Meth.Enzymol.155:335−350)。完全な感染性ウイルスをVSVゲノムのプラスミドcDNAコピーから回復する能力は、このウイルスの遺伝的操作を実行可能すること許容する。
【0067】
本明細書に開示の実施例において、VSVの11,161ヌクレオチドの全体を表すcDNAクローンが生成され、そして、固有のXho I/Nhe I部位が、異種遺伝子が入ることを容易にするように加えられた(例えば、HSV−TK)。このcDNAの転写は、T7 RNAポリメラーゼに依存する。ワクシニアvTF7−3は、胎仔ハムスター腎細胞(BHK−21)を感染するために使用され得、ポリメラーゼの供給源を提供した。その後、VSV cDNAが、VSVのNプロテイン、Pプロテイン、およびLプロテインを発現する3つの他のプラスミドと一緒に同じ細胞に移入された。これらの最後の3つのタンパク質は、ヌクレオカプシドへの発生しようとするVSV抗ゲノムRNAのアセンブルを容易にし、そして、VSV感染サイクルを開始する。24時間後に、宿主細胞が溶解され、分類され、そして残るワクシニアが、0.2μmフィルターを通して濾過することによって、きれいなBHK細胞へと除去される。野生型VSVは、産生され得ないので組換えVSVのみが、この方法によって産生される(Roseら,1995,P.N.A.S.USA)。
【0068】
VSVは、インビボでの用途のためにその特性を変更するために、遺伝的に改変され得る。VSVの遺伝的改変のための方法は、当該分野で十分に確立している。例えば、逆遺伝学的系がVSVのために確立されており(Robertsら,Virology,1998,247:1−6)、これによって、VSVの遺伝的特性の改変が可能となる。当業者にとって周知の標準的な技術は、VSVを遺伝的に改変し、そして所望の遺伝子をVSVゲノムに導入して組換えVSVを産生するために使用され得る(例えば、Sambrookeら,1989,A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと)。ヌクレオチド配列(例えば、サイトカインをコードするヌクレオチド配列)をVSVベクターへ挿入するために、または、VSV遺伝子配列をベクターに挿入するために(例えば、産生ヘルパー細胞株のために)、特異的な開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために必要とされる。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。VSV遺伝子全体(例えば、それ自体の開始コドンおよび隣接配列を備えるGタンパク質)が適切なベクターに挿入されるような場合に、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされ得ない。しかし、この遺伝子配列の一部分のみが挿入される場合、内因性翻訳制御シグナル(ATG開始コドンを含む)が提供されなければならない。この開始コドンは、さらに、挿入物全体の翻訳を確保するために、タンパク質コード配列のリーディングフレームとフェーズが一致していなければならない。これらの内因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源(天然および合成の両方)であり得る。
【0069】
宿主細胞の感染の後に、組換えVSVは宿主細胞タンパク質合成をシャットダウンしそしてそれ自体の5つの遺伝子産物だけではなくそのゲノム中にコードされた異種タンパク質も発現する。VSV組換え体由来の異種核酸の首尾よい発現は、VSV遺伝子接合部の各々において見出される最小限の保存された配列を伴った全長cDNAへの異種核酸配列の添加のみを必要とする。この配列は、ポリアデニル化/転写停止シグナル(3’AUACU7)、その後の遺伝子間ジヌクレオチド(GAまたはCA)およびVSV mRNAの5’に対して相補的な転写開始配列(3’UUGUCNNUAG)からなる。Ballら1999,J.Virol.73:4705−4712;Lawsonら1995,P.N.A.S.USA 92:4477−4481;Whelanら1995,P.N.A.S.USA 92:8388−8392。さらに、(好ましくは、固有の)制限部位(これは、例えば、ポリリンカー中にある)が、VSV cDNA(例えば、遺伝子間領域)に導入され、異種核酸(例えば、インターロイキンまたはインターフェロンをコードする核酸)の挿入を促進する。他の実施例において、このVSV cDNAは、それに作動可能に連結したプロモーターを有するように構築されている。このプロモーターは、その組換えVSVベクターを産生することが所望される動物細胞または昆虫細胞におけるそのcDNAの転写を開始することができるはずである。使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない:SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981,Nature 290:304−310)、Rous sarcomaウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamoto,et al.,1980,Cell 22:787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441−1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら,1982,Nature 296:39−42);熱ショックプロモーター(例えば、ショウジョウバエS2細胞での使用のためのhsp70);ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに以下の動物転写制御領域(これらは、組織特異性を提示しかつトランスジェニック動物中で使用されてきている):膵臓腺房細胞おいて活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら,1984,Cell 38:639−646;Ornitzら,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409;MacDonald,1987,Hepatology 7:425−515);膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan,1985,Nature 315:115−122)、リンパ細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38:647−658;Adamesら,1985,Nature 318:533−538;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436−1444)、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell 45:485−495)、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら,1987,GenesおよびDevel.1:268−276)、肝臓で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら,1985,Mol.Cell.Biol.5:1639−1648;Hammerら,1987,Science 235:53−58);肝臓で活性であるα1−抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes and Devel.1:161−171)、骨髄細胞で活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域(Mogramら,1985,Nature 315:338−340;Kolliasら,1986,Cell 46:89−94);脳の中の希突起神経膠細胞において活性なミエリンベーシックプロテイン遺伝子制御領域(Readheadら,1987,Cell 48:703−712);ならびに骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature 314:283−286)。好ましくは、このプロモーターは、RNAポリメラーゼプロモーター、好ましくは、バクテリオファージまたはウイルスまたは昆虫のRNAポリメラーゼプロモーターであり、これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:T7 RNAポリメラーゼに対するプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼに対するプロモーター、およびT3 RNAポリメラーゼに対するプロモーター。RNAポリメラーゼプロモーターが使用される場合(ここで、このRNAポリメラーゼは、宿主細胞によって内因的に産生されておらず、この宿主細胞において、その組換えVSVが産生されることが所望される)、RNAポリメラーゼの組換え供給源は、宿主細胞中において提供されなければならない。このようなRNAポリメラーゼは、当該分野で公知である。
【0070】
VSV cDNAは、異種タンパク質(例えば、サイトカインまたは自殺遺伝子を含む哺乳動物タンパク質)をコードする核酸の挿入の前またはその後に、プロモーターに作動可能に連結され得る。幾つかの例において、転写ターミネータは、VSV cDNAの下流に位置付けられる。いくつかの例において、リボザイム配列を産生するように転写されるDNA配列は、VSV cDNAの3’末端の近く、転写停止シグナルの前に位置付けられ、その結果、転写の際に、自己切断リボザイム配列は、抗ゲノムRNAの3’末端において産生され、このリボザイム配列は、自己溶解的(autolytically)に(Uの後で)その融合転写物を切断してVSV抗ゲノム(+)RNAの正確な3’末端を放出する。当該分野で公知のリボザイム配列が、その正確な配列が認識されそして切断される限りにおいて、使用され得る(ハンマーヘッドリボザイムは、使用にはおそらく不適切であることに留意のこと)。
【0071】
本発明のVSVベクターは、例えば、サイトカイン、自殺遺伝子または熱ショックタンパク質gp96遺伝子、または例えば、緑蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子のような、哺乳動物タンパク質をコードする1以上の異種核酸配列を含む。サイトカインの例としては、以下があげられるが、これらに限定されない:インターフェロン(IFN)(IFN−β、IFN−γ、INF−α、INF−ω、およびINF−ε;腫瘍壊死因子(TNF)、リンホトキシン、インターロイキン(IL)(これは、IL−2、IL−4およびIL−12を含むがこれらの限定されない)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)。VSVベクターは、例えば、2つのインターロイキン、2つのインターフェロン、または(1つの)インターロイキンおよび(1つの)インターフェロンのような、2つのサイトカインをコードする核酸を含み得る。
【0072】
IFNをコードする遺伝子のほとんどについての配列は、それらが天然に存在するときに、公開され、そして多くがAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Rockville,Md.)に寄託されている。本発明のVSVベクターは、任意の形態のIFNをコードし得る。いくつかの例において、この核酸は、ヒト形態のIFNをコードする。これは、ヒトIFN、IFN−α、IFN−β,IFN−γ,IFNω,およびINF−εを含む。ヒトINF−α配列が、Weberら(1987,EMBO,J.6:591−598)に記載され;ヒトINF−β配列が米国特許第5,908,626号およびFiersら(1982)Philos.Trans.R.Soc.Lond.,B,Biol.Sci.299:29−38)に記載され、そして、GenBankにAccession No.M25460のもと寄託され;ヒトINF−γは、ATCCから利用可能であり、そして、ATCCAccession No.39047および同39046を有し、そして、特定の形態の組換えヒトIFN−γが市販されており(rhIFN−γ−lb,Actimmune.RTM.,Genentech,Inc.South San Francisco,Calif.);そしてヒトIFN−ε配列は米国特許第6,329,175号に開示されている。ヒトIL−2遺伝子は、クローンニングされ、そして配列決定され、そして例えば、0.68 kB BamHI−HinDIIIフラグメントとしてpBC12/HIV/IL−2(American Type Culture Collection(「ATCC」)から寄託番号67618のもと入手可能である)から得られ得る。米国特許第5,951,973号は、マウスおよびヒトのIL−4についての配列を開示している。インターロイキン−12(IL−12)は、もともと、ナチュラルキラー細胞刺激因子と称されており、例えば、M.Kobayashiら,J.Exp.Med.,170:827(1989)に記載されているようなヘテロダイマー性サイトカインである。組換え宿主細胞におけるIL−12プロテインのこの発現および単離は、詳細に以下において記載されている:国際特許出願W090/05147(1990年5月17日に公開)(また、欧州特許出願第441,900号においても公開されている)。ヘテロダイマー性のヒトIL−12の30kdおよび40kdのサブユニットのDNAおよびアミノ酸配列が、上で引用した国際出願において提供されている。研究量の組換えヒトIL−12および組換えマウスIL−12は、Genetics Institute,Inc.,Cambridge,Massachusettsから利用可能である。さらに、ヒトGM−CSF、ヒトTNF、およびヒトリンホトキシンの配列が、知られておりそして利用可能である。ヒトGM−CSFの配列が知られており(Wongら(1985)Science 228:810−815)そして、GenBankにAccession No.M10663のもと寄託されている。ヒトTNFの配列が記載されおり(Wangら(1985)Science 228:149−154)、そして、GenBankにAccession No.M10988のもと寄託されている。ヒトリンホトキシン(TNF−b)の配列もまた、公開されおり(Irisら(1993)Nature Genet.3:137−145)、そして、GenBankにAccession No.Z15026のもと寄託されている。
【0073】
本発明のVSVベクターまたはウイルス粒子は、自殺遺伝子(例えば、チミジンキキナーゼ(TK)(例えば、単純疱疹TK)またはシトシンデアミナーゼ(CD)(例えば、E.coli CD)をコードする核酸を含み得る。このHSV−TK遺伝子は、以前に、マップされ、クローニングされ、そして配列決定されており、そして容易に利用可能である(EMBL HEHSVLTK,Accession X03764,EMBL HEHS07,Accession V00466)。このHSV−tk遺伝子は、天然の供給源(例えば、単純疱疹ウイルスI型(HSV−1)のウイルスゲノム由来または単純疱疹ウイルスII型(HSV−2)ゲノム由来)から得られ得る。水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ゲノムもまた、特異的なチミジンキナーゼ遺伝子(VZV−tk)を含み、この遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、そして特徴付けられている(Moriら(1988)Intervirology 29:301−310,(1986)J.Gen.Virol.67:1759−1816)。従って、VZV−tk遺伝子は、VZVゲノムから得られ得る。E.coliシトシンデアミナーゼ遺伝子もまた、クローニングされそして配列決定されている(Danielsonら(1992)Mol.Microbiol.6:1335−1344,Austinら(1993)Mol.Pharmacol.43:380−387,Dongら(1996)Human Gene Therapy 7:713−720)、そして、これの遺伝子配列は、Accession No.S56903のもとGenBankに寄託されている。従って、E.coliシトシンデアミナーゼ遺伝子は、当業者にとって公知の多くの天然または合成の供給源から取得可能であり得る。あるいは、シトシンオリゴヌクレオチドまたは自殺遺伝子オリゴヌクレオチドは、当該分野で従来のものである固相直接オリゴヌクレオチド合成化学的な方法および酵素連結法の併用によって合成的に誘導され得る。合成配列は、市販のオリゴヌクレオチド合成デバイス(例えば、Applied Biosystems,Inc.(Foster City,Calif)から入手可能なデバイス)を使用して調製され得る。
【0074】
本発明は、1つ以上の異種ヌクレオチド配列(例えば、サイトカイン(例えば、インターフェロン)または2つのサイトカイン、あるいは自殺遺伝子(例えば、複製に必須のVSVの領域(例えば、G糖タンパク質領域)または他の複製に必須の領域内に挿入された、TK))をコードするヌクレオチド配列)を含み、その結果、そのVSVが必須の機能を欠失しそして複製欠損となるVSVベクターを含む発現系を包含する。このVSVベクターは、例えば、VSVゲノム(G領域、M領域、N領域、L領域またはP領域を含む)の、点変異また一部分または全体の欠失のような変異を有し得る。この変異が、複製に必須の領域の中にある場合、そのVSVは、必須領域の機能を提供するヘルパー細胞株の中で増殖する。このVSVはまた、例えば、点変異または複製に必須のヌクレオチド配列の一部分または全体の欠失のような変異を含み、必要に応じて、その欠失したヌクレオチド配列の部位において挿入された異種核酸配列を伴う。この異種ヌクレオチド配列は、必要に応じて転写調節配列に連結し得る。標的の悪性細胞または腫瘍細胞への感染の後に、子孫ウイルスは、必須タンパク質機能を欠失させ、かつその周囲組織への感染が汎発し得ない。さらなる実施形態において、VSVベクターは、例えば、核酸の、点変異、置換、または添加によってかあるいはVSVタンパク質機能(例えば、Mプロテイン機能および/またはNプロテイン機能)をコードする他の核酸の一部分または全体の欠失によって核酸において変異されている。VSVは、インビトロで所望の部位に対して標的化され得、ウイルスの効率を増大させる。例えば、特異的部位を標的する融合タンパク質を産生するためのVSV Gプロテイン(または他のVSVタンパク質)の改変がインビボでのVSV効率を増大するために使用され得る。このような融合タンパク質としては、例えば、腫瘍抗原に対する特異性を有する単鎖Fvフラグメント(Lorimerら,P.N.A.S.U.S.A.,1996.93:14815−20)が挙げられえるがこれらに限定されない。
【0075】
ウイルス複製に必須な遺伝子を欠くVSVベクターは、適切な相補性細胞株において増殖し得る。従って、本発明は、複製欠損型VSV構築物の複製に必須なVSVタンパク質機能を提供する組換えヘルパー細胞株またはヘルパー細胞を提供する。いくつかの例において、タンパク質機能は、Gタンパク質機能である。例えば、サイトカインをコードし、Gタンパク質機能を欠く核酸を含むVSVベクターは、細胞株、すなわち、ヘルパー細胞株(例えば、VSV複製に許容的なCHO細胞株のような哺乳動物細胞株)において増殖し得、ここで、この細胞株は、適切なGタンパク質機能を発現し、その結果、このVSVは、細胞株において複製し得る。これらの相補的またはヘルパー細胞株は、複製欠損型VSVが、複製し、異種ヌクレオチド配列によってコードされる1つ以上の外来遺伝子またはそのフラグメントを発現することを可能にし得る。いくつかの実施形態において、VSVベクターは、複製に必須なタンパク質機能(例えば、Gタンパク質機能)を欠き、そして宿主細胞株は、複製に必須なタンパク質機能(例えば、VSV Gタンパク質機能)をコードする核酸を含む。相補的細胞株は、例えば、ヘルパーウイルスを同時感染することによって、または特定のウイルス機能をコードするウイルスゲノムの一部または全てを、安定な形態で組み込むかもしくはそれ以外で維持することによって、VSVウイルス機能を提供し得る。他の例において、さらなるVSV非必須タンパク質は、欠失され得るか、異種ヌクレオチド配列が、非必須VSV(例えば、Mタンパク質およびNタンパク質)をコードするヌクレオチド領域に挿入され得る。異種ヌクレオチド配列は、複製に非必須な領域に挿入され得、ここで、VSVは、複製コンピテントである。異種ヌクレオチド配列は、VSVベクターの増殖のためにヘルパー細胞株の使用を必要とすることなく、VSVゲノムの非必須領域に挿入され得る。
【0076】
本発明の組換えVSVは、例えば、適切な宿主細胞VSV cDNAにおいて提供することによって産生され、ここで、このcDNAは、異種タンパク質(例えば、サイトカイン(インターロイキンまたはインターフェロンを含む)または自殺遺伝子)をコードするヌクレオチド配列を含む。異種タンパク質をコードする核酸は、複製に非必須な領域または複製に必須な領域に挿入され得、この場合、VSVは、適切なヘルパー細胞株の存在下で増殖する。いくつかの例において、組換えVSVベクターの産生は、インビトロ、細胞培養物中、VSVの増殖に許容性の細胞においてである。標準的な組換え技術は、VSVタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。このようなタンパク質の発現は、当該分野において公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントによって制御され得る。VSVタンパク質の発現を制御するために使用され得るプロモーターは、構成性または誘導性であり得る。
【0077】
組換えVSV産生に使用される宿主細胞は、VSVが増殖する任意の細胞(例えば、哺乳動物細胞およびいくつかの昆虫(例えば、Drosophila)細胞)であり得る。機能性INF系を欠く初代細胞、または他の例において、不死化または腫瘍細胞株が使用され得る。当該分野において一般的に公知な多くの細胞株が使用のために利用可能である。例として、このような細胞株としては、限定しないが、BHK(べービーハムスター腎臓)細胞、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞、HeLA(ヒト)細胞、マウスL細胞、Vero(サル)細胞、ESK−4、PK−15、EMSK細胞、MDCK(Madin−Darbyイヌ腎臓)細胞、MDBK(Madin−Darbyウシ腎臓)細胞、293(ヒト)細胞、およびHep−2細胞が挙げられる。このような細胞株は、例えば、ATCCおよび他の培養受託所から公に入手可能である。
【0078】
本明細書中に開示される例において、プラスミド(pVSV−XN2)は、図1Aに示されるように、構築された。HSV−TK、マウスIL−4、INF−βまたはINF−γまたはGFPをコードする遺伝子は、VSV G遺伝子およびVSV L遺伝子の間で、pVSV−XN2中にクローンされた。細胞株によって産生される組換えVSV(rVSV)は、例えば、親和性マトリクスを使用して単離され得る。親和性マトリクスによって単離する方法は、例えば、WO 01/19380に記載される。簡潔には、rVSVを単離する方法は、VSVを親和性マトリクスに添加して、結合したVSVを産生する工程、結合したVSVを洗浄する工程、および親和性マトリクスからVSVを溶出する工程を包含する。本発明は、ウイルスの外側表面に非天然の融合タンパク質を含む改変VSVを含む。非ネイティブなタンパク質は、親和性タグおよびウイルスエンベロープタンパク質を含む融合タンパク質であり得るか、またはそれは、プロデューサー細胞由来であり得る。プロデューサー細胞株は、それらの原形質膜上に1つ以上の親和性タグを発現するように操作され得、これは、ウイルスがこの膜を通って出芽するので、ウイルスによって獲得される。親和性タグの1つの例は、固定化ニッケルカラムに結合するヒスチジン残基の使用である。親和性タグはまた、抗体を含む。アフィニティー精製のための他のプロトコルが当該分野において公知であるように使用され得、例えば、限定しないが、バッチプロセシング、ウイルスおよび親和性マトリクスの溶液、遠心分離によるVSV結合マトリクスのペレット化、およびウイルスの単離が挙げられる。あるいは、VSVは、米国特許第6,168,943号に記載されるように、収集および精製され得る。簡潔には、VSVは、培養上清から収集され、そして上清は、細胞細片を除くために浄化される。ウイルスを単離および濃縮する1つの方法は、接線方向流れの膜濃度を通る上清の通過による。収集物は、グリセロールクッションを通すペレット化によって、そしてスクロースの段階的勾配での濃縮によって容積をさらに減少し得る。
【0079】
(本発明の組換えVSVベクターを使用する方法)
目的のVSVベクターおよびウイルス粒子が、幅広い種々の目的(これは、所望の結果または意図した結果とともに変化する)について使用され得る。従って、本発明は、本明細書中に記載されるVSVベクターを使用する方法を含む。
【0080】
本発明は、腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌細胞において腫瘍崩壊性活性を生じるための方法を提供し、この方法は、細胞(例えば、転移性疾患の腫瘍細胞または悪性細胞を含む)を、本発明のVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、このVSVベクターは、細胞に対して、野生型VSVベクターよりも大きな腫瘍崩壊性活性を示す。いくつかの例において、接触は、投与(例えば、この細胞を含む個体への静脈注射)によってもたらされる。他の例において、この接触は、投与(例えば、この細胞を含む個体への腫瘍内注射)によってもたらされる。これらの方法について、VSVベクターは、腫瘍崩壊性活性を生じるための他の処置様式(例えば、腫瘍抑制)(限定しないが、当該分野で公知の化学療法剤、照射および/または抗体が挙げられる)とともに使用されても使用されなくても良い。本発明はまた、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードする核酸を含むVSVベクターを含む組成物を提供し、ここで、このVSVベクターは、この組成物が腫瘍細胞および/または悪性細胞に投与された場合に、腫瘍崩壊性活性を生じるのに十分な量で組成物中に存在する。いくつかの例において、この組成物は、薬学的賦形剤をさらに含む。他の例において、この組成物は、腫瘍細胞を含む個体に、腫瘍内的にまたは静脈内的に投与される。
【0081】
従って、本発明は、腫瘍細胞において腫瘍崩壊性活性を生じるための方法を提供し、この方法は、この細胞を、組換えVSVベクター(サイトカインをコードする核酸を含む)と接触させる工程を包含し、ここで、このVSVベクターは、腫瘍細胞に対して、野生型VSVベクターよりも大きな腫瘍崩壊性活性を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質機能を欠く。なおさらなる例において、サイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ);例えば、インターロイキン(例えば、インターロイキン−4またはインターロイキン−12)のようなサイトカインである。さらなる例において、腫瘍細胞は、黒色腫細胞、哺乳動物腫瘍細胞、前立腺細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞が挙げられる。なおさらなる実施形態において、この接触は、この腫瘍細胞を含む個体への静脈注射によって、またはこの腫瘍細胞を含む個体への腫瘍内注射によってである。
【0082】
本発明はまた、腫瘍細胞において腫瘍崩壊性活性を生じるための方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞を、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、このVSVベクターは、プロドラッグとともに投与される場合、腫瘍細胞に対して、野生型VSVベクターよりも大きな腫瘍崩壊性活性を示す。この方法のいくつかの例において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ(TK)をコードし、そしてプロドラッグは、ガンシクロビルまたはアシクロビルである。他の例において、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼをコードし、そしてプロドラッグは、5−フルオロシトシンである。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質機能を欠く。この方法のなお他の例において、腫瘍細胞としては、黒色腫細胞、哺乳動物腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞が挙げられる。他の例において、この接触は、この腫瘍細胞を含む個体への静脈注射によって、またはこの腫瘍細胞を含む個体への腫瘍内注射によってである。
【0083】
本発明はまた、処置方法を提供し、ここで、本明細書中に記載されるVSVベクター、または本発明のVSVベクターを含む組成物の有効量は、悪性細胞および/または腫瘍細胞および/または癌性細胞を含むか、有するかまたは有すると疑われる個体に投与される。VSVは、乳腺腫瘍(MCF7)、前立腺腫瘍(PC−3)、または頸部腫瘍(Hela)由来の細胞株、ならびに血液学的に関連する悪性疾患由来の種々の細胞(HL 60、K562、Jurkat、BC−1)を含む形質転換されたヒト細胞株において、細胞死を誘導することが示された。BC−1は、ヒトヘルペスウイルス−8(HHV−8)に対して陽性であり、Bcl−2を過剰発現し、そして幅広い種々のアポトーシス刺激および化学療法ストラテジーに対して非常に耐性である。さらなる研究の結果は、VSVが、Mycまたは活性化Rasを用いて特異的に形質転換された細胞のアポトーシスを誘導し得、そしてMycもしくは活性化されたRasを有するか、またはp53を欠くかまたはBcl−2を過剰発現する形質転換された細胞が、VSV複製およびウイルス誘導アポトーシスに感受性であることを示した。図7A〜7Bは、いくつかのヒト癌細胞株が、VSV複製および溶解に対して許容性であることを図示する。従って、本発明のVSVベクターまたは本発明のVSVベクターを含む組成物の投与が、種々の悪性細胞または腫瘍細胞において腫瘍崩壊性活性を生じることが予測される。本発明のVSVベクターでの感染に対する感受性について、細胞または細胞株(悪性細胞株を含む)をスクリーニングするための方法が、WO 01/19380に開示される方法によって実施され得る。簡潔には、ウイルスを用いる処置に感受性の腫瘍を同定するための方法は、以下の工程を包含する:(a)腫瘍の細胞を含むサンプルを第1部分および第2部分に分割する工程;(b)VSVウイルスを用いて部分を処置する工程;ならびに(c)第1部分における死滅した細胞の割合が、第2部分におけるよりも高いか否かを決定する工程。ここで、この腫瘍は、第1部分における死滅した細胞の割合が、第2部分における割合よりも高い場合、VSVウイルスを用いた処置に感受性である。
【0084】
本発明は、上記のように、VSV感染に感受性の悪性細胞および/または腫瘍細胞を有する個体においてVSVベクターを使用する処置を包含する。腫瘍または悪性細胞を発症する危険があると考えられる個体(例えば、悪性細胞または腫瘍細胞を含む以前の疾患を有した個体、またはこのような腫瘍細胞または悪性細胞の家族歴を有した個体)もまた示される。本発明のVSVベクターを投与することの適合性の決定は、評価可能な臨床的パラメーター(例えば、血清学的な指標および細胞、組織または腫瘍生検の組織学的検査)に依存する。一般的に、薬学的に受容可能な賦形剤中にVSVベクターを含む組成物が、投与される。
【0085】
従って、本発明は、腫瘍増殖を抑制するための方法を提供し、この方法は、腫瘍を組換えVSVベクター(サイトカインをコードする核酸を含む)と接触させる工程を包含し、ここで、このVSVベクターは、野生型VSVベクターよりも大きな腫瘍抑制を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質機能を欠く。なおさらなる例において、サイトカインは、インターフェロン(例えば、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ);例えば、インターロイキン(例えば、インターロイキン−4またはインターロイキン−12)のようなサイトカインである。本発明はまた、腫瘍増殖を抑制するための方法を提供し、この方法は、腫瘍を組換えVSVベクター(自殺遺伝子をコードする核酸を含む)と接触させる工程を包含し、ここで、このVSVベクターは、プロドラッグとともに投与した場合、野生型VSVベクターよりも大きな腫瘍抑制を示す。この方法のいくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVベクターは、Gタンパク質機能を欠く。なおさらなる例において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ(TK)であり、そしてプロドラッグは、ガンシクロビルまたはアシクロビルである。他の例において、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼをコードし、そしてプロドラッグは、5−フルオロシトシンである。この方法のいくつかの例において、腫瘍細胞としては、黒色腫細胞、哺乳動物腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞が挙げられる。
【0086】
本発明は、上記のように、VSV感染に感受性の悪性細胞および/または腫瘍細胞を有する個体において、VSVベクターを使用する、細胞または組織のエキソビボ処置を包含する。細胞のエキソビボ処置は、細胞の混合物から望ましくない悪性細胞または癌性細胞を減少または排除する試みにおいて行われ得る。このような細胞としては、例えば、骨髄細胞または末梢血幹細胞が挙げられる。従って、本発明は、細胞のエキソビボ処置のための方法を提供し、これによって、望ましくない細胞を含むかまたは望ましくない細胞を含む疑いのある個体由来の細胞集団を、本発明のVSVベクター(例えば、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードする核酸を含むVSVベクター)と接触する。接触後、細胞集団は、個体に移植して戻され得る。ウイルスを使用する細胞のエキソビボパージは、例えば、WO 02/00233に記載される。
【0087】
本発明はまた、腫瘍および/または悪性細胞および/または癌性細胞をインビトロで感染させるために、VSVベクター(例えば、IFN(IFN−βおよびIFN−γを含む)のような1つ以上のサイトカインをコードする核酸を含むVSVベクターを含む)の使用を包含する。本発明は、VSV感染に感受性の任意の腫瘍および/または悪性細胞および/または癌性細胞を包含する。VSVベクターは、腫瘍細胞において複製し、サイトカイン(免疫調節性遺伝子)を高レベルに発現する。これらの細胞は、動物(いくつかの例において、これらが得られる動物に戻される)に播種され、この動物は、感染し、溶解した腫瘍細胞に対する免疫応答を作り出す。VSV発現サイトカインは、宿主の免疫応答を刺激する。従って、個体(例えば、ヒトを含む哺乳動物)は、本発明のVSVベクターと接触した腫瘍細胞および/または悪性細胞および/または癌性細胞に曝露され、続いて、溶解され、それによって「癌ワクチン」効果を生じる場合、引き続く腫瘍チャレンジから保護され得る。「癌ワクチン」としての本発明のVSVベクターの使用は、マウスにおいて増殖した腫瘍を得;本発明のVSVベクター(例えば、IFN、IL−12のようなサイトカインをコードする核酸を含むVSVベクター)および/または熱ショックタンパク質と腫瘍をインビトロで接触させることによって、動物モデルにおいて試験され得る。次いで、異なるマウス(同じ系統)(それらにおいて増殖する同じ腫瘍型を有する)に、VSV感染腫瘍細胞を播種する。VSV感染腫瘍細胞は、その動物において溶解し、宿主の免疫系を誘発し、そして樹立された腫瘍(ワクチン後)を根絶する。対照的に、ウイルスに曝露されない、溶解した腫瘍細胞は、免疫原性に乏しい。VSVウイルス感染の使用は、動物において免疫応答を誘発する。いくつかの例において、VSVベクターは、複製欠損型である。他の例において、VSVは、複製コンピテントである。従って、本発明は、本発明のVSVベクターに感染するかまたは本発明のVSVベクターによって溶解される腫瘍細胞を含む個体において免疫応答を誘発し得る組成物を提供する。本発明はまた、個体において腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するための方法を提供し、この方法は、本発明のVSVベクターに感染するかまたは本発明のVSVベクターによって溶解する腫瘍細胞を含む組成物をこの個体に投与する工程を包含する。いくつかの例において、VSVベクターは、1つ以上のサイトカイン(例えば、インターフェロンまたはインターロイキン)をコードする核酸を含む。他の例において、VSVベクターは、免疫調節タンパク質(例えば、ケモカイン);または熱ショックタンパク質(例えば、gp96)をコードする核酸を含む。本発明はまた、腫瘍チャレンジに対して個体を保護するための方法を提供し、この方法は、個体由来の腫瘍細胞と、サイトカイン、免疫調節タンパク質または熱ショックタンパク質(例えば、gp96)をコードする核酸を含むVSVベクターとを、この腫瘍細胞を溶解するのに適切な条件下で接触させる工程;およびこの溶解した腫瘍細胞をこの個体に戻す工程を包含する。
【0088】
一旦、サイトカインまたは自殺遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むVSVベクターが得られると、VSVベクター、またはベクターを含むVSV粒子は、必要な個体に投与され得る。このような個体は、悪性細胞または腫瘍細胞を含み得るか、あるいは悪性細胞もしくは腫瘍細胞を発症する危険があり得るかまたは転移性疾患の発症があり得る。サイトカインまたは自殺遺伝子カセットを含む本発明のVSV構築物は、局所的腫瘍または転移性疾患を処置するために使用され得る。種々の細胞および細胞株(卵巣癌腫細胞、線維肉腫、肺癌腫、黒色腫、前立腺癌腫、肺癌腫および白血病細胞を含む)は、VSV感染に感受性である。従って、これら由来のこのような腫瘍細胞および/または悪性細胞は、サイトカインまたは自殺遺伝子を発現するVSVを用いた処置に特に受け入れ可能であり得る。本明細書中に開示されるように、サイトカインまたは自殺遺伝子を発現するVSVは、wtVSVよりも大きな腫瘍崩壊性活性を示すことが示されている。VSVが、腫瘍内的に、腫瘍細胞または悪性細胞に局所的に投与される場合、ならびに腫瘍または悪性細胞に対して遠位に投与される(例えば、静脈内投与または他の経路によって)場合、腫瘍崩壊性活性を有することが予期される。
【0089】
免疫調節遺伝子または自殺遺伝子(例えば、チミジンキナーゼ)を有する、遺伝的に操作されたVSVが作製され得るか否か、およびこのようなウイルスが腫瘍治療において野生型VSVよりも効果的であるか否かを評価するために、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ自殺カセット(TK)またはサイトカイン遺伝子インターロイキン−4(IL−4)を有するVSVベクターを開発した。TKの作用の機構が、非毒性プロドラッグガンシクロビル(GCV)をリン酸化するTKタンパク質を含み、これは、鎖の終結および細胞死を導く複製の間、細胞性DNAに組み込まれることが公知である。TK/GCV自殺アプローチは、改変されたTKが、形質導入された細胞から隣接する細胞に直接的に通過し得、それによって腫瘍殺傷を増加する(「バイスタンダー(bystander)効果」として公知の現象)というさらなる利点を有することを報告している。対照的に、IL−4の活性は、効果器細胞(例えば、好酸球および抗原提示細胞)の発症に影響する工程を包含する。IL−4はまた、Tヘルパー(Th)細胞のTh2への発達を調節し、そして体液性応答の刺激を補助することが公知である(Asnagliら、2001,Curr.Opin.Immunol.13:242−7)。高いレベルのIL−4は、腫瘍発達の初期段階における腫瘍の拒絶に重要であることが報告されており、そして移植された操作されたIL−4分泌細胞およびIL−4を形質導入するウイルスベクターは、黒色腫、神経膠腫および結腸癌腫を含む多くの悪性疾患の後退を媒介することが示されている(Benedettiら、2000,Nat.Med.6:447−50;Giezeman−Smits,2000,Cancer Res 60:2449−50;Nagaiら、2000,Breast Cancer 7:181−6;Tepperら、1992,Science 257:548−51)。
【0090】
本明細書中に開示される実験からの結果は、TKをコードする核酸を含むVSVベクターが、全身性の皮下腫瘍に対して細胞崩壊性活性を示し、そして抗腫瘍性T細胞応答を刺激することを実証する。データはまた、VSV−IL4またはVSV−TKが、動物に1以下のm.o.i.で感染させた場合、高度に活性な黒色腫細胞のアポトーシスをインビボで誘導することを実証する。データはまた、VSV−TKおよびVSV−IL−4が、本明細書中に開示される実施例において、VSV単独に対してよりも優れた細胞崩壊性活性を示すことを実証する。
【0091】
インターフェロン(特に、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ)をコードする核酸を含むVSVベクターが開発された。本明細書中に記載される実験からの結果は、INF−βまたはINF−γをコードする核酸を含むVSVベクターが、悪性細胞において複製し、そしてそれらを殺傷することを実証する。データはまた、VSV−INF−βおよびINF−γが、VSV単独よりも優れた細胞崩壊性活性を示すことを実証する。
【0092】
(投与方法)
多くの方法が、VSVベクターまたはウイルス粒子を個体に投与または導入するために使用され得、限定しないが、経口的、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内、皮下、および鼻腔内の経路を含む。VSVベクターまたはウイルス粒子が投与される個体は、霊長類であり、他の例において、哺乳動物であり、他の例において、ヒトであるが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない、非ヒト哺乳動物であり得る。VSVベクターまたはウイルス粒子の使用において、個体は、VSVベクターまたはウイルスが増殖および/または複製し得る任意の動物であり得る。本発明は、VSVベクターまたはウイルス粒子を含む組成物を包含し、ここで、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。投与されるVSVベクターの量は、いくつかの因子(例えば、投与経路、個体の状態、悪性疾患の活性の程度、および使用される特定のVSVベクター)に依存する。また、VSVベクターは、他の処置様式とともに使用され得る。
【0093】
VSVウイルスとして投与される場合、約102〜約107のp.f.u.で、他の例において、約103〜約106のp.f.u.で、そして他の例において、約104〜約105のp.f.u.が投与され得る。ポリヌクレオチド構築物(すなわち、ウイルスとしてパッケージングされない)として投与される場合、約0.01μg〜約100μgの本発明のVSV構築物が投与され得、他の例において、0.1μg〜約500μg、そして他の例において、約0.5μg〜約200μgが投与され得る。1種より多くのVSVベクターが、同時にまたは連続的に投与され得る。投与は、代表的に、任意の応答をモニターしながら、周期的に与えられる。投与は、例えば、腫瘍内、静脈内、または腹腔内に与えられ得る。
【0094】
薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知であり、これには、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張性水性緩衝液、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような受容可能なキャリアの1つの例は、安定化された加水分解されたタンパク質、ラクトースなどのような1種以上の安定化剤を含む生理学的にバランスのとられた培養培地である。キャリアは、好ましくは、滅菌である。この処方物は、投与の様式に適合するべきである。
【0095】
組成物は、所望な場合、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝化剤を含み得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または散剤であり得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なキャリアを含み得る。
【0096】
一般的に、成分は、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、密閉された容器(例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェト)中で、単位投薬形態で、別々にまたは一緒に混合されてのいずれかで供給される。組成物が注射によって投与される場合、滅菌希釈剤のアンプルは、成分が、投与の前に混合され得るように、提供され得る。
【0097】
特定の実施形態において、本発明の凍結乾燥された組換えVSVは、第1容器において提供され;第2容器は、50%のグリセリン、0.25%のフェノール、および防腐剤(例えば、0.005%のブリリアントグリーン)の水溶液からなる希釈剤を含む。
【0098】
処方物に使用されるVSVベクターまたはウイルス粒子の正確な用量は、投与経路、および患者の性質に依存し、そして開業医の判断および標準的な臨床技術に従う各患者の環境に従って決定されるべきである。所定の調製物において使用されるVSVベクターまたはウイルスの正確な量は、重要ではないが、但し、細胞崩壊性活性を生じるのに必要な最小量のウイルスが与えら得る。約10mgという少量の投薬量範囲(ミリグラム以上の量まで)が企図される。
【0099】
本発明のVSVベクターまたはウイルス粒子の有効用量はまた、動物モデル試験システムから誘導される用量−反応曲線から外挿され得る。BALB/cマウスに対する組換えウイルスの安全性の表を、以下に示す。
【0100】
【表3】
これらのデータは、VSV−IFN−βの増殖がVSV−GFPと比較して弱化されることを示す。以下の実施例は、例示として与えられ、そして本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【実施例】
【0101】
(実施例1)
(材料および方法)
(実験プロトコル)
(細胞株。) BHK−21細胞およびB16(F10)黒色腫細胞を、American Type Culture Condition(ATCC,Manassas,Virginia)から入手した。BHK細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS,Hyclone Laboratories Inc,Logan,UT)を含有するダルベッコ改変必須培地(DMEM)中で増殖させた。B16(F10)細胞を、低い重炭酸ナトリウム(1.5g/L)を含有することを除いて類似の培地中で、増殖させた。D1−DMBA3胸部腫瘍およびこの腫瘍由来のDA−3細胞は、Dr.Diana Lopez(University of Miami,Miami,FL)からの贈与であった。ヒト初代細胞(微小血管内皮HMVEC)を、Clonetics Corp(San Diego,CA)から入手し、そして製造業者の仕様に従って増殖させた。
【0102】
(組換えウイルスの構築。) IL−4、TKおよびGFP挿入物を、それぞれpGexp、pKO−TKおよびpLEGFP−C1(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA)プラスミドから、PCRによって増幅した。IL−4については、プライマー
【0103】
【化1】
を使用した。
【0104】
GFP遺伝子については、使用したプライマーは、
【0105】
【化2】
であった。
【0106】
TK遺伝子を、以下のプライマー:
【0107】
【化3】
を使用して増幅した。
【0108】
IL−4およびGFPのPCR産物を、XhoIおよびXbaIで消化し、一方でTKのPCR産物を、XhoIおよびNheIで消化し、そしてXhoIおよびNheI(XbaIと適合性)で消化したpVSV−XN2(Dr.John Rose,Yale Universityからの贈与)に連結した。プラスミドpVSV−XN2は、VSVゲノム全体を含み、そしてVSVの転写開始シグナルおよび転写終止シグナルに隣接する独特のXhoI部位およびNheI部位を有する。感染性の組換えVSVウイルスを回収するための手順は、以前に記載されたものと類似であった(Lawsonら、1995、P.N.A.S.USA 92:4477−81;Whelanら、1995、P.N.A.S.USA 92:8388−92)。
【0109】
(インビトロ細胞殺傷アッセイ。) マウスのB16細胞、DA−3細胞、およびヒトHMVECs細胞を、約2×105細胞/ウェルで12ウェルプレートに播種した。細胞を、1000u/mlのインターフェロン(HMVECsについてはヒトインターフェロン−α−2a[Hoffman−La Roche,Nutley NJ]、B16およびDA−3についてはマウスインターフェロンαβ[Sigma,St Louis,MI])で24時間、前処理した。次いで、これらの細胞を、wt VSV、VSV−TK、VSV−IL−4またはVSV−GFPで、0.1のm.o.i.で18時間感染させ、トリプシン処理し、そしてトリパンブルー排除分析によって計数した。
【0110】
(IL−4産生についての酵素結合イムノソルベント検定法。) rVSV−IL−4でのBHK細胞の感染の24時間後に得られたrVSV−IL−4上清におけるIL−4のレベルを、Pharmingen(San Diego,CA)から入手したIL−4 ELISAキットを製造業者のプロトコルに従って使用して、決定した。
【0111】
(チミジンキナーゼ酵素アッセイ。) ガンシクロビルのリン酸化を使用して、VSV−TK感染した細胞の抽出物中のHSV−TK機能的レベルを、以下のように測定した(Yamamotoら、1997、Cancer Gene Ther 4:91−6)。野生型ウイルスまたは組換えウイルスでの24時間の感染の後に、BHK細胞をPBSで2回洗浄し、そして0.5%NP−40、50mM Tris HCl(pH7.5)、20%グリセロール、5mMベンズアミジン、2mM ジチオトレイトールおよび0.5mM PMSFを含有する緩衝液中に再懸濁させた。これらを4サイクルの凍結解凍に供し、次いで溶解物を、4℃で、13,000rpmで5分間遠心分離した。酵素アッセイを、50mM Tris HCl、5mM塩化マグネシウム、5mM ATP、10mMフッ化ナトリウムおよび2mMジチオトレイトールを含有する反応混合物中の60μgのタンパク質を使用して、37℃の水浴中で実施した。[3H]GCV(45μM)の添加後、0分、30分および60分に20μlのアリコートを取り、そしてDE−81(Whattman)ペーパー上にスポットした。このフィルターペーパーを1mM ギ酸アンモニウムで2回洗浄し、そして0.1M KCl/0.1M HClを用いて抽出し、そしてシンチレーションカウンタで計数した。
【0112】
(マウスでの腫瘍播種)
Jacksonラボラトリーからの雌のC57B1/6マウスまたはBalb/cマウス(8週齢)を、5×105個のB16(F10)黒色腫細胞を皮下(左脇腹)に播種するか、または1.5×106個のD1−DMBA3乳腫瘍細胞を皮下(乳房パッド)に播種した。投与したウイルスの型(熱不活性化VSV、野生型VSVウイルス、VSV−TKまたは熱VSV−IL−4)に従って、マウスを各々5匹の4群に分割した。触知可能な腫瘍の発達の後、マウスに2×107pfuの野生型VSVウイルスまたは組換えVSVウイルスを腫瘍内に投与し、引き続いて3日後に第2回目を注射した。VSV−TKを受けたマウスにまた、最初の注入の1日後にGCV(体重1kg当たり100mg)を投与し、引き続いてその後10日間毎日注射した。腫瘍を週に3回計測した。腫瘍がいずれかの直径で1.8cmより大きく達したらマウスを屠殺した。4つの群における平均腫瘍容積を、1方向ANOVA分析を使用して比較した。以前に記載されるように(Balachandranら、2001、J.Virol.75:3474−9)、組織病理学を実行した。
【0113】
(細胞傷害性アッセイ)
単一の細胞脾臓懸濁物を、25mmの直立フラスコ中で20:1の比率で、マイトマイシンCで処理したB16F10細胞と共に、400pg/mlのIL−2(Calbiochem、San Diego、CA)の存在下で、加湿した5%CO2雰囲気下で37℃で培養した。脾臓細胞の細胞傷害活性を、0.1mCiのNa2 51CrO4(Amersham、Arlington Heights、IL)を使用して、37℃で2時間、標準的なクロム放出アッセイを実施することによって決定した。エフェクター細胞および標的細胞の4時間のインキュベーション後、SKATRON細胞ハーベスターを使用して上清を収集し、そして51Cr放出量をγ腺カウンタ(Beckman、Palo Alto、CA)で決定した。パーセント特異的溶解を以下の公式によって計算した:実験的放出CPM−自然放出CPM/最大放出CPM−自然放出CPM×100。最大放出は、標的細胞を2% SDS(Fisher)と共にインキュベートすることによって得たcpmであり、そして自然放出は増殖培地単独を用いたインキュベーションによって決定した。51Crの自然放出は、常に、これらのアッセイにおいて全放出の15%未満であった。
【0114】
(実施例2)
(TKまたはIL−4を発現するrVSVの作製)
VSVが作製され潜在的な抗癌遺伝子を発現し得るかどうかを評価するために、HSV−TK、マウスIL−4またはコントロールの緑色蛍光タンパク質(GFP)を、VSVのG遺伝子およびL遺伝子の間のさらなる転写ユニットとして、プラスミドpVSV−XN2にクローニングした(図1a)。改変した転写ユニットからTK、IL−4またはGFPのいずれかを発現する組換えVSVを、さらなる遺伝子、ならびにVSVヌクレオキャプシド(N)、リンタンパク質(P)およびポリメラーゼ(L)タンパク質を含有する全長の抗ゲノム性(antigenomic)VSV RNAを発現する細胞において回収した。予備的な分析は、生存可能な組換えウイルスが全ての場合において得られることを示し、そして1段階の増殖曲線研究による細胞当たりのウイルス産生の試験は、野生型VSVと比較して複製能の異常な変化を全く示さなかった(図1b)。実際に、全てのウイルスは1ml当たり約109プラーク形成単位(pfu)の抜群の高力価まで増殖した。次に、本発明者らは、回収したVSVがTK、IL−4またはGFPを発現するかどうかを決定した。従って、BHK細胞をVSV−TKで24時間、1感染多重度(m.o.i.)で感染させ、そして感染細胞を、抗TKモノクローナル抗体を使用するイムノブロット分析によってTKタンパク質の発現について試験した。結果は、このTKタンパク質がVSV−TKに感染した細胞において非常に高レベルに合成されていることを示したが、対照的に、本発明者らは他の型のVSVに感染した細胞中に発現されているTKを全く検出できなかった(図2b、レーン1〜3)。TKの発現を確認を、VSV−TK感染細胞の免疫蛍光顕微鏡を使用して実証したが、VSV−緑色蛍光タンパク質(GFP)に感染したBHK細胞もまた、蛍光顕微鏡によって決定されるように、高レベルのGFPを発現した。このTKが機能性であるかどうかを確認するために、GCVリン酸化レベルを、VSV−TKまたは野生型ウイルスを用いて1m.o.i.で感染した細胞において、感染の8時間後に測定した。これらの結果は、平均で200pmol/mg/分に近づく高レベルで、TKがGCVをリン酸化したことを示し、これを本発明者らは、野生型VSV感染細胞中よりほぼ60倍大きいと評価した(図2a)。従って、本明細書中に開示されるデータは、VSVが作製されて、ウイルス複製に対して悪影響を全く有さずに、高レベルの機能性TKを発現することを示す。
【0115】
次に本発明者らは、VSVが機能性IL−4を発現し得るかどうかを分析した。IL−4は翻訳後、細胞から直ちに分泌されるので、抗マウスIL−4モノクローナル抗体を使用したVSV−IL−4感染細胞抽出物の予備的なイムノブロット分析は、予想通り、感染細胞の細胞質中にはIL−4は極僅かしか存在しないことを示した。しかし、機能性IL−4に結合するモノクローナル抗体を使用する捕捉酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)は、サイトカインがVSV−IL−4感染細胞から非常に高レベルで培養培地中に分泌されていることを示した(図2c)。実際に、VSV−IL−4は、CMVプロモーターの制御下のIL−4 cDNAでトランスフェクトした同数のBHK細胞におけるよりも100倍以上高い、106個の細胞当たり約150ng/mlのIL−4を産生した。IL−4の発現の確認を、抗IL−4モノクローナル抗体を使用して、35S標識したVSV−IL−4感染細胞の培養培地から、分泌されたIL−4を免疫沈降することによって達成した(図2d)。従って、VSV−TKを特徴付ける本発明者らの観察と同様に、本発明者らはVSVをまた操作して、生物学的に活性である、高レベルのサイトカインIL−4を発現し得ることを実証する。
【0116】
(実施例3)
(TKまたはIL−4を発現するrVSVは、腫瘍崩壊活性を保持する)
IL−4またはTKを発現する組換えウイルスが悪性細胞において優先的に複製し、最終的に細胞死を誘発する能力を保持するかどうかを評価するため、多くの形質転換細胞を感染アッセイにおいて試験した。重要な目的はまた、正常細胞に対するVSVおよび組換えVSVの影響を比較することであった。このことを評定することを開始するために、本発明者らはヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)を選択した。なぜなら、これらの細胞は、腫瘍治療において皮下(s.c.)投与または静脈内(i.v.)投与の後にVSV感染に曝される可能性が最も高いからである。従って、HMVEC(106)を、野生型VSVまたはVSV−IL−4、VSV−TKもしくはVSV−GFPを用いて、0.1m.o.i.で18時間感染させた。細胞の生存率をトリパンブルー排除分析を使用して測定し、そして約20〜30%のHMVEC細胞が細胞死(インターフェロン(IFN−α)を用いた前処理後に本質的に除外され得る影響)を受けることを示した[図3aおよび図3d]。対照的に、同様に感染したマウス乳腺腫瘍細胞株(Sotomayorら、1991、J.Immunol.147:2816−23)(DA−3、D1 DMBA−3腫瘍由来)ならびに黒色腫細胞株B16(F10)(Fidlerら、1975、Cancer Res.35、218−24)は、野生型ウイルス、VSV−TK、VSV−IL−4またはVSV−GFPのいずれかでの感染後に、劇的な細胞溶解を受けた(80〜90%)。VSV−TKは、GCVの非存在下であっても細胞の強力な細胞溶解を誘発した。IFN(1000u/mlを24時間)を用いたB16(F10)の予備処理は、使用されるウイルスに関係なく、感染後に観察されるウイルス媒介性細胞死の量を低減した。抗ウイルス保護を誘導するためのIFNシグナル伝達が部分的にインタクトであるようである事実を考慮して、IFN産生のメカニズムがB16(F10)細胞において優性に欠損し得ることは、依然としてもっともなままである。しかし、IFNで予備処理したB16(F10)細胞におけるウイルス産生の引き続いての分析は、比較的高いウイルス複製を示し(105/ml)、このことは、不完全な保護および抗ウイルス活性を示唆する(表1)。対照的に、トリパンブルー排除分析は、IFNが乳腺腫瘍由来のDA−3細胞を有意な保護を全く提供しないことを示した。このことは、IFN機能がこれらの細胞において複数のレベルで欠損し得ることを示唆する(図3cおよび図3f)。これらのデータを、IFN処理したDA−3細胞におけるウイルス複製が、コントロールHMVECと比較して非常に高く(107/ml)、ここではウイルス産生がほぼ完全に取り除かれることを決定することによって確認した(表1)。ウイルス媒介性細胞溶解のメカニズムを評価するために、感染したB16(F10)細胞およびDA−3細胞を、感染の18時間後にアポトーシス活性について評価した。組換えVSV−IL−4ウイルス、または組換えVSV−TKウイルス、および野生型ウイルスによって引き起こされる細胞溶解のメカニズムは、アポトーシスの誘発に関係した。何故なら、活性なカスパーゼ−8およびカスパーゼ−9のレベルが未処理細胞よりも3倍高かったからである。従って、IL−4またはTKを発現する組換えVSVは、野生型VSVと比較して、感染した細胞においてプログラム細胞死を誘発する点で、それらの有効性を損なわないようである。
【0117】
(実施例4)
(TKまたはIL−4を発現するrVSVはインビボで腫瘍を殺傷する)
組換えウイルスの腫瘍崩壊活性を評価するために、免疫適格性マウスに、1×106細胞の同質遺伝子的なB16黒色腫(C57B1/6)、または低免疫原性の乳腺腫瘍由来のD1 DMBA(Balb/c)(両方とも活動的な腫瘍である)を用いて、皮下(s.c.)移植した。触知可能な腫瘍の形成後、2×107の野生型VSVまたはVSV−IL−4もしくはVSV−TKを腫瘍内(i.t.)に導入した。コントロールとして、等量の熱不活性化(HI)VSVを使用した。VSV−TKを投与した動物において毎日、ガンシクロビル(体重1kg当たり100mg)を腹腔内に(i.p.)投与した。ウイルス治療をもう1回、最初の注射の3日後に繰り返し、そして週に3度、腫瘍増殖をモニターした。得られたデータは、野生型VSVが、コントロールHIウイルスを用いて処理した腫瘍と比較して、黒色腫瘍および乳腺腫瘍の両方の増殖を阻害することを実証した(図4aおよび図4b)。しかし、独立した組の実験において、腫瘍増殖(B16およびD−1 DMBAの両方)のさらに強力な阻害が、VSV−IL−4またはVSV−TKのいずれかで処理した動物において観察された(図4aおよび図4b)。いくつかの例において、腫瘍の完全な退行が、VSV−TKでの処置の後、B16(F10)(3/5のマウス)またはD1 DMBA(2/5のマウス)のいずれかを移植した動物において観察された。対照的に、いずれかの腫瘍を移植した多くのマウスおよびHI−VSVに感染した多くのマウスを、過剰な腫瘍サイズに起因して処理の4日後に屠殺しなければならなかった。コントロール群(HI−VSV)と、VSV−TKまたはVSV−IL−4のいずれかで処理した動物との間の腫瘍容積の差異が、B16(F10)またはD1 DMBAを移植した動物について、それぞれ(p<0.01)および(P<0.001)で、統計学上有意であることが観察された。これらのデータは、IL−4またはTKのいずれかを発現するVSVが、VSV単独の活性より勝る、強力な腫瘍崩壊活性を提示することを示した。
【0118】
ウイルス治療の効果を試験するために、インビボで、種々のウイルスを播種した腫瘍を摘出し、そして切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の後、組織学的に試験した。予想される通り、コントロールHI−VSVに感染した腫瘍は、ウイルス誘導性の腫瘍崩壊活性と関係し得る極僅かな形態学的な異常を示した(30%未満の壊死[図5a])。しかし、細胞死のより大部分が、核濃縮の核によって示されるように、野生型VSV(約50%)、またはVSV−IL−4(75%)もしくはVSV−TK(約95%)で処置したB16(F10)腫瘍において観察された。このことは、腫瘍崩壊活性の増加を示す(図5b〜d)。有意な炎症性浸潤がまた、組換えウイルスで処置した腫瘍において、特にVSV−IL−4で処置した腫瘍において、明らかであった。このことは、多形核細胞の主要な浸潤が好中球および好酸球を含むことを示した(図5のeとgとの比較)。B16(F10)細胞またはD1 DMBA細胞を移植したマウス、および野生型ウイルスまたは組換えウイルスで処置したマウス(各ウイルス処置群から2匹を分析した)から取出した、脳、肝臓および腫瘍におけるウイルス複製の分析は、最後のウイルス処置の7日後(最初の播種の1週間後)に感染性ウイルスの証拠を示さなかった。従って、i.t.播種後、全てのVSV型は動物から速やかに除かれるようである。
【0119】
CD8+ Tリンパ球はIL−4の抗腫瘍活性に重要であることが報告されているが、細胞性免疫応答はまた、TK/GCVの局所的抗腫瘍活性および全身性抗腫瘍活性において役割を果たすことが報告されている(Yamamotoら、1997、Cancer Gene Ther 4:91−6)。IL−4およびTK/GCVで処置した腫瘍は、明白な宿主細胞の浸潤を示したので、本発明者らは、動物によって作製されたリンパ球が、移植された同質遺伝子的な形質転換細胞において、腫瘍関連抗原に対する特異的な細胞傷害活性を提示するかどうかを試験した。従って、B16(F10)由来の腫瘍を保持する動物に、野生型VSV、HI VSV、VSV−IL−4またはVSV−TKを用いて腫瘍内に2回播種した。播種の7日後、脾臓を取出し、単核細胞を単離し、そしてクロム放出アッセイをB16(F10)標的細胞を使用して実行した。これらの結果は、動物が、VSV−IL−4でも野生型ウイルスでもコントロールでもなく、VSV−TKウイルスを受けた腫瘍に対してのみ頑強なCTL応答を生じることを示した。これらのデータは、腫瘍細胞のTK/GCV媒介性崩壊が、プロフェッショナル抗原提示細胞による抗原取り込みを促進し得るという以前の知見と一致する。可能性として、細胞溶解のプロセスは、p53の蓄積およびFas(CD−95)のアップレギュレート(次いでこれは、凝集を介してFasリガンド非依存的な様式でFADD依存性細胞死を刺激する)を介したアポトーシスと関係する(Beltingerら、1999、P.N.A.S.USA 96:8699−704)。従って、TKを発現するVSVが、TK/GCV媒介性アポトーシス、および増強した脇道(bystander)効果、ならびに特異的な抗腫瘍CTL応答の発生を介した、より大きな腫瘍崩壊性効果を表すことは、もっともらしい。IL−4はTh細胞の発達に影響し得るが、この腫瘍モデルにおけるIL−4は、CTLアッセイによって判定されるように、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞の発達には強くは影響しなかった。それにもかかわらず、IL−4発現VSVは、野生型VSVと比較して統計上有意である、より大きな腫瘍崩壊性効果を表した。
【0120】
IL−4は、遺伝子治療、抗癌ストラテジー、または候補のウイルス−ワクチンに対する免疫応答を増加することのいずれかのために、多くの生存ウイルスベクター中に組み込まれているが、サイトカインの寄与の最終的なポジティブな効果は、変動する(Bebedettiら、2000、Nat.Med.6:447−50)。本明細書中に示されるデータは、IL−4発現VSVで処置した腫瘍が、おそらく浸潤性の好酸球および好中球(これらは直接的な抗腫瘍活性を有すると報告されている)の存在の増加(Tepperら、1992、Science 257:548−51)に起因して、VSV単独よりも強力な腫瘍崩壊性活性を表し得る。しかし、IL−4媒介性抗腫瘍活性の完全なメカニズムは、疑いようも無く、依然として明かにされるべきである。
【0121】
最近の報告は、エクトロメリアウイルスによるIL−4の発現が、抗ウイルス性細胞媒介性免疫応答を抑制し、そして通常野生型ウイルスに耐性のマウスにおける高い死亡率と関係することを示した(Jacksonら、2001、J.Virol.75:1205)。これらのデータは、免疫調節遺伝子を含有する新規のウイルスを開発することについての関心を生じたが、これらのデータは、IL−4を発現するレトロウイルスまたはアデノウイルスが、インビボで悪影響を全く生じない研究と一致する(Steeleら、2000、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.223:118−27)。安全性試験において、本発明者らは、野生型VSVと比較して、VSV−IL−4が種々の経路によって播種された動物における毒性の増加を全く見出さなかった。VSV処置を受けたマウスからの器官または腫瘍において感染性VSVを検出し得ないこととは別に、最後の腫瘍の播種の7日後、2×107(i.p.)または2×106(i.v.)でVSV−IL−4またはVSV−TKを受けた動物は、現在のところ、感染の8週後、健常なままである。
【0122】
(実施例5)
(材料および方法)
(細胞)
BHK−21細胞、C57BL/6マウス由来の初代マウス胚線維芽細胞および形質転換したマウス胚線維芽細胞を、10%胎仔ウシ血清(HyClone Laboratories Inc.,Logan,UT)、100単位/mlのペニシリンG、100単位/mlのストレプトマイシンおよび0.25μgのアンフォテリシンBを補充したダルベッコ改変必須培地(DMEM)中で維持した。B16(F10)黒色腫細胞およびD1−DMBA3乳腺腫瘍由来のDA−3細胞を、それぞれ1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムおよびOPI培地補充物(Sigma,St.Louis,MO)を含むことを除いて、同じ培地中で維持した。TS/A乳腺癌細胞を、10%胎仔ウシ血清を補充したRPMI1640培地中で維持した。
【0123】
(組換えウイルスの構築)
マウスIFN−β cDNAを、プラスミドpMK−Mβ(Dr.Yoichiro Iwakura,Institute of Medical Science,University of Tokyoからの贈与)から、以下のオリゴヌクレオチド:
【0124】
【化4】
を使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。次いで、増幅したフラグメントを、pVSV−XN2(Fernandezら、2002、J.Virol.;76(2):895−904)のXhoI−NheI部位に挿入した。組換えVSVを回収するための手順は、以前に記載された手順(Lawsonら、1995、P.N.A.S.USA、92:4477−81;Whelanら、1995、P.N.A.S.USA、92:8388−92)と同様であった。種ウイルスをBHK−21細胞中で増殖させ、そして使用まで−80℃で保存した。VSV−GFPおよびrVSVを、以前に記載されたように調製した(Fernandezら、2002)。
【0125】
(インビトロでのウイルスの増殖)
BHK−21細胞中での組換えウイルスの増殖を、以前に記載されたように試験した(Fernandezら、2002)。細胞を6ウェル培養プレート中に1×106細胞/ウェルで播種し、そして1細胞当たり10PFUの感染多重度(m.o.i.)で各々のウイルスに感染させた。培養物上清を示される時間で収集し、そしてBHK−21細胞に対する標準的なプラークアッセイによる力価決定に供した。
【0126】
インビトロ細胞殺傷アッセイのために、マウス胚線維芽細胞、B16(F10)細胞、DA−3細胞およびTS/A細胞を、12ウェル培養プレートまたは24ウェル培養プレート中に、1ウェル当たり約2×105細胞で播種し、そして示されるm.o.i.で24時間ウイルスに感染させ、次いでトリプシン処理し、そしてトリパンブルー排除分析によって計数した。
【0127】
(IFN−β産生についてのELISA)
VSV−IFNβ感染細胞上のIFN−β発現レベルを、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって試験した。BHK−21細胞を、直径35mmの培養ディッシュ中に1×106細胞で播種し、そして1細胞当たり10p.f.u.のm.o.i.で24時間感染させた。次いで、その上清をELISAに供した。ELISAを、以前に刊行された手順のように実施した(Coliganら、1991)。簡潔に述べると、96ウェルマイクロプレート(microcroplate)(Nalge Nunc International,Rochester,NY)を、マウスIFN−βに対する5μg/mlのラットモノクローナル抗体(Seikagaku America,Falmouth,MA)でコーティングし、そして4℃で一晩インキュベートした。次いで、上清の連続希釈物を添加し、そして4℃で一晩インキュベートした。1:2000に希釈した、マウスIFN−α/βに対するヒツジポリクローナル抗体(United States Biological,Swampscott,MA)を、2次抗体として使用し、そして結合した抗体を、1:2500に希釈した、ヒツジIgG(H+L)に対する、ペルオキシダーゼ標識化ウサギポリクローナル抗体(KPL,Gaithersburs,MD)を用いて検出した。ペルオキシダーゼを、基質2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホネート)と共に30分間インキュベートすることによって明かにし、そして分光光度的読み取りを414nmで得た。
【0128】
(IFN−βについての生物学的活性のアッセイ)
BHK−21細胞を直径35mmの培養ディッシュ中に1×106細胞で播種し、そして1細胞当たり10p.f.u.のm.o.i.で24時間感染させた。その上清を収集し、そして56℃で30分間処理してウイルス感染性を不活性化した。B16(F10)細胞を、24ウェル培養プレート中に1ウェル当たり2×106細胞で播種し、そして1:50に希釈した上清、または500単位/mlのマウスIFN−α/β(Sigma)と共に24時間インキュベートした。次いで、細胞を24時間0.1m.o.i.でVSVに感染させ、そしてCPEを顕微鏡下で評価した。
【0129】
(動物研究)
6〜8週齢の雌BALB/cマウスを、Jackson Laboratoriesから獲得し、特定の病原体が存在しない条件下で維持した。マウスに、5×104のTS/A細胞を静脈内(i.v.)注射し、次いで、2日後に5×107p.f.u.の組換えVSVに感染させた。マウスの生存を、ウイルス感染後毎日モニタリングした。VSV−IFNβに感染したTS/A細胞のワクチン播種について、細胞を、1細胞当たり10のm.o.i.にて、2時間ウイルスに感染させた。マウスに1×106の感染したTS/A細胞を皮下(s.c.)注射し、そして10日後に、1×105のTS/A細胞で皮下チャレンジした。腫瘍サイズを、2日間隔で測定し、そしてその体積を、式:0.5×長さ×(幅2)に従って計算した。
【0130】
グループ内の差異の統計学的有意さを、マンホイットニー検定を使用して評価した。組織病理学的分析のために、マウスを示された時点で屠殺し、そして腫瘍を摘出し、10%の中和した緩衝化ホルマリンで固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【0131】
(細胞傷害性アッセイ)
Tリンパ球の細胞傷害性を、以前に記載された(Fernandezら、2002)ように実施した。簡潔には、VSV感染腫瘍保有マウスから調製した脾臓細胞を、標的細胞に対するエフェクター細胞の示された比率にて、51Cr標識したST/A細胞と共にインキュベートし、そして51Crの放出を、γ線計数器によって定量化した。溶解の割合を、以下の式に従って計算した:[(実験的放出cpm−自然放出cpm)/(最大放出−自然放出)]×100。
【0132】
表4は、初代C57BL/6マウス繊維芽細胞および形質転換C57BL/6マウス繊維芽細胞におけるウイルス力価を示す。表5は、TS/A細胞におけるウイルス力価を示す。
【0133】
(表4 初代C57BL/6マウス繊維芽細胞および形質転換C57BL/6マウス繊維芽細胞におけるウイルス力価)
【0134】
【表4】
a)MOI 0.01
b)データは、2回の独立した実験の平均を示す。
【0135】
(表5 TS/A細胞におけるウイルス力価)
【0136】
【表5】
a)データは、2回の独立した実験の平均を示す。
【0137】
このデータは、VSV−IFN−βまたはVSV−IFN−γが、腫瘍細胞を殺傷する能力を保持することを示す。VSVベクター構築物中にIFN−βまたはIFN−γを含めることは、VSVの腫瘍崩壊活性または複製能力を妨害しない。
【0138】
(実施例6)
(VSVは、p53欠損、Myc形質転換またはRas形質転換の増殖をインビボで阻害する。)
抗腫瘍治療におけるVSVの使用の評価を開始するために、無胸腺ヌードマウスに、2×106のC6神経膠腫細胞、またはMycもしくは活性化K−Ras遺伝子で形質転換されたBalb−3T3細胞を皮下移植した。触知可能な腫瘍が形成されると(腫瘍がほぼ0.25cm2のサイズに達した時点で、約7〜14日)、マウスを、VSV(2.5×107pfu/ml)に腫瘍内感染させ、そして毎日モニタリングした。等量のウイルスを用いる注射を、4日後に繰り返した。VSVを受けた全てのマウスが、腫瘍の遺伝的背景にかかわらず顕著に阻害された、腫瘍増殖またはその形質転換に寄与する腫瘍形成事象を示した。実際、VSVの投与は、17日(コントロール動物において、腫瘍が受容可能な腫瘍負荷を超えた時点)以内に試験した全てのマウスにおいて腫瘍増殖の顕著な抑制を生じた。これらのデータは、インビトロおよびインビボの両方の腫瘍に対するVSVの強力な効果を強調する。
【0139】
VSVが、移植されたウイルス播種腫瘍を越えて広がるか否かを試験するために、VSV処置された動物由来の種々の組織ならびに腫瘍自体を、残留の複製しているVSVの存在について分析した。感染後21日でのVSVの存在についてのVSV感染したマウスの試験により、C6腫瘍細胞由来の腫瘍組織において、残留ウイルス(2×104〜3.5×105pfu/g)の存在が明らかとなった。しかし、この期間の後にVSV治療を受けたマウスの肺、脳、腎臓、脾臓または肝臓においては、ウイルスは検出不能であった。これらのデータは、VSV複製が、腫瘍系統に限定されることを示す。
【0140】
(実施例7)
(VSVは、静脈内および遠位腫瘍に対して抗腫瘍活性を発揮する。)
VSVが、腫瘍とは別個の部位での播種後に、その抗腫瘍効果を発揮し得るか否かを試験するために、VSVを静脈内(i.v.;各々1×107pfu/マウスの、2日毎の3回の注射)に導入し、そして8日目まで毎日、移植されたC6神経膠芽腫の増殖をモニタリングした。
【0141】
ヌードマウスに1×106個のC6腫瘍細胞を、マウスの両方の後脇腹に両側で移植し、そして右側の腫瘍に、1×107pfuのVSVまたは熱不活化コントロールウイルスを播種した。単一のC6腫瘍を有するヌードマウスに、1日目、3日目、5日目、7日目、9日目、11日目および13日目に、1×108pfuのVSVを静脈内注射した。静脈内播種したVSVは、インビボでC6腫瘍の退行を生じ得た。
【0142】
次に、VSVの腫瘍内播種が、そのマウスの他の部位での遠位腫瘍の退行を生じ得るか否かを決定するために、実験を設計した。これらの実験について、ヌードマウスに、C6神経膠芽腫細胞を、マウスの左脇腹および右脇腹の両方に両側で移植し、そして両方の腫瘍が約0.25cm2のサイズに達した後、移植した腫瘍の一方のみをVSVで播種した。VSVは、一方の腫瘍へと導入される場合、遠位腫瘍の部分的退行を生じ得るが、熱不活化コントロールウイルスは生じ得なかった。これらの研究は、播種部位から遠位の部位にて、VSVが腫瘍および転移を根絶する可能性を実証する。
【0143】
(実施例8)
(cDNA由来のVSV)
VSVの全11,161ヌクレオチドを示すcDNAクローンを作製し、そして独自のXho I/Nhe I部位を付加して、異種遺伝子(本発明の場合、HSV−TK)の進入を容易にした。cDNAの転写は、T7 RNAポリメラーゼに依存する。ワクシニアvTF7−3を、新生仔ハムスター腎臓細胞(BHK−21)を感染するために使用して、ポリメラーゼの供給源を提供する。引き続いて、VSV cDNAを、VSV Nタンパク質、VSV Pタンパク質およびVSV Lタンパク質を発現する3つの他のプラスミドと共に同じ細胞にトランスフェクトする。これらの後者の3種のタンパク質は、新生VSV抗ゲノムRNAの、ヌクレオキャプシドへのアセンブリを容易にし、そしてVSV感染サイクルを開始する。24時間後、宿主細胞を溶解し、清浄化し、そして残留ワクシニアを、0.2umのフィルターを介する濾過によって除去し、新たなBHK細胞へと置いた。野生型VSVは生成され得なかったので、この方法により、組換えVSVのみが生成される。
【0144】
(実施例9)
(組換えVSV(rVSV)の特徴付け)
rVSVまたは野生型VSVに感染した細胞を、[35S]メチオニンで代謝的に標識する。細胞を溶解し、そしてアリコートをSDS−PAGEによって分析する。VSVは、宿主のタンパク質合成を阻害するので、そのゲノムに挿入された異種遺伝子を含むウイルスタンパク質のみが作製される。rVSVに感染した細胞は、VSV単独に感染したコントロール細胞と比較して、余分なタンパク質(すなわち、HSV−TK、約26kDa)が合成される。VSV mRNAを、放射性標識したdUTPを使用して類似の様式によって検出する。多くの場合、異種タンパク質に対する抗体が存在する。従って、ELISAを使用して、異種タンパク質(例えば、IL−4、IL−12およびIFN)の発現を検出する。高レベルの異種タンパク質発現が、試験した全ての組換え系において得られている。
【0145】
(実施例10)
(VSVの増殖)
大量のVSV(Indiana株)および組換えVSVを、ショ糖勾配によって精製する。基本的に、BHK細胞を、0.01m.o.i.で感染させ、そして24時間後(ここで、80%より多い細胞が通常CPE/アポトーシスを示す)、上清を収集し、そして遠心分離によって清浄化する。清浄化した上清を、10%ショ糖での遠心分離によって精製し、そしてウイルスペレットを再懸濁し、そして35〜55%の連続ショ糖勾配上に層状化する。この勾配を、4℃にて110,000gで18時間遠心分離し、そしてウイルスを回収し、そして4℃にて15,000rpmで1時間さらに遠心分離することによってペレット化する。ウイルスをPBS中に再懸濁し、標準的なプラークアッセイによって濃度を決定し、そしてアリコートで−80℃にて保存する(30)。
【0146】
(実施例11)
(複製欠損型組換えVSVの生成)
Gタンパク質機能を欠き、かつIL−12またはIFN−βおよびIFN−γを発現するVSVを、構築する。このようなウイルスを、VSV Gタンパク質を誘導性に発現するように構築されたヘルパー細胞(CHO)において生成する。標的細胞の感染後、得られたウイルスは、細胞に感染する。なぜなら、これらのウイルスは、ヘルパー細胞由来のVSV Gタンパク質を含むからである。しかし、感染および複製の後、子孫ウイルスは、レセプターGを欠き、そして周りの組織に感染して広がることができない。これは、おそらく、これらのウイルスが腫瘍細胞に感染し得、そして優先的に複製して、免疫調節タンパク質または自殺タンパク質を発現するからである。選択された異種遺伝子を発現する複製欠損型VSVウイルスを生成し、そしてインビトロおよびインビボでの抗腫瘍効果について、wt VSV対応物と比較する。Mタンパク質機能およびNタンパク質機能を欠くrVSVを生成する。さらに、Gタンパク質を他のレセプター(例えば、腫瘍特異的レセプター)で置換したVSVを生成し、そしてrVSV中の腫瘍特異的レセプターの存在が、腫瘍細胞により特異的であるか否かを決定するために分析する。
【0147】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって、その範囲が限定されない。本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の記載および添付の図面から、当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0148】
【図1A】図1Aは、TK、IL−4、IFNまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する組換えVSVの生成を示す。T7RNAポリメラーゼリーダーおよびT7ターミネーターならびにδ型肝炎ウイルスリボソーム(RBZ)が隣接するVSVゲノム(pVSV−XN2)を示すcDNAを使用して、組換えウイルスを作製した。IL−4、TKまたはGFPを、VSVのG遺伝子とL遺伝子との間に挿入した。
【図1B】図1Bは、TK、IL−4、IFNまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する組換えVSVの生成を示す。組換えウイルスの増殖曲線を示す。BHK細胞を、野生型(WT)VSV、VSV−IL−4およびVSV−TKでm.o.i 10にて感染させた。感染細胞からの上清を、感染後の示した時点で回収し、そしてプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。
【図2】図2A〜図2Dは、rVSV由来のIL−4またはTKの発現を示す。図2Aは、GCVが、VSV−TKで感染させた細胞においてリン酸化されることを示す。BHK細胞を、モック感染したか、またはVSV−TKもしくはWT VSV(m.o.i.=1)で8時間感染させ、細胞溶解物を、インビトロでのGCVリン酸化についてアッセイした。CMVプロモーター駆動性HSV−TK[BHK(+)]または空ベクター(BHK)で一過性にトランスフェクトしたBHK細胞を、コントロールとして使用した。図2Bは、VSV−TK感染細胞におけるHSV−TKの発現を示す。BHK細胞を、モック感染(レーン1)したか、またはm.o.i 1にてWT VSV(レーン2)もしくはVSV−TK(レーン3)で24時間感染させ、そして細胞抽出物を、抗TKモノクローナル抗体を使用してTK発現について分析した。空ベクター(レーン4)またはCMVプロモーター駆動性HSV−TK(レーン5)で一過性にトランスフェクトした293T細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。図2Cは、VSV−IL−4で感染させた細胞におけるIL−4の高レベルの発現を示す。WT VSVまたはVSV−IL−4で感染させたBHK細胞からの培養培地を、捕捉ELISAを使用して機能的IL−4について測定した。さらなるコントロールとして、IL−4を、空ベクターまたはCMVプロモーター駆動性IL−4 cDNAで一過性にトランスフェクトしたBHK細胞からの培養培地中で測定した。図2Dは、VSV−IL−4感染細胞の上清からのIL−4の免疫沈降を示す。[35S]メチオニン標識した、モック感染した細胞(レーン1)またはVSV−IL−4(レーン2)もしくはWT VSV(レーン3)で感染させた細胞を、IL−4抗体で免疫沈降させた。
【図3−1】図3ABCは、初代細胞または形質転換細胞に対する野生型VSVおよび組換えVSVのインビトロ効果を示す。図3ABCは、形質転換細胞におけるVSV−GFPの効率的な複製を示す。HMVEC細胞、B16(F10)細胞、またはDA−3細胞を、IFNα(500u/ml)の前処理ありまたはなしにおいて、VSV−GFPで感染させた。上パネルは明視野顕微鏡下(倍率、20×)での細胞を示し、そして下パネルは免疫蛍光による同一視野を示す。
【図3−2】図3Dは、初代細胞または形質転換細胞に対する野生型VSVおよび組換えVSVのインビトロ効果を示す。HMVEC細胞を、IFNαの前処理あり(黒カラム)またはなし(白カラム)において、WT VSV、VSV−TKまたはVSV−IL−4で感染させた。細胞生存度を、感染18時間後のトリパンブルー排除によって評価した。
【図3−3】図3Eは、初代細胞または形質転換細胞に対する野生型VSVおよび組換えVSVのインビトロ効果を示す。B16(F10)細胞を、IFNα(500u/ml)の前処理あり(黒カラム)またはなし(白カラム)において、WT VSV、VSV−TKまたはVSV−IL−4で感染させた。細胞生存度を、感染18時間後のトリパンブルー排除によって評価した。
【図3−4】図3Fは、初代細胞または形質転換細胞に対する野生型VSVおよび組換えVSVのインビトロ効果を示す。DA−3細胞を、IFNα(500u/ml)の前処理あり(黒カラム)またはなし(白カラム)において、WT VSV、VSV−TKまたはVSV−IL−4で感染させた。細胞生存度を、感染18時間後のトリパンブルー排除によって評価した。
【図4A】図4Aは、TKおよびIL−4を発現するrVSVが免疫適合性マウスにおいて先天性の胸部腫瘍および黒色腫の増殖を阻害することを示す。図4Aにおいて、C57B1/6マウスに、5×105個のB16(F10)黒色腫細胞を皮下移植した。触診可能な腫瘍が形成した後、動物を、2×107p.f.u.のWT VSV、VSV−IL−4またはVSV−TKで腫瘍内処置した。ウイルスの注射を3日後に繰り返した。腫瘍容積を算出し、平均±S.E.M.(n=5)として示す。腫瘍サイズが大きいので、熱非働化ウイルスを受けた2匹のマウスを、4日目で屠殺した。
【図4B】図4Bは、rVSV発現TKおよびrVSV発現IL−4が免疫適合性マウスにおいて先天性の胸部腫瘍および黒色腫の増殖を阻害することを示す。図4Bにおいて、BALB/cマウスに、1.5×106個のD1 DMBA3腫瘍細胞を皮下移植した。触診可能な腫瘍が形成した後、動物を、2×107p.f.u.の熱非働化ウイルス、WT VSV、VSV−IL−4またはVSV−TKで腫瘍内注射した。ウイルス処理を3日後に繰り返した。移植21日後(最後のウイルス処置の7日後)の腫瘍容量を示す。結果を、平均±S.E.M.(n=5)として示す。比較可能な結果を、3つの独立したセットの実験において得た。
【図4C】図4Cは、rVSV発現TKおよびrVSV発現IL−4が免疫適合性マウスにおいて先天性の胸部腫瘍および黒色腫の増殖を阻害することを示す。図4Cは、VSV−TK/GCV処置を受けた動物におけるB16(F10)腫瘍に対するCTL応答の誘導を示す。C57B1/6腫瘍を保有するマウスに、野生型VSVまたは組換えVSVを腫瘍内注射した。第2の注射を、3日後に投与した。第1のウイルス注射の10日後、脾細胞を単離し、B16(F10)細胞とともに同時培養した。脾細胞を、示したエフェクター対標的の比で、51Cr標識B16(F10)標的細胞とともにインキュベートした。CTL活性を、51Cr放出によって決定した。
【図5】図5A〜図5Dは、腫瘍の組織病理学的分析を示す。熱非働化(HI)−VSV(図5A)、WT VSV(図5B)、VSV−IL−4(図5C)またはVSV−TK(図5D)のいずれかの腫瘍内注射を受けた7日後に、C57B1/6マウスおよびBalb/cマウスからの腫瘍を回収した。左パネルは、WT VSV処置腫瘍からのB16(F10)腫瘍における細胞死の大きな領域を示し、これは、VSV−TKおよびVSV−IL−4で処理した腫瘍においてより著しい。右パネルは、VSV−IL−4を注射したD1 DMBA3腫瘍における好酸球の浸潤増加を強調する。
【図6】図6は、VSVゲノムのゲノム構成を示す。
【図7】図7A〜図7Bは、いくつかのヒト癌細胞株がVSV複製および溶解に許容性であることを示す。図7Aは、MCF−7細胞、BC−1細胞、Jurkat細胞、HL60細胞、K562細胞、PC−3細胞およびHeLa細胞を、1000U/ml hIFN−βで18時間処置したかまたは処置せず、続いて、VSVで感染させた。感染48時間後、生存度を、トリパンブルー排除分析によって評価した。図7Bは、図7Aのように処置した細胞からの上清を、標準的なプラークアッセイによるウイルス収率について分析した。
【図8】図8は、BHK−21細胞においてインターフェロンを発現する組換えウイルスの増殖曲線を示す。
【図9】図9は、感染24時間後のVSV−INFのDA−3細胞に対するインビトロ効果を示す。
【図10】図10は、組換えウイルス感染BHK−21細胞におけるINF−βの産生を示す。
【図11】図11A〜図11Bは、ウイルス播種の、重量および生存に対する効果を示す。図11Aは、ウイルス播種後のマウスの平均重量を示す。BALB/cマウス(1群当たりn=5)に、マウス1匹当たり5×106p.f.u.または2×107p.f.u.にて、VSV−IFNβ、VSV−GFP、またはrVSVを腫瘍内播種し、そしてマウスの重量を、毎週測定した。エラーバーは、0.5×標準偏差を示す。図11Bは、ウイルス播種後のマウスの生存率を示す。BALB/cマウス(1群当たりn=5)に、1×108p.f.u.のVSV−IFNβ、VSV−GFP、または野生型VSVを腫瘍内播種し、そしてマウスの運動性を毎日モニタリングした。
【図12】図12は、VSV−IL−12で感染させたBHK細胞によるIL−12発現を示す。
【図13】図13は、感染させていないかまたはVSV−gp96もしくはVSV GFP(m.o.i.10)で感染させたBHK細胞におけるgp96の発現を示す。
【図14】図14は、m.o.i.10にてVSV−エンドスタチン:アンギオスタチンまたはVSV−GFPで感染させたBHK細胞の細胞溶解物および上清におけるエンドスタチンの発現を示す。ポジティブコントロールとして、細胞を、エンドスタチン:アンギオスタチンを発現するプラスミド(pBlast:mEndo:Angio)でトランスフェクトした。
Claims (63)
- 組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)ベクターであって、該ベクターは、サイトカインをコードする核酸を含み、該組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触した場合に、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、組換えVSVベクター。
- 前記サイトカインが、インターフェロンである、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 前記インターフェロンが、インターフェロン−βである、請求項2に記載の組換えVSVベクター。
- 前記インターフェロンが、インターフェロン−γである、請求項2に記載の組換えVSVベクター。
- 前記サイトカインが、IL−4である、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 前記サイトカインが、IL−12である、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 前記VSVベクターが、複製欠損型である、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 前記VSVベクターが、Gタンパク質機能を欠く、請求項7に記載の組換えVSVベクター。
- 前記腫瘍細胞が、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞を含む、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 哺乳動物が前記腫瘍細胞を含む、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 第二のサイトカインをコードする核酸をさらに含む、請求項1に記載の組換えVSVベクター。
- 複製欠損型VSVベクターであって、該ベクターは、インターフェロンをコードする核酸を含み、該組換えVSVベクターは、腫瘍細胞と接触した場合に、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、複製欠損型VSVベクター。
- 前記インターフェロンが、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γである、請求項12に記載の複製欠損型VSVベクター。
- 前記VSVが、Gタンパク質を欠く、請求項12に記載の複製欠損型VSVベクター。
- 前記腫瘍細胞が、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞を含む、請求項12に記載の複製欠損型VSVベクター。
- 哺乳動物が前記腫瘍細胞を含む、請求項12に記載の組換えVSVベクター。
- インターロイキンをコードする核酸をさらに含む、請求項13に記載の組換えVSVベクター。
- 請求項1に記載の組換えVSVベクターをコードする、単離された核酸。
- 請求項12に記載の組換えVSVベクターをコードする、単離された核酸。
- 請求項1に記載のVSVベクターを含む細胞およびその子孫。
- 請求項12に記載のVSVベクターを含む細胞およびその子孫。
- サイトカインをコードする核酸を含むVSVを生成する方法であって、該方法は、請求項20に記載の細胞を、VSVが生成される条件下で増殖させる工程;および該VSVを必要に応じて単離する工程、を包含する、方法。
- インターフェロンをコードする核酸を含むVSVを生成する方法であって、該方法は、請求項21に記載の細胞を、VSVが生成される条件下で増殖させる工程;および該VSVを必要に応じて単離する工程、を包含する、方法。
- 前記VSVがGタンパク質機能を欠き、そして前記細胞がVSV Gタンパク質機能を発現する、請求項23に記載の方法。
- 請求項1に記載のVSVベクターを含む、組換え水疱性口内炎ウイルス粒子。
- 請求項12に記載のVSVベクターを含む、組換え水疱性口内炎ウイルス粒子。
- 請求項1に記載のVSVベクターを含む、組成物。
- 前記VSVベクターが、前記組成物を前記腫瘍細胞と接触させた場合に、該腫瘍細胞の腫瘍崩壊活性を生じるに有効な量で該組成物中に存在する、請求項27に記載の組成物。
- 前記サイトカインがインターフェロンである、請求項27に記載の組成物。
- 前記サイトカインがインターロイキンである、請求項27に記載の組成物。
- 前記VSVベクターが、複製欠損型である、請求項27に記載の組成物。
- 前記VSVベクターが、Gタンパク質機能を欠く、請求項31に記載の組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項27に記載の組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤を含む、請求項28に記載の組成物。
- 腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための方法であって、該方法は、該細胞を、サイトカインをコードする核酸を含む組換えVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、該VSVベクターは、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、方法。
- 前記VSVベクターが、複製欠損型である、請求項35に記載の方法。
- 前記VSVベクターが、Gタンパク質機能を欠く、請求項36に記載の方法。
- 前記サイトカインが、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γである、請求項35に記載の方法。
- 前記サイトカインが、インターロイキンである、請求項35に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記腫瘍細胞を有する個体への静脈内注射による、請求項35に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記腫瘍細胞を有する個体への腫瘍内注射による、請求項35に記載の方法。
- 腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための方法であって、該方法は、該腫瘍細胞を、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、該VSVベクターは、プロドラッグと共に投与された場合に、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、方法。
- 前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ(TK)をコードする、請求項43に記載の方法。
- 前記プロドラッグが、ガンシクロビル(ganclyclovir)である、請求項44に記載の方法。
- 前記プロドラッグが、アシクロビルである、請求項43に記載の方法。
- 前記VSVベクターが、複製欠損型である、請求項43に記載の方法。
- 前記VSVベクターが、Gタンパク質を欠く、請求項47に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が、黒色腫腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、血液学的に関連する腫瘍細胞、または腫瘍抑制経路において欠損を有する細胞を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記腫瘍細胞を有する個体への静脈内注射による、請求項43に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記腫瘍細胞を有する個体への腫瘍内注射による、請求項43に記載の方法。
- 腫瘍増殖を抑制するための方法であって、該方法は、該腫瘍を、サイトカインをコードする核酸を含む組換えVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、該VSVベクターは、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す、方法。
- 腫瘍増殖を抑制するための方法であって、該方法は、該腫瘍を、自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターと接触させる工程を包含し、ここで、該VSVベクターは、プロドラッグと共に投与された場合に、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す、方法。
- 個体において腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、サイトカイン、ケモカインもしくは熱ショックタンパク質をコードする核酸を含むVSVベクターに感染したか、または該VSVベクターによって溶解された腫瘍細胞を含む組成物を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記サイトカインが、インターフェロンまたはインターロイキンである、請求項54に記載の方法。
- 個体において免疫応答を誘導し得る組成物であって、該組成物は、サイトカイン、ケモカインもしくは熱ショックタンパク質をコードする核酸を含むVSVベクターに感染したか、または該VSVベクターによって溶解された腫瘍細胞を含む、組成物。
- 腫瘍に対して個体を保護するための方法であって、該方法は、個体から得られた腫瘍細胞を、該腫瘍細胞を溶解させるために適切な条件下で、サイトカイン、ケモカインもしくは熱ショックタンパク質をコードする核酸を含むVSVベクターと接触させる工程;および該溶解した腫瘍細胞を該個体に戻す工程、を包含する、方法。
- サイトカインをコードする核酸を含むVSVベクター、および該VSVベクターの使用のための指示書を備える、キット。
- チミジンキナーゼをコードする核酸を含むVSVベクター、および該VSVベクターの使用のための指示書を備える、キット。
- 腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための医薬の調製における組成物の使用であって、該医薬は、以下:
サイトカインをコードする核酸を含む組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)ベクターであって、該組換えVSVベクターは、該腫瘍細胞と接触した場合に、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、組換えVSVベクター;および
薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、使用。 - 腫瘍細胞において腫瘍崩壊活性を生じるための医薬の調製における組成物の使用であって、該医薬は、以下:
インターフェロンをコードする核酸を含む複製欠損型VSVベクターであって、該組換えVSVベクターは、該腫瘍細胞と接触した場合に、野生型VSVベクターよりも高い、該腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊活性を示す、複製欠損型VSVベクター;および
薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、使用。 - 腫瘍抑制のための医薬の調製における組成物の使用であって、該医薬は、以下:
サイトカインをコードする核酸を含む組換えVSVベクターであって、該VSVベクターは、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す、組換えVSVベクター;および
薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、使用。 - 腫瘍抑制のための医薬の調製における組成物の使用であって、該医薬は、以下:
自殺遺伝子をコードする核酸を含む組換えVSVベクターであって、該VSVベクターは、プロドラッグと共に投与された場合に、野生型VSVベクターよりも高い腫瘍抑制を示す、組換えVSVベクター;および
薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、使用。
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