JP2018519805A - 組換え腫瘍溶解性ウイルスおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
腫瘍における非常に多くのTILに加えて、腫瘍内のリンパ球の組織化が抗腫瘍免疫応答における重要な役割を果たすと考えられている。二次リンパ器官に似た免疫細胞のインサイチュ凝集物である三次リンパ構造(TLS)は、乳、結腸直腸、および他のヒトがんを含めた多くのがんにおける増加した患者生存と相関していた(6、20で概説されている)。
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、がん細胞において選択的に複製するウイルスである。生きた複製OVがいろいろなヒトがんにおける臨床治験において試験された(17で概説されている)。OVは、抗腫瘍免疫応答、および腫瘍細胞の直接溶解を誘発し得る。一般的なOVは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)およびワクシニアウイルス(VV)の弱毒化株を含む。
一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス(VV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、またはアデノウイルスなどの腫瘍溶解性DNAウイルスであってもよく、異種核酸配列は、CXCL10などのT細胞誘引性ポリペプチドをコードし得る。
一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、VSV−CXCL12、VV−CXCL12、VSV−CXCL13、VV−CXCL13、VSV−CXCL10またはVV−CXCL10であってもよい。
一部の態様では、本発明は、腫瘍を本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることにより免疫細胞を腫瘍に動員する方法を提供する。
この概要は、本発明の必ずしも全ての特色を記載したものではない。
本発明のこれらおよび他の特色は、添付の図面が参照される以下の説明からより明らかになると予想される。
「B細胞誘引性ポリペプチド」は、本明細書では、B細胞を特定の位置に動員する能力があるポリペプチドを表す。一部の実施形態では、位置は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を支持する能力がある位置であってもよい。一部の実施形態では、位置は、固形腫瘍であってもよい。
本明細書で開示されたB細胞誘引性ポリペプチドは、恒常性ケモカインなどのケモカインであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されたB細胞誘引性ポリペプチドは、CXCL12またはCXCL13、またはその生物学的に活性な断片であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されたB細胞誘引性ポリペプチドは、限定することなく、CXCL12またはCXCL13配列と実質的に同一な配列を有するポリペプチドを含み得る。
代替の実施形態では、CXCL12ポリペプチドは、配列番号9、11もしくは12の1つもしくは複数によってコードされるまたはMGI OTTMUST00000054664もしくはNCBI参照番号NM_000609.6もしくはNM_000609.3に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
一部の実施形態では、CXCL13ポリペプチドは、配列番号6もしくは8に記載された、またはMGI OTTMUSP00000072614もしくはNCBI参照番号NP_006410.1に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
代替の実施形態では、CXCL13ポリペプチドは、配列番号5もしくは7に記載された、またはOTTMUST00000138021もしくはNCBI参照番号NM_006419.2に記載された配列の1つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、3’UTRを欠くcDNA断片を有し得る。
代替の実施形態では、CXCL13核酸分子は、配列番号5もしくは7に記載された、またはOTTMUST00000138021もしくはNCBI参照番号NM_006419.2に記載された核酸配列の1つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、3’UTRを欠くcDNA断片を有し得る。
「T細胞誘引性ポリペプチド」は、本明細書では、T細胞を特定の位置に動員する能力があるポリペプチドを表す。一部の実施形態では、位置は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を支持する能力がある位置であってもよい。一部の実施形態では、位置は、固形腫瘍であってもよい。
本明細書で開示されたT細胞誘引性ポリペプチドは、CXCL10ポリペプチドなどのケモカインであってもよい。
一部の実施形態では、CXCL10ポリペプチドは、配列番号2もしくは4に記載された、またはOTTMUSP00000036424もしくはNCBI参照番号NP_001556.2に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
「実質的に同一な」は、アミノ酸もしくは核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列の位置に位置する1つもしくは複数の保存的置換だけ、または1つもしくは複数の非保存的置換、欠失、もしくは挿入のみがCXCL10、CXCL12またはCXCL13配列などの参照配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。かかる配列は、例えば、Align Program(Myers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17)またはFASTAを使用して、比較に使用される配列にアミノ酸またはヌクレオチドレベルで最適に整列した場合、約45%から約99%の間の任意の値で同一あってもよく、またはより一般的に、少なくとも45%、48%、50%、52%、55%、57%もしくは60%同一であってもよく、または少なくとも63%、65%、68%、70%、75%、77%、80%、85%、90%、もしくは95%同一であってもよく、または96%、97%、98%、もしくは99%もの値で同一であってもよい。ポリペプチドに関して、比較配列の長さは、少なくとも10、15、20、25、または30アミノ酸であってもよい。代替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも35、40、もしくは50アミノ酸、または60、80、もしくは100を超えるアミノ酸であってもよい。核酸分子に関して、比較配列の長さは、少なくとも15、20、25、30、40、または50ヌクレオチドであってもよい。代替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも60、70、80、もしくは90ヌクレオチド、または100、200、もしくは500を超えるヌクレオチドであってもよい。配列同一性は、公的に利用可能な配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、Wis.53705、またはNational Library of Medicineから入手可能な、もしくは本明細書に記載のBLASTソフトウェア)を使用して容易に測定され得る。有用なソフトウェアの例は、Pile−upおよびPrettyBoxプログラムを含む。かかるソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、置換、および他の修飾に割り当てることによって類似した配列を一致させる。
実質的に同一な配列は、例えば、本明細書で記載されたマウスもしくはヒトCXCL10、CXCL12もしくはCXCL13配列と、または任意の哺乳類種において見出される相同配列と実質的に同一である配列であってもよい。
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、がん細胞において選択的に複製するウイルスである。それ自体、OVは、非がん細胞に及ぼす著しい効果を有することなく、がん細胞の死を誘発する能力があり得る。
腫瘍溶解性RNAウイルスは、限定することなく、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、マラバウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、またはニューカッスル病ウイルスを含む。
一部の実施形態では、腫瘍溶解性RNAウイルスは、弱毒化されている、すなわち、病原性ではなく、病気を引き起こす能力もないが、がん細胞に感染し、免疫応答を刺激する能力を保持する。
一部の実施形態では、VSVは、限定することなく、VSVインディアナ株を含み得る。
一部の実施形態では、VSVは、限定することなく、Mタンパク質における変異を含むVSVを含み得る。
腫瘍溶解性DNAウイルスは、限定することなく、ワクシニアウイルス(VV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、またはアデノウイルスを含む。
「組換え腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書では、異種B細胞誘引性ポリペプチドまたは異種T細胞誘引性ポリペプチドを発現する腫瘍溶解性RNAウイルスまたは腫瘍溶解性DNAウイルスを意味する。
「組換え」という用語は、腫瘍溶解性ウイルスに関連して使用される場合、結果として生じる組換え腫瘍溶解性ウイルスが、野生型であろうと弱毒化されていようとその腫瘍溶解性ウイルスによって通常発現されないタンパク質またはポリペプチドを発現するように、腫瘍溶解性ウイルスが異種核酸配列の導入によって修飾されていることを示す。一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、1つを超える異種核酸配列を発現するように操作され得る。
組換えVSVは、例えば、VSVゲノムにおけるGタンパク質とLタンパク質の間、または任意の2つの隣接するVSV遺伝子の間に異種核酸配列を挿入することによって産出され得る。一部の実施形態では、VSVは、Mタンパク質における変異、または腫瘍選択性を与え得るVSVタンパク質における他の変異を有し得る。一部の実施形態では、Mタンパク質での変異は、例えば、メチオニン51位置での記載された欠失であってもよい。
弱毒化組換えVVは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子座、またはワクシニア増殖因子(VGF)遺伝子座、または遺伝子の混乱が腫瘍選択性を与える任意の他の遺伝子座内に異種核酸配列を挿入することによって産出され得る。
腫瘍溶解性ウイルスがVVである場合、異種核酸配列は、配列:AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA(配列番号18)を有するVV合成初期/後期プロモーターの制御下に置かれ得る。
一部の実施形態では、本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、T細胞誘引性ポリペプチドを発現するように修飾された腫瘍溶解性RNAまたはDNAウイルスを表し、限定することなく、本明細書に記載のVSV−CXCL10またはVV−CXCL10ウイルスを含む。
異種ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスは、特定の位置での接種後のある一定の期間後に検出不可能であり得るけれども、異種ポリペプチドは、例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルスによってその位置に動員された免疫細胞によって発現され続け得、したがって、検出され得ることが理解されよう。
本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、B細胞および/またはT細胞を固形がん、腫瘍または新生物に動員するために使用され得る。「がん」、「腫瘍」または「新生物」は、生理学的機能を果たさない細胞の任意の望まれない増殖を意味する。一般に、新生物の細胞は、その正常な細胞分裂制御から解放されている、すなわち、その増殖が細胞環境における通常の生化学的および物理学的影響によって調節されない細胞である。大部分の場合、新生物細胞は、増殖して、良性または悪性である細胞のクローンを形成する。がんまたは新生物の例は、限定することなく、形質転換および不死化細胞、腫瘍、ならびに乳腺細胞癌および前立腺癌などの癌を含む。がんという用語は、技術的に良性であるが、悪性になるリスクを保有する細胞増殖を含む。
「悪性」は、任意の細胞型または組織の異常な増殖を意味する。悪性という用語は、技術的に良性であるが、悪性になるリスクを保有する細胞増殖を含む。この用語は、任意のがん、癌腫、新生物、異常増殖、または腫瘍も含む。大部分のがんは、3つの広い組織学的分類に入る:癌、これは、最も多数を占めるがんであり、上皮細胞または臓器、腺、もしくは他の身体構造(例えば、皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸)の外または内面を覆っている細胞のがんであり、転移する傾向がある;肉腫、これは、結合または支持組織(例えば、骨、軟骨、腱、靭帯、脂肪、筋肉)に由来する;および血液腫瘍、これは、骨髄およびリンパ組織に由来する。癌は、腺癌(乳房、肺、結腸、前立腺または膀胱などの分泌の能力がある臓器または腺において一般に生じる)であってもよいし、または扁平上皮癌(扁平上皮において起こり、身体の大多数の領域において一般に生じる)であってもよい。肉腫は、骨肉腫または骨原性肉腫(骨)、軟骨肉腫(軟骨)、平滑筋肉腫(平滑筋)、横紋筋肉腫(骨格筋)、中皮肉腫もしくは中皮腫(体腔の膜裏)、線維肉腫(線維性組織)、血管肉腫もしくは血管内皮腫(血管)、脂肪肉腫(脂肪組織)、神経膠腫もしくは星状細胞腫(脳に見出される神経原性結合組織)、粘液肉腫(原始胚性結合組織)、または間葉性もしくは混合性中胚葉腫瘍(混合性結合組織型)であってもよい。さらに、腺扁平上皮癌、混合性中胚葉腫瘍、癌肉腫、または奇形癌などの混合型がんも存在する。
原発がん 転移に関する一般的な部位
乳房 骨、肺、皮膚、脳
肺 骨、脳
結腸 肝臓、肺、骨
腎臓 肺、骨
膵臓 肝臓、肺、骨
メラノーマ 肺
子宮 肺、骨、卵巣
卵巣 肝臓、肺
膀胱 骨、肺
本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、対象への投与に適した形で薬学的に許容される担体などの担体とともに製剤化されていてもよい。一部の実施形態では、エクスビボ技法が使用され得る。例えば、一部の実施形態では、担体は、Lemay CG et al.(8)によって報告されたエクスビボ感染自己腫瘍細胞であってもよい。
本明細書では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどであってもよい。対象は、臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物などであってもよい。対象は、がんまたは新生物を有するリスクを有していてもよく、がんまたは新生物と診断されてもよい、またはがんも新生物も有さないと確認された対照対象であってもよい。がんまたは新生物に関する診断法およびかかる診断の臨床描写は、当業者に既知である。
CXCL10、CXCL12またはCXCL13などの異種ポリペプチドを発現する1つまたは複数の組換え腫瘍溶解性ウイルスが対象に投与され得る。例えば、対象は、CXCL10、CXCL12またはCXCL13の1つまたは複数をそれぞれ発現するVSVまたはVVなどの1つまたは複数の組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与され得る。
必要に応じて、本開示による組換え腫瘍溶解性RNAウイルスでの処置は、がんまたは新生物に関するより伝統的かつ既存の療法と組み合わされ得る。本開示による組換え腫瘍溶解性RNAウイルスは、慢性的または断続的に提供され得る。「慢性的」投与は、急性的方式とは対照的に、最初の治療効果(活性)を長期間維持するための連続的方式での薬剤の投与を表す。「断続的」投与は、中断なく継続的に行われないが、本来ある程度周期的である処置である。
使用の方法
本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍細胞の死滅を促進する、または免疫細胞(T細胞またはB細胞など)を腫瘍に動員するために使用され得る。
「免疫細胞を腫瘍に動員する」は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非存在下でのT細胞またはB細胞などの免疫細胞の数と比較した場合の、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの存在下でのT細胞またはB細胞などの免疫細胞の数の10%から90%の間の任意の値、または30%から60%の間の任意の値の、または100%を超える増加、または1倍、2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、50倍、100倍以上の増加を意味する。
本発明は、以下の例においてさらに例証されることになる。
本発明者らは、ケモカインCXCL10およびCXCL13をVSVおよびVVの弱毒化株中に操作した。VSV組換えウイルスにおいて、ケモカインをVSVゲノムにおけるGとLタンパク質間に挿入した。VV組換えウイルスに関して、ケモカインをチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入した。両方のウイルスに関して、導入遺伝子は、cDNAの5’UTR、完全なコード配列、および終止コドンを含み;3’UTRを除外した。本発明者らは、PCRクローニングを使用して、マウスCXCL13(mCXCL13)遺伝子をVSVに挿入した。本発明者らは、これをマウス脾細胞から抽出されたmRNAから調製されたcDNAから増幅した。この増幅のためのプライマーは、VSVウイルスゲノム中への挿入を可能にする制限酵素部位を含んだ。組換えVSVクローンを得ると同時に、本発明者らは、mCXCL13の挿入が成功的であったことをサンガーシークエンシングによって確認した。組換えVSV−mCXCL13ウイルスをDNA構築物から産出した。VVに関して、本発明者らはまた、マウス脾細胞cDNAからmCXCL13に関するDNAをPCR増幅した。この場合、PCRプライマーを、それらがVVウイルスゲノム中へのmCXCL13の挿入を可能にするように設計した。さらに、VVに関するレフトプライマーは、組換えウイルスに感染した標的細胞中でのmCXCL13の高発現を強制するための合成プロモーターを含有するように設計した。
より詳細には、活性化マウス脾細胞からcDNAを単離するために、新鮮に収集されたマウス脾臓をシリンジプランジャーの鈍い末端ですりつぶし、次いで、100μmスクリーンを通してろ過した。脾細胞をペレット化し、ACK溶解緩衝液に再懸濁した。室温での5分のインキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで、40μmろ過器を通したろ過の前に完全RPMIに再懸濁した。脾細胞を1〜2×106細胞/mLの濃度で完全RPMI培地中で増殖した。Concavalin A(Sigma−Aldrich)を使用して、細胞を1μg/mLの濃度で刺激した。細胞を48時間インキュベートし、次いで、遠心分離によってペレット化し、均質化の前に1%β−メルカプトエタノールを有する緩衝液RLT Plus(Qiagen)の溶液に再懸濁した。RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を使用して、製造者のプロトコールに従ってホモジネートからRNAを抽出した。cDNAを製造者のプロトコールに従ってqScript(商標) cDNA SuperMix(Quanta Biosciences)を使用してRNAから調製した。
表1のプライマーを使用して、全マウスcDNAから3’UTRを欠くCXCL10およびCXCL13 cDNAを増幅した。VSVクローニングに関して、プライマーをxhoIおよびNheI制限部位を含有するように設計した。ワクシニアウイルスクローニングに関して、プライマーをspeI制限部位を含有するように設計した。加えて、レフトワクシニアウイルスプライマーは、ケモカイン遺伝子の高発現を駆動するための合成ワクシニアウイルス初期/後期プロモーター:AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA(配列番号18;3)を含有した。全てのプライマーをIntegrated DNA Technologiesから購入した。PCRを高忠実度Q5ポリメラーゼ(NEB)を使用して行った。
3’UTRを欠くmCXCL10 cDNA:
GAGAAGCGCTTCATCCACCGCTGAGAGACATCCCGAGCCAACCTTCCGGAAGCCTCCCCATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTGGGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAA(配列番号1)
GAGCTAAAGGTTGAACTCCACCTCCAGGCAGAATGAGGCTCAGCACAGCAACGCTGCTTCTCCTCCTGGCCAGCTGCCTCTCTCCAGGCCACGGTATTCTGGAAGCCCATTACACAAACTTAAAATGTAGGTGTTCTGGAGTGATTTCAACTGTTGTCGGTCTAAACATCATAGATCGGATTCAAGTTACGCCCCCTGGGAATGGCTGCCCCAAAACTGAAGTTGTGATCTGGACCAAGATGAAGAAAGTTATATGTGTGAATCCTCGTGCCAAATGGTTACAAAGATTATTAAGACATGTCCAAAGCAAAAGTCTGTCTTCAACTCCCCAAGCTCCAGTGAGTAAGAGAAGAGCTGCCTGA(配列番号5)
組換えVSVの産出
別個の管において、5ulのリポフェクタミン2000(Thermo Fisher Scientific)を250ul Opti−MEMに加えた。プラスミドおよびリポフェクタミン溶液を一緒に混合し、室温で10〜20分間インキュベートした。
2日のインキュベーション後、培養物を収集し、1600RPMで10分間遠心分離して、細胞片をペレット化した。次いで、上清を0.2umフィルターを通過させて、全てのワクシニアウイルス汚染物質を除去した。
1mlのこの清澄上清を6−ウェル組織培養プレートの6e5 Vero細胞/ウェルの新鮮な、コンフルエントな層上で平板培養し、37Cで24〜48hインキュベートした。成功的な組換えウイルスレスキューが24〜48h以内の細胞死によって示された。
成功的にレスキューされたウェルを一緒にプールし、−80Cで凍結させた。これらのストックを使用して、実験において使用する後のウイルスストックを産出した。
ウェルあたり2mLの完全培地における6e5 Vero細胞を6−ウェル組織培養プレートで平板培養した。翌日、培地を除去し、細胞をレスキューされた組換えVSV−CXCL13を含有する上清に感染させた。感染を、無血清高グルコースDMEM(Thermo Fisher Scientific)中で全体で500μLにした様々な量の上清を使用して行った。ウイルスをVero細胞に加え、次いで、細胞を、プレートを15分毎に穏やかに揺り動かしながら37Cで1時間インキュベートした。次いで、ウェルを1.5mLの2%FBS高グルコースDMEM培地で覆い、37Cでインキュベートした。翌日、セルスクレーパー(Sarstedt)を使用して細胞を収集し、次いで、細胞を1500rpmで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをβ−メルカプトエタノール(Thermo Fisher Scientific)を含有する350μLのRLT溶解緩衝液(Qiagen)に再懸濁した。次に、RNAをRNEasy Kit(Qiagen)を使用して抽出した。RNAを、qScript cDNA キット(Quanta Biosciences)を使用してcDNAに変換した。次に、PCRを使用して、VSVゲノムからのケモカイン遺伝子の発現をスクリーニングした。PCRを、組換えウイルスを産出するために使用したクローニングプライマーおよびTaqポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)を使用して実施した。PCRサイクリング条件は、以下の通りであった:95℃で30秒間の最初の変性、その後の95℃で30秒、54.5℃で30秒および72℃で35秒からなる35サイクルを72℃で2分の長さの最終伸長ステップで行った。PCR産物を2%アガロースゲル上で可視化した。CXCL10およびCXCL13組換えVSVの両方に関して、本発明者らは、導入遺伝子が転写されたこと示す期待されたサイズのバンドを検出することができた。
組換えワクシニアウイルス株を産出するために、本発明者らは、Rintoul et al.(19)によって以前報告された方法を適応した。簡潔に述べると、9e5 U−2 OS細胞(ATCC HTB−96)を6ウェル組織培養プレート中の2mlの完全培地(500ml高グルコース(4500mg/L)DMEM、50ml熱失活ウシ胎仔血清、各5mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミンおよび1mMピルビン酸ナトリウム)(Thermo Fisher Scientific)で平板培養し、37Cでインキュベートした。
翌日、ヘルパーウイルス(野生型ワクシニアウイルスウエスタンリザーブ株)を無血清培地に希釈した。培地をウェルから吸引し、細胞をウェルあたり300〜500ulの体積で3〜5のMOIで感染させ、プレートを15分毎に穏やかに揺り動かしながら37Cで1時間インキュベートした。
1時間のウイルス感染後、培地をウェルから吸引し、トランスフェクション混合物をウェルに滴下添加した。負の対照として、1つのウェルをヘルパーウイルスに感染させたが、トランスフェクトしないままにした。プレートを37Cで3〜4時間インキュベートした。このインキュベーション後、トランスフェクション混合物を吸引し、2ml/ウェルの高グルコースDMEM培地と交換した。次いで、プレートを37Cで24〜48hインキュベートした。
次に、コンフルエントなU2−OS細胞を含有する6ウェルプレートにおいて、培地を除去し、5〜20ulの凍結融解ウイルスを無血清培地と混合して、総体積を500ulにし、1時間、平板培養した。1時間のインキュベーション後、ウイルス混合物を除去し、2ml/ウェルのGPT選択完全高グルコースDMEM培地(250μg/mLキサンチン、15μg/mLヒポキサンチン(Sigma)、および25μg/mLミコフェノール(MPA,Merck Millipore)を含有する)を各ウェルに加えた。プレートを37℃で24〜96時間の間インキュベートした。
総計で、ウイルスは、4〜5ラウンドのGPT選択/プラーク採取を経た。ウイルスの最終粗ストックを−80Cで保管し、後のウイルスストックを産出するために使用した。
本発明者らの組換えウイルス調製物中に野生型ウイルス汚染物質がないことを確認するために、本発明者らは、最初に、Meyer et al.(12)によって報告されたようにU2−OS細胞を組換えウイルスに感染させ、次いで、結果として生じた細胞/ウイルス混合物からDNAを抽出した。本発明者らは、Platinum(登録商標) Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)をワクシニアウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子座にアニールするプライマーと組み合わせて使用して、野生型汚染物質をスクリーニングした。野生型ウイルスでは、TKプライマーセットは、約500bpのバンドを増幅する。組換えウイルスでは、TK遺伝子座中への挿入により、TKプライマーセットは、約5kbの領域を増幅する。したがって、約500bpバンドの非存在(約5kbバンドの存在)は、組換えストックの純度を示す。PCRサイクリング条件は、以下の通りであった:94Cで2分間の1サイクル;94Cで30秒間、58Cで30秒間、68Cで5.5分間の40サイクル;68Cで10分間の1サイクル;4Cで維持。PCR産物を0.8%アガロースゲル上で可視化した。CXCL10およびCXCL13組換えワクシニアウイルスストックの両方は、純粋であることが分かった。
VSV
Vero細胞のコンフルエントな単層を150mm培養皿上で増殖させた。各皿を無血清培地中で5mLに希釈されたウイルスを用いておよそ0.02のMOIでVSVに感染させた。15分毎にプレートを揺り動かしながらの1時間のインキュベーション後、20mLの2%血清含有培地を各プレートに加え、24時間インキュベートした。感染した培養物からの上清を収集し、1400rpmで10分間遠心分離し、次いで、0.2μmフィルター(Thermo Fisher Scientific)を通してろ過した。次いで、ろ過された上清をJA−25.5ローターを有するAvanti J−20 XP遠心機(Beckman Coulter)を使用して16000rpmで4Cで90分間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、ウイルスペレットをプールし、10プレートあたり1mL PBSに再懸濁した。次いで、ウイルスをアリコートし、−80Cで保管した。ウイルスをVero細胞上で標準的なプラークアッセイを使用してタイターした。
U2−OS細胞のコンフルエントな単層を150mm培養皿上で増殖させた。各皿をプレートあたり2e6 pfuで無血清培地中で5mLに希釈されたワクシニアウイルスに感染させた。プレートを15分毎に揺り動かしながらの1時間のインキュベーション後、20mLの2%血清含有培地を各プレートに加え、約72時間インキュベートした。感染細胞を擦り取り、3000rpmで10分間回転させた。ペレットを1mMトリス−HCl pH9(プレートあたり4mL)に再懸濁し、3回凍結融解した。管を3000rpmで10分間回転させて、細胞片を除去した。清澄上清を10mL 36%スクロース溶液上に覆わせた(管あたり20mL清澄上清)。次いで、管をJS−13.1スインギングバケットローターを使用してAvanti J−20 XP遠心機(Beckman Coulter、Pasadena、CA)において11,500rpmで1.5時間回転させた。上清を捨て、過剰なスクロースをピペットで除去した。ペレットを1mMトリス−HCl pH9(10プレートあたり1ml)に再懸濁した。ウイルスをアリコートし、−80Cで保管した。ウイルスをU2−OS細胞上で標準的なプラークアッセイを使用してタイターした。
腫瘍細胞に感染すると組換えウイルスがケモカインタンパク質を産生したことを検証するために、3e4 NOP23マウス乳房腫瘍細胞(22)を96−ウェルプレートで平板培養し、24時間インキュベートした。次いで、NOP23腫瘍細胞をMOI=1で組換えまたは親(GFP発現)ウイルスに感染させ、次いで、48時間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離し、培養上清中のケモカインを、製造者のプロトコールに従ってMouse CXCL10/IP−10/CRG−2またはCXCL13/BLC/BCA−1 Quantikine ELISA Kits(R&D Systems)を使用してELISAによって定量化した。ウェルの色強度をVersaMax Microplate Reader(Molecular Devices)を使用して分析した。
VSV−GFP感染もVV−GFP感染も腫瘍細胞からのCXCL13発現を誘発しなかった。対照的に、VSV−CXCL13およびVV−CXCL13の両方は、腫瘍細胞におけるCXCL13の頑強な発現を誘発した(図1B)。
VSV−CXCL13有効性のin vivo評価
乳房がんのマウスモデル(22)を使用して、VSV−CXCL13の治療有効性およびそのB細胞を動員する能力を決定した。使用した実験手法を図2Aにおける模式図に示す。
参考文献
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれている。
Claims (19)
- B細胞誘引性ポリペプチドまたはT細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、異種核酸配列が組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに安定に組み込まれている、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- 弱毒化されている、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- 腫瘍溶解性RNAウイルスまたは腫瘍溶解性DNAウイルスである、請求項1または2に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- 腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性RNAウイルスであり、異種核酸配列がB細胞誘引性ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- 水疱性口内炎ウイルス(VSV)、マラバウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスまたはレオウイルスである、請求項3または4に記載の組換え腫瘍溶解性RNAウイルス。
- 腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性DNAウイルスであり、異種核酸配列がT細胞誘引性ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- ワクシニアウイルス(VV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、またはアデノウイルスである、請求項3または6に記載の組換え腫瘍溶解性DNAウイルス。
- B細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列がCXCL12またはCXCL13である、請求項1または4に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- T細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列がCXCL10である、請求項1または6に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- VSV−CXCL12、VV−CXCL12、VSV−CXCL13、VV−CXCL13、VSV−CXCL10またはVV−CXCL10である、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
- 請求項1から10のいずれか1項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 組換え腫瘍溶解性ウイルスが、VSV−CXCL13を、VV−CXCL12、VV−CXCL13またはVV−CXCL10と組み合わせて含む、請求項11に記載の医薬組成物。
- 全身投与のために製剤化されている、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 有効量の請求項1から10に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または請求項11から13に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法。
- がんが乳がん、結腸直腸がん、肺がん、メラノーマ、または卵巣がんである、請求項14に記載の方法。
- 腫瘍を請求項1から10のいずれか1項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む、免疫細胞を腫瘍に動員する方法。
- 腫瘍細胞の増殖を阻害するかまたは腫瘍細胞の死滅を促進する方法であって、腫瘍細胞を請求項1から10のいずれか1項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む、前記方法。
- 組換え腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞の細胞死を引き起こすのに十分な投薬量で提供される、請求項17に記載の方法。
- それを必要とする対象におけるがんを処置するための、請求項1から10に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または請求項11から13に記載の医薬組成物。
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