CN109988236B - 一种流感病毒抗体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种流感病毒抗体的应用，具体涉及一种流感病毒抗体用于制备抗H7亚型流感病毒药物的应用，其中，所述流感病毒抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。所述流感病毒抗体能够很好的结合H7亚型的流感病毒的HA蛋白，尤其针对H7N9流感病毒在体内具有很好的中和效果，该抗体能预防H7N9亚型流感病毒感染致死小鼠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种流感病毒抗体的应用，具体涉及一种流感病毒抗体能够体内中和H7亚型流感病毒的应用。
背景技术
禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒(influenza A virus，IAV)引起的一类人畜共患传染性疾病。研究发现，A型流感病毒的H亚型(H1-H16)和N(N1-N9)亚型都存在于水禽及海鸟中，而只有H17、H18和N10、N11亚型病毒存在于蝙蝠这一哺乳动物体内，目前还没有感染水禽的报道。因此水禽和海鸟被称为A型流感病毒的天然存贮库(naturalreservoir)。禽流感可感染包括人在内的多种哺乳动物及多种野生及家养禽类。根据致病性的不同，禽流感可分为三大类：高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)、低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)和非致病性禽流感(non-pathogenic avian influenza,NPAI)。其中HPAI是以H5N1和H7N7为代表的H5和H7亚型流感病毒引起的疾病，危害巨大，严重影响了养禽业的发展。此外，这类病毒可跨越种间障碍，进而感染人类，因此具有重要的公共卫生意义。
CN102264896 A公开了一种对人流感病毒具有中和活性的人型抗体，其能够识别人流感A型病毒的H3N2亚型或人流感B型病毒的高度保守的区域，具有中和活性的人型抗体，但其对H7亚型流感病毒并没有相关的作用。
流感病毒通过病毒颗粒表面的血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)识别并结合宿主细胞表面的唾液酸受体，从而启动病毒与宿主细胞的融合，引发病毒的复制。禽流感病毒和人流感病毒分别与唾液酸α2,3Gal和α2,6Gal结合而感染不同的宿主细胞，受体结合的特异性是流感病毒跨种间传播的主要障碍。但除了早期的个别H7N9分离株在HA的受体结合位点226位是禽类特征的谷氨酰胺外，其余大多数分离株都自然获得了嗜人受体的Q226L突变，除HA外，在H7N9流感病毒的内部基因片段PB2中，也出现了不同的人适应性突变，如E627K，D701N和Q591K。
目前H7N9流感患者临床治疗用的药物主要是神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶抑制剂是以流感病毒的神经氨酸酶NA为靶标，针对病毒粒子释放过程的抗病毒药物。市场上已有治疗流感的神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦和奥司他韦，对感染流感早期病人提供较好的治疗效果。然而治疗后的病人容易对神经氨酸酶抑制剂产生耐药性，有些病人在没有使用治疗的情况下也会对其产生耐药性。因此亟需研制出其他新型的H7N9流感病毒特异的治疗性药物。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种流感病毒抗体的应用，研制出了可以体内中和H7亚型流感病毒的人源抗体，将为H7亚型流感的预防和治疗提供新的备选药物，具有重要的经济和社会意义。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种流感病毒抗体用于制备抗H7亚型流感病毒的药物的应用；
其中，所述流感病毒抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
所述的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：
DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYRASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSFT；
SEQ ID NO.2：
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCEASGFTSSAYAMHWVRQAPGKGLEWVAVITFDGGYQYYADSVKGRFTISRDISRNTLHLHMNSLRAEDTAVYYCARDPLTKLLPFDWVSGGYFDY.
本发明中，所述氨基酸序列中，取代、缺失、添加或导入1-2个氨基酸的任意一种氨基酸序列也在本发明的保护中，其仍然具有抗H7亚型流感病毒的活性。
根据本发明，所述H7亚型流感病毒包括H7N9流感病毒、H7N1流感病毒、H7N2流感病毒、H7N3流感病毒、H7N4流感病毒、H7N5流感病毒、H7N6流感病毒、H7N7流感病毒、H7N8流感病毒或其突变体中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，通过一级氨基酸序列析发现，H7亚型人感染病毒的神经氨酸酶蛋白(HA)都具有低致病性禽流感的特征，AF4H1K1抗体识别对应的H7亚型HA蛋白的关键氨基酸序列是相对保守的，AF4H1K1可以识别并结合H7N9流感病毒的HA蛋白，同理也可识别其他H7亚型HA蛋白。
根据本发明，所述流感病毒抗体的轻链抗原互补决定区具有SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7中任意一种所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链抗原互补决定区具有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10中任意一种所示的氨基酸序列。
所述的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.5：QSVSSSY；
SEQ ID NO.6：RAS；
SEQ ID NO.7：QQYGSSFT；
SEQ ID NO.8：GFTSSAYA；
SEQ ID NO.9：ITFDGGYQ；
SEQ ID NO.10：ARDPLTKLLPFDWVSGGYFDY.
第二方面，本发明提供一种编码如第一方面所述应用中的流感病毒抗体的DNA片段，其轻链可变区具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
所述的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.3：
Gacatcgtgatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcgttcact；
SEQ ID NO.4：
Caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgaagcctctggattcacctccagtgcctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggcctagagtgggtggcagttataacatttgatggaggttatcaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacatttccaggaacactcttcacctgcacatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtttattactgtgcgagagatcccctaacaaagttactgccttttgactgggtctctggggggtactttgactac.
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种抗H7亚型流感病毒的药物，所述药物包括如第一方面所述的应用中的流感病毒抗体、如第二方面所述的DNA片段、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述药物还包括药学上可接受的载体。
第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；
(2)扩增重链和轻链的高度可变区序列，根据CDR丰度进行挑选并合成；
(3)将合成的抗体片段构建到表达载体中。
优选地，步骤(3)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为pCAGGS哺乳动物表达载体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述流感病毒抗体能够很好的中和H7亚型的流感病毒，尤其针对高致病性H7N9亚型流感病毒在体内具有很好的中和效果，该抗体能预防高致病性H7N9亚型流感病毒感染致死小鼠；
(2)本发明所述抗体能治疗H7亚型流感病毒感染的小鼠，针对高致病性H7N9流感病毒感染的小鼠具有100％的治愈率；
(3)本发明所述抗体的获得为流感的预防和治疗提供了新的途径，具有重要的经济和社会意义。
附图说明
图1是本发明制备的抗体IgG经SuperdexTM200 10/300GL分子筛层析纯化结果；
图2是本发明制备的抗体AF4H1K1在BALB/c小鼠体内预防效力评估，其中，图2(a)为小鼠体重变化，图2(b)为小鼠存活率；
图3是本发明制备抗体AF4H1K1在BALB/c小鼠体内治疗效力评估，其中，图3(a)为小鼠体重变化，图3(b)为小鼠存活率；
图4是本发明制备抗体AF4H1K1在识别H3和H7亚型等HA蛋白的关键氨基酸位点的比对分析图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1抗体的制备和纯化
所述的流感病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；
(2)扩增出重链和轻链的高度可变区序列，将扩增的目的片段利用Miseq 2X300bp进行测序，并对测序结果进行分析；
(3)以CDR丰度为主要参数挑选感染患者的高频可变区序列，并通过重链轻链配对算法计算自然配对的几率，接着挑选出CDR1、CDR2和CDR3的高频出现的VH和VL序列加上各自的恒定区进行合成；
所述VL的核苷酸序列为：gacatcgtgatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcgttcact；
所述VH的核苷酸序列为：caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgaagcctctggattcacctccagtgcctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggcctagagtgggtggcagttataacatttgatggaggttatcaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacatttccaggaacactcttcacctgcacatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtttattactgtgcgagagatcccctaacaaagttactgccttttgactgggtctctggggggtactttgactac.
(4)在N端加入对应的重链和轻链的分泌信号肽后，将抗体IgG片段构建到pCAGGS哺乳动物表达载体；
(5)将插入重链和轻链序列的pCAGGS表达载体，通过PEI转染试剂共转染293T细胞进行大量表达，并进行纯化。
(6)纯化具体步骤：在转染后96h后收获上清，5000rpm，离心1h，上清经过0.22μM的滤膜过滤，蠕动泵过夜将上清结合Protein A预装柱，AKTA机器上用0.1M的甘氨酸洗脱结合在Protein A上面的IgG蛋白。洗脱的蛋白浓缩换buffer(10mM Tris，40mM NaCl)后，经过SuperdexTM200 10/300GL分子筛进一步纯化，纯化后的抗体命名为AF4H1K1。
纯化结果如图1所示，可见，通过纯化后都能得到单一所要抗体的IgG。
实施例2 H7N9流感病毒体内抗体预防效果
(1)预防实验
通过小鼠(6周龄BALB/c，雌性)尾静脉注射抗体AF4H1K1，剂量为15mg/kg，同时设定埃博拉病毒中和抗体13C6(人-鼠杂合抗体)为阴性对照。抗体注射24h后干冰麻醉小鼠，而后滴鼻感染107EID50的高致病性H7N9流感病毒。每组5只，攻毒后，观察小鼠的死亡，并称取小鼠的体重，直至攻毒后第14天，结果如图2(a)-图2(b)所示。
从图2(a)可以看出，AF4H1K1预防组中，小鼠的体重随着饲养天数的增加呈逐渐下降的趋势，可见AF4H1K1预防组不能抑制小鼠体重的下降，但是从图2(b)可以看出，AF4H1K1预防组中，在攻毒前24小时通过尾静脉注射抗体后，可以100％预防小鼠的死亡。而阴性对照13C6抗体注射组的小鼠却是100％的死亡率。
可见，根据小鼠预防实验可以看出AF4H1K1抗体对高剂量H7N9病毒感染的小鼠有100％的预防效果。
(2)治疗实验
首先，滴鼻感染107EID50的高致病性H7N9流感病毒，在感染后24h，通过小鼠尾静脉注射抗体AF4H1K1，剂量分别为15mg/kg，同时设定埃博拉病毒中和抗体13C6(人-鼠杂合抗体)为阴性对照。攻毒后第0-第14天，称取小鼠的体重，记录小鼠存活率，结果如图3(a)-图3(b)所示。
结果发现，从图3(a)可以看出，AF4H1K1治疗组不能抑制小鼠体重的下降，但是从图3(b)可以看出，AF4H1K1治疗组中，在攻毒后24小时通过尾静脉注射抗体后，可以对小鼠提供100％保护率，而阴性对照13C6抗体注射组的小鼠却是100％的死亡率。
可见，根据小鼠治疗实验可以看出AF4H1K1抗体对高剂量H7N9病毒感染的小鼠有100％的治疗效果。
实施例3 AF4H1K1对其他H7亚型的流感病毒的保护效果
本发明中，AF4H1K1可以识别并结合H7N9流感病毒的HA蛋白，确定了AF4H1K1识别H7亚型流感病毒的抗原表位HA序列，为此，将录入在NCBI中的各种H7亚型(H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7和H7N8)的HA序列与H7N9流感病毒的HA蛋白进行序列比对分析，结果如图4所示。
从图4可以看出AF4H1K1抗体识别对应的H7亚型HA蛋白的关键氨基酸序列是相对保守的，显然，AF4H1K1除结合和识别H7N9亚型流感病毒外，还可以结合H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7和H7N8等其他亚型流感病毒。
综上所述，本发明所述流感病毒抗体能够很好的中和H7亚型的流感病毒，尤其针对高致病性H7N9流感病毒在体内具有很好的中和效果，该抗体能预防高致病性H7N9亚型流感病毒感染致死小鼠。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种流感病毒抗体的新应用
<130> 2017
<141> 2017-12-29
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe
85 90 95
Thr
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ala Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Phe Asp Gly Gly Tyr Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Arg Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Asp Trp Val Ser Gly
100 105 110
Gly Tyr Phe Asp Tyr
115
<210> 3
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
gacatcgtga tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat cgtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgttcac t 291
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 4
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggacgtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctggatt cacctccagt gcctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gcctagagtg ggtggcagtt ataacatttg atggaggtta tcaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca tttccaggaa cactcttcac 240
ctgcacatga acagcctgag agctgaggac acggctgttt attactgtgc gagagatccc 300
ctaacaaagt tactgccttt tgactgggtc tctggggggt actttgacta c 351
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 5
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 6
Arg Ala Ser
1
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 7
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 8
Gly Phe Thr Ser Ser Ala Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 9
Ile Thr Phe Asp Gly Gly Tyr Gln
1 5
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 10
Ala Arg Asp Pro Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Asp Trp Val Ser Gly
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Asp Tyr
20
Claims (1)
1.一种流感病毒抗体用于制备抗H7N9亚型流感病毒的药物中的应用；
其中，所述流感病毒抗体的轻链可变区为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
所述流感病毒抗体的轻链抗原互补决定区为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列；
所述流感病毒抗体的重链抗原互补决定区为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列。
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