CN109563489A - 具有经修饰的糖蛋白d的疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源肽和任选地多肽配体，所述异源肽和任选地多肽配体能够与靶分子结合并且融合至或插入至糖蛋白D。所述重组疱疹病毒可另外包含使所述病毒从gD的天然受体去靶向的修饰。这使得所述疱疹病毒可以有效地为了治疗目的而靶向细胞和为了病毒生产而靶向细胞。本发明还包括一种含有所述疱疹病毒的药物组合物，所述疱疹病毒用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病，编码所述gD的核酸和载体，含有所述gD的多肽以及含有所述疱疹病毒、核酸、载体或多肽的细胞。此外，公开了一种用所述疱疹病毒感染细胞的方法或生产所述疱疹病毒的方法。

Description

具有经修饰的糖蛋白D的疱疹病毒
背景技术
产生本发明的工作得到了欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)/ERC拨款协议号340060的资助。
尽管医疗保健领域稳步发展，但是无法治疗或无法充分治疗的疾病和病状负担仍然很高。其中突出的是多种形式的肿瘤，特别是使用放化疗或生物药物或者其组合治疗的肿瘤的转移形式，但取得的成功有限。
肿瘤治疗的另一种疗法是溶瘤病毒疗法，其中复制型病毒感染肿瘤细胞，在肿瘤的细胞之间扩散并且破坏它们。
单纯疱疹病毒(HSV)是人类的病原体病毒。在培养时，其感染大量哺乳动物细胞。它是一种通过膜融合进入细胞的包膜病毒，其取决于靶细胞的类型，通过在质膜处的膜融合或通过内吞作用进入细胞。HSV进入靶细胞是一个多步骤过程，需要病毒糖蛋白gD、gH/gL、gC和gB复杂的相互作用和构象变化。这些糖蛋白构成病毒包膜，其是HSV颗粒的最外部结构并且由膜组成。对于进入细胞，gC和gB介导HSV颗粒与细胞表面硫酸乙酰肝素的第一次附着。此后，病毒与靶细胞发生更特异性的相互作用，gD结合至少两种可选的细胞受体，粘连蛋白-1(人：HveC)和HVEM(也称为HveA)，引起gD的构象变化，其启动导致病毒粒子-细胞膜融合的级联事件。由此，中间蛋白gH/gL(异二聚体)被激活，其触发gB以催化膜融合。
近年来，溶瘤性HSV(o-HSV)已被用作溶瘤剂。由于野生型HSV病毒具有高毒性，因此需要将o-HSV减毒。T-VEC/Imlygic和已经进入临床试验的病毒携带一个或多个HSV基因的缺失，包括编码ICP34.5蛋白的γ134.5基因，该蛋白的作用是阻止被感染细胞中蛋白合成的关闭，还包括编码核糖核苷酸还原酶大亚单位的UL39基因。除了这些病毒所显示出的一些缺点(如不能以高产率生产子代病毒)以外，其还保留了与携带其天然受体的任何细胞结合的能力。因此，对肿瘤细胞进行杀伤的治疗作用被减弱，并且病毒在医疗用途方面可能具有局限性。
克服这些限制的一种方法是对o-HSV进行基因工程改造，使其表现出对肿瘤细胞高度特异的嗜性(tropism)，并且除此以外并未被减弱。已将这种方法定义为HSV嗜性重新靶向(retargeting)肿瘤特异性受体。
HSV重新靶向癌症特异性受体需要对gD进行基因修饰，以使其具有编码特异性配体的异源序列。使用重组病毒感染后，形成在其包膜中携带嵌合的gD-配体糖蛋白替代野生型gD的子代病毒。该配体与在所选定的细胞上特异性表达的分子相互作用，并且能够使重组o-HSV进入所选定的细胞。已成功用于重新靶向HSV的配体的实例为IL13α、uPaR、针对HER2的单链抗体和针对EGFR的单链抗体。
尽管重新靶向能够使重组病毒靶向选定的细胞，但是重新靶向不能阻止重组病毒仍能够靶向其天然细胞受体，这导致感染和杀伤体细胞。为了阻止疱疹病毒与其天然受体结合并杀死机体的正常细胞，已经尝试减少其与天然受体的结合。将其称为“去靶向”，这是指重组疱疹病毒与未经修饰疱疹病毒的天然受体具有降低的或不具有结合能力，从而术语“降低”用于与没有这种结合力降低修饰的相同疱疹病毒相比。其具有不感染正常细胞或使正常细胞感染程度降低的效果，因此不杀死正常细胞或杀死较少的正常细胞。这种去靶向的疱疹病毒通过感染较少或不感染正常细胞而降低有害活性，并且通过杀死患病细胞增加其有益活性。
尽管本领域知晓将HSV重新靶向疾病特异性受体的方法，但是具有重新靶向能力的这些HSV需要增殖，以使得可以对其进行大量生产并将其用作治疗疾病的药物。出于安全性的原因，用于HSV增殖和生产的细胞不应是患病细胞，以避免引入患病细胞(如人体中的肿瘤细胞)的物质(如DNA、RNA和/或蛋白)，需要对HSV进行另外的修饰以使得HSV能够感染“安全的”细胞，用于HSV增殖和生产的所述“安全的”细胞不产生对人体有害的成分。然而，到目前为止现有技术尚未披露能够在安全细胞中增殖和生产能够重新靶向疾病特异性受体的疱疹病毒的方法。而且，到目前为止现有技术尚未披露除了将HSV重新靶向疾病特异性受体以及用于增殖和生产疱疹病毒的安全细胞以外，还能够将HSV去靶向的方法。
本领域需要提供用于将疱疹病毒靶向不同细胞的重新靶向策略，所述不同细胞一方面是需要消除的患病细胞，另一方面是用于增殖和产生疱疹病毒的细胞。而且，本领域需要这种疱疹病毒不能感染体内正常细胞。
本发明描述了具有经修饰的gD蛋白的重组HSV，所述经修饰的gD蛋白使病毒重新靶向用于增殖和生产重组疱疹病毒的细胞和需要消除的细胞上的受体，并且使病毒从gD的天然受体去靶向。
特别地，本申请的发明人已示出，可以构建重组HSV，所述重组HSV包含作为与gD融合蛋白的针对特异性靶分子的较短长度的肽配体，由此尽管配体的长度较短，但是HSV重新靶向携带各自靶分子的细胞。本申请的发明人已示出，gD中还存在针对其他特异性靶分子的其他配体，其使HSV还能够重新靶向这种其他的特异性靶分子。本申请的发明人已示出，通过将配体插入HVEM结合位点和/或缺失粘连蛋白-1结合位点所包含的氨基酸使gD与天然受体HVEM和粘连蛋白-1的结合位点失活，从而导致重组HSV从其天然受体去靶向。本申请的发明人已示出，上述组合，即将两个配体插入gD和将特定序列从gD缺失，导致重组HSV重新靶向配体的靶分子并从gD的天然受体去靶向。因此，已表明HSV保持了其感染性，导致重组HSV进入携带配体靶分子的细胞，即进入用于增殖和生产HSV的细胞以及进入患病细胞，但是对不携带配体靶分子而是携带gD天然受体的细胞不具有感染性。
发明详述
在下文中，对本发明进行了详细描述。在各个段落中描述了本发明的特征。然而，这并不意味着在一段中描述的特征孤立于其他段落中描述的一个或多个特征。相反，可以将一段中描述的特征与其他段落中描述的一个或多个特征组合。
用于本申请中的术语“包含(comprise/es/ing)”意指“包括/含有”所公开的特征以及未特别提及的其他特征。术语“包含(comprise/es/ing)”还意指“由”所示特征“组成”，因此不包括除所示特征以外的其他特征。因此，本发明产品可以由除了所示特征以外的其他特征表征。
在第一个方面中，本发明提供了一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含长度为5至131个氨基酸的异源肽配体，所述异源肽配体能够与靶分子结合并且融合至或插入至存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白D(gD)。
在其一个实施方式中，所述异源肽配体的长度为5至120个氨基酸，优选地5至100个氨基酸，更优选地5至80个氨基酸，甚至更优选地5至60个氨基酸，甚至更优选地5至50个氨基酸，甚至更优选地5至45个氨基酸，甚至更优选地5至40个氨基酸，甚至更优选地5至35个氨基酸，甚至更优选地5至30个氨基酸，甚至更优选地10至30个氨基酸或者甚至更优选地12至20个氨基酸。
在其一个实施方式中，所述异源肽配体包含GCN4酵母转录因子的一部分，优选地GCN4酵母转录因子的表位，更优选地如SEQ ID NO:13所示的GCN4的表位，甚至更优选地GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分，最优选地所述肽是如SEQ ID NO:12所示的肽。
在其一个实施方式中，所述异源肽配体与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合或与存在于患病细胞上的靶分子结合，或者所述重组疱疹病毒包含一种以上异源肽配体，其中所述一种以上异源肽配体中的一种与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合和所述一种以上异源肽配体中的另一种与存在于患病细胞上的靶分子结合，优选地其中所述疱疹病毒具有与表达所述靶分子的细胞膜融合的能力，甚至更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
在上述实施方式的一个实施方式中，存在于细胞培养物中的所述细胞是适于所述疱疹病毒生长的培养细胞，优选地是批准用于疱疹病毒生长的细胞系，更优选地是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，甚至更优选地是Vero细胞，和/或存在于细胞培养物中存在的细胞上的所述靶分子是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，优选地是单链抗体(scFv)，更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是与GCN4酵母转录因子的表位结合，甚至更优选地是与如SEQ ID NO:13所示的GCN4的表位结合，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:17的scFv，或者甚至更优选地是如SEQ ID NO:18所示的scFv。最优选地存在于细胞培养物中的所述细胞是携带如SEQ ID NO:18所示的scFv作为所述靶分子的Vero细胞。
在其一个实施方式中，所述重组疱疹病毒还包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与存在于患病细胞上的靶分子结合并且融合至或插入至gD，优选地所述疱疹病毒具有与表达所述靶分子的患病细胞膜融合的能力，甚至更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
在上述实施方式的一个实施方式中，所述重组疱疹病毒包含所述异源肽配体和所述异源多肽配体，所述异源肽配体能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合。
在前四段的一个实施方式中，存在于患病细胞上的所述靶分子存在于肿瘤细胞上，优选地所述靶分子是肿瘤相关受体，更优选地是EGF受体家族成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII、或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII，或MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CEA-CAM、Ep-CAM、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、gp100、GD2、VEGF受体1和2、CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、免疫检查点家族调节因子成员，包括PD-1、PD-L1、CTL-A4、TIM-3、LAG3、B7-H3或IDO，肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2，或者所述患病细胞是感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞，更优选地能够与所述肿瘤细胞、感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞结合的所述异源多肽配体是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是与HER2结合的scFv，或者最优选地是如SEQ ID NO:16所示的scFv。
在其一个实施方式中，gD经过修饰以使得所述重组疱疹病毒与受体HVEM和/或粘连蛋白-1相互作用的能力降低，优选地基本上消除。
在其一个实施方式中，gD的粘连蛋白-1结合位点失活，优选地对于包含SEQ IDNO:1的成熟gD，从gD缺失含有氨基酸35至39或其子集或者含有氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223的gD的一部分，或同源gD的对应氨基酸。更优选地，氨基酸35至39、氨基酸214至223或者氨基酸219至223缺失。
在上述实施方式的一个实施方式中，对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸。
在其一个实施方式中，对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，gD的HVEM结合位点失活，优选地所述异源肽配体或所述异源多肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，更优选地插入至gD的氨基酸6和34之间，或者甚至更优选地插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸。
在上述实施方式的一个实施方式中，对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，优选地插入至gD的氨基酸6和34之间，更优选地插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，优选地插入至氨基酸6和34之间，更优选地插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸。优选地，对于包含SEQ IDNO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸。更优选地，对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:12所示的所述异源肽配体插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:16所示的所述异源多肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或以取代氨基酸214至223或以取代氨基酸219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者对于包含SEQ IDNO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:16所示的所述异源多肽配体插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:12所示的所述异源肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或以取代氨基酸214至223或以取代氨基酸219至223，或同源gD的对应氨基酸。
在上述段落中使用的“在其一个实施方式中”指对标题为“在第一个方面中”或“在其一个实施方式中”的每个前述段落的反向引用。
本发明的重组疱疹病毒用于感染和杀死人体中的患病细胞的目的。这需要提供疱疹病毒，因此需要繁殖和生产疱疹病毒。由于应避免疱疹病毒在患病细胞中的繁殖，以避免将患病细胞(如肿瘤细胞)的物质(如DNA、RNA和/或蛋白)引入人体，因而必须对重组疱疹病毒进行工程改造以使其能够感染用于生产疱疹病毒并且不会产生可能对人有害物质的细胞。在本申请中也将此类细胞称为“安全”细胞。这需要将本发明的重组疱疹病毒重新靶向至用于增殖和生产的此类细胞。为此，对本发明重组疱疹病毒的糖蛋白D进行修饰以纳入融合至或插入至gD的异源肽配体。尽管其长度较短，但是所述肽能够与靶分子结合，所述靶分子是在能够安全地用于生产疱疹病毒的细胞表面上可接近的。使用肽结合靶分子需要能够安全地用于增殖和生产重组疱疹病毒的细胞上的此类靶分子具有可接近性。这反过来可能需要对能够安全地生产本发明的重组疱疹病毒的细胞进行修饰，以包含能够与所述肽结合的靶分子。配体和靶分子的这种互相依赖的生产可能会产生高效配体/靶分子对，其能够将本发明的重组疱疹病毒有效地重新靶向至用于生产病毒的细胞。
在本发明的一个实施方式中，为了有助于消除患病细胞，除了将疱疹病毒重新靶向至用于增殖和生产的细胞的异源肽配体以外，本发明的重组疱疹病毒还包含融合至或插入至gD的用于将疱疹病毒重新靶向至患病细胞的配体。因此，本发明的重组疱疹病毒可以包含将疱疹病毒重新靶向至用于增殖和生产的细胞的异源肽配体以及将疱疹病毒重新靶向至患病细胞的异源肽配体或异源多肽配体，这些配体融合至或插入至gD。
为了将本发明的重组疱疹病毒有效地重新靶向至细胞培养物中存在的细胞和可能地重新靶向至患病细胞，将重组疱疹病毒与细胞上存在的gD天然受体的结合位点失活是有利的。这使得能够有效地靶向至旨在被感染的细胞，而对被疱疹病毒天然感染的正常细胞的感染降低。gD是病毒进入宿主细胞所必需的并且对疱疹病毒的感染性具有重要作用。gD与其天然受体结合位点的失活有利于重新靶向携带配体靶分子的细胞。因此，在本发明的实施方式中，将gD的天然HVEM和/或粘连蛋白-1结合位点失活，以使得与其结合以及因此与携带这些受体的细胞的结合减少。本申请的发明人发现了粘连蛋白-1结合位点内的新区域，将其缺失，以及与将HVEM结合位点失活结合，导致将重组疱疹病毒有效地从gD的天然受体去靶向，并且因此导致将本发明的重组疱疹病毒从正常细胞去靶向。将通过对包含SEQID NO:1的成熟gD的氨基酸24和25之间插入配体使与HVEM的结合位点失活和通过插入配体以取代包含SEQ ID NO:1的成熟gD的缺失的氨基酸35至39或其子集或以取代缺失的氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223)以使得与粘连蛋白-1的结合位点失活组合是本发明优选的实施方式，这使得重组疱疹病毒非常有效地重新靶向携带配体靶分子的细胞并且从gD的天然受体去靶向。
更一般地，可以通过将gD的HVEM结合位点失活使本发明的重组疱疹病毒从gD的天然受体去靶向，如通过在氨基酸6和34之间(如在氨基酸24至25之间)插入配体使HVEM结合位点失活。可以通过将gD的粘连蛋白-1结合位点失活使本发明的重组疱疹病毒从gD的天然受体去靶向，如通过缺失氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)，如插入配体以取代氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)使粘连蛋白-1结合位点失活。可以通过将gD的HVEM结合位点和粘连蛋白-1结合位点失活使本发明的重组疱疹病毒从gD的天然受体去靶向，如通过在氨基酸24和25之间插入配体使HVEM结合位点失活和通过缺失氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)使粘连蛋白-1结合位点失活。可以通过在氨基酸24和25之间插入配体使HVEM结合位点失活和通过插入配体以取代氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)使粘连蛋白-1结合位点失活，从而使得本发明的重组疱疹病毒从gD的天然受体去靶向。氨基酸编号指包含SEQ ID NO:1的成熟gD或同源gD的对应氨基酸。
因此，在本发明中可以将重组疱疹病毒对一个或多个配体靶分子的重新靶向与重组疱疹病毒从gD天然受体的去靶向有效地组合，以获得有效地感染用于增殖和生产的细胞并杀死患病细胞的重组疱疹病毒。
作为上述的替代方案，异源肽配体能够与患病细胞上存在的靶分子结合。在与本申请所定义的能够与患病细胞上存在的靶分子结合的异源多肽配体可能的组合中，这两种配体可以用于将重组疱疹病毒靶向相同或不同患病细胞上存在的一个或多个靶分子上的一个或多个结合位点。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含融合至或插入至gD的至少2个配体，如2、3或4个配体，优选地2个配体。靶细胞包含用于增殖和生产的那些细胞，或者靶细胞包含用于增殖和生产的那些细胞以及为患病细胞的那些细胞，或者靶细胞包含为患病细胞的那些细胞。疱疹病毒、配体、gD和细胞如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含至少2个配体，如2、3或4个配体，优选地2个配体，其中1个配体插入至HVEM结合位点。优选地，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含至少2个配体，如2、3或4个配体，优选地2个配体，其中1个配体插入至对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸6至34，优选地氨基酸24至25，或者同源gD的对应氨基酸。靶细胞包含用于增殖和生产的那些细胞，或者靶细胞包含用于增殖和生产的那些细胞以及为患病细胞的那些细胞，或者靶细胞包含为患病细胞的那些细胞。疱疹病毒、配体、gD和细胞如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)或者同源gD的对应氨基酸的缺失。疱疹病毒和gD如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)或者同源gD的对应氨基酸的缺失，以及将配体插入至HVEM结合位点，优选地在对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸6至34之间，更优选地氨基酸24和25之间，或者同源gD的对应氨基酸。疱疹病毒、配体和gD如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)或者同源gD对应氨基酸的缺失，以及插入配体以取代缺失的氨基酸。疱疹病毒、配体和gD如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)或者同源gD对应氨基酸的缺失，以及将配体插入至HVEM结合位点，并且插入配体以取代缺失的氨基酸。疱疹病毒、配体和gD如本申请所定义的。
除了上述以外，疱疹病毒可以以非常通常的方式包含对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集(如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或者219至223)或者同源gD对应氨基酸的缺失，以及在对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸24和25之间或同源gD的对应氨基酸插入配体，并且插入配体以取代缺失的氨基酸。疱疹病毒、配体和gD如本申请所定义的。
糖蛋白D(gD)是一种55kDa的病毒粒子包膜糖蛋白，其对于单纯疱疹病毒进入宿主细胞是必需的并且在疱疹病毒感染性中发挥重要作用。在单纯疱疹病毒进入细胞后，gD与异二聚体gH/gL的相互作用是在四种糖蛋白gD、gH、gL和gB激活级联中的关键事件，这四种糖蛋白参与了疱疹病毒进入细胞。激活级联始于gD与其受体之一，粘连蛋白-1、HVEM和经修饰的硫酸乙酰肝素的结合，传递至gH/gL以及最后传递至gB。gB进行疱疹病毒与靶细胞膜的融合。异二聚体gH/gL与gD的促融合结构域相互作用，在进入细胞的过程中，gD与其受体之一相互作用时，促融合结构域脱落。gD包含负责将疱疹病毒靶向至其天然受体的一些特异性区域。对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，这些是位于氨基酸7至32之间的HVEM-1结合位点和粘连蛋白-1结合位点，所述粘连蛋白-1结合位点是更加广泛且不连续的并且包括主要位于氨基酸36至39、132至134和213至223之间的三个区域中的关键残基。不同单纯疱疹病毒-1和单纯疱疹病毒-2毒株和临床分离株以及动物直系同源物的各种gD的核苷酸和氨基酸序列是本领域公知的。仅出于说明性目的，但不限于此，本申请公开的人疱疹病毒1gD的氨基酸序列参见SEQ ID NO:1。前体gD相应的核苷酸序列和氨基酸序列可以从NCBI(美国国家生物技术信息中心；国家医学图书馆，贝塞斯达，MD20894，美国；www.ncbi.nlm.nih.gov)获得，GenBank登录号GU734771.1，坐标从位置138281至139465。
SEQ ID NO:1
在疱疹病毒科α亚家族的一些成员中发现了gD同源物。因此，本申请中所涉及的术语“糖蛋白D”指见于疱疹病毒科的gD编码成员中的任何gD同源物。另选地，本申请中所涉及的gD是指与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的任何gD。另选地，本申请中所涉及的gD是指与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸同源性的任何gD。本申请中所涉及的gD还包括gD的片段。优选地，本申请中所涉及的gD包括见于疱疹病毒科中的任何gD，如上文所定义的与SEQ ID NO:1的序列具有氨基酸同一性的任何gD，以及与SEQ IDNO:1所示的gD具有相同活性的任何gD的片段。更优选地，在病毒进入细胞的过程中，gD与其受体之一结合，从而甚至更优选地与gH/gL异二聚体相互作用，其甚至更优选地导致富含gD结构域的移出。
用于本申请中的“序列同一性”百分比指在经最佳比对的两条序列的对应位置中相同的氨基酸残基的百分比。其通过在比较窗中比较两条经最佳比对的序列来确定，其中为了将两条序列进行最佳比对，与参照序列SEQ ID NO:1(其不包含增加或缺失)相比，在比较窗中的氨基酸序列片段可以包含增加或缺失(例如，空位或突出端)。确定在两条序列中出现相同氨基酸残基的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数，再乘以100得到序列同一性百分比。可以通过Smith和Waterman，1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，1988的相似性检索方法，通过经Karlin和Altschul，1993改进的Karlin和Altschul，1990的算法，或者通过这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)或通过观察，来进行用于比较的序列最佳比对。优选地使用GAP和BESTFIT确定最佳比对。通常，通常使用缺省值空位加权5.00和空位加权长度0.30。
用于本申请中的“同源性百分比”是指在两条最佳比对序列的对应位置中同源的氨基酸残基的百分比。除了在计算时还要考虑同源的位置而不仅仅是相同的位置以外，确定两条序列之间的“同源性百分比”的方法与上文所述的确定“同一性百分比”的方法基本上相同。两个同源的氨基酸具有两个相同的或同源的氨基酸。同源的氨基酸残基具有相似的化学-物理性质，例如属于同一族的氨基酸：芳香族(Phe、Trp、Tyr)、酸性(Glu、Asp)、极性(Gln、Asn)、碱性(Lys、Arg、His)、脂肪族(Ala、Leu、lie、Val)、具有羟基基团(Ser、Thr)或具有短侧链(GIy、Ala、Ser、Thr、Met)。预期此类同源氨基酸之间的取代不改变蛋白表型(保守性取代)。
如果gD与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，如果与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性，或者与如SEQ ID NO:1所示的gD具有相同活性，则该gD是“同源的”或“同源物”。优选地，“相同活性”可以理解为gD与细胞受体结合，以及更优选地，在病毒进入细胞的过程中，gD与gH/gL异二聚体相互作用，其甚至更优选地导致富含gD结构域的移出。同源物还可以是具有如上所示活性的全长gD的片段。
同源gD的对应区域是指当使用Smith-Waterman算法以及下述比对参数：MATRIX：BLOSUM62、GAP OPEN：10、GAP EXTEND：0.5时，与如SEQ ID NO:1所示的gD的给定区域对齐的gD的区域。如果进行成对序列比较，这种算法通常是在已知的并且是在现有技术中使用的，并且本领域技术人员知晓如何应用这种算法。如果在使用上述算法和参数时同源gD的序列仅与SEQ ID NO:1给定区域的一或多个部分对齐，此时术语“对应区域”是指与SEQ ID NO:1给定区域的部分对齐的区域。在这种情况下，其中插入配体的同源gD中的该区域仅包含与SEQ ID NO:1给定区域的部分对其的氨基酸。术语“对应区域”还可以指与对应的侧翼序列侧接的区域，其中使用上述算法和参数，所述侧翼序列与侧接SEQ ID NO:1区域的序列对齐。这些侧翼序列的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个氨基酸。可以使用的其他算法是Needleman和Wunsch，1970的算法，Pearson和Lipman，1988的相似性方法，或经Karlin和Altschul，1993改进的Karlin和Altschul，1990的算法，或者这些算法的计算机化实施。术语“对应氨基酸”是指在对应区域内存在的氨基酸，并且其是比对中SEQ ID NO:1的给定氨基酸的对应物。对应氨基酸在比对中不必然与其SEQ ID NO:1中的对应物相同，只要其存在于对应区域内。
用于本申请中的术语“嵌合糖蛋白D”或“嵌合gD”指gD配体与其融合或者其中插入了gD配体的gD。嵌合gD由重组病毒编码，在生产重组病毒的细胞内合成，并且掺入病毒粒子的包膜中。通过基因工程生产重组病毒的方法是本领域公知的，例如但不限于BAC技术。用于生产嵌合糖蛋白D的方法是本领域公知的。
本发明的嵌合gD(如SEQ ID NO:2至11所示例的)携带异源肽配体以及可能的异源多肽配体，从而使病毒除了具有野生型(wt)病毒gD部分实现的活性以外还具有新的活性。嵌合gD一旦成为重组病毒包膜的一部分，就能够使重组病毒与配体的靶分子结合，并且将重组病毒的嗜性重新靶向至携带配体的所述靶分子的细胞。优选地，与配体的靶分子结合后，嵌合gD与gH/gL异源二聚体相互作用，并且甚至更优选地gD的促融合结构域脱落，其甚至更优选地导致重组疱疹病毒通过配体的靶分子进入细胞。在与携带所述配体的靶分子的细胞融合后，重组疱疹病毒进入细胞，被重组疱疹病毒感染的细胞产生由病毒基因组编码的蛋白，包括携带异源肽配体的嵌合gD。被感染的细胞产生裂解所述细胞的子代病毒，从而将细胞杀死。
根据配体插入至gD的位点，可以保持重组疱疹病毒对天然受体的靶向性质，以及gD可以保持其与天然受体结合和通过天然受体介导进入细胞的活性。然而，优选在这样的位点将配体插入至gD，以使得gD与其天然受体的结合能力降低。
本申请中所指的gD特定氨基酸编号或区域是以包含SEQ ID NO:1的gD的“成熟”形式为参考的，其中SEQ ID NO:1包括含有前25个氨基酸的N-末端信号序列。gD的“成熟”形式从SEQ ID NO:1所示的氨基酸26开始，对应于成熟gD的氨基酸1，并且延伸至氨基酸394，对应于成熟gD的氨基酸369。由于具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的gD糖蛋白也包括在本发明中，因而所指的与包含SEQ ID NO:1的成熟gD相关的特定氨基酸编号或特定氨基酸区域也指对应于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的相应氨基酸编号或区域的同源gD的氨基酸编号或区域。氨基酸编号6至34；24至25；35至39；214至223或219至223指成熟gD以及如在本申请中所使用的，分别对应于如SEQ ID NO:1所示的前体gD的氨基酸编号31至59；49至50；60至64；239至248或244至248。术语“包含SEQ ID NO:1的成熟gD”指SEQ ID NO:1的氨基酸26至394，对应于成熟gD的氨基酸1至369。
用于本申请中的术语“重新靶向”指将本发明的重组疱疹病毒靶向与引入至疱疹病毒的配体结合的靶分子。然而，重组疱疹病毒仍能靶向gD的天然受体。重新靶向与“去靶向(detargeting)”不同，后者是指重组疱疹病毒不能再靶向gD的天然受体。
本申请中所提及的术语“重组”疱疹病毒指通过基因重组进行基因工程改造以包含编码异源肽或多肽的另外的核酸序列的疱疹病毒。生产重组疱疹病毒的方法是本领域熟知的(参见例如Sandri-Goldin等，2006)。然而，本发明不仅限于基因工程方法。还可以使用其他方法分别产生异源多肽配体与gD融合的或者异源多肽配体插入gD的疱疹病毒。
本申请中所涉及的术语“疱疹病毒”是指双链DNA病毒疱疹病毒科的成员，其导致潜伏性或裂解性感染。疱疹病毒均具有一个共同的结构，因为其基因组由编码80至200个基因的相对较大的(约100.000至200.000个碱基对)、双链线形DNA构成，其被包裹在称为衣壳的二十面体蛋白笼中，衣壳本身被包裹在称为被膜的蛋白层中，被膜含有病毒蛋白和病毒mRNA以及称为包膜的脂质双层膜。这样的整个粒子也称为病毒粒子。术语“疱疹病毒”也指包含一个或多个突变基因的突变的疱疹病毒科成员，例如在实验室中修饰的疱疹病毒。
在一个优选的实施方式中，疱疹病毒选自下组：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、猪α疱疹病毒伪狂犬病病毒(PRV)、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)、狒狒疱疹病毒2型(HVP2)、猕猴疱疹病毒1型(CeHV1)、猕猴疱疹病毒2型(CeHV2)、恒河猴疱疹病毒1型(MHV1)、猿猴疱疹病毒1型(HVS1)、牛疱疹病毒1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒5型(BoHV-5)、马疱疹病毒1型(EHV-1)、犬疱疹病毒1型(CHV)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)、鸭肠炎病毒(DEV)、果蝠α疱疹病毒1型(FBAHV1)、牛疱疹病毒2型(BoHV-2)、兔疱疹病毒4型(LHV-4)、马疱疹病毒3型(EHV-3)、马疱疹病毒4型(EHV-4)、马疱疹病毒8型(EHV-8)、马疱疹病毒9型(EHV-9)、猪疱疹病毒1型(SuHV-1)、马立克氏病病毒血清型2型(MDV2)、隼鸟疱疹病毒1型(FaHV-1)、禽疱疹病毒3型(GaHV-3)、禽疱疹病毒2型(GaHV-2)、禽疱疹病毒1型(GaHV-1)、鹦鹉疱疹病毒1型(PsHV-1)或吐绶鸡疱疹病毒1型(MeHV-1)。在一个更优选的实施方式中，疱疹病毒是HSV-1或HSV-2，最优选地是HSV-1。
用于本申请中的术语“异源的”是指不由所述疱疹病毒基因组编码的肽或多肽，或者任何其他疱疹病毒的肽或多肽。优选地，术语“异源的”是指与携带配体的靶分子并且将被本发明所述的重组疱疹病毒感染的细胞结合的肽配体或多肽配体。
用于本申请中的术语“肽”或“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的连续的非分支肽链。用于本申请中的术语“肽”是由5至131个氨基酸组成的短链，优选地5至120个氨基酸，更优选地5至100个氨基酸，甚至更优选地5至80个氨基酸，甚至更优选地5至60个氨基酸，甚至更优选地5至50个氨基酸，甚至更优选地5至45个氨基酸，甚至更优选地5至40个氨基酸，甚至更优选地5至35个氨基酸，甚至更优选地5至30个氨基酸，甚至更优选地10至30个氨基酸，如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸，或者甚至更优选地12至20个氨基酸。最短长度是5个氨基酸残基。或者，最短长度是表位或多肽与受体结合区域的长度。术语“多肽”在通常情况下指由通过肽键连接的氨基酸组成的任何多肽。多肽的长度不受限制，因此其长度范围可以从几个氨基酸(如5个氨基酸或者表位或与受体结合区域的长度)至几百个或几千个氨基酸，只要形成分子或分子组装物即可，就配体而言，其能够与靶分子结合，或者就靶分子而言，其能够与配体结合。在本发明中，可以将多肽用作配体或靶分子。可以将多于1条多肽链组装成复合物(如抗体)。用于本申请中的术语“多肽”还包含多肽链的组装物。“肽”与“多肽”之间的差别在于如上文所述的肽具有较短的长度并且由单一肽链构成，而多肽可以是任何长度，可以由单一多肽链构成或者可以形成多肽链的组装物。
本申请中所提及的配体结合或能够结合细胞表面上可接近的靶分子。优选地，其特异性结合或能够特异性结合细胞表面上可接近的靶分子，因此术语“特异性结合”是指一种结合反应，其中配体与感兴趣的特定靶分子结合，但是其在生物体中不与细胞上存在的其他分子或者配体可能接触的其他分子结合或大量结合(少于10％、5％、3％、2％、1％或0.5％)。“特异性结合”靶分子的配体通常对靶分子可以具有大于约105(例如，106、107、108、109、1010、1011、1012或者更高)摩尔/升的平衡亲和常数。优选地，配体介导病毒与细胞融合的能力，更优选地，其使得病毒随后进入细胞，以及甚至更优选地杀死细胞。应当理解的是，配体对人体无害。而且，配体不是疱疹病毒蛋白，或者不是来源于对疱疹病毒蛋白的修饰。本申请中所提及的术语“配体”指长度为5至131个氨基酸的异源肽配体以及异源多肽配体。
本发明的特征在于重组疱疹病毒包含异源肽配体，所述异源肽配体可能能够与存在于细胞培养物中的细胞上存在的靶分子或患病细胞上存在的靶分子结合。肽配体可以是能够与细胞上可接近的靶分子特异性结合的天然多肽，只要其长度不超过131个氨基酸即可。配体可以是细胞上可接近的天然靶分子(如受体分子)的天然配体。配体可以是经选择用于与人造靶分子结合的天然多肽，从而将所述靶分子设计为能够与配体结合。天然多肽可以来源于任何生物体，优选来自对人体无害的生物体。例如，天然多肽是真菌或细菌多肽，如来自酵母属(如酿酒酵母)的多肽。肽配体可以是能够与靶分子特异性结合的人造多肽。人造多肽配体具有非天然存在的氨基酸序列，其功能是与特定靶分子结合。人造多肽配体的序列可以来源于经修饰(包括氨基酸插入、缺失、替代和/或增加)的天然多肽，从而保留对应天然多肽的结合能力。例如，配体可以是上文所提及的天然多肽的一部分，只要所述部分能够与对应的全长多肽结合的靶分子结合即可。另选地，天然多肽经修饰以与对应的天然多肽具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性，从而经修饰的多肽保留对应天然多肽的活性，如与靶分子结合的活性。再另选地，多肽是与靶分子结合的抗体衍生物或抗体模拟物。抗体衍生物或抗体模拟物可以是单特异性的(即，对细胞表面上可接近的一种靶分子具有特异性)或多特异性的(即，对相同或不同细胞表面上可接近的一种以上靶分子具有特异性)，例如双特异性或三特异性的(例如，Castoldi等，2013，Castoldi等，2012)。本发明优选的肽配体是GCN4酵母转录因子的一部分，更优选地是GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分，最优选地是如SEQ ID NO:12(GCN4肽)所示的序列，其能够与设计为与配体结合的人造靶分子结合。所述人造靶分子存在于在细胞培养物中存在的细胞上并且用于增殖和生产病毒。
GCN4酵母转录因子是现有技术(参见例如，Arndt和Fin,1986；Hope和Struhl,1987)。示例性的GCN4酵母转录因子如SEQ ID NO:14所示(UniProtKB-P03069)，其由SEQ IDNO:15所示的基因编码(GenBank登录号AJ585687.1)。本申请中所提及的术语“GCN4酵母转录因子”指在自然界中存在的任何GCN4酵母转录因子。另选地，本申请中所提及的GCN4酵母转录因子是指与SEQ ID NO:14的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的任何GCN4酵母转录因子。另选地，本申请中所提及的GCN4酵母转录因子指与SEQ ID NO:14具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性的任何GCN4酵母转录因子。如果一种GCN4酵母转录因子与SEQ IDNO:14具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，如果其与SEQ ID NO:14具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性，或者其与如SEQ ID NO:14所示的GCN4酵母转录因子具有相同活性，则该GCN4酵母转录因子是“同源性的”或“同源物”。优选地，“相同活性”可以理解为GCN4酵母转录因子与如SEQID NO:14所示的GCN4酵母转录因子以相同方式作为转录因子工作。用于本申请中的术语“其部分”包括针对其可以产生“其部分”能够结合的靶分子的GCN4酵母转录因子的任何部分。“其部分”的长度是使得肽长度为5至131个氨基酸，优选地使得肽长度为5至120个氨基酸，更优选地5至100个氨基酸，甚至更优选地5至80个氨基酸，甚至更优选地5至60个氨基酸，甚至更优选地5至50个氨基酸，甚至更优选地5至45个氨基酸，甚至更优选地5至40个氨基酸，甚至更优选地5至35个氨基酸，甚至更优选地5至30个氨基酸，甚至更优选地10至30个氨基酸，如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸，或者甚至更优选地12至20个氨基酸残基，同时所述肽可以包括另外的氨基酸，如接头序列。最优选地，“其部分”的长度是12个氨基酸。最优选的“其部分”是GCN4酵母转录因子的表位YHLENEVARLKK(SEQ ID NO:13)(GCN4表位)。表位YHLENEVARLKK由12个氨基酸组成，其被如SEQ ID NO:18所示的scFv所识别。为了融合至或插入至gD，表位YHLENEVARLKK还可以在每一侧包含两个侧翼wt(野生型)GCN4残基以及一个(对于融合)或两个(对于插入)GS接头。在本申请中将包括两个GS接头的这种构建体称为GCN4肽(SEQ ID NO:12)。这种20个氨基酸的肽使得疱疹病毒具有在细胞系中感染和复制的能力，所述细胞系携带与“其部分”结合的靶分子。
本发明的特征还在于重组疱疹病毒任选地包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与患病细胞上存在的靶分子结合。多肽配体可以是能够与患病细胞上可接近的靶分子特异性结合的天然多肽。多肽配体可以是能够与患病细胞上可接近的天然靶分子(如受体分子)结合的天然配体。此类配体的实例可以是细胞因子、趋化因子、尿激酶纤溶酶原激活剂(UPa)、免疫检查点阻断剂或生长因子。已知的实例是EGF和IL13。另选地，配体是与靶分子结合的抗体。天然多肽可以来自任何生物体，优选地来自对人体无害的生物体。多肽配体可以是能够与患病细胞上可接近的靶分子特异性结合的人造多肽。人造多肽配体的序列可以来自经修饰(包括氨基酸的插入、缺失、替代和/或增加)的天然多肽，从而保留对应天然多肽的结合能力。例如，配体可以是上文所提及的天然多肽的一部分，只要所述部分能够与对应的全长多肽结合的靶分子结合即可。另选地，天然多肽经修饰以与对应的天然多肽具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性，从而经修饰的多肽保留对应天然多肽的活性，如与靶分子结合的活性。再另选地，多肽是与靶分子结合的抗体衍生物或抗体模拟物。抗体、抗体衍生物或抗体模拟物可以是单特异性的(即，对细胞表面上可接近的一种靶分子具有特异性)或多特异性的(即，对相同或不同细胞表面上可接近的一种以上靶分子具有特异性)，例如双特异性的或三特异性的(例如，Castoldi等，2013，Castoldi等，2012)。在本发明的一个优选的实施方式中，多肽配体是人造多肽，更优选地是抗体衍生物，甚至更优选地是scFv，其能够与患病细胞上的天然受体结合，优选地与肿瘤细胞上的天然受体结合，更优选地与表达HER2的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞上的天然受体结合。在一个甚至更优选的实施方式中，异源多肽配体是能够与HER2结合的scFv。在最优选的实施方式中，异源多肽配体是如SEQ ID NO:16所示的scFv。
本申请中所提及的术语“抗体衍生物”指包含至少一个抗体可变结构域，但是不包含抗体的总体结构的分子。抗体衍生物仍然能够与靶分子结合。优选地，抗体衍生物介导病毒与细胞融合的能力，更优选地，其使得病毒随后进入细胞，以及甚至更优选地杀死细胞。所述衍生物可以是抗体片段，如Fab、Fab2、scFv、Fv或其部分，或者免疫球蛋白的其他衍生物或组合，如纳米抗体、双体、微抗体、骆驼单域抗体、单结构域或Fab片段、可变区的重链和轻链结构域(如Fd、VL，包括Vλ和Vκ，VH、VHH)以及由至少两个结构环连接的免疫球蛋白结构域的两条β链组成的微结构域。优选地，抗体衍生物是单链抗体，更优选地是scFv，其是由短接头肽连接的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。VH的N-末端与VL的C-末端连接或者VL的N-末端与VH的C-末端连接。
本申请中所提及的术语“抗体模拟物”指与抗体一样能够与抗原特异性结合，但是在结构上与抗体无关的有机化合物。其通常是摩尔质量约3至20kDa的人造肽或蛋白。其可以具有治疗或诊断作用。抗体模拟物的非限制性实例是亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、抗运载蛋白(anticalin)、高亲合性多聚体(avimer)、DARPin、fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobody)、蛋白A的Z结构域、γB结晶、泛素、胱抑素、来自嗜酸热硫化叶菌的Sac7D、脂质运载蛋白、膜受体的A结构域、锚蛋白重复序列模体(ankyrinrepeat motive)、Fyn的SH3结构域、蛋白酶抑制剂的Kunits结构域、纤连蛋白的第10个III型结构域、合成异二价或异多价配体(Josan等，2011，Xu等，2012，Shallal等，2014)。
本申请中所提及的肽接头用于连接多肽内来自不同来源的多肽序列。此类接头用于将异源多肽配体与糖蛋白D序列连接并使其正确折叠，或者连接异源多肽配体内的配体部分。其还可以用于将配体序列与除gD之外的糖蛋白序列连接。接头的长度通常为1至30个氨基酸之间，优选地5至25个氨基酸，更优选地8至20个氨基酸，如8、12或20个氨基酸，并且可以包含任何氨基酸。优选地，其包含氨基酸Gly和/或Ser和/或Thr，更优选地其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个选自下组的氨基酸：Gly、Ser和/或Thr。最优选地，其由氨基酸Gly和/或Ser组成。基于Gly和/或Ser的接头提供了柔性、良好的溶解性以及对蛋白水解作用的抗性。另选地，接头可以不主要包含甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸，而甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸可以不存在或仅以很小的程度存在。
在本发明的重组疱疹病毒中，配体可以融合至或插入至gD。在此上下文中，本申请中所提及的术语“融合的”或“融合”是指通过肽键直接地或经由肽接头间接地将配体加至gD的N-末端或C-末端氨基酸。“融合的”或“融合”不同于“插入”，因为“融合的”或“融合”指加至gD的末端，而“插入”指掺入gD。
本申请中所提及的术语“插入的”或“插入”，在表达将所述配体插入gD时，意思是指将配体掺入gD，其中通过肽键直接地或经由一个或多个肽接头(更具体地经由位于插入物的上游和/或下游的肽接头)间接地将要掺入的配体引入gD的两个氨基酸之间。接头直接与配体连接。还可以把配体与gD的融合视为将配体序列在紧邻成熟gD的氨基酸1之前插入gD前体(如SEQ ID NO:1所示例的或同源gD)；在本申请中将这样的插入称为融合。在本申请中将携带融合或插入的配体的gD称为嵌合gD。嵌合gD是病毒粒子包膜的一部分。“接头”的定义如上文所述。
术语“在氨基酸6和34之间插入的”或“在氨基酸6和34之间插入”等意指配体在包括氨基酸6和氨基酸34及其之间的两个相邻的氨基酸之间插入。
本申请中所提及的术语“异源肽配体”包括一种或一种以上肽配体，如2、3或4种配体。这是指提及“异源肽配体”时，本发明的重组疱疹病毒可以包含一种异源肽配体或可以包含2种或更多种，如3种或4种此类配体，优选地重组疱疹病毒包含1种或2种肽配体。如果存在1种以上肽配体，则配体可能能够与存在于相同细胞或不同细胞上的相同靶分子或不同靶分子结合。优选地，一种配体能够与细胞培养物中存在的细胞结合并且另一种配体能够与患病细胞上存在的不同靶分子结合。如果存在一种以上配体，则配体可以融合至或插入至一个gD，位于gD分子中的不同位点或相同位点上(即，连续地)，或者配体可以融合至或插入至不同gD。
本申请中所提及的术语“异源多肽配体”指与上文中类似的一种或一种以上多肽配体，如2、3或4种配体。优选地，重组疱疹病毒包含一种多肽配体。如果存在一种以上多肽配体，则配体可能能够与存在于相同或不同患病细胞上的相同靶分子或不同靶分子结合。如果存在一种以上配体，则配体可以融合至或插入至一个gD，位于gD分子中的不同位点或相同位点上(即，连续地)，或者配体可以融合至或插入至不同gD。
优选地，本发明的重组疱疹病毒包含一种能够与存在于细胞培养物中的细胞上存在的靶分子结合的肽配体和一种能够与患病细胞上存在的靶分子结合的多肽配体。
与上文类似，本申请中所提及的术语“靶分子”包括一种或一种以上靶分子，如2、3或4种靶分子。因此，重组疱疹病毒可以与一种靶分子或一种以上靶分子(如可能存在于相同或不同细胞上的2、3或4种不同靶分子)结合。
用于本申请中的靶分子可以是在细胞表面上可接近的并且可以与异源肽或多肽配体结合的任何分子。靶分子可以是天然分子，如多肽、糖脂或糖苷。例如，靶分子可以是受体，如蛋白受体。受体是嵌入细胞膜中的分子，其经由与配体结合接收来自外部的化学信号，引起某些形式的细胞应答。另选地，靶分子可以是存在于细胞表面上作为药物靶点的分子，如酶、转运蛋白或离子通道。对于患病细胞而言，靶分子以如下文所述的特异或异常方式天然地存在于生物体的患病细胞上。“特异方式”可以理解为靶分子在患病细胞上过表达，但是其在正常细胞上不表达或仅以很小的程度表达(即，以其在相应正常细胞上通常存在的程度表达)。“异常方式”可以理解为与相应的非患病细胞的相应分子相比，靶分子以突变形式存在于患病细胞上。因此，将疱疹病毒重新靶向靶分子(如特异性表达的或突变的靶分子)导致携带靶分子的细胞与未携带靶分子或者以较低水平携带靶分子或携带野生型(未突变的)靶分子的细胞相比具有更高的感染和杀灭率。在患病细胞上优选的靶分子是HER2分子。各配体优选地是人造多肽，更优选地是抗体衍生物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与HER2结合的scFv，最优选地是如SEQ ID NO:16所示的scFv。对于靶向患病细胞而言，最优选的配体/靶分子对是SEQ ID NO:16/HER2分子对。
另选地，靶分子可以是人造分子。本申请中所提及的术语“人造靶分子”是非天然存在(即具有非天然氨基酸序列)的分子。这种人造分子可以构建成在细胞表面上表达(例如，Douglas等，1999；和Nakamura等，2005中所述的)或者其可以结合细胞表面。人造靶分子具有起到与特定配体结合作用的非天然存在的氨基酸序列，其或者由细胞非天然表达或结合至细胞。人造靶分子可以存在于细胞培养物中存在的细胞表面上，所述细胞可以用于生产重组疱疹病毒。存在于细胞培养物中存在的的细胞上的优选的人造靶分子是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:17的scFv，最优选地是如SEQ ID NO:18的序列所示的分子。各配体优选地是GCN4酵母转录因子的一部分，更优选地是GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分，最优选地是如SEQ ID NO:12所示的序列。对于靶向存在于细胞培养物中的细胞而言，最优选的配体/靶分子对是SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:18对。
在一个优选的实施方式中，存在于患病细胞上的靶分子是肿瘤相关受体，优选地是EGF受体家族成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII、或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII、或MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CEA-CAM、Ep-CAM、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、gp 100、GD2、VEGF受体1和2、CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、免疫检查点家族调控因子成员(包括PD-1、PD-L1、CTL-A4、TIM-3、LAG3、B7-H3或IDO)、肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2。优选地，靶分子是HER2，其由一些肿瘤细胞(如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞)过表达，但是在非恶性组织中以非常低的水平表达。肿瘤相关受体是由肿瘤细胞以特异或异常方式表达的受体。另选地，靶分子是来源于感染了细胞的感染因子(如病原体，例如，病毒、细菌或寄生虫)的分子。靶分子在被感染细胞的表面上表达(如来自HBV的HBsAg、来自HIV的gpl20、来自HCV的E1或E2、来自EBV的LMP1或LMP2)。病原体可以导致感染性疾病，如慢性感染性疾病。再另选地，靶分子由退行性病症相关细胞或由衰老细胞表达，如CXCR2或IL-1受体。
本申请中所提及的术语“细胞”是携带靶分子且能够被本发明的重组疱疹病毒感染的任何细胞。细胞可以是天然存在的细胞，如不被需要的并且应当被消除的细胞，如患病细胞。患病细胞的实例如下文所示。优选的患病细胞是包含HER2的细胞。另选地，细胞可以是天然存在的或经修饰的用于生产重组疱疹病毒的细胞。此类细胞可以是能够被本发明的重组疱疹病毒感染并能够生产疱疹病毒的任何细胞。由于应当避免疱疹病毒在患病细胞中的繁殖，以避免引入患病细胞(如在人体内的肿瘤细胞)的物质，如DNA、RNA和/或蛋白，因此，用于生产疱疹病毒的细胞是在人体中存在时无害的细胞(例如，非患病细胞)。细胞可以以细胞系的形式存在。为了生产重组疱疹病毒，细胞存在于细胞培养物中。因此，用于生产重组疱疹病毒的细胞在本申请中称为“细胞培养物中存在的细胞”。因此，细胞可以是适于疱疹病毒生长的培养细胞，优选地，细胞是批准用于疱疹病毒生长的细胞系。此类细胞的实例是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，优选地是Vero细胞。优选地，细胞培养物中存在的细胞经修饰以表达不由对应的亲代细胞天然表达的靶分子，或者细胞培养物中存在的细胞经修饰并且在其表面上与靶分子结合。更优选地，细胞包含抗体衍生物，甚至更优选地scFv，甚至更优选地能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地包含能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分结合的scFv，甚至更优选地包含SEQID NO:17的scFv，最优选地如SEQ ID NO:18的序列所示的分子，作为靶分子。
“培养的”细胞是存在于本领域已知的维持和增殖的体外细胞培养物中的细胞。培养的细胞在受控条件下生长，通常是在其天然环境以外。通常，培养的细胞来自多细胞真核生物，特别地为动物细胞。“批准用于疱疹病毒生长的细胞系”意指包括已显示出能够被疱疹病毒感染(即，病毒进入细胞并且能够增殖和生产病毒)的任何细胞系。细胞系是来源自单一细胞并且含有相同遗传组成的细胞群。优选的用于重组疱疹病毒的增殖和生产的细胞是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞。
用于本申请中的术语“患病细胞”是指对生物体具有负面影响并且因此不被需要的细胞。杀灭此类细胞是需要的，因为将其杀死可以挽救生命或增强生物体的健康。在一个优选的实施方式中，患病细胞的特征是异常生长，更优选地，该细胞是肿瘤细胞。在一个另选的优选实施方式中，细胞是被感染细胞(如慢性感染细胞)，退行性病症相关的细胞或衰老细胞。
在肿瘤细胞的情况下，潜在疾病是肿瘤，优选地选自下组：肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS肿瘤、乳腺癌、原发灶不明癌症、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(gist)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成人软组织癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯肿瘤。优选的肿瘤疾病是HER2-阳性癌症(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、头颈癌、骨肉瘤和多形性胶质母细胞瘤)、EGFR-阳性癌症(如头颈癌、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌)、EGFR-vIII-阳性癌症(如多形性胶质母细胞瘤)、PSMA-阳性癌症(如前列腺癌)、CD20+阳性淋巴瘤和EBV相关肿瘤(如B-细胞淋巴增殖性病症，如伯基特淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤和免疫受损个体中出现的淋巴瘤(移植后和HIV相关的淋巴增殖性病症))、T细胞淋巴增殖性病症、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、淋巴结外鼻型自然杀伤/T细胞淋巴瘤。
在受感染细胞的情况下，潜在疾病是感染性疾病，如慢性感染性疾病，其中感染因子可以是病毒、细菌或寄生虫。实例是结核病、疟疾、慢性病毒性肝炎(HBV、丁型肝炎病毒和HCV)、获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，由人类免疫缺陷病毒HIV引起)、EBV相关病症或HCMV相关病症。
在退行性病症相关细胞的情况下，潜在疾病可以是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ASL)、卢伽雷氏(Lou Gehrig)病、骨关节炎、动脉粥样硬化、进行性腓骨肌萎缩病(Charcot Marie Tooth disease)(CMT)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性创伤性脑病、糖尿病、埃勒斯-当洛斯综合征、特发性震颤、弗里德希氏共济失调、亨廷顿病、炎性肠病(IBD)、圆锥角膜、球状角膜、黄斑变性、马凡综合征、多发性硬化、多系统萎缩、肌肉萎缩症、尼曼皮克病、骨质疏松症、帕金森病、进行性核上性麻痹、前列腺炎、色素性视网膜炎、类风湿性关节炎或泰-萨克斯病。术语“退行性病症相关细胞”是指与所述病症有关的细胞，意思是细胞的改变促进疾病的发展或者疾病导致了细胞的改变。破坏所述细胞使疾病得到治疗。
在衰老细胞的情况下，潜在疾病是衰老相关疾病，如(i)称为早衰综合征的罕见遗传性疾病，其特征是过早的老化：沃纳综合征(WS)、布卢姆综合征(BS)、罗斯蒙德-汤姆森综合征(RTS)、科凯恩综合征(CS)、色素性干皮病(XP)、毛发硫营养不良或哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)或(ii)常见年龄相关病症，如肥胖、2型糖尿病、肌肉减少症、骨关节炎、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、白内障、神经退行性疾病、系统性自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或舍格伦综合征)或多发性硬化症。
本发明重组疱疹病毒的gD与配体的融合使得疱疹病毒能够重新靶向携带相应靶分子的细胞。此外，重组疱疹病毒可以包含用于使重组疱疹病毒从gD的天然受体去靶向的其他修饰。通过去靶向，重组疱疹病毒感染细胞的能力降低，所述细胞含有gD的天然受体而不含有配体的靶分子(如正常体细胞)。通过将gD与其天然受体HVEM和/或粘连蛋白-1的结合位点失活实现去靶向。HVEM结合位点的失活导致对HVEM去靶向，而保持对粘连蛋白-1的靶向性。粘连蛋白-1结合位点的失活导致对粘连蛋白-1去靶向，而保持对HVEM的靶向性。HVEM和粘连蛋白-1结合位点的失活导致对gD的天然受体去靶向，以及因此对携带这些受体但不携带配体的靶分子的细胞(如正常体细胞)去靶向。HVEM结合位点的失活可以如本领域公知的那样进行，包括从HVEM结合位点缺失序列，例如缺失氨基酸残基6至38，其同时缺失了一些对与粘连蛋白-1相互作用关键的残基(Menotti等，2008)，或者将组分纳入HVEM结合位点，例如通过将IL-13或将HER2的scFv插入氨基酸残基24和25之间(Xhou和Roizman,2005；Menotti等，2008)。优选地，通过在对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸6至34之间，更优选地在氨基酸24和25之间，或者同源gD的对应氨基酸插入如本申请所定义的配体，使得如本申请所包含的HVEM结合位点失活。作为HVEM结合位点失活的替代或补充，可以将粘连蛋白-1结合位点失活。粘连蛋白-1结合位点的失活可以如本领域公知的那样进行，包括从粘连蛋白-1结合位点缺失序列，例如缺失氨基酸残基6至38，其同时缺失了一些对与HVEM的相互作用关键的残基(Menotti等，2008)，或者将gD中对与粘连蛋白-1相互作用关键的重要氨基酸残基突变Y38C(Uchida等，2013)。优选地，通过缺失对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或者同源gD的对应氨基酸将粘连蛋白-1结合位点失活。更优选地，通过插入如本申请所定义的配体以取代对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD的氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或者同源gD的对应氨基酸，从而使得粘连蛋白-1结合位点失活。在本发明的一个特别优选的实施方式中，重组疱疹病毒包含至少2种配体插入至gD，如2、3或4种配体，优选地2种配体，其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，将一种配体插入氨基酸24和25之间，并将一种配体插入以取代氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或者同源gD的对应氨基酸。甚至更优选地，一种配体是GCN4酵母转录因子的一部分，甚至更优选地是GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分，最优选地是SEQ ID NO:12的序列(GCN4肽)，以及其他配体是抗体衍生物，优选地是scFv，其能够与患病细胞(优选地肿瘤细胞，更优选地表达HER2的肿瘤细胞)上的天然受体结合，甚至更优选地是能够与HER2结合的scFv，最优选地是如SEQ ID NO:16所示的scFv。在本发明的最优选的实施方式中，重组疱疹病毒包含两种配体，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，将SEQ ID NO:12插入氨基酸24和25之间，并将SEQ ID NO:16插入以取代氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或者同源gD的对应氨基酸；或者对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，将SEQ ID NO:16插入氨基酸24和25之间，并将SEQ ID NO:12插入以取代氨基酸35至39或其子集或者氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或者同源gD的对应氨基酸。
用于本申请中的“失活”指负责gD与细胞上可接近的其天然受体结合的特异性区域以这样的方式(即，使结合能力降低的方式)被修饰，如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或100％，导致使疱疹病毒进入细胞并杀死细胞的能力部分或完全丧失。用于本申请中的术语“基本上消除”指结合能力降低，如降低至少95％、97％、99％或100％。
术语“氨基酸35至39”或者“氨基酸214至223”分别指由氨基酸35、36、37、38和39构成的区域，或者由氨基酸214、215、216、217、218、219、220、221、222和223构成的区域。术语“其子集”指由氨基酸35至39构成的区域之中的一个氨基酸或至少2个(如2、3或4个)相邻的氨基酸，或者由氨基酸214至223构成的区域之中的一个氨基酸或至少2个(如2、3、4、5、6、7、8或9个)相邻的氨基酸。因此，“其子集”可以指氨基酸35、36、37、38、39、35至38、35至37、35至36、36至39、36至38、36至37、37至39、37至38、或者38至39。“其子集”可以指氨基酸214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、214至215、214至216、214至217、214至218、214至219、214至220、214至221、214至222、215至216、215至217、215至218、215至219、215至220、215至221、215至222、215至223、216至217、216至218、216至219、216至220、216至221、216至222、216至223、217至218、217至219、217至220、217至221、217至222、217至223、218至219、218至220、218至221、218至222、218至223、219至220、219至221、219至222、219至223、220至221、220至222、220至223、或者221至222。优选地，子集是氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223、或者219至223，更优选地是氨基酸219至223。术语“子集”可以包含一个或多个子集，如2、3、4或5个子集。例如，“子集”可以包含氨基酸214和氨基酸219至223，导致gD不包含氨基酸214和氨基酸219至223。如本申请所定义的，子集的缺失导致gD的粘连蛋白-1结合位点失活，这使得gD与如本申请所定义的粘连蛋白-1的结合能力降低。上述编号指包含SEQ ID NO:1的成熟gD或者同源gD的对应氨基酸。
在其一个实施方式中，除了嵌合gD以外，本发明的重组疱疹病毒还可以包含经修饰的gB糖蛋白。经修饰的gB可以携带如本申请所定义的异源多肽配体。除了嵌合gD以外，本发明的重组疱疹病毒还可以包含经修饰的gH糖蛋白。经修饰的gH可以携带如本申请所定义的异源多肽配体。经修饰的gH糖蛋白可以是如Gatta等，2015中所公开的，但是不限于那些描述。除了嵌合gD以外，本发明的重组疱疹病毒还可以包含经修饰的gB和经修饰的gH糖蛋白，但是不限于那些描述。gB和/或gH的修饰使得疱疹病毒的嗜性重新定向至如本申请所定义的患病细胞。
本发明的重组疱疹病毒可以包含嵌合gG，但是可以不包含经修饰的gB，或者可以不包含经修饰的gH，或者可以不包含经修饰的gB和经修饰的gH。因此，本发明的重组疱疹病毒可以不包含经修饰以融合至或插入异源多肽(如异源多肽配体)的gB。而且，本发明的重组疱疹病毒可以不包含经修饰以融合至或插入异源多肽(如异源多肽配体)的gH。而且，本发明的重组疱疹病毒可以不包含经修饰以融合至或插入异源多肽(如异源多肽配体)的gB，以及可以不包含经修饰以融合至或插入异源多肽(如异源多肽配体)的gH。
另外，本发明的重组疱疹病毒可以编码调控(例如，刺激)针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。调控(例如，刺激)宿主免疫应答的分子也称为“免疫治疗分子”。因此，本发明的重组疱疹病毒可以是复合的溶瘤和免疫治疗病毒。免疫治疗病毒是编码增强针对细胞的宿主免疫应答的分子的病毒，即调控(例如，刺激)宿主免疫应答以使直接针对细胞的病毒。此类病毒的实例是T-VEC(Liu等，2003)。
除了嵌合gD以外的免疫治疗分子也使得重组病毒能够经由异源肽或多肽配体特异性靶向和杀死细胞，除此之外，还使得重组病毒能够以特异性或非特异性的方式调控(例如，刺激)对象的免疫系统。通过重组病毒在对象中表达免疫治疗分子能够诱导免疫应答，其最终导致杀死患病细胞。免疫疗法可以特异性发挥作用，其中免疫治疗分子针对细胞上存在的一种或几种特异性抗原调控(例如，刺激)对象的免疫系统。例如，免疫治疗分子可以是针对特异性细胞表面受体(例如，CD20、CD274和CD279)的抗体。一旦与抗原结合，抗体能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，激活补体系统或阻止受体与其配体相互作用。这些均导致细胞死亡。优选的细胞是肿瘤细胞。这种技术是本领域已知和已批准的。有多种批准用于治疗癌症的抗体，包括阿仑单抗、伊匹单抗、纳武单抗、奥法木单抗和利妥昔单抗。另选地，免疫治疗分子可以通过刺激对象的免疫系统而非特异性地发挥作用。特别地，免疫治疗分子的实例是细胞因子、趋化因子或免疫检查点调控因子。例如，一些细胞因子具有增强抗肿瘤活性的能力并且能够用作被动癌症治疗。细胞因子作为免疫治疗分子的用途是本领域已知的。细胞因子的实例是GM-CSF、白介素-2、白介素-12或干扰素-α。GM-CSF用于例如治疗激素难治性前列腺癌或白血病。白介素-2用于例如治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌。IL-12用于胶质母细胞瘤的实验性治疗。干扰素-α例如用于治疗毛细胞白血病、AIDS相关的卡波西肉瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病和恶性黑色素瘤。
本发明的重组疱疹病毒可以是减毒的，例如通过缺失或改变已知减弱病毒毒力的基因，如病毒基因y134.5、UL39和/或ICP47。术语“减毒的”是指毒力减弱或降低的疱疹病毒。优选的是条件性减毒，其中减毒仅影响非患病细胞。更优选地，仅患病细胞(如肿瘤细胞)受到疱疹病毒完全毒力的影响。例如，通过用专门在患病细胞中表达的人基因的启动子(例如，肿瘤细胞中的存活素启动子)取代y134.5、UL39和/或ICP47基因的启动子区，能够实现条件性减毒。用于条件性减毒的进一步修饰可以包括用专门在患病细胞中表达的基因的启动子区(例如，存活素启动子)取代负责IE基因(即刻早期基因(immediate early gene))转录的调控区，如ICP-4启动子区。这种变化将导致条件性复制的HSV，其能够在患病细胞中而非正常细胞中复制。对病毒另外的修饰可以包括将响应富含于正常细胞而非肿瘤细胞的微RNA(miR)的序列元件插入必需HSV基因(如ICP4)的3’非翻译区。其也产生仅在正常细胞中无法复制的病毒。
在第二个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的重组疱疹病毒和药学上可接受的运载体，任选地另包含调控(例如，刺激)针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。本发明的重组疱疹病毒可以用作药物。为了产生药物，疱疹病毒可以是药物剂型，所述药物剂型包含本发明的重组疱疹病毒和成分的混合物，如提供所需特性的药学上可接受的运载体。药物组合物包含本领域技术人员已知的一种或多种适宜的药学上可接受的运载体。药物组合物可以另包含调控(例如，刺激)针对细胞的宿主免疫应答的一种或多种分子。调控(例如，刺激)针对细胞的宿主免疫应答的一种或多种分子的定义参见上述本发明的第一个方面。
可以制备用于系统、鼻腔、胃肠外、阴道、局部、阴道、瘤内施用的药物组合物。胃肠外施用包括皮下、皮内、肌内、静脉内或腹腔内施用。
药物组合物可以制成各种剂型，包括用于口服施用的固体剂型(如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒)、用于口服施用的液体剂型(如药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂)、可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性混悬剂)、用于直肠或阴道施用的组合物(优选栓剂)，以及用于局部或透皮施用的剂型(如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片)。
任何特定对象的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括本发明的重组疱疹病毒的活性，剂型，对象的年龄、体重和性别，治疗持续时间等医药领域熟知的因素。
以单剂量或多剂量向对象施用的本发明化合物的总剂量可以是例如103至1010的量。单剂量组合物可以含有该剂量或其约数以构成日剂量。重组疱疹病毒的剂量可以定义为噬斑形成单位(pfu)的数目。剂量的实例包括103、104、105、106、107、108、109或1010。
本发明的重组疱疹病毒用于治疗疾病，其中患病细胞在其表面上表达特异性靶分子，以使得所述靶分子可以从细胞外接近，所述靶分子不是由正常细胞产生的或者是由正常细胞以较低程度产生。正常细胞可以是相应的正常细胞。“相应的”指患病细胞和正常细胞是相同来源的，但是由于疾病产生的影响使得细胞发展成了患病细胞，而同一来源的其他细胞仍是健康的。
在第三个方面，本发明提供了本发明的重组疱疹病毒，任选地与调控(例如，刺激)针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子联合施用，用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病。本发明的重组疱疹病毒和调控(例如，刺激)针对细胞的宿主免疫应答的分子能够存在于同一药物组合物中或不同药物组合物中。如果其存在于不同药物组合物中，则其可以同时施用或以疱疹病毒先于分子或分子先于疱疹病毒的顺序依次施用。疱疹病毒或分子可以以不同频率和/或在不同时间点施用。然而，联合治疗包含以能够同时治疗疾病的时间间隔和/或时间点施用疱疹病毒和分子。
本发明还公开了一种通过施用药学有效量的本发明的重组疱疹病毒来治疗患有肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关病症的对象的方法。
本发明的重组疱疹病毒可以与其他治疗联合向对象施用，所述其他治疗调控(例如，刺激)针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答和/或用于治疗对象的特定疾病。此类其他治疗可以包括其他药物、化疗、放疗、免疫疗法、联合病毒疗法等。
本发明还公开了本发明的疱疹病毒的用途，任选地与调控(例如，刺激)针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子联合，用于制备用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病的药物组合物的用途。
本发明的重组疱疹病毒治疗的对象优选地是人。
在第四个方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含核酸，所述核酸编码融合了或插入了异源肽配体和任选地异源多肽配体的本发明的嵌合gD。核酸分子可以是本发明的重组疱疹病毒的基因组或其一部分。优选地，核酸分子编码包含gD糖蛋白的信号序列的嵌合gD前体的形式。如果将嵌合gD工程改造为在其N-末端氨基酸处携带融合的配体，则对应的核酸具有插入信号序列最后一个氨基酸与成熟蛋白第一个氨基酸之间的配体的核酸序列。
在第五个方面，本发明提供了一种包含核酸分子的载体。适宜的载体是本领域已知的并且包括质粒、粘粒、人造染色体(例如，细菌、酵母或人)、噬菌体、病毒载体(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)，特别是杆状病毒载体或纳米工程改造的物质(例如，有机改性硅酸盐(ormosil))。在一个实施方式中，对载体进行修饰，特别是通过缺失、插入和/或突变一个或多个核酸碱基，以使得其毒力减弱(优选在病毒载体的情况下)，或者使得其在患病细胞中而不在非患病细胞中条件性地复制。例如，缺失γ134.5基因、UL39基因、ICP47基因的一个或全部两个拷贝导致病毒减毒。减毒或减毒的是指毒力减弱或降低的病毒。
而且，本发明包括用仅在患病细胞(例如，肿瘤细胞)中表达的人基因的启动子(例如，肿瘤细胞中的存活素启动子)取代γ134.5基因的启动子区，这将导致在非患病细胞中其为减毒表型而在患病细胞中其为非减毒表型。进一步修饰可以包括用仅在患病细胞中表达的基因的启动子(例如，存活素启动子)取代负责IE基因转录的调控区，如ICP-4启动子区。这种改变将产生能够在患病细胞中而不在正常细胞中复制的条件复制性疱疹病毒。用于病毒子代增殖的细胞培养物细胞将提供高水平的特异性启动子活化蛋白，以便能够以高病毒产率进行生产。
在第六个方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽包含融合了或插入了异源肽配体和任选地异源多肽配体的嵌合gD。
在第七个方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含重组疱疹病毒、核酸分子，所述核酸分子包含编码融合了或插入了异源肽配体和任选地异源多肽配体的本发明的嵌合gD的核酸、包含所述核酸分子的载体，或包含融合了或插入了异源肽配体和任选地异源多肽配体的嵌合gD的多肽。优选地，细胞是细胞培养物的细胞。适宜的细胞培养物和培养技术是本领域熟知的(Peterson和Goyal，1988)。
在第八个方面，本发明提供了一种使用本发明的重组疱疹病毒感染细胞的方法。本发明的目的是提供重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒感染对象中不需要的细胞，在其中繁殖，裂解细胞并且从而杀死细胞。用于感染的方法还用于重组疱疹病毒在细胞培养物中存在的细胞中的生长。“感染”指病毒经由病毒表面的膜与细胞膜的融合进入细胞，并且病毒组分(如病毒基因组)释放至细胞中。用病毒感染细胞的方法是本领域已知的，例如通过将病毒与待感染的细胞一起孵育(Florence等，1992；Peterson和Goyal，1988)。“杀死”指由于本发明的疱疹病毒的感染，细胞内病毒颗粒的产生，以及最后通过裂解细胞释放新的病毒颗粒，使得细胞被完全消除。在其表面上携带配体靶分子的细胞可以用于检测重组疱疹病毒的裂解效力。例如，细胞可以是获取自对象的患病细胞，例如肿瘤细胞。这种细胞被重组疱疹病毒感染并且由此被重组疱疹病毒杀死。成功杀死细胞表示重组疱疹病毒具有细胞特异性，以评价消除细胞(如来自对象的肿瘤细胞)的治疗成果。在进一步的实施方式中，还可以自同一对象或从未患有疾病的对照对象获取非患病细胞，即在其表面上不携带配体的靶分子或以较低程度携带靶分子的细胞。通过这种方式，可以检测非患病细胞是否易受重组疱疹病毒感染和/或非患病细胞易受重组疱疹病毒感染的程度。在另一个实施方式中，自对象分离细胞群后(例如，白细胞去除术)，将包含非患病细胞和患病细胞(例如，肿瘤细胞(如白血病细胞))的细胞群(例如，组织(如血液))中的患病细胞杀死。这用于获取不含患病细胞的细胞群，例如不含患病细胞(如白血病细胞)的血液，特别是用于随后将细胞群移植到对象中，优选地移植到细胞群自其分离的同一对象中。例如，在血液和白血病的情况下，这种方法提供了不含肿瘤细胞血液的回输。使用本发明的重组疱疹病毒杀死细胞的方法可以是体外方法或体内方法。
在第九个方面，本发明提供了一种使用本发明的重组疱疹病毒在细胞培养物中存在的细胞中生产重组疱疹病毒的体外方法，优选地其中所述细胞表达或结合作为靶分子的人造分子，更优选地所述靶分子包括抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQID NO:17的scFv，最优选地是如SEQ ID NO:18的序列所示的分子。
本发明的重组疱疹病毒用于感染和杀死人体中的患病细胞的目的。这需要提供疱疹病毒，并因此需要繁殖和生产疱疹病毒。由于应当避免疱疹病毒在患病细胞中的繁殖，以避免引入患病细胞(如人体中的肿瘤细胞)的物质，如DNA、RNA和/或蛋白，因而必须将重组疱疹病毒工程改造为还能够感染非患病细胞。这需要将重组疱疹病毒重新靶向至患病细胞用于将其杀死以及重新靶向至非患病细胞用于繁殖。因此，本发明的第九个方面包括用一种以上(如2、3或4种，优选2种)配体修饰重组疱疹病毒的gD。
因此，在第九个方面的一个实施方式中，重组疱疹病毒包含融合至或插入至gD的异源肽配体，其能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合，并且包含另外的融合至或插入至gD的配体，其是异源肽配体或异源多肽配体(优选异源多肽配体)，其能够与患病细胞上存在的靶分子结合。
用于在细胞中培养疱疹病毒的适宜技术和条件是本领域熟知的(Florence等，1992；Peterson和Goyal，1988)，并且包括将疱疹病毒与细胞一起孵育并且从感染细胞培养物的培养基中回收疱疹病毒。生产重组疱疹病毒的细胞携带靶分子，重组疱疹病毒经由异源肽配体与所述靶分子结合。优选地，靶分子是人造靶分子。特异性地构建人造靶分子以结合异源肽配体。反之，特异性地选择和构建配体以结合人造靶分子。因此，靶分子可以是不由靶细胞天然产生的抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，优选scFv。异源肽配体可以是天然多肽，优选地是真菌或细菌多肽，如来自酵母菌属(如酿酒酵母)的多肽，或者是人造多肽，如能够与靶分子结合的天然多肽的一部分。细胞可以是适于疱疹病毒生长的任何培养细胞。优选地，细胞是非患病细胞。细胞可以作为细胞系存在或者可以是分离的细胞，优选地细胞作为细胞系存在。细胞系可以是批准用于疱疹病毒生长的细胞系。适宜的细胞系是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，最优选地是Vero细胞。
“培养的”细胞是存在于本领域已知的维持和增殖的体外细胞培养物中的细胞。培养的细胞在受控条件下生长，通常是在其天然环境以外。通常，培养的细胞来源于多细胞真核生物，特别地为动物细胞。“批准用于疱疹病毒生长的细胞系”意指包括已显示出其能够被疱疹病毒感染(即，病毒进入细胞并且能够增殖和生产病毒)的任何细胞系。细胞系是源自单一细胞并且含有相同遗传组成的细胞群。优选地用于重组疱疹病毒的增殖和生产细胞是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞。
在体外方法的一个优选实施方式中，靶分子是能够与肽配体结合的抗体衍生物。更优选地，异源肽配体是GCN4酵母转录因子的一部分，靶分子是能够与配体结合的抗体衍生物，以及细胞是已被修饰以表达靶分子的细胞。最优选地，异源肽配体是如SEQ ID NO:12的序列所示的分子，靶分子是如SEQ ID NO:18的序列所示的分子(包括scFv序列和人粘连蛋白-1(PVRL1)的残基Met143至Val517)，以及细胞是已被修饰以表达如SEQ ID NO:18的序列所示的分子的Vero细胞系，在本申请中将其称为Vero-GCN4R细胞系。SEQ ID NO:19表示编码如SEQ ID NO:18所示的scFv-GCN4-粘连蛋白-1嵌合体的核苷酸序列。SEQ ID NO:17表示针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列，其包含N-末端前导肽、HA标签序列、短GA接头和scFv序列。
Vero-GCN4R细胞系表达GCN4肽的人造受体，其为scFv。Vero-GCN4R细胞系用于实现对重新靶向癌细胞的疱疹病毒重组体的培养。应避免在癌细胞中生长和生产供人用的溶瘤重组疱疹病毒，以避免将肿瘤来源物质(DNA、RNA、蛋白)可能地、偶然地引入人体。与此同时，疱疹病毒应能够感染患病细胞。因此，构建Vero-GCN4R细胞系和重新靶向癌细胞的疱疹病毒。Vero-GCN4R细胞系表达人造受体，所述人造受体由针对GCN4肽的scFv构成，其与粘连蛋白-1的胞外域2和3、跨膜结构(TM)和C-尾融合。重新靶向癌细胞的疱疹病毒在gD中表达GCN4肽。因此，重组疱疹病毒同时重新靶向癌细胞，以感染和杀死癌细胞，和用于病毒生长和生产的Vero-GCN4R细胞系。
在第九个方面的一个特别优选的实施方式中，gD包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的肽配体，因此所述配体可以是人造多肽，更优选地是天然多肽的一部分，以及甚至更优选地是GCN4酵母转录因子的一部分，以及能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的多肽配体，其中所述多肽配体可以是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，以及甚至更优选地是能够与HER2结合的scFv。在最优选的实施方式中，重组疱疹病毒包含嵌合gD，所述嵌合gD包含如SEQ ID NO:12所示的分子和如SEQ IDNO:16所示的scFv。此类疱疹病毒能够感染表达如SEQ ID NO:18的序列所示分子的Vero-GCN4R细胞系用于繁殖，以及通过存在于肿瘤细胞上的HER2感染肿瘤细胞，用于杀死肿瘤细胞。
附图说明
图1：R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2的基因组排布。HSV-1基因组的序列排布以矩形框显示反向重复IR序列。由上游和下游Gly-Ser接头括起的GCN4肽插入R-87和R-89中的gD的AA 24和25之间。将由上游和下游Gly-Ser接头括起的GCN4肽插入以取代R-97中gD的AA35-39，以取代R-99中gD的AA 214-223，以取代R-97中gD的AA 219-223。将scFv-HER2序列(VL-接头-VH)插入以取代R-87中gD的AA 35-39。将scFv-HER2序列(VL-接头-VH)插入以取代R-89中gD的AA 214-223。将scFv-HER2序列(VL-接头-VH)插入R-97、R-99和R-99-2中gD的AA 24和25之间。所有重组体均携带插入UL3-UL4区域之间的LOX-P-括起的p-Belo-BAC和EGFP序列。
图2：R-87的嗜性。在SK-OV-3(A)或Vero-GCN4R(B)细胞中培养R-87。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白-1、J-HVEM仅表达所示受体。使用R-87感染所示细胞并使用荧光显微镜监测EGFP。在存在中和剂量(28μg/ml)赫赛汀/曲妥珠单抗的条件下，感染图e、f、g和h中的细胞。除了J-HER2细胞(d、h)以外，R-87还感染Vero-GCN4R细胞(b、f)和HER2阳性癌细胞系SK-OV-3(c、g)。其还感染wt-Vero细胞，所述wt-Vero细胞表达HER2的猿猴直系同源物(a)。赫赛汀抑制R-87感染wt-Vero、SK-OV-3和J-HER2细胞(e、g、h)，但是不能抑制R-87感染Vero-GCN4R细胞(f)。R-87不能感染J-粘连蛋白-1、J-HVEM和J细胞(i、j、k)，因为其已从gD的受体HVEM和粘连蛋白-1去靶向。
图3：R-89的嗜性。在SK-OV-3(A)或Vero-GCN4R(B)细胞中培养R-89。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白-1、J-HVEM仅表达所示受体。使用R-89感染所示细胞并使用荧光显微镜监测EGFP。在存在中和剂量(28μg/ml)赫赛汀/曲妥珠单抗的条件下，感染图e、f、g和h中的细胞。除了J-HER2细胞(d、h)以外，R-89还感染Vero-GCN4R细胞(b、f)和HER2阳性癌细胞系SK-OV-3(c、g)；其对wt-Vero细胞的感染较差，所述wt-Vero细胞表达HER2的猿猴直系同源物(a)。赫赛汀抑制R-89感染wt-Vero、SK-OV-3和J-HER2细胞(e、g、h)，但是不能抑制R-89感染Vero-GCN4R细胞(f)。R-89不能感染J-粘连蛋白-1、J-HVEM和J细胞(i、j、k)，因为其已从gD的受体HVEM和粘连蛋白-1去靶向。
图4：R-97的嗜性。在SK-OV-3细胞中培养R-97。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白-1、J-HVEM仅表达所示受体。使用R-97感染所示细胞并使用荧光显微镜监测EGFP。在存在中和剂量(28μg/ml)赫赛汀/曲妥珠单抗的条件下，感染图e、f、g和h中的细胞。除了J-HER2细胞(d、h)以外，R-97还感染Vero-GCN4R细胞(b、f)和HER2阳性癌细胞系SK-OV-3(c、g)；其还感染wt-Vero细胞，所述wt-Vero细胞表达HER2的猿猴直系同源物(a)。赫赛汀抑制R-97感染wt-Vero、SK-OV-3和J-HER2细胞(e、g、h)，但是不能抑制R-97感染Vero-GCN4R细胞(f)。R-97不能感染J-粘连蛋白-1、J-HVEM和J细胞(i、j、k)，因为其已从gD的受体HVEM和粘连蛋白-1去靶向。
图5：R-99的嗜性。在SK-OV-3(A)或Vero-GCN4R(B)细胞中培养R-99。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白-1、J-HVEM仅表达所示受体。使用R-99感染所示细胞并使用荧光显微镜监测EGFP。在存在中和剂量(28μg/ml)赫赛汀/曲妥珠单抗的条件下，感染图e、f、g和h中的细胞。除了J-HER2细胞(d、h)以外，R-99还感染Vero-GCN4R细胞(b、f)和HER2阳性癌细胞系SK-OV-3(c、g)；其还感染wt-Vero细胞，所述wt-Vero细胞表达HER2的猿猴直系同源物(a)。赫赛汀抑制R-99感染wt-Vero、SK-OV-3和J-HER2细胞(e、g、h)，但是不能抑制R-99感染Vero-GCN4R细胞(f)。R-99不能感染J-粘连蛋白-1、J-HVEM和J细胞(i、j、k)，因为其已从gD的受体HVEM和粘连蛋白-1去靶向。
图6：R-99-2的嗜性。在SK-OV-3细胞中培养R-99-2。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白-1、J-HVEM仅表达所示受体。使用R-99-2感染所示细胞并使用荧光显微镜监测EGFP。在存在中和剂量(28μg/ml)赫赛汀/曲妥珠单抗的条件下，感染图e、f、g和h中的细胞。除了J-HER2细胞(d、h)以外，R-99-2还感染Vero-GCN4R细胞(b、f)和HER2阳性癌细胞系SK-OV-3(c、g)；其还感染wt-Vero细胞，所述wt-Vero细胞表达HER2的猿猴直系同源物(a)。赫赛汀抑制R-99-2感染wt-Vero、SK-OV-3和J-HER2细胞(e、g、h)，但是不能抑制R-99-2感染Vero-GCN4R细胞(f)。R-99-2不能感染J-粘连蛋白-1、J-HVEM和J细胞(i、j、k)，因为其已从gD的受体HVEM和粘连蛋白-1去靶向。
图7：重组体R-87、R-89、R-99以及R-LM113在SK-OV-3细胞(A)和在Vero-GCN4R细胞(B)中的产率，和子代病毒向胞外培养基(C、D)中的释放。将R-87、R-89和R-99在Vero-GCN4R或在SK-OV-3细胞中的复制程度与R-LM113病毒复制程度进行比较。使用MOI 0.1PFU/细胞(在Vero-GCN4R中滴定接种物用于在Vero-GCN4R中复制，在SK-OV-3细胞中滴定接种物用于在SK-OV-3细胞中复制)的所示病毒感染细胞。在感染后24和48小时收集样品，并在SK-OV-3细胞中滴定子代病毒(A、B)。如图A中所示，使用MOI 0.1PFU/细胞(在SK-OV-3细胞中滴定接种物)的R-87、R-89、R-99和R-LM113感染SK-OV-3(C)或Vero-GCN4R(D)细胞。在感染后48小时收集样品，并滴定释放到胞外培养基中的(外)、细胞相关的组分中存在的(内)或者细胞相关的加上培养基中的(内+外)子代病毒粒子。
图8：R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2在不同细胞系中的噬斑尺寸和植板效率。(A)将复制等份的R-87、R-89、R-97、R-99、R-99-2和用于比较的R-LM113铺板到Vero-GCN4R、wt-Vero和SK-OV-3细胞中。3天后使用荧光显微镜对噬斑评分。(B)R-87、R-89、R-97、R-99、R-99-2和R-LM113在不同细胞系中的相对植板效率。以在SK-OV-3细胞中评分的噬斑百分比表示评分的噬斑数目。
图9：由R-87、R-89、R-99和R-LM113引起的对SK-OV-3(A)和Vero-GCN4R细胞(B)的细胞毒性。使用所示病毒(3PFU/细胞)感染细胞。在感染后指定天数通过Alamar-blue法测定细胞毒性。可以看出，除了R-LM113未对Vero-GCN4R细胞产生细胞毒性，所有病毒对SK-OV-3和Vero-GCN4R均产生了细胞毒性，这与该病毒未重新靶向GCN4R的事实一致。
序列
SEQ ID NO:1：HSV-1gD野生型前体的氨基酸序列(人疱疹病毒1型F株，GenBank登录号：GU734771.1；位置138281至139465编码gD)。
SEQ ID NO:2：R-87的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3：gD前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，所述序列在切割信号序列(由氨基酸1-25形成的)后在成熟gD的氨基酸24和25之间插入GCN4肽并且插入针对HER2受体的scFV以取代成熟gD的氨基酸35至39，其由构建体R-87编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:4：R-89的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5：gD前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，所述序列在成熟gD的氨基酸24和25之间插入GCN4肽并且插入针对HER2受体的scFV以取代成熟gD的氨基酸214-223，其由构建体R-89编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:6：R-97的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7：gD前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，所述序列在成熟gD的氨基酸24和25之间插入针对HER2受体的scFv并且插入GCN4肽以取代成熟gD的氨基酸35至39，其由构建体R-97编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:8：R-99的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9：gD前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，所述序列在成熟gD的氨基酸24和25之间插入针对HER2受体的scFv并且插入GCN4肽以取代成熟gD的氨基酸214至223，其由构建体R-99编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:10：R-99-2的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11：gD前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，所述序列在成熟gD的氨基酸24和25之间插入针对HER2受体的scFv并且插入GCN4肽以取代成熟gD的氨基酸219至223，其由构建体R-99-2编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:12：GCN4肽-包括括入上游和下游GS接头的GCN4肽的氨基酸序列。GCN4表位为YHLENEVARLKK(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/15811626/)。
SEQ ID NO:13：GCN4表位。
SEQ ID NO:14：GCN4酵母转录因子UniProtKB–P03069的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15：Genbank登录号AJ585687.1(编码GCN4酵母转录因子的基因)。
SEQ ID NO:16：侧接两个接头EN和SSGGGSGSGGS的scFv HER2表达盒的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17：针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列，其包含N-末端前导肽、HA标签序列、短GA接头和scFv序列。
SEQ ID NO:18：由SEQ ID NO:19编码的氨基酸序列；能够与GCN4肽结合的scFv的氨基酸序列包含N-末端前导肽、HA标签序列、短GA接头、氨基酸33至275的scFv序列、短GSGA接头和人粘连蛋白-1(PVRL1)残基Met143至Val517。
SEQ ID NO:19：编码scFv-GCN4-粘连蛋白-1嵌合体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20：引物gD24_galK_f
SEQ ID NO:21：引物gD25_galK_r
SEQ ID NO:22：引物galK_827_f
SEQ ID NO:23：引物galK_1142_r
SEQ ID NO:24：GCN4肽表达盒–包括括入上游和下游GS接头(ggatcc和ggcagc)的GCN4肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25：引物gD24_GCN4_fB
SEQ ID NO:26：引物gD25_GCN4_rB
SEQ ID NO:27：R-81的嵌合gD-GCN4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28：在成熟gD的氨基酸24和25之间插入了GCN4肽的gD前体(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列，其由构建体R-81编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:29：引物gD_ext_f
SEQ ID NO:30：引物gD_ext_r
SEQ ID NO:31：引物galK_gD35_F
SEQ ID NO:32：引物galK_gD39_R
SEQ ID NO:33：scFv HER2表达盒的核苷酸序列
SEQ ID NO:34：引物gD-34-scFvHER2-F
SEQ ID NO:35：引物gD-40-scFvHER2-R
SEQ ID NO:36：引物scFv_456_r
SEQ ID NO:37：引物galK_gD214_F
SEQ ID NO:38：引物galK_gD223_R
SEQ ID NO:39：引物gD213-scFvHER2f
SEQ ID NO:40：引物gD224-scFvHER2r
SEQ ID NO:41：引物gDintforw
SEQ ID NO:42：引物gD24-scFvHer2-F
SEQ ID NO:43：引物gD25-scFvHer2-R
SEQ ID NO:44：引物gD213-GCN4-F
SEQ ID NO:45：引物gD224-GCN4-R
SEQ ID NO:46：引物HSV_139688_r
SEQ ID NO:47：引物gD35-galK-F
SEQ ID NO:48：引物gD39-galK-R
SEQ ID NO:49：引物gD35-GCN4-F
SEQ ID NO:50：引物gD39-GCN4-R
SEQ ID NO:51：引物scFv4D5 651_f
SEQ ID NO:52：引物gDintrev
SEQ ID NO:53：引物gD219-GCN4-F
实施例
实施例1：HSV重组体R-87、R-89、R-97、R-99、R-99-2的构建，所述HSV重组体表达基因修饰形式的gD，携带(i)插入gD的AA 24和25之间(R-87和R-89)，或取代AA 35-39(R-97)，或取代AA 214-223(R-99)，或取代AA 219-223(R-99-2)的GCN4肽；(ii)缺失gD的AA 35-39(R-87)，缺失gD的AA 214-223(R-89和R-99)，缺失gD的AA 219-223(R-99-2)；(iii)使用针对HER2的scFv取代AA 35-39的缺失序列(R-87)和取代AA 214-223的缺失序列(R-89)；(iv)插入在gD的AA 24和25之间的针对HER2的scFv(R-97、R-99和R-99-2)。
A)作为工程改造R-87和R-89的准备步骤，发明人构建了R-81，其携带插入HSV gD的AA 24和25之间的GCN4肽。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码GCN4肽的序列，工程改造了R-81。
起始基因组为BAC LM55，其携带插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和eGFP序列(Menotti等，2008)。通过galK重组工程进行工程改造。简言之，为了在gD中插入GCN4肽，以pGalK作为模板，使用引物gD24_galK_fCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:20)和gD25_galK_rTGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQID NO:21)扩增具有针对gD同源臂的galK表达盒。在携带BAC LM55BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_fGCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ ID NO:22)和galK_1142_rTATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过使用引物gD24_GCN4_fB CTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:25)和gD25_GCN4_rB TGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:26)进行退火和延伸，产生具有下游和上游Ser-Gly接头并且由gD的同源臂括起的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:24，编码SEQ ID NO:12)，其引入了BamHI核酸内切酶的沉默限制性位点，可用于通过限制性分析筛选菌落。重组基因组(SEQ ID NO:27)编码嵌合gD(SEQ ID NO:28)，其携带GCN4肽，所述GCN4肽包括具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆GCN4肽进行选择。使用引物gD_ext_fTCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(SEQ ID NO:29)和gD_ext_r GAGTTTGATACCAGACTGACCGTG(SEQ ID NO:30)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
B)R-87
在HSV gD的AA 24和25之间插入GCN4肽，使用针对HER2受体的scFv取代缺失的AA35-39。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码GCN4肽的序列，并使用scFv取代缺失的AA 35-39工程改造了R-87(图1)。
起始基因组为BAC 81，其携带在HSV gD的AA 24和25之间的GCN4肽，如上文所述的插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和EGFP序列。通过galK重组工程进行工程改造。简言之，为了在gDΔAA 35-39中插入scFv，以pGalK作为模板，通过引物galK_gD35_F TGAAGAAGCTGGTGGGCAGCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:31)和galK_gD39_R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:32)扩增具有针对gD同源臂的galK表达盒。在携带BAC 81BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ IDNO:22)和galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQ ID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过引物gD-34-scFvHER2-F TGAAGAAGCTGGTGGGCAGCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCGAGAATTCCGATATCCAGAT(SEQ ID NO:34)和gD-40-scFvHER2-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATGGATCCACCGGAACCAGAGC(SEQ ID NO:35)扩增由gD的同源臂括起的scFv HER2表达盒(SEQ ID NO:33，编码SEQ ID NO:16)。重组基因组(SEQ IDNO:2)编码嵌合gD(SEQ ID NO:3)，其携带在位置24至25中包括具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头的GCN4肽和取代AA 35至39的针对HER2受体的scFv。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物gD_ext_f TCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(SEQ ID NO:29)和scFv_456_r AGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(SEQ ID NO:36)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
为重新构建重组病毒R-87，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至Vero-GCN4R细胞系和SK-OV-3细胞系，然后在这些细胞中对其进行培养。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对整个gD进行测序确证重组体的结构。在Vero-GCN4R细胞中产生病毒原液并在Vero-GCN4R和SK-OV-3中对其进行滴定。
C)R-89
在HSV gD的AA 24和25之间插入GCN4肽，使用针对HER2受体的scFv取代缺失的AA214至223。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码GCN4肽的序列，并使用针对HER2的scFv取代缺失的AA 214-223工程改造了R-89(图1)。
起始基因组为BAC 81，其携带在HSV gD的AA 24和25之间的GCN4肽，如上文所述的插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和EGFP序列。通过galK重组工程进行工程改造。简言之，为了在gDΔAA 214-223中插入scFv，以pGalK作为模板，通过引物galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:37)和galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:38)扩增具有针对gD同源臂的galK表达盒。在携带BAC81BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ IDNO:22)和galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQ ID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过引物gD213-scFvHER2f CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCGAGAATTCCGATATCCAGAT(SEQ ID NO:39)和gD224-scFvHER2r CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGGATCCACCGGAACCAGAGC(SEQ ID NO:40)扩增由gD的同源臂括起的scFv HER2表达盒(SEQ ID NO:33，编码SEQ ID NO:16)。重组基因组(SEQ ID NO:4)编码嵌合gD(SEQ ID NO:5)，其携带在位置24至25中包括具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头的GCN4肽和取代AA 214至223的针对HER2受体的scFv。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物gDintforw CCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(SEQ ID NO:41)和scFv_456_r AGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(SEQ ID NO:36)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
为重新构建重组病毒R-89，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至Vero-GCN4R细胞系和SK-OV-3细胞系，然后在这些细胞中对其进行培养。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对整个gD进行测序确证重组体的结构。在Vero-GCN4R细胞中产生病毒原液并在Vero-GCN4R和SK-OV-3中对其进行滴定。
D)R-97
在HSV gD的AA 24和25之间插入针对HER2受体的scFv，使用GCN4肽取代缺失的AA35-39。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码针对HER2受体的scFv的序列，并使用GCN4肽取代缺失的AA 35-39工程改造了R-97(图1)。
起始基因组为BAC LM55，其携带插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和EGFP序列(Menotti等，2008)。通过galK重组工程进行工程改造。简言之，为了在gD中插入scFv，如在上述R-81中所述，在AA 24和25之间插入galK表达盒。接下来，通过引物gD24-scFvHer2-F CTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCGAGAATTCCGATATCCAGATG(SEQ ID NO:42)和gD25-scFvHer2-R TGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGGGATCCACCGGAACCAGAGC(SEQ ID NO:43)扩增由gD的同源臂括起的scFv HER2表达盒(SEQ ID NO:33，编码SEQ ID NO:16)。重组基因组(BAC 91)编码嵌合gD，其在AA 24至25之间携带针对HER2受体的scFv。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物gD_ext_f TCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(SEQ ID NO:29)和scFv_456_rAGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(SEQ ID NO:36)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
然后，为了在gDΔAA 35-39中插入GCN4肽，以pGalK作为模板，通过引物gD35-galK-F GCTCTGGTTCCGGTgGaTCCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:47)和gD39-galK-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:48)扩增具有针对gD的同源臂的galK表达盒。在携带BAC 91BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ ID NO:22)和galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQ ID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过引物gD35-GCN4-F GCTCTGGTTCCGGTgGaTCCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:49)和gD39-GCN4-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:50)扩增具有由gD的同源臂括起的下游和上游Ser-Gly接头的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:24，编码SEQ ID NO:12)。重组基因组(SEQID NO:6)编码嵌合gD(SEQ ID NO:7)，其携带在AA 24至25之间的针对HER2受体的scFv和包括取代AA 35至39的具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头的GCN4肽。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物scFv4D5 651_fGGACACTGCCGTCTATTATTGTAGCCGCT(SEQ ID NO:51)和引物gDintrevCCAGTCGTTTATCTTCACGAGCCG(SEQ ID NO:52)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。为重新构建重组病毒R-97，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至Vero-GCN4R细胞系和SK-OV-3细胞系，然后在这些细胞中对其进行培养。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对整个gD进行测序确证重组体的结构。
E)R-99
在HSV gD的AA 24和25之间插入针对HER2受体的scFv，使用GCN4肽取代缺失的AA214-223。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码针对HER2受体的scFv的序列，并使用GCN4肽取代缺失的AA214-223工程改造了R-99(图1)。
起始基因组为BAC 91，其携带在gD的AA 24和25之间的针对HER2受体的scFv，插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和EGFP序列，其构建如上文所述。为了在gDΔAA 214-223中插入GCN4肽，以pGalK作为模板，通过引物galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ IDNO:37)和galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:38)扩增具有针对gD的同源臂的galK表达盒。在携带BAC91BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mMKH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ ID NO:22)和galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQ ID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过引物gD213-GCN4-F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:44)和gD224-GCN4-RCTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:45)扩增具有由gD的同源臂括起的下游和上游Ser-Gly接头的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:24，编码SEQ ID NO:12)。重组基因组(SEQ ID NO:8)编码嵌合gD(SEQ ID NO:9)，其携带在AA 24至25之间的针对HER2受体的scFv和包括取代AA 214至223的具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头的GCN4肽。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mMMgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物gDintforwCCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(SEQ ID NO:41)和HSV_139688_rCCGACTTATCGACTGTCCACCTTTCCC(SEQ ID NO:46)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
为重新构建重组病毒R-99，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至Vero-GCN4R细胞系和SK-OV-3细胞系，然后在这些细胞中对其进行培养。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对整个gD进行测序确证重组体的结构。在Vero-GCN4R细胞中产生病毒原液并在Vero-GCN4R和SK-OV-3中对其进行滴定。
F)R-99-2
在HSV gD的AA 24和25之间插入针对HER2受体的scFv，使用GCN4肽取代缺失的AA219-223。
发明人通过在成熟gD的AA 24和25(对应于切割信号序列前含AA 1至25的前体gD的AA 49和50)之间插入编码针对HER2受体的scFv的序列，并使用GCN4肽取代缺失的AA219-223工程改造了R-99-2(图1)。
起始基因组为BAC 91，其携带在gD的AA 24和25之间的针对HER2受体的scFv，插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P-括起的pBeloBAC11和EGFP序列，其构建如上文所述。为了在gDΔAA 219-223中插入GCN4肽，以pGalK作为模板，通过引物galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ IDNO:37)和galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:38)扩增具有针对gD的同源臂的galK表达盒。在携带BAC91BG的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mMKH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并使用引物galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(SEQ ID NO:22)和galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(SEQ ID NO:23)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过引物gD219-GCN4-F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGG(SEQ ID NO:53)和gD224-GCN4-R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:45)扩增具有由gD的同源臂括起的下游和上游Ser-Gly接头的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:24，编码SEQ ID NO:12)。重组基因组(SEQ ID NO:10)编码嵌合gD(SEQ ID NO:11)，其携带在AA 24至25之间的针对HER2受体的scFv和包括取代AA 219至223的具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头的GCN4肽。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择序列的插入的重组克隆进行选择。使用引物gDintforwCCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(SEQ ID NO:41)和HSV_139688_rCCGACTTATCGACTGTCCACCTTTCCC(SEQ ID NO:46)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择序列。
为重新构建重组病毒R-99-2，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至Vero-GCN4R细胞系和SK-OV-3细胞系，然后在这些细胞中对其进行培养。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对整个gD进行测序确证重组体的结构。
实施例2：R-87针对Vero-GCN4R以及针对HER-2阳性SK-OV-3和J-HER2细胞的双重嗜性。
此前已表明，在gD中插入scFv-HER2使得重组病毒R-LM113能够通过HER2受体进入细胞，并且表明由于AA 6-38之间gD区域的缺失，R-LM113从天然gD受体粘连蛋白-1和HVEM去靶向。
为了确证在gD的AA 24和25之间插入GCN4肽是否能够使得R-87感染Vero-GCN4R细胞，发明人使用了Vero-GCN4R细胞系，并且为了进行比较使用了其wt对应物wt-Vero。为了确证R-87能够通过HER2受体进行感染，发明人使用了J-HER2细胞(其表达HER2作为唯一的受体)以及HER2-阳性癌细胞SK-OV-3细胞。为了确证R-87从粘连蛋白-1和HVEM去靶向，发明人使用了J-粘连蛋白-1和J-HVEM，其仅表达所示受体。使用在SK-OV-3(图2A)或在Vero-GCN4R(图2B)细胞中培养的R-87感染细胞。如所示的，在存在浓度为28μg/ml的针对HER2的MAb(称为赫赛汀)的条件下进行感染。以1PFU/细胞进行感染并于24小时后使用荧光显微镜进行监测。如图2A和2B中所示，R-87感染Vero-GCN4R、J-HER2和SK-OV-3细胞。R-87还感染wt-Vero细胞，正如预期的那样，这些细胞表达HER-2的猿猴直系同源物。J-HER2、SK-OV-3、wt-Vero的感染被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过HER2发生。而相反的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过GCN4肽而不通过HER2发生。无论R-87是在SK-OV-3还是在Vero-GCN4R细胞中生长，均无法区分感染模式，这清楚地表明R-87的感染特异性未根据其在一种或在另一种细胞系中培养而被改变。
实施例3：R-89针对Vero-GCN4R以及针对HER-2阳性SK-OV-3和J-HER2细胞的双重嗜性。
为了确证在gD的AA 24和25之间插入GCN4肽是否能够使得R-89感染Vero-GCN4R细胞，发明人使用了Vero-GCN4R细胞系，并且为了进行比较使用了其wt对应物wt-Vero。为了确证R-89能够通过HER2受体进行感染，发明人使用了J-HER2细胞(其表达HER2作为唯一的受体)以及HER2-阳性癌细胞SK-OV-3细胞。为了确证R-89从粘连蛋白-1和HVEM去靶向，发明人使用了J-粘连蛋白-1和J-HVEM，其仅表达所示受体。使用在SK-OV-3(图3A)或在Vero-GCN4R(图3B)细胞中培养的R-89感染细胞。如所示的，在存在浓度为28μg/ml的针对HER2的MAb(称为赫赛汀)的条件下进行感染。以1PFU/细胞进行感染并于24小时后使用荧光显微镜进行监测。如图3A和3B中所示，R-89感染Vero-GCN4R、J-HER2和SK-OV-3细胞。R-89对wt-Vero细胞和J-HER2的感染较差。SK-OV-3、wt-Vero和J-HER2的感染被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过HER2发生。而相反的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过GCN4肽而不通过HER2发生。无论R-89是在SK-OV-3还是在Vero-GCN4R细胞中生长，均无法区分感染模式，这清楚地表明R-89的感染特异性未根据其在一种或在另一种细胞系中培养而被改变。
实施例4：R-97针对Vero-GCN4R以及针对HER-2阳性SK-OV-3和J-HER2细胞的双重嗜性。
为了确证插入GCN4肽以取代gD的AA 35-39是否能够使得R-97感染Vero-GCN4R细胞，发明人使用了Vero-GCN4R细胞系，并且为了进行比较使用了其wt对应物wt-Vero。为了确证R-97能够通过HER2受体进行感染，发明人使用了J-HER2细胞(其表达HER2作为唯一的受体)以及HER2-阳性癌细胞SK-OV-3细胞。为了确证R-97从粘连蛋白-1和HVEM去靶向，发明人使用了J-粘连蛋白-1和J-HVEM，其仅表达所示受体。使用在SK-OV-3细胞中培养的R-97感染细胞。如所示的，在存在浓度为28μg/ml的针对HER2的MAb(称为赫赛汀)的条件下进行感染。以1PFU/细胞进行感染并于24小时后使用荧光显微镜进行监测。如图4中所示，R-97感染Vero-GCN4R、J-HER2和SK-OV-3细胞。R-97还感染wt-Vero细胞，正如预期的那样，这些细胞表达HER-2的猿猴直系同源物。J-HER2、SK-OV-3、wt-Vero的感染被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过HER2发生。而相反的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过GCN4肽而不通过HER2发生。
实施例5：R-99针对Vero-GCN4R以及针对HER-2阳性SK-OV-3和J-HER2细胞的双重嗜性。
为了确证插入GCN4肽以取代gD的AA 214-223是否能够使得R-99感染Vero-GCN4R细胞，发明人使用了Vero-GCN4R细胞系，并且为了进行比较使用了其wt对应物wt-Vero。为了确证R-99能够通过HER2受体进行感染，发明人使用了J-HER2细胞(其表达HER2作为唯一的受体)以及HER2-阳性癌细胞SK-OV-3细胞。为了确证R-99从粘连蛋白-1和HVEM去靶向，发明人使用了J-粘连蛋白-1和J-HVEM，其仅表达所示受体。使用在SK-OV-3(图5A)或在Vero-GCN4R(图5B)细胞中培养的R-99感染细胞。如所示的，在存在浓度为28μg/ml的针对HER2的MAb(称为赫赛汀)的条件下进行感染。以1PFU/细胞进行感染并于24小时后使用荧光显微镜进行监测。如图5A中所示，R-99感染Vero-GCN4R、J-HER2和SK-OV-3细胞。R-99还感染wt-Vero细胞，正如预期的那样，这些细胞表达HER-2的猿猴直系同源物。J-HER2、SK-OV-3、wt-Vero的感染被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过HER2发生。而相反的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过GCN4肽而不通过HER2发生。
实施例6：R-99-2针对Vero-GCN4R以及针对HER-2阳性SK-OV-3和J-HER2细胞的双重嗜性。
为了确证插入GCN4肽以取代gD的AA 219-223是否能够使得R-99-2感染Vero-GCN4R细胞，发明人使用了Vero-GCN4R细胞系，并且为了进行比较使用了其wt对应物wt-Vero。为了确证R-99-2能够通过HER2受体进行感染，发明人使用了J-HER2细胞(其表达HER2作为唯一的受体)以及HER2-阳性癌细胞SK-OV-3细胞。为了确证R-99-2从粘连蛋白-1和HVEM去靶向，发明人使用了J-粘连蛋白-1和J-HVEM，其仅表达所示受体。使用在SK-OV-3细胞中培养的R-99-2感染细胞(图6)。如所示的，在存在浓度为28μg/ml的针对HER2的MAb(称为赫赛汀)的条件下进行感染。以1PFU/细胞进行感染并于24小时后使用荧光显微镜进行监测。如图6中所示，R-99-2感染Vero-GCN4R、J-HER2和SK-OV-3细胞。R-99-2还感染wt-Vero细胞，正如预期的那样，这些细胞表达HER-2的猿猴直系同源物。J-HER2、SK-OV-3、wt-Vero的感染被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过HER2发生。而相反的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，这表明所述感染通过GCN4肽而不通过HER2发生。
实施例7：与重组体R-LM113相比，R-87、R-89和R-99在SK-OV-3(A)和在Vero-GCN4R(B)细胞中的复制程度，所述重组体R-LM113携带在gD中的针对HER2的scFv，其取代AA 6-38之间的缺失。
发明人在SK-OV-3(图7A)或在Vero-GCN4R细胞(图7B)中将R-87、R-89和R-99的复制程度与R-LM113进行了比较。R-LM113病毒携带插入gD中以取代序列6-38的scFv-HER2，并且不携带GCN4肽。在37℃下，以MOI 0.1PFU/细胞，使用所示病毒(在各细胞系中滴定接种物)感染SK-OV-3(A)或Vero-GCN4R(B)细胞90min。通过酸洗(40mM柠檬酸，10mM KCl，135mMNaCl[pH 3])的方式将未吸附的病毒灭活。在感染后的指定时间(24和48小时)冷冻复制培养物，并且在SK-OV-3细胞中对子代进行滴定。从图7A和7B中可以看出，R-87以与R-LM113相似的滴度生长。而相反的是，在24小时时，R-89的生长比R-87低约1-2个对数。R-99以中等水平生长。
发明人测定了子代病毒释放到SK-OV-3(C)或Vero-GCN4R(D)细胞胞外培养基中的程度，其分别以如图A和B中所示的实验以0.1PFU/细胞进行感染。在感染后48小时，以总裂解物加培养基(内+外)形式冷冻复制培养物。或者，将培养基(外)和细胞相关(内)组分分离并冷冻。在SK-OV-3细胞中滴定子代病毒。可以看出的是，所有三种病毒在胞外培养基中的子代释放效率相似。
实施例8：R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2在不同细胞系中的植板效率。
发明人比较了R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2在不同细胞系中形成噬斑的能力，针对噬斑尺寸(图8A)和噬斑数(图8B)。(A)在Vero-GCN4R、wt-Vero、SK-OV-3细胞中铺板复制等份的R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2。显示了在不同细胞中R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2的相对噬斑尺寸的典型实例。通过该参数，R-87和R-89在Vero-GCN4R以及在SK-OV-3细胞中表现出最大的噬斑尺寸。(B)在Vero-GCN4R、wt-Vero、SK-OV-3细胞中铺板复制等份的R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2。3天后对噬斑数评分。对于每种病毒，以相对于在SK-OV-3细胞中评分的噬斑数(设为等于100)来表示在给定细胞系中评分的噬斑数。可以看出，R-87、R-89、R-97、R-99和R-99-2在Vero-GCN4R细胞中显示出较高的噬斑数。
实施例9：以8 x 103个细胞/孔将SK-OV-3(A)和Vero-GCN4R(B)接种在96孔板中，并且在37℃下暴露于R-87、R-89、R-99和用于比较的R-LM113或假性感染90min。SK-OV-3和Vero-GCN4R的输入感染复数(根据在对应细胞系中所滴定的)为3PFU/细胞。在感染后的指定天数将Alamar-Blue(10μl/孔，Life Technologies)加入培养基，并且在37℃下孵育4小时，随后读板。用GloMax Discover System(Promega)在560和600nm处读板。对于各时间点，细胞活力表示为感染细胞相对于未感染细胞AlamarBlue减少的百分比，每个样品中排除培养基的单独贡献。除了R-LM113对Vero-GCN4R细胞具有非常低的细胞毒性(这与R-LM113不能重新靶向该细胞一致)以外，所有病毒对SK-OV-3和Vero-GCN4R细胞具有相似的细胞毒性。
参考文献
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序列表
<110> 大学之母 博洛尼亚大学
<120> 具有经修饰的糖蛋白D的疱疹病毒
<130> U70628PC
<150> EP 16173830.7
<151> 2016-06-09
<150> EP 17000247.1
<151> 2017-02-15
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> 单纯疱疹病毒1
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65 70 75 80
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> R-87的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列
<400> 2
atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60
catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120
cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgga tccaagaact accacctgga gaacgaggtg 180
gccagactga agaagctggt gggcagcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtcgag 240
aattccgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 300
gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag 360
aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc 420
ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 480
cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc 540
ggacagggta ccaaggtgga gatcaaatcg gatatgccga tggctgatcc gaaccgtttc 600
cgcggtaaga acctggtttt tcattctgag gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg 660
gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac 720
acctatatac actgggtgcg tcaggccccg ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt 780
tatcctacga atggttatac tagatatgcc gatagcgtca agggccgttt cactataagc 840
gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact 900
gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg gacggcttct atgctatgga ctactggggt 960
caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt ggcggtggct ctggttccgg tggatccatc 1020
caggcgggcc taccagaccc gttccagccc cccagcctcc cgatcacggt ttactacgcc 1080
gtgttggagc gcgcctgccg cagcgtgctc ctaaacgcac cgtcggaggc cccccagatt 1140
gtccgcgggg cctccgaaga cgtccggaaa caaccctaca acctgaccat cgcttggttt 1200
cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgctcctac 1260
aacaagtctc tgggggcctg tcccatccga acgcagcccc gctggaacta ctatgacagc 1320
ttcagcgccg tcagcgagga taacctgggg ttcctgatgc acgcccccgc gtttgagacc 1380
gccggcacgt acctgcggct cgtgaagata aacgactgga cggagattac acagtttatc 1440
ctggagcacc gagccaaggg ctcctgtaag tacgccctcc cgctgcgcat ccccccgtca 1500
gcctgcctgt ccccccaggc ctaccagcag ggggtgacgg tggacagcat cgggatgctg 1560
ccccgcttca tccccgagaa ccagcgcacc gtcgccgtat acagcttgaa gatcgccggg 1620
tggcacgggc ccaaggcccc atacacgagc accctgctgc ccccggagct gtccgagacc 1680
cccaacgcca cgcagccaga actcgccccg gaagaccccg aggattcggc cctcttggag 1740
gaccccgtgg ggacggtggc gccgcaaatc ccaccaaact ggcacatacc gtcgatccag 1800
gacgccgcga cgccttacca tcccccggcc accccgaaca acatgggcct gatcgccggc 1860
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cgccgcactc aaaaagcccc aaagcgcata cgcctccccc acatccggga agacgaccag 1980
ccgtcctcgc accagccctt gttttactag 2010
<210> 3
<211> 669
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 插入GCN4肽和针对HER2受体的scFV的gD前体的氨基酸序列，由构建体R-87编码。
<400> 3
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1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
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65 70 75 80
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180 185 190
Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
245 250 255
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260 265 270
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
275 280 285
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355 360 365
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Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr
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485 490 495
Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val
500 505 510
Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln
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Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser
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Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly
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caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840
gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900
ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtcgga 960
tccaagaact accacctgga gaacgaggtg gccagactga agaagctggt gggcagcatc 1020
caggcgggcc taccagaccc gttccagccc cccagcctcc cgatcacggt ttactacgcc 1080
gtgttggagc gcgcctgccg cagcgtgctc ctaaacgcac cgtcggaggc cccccagatt 1140
gtccgcgggg cctccgaaga cgtccggaaa caaccctaca acctgaccat cgcttggttt 1200
cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgctcctac 1260
aacaagtctc tgggggcctg tcccatccga acgcagcccc gctggaacta ctatgacagc 1320
ttcagcgccg tcagcgagga taacctgggg ttcctgatgc acgcccccgc gtttgagacc 1380
gccggcacgt acctgcggct cgtgaagata aacgactgga cggagattac acagtttatc 1440
ctggagcacc gagccaaggg ctcctgtaag tacgccctcc cgctgcgcat ccccccgtca 1500
gcctgcctgt ccccccaggc ctaccagcag ggggtgacgg tggacagcat cgggatgctg 1560
ccccgcttca tccccgagaa ccagcgcacc gtcgccgtat acagcttgaa gatcgccggg 1620
tggcacgggc ccaaggcccc atacacgagc accctgctgc ccccggagct gtccgagacc 1680
cccaacgcca cgcagccaga actcgccccg gaagaccccg aggattcggc cctcttggag 1740
gaccccgtgg ggacggtggc gccgcaaatc ccaccaaact ggcacatacc gtcgatccag 1800
gacgccgcga cgccttacca tcccccggcc accccgaaca acatgggcct gatcgccggc 1860
gcggtgggcg gcagtctcct ggcagccctg gtcatttgcg gaattgtgta ctggatgcgc 1920
cgccgcactc aaaaagcccc aaagcgcata cgcctccccc acatccggga agacgaccag 1980
ccgtcctcgc accagccctt gttttactag 2010
<210> 7
<211> 669
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 插入针对HER2受体的scFV和GCN4肽的gD前体的氨基酸序列，由构建体R-97编码。
<400> 7
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
50 55 60
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
65 70 75 80
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
85 90 95
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
100 105 110
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
115 120 125
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
130 135 140
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
145 150 155 160
Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val
165 170 175
Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
180 185 190
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
210 215 220
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
225 230 235 240
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
245 250 255
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
260 265 270
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
275 280 285
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Gly
305 310 315 320
Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu
325 330 335
Val Gly Ser Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser
340 345 350
Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser
355 360 365
Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala
370 375 380
Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe
385 390 395 400
Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr
405 410 415
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420 425 430
Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn
435 440 445
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450 455 460
Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile
465 470 475 480
Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg
485 490 495
Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly
610 615 620
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625 630 635 640
Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg
645 650 655
Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
660 665
<210> 8
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> R-99的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列
<400> 8
atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60
catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120
cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgag aattccgata tccagatgac ccagtccccg 180
agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat 240
gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt 300
tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg 360
acggatttca ctctgaccat cagcagtctg cagccggaag acttcgcaac ttattactgt 420
cagcaacatt atactactcc tcccacgttc ggacagggta ccaaggtgga gatcaaatcg 480
gatatgccga tggctgatcc gaaccgtttc cgcggtaaga acctggtttt tcattctgag 540
gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 600
tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgcg tcaggccccg 660
ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt tatcctacga atggttatac tagatatgcc 720
gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta 780
caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840
gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900
ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 960
cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 1020
acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 1080
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accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 1200
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cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 1380
attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 1440
cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 1500
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gccccataca cgagcaccct gctgcccccg gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag 1680
ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg 1740
gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct 1800
taccatcccc cggccacccc gaacaacatg ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt 1860
ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa 1920
gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag 1980
cccttgtttt actag 1995
<210> 9
<211> 664
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 插入针对HER2受体的scFV和GCN4肽的gD前体的氨基酸序列，由构建体R-99编码。
<400> 9
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
50 55 60
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
65 70 75 80
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
85 90 95
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
100 105 110
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
115 120 125
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
130 135 140
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
145 150 155 160
Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val
165 170 175
Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
180 185 190
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
210 215 220
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
225 230 235 240
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
245 250 255
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
260 265 270
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
275 280 285
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg
305 310 315 320
Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro
325 330 335
Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg
340 345 350
Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly
355 360 365
Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr
385 390 395 400
Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr
405 410 415
Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp
420 425 430
Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr
435 440 445
Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe
450 455 460
Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu
465 470 475 480
Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly
485 490 495
Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Gly Ser Lys Asn
500 505 510
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser
515 520 525
Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr
530 535 540
Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln
545 550 555 560
Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp
565 570 575
Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro
580 585 590
Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn
595 600 605
Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala
610 615 620
Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gln Lys
625 630 635 640
Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro
645 650 655
Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
660
<210> 10
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> R-99-2的嵌合gD-GCN4，scFv HER2的核苷酸序列
<400> 10
atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60
catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120
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gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt 300
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gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta 780
caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840
gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900
ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 960
cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 1020
acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 1080
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cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 1500
agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcggatccaa gaactaccac 1560
ctggagaacg aggtggccag actgaagaag ctggtgggca gctacagctt gaagatcgcc 1620
gggtggcacg ggcccaaggc cccatacacg agcaccctgc tgcccccgga gctgtccgag 1680
acccccaacg ccacgcagcc agaactcgcc ccggaagacc ccgaggattc ggccctcttg 1740
gaggaccccg tggggacggt ggcgccgcaa atcccaccaa actggcacat accgtcgatc 1800
caggacgccg cgacgcctta ccatcccccg gccaccccga acaacatggg cctgatcgcc 1860
ggcgcggtgg gcggcagtct cctggcagcc ctggtcattt gcggaattgt gtactggatg 1920
cgccgccgca ctcaaaaagc cccaaagcgc atacgcctcc cccacatccg ggaagacgac 1980
cagccgtcct cgcaccagcc cttgttttac tag 2013
<210> 11
<211> 670
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 插入针对HER2受体的scFV和GCN4肽的gD前体的氨基酸序列，由构建体R-99-2编码。
<400> 11
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
50 55 60
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
65 70 75 80
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
85 90 95
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
100 105 110
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
115 120 125
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
130 135 140
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
145 150 155 160
Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val
165 170 175
Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
180 185 190
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
210 215 220
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
225 230 235 240
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
245 250 255
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
260 265 270
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
275 280 285
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg
305 310 315 320
Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro
325 330 335
Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg
340 345 350
Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly
355 360 365
Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr
385 390 395 400
Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr
405 410 415
Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp
420 425 430
Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr
435 440 445
Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe
450 455 460
Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu
465 470 475 480
Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly
485 490 495
Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn
500 505 510
Gln Arg Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu
515 520 525
Lys Lys Leu Val Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly
530 535 540
Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu
545 550 555 560
Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
565 570 575
Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro
580 585 590
Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His
595 600 605
Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly
610 615 620
Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met
625 630 635 640
Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile
645 650 655
Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
660 665 670
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4肽
<400> 12
Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10 15
Leu Val Gly Ser
20
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4表位
<400> 13
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 281
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 14
Met Ser Glu Tyr Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu Asn Pro Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Pro Leu Asp Gly Ser Lys Ser Thr Asn Glu Asn Val Ser Ala Ser
20 25 30
Thr Ser Thr Ala Lys Pro Met Val Gly Gln Leu Ile Phe Asp Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Thr Glu Glu Asp Pro Ile Ile Lys Gln Asp Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Leu Asp Phe Asp Phe Ala Leu Pro Gln Thr Ala Thr Ala Pro Asp Ala
65 70 75 80
Lys Thr Val Leu Pro Ile Pro Glu Leu Asp Asp Ala Val Val Glu Ser
85 90 95
Phe Phe Ser Ser Ser Thr Asp Ser Thr Pro Met Phe Glu Tyr Glu Asn
100 105 110
Leu Glu Asp Asn Ser Lys Glu Trp Thr Ser Leu Phe Asp Asn Asp Ile
115 120 125
Pro Val Thr Thr Asp Asp Val Ser Leu Ala Asp Lys Ala Ile Glu Ser
130 135 140
Thr Glu Glu Val Ser Leu Val Pro Ser Asn Leu Glu Val Ser Thr Thr
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Thr Pro Val Leu Glu Asp Ala Lys Leu Thr Gln Thr
165 170 175
Arg Lys Val Lys Lys Pro Asn Ser Val Val Lys Lys Ser His His Val
180 185 190
Gly Lys Asp Asp Glu Ser Arg Leu Asp His Leu Gly Val Val Ala Tyr
195 200 205
Asn Arg Lys Gln Arg Ser Ile Pro Leu Ser Pro Ile Val Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Asp Pro Ala Ala Leu Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys
245 250 255
Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
260 265 270
Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
275 280
<210> 15
<211> 846
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 15
atgtccgaat atcagccaag tttatttgct ttaaatccaa tgggtttctc accattggat 60
ggttctaaat caaccaacga aaatgtatct gcttccactt ctactgccaa accaatggtt 120
ggccaattga tttttgataa attcatcaag actgaagagg atccaattat caaacaggat 180
accccttcga accttgattt tgattttgct cttccacaaa cggcaactgc acctgatgcc 240
aagaccgttt tgccaattcc ggagctagat gccgctgtag tggaatcttt cttttcgtca 300
agcactgatt caactccaat gtttgagtat gaaaacctag aagacaactc taaagaatgg 360
acatccttgt ttgacaatga cattccagtt accactgacg atgtttcatt ggctgataag 420
gcaattgaat ccactgaaga agtttctctg gtaccatcca atctggaagt ctcgacaact 480
tcattcttac ccactcctgt tctagaagat gctaaactga ctcaaacaag aaaggttaag 540
aaaccaaatt cagtcgttaa gaagtcacat catgttggaa aggatgacga atcgagactg 600
gatcatctag gtgttgttgc ttacaaccgc aaacagcgtt cgattccact ttctccaatt 660
gtgcccgaat ccagtgatcc tgctgctcta aaacgtgcta gaaacactga agccgccagg 720
cgttctcgtg cgagaaagtt gcaaagaatg aaacaacttg aagacaaggt tgaagaattg 780
ctttcgaaaa attatcactt ggaaaatgag gttgccagat taaagaaatt agttggcgaa 840
cgctga 846
<210> 16
<211> 260
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv HER2表达盒的氨基酸序列
<400> 16
Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
20 25 30
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr
85 90 95
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp
100 105 110
Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe
115 120 125
His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
145 150 155 160
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Ser
260
<210> 17
<211> 275
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
50 55 60
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
65 70 75 80
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
100 105 110
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
115 120 125
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
180 185 190
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
245 250 255
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
260 265 270
Val Ser Ser
275
<210> 18
<211> 654
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 包含人粘连蛋白-1残基的针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列
<400> 18
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
50 55 60
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
65 70 75 80
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
100 105 110
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
115 120 125
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
180 185 190
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
245 250 255
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Gly Ala Met Ala Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu
275 280 285
Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val
290 295 300
Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn Gly Lys Pro Pro Ser Val Val
305 310 315 320
Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg
325 330 335
Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu Ala Cys Ile Val Asn Tyr His
355 360 365
Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met
385 390 395 400
Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu
405 410 415
Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala
420 425 430
Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala
435 440 445
Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly
450 455 460
Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro
465 470 475 480
Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly
485 490 495
Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Val Gly Gly Ile Val
500 505 510
Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr
515 520 525
Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln
530 535 540
His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp
545 550 555 560
Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu
565 570 575
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly
580 585 590
Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val
595 600 605
Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly
610 615 620
Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp Leu Ala Glu Asn Met Val Ser
625 630 635 640
Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Val
645 650
<210> 19
<211> 1965
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 编码针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列的核苷酸序列,所述氨基酸序列包含人粘连蛋白-1残基
<400> 19
atggaaaccg acacccttct tttgtgggtg cttcttcttt gggtgcccgg gagcaccggg 60
gactacccct acgacgtgcc cgactacgcc ggggctgatg ccgtggtgac ccaggagagc 120
gccttgacca caagccccgg ggagaccgtg accttgacct gtagaagcag cacaggggcc 180
gttacaacct ctaactacgc cagctgggtt caggagaagc ccgaccacct tttcaccgga 240
cttatcggag ggaccaacaa cagagccccc ggggtgcctg ctagattcag cgggagcctt 300
attggggaca aggccgccct taccattacc ggggctcaga ccgaagacga ggctatctac 360
ttctgtgctc tttggtacag caaccattgg gtgttcggag gcgggacaaa gcttacagtg 420
cttggaggcg gtggaggcag cggcggaggt gggtctggtg gagggggctc tgggggaggc 480
ggtagcgacg tgcagcttca gcagagcggg cccgggcttg tggccccctc tcagtctctt 540
agcataacgt gcaccgtgag cgggttcagc cttaccgact atggggttaa ctgggtgaga 600
cagtctcctg ggaaggggct tgagtggttg ggagttatct ggggagacgg aatcaccgac 660
tacaacagcg ccttgaagag cagactttct gtgacaaagg acaactctaa gagccaggtg 720
ttccttaaga tgaacagcct tcagagcggg gactctgcca gatactactg cgtgacaggg 780
cttttcgact actggggaca agggaccacc ttgaccgtga gcagcggaag cggagccatg 840
gccaagccca ccaactggat cgaggggaca caggccgtgc ttagagccaa gaaggggcag 900
gacgacaagg ttcttgttgc tacttgcacc agcgccaacg gaaagccccc cagcgtggtg 960
agctgggaga caagattgaa aggggaggcc gagtatcagg agatcagaaa ccctaacggg 1020
accgtgaccg tgatcagcag atacagactt gtgcctagca gagaggccca ccagcagagc 1080
cttgcctgca tcgttaacta ccacatggac agattcaagg agagccttac acttaacgtg 1140
cagtacgaac ccgaggtgac catcgagggg ttcgacggga actggtacct tcagagaatg 1200
gacgtgaagc ttacctgcaa ggccgacgcc aaccctcccg ccaccgagta ccactggacc 1260
acccttaacg ggagccttcc caaaggggtg gaggcccaga acagaaccct tttcttcaag 1320
gggcccatca attacagcct tgccgggacc tacatctgcg aggccaccaa ccccatcggg 1380
accagaagcg gtcaagtgga ggtgaacatc accgagttcc cctacacccc cagcccaccc 1440
gagcacggga gaagagctgg gcccgttccc accgccatca tcggaggggt ggccgggagc 1500
atcttgcttg tgcttatcgt ggtgggtggg attgtggtgg cccttagaag aagaagacat 1560
accttcaaag gggactacag caccaagaag cacgtgtacg ggaacgggta cagcaaggcc 1620
ggaatccctc agcaccatcc acctatggcc cagaaccttc agtaccccga cgacagcgac 1680
gatgagaaga aggctgggcc ccttggtggg agcagctacg aagaggagga agaagaggaa 1740
gagggtggcg gcggtggaga gagaaaagtg ggagggcctc atcccaaata cgacgaggac 1800
gccaagagac cctacttcac cgtggacgag gccgaggcca gacaggacgg gtacggggac 1860
agaacccttg ggtaccagta cgaccccgag cagttggact tggccgagaa catggtgagc 1920
cagaacgacg gaagcttcat ctctaagaag gagtggtacg tgtga 1965
<210> 20
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD24_galK_f
<400> 20
ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 21
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD25_galK_r
<400> 21
tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_827_f
<400> 22
gcgtgatgtc accattgaag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_1142_r
<400> 23
tattgttcag cgacagcttg 20
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4肽表达盒
<400> 24
ggatccaaga actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 60
<210> 25
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD24_GCN4_fB
<400> 25
ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc ggatccaaga 60
actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110
<210> 26
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD25_GCN4_rB
<400> 26
tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag gctgcccacc 60
agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110
<210> 27
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> R-81的嵌合gD-GCN4的核苷酸序列
<400> 27
atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60
catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120
cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgga tccaagaact accacctgga gaacgaggtg 180
gccagactga agaagctggt gggcagcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 240
cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 300
acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 360
gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 420
accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 480
accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 540
aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 600
cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 660
attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 720
cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 780
agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc 840
ttgaagatcg ccgggtggca cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg 900
gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 960
tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac 1020
ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc cggccacccc gaacaacatg 1080
ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt 1140
gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc 1200
cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actag 1245
<210> 28
<211> 414
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 插入GCN4肽的gD前体的氨基酸序列，由构建体R-81编码
<400> 28
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
50 55 60
Lys Leu Val Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg
65 70 75 80
Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro
85 90 95
Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg
100 105 110
Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly
115 120 125
Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp
130 135 140
Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr
145 150 155 160
Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr
165 170 175
Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp
180 185 190
Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr
195 200 205
Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe
210 215 220
Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu
225 230 235 240
Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly
245 250 255
Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn
260 265 270
Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly
275 280 285
Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu
290 295 300
Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
305 310 315 320
Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro
325 330 335
Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His
340 345 350
Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly
355 360 365
Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met
370 375 380
Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile
385 390 395 400
Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
405 410
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD_ext_f
<400> 29
tccataccga ccacaccgac gaatccc 27
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD_ext_r
<400> 30
gagtttgata ccagactgac cgtg 24
<210> 31
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_gD35_F
<400> 31
tgaagaagct ggtgggcagc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_gD39_R
<400> 32
gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 33
<211> 780
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv HER2表达盒的核苷酸序列
<400> 33
gagaattccg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 60
agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gatgtgaata ctgctgtagc ctggtatcaa 120
cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttactcgg catccttcct ctactctgga 180
gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 240
ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac attatactac tcctcccacg 300
ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa tcggatatgc cgatggctga tccgaaccgt 360
ttccgcggta agaacctggt ttttcattct gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc 420
ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag cttctggctt caacattaaa 480
gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaagg 540
atttatccta cgaatggtta tactagatat gccgatagcg tcaagggccg tttcactata 600
agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac ctacaaatga acagcttaag agctgaggac 660
actgccgtct attattgtag ccgctgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg 720
ggtcaaggaa cactagtcac cgtctcctcg agtggcggtg gctctggttc cggtggatcc 780
<210> 34
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD-34-scFvHER2-F
<400> 34
tgaagaagct ggtgggcagc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc gagaattccg 60
atatccagat 70
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD-40-scFvHER2-R
<400> 35
gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat ggatccaccg 60
gaaccagagc 70
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 scFv_456_r
<400> 36
agctgcacag gacaaacgga gtgagccccc 30
<210> 37
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_gD214_F
<400> 37
cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 38
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 galK_gD223_R
<400> 38
ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD213-scFvHER2f
<400> 39
cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc gagaattccg 60
atatccagat 70
<210> 40
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD224-scFvHER2r
<400> 40
ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta ggatccaccg 60
gaaccagagc 70
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gDintforw
<400> 41
ccctacaacc tgaccatcgc ttgg 24
<210> 42
<211> 71
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD24-scFvHer2-F
<400> 42
ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc gagaattccg 60
atatccagat g 71
<210> 43
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD25-scFvHer2-R
<400> 43
tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag ggatccaccg 60
gaaccagagc 70
<210> 44
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD213-GCN4-F
<400> 44
cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc ggatccaaga 60
actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110
<210> 45
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD224-GCN4-R
<400> 45
ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta gctgcccacc 60
agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 HSV_139688_r
<400> 46
ccgacttatc gactgtccac ctttccc 27
<210> 47
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD35-galK-F
<400> 47
gctctggttc cggtggatcc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 48
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD39-galK-R
<400> 48
gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 49
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD35-GCN4-F
<400> 49
gctctggttc cggtggatcc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc ggatccaaga 60
actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110
<210> 50
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD39-GCN4-R
<400> 50
gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat gctgcccacc 60
agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110
<210> 51
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 scFv4D5 651_f
<400> 51
ggacactgcc gtctattatt gtagccgct 29
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gDintrev
<400> 52
ccagtcgttt atcttcacga gccg 24
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引物 gD219-GCN4-F
<400> 53
cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc atccccgaga 60
accagcgcgg atccaagaac taccacctgg agaacgaggt ggccagactg aagaagctgg 120

Claims (22)

1.一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含长度为5至131个氨基酸的异源肽配体，所述异源肽配体能够与靶分子结合并且融合至或插入至存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白D(gD)。
2.根据权利要求1所述的疱疹病毒，其中所述异源肽配体的长度为5至120个氨基酸，优选地5至100个氨基酸，更优选地5至80个氨基酸，甚至更优选地5至60个氨基酸，甚至更优选地5至50个氨基酸，甚至更优选地5至45个氨基酸，甚至更优选地5至40个氨基酸，甚至更优选地5至35个氨基酸，甚至更优选地5至30个氨基酸，甚至更优选地10至30个氨基酸或者甚至更优选地12至20个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的疱疹病毒，其中所述异源肽配体包含GCN4酵母转录因子的一部分，优选地GCN4酵母转录因子的表位，更优选地如SEQ ID NO:13所示的GCN4的表位，甚至更优选地GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分，最优选地所述肽是如SEQ IDNO:12所示的肽。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中所述异源肽配体与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合或与存在于患病细胞上的靶分子结合，或者
其中所述重组疱疹病毒包含一种以上异源肽配体，其中所述一种以上异源肽配体中的一种与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合和所述一种以上异源肽配体中的另一种与存在于患病细胞上的靶分子结合，
优选地其中所述疱疹病毒具有与表达所述靶分子的细胞膜融合的能力，甚至更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
5.根据权利要求4所述的重组疱疹病毒，其中存在于细胞培养物中的所述细胞是适于所述疱疹病毒生长的培养细胞，优选地是批准用于疱疹病毒生长的细胞系，更优选地是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，甚至更优选地是Vero细胞，和/或
其中存在于细胞培养物中存在的细胞上的所述靶分子是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，优选地是单链抗体(scFv)，更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是与GCN4酵母转录因子的表位结合，甚至更优选地是与如SEQ ID NO:13所示的GCN4的表位结合，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:12的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:17的scFv，或者甚至更优选地是如SEQ IDNO:18所示的scFv，
最优选地其中存在于细胞培养物中的所述细胞是携带如SEQ ID NO:18所示的scFv作为所述靶分子的Vero细胞。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中所述疱疹病毒还包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与存在于患病细胞上的靶分子结合并且融合至或插入至gD，
优选地其中所述疱疹病毒具有与表达所述靶分子的患病细胞膜融合的能力，甚至更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
7.根据权利要求6所述的重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含所述异源肽配体和所述异源多肽配体，所述异源肽配体能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合。
8.根据权利要求4至7中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中存在于患病细胞上的所述分子存在于肿瘤细胞上，
优选地其中所述靶分子是肿瘤相关受体，更优选地是EGF受体家族成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII、或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII，或MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CEA-CAM、Ep-CAM、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、gp100、GD2、VEGF受体1和2、CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、免疫检查点家族调节因子成员，包括PD-1、PD-L1、CTL-A4、TIM-3、LAG3、B7-H3或IDO，肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2，或者
其中所述患病细胞是感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞，
更优选地其中能够与所述肿瘤细胞、感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞结合的所述异源多肽配体是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是与HER2结合的scFv，或者最优选地是如SEQ ID NO:16所示的scFv。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中gD经过如此修饰，以使得所述重组疱疹病毒与受体HVEM和/或粘连蛋白-1相互作用的能力降低，优选地基本上消除。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中gD的粘连蛋白-1结合位点失活，
优选地其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，含有氨基酸35至39或其子集或者含有氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223的gD的一部分，或同源gD的对应氨基酸从gD缺失，
更优选地其中氨基酸35至39、氨基酸214至223或者氨基酸219至223缺失。
11.根据权利要求10所述的重组疱疹病毒，
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的重组疱疹病毒，其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，gD的HVEM结合位点失活，优选地其中所述异源肽配体或所述异源多肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，更优选地插入至gD的氨基酸6和34之间，或者甚至更优选地插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸。
13.根据权利要求12所述的重组疱疹病毒，
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，优选地插入至gD的氨基酸6和34之间，更优选地插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至所述gD的HVEM结合位点，优选地插入至氨基酸6和34之间，更优选地插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以便将所述粘连蛋白-1结合位点失活，优选地插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，
优选地
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源多肽配体插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，所述异源肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或其子集或者以取代氨基酸214至223或其子集，如氨基酸215至223、216至223、217至223、218至223或219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者
更优选地
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:12所示的所述异源肽配体插入至氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQID NO:16所示的所述异源多肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或以取代氨基酸214至223或以取代氨基酸219至223，或同源gD的对应氨基酸，或者
其中对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:16所示的所述异源多肽配体插入至gD的氨基酸24和25之间，或同源gD的对应氨基酸，以及对于包含SEQ ID NO:1的成熟gD，如SEQ ID NO:12所示的所述异源肽配体插入至gD以取代氨基酸35至39或以取代氨基酸214至223或以取代氨基酸219至223，或同源gD的对应氨基酸。
14.根据权利要求1至13中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒编码调控针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。
15.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至14中任意一项所述的重组疱疹病毒和药学上可接受的运载体，任选地另包含调控针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。
16.根据权利要求1至14中任意一项所述的重组疱疹病毒，任选地与调控针对患病细胞的宿主免疫应答的一种或多种分子联合施用，用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病。
17.一种核酸分子，所述核酸分子包含核酸，所述核酸编码如权利要求1至13中任意一项所定义的融合了或插入了所述异源肽配体和任选地所述异源多肽配体的gD。
18.一种载体，所述载体包含根据权利要求17所述的核酸分子。
19.一种多肽，所述多肽包含如权利要求1至13中任意一项所定义的融合了或插入了所述异源肽配体和任选地所述异源多肽的gD。
20.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至14中任意一项所述的重组疱疹病毒，根据权利要求17所述的核酸分子，根据权利要求18所述的载体或根据权利要求19所述的多肽。
21.一种使用根据权利要求1至14中任意一项所述的重组疱疹病毒感染细胞的方法。
22.一种使用根据权利要求1至14中任意一项所述的重组疱疹病毒在细胞培养物存在的细胞中生产疱疹病毒的体外方法。
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