CN112368007A - 抗原隐匿的溶瘤病毒 - Google Patents

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Abstract

本文提供了抗原隐匿的HSV颗粒，以及所述抗原隐匿的HSV颗粒的使用方法。在本发明的一个方面，提供了一种重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒，所述HSV颗粒包含经修饰以减少或消除干扰病毒感染的抗体的识别的糖蛋白。在一个实施方案中，经修饰的糖蛋白是抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白。还提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用一定量的重新靶向的HSV颗粒。

Description

抗原隐匿的溶瘤病毒
关于联邦资金的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号AI018289-38的政府支持下完成的。政府对本发明享有特定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月31日提交的美国临时专利申请第62/678,737号的权益，其以全文引用的方式并入本文。
已由各种各样的病毒物种产生了溶瘤病毒(OV)，其中付出了巨大的努力来实现载体的安全性和功效。许多溶瘤病毒已经在人类临床试验中进行了测试，并取得了不同的成功。载体的递送已主要依靠肿瘤内接种而不会限制脱靶细胞感染。肿瘤内接种的局限性在于，例如由于肿瘤的大小或位置，许多肿瘤不能被接种，此外，除非单独地可识别且数量有限，否则散布的转移细胞和微转移通常不能被容易地局部治疗。
我们以前已经开发了溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)载体，其独特地需要与肿瘤相关的受体进行感染，例如表皮生长因子受体(EGFR)或其肿瘤特异性变体EGFRvIII(参见例如Uchida,H.等人，Effective treatment of an orthotopic xenograft model of humanglioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Mol Ther21,561-569,doi:10.1038/mt.2012.211(2013))。Campadelli-Fiume等人(Retargetingstrategies for oncolytic herpes simplex viruses.Viruses 8,63,doi:10.3390/v8030063(2016))也描述了重新靶向的oHSV的工程化。这些“重新靶向”的oHSV在免疫受损小鼠中可以归巢至带有靶受体的肿瘤，但是尚未在患者或HSV免疫动物肿瘤模型中测试重新靶向的载体，并且人类群体中普遍存在的抗HSV免疫力可能将限制oHSV肿瘤疗法的有效性。
这样，使用oHSV的主要障碍是宿主对HSV的免疫力，特别是对oHSV颗粒中存在的抗原(例如表位或抗原决定簇)的适应性免疫应答。来自HSV免疫动物和患者的血清通过抗体介导的机制有效地中和HSV(参见例如Cairns,T.M.等人2015.Patient-specificneutralizing antibody responses to herpes simplex virus are attributed toepitopes on gD,gB,or both and can be type specific.J Virol89:9213–9231)。这些抗体的主要靶标是两种病毒包膜糖蛋白gD和gB，它们是HSV进入细胞所必需的。适应性宿主免疫可以从包含交叉反应性表位的病毒粒子的早期HSV感染，或从利用所述病毒粒子或抗原性交叉反应性病毒颗粒的早期oHSV治疗中发展出来。因此，由于已经存在的免疫力或注射后的免疫力的出现，预期全身注射或在注射(肿瘤)部位复制的病毒粒子传播到患者体内的其他肿瘤或转移细胞至多是暂时性的。
期望的是能够在HSV免疫患者中进行全身性肿瘤归巢的重组HSV载体(病毒颗粒)。这种新颖类型的oHSV的成功开发将提供适用于全身治疗转移性癌症(这是癌症治疗中的核心问题)的一代OV。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了一种重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒。所述病毒颗粒包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为减少或消除通过阻止病毒附着和/或进入易感宿主细胞而干扰病毒感染的抗体的识别。
在另一方面，提供了一种重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒。所述病毒颗粒包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白质，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修改，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
在另一方面，一种重组HSV基因组，其包含编码重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒的核酸，所述HSV颗粒包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为减少或消除通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而干扰病毒感染的抗体的识别。在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白质，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
在另一方面，提供了一种病毒原液，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒，所述HSV颗粒包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而减少或消除被干扰病毒感染的抗体的识别。在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白质，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
一种剂型，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒和药学上可接受的赋形剂，所述HSV颗粒包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而减少或消除被干扰病毒感染的抗体的识别。在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白质以及药学上可接受的赋形剂，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
一种治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用一定量的可有效治疗癌症患者的重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒。所述重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒包含基因组、衣壳、被膜和包膜以及药学上可接受的赋形剂，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而减少或消除被干扰病毒感染的抗体的识别。在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白以及药学上可接受的赋形剂，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
以下编号的条款描述了本发明的各个方面。
条款1：一种重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒，其包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而减少或消除被干扰病毒感染的抗体的识别。
条款2：条款1的病毒颗粒，其包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白质，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
条款3：条款2的病毒颗粒，其中gD的一个或多个表位被修饰以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除一个或多个主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
条款4：条款2的病毒颗粒，其中gB的一个或多个表位被修饰以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除一个或多个主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
条款5：条款1-3中任一项的病毒颗粒，其中在所述病毒颗粒的gD糖蛋白中，SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸10-20、54、75-79、132、140、213、216、222-224和262-279中的一个或多个或对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸10-20、54、75-79、132、140、213、216、222-224和262-279的一个或多个氨基酸被修饰，以减少主要HSV血清中和抗体与所述病毒颗粒的结合。
条款6：条款5的病毒颗粒，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸P54和T213中的一个或两个或对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸P54和T213的一个或两个氨基酸，例如P54Q和/或T213M，被修饰。
条款7：条款2的病毒颗粒，其中在所述病毒颗粒的gB糖蛋白中，SEQ ID NO:3的氨基酸47、62、85、203、303、304、305、308、328、335、419、473、594或640-670或SEQ ID NO:4的氨基酸412中的一个或多个或对应于SEQ ID NO:3的氨基酸47、62、85、203、303、304、305、308、328、335、419、473、594或640-670或SEQ ID NO:4的氨基酸412的一个或多个氨基酸被修饰，以减少主要HSV血清中和抗体与所述病毒颗粒的结合。
条款8：条款1-7中任一项的病毒颗粒，其具有SEQ ID NO:1或2的Δ38突变，或在gD糖蛋白中的对应于SEQ ID NO:1或2的Δ38突变的突变。
条款9：条款1-8中任一项的病毒颗粒，其包含能够结合靶细胞类型的表面组分的非天然配体。
条款10：条款9的病毒颗粒，其中所述靶细胞类型是癌细胞。
条款11：条款9的病毒颗粒，其中能够结合靶细胞类型的表面组分的所述非天然配体被掺入到所述病毒颗粒的病毒包膜糖蛋白中。
条款12：条款11的病毒颗粒，其中掺入了所述配体的所述病毒颗粒的所述病毒包膜糖蛋白是gD、gC、gB和/或gH。
条款13：条款9的病毒颗粒，其中所述表面组分是EGFR、EGFRvIII、其他致癌EGFR变体、HER2、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3/膜联蛋白-2/MMP-2、人转铁蛋白受体、EpCAM或c-Met中的一个或多个。
条款14：条款1-13中任一项的病毒颗粒，其中至少一种或多种病毒包膜糖蛋白与其天然受体的结合被消除。
条款15：条款1-14中任一项的病毒颗粒，其中所述基因组包含外源表达盒。
条款16：条款15的病毒颗粒，其中所述外源表达盒编码增强肿瘤杀伤活性的试剂。
条款17：条款1-16中任一项的病毒颗粒，其中所述基因组包含用于一种或多种微小RNA的靶序列。
条款18：一种编码条款1-17中任一项的病毒颗粒的重组HSV基因组。
条款19：一种病毒原液，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的条款1-17中任一项的病毒颗粒。
条款20：一种剂型，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的条款1-17中任一项的病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。
条款21：条款20的剂型，其以单位剂型提供。
条款22：条款20的剂型，其被配制用于肠胃外递送。
条款23：条款22的剂型，其被配制用于静脉内递送。
条款24：一种治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用一定量的可有效治疗癌症患者的条款1-17中任一项的病毒颗粒。
附图说明
图1A提供了比对的示例性HSV gD1和gD2序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。氨基酸2-24可以被scFv序列，例如图2的序列，或其他靶向配体序列取代。图1B和1C提供了连续比对的示例性HSV gB1和gB2序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。图1D提供了修饰的(“重新靶向的”)gD1(gD:scEΔ38(SEQ ID NO:5))的序列，其在残基1和25之间具有抗EGFR scFv序列，并缺失了残基Y38(Δ38；表示为氨基酸序列中的*)。信号肽(粗体)显示在单独的一行上，但在蛋白质被信号肽酶裂解之前与蛋白质的其余部分是连续的序列。
图2提供抗EGFR/EGFRvIII scFv的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图3示意性地显示了wt HSV(a)和KNTc重组体的基因组结构。(b)KNTc-ΔgD:GW包含在UL37与UL38之间的用于在大肠杆菌中进行病毒基因组扩增和工程改造的细菌人工染色体(BAC)序列、在UL3与UL4之间的泛素C启动子-mCherry表达盒(UbC-mCh)、gB基因中的两个增强病毒进入的突变(gB:NT)以及代替gD编码序列的GW重组盒(ΔgD:GW)，所述GW重组盒用于允许参考gD基因和修饰的gD基因在gD启动子控制下的快速的取向特异性插入。插入的基因包括wt gD1(gD wt)(c)和不具有或具有P54Q和/或T213M突变的重新靶向的gD(gD:scEΔ38)(d)。mAb MC5和MC23的已知表位残基显示在gD:scEΔ38示意图的上方，突变残基显示在下方。
图4显示了B78-EGFRvIII克隆(B78-vIII)的产生和表征。用表达EGFRvIII的重组逆转录病毒感染B78-H1小鼠黑素瘤细胞。选择对10μg/ml杀稻瘟菌素具有抗性的转导细胞，汇集并使用抗EGFR单克隆抗体H11和荧光激活细胞分选仪(FACS)按EGFRvIII表达水平分选。通过有限稀释分别克隆来自EGFRvIII阳性峰前部和后部的细胞，并通过蛋白质印迹(WB)分析单个克隆的EGFRvIII表达。结果显示在选定的B78-vIII克隆中的EGFRvIII表达。表达EGFRvIII的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞(CHO-EGFRvIII)被用作阳性对照。B78H1细胞对EGFRvIII是阴性的(B78H1，最右边)。用EGFRvIII表达质粒瞬时转染的B78H1细胞显示几乎检测不到的EGFRvIII表达。将β-肌动蛋白可视化为上样对照。选择B78-vIII克隆11B用于随后的实验研究。
图5.重新靶向和单克隆抗体(mAb)抗性(mar)突变对mAb与纯化的gD胞外域(ECD)结合的影响。将编码gD:scEΔ38的ECD的序列及其mar突变体的序列克隆到杆状病毒表达质粒pVTBac中。用这些质粒连同线性化的杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞，以产生重组杆状病毒。通过WB测试单独分离物的gD ECD生产，并且最高产量的克隆用于更大规模的蛋白质生产。通过抗gD(DL6)柱纯化可溶性蛋白。通过表面等离激元共振成像(SPRi)分析了25种gD特异性mAb与每个纯化ECD的结合，并显示了每种抗gD mAb结合重新靶向gD(A)或突变的重新靶向gD(B-D)的数据，其作为相对于wt gD(100％)的百分比显示。每种mAb在水平轴下方命名；将针对相同或重叠表位的mAb分组，并且每组用不同的颜色表示(Cairns 2017)，如mAb名称下方所示。值是2-5次独立测定的平均值±SEM，但用(*)表示的值仅测定一次。A.gD:scEΔ38；B.gD:scEΔ38-P54Q；C.gD:scEΔ38-T213M；D.gD:scEΔ38-P54Q/T213M。
图6A-6C.无病毒融合测定中的gD活性和mAb的抑制作用。为了测量gD融合活性，通过用针对gB:NT、gH、gL、所示的不同版本的gD的表达质粒和分裂荧光素酶N末端质粒RLuc8(1-7)转染B78H1细胞(无gD受体)，创建了效应细胞群体。用分裂荧光素酶C末端质粒RLuc8(8-11)转染B78-vIII(表达EGFRvIII的)靶细胞。效应细胞群体和靶细胞群体混合后，随时间测量由糖蛋白介导的靶细胞与效应细胞融合所产生的发光。(图6A)在6小时时融合活性相对于gD:scEΔ38活性的时间过程(设置为100％发光)。(图6B和6C)通过在与靶细胞混合之前将效应细胞群体与指定浓度的MC5(图6B)或MC23 mAb(图6C)一起预孵育1小时来进行抗体抑制。在6小时时显示了相对于无抗体的数据(100％)。
图7A和7B.gD的病毒进入特异性和病毒粒子掺入。(图7A)使用通过BAC转染Vero细胞产生的重新靶向的KNTc病毒在MOI＝1下感染Vero(结合素-1+/EGFR+)、B78-H1、B78/C(结合素-1+)和B78-vIII细胞(EGFRvIII+)20小时。根据其重新靶向的gD版本，在列的顶部标识病毒。进入被记录为mCherry荧光。(图7B)蛋白质印迹显示经纯化病毒粒子的相等基因组拷贝的VP16、gD和gB含量。gD印迹的左侧显示了以kDa为单位的大小标记物。
图8.mAb MC5和MC23中和重新靶向的病毒。在感染Vero细胞之前，将每竖直对的图(A，B或C，D)下方指定的病毒与病毒中和mAb MC5(A，C)或MC23(B，D)在一定范围的稀释度下一起孵育。在感染的细胞单层上覆盖高密度培养基，并在48小时后对噬菌斑进行计数。代表性结果显示相对于仅病毒的对照孔(100％)的噬菌斑形成单位(PFU)％。(A，B)重新靶向的病毒和单突变的重新靶向的病毒；(C，D)重新靶向的病毒和双重突变的重新靶向的病毒。数据代表3孔/条件的平均值±SEM。
图9-重新靶向的病毒和双mar突变的重新靶向的病毒的中和。在感染Vero细胞之前，将两种病毒与不同的mAb在一定范围的稀释度下一起孵育。在感染的细胞单层上覆盖高密度培养基，并在48小时后对噬菌斑进行计数。代表性结果显示相对于仅病毒的对照孔(100％)的PFU％。用A，mAb H162；B，mAb LP2；C，mAb DL6；和D，mAb MC14中和重新靶向的病毒(gD:scEΔ38)和双mar突变的重新靶向的病毒(gD:scEΔ38P54Q/T213M)。为了比较，在图C和D中包括表达wt gD的KNTc。数据显示为一式三份孔的平均值±SEM。
具体实施方式
除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各种范围内的数值的使用被表示为近似值，就好像在所述范围内的最小值和最大值均以单词“约”开头一样。以这种方式，在所述范围之上和之下的微小变化可以用于获得与范围内的值基本相同的结果。同样，除非另外指出，否则这些范围的公开意图是包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。对于本文提供的定义，那些定义也指那些词或短语的词形、同源词和语法变体。
如本文所使用的，涉及项目、组合物、装置、方法、工艺、系统、权利要求等的要素的术语“包括(comprising)”、“包括(comprise)”或“包括(comprised)”及其变化形式意图是开放式的，表示所述项目、组合物、装置、方法、工艺、系统、权利要求等包括那些要素，并且其他要素也可以包括在内并且仍属于所描述的项目、组合物、装置、方法、工艺、系统、权利要求等的范围/定义内。如本文所使用的，“一”或“一”是指一个或多个。如本文中所使用的，“另一个”可以意味着再一个或更多个。
如本文所用的，术语“患者”或“受试者”是指动物界的成员，包括但不限于人类。
实现期望的治疗、药理、医学或生理学效果的“有效量”或“有效的量”是达到所述目的的任何量。基于本文提供的教导，普通技术人员可以容易地确定所述剂型的成分的有效量，并生产安全有效的剂型和药物产品。
在递送例如本文所述的rHSV的治疗剂的情况下，递送概况可以根据期望的治疗效果而变化。本公开的本质涉及重组病毒颗粒向癌细胞的递送。这样，治疗剂可以优选地肠胃外递送，例如静脉内递送。“剂型”是用作意图给药或消费的药物或药品的化合物的剂量的物理形式。剂型对应于单位剂型，即使当从包括多个剂量的药物产品中分配时也是如此。
可以将病毒颗粒掺入可以包含药学上可接受的载剂或赋形剂的静脉内或其他肠胃外剂型中。根据可接受的药学程序，例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Paul Beringer等人,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MDEaston,Pa.(2005)(关于肠胃外和静脉内制剂的实例和制造此类制剂的方法，参见例如第41和42章)所述的，制备治疗/药物组合物。取决于递送途径，剂型可以包含另外的载剂或赋形剂，例如水、盐水(例如，生理盐水)或磷酸盐缓冲盐水，这在制药领域是众所周知的。组合物可以包含药学上可接受的载剂或赋形剂。赋形剂是用作药品活性成分的载剂的非活性物质。尽管是“非活性的”，但是赋形剂可以促进和帮助提高药物产品中活性成分的递送、稳定性或生物利用度。有用的赋形剂的非限制性实例包括：抗粘剂、粘合剂、流变改性剂、涂料、崩解剂、乳化剂、油、缓冲剂、盐、酸、碱、填充剂、稀释剂、溶剂、调味剂、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附剂、维生素、甜味剂等，如在制药/混配领域中可获得的。
术语“配体”是指针对特异性靶标(其结合伴侣)的结合部分。该分子可以是同源受体、蛋白质、小分子、半抗原或任何其他相关分子，例如亲和体(affibody)或含互补位(paratope)的分子。术语“抗体”是指免疫球蛋白、其保持特异性结合能力的衍生物，以及具有与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结合结构域的蛋白质。这样，抗体作为其同源抗原的配体起作用，所述同源抗原实际上可以是任何分子。
术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。在示例性的实施方案中，抗体片段保留了全长抗体的特异性结合能力的至少相当一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab′)2、Fv、Fd、dsFv、scFv、双价抗体(diabody)、三价抗体(tribody)、四价抗体(tetrabody)、di-scFv(二聚单链可变片段)、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、单域抗体(sdAb)或抗体结合结构域片段。在靶向配体的情况下，抗体片段可以是单链抗体片段。或者，片段可以包含多个链，这些链例如通过二硫键连接在一起。片段也可以任选地是多分子复合物。功能性抗体片段典型地将包含至少约50个氨基酸，更典型地将包含至少约200个氨基酸。
配体还包括其他工程化的结合试剂，例如亲和体和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，所述DARPin利用重复蛋白的模块性质(Forrer T,Stumpp MT,Binz HK,Plückthun A:A novel strategy to design binding molecules harnessing the modularnature of repeat proteins,FEBS Lett 2003,539:2-6；Gebauer A,Skerra A:Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics,CurrOpin Chem Biol 2009,13:245-255)，所述重复蛋白包含(通常作为单条链)一个或多个抗原结合或表位结合序列和为了确保组合物的适当特异性、递送和稳定性所需的最少数量的任何其他氨基酸序列(还参见例如，Nelson,AL,“Antibody Fragments Hope and Hype”(2010)MAbs 2(1):77-83)。
病毒基因组是一种可以包装在病毒衣壳中并作为病毒颗粒一部分递送的核酸。病毒基因组包括将基因组包装和递送至靶细胞以表达由病毒基因组编码的一个或多个基因所必需的任何序列。在本文所述的HSV病毒颗粒或病毒粒子的情况下，基因组包装在HSV病毒衣壳中以递送至靶细胞。
大量研究已针对重组溶瘤性HSV病毒(oHSV)。制造和使用oHSV载体和病毒的方法是众所周知的(参见例如Goins,Wf等人Retargeting of Herpes Simplex Virus(HSV)Vectors Curr Opin Virol.2016年12月；21:93–101；Grandi,P等人Design andapplication of oncolytic HSV vectors for glioblastoma therapy.Expert RevNeurother.2009年4月；9(4):505–517；以及Peters和Rabkin,Designing herpes virusesas oncolytics,Oncolytics(2015)2,15010，其技术公开内容通过引用并入本文)。同样，对各种HSV组分的整体结构也进行了深入研究。2015年，oHSV(T-VEC，IMLYGICTM，talimogenelaherparepvec)成为第一个获得FDA批准的oHSV，因为它在黑素瘤患者的治疗中证明了安全性和有效性。此病毒的有效性已部分依赖于用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行载体武装，以增强抗原呈递细胞的募集。但是，如上所述，由于对HSV(例如对HSV糖蛋白gB和gD)的免疫力的出现，部分地阻碍了实施。在肿瘤内递送T-VEC以治疗黑素瘤肿瘤后，抗HSV抗体滴度与治疗反应之间没有相关性，但所有血清阴性患者在3-4周内都发生血清转化。人类群体中的很大一部分是HSV血清阳性，并且在这些患者体内，即使是使用靶向肿瘤的HSV对转移癌的全身治疗也可能被削弱。这样，本文中描述了“隐匿”HSV，例如对于预先存在的免疫力来说是隐藏的oHSV。
示例性HSV gB和gD糖蛋白的氨基酸序列在图1A-1C中提供(SEQ ID NO:1-4)。多项研究已为HSV gD和gB生成了详细的表位图(epitope map)(参见例如，Atanasiu D等人2018.Using Antibodies and Mutants to Localize the Presumptive gH/gL BindingSite on Herpes Simplex Virus gD.J Virol 92:e01694-18；Cairns,T.M.等人2015.JVirol 89:9213–9231；Bender FC等人2007.Antigenic and mutational analyses ofherpes simplex virus glycoprotein B reveal four functional regions.J Virol 81(8):3827–3841；和Cairns TM等人2006.Epitope Mapping of Herpes Simplex VirusType 2gH/gL Defines Distinct Antigenic Sites,Including Some Associated withBiological Function.J Virol 80:2596–2608；以及Cairns TM等人(2017)GlobalSensing of the Antigenic Structure of Herpes Simplex Virus gD Using High-Throughput Array-Based SPR Imaging.PLoS Pathog 13(6):e1006430(Cairns等人2017))，包括主要血清抗体结合位点的功能的更详细了解，包括结合位点与病毒中和、受体结合、病毒进入和膜融合的关系。
“中和抗体”是结合病毒粒子并降低该病毒粒子的感染性的抗体或其片段。抗体中和病毒的能力可以被有效地测试，例如但不限于通过例如在Cairns等人,2017中众所周知的噬菌斑测定法。在本发明的上下文中，“主要”中和抗体是大多数群体中存在的中和抗体，例如对HSV(例如，HSV-1或HSV-2)呈血清阳性并且对特异性表位(例如，本文所述表位和Cairns等人,2017中描述为MC5、MC23、DL11、MC14、1D3和11B3AG的表位或描述为“红色社群”、“粉色社群”或“蓝色社群”表位的表位或以Ia、Ib和III组描述的表位，如Cairns等人,2017所示(在以下表1中重现)(还参见Cairns,TM等人(2015)Patient-SpecificNeutralizing Antibody Responses to Herpes Simplex Virus Are Attributed toEpitopes on gD,gB,or Both and Can Be Type Specific.J.Virology 89(18):9213-9231(“Cairns等人2015”))具有选择性的人类群体中的至少10％，至少20％，至少30％，至少40％或至少50％。对于gB，主要表位包括SS144、C226和SS10，如Cairns等人,2015所述的(参见例如，Cairns等人2014.《Mechanism of Neutralization of Herpes Simplex Virusby Antibodies Directed at the Fusion Domain of Glycoprotein B.J.Virol.88(5):2677-2689；Bender FC等人2007.Antigenic and mutational analyses of herpessimplex virus glycoprotein B reveal four functional regions.J Virol81(8):3827–3841；Kousoulas,KG等人,(1988)Antibody-resistant mutations in cross-reactive and type-specific epitopes of herpes simplex virus 1glycoprotein Bmap in separate domains Virology 166(2):423-431；Sanchez-Pescador,L等人(1993)Antibodies to Epitopes of Herpes Simplex Virus Type 1Glycoprotein B(gB)inHuman Sera:Analysis of Functional gB Epitopes Defined by Inhibition of MurineMonoclonal Antibodies J.Infectious Diseases 168(4):844-853；以及Highlander,SL等人(1989)Identification of mar Mutations in Herpes Simplex Virus Type1Glycoprotein B Which Alter Antigenic Structure and Function in VirusPenetration J.Virol 63(2):730-738)。中和抗体可以关于其在病毒粒子中的靶表位(例如包膜糖蛋白，例如gD或gB)分类。主要中和抗体与包膜糖蛋白中的相应“主要表位”结合。
表1.抗gD mAb的特性(Cairns等人2017)。
Figure BDA0002864656870000131
应当认识到，若干HSV毒株的基因组序列是普通技术人员已知的(例如MacDonald,J.Virol.,86(11):6371(2012)；McGeoch,J.Gen.Virol.,69:1531-1574(1988)；GenBank登录号JQ673480；NCBI参考序列：NC_001806.1；MacDonald,J.Virol.86(17):9540(2012)；GenBank登录号JX142173，其以引用的方式并入本文)。因此，HSV基因和基因座的序列的操纵在普通技术人员的能力范围内。还应注意，这些公开的序列以及本文提供的序列(SEQ IDNO:1-4)仅是示例性的，并且HSV的其他毒株或变体可以用作对本发明的病毒颗粒或载体进行工程化中的源基因组。
可以通过破坏(例如缺失或以其他方式使其无效)病毒粒子对其正常结合靶标(包括结合素(nectin)-1(CD111/HveC)、结合素-2(CD112/HveB)、HVEM(TNFRSF14/HveA)和3-O-硫酸化硫酸乙酰肝素(3-OS HS))的靶向来重新靶向HSV颗粒。结合素-1是HSV-1和HSV2的主要受体，结合素-2是HSV-2和某些具有阻断HVEM结合的突变(例如Q27P)的HSV-1突变株(ANG、KOS-rid1、KOS-rid2)的受体。HVEM主要在淋巴细胞上表达。3-OS HS是HSV-1gD的定义不太明确的受体，它的结合可以通过HVEM结合区中的突变消除(Yoon等人,DOI:10.1128/JVI.77.17.9221–9231.2003)。在HSV-1的gD的情况下，缺失Y38并用重新靶向性配体序列(例如scFv)或另一种配体(例如单域(VHH)抗体、亲和体或天然受体结合伴侣序列，例如生长因子，如重组HSV领域众所周知的(参见例如，美国专利号9,593,347和Goins,WF等人,Curr Opin Virol.2016年12月；21:93–101)取代HVEM靶向部分可用于改变HSV感染的特异性受体依赖性，即重新靶向病毒。
如本文所使用的，氨基酸序列、蛋白质、表位、抗原决定簇等的“修饰”包括改变蛋白质的氨基酸序列的任何突变类型。在实施方案中，修饰是非保守的，因为它们改变了一种或多种抗体与蛋白质的结合。合适的修饰包括但不限于：一个或多个氨基酸的缺失，一个或多个所述氨基酸的取代(例如，错义突变)或一个或多个氨基酸的插入。尽管在下面的实例中列出了特定的氨基酸取代(对于HSV-1gD(gD1)，取代是P54Q和T213M)，但相同氨基酸(即gD1的氨基酸残基P54和/或T213)被某些其他氨基酸取代可以修饰相关表位，例如抗体结合，优选基本上不破坏病毒粒子对靶细胞的感染力。同样，与HSV-1gD(gD1)或HSV-2gD(gD2)的表位相关的其他氨基酸(例如SEQ ID NO:1或2的氨基酸10-20、75-79、132、140、213、216、222-224和262-279，或与那些氨基酸相对应的氨基酸)、与在HSV-1gB(gB1)或HSV-2gB(gB2)中发现的主要表位相关的氨基酸(例如参考SEQ ID NO:3，氨基酸47(例如N47T)、62(例如A62T)、85(例如G85D)、203(例如A203T)、303(例如Y303N)、304(例如R304Q)、305(例如E305K)、308(例如H308Y)、328(例如R328H)、335(例如R335Q)、419(D419K)、473(例如S473N)、594(例如G594R)、640-670，或参考SEQ ID NO:4，氨基酸412(例如E414K)，或与那些氨基酸相对应的氨基酸)以及gD1、gD2、gB1、gB2或其对应于中和抗体的重新靶向形式的主要表位中的其他氨基酸可以被突变以有效地修饰表位，突变方式与减少中和但仍保持在靶细胞中的感染力的目的相一致。此外，例如在噬菌斑测定、蛋白质印迹法或抗体结合测定中，例如如本文所述的，容易测定在给定表位上的任何修饰对抗体结合的影响，以及这种修饰是否会对靶细胞中的感染性产生负面影响。
可以在本文描述的病毒颗粒中以原始或修饰形式使用的许多形式的HSV gD和gB是本领域普通技术人员已知的。那些形式的gD和gB可以具有例如在SEQ ID NO:1-4中所述的野生型(wt)序列，或其变体，包括其天然存在的或人造的变体，或其前体。此外，取决于序列信息的来源，HSV gD和gB糖蛋白中氨基酸的编号可能会有所不同。这样，在本文提及特定氨基酸的情况下，它们是指在SEQ ID NO:1-4的背景中的氨基酸。除非特别提及SEQ ID NO:1-4的序列，否则氨基酸序列中的修饰因此被称为“对应于”SEQ ID NO:1-4中所引用的氨基酸，这意味着等效氨基酸在gD或gB糖蛋白中被修饰，其序列或序列编号可能与SEQ ID NO:1-4的序列不同。
本发明提供了重组HSV(rHSV)，例如oHSV，其包含修饰的gB和/或修饰的gD包膜糖蛋白，其中代表HSV血清阳性个体中一种或多种血清抗体的结合位点的一个或多个表位被修饰，以当施用给对所述一种或多种血清抗体呈血清阳性的患者时，可减少或消除重组HSV的中和作用。也就是说，减少或消除了一个或多个主要血清抗体与gD或gB的抗体结合。注意，在实施例中，mAb被用作主要血清抗体的代理。
“重组”是指病毒基因组经过遗传修饰或基因工程以编码野生型(wt)基因组中不存在的氨基酸变化，例如插入、缺失或取代。这样，如果蛋白质序列具有不同于wt(例如，参考)序列的序列，例如SEQ ID NO:1-4中的一者，则认为所述蛋白质序列被“修饰”。rHSV可以自HSV-1和/或HSV-2基因组衍生或工程化，所述HSV-1和/或HSV-2基因组包括任何合适的毒株的基因组或那些基因组的基因工程形式。
实践中，重组HSV可以被脱靶，并且任选地被重新靶向。重组HSV通过去除或破坏gD中的天然细胞表面结合部分而被脱靶或重新靶向，所述天然细胞表面结合部分例如结合素-1结合位点，其通过去除或取代Y38(例如Δ38)，和HVEM结合序列，其通过去除或破坏HVEM结合序列和任选地用结合靶细胞上存在的细胞表面结合伴侣的配体(例如，例如且不限于编码抗EGFR/EGFRvIII scFv的scFv序列(参见例如图2)，用于靶向人胶质母细胞瘤细胞及其他癌细胞)取代HVEM结合序列。任选地，靶向细胞的配体可以表达为独立的蛋白质或除gD以外的包膜糖蛋白的部分，例如在gB或gH中的部分(参见例如，Petrovic,B等人DualLigand Insertion in gB and gD of Oncolytic Herpes Simplex Viruses forRetargeting to a Producer Vero Cell Line and to Cancer Cells.J.Virology 2018年2月,92(6)e02122-17；Petrovic B等人(2017)Insertion of a ligand to HER2 in gBretargets HSV tropism and obviates the need for activation of the other entryglycoproteins.PLoS Pathog 13(4):e1006352；和Gatta V等人(2015)The Engineeringof a Novel Ligand in gH Confers to HSV an Expanded Tropism Independent of gDActivation by Its Receptors.PLOS Pathogens 11(5):e1004907。因此，“重新靶向”是指对病毒(例如HSV病毒)进行了遗传或合成改变，从而修饰了包膜糖蛋白以消除正常病毒同源受体的识别(称为“脱靶”)，并为包膜糖蛋白提供了配体或突变，以通过识别除了正常病毒同源受体以外的细胞表面结构来实现病毒附着和进入。
病毒基因组还可包含一种或多种微小RNA(microRNA)靶序列，以减少或防止病毒基因组的脱靶感染和复制。本文还提供了包含所描述rHSV的病毒原液和药物组合物，以及使用所描述rHSV(oHSV)杀死肿瘤细胞的方法。
如上所述，HSV颗粒可包含对细胞(例如癌细胞)表面上存在的分子(蛋白质、脂质或碳水化合物决定簇)具有特异性的非HSV配体，和/或插入一个或多个HSV基因座(例如在正常细胞中复制HSV所需的一个或多个HSV基因)中的一个或多个微小RNA靶序列的一个或多个拷贝。
将重组HSV(rHSV)的非HSV配体掺入暴露于HSV表面上的糖蛋白(例如gD或gC)中，以利于用所述配体靶向期望的细胞。例如，可以将配体掺入gD的残基1与25之间，残基24与25之间或残基7与39之间。靶向癌细胞(例如胶质母细胞瘤或乳腺癌)的配体包括靶向EGFR和EGFRvIII、HER2(人类表皮生长因子受体2)、CD133、CXCR4(趋化因子受体4型，融合素(fusin))、癌胚抗原(CEA)、CLC-3/膜联蛋白-2/MMP-2(氯毒素受体)、人类转铁蛋白受体、上皮细胞粘附分子(EpCAM)或c-Met的那些配体，并且所述配体可以靶向此类受体或细胞表面分子，即配体能够特异性结合这种受体或细胞表面分子。EGFR和EGFRvIII特异性配体(例如抗体、scFvs(单链抗体)和VHH(单域抗体))已在文献中进行了描述(Kuan等人,Int.J.Cancer,88,962-69(2000)；Wickstrand等人,Cancer Res.,55(14):3140-8(1995)；Omidfar等人,Tumor Biology,25:296-305(2004)；还参见Uchida等人Molecular Therapy,21:561-9(2013)；还参见Braidwood等人,Gene Ther.,15,1579-92(2008))。
也可以或替代性地可以通过将配体掺入其他不一定与癌症相关的细胞表面分子或受体来靶向rHSV。例如，配体可以包括来自天然配体(例如，生长因子(例如，可以靶向EGFR的EGF、可以靶向trkA的NGF、可以靶向GFRα1的GDNF等)、肽或非肽激素、经选择用于结合靶分子的肽(例如DARPin和亲和体)等的结合结构域。rHSV还可以包含gB和/或gH的突变形式，其通过非规范受体促进病毒进入(并且会通常在rHSV基因组内的这些基因中的一者或两者中也具有此类突变)。
用于包含在rHSV载体中的示例性微小RNA靶序列(例如，作为串联的其多个拷贝)是miR-124的结合序列，其在神经应用中具有特殊应用(例如，在使用rHSV治疗神经系统肿瘤例如GBM时保护非癌性神经元)。可替代地，可以将其他微小RNA靶序列用于保护其他类型的组织，并且选择合适的微小RNA靶序列以保护期望的组织或细胞类型是在本领域普通技术人员的能力范围内的。例如，miR-122和miR-199在正常肝细胞中表达，但在原发性肝癌中不表达；因此，在用于治疗肝癌的rHSV的一个实施方案中，可以使用miR-122和/或miR-199微小RNA靶序列之一或其组合。类似地，miR-128和/或miR-137微小RNA的靶序列可以在oHSV中用于保护正常大脑。示例性的微小RNA靶序列可以是微小RNA的反向互补序列。当全身施用rHSV时，使用一个或多个微小RNA靶序列来保护全身的非靶细胞。
微小RNA靶序列可以被包括在HSV基因的3'非翻译区(“UTR”)中，以在微小RNA存在下使该基因沉默。优选的是将微小RNA靶序列的多个拷贝(例如2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝、5个拷贝、6个拷贝或更多个)串联插入。微小RNA靶序列的多个拷贝可以被四个或更多个核苷酸(更优选地八个或更多个核苷酸)的间隔区分开。微小RNA靶序列的多个拷贝可以相同或不同，使得于单个基因中提供两个或更多个微小RNA的靶序列。
在rHSV的实施方案中，为了帮助保护非癌细胞免受HSV感染的裂解作用，将一个或多个微小RNA靶序列的多个拷贝插入对于在非癌细胞中复制是必不可少的HSV基因的3′UTR中，这对于普通技术人员是已知的。在实施例中，位点是在HSV基因组内其正常(或天然)基因座中的靶向微小RNA的基因的3′UTR。在一个实施方案中，在具有ICP4基因的两个天然拷贝的载体中，将多个微小RNA靶序列插入到ICP4基因(例如ICP4基因的两个拷贝)的3′UTR中。
rHSV载体的基因组还可以包含一个或多个外源表达盒，其含有与启动子、增强子和其他用于表达ORF的合适的调控元件可操作地连接的编码序列，例如开放阅读框(ORF)。所述编码序列(例如ORF)编码基因产物，例如蛋白质，例如报道蛋白(例如绿色荧光蛋白)、溶瘤因子或增强肿瘤杀伤活性的试剂(例如肿瘤坏死因子(“TNF”)或TNF相关的凋亡诱导配体(“TRAIL”))，或其他治疗上重要的基因产物(例如，肽、药物激活酶、抗体、治疗性或调节性RNA等)。
示例性外源表达盒编码蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽诱导针对使用本发明的HSV要治疗的癌症或肿瘤的患者免疫应答。例如，此类表达盒可包含一种或多种编码因子的核酸，所述因子例如细胞因子(例如IL-12和IFN-β)、针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(“CTLA-4”)的抗体(Hodi等人,N.Engl.J.Med.,363(8):711-23(2010))、针对程序化细胞死亡蛋白1(PD1)的配体或受体本身的抗体(Topalian等人,N.Engl.J.Med.,366(26):2443-54(2012))或上皮细胞粘附分子(“EpCAM”)(Patriarca等人,Cancer Treatment Rev.,38:68-75(2012))。EpCAM既可用作细胞靶标，又可用作rHSV靶向配体。在一个实施方案中，外源表达盒编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)。例如，如Chung,HK等人(2019)中所述，所述外源表达盒还可以编码用于“重塑针对效应物释放的异常信号传导(rewiring ofaberrent signaling to effector release)”(RASER)的蛋白质。紧凑的合成路径重塑针对治疗效应物释放的癌症信号传导，Science364(6439),eaat6982,DOI:10.1126/science.aat6982。
其他表达盒编码催化前药向活性剂转化的蛋白质或多肽。例如，此类表达盒可以编码酶，诸如胞嘧啶脱氨酶，其可以在由本发明载体感染的肿瘤或癌细胞中局部地将5-氟胞嘧啶(“5-FC”)转化为5-氟尿嘧啶(“5-FU”)(参见例如，Akimoto等人,J.Ophthalmol.,86(5):581-86(2002))，以允许5-FU在此类细胞或肿瘤内局部地发挥作用，同时最大限度地减少对5-FU的全身暴露。类似地，此种表达盒可以编码胸苷激酶(tk)(例如，可操作地连接至HSV立即早期启动子或强组成型启动子)或嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，所述胸苷激酶可以激活更昔洛韦(ganciclovir)，所述嘌呤核苷磷酸化酶可以阻断或减弱核糖核苷酸还原酶的活性。在某些实施方案中，本发明载体还可以包含功能性天然HSV tk基因。
在本文所述的rHSV载体中，外源表达盒内的编码序列可以与任何期望的遗传调节序列(例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子，其许多实例是本领域已知的)或微小RNA靶位点可操作地连接。例如，常用的组成型启动子是人巨细胞病毒(hCMV)启动子，并且也可以使用其他启动子，例如CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、HSV立即早期启动子(例如ICP4启动子)等。
此外，在某些实施方案中，本发明载体的基因组包含内部重复(接头)区域的缺失，所述内部重复(接头)区域包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT和ICP4各一个拷贝以及ICP47或ICP22基因的启动子。在其他实施方案中，并非缺失接头，而是可以将接头区域中或其侧翼的基因(尤其是ICP0、ICP34.5和/或ICP47)的表达通过缺失这些基因或以其他方式使它们发生有限的诱变来阻止它们的表达或产物功能性，从而使这些基因的表达沉默。
rHSV载体可以通过HSV病毒学领域的普通技术人员已知的标准方法生产。然而，为了便于HSV基因组的操纵和本发明载体的生产，本发明还提供了代表本发明载体基因组的核酸。一方面，所述核酸是编码rHSV载体的细菌人工染色体(“BAC”)，其有助于在细菌系统中操纵HSV。
本文所述的rHSV可用于在体内或体外靶向和杀死癌细胞。在一种应用中，rHSV载体被治疗性地用于例如人类患者中和/或针对人类肿瘤/细胞(其可以是多种哺乳动物物种中的异种移植物)使用。但是，所述方法也可以用于动物，例如伴侣动物(例如猫和狗)，或具有农业重要性的动物(例如牛、绵羊、马等)或具有生态重要性的动物。本发明载体可用于治疗的示例性肿瘤/癌细胞包括：中枢神经系统癌症(例如多形性胶质母细胞瘤(例如，靶向EFGR/vIII的))、乳腺癌(例如，靶向HER2的)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC，例如，靶向EFGR/vIII的)、前列腺癌(例如，靶向EFGR/vIII的)和肺癌(NSCLC)(例如，靶向EFGR/vIII的)。
通常，当可以将足够的病毒递送给细胞群体以确保细胞面对适当数量的病毒颗粒时，rHSV载体最有用。因此，本发明提供了一种包含rHSV载体的原液，例如均匀原液。HSV原液的制备和分析是本领域众所周知的。例如，病毒原液可以在含有用rHSV载体转导的细胞的滚瓶或多层细胞堆叠中制造。然后可以在连续密度梯度介质(例如
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梯度)上纯化病毒原液，分装并保存直至需要。病毒原液的滴度差异很大，主要取决于病毒基因型以及用于制备它们的方案和细胞系。可能优选的是，此种原液具有至少约105噬菌斑形成单位(pfu)的病毒滴度，例如至少约106pfu，至少约107pfu，至少约108pfu，至少约109pfu，至少约1010pfu，或至少约1011pfu。
本发明另外提供了一种组合物，其包含本发明的oHSV载体和载剂，优选生理上可接受或药学上可接受的载剂。组合物的载剂可以是用于载体的任何合适的载剂。载剂通常是液体，但也可以是固体，或液体和固体组分的组合。载剂期望地是药学上可接受的(例如生理上或药理学上可接受的)载剂(例如赋形剂或稀释剂)。药学上可接受的载剂是众所周知的并且容易获得。载剂的选择将至少部分地由用于施用组合物的特定载体和特定方法决定。组合物可以进一步包含任何其他合适的组分，特别是用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，本发明的组合物有多种合适的配方。以下配方和方法仅是示例性的，绝不是限制性的。
适用于肠胃外给药的配方包括水性和非水性、等渗的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配方与预期受体的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。配方可以在例如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中提供，并且可以在仅需要在即将使用前才添加用于注射的无菌液体赋形剂(例如水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
另外，组合物可以包含另外的治疗剂或生物活性剂，或者另外的治疗剂或生物活性剂可以与rHSV共同施用。例如，可以存在或共同施用可用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子，例如布洛芬或类固醇，可以是组合物的一部分，或者可以被共同施用以减少与载体的体内给药有关的肿胀和炎症以及生理痛苦。免疫系统抑制剂可以与组合物方法施用，以减少对载体本身或与疾病相关的任何免疫应答。可选择地，免疫增强剂可以包含在组合物中或共同施用以上调人体对疾病的自然防御，特别是针对要使用本发明载体对抗的癌症或肿瘤的自然防御。抗生素，例如杀微生物剂和/或杀真菌剂，可以包含在组合物中或共同施用，以降低与基因转移程序和其他疾病有关的感染风险。
如图3所示，制备了重新靶向的rHSV。HSV-1基因组由两个独特的区域(独特的长[UL]，108kb，和独特的短[US]，13kb)组成，每个区域的侧翼均为大的反向重复序列。插入重组盒(GW)代替gD编码序列(ΔgD:GW)，以允许在gD启动子的控制下快速地定向特异性插入改变的gD基因。该骨架包含细菌人工染色体(BAC)序列，其允许在细菌中生成突变病毒基因组并通过转染合适的哺乳动物细胞系产生感染性病毒。构建体还包含用于观察重新靶向的病毒进入的由泛素C启动子(UbCp)驱动的mCherry报道基因，和增强病毒进入的突变gB基因(gB:NT或gB:N/T；Uchida等人,A Double Mutation in Glycoprotein gB Compensatesfor Ineffective gD-Dependent Initiation of Herpes Simplex VirusType1Infection.J Virol 2010:12200-12209.DOI:10.1128/JVI.01633-10；Uchida等人,Effective treatment of an orthotopic xenograft model of human glioblastomausing an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Mol Ther 21,561-569,doi:10.1038/mt.2012.211(2013))。gD wt包括来自毒株KOS的野生型gD序列，包括信号肽(残基-25至-1)、HVEM结合位点、结合素-1结合位点(包括Y38)、跨膜区(TM)和细胞质尾部区域(CT)。gD:scEΔ38的开放阅读框缺失了残基Y38，从而破坏了结合素-1结合位点，并用抗EGFR/EGFRvIII scFv序列取代了HVEM结合位点的残基2-24，从而有效地重新靶向了rHSV(图7A和7B)。
实施例
大约70％的人类群体是HSV血清阳性的。因此，我们想知道，通过HSV中和性抗gD抗体所识别的表位的诱变来改变重新靶向gD的表位结构是否会降低单克隆(也可能是多克隆)抗gD抗体对重新靶向gD和重新靶向病毒的识别，从而增加病毒对病毒中和(VN)血清的抗性。我们比较了一组模拟人类HSV免疫血清中的抗体特异性的单克隆抗体(mAb)与野生型和重新靶向的gD的纯化胞外域的结合，揭示了在重新靶向的gD中保留了两个突出的野生型gD表位。每个表位中的关键残基被单独或一起取代，导致以下发现：两种取代(i)均阻断了mAb对相应表位的重新靶向gD识别，并且其组合导致了mAb结合的整体降低；(ii)在无病毒的细胞-细胞融合测定中，通过对每个表位均具有反应性的VN mAb防止融合抑制；和(iii)增加了重新靶向的HSV-1对这些VN mAb的抗性。消除其他共有表位的诱变作用有望进一步降低重新靶向的病毒对中和抗体的敏感性。
材料和方法:
质粒
用于病毒基因组修饰的基于pENTR的质粒：将完整的gD wt和gD:scEΔ38编码序列(例如，编码SEQ ID NO:1)克隆到质粒pENTR1A的Gateway(GW)相容的attL位点之间。通过引入内部BstBI位点以插入表示密码子54从CCG变成CAG并且侧翼为BstBI和BspEI位点的合成DNA片段(GenScript)来产生P54Q取代。同样，通过用KasI和FspI位点取代表示密码子T213M从ACG变成ATG的合成DNA片段(GenScript)来引入T213M取代。
用于gD胞外域表达和纯化的基于pVT-Bac的质粒：通过使用引物pVT Bac gD:scEGFRΔ38 5’CCAGCCCGGGCAAAGACATTCTAATGACCCAATCTC(SEQ ID NO:7)(引入SmaI位点(带下划线))和pVT Bac gD:scEGFRΔ38 3’GGTATGCGGCCGCTTAATGGTAAGGCGTCGCGGCGTCCT(SEQ ID NO:8)(引入NotI位点(带下划线))的PCR扩增分离出wt的gD、重新靶向的gD和突变重新靶向的gD的成熟胞外域(残基1-306)的编码序列。将各自的pENTR重组体用作模板，并将PCR产物克隆到杆状病毒表达质粒pVT-Bac中以产生可溶性蛋白。
用于哺乳动物细胞中gD表达的基于pcDNA3.1的质粒：通过LR Clonase II(ThermoFisher,Waltham,MA)介导的与各自的基于pENTR的质粒的重组，将wt gD和重新靶向gD的编码序列克隆到修饰的pcDNA 3.1质粒中，所述质粒包含CMV启动子和牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化区域之间的Gateway(GW)重组盒(pcDNA-GW；Reinhart等人,An HSV-basedlibrary screen identifies PP1αas a negative TRPV1 regulator with analgesicactivity in models of pain,Mol Ther 2016,3:16040,doi:10.1038/mtm.2016.40)。
其他质粒：Uchida,H.等人,Novel mutations in gB and gH circumvent therequirement for known gD Receptors in herpes simplex virus 1entry and cell-to-cell spread.J Virol,2013.87(3):第1430-42页描述了gB:NT表达质粒pCAgB:NT。gH和gL表达质粒pPEP100和pPEP101分别由Patricia Spear(西北大学)馈赠。由John Ohlfest(明尼苏达大学)获得的PT3.5/CMV-EGFRvIII购自Addgene(质粒#20280)。pCX4-bsr-DEST、pCL-gag-pol和pHCMV-VSVG是来自Akihiro Umezawa(NRICHD,Tokyo,Japan)的馈赠。通过使用引物Sal1EGFRvIIIF(gactagtcgacAATTCGTTGGCCGCATGCGA，SEQ ID NO:9)和Xho1EGFRvIIIR(cactactcgagTCATGCTCCAATAAATTCACTGCTTTG，SEQ ID NO:10)的PCR扩增来自质粒PT3.5/CMV-EGFRvIII的EGFRvIII编码序列来构建pCX4-bsr-EGFRvIII(Weisner,SM等人,De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice usingplasmid DNA.Cancer Res.2009年1月15日；69(2):431-9.doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1800)。通过SalI-XhoI酶消化并克隆到pENTR1a的SalI和XhoI位点之间，将PCR片段转移到pENTR1a(ThermoFisher)中。通过LR Clonase II介导的重组将EGFRvIII编码序列从pENTR1a转移到pCX4-bsr-DEST。通过DNA测序确认所有的新构建体。
病毒细菌人工染色体(BAC)上的GW相容性gD无效病毒主链KNTc-ΔgD:GW(图3)是通过Red介导的GW盒GW-Zeo对gD编码序列的取代而从KNTc BAC衍生的(Miyagawa,Y.等人,Herpes simplex viral-vector design for efficient transduction of nonneuronalcells without cytotoxicity.Proc Natl Acad Sci U S A,2015.112(13):第E1632-41页)，GW-Zeo是用靶向近端5’和3’gD非翻译序列的引物扩增的，基本上如Miyagawa等人中所述。然后通过LR Clonase II介导的GW盒与不同的基于pENTR的gD质粒的重组，引入Wt gD基因和重新靶向的gD基因。通过转染Vero细胞产生感染性病毒，并通过在Vero细胞上进行标准噬菌斑测定来确定生物学滴度。所有重组病毒均通过跨gD盒的DNA测序确认。
细胞鼠类黑素瘤B78H1、B78-C10(结合素-1转导的B78H1；Miller,C.G.等人,Development of a Syngenic Murine B16 Cell Line-Derived Melanoma Susceptibleto Destruction by Neuroattenuated HSV-1,MolTher 2001,3:160-168,doi:10.1006/mthe.2000.0240)和B78/C细胞(结合素-1转导的B78H1)(Uchida,H.等人,Generation ofherpesvirus entry mediator(HVEM)-restricted herpes simplex virus type 1mutantviruses:resistance of HVEM-expressing cells and identification of mutationsthat rescue nectin-1recognition.J Virol,2009.83(7):第2951-61页)在补充有5％胎牛血清(FBS；Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle'smedium)(DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。非洲绿猴肾Vero细胞(ATCC CCL-81)在补充有5％FBS的DMEM中培养。通过用表达EGFRvIII的重组逆转录病毒感染B78H1细胞来建立B78-vIII细胞，所述重组逆转录病毒是通过质粒pCX4-bsr-EGFRvIII、pCL-gag-pol和pHCMV-VSVG共转染293T细胞(ATCC CRL-3216)而产生的。选择对杀稻瘟菌素具有抗性的感染的B78H1培养物，并通过蛋白质印迹和抗EGFR mAb H11的流式细胞术分析(ThermoFisher)测试抗性库的EGFRvIIII表达。验证后，基于表达水平在匹兹堡大学麦高恩研究所的细胞分选设施中对细胞进行分选，并通过有限稀释从高度表达级分中分离出命名为B78-vIII的克隆。不同B78-vIII克隆的EGFRvIII表达如图4所示。本研究中使用了一个克隆(11B)。
gD胞外域产生和mAb结合(SPRi)分析.使用的所有可溶性蛋白均在杆状病毒感染的昆虫(Sf9)细胞中产生。如Sisk WP,Bradley JD,Leipold RJ等人,High-levelexpression and purification of secreted forms of herpes simplex virustype1glycoprotein gD synthesized by baculovirus-infected insect cells.)JVirol.1994；68(2):766-775中所述，使用DL6免疫吸附柱纯化HSV-1gD(306t)的所有变体。gD-mAb结合分析是在Wasatch Microfluidics CFM/SPRi系统上使用可溶性蛋白进行的，如Cairns TM,Ditto NT,Lou H等人(Global sensing of the antigenic structure ofherpes simplex virus gD using high-throughput array-based SPR imaging.PLoSPathog.2017；13(6):e1006430)中所述的。使用CFM 2在CDM200M传感器芯片(Xantec GmbH)上创建了胺偶联mAb的48点微阵列。将打印机芯片对接至SPR成像器(IBIS MX96)后，将芯片用乙醇胺封闭，并使用PBS-0.01％Tween20的运行缓冲液填充系统。通过使100nM可溶性gD跨过已打印的mAb阵列流动来评估mAb结合；将1M甘氨酸pH 2.0用于再生。
融合测定.在Atanasiu D等人(Dual split protein-based fusion assayreveals that mutations to herpes simplex virus(HSV)glycoprotein gB alter thekinetics of cell-cell fusion induced by HSV entry glycoproteins.J Virol.2013；87(21):11332-11345)和Saw等人(Using a split luciferase assay(SLA)to measurethe kinetics of cell-cell fusion mediated by herpes simplex virusglycoproteins.Methods.2015；90:68-75)中描述了融合测定。简而言之，将5x104个B78H1细胞(效应细胞)接种在经过细胞培养物处理的白色96孔板上。将4x105个B78-vIII细胞(靶细胞)接种在6孔板上。第二天进行转染。将包含375ng gB:NT、125ng每种指定的gD构建体(wt gH、wt gL和Rluc8(1–7))的预混液分配到三个效应细胞孔中。每孔用1μg Rluc8(8–11)质粒转染靶细胞。转染后四十八小时，将效应细胞与在融合培养基(不含酚红的DMEM，50mMHEPES和5％FBS)中稀释的EnduRen底物(Promega)在37℃下一起预孵育1小时。将靶细胞用versene分离，重悬于融合培养基中并转移至效应细胞。通过添加靶细胞触发融合。还包括阴性对照(用gB:NT、gH、gL转染但没有用gD转染的效应细胞)。使用BioTek酶标仪，在6个小时内，用每小时的测量来监测荧光素酶的产生。
阻断融合.将转染的效应细胞与EnduRen底物和指定的gD mAb的2倍连续稀释液(从20μg/ml mAb开始，基于80μl最终体积)一起预孵育。
进入测定.将细胞在MOI＝1下感染过夜，并在Nikon Diaphot荧光显微镜(Nikon,Melville,NY)下对mCherry表达进行成像。
实时PCR.使用血液和组织DNA提取试剂盒(Qiagen,Venlo,Netherlands)分离病毒DNA。然后通过用HSV-1UL5质粒DNA模板创建标准曲线来确定基因组拷贝(gc)滴度。通过使用引物UL5F(ACGAGCGTGGTGCGGTCATGG)(SEQ ID NO:11)和UL5R(GCGGGTTAATAGACAATGACCACG)(SEQ ID NO:12)的PCR扩增UL5 DNA序列，并使用Zero BluntTOPO PCR克隆试剂盒(ThermoFisher)将其克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中。针对UL5基因(UL5qPCR F引物ATGCCGTAGTCGGCGTTTAT(SEQ ID NO:13)；UL5 qPCR R引物CGAGTTTGTCGAGTCCATTGAC(SEQ ID NO:14)；UL5 FAM MGB探针ATGGCCAGCTCCGTAG(SEQ IDNO:15))设计定制的FAM-MGB Taqman引物探针组(ThermoFisher)。通过创建以98-100％的效率扩增的UL5质粒的10倍稀释液系列(代表3x 106gc，对应于3x 102gc的HSV基因组)来生成每个实验的标准曲线。反应条件：2μl DNA，1μl 20x UL5 FAM-MGB Taqman引物探针组，10μl TaqMan Fast Advanced Universal PCR Master Mix(2x)，总PCR体积为20μl。扩增条件：在第一个循环中，在50℃下2分钟和在95℃下20秒，然后是95℃下1秒和60℃下20秒的40个循环。使用StepOne Plus实时PCR系统(Applied Biosystems)在MicroAmp光学96孔反应板中一式三份地运行样品、标准曲线和阴性对照。
蛋白质印迹.通过在1X Laemmli缓冲液(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)中煮沸使基于gc的等量的纯化病毒原液变性，并在预制的4-15％SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories)上电泳。将蛋白质转移至PVDF膜(Millipore,Billerica,MA)，并将膜的水平切开部分与抗VP16(Santa Cruz,Dallas,TX)、抗gD(DL6,Santa Cruz,Dallas,TX)或抗gB(Virusys Corp.,Taneytown,MD)反应，然后与HRP缀合的兔抗小鼠IgG(Abcam,Cambridge,UK)一起孵育。使用ECL Plus(ThermoFisher)使膜显影。
病毒中和在感染Vero细胞之前，将重组病毒(50-75PFU/孔)与病毒中和性mAb MC5和MC23在一定范围的稀释度下一起孵育。在感染的细胞单层上覆盖高密度培养基，并在48小时后在Nikon Diaphot荧光显微镜下对噬菌斑进行计数。
结果
重新靶向诱导gD抗原结构发生变化.
我们使用纯化的gD胞外域的SPRi分析来比较wt gD和重新靶向的gD的表位景观。对于任何黄色组的mAb，均未观察到与重新靶向的gD的结合(图5(A))。这是预料之中的，因为这些mAb(表1中的第VII组)识别wt gD的HVEM结合N末端片段(表1)，其在重新靶向gD中被我们的抗EGFR/EGFRvIII scFv很大程度上取代。此外，我们观察到与绿色群mAb以及棕褐色mAb(棕色组的VN成员)的结合减少，同时红色和蓝色组的mAb的结合有一些减少。有趣的是，棕色组中的所有非VN mAb都显示出增加的结合(参见Cairns等人,2017及上文，描述了各种有色组或“社群”)。这些观察结果表明，重新靶向修饰广泛影响gD的构象。
mar突变进一步改变了重新靶向的gD的抗原结构并减少了特异性中和mAb的结合
为了消除中和mAb的结合，我们在重新靶向的gD中创建了取代突变P54Q和T213M。基于SPRi结果，P54Q(图5(B))完全取消了MC5和另一种蓝色mAb(H162)的结合，H162显示出与亲本重新靶向gD的结合的增加(图5(A))。此突变还降低了其他两种蓝色mAb以及绿色、棕色和棕褐色mAb的结合，但作用不明显(图5(B))。T213M似乎具有更特异的作用，导致红色组的mAb(尤其是MC23)的结合受到轻度至严重的损害，但其他mAb的结合没有重大变化(图5(C))。将重新靶向的gD中的两个突变(P54Q/T213M)结合在一起表明了加和效应，与单独的P54Q的结合曲线非常相似，但红色mAb的结合受限(图5(D))。总的来说，这些结果表明，合理取代突变的堆积可以广泛地降低重新靶向的gD的抗原组成。
mar突变降低了重新靶向的gD的无病毒细胞-细胞融合活性
我们使用哺乳动物构建体在HSV进入受体缺陷型小鼠黑素瘤B78H1细胞表面上与糖蛋白gB:NT和gH/gL一起表达全长的亲本和突变的重新靶向gD。在将这些细胞与经EGFRvIII稳定转导的B78H1细胞(B78-vIII)一起孵育后，我们以1小时的间隔历经6小时的时期通过分裂荧光素酶测定法测量了细胞-细胞融合活性。尽管所有重新靶向的构建体都在转染的细胞与表达EGFRvIII的细胞之间引起融合，但与亲本gD:scEΔ38相比，P54Q和T213M突变体的活性降低了50％(图6A)。P54Q/T213M双重突变体的融合进一步受到损害(～15％活性)，表明突变损害了重新靶向的gD在细胞表面的呈递，或者直接干扰了修饰的gD引发融合级联的能力。
mar突变阻断了位点特异性mAb抑制细胞融合的能力.
为了确定由重新靶向的gD引发的融合是否对mAb MC5和MC23敏感，我们在添加B78-vIII细胞之前，先将用4种糖蛋白构建体转染的B78H1细胞与浓度升高的任一mAb一起孵育1小时。我们观察到，MC5和MC23均以剂量依赖性方式抑制了以亲本的重新靶向gD构建体转染的细胞的融合活性(图6B和6C)。但是，P54Q和T213M突变分别降低或完全阻断了MC5和MC23的抑制作用，并且组合的突变消除了对两种mAb的融合敏感性(图6B和6C)。
病毒的构建、生长和进入特异性
MC23和MC5是针对wt HSV-1的中和抗体，它们似乎分别通过阻断受体(结合素-1)结合或受体结合的gD对gH/gL的信号传导而在融合途径的不同阶段起作用。为了确定两种mar突变是否能减少重新靶向病毒的感染(如其对细胞融合效率的负面影响所表明)，同时保护所述病毒免受例如MC23和MC5的抗体的作用，我们创建了重组病毒，所述重组病毒表达亲本的重新靶向gD或其单或双突变衍生物，如上所述(图3)。使病毒在天然表达我们的抗EGFR scFv所识别的结合素-1和猿猴EGFR的Vero细胞上生长。通过在Vero细胞上进行标准噬菌斑测定来确定以PFU/μl为单位的生物滴度，并通过针对编码DNA解旋酶-引发酶亚基的HSV-1早期基因UL5的实时定量PCR(qPCR)创建以基因组拷贝数(gc)/μl为单位的物理滴度。病毒原液之间的gc/pfu比率的比较表明，未修饰的重新靶向病毒比其mar突变对应物更有效地产生感染性病毒(表2)。
表2
Figure BDA0002864656870000271
Figure BDA0002864656870000281
我们还使用Vero细胞作为对照，通过感染不表达gD受体(B78H1)、人结合素-1(B78/C)或EGFRvIII(B78-vIII)的细胞来测试了这4种病毒的进入特异性。感染后24小时，来自这些病毒的共同基因组骨架的mCherry表达图像显示，没有一种病毒能够进入B78H1或B78/C细胞，而所有病毒都可以进入B78-vIII和Vero细胞，证明了进入仍然严格依赖于灵长类EGFR的细胞表达(图7A)。
与亲本的重新靶向和T213M突变体相比，P54Q和P54Q/T213M突变体在MOI＝1时的进入效率似乎更低(图7A)，这可能与此特定实验中使用的不同病毒的原液之间的颗粒(gc)/PFU比率差异有关(表2)。
重新靶向的病毒突变体之间gD掺入病毒颗粒的比较.
我们使用DL6作为一抗，通过相等gc的蛋白质印迹分析评估了gD向纯化病毒粒子中的掺入。为了控制颗粒内容物的总体差异，我们还用针对gB和被膜蛋白VP16的抗体探测了印迹。如图7B中显示的结果所例证的，重新靶向减少了gD掺入，并且mar突变(特别是组合时)增强了这种效果。不同病毒(包括非靶向病毒(gD wt))之间的gB水平没有显著差异，表明gD和gB掺入是相互独立的。这些结果表明，重新靶向和mar突变均可限制成熟病毒粒子中gD的丰度，这很可能是经修饰蛋白的胞内加工受损、稳定性降低或两者兼而有之的结果。
mar突变增加了对于mAb的病毒中和的抗性
我们确认了重新靶向的病毒对mAb MC5和MC23所引起的失活是敏感的，并进行了其他中和测定，以确定mar突变是否提供针对这些mAb的保护。在感染Vero细胞之前，将病毒与MC5或MC23的连续稀释液一起孵育90分钟，并在48小时时对噬菌斑进行计数。图8的图A和图B显示，每个mar突变均以与早期结合和融合抑制结果一致的方式提高了重新靶向病毒的抗性。具体而言，P54Q突变体显示出对mAb MC5的抗性，类似地，T213M突变体也显示出对MC23的抗性。此外，P54Q/T213M双重突变体对两种mAb均具有抗性(图8(C,D))。
我们通过检查双重突变的重新靶向病毒对其他两种mAb(来自与MC5同组(蓝色)的H162，和来自与MC23同组(红色)的LP2)的病毒中和的抗性扩展了这些结果。与重新靶向gD的结合被双重突变消除(图5(D))的H162中和了重新靶向病毒，而双重突变体则被完全保护(图9(A))。同样，突变引起对LP2的抗性增加，尽管在较低的mAb稀释度下仍存在一些残留敏感性(图9(B))，这与LP2与双重突变的重新靶向gD的残留结合较低是相一致的(图5(D))。因此，突变对病毒中和的影响不限于蓝色和红色mAb组的单个代表。
由于SPRi结果显示，棕色组的所有或几乎所有mAb与重新靶向gD和双重突变的重新靶向gD的结合增加，相比wt gD而言(图5(A,D))，我们测试了2种棕色mAb对包含这些不同版本的gD的病毒的中和。结果(图9(C,D))显示，两种mAb均对这两种重新靶向的病毒具有中和性，而表达wt gD的非重新靶向的病毒对任一mAb的敏感性均非常低。我们提议这些mAb通过重新靶向修饰而增加其表位的可及性来获得中和活性，并且P54Q/T213M双重突变不能恢复该区域的受保护wt构象以减少或逆转这种作用。
应该注意的是，人类免疫血清通常不会阻断来自棕色组(例如MC14)的mAb与wt gD的结合(Cairns等人,2015)，这表明HSV免疫个体不包含针对重新靶向gD的棕色表位的抗体。
已经参考某些示例性实施方案、可分散组合物及其用途描述了本发明。但是，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对任何示例性实施方案进行各种替换、修改或组合。因此，本发明不受示例性实施方案的描述的限制，而是由最初提交的所附权利要求书限制。

Claims (24)

1.一种重新靶向的单纯疱疹病毒(HSV)颗粒，其包含基因组、衣壳、被膜和包膜，所述包膜包含糖蛋白，所述糖蛋白被修饰为通过削弱或阻断病毒附着和/或进入易感宿主细胞而减少或消除被干扰病毒感染的抗体的识别。
2.根据权利要求1所述的病毒颗粒，其包含抗原修饰的糖蛋白B(gB)和/或抗原修饰的糖蛋白D(gD)蛋白，其中对一个或多个主要人类血清HSV中和抗体具有反应性的gB和/或gD的一个或多个主要表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
3.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中gD的一个或多个表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除一个或多个主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
4.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中gB的一个或多个表位被修饰，以减少或消除所述病毒颗粒与主要人类血清HSV中和抗体的结合，从而减少或消除一个或多个主要人类血清HSV中和抗体对病毒的中和。
5.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中在所述病毒颗粒的gD糖蛋白中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸10-20、54、75-79、132、140、213、216、222-224和262-279中的一个或多个、或对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸10-20、54、75-79、132、140、213、216、222-224和262-279的一个或多个氨基酸被修饰，以减少主要HSV血清中和抗体与所述病毒颗粒的结合。
6.根据权利要求5所述的病毒颗粒，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸P54和T213中的一个或两个、或对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸P54和T213的一个或两个氨基酸被修饰，例如P54Q和/或T213M。
7.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中在所述病毒颗粒的gB糖蛋白中的SEQ ID NO:3的氨基酸47、62、85、203、303、304、305、308、328、335、419、473、594或640-670或SEQ ID NO:4的氨基酸412中的一个或多个、或对应于SEQ ID NO:3的氨基酸47、62、85、203、303、304、305、308、328、335、419、473、594或640-670或SEQ ID NO:4的氨基酸412的一个或多个的氨基酸被修饰，以减少主要HSV血清中和抗体与所述病毒颗粒的结合。
8.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其具有SEQ ID NO:1或2的Δ38突变，或在gD糖蛋白中的对应于SEQ ID NO:1或2的Δ38突变的突变。
9.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其包含能够结合靶细胞类型的表面组分的非天然配体。
10.根据权利要求9所述的病毒颗粒，其中所述靶细胞类型是癌细胞。
11.根据权利要求9所述的病毒颗粒，其中能够结合靶细胞类型的表面组分的所述非天然配体被掺入到所述病毒颗粒的病毒包膜糖蛋白中。
12.根据权利要求11所述的病毒颗粒，其中掺入了配体的所述病毒颗粒的所述病毒包膜糖蛋白是gD、gC、gB和/或gH。
13.根据权利要求9所述的病毒颗粒，其中所述表面组分是EGFR、EGFRvIII、其他致癌EGFR变体、HER2、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3/膜联蛋白-2/MMP-2、人转铁蛋白受体、EpCAM或c-Met中的一个或多个。
14.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中至少一种或多种病毒包膜糖蛋白与其天然受体的结合被消除。
15.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中所述基因组包含外源表达盒。
16.根据权利要求15所述的病毒颗粒，其中所述外源表达盒编码增强肿瘤杀伤活性的试剂。
17.根据权利要求2所述的病毒颗粒，其中所述基因组包含用于一种或多种微小RNA的靶序列。
18.一种编码权利要求1至17中任一项的病毒颗粒的重组HSV基因组。
19.一种病毒原液，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的权利要求1至17中任一项的病毒颗粒。
20.一种剂型，其包含至少105pfu、至少106pfu、至少107pfu、至少108pfu、至少109pfu、至少1010pfu或至少1011pfu的权利要求1至17中任一项的病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。
21.根据权利要求20所述的剂型，其以单位剂型提供。
22.根据权利要求20所述的剂型，其被配制为用于肠胃外递送。
23.根据权利要求22所述的剂型，其被配制为用于静脉内递送。
24.一种治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用一定量的有效治疗癌症患者的权利要求1至17中任一项的病毒颗粒。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024067540A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Immvira Biopharmaceuticals Co., Limited Genetically engineered herpes simplex virus type 1 for treatment of hematologic cancers

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022173767A1 (en) * 2021-02-09 2022-08-18 University Of Houston System Oncolytic virus for systemic delivery and enhanced anti-tumor activities

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100172906A1 (en) * 2009-01-05 2010-07-08 Jiann-Shiun Lai Anti-herpes simplex virus antibodies and methods of use thereof
US20130096186A1 (en) * 2010-04-16 2013-04-18 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Identification of mutations in herpes simplex virus envelope glycoproteins that enable or enhance vector retargeting to novel non-hsv receptors
US20160250276A1 (en) * 2010-11-29 2016-09-01 Osaka City University Lissencephaly therapeutic agent
US20170081384A1 (en) * 2007-05-14 2017-03-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeted delivery of glycine receptors to excitable cells

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2781852T3 (es) * 2013-10-28 2020-09-08 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Vector de HSV oncolítico
JP6751721B2 (ja) * 2015-02-11 2020-09-09 アルマ マータ ステューディオラム — ユニバーシタ ディ ボローニャ 糖タンパク質ｈ融合により再標的化されたヘルペスウイルス

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170081384A1 (en) * 2007-05-14 2017-03-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeted delivery of glycine receptors to excitable cells
US20100172906A1 (en) * 2009-01-05 2010-07-08 Jiann-Shiun Lai Anti-herpes simplex virus antibodies and methods of use thereof
US20130096186A1 (en) * 2010-04-16 2013-04-18 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Identification of mutations in herpes simplex virus envelope glycoproteins that enable or enhance vector retargeting to novel non-hsv receptors
US20160250276A1 (en) * 2010-11-29 2016-09-01 Osaka City University Lissencephaly therapeutic agent

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOINS等: "Retargeting of herpes simplex virus (HSV) vectors", 《CURRENT OPINION IN VIROLOGY》 *
HIROAKI等: "Effective Treatment of an Orthotopic Xenograft Model of Human Glioblastoma Using an EGFR-retargeted Oncolytic Herpes Simplex Virus", 《MOLCULAR THERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024067540A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Immvira Biopharmaceuticals Co., Limited Genetically engineered herpes simplex virus type 1 for treatment of hematologic cancers

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