KR102405246B1 - 암세포 표적화 영역과 hvem의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 - Google Patents

암세포 표적화 영역과 hvem의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도를 개시한다. 상기 융합된 단백질은 재조합 HSV가 암세포인 표적세포를 감염시켜 표적세포 내로 들어가게 되면, HSV가 증식됨과 함께 융합 단백질인 어댑터가 세포 내에서 발현되어 세포 용해에 의하여 그 증식된 HSV 비리온과 함께 세포 외부로 방출되거나 어뎁터가 리더서열을 가질 경우에는 세포 용해에 의한 비리온 방출 이전에도 방출된다. 이 세포 외부로 방출된 어댑터는 HSV 비리온을, 어댑터의 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자를 발현하는 주변 암세포로 감염을 유도하거나 감염 효율을 높이는 작용을 하게 된다.

Description

암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도{Recombinant Herpes Simplex Virus Having Expression Cassette Expressing Fused Protein of Cancer Cell-Targeting Domain and Extracellular Damain of HVEM and Use Thereof}
본 발명은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도에 관한 것이다.
암 치료에는 현재까지 수술 요법, 항암 화학 요법, 방사선 요법 등이 널리 이용되어 있으나 대부분이 부작용을 수반하고 불완전한 치료 효과, 암 재발과 전이 등의 문제점을 가지고 있다. 따라서 새롭고 효과적인 암 치료법 개발이 지속적으로 요구되어 왔으며, 최근 몇년 사이 항암 바이러스, CAR-T 세포 치료법(chimeric antigen receptor T cell therapy) 등 항암 면역 요법에 있어 급속한 발전이 있었다.
항암 면역 요법 중 항암 바이러스는 살아있는 바이러스의 유전자를 조작해 암세포에서 선택적으로 증식하여 암세포를 용해하는 특성을 가진 바이러스로서, 정상세포에서의 증식은 제한적이다. 암세포를 용해하여 방출된 바이러스는 주변 암세포를 계속 감염시킴으로써 지속적이고 상승적인 치료 효과를 낼 수 있다. 또한 항암 바이러스는 암세포를 용해하는 과정에서 면역원성을 가진 종양 항원이 방출되어 인체의 면역반응을 자극시킴으로써 항암 효과를 높일 수 있으며, 또 이러한 항암 효과는 사이토카인, 케모카인 등을 발현하도록 인위적으로 조작함으로써 증진될 수도 있다.
현재의 개발되는 항암 바이러스는 아데노 바이러스와 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus, HSV), 백시니아 바이러스를 포함하여 10종 이상으로 나눌 수 있는데, 이중 HSV는 152kb 크기의 선상의 이중가닥 DNA를 포함하는 다면체성 바이러스(enveloped icosahedral virion)로서, HSV-1형과 HSV-2형으로 나뉜다. HSV는 많은 비필수 유전자(non-essential genes)를 가지고 있고 게놈의 크기가 커서 외부 유전자의 조작이나 운반이 용이하고, 복제 주기가 짧으며, 또 감염 효율이 높고, 세포 부착과 감염에 관여하는 당단백질의 조작이 용이하여 암세포에 대한 표적화를 개선시킬 수 있는 장점을 가진다.
2015년 10월 미국 FDA의 승인을 받은 T-VEC(Talimogene Laherparepvec, 제품명: 임리직)은 HSV-1을 이용한 악성 흑색종에 대한 항암 바이러스 치료제이다. T-VEC은 병원성을 약화시키기 위하여 ICP34.5와 ICP47 유전자가 결실되어 있고, 인체 면역 반응을 촉진시키기 위한 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)를 발현하는 약화된(attenuated) HSV-1형 바이러스이다. 그러나 T-VEC은 일부 유전자가 소실됨에 따라 바이러스 증식이 제한되어 치료 효능이 낮은 한계점을 갖고 있다.
HSV는 외피(envelope)를 가진 바이러스로, HSV의 세포 진입은 외피에 존재하는 당단백질 gD, gB, gH/gL 및 gC의 복잡한 상호 작용에 의해 이루어진다. 먼저 gB와 gC가 세포 표면의 3-O-S HS(3-O-sulfated heparan sulfate)에 부착하면, gD가 세포 수용체인 HVEM(herpesvirus entry mediator, HveA), 넥틴-1(nectin-1, HveC), 넥틴-2(nectin-2, HveB) 중 적어도 하나의 수용체 결합하여 바이러스와 세포막 사이의 융합을 유도함으로써 HSV가 세포로 진입한다(Hiroaki Uchida et al., Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)-restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition. J Virol. 2009 Apr;83(7):2951-61).
HSV의 세포 수용체 중 HVEM은 종양괴사인자 수용체 단백질 패밀리(tumor necrosis factor receptor protein family, TNFR family)에 속하며, 주로 T, B 림프구, 마크로페이지, DC 세포, 감각 신경 세포(sensory neuron), 점막 상피 세포(mucosal epithelial cell)에서 발현되지만(Shui JW, Kronenberg M. 2013. Gut Microbes 4(2):146-151), B, T 림프종, 흑색종, 직장암(colorectal cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 유방암(breast cancer), 난소의 장액 선암종(ovarian serous adenocarcinoma), 투명신세포암(clear renal cell carcinoma), 교모세포종(glioblastoma) 같은 여러 종양조직에서도 많이 발현되는 것으로 알려져 있다 (Pasero C et al., Curr Opin Pharmacol. 2012. 2(4):478-85, Malissen N et al., ONCOIMMUNOLOGY 2019, VOL. 8(12):e1665976) HVEM은 TNFR 패밀리의 특징인 4개의 CRD(cystein-rich domain)를 가지며, 이 중 2개의 CRD가 HSV의 gD와 결합하여 HSV-1과 HSV-2의 세포 진입을 유도하는 것으로 보고 있다(Sarah A Connolly et al., Structure-based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM). J Virol. 2002 Nov;76(21):10894-904.).
본 발명자들은 이전에 CEA(carcinoembryonal antigen)에 대한 scFv(single-chain variable fragment)와 HSV 세포 표면 수용체의 하나인 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질(CEAscFv-HveA)을 제작하여, 그 융합 단백질을 HSV와 함께 CEA을 발현하는 세포주에 처리할 경우, 그 융합 단백질이 어탭터(adapter)로 작용하여 HSV가 해당 세포주를 표적하여 감염시키도록 유도함을 이전에 보고한 바 있다(한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호 참조).
본 발명은 상기 어댑터인 융합 단백질(CEAscFv-HveA)을 암호화하는 유전자를 HSV의 게놈에 발현 가능하게 삽입하여 그 융합 단백질이 HSV에 감염된 세포 내에서 발현되도록 할 경우, 그 융합 단백질이 HSV를, CEA을 발현하는 세포주를 표적하여 감염시키도록 유도함을 확인하는 한편, CEA에 대한 scFv 대신에 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)에 대한 ScFv와 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질(HER2scFv-HveA)도 마찬가지로 HER2를 발현하는 세포주를 표적하여 감염시키도록 유도함을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 목적은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어뎁터를 발현할 수 있는, 그 융합 단백질의 발현 카세트를 가지는 재조합 HSV를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 HSV를 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 유효량으로 환자 등 대상체에 투여하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 암세포 표적화 영역(암 표적화 영역은 본 명세서에서 암 표적화 도메인과 혼용되어 사용되거나, 본 명세서의 문맥에 따라서는 리간드로 표현된다)과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어뎁터를 발현할 수 있는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus, HSV)에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 HSV가 암세포인 표적세포를 감염시켜 표적세포 내로 들어가게 되면, HSV가 증식됨과 함께 융합 단백질인 어뎁터가 세포 내에서 발현되어 세포 용해에 의하여 증식된 HSV 비리온과 함께 세포 외부로 방출되거나 어뎁터가 리더서열을 가질 경우에는 세포 용해에 의한 비리온 방출 이전에도 방출된다. 이 세포 외부로 방출된 어뎁터는 HSV 비리온을, 어뎁터의 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자를 발현하는 주변 암세포로 감염을 유도하거나 감염 효율을 높이는 작용을 하게 된다.
일반적으로 재조합 HSV는 야생형 HSV 바이러스와 비교할 때 인위적인 돌연변이가 도입됨으로써(즉 일부 핵산 서열이 결실, 치환 또는 삽입됨으로써) 일정 기능이 상실 또는 변경되거나 의도한 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전적으로 조작된 HSV를 의미하는데, 본 발명에서 재조합 HSV는 HSV 게놈에, HSV의 증식을 저해하지 않으면서, 어댑터의 발현 카세트(adapter expressionl cassette)(즉 어뎁터 유전자가 이의 발현을 가능하게 하는 프로모터 서열 및 폴리아데닐화 시그널 서열과 작동가능하게 연결된 구성체)를 도입(즉 삽입)함으로써 그 재조합 HSV가 감염된 암세포 내에서 어뎁터를 발현할수 있는 HSV를 의미한다. 이러한 바이러스의 유전자 조작과 비리온의 생산 등 재조합 바이러스 제조 기술은 당업계에 매우 잘 공지되어 있으며, 구체적으로는 문헌[Sandri-Goldin RM et al, Alpha Herpesviruses: Molecular and Cellular Biology, Caister Academic Press, 2006], 문헌[Robin H Lachmann, Herpes simplex virus-based vectors, Int J Exp Pathol. 2004 Aug; 85(4): 177-190] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌을 포함하여 본 명세서에서 인용되는 문헌들은 모두 본 명세서의 일부로 간주된다.
본 발명의 재조합 HSV는, 특히 이러한 어뎁터를 발현하도록 조작되는 이외에, 진입 수용체(entry receptor)로서 넥틴-1(nectin-1)을 통하여 세포 내로 진입하지 못하고 오직 HVEM 수용체를 통해서만 세포 내로 진입하도록 추가로 조작될 수 있다. 본 발명은 아래의 실시예에서 HSV 당단백질(envelope glycoprotein) gD의 서열을 조작하여 HVEM 수용체를 통해서만 HSV가 세포 내로 진입하도록 하였다. 구체적으로 gD의 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)을 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환시켜 gD의 기능이 변경되도록 조작하였으며, 이러한 gD 기능이 변경된 재조합 HSV는 오직 HVEM(HveA) 수용체를 통해서만 숙주세포 내로 들어갈 수 있다(Hiroaki Uchida et al. Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)-restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition. J Virol. 2009 Apr;83(7):2951-61). HVEM(HveA) 수용체는 정상세포에는 거의 존재하지 않고 림프종 등에만 존재하는데 반해, 넥틴-1은 대부분의 정상세포에 존재하므로, HVEM 수용체를 통해서만 세포 진입이 가능하고 넥틴-1 수용체를 통해서는 세포 진입이 불가한, 상기 gD 기능이 변경된 재조합 HSV는 정상세포를 감염시키지 못하므로 안전성 측면에서 유리한 특성을 가지게 된다.
또한 본 발명의 재조합 HSV는 HSV의 증식(즉 생존과 복제)에 필요하지 않은 비필수 유전자(non-essential genes)가 결실되거나 기능을 발휘하지 않도록(즉 전사나 번역이 방해를 받도록) 돌연변이(mutation) 될 수도 있다. 구체적으로 그러한 비필수 유전자는 UL3 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62830.1 참조), UL4 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62831.1 참조), UL14 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62841.1), UL16 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62843.1 참조), UL21 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62848.1 참조), UL24 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62851.1 참조), UL31 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62859.1 참조), UL32 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62860.1 참조), US3 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62891.1 참조), UL51 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62880.1 참조), UL55 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62884.1 참조), UL56 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62885.1 참조), US2 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62890.1), US12 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62901.1; 즉, ICP47 유전자 참조), LAT 유전자(예컨대, Genbank Accession No. JQ673480.1 참조), gB 유전자(예컨대, Genbank Accession No. GU734771.1의 52996과 55710 사이 서열), gL 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62828.1 참조), gH 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62849.1 참조), gD 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62894.1 참조) 1) 등을 들 수 있다.
HSV 바이러스의 비필수 유전자에 대해 더 구체적인 것은 문헌[DM Knipe and PM Howley(ed.) Fields virology(vol.2) Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. 2001. p.2399-2460)], 문헌[Subak-Sharpe J H, Dargan D J HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251], 문헌[Travis J. Taylor 및 David M. Knipe, Proteomics of Herpes Simplex Virus Replication Compartments: Association of Cellular DNA Replication, Repair, Recombination, and Chromatin Remodeling Proteins with ICP8, J Virol. 2004 Jun; 78(11): 5856-5866] 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1/HSV-2 키메라 바이러스(즉, 게놈이 HSV-1로부터 유래된 DNA 및 HSV-2로부터 유래된 DNA 둘 모두를 포함하는 재조합 HSV 바이러스임)일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 HSV-1 바이러스, 더 바람직하게는 HSV-1 KOS 균주로부터 유래된 재조합 HSV-1이다. HSV-1 KOS 균주는 ATCC(Cat No VR-1493TM)로부터 구입이 가능하고 그 균주의 게놈 서열은 전체 서열 분석이 완료되어 GenBank Accession No. JQ673480.1에 제시되어 있다(Stuart J Macdonald et al. Genome Sequence of Herpes Simplex Virus 1 Strain KOS. J Virol. 2012 Jun;86(11):6371-2).
HSV-1 바이러스의 게놈은 총 84개의 유전자를 암호화하는 152 kb의 이중가닥 선형 DNA로 구성되어 있으며, 이는 서로 연결된 두 개의 단편 즉 긴 단편(L 영역)와 짧은 단편(S 영역)으로 구성된다. 긴 단편(L 영역)은 게놈의 약 82%를 차지하고, 짧은 단편(S 영역)은 게놈의 약 18%를 차지하며, 긴 단편과 짧은 단편은 접합 영역인 2개의 IRL((intermediate inverted repeat sequence) 의해 결합되며, 각 단편의 말단에는 TRL(terminal inverted repeat segment)이 존재한다. L 영역(UL)에는 56개의 UL1~UL56 유전자와 10개의 유전자(UL8.5, 9.5, 10.5, 12.5, 15.5, 20.5, 26.5, 27.5, 43.5, 49.5)가 존재하고, S 영역(US)에는 12개의 US1~US12 유전자와 2개의 유전자(US1.5, 8.5)가 존재하며, 접합 영역인 2개의 IRL에 4개의 유전자(ICP4, ICP34.5, ICP0 및 LAT)가 포함되어 있다.
본 발명에서, 어댑터 발현 카세트는 어댑터 유전자가 그것의 발현을 가능하게 하기 위한 프로모터 서열과 전사 종결 신호 서열인 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal) 서열과 작동 가능하게 연결되어 구성된다. 여기서 "작동 가능하게 연결된다"는 것은 발현되는 어뎁터 유전자의 전사 및/또는 번역이 가능하도록 연결된다는 의미이다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그것에 연결된 어댑터 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 프로모터는 그 어뎁터 유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다.
일반적으로 프로모터는 어떤 유전자의 전사 개시점을 기준으로 상위(5'쪽)에 위치하고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시점, 전사 인자 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는 진핵생물 유래일 경우 전사 개시점 상위에 있는 TATA 박스(통상 전사 개시점(+1) -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시 부위와 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 인핸서, 전사 인자 결합 부위 등을 포함한다.
프로모터는 그것에 연결된 목적유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터라면 구성적 프로모터(상시적으로 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 유도성 프로모터(특정 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 조직 특이성 프로모터(특징 조직이나 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 조직 비특이적 프로모터(모든 조직이나 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프모모터), 내인성 프로모터(바이러스가 감염되는 세포에서 유래된 프로모터), 외인성 프로모터(바이러스가 감염되는 세포 이외의 세포에서 유래된 프로모터) 모두 사용이 가능하다. 이러한 프로모터는 당업계에 많은 것이 공지되어 있으며 공지된 것 중 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 promotor), 라우스 육종 바이러스(RSV, rous sarcoma virus) 프로모터, HSV(herpes simplex virus) TK(thymidine kinase) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 75K 프로모터, SV40 프로모터, 메탈로티오닌(metallothionein) 프로모터, CD45 프로모터(조혈모세포 특이적 프로모터), CD14 프로모터(단핵구세포 특이적 프로모터), 서비빈(Survivin), 미드킨(Midkine), TERT, CXCR4 등의 암세포 특이적 프로모터(tumor specific promoter) 등을 사용할 수 있다. 특히 암세포 특이적 프로모터를 사용할 경우 암세포에서만 어뎁터의 발현을 유도함으로써 어뎁터가 정상세포에서 발현되는 것을 억제하여 본 발명의 재조합 HSV의 안전성을 높일 수 있다.
상기 어댑터 발현 카세트는 프로모터 이외에 전사 종결 신호 서열을 포함하여 구성되는데, 전사 종결 신호 서열은 poly(A) 첨가 신호(polyadenylation signal)로 작용하는 서열로서 전사의 완결성 및 효율성을 높이기 위한 것이다. 많은 전사 종결 신호 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이중에서 적절한 것 예컨대 SV40 전사 종결 신호 서열, HSV TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)의 전사 종결 신호 서열 등을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 어댑터 발현 카세트는 HSV의 증식을 저해하지 않으면서 HSV 게놈에 발현 가능하도록 삽입되는데, 그러한 삽입은 HSV 게놈의 결실 없이 삽입되거나, 또는 HSV 게놈 중 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 수 있다. 어댑터 발현 카세트가 HSV 게놈의 결실 없이 삽입될 경우 각 유전자 사이에 삽입될 수 있는데, 삽입되는 위치로서 바람직한 위치는 예컨대 UL3과 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 유전자 사이 등을 들 수 있다.
어댑터 발현 카세트가 HSV 게놈에 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 경우, 결실되는 비필수 유전자는 앞서 예시한 바의 임의의 비필수 유전자일 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV에서, 어뎁터의 암세포 표적화 영역은 표적세포인 암세포의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 부분으로서, 이러한 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자는 암세포의 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체이다.
이러한 항원 또는 수용체는 바람직하게는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 항원 또는 수용체를 말한다. 예컨대 교모세포종(glioblastoma)에서 발현되는 EGFRvⅢ(epidermal growth factor receptor variantⅢ), 역형성 갑상선암이나 유방암, 폐암, 신경교종(glioma) 등에 과발현되는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), 유두성 갑상선 암(papillary thyroid cancer) 등에서 과발현 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 유방암 등에서 과발현되는 ErbB 계열의 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), 유방암, 방광암, 담낭암(Gallbladder cancers), 담관암(Cholangiocarcinomas), 위식도접합부암(esophagogastric junction cancers) 등에서 과발현되는 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 육두성 신암종 등에서 과발현되는 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), 식도 선암 등에 과발현되는 HGF 수용체 c-Met, 유방암 등에서 과발현되는 CXCR4 또는 CCR7, 전림선암에서 과발현되는 엔도테린-A 수용체, 직장암 등에서 과발현되는 PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), 난소암 등에서 과발현되는 PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), 간암, 다발성 골수종 등에서 과발현되는 CD133, 폐암, 대장암, 위암, 췌장암, 유방암, 직장암, 결장암, 갑상선 수질암 등에서 과발현되는 CEA(carcinoembryonic antigen), 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등에서 과발현되는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), 신경모세포종 등에서 과발현되는 GD2(disialoganglioside), 간세포암 등에서 과발현되는 GPC3(Glypican 3), 전립선암 등에서 과발현되는 PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), 난소암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암 등에서 과발현되는 TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), 흑색종 등에서 과발현되는 GD3(disialoganglioside), 혈액암, 고형암 등에서 과발현되는 HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), 진행성 고형암 등에서 과발현되는 MUC1(Mucin 1), 진행성 폐암(advanced non-small-cell lung cancer) 등에서 과발현되는 NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), 비인두종양(Nasopharyngeal neoplasms) 등에서 과발현되는 LMP1(Latent membrane protein 1), 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 등에서 과발현되는 TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), 간세포암 등에서 과발현되는 HGFR(hepatocyte growth factor receptor) 등이 표적분자일 수 있으며, 또한 암 줄기세포의 표면 항원인 CD44, CD166 등이 또한 표적 분자일 수 있다. 당업계에는 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 많은 표적분자가 알려져 있으며, 상기 예시된 것 이외의 기타의 표적분자와 관련해서 더 구체적인 것은 문헌[Anne T Collins et al. Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10946-51], 문헌[Chenwei Li et al. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2007 Feb 1;67(3):1030-7], 문헌[Shuo Ma et al. Current Progress in CAR-T Cell Therapy for Solid Tumors. Int J Biol Sci. 2019 Sep 7;15(12):2548-2560], 문헌[Dhaval S Sanchala et al. Oncolytic Herpes Simplex Viral Therapy: A Stride Toward Selective Targeting of Cancer Cells. Front Pharmacol. 2017 May 16;8:270] 등을 참조할 수 있다.
특히 본 발명에서 표적분자는 바람직하게는 HER2 또는 CEA이다.
본 발명의 재조합 HSV가 어뎁터에 의해 표적화하는 표적세포는 본 발명에서의 어뎁터의 암세포 표적화 영역이 표적할 수 있는 표적분자를 가지는 임의의 암세포이다. 암세포라면 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 흑색종, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종, 혈액암 등 암종을 불문한다.
본 발명에서, 어뎁터의 세포 표적화 영역은 표적분자와 특이적 결합능을 가지는 완전한 항체 이외에도 항체 유도체, 항체 유사체일 수 있다. 항체 유도체는 표적분자와 특이적 결합능을 가지는 항체 가변 영역을 적어도 하나 이상 포함하는 완전한 항체의 단편 또는 변형 항체을 의미한다. 이러한 항체 유도체로서는 Fab, scFv, Fv, VhH, VH, VL 등의 항체 단편, Fab2, Fab3, 미니바디, 디아바디, 트리바디, 테트라바디, 비스-scFv 등의 다가성 또는 다중특이적 변형 항체 등을 들 수 있다. 항체 유사체는 항체와 마찬가지로 표적분자와 특이적 결합능을 갖지만 구조상 항체와는 다르고 일반적으로 항체보다 낮은 분자량을 갖는 인위적 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 유사체로서 ABD, 애드히론 (adhiron), 애피바디(affibody), 애필린(affilin), 애피머(affimer), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 아르마딜로(armadillo) 반복 단백질, 센티린 (centyrin), 달핀(DARPin), 피노머(fynomer), Kunitz 영역, 프로넥틴 (pronectin), 리피바디(repebody) 등을 들 수 있다.
이러한 항체, 항체 유도체, 항체 유사체, 그 제조와 관련해서는 당업계에 상당히 많은 문헌이 축적되어 있으며, 그러한 문헌으로서는 예컨대 문헌[Renate Kunert & David Reinhart, Advances in recombinant antibody manufacturing. Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Apr;100(8):3451-61], 문헌[Holliger P1, Hudson PJ., Engineered antibody fragments and the rise of single domains, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36], 문헌[Xiaowen Yu et al., Beyond Antibodies as Binding Partners: The Role of Antibody Mimetics in Bioanalysis, Annual Review of Analytical Chemistry, 2017, 10:293-320], 문헌[Abdul Rasheed Baloch et al., Antibody mimetics: promising complementary agents to animal-sourced antibodies, Critical Reviews in Biotechnology, 2016, 36:268-275] 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 어뎁터의 세포 표적화 영역은 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment)이다. scFv는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 영역과 경쇄(VL)의 가변 영역의 짧은 링커 펩티드를 매개로 연결된 단일사슬항체를 말한다. scFv에서 VH의 C-말단은 VL의 N-말단과 연결되거나, 또는 VL의 C-말단은 VH의 N-말단과 연결된다. scFv에서 링커 펩티드는 중쇄와 경쇄의 고유 3차원 구조를 방해하지 않으면서 이들 중쇄와 경쇄가 공간적으로 인접하여 표적분자와의 특이적인 결합 능력을 가지도록 하는 한, 임의의 길이, 임의의 서열의 링커 펩티드일 수 있다. 바람직하게는 링커는 유연성(flexibility), 용해성(solubility), 단백분해에 대한 저항성 등을 고려할 때, Ser, Gly, Ala, Thr 등의 아미노산 중 한 종류 이상의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하며, 길이는 1~30개 아미노산, 바람직하게는 3~25개 아미노산, 더 바람직하게는 8~20개 아미노산일 수 있다.
본 발명에서 특히 scFv는 표적분자를 HER2 또는 CEA를 표적분자로 하고, HER2에 대한 scFv는 서열번호 1의 VH와 서열번호 2의 VL이 링커 펩티드를 매개로, VH, 링커 펩티드 VL 순서로 연결된 것(즉 VH의 C-말단이 VL의 N-말단과 링커 펩티드를 매개로 연결된 것)이 바람직하고, CEA에 대한 scFv는 서열번호 3의 VL와 서열번호 4의 VH이 링커 펩티드를 매개로 VL, 펩티드 링커, VH 순서로 결합된 것(즉 VL의 C-말단이 VH의 N-말단과 링커 펩티드를 매개로 연결된 것)이 바람직하다. 상기에서 HER2에 대한 scFv의 링커 펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 상기 CEA에 대한 scFv의 링커 펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서 HVEM의 세포외 도메인은 아래의 실시예에서 사용된, 서열번호 7의 HveA82(리더 서열까지 포함된 HveA82 서열은 서열번호 8에 개시되어 있음) 이외에 한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호(본 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다)가 개시하는 서열번호 9의 HveA87(리더 서열까지 포함된 HveA87 서열은 서열번호 10에 개시되어 있음), 서열번호 11의 HveA102(리더 서열까지 포함된 HveA102 서열은 서열번호 12에 개시되어 있음) 또는 서열번호 13의 HveA107(리더 서열까지 포함된 HveA107 서열은 서열번호 14에 개시되어 있음)일 수도 있다. HveA87, HveA102, HveA107은 각각 HveA82보다 5, 20, 25개 아미노산을 더 포함하고 있으며, 상기 한국 등록특허 제10-0937774호에서 모두 어뎁터의 HSV 리셉터로 사용 가능함을 확인한 바 있다.
또 본 발명에서 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인 사이에 링커 서열이 게재될 수 있는데, 이 링커 서열은 이들 어뎁터의 각 도메인의 기능을 저해 하지 않는 한 임의의 길이, 임의의 서열의 링커일 수 있다. 바람직하게는 링커는 Ser, Gly, Ala, Thr 4가지 아미노산 중 한 종류 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 길이는 1~30개, 아미노산, 바람직하게는 3~25개 아미노산, 더 바람직하게는 8~20개 아미노산일 수 있다.
또 본 발명의 어뎁터는 NH2-암세포 표적화 도메인-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순의 구성을 가질 수 있다. 링커 펩티드가 매개될 경우는 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순의 구성일 수 있다.
본 발명의 어뎁터는 그 N-말단에, 구체적으로 어뎁터의 구성이 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순일 경우는 암세포 표적화 도메인의 N-말단(scFv가 사용될 경우 VH나 VL의 N-말단)에, 어뎁터의 구성이 NH2-HVEM 세포외 도메인-링커 펩타이드-암세포 표적화 도메인-COOH 순일 경우에는 HVEM 세포외 도메인의 N-말단에 리더 서열이 더 포함될 수 있다. 이러한 리더 서열은 표적세포에서 어뎁터가 발현되어 세포 밖으로 어뎁터가 유출되도록 유도하는 작용을 하는 서열로, 표적세포가 용해되어 HSV 바이러스가 방출된 후에야 어뎁터가 HSV 바이러스를 인접 표적세포로 감염되도록 유도하는 작용을 하기 때문에 생략될 수도 있다.
또 본 발명에서 세포 표적화 영역으로 표적분자에 대한 scFv을 사용할 경우, VH와 VL 사이에, VH와 VL 사이에 링커 펩타이드가 매개될 경우는 VH 또는 VL와 링커 펩타이드 사이, scFv와 HVEM 사이, scFv와 HVEM 사이에 링커 펩타이드가 매개될 경우에는 scFv와 링커 사이, 링커와 HVEM 사이에, 클로닝을 용이하게 하기 위하여 임의의 제한효소 작용 부위에 해당하는 아미노산이 게재될 수 있다. 예컨대 아래와 같이 실시예에서 같이 제한효소 EcoRI가 작용하는 EF(염기서열: GAATTC), BamHI이 작용하는 GS((염기서열: GGATCC))가 게재될 수 있다.
본 발명에서, 재조합 HSV는 암세포에 대한 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 발현하도록 해당 인자에 대한 유전자가 HSV 게놈에 삽입될 수 있다. 그러한 인자들은 사이토카인, 케모카인, 면역관문(immune checkpoint)에 대한 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv), 면역세포(T 세포 또는 NK 세포)의 활성화를 유도할 수 있는 보조 자극 인자(co-stimulatory factor), 암세포에 대한 면역반응을 억제하는 TGFβ의 기능을 저해할 수 있는 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv), 고형암 종양미세환경을 구성하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)을 분해할 수 있는 헤파라나아제(heparanase), 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR-2(VEGF receptor-2)의 기능을 저해할 수 있는 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv) 등을 발현하도록 조작될 수 있다.
사이토카인은 예컨대 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-24 등의 인터류킨, IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론, TNFα 등의 종양 괴사 인자, GM-CSF, G-CSF 등의 콜로니 자극 인자 등이 단독으로 또는 2 이상의 임의의 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
케모카인은 예컨대 CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2), CCL5(RANTES), CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1( (X-C Motif Chemokine Ligand 1)) 등이 단독으로 또는 조합함으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
면역관문에 대한 항체는 PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell deathligand 1), PD-L2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand), CTLA-4(cytolytic T lymphocyte associated antign-4) 등에 대한 길항제가 단독으로 또는 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
보조 자극 인자는 CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1(림프구 기능 연관 항원-1), ICOS(유도성 T 세포 공동자극인자), CD3γ, CD3δ, CD3ε 등이 단독으로 또는 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
본 발명에서, 재조합 HSV는 프로드럭(prodrug)을 암세포에 독성을 나타내는 약물(drug)으로 전환시켜주는 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes)를 발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 프로드럭 활성화 효소로서는, 프로드럭인 5-FC(5-fluorocytosine)을 5-FU(5-fluorouracil)인 약물로 전환시켜 주는 시토신 디아민나아제(Cytosine deaminase), 프로드럭인 CPA(cyclophosphamide)를 PM( phosphoramide mustard)인 약물로 전환시키주는 랫드 사이토크롬 P450(rat cytochrome P450, CYP2B1), 프로드럭인 이리노테칸(irinotecan, SN-38150)을 SN-38인 약물로 전환시켜주는 카르복실에스터라제(carboxylesterase), 프로드럭인 BC1954를 DNA 교차결합제인 4-하이드록시아민151(4-hydroxylamine151)로 전환시켜주는 세균 니트로리덕타아제(bacterial nitroreductase), 프로드럭인 6-메틸퓨린-2'-디옥시리보시드(6-methypurine-2'-deoxyriboside)를 6-메틸퓨린(6-methylpurine)으로 전환시켜주는 대장균에서 분리된 PNP(purine nucleoside phosphorylase) 등을 들 수 있다.
또한 본 발명에서, 재조합 HSV는 TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)를 발현하도록 조작될 수도 있다. TRAIL는 암세포에서 과발현되는 그것의 수용체에 결합하여 암세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다(Kaoru Tamura et al. Multimechanistic Tumor Targeted Oncolytic Virus Overcomes Resistance in Brain Tumors. Mol Ther. 2013 Jan;21(1):68-77).
이러한 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들이나 프로드럭 활성화 효소의 사용과 관련해서 더 구체적인 것은 문헌[Michele Ardolino et al., Cytokine treatment in cancer immunotherapy, J. Oncotarget, Oncotarget. 2015 Aug 14;6(23):], 문헌Bernhard Homey et al. Chemokines: Agents for the Immunotherapy of Cancer. Nat Rev Immunol. 2002 Mar;2(3):175-84], 문헌[Marianela Candolfi et al, Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme(GBM), J. FASEB J, 2008, 22:107713], 문헌[Danny N Khalil et al. The Future of Cancer Treatment: Immunomodulation, CARs and Combination Immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2016 May;13(5):273-90], 문헌[Paul E Hughes et al. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer. Trends Immunol. 2016 Jul;37(7):462-476], 문헌[Cole Peters1, Samuel D Rabkin, Designing herpes viruses as oncolytics, Mol Ther Oncolytics. 2015;2:15010] 등을 참조할 수 있다.
본 발명에서, 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들이나 프로드럭 활성화 효소는 전술한 바의 어텝터에서와 같이, 그 유전자의 발현 카세트(즉 그 유전자가 이의 발현을 가능하게 하는 프로모터 서열 및 폴리아데닐화 시그널 서열과 작동가능하게 연결된 구성체)가 HSV의 증식을 저해하지 않으면서 HSV 게놈에 삽입되는데, 그러한 삽입은 HSV 게놈의 결실 없이, 또는 HSV 게놈 중 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 수 있다. 이때 HSV 게놈의 결실 없이 삽입될 경우 각 유전자 사이에 삽입될 수 있으며 바람직한 삽입 위치는 예컨대 UL3과 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이 등을 들 수 있다. 비필수 유전자가 결실되고 그 결실된 위치에 삽입되거나 비필수 유전자의 결실 없이 그 유전자 중에 삽입될 경우, 그러한 비필수 유전자는 전술한 바의 임의의 비필수 유전자 중에서 선택될 수 있다.
다른 측면에 있어서 본 발명은 전술한 바의 재조합 HSV를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 재조합 HSV이 발현하는 어뎁터의 표적화 영역이 표적하는 표적분자를 발현하는 암종에 대해 항암 용도를 갖는다. 그러한 암종은 앞서 표적분자와 관련하여 설명한 바와 같다.
특히 본 발명의 조성물은 CEA나 HER2를 발현하는 종양세포를 갖는 암종에 대해 항암 용도를 갖는 것이 바람직하다. 예컨대 CEA를 발현하는 종양세포는 대장암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 직장암 세포, 결장암 세포, 간암 세포 등을 들 수 있고, 또 예컨대 HER2를 발현하는 종양세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포(glioblastoma multiforme), 침샘 종양(salivary gland tumor) 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에서 항암은 암세포의 사멸, 암세포의 생존능 저하, 암세포의 증식 억제에 따른 암이 가지는 병리적 증상의 억제나 지연, 그러한 병리적 증상의 발병 억제나 지연, 암 전이 억제, 암 재발 억제를 포함하는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 전술한 바의 재조합 HSV 이외에, 재조합 어뎁터 분자를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 어뎁터 분자는 전술한 바의 재조합 HSV가 발현하는 어뎁터 즉 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질과 동일하게 암세포 표적화 영역을 가지는 융합단백질이 재조합 방법으로 제조된 것을 말한다. 여기서 재조합 HSV가 발현하는 어뎁터와 동일하게 암세포 표적화 영역을 가진다는 것은 HSV가 발현하는 어뎁터의 암세포 표적화 영역이 HER2를 표적 분자로 하는 경우, 어뎁터 분자의 암세포 표적화 영역도 HER2를 표적 분자로 한다는 것을 의미한다. 재조합 방법에 의해 의도하는 목적 단백질의 제조 방법은 일반적으로 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하여, 대장균, 효모, 동물세포(CHO 세포, NSO 세포, BHK 세포, Sp2 세포, HEK-293 세포) 등 숙주세포에 형질전환시키고 배양한 후 목적 단백질을 분리하는 단계 등으로 이루어지는데, 이러한 재조합 방법에 의한 목적 단백질의 제조 방법은 당업계에 매우 잘 공지되어 있으며(Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)), 특히 본 발명에 사용되는 재조합 어뎁터 분자의 제조와 관련해서는 한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호를 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 이러한 재조합 어뎁터 분자를 추가로 포함되어, 본 발명의 유효성분인 재조합 HSV과 재조합 어뎁터 분자가 함께 환자에 투여될 경우 재조합 HSV의 초기 감염 효율이 증가되는 효과가 있다.
또 본 발명의 약제학적 조성물은 허가된 항암제와 병용 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 그러한 항암제로는 대사 길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 식물유래 알칼로이드 등 암세포에 세포독성을 나타내는 임의의 항암제, 임의의 사이토카인 의약품, 임의의 항체 의약품, 임의의 면역관문 억제제 의약품, 임의의 세포 치료제(car-T cell therarpy, car-NK cell therapy) 의약품 등을 포함한다. 구체적으로 탁솔, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 시스플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 소라페닙, IL-2 의약품, INF-α 의약품, INF-γ 의약품, 트라스투주맙, 블리나투모맙, 이필리무맙, 펩브롤리주맙, 니볼리주맙, 아테졸리주맙(Atezolizumab), 두발루맙(Durvalumab), 베바시주맙, 세툭시맙, 티사젠렉루셀(Tisagenlecleucel, 킴리아), 액시캡타젠 실로루셀(Tisagenlecleucel Axicabtagene Ciloleucel, 예스카타) 등이 예시될 수 있으며, 이들 예시된 항암제 이외에도 당업계에 공지된 여타의 항암제도 제한없이 본 발명의 약제학적 조성물과 혼합되어 사용되거나 병용 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하여 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 통상의 방법으로 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.
그러한 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 인체에 특별한 독성을 가지지 않으면서 약물의 활성이나 특성을 저해하지 않는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특히 본 발명의 약제학적 조성물이 액상 용액으로 제제화될 경우 적합한 담체 또는 부형제로서는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등의 성분 중에서 하나 이상의 성분을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 의약품 첨가제 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구 투여제로 제제될 경우는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있고, 비경구 투여제 특히 주사제로 제제화 경우 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등의 형태로도 제조화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구 투여 경로나, 또는 피부, 병변 내(intralesional), 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내, 직장 경로 등 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량(유효량)은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 결정할 수 있다. 바람직한 양태에 있어 본 발명의 약제학적 조성물은 단위 용량 형태의 주사제로 제조되며, 단위 용량 형태의 주사제로 제조될 경우 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량 당 포함되는 재조합 HSV 바이러스의 양은 102-1014 pfu 범위, 특히 104-1011 pfu 범위일 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 재조합 HSV를 포함하는 약제학적 조성물을 유효량으로 환자 등의 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방 방법(즉 종양 치료 또는 예방 방법)에 관한 것이다.
이러한 암 치료 방법은 재조합 HSV가 그 어뎁터의 암세포 표적화 영역이 표적하는 표적분자를 가진 암세포를 용해하여 사멸시킴으로써 가능해진다. 따라서 본 발명의 치료 방법은 그러한 표적분자를 가진 임의의 암종에 대해서 적용이 가능하다. 특히 본 발명의 치료 방법은 CEA나 HER2를 발현하는 암종에 적용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료 방법은 상기 다른 암 치료법과 제한없이 병용되어 사용될 수 있다. 예컨대 앞서 예시된 세포독성 항암제, 사이토카인 의약품, 항체 의약품, 면역관문 억제제 의약품, 세포 치료제(car-T cell therarpy, car-NK cell therapy) 의약품, 방사선 치료 요법, 수술 요법 등이 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 전·후나 동시 투여 방식으로 병용 사용될 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서 유효량은 그 적용 대상인 환자 등에 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 약제학적 조성물이 투여될 때, 암 치료 또는 예방 효과 등 의도한 의학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 약제학적 조성물이 투여되는 양을 말한다. 이러한 유효량은 전술한 바와 같이 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등에 따라 의료 전문가 등 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서, 그 약제학적 조성물은 바람직하게는 환자 등에 주사제로, 비경구 투여 경로에 의하여 예컨대 병변 내(intralesional, 종양 내), 정맥 내, 근육 내, 동맥 내 등에 투여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도를 제공할 수 있다.
상기 융합 단백질은 재조합 HSV가 표적세포를 감염시켜 표적세포 내로 들어가게 되면, HSV가 증식됨과 함께 세포 내에서 발현되어 세포 용해에 의하여 그 증식된 HSV 비리온과 함께 세포 외부로 방출되거나 어뎁터가 리더서열을 가질 경우에는 세포 용해에 의한 비리온 방출 이전에도 방출된다. 이 세포 외부로 방출된 융합 단백질은 HSV 비리온을, 그 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자를 발현하는 주변 암세포로 감염을 유도하거나 감염 효율을 높이는 작용을 하게 된다.
도 1은 KOS-37 BAC 게놈 구조 및 Cre-Lox 시스템에 의한 BAC 유전자 제거에 대한 개요도이다.
도 2는 HVEM-제한 HSV-1인 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 3은 EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1인 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스 게놈 구조의 개요도이다.
도 4는 EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1의 형광 발현 및 HVEM 수용체를 가진 세포에의 특이점 감염을 보여주는 결과이다.
도 5는 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 게놈 구조의 개요도와 HveA-HER2scFv 어뎁터를 발현하는 KOS-HveA-HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 그리고 CEAscFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 구조의 개요도이다.
도 6은 HER2scFv-HveA 어뎁터, HveA-HER2scFv 어뎁터 및 CEAscFv-HveA 어뎁터의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 도시한 것이다.
도 7은 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 HER2 발현 세포에의 특이적 감염을 보여주는 결과이다.
도 8은 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 HER2 발현 세포에 대한 특이적 세포 사멸을 보여주는 결과이다.
도 9은 야생형 바이러스(HSV-1 KOS)와 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스(Her2 Adapter)의 HER2 발현 세포에서의 세포사멸 정도를 비교한 결과이다.
도 10은 CEAscFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 CEA 발현 세포에의 특이적 감염을 보여주는 결과이다.
도 11은 EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1인 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(gD/NI)와 CEAscFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 CEA 발현 세포에의 특이적 감염 정도를 비교한 결과이다.
도 12는 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스와 HveA-HER2scFv 어뎁터를 발현하는 KOS-HveA-HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스의 특이적 감염 정도를 비교한 결과이다.
도 13은 HER2scFv-HveA 어댑터 발현 바이러스의 어댑터의 세포 외 발현을 보여주는 결과와 주변 암세포로로 바이러스 감염이 확산되는 것을 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HVEM 제한 HSV-1(HVEM-restricted HSV-1) 제작
HSV-1 유전자는 152kb에 달하는 커다란 유전자로 구성이 되어 있어, 외래 유전자를 삽입하거나 특정 위치에서의 변이를 도입하기 위해서 KOS-37 BAC(Genbank Accession No. MF156583)(Gierasch WW et al. J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)을 사용하였다. HSV-1 KOS 스트레인(HSV-1 KOS strain)은 그 특성이 잘 알려져 있고, 유전자의 기능 및 병인 조사에 유용하여 실험실에서 주로 사용되는 HSV-1 스트레인의 일종이다(Smith KO. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964. 115:814-816). KOS 유전자에 BAC 플라스미드 삽입을 통해서 제작된 KOS-37 BAC은 DH10B 박테리아(Invitrogen)에 형질전환(transformation)을 통해 박테리아 수준에서 클로닝을 가능케 한다(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206). KOS-37 BAC는 HSV-1 KOS 게놈의 UL37과 UL38 사이의 위치에 BAC(bacterial artificial chromosomes)가 양쪽에 LoxP 사이트와 함께 삽입되어 있다. 차후 Cre-Lox system을 이용하여 BAC 유전자를 제거할 수 있게 제작됐다. 그 개요도를 도 1에 나타내었다.
HVEM 세포 수용체를 통해서만 세포 진입하는 HVEM 제한 HSV-1 제작하기 위하여, HSV-1 gD 아미노산 서열(GenBank Accession No. ASM47818, 서열번호 15)의 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)을 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환한 gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스를 제작하였다.
이러한 돌연변이에 의해 만들어진 gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스는 세포 감염 수용체(entry receptor)로 넥틴-1(nectin-1)을 사용하지 못하고 오직 HVEM(HveA)을 통해서만 숙주세포 내로 감염이 가능하기 때문에(Uchida H et al., J Virol. 2009. 83(7):2951-2961), 넥틴-1(nectin-1) 수용체를 가진 정상세포를 감염시키지 못하여 안전성에 있어서도 유리하다.
HVEM-제한 HSV-1의 게놈 구조의 개요도를 도 2에 나타내었다.
gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스를 제작은 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(Counter selection BAC modification kit; GeneBridges, Inc.)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 KOS-37 BAC의 gD 부분에 R222N/F223I 돌연변이를 도입하였다.
구체적으로 KOS-37 BAC이 들어 있는 E.coli 클론에, 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행할 수 있는 RecE와 RecT를 발현할 수 있는 pRed/ET 플라스미드를 형질전환(transformation)시켰다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). gD에 돌연변이를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 gD-rpsL For: 서열번호 16, 역방향 프라이머 gD-rpsL Rev: 서열번호 17)를 사용하여 gD-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. gD-rpsL-neo/kan 카세트는 삽입할 위치의 gD 상동 영역과 스트렙토마이신(streptomycin)에 민감성을 갖게 하는 선별마커(selective marker)인 rpsL유전자와 카나마이신(kanamycin) 저항성을 갖게 하는 neo/kan 유전자로 구성되게 된다. gD-rpsL-neo/kan 카세트가 삽입되면, rpsL 유전자에 의하여 스트렙토마이신 항생제에 민감하게 되고, neo/kan 유전자에 의하여 카나마이신 저항성을 갖는 E.coli가 만들어지게 된다. KOS-37 BAC과 pRedET가 들어있는 E.coli 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 pRed/ET의 기능을 활성화시켜 상동 재조합이 가능하도록 RecE와 RecT의 발현을 유도한 후(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557), 제작한 gD-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng을 형질전환(transformation)하였다. 상동 재조합에 의하여 gD-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS-37 BAC의 gD 위치에 삽입되게 된다. KOS-37 BAC에 gD-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자 때문에 차단된 상태이다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 gD-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 최종적인 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다. KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan 클론이 있는 E.coli에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 pRed/ET의 기능을 활성화시켜 상동 재조합이 가능하도록 RecE와 RecT의 발현을 유도한 후 gD에서 222번 위치 및 223번 위치에서 각각 N 및 I를 치환한 아미노산 서열(서열번호 18)에 해당하는 올리고뉴클레오티드인 R222N_F223I_mutant을 100 pmol을 넣고 형질전환을 하였다. 기존 gD-rpsL-neo/kan 카세트와 삽입된 올리고뉴클레오티드가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), gD에서 222번 위치 및 223번 위치에서 각각 N 및 I가 도입 여부를 PCR (ploymerase chain recation)과 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
다음 바이러스 제작은 상기 완성된 KOS37-BAC-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey0-Nagel)를 이용하여 추출한 후 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1ug을 형질주입(transfection)했다. DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene)에 100 U/ml 페니실린(penicillin)/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum, Wellgen)를 이용하여 세포 배양을 했다. 상기 Cre-Vero-HVEM 세포주는 Cre-Vero 세포주(Gierasch et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)에 HVEM 유전자를 삽입시켜 HVEM 단백질 발현을 유도한 세포주이다. Cre-Vero-HVEM을 사용한 이유는 세포의 Cre 재조합 효소(recombinase)를 이용하여 KOS 37 BAC의 BAC 유전자를 제거할 수 있으며, HVEM 과발현에 의한 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스의 감염이 효과적이어서 차후 바이러스 대량생산이 용이하기 때문이다. 유전자 도입 3~4일 경과 후, 플라크(plaque)의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 최종적으로 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스를 획득했다.
<실시예 2> EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1 제작
상기 실시예 1에서 제작된 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스의 유전자 UL26/UL27 위치에, EmGFP(Emerald Green Fluorescent Protein)를 발현할 수 있는 발현 카세트(expression cassette)를 삽입하였다. 이는 마커로서 EmGFP를 이용하여 바이러스의 생산과 감염 정도의 관찰을 용이하게 하기 위한 것이다. EmGFP 카세트 제작에는 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR 플라스미드(Invitrogen)를 이용하였다.
UL26/27-EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1의 지놈 개요도는 도 3에 나타내었다.
EmGFP 발현을 위하여 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 유전자 프로모터와 HSV TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)의 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal)인 tkpA를 이용하여 pCMV-EmGFP-tkpA의 구조로 KOS37-BAC-gD-R222N/F223I에 삽입했다.
모든 삽입 방법은 상기 실시예 1에서 같이 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행했다.
구체적으로 KOS37-BAC-gD-R222N/F223I 유전체가 들어 있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행할 수 있는 RecE와 RecT를 발현할 수 있는 pRed/ET 플라스미드를 형질전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). UL26와 UL27 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 UL26/27-rpsL_For: 서열번호 19, 역방향 프라이머 UL26/27-rpsL_Rev: 서열번호 20)를 사용하여 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. KOS37-BAC-gD-R222N/F223I와 pRed/ET가 들어 있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 제작한 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng을 형질전환한다. 이러한 상동 재조합에 의하여 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS37-BAC-gD-R222N/F223I의 UL26/27 위치에 삽입되게 된다. UL26/27-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된 상태이다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 UL26/27-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
UL26/27-rpsL-neo/kan카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도하고, 그 다음 UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV 카세트 200 ng을 형질전환시켰다. UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV 카세트는 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR 플라스미드(Invitrogen)를 주형(Template)으로 사용하고 정방향 프라이머 UL26-tkpA_For(서열번호 21)와 역방향 프라이머 UL27-pCMV_Rev(서열번호 22)를 사용하여 제작한 것이다.
기존 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트와 삽입된 UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였다(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352). UL26/27에서 tkpA-EmGFP-pCMV의 도입 여부를 EcoRI, XhoI처리와 PCR(ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자서열을 확인했다.
형광단백질의 정상적인 발현과 바이러스의 생산을 위하여 실험을 진행하였다. 완성된 KOS37-BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey0-Nagel)를 이용하여 추출한 후, 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1ug을 형질주입하였다. 형질주입 3일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광발현을 형광현미경을 통하여 관찰하고, Cre-Vero-HVEM 세포의 플라크(plaqe) 형성을 통해 바이러스 생산을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스를 획득했다.
KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스의 감염과 형광 발현은 HVEM가 없는 세포주(J1 및 J-Nectin)와 HVEM이 발현되는 세포주(J-HVEM)를 사용했다. J1세포는 어린 햄스터 신장세포주로 바이러스 HSV-1 리셉터인 HVEM와 Nectin-1이 결핍되어 있는 세포주이다(Petrovic B et al., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352). J-Nectin, J-HVEM 세포주는 J1세포에 각각 Nectin-1과 HVEM을 과발현하는 세포주이다(Petrovic B et al., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352). 각 세포주는 DMEM 배지(Welgene)에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 이용하여 배양했다. 1×104의 세포에, 상기 얻어진 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스를 10 MOI (multiplicity of infection)로 감염시키고 24시간 후, 형광단백질 발현 및 바이러스 감염 정도를 형광현미경을 통하여 관찰했다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
결과를 도 4에 형광현미경 모드로 촬영한 사진과 광학현미경 모드로 촬영한 사진을 각각 상하에 나타내었다. 도 4의 윗쪽 형광현미경 사진을 참조하여 보면, J1 세포주와 J-Nectin 세포주는 감염되지 않고, J-HVEM 세포주만 감염됨을 알 수 있다.
이러한 결과를 통하여, 의도한 바와 같이 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스가 형광단백질의 발현으로 바이러스 감염의 관찰이 용이하고 진입 경로로 Nectin-1을 사용하지 못하고 HVEM만을 사용하여 진입하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> HER2scFv-HveA 어뎁터, HveA-HER2scFv 어뎁터, CEAscFv-HveA 어뎁터를 발현하는 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스 제작
상기 실시예 2에서 제작된, EmGFP 발현 카세트(tkpA-EmGFP-pCMV)가 삽입된 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스의 유전자 UL3/UL4 위치에, HER2scFv-HveA 어뎁터 발현 카세트, HveA-HER2scFv 어뎁터 발현 카세트, CEAscFv-HveA 어뎁터 발현 카세트를 삽입하였다.
HER2scFv-HveA 어뎁터 발현 카세트인 pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA가 삽입된 KOS-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도와 HveA-HER2scFv 어뎁터 발현 카세트인 pCMV-HveA-HER2scFv-bGHpA가 삽입된 KOS-HveA-HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도, 그리고 CEAscFv-HveA 어뎁터 발현 카세트인 pCMV-CEAscFv-HveA-bGHpA이 삽입된 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도를 도 5에 나타내었으며, 또 도 6에 HER2scFv-HveA 어뎁터, HveA-HER2scFv 어뎁터 및 CEAscFv-HveA 어뎁터의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 나타내었다. 여기서 HER2에 대한 scFv는 서열번호 1의 VH와 서열번호 2의 VL이 서열번호 5의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이고, CEA에 대한 scFv는 서열번호 3의 VL와 서열번호 4의 VH이 서열번호 6의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이며, HveA는 HER2scFv-HveA 어뎁터 및 CEAscFv-HveA 어뎁터에 있어서는 리더 서열이 제외된 서열번호 7의 HveA82이고, HveA-HER2scFv 어뎁터에 있어서는 리더서열이 포함된 서열번호 8의 Hve82이다. 또 HER2scFv-HveA 어뎁터 및 CEAscFv-HveA 어뎁터에 있어서는 그 N-말단 즉 HER2scFv의 VH과 CEAscFv의 VL의 앞부분에 서열번호 33의 리더서열이 포함되어 있다.
HER2 또는 CEA에 대한 scFv 서열과 HveA 서열의 링커 서열인 NH2-GGGGS 서열 다음에는 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한효소 EcoRI 작용 부위인 EF(염기서열: GAATTC) 추가되어 있고, HveA 서열과 Her2에 대한 scFv 서열의 링커 서열인 NH2-GGGGS 서열 다음에도 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한효소 BamHI 작용 부위인 GS(염기서열: GGATCC) 추가되어 있는데, 이 또한 어뎁터에서 제외되어도 무방한 서열이다. bGHpA는 bgh-PolyA(bovine growth hormone polyadenylation) 시그널 서열이다. 본 실시예에서 사용된 HER2scFv-HveA 어뎁터 전장의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 23와 서열번호 24에 개시되어 있고, HveA-HER2scFv 어뎁터 전장의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 25와 서열번호 26에 개시되어 있으며, 그리고 CEAscFv-HveA 어뎁터 전장의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 27와 서열번호 28에 개시되어 있다.
HER2scFv-HveA 어뎁터 발현 카세트, HveA-HER2scFv 어뎁터 발현 카세트, CEAscFv-HveA 어뎁터 발현 카세트의 삽입은 상기 실시예 1과 2와 마찬가지로 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행했다.
구체적으로 상기 실시예 2에서 제작된 KOS37-BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I 유전체가 들어 있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행하는 RecE와 RecT를 발현하는 pRed/ET 플라스미드를 형질전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). UL3와 UL4 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 HSV-1_UL3/4-rpsL-neo_for: 서열번호 29, 역방향 프라이머 HSV-1_UL3/4-rpsL-neo_rev: 서열번호 30)를 사용하여 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. KOS37-BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I와 pRedET가 들어 있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 상기 제작한 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트 200ng 를 형질전환한다. 이러한 상동 재조합에 의하여 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS37-BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I의 UL3/4 위치에 삽입되게 된다. UL3/4-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 UL3/4-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
UL3/4-rpsL-neo/kan카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, UL3/4-pCMV-Her2scFv-HveA-bGHpA 카세트와 UL3/4-pCMV-HveA-Her2scFv-bGHpA 카세트 그리고 UL3/4-pCMV-CEAscFv-HveA-bGHpA 카세트 200 ng을 형질전환 시켰다. 상기 UL3/4-pCMV-Her2scFv-HveA-bGHpA 카세트와 UL3/4-pCMV-HveA-Her2scFv-bGHpA 카세트 그리고 UL3/4-pCMV-CEAscFv-HveA-bGHpA 카세트는 pCDNA3.1-HER2scFv-HveA 플라스미드, pCDNA3.1-HveA-HER2scFv 플라스미드, pCDNA3.1-CEAscFv-HveA 플라스미드(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514)를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 HSV-1_UL3/4-HM_pCMV_For(서열번호 31)와 역방향 프라이머 UL3/4_bGH_poly_R(서열번호 32)를 사용하여 제작하였다.
기존 삽입된 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트와 앞서 삽입된 UL3/4-pCMV-Her2scFv-HveA-bGHpA와 UL3/4-pCMV-HveA-Her2scFv-bGHpA 그리고 UL3/4-pCMV-CEAscFv-HveA-bGHpA가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), UL3/4에서 UL3/4-pCMV-Her2scFv-HveA-bGHpA와 UL3/4-pCMV-HveA-Her2scFv-bGHpA 그리고 UL3/4-pCMV-CEAscFv-HveA-bGHpA의 도입 여부를 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자서열을 확인했다.
완성된 KOS37-BAC-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I와 KOS37-BAC-HveA-Her2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223 그리고 KOS37-BAC-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey0-Nagel)를 이용하여 추출한 후, 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1ug을 형질주입 하였다. 형질주입 3일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광발현과 세포의 플락(plaque) 형성을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄를 통해 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스와 KOS-HveA-Her2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스 그리고 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스를 획득했다.
<실시예 4> 어뎁터 발현 항암 바이러스를 이용한 HER2 또는 CEA 발현 암세포 타게팅
<실시예 4-1> HER2scFv-HveA 어뎁터 발현 항암 바이러스를 이용한 HER2 발현 암세포의 타겟팅
상기 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스가 HER2scFv-HveA 어뎁터를 발현함으로써 주변의 암세포로 바이러스의 감염을 유도하는지, 감염 후 세포사멸을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행했다.
실험에 사용된 세포주는 HER2가 발현되지 않는 세포주(J1, CHO-K1, MDA-MB-231)와 HER2가 발현되는 세포주(J-HER2, CHO-HER2, SK-OV-3)이다. 중국 햄스터난소 세포주인 CHO-K1, CHO-HER2(Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141)는 HaM's F-12K 배지(Welgene)에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 사용하여 배양하였고 J1, J-HER2(Petrovic B et al., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352), 유방암 세포주인 MDA-MB-231(ATCC, HTB-26), 난소암 세포주인 SK-OV-3(ATCC, HTB-77)는 DMEM 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양했다.
HER2 특이적 바이러스 감염을 위하여 1×104의 J 세포주들은 10 MOI, 1.5×104의 CHO 세포주들은 1 MOI, 1×104의 SK-OV-3과 MDA-MB-231 세포주들은 0.1 MOI로, 상기 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 HER2scFv-HveA 에뎁터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체했다. 감염 3일 후, 형광 발현으로 각각의 세포주에 바이러스 감염을 형광현미경으로 관찰했다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
결과를 도 7에 광학현미경 모드로 촬영한 사진과 형광현미경 모드로 촬영한 사진을 각각 좌우에 나타내었다. 도 7의 오른 쪽 형광현미경 사진을 참조하여 보면, HER2가 발현되는 세포주인 CHO-Her2, J-Her2, SK-OV-3에만 특이적으로 감염됨을 확인할 수 있다. HSV-1의 감염 경로는 gB와 gC가 세포에 부착(Attachment)하고 gD에 의하여 세포 안으로 진입 (Entry)하는 작용기작을 갖는다. HER2scFv-HveA를 발현하는 gD R222N/F223I 변이가 된 바이러스에서 HVEM, Nectin-1이 결핍된 CHO-K1 세포주에 약간의 감염을 보이는 것은 gD의 역할 외에도 gB와 gC의 세포 부착만으로도 약간의 감염이 일어날 수 있기 때문이다((BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
또 HER2가 발현되는 세포주인 CHO-Her2, J-Her2, SK-OV-3는 HVEM 수용체가 결핍되어 있는데도 바이러스가 최초 감염하는 것은, 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스를 감염시킬 때, 그 바이러스에는, Cre-Vero-HVEM 세포를 통한 바이러스 생산과정에서 HER2scFv-HveA 어뎁터가 gD에 결합되어 있거나 또는 발현된 HER2scFv-HveA 어뎁터가 미량 포함되어 있기 때문이다.
다음 바이러스에 의한 세포사멸을 관찰하기 위해서는 1.5×104의 CHO-K1, CHO-Her2 세포주들은 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스 1 MOI, 1×104의 SK-OV-3과 MDA-MB-231 세포주들은 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스 2 MOI를 감염시켰다. 감염 3 일 후 각각의 세포주를 광학현미경으로 촬영하고 결과를 도 8에 나타내었다. HER2가 발현되는 세포주인 CHO-Her2 및 SK-OV-3의 경우, HER2를 발현하지 않는 세포주인 CHO-K1, MDA-MB-231에 비해 세포수가 현저히 낮음을 알 수 있다.
또 HVEM 제한 헤르페스 바이러스(gD/NI)와 HER2scFv-HveA 어뎁터 발현 바이러스(Her2 Adapter)를 HER2 발현 세포주인 1×104의 SK-OV-3 세포에 2 MOI 감염시키고, 1, 2, 3, 4, 5일차의 각각의 세포에 Alamar blue (sigma) 이용하여 세포의 염색을 통한 세포사멸을 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스(Her2 Adapter)의 세포사멸 유도 효과가 일반 헤르페스 바이러스(HSV-1 KOS)의 세포사멸 유도 효과보다 뚜렷하게 높음을 알 수 있다.
<실시예 4-2> CEAscFv-HveA 어뎁터 발현 항암 바이러스를 이용한 CEA 발현 암세포의 타겟팅
상기 실시예 3에서 제작된 CEAscFv-HveA 에뎁터 발현 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스가 CEAscFv-HveA 어뎁터를 발현함으로써 주변의 암세포로 바이러스의 감염을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행했다.
실험에 사용된 세포주는 CEA가 발현되지 않는 세포주(CHO-K1)와 CEA가 발현되는 세포주(CHO-CEA, MKN45)이다. 중국 햄스터난소 세포주인 CHO-K1, CHO-CEA 세포주(Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141)는 HaM's F-12K 배지(Welgene)에 100 U/ml penicillin/100 μg/ml streptoycin (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양하였고, 위암 세포주인 MKN45(JCRB, JCRB0254)는 RPMI-1640 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양했다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
CEA 특이적 바이러스 감염을 위하여 1.5×104의 CHO-K1, CHO-CEA 세포에 10 MOI로 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 CEAscFv-HveA 에뎁터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체했다. 72시간 후, 각각의 세포주에 바이러스 감염 정도를 형광현미경으로 관찰했다.
결과를 도 10에 광학현미경 모드로 촬영한 사진과 형광현미경 모드로 촬영한 사진을 각각 좌우에 나타내었다. 도 10의 오른 쪽 형광현미경 사진을 참조하여 보면, CHO-K1 세포주는 거의 감염이 되지 않았고 CHO-CEA 세포주는 뚜렷하게 감염이 되었음을 알 수 있다.
CEAscFv-HveA를 발현하는 gD R222N/F223I 변이가 된 바이러스에서 HVEM, Nectin-1이 결핍된 CHO-K1 세포주에 약간의 감염을 보이는 것은 앞서 설명한 바와 같이 gD의 역할 외에도 gB와 gC의 세포 부착만으로도 약간의 감염이 일어날 수 있기 때문이다((BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
또한 CEA 발현 암세포에서의 특이적인 감염을 확인하기 위하여 6×104의 MKN45 세포주에 상기 실시예 2에서 제작된 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(gD/NI, 비교군)와, 상기 실시예 3에서 얻어진 KOS-CEAscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I(scCEA-HveA)를 각각 1 MOI로 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 CEAscFv-HveA 에뎁터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체했다. 72시간 후, 각각의 세포주에 바이러스 감염 정도를 형광현미경으로 관찰했다.
결과를 도 11에 광학현미경 모드로 촬영한 사진과 형광현미경 모드로 촬영한 사진을 각각 좌우에 나타내었다. 오른쪽 사진을 참조하여 보면 MKN45세포에서 비교군인 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스에 비하여 KOS-CEAscFv-HA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스가 특이적으로 암세포에 감염된다는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 5> HER2 어뎁터 구조변화에 의한 어뎁터 발현 항암 바이러스의 감염활성변화
상기 실시예 3에서 제작된 구조가 서로 다른 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스와 HveA-HER2scFv 에뎁터 발현 KOS-HveA-HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스가 HER2scFv-HveA 또는 HveA-HER2scFv 어뎁터를 발현함으로써 어뎁터 구조에 따른 감염의 활성변화를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행했다.
실험에 사용된 세포주는 HER2가 발현되지 않는 세포주 CHO-K1과 HER2가 발현되는 세포주 CHO-HER2이다. 중국 햄스터난소 세포주인 CHO-K1, CHO-HER2(Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141)는 HaM's F-12K 배지(Welgene)에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 사용하여 배양했다.
어뎁터 구조에 따른 바이러스 감염 활성 변화를 보기 위하여 1.5×104의 CHO-K1, CHO-HER2 세포주들에 1 MOI로 상기 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA, HveA-HER2scFv 에뎁터 발현 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 HER2scFv-HveA, HveA-HER2scFv 에뎁터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체했다. 감염 3일 후, 바이러스 초기 유전자의 전사에 필수적인 단백질인 VP16을 염색하여 각각의 구조가 다른 어뎁터 발현 바이러스의 감염을 형광현미경으로 관찰했다 (BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
도 12의 오른쪽 CHO-HER2 세포에서 각각 어뎁터 구조가 다른 바이러스 감염 정도를 VP16 염색으로 관찰한 사진을 참조하여 보면, HER2scFv-HveA, HveA-HER2scFv 에뎁터 발현 바이러스들의 감염 정도가 비슷한 수준으로 관찰되었다. 어뎁터 발현 시스템에서 HveA의 위치에 의한 감염 정도의 차이는 없는 것으로 확인되었고, 두 가지 구조 모두 HER2 특이적인 감염 활성이 높은 것을 확인하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 핵산 염색을 통해 VP16염색의 비교 관찰 지표로 사용되었다.
HER2scFv-HveA 또는 HveA-HER2scFv를 발현하는 gD R222N/F223I 변이가 된 바이러스에서 HVEM, Nectin-1이 결핍된 CHO-K1 세포주에 약간의 감염을 보이는 것은 앞서 설명한 바와 같이 gD의 역할 외에도 gB와 gC의 세포 부착만으로도 약간의 감염이 일어날 수 있기 때문이다((BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
또 HER2가 발현되는 세포주인 CHO-Her2는 HVEM 수용체가 결핍되어 있는데도 바이러스가 최초 감염하는 것은, 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 에뎁터 발현 바이러스를 감염시킬 때, 그 바이러스에는, Cre-Vero-HVEM 세포를 통한 바이러스 생산과정에서 HER2scFv-HveA 어뎁터와 HveA-HER2scFv 어뎁터가 결합되어 있거나 또는 발현된 HER2scFv-HveA가 미량 포함되어 있기 때문이다.
<실시예 6> 어댑터 발현 바이러스의 어댑터의 세포 외 발현과 주변 암세포로의 바이러스 감염 확산 관찰
상기 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 어댑터 발현 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스에 의하여 세포 내에 발현 된 HER2scFv-HveA 어댑터가 세포 외부로 방출는 것을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행했다.
실험에 사용된 세포주는 Vero-HVEM 세포주(Gierasch et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)이다. Vero-HVEM 세포주는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene)에 100 U/ml 페니실린(penicillin)/100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum, Wellgen)를 이용하여 세포 배양을 했다. 2.0×105의 Vero-HVEM 세포에 0.1 MOI로 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I와 대조군인 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 HER2scFv-HveA 어댑터를 제거하기 위하여 FBS가 포함되지 않은 새로운 배지로 교체했다. 48시간 후, 배지를 수거하였다. 수거한 배지의 HER2scFv-HveA 어댑터 발현을 확인하기 위하여 Western blot 방법을 이용하여 단백질 발현 정도를 측정하였다.
결과를 도 13의 상단에 나타내었다. 결과를 도 13의 상단을 보면, 어댑터를 포함하지 않는 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(gD/NI) 감염군에서 확보한 배지에서는 어댑터의 발현이 검출되지 않았지만, KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(Her2scFv-HveA) 감염군에서 확보한 배지에서는 세포 외부로 방출된 어댑터가 검출되었다.
이러한 결과를 통하여, 의도한 바와 같이 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스의 세포 내 감염을 통하여 삽입된 어댑터의 발현과 세포 외부로의 방출이 원활히 작동하는 것을 확인하였다.
또한 세포 외부로 방출된 어댑터와 세포 용해에 의하여 방출 바이러스에 의해 주변 암세포로 그 감염이 확산되는 것을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행했다.
실험에 사용된 세포주는 SK-OV-3 세포주이다. 난소암 세포주인 SK-OV-3 세포주는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene)에 100 U/ml 페니실린(penicillin)/100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum, Wellgen)를 이용하여 세포 배양을 했다.
다음 1×104의 SK-OV-3 세포주에 0.01 MOI로 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스를 희석하여 감염시켰다. 여기서 바이러스를 희석하여 감염시킨 것은 주변 암세포로 바이러스 감염이 확산되는 것을 관찰하기 위한 것이다.
결과를 도 13의 하단에 나타내었다. 결과를 도 13의 하단을 보면, 감염 후 24시간이 지나서 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스에 의하여 하나의 감염군이 관찰했다. 그 후, 48시간, 72시간이 지나면서 최초 감염군의 주변 암세포로 바이러스가 감염이 급속도로 확산되는 것을 관찰하였다.
이러한 결과를 통하여, 의도한 바와 같이 KOS-Her2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스의 세포 내 감염을 통하여 삽입된 어댑터가 세포 외부로의 방출되어 주변 암세포 표면의 항원에 결합하고, 세포 용해에 의하여 방출된 바이러스는 이미 암세포를 결합된 어뎁터를 표적하거나 바이러스에 결합된 어뎁터에 의하여 표적분자를 발현하는 주변 암세포로 감염이 확산되는 패턴을 확인하였다.
<110> Gencellmed Inc. <120> RECOMBINANT HERPES SIMPLEX VIRUS HAVING EXPRESSION CASSETTE EXPRESSING FUSED PROTEIN OF CANCER CELL-TARGETING DOMAIN AND EXTRACELLULAR DOMAIN OF HVEM AND USE THEREOF <130> PP20-067 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 VL <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA VH <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Ala Leu Ser Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asn Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Ala Leu Ser Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asn Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 Linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA Linker <400> 6 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HveA 82 <400> 7 Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu 20 25 30 Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His 35 40 45 Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala 50 55 60 Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Cys Gly <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp.-HveA 82 <400> 8 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly 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Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His 115 120 125 <210> 11 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HveA102 <400> 11 Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu 20 25 30 Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His 35 40 45 Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala 50 55 60 Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His 85 90 95 Cys Ala Ala Cys Arg Ala 100 <210> 12 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-HveA102 <400> 12 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile 115 120 125 Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala 130 135 140 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HveA107 <400> 13 Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu 20 25 30 Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His 35 40 45 Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala 50 55 60 Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His 85 90 95 Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser 100 105 <210> 14 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-HveA107 <400> 14 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile 115 120 125 Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser 130 135 140 Ser 145 <210> 15 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gD ASM47818 <400> 15 Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 5 10 15 Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro 20 25 30 Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 35 40 45 Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg 50 55 60 Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile 65 70 75 80 Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr 85 90 95 Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val 100 105 110 Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 115 120 125 Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val 130 135 140 Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 145 150 155 160 Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile 165 170 175 Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr 195 200 205 Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile 210 215 220 Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 225 230 235 240 Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 245 250 255 Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro 275 280 285 Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr 290 295 300 Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val 325 330 335 Tyr Trp Met His Arg Arg Thr Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 340 345 350 Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe 355 360 365 Tyr <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gD-rpsL For <400> 16 cccaggccta ccagcagggg gtgacggtgg acagcatcgg gatgctgccc ggcctggtga 60 60 <210> 17 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gD-rpsL Rev <400> 17 ccggcgatct tcaagctgta tacggcgacg gtgcgctggt tctcggggat tcagaagaac 60 tcgtcaagaa ggcgtgatgg cgggatcg 88 <210> 18 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gD R222N_F223I <400> 18 Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 5 10 15 Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro 20 25 30 Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 35 40 45 Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg 50 55 60 Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile 65 70 75 80 Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr 85 90 95 Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val 100 105 110 Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 115 120 125 Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val 130 135 140 Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 145 150 155 160 Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile 165 170 175 Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr 195 200 205 Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Asn Ile Ile 210 215 220 Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 225 230 235 240 Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 245 250 255 Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro 275 280 285 Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr 290 295 300 Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val 325 330 335 Tyr Trp Met His Arg Arg Thr Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 340 345 350 Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe 355 360 365 Tyr <210> 19 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UL26/27-rpsL_For <400> 19 gcgtgggggg gaggaaatcg gcactgacca agggggtccg ttttgtcacg tcagaagaac 60 tcgtcaagaa ggcg 74 <210> 20 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UL26/27-rpsL_Rev <400> 20 aacacataaa ctcccccggg tgtccgcggc ctgtttcctc tttcctttcc ggcctggtga 60 tgatggcggg atcg 74 <210> 21 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UL26-tkpA_For <400> 21 gcgtgggggg gaggaaatcg gcactgacca agggggtccg ttttgtcacg gcctcagaag 60 ccatagagcc cacc 74 <210> 22 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UL27-pCMV_Rev <400> 22 aacacataaa ctcccccggg tgtccgcggc ctgtttcctc tttcctttcc tatacgcgtt 60 gacattgatt attg 74 <210> 23 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2scFv-HveA adaptor <400> 23 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 65 70 75 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Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr 290 295 300 Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly 305 310 315 320 Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu 325 330 335 Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly 340 345 350 <210> 24 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2scFv-HveA adaptor <400> 24 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 120 tcttgtgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt ccgacaggcc 180 cctggcaaag gacttgaatg ggtcgccaga atctacccca ccaacggcta caccagatac 240 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 300 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgttc tagatgggga 360 ggcgacggct tctacgccat ggattattgg ggccagggca ccctggtcac agtttctagc 420 ggaggcggag gttctggcgg cggaggaagt ggtggcggag gctctgatat ccagatgaca 480 cagagcccca gcagcctgtc tgcctctgtg ggagacagag tgaccatcac ctgtagagcc 540 agccaggacg tgaacacagc cgtggcttgg tatcagcaga agcctggcaa ggcccctaag 600 ctgctgatct acagcgccag ctttctgtac agcggcgtgc ccagcagatt cagcggctct 660 agaagcggca ccgacttcac cctgaccata agcagtctgc agcccgagga cttcgccacc 720 tactactgtc agcagcacta caccacacct ccaaccttcg gacagggcac caaggtggaa 780 atcaagggtg gtggcggttc agaattcctg ccgtcctgca aggaggacga gtacccagtg 840 ggctccgagt gctgccccaa gtgcagtcca ggttatcgtg tgaaggaggc ctgcggggag 900 ctgacgggca cagtgtgtga accctgccct ccaggcacct acattgccca cctcaatggc 960 ctaagcaagt gtctgcagtg ccaaatgtgt gacccagcca tgggcctgcg cgcgagccgg 1020 aactgctcca ggacagagaa cgccgtgtgt ggc 1053 <210> 25 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HveA-HER2scFv adaptor <400> 25 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 145 150 155 160 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 180 185 190 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 210 215 220 Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 260 265 270 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 275 280 285 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 290 295 300 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 305 310 315 320 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 325 330 335 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 340 345 350 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 355 360 365 Lys <210> 26 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HveA-HER2scFv adaptor <400> 26 atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccag aaccgacgtc 60 ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120 tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180 tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240 ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300 ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360 ggtggtggcg gttcaggatc cgaggtgcag ctggttgaat ctggcggagg actggttcag 420 cctggcggat ctctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaacatcaa ggacacctac 480 atccactggg tccgacaggc ccctggcaaa ggacttgaat gggtcgccag aatctacccc 540 accaacggct acaccagata cgccgactct gtgaagggca gattcaccat cagcgccgac 600 accagcaaga acaccgccta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660 tactactgtt ctagatgggg aggcgacggc ttctacgcca tggattattg gggccagggc 720 accctggtca cagtttctag cggaggcgga ggttctggcg gcggaggaag tggtggcgga 780 ggctctgata tccagatgac acagagcccc agcagcctgt ctgcctctgt gggagacaga 840 gtgaccatca cctgtagagc cagccaggac gtgaacacag ccgtggcttg gtatcagcag 900 aagcctggca aggcccctaa gctgctgatc tacagcgcca gctttctgta cagcggcgtg 960 cccagcagat tcagcggctc tagaagcggc accgacttca ccctgaccat aagcagtctg 1020 cagcccgagg acttcgccac ctactactgt cagcagcact acaccacacc tccaaccttc 1080 ggacagggca ccaaggtgga aatcaag 1107 <210> 27 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEAscFv-HveA <400> 27 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Ala Leu Ser Glu Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 100 105 110 Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Gln Ile Gln 130 135 140 Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 145 150 155 160 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Asp Gly Ile Asn 165 170 175 Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Tyr Met Gly Trp Ile 180 185 190 Asn Thr Ile Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Lys Gly Arg 195 200 205 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile 210 215 220 Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Thr Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 245 250 255 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu 260 265 270 Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg 275 280 285 Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys 290 295 300 Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu 305 310 315 320 Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn 325 330 335 Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly 340 345 <210> 28 <211> 1038 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEAscFv-HveA adaptor <400> 28 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctttctgcat ctgtgggaga cactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaacatttat agttatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaggcct tatcagaagg tgtgccgtca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ggatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg gggattatta ctgtcaacat cattataatt ctccttatac gttcggaggg 360 gggaccaaac tggaaataaa gggctccacc tccgggtctg gtaaatcttc cgagggcaag 420 ggccagatcc agttggtgca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga gacagtcaag 480 atctcctgca aggcttctgg ttattccttc acaaacgatg gaataaactg ggtgaagcag 540 gctccaggaa agggttttaa gtacatgggc tggataaaca ccatcactgg agagccaaca 600 tatactgaag acttcaaggg gcggtttgcc ttctctttgg aaacctctgc cagcactgcc 660 tatttgcaga tcaacaacct caaagatgag gacacggcta catttttctg tgcaaagggg 720 actgggacga gcgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc tggtggtggc 780 ggttcagaat tcctgccgtc ctgcaaggag gacgagtacc cagtgggctc cgagtgctgc 840 cccaagtgca gtccaggtta tcgtgtgaag gaggcctgcg gggagctgac gggcacagtg 900 tgtgaaccct gccctccagg cacctacatt gcccacctca atggcctaag caagtgtctg 960 cagtgccaaa tgtgtgaccc agccatgggc ctgcgcgcga gccggaactg ctccaggaca 1020 gagaacgccg tgtgtggc 1038 <210> 29 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1_UL3/4-rpsL-neo_for <400> 29 taaataacac ataaatttgg ctggttgttt gttgtcttta atggaccgcc cgcaaggcct 60 ggtgatgatg gcgggatcg 79 <210> 30 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1_UL3/4-rpsL-neo_rev <400> 30 taggatcccg gccggatcgc gctcgtcacc cgacactgaa acgccccccc cccctcagaa 60 gaactcgtca agaaggcg 78 <210> 31 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1_UL3/4-HM_pCMV_For <400> 31 taaataacac ataaatttgg ctggttgttt gttgtcttta atggaccgcc cgcaatatac 60 gcgttgacat tgattattg 79 <210> 32 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UL3/4_bGH_poly_Rev <400> 32 taggatcccg gccggatcgc gctcgtcacc cgacactgaa acgccccccc ccccgcctca 60 gaagccatag agcccacc 78 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal seq. HER2 <400> 33 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys 20

Claims (23)

  1. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, 암세포 표적화 도메인과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트가 삽입되어 있는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스로서,
    상기 암세포 표적화 도메인은 표적세포인 암세포의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 도메인으로, 상기 표적분자는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 암세포 표면의 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하고,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 상기 바이러스 게놈의 UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, 또는 US1과 US2 유전자 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HVEM의 세포외 도메인은 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 HveA82, 서열번호 9또는 10의 아미노산 서열로 이루어진 HveA87, 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열로 이루어진 HveA102 또는 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 HveA107인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 그 암세포 표적화 도메인과 그 HVEM(HveA)의 세포외 도메인은 1 내지 30개 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커 펩티드의 아미노산은 Ser, Gly, Ala 및 Thr 중 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원 또는 수용체는 EGFRvⅢ, EGFR, 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), HGF 수용체 c-Met, CXCR4, CCR7, 엔도테린-A 수용체, PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), CD133, CEA(carcinoembryonic antigen), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), GD2(disialoganglioside), GPC3(Glypican 3), PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), GD3(disialoganglioside), HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), MUC1(Mucin1), NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), LMP1(Latent membrane protein 1), TRAILR2(tumor-necrosis factor related apoptosis-inducing ligand receptor), VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), HGFR(hepatocyte growth factor receptor), CD44 또는 CD166인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암세포 표적화 도메인은 표적세포인 암세포의 표적분자인 HER2를 특이적으로 인식하여 결합하는 도메인이고, 그 도메인은 서열번호 1의 VH와 서열번호 2의 VL이 링커 펩티드를 매개로 VH, 링커 펩티드, VL 순서로 연결된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 암세포 표적화 도메인은 표적세포인 암세포의 표적분자인 CEA를 특이적으로 인식하여 결합하는 도메인이고, 그 도메인은 서열번호 3의 VL와 서열번호 4의 VH가 링커 펩티드를 매개로 VL, 링커 펩티드, VH 순서로 결합된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 서열번호 15의 gD(glycoprotein D)의 아미노산 서열 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)이 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)으로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  12. 제1항에 있어서, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 그 당단백질 gB, gC, gD 또는 gH에 추가적인 암세포 표적화 도메인이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  13. 제1항에 있어서, 상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1와 HSV-2 키메라 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 HSV-1 KOS 균주로부터 유래된 재조합 HSV-1인 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  15. 제1항에 있어서, 상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, (i) 사이토카인, (ii) 케모카인, (iii) 면역관문(immune checkpoint)에 대한 길항제, (iv) 면역세포의 활성화를 유도할 수 있는 보조 자극 인자(co-stimulatory factor), (v) 암세포에 대한 면역반응을 억제하는 TGFβ에 대항 길항제, (vi) 고형암 종양미세환경을 구성하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)을 분해할 수 있는 헤파라나아제(heparanase), (vii) 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR-2(VEGF receptor-2)의 기능을 저해할 수 있는 길항제, 및 (viii) 프로드럭(prodrug)을 암세포에 독성을 나타내는 약물(drug)으로 전환시켜주는 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes) 중에 선택된 것을 발현하는 발현카세트가 추가로 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  16. 제15항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-24 등의 인터류킨, IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론, TNFα 등의 종양 괴사 인자, GM-CSF 및 G-CSF 중 하나 이상이고,
    상기 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20 및 XCL-1 중 하나 이상이며,
    상기 면역관문은 PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell deathligand 1), PD-L2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand) 및 CTLA-4(cytolytic T lymphocyte associated antign-4) 중 하나 이상이며,
    상기 보조 자극 인자는 CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1(림프구 기능 연관 항원-1), ICOS(유도성 T 세포 공동자극인자), CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 중 하나 이상이며,
    상기 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes)는 시토신 디아민나아제(Cytosine deaminase), 랫드사이토크롬 P450(rat cytochrome P450, CYP2B1), 카르복실에스터라제(carboxylesterase), 세균 니트로리덕타아제(bacterial nitroreductase) 및 대장균에서 분리된 PNP(purine nucleoside phosphorylase) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  17. 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트가 상기 바이러스 게놈의 UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, 또는 US1과 US2 유전자 사이에 삽입되어 있되, 상기 제1항에 따른 융합단백질의 발현 카세트와는 다른 위치에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  18. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 도메인-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  19. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 암세포 표적화 도메인과 HVEM의 세포외 도메인이 링커 펩타이드를 매개로 연결되고, 상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 도메인-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  20. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제16항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 암세포 표적화 도메인과 HVEM의 세포외 도메인이 융합된 재조합 어댑터 분자를 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제17항의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 암세포 표적화 도메인과 HVEM의 세포외 도메인이 융합된 재조합 어댑터 분자를 추가로 포함하는 조성물.
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