JP5517116B2 - 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 - Google Patents
組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5517116B2 JP5517116B2 JP2008142662A JP2008142662A JP5517116B2 JP 5517116 B2 JP5517116 B2 JP 5517116B2 JP 2008142662 A JP2008142662 A JP 2008142662A JP 2008142662 A JP2008142662 A JP 2008142662A JP 5517116 B2 JP5517116 B2 JP 5517116B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hsv
- virus
- genome
- region
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 28
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 79
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 58
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 101150040913 DUT gene Proteins 0.000 description 11
- 101150098384 NEC2 gene Proteins 0.000 description 11
- 101150110861 TRM2 gene Proteins 0.000 description 11
- 101150063032 UL51 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 6
- 101150087840 UL11 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 4
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 1
- 208000004898 Herpes Labialis Diseases 0.000 description 1
- 101900267627 Human herpesvirus 1 Tegument protein UL21 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150023763 UL12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
また、本発明は、HSV−2のゲノムの全長を保持した組換えHSV−2を提供し、そのウイルスゲノムを保持した大腸菌を提供することにある。
また、本発明は、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる2種の遺伝子のpolyAシグナル間の領域(HSV−1のUL3−UL4間を除く)にバクミドを挿入し、得られた組換えウイルスゲノムを大腸菌に導入させることを特徴とする、野生型ウイルスゲノムの全長を実質的に保持した組換えウイルスゲノム導入大腸菌の製造法を提供するものである。
また、本発明は、野生型HSV−2のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのUL50−UL51遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えHSV−2を提供するものである。
さらに、本発明は、野生型HSV−2のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのUL50−UL51遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えHSV−2ゲノムを保持した大腸菌を提供するものである。
また、本発明の組換えHSV−2は、野生型HSV−2のゲノムの全長を実質的に保持するため、遺伝子発現やワクチン開発のためのベクターおよび基礎的研究に有用である。
本発明方法においては、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる2種の遺伝子のpolyAシグナル間の領域に、外来遺伝子を挿入する。標的ウイルスとしては、DNA型であれば特に制限されないが、例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、パポーバウイルスが挙げられる。
標的ウイルスゲノム中の同一方向にコードされる2種の遺伝子の間の領域に外来遺伝子を挿入すると、プロモーターを破壊するおそれがある。この点、本発明方法で用いるpolyAシグナル間領域であれば、標的ウイルスゲノムの遺伝子の欠損や性状の変化がない。
次に野生型HSV−2DNAと得られた組換えプラスミドとを、HSV−2が感染する細胞にトランスフェクトし、相同組換えを行えば、野生型HSV−2のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのUL50−UL51遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えHSV−2が得られる。ここで、実質的にとは、機能を損ねない範囲でゲノムの全長を保持していることをいう。
(遺伝子間領域に蛍光タンパク質カセットを挿入した組み換えウイルスの製造法)
p26.5-Venusは、HSV-1(F)のUL26.5プロモーター領域(nt 51388 to nt 51673)、Venus蛍光タンパク質遺伝子、HSV-1 UL21およびUL22の双方向poly Aシグナルを含む270bp断片をpBluescript II KS+ (Stratagene)にクローニングした。p26.5-VenusのSacI-KpnI断片をpRB442 (J. Virol. 65: 938-944, 1991)のBamHIサイトにクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in UL3-4を作製した。UL50, UL51を含むHSV-1(F)のBglII-EcoRI断片(nt 106750 to nt 110095)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUL50および UL51のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、pUL50-51pacを作製した。pUL50-51pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in UL50-51を作製した。Us1, Us2を含むHSV-1(F)のEcoRI-BamHI断片(nt 131535 to nt 136289)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUs1およびUs2のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、pUs1-2pacを作製した。pUs1-2pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in Us1-2を作製した。
UL3, UL4遺伝子を含むHSV-2 186ウイルスゲノムのBamHI断片(nt 6772 to nt 14950)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUL3およびUL4のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、p2UL3-4pacを作製した。p2UL3-4pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in 2UL3-4を作製した。UL50, UL51遺伝子を含むHSV-2 186株のゲノムDNA NotI-ClaI断片(n.n. 106473 to n.n. 110443)をpBluescript II KS+ (Stratagene)のNotI-ClaIサイトにクローニングした(pBS-2NC)。pBS-2NCにおけるUL50およびUL51遺伝子のpoly Aシグナル間領域にあるNdeIサイトに、p26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in 2UL50-51を作製した。
p26.5-Venus in UL3-4、p26.5-Venus in UL50-51またはp26.5-Venus in Us1-2とHSV-1(F)株のウイルスDNAをウサギ皮膚細胞(RSC)にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、Venus発現カセットが各遺伝子間領域に挿入された組み換えウイルスYK336 (UL3-UL4遺伝子間)、YK338 (UL50-UL51遺伝子間) 、YK339 (Us1-Us2遺伝子間)(図2)を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、100%のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。YK336, YK338, YK339が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。
YK336, YK338, YK339および野生型HSV-1(F)をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 5で感染させウイルスの細胞内外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した(図4)。YK336, YK338, YK339は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
YK381, YK382および野生型HSV-2 186をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 3で感染させウイルスの細胞内外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した(図5)。YK381, YK382は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
YK336, YK338, YK339と野生型HSV-1(F)について、様々な量のウイルスをマウスの脳内に接種し、LD50を算出した。その結果、各ウイルスのLD50の値に有意な差は見られなかった(表1)。
YK381,YK382と野生型HSV-2 (186)について、様々な量のウイルスをマウスの脳内に接種し、LD50を算出した。その結果、両ウイルスのLD50の値に有意な差は見られなかった(表2)。
(1)pBS246GFPBACの構築
pEGFP-C1 (Clontech)をBglII, BamHIで消化した。その後、末端を平滑化し、ライゲーションを行った。そのAseI-AflIII断片を平滑末端化し、pBS246 (Invitrogen)のSmaIサイトにクローニングした。さらに、pBelloBAC11 (Research Genetics)のSalI断片を平滑末端化し、EcoRVにクローニングした。(図6)
HSV-2 186株のゲノムDNA NotI-ClaI断片(n.n. 106473 to n.n. 110443)をpBliuescript II KS+ (Stratagene)のNotI-ClaIサイトにクローニングした(pBS-2NC)。得られたプラスミドのNdeIサイトを平滑化し、pBS246GFPBACのNotI断片を平滑末端化したものをクローニングして、pBS-2NC-EGFP/BACを構築した。(図6)
pBS-2NC-EGFP/BACとHSV-2 186株のウイルスDNAをウサギ皮膚細胞(RSC)にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、EGFP発現カセットとbacmidがUL50とUL51の遺伝子間領域に挿入された組み換えウイルスYK351を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、100%のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。YK351が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。YK351はUL50とUL51の遺伝子間領域にloxP配列で挟まれたbacmidおよびEGFP発現カセットが挿入され、如何なる既知のHSV-2 ORFも欠損しない全長のHSV-2遺伝子を有している(図7)。
YK351をVero細胞に感染させ、その感染細胞からHirt法により環状ウイルスDNAを抽出した。抽出した環状ウイルスDNAを大腸菌DH10B (Invitrogen)にエレクトロポレーション法によって導入し、クロラムフェニコール添加培地にて選択し、YK351ゲノムを保持する大腸菌YEbac356を得た。(図7)
大腸菌YEbac356からアルカリSDS法によって感染性のHSV DNA (pYEbac356)を抽出し、これをリン酸カルシウム法でRSCにトランスフェクションした。その結果、感染性の組み換えHSV-2 (YK356)の産生が確認された。
pYEbac356から再構築された組み換えウイルス(YK356)と野生型HSV-2 186 DNAについて、アガロース電気泳動上の制限酵素(NotI)切断パターンを図8に示す。図8においてaはbacmid挿入によって見られるバンドであり、bはbacmid挿入によって消失するバンドである。図8に示すように、YK356の制限酵素切断パターンは、bacmid挿入領域を除いて、野生型HSV-2(186)のパターンとほぼ一致した。
得られたYK356および野生型HSV-2 186をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 3で感染させウイルスの細胞内および細胞外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した(図9)。YK356は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
既知の方法(J. Virol. 81: 10575-10587, 2007)を利用して、HSV-2のUL11領域にカナマイシン耐性遺伝子を挿入することによって、当該ウイルス遺伝子を不活化させることを試みた。また、Us3のLys-220をmethionineに置換する変異導入も試みた。既知の方法(J. Virol. 81: 10575-10587, 2007)によって、大腸菌内において、HSV-2ゲノムに変異を導入後、大腸菌よりウイルスゲノムを抽出し、RSCにトランスフェクションすることによって変異ウイルスを得た(YK801: UL11変異、YK811: Us3変異)。変異導入には以下のprimerを用いた。
UL11変異:caccgacggcggggaggtcgtctcgctgaccgcccactaatttgacgtcgtggacatcga aggatgacgacgataagtaggg(配列番号3)およびtaccctcttcttcggactcgatgtccacgacgtcaaattagtgggcggtcagcgagacgacaaccaattaaccaattctgattag(配列番号4)。
Us3変異:tgatagcagccacccgaactaccctcatcgggtaatcgtcatggcggggtggtacgccagaggatgacgacgataagtaggg(配列番号5)およびgccgcgcctcgtggctcgtgctggcgtaccaccccgccttgacgattacccgatgagggtcaaccaattaaccaattctgattag(配列番号6)。
UL11の変異導入は、YK801, YK356のウイルスゲノムをBamHIで処理後、サザン法に供して確認した。プローブは、UL11およびUL12遺伝子にまたがる約500bpの領域をPCRで増幅したものを用いた。Primerは、gtggtgtttattttcccccc(配列番号7)およびtcgagccggggatctaccgg(配列番号8)。Us3の変異導入はYK811のウイルスゲノムの当該領域の塩基配列を決定することによって確認した。図12および13に示すように、目的の変異導入(配列番号9、10)が確認された。
Claims (2)
- 野生型単純ヘルペスウイルス2型のゲノムの全長を保持し、そのゲノムのUL50−UL51遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換え単純ヘルペスウイルス2型。
- 野生型単純ヘルペスウイルス2型のゲノムの全長を保持し、そのゲノムのUL50−UL51遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換え単純ヘルペスウイルス2型ゲノムを保持した大腸菌。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008142662A JP5517116B2 (ja) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 |
CN2009801203142A CN102046790B (zh) | 2008-05-30 | 2009-05-29 | 重组病毒、保持该重组病毒的大肠杆菌及其制备方法 |
PCT/JP2009/002394 WO2009144958A1 (ja) | 2008-05-30 | 2009-05-29 | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 |
US12/995,358 US20120003742A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-05-29 | Recombinant virus, escherichia coli retaining the same and a process for production thereof |
EP09754466.2A EP2298882A4 (en) | 2008-05-30 | 2009-05-29 | RECOMBINANT VIRUS, ESCHERICHIA COLI AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008142662A JP5517116B2 (ja) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009284857A JP2009284857A (ja) | 2009-12-10 |
JP5517116B2 true JP5517116B2 (ja) | 2014-06-11 |
Family
ID=41376847
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008142662A Active JP5517116B2 (ja) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120003742A1 (ja) |
EP (1) | EP2298882A4 (ja) |
JP (1) | JP5517116B2 (ja) |
CN (1) | CN102046790B (ja) |
WO (1) | WO2009144958A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210023751A (ko) * | 2019-08-22 | 2021-03-04 | 주식회사 젠셀메드 | 암세포 표적화 영역과 hvem의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 |
EP3950948A1 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Platform vector for modular and simplified insertion of transgenes into alphaherpesvirinae |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6277621B1 (en) * | 1998-02-26 | 2001-08-21 | Medigene, Inc. | Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences |
JP4226294B2 (ja) * | 2001-10-16 | 2009-02-18 | 寧 川口 | 組換え単純ヘルペスウイルス、大腸菌、及びこれらを得る方法 |
-
2008
- 2008-05-30 JP JP2008142662A patent/JP5517116B2/ja active Active
-
2009
- 2009-05-29 EP EP09754466.2A patent/EP2298882A4/en not_active Withdrawn
- 2009-05-29 CN CN2009801203142A patent/CN102046790B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-29 US US12/995,358 patent/US20120003742A1/en not_active Abandoned
- 2009-05-29 WO PCT/JP2009/002394 patent/WO2009144958A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102046790A (zh) | 2011-05-04 |
US20120003742A1 (en) | 2012-01-05 |
WO2009144958A1 (ja) | 2009-12-03 |
CN102046790B (zh) | 2013-03-27 |
EP2298882A1 (en) | 2011-03-23 |
JP2009284857A (ja) | 2009-12-10 |
EP2298882A4 (en) | 2014-11-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2011234731A (ja) | ポックスウイルスゲノムへの異種遺伝子の組込みのためのベクター | |
JP5517116B2 (ja) | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 | |
Nagel et al. | Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes (BACs) containing herpes simplex virus full-length genomes | |
CN113637705A (zh) | 猴1型腺病毒(SAdV-1)载体系统及其应用 | |
US7494813B2 (en) | VAC-BAC shuttle vector system | |
Yuan et al. | Direct cloning of a herpesvirus genome for rapid generation of infectious BAC clones | |
JP4226294B2 (ja) | 組換え単純ヘルペスウイルス、大腸菌、及びこれらを得る方法 | |
US20200017863A1 (en) | Means for generating adenoviral vectors for cloning large nucleic acids | |
JPH03504196A (ja) | 新規組換えワクチニアウイルス発現ベクター及びその選択方法 | |
Dulal et al. | Use of recombination-mediated genetic engineering for construction of rescue human cytomegalovirus bacterial artificial chromosome clones | |
JP2008283921A (ja) | 動物用ワクチン | |
JP4159620B2 (ja) | 組換えアデノウイルスの製造方法 | |
WO2009053988A1 (en) | Production of bac vectors carrying viral genomes | |
JP6761946B2 (ja) | 巨大環状ウイルスゲノムdnaの単離方法 | |
Liao et al. | Methods for the Manipulation of Herpesvirus Genome and the Application to Marek’s Disease Virus Research. Microorganisms 2021, 9, 1260 | |
CN116064425A (zh) | Tk基因缺失的重组猪伪狂犬病毒和其感染性克隆系统、构建方法及应用 | |
JP3713038B2 (ja) | 組換えアデノウイルス | |
EP4192963A1 (en) | Platform vector for modular and simplified insertion of transgenes into alphaherpesvirinae | |
CN116855547A (zh) | 基于hsv-1的疫苗和融瘤病毒载体的构建 | |
JP2002045184A (ja) | ウイルスの増殖に非必須なdna領域、及びそれを利用した組み換えカナリア痘ウイルス | |
WO2002081716A1 (en) | Improved ovine adenovirus vector | |
JP2003238449A (ja) | 鶏用組み換えワクチン及びそれを用いた免疫付与方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110527 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130319 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130417 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140220 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140311 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140324 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5517116 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |