KR100937774B1 - 헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성재조합 단백질 ｓＨｖｅＡ 및 유전자 치료에 이의 적용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포에 대한 헤르페스바이러스의 감염 효율을 증가시키는, sHveA 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, sHveA₁₀₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법, 상기 sHveA 재조합 단백질과 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너로서 암 표적 항원에 대한 리간드, 수용체, 항체, 혹은 그 항체의 일부분을 융합한 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 CEA scFV-HA₈₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

헤르페스바이러스, HveA/HVEM, 재조합 단백질, 유전자 치료제, 당단백질 D(Glycoprotein D), 암배아성항원(CEA, carcinoembryonic antigen)

Description

헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성 재조합 단백질 ｓＨｖｅＡ 및 유전자 치료에 이의 적용{Soluble recombinant protein sHveA for increasing cell infection efficiency of herpes simplex virus and its application in gene therapy}

본 발명은 헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성 재조합 단백질 sHveA 및 유전자 치료에 이의 적용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 헤르페스바이러스의 세포 표면 수용체인 HveA/HVEM의 일부분을 동물세포에서 발현시킨 수용성 재조합 단백질 sHveA와 특정 표적을 타겟으로하는 sHveA 어댑터에 관한 것으로, 헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1 세포 내로 헤르페스바이러스를 효과적으로 감염시킬 수 있는 물질이다. sHveA₁₀₂와 HveA 어댑터는 암표적 유전자 치료제로서 유용한 선도물질로 목적하는 암표적 물질을 발현하는 세포 내로 헤르페스바이러스를 감염시켜 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

헤르페스바이러스는 150 킬로베이스의 유전자를 포함하는 DNA 바이러스로서, 약 100-200nm 크기의 엔벨롭(envelope)이 있는 다면체성 바이러스(enveloped icosahedral virion)이다. 헤르페스바이러스의 세포 내 감염 경로를 살펴보면, 먼저 엔벨롭의 당단백질 B(Glycoprotein B; gB) 혹은 C(Glycoprotein C; gC)가 세포 표면의 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan; GAG)에 먼저 부착하며, 그 다음 단계로 엔벨롭의 당단백질 D(Glycoprotein D; gD)가 세포 표면의 여러 가지 수용체와 결합하여 세포막과 바이러스 사이의 융합이 이루어져 세포 내로 들어가게 된다 (Spear PG. Cell Microbiol. 2004;6(5):401-410; Spear PG, Eisenberg RJ, Cohen GH. Virology. 2000;275(1):1-8). 이 과정에 대한 메카니즘은 아직 상세하게 밝혀져 있지 않다. 현재까지 알려진 세포 표면 헤르페스바이러스 수용체는 HveC/nectin-1, HveA/HVEM, 및 HveB/nectin-2이다. HveC와 HveB는 면역글로불린의 슈퍼 패밀리에 속하며 세포부착에 관련하는 물질인 nectin-1과 nectin-2로 잘 알려져 있다. 이들은 주로 HSV 타입 1과 타입 2 바이러스의 수용체로서 작용한다. 다음으로 본 발명의 주요물질인 HveA/HVEM은 종양괴사인자 수용체(Tumor necrosis factor receptor; TNFR) 슈퍼 패밀리에 속하며 주로 헤르페스바이러스 타입 1과 타입 2의 수용체로서 작용하는 것으로 잘 알려져 있다 (Whitbeck JC et al., J. Virol. 1997;71(8): 6083-6093). 또한, HveA/HVEM은 주로 B 림프종이나 T 림프종 같은 림프종 조직에 많이 발현되는 것으로 알려져 있다 (Montgomery RI et al., Cell. 1996;87(3): 427-436). HveA/HVEM은 4 개의 cystein-rich domain(CRD)으로 구성되어 있으며, 그 중 아미노 말단 부위의 2 개 CRD가 헤르페스바이러스 gD와 결합하여 수용체로서 작용하는 것으로 알려져 있다.

암을 치료하기 위한 수술요법, 항암화학요법, 방사선요법 및 면역요법은 수 반되는 부작용을 피할 수 없을 뿐만 아니라 항암 효과도 한계점이 노출되어 몇몇 암을 제외하고는 큰 효과를 보지 못하고 있다. 종래의 암치료제의 경우 체내에서 쉽게 분해되거나 그 치료 효과가 오래 지속되지 못하므로 반복 투여가 필요하고 그에 따른 내성이나 부작용 등의 문제점이 발생해 왔다. 유전자치료(Gene therapy)란 결핍된 유전자나 전혀 새로운 기능의 유전자를 인체 세포에 이입함으로써 암이나 AIDS와 같은 난치병을 치료하고자 하는 것이다. 유전자치료를 이용하면 치료용 물질이 체내에서 장기간 발현될 수 있으며, 목적 유전자의 전달과 발현의 조절이 가능하고 치료제 작용의 선택성을 추구할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 환자의 변이된 유전 정보를 유전자 재조합에 의해 교정할 수 있는 등의 잠재성을 지니고 있다.

현재 많이 이용되고 있는 유전자 치료제의 벡터는 80% 이상이 바이러스 벡터이다. 이는 목적 유전자를 세포에 효율적으로 전달, 발현할 수 있어야 하는 등의 목적을 달성하기에 적합하기 때문이다. 그 중에서도 아데노바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 증식/비증식 세포에 모두 전달이 가능하다는 장점 때문에 많이 이용되고 있지만, 반복투여시 강한 면역반응을 유도하고 삽입할 수 있는 유전자의 크기가 제한된다는 단점이 있다. 이에 반해 헤르페스바이러스는 삽입 유전자의 제한이 없고 여러 개의 유전자 삽입이 가능하며, 신경세포 내로도 유전자의 전달이 가능하다는 장점을 지니고 있다. 특히 표적지향적 유전자 전달 벡터로 헤르페스바이러스가 유리한 점은 앞서 언급하였듯이 세포내 삽입에 관련하는 세포 표면 수용체가 3가지나 된다는 점으로 이것을 각각 특이적으로 이용하면 세포 표적 유전자 전달에 시너 지 효과를 가져올 수 있다.

미국에서 아데노바이러스나 레트로바이러스를 이용한 유전자 치료제 연구는 아주 많이 개발되어 전임상뿐만 아니라 임상시험을 진행하고 있지만 헤르페스바이러스를 이용한 세포 수준에서의 연구는 초보단계에 머물러 있다. 그간 진행된 연구사례로는 세포 표면 수용체-리간드간 상호반응에 의하여 표적세포의 표면단백질과 결합할 수 있는 리간드를 바이러스 벡터의 표면에 함입시켜서 재조합 벡터를 재조합함으로써 내재된 유전자를 특정 세포에 선택적으로 전달하려는 시도로 1998년 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 헤르페스바이러스 표면에 있는 당단백질 C의 아미노 말단에 함입시켜 키메라 당단백질 C 바이러스를 제조해서 에리스로포이에틴 수용체(Erythropoietin receptor) 발현 세포주에 전달을 하였지만 전달 후 융합에 의해서가 아니라 엔도사이토시스에 의해 바이러스가 세포 안에서 분해됨으로써 낮은 전달 효율을 보고하였다 (Laquerre S et al., J. Virol. 1998. Dec;72(12): 9683-9697). 다음으로 시카고대학의 Dr. Roizman은 당단백질 C와 당단백질 D에 IL-13을 함입시켜 IL-13에 의존적인 바이러스 전달을 시도하였다고 보고하였지만 여전히 바이러스가 결합할 수 있는 세포 표면 수용체인 HveC와 결합할 수 있는 당단백질 D 도메인을 갖고 있어 진정한 표적화 벡터라 하기는 어렵다(Zhou G et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2002. Nov;99(23): 15124-15129). 표적세포 표면 항원에 대해 특이성을 갖는 항체분자를 벡터의 표면에 발현시키거나 세포 표면물질과 벡터 표면물질에 대해 각각 특이성을 보이는 물질들을 결합시킨 bi-specific 어댑터를 이용하여 특정 표면 항원이 존재하는 제한된 세포군에 헤르페스바이러스를 이용하 여 목적 유전자를 전달시키는 방법은 아직 연구되고 있지 않다. 본 발명자들이 헤르페스바이러스 세포 표면 수용체의 하나인 HveC/nectin-1을 재조합 단백질로 발현시키고 수용체로서의 기능을 확인하여 보고하였고, 특정 세포 표적 어댑터로서 개발을 진행 중에 있다 (Kwon H et al., J. Virol. 2006 Jan;80(1): 138-148).

암에 걸리면 혈액에 이상 징후를 반영하는 항원 물질이나 단백질이 발생한다. 거꾸로 암을 억제하는 생체물질이 감소한다. 이런 물질을 종양표식자라 한다. 현재 종양표식자는 암의 종류에 따라 수개 또는 수십 종류가 발견되고 있다. 종양표식자를 이용해 암을 진단하면 조직검사를 하는 것에 비해 시간이 적게 들고 환자가 편하다. 암의 종류, 전이 여부, 치료 효과 판정에도 도움을 준다. 하지만 종양표식자가 검출 또는 증가했다고 해서 100% 암이 있다고 볼 수는 없다. 이런 징후가 혈액검사로 나타났을 경우 조직검사를 통해 실제 암으로 확진되는 경우는 적게는 20%, 많게는 90% 정도이다. 일반적으로 혈액을 이용한 암진단은 암마다 한두가지 정도의 종양표식자가 나오는지를 판독한다. 위암, 간암, 폐암 등은 진단정확도가 떨어지는 반면 자궁암, 유방암 등은 상대적으로 높다.

현재 국내외적으로 췌장암, 대장암, 위암, 폐암, 유방암, 직장암, 결장암, 갑상선 수질암 등의 진단을 위한 종양표식자로 암 배아성 항원의 유무를 검사하고 있다. 암 배아성 항원은 태아 조직의 정상 분화 동안 발현되지만 성인에서는 부분적으로 또는 완전히 억제되는 유전자 산물이다. 따라서 성인에게서 혈액 내 암 배아성 항원의 존재는 상기 열거한 암에 걸릴 가능성이 매우 높다고 할 수 있다.

본 발명의 목적은 세포에 대한 헤르페스바이러스의 감염 효율을 증가시키는, sHveA 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 sHveA 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 sHveA₁₀₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 sHveA 재조합 단백질과 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너로서 암 표적 항원에 대한 리간드, 수용체, 항체, 혹은 그 항체의 일부분을 융합한 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CEA scFV-HA₈₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명자들은 표적지향적 헤르페스바이러스의 세포 내 전달을 위한 전단계물질인 sHveA를 수용성 재조합 단백질로 발현시키고, 발현된 단백질을 순수하게 분리하여 헤르페스바이러스의 세포내 전달에 sHveA₁₀₂가 80-90% 정도의 효율을 지닌다는 것을 밝혔으며, 또한 표적지향적 헤르페스바이러스의 세포 내 전달을 위한 표적으로 암 배아성 항원을 선택하여 전술한 sHveA와 암 배아성 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv 부분을 융합시킨 재조합 CEA scFv-HA₈₂를 제작하여 암 배아성 항원을 발현하는 세포주 내로만 특이적으로 헤르페스바이러스를 전달할 수 있는 유전자 치료제를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 sHveA₁₀₂를 수용성 재조합 단백질로 발현시키고, 상기 발현된 단백질을 이용하여 헤르페스바이러스 저항성 세포주 내로 헤르페스바이러스를 효과적으로 전달할 수 있다. 또한, 상기 단백질에 암 표적 리간드에 결합하는 물질을 부착하면 암세포 표적 유전자 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포에 대한 헤르페스바이러스의 감염 효율을 증가시키는, sHveA 재조합 단백질을 제공한다. 상기 세포는 다 양한 유래의 세포일 수 있으나, 바람직하게는 헤르페스바이러스 저항성 세포이며, 더욱 바람직하게는 CHO-K1 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 세포는 헤르페스바이러스 감염이 불가능한 세포일 수도 있다. 상기 재조합 단백질은 바람직하게는 수용성이다.

본 발명은 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질 뿐만 아니라 서로 다른 크기의 sHveA 단백질 즉, sHveA₈₂, sHveA₈₇, sHveA₁₀₇ 단백질 등을 포함한다. 이 재조합 단백질들 또한 헤르페스바이러스를 헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1 세포 내로 감염시키는 효율이 sHveA₁₀₂와 비슷한 정도를 보이고 있다. 상기 sHveA₁₀₂ 는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 sHveA₈₂ 는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 sHveA₈₇ 는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 sHveA₁₀₇ 는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 sHveA 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₁₀₂, 서열번호 11으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₈₂, 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₈₇, 또는 서열번호 15로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₁₀₇ 일 수 있다.

sHveA 단백질들은 헤르페스바이러스의 세포 표면 수용체인 HveA/HVEM의 일부분이다. 인간 HveA/HVEM은 진뱅크 수탁번호(GenBank accession No. U70321)에 기재된 것으로, 세포 외 구역(extracellular region)에 존재하는 아미노 말단 부위, 트랜스막 도메인(transmembrane domain), 세포 내 구역(intracellular region)에 존재하는 카르복시 말단 부위 등으로 이루어져 있다. 예를 들면, 상기 sHveA₁₀₂ 유전자는 HveA/HVEM의 아미노 말단 부위 2개의 CRD를 포함하는 부분으로 148개의 아미노산으로 이루어져 있고, 종결코돈 앞에 6개의 히스티딘 아미노산 서열이 첨가되어 있다. 6개의 히스티딘 아미노산 서열은 재조합 단백질로 발현되었을 때 웨스턴 블랏을 통한 단백질의 확인과 Probond resin을 통한 단백질의 분리에 이용하기 위한 것이다.

상기 sHveA 단백질의 아미노산 서열에서 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있으며 이와 같이 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 sHveA 재조합 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴 클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.

"실질적으로 유사한" 폴리펩티드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 변화에 의해 상이할 수 있는 것을 제외하고는 상기 서열을 공유한다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며, 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이며, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이며, 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다.

폴리뉴클레오티드 서열의 실질적인 동일성은 폴리뉴클레오티드가 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또 다른 의미는 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로에게 특이적으로 혼성화되는 경우 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 것이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서는 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 10 ℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 정합된 프로브에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 프로브의 길이 및 염기 조성 양자의 함수인, 혼성체의 Tm은 문헌(Sambrook, T. et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (second edition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring) 내의 정보를 이용하여 계산될 수 있다. 전형적으로, 서던 블롯 절차에 대한 엄격한 조건은 0.2XSSC로 65℃에서의 세척을 포함한다.

본 발명의 sHveA₁₀₂(sHveA₈₂, sHveA₈₇, sHveA₁₀₇ 등도 포함) 유전자 및 단백질은 인간 세포로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 sHveA₁₀₂ 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환 시켰다. 벡터의 제작시에는, 상기 sHveA₁₀₂ 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator) 등과 같은 발현 조절 서열, 자가-복제 서열 및 분비 신호 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 sHveA 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 유전자는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현할 수 있다. 박테리아에 이용하기에 바람직한 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen); pBS 벡터, PHAGESCRIPT 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵세포 벡터는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(Stratagene); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 본 발명에서는 pcDNA3.1 벡터를 이용하였다.

바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터는 sHveA 유전자가 pcDNA3.1 벡터의 HindIII 및 XhoI 부위에 삽입된 sHveA-pcDNA3.1인 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터는 sHveA₁₀₂ 유전자가 pcDNA3.1 벡터의 HindIII 및 XhoI 부위에 삽입된 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1인 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 프로모터 부위, 다클로닝 부위(multiple cloning site), 소성장호르몬(Bovine growth hormone; BGH)의 후아데닌다중화(late polyadenylation) 신호 부위를 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 sHveA₁₀₂ 단백질을 생산할 수 있는 재조합 단백질 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터인 pcDNA3.1 벡터는 시판되는 포유동물 발현용 벡터로 sHveA₁₀₂ 유전자를 삽입하고 이를 숙주세포, 예를 들어 DH5α세포 등에 형질전환시켜 제조될 수 있다. sHveA₁₀₂ 유전자의 증폭을 위해서 PCR 반응을 수행하였다. 상기 수득된 sHveA₁₀₂ DNA를 이용하여 sHveA₁₀₂ 단백질을 발현할 수 있는 재조합 단백질 발현 벡터 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1을 완성하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터를 형질전환하기 위한 숙주 세포로는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 포유동물 세포는 예를 들면, 293T 세포주이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 포유동물 세포에 삽입하여 배양하는 단계를 포함하는 sHveA 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. sHveA₁₀₂ 재조합 단백질뿐만 아니라, sHveA₈₂, sHveA₈₇ 또는 sHveA₁₀₇ 단백질도 본 발명의 방법에 의해 제조할 수 있다. sHveA₁₀₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법은 구체적으로 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1를 포유동물 세포에 삽입하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

단백질 발현을 위한 숙주 세포는 통상적으로 포유동물 세포이며, 재조합 단백질이 발현되기에 좋은 환경을 제공하는 한 특별한 종류에 한정될 필요는 없으며 유전자 발현을 위해 숙주시스템으로 개발된 것 또는 시판되고 있는 포유동물 세포로서 특히 293T 등을 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 세포 내 삽입은 통상적으로 제조사로부터 제공되는 트랜스펙션 과정이 그대로 적용될 수 있다.

숙주세포는 이미 알려진 배양 조건하에 배양되며, 통상적인 발효 산물의 회수방법에 따라 수집한 후 파쇄시켜 그로부터 재조합 단백질을 회수 및 정제할 수 있다. 이와 같이 제조되는 재조합 단백질은 헤르페스바이러스의 세포 내 감염 수용체 단백질을 포함하며 헤르페스바이러스 감염의 수용체로 제공된다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 sHveA 재조합 단백질과 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너로서 암 표적 항원에 대한 리간드, 수용체, 항체, 혹은 그 항체의 일부분을 융합한 융합 단백질을 제공한다. 상기 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너는 상피세포 성장인자 수용체의 항체, CD20에 결합하는 항체 또는 에리스로포이에틴 수용체 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CEA scFv-HA₈₂ 일 수 있다. 상기 융합 단백질 CEA scFv-HA₈₂ 는 암 배아성 항원(CEA)의 단일쇄 가변 단편 (single-chain variable fragment; scFv) 부분 및 sHveA₈₂로 이루어진다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 CEA scFv-HA₈₂ 코딩 유전자일 수 있다. 상기 암 배아성 항원의 scFv 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 마우스 항체의 일부분이다. 서열번호 3으로 표시되는 암 배아성 항원의 scFv 유전자는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위로 이루어져 있다. 상기 서열번호 3으로 표시되는 CEA scFv-HA₈₂ 유전자는 HveA/HVEM의 아미노 말단 부위 2개의 CRD를 포함하는 부분과 암 배아성 항원의 scFv가 GGGGS 아미노산으로 이루어진 링커로 연결되어 있다. 상기 CEA scFv-HA₈₂ 단백질의 아미노산 서열에서 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있으며 이와 같이 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 CEA scFv-HA₈₂ 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 CEA scFv-HA₈₂ 유전자 및 단백질은 인간 세포와 마우스 하이브리도마 세포로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명 의 유전자를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 CEA scFv-HA₈₂ 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 벡터의 제작시에는, 상기 CEA-HA 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator) 등과 같은 발현 조절 서열, 자가-복제 서열 및 분비 신호 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 유전자는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현할 수 있다. 박테리아에 이용하기에 바람직한 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen); pBS 벡터, PHAGESCRIPT 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵세포 벡터는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(Stratagene); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 본 발명에서는 pcDNA3.1 벡터를 이용하였다.

바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터는 CEA scFV-HA₈₂ 유전자가 pcDNA3.1 벡터의 BamHI 및 XhoI 부위에 삽입된 CEA scFV-HA₈₂-pcDNA3.1 일 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 프로모터 부위, 다클로 닝 부위(multiple cloning site), 소성장호르몬(Bovine growth hormone; BGH)의 후아데닌다중화(late polyadenylation) 신호 부위를 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 CEA scFv-HA₈₂ 단백질을 생산할 수 있는 재조합 단백질 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터인 pcDNA3.1 벡터는 시판되는 포유동물 발현용 벡터로 CEA scFv-HA₈₂ 유전자를 삽입하고 이를 숙주세포, 예를 들어 DH5α세포 등에 형질전환시켜 제조될 수 있다. CEA scFv-HA₈₂ 유전자의 증폭을 위해서 PCR 반응을 수행하였다. 상기 수득된 CEA scFv-HA₈₂ DNA를 이용하여 CEA scFv-HA₈₂ 단백질을 발현할 수 있는 재조합 단백질 발현 벡터 CEA scFv-HA₈₂-pcDNA3.1을 완성하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터를 형질전환하기 위한 숙주 세포로는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 포유동물 세포는 예를 들면, 293T 세포주이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 포유동물 세포에 삽입하여 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 융합 단백질 중, sHveA 단백질은 sHveA₈₂ 단백질뿐만 아니라, sHveA₈₇, sHveA₁₀₂ 또는 sHveA₁₀₇ 단백질도 본 발명의 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법은 구체적으로 재조합 발현 벡터 CEA scFV-HA₈₂-pcDNA3.1를 포유동물 세포에 삽입하여 배양하는 단계를 포함하는 CEA scFV-HA₈₂ 재조합 단백질을 제조하는 방법을 예로 들 수 있다.

단백질 발현을 위한 숙주 세포는 통상적으로 포유동물 세포이며, 재조합 단백질이 발현되기에 좋은 환경을 제공하는 한 특별한 종류에 한정될 필요는 없으며 유전자 발현을 위해 숙주시스템으로 개발된 것 또는 시판되고 있는 포유동물 세포로서 특히 293T 등을 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 세포 내 삽입은 통상적으로 제조사로부터 제공되는 트랜스펙션 과정이 그대로 적용될 수 있다.

숙주세포는 이미 알려진 배양 조건하에 배양되며, 통상적인 발효 산물의 회수방법에 따라 수집한 후 파쇄시켜 그로부터 재조합 단백질을 회수 및 정제할 수 있다. 이와 같이 제조되는 재조합 단백질은 암을 포함한 특정 세포 표적을 발현하는 세포 내로 헤르페스바이러스를 감염시킬 수 있는 유전자 치료제로 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

일반적인 분자 생물학 기법

분자생물학에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면 정제용 플라스미드 추 출, 염화세슘 구배에서의 플라스미드 DNA 원심분리, 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 대장균의 형질전환 등은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982 (2nd Ed., 1989); Ausubel F.M.et al., (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 충분히 설명되어 있다.

라이게이션을 위하여, DNA 단편은 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로 크기별로 분리한 뒤 제조업자의 추천에 따라 파아지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 항온처리하였다.

PCR 기법에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 "DNA 가열 순환기"(제조원: Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 염기서열의 확인은 제조원(Amersham)에서 공급하는 키트를 사용하여 생거 등에 의해 개발된 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467]에 따라 실시하였다.

플라스미드 DNA는 퀴아젠 플라스미드 정제 시스템(제조원: Qiagen)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다.

실시예 1: sHveA ₁₀₂ 를 발현하는 재조합 발현 벡터 제조

sHveA₁₀₂ 유전자를 분리하기 위해, 정방향 프라이머(서열번호 5)와 역방향 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 인간 HveA/HVEM 유전자로부터 PCR 반응을 수행하여 정상적인 인간 sHveA₁₀₂ 유전자를 얻었다. 구체적인 PCR 반응은 하기와 같이 실시하였다: 0.1㎍의 HveA/HVEM DNA, 10pmol의 서열번호 5 및 6 프라이머, Taq 중합효소 (제조원:Takara) 10 유닛, 1X 완충액, dNTP 2.5mM의 혼합물에 50㎕가 되게 물을 맞추었다. 95℃에서 5분간 주형 DNA를 예비변성하고, 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분의 30 사이클을 수행하고, 72℃에서 10분간 최종연장하여 sHveA₁₀₂ DNA를 증폭하였다. 이렇게 증폭된 sHveA₁₀₂ DNA를 컬럼을 통해 분리하였다. 역방향 프라이머(서열번호 6)는 6개의 히스티딘 아미노산 코딩 서열을 포함하고 있다. 상기 sHveA₁₀₂ DNA를 상기 pcDNA3.1 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하기 위하여, HindIII와 XhoI 제한효소로 벡터 및 sHveA₁₀₂ DNA를 절단하여 분리하였다. 이렇게 분리된 sHveA₁₀₂을 상기 벡터에 라이게이션한 후 형질전환 숙주인 DH5α에 형질전환시켰으며, 이 중에서 정상적으로 제조된 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1을 선별하였으며, 이를 대량 생산하였다. 도 1은 HveA/HVEM의 구조와 sHveA102의 구조 개요도를 나타낸다. 도 2는 재조합 단백질 발현 벡터인 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1의 개열 지도를 보여준다.

실시예 2: 재조합 sHveA ₁₀₂ 단백질의 발현 및 정제

재조합 sHveA₁₀₂ 단백질을 생산하기 위하여 293T 세포를 이용하였으며, 대량생산한 15㎍의 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1 벡터를 항생제가 포함되지 않은 배지에 혼합하고 또한 30㎕의 리포펙타민(lipofectamine)을 항생제가 포함되지 않은 배지에 혼합한 후 두 용액을 혼합하여 약 15분간 실온에 방치하여 293T 세포 내로 넣어주었다. 37℃에서 5시간 배양 후 용액을 제거하고 10% FBS(fetal bovine serum)이 함유된 배양액에서 3일간 배양하였다. 배양 상층액을 취하여 1ml의 Probond Resin(제조원: Invitorgen)과 4℃에서 1시간 동안 혼합하여 배양 상층액의 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질을 결합시켰다. 반응액을 컬럼을 통과시킨 후 10 mM 이미다졸이 포함된 인산 완충액 20 ml을 넣어 resin에 결합하지 않은 배양액을 세척하였다. 250 mM 이미다졸이 포함된 인산 완충액 5 ml을 넣어 resin과 결합한 단백질을 용출한 후 1X PBS(인산 완충 염수)에서 2시간씩 3번 투석하였다. 투석한 후 얻어진 단백질은 Bradford 단백질 정량분석법에 따라 정량하고 단백질의 발현은 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다. 도 4의 1번 레인은 분리한 500 ng의 sHveA₁₀₂ 단백질을 나타낸다. 도 4에서 맨 좌측의 숫자는 단백질의 크기를 나타내는 마커를 표시한 것이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이 sHveA₁₀₂(레인 1)는 15 kDa의 크기를 나타내었다.

실시예 3: sHveA ₁₀₂ 에 의한 헤르페스바이러스의 세포 내 감염 효과

재조합 sHveA₁₀₂ 단백질이 헤르페스바이러스 저항성 세포 내로 바이러스를 효과적으로 전달할 수 있는지를 알아보았다.

헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1 4.2 X 10⁵ 개체와 야생형 헤르페스바이러스인 KOS/tk12를 1부터 9 엠오아이(moi)로 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000 nM 농도의 sHveA₁₀₂를 PBS에 희석하 여 위의 바이러스와 세포 배양 반응액에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 각각의 반응액을 96웰 플레이트(Corning Inc. NY, USA)에 40 ㎕씩 넣어주고 10% FBS(JRH Biosciences Inc. Kansas, USA), 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 Ham's F12-K (WelGENE Inc. Daegu, South Korea)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. 배양한 지 6-8시간이 지난 후에 X-gal 염색과 ONPG 방법으로 KOS/tk12의 세포 내 감염 정도를 측정하였다. KOS/tk12 바이러스에 리포터 유전자인 LacZ가 삽입되어 있어 바이러스가 세포 내로 감염되면 β-갈락토시다아제를 발현하게 된다. 이 물질은 x-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside; Sigma)과 반응시키면 푸른색으로 발색하게 된다. 따라서 KOS/tk12가 감염된 세포주를 1% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde; Sigma)로 고정시킨 후 x-gal 용액을 넣어주고 반응시킨 후 광학현미경으로 감염된 세포를 관찰할 수 있다. ONPG(2-Nitrophenylβ-D-galactopyranoside; Sigma) 역시 x-gal과 비슷한 물질로 β-갈락토시다아제와 반응시키면 노란색을 나타내고 이것의 흡광도를 측정하여 도식화할 수 있다. 도 5a에서, 그래프의 x 축은 sHveA₁₀₂ 농도를 나타내고, y 축은 바이러스의 감염 정도를 나타낸다. 도 5b는 sHveA₁₀₂의 농도에 따른 모양을 나타낸다. 도 5a에서 보여주는 바와 같이, sHveA₁₀₂의 농도가 높아질수록 KOS/tk12의 감염이 증가하였다. 바이러스의 엠오아이(moi)와 sHveA₁₀₂의 농도 증가에 따른 감염 정도를 관찰한 결과, 도 6a에서 보는 바와 같이 바이러스의 양과 sHveA₁₀₂의 농도에 따라 바이러스의 감염 정도는 증가하였다. 도 6b는 도 6a의 실험을 x-gal 염색법으로 염색하여 전체 세포 중 바이러스가 감염된 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타낸 것이다. 통상 3 엠오아이(moi)의 바이러스를 넣어주고 sHveA₁₀₂를 500 nM 정도 처리하면 70% 정도의 세포에 바이러스를 전달하는 효과를 나타내었다.

또한, 재조합 sHveA₈₂ 단백질 및 재조합 sHveA₁₀₇ 단백질이 헤르페스바이러스 저항성 세포 내로 바이러스를 효과적으로 전달할 수 있는지를 알아보았다. 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질과 유사하게 실험을 수행하였다. 도 7a에서, 그래프의 x 축은 각각 500 nM 농도의 재조합 sHveA 단백질들을 나타내고, y 축은 바이러스의 감염 정도를 나타낸다. 도 7b는 재조합 sHveA 단백질들의 농도에 따른 모양을 나타낸다. 도 7a에서 보여주는 바와 같이, 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질 못지 않게 재조합 sHveA₈₂ 단백질 및 재조합 sHveA₁₀₇ 단백질도 KOS/tk12을 효율적으로 감염시킨다는 것을 알 수 있다.

실시예 4: sHveA ₁₀₂ 에 의한 헤르페스바이러스의 세포 내 감염 특이성 확인

상기 실시예 3에서 나타난 sHveA₁₀₂에 의한 바이러스의 헤르페스바이러스 저항성 세포 내로의 감염이 당단백질 D에 특이적인 반응인지를 알아보기 위해 아래의 방법으로 검증하였다.

야생형 헤르페스바이러스에 리포터 유전자만을 포함하고 있는 KOS/tk12와 바이러스 엔벨롭의 당단백질 D에 돌연변이화로 인하여 HveA와 결합하는 능력을 제거 한 돌연변이성 헤르페스바이러스 Rid1을 이용하여 sHveA₁₀₂에 의한 바이러스의 감염 특이성을 살펴보았다.

KOS/tk12와 Rid1 바이러스와 CHO-K1 세포주를 실시예 3에서와 같은 방법으로 혼합한 후, 0부터 1000 nM 농도의 sHveA₁₀₂를 넣어주었다. 반응액을 37℃에서 1시간 동안 처리하고 96웰 플레이트에 넣어주고 배양액을 첨가하여 다시 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 6-8 시간 동안 배양하였다. 실시예 3에서와 마찬가지로 x-gal 염색법과 ONPG 방법으로 각각 바이러스의 세포 내 감염 정도를 측정하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, HveA에 결합하는 능력을 상실한 Rid1 바이러스의 경우에는 sHveA₁₀₂와 결합하지 못하므로 결과적으로 세포 내로 감염이 되지 않음을 알 수 있었고, 반면 야생형 바이러스는 여전히 sHveA₁₀₂의 농도가 높아짐에 따라 세포 내로 감염이 효율적으로 일어나는 결과를 보여주었다.

실시예 5: CEA scFv - HA ₈₂ 를 발현하는 재조합 발현 벡터 제조

CEA scFv 유전자를 분리하기 위해, 정방향 프라이머(서열번호 7)와 역방향 프라이머(서열번호 8)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 정상적인 CEA scFv 유전자를 얻었다. 구체적인 PCR 반응은 하기와 같이 실시하였다: 0.1㎍의 CEA scFv DNA, 10pmol의 서열번호 7 및 8 프라이머, Taq 중합효소 (제조원:Takara) 10 유닛, 1X 완충액, dNTP 2.5mM의 혼합물에 50ul가 되게 물을 맞추었다. 95℃에서 5분간 주형 DNA를 예비변성하고, 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분의 30 사이클을 수행하고, 72℃ 에서 10분간 최종연장하여 CEA scFv DNA를 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 CEA scFv DNA를 컬럼을 통해 분리하였다. 역방향 프라이머 (서열번호 8)는 GGGGS 아미노산 코딩 서열을 포함하고 있다. 상기 CEA scFv DNA를 상기 pcDNA3.1 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하기 위하여, BamHI와 EcoRI 제한효소로 벡터 및 CEA scFv DNA를 절단하여 분리하였다. 이렇게 분리된 CEA scFv을 상기 벡터에 라이게이션한 후 형질전환 숙주인 DH5α에 형질전환시켰으며, 이 중에서 정상적으로 제조된 CEA scFv-pcDNA3.1을 선별하였으며, 이를 대량 생산하였다.

다음으로, sHveA₈₂ 유전자를 분리하기 위해, 정방향 프라이머 (서열번호 9)와 역방향 프라이머 (서열번호 10)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 정상적인 sHveA₈₂ 유전자를 얻었다. 구체적인 PCR 반응은 하기와 같이 실시하였다: 0.1㎍의 HVEM/HveA DNA, 10pmol의 서열번호 9 및 10 프라이머, Taq 중합효소 (제조원:Takara) 10 유닛, 1X 완충액, dNTP 2.5mM의 혼합물에 50ul가 되게 물을 맞추었다. 95℃에서 5분간 주형 DNA를 예비변성하고, 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분의 30 사이클을 수행하고, 72℃에서 10분간 최종연장하여 sHveA₈₂ DNA를 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 sHveA₈₂ DNA를 컬럼을 통해 분리하였다. 역방향 프라이머(서열번호 10)는 6개의 히스티딘 아미노산 코딩 서열을 포함하고 있다. 상기 sHveA₈₂ DNA를 상기 CEA scFv-pcDNA3.1 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하기 위하여, EcoRI와 XhoI 제한효소로 벡터 및 HveA₈₂ DNA를 절단하여 분리하였다. 이렇게 분리된 HveA₈₂을 상기 벡터에 라 이게이션한 후 형질전환 숙주인 DH5α에 형질전환시켰으며, 이 중에서 정상적으로 제조된 CEA scFv-HA₈₂-pcDNA3.1을 선별하였으며, 이를 대량 생산하였다. 도 1은 CEA scFv-HA₈₂의 구조 개요도를 나타낸다. 도 3은 재조합 단백질 발현 벡터인 CEA scFV-HA₈₂-pcDNA3.1의 개열 지도를 보여준다.

실시예 6: 재조합 CEA scFv - HA ₈₂ 단백질의 발현 및 정제

재조합 CEA scFv-HA₈₂ 단백질의 발현 및 정제는 실시예 2의 sHveA₁₀₂ 단백질의 발현 및 정제와 유사하게 수행하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 약 37 kD (레인 2)의 단백질을 얻어 분리 정제하였다.

실시예 7: CEA scFv - HA ₈₂ 에 의한 헤르페스바이러스의 세포 내 감염 효과

재조합 CEA scFv-HA₈₂ 단백질이 암 배아성 항원을 발현하는 헤르페스바이러스 저항성 세포 (CHO-CEA 세포주) 내로 바이러스를 효과적으로 전달할 수 있는지를 알아보았다.

헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1과 CHO-CEA 1.5 X 10⁴ 개체를 96웰 플레이트에 넣어주고 10% FBS, 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 Ham's F12-K을 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. 헤르페스바이러스인 QOZHG를 10 엠오아이(moi)와 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000 nM 농도의 CEA scFv-HA₈₂를 PBS에 희석하여 4℃에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 각각의 반응액을 CHO-K1과 CHO-CEA 세포가 배양되어 있는 96웰 플레이트에 40 ㎕씩 넣어주고 10% FBS, 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 Ham's F12-K을 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. 배양한지 14-16 시간이 지난 후에 X-gal 염색과 ONPG 방법으로 QOZHG의 세포 내 감염 정도를 측정하였다. QOZHG 바이러스에 리포터 유전자인 LacZ가 삽입되어 있어 바이러스가 세포 내로 감염되면 β-갈락토시다아제를 발현하게 된다. 이 물질은 x-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside; Sigma)과 반응시키면 푸른색으로 발색하게 된다. 따라서 QOZHG가 감염된 세포주를 1% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde; Sigma)로 고정시킨 후 x-gal 용액을 넣어주고 반응시킨 후 광학현미경으로 감염된 세포를 관찰할 수 있다. ONPG(2-Nitrophenylβ-D-galactopyranoside; Sigma) 역시 x-gal과 비슷한 물질로 β-갈락토시다아제와 반응시키면 노란색을 나타내고 이것의 흡광도를 측정하여 도식화할 수 있다. 도 9에서, 그래프의 x 축은 CEA-HA 농도를 나타내고 y 축은 바이러스의 감염 정도를 나타낸다. 도 9에서 보여주는 바와 같이, CHO-CEA 세포주 내로만 CEA scFv-HA₈₂의 농도가 높아질수록 QOZHG의 감염이 증가하였다.

도 1은 HveA/HVEM의 구조와 sHveA₁₀₂, CEA scFv-HA₈₂의 구조 개요도를 나타낸다.

도 2는 sHveA₁₀₂ 유전자를 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3.1에 클로닝한 모식도를 나타낸다.

도 3은 CEA scFv-HA₈₂ 유전자를 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3.1에 클로닝한 모식도를 나타낸다.

도 4는 293T 세포주에 sHveA₁₀₂-pcDNA3.1 플라스미드를 전달시킨 세포의 배양액에서 sHveA₁₀₂(레인 1번) 및 CEA scFv-HA₈₂(레인 2번)의 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 것이다.

도 5는 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질을 0에서 1000 nM의 농도로 처리하여 헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1 세포 내로 헤르페스바이러스의 감염 정도를 측정한 것이다.

도 6은 바이러스의 엠오아이(multiplicity of infection; moi)와 재조합 sHveA₁₀₂ 단백질 농도에 따른 헤르페스바이러스의 감염 정도를 측정한 것이다.

도 7은 재조합 sHveA 단백질들을 500 nM의 농도로 처리하여 헤르페스바이러스 저항성 세포주인 CHO-K1 세포 내로 헤르페스바이러스의 감염 정도를 측정한 것이다.

도 8은 야생형(wild type) 헤르페스바이러스 KOS/tk12와 돌연변이형(mutant type) 헤르페스바이러스 Rid1의 재조합 sHveA₁₀₂에 의한 CHO-K1 세포내 감염 정도를 측정한 것이다.

도 9는 재조합 CEA scFv-HA₈₂에 의한 헤르페스바이러스의 CHO-K1과 암배아성항원을 발현하는 CHO-CEA 세포내 감염 정도를 측정한 것이다.

<110> Korea institute of radiological & medical sciences <120> Soluble recombinant protein sHveA for increasing cell infection efficiency of herpes simplex virus and its application in gene therapy <130> pn073991 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagcttgcca ccatggagcc tcctggagac tgggggcctc ctccctggag atccaccccc 60 agaaccgacg tcttgaggct ggtgctgtat ctcaccttcc tgggagcccc ctgctacgcc 120 ccagctctgc cgtcctgcaa ggaggacgag tacccagtgg gctccgagtg ctgccccaag 180 tgcagtccag gttatcgtgt gaaggaggcc tgcggggagc tgacgggcac agtgtgtgaa 240 ccctgccctc caggcaccta cattgcccac ctcaatggcc taagcaagtg tctgcagtgc 300 caaatgtgtg acccagccat gggcctgcgc gcgagccgga actgctccag gacagagaac 360 gccgtgtgtg gctgcagccc aggccacttc tgcatcgtcc aggacgggga ccactgcgcc 420 gcgtgccgcg ctggatccca ccatcaccat caccattagc tcgag 465 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile 115 120 125 Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Gly Ser His His 130 135 140 His His His His 145 <210> 3 <211> 1077 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggatccgcca ccatgagtgt gcccactcag gtcctggggt tgctgctgct gtggcttaca 60 ggtgccagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctttctgc atctgtggga 120 gacactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaacattt atagttattt agcatggtat 180 cagcagaaac agggaaaatc tcctcagctc ctggtctata atgcaaaggc cttatcagaa 240 ggtgtgccgt caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaggatcaac 300 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Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Thr Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 35 40 45 Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 50 55 60 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Ala Leu Ser Glu 65 70 75 80 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 85 90 95 Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His His Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys 130 135 140 Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 145 150 155 160 Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn 165 170 175 Asp Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Tyr 180 185 190 Met Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp 195 200 205 Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe 225 230 235 240 Cys Ala Lys Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 245 250 255 Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Leu Pro Ser Cys 260 265 270 Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser 275 280 285 Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val 290 295 300 Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu 305 310 315 320 Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg 325 330 335 Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly His His 340 345 350 His His His His 355 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for sHveA102 gene <400> 5 cccaagcttg ccaccatgga gcctcctgga gactgggggc c 41 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for sHveA102 gene <400> 6 agactcgagc taatggtgat ggtgatggtg ggatccagcg cggcacgcgg cgca 54 <210> 7 <211> 41 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tctgcagtgc 300 caaatgtgtg acccagccat gggcctgcgc gcgagccgga actgctccag gacagagaac 360 gccgtgtgtg gccaccacca ccaccaccac tagctcgag 399 <210> 12 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Leu Ala Thr Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp 1 5 10 15 Arg Ser Thr Pro Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr 20 25 30 Phe Leu Gly Ala Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu 35 40 45 Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly 50 55 60 Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu 65 70 75 80 Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser 100 105 110 Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly His His His His 115 120 125 His His 130 <210> 13 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aagcttgcca ccatggagcc tcctggagac tgggggcctc ctccctggag atccaccccc 60 agaaccgacg tcttgaggct ggtgctgtat ctcaccttcc tgggagcccc ctgctacgcc 120 ccagctctgc cgtcctgcaa ggaggacgag tacccagtgg gctccgagtg ctgccccaag 180 tgcagtccag gttatcgtgt gaaggaggcc tgcggggagc tgacgggcac agtgtgtgaa 240 ccctgccctc caggcaccta cattgcccac ctcaatggcc taagcaagtg tctgcagtgc 300 caaatgtgtg acccagccat gggcctgcgc gcgagccgga actgctccag gacagagaac 360 gccgtgtgtg gctgcagccc aggccacgga tcccaccatc accatcacca ttagctcgag 420 420 <210> 14 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Leu Ala Thr Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp 1 5 10 15 Arg Ser Thr Pro Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr 20 25 30 Phe Leu Gly Ala Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu 35 40 45 Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly 50 55 60 Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu 65 70 75 80 Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser 100 105 110 Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly 115 120 125 His Gly Ser His His His His His His 130 135 <210> 15 <211> 480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aagcttgcca ccatggagcc tcctggagac tgggggcctc ctccctggag atccaccccc 60 agaaccgacg tcttgaggct ggtgctgtat ctcaccttcc tgggagcccc ctgctacgcc 120 ccagctctgc cgtcctgcaa ggaggacgag tacccagtgg gctccgagtg ctgccccaag 180 tgcagtccag gttatcgtgt gaaggaggcc tgcggggagc tgacgggcac agtgtgtgaa 240 ccctgccctc caggcaccta cattgcccac ctcaatggcc taagcaagtg tctgcagtgc 300 caaatgtgtg acccagccat gggcctgcgc gcgagccgga actgctccag gacagagaac 360 gccgtgtgtg gctgcagccc aggccacttc tgcatcgtcc aggacgggga ccactgcgcc 420 gcgtgccgcg cttacgccac ctccagcgga tcccaccatc accatcacca ttagctcgag 480 480 <210> 16 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Leu Ala Thr Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp 1 5 10 15 Arg Ser Thr Pro Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr 20 25 30 Phe Leu Gly Ala Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu 35 40 45 Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly 50 55 60 Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu 65 70 75 80 Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser 100 105 110 Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly 115 120 125 His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala 130 135 140 Tyr Ala Thr Ser Ser Gly Ser His His His His His His 145 150 155

Claims (13)

1. 세포에 대한 헤르페스바이러스의 감염 효율을 증가시키는, sHveA 재조합 단백질로서, 상기 sHveA는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 sHveA₈₂, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 sHveA₈₇, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 sHveA₁₀₂ 또는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 sHveA₁₀₇인 것인 sHveA 재조합 단백질.
2. 삭제
3. 제1항에 따른 sHveA 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₁₀₂, 서열번호 11로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₈₂, 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₈₇, 또는 서열번호 15로 표시되는 염기 서열로 이루어진 sHveA₁₀₇ 인 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
6. 제5항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
7. 제1항에 따른 sHveA 재조합 단백질과 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너로서 암 표적 항원에 대한 리간드, 수용체, 항체, 혹은 그 항체의 일부분을 융합한 융합 단백질.
8. 제7항에 있어서, 상기 sHveA 재조합 단백질의 융합 파트너는 상피세포 성장인자 수용체의 항체, CD20에 결합하는 항체 또는 에리스로포이에틴 수용체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
9. 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CEA scFv-HA₈₂ 인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
10. 제9항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
11. 제10항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
12. 제10항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
13. 제12항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.

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