CN108602875B

CN108602875B - T细胞受体及其用途

Info

Publication number: CN108602875B
Application number: CN201680079010.6A
Authority: CN
Inventors: 史蒂文·P·李
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2036-11-15
Also published as: GB201520191D0; HK1258886A1; MY193807A; SG11201803942QA; CN108602875A; WO2017085471A1

Abstract

本发明涉及一种T细胞受体及其用途，包括治疗EBV+肿瘤，所述T细胞受体包含：a)α链，所述α链包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其功能等同物；和/或b)β链，所述β链包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其功能等同物。

Description

T细胞受体及其用途

本发明涉及编码T细胞受体(TCR)的多肽和多核苷酸及其在治疗Epstein-Barr病毒阳性(EBV+)肿瘤例如鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌中的用途。

背景

鼻咽癌(NPC)在整个东南亚地区特别是在中国南部尤其常见，在那里它是男性中第三大常见癌症，年发病率高达28例/100,000名男性(1)。早期疾病对放疗(+/-化疗)响应良好，但对2687例在香港接受治疗的患者进行的研究表明，超过一半的患有晚期疾病(III-IV期)的这些患者具有仅72％的5年的疾病特异性存活率(2)。存活者也处于治疗相关毒性，包括继发性恶性肿瘤的风险中(3)。因此，对开发针对这种癌症的改进疗法存在明确需求。

Epstein-Barr病毒(EBV)在患有未分化的NPC患者的恶性细胞中被始终如一地检测到，并且与该肿瘤和其他人类肿瘤的发病机制密切相关(4)。尽管EBV具有致癌潜力，但EBV在人群中无处不在，并且它通常作为在病毒特异性T细胞的控制下的无症状的终生感染持续存在(4)。因此，该病毒在NPC中的存在提高了基于T细胞的疗法用于该疾病的可能性。

基于输注肿瘤特异性T细胞的治疗已在一些癌症中产生了令人印象深刻的临床响应。事实上，一些最早的支持该方法的数据来自靶向EBV+淋巴瘤的试验。输注EBV特异性多克隆T细胞系作为用于发生在移植受体中的罕见EBV+淋巴瘤的治疗性和预防性处理高度有效(5)。然而，为了将该处理扩展到更常见的EBV+肿瘤诸如NPC，必须解决两个问题。首先，最初用于治疗EBV+淋巴瘤的多克隆T细胞系使用自体EBV转化的类淋巴母细胞系(LCL)在体外再活化。在LCL(和大多数移植后EBV+淋巴瘤)内，该病毒表达至少六种核抗原EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP和两种潜伏膜蛋白LMP1和LMP2。其中，EBNA3家族的成员是CD8+T细胞的免疫显性抗原。然而，在NPC中，EBV蛋白表达限于EBNA1、LMP1(可变)和LMP2。尽管如此，通过输注LCL再活化的T细胞系来治疗NPC的尝试已在少数患者中产生客观响应(6-9)。低频率的LMP2特异性T细胞在一些输注的细胞制品中是可检测的，并且这些可具有介导的抗肿瘤效应，但是由于大多数病毒特异性T细胞靶向的EBV基因在肿瘤中未表达，所以该程序明显不是最佳的(7、9)。其次，通过LCL再活化产生T细胞需要超过2个月的体外培养，包括建立LCL以及随后选择性扩增EBV特异性效应细胞所需的时间。这是劳动密集型的，并且并不总是产生可检测的NPC相关EBV抗原特异性的T细胞应答(7-9)。最近，使用重组病毒载体或肽尝试了靶向NPC相关EBV抗原的T细胞的选择性再活化(10-12)，但是这又需要数周的体外培养和/或经常导致具有非常低频率的肿瘤特异性T细胞的产物。

因此，需要更快和更容易的方法来提供用于治疗或改善EBV+肿瘤，特别是表达LMP2并且是HLA A*1101的那些EBV+肿瘤的药物。合适地，EBV+肿瘤可包括鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌。优选地，NPC。

本公开内容的简述

在一个方面中，本发明提供了一种T细胞受体，包含：

a.α链，所述α链包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其功能等同物；和/或

b.β链，所述β链包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其功能等同物。

合适地，T细胞受体的α链和β链可通过接头例如猪(porcine)接头连接。

合适地，T细胞受体可包含如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或其功能等同物。

合适地，T细胞受体可包含与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

合适地，除去一个或数个修饰，T细胞受体可包含如以下任一个所示的序列：SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。优选地，所述一个或数个修饰是取代并且可优选地在可变区内进行。

合适地，本发明的T细胞受体可在等同于α链的可变区的位置48的位置处包含半胱氨酸残基(在图1中以粗体和下划线显示)，并在等同于β链的可变区的位置57的位置处包含半胱氨酸残基(在图2中以粗体和下划线显示)。

合适地，T细胞受体可由包含以下的核苷酸序列编码：

a.SEQ ID No.4至6的任一个；

b.由于遗传密码简并性而等同于SEQ ID No.4至6的任一个的核苷酸序列；

c.编码功能上等同于由包含SEQ ID No.4至6的任一个的核苷酸序列编码的T细胞受体并且与其具有至少90％同一性的T细胞受体的核苷酸序列；或

d.由于遗传密码简并性而等同于根据以上c的核苷酸序列的核苷酸序列。

在另一个方面中，本发明涉及针对癌症的免疫动员单克隆TCR(ImmTac)，其包含可溶性的根据本发明的TCR。合适地，ImmTac可包含抗CD3 scFv。

在另一个方面中，本发明提供一种包含以下的核酸序列：

a.SEQ ID No.4至6的任一个；

c.编码功能上等同于由包含SEQ ID No.4至6的任一个的核苷酸序列编码的T细胞受体并且与其具有至少90％同一性的TCR受体的核苷酸序列；或

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸序列的载体。

在另一个方面中，本发明提供了用本发明的核酸序列或本发明的载体转化或转染的宿主细胞；优选地宿主细胞是T细胞，例如CD8⁺或CD4⁺T细胞。合适地，宿主细胞可以是来自待治疗患者的分离的T细胞。

在又另一个方面中，本发明提供了包含以下的组合物：

a.本发明的T细胞受体；

b.本发明的ImmTac；

c.本发明的核酸序列；

d.本发明的载体；或

e.本发明的宿主细胞。

在另一个方面中，本发明提供了本发明的T细胞受体；本发明的ImmTac；或本发明的组合物，用于在治疗或预防EBV+肿瘤中使用。合适地，EBV+肿瘤可表达LMP2并且是HLA A*1101。合适地，EBV+肿瘤可包括鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌。优选地，EBV+肿瘤是鼻咽癌，优选地未分化的鼻咽癌。

合适地，T细胞受体或药物组合物可以被配制为提供至少10⁸个或至少10⁹个包含T细胞受体的T细胞的剂量。

在另一个方面中，本发明提供了本发明的T细胞受体或本发明的组合物在制备用于治疗或预防EBV+肿瘤的药物中的用途。合适地，EBV+肿瘤可表达LMP2并且是HLA A*1101。合适地，EBV+肿瘤可包括鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌。优选地，EBV+肿瘤是鼻咽癌，优选地未分化的鼻咽癌。

在另一个方面中，本发明提供了制备包含本发明的T细胞受体的T细胞的体外方法，包括：用本发明的核酸序列转染或转化T细胞(例如CD8⁺或CD4⁺T细胞)样品。

在另一个方面中，本发明提供了治疗或预防受试者中的EBV+肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的：a)本发明的T细胞受体；b)本发明的ImmTac；或c)本发明的组合物。合适地，EBV+肿瘤可表达LMP2并且是HLA A*1101。合适地，EBV+肿瘤可包括鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌。优选地，EBV+肿瘤是鼻咽癌，优选地未分化的鼻咽癌。

合适地，受试者自体的T细胞可以用本发明的T细胞受体或本发明的组合物转化或转染，并且治疗有效量的经转化的T细胞被施用。因此，可将包含本发明的T细胞受体的自体T细胞施用至受试者。

适当地，可以施用至少10⁸或10⁹个T细胞。优选地，施用通过输注进行。

附图简述

参考附图，在下文中进一步描述本发明的实施方案，在附图中：

图1显示了本发明的TCR的α链的氨基酸序列(SEQ ID No.1)。呈粗体的序列表示(在前的)恒定区与(接下来的)可变区之间的连接区域。“C”表示可变区的位置48，此处氨基酸被改变为半胱氨酸。

图2显示了本发明的TCR的β链的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。呈粗体的序列表示(在前的)恒定区与(接下来的)可变区之间的连接区域。“C”表示可变区的位置57，此处氨基酸被改变为半胱氨酸。

图3显示了本发明的TCR的全长氨基酸序列(SEQ ID No.3)。呈粗体的序列代表将在前的α链连接到接下来的β链的猪接头。

图4显示了编码由SEQ ID No.1表示的本发明的TCR的α链的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID No.4)。(在前的)恒定区与(接下来的)可变区之间的连接区域的核苷酸序列以粗体显示。

图5显示了编码由SEQ ID No.2表示的本发明的TCR的β链的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID No.5)。(在前的)恒定区与(接来下的)可变区之间的连接区域的核苷酸序列呈粗体显示。合适地，贯穿始终提及SEQ ID No.5是指图5中显示的序列，但没有加下划线的终止密码子。

图6显示了编码由SEQ ID No.3表示的本发明的全长TCR的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID No.6)。(在前的)编码α链的核苷酸序列与(接下来的)编码β链的核苷酸序列之间的接头的核苷酸序列以粗体显示。

图7显示了A*1101限制性SSC特异性CD8+细胞毒性T细胞克隆的表征。(a)通过细胞毒性测定(E:T＝3:1)确定对SSC肽的亲合力。(b)通过IFNγ产生来测量对在携带来自高加索人或中国人人群的EBV毒株的A*1101匹配或不匹配的LCL中表达的LMP2的应答。单独的靶细胞产生<100pg/ml IFNγ。应答者：刺激物的比＝1:10。结果显示平均值±SD并且代表3个单独的实验。

图8显示野生型SSC特异性TCR的表达和功能。(A)pMP71逆转录病毒表达载体的设计。(b)与模拟转导的细胞(模拟-T)上SSC特异性TCR表达相比，转导的来自患有晚期NPC的患者的PBMC(TCR-T)上的SSC特异性TCR表达。显示的值是指五聚体+、CD8+或CD4+细胞的百分比。(c)通过ELISA确定IFNγ释放来测量TCR转导的T细胞(TCR-T)和T细胞克隆85对SSC肽的亲合力。模拟转导的T细胞(模拟-T)被包括作为对照。应答者：刺激物的比＝1:4。结果显示平均值±SD并且代表3个重复的实验。(d)TCR转导的(但不是模拟转导的)T细胞裂解表达来自重组痘苗病毒载体的LMP2的自体成纤维细胞(实心符号)，但不裂解用对照痘苗病毒载体感染的成纤维细胞(空心符号)。数据代表3个单独的实验。

图9显示了TCR基因构建体的优化。(a)用野生型TCR(WT TCR)、密码子优化型(coTCR)或掺入另外的二硫键的密码子优化的TCR(coTCRcys)转导后3天的SSC特异性TCR表达。(b)不同TCR构建体的五聚体染色强度。(c)使用ELISA确定IFNγ释放来比较用每种TCR构建体转导的T细胞对SSC肽的亲合力。调整T细胞输入数目以确保对于每种TCR构建体测试了等同数目的转导效应物。应答者:刺激物的比＝1:3。结果显示平均值±SD。模拟转导的T细胞(模拟-T)被包括作为对照。显示的所有结果代表至少3个单独的实验。

图10显示表达coTCRcys的CD8+和CD4+T细胞的功能。(a)通过IFNγ产生来测量转导的T细胞克隆对在A*1101匹配的或不匹配的LCL中表达的LMP2的应答。单独的靶细胞产生<100pg/ml IFNγ。应答者:刺激物的比＝1:10。结果显示平均值+SD并且代表每个亚组的7个克隆。(b)在用单独的T2-A*1101细胞(虚线)或用SSC肽脉冲的T2-A*1101细胞(实线)刺激后通过CFSE染色测量的coTCRcys-表达T细胞的增殖。(c)coTCRcys转导的CD8+和CD4+T细胞克隆针对表达LMP2+/-用SSC肽脉冲的HONE1细胞或单独的HONE1细胞的细胞毒性活性。结果显示平均值±SD并且代表每个亚组的4个克隆。

图11显示表达coTCRcys的CD4+T细胞在用通过SSC肽预脉冲的T2-A*1101细胞刺激后产生多种细胞因子。(a)与用单独的T2-A*1101刺激的coTCRcys-T细胞(虚线)或用T2-A*1101+SSC刺激的模拟T细胞(灰色区域)相比，由用T2-A*1101+SSC刺激的coTCRcys-T细胞(实线)的IL2产生。(b)产生IL2的同时产生TNFα和/或IFNγ的这些coTCRcys-T细胞的百分比。显示的所有数据针对CD4+T细胞门控。根据用单独的T2-A*1101刺激的coTCRcys-T细胞确定阳性细胞因子染色的阈值。结果代表5个单独的实验。

图12显示coTCRcys转导的T细胞在体内控制肿瘤生长。用A*1101+LMP2+MDA-MB-231肿瘤细胞注射NSG小鼠，然后用T细胞输注物处理(每组6只小鼠)。与模拟T细胞相比，通过卡尺(a)或生物发光(b)测量的肿瘤尺寸显示coTCRcys转导的T细胞显著抑制肿瘤生长。在T细胞输注后17天拍摄生物发光图像。

图13显示coTCRcys转导的来自晚期NPC患者的T细胞的功能测试。(a)用表达LMP2的重组修饰的痘苗病毒载体(MVA LMP2)或空载体(MVA对照)感染的A*1101+靶刺激后的IFNγ产生。MVA LMP2感染的靶在用SSC肽脉冲后也被测试。使用模拟转导的来自相同供体的T细胞作为对照。单独的靶细胞产生<10pg/ml IFNγ。(b)当与NPC细胞系(HK1/A*1101和c666.1/A*1101)共同培养(效应物:靶＝6:1)时，coTCRcys转导的或模拟转导的来自患有晚期NPC的患者的T细胞的细胞毒性活性。将靶用表达LMP2的重组痘苗病毒载体(vacc LMP2)或用空载体(vacc对照)感染。将一些vacc LMP2感染的靶用SSC肽预脉冲。显示的所有结果代表平均值+SD并且代表3-5个单独的实验。

详述

在一个方面中，本发明涉及具有优化的表达的HLA A*1101限制性T细胞受体(TCR)。合适地，TCR可以用于快速且可靠地产生对EBV+肿瘤优选地对表达LMP2的肿瘤具有特异性的高亲合力T细胞。优选地，对表达LMP2并且是HLA A*1101的EBV+肿瘤具有特异性。

合适地，EBV+肿瘤可包括鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和一些胃癌。优选地，EBV+肿瘤是鼻咽癌，优选地未分化的鼻咽癌。

有利地，40％的鼻咽癌(NPC)患者携带这种HLA等位基因。合适地，TCR可用于快速且可靠地产生对NPC相关病毒蛋白LMP2具有特异性的高亲合力T细胞，其可用于治疗NPC。

在一个方面中，本发明提供了一种TCR，包含：

T细胞受体的α链和β链可通过接头连接。合适地，接头将α链和β链连接起来，并且允许在等同于如SEQ ID No.1所描绘的α链的可变区的位置48的位置和等同于如SEQ IDNo.2所描绘的β链的可变区的位置57的位置之间形成二硫桥。

合适地，T细胞受体可包含如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或其功能等同物。SEQID No.3包含通过以粗体显示的猪接头连接的如SEQ ID No.1所示的α链的密码子优化的氨基酸序列和如SEQ ID No.2所示的β链的密码子优化的氨基酸序列。

合适地，T细胞受体可包含与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。合适地，这样的T细胞受体可以在功能上等同于如SEQ ID No.3中所描绘的T细胞受体。

合适地，除去1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代，T细胞受体可包含如以下任一个所示的序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。合适地，可以选择取代以对TCR产生可用于治疗EBV+肿瘤诸如NPC的LMP2特异性T细胞的活性没有不利影响。

合适地，本发明的TCR可以是可溶性TCR。在一些实施方案中，可溶性TCR可与免疫刺激肽和/或蛋白和/或部分(例如但不限于CD3激动剂(例如抗CD3抗体))缀合。CD3抗原存在于成熟的人类T细胞、胸腺细胞和一个子集的天然杀伤细胞上。它与TCR相关并参与TCR的信号转导。对人类CD3抗原特异性的抗体是众所周知的。一种这样的抗体是鼠单克隆抗体OKT3，它是FDA批准的首个单克隆抗体。OKT3被报道是有效的T细胞有丝分裂原(Van Wauve，1980；美国专利号4,361,539)和有效的T细胞杀伤物(Wong，1990)。对CD3抗原特异性的其他抗体也已被报道(参见PCT国际专利申请公布号WO 2004/106380；美国专利申请公布号2004/0202657；美国专利号6,750,325；美国专利号6,706,265；英国专利公布GB 2249310A；Clark等人，1989；美国专利号5,968,509；美国专利申请公布号2009/0117102)。针对癌症的免疫动员mTCR(ImmTAC；Immunocore Limited,Milton Partk,Abington,Oxon,UnitedKingdom)是将亲和性单克隆T细胞受体(mTCR)靶向与治疗作用机制(即，抗CD3 scFv)组合的双功能性蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供一种ImmTac，其包含根据本发明的可溶性TCR。合适地，ImmTac可包含抗CD3 scFv。作为一类双特异性试剂的ImmTAC(针对癌症的免疫动员单克隆TCR)包含可溶性单克隆T细胞受体，其已经被工程化为对同源肿瘤抗原具有极其高的亲和力。以这种方式，ImmTAC克服了由胸腺选择施加的低亲和力肿瘤特异性T细胞的问题，并提供了接触作为肽-HLA复合物呈递的大量抗原。与肿瘤细胞结合之后，ImmTAC的抗CD3效应物末端驱动多克隆T细胞至肿瘤部位的募集，导致有效的重定向的T细胞应答和肿瘤细胞破坏。

合适地，T细胞受体可由包含以下的核苷酸序列编码：

a.如SEQ ID No.4至6所示的密码子优化的序列的任一个；

有利地，本发明的T细胞受体可以用于T细胞受体(TCR)基因转移，这是一种快速、可靠且能够产生对LMP2(其是例如鼻咽癌(NPC)相关病毒蛋白)具有特异性的大量T细胞(>10⁸-10¹⁰个细胞/患者)，而不论患者预先存在的免疫组库如何的方法。例如，逆转录病毒转导可仅要求预活化T细胞的48小时的培养。此外，大量的自体T细胞可以通过白细胞去除术从受试者的血液样品获得。因此，在几天内工程化10⁸-10⁹个转化或转染的T细胞用于输注可以是可能的。该T细胞水平大大超过通过用LCL再活化的T细胞的过继性疗法成功治疗NPC患者所使用的剂量(7)。

不希望受理论束缚，认为用本发明的T细胞受体(例如如SEQ ID No.3中列出的TCR)转导的T细胞含有幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞的混合物，这表明它们应在体内持续存在并表现出更大程度的抗肿瘤应答(30)。

合适地，CD8⁺或CD4⁺T细胞可以用包含编码本发明的TCR的核酸序列的载体转染。合适地，宿主细胞可以是来自待治疗患者的分离的T细胞。合适地，T细胞的混合物可以通过白细胞去除术从血液样品分离。

适当地，在本发明的第二医药用途和治疗方法中，药物可以包含至少10⁸个表达本发明的TCR的T细胞。合适地，药物可以包含至少10⁹或至少10¹⁰或至少10¹¹个细胞，优选地所述T细胞可以是CD8⁺和/或CD4⁺T细胞。

适当地，在本发明的第二医药用途和治疗方法中，药物可以呈双特异性免疫治疗剂的形式，例如ImmTAC(针对癌症的免疫动员TCR)(Liddy等，(2012)Nat Med 18:980-987)或BiTE(双特异性T细胞衔接抗体)(Baeuerle等，(2009).Curr Opin Mol Ther 11(1):22-30)。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防受试者中的EBV+肿瘤(诸如鼻咽癌)的方法，包括施用治疗有效量的：a)本发明的T细胞受体；b)本发明的ImmTac；或c)本发明的组合物。合适地，受试者自体的T细胞可以用本发明的T细胞受体或本发明的组合物转化或转染，并且治疗有效量的转化的T细胞被施用。因此，可将包含本发明的T细胞受体的自体T细胞施用至受试者。合适地，患者群体可以是中国来源的。优选地，通过输注进行施用。

除非另外定义，否则与本发明关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，且复数形式的术语应包括单数形式。

与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)、酶促反应和纯化技术关联使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序例如在Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))等中描述。

定义

根据本发明，除非另有说明，下列术语应被理解为具有以下含义：

术语“功能等同物”是指对LMP2具有特异性的变体TCR，其具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少97％或至少99％或100％的具有如SEQ ID No.1-3(优选地SEQ ID No.3)所示的氨基酸序列或由如SEQ ID No.4-6(优选地SEQ ID No.6)所示的核酸序列编码的氨基酸序列的TCR的亲合力抗原特异性功能。在一个实施方案中，亲合力抗原特异性功能关于以下一项或更多项被测量：增殖、细胞毒性、细胞因子释放或LMP2⁺肿瘤生长的抑制。在一个实施方案中，测量功能等同物对LMP2的特异性和对LMP2⁺肿瘤生长的抑制。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以可互换地使用，并且指核苷酸的聚合物。这样的核苷酸的聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。

术语“多肽”和“蛋白”可以可互换地使用，指氨基酸残基的聚合物。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白和其片段都涵盖在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，在本发明的上下文中，“多肽”是指包括对天然序列的修饰例如缺失、添加和取代(本质上通常是保守的取代)的蛋白，只要所述蛋白保持所需的活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变发生的修饰，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白的宿主的突变的修饰或由于PCR扩增引起的错误的修饰。

“天然序列”多肽包含具有与天然发现的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。这样的天然序列多肽可以从自然界分离或可以通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽特别包括天然存在的截短或分泌形式的多肽(例如，细胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可变剪接的形式)的多肽和多肽的天然存在的等位基因变体。

多肽“变体”意指在对序列进行比对并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分之后，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括例如其中在多肽的N端或C端添加或缺失一个或更多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约97％或98％或99％的氨基酸序列同一性。

如本文所用的，关于肽、多肽或抗体序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”和“同源性”被定义为在对序列进行比对并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现跨越所比较的序列的全长的最大比对所需的任何算法。

术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或者指该特征的发病率、程度或可能性的减少或停止。优选地，“减少”或“抑制”是指引起20％或更大的减少；优选地引起50％或更大的减少的能力。优选地，“减少”或“抑制”是指引起75％、85％、90％、95％或更大的总体减少的能力。

术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用，指人类。在一些实施方案中，还提供了治疗其他哺乳动物包括但不限于啮齿动物、类人猿下目的动物(simians)、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊(ovines)、山羊(caprines)、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物的方法。在一些情况下，“受试者”或“患者”是指需要治疗疾病或紊乱的受试者或患者。

遍及本说明书的描述和权利要求，词语“包括”和“包含”及它们的变化形式意指“包括但不限于”，并且它们不意图(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。遍及本说明书的描述和权利要求，单数形式涵盖复数形式，除非上下文另有要求。具体地，在使用不定冠词时，应理解本说明书预期了复数形式以及单数形式，除非上下文另有要求。

与本发明的特定方面、实施方案或实例关联描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为可应用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与其不相容。在本说明书(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或程序的所有步骤可以以任何组合方式被组合，其中此类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。本发明不受任何前述实施方案的细节的限制。本发明扩展至在本说明书(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的特征或任何新颖组合，或扩展至如此公开的任何方法或程序的步骤的任何新颖的步骤或任何新颖的组合。

读者的注意力被引导到与本说明书同时递交或在本说明之前递交的、与本申请有关的并且与本说明书向公众开放供查阅的所有论文和文献，并且所有此类论文和文献的内容通过引用并入本文。

实施例

材料和方法

细胞和细胞系

通过在lymphoprep(Axis Shield,Oslo,Norway)上的密度梯度离心从肝素化的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。使用高加索人(B95.8)或中国人(CKL)原型1EBV毒株产生LCL(15)。Phoenix兼嗜性包装细胞由Gary Nolan(Stanford University)友情提供。用HLAA*1101基因转导的T2细胞系由M.Masucci(Karolinska Institute，Stockholm，Sweden)友情提供。用我们已经将编码HLA A*1101的基因克隆到其中的逆转录病毒(分别为pQCXIH和pQCXIN；Clontech，CA)转导NPC细胞系HK1(16)和c666.1(17)。然后分别使用20μg/ml潮霉素或50μg/ml G418(Life technologies，UK)在药物选择下培养这些细胞系。虽然最初被描述为NPC细胞系，并在本文使用，但因为它天然表达HLA A*1101，HONE-1现在表现为是Hela相关的体细胞杂合体(18)。用分别携带编码HLA A*1101、LMP2和萤光素酶的基因的三种逆转录病毒(pQCXIH、pLXSN和pMSCV)转导乳腺癌细胞系MDA-MB-231(19)，并使用300μg/ml潮霉素、600μg/ml G418和1μg/ml嘌呤霉素在药物选择下培养。所有上述细胞系在含有10％胎牛血清(FBS；PAA，Pasching Austria)、2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100pg/ml链霉素的RPMI1640(Sigma)(标准培养基)中培养。成纤维细胞从在如上所述补充的DMEM(Sigma，UK)中培养的皮肤活组织检查物生长。所有的T细胞、B细胞和成纤维细胞的细胞系来源于健康供体或已知HLA类型的NPC患者。通过短串联重复序列分析验证所有癌细胞系，并在实验前传代少于6个月。本研究的人体材料的使用得到了英国国家研究伦理服务处(the NationalResearch Ethics Service,U.K.)和香港联合中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会(the Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East ClusterClinical Research Ethics Committee)的批准。研究根据赫尔辛基协议的声明进行，且所有供体提供了书面知情同意书。

合成肽和重组痘苗病毒

肽由Alta Bioscience，Birmingham，UK使用芴基甲氧基羰基化学反应合成。表达LMP2和相应的对照载体的重组痘苗病毒和修饰的安卡拉痘苗病毒先前已有描述(20、21)。

TCR基因克隆

使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，UK)从T细胞克隆分离RNA并进行逆转录。然后用BD SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)根据制造商的说明使用以下引物扩增TCR-α和TCR-β基因：TCRα恒定区：5’-agcacaggctgtcttacaatcttgc-3’(SEQID No.7)；TCRβ2恒定区：5’-ggacacagattgggagcagg-3’(SEQ ID NO.8)。将TCR基因亚克隆到pCR2.1(Life Technologies)载体中并测序。然后将TCR-α(TCRVA22)和TCR-β(TRBV4.01)链克隆到逆转录病毒pMP71-PRE载体(22)(由C.Baum，Hannover，Germany友情提供)中，它们被来自猪捷申病毒(teschovirus)的2A肽接头隔开。由GeneArt(Regensburg,Germany)设计和产生了修饰的TCR基因。

人类T细胞的逆转录病毒转导

使用FuGENE HD(Roche)，根据制造商的说明用pMP71逆转录病毒载体和pCL ampho(Imgenex)转染Phoenix兼嗜性包装细胞，且48小时后收获逆转录病毒上清液。使用抗CD3抗体(OKT3；30ng/ml)和白介素-2(IL2；600U/ml；Chiron，Emeryville，CA)，在含有1％人类AB血清(TCS Biosciences,Buckingham,UK)的标准培养基中将PBMC预活化48小时。然后使用retronectin包被的(Takara,Shiga,Japan)6孔板根据制造商的说明用逆转录病毒上清液转导这些细胞(或用来自未转染的phoenix细胞的条件上清液(conditioned supernatant)模拟转导这些细胞)。然后将细胞维持在含有1％人AB血清和IL2(100U/ml)的标准培养基中。

流式细胞术

根据制造商的说明，用HLA-A*1101/SSC五聚体(5μg/ml；ProImmune，Oxford，UK)在室温将细胞染色10分钟。然后洗涤细胞并在冰上用Pro5Fluorotag(APC或R-PE标记的；ProImmune)和饱和浓度的抗CD3(PE缀合的)、抗CD4(FITC缀合的)(Pharmingen)和抗CD8(三色或ECD缀合的)(Caltag)抗体染色30分钟。对于细胞内细胞因子染色，将T细胞通过用或未用SSC肽(5μg/ml)预脉冲的T2-A11细胞刺激2小时。然后加入布雷菲德菌素A(10μg/ml,Sigma)，并且培养细胞持续另外的5小时。

然后如以上所描述的用五聚体和针对表面标志物的抗体(CD4-FITC、CD8-ECD，BDPharmingen)对细胞染色。根据制造商的说明用固定和透化缓冲液(E-bioscience，SanDiego，CA)处理后，将细胞与抗细胞因子抗体(IL2-PE、IFNγ-PECy7和TNFα-APC)或同种型和浓度匹配的对照抗体(BD Pharmingen)一起在4℃孵育30分钟，然后在PBS中洗涤两次。使用LSRII细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)和FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)分析细胞。

CFSE标记

用PBS洗涤T细胞两次，并与2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)一起在37℃孵育10分钟。通过加入含有10％FBS的RPMI-1640使标记反应停止。洗涤细胞，以2×10⁶个细胞/ml重悬于标准生长培养基中，与用SSC肽(10μg/ml)预脉冲的T2-A*1101细胞共培养5天，然后如以上所描述的通过流式细胞术分析。

IFNγ释放测定

将刺激物细胞(5x10⁴/孔)以如指明的应答者：刺激物的比与T细胞一起一式三份共培养。在37℃/5％CO₂将细胞在100μl/孔的补充有10％FBS和IL2(25U/ml)的Iscove改良的Dulbecco培养基(Life Technologies)中孵育。18小时后，使用ELISA(Pierce Endogen，Rockford，IL)根据制造商的说明测试培养物上清液的分泌的IFNγ。

细胞毒性测定

使用痘苗病毒感染的或肽脉冲的靶以已知的效应物:靶的比(2500个靶/孔)设置铬释放测定并在5或8小时后收获。这些方案之前已详细描述(23)。

体内肿瘤保护实验

将6-8周龄雌性NSG小鼠(Charles River Laboratories)用基质胶(BDBiosciences)中表达A*1101、LMP2和萤光素酶的MDA-MB-231细胞在胁腹进行皮下接种(5x10⁶个细胞/小鼠)。一天后，小鼠静脉内接受10⁷个TCR转导的(或模拟转导的)T细胞。在第2、4、7、9和11天给予腹膜内注射10⁴个单位的IL2。使用卡尺和生物发光成像(IVISSpectrum，Caliper Life Sciences)以盲式测量肿瘤生长。所有实验在英国内政部(UKHome Office)授权下进行。

结果

野生型HLA A*1101限制性LMP2特异性TCR的表达和功能

将来自健康中国人供体的EBV特异性T细胞用自体LCL在体外再活化，并如之前所描述的通过有限稀释克隆(23)。筛选克隆以确定对A*1101限制性LMP2表位SSC的反应性，并选择了克隆85。使用细胞毒性测定用滴定浓度的肽脉冲的A*1101⁺靶来确定该CD8⁺克隆对SSC肽的亲合力。该克隆表现出高亲合力，明确识别用仅10^-10M肽脉冲的靶细胞(图7a)。当测试响应于A*1101匹配的和不匹配的LCL靶的IFNγ产生时，观察到明确的A*1101限制性应答(图7b)。重要的是，该克隆不仅识别携带标准EBV毒株B95.8(来源于高加索人群体)的A*1101⁺LCL，而且还识别携带来自中国人群体的最具有NPC风险的EBV毒株的A*1101⁺LCL。

分离编码来自克隆85的TCR-α和TCR-β链的基因并克隆到同一MP71逆转录病毒表达载体中，由来自猪捷申病毒的2A肽接头隔开以确保这些链的等摩尔表达(图8a)。然后用重组逆转录病毒转导来自健康供体和NPC患者的活化的T细胞，并使用A*1101/SSC五聚体确定SSC特异性TCR的表面表达。图8b显示来自患有晚期NPC的患者的T细胞的结果。SSC特异性T细胞在大多数NPC患者和健康的病毒携带者中是罕见/不可检测的(如由模拟转导的细胞所示出的)，但在用重组逆转录病毒转导后3天，SSC特异性TCR的表面表达在13.6％CD8⁺T细胞中清楚地可检测。注意，12％的CD4⁺T细胞在转导后也表达该TCR。这些数据代表来自9名健康供体和5名NPC患者的数据。

该野生型TCR的功能测试使用转导的多克隆T细胞开始，以探讨其响应于以滴定浓度的SSC肽脉冲的T2:A*1101细胞产生IFNγ的能力。TCR转导的T细胞明确识别以低至10^-10M肽的肽脉冲的靶，而模拟转导的T细胞在任何测试的肽浓度都不应答(图8c)。以与转导的T细胞内的SSC特异性效应物相同的输入细胞数目测试克隆85(TCR基因来源于其)产生几乎相同的结果(图8c)。与针对用空对照载体感染的成纤维细胞相比，当针对表达来自重组痘苗病毒载体的LMP2蛋白的自体成纤维细胞测试时，转导的T细胞也介导了特异性细胞毒性功能(图8d)。

TCR基因构建体的优化.

我们产生了我们的野生型SSC特异性TCR的两种变体，密码子优化的形式(coTCR)和其中TCR-α链的氨基酸残基48和TCR-β链的残基57都被改变为半胱氨酸，因此引入第二个二硫键的密码子优化的TCR(coTCRcys)(25)。然后一系列实验比较了这两种变体与野生型SSC特异性TCR(WT TCR)的表达和功能。观察到的主要差异是TCR表面表达。用递增体积的平行产生的三种逆转录病毒上清液转导的CD8⁺T细胞的五聚体染色显示，WT TCR和coTCR的表达相似，但用coTCRcys构建体观察到明显增加的表达(图9a)。用CD4⁺T细胞获得了相似的结果(数据未显示)。coTCRcys受体不仅在更大比例的T细胞上表达，而且个体细胞上的表达水平也增加(图9b)。用针对Vβ4.1的抗体染色转导的细胞显示与用SSC五聚体染色的相同细胞相似的结果(未示出)，表明该外源性β链和内源性α链之间存在很少(如果有的话)的错配。

虽然用coTCRcys改善了表达，当测试每种TCR构建体的等同数目的转导效应物时，T细胞功能不受影响(图9c)。尽管单独的密码子优化(coTCR)既不影响表面表达也不影响功能活性(图9)，但其他研究已经显示，尽管缺乏这样的体外作用，密码子优化仍然能够改善输注后可检测到的TCR-修饰的T细胞的频率和体内抗肿瘤活性二者(26、27)。分析coTCRcys转导的细胞的分化状态显示，它们含有主要是幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞的混合物(未显示)。

CD8⁺和CD4⁺T细胞中coTCRcys的功能分析

优化了SSC特异性TCR的表达后，我们确定了coTCRcys转导的T细胞识别LCL中在生理水平表达的LMP2蛋白的能力。为此，我们使用TCR转导的细胞的克隆群体来研究CD8⁺细胞和CD4⁺细胞中的功能活性，CD8⁺细胞可具有直接的体内抗肿瘤作用，CD4⁺细胞可以帮助产生和维持有效的CD8⁺应答并且也可以是细胞毒性的。为了确保SSC特异性CD8⁺克隆已被工程化并且不是天然存在的效应物，我们使用PCR来检测逆转录病毒构建体(数据未显示)。当针对A*1101匹配的和不匹配的LCL的一个组测试时，工程化的CD8⁺和CD4⁺细胞二者以A*1101限制性的方式通过IFNγ产生来应答(图10a)。因此，该TCR能够以独立于CD8的方式起作用。

使用CFSE标记，我们研究了coTCRcys转导的T细胞在抗原遭遇后增殖的能力。(与单独的T2-A*1101相比)工程化的CD8⁺和CD4⁺T细胞在用SSC肽负载的T2-A*1101细胞刺激后经历几轮分裂(图10b)。此外，工程化的CD8⁺和CD4⁺T细胞二者是细胞毒性的，在添加或不添加SSC肽的情况下裂解表达来自重组痘苗病毒载体的LMP2的A*1101阳性HONE1细胞(图10c)。

具有细胞因子产生的多功能能力的CD4 T细胞的频率增加与改善的一些感染的控制相关(28)。使用细胞内染色，我们显示coTCRcys转导的CD4⁺T细胞在抗原特异性刺激后能够同时产生多种细胞因子(IL2、IFNγ、TNFα)(图11)。

用LMP2⁺上皮肿瘤模型的体内研究

我们将另一种人类上皮肿瘤(MDA-MB-231)工程化为共表达LMP2和A*1101以及萤光素酶进行生物发光成像。将携带这种肿瘤的免疫缺陷小鼠用表达coTCRcys的T细胞处理。流式细胞术分析显示输注的T细胞含有3:2的CD4:CD8的比，50％的CD4和60％的CD8 T细胞表达SSC特异性TCR。与接受模拟转导的T细胞的对照小鼠相比，这些小鼠中的肿瘤生长显著减少(图12)。

来自晚期NPC患者的T细胞的TCR转导和NPC细胞系的识别

我们力图确定coTCRcys转导的来自晚期NPC患者的T细胞是否能够对表达LMP2的NPC细胞系产生应答。除c666.1之外，所有NPC肿瘤都是EBV⁺，c666.1是一种体外建立的丢失EBV基因组的NPC细胞系；c666.1甚至不表达LMP2蛋白。因此，通过逆转录病毒转导将限制性HLA等位基因引入c666.1中后(c666.1/A*1101)，我们在添加或不添加SSC肽的情况下表达了来自重组修饰的痘苗病毒(安卡拉)载体的LMP2。转导的来自两名晚期NPC患者的T细胞以抗原特异性的方式通过产生IFNγ对表达LMP2的c666.1/A*1101细胞清楚地产生应答。用抗原负载的A*1101匹配的成纤维细胞和HONE1细胞观察到相似水平的应答(图13a)。还测试了这些T细胞针对NPC细胞系的细胞毒性活性，并且在本文我们包括了第二种NPC系HK1，其同样必须被转导以表达A*1101(HK1/A*1101)。转导的(但不是模拟转导的)T细胞以LMP2特异性的方式裂解HK1/A*1101和c666.1/A*1101细胞二者(图13b)。

讨论

从使用过继性T细胞疗法的研究明显的是，NPC对基于EBV特异性T细胞的疗法有响应(6-9)。然而，目前生成用于输注的此类细胞的方法既费时又不可靠。我们利用了TCR基因转移，这是一种能够在几天内可靠地生成大量特异性T细胞，而不论患者预先存在的免疫应答如何的技术。鉴定出对HLA A*1101限制性LMP2表位SSC具有高亲合力的T细胞克隆后，我们克隆了编码TCR的基因，并通过逆转录病毒介导的基因转移将它们在来自健康供体和晚期NPC患者的T细胞中表达。被工程化为表达修饰形式的TCR的来自健康供体的T细胞以抗原特异性的方式通过增殖、产生细胞因子(IFNγ、TNFα和IL2)、裂解靶细胞和抑制体内LMP2+肿瘤生长产生应答。TCR转导的来自晚期NPC患者的T细胞也能够识别表达LMP2蛋白的NPC细胞系。

如在方法中描述的，逆转录病毒转导仅要求培养48小时以预活化T细胞，并通过用通过白细胞去除术从患者可得的大量(10⁹-10¹⁰)T细胞开始按比例放大该过程，应该有可能在几天内工程化>10⁸-10⁹个T细胞用于输注。包括另外几天用于体外扩增，TCR基因转移的试验产生输注的10⁹-10¹¹个T细胞/患者(13、14)。这大大超过了通过用LCL-再活化的T细胞的过继性疗法成功治疗NPC患者所使用的剂量(7)，在所述过继性疗法中，患者仅接受4×10⁷-4×10⁸个细胞/m²，并且LMP特异性和SSC特异性T细胞分别构成该产物的<1％和<0.05％(29)。用coTCRcys受体转导的T细胞含有幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞的混合物。低分化的T细胞的存在表明，它们应在体内持续存在并表现出更大程度的抗肿瘤应答(30)。

我们专注于A*1101限制性TCR，因为这种HLA等位基因在最具NPC风险的人群中非常常见。实际上，大约40％的NPC患者是A*1101+(31、32)，并因此可利用通过A*1101限制性SSC特异性TCR的治疗。

令人鼓舞的是，一些研究也已经报道A*1101与降低的NPC风险相关(31、32)，这支持了我们的假设，即，SSC肽是T细胞疗法的良好的靶。此外，使用SSC肽脉冲的树突细胞瞬时加强A*1101+NPC患者中对这一表位的T细胞应答是安全的，并且能够诱导部分临床响应(33)。最初使用标准实验室毒株B95.8鉴定出的SSC表位序列在中国南部人群内的EBV毒株(包括来自NPC肿瘤的病毒分离株)中很大程度上是保守的(23、34)。在中国北部，在50％的NPC患者中已经检测到表位的残基9中的S-T突变(35)。然而，根据我们以前的研究，我们没有发现该突变影响表位的抗原性的证据(23)。

靶向单个表位的基于T细胞的疗法可导致选择携带表位丢失的EBV变体的肿瘤细胞。然而，这可以通过使用靶向NPC相关EBV蛋白中的另外的表位的多种TCR来避免。事实上，已经描述了几个表位，其中一些表位在中国人群中以相对高频率存在的HLA I类和II类等位基因中也是限制性的(23、36)，从而增加了可利用基于TCR基因转移的疗法的患者数目。将TCR基因转移与疫苗接种结合(37)也可以扩大并拓宽体内EBV特异性T细胞应答。

如果要使T细胞疗法对NPC有效，那么肿瘤细胞中的抗原呈递功能必须完整。来自NPC组织的免疫组织化学分析的结果已经显示，在某些NPC肿瘤中，HLA I类抗原加工途径的关键组分可能被下调(38)。此外，存在证据证明NPC中的其他潜在的免疫逃避机制，包括调节性T细胞(39)和转化生长因子β(40)的存在。然而，来自NPC细胞系的体外研究(41)的结果，包括该报告中提供的数据和A*1101与NPC的降低的风险相关(31、32)表明，恶性细胞可将抗原呈递至T细胞。更重要的是，过继性T细胞疗法(6-9)和疫苗接种(33)后的临床响应表明，免疫逃避机制至少在一些患者中可以被克服。实际上，有效递送大量的肿瘤特异性的产生IFNγ的细胞毒性T细胞可足以压倒免疫抑制因子。输注的T细胞的另外的遗传修饰，例如显性负性TGFβ受体的表达(42)也可能有所帮助。如果患者的抗原呈递功能受到损害，通过靶向基质细胞(如果它们交叉呈递肿瘤抗原)，成功的治疗仍然可以是可能的。交叉呈递表现出依赖于靶表位的HLA结合亲和力(43)，这表明，SSC(基于免疫表位数据库分析资源(theImmune Epitope Database Analysis Resource)的预测亲和力(IC50)＝14nM)应该容易被交叉呈递，由此也降低通过逃逸变体的肿瘤复发的风险。

TCR基因转移已在临床中被测试，以治疗晚期黑素瘤和滑膜细胞肉瘤(13、14)。结合这些研究，在治疗的22/87患者中观察到了客观的临床响应。然而，在其中TCR靶向的自身蛋白在正常细胞上表达的一些患者中发生了显著的自身免疫反应(13)。

在这方面，NPC是测试TCR基因转移潜力的理想环境，因为使用天然存在的高亲和力TCR可以靶向外来(病毒)抗原而不是自身抗原。EBV存在于一些正常淋巴细胞中，但只有1-50/百万个循环B细胞，且这些细胞中的大多数缺乏病毒蛋白表达(44)。因此，EBV特异性TCR中靶(on-target)毒性的风险很小。

由于TCR链的错配而产生新的自体反应受体特异性，TCR基因转移具有潜在的脱靶毒性风险(45)。虽然该毒性尚未在临床试验中被报道，并且我们几乎没有发现至少与外源性β链错配的证据，我们并入了几种降低coTCRcys受体的该风险的方法。因此，用2A肽接头将编码TCRα链和β链的基因克隆到单个逆转录病毒载体中，以确保在同一T细胞中的等摩尔表达。此外，我们还在α和β恒定结构域之间掺入了第二个二硫键，这也改善了TCR表面表达。为了进一步降低该风险，使用shRNA敲低内源性TCR链的表达是可能的(46)。尽管如此，如果自身免疫发展，可以谨慎地掺入自杀基因(47)用于选择性缺失输注的细胞。

一些研究已经强调了CD4+T细胞在控制肿瘤生长中的重要性(48、49)，并且我们的SSC特异性TCR在这些细胞中发挥功能的能力是重要的，原因有两个。首先，同时发生的抗原特异性CD4+T细胞应答有助于细胞毒性CD8+T细胞的扩展和效力(50)。实际上，当NPC患者用表达SSC肽的树突细胞免疫时，CD8+T细胞对该表位的应答被加强，但仅是瞬时的(33)。这意味着，还要求加强EBV特异性CD4+T细胞。当用SSC肽刺激时，用coTCRcys转导的CD4+T细胞产生细胞因子，包括IL2，表明它们可以帮助维持coTCRcys转导的CD8+T细胞。其次，coTCRcys转导的CD4+T细胞是细胞毒性的，表明它们可直接破坏NPC细胞。因此，该TCR在CD8和CD4 T细胞二者中起作用的能力增加了其用于治疗NPC的潜力。

参考文献

1.CURADO MP，EDWARDS B，SHIN HR，STORM H，FERLAY J，HEANUE M，ET AL.CANCERINCIDENCE IN FIVE CONTINENTS.VOLUME IX.INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ONCANCER；2007.

2.LEE AW，SZE WM，AU JS，LEUNG SF，LEUNG TW，CHUA DT，ET AL.TREATMENTRESULTS FOR NASOPHARYNGEAL CARCINOMA IN THE MODERN ERA：THE HONG KONGEXPERIENCE.INT J RADIAT ONCOL BIOL PHYS 2005；61：1107-16.

3.WANG CC，CHEN ML，HSU KH，LEE SP，CHEN TC，CHANG YS，ET AL.SECONDMALIGNANT TUMORS IN PATIENTS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND THEIRASSOCIATION WITH EPSTEIN-BARR VIRUS.INT J CANCER 2000；87：228-31.

4.RICKINSON AB，KIEFF E，KNIPE DM，HOWLEY PM.EPSTEIN-BARR VIRUS.FIELDSVIROLOGY.VOLUME 5TH.PHILADELPHIA：LIPPINCOTT WILLIAMS AND WILKINS；2007.P2655-700.

5.HESLOP HE，SLOBOD KS，PULE MA，HALE GA，ROUSSEAU A，SMITH CA，ET AL.LONGTERM OUTCOME OF EBV SPECIFIC T-CELL INFUSIONS TO PREVENT OR TREAT EBV-RELATEDLYMPHOPROLIFERATIVE DISEASE IN TRANSPLANT RECIPIENTS.BLOOD2010；115：925-35.

6.LOUIS CU，STRAATHOF K，BOLLARD CM，ENNAMURI S，GERKEN C，LOPEZ TT，ETAL.ADOPTIVE TRANSFER OF EBV-SPECIFIC T CELLS RESULTS IN SUSTAINED CLINICALRESPONSES IN PATIENTS WITH LOCOREGIONAL NASOPHARYNGEAL CARCINOMA.J IMMUNOTHER2010；33：983-90.

7.STRAATHOF KC，BOLLARD CM，POPAT U，HULS MH，LOPEZ T，MORRISS MC，ETAL.TREATMENT OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA WITH EPSTEIN-BARR VIRUS--SPECIFIC TLYMPHOCYTES.BLOOD 2005；105：1898-904.

8.COMOLI P，PEDRAZZOLI P，MACCARIO R，BASSO S，CARMINATI O，LABIRIO M，ETAL.CELL THERAPY OF STAGE IV NASOPHARYNGEAL CARCINOMA WITH AUTOLOGOUS EPSTEIN-BARR VIRUS-TARGETED CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES.J CLIN ONCOL2005；23：8942-49.

9.LOUIS CU，STRAATHOF K，BOLLARD CM，GERKEN C，HULS MH，GRESIK MV，ETAL.ENHANCING THE IN VIVO EXPANSION OF ADOPTIVELY TRANSFERRED EBV-SPECIFIC CTLWITH LYMPHODEPLETING CD45 MONOCLONAL ANTIBODIES IN NPC PATIENTS.BLOOD2009；113：2442-50.

10.BOLLARD CM，GOTTSCHALK S，TORRANO V，DIOUF O，KU S，HAZRAT Y，ETAL.SUSTAINED COMPLETE RESPONSES IN PATIENTS WITH LYMPHOMA RECEIVINGAUTOLOGOUS CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES TARGETING EPSTEIN-BARR VIRUS LATENTMEMBRANE PROTEINS.J CLIN ONCOL 2014；32∶798-808.

11.SMITHC，TSANG J，BEAGLEYL，CHUAD，LEEV，LIV，ETAL.EFFECTIVE TREATMENT OFMETASTATIC FORMS OF EPSTEIN-BARR VIRUS-ASSOCIATED NASOPHARYNGEAL CARCINOMAWITH A NOVEL ADENOVIRUS-BASED ADOPTIVE IMMUNOTHERAPY.CANCER RES 2012；72∶1116-25.

12.GERDEMANN U，KEIRNAN JM，KATARIUL，YANAGISAWA R，CHRISTIN AS，HUYE LE，ET AL.RAPIDLY GENERATED MULTIVIRUS-SPECIFIC CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES FOR THEPROPHYLAXIS AND TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS.MOL THER 2012；20∶1622-32.

13.JOHNSON LA，MORGAN RA，DUDLEY ME，CASSARD L，YANG JC，HUGHES MS，ETAL.GENE THERAPY WITH HUMAN AND MOUSE T-CELL RECEPTORS MEDIATES CANCERREGRESSION AND TARGETS NORMAL TISSUES EXPRESSING COGNATE ANTIGEN.BLOOD2009；114∶535-46.

14.ROBBINS PF，MORGAN RA，FELDMAN SA，YANG JC，SHERRY RM，DUDLEY ME，ETAL.TUMOR REGRESSION IN PATIENTS WITH METASTATIC SYNOVIAL CELL SARCOMA ANDMELANOMA USING GENETICALLY ENGINEERED LYMPHOCYTES REACTIVE WITH NY-ESO-1.JCLIN ONCOL 2011；29∶917-24.

15.MIDGLEY RS，BELL AI，MCGEOCH DJ，RICKINSON AB.LATENT GENE SEQUENCINGREVEALS FAMILIAL RELATIONSHIPS AMONG CHINESE EPSTEIN-BARR VIRUS STRAINS ANDEVIDENCE FOR POSITIVE SELECTION OF A11 EPITOPE CHANGES.J VIROL 2003；77∶11517-30.

16.HUANG DP，HO JH，POON YF，CHEW EC，SAW D，LUI M，ET AL.ESTABLISHMENT OFA CELL LINE(NPC/HK1)FROM A DIFFERENTIATED SQUAMOUS CARCINOMA OF THENASOPHARYNX.INT J CANCER 1980；26∶127-32.

17.CHEUNG ST，HUANG DP，HUI ABY，LO KW，KO CW，TSANG YS，ETAL.NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE(C666-1)CONSISTENTLY HARBOURING EPSTEIN-BARR VIRUS.INT J CANCER 1999；83∶121-26.

18.STRONG MJ，BADDOO M，NANBO A，XU M，PUETTER A，LIN Z.COMPREHENSIVEHIGH-THROUGHPUT RNA SEQUENCING ANALYSIS REVEALS CONTAMINATION OF MULTIPLENASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINES WITH HELA CELL GENOMES.J VIROL 2014；88：10696-704.

19.CAILLEAU R，YOUNG R，OLIVE M，REEVES WJ，JR.BREAST TUMOR CELL LINESFROM PLEURAL EFFUSIONS.J NATL CANCER INST 1974；53：661-74.

20.MURRAY RJ，KURILLA MG，BROOKS JM，THOMAS WA，ROWE M，KIEFF E，ETAL.IDENTIFICATION OF TARGET ANTIGENS FOR THE HUMAN CYTOTOXIC T CELL RESPONSETO EPSTEIN-BARR VIRUS(EBV)-IMPLICATIONS FOR THE IMMUNE CONTROL OF EBV-POSITIVE MALIGNANCIES.J EXP MED 1992；176：157-68.

21.TAYLOR GS，HAIGH TA，GUDGEON NH，PHELPS RJ，LEE SP，STEVEN NM，ETAL.DUAL STIMULATION OF EPSTEIN-BARR VIRUS(EBV)-SPECIFIC CD4+- AND CD8+-T-CELLRESPONSES BY A CHIMERIC ANTIGEN CONSTRUCT：POTENTIAL THERAPEUTIC VACCINE FOREBV-POSITIVE NASOPHARYNGEAL CARCINOMA.J VIROL 2004；78：768-78.

22.ENGELS B，CAM H，SCHULER T，INDRACCOLO S，GLADOW M，BAUM C，ETAL.RETROVIRAL VECTORS FOR HIGH-LEVEL TRANSGENE EXPRESSION IN TLYMPHOCYTES.HUM GENE THER 2003；14：1155-68.

23.LEE SP，TIERNEY RJ，THOMAS WA，BROOKS JM，RICKINSON AB.CONSERVED CTLEPITOPES WITHIN EBV LATENT MEMBRANE PROTEIN 2-A POTENTIAL TARGET FOR CTL-BASED TUMOR THERAPY.J IMMUNOL 1997；158∶3325-34.

24.SCHOLTEN KB，KRAMER D，KUETER EW，GRAF M，SCHOEDL T，MEIJER CJ，ETAL.CODON MODIFICATION OF T CELL RECEPTORS ALLOWS ENHANCED FUNCTIONALEXPRESSION IN TRANSGENIC HUMAN T CELLS.CLIN IMMUNOL 2006；119：135-45.

25.KUBALL J，DOSSETT ML，WOLFL M，HO WY，VOSS RH，FOWLER C，ETAL.FACILITATING MATCHED PAIRING AND EXPRESSION OF TCR CHAINS INTRODUCED INTOHUMAN T CELLS.BLOOD2007；109∶2331-38.

26.DE WITTE MA，JORRITSMA A，KAISER A，VAN DEN BOOM MD，DOKTER M，BENDLEGM，ET AL.REQUIREMENTS FOR EFFECTIVE ANTITUMOR RESPONSES OF TCR TRANSDUCED TCELLS.J IMMUNOL2008；181：5128-36.

27.JORRITSMA A，GOMEZ-EERLAND R，DOKTER M，VAN DE KASTEELE W，ZOET YM，DOXIADIS II，ET AL.SELECTING HIGHLY AFFINE AND WELL-EXPRESSED TCRS FOR GENETHERAPY OF MELANOMA.BLOOD2007；110：3564-72.

28.DARRAH PA，PATEL DT，DE LUCA PM，LINDSAY RW，DAVEY DF，FLYNN BJ，ETAL.MULTIFUNCTIONAL TH1 CELLS DEFINE A CORRELATE OF VACCINE-MEDIATEDPROTECTION AGAINST LEISHMANIA MAJOR.NAT MED 2007；13：843-50.

29.STRAATHOF KC，LEEN AM，BUZA EL，TAYLOR G，HULS MH，HESLOP HE，ETAL.CHARACTERIZATION OF LATENT MEMBRANE PROTEIN2SPECIFICITY IN CTL LINES FROMPATIENTS WITH EBV-POSITIVE NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND LYMPHOMA.JIMMUNOL2005；175：4137-47.

30.GATTINONI L，KLEBANOFF CA，PALMER DC，WRZESINSKI C，KERSTANN K，YU Z，ETAL.ACQUISITION OF FULL EFFECTOR FUNCTION IN VITRO PARADOXICALLY IMPAIRS THEIN VIVO ANTITUMOR EFFICACY OF ADOPTIVELY TRANSFERRED CD8+T CELLS.J CLININVEST 2005；115：1616-26.

31.TANG M，ZENG Y，POISSONA，MARTI D，GUAN L，ZHENG Y，ET AL.HAPLOTYPE-DEPENDENT HLA SUSCEPTIBILITY TO NASOPHARYNGEAL CARCINOMA IN A SOUTHERNCHINESE POPULATION.GENES IMMUN2010；11(4)：334-42.

32.HU SP，DAY NE，LI DR，LUBEN RN，CAI KL，OU-YANG T，ET AL.FURTHEREVIDENCE FOR AN HLA-RELATED RECESSIVE MUTATION IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMAAMONG THE CHINESE.BR J CANCER 2005；92：967-70.

33.LIN CL，LO WF，LEE TH，REN Y，HWANG SL，CHENG YF，ET AL.IMMUNIZATIONWITH EPSTEIN-BARR VIRUS(EBV)PEPTIDE-PULSED DENDRITIC CELLS INDUCES FUNCTIONALCD8+ T-CELL IMMUNITY AND MAY LEAD TO TUMOR REGRESSION IN PATIENTS WITH EBV-POSITIVE NASOPHARYNGEAL CARCINOMA.CANCER RES 2002；62：6952-58.

34.KWOK H，WU CW，PALSER AL，KELLAM P，SHAM PC，KWONG DL，ET AL.GENOMICDIVERSITY OF EPSTEIN-BARR VIRUS GENOMES ISOLATED FROM PRIMARY NASOPHARYNGEALCARCINOMA BIOPSY SAMPLES.J VIROL2014；88：10662-72.

35.WANG X，LIU X，JIA Y，CHAO Y，XING X，WANG Y，ET AL.WIDESPREAD SEQUENCEVARIATION IN THE EPSTEIN-BARR VIRUS LATENT MEMBRANE PROTEIN 2A GENE AMONGNORTHERN CHINESE ISOLATES.J GEN VIROL 2010；91(PT 10)：2564-73.

36.TSANG CW，LIN X，GUDGEON NH，TAYLOR GS，JIA H，HUI EP，ET AL.CD4+ T-CELLRESPONSES TO EPSTEIN-BARR VIRUS NUCLEAR ANTIGEN EBNA1 IN CHINESE POPULATIONSARE HIGHLY FOCUSED ON NOVEL C-TERMINAL DOMAIN-DERIVED EPITOPES.J VIROL2006；80：8263-66.

37.HUI EP，TAYLOR GS，JIA H，MA BB，CHAN SL，HO R，ET AL.PHASE I TRIAL OFRECOMBINANT MODIFIED VACCINIA ANKARA ENCODING EPSTEIN-BARR VIRAL TUMORANTIGENS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA PATIENTS.CANCER RES 2013；73：1676-88.

38.OGINO T，MORIAI S，ISHIDA Y，ISHII H，KATAYAMA A，MIYOKAWA N，ETAL.ASSOCIATION OF IMMUNOESCAPE MECHANISMS WITH EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTIONIN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA.INT J CANCER 2007；120：2401-10.

39.LAU KM，CHENG SH，LO KW，LEE SA，WOO JK，VAN HASSELT CA，ET AL.INCREASEIN CIRCULATING FOXP3+CD4+CD25(HIGH)REGULATORY T CELLS IN NASOPHARYNGEALCARCINOMA PATIENTS.BRJ CANCER 2007；96：617-22.

40.XU J，AHMAD A，JONES JF，DOLCETTI R，VACCHER E，PRASAD U，ET AL.ELEVATEDSERUM TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA1 LEVELS IN EPSTEIN-BARR VIRUS-ASSOCIATED DISEASES AND THEIR CORRELATION WITH VIRUS-SPECIFIC IMMUNOGLOBULINA(IGA)AND IGM.J VIROL 2000；74：2443-6.

41.LEE SP，CHAN AT，CHEUNG ST，THOMAS WA，CROOMCARTER D，DAWSON CW，ETAL.CTL CONTROL OF EBV IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA(NPC)：EBV-SPECIFIC CTLRESPONSES IN THE BLOOD AND TUMORS OF NPC PATIENTS AND THE ANTIGEN- PROCESSINGFUNCTION OF THE TUMOR CELLS.J IMMUNOL 2000；165：573-82.

42.BOLLARD CM，ROSSIG C，CALONGE MJ，HULS MH，WAGNER HJ，MASSAGUE J，ETAL.ADAPTING A TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA-RELATED TUMOR PROTECTIONSTRATEGY TO ENHANCE ANTITUMOR IMMUNITY.BLOOD 2002；99：3179-87.

43.ENGELSB，ENGELHARD VH，SIDNEY J，SETTEA，BINDER DC，LIURB，ETAL.RELAPSEOR ERADICATION OF CANCER IS PREDICTED BY PEPTIDE-MAJOR HISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX AFFINITY.CANCER CELL 2013；23∶516-26.

44.BABCOCK GJ，DECKER LL，FREEMAN RB，THORLEY-LAWSON DA.EPSTEIN-BARRVIRUS-INFECTED RESTING MEMORY B CELLS，NOT PROLIFERATING LYMPHOBLASTS，ACCUMULATE IN THE PERIPHERAL BLOOD OF IMMUNOSUPPRESSED PATIENTS.J EXP MED1999；190：567-76.

45.BENDLE GM，LINNEMANN C，HOOIJKAAS AI，BIES L，DE WITTE MA，JORRITSMA A，ET AL.LETHAL GRAFT-VERSUS-HOST DISEASE IN MOUSE MODELS OF T CELL RECEPTORGENE THERAPY.NAT MED 2010；16∶565-70，1P FOLLOWING 570.

46.BUNSE M，BENDLE GM，LINNEMANN C，BIES L，SCHULZ S，SCHUMACHER TN，ETAL.RNAI-MEDIATED TCR KNOCKDOWN PREVENTS AUTOIMMUNITY IN MICE CAUSED BY MIXEDTCR DIMERS FOLLOWING TCR GENE TRANSFER.MOL THER2014；22∶1983-91.

47.DI STASI A，TEY SK，DOTTI G，FUJITA Y，KENNEDY-NASSER A，MARTINEZ C，ETAL.INDUCIBLE APOPTOSIS AS A SAFETY SWITCH FOR ADOPTIVE CELL THERAPY.N ENGL JMED 2011；365：1673-83.

48.FRANKEL TL，BURNS WR，PENG PD，YU Z，CHINNASAMY D，WARGO JA，ET AL.BOTHCD4 AND CD8 T CELLS MEDIATE EQUALLY EFFECTIVE IN VIVO TUMOR TREATMENT WHENENGINEERED WITH A HIGHLY AVID TCR TARGETING TYROSINASE.J IMMUNOL 2010；184：5988-98.

49.QUEZADA SA，SIMPSON TR，PEGGS KS，MERGHOUB T，VIDER J，FAN X，ETAL.TUMOR-REACTIVE CD4(+)T CELLS DEVELOP CYTOTOXIC ACTIVITY AND ERADICATELARGE ESTABLISHED MELANOMA AFTER TRANSFER INTO LYMPHOPENIC HOSTS.J EXP MED2010；207：637-50.

50.BEVAN MJ.HELPING THE CD8(+)T-CELL RESPONSE.NAT REV IMMUNOL 2004；4：595-602.

序列表

<110> 癌症研究科技有限公司

<120> T细胞受体及其用途

<130> P226265WO

<140> PCT/GB2016/053566

<141> 2016-11-15

<150> GB1520191.6

<151> 2015-11-16

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 本发明的TCR的α链

<400> 1

Met Lys Arg Ile Leu Gly Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ser Ala Gln Val

1 5 10 15

Cys Cys Val Arg Gly Ile Gln Val Glu Gln Ser Pro Pro Asp Leu Ile

20 25 30

Leu Gln Glu Gly Ala Asn Ser Thr Leu Arg Cys Asn Phe Ser Asp Ser

35 40 45

Val Asn Asn Leu Gln Trp Phe His Gln Asn Pro Trp Gly Gln Leu Ile

50 55 60

Asn Leu Phe Tyr Ile Pro Ser Gly Thr Lys Gln Asn Gly Arg Leu Ser

65 70 75 80

Ala Thr Thr Val Ala Thr Glu Arg Tyr Ser Leu Leu Tyr Ile Ser Ser

85 90 95

Ser Gln Thr Thr Asp Ser Gly Val Tyr Phe Cys Ala Val Val Glu Asn

100 105 110

Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Asn

115 120 125

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

130 135 140

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

145 150 155 160

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val

165 170 175

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

180 185 190

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

195 200 205

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

210 215 220

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

225 230 235 240

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

245 250 255

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265

<210> 2

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 本发明的TCR的β链

<400> 2

Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met

20 25 30

Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His

35 40 45

Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu

50 55 60

Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His

85 90 95

Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Pro Gly Arg Trp Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 3

<211> 600

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 本发明的TCR的全长氨基酸序列

<400> 3

Met Lys Arg Ile Leu Gly Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ser Ala Gln Val

1 5 10 15

Cys Cys Val Arg Gly Ile Gln Val Glu Gln Ser Pro Pro Asp Leu Ile

20 25 30

Leu Gln Glu Gly Ala Asn Ser Thr Leu Arg Cys Asn Phe Ser Asp Ser

35 40 45

Val Asn Asn Leu Gln Trp Phe His Gln Asn Pro Trp Gly Gln Leu Ile

50 55 60

Asn Leu Phe Tyr Ile Pro Ser Gly Thr Lys Gln Asn Gly Arg Leu Ser

65 70 75 80

Ala Thr Thr Val Ala Thr Glu Arg Tyr Ser Leu Leu Tyr Ile Ser Ser

85 90 95

Ser Gln Thr Thr Asp Ser Gly Val Tyr Phe Cys Ala Val Val Glu Asn

100 105 110

Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Asn

115 120 125

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

130 135 140

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

145 150 155 160

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val

165 170 175

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

180 185 190

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

195 200 205

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

210 215 220

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

225 230 235 240

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

245 250 255

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Gly Ser Gly Ala

260 265 270

Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

275 280 285

Gly Pro Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu

290 295 300

Gly Ala Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu

305 310 315 320

Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met

325 330 335

Gly His Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro

340 345 350

Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser

355 360 365

Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn

370 375 380

Leu His Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys

385 390 395 400

Ala Ser Ser Pro Gly Arg Trp Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

405 410 415

Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

420 425 430

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

435 440 445

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

450 455 460

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp

465 470 475 480

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

485 490 495

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

500 505 510

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

515 520 525

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

530 535 540

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

565 570 575

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

580 585 590

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

595 600

<210> 4

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码由SEQ ID No.1表示的本发明的TCR的α链的密码子优化的核苷酸序列(SEQ IDNo.4)

<400> 4

atgaagagaa tcctgggcgc cctgctgggc ctgctgtccg cccaggtgtg ctgcgtgcgg 60

ggcatccagg tggagcagag cccccctgac ctgatcctgc aggaaggcgc caacagcacc 120

ctgcggtgca acttcagcga cagcgtgaac aacctgcagt ggttccacca gaacccctgg 180

ggccagctga tcaacctgtt ctacatcccc agcggcacca agcagaacgg cagactgagc 240

gccaccaccg tggccaccga gcggtacagc ctgctgtaca tcagcagcag ccagaccacc 300

gacagcggcg tgtacttctg cgccgtggtg gagaacaacg acatgagatt cggagccggc 360

acccggctga ccgtgaagcc caacatccag aaccccgacc ccgccgtgta ccagctgcgg 420

gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg acttcgactc ccagaccaac 480

gtgtcccaga gcaaggactc cgacgtgtac atcaccgaca agtgcgtgct ggacatgcgg 540

agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca acaagagcga cttcgcctgc 600

gccaacgcct tcaacaacag catcatcccc gaggacacct ttttccccag ccccgagagc 660

agctgcgacg tgaaactggt ggagaagtcc ttcgagacag acaccaacct gaacttccag 720

aacctgagcg tgatcggctt cagaatcctg ctgctgaaag tggctggatt caacctgctg 780

atgaccctgc ggctgtggag cagc 804

<210> 5

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码由SEQ ID No.2表示的本发明的TCR的β链的密码子优化的核苷酸序列(SEQ IDNo.5)

<400> 5

atgggctgcc ggctgctgtg ctgcgccgtg ctgtgtctgc tgggcgccgt gcccatcgac 60

accgaagtga cccagacccc caagcacctg gtgatgggca tgaccaacaa gaaaagcctg 120

aagtgcgagc agcacatggg ccaccgggcc atgtactggt acaagcagaa ggccaagaaa 180

ccccccgagc tgatgttcgt gtacagctac gagaagctgt ccatcaacga gagcgtgccc 240

agcagattca gccctgagtg ccccaactcc tccctgctga acctgcacct gcatgccctg 300

cagcccgagg acagcgccct gtacctgtgc gccagcagcc ccggcaggtg gtacgagcag 360

tacttcggcc ctggcaccag actgacagtg accgaggacc tgaagaacgt gttccccccc 420

gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa agccaccctg 480

gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgat cacgtggagc tgtcttggtg ggtgaacggc 540

aaagaggtgc actccggcgt ctgcaccgac cctcagcccc tgaaagagca gcccgccctg 600

aacgacagcc ggtactgcct gtcctcccgg ctgagagtgt ctgctacatt ctggcagaat 660

ccccggaacc acttccggtg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720

acccaggaca gagccaagcc cgtgacccag atcgtgtccg ccgaggcctg gggcagagcc 780

gactgcggct tcaccagcga gagctaccag cagggcgtgc tgtctgccac catcctgtac 840

gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900

gccatggtga agcggaagga cagcagaggc tga 933

<210> 6

<211> 1803

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码由SEQ ID No.3表示的本发明的全长TCR的密码子优化的核苷酸序列(SEQ IDNo.6)

<400> 6

atgaagagaa tcctgggcgc cctgctgggc ctgctgtccg cccaggtgtg ctgcgtgcgg 60

ggcatccagg tggagcagag cccccctgac ctgatcctgc aggaaggcgc caacagcacc 120

ctgcggtgca acttcagcga cagcgtgaac aacctgcagt ggttccacca gaacccctgg 180

ggccagctga tcaacctgtt ctacatcccc agcggcacca agcagaacgg cagactgagc 240

gccaccaccg tggccaccga gcggtacagc ctgctgtaca tcagcagcag ccagaccacc 300

gacagcggcg tgtacttctg cgccgtggtg gagaacaacg acatgagatt cggagccggc 360

acccggctga ccgtgaagcc caacatccag aaccccgacc ccgccgtgta ccagctgcgg 420

gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg acttcgactc ccagaccaac 480

gtgtcccaga gcaaggactc cgacgtgtac atcaccgaca agtgcgtgct ggacatgcgg 540

agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca acaagagcga cttcgcctgc 600

gccaacgcct tcaacaacag catcatcccc gaggacacct ttttccccag ccccgagagc 660

agctgcgacg tgaaactggt ggagaagtcc ttcgagacag acaccaacct gaacttccag 720

aacctgagcg tgatcggctt cagaatcctg ctgctgaaag tggctggatt caacctgctg 780

atgaccctgc ggctgtggag cagcggcagc ggcgccacca acttcagcct gctgaagcag 840

gccggcgacg tggaggaaaa ccctggcccc atgggctgcc ggctgctgtg ctgcgccgtg 900

ctgtgtctgc tgggcgccgt gcccatcgac accgaagtga cccagacccc caagcacctg 960

gtgatgggca tgaccaacaa gaaaagcctg aagtgcgagc agcacatggg ccaccgggcc 1020

atgtactggt acaagcagaa ggccaagaaa ccccccgagc tgatgttcgt gtacagctac 1080

gagaagctgt ccatcaacga gagcgtgccc agcagattca gccctgagtg ccccaactcc 1140

tccctgctga acctgcacct gcatgccctg cagcccgagg acagcgccct gtacctgtgc 1200

gccagcagcc ccggcaggtg gtacgagcag tacttcggcc ctggcaccag actgacagtg 1260

accgaggacc tgaagaacgt gttccccccc gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc 1320

gagatcagcc acacccagaa agccaccctg gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgat 1380

cacgtggagc tgtcttggtg ggtgaacggc aaagaggtgc actccggcgt ctgcaccgac 1440

cctcagcccc tgaaagagca gcccgccctg aacgacagcc ggtactgcct gtcctcccgg 1500

ctgagagtgt ctgctacatt ctggcagaat ccccggaacc acttccggtg ccaggtgcag 1560

ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg acccaggaca gagccaagcc cgtgacccag 1620

atcgtgtccg ccgaggcctg gggcagagcc gactgcggct tcaccagcga gagctaccag 1680

cagggcgtgc tgtctgccac catcctgtac gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtac 1740

gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg gccatggtga agcggaagga cagcagaggc 1800

tga 1803

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知的(Unknown)

<220>

<223> TCRα恒定区引物

<400> 7

agcacaggct gtcttacaat cttgc 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知的(Unknown)

<220>

<223> TCRβ2恒定区引物

<400> 8

ggacacagat tgggagcagg 20

Claims

1.一种T细胞受体，包含：

a. α链，所述α链包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；和

b. β链，所述β链包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其中所述α链和所述β链通过接头连接，其中所述接头是来自猪捷申病毒的2A肽接头。

3.根据权利要求1至2的任一项所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体包含SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至2的任一项所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体包含在所述α链的可变区的位置48处的半胱氨酸残基和在所述β链的可变区的位置57处的半胱氨酸残基。

5.根据权利要求3所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体包含在所述α链的可变区的位置48处的半胱氨酸残基和在所述β链的可变区的位置57处的半胱氨酸残基。

6.根据权利要求1、2和5的任一项所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体由包含以下的核苷酸序列编码：

a. SEQ ID No.6；或

b. 由于遗传密码简并性而等同于SEQ ID No.6的核苷酸序列。

7.根据权利要求3所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体由包含以下的核苷酸序列编码：

a. SEQ ID No.6；或

b. 由于遗传密码简并性而等同于SEQ ID No.6的核苷酸序列。

8.根据权利要求4所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体由包含以下的核苷酸序列编码：

a. SEQ ID No.6；或

b. 由于遗传密码简并性而等同于SEQ ID No.6的核苷酸序列。

9.一种针对癌症的免疫动员单克隆TCR (ImmTac)，所述ImmTac包含可溶性的根据权利要求1至8的任一项所述的T细胞受体。

10.根据权利要求9所述的ImmTac，其中所述ImmTac包含抗CD3 scFv。

11.一种核酸分子，包含：

a. SEQ ID No.6；或

b. 由于遗传密码简并性而等同于SEQ ID No.6的核苷酸序列。

12.一种载体，所述载体包含根据权利要求11所述的核酸分子。

13.一种用根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的载体转化或转染的宿主细胞。

14.一种组合物，包含：

a. 根据权利要求1至8的任一项所述的T细胞受体；

b. 根据权利要求9或权利要求10所述的ImmTac；

c. 根据权利要求11所述的核酸分子；

d. 根据权利要求12所述的载体；或

e. 根据权利要求13所述的宿主细胞。

15.根据权利要求1至8的任一项所述的T细胞受体、根据权利要求9或权利要求10所述的ImmTac、或根据权利要求14所述的组合物在制备用于治疗或预防EBV+肿瘤的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述EBV+肿瘤选自由以下组成的组：鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和胃癌。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的用途，其中所述EBV+肿瘤是鼻咽癌。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述EBV+肿瘤是未分化的鼻咽癌。

19.根据权利要求15、16和18的任一项所述的用途，其中所述T细胞受体或组合物被配制为提供至少10⁸个包含所述T细胞受体的T细胞的剂量。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述T细胞受体或组合物被配制为提供至少10⁸个包含所述T细胞受体的T细胞的剂量。

21.一种制备包含根据权利要求1至8的任一项所述的T细胞受体的T细胞的体外方法，包括：用根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的载体转染或转化T细胞样品。