CN113423724B - Ebv表位高亲和力t细胞受体 - Google Patents

Ebv表位高亲和力t细胞受体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种EBV表位高亲和力T细胞受体。本发明所提供的EBV表位高亲和力T细胞受体包含α链和β链；所述α链包含三个互补决定区，序列分别为SEQ ID No.3的第43‑49位、第67‑71位以及第106‑116位；所述β链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别为SEQ ID No.4的第46‑50位、第68‑73位以及第111‑118位。本发明所提供的表达TCR的T细胞可以有效的识别T2细胞负载的EBV抗原多肽，并分泌IFN‑γ，证明其具有功能。本发明提供的EBV表位高亲和力T细胞受体具有重要的应用价值。

Description

EBV表位高亲和力T细胞受体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种EBV表位高亲和力T细胞受体。
背景技术
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是上皮细胞来源的肿瘤，与EBV病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的感染高度相关，所有EBV阳性的NPC恶性肿瘤都伴随了EBV的潜伏感染。化疗与放疗是治疗NPC的传统方案，能有效控制疾病发展，但不能完全清除微小病灶和循环中转移的肿瘤细胞。随着免疫疗法在肿瘤治疗中取得越来越多的瞩目成果，将NPC的传统治疗和免疫疗法相结合，在提高疗效，降低副反应，清除微小病灶等方面将会有较好的效果。
在肿瘤免疫方面，已知细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗感染和肿瘤特异性免疫应答中发挥关键作用。启动免疫应答程序的并不是整个抗原分子，而是与MHC分子结合的氨基酸短肽，即CTL表位。随着生物信息学的发展，越来越多的与病毒、肿瘤抗原相关的MHC I类分子限制性CTL表位被成功预测并鉴定出来。鼻咽癌细胞可通过人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)I类分子递呈内部表达的病毒抗原，产生特异的CTL，这为鼻咽癌的免疫治疗提供了契机。
EBV潜伏感染时表达的病毒蛋白包括6种核抗原(EBNAs1，2，3A，3B，3C和LP)、3种潜伏膜蛋白(LMPs1，2A和2B)以及BamHI-A向右开放读码框的转录产物(BARTs)。EBV的这些潜伏基因产物在不同肿瘤组织中呈现不同表达方式，包括潜伏O型，潜伏I型，潜伏II型和潜伏III型，在NPC中以潜伏II型方式存在，仅表达EBNA1、LMP1、LMP2A、LMP2B和BARF1。其中LMP2A序列较为保守，在肿瘤相关组织中能持续表达，且含有多种受HLA限制的CTL表位，是目前EBV相关NPC免疫治疗的理想靶抗原。目前随着研究的深入，不断有LMP2A的表位肽被鉴定出来，其中有多条表位肽在针对NPC的体内和体外免疫治疗实验中均取得了不错效果。
目前针对NPC的免疫治疗主要集中在主动免疫治疗。根据靶抗原设计相应的表位肽疫苗，选择合适的抗原呈递给患者，诱导特异性免疫反应以清除肿瘤细胞。Lin等报道了LMP2多肽负载自体DCs治疗16例难治性鼻咽癌的研究。由DC分别负载自体来源的HLA-A1101、HLA-A2402和HLA-B40011限制型的表位多肽后输回患者体内，以LMP2特异性CD8+T淋巴细胞为评价标准，9例患者(56％)表现出较强的针对LMP2多肽的免疫反应。此外，两例病人肿瘤消退，无瘤期分别为10个月和12个月以上。该研究表明相关的表位多肽对于激发NPC患者的免疫应答的可行性，对后期进行其他免疫疗法具有极大地参考价值。
发明公开
本发明的目的是提供一种识别EBV抗原的T细胞受体。其中，所述EBV抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示(LMP2表位)。
本发明所提供的识别EBV抗原的T细胞受体，包含α链和β链。其中，所述α链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别为SEQ ID No.3的第43-49位、第67-71位以及第106-116位；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。所述β链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别为SEQ ID No.4的第46-50位、第68-73位以及第111-118位；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。
进一步地，所述α链的可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第18-127位；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。所述β链的可变区的氨基酸序列为SEQID No.4的第20-128位；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。
所述α链的恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第128-268。所述β链的恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No.4的第129-307位。
更进一步地，所述α链的氨基酸序列具体为SEQ ID No.3；所述β链的氨基酸序列具体为SEQ ID No.4。
编码所述T细胞受体的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码所述T细胞受体的核酸分子包含编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子。
其中，编码所述T细胞受体的α链中三个互补决定区的核酸分子的序列分别为SEQID No.1的第127-147位、第199-213位以及第316-348位；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。编码所述T细胞受体的β链中三个互补决定区的核酸分子的序列分别为SEQ ID No.2的第136-150位、第202-219位以及第331-354位；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
进一步地，编码所述α链的可变区的核酸分子的序列为SEQ ID No.1的第52-381位；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。编码所述β链的可变区的核酸分子的序列为SEQ ID No.2的第58-384位；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
所述α链的恒定区的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第382-804。所述β链的恒定区的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第385-921位。
更进一步地，编码所述α链的核酸分子的序列具体为SEQ ID No.1。编码所述β链的核酸分子的序列具体为SEQ ID No.2。
含有所述核酸分子的表达盒、载体或细胞也属于本发明的保护范围。
进一步地，所述载体可为慢病毒载体。
所述载体可为向载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的多克隆位点(如限制性内切酶BamHI和SalI)之间插入编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子，得到的重组质粒。
所述载体具体可为向载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的多克隆位点(如限制性内切酶BamHI和SalI)之间插入DNA序列，得到的重组质粒；所述DNA序列为将编码所述α链的核酸分子和编码所述β链的核酸分子用连接肽(如P2A肽)的编码序列连接而成。
在本发明的一个实施例中，所述载体具体可为向载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的限制性内切酶BamHI和SalI之间插入SEQ ID No.6所示的DNA分子。
进一步地，所述细胞可为T细胞。
具有上述任一所述T细胞受体的T细胞也属于本发明的保护范围。
含有所述载体或所述细胞、或、含有上述任一所述T细胞受体的T细胞的药物组合物也属于本发明的保护范围。
其中，所述药物组合物可用于预防和/或治疗由EBV感染所致疾病。
所述T细胞受体、或、所述核酸分子、或、所述载体或细胞、或、含有上述任一所述T细胞受体的T细胞在制备预防和/或治疗由EBV感染所致疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
所述T细胞受体、或、所述核酸分子、或、所述载体或细胞、或、含有上述任一所述T细胞受体的T细胞在预防和/或治疗由EBV感染所致疾病中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种预防和/或治疗由EBV感染所致疾病的方法。该方法可包括如下步骤：以前文所述的T细胞受体、或、所述核酸分子、或、所述载体或细胞、或、含有上述任一所述T细胞受体的T细胞来预防和/或治疗由EBV感染所致疾病。
其中，前文所述的由EBV感染所致疾病具体可为鼻咽癌和/或口咽鳞状细胞瘤和/或T细胞恶性肿瘤。
实验证明，本发明通过EBV抗原多肽体外刺激特异性T细胞，获得特异性T细胞群体，利用单细胞配对TCR测序技术，获得EBV抗原多肽对应的有效T淋巴细胞的TCR序列集合，再将这些序列集合通过丰度排序，进行体外的功能验证，最终获得了本发明请求保护的TCR。实验证明，本发明所提供的表达TCR的T细胞可以有效的识别T2细胞负载的EBV抗原多肽(靶细胞)，并分泌IFN-γ，证明这群T细胞是具有功能的。本发明提供的EBV表位高亲和力T细胞受体具有重要的应用价值。
附图说明
图1为EBV抗原多肽第一轮刺激后的流式检测结果。左图为未经过多肽刺激的T细胞对照组；右图为经过EBV多肽一轮刺激的T细胞。
图2为EBV抗原多肽特异性T细胞Elispot检测结果。左图为EBV多肽刺激的特异性T细胞与抗原(T2+EBV多肽)反应可以有效的分泌INF-γ，右图为无关多肽对照组，不能分泌IFN-γ。
图3为单细胞TCR扩增电泳图，框标记的扩增的TCRα/β目的条带。
图4为TA克隆的菌落PCR电泳图，不同泳道代表扩增的不同阳性单细胞克隆。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下的实施例中所用到的实验试剂物品具体如下：
实验物品：采血管(含ACD抗凝剂)，注射器，离心管，0.2μm滤膜，MS分选柱，磁力架，低吸附六孔板；0.2μm滤膜，达优冻存试剂盒，PCR管。
实验试剂：无菌盐溶液(DPBS)，RPMI1640培养基，Ficoll，AIM-V培养基，无菌超纯水(0.1um滤膜过滤)，MACS running buffer；AIM-V培养基，GM-CSF，IL-4，IFN-γ，LPS，IL-7。抗原呈递beads，AIM-V培养基，IL-21，IL-2，IL-15。无菌盐溶液(PBS)，Human IFN-γELISpot试剂盒(MABTECH)，四聚体(EBV四聚体)。载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为Addgene公司的产品。
实施例1、EBV表位高亲和力T细胞受体全长序列的获得
一、EBV特异性T细胞刺激
1、健康人外周血PBMC分离
1)血样收集于50ml，室温100g、15min离心(ACC 2，DEC2)；
2)分别收上层血浆和下层血细胞，层血浆室温1100g，20min离心，弃沉淀；
3)56℃(30min)灭活后，放于-20℃冷冻层静置15min；
4)室温3800rpm，20min离心，离心后上清即为人血清，取之备用；
5)取DPBS补足下层血细胞加至50ml，上下颠倒混匀；
6)吸取Ficoll 20mL加入到50mL离心管中；
7)在Ficoll上方小心加入混匀后的血样25mL，室温离心；
8)离心结束后，液体分为四层，从上至下分别为血浆层、白膜层、Ficoll层和血细胞层，用巴氏滴管将白膜层小心的吸出，并转移至一个无菌的离心管中；
9)加入3倍体积的1640培养基洗涤吸出的白膜层，并轻轻的吹打数次，室温500g，10min离心，小心的吸去上清，沉淀即为PBMC；
10)加入DNAase消化成团细胞，肉眼判断成单细胞悬液加入5-6ml 4℃MACSrunning buffer终止。
11)将终止后的单细胞悬液加到70μm的细胞筛网上，1-2ml的MACS runningbuffer洗三遍管子和筛网，室温300g，10min离心，重悬后计数。
2、CD8+T细胞分选
1)计数后PBMC按80μl buffer/107细胞加入MACS running buffer重悬，并加入20μl CD8磁珠/107cells，混匀，于4℃孵育15min；
2)孵育结束后加入1-2mL buffer/107cells洗涤；
3)完全吸去上清，PBMC弹散，并加入500μl buffer(0-108total cells)重悬；
4)分选柱置于磁力架上，加入MACS running buffer平衡分选柱。(MS：500μl，LS：3mL)加入细胞悬液，用MACS running buffer洗涤管子和分选柱三次，每次体积同上；
5)将柱子取下，加入1ml MACS running buffer后猛推柱子活塞，推出的液体即为CD8+T细胞，计数后按107/ml冻存；
6)CD8-T细胞(阴性细胞)贴壁取DC细胞(1.5-2h或过夜)。
3、DC负载EBV抗原多肽
1)阴性细胞重悬于5％人血清AIM-V中，铺板；
2)摇晃培养皿使未贴壁细胞重悬于上清中，吸出上清，再加入AIM-V培养基滴洗；
3)贴壁细胞加入DC培养基，48h后补加半量5％人血清AIM-V培养基，24h后用冷的DPBS将细胞吹下来(原培养基与后续加入DPBS吹洗下来的细胞液分开在不同的管子)，并按照12孔板5×105cells，1ml培养基每孔，培养基为5％人血清AIM-V，并加入细胞因子诱导DC细胞成熟，得到成熟的DC细胞。
4)向成熟的DC细胞中加入多肽(EBV抗原多肽，LMP2表位，aa426-aa434，SEQ IDNo.5)，得到体系。该体系中，EBV抗原多肽的浓度为10ug/ml。
5)取步骤4)得到的体系，37℃培养4h，得到负载EBV抗原多肽的DC细胞。
4、负载EBV抗原多肽的DC细胞与CD8+T细胞共培养
1)16h后将负载EBV抗原多肽的DC细胞用冷的DPBS吹打下来与复苏的CD8+T共培养；
2)将CD8+吹洗下来，并用AIM-V培养基吹洗孔板至少3遍，室温400g，5min离心；
3)1ml AIM-V重悬，加入DNAase消化至单细胞悬液0-5min后加入5ml AIM-V终止，室温400g，5min离心；
4)T细胞用5％人血清AIM-V重悬，按6.25×105细胞/cm2铺板。
5)按照比例加入负载EBV抗原多肽的DC细胞，并加入IL-21；
6)72h后加入，每隔2-3天补液或半量换液，并补加细胞因子总体积的IL2，IL-7和IL-15；
7)每隔2-3天，补加细胞因子或换液；
8)培养至第5天时，制备第二轮刺激所用抗原呈递beads：加入等体积硼酸溶液洗两次后等体积重悬，加入CD28和HLA-A2：Ig，4℃摇床过夜。培养至第10天，重悬细胞，取出用于检测和流式分选的细胞数，余下细胞用于进行第二轮共培养。
二、EBV抗原多肽特异性T细胞的单细胞TCR测序
1、加载了EBV表位多肽的HLA-A*02四聚体的合成
四聚体有四个单体连接而成，单个HLA分子蛋白与多肽形成的复合物称为单体，通过生物素-亲和链霉素连接四个单体，形成的四聚体。单体置换指的是单体上的多肽交换的过程，因不同实验需要，需要针对不同的抗原构建四聚体，不同抗原(多肽序列)的置换，称为单体置换。
1)取5μl 10mM EBV表位多肽(LMP2表位，aa426-aa434，SEQ ID No.5)，加入120μlPBS，放置冰上；
2)向U型底部96孔板中加入20μl已稀释目的多肽和HLA-A*02单体，混匀；
3)用锡箔纸封板，反应溶液至板底；
4)UV灯管365nm交联30min，37℃避光孵育30min；
5)取30μl EBV表位多肽置换HLA-A*02单体于新的平板中，加入3.3μl荧光偶联链霉亲和素，冰上放置30min；
6)冰上孵育期间，配制终止液。4℃过夜，冰上避光30min，得到加载了EBV表位多肽的HLA-A*02四聚体(以下简称四聚体)。
2、EBV抗原多肽特异性T细胞流式检测
重悬步骤一4中经过刺激后的细胞并计数，取出用于流式分选的细胞数2×105/管，加入1ml PBS重悬，4℃ 500g，5min离心后，小心弃去上清，加入200μl PBS重悬；向tube中加入步骤1制备的四聚体(10μl/ml)，混匀并4℃反应30min；反应时间结束后，加入1mlPBS重悬，4℃ 500g，5min离心，小心弃去上清，加入200μl PBS重悬，置于冰上用于流式检测；流式上样后，选择阳性群体用于分选单细胞。
EBV抗原多肽第一轮刺激后的流式检测结果如图1所示，可见：相比于对照组(对照组为相同条件下培养，未经过刺激的T细胞)，用EBV抗原多肽抗原刺激后的T细胞可以用四聚体检测出8.9％的阳性肿瘤特异性T细胞。
3、EBV抗原多肽特异性T细胞Elispot检测
准备靶细胞：T2细胞计数，取出所需细胞数量，室温400g，5min离心后，用无血清IMDM培养基重悬。
靶细胞负载EBV抗原多肽：根据取出的细胞数量确定合适的孔板和负载体积，EBV抗原多肽(LMP2表位，aa426-aa434，SEQ ID No.5)配制成10μg/μl，按1000X加入负载体积中，重悬混匀，37℃，5％的CO2孵箱培养4h。同时设置负载无关多肽的对照组。
准备效应细胞(第二轮刺激后的流式筛选出的EBV抗原多肽特异性T细胞)：效应细胞计数，取出所需细胞，室温300g，10min离心后，用5％人血清AIM-V培养基重悬，置于冰上。
洗板：至抗原负载还剩45min时，在超净台中取出Human IFN-γ ELISpot试剂盒中的反应孔板，加入PBS，静置30s后拍掉孔中液体，该动作重复五次后，加入10％FBSRPMI1640培养基100μl/孔，37℃，5％的CO2孵箱孵育30min。
加样：抗原负载时间结束后，用5％人血清AIM-V培养基将孔板中的T2细胞吹洗下来，室温400g，5min离心后，用5％人血清AIM-V培养基重悬。将效应细胞50μl/孔加到反应孔板中后，加入靶细胞悬液50μl/孔，放入37℃，5％的CO2孵箱培养16-48h；培养时间结束后，加入PBS 150μl/孔，静置30s后拍掉孔中液体，该动作重复五次后，用0.5％FBS的PBS(0.2μm滤膜过滤)配制抗人IFN-γ检测抗体溶液(7-b6-1-ALP)。200X加入7-b6-1-ALP抗体并充分混匀0.5％FBS的PBS后，100μl/孔加到反应孔板中，反应板放入37℃，5％的CO2孵箱反应2h；反应时间结束后，加入PBS 150μl/孔，静置30s后拍掉孔中液体，该动作重复五次后，避光加入NBT/BCIP(0.2μm滤膜过滤)100μl/孔到反应孔中，避光显色30s-5min(以观察到阳性对照斑点明显为反应终点)后以大量自来水冲洗，晾干后观察结果。
结果如图2所示。相比于对照组(对照组为EBV特异性T细胞与T2负载的无关多肽反应)，EBV抗原多肽特异性T细胞可以有效的识别T2负载的多肽(靶细胞)，并分泌IFN-γ，证明这群细胞是具有功能的。
4、单细胞TCR测序
所用试剂如表1所示。
表1.单细胞TCR全长测序所需试剂
所用引物序列如表2。
表2.EBV抗原多肽特异性T细胞的单细胞TCR全长测序所需引物
(1)细胞裂解
按照表3配制细胞裂解混合液。
表3.细胞裂解混合液
细胞裂解混合液 体积μl 终浓度
RNase/DNase-free water 1.86
10μM Oligo-dT Primer 1 2.5μM
10mM dNTP 1 2.5mM
40U/μl RNase Inhibitor 0.1 2U/μl
10％Triton X-100 0.04 0.2％
总体积 4
配制时，按样品数110％配制(如有10个细胞样品，则配制11管的量)。配制好的裂解液吹打混匀后分装到洁净PCR管中，4℃ 14000rpm，30s离心(将液滴离心到管底并去除气泡)，冰盒放置，待后续分入细胞；选择阳性群体(即步骤1所得的EBV抗原多肽特异性T细胞)并向装有裂解液的PCR管分入单细胞；分选完毕后，盖好管盖，短时离心，并调试好PCR仪准备进行单细胞裂解。
将0.2ml PCR管置于PCR仪内，72℃，3min孵育(细胞细胞为bulk样本增至5min)，热盖温度为75℃，裂解完成后立即置于冰上1min；10000rpm 4℃离心30s，后立即转至冰上；此步后，所有mRNAs都从单细胞中释放，并且Oligo-dT引物也已与mRNAs结合。
(2)按表4配制逆转录体系。
表4.逆转录体系
成分 体积μl 终浓度
5×SuperScript II 2 1X
5M Betaine 2 1M
100mM MgCl2 0.9 9mM
100mM DTT 0.25 2.5mM
100μM TSO 0.1 1μM
40U/ul RNAse inhibitor 0.25 1U/μL
200U/μl SSII 0.5 10U/μL
总体积 6
配制时，按样品数+0.5个配制(如有9个细胞样品，则配制9.5管的量)。配制好的Mix充分混匀后，依次加入到上步离心管中；
(3)吹打混匀、瞬时离心后，按如表5所示的条件进行逆转录反应(75℃热盖)。
表5.逆转录反应条件
此步后，所有mRNAs的第一链cDNA合成完毕；
(4)按表6配制第一轮PCR Mix。
表6.第一轮PCR Mix
成分 体积μl 终浓度
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 1X
IS PCR Primer(10μM) 1 0.4μM
TCRA-out Primer(10μM) 0.5 0.2μM
TCRB-out Primer(10μM) 0.5 0.2μM
NF-water 0.5
总体积 15
配制时，按样品数+0.5配制(如有9个细胞样品，则配制9.5管的量)。配制好的Mix充分混匀后，依次取15μl加入到上步离心管中，吹打混匀、瞬时离心后，按表7所示条件预扩增。
表7.第一轮PCR预扩增条件
(5)按表8配制第二轮PCR Mix。
表8.第二轮PCR Mix
成分 体积μl 终浓度
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 1X
IS PCR Primer(10μM) 1 0.4μM
TCRA-middle Primer(10μM) 0.5 0.2μM
TCRB-middle Primer(10μM) 0.5 0.2μM
NF-water 9.5
总体积 24
配制时，按样品数+0.5配制(如有9个细胞样品，则配制9.5管的量)。配制好的Mix充分混匀后，依次取24μl加入到上步离心管中，吹打混匀、瞬时离心后，按表9所示条件预扩增。
表9.第二轮PCR预扩增条件
(6)按表10配制第三轮PCR Mix。
表10.第三轮PCR Mix
成分 体积μl 终浓度
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 1X
IS PCR Primer(10μM) 1 0.4μM
TCRA-in Primer(10μM) 0.5 0.2μM
TCRB-in Primer(10μM) 0.5 0.2μM
NF-water 9.5
总体积 24
配制时，按样品数+0.5配制(如有9个细胞样品，则配制9.5管的量)。配制好的Mix充分混匀后，依次取24μl加入到上步离心管中，吹打混匀、瞬时离心后，按表11所示条件预扩增。
表11.第三轮PCR预扩增条件
(7)电泳检测：PCR完成后电泳检测，采用2％琼脂糖凝胶，取15μL产物，加3ulLoading buffer混匀，130V电泳45min，目的条带切胶回收。之后与T载体连接，然后再进行菌落PCR鉴定。
图3为单细胞TCR扩增电泳图；图4为TA克隆的菌落PCR电泳图。图中结果显示，扩增出来的TCR片段与T载体连接成功，通过菌落PCR可以有效的检测出成功构建的插入片段载体。
(8)TA克隆阳性的目的克隆，送sanger测序，获得TCRα/β序列，序列在IMGT数据库进行比对。
三、EBV抗原多肽特异性TCR序列的筛选及功能验证
1、将步骤二获得的EBV抗原多肽特异性T细胞的单细胞TCR序列合集按照丰度由高到低的顺序进行排序，选择丰度高(top3)的序列进行初步的功能验证，以确定最终的用于治疗的TCR全长序列。其中，一个丰度达到3％的功能性配对的TCRα/β序列，找到起始密码子后，根据恒定区(TRAC/TRBC)实际序列进行拼接，形成新序列，α链的完整编码基因的序列为SEQ ID No.1(编码SEQ ID No.3所示α链)，β链的完整编码基因的序列为SEQ ID No.2(编码SEQ ID No.4所示β链)。其中，SEQ ID No.1的第52-381位为α链可变区的编码基因(第127-147位、第199-213位和第316-348位分别为三个CDR的编码基因)，SEQ ID No.2的第58-384位为β链可变区的编码基因(第136-150位、第202-219位和第331-354位分别为三个CDR的编码基因)。α链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第18-127位(第43-49位、第67-71位和第106-116位分别为三个互补决定区)。β链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4的第20-128位(第46-50位、第68-73位和第111-118位分别为三个互补决定区)。
2、将SEQ ID No.1所示的α链的编码基因和SEQ ID No.2所示的β链的编码基因通过P2A肽的基因序列连接后构建到载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中，得到重组病毒载体。该重组病毒载体的结构描述为：向载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的限制性内切酶BamHI和SalI之间插入SEQ ID No.6所示的DNA分子。
3、将步骤2构建的重组病毒载体感染T细胞，然后参照步骤二中3的方法进行Elispot检测。
4、将载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE感染T细胞，然后参照步骤二中3的方法进行Elispot检测(作为对照组)。
结果表明，相比于对照组，重组病毒载体感染的T细胞可以有效的识别T2负载的EBV抗原多肽，并分泌IFN-γ，即可以有效的与靶细胞反应。
工业应用
本发明通过EBV抗原多肽体外刺激特异性T细胞，获得特异性T细胞群体，利用单细胞配对TCR测序技术，获得EBV抗原多肽对应的有效T淋巴细胞的TCR序列集合，再将这些序列集合通过丰度排序，进行体外的功能验证，最终获得了本发明请求保护的TCR。实验证明，本发明所提供的表达TCR的T细胞可以有效的识别T2细胞负载的EBV抗原多肽(靶细胞)，并分泌IFN-γ，证明这群T细胞是具有功能的。有效的全体通过TCR序列集合能够快速验证，比以往的方法可以更全面更有效的信息，这些信息经过体外功能验证、人源化小鼠的功能验证，即可以推向临床，具有极高的临床应用价值。
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> EBV表位高亲和力T细胞受体
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>807
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
atgaggctgg tggcaagagt aactgtgttt ctgacctttg gaactataat tgatgctaag 60
accacccagc ccacctccat ggattgcgct gaaggaagag ctgcaaacct gccttgtaat 120
cactctacca tcagtggaaa tgagtatgtg tattggtatc gacagattca ctcccagggg 180
ccacagtata tcattcatgg tctaaaaaac aatgaaacca atgaaatggc ctctctgatc 240
atcacagaag acagaaagtc cagcaccttg atcctgcccc acgctacgct gagagacact 300
gctgtgtact attgcatcgt cagagtctat gggaacaaca gactcgcttt tgggaagggg 360
aaccaagtgg tggtcatacc aaatatccag aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga 420
gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat 480
gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct agacatgagg 540
tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt 600
gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct tcttccccag cccagaaagt 660
tcctgtgatg tcaagctggt cgagaaaagc tttgaaacag atacgaacct aaactttcaa 720
aacctgtcag tgattgggtt ccgaatcctc ctcctgaaag tggccgggtt taatctgctc 780
atgacgctgc ggctgtggtc cagctag 807
<210>2
<211>924
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>2
atgggccccc agctccttgg ctatgtggtc ctttgccttc taggagcagg ccccctggaa 60
gcccaagtga cccagaaccc aagatacctc atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg 120
acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg 180
ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct 240
gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc 300
agccccaacc agacctctct gtacttctgt gccagcagtt acaatgagca gttcttcggg 360
ccagggacac ggctcaccgt gctagaggac ctgaaaaacg tgttcccacc cgaggtcgct 420
gtgtttgagc catcagaagc agagatctcc cacacccaaa aggccacact ggtgtgcctg 480
gccacaggct tctaccccga ccacgtggag ctgagctggt gggtgaatgg gaaggaggtg 540
cacagtgggg tcagcacaga cccgcagccc ctcaaggagc agcccgccct caatgactcc 600
agatactgcc tgagcagccg cctgagggtc tcggccacct tctggcagaa cccccgcaac 660
cacttccgct gtcaagtcca gttctacggg ctctcggaga atgacgagtg gacccaggat 720
agggccaaac ctgtcaccca gatcgtcagc gccgaggcct ggggtagagc agactgtggc 780
ttcacctccg agtcttacca gcaaggggtc ctgtctgcca ccatcctcta tgagatcttg 840
ctagggaagg ccaccttgta tgccgtgctg gtcagtgccc tcgtgctgat ggccatggtc 900
aagagaaagg attccagagg ctag 924
<210>3
<211>268
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>3
Met Arg Leu Val Ala Arg Val Thr Val Phe Leu Thr Phe Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ile Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Thr Ser Met Asp Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Arg Ala Ala Asn Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Asn Glu
35 40 45
Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile
50 55 60
Ile His Gly Leu Lys Asn Asn Glu Thr Asn Glu Met Ala Ser Leu Ile
65 70 75 80
Ile Thr Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Val Tyr Gly Asn
100 105 110
Asn Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn
115 120 125
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
130 135 140
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
145 150 155 160
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
165 170 175
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
180 185 190
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
195 200 205
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
210 215 220
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210>4
<211>307
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>4
Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr
20 25 30
Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile
85 90 95
Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
130 135 140
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145 150 155 160
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
165 170 175
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
180 185 190
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
195 200 205
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
210 215 220
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
225 230 235 240
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
245 250 255
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
260 265 270
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
275 280 285
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
290 295 300
Ser Arg Gly
305
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>5
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210>6
<211>1794
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>6
atgaggctgg tggcaagagt aactgtgttt ctgacctttg gaactataat tgatgctaag 60
accacccagc ccacctccat ggattgcgct gaaggaagag ctgcaaacct gccttgtaat 120
cactctacca tcagtggaaa tgagtatgtg tattggtatc gacagattca ctcccagggg 180
ccacagtata tcattcatgg tctaaaaaac aatgaaacca atgaaatggc ctctctgatc 240
atcacagaag acagaaagtc cagcaccttg atcctgcccc acgctacgct gagagacact 300
gctgtgtact attgcatcgt cagagtctat gggaacaaca gactcgcttt tgggaagggg 360
aaccaagtgg tggtcatacc aaatatccag aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga 420
gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat 480
gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct agacatgagg 540
tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt 600
gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct tcttccccag cccagaaagt 660
tcctgtgatg tcaagctggt cgagaaaagc tttgaaacag atacgaacct aaactttcaa 720
aacctgtcag tgattgggtt ccgaatcctc ctcctgaaag tggccgggtt taatctgctc 780
atgacgctgc ggctgtggtc cagcggatcc ggagccacca acttcagcct gctgaagcag 840
gccggcgacg tggaggagaa ccccggcccc atgggccccc agctccttgg ctatgtggtc 900
ctttgccttc taggagcagg ccccctggaa gcccaagtga cccagaaccc aagatacctc 960
atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat 1020
atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat 1080
gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag 1140
aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc agccccaacc agacctctct gtacttctgt 1200
gccagcagtt acaatgagca gttcttcggg ccagggacac ggctcaccgt gctagaggac 1260
ctgaaaaacg tgttcccacc cgaggtcgct gtgtttgagc catcagaagc agagatctcc 1320
cacacccaaa aggccacact ggtgtgcctg gccacaggct tctaccccga ccacgtggag 1380
ctgagctggt gggtgaatgg gaaggaggtg cacagtgggg tcagcacaga cccgcagccc 1440
ctcaaggagc agcccgccct caatgactcc agatactgcc tgagcagccg cctgagggtc 1500
tcggccacct tctggcagaa cccccgcaac cacttccgct gtcaagtcca gttctacggg 1560
ctctcggaga atgacgagtg gacccaggat agggccaaac ctgtcaccca gatcgtcagc 1620
gccgaggcct ggggtagagc agactgtggc ttcacctccg agtcttacca gcaaggggtc 1680
ctgtctgcca ccatcctcta tgagatcttg ctagggaagg ccaccttgta tgccgtgctg 1740
gtcagtgccc tcgtgctgat ggccatggtc aagagaaagg attccagagg ctag 1794

Claims (14)

1.一种识别EBV抗原的T细胞受体，包含α链和β链；所述α链的氨基酸序列为SEQ ID No.3；所述β链的氨基酸序列为SEQ ID No. 4。
2.编码权利要求1所述T细胞受体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：编码所述T细胞受体的核酸分子包含编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述编码所述T细胞受体的α链的核酸分子的序列为SEQ ID No.1；所述编码所述T细胞受体的β链的核酸分子的序列为SEQ IDNo. 2。
5.含有权利要求2-4任一所述核酸分子的表达盒、载体或细胞。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于：所述载体为向pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的多克隆位点之间插入编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子，得到的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述载体为向pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的限制性内切酶BamHI和SalI之间插入SEQ ID No.6所示的DNA分子，得到的重组质粒。
8.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细胞为T细胞。
9.具有权利要求1所述T细胞受体的T细胞。
10.感染权利要求5至7任一所述载体的T细胞。
11.含有权利要求5中所述表达盒的药物组合物。
12.含有权利要求5至7中任一所述载体的药物组合物。
13.含有权利要求5或8中所述细胞的药物组合物。
14.含有权利要求9或10所述T细胞的药物组合物。
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