CN102695717A

CN102695717A - T细胞受体

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Publication number: CN102695717A
Application number: CN2010800539712A
Authority: CN
Inventors: H.斯陶斯; S-A.薛; M.托普
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-09-28
Also published as: CN102695717B; IN2012DN02993A; KR101760277B1; WO2011039508A3; JP2016047064A; EP2483294B1; ES2584541T3; EP2483294A2; AU2010302477B2; JP6180114B2; WO2011039508A2; US20120244132A1; GB0917090D0; KR20120074291A; US8889141B2; AU2010302477A1; JP2013505734A

Abstract

本发明提供了T细胞受体(TCR)，通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递时其与来自埃-巴二氏病毒(EBV)的潜伏膜蛋白2(LMP-2)的肽结合，所述肽具有氨基酸序列CLGGLLTMV(SEQ ID No.1)。本发明还提供了编码这种TCR的核苷酸序列，包含这种核苷酸序列的载体，以及其用于产生EBV特异性T细胞的用途。本发明还提供了EBV特异性T细胞用于细胞免疫治疗的用途。

Description

T细胞受体

发明领域

本发明涉及能够识别来自埃-巴二氏病毒(EBV)的抗原的T细胞受体(TCR)。本发明还涉及TCR基因转移以产生EBV特异性T细胞的用途，以及它们用于治疗和/或预防EBV相关疾病的用途。

背景技术

埃-巴二氏病毒(EBV)是疱疹病毒家族成员，其在全世界普遍存在。研究显示所有成年人中高达95%具有针对这种常见病毒的抗体，意味着他们在生命中的一些时间点已被感染。EBV一般在多数受感染的人的一生中持续，并很少引起任何问题。然而在一些情况下，EBV与癌症和严重疾病的形成有关，包括伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌以及移植后淋巴增生疾病，其中所述移植后淋巴增生疾病是在实体器官或造血干细胞移植(HSCT)后的患者中可能发生的一类B细胞淋巴瘤。

因此存在对治疗和/或预防EBV-相关疾病的方法的需求。

附图简述

图1-逆转录病毒载体构建体pMP71-pp65(α-2A-β)-Cys1的图例。

图2-huPBMC的EBV-sVβ-TCR转导。

图3-EBV-sVβ-TCR-X3-CD4-cytk

图4-EBV-sVβ-TCR-X3-CD8-cytk

本发明各方面概述

本发明的发明人开发了治疗和/或预防EBV相关疾病的细胞治疗，其包括应用TCR基因治疗以产生EBV特异性T细胞。

本发明的发明人组装了对EBV的LMP-2蛋白特异性的T细胞受体。他们还构建了包含TCR α和β基因的逆转录病毒载体，并且将其用于转导人T细胞。该细胞显示表达LMP2特异性TCR并且显示出功能性的抗原特异性活性。

因此，在第一个方面，本发明提供了对埃-巴二氏病毒的LMP2蛋白特异性的T细胞受体(TCR)。

该TCR可识别来自LMP-2的表位CLGGLLTMV(SEQ ID No.1)。

当由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递时，该TCR可能能够结合具有氨基酸序列CLGGLLTMV(SEQ ID No.1)的肽。

该TCR的α链和β链各具有三个互补决定区(CDR)。该TCR的α链和β链可具有以下CDR3序列：

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)

或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。

该α链的CDR可具有以下氨基酸序列：

CDR1α-TSDQSYG(SEQ ID No.4)

CDR2α-QGSYDEQ(SEQ ID No.5)

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)

或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。

该β链的CDR可具有以下氨基酸序列：

CDR1β-SSHAT(SEQ ID No.6)

CDR2β-FNYEAQ(SEQ ID No.7)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)

或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。

本发明第一方面的TCR可包含如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，或其具有至少80%氨基酸序列同一性的变体。

本发明第一方面的TCR可在TCR α链/β链分界处包含一个或多个突变，使得当如之前任意权利要求定义的TCR α链和β链在T细胞中表达时，这些链与内源TCR α链和β链之间的错配率减少。

例如，在本发明第一方面的TCR中，α链和β链的恒定区结构域每一个可包含额外的半胱氨酸残基，使得能够在α链和β链之间形成额外的二硫键。

第二方面提供了编码根据本发明第一个方面的TCR的全部或部分的核苷酸序列。

本发明第二方面的第一个实施方案涉及编码根据本发明第一个方面的TCR的α链的核苷酸序列。

该第一个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的碱基1-810，或其具有至少80%序列同一性的变体。

本发明第二方面的第二个实施方案涉及编码根据本发明第一个方面的TCR的β链的核苷酸序列。

该第二个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的碱基886-1812，或其具有至少80%序列同一性的变体。

本发明第二方面的第三个实施方案涉及编码与TCR β链连接的TCR α链的核苷酸序列。

该核苷酸序列可包含通过内部自裂解序列连接的TCR α和β基因。

该第三个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，或其具有至少80%序列同一性的变体。

在第三个方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的载体。该载体例如可以是逆转录病毒载体。

在第四个方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的细胞。该细胞例如可以是T细胞或干细胞。该细胞可从分离自受试者的T细胞衍生。

在第五个方面，本发明提供了产生根据本发明第四方面的细胞的方法，其包括用根据本发明第三方面的载体体外或离体(ex vivo)转导或转染细胞的步骤。

在第六个方面，本发明提供了用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，其包括将EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤，其中该EBV-特异性T细胞通过TCR基因转移制得。

该T细胞包含一个或多个能够编码EBV特异性TCR的异源核苷酸序列。

该TCR可以依照本发明的第一个方面。

该方法可用于治疗或预防EBV相关疾病，诸如EBV阳性霍奇金淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性移植后淋巴增生疾病(PTLD)。

本发明还提供了用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的细胞。

本发明还提供了包含根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的细胞的药物组合物。

本发明还提供了根据本发明第一方面的TCR、根据本发明第二方面的核苷酸序列、根据本发明第三方面的载体、或根据本发明第四方面的细胞在制备用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的药物中的用途。

详述

T-细胞受体

在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过主要组织相容性复合物(MHC)分子携带至细胞表面。T细胞能够识别抗原递呈细胞表面的这种肽:复合物。存在两类不同的MHC分子：MHC I和MHC II，其将来自不同细胞区室的肽递送至细胞表面。

T细胞受体或TCR是存在于T细胞表面的分子，其负责识别与MHC分子结合的抗原。在95%的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5%的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。

TCR与抗原和MHC的啮合导致其T淋巴细胞通过一系列由相关酶、辅助受体和专门的辅助性分子介导的生化事件而活化。

TCR的每一条链都是免疫球蛋白超家族的成员，并且拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)-可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨膜/细胞膜跨越区以及在C端末端的短胞质尾。

TCR α-链和β-链的可变结构域均具有三个高变或互补决定区(CDR)。CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也显示出与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与所述肽的C端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。

TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间产生连接。本发明的TCR可在α链和β链的每一条中具有额外的半胱氨酸氨基，使得该TCR在恒定区中包含两个二硫键(见下)。

该结构使得TCR能够与其他分子结合，所述分子例如在哺乳动物中拥有三种不同链(γ、δ和ε)的CD3和ζ-链。这些辅助分子具有荷负电的跨膜区，并且对于将信号从TCR传导至(propagate into)细胞内是非常重要的。CD3-和ζ-链与TCR一起形成称为T细胞受体复合物的东西。

来自T细胞复合物的信号通过MHC与特异性辅助受体的同时结合而增强。在辅助T细胞中，这一辅助受体是CD4(对II类MHC是特异性的)；而在细胞毒性T细胞中，这一辅助受体是CD8(对I类MHC是特异性的)。辅助受体不仅确保TCR对抗原的特异性，而且还允许延长抗原递呈细胞和T细胞之间的啮合，以及募集细胞内活化的T淋巴细胞的信号传导中牵涉的关键分子(例如，LCK)。

因此术语“T细胞受体”在常规意义上用于表示能够识别当由MHC分子递呈时的肽的分子。该分子可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异质二聚体，或其可以是单链TCR构建体。

本发明还提供了来自此类T细胞受体的α链或β链。

本发明的TCR可以是包含衍生自超过一种物种的序列的杂合TCR。例如，惊讶地发现了鼠科TCR被发现在人T细胞中比人TCR更有效地表达。因此，TCR可包含人可变区和鼠科恒定区。这一方法的缺陷是该鼠科恒定序列可能引发免疫应答，导致对所转移T细胞的排斥。然而，用于准备过继性T细胞治疗的调节方案可能导致足够的免疫抑制，以允许表达鼠科序列的T细胞的植入。

CDR序列

本发明第一方面的TCR包含两条链(α和β)，其各包含三个互补决定区。

T细胞受体的多样性集中于CDR3上，并且这一区域主要负责抗原识别。来自本发明TCR的CDR3区的序列可以是：

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)

或这些序列的具有多至三个氨基酸改变的变体。

α链可包含具有以下氨基酸序列的CDR：

CDR1α-TSDQSYG(SEQ ID No.4)

CDR2α-QGSYDEQ(SEQ ID No.5)

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)。

β链可包含具有以下氨基酸序列的CDR：

CDR1β-SSHAT(SEQ ID No.6)

CDR2β-FNYEAQ(SEQ ID No.7)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)。

该CDR可包含一个或多个“改变”，诸如在给定序列中的取代、添加或缺失，只要该TCR保持了与pp65表位:MHC复合物结合的能力。该改变可包括氨基酸对类似氨基酸的取代(保守取代)。类似氨基酸是具有有着相关性质的侧链部分的氨基酸，如分组在一起那样，例如如下所示：

(i)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、组氨酸

(ii)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸

(iii)不带电极性侧链：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸

(iv)非极性侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。

任何氨基酸改变应当保持或改善结合MHC分子的能力。例如，如果肽能够结合HLA-A*0201等位基因的MHC分子，则优选在该肽位置2的氨基酸(即，从N端起的第二个氨基酸)是亮氨酸或甲硫氨酸，尽管异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苏氨酸也是可容许的。还优选位置9或10的氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，尽管丙氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸也是可容许的。优选的MHC结合基序或其他HLA等位基因公开在Celis等,MolecularImmunology,卷31,1994年12月8日,第1423至1430页中。

本发明第一方面的TCR可包含以下氨基酸序列(SEQ ID No.8)或其具有至少70%、80%、90%或95%氨基酸序列同一性的变体：

EBVa14-p2A-Vb7.7-aa:

MSLSSLLKVV TASLWLGPGI AQKITQTQPG MFVQEKEAVT LDCTYDTSDQ

SYGLFWYKQP SSGEMIFLIY QGSYDEQNAT EGRYSLNFQK ARKSANLVIS

ASQLGDSAMY FCAMREGSGS ARQLTFGSGT QLTVLPDIQN PEPAVYQLKD

PRSQDSTLCL FTDFDSQINV PKTMESGTFI TDKCVLDMKA MDSKSNGAIA

WSNQTSFTCQ DIFKETNATY PSSDVPCDAT LTEKSFETDM NLNFQNLSVM

GLRILLLKVA GFNLLMTLRL WSSGSGATNF SLLKQAGDVE ENPGPMGTSL

LCWVVLGFLG TDHTGAGVSQ SPRYKVTKRG QDVTLRCDPI SSHATLYWYQ

QALGQGPEFL TYFNYEAQPD KSGLPSDRFS AERPEGSIST LTIQRTEQRD

SAMYRCASSL GPAGIQETQY FGPGTRLLVL EDLRNVTPPK VSLFEPSKAE

IANKQKATLV CLARGFFPDH VELSWWVNGK EVHSGVCTDP QAYKESNYSY

CLSSRLRVSA TFWHNPRNHF RCQVQFHGLS EEDKWPEGSP KPVTQNISAE

AWGRADCGIT SASYHQGVLS ATILYEILLG KATLYAVLVS GLVLMAMVKK

KNS●

蓝色：恒定序列

红色：链间二硫键的半胱氨酸分子

粉红色：2A序列

黑色：可变序列

带下划线的为CDR1、2和3区域。

变体序列可包含氨基酸添加、缺失和/或插入。变化可集中在一个或多个区域，诸如α或β链的恒定区、接头或框架区，或者它们可遍布在分子中。

可通过肉眼进行同一性比较，或更普遍地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的%同一性。

%同一性可在连续的序列上进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并将一个序列上的每一个氨基酸与另一序列上相应的氨基酸直接进行比较，一次一个残基。这称为“无空位(ungapped)”比对。通常，这种无空位比对仅在相对短数量的残基上进行。

尽管这是一个非常简单且始终如一的方法，但其未能考虑到，例如，在本来相同的一对序列中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基无法对齐，从而当进行全局比对时将可能导致%同源性的大幅下降。因此，多数序列比较方法均被设计成产生最佳比对，将可能的插入和缺失考虑在内，而不会过分地降低(penalise)总同源性得分。这通过在序列比对中插入“空位”从而试图最大化局部同源性而实现。

然而，这些更复杂的方法给比对中发生的每一空位指定“空位罚分”，使得对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对—反映了两个所比较序列间更高的相关度—将得到比具有许多空位的比对更高的得分。通常使用“仿射空位损失”，其使空位的存在付出相对更高的代价，而使在该空位中每一个随后的残基付出更小的罚分。这是最常用的空位打分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化比对。多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用此类软件用于序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的缺省空位罚分是：空位-12，每一个延伸-4。

因此，计算最大%同一性首先需要产生将空位罚分考虑在内的最佳比对。用于进行该比对的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(Universityof Wisconsin,U.S.A.;Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等,1999ibid-第18章)、FASTA(Atschul等,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等,1999ibid,第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。BLAST 2 Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50;FEMS Microbiol Lett 1999177(1):187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。

该序列还可具有产生沉默改变及导致功能等价物质的氨基酸残基缺失、插入或取代。可在残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质类似的基础上进行蓄意的氨基酸取代，只要该物质的次级结合活性得以保持。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有不带电极性头基团、具有类似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

例如可根据下表进行保守取代。第二列相同区块中以及优选在第三列相同行中的氨基酸可彼此取代。

本发明还包括可发生同源取代(取代和替换在本文中均用于表示现存氨基酸残基与另一残基的互换)，即类似-对-类似取代，诸如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可发生非同源取代，即从一类残基取代为另一类残基，或备选地涉及包括非天然氨基酸，诸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

LMP-2

本发明第一个方面涉及特异性结合EBV潜伏膜蛋白2(LMP-2)的TCR。LMP-2是指两种与埃-巴二氏病毒相关的病毒蛋白，LMP-2A和LMP-2B。

LMP-2A/LMP-2B是发挥阻断酪氨酸激酶信号传导作用的跨膜蛋白。据信它们发挥作用以抑制病毒裂解周期的活化。

LMP-2A具有以下给出的序列：

1 mgslemvpmg agppspggdp dgddggnnsq ypsasgssgn tptppndeer esneeppppy

61 edpywgngdr hsdyqplgtq dqslylglqh dgndglpppp ysprddssqh iyeeagrgsm

121 npvclpviva pylfwlaaia ascftasvst vvtatglals llllaavass yaaaqrkllt

181 pvtvltavvt ffaicltwri edppfnsllf allaaagglq giyvlvmlvl lilayrrrwr

241 rltvcggimf lacvlvlivd avlqlspllg avtvvsmtll llafvlwlss pgglgtlgaa

301 lltlaaalal laslilgtln lttmfllmll wtlvvllics scsscplski llarlflyal

361 allllasali aggsilqtnf kslsstefip nlfcmllliv agilfilail tewgsgnrty

421 gpvfmclggl ltmvagavwl tvmtntllsa wiltagflif ligfalfgvi rccryccyyc

481 ltleseerpp tpyrntv

LMP-2B具有以下给出的序列：

1 mnpvclpviv apylfwlaai aascftasvs tvvtatglal sllllaavas syaaaqrkll

61 tpvtvltavv tffaicltwr iedppfnsll fallaaaggl qgiyvlvmlv llilayrrrw

121 rrltvcggim flacvlvliv davlqlspll gavtvvsmtl lllafvlwls spgglgtlga

181 alltlaaala llaslilgtl nlttmfllml lwtlvvllic sscsscplsk illarlflya

241 lallllasal iaggsilqtn fkslsstefi pnlfcmllli vagilfilai ltewgsgnrt

301 ygpvfmclgg lltmvagavw ltvmtntlls awiltagfli fligfalfgv irccryccyy

361 cltleseerp ptpyrntv

由本发明第一方面的T细胞受体识别的肽CLGGLLTMV在各个序列中以红色给出。

TCR可识别这一序列的全部或部分。TCR可识别与一个或多个(例如多至5个)上游或下游氨基酸一起的这一序列的一部分。TCR可识别以下序列GPVFMCLGGLTMVAGAVW的全部或部分。

主要组织相容性复合物(MHC)分子

TCR结合作为肽:MHC复合物的肽。

MHC分子可以是I类MHC或II类MHC分子。该复合物可在抗原递呈细胞(诸如树突状细胞或B细胞)的表面，或其可通过例如包被在珠或板上而被固定。

人白细胞抗原系统(HLA)是人的主要组织相容性复合物(MHC)的名称，并且包括I类HLA抗原(A、B&C)和II类HLA抗原(DP、DQ&DR)。

减少错配

本发明第一个方面的TCR可在T细胞中表达，以改变其抗原特异性。TCR转导的T细胞表达至少两条TCR α和两条TCR β链。尽管内源TCRα/β链形成自身耐受的受体，但引入的TCR α/β链形成对给定靶抗原具有确定特异性的受体。

然而，可能发生内源的和引入的链之间的错误配对从而形成新的受体，其可能表现出意外的对自身抗原的特异性，并且当转化至患者时引起自身免疫损伤。

因此，开发了多种策略以降低内源的和引入的TCR链之间错误配对的风险。TCRα/β交界处的突变是当前应用于减少不想要的错误配对的一种策略。

例如，在α和β链的恒定结构域中引入额外的半胱氨酸，使得形成额外的二硫键，并增强引入的链的配对而减少与野生型链的错误配对。

因此本发明的TCR可在α链和β链中包含额外的半胱氨酸，其在两条链之间形成额外的二硫键，使得总共有两个二硫键。

在上文“CDR序列”一节中显示的氨基酸序列中，额外的半胱氨酸以红色示出。

核苷酸序列

本发明的第二个方面涉及编码本发明第一方面的TCR受体或其部分的核苷酸序列，所述部分诸如是一个或多个CDR；α链或β链的可变序列；α链和/或β链。

该核苷酸序列可以是双链或单链的，并且可以是RNA或DNA。

该核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的。这种密码子偏好与细胞类型中特定tRNA的相对丰度相对应。通过改变序列中的密码子，从而将它们特制成与相应tRNA的相对丰富相匹配，能够增加表达。

包括HIV和其他慢病毒在内的许多病毒使用大量的稀有密码子，而通过将这些变成以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现哺乳动物生产细胞中包装成分的升高表达。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域公知的。

密码子优化还可包括移除mRNA不稳定基序和隐藏的剪接位点。

本发明第二方面的核苷酸序列可包含以下序列(SEQ ID No.9)的全部或部分，或其具有至少70%、80%、90%或95%氨基酸序列同一性的变体：

EBVa14-p2A-Vb7.7-编码seq:

ATGTCACTTT CTAGCCTGCT GAAGGTGGTC ACAGCTTCAC TGTGGCTAGG

ACCTGGCATT GCCCAGAAGA TAACTCAAAC CCAACCAGGA ATGTTCGTGC

AGGAAAAGGA GGCTGTGACT CTGGACTGCA CATATGACAC CAGTGATCAA

AGTTATGGTC TCTTCTGGTA CAAGCAGCCC AGCAGTGGGG AAATGATTTT

TCTTATTTAT CAGGGGTCTT ATGACGAGCA AAATGCAACA GAAGGTCGCT

ACTCATTGAA TTTCCAGAAG GCAAGAAAAT CCGCCAACCT TGTCATCTCC

GCTTCACAAC TGGGGGACTC AGCAATGTAT TTCTGTGCAA TGAGAGAGGG

TTCTGGTTCT GCAAGGCAAC TGACCTTTGG ATCTGGGACA CAATTGACTG

TTTTACCTGA TATCCAGAAC CCTGAGCCCG CGGTGTACCA GCTGAAGGAC

CCCAGAAGCC AGGACAGCAC CCTGTGCCTG TTCACCGACT TCGACAGCCA

GATCAACGTG CCCAAGACAA TGGAAAGCGG CACCTTCATC ACCGACAAGT

GCGTGCTGGA CATGAAGGCT ATGGACAGCA AGAGCAACGG CGCCATCGCC

TGGTCCAACC AGACCTCCTT CACATGCCAA GACATCTTCA AAGAGACCAA

CGCCACCTAC CCCAGCAGCG ACGTGCCCTG CGATGCCACT CTCACCGAGA

AGAGCTTCGA GACCGACATG AACCTGAACT TCCAGAACCT GAGCGTGATG

GGCCTGAGAA TCCTGCTCCT GAAAGTGGCC GGCTTCAACC TGCTGATGAC

CCTGCGGCTC TGGAGTTCTG GCAGCGGCGC TACCAACTTC AGCCTGCTGA

AGCAGGCCGG CGACGTGGAG GAAAACCCTG GCCCCATGGG TACCAGTCTC

CTATGCTGGG TGGTCCTGGG TTTCCTAGGG ACAGATCACA CAGGTGCTGG

AGTCTCCCAG TCTCCCAGGT ACAAAGTCAC AAAGAGGGGA CAGGATGTAA

CTCTCAGGTG TGATCCAATT TCGAGTCATG CAACCCTTTA TTGGTATCAA

CAGGCCCTGG GGCAGGGCCC AGAGTTTCTG ACTTACTTCA ATTATGAAGC

TCAACCAGAC AAATCAGGGC TGCCCAGTGA TCGGTTCTCT GCAGAGAGGC

CTGAGGGATC CATCTCCACT CTGACGATTC AGCGCACAGA GCAGCGGGAC

TCAGCCATGT ATCGCTGTGC TAGCAGCTTA GGTCCCGCAG GGATCCAAGA

GACCCAGTAC TTCGGGCCAG GCACGCGGCT CCTGGTGCTC GAGGACCTGC

GGAACGTGAC CCCCCCCAAG GTGTCCCTGT TCGAGCCCAG CAAGGCCGAG

ATCGCCAACA AGCAGAAAGC CACACTGGTC TGTCTGGCTA GGGGCTTCTT

CCCCGACCAC GTGGAGCTGT CTTGGTGGGT CAACGGCAAA GAAGTCCATA

GCGGCGTCTG CACCGACCCT CAGGCTTACA AAGAGAGCAA CTACTCCTAC

TGCCTGAGCA GCCGGCTGAG AGTGAGCGCC ACCTTCTGGC ACAACCCCCG

GAACCACTTC CGGTGCCAGG TGCAGTTCCA CGGCCTGAGC GAAGAGGACA

AGTGGCCTGA GGGCTCCCCC AAGCCCGTGA CCCAGAACAT CAGCGCCGAG

GCCTGGGGCA GAGCCGACTG CGGCATCACC AGCGCCAGCT ACCACCAGGG

CGTGCTGTCC GCCACCATCC TGTACGAGAT CCTGCTGGGC AAGGCCACAC

TGTACGCCGT GCTGGTGTCC GGCCTGGTCC TGATGGCTAT GGTGAAGAAG

AAGAACAGCT GA

该核苷酸序列可包含上述序列的编码一个或多个CDR的部分，或其具有至少70%、80%、90%或95%氨基酸序列同一性的变体，这些部分是以下SEQ ID No.9的部分：

CDR1α:139-159

CDR2α:211-231

CDR3α:331-411

CDR1β:1021-1035

CDR2β:1087-1104

CDR3β:1219-1290

该核苷酸序列可包含上述序列的编码一个或多个可变区的部分，或其具有至少70%、80%、90%或95%氨基酸序列同一性的变体，这些部分是：

Vα:1-411

Vβ:886-1290

该核苷酸序列可包含上述序列的编码α链和/或β链的部分，或其具有至少70%、80%、90%或95%氨基酸序列同一性的变体，这些部分是：

α-1-810

β-886-1812。

变体序列可具有一个或多个碱基的添加、缺失或取代。如果改变包括添加或缺失，它们可以以三个发生或是平衡的(即，每一缺失均有一个添加)，从而使得该改变不会造成剩余序列翻译的移码。

一些或所有的改变可以是“沉默的”，意味着由于蛋白质编码的简并性它们不会影响编码蛋白的序列。

一些或所有的改变可以产生如上面所解释的保守氨基酸取代。改变可以集中于一个或多个区域，诸如编码α链或β链的恒定区、接头或框架区的区域，或它们可遍布在分子上。

变体序列应当保留编码结合CLGGLLTMV:MHC复合物的序列的全部或部分的能力。

载体

本发明还提供了包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的载体。

术语“载体”包括表达载体，即能够在体内或在体外/离体表达的构建体。

病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。

逆转录病毒是RNA病毒，其具有与裂性病毒(lytic virus)不同的生命周期。在这点上，逆转录病毒是通过DNA中间体复制的传染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组通过逆转录酶被转化为DNA形式。该DNA拷贝充当模板用于产生新RNA基因组、以及组装传染性病毒颗粒所需的病毒编码蛋白。

有许多逆转录病毒，例如鼠科白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞增生病毒29(MC29)、以及禽骨髓成红细胞增多症病毒(avian erythroblastosis virus;AEV)，以及所有其他逆转录病毒科，包括慢病毒。

逆转录病毒的详细列表可在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold SpringHarbour Laboratory Press编辑:JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus pp758-763)中找到。

慢病毒也属于逆转录病毒科，但它们可感染分裂细胞和非分裂细胞(Lewis等(1992)EMBO J.3053-3058)。

载体可能能将根据本发明第二方面的核苷酸转移至细胞中，诸如T细胞中，使得该细胞表达EBV-特异性的TCR。理想情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平表达，使得引入的TCR可成功地与内源TCR竞争有限的CD3分子池。

载体可以是逆转录病毒载体。该载体可基于或可衍生自MP71载体骨架。该载体可缺乏土拨鼠肝炎反应元件(Woodchuck Hepatitis Response Element，WPRE)的全长或截短版本。

为有效感染人细胞，病毒颗粒可以可用双嗜性包膜或长臂猿白血病病毒包膜进行包装。

增加CD3分子供应可增加基因修饰细胞中的TCR表达。因此该载体还可包含CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε和/或CD3-ζ的基因。该载体可仅包含CD3-ζ的基因。所述基因可通过自裂解序列连接，诸如2A自裂解序列。备选地，可提供一个或多个编码CD3基因的单独的载体用于与TCR-编码载体共转移。

细胞

本发明第四方面涉及包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的细胞。该细胞可表达本发明第一方面的T-细胞受体。

该细胞可以是T细胞。该细胞可衍生自从受试者分离的T细胞。该T细胞可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。PBL群中的T细胞可通过本领域公知的方法进行活化，诸如应用抗-CD3和CD28抗体。

T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。多克隆活化，例如应用任选地与抗CD28抗体组合的抗-CD3抗体，将引发CD4+和CD8+T细胞的增殖，但还可引发CD4+25+调节性T细胞的增殖。TCR基因转移至调节性T细胞中是不期望的，因为它们可能抑制基因修饰的细胞毒和辅助T细胞的抗病毒活性。因此可在TCR基因转移之前除去CD4+25+群。

本发明还提供了产生根据本发明第四方面的细胞的方法，其包括用根据本发明第三方面的载体体外或离体转染或转导细胞的步骤。

该细胞可从待过继性转移该遗传修饰的细胞的受试者中分离。在这一方面，该细胞可通过从受试者中分离T细胞、任选地活化该T细胞、离体转移TCR基因，并随后通过过继性转移该TCR-转导的细胞而免疫治疗受试者而制得。

备选地，该细胞可从不同的受试者分离，使得其为同种异体的。该细胞可分离自供体受试者。例如，如果该受试者在进行同种异体造血干细胞移植(Allo-HSCT)，则该细胞可源自获得该HSC的供体。如果该受试者在进行或已进行实体器官移植，则该细胞可源自获得该实体器官的受试者。

备选地，该细胞可以是、或衍生自干细胞，诸如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3表达的启动将导致在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR。

这一方法的优点是成熟T细胞一旦产生，其仅表达引入的TCR，而表达很少的或不表达内源TCR链，因为引入的TCR链的表达抑制了内源TCR基因片段重排形成功能性TCRα和β基因。

其他的益处是，基因修饰的干细胞是具有期望的抗原特异性的成熟T细胞的持续来源。因此该细胞可以是基因修饰的干细胞，其分化后产生表达本发明第一方面的TCR的T细胞。本发明还提供了通过诱导包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的干细胞分化，从而产生表达本发明第一方面的TCR的T细胞的方法。

干细胞方法的缺陷是T细胞在胸腺中发育期间，具有期望的特异性的TCR可能会被缺失掉，或当在周围T细胞中表达时可能诱导耐受性。另一个可能的问题是干细胞中插入诱变的风险。

EBV-相关疾病

本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，其包括过继性转移EBV特异性T细胞至该受试者的步骤。

该EBV特异性T细胞可识别LMP-2蛋白。该EBV特异性T细胞可识别表位CLGGLLTMV。

术语“预防”试图指避免、延缓、阻抗或阻碍疾病的感染。该治疗例如可以预防或降低EBV感染的可能性。

本文所使用的“治疗”是指照顾生病的受试者，以便于改善、治愈或减少疾病的症状，或减少或阻止疾病的进展。其还指使得受病毒感染的受试者对其他受试者无感染性的治疗。该治疗还减少EBV病毒载量。

EBV特异性T细胞可用于治疗任何其中表达LMP-2的EBV相关病症。

例如，EBV特异性T细胞可用于管理EBV阳性霍奇金淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性移植后淋巴增生病(PTLD)。PTLD发生在实体器官移植(肾、心脏、肺、肝)之后以及同种异体HSCT之后。

伯基特氏淋巴瘤是赤道非洲的最常见儿童恶性肿瘤。肿瘤典型地位于颌中。遗传研究已显示在赤道非洲(在这里超过95%的儿童在3岁时已感染EBV)，绝大多数伯基特氏淋巴瘤源自EBV感染的淋巴细胞。

伯基特氏淋巴瘤的特征是疾病从一个淋巴结群扩散至另一个的级数扩散，以及随着疾病进展的全身症状的发展。在某些地理区域和患者人群中，在高至50%的伯基特氏淋巴瘤病例中发现了EBV遗传材料。

鼻咽癌是南中国最常见的癌症之一。其起源于鼻咽，即咽或“喉咙”的最上部区域，在这一鼻道和耳咽管连接上呼吸道的剩余部分。

移植后淋巴增生病(PTLD)是指可能在器官移植后的人中形成的一类状况。EBV病毒与大多数PTLD病例有牵连。表现形式可以是不同的，从血流中淋巴细胞数量的增加到血细胞恶性生长，诸如B细胞淋巴瘤。

PTLD是感染埃-巴二氏病毒后B淋巴细胞的不受控增殖。

在预防或治疗移植排斥中通过应用抗T细胞抗体去除T细胞进一步增加了形成移植后淋巴增生病的风险。

多克隆PTLD可形成肿瘤块，并且由于块效果而呈现症状，例如肠梗阻症状。单克隆形式的PTLD倾向于形成散布的恶性淋巴瘤。

PTLD可自发退行减少，或停止免疫抑制药物，并且还可以通过增加抗病毒治疗而治疗。

造血干细胞移植(HSCT)是移植衍生自骨髓或血液的血液干细胞。干细胞移植最经常对患有血液疾病、骨髓疾病或某些类型的癌症的患者进行。

由于可利用干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF，现在多数造血干细胞移植方法应用收集自外周血的干细胞，而非收集自骨髓的干细胞进行。收集外周血干细胞提供了更大的移植，不需要供体进行全身麻醉以收集移植物，导致更短的移植时间，以及可提供更低的长期复发率。

造血干细胞移植仍然是有风险的方法，具有许多可能的并发症；其传统上给患者留下了威胁生命的疾病。尽管偶尔在非恶性和非血液性疾病(诸如严重致残自生免疫疾病和心血管疾病)中实验性地使用，但出现致命综合症的风险太高而不能得到更宽的接受度。

许多HSCT的接受者是多发性骨髓瘤或白血病患者，其不能获益于应用化疗的延长治疗，或已经对化疗有抗性。HSCT的候选者包括儿科病例，其中该患者具有天生的缺陷，诸如具有缺陷性干细胞的重度联合免疫缺陷或先天性嗜中性白细胞减少症，以及还有出生后丧失其干细胞的患再生障碍性贫血的儿童或成人。其他用干细胞移植治疗的病症包括镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤因氏肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和霍奇金病。最近开发了非去髓性(non-myeloablative)或所谓的“小型移植”的方法，其需要更少剂量的预备化疗或放射。这允许在否则会被认为太虚弱而不能经受住常规治疗方案的年老或其他患者中进行HSCT。

除了高度免疫抑制(或T细胞缺失)之外，还开发了降低强度的调节性Allo-HSCT。这些方法减少了在患有更多并存病(co-morbidity)的年老患者中移植的毒性。

同种异体HSCT涉及两个人：(健康的)供体和(患病的)接受者。同种异体HSC供体必须具有与接受者匹配的组织(HLA)型。基于在(HLA)基因的三个或更多个基因座上的变异性进行匹配，且在这些基因座上的精确匹配是优选的。即使在这些重要等位基因上存在良好匹配，接受者也需要免疫抑制药物以减轻移植物抗宿主疾病。同种异体移植供体可以是亲属(通常是HLA严密匹配的同胞(a closely HLA matched sibling))、同系基因型的(患者的同卵或“相同”的双胞胎-必然极端稀有，因为很少患者具有相同的双胞胎，而是提供精确HLA匹配的干细胞来源)或无亲属关系的(无亲属关系但发现具有非常接近的HLA匹配程度的供体)。约25至30%的同种异体HSCT接受者具有HLA-相同的同胞。同种异体移植还应用脐带血作为干细胞来源。一般地，通过移植健康的干细胞至接受者的免疫系统，一旦分辨出即刻的移植相关并发症，则同种异体HSCT表现出改进治愈或长期缓解的可能性。

该受试者可以是人受试者。具体而言，该受试者可以是移植接受者。

本发明现将通过实施例的方式进一步描述，所述实施例用于帮助本领域技术人员实施本发明，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1-构建递送EBV-特异性TCR基因的逆转录病毒载体

TCR基因治疗的一个重要问题是选择能够在T淋巴细胞中持续高水平表达的载体。需要高水平的表达以允许引入的TCR与内源TCR竞争有限的CD3分子池。TCR基因治疗的其他需求是(i)在最小离体操作的情况下高至30%的转导效率，(ii)不存在能够复制的载体，以及(iii)在时间上稳定的TCR表达以允许记忆形成。

在这一研究中，使用了MP71载体骨架和密码子优化的TCR序列以及在每一α和β链恒定区的额外半胱氨酸，以增强基因表达和最小化与内源TCR链的错误配对。MP71载体骨架已在之前得以描述(Hildigner等(1999)J.Virol.73:4083-4089)。MP71载体的LTR衍生自骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，并且前导序列(LS)衍生自小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)。设计了前导序列以增加载体在临床应用中的安全性。移除了所有的ATG密码子以减少可能的蛋白/肽产生的风险，以及降低与内源逆转录病毒序列的同源重组的可能性。通过前导序列3’端的最小剪接受体位点增强插入到MP71的基因的表达。原始MP71载体含有全长土拨鼠肝炎反应元件(Woodchuck Hepatitis ResponseElement，WPRE)，以提高基因在转录后水平的表达。在德国，含有具突变ATG密码子的截短WPRE的MP71载体当前在HIV患者中应用基因修饰的T细胞的临床实验中得以使用。

本发明的发明人进一步改进了MP71载体，并且测试了没有任何WPRE序列的变体。该载体包含通过内部自裂解猪捷申病毒(teschovirus)2A序列连接的EBV TCR α和β基因，如图1所示。该α和βTCR基因基于EBV LMP-2-特异性CTL克隆所使用的优势TCR合成。TCRα-2A-β产物的氨基酸序列在SEQ ID No.8中给出，并且其编码序列在SEQ ID No.9中给出。

实施例2–产生EBV LMP-2-特异性TCR转导的人T细胞

通过使用携带有期望TCR基因的逆转录载体将对EBV特异性的人T细胞受体(TCR)基因转导至人T细胞中。简而言之，通过应用磷酸钙沉淀法用指定的TCR逆转录载体转染表达逆转录病毒gag-pol基因的双嗜性包装细胞。逆转录病毒转染后，将转染培养基更换为人T细胞培养基，用于收集逆转录病毒上清液。然后将收集的含有表达期望TCR基因的病毒颗粒的逆转录病毒上清液用于感染/转导活化的人T细胞。24小时后，引入的TCR基因在经转导的T细胞表面表达，并可通过FACS染色检测。

LMP-2-特异性TCR的逆转录病毒转移导致在受体T细胞表面上表达TCR，如通过肽/MHC四聚体染色以及抗-Vβ13抗体染色所确定的那样(图2)。

实施例3-TCR转导的T细胞的细胞内细胞因子染色

为证实功能性抗原特异性活性，本发明的发明人进行了抗原特异性刺激以及细胞内细胞因子染色测定法。

在200ml含1mg/ml布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich)的培养基中用2x10⁵个包被有100mM相关(pCLG:CLGGLLTMV)或无关(pNLV:NLVPMVATV)肽的T2刺激子细胞温育TCR转导的T细胞(2x10⁵)。在37℃、5% CO₂下温育18小时后，首先针对表面CD8和CD4染色该细胞，然后固定，透化，并且应用Fix&Perm试剂盒(Caltag)根据生产商的说明对细胞内IFNg、IL2和TNFa染色。在LSR II流式细胞仪上获得样本，并应用FACSDiva软件(BDBiosciences)分析数据。

结果显示于图3和4。

在上面说明书中提及的所有公开物通过引用引入本文。本发明的所述方法和系统的各种修改和变形对本领域技术人员是显而易见的，不会背离本发明的范围和精神。尽管本发明已结合特定优选的实施方案进行了描述，应当理解如权利要求所要求的本发明不会不正当地限定至此类具体实施方案。实际上，所描述的实施本发明的方式的对分子生物学或相关领域技术人员而言显而易见的各种修改也在以下权利要求的范围之内。

Claims

1.T细胞受体(TCR)，其当通过主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递时与来自埃-巴二氏病毒(EBV)的潜伏膜蛋白2(LMP-2)的肽特异性结合，所述肽具有氨基酸序列CLGGLLTMV(SEQ ID No.1)。

2.权利要求1的TCR，其包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，并且每一CDR3的序列如下：

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)

或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。

3.权利要求2的TCR，其中所述α链包含具有以下氨基酸序列的三个互补决定区(CDR)：

CDR1α-TSDQSYG(SEQ ID No.4)

CDR2α-QGSYDEQ(SEQ ID No.5)

CDR3α-FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No.2)

并且其中所述β链包含具有以下氨基酸序列的三个互补决定区(CDR)：

CDR1β-SSHAT(SEQ ID No.6)

CDR2β-FNYEAQ(SEQ ID No.7)

CDR3β-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No.3)

或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。

4.前述任一项权利要求的TCR，其包含如SEQ ID No.8显示的氨基酸序列，或其具有至少80%氨基酸序列同一性的变体。

5.前述任一项权利要求的TCR，其在TCRα链/β链交界处包含一个或多个突变，使得当如前述任意一项权利要求定义的TCRα链和β链在T细胞中表达时，这些链和内源TCRα链和β链之间的错配频率降低。

6.权利要求5的TCR，其中所述α链和β链的恒定区结构域各包含额外的半胱氨酸残基，使得能够在α链和β链之间形成额外的二硫键。

7.编码前述任一项权利要求的TCR的α链的核苷酸序列。

8.权利要求7的核苷酸序列，其包含SEQ ID No.9的碱基1-810，或其具有至少80%序列同一性的变体。

9.编码权利要求1-6任一项的TCR的β链的核苷酸序列。

10.权利要求9的核苷酸序列，其包含SEQ ID No.9的碱基886-1812，或其具有至少80%序列同一性的变体。

11.权利要求7和9的核苷酸序列，其编码与TCRβ链连接的TCRα链。

12.权利要求11的核苷酸序列，其包含通过内部自裂解序列连接的TCRα和β基因。

13.权利要求12的核苷酸序列，其具有SEQ ID No.9所示序列，或其具有至少80%序列同一性的变体。

14.包含权利要求7-13任一项的核苷酸序列的载体。

15.包含权利要求7-13任一项的核苷酸序列的细胞。

16.权利要求14或15的细胞，其为T细胞或干细胞。

17.权利要求16的细胞，其从分离自受试者的T细胞衍生。

18.产生权利要求15-17任一项的细胞的方法，其包括用根据权利要求10的载体体外或离体转导细胞的步骤。

19.用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，其包括将EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤，其中所述EBV-特异性T细胞通过TCR基因转移制得。

20.权利要求19的方法，其包括将权利要求15-17任一项的EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤。

21.权利要求19或20的方法，用于治疗或预防EBV阳性霍奇金淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性移植后淋巴增生病(PTLD)。

22.权利要求14的载体或权利要求15-17任一项的细胞，其用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的用途。

23.包含权利要求14的载体或权利要求15-17任一项的细胞的药物组合物。