CN104797711B - 抗原特异性辅助性t细胞受体基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及编码对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR‑α链和TCR‑β链基因中的CDR3的多核苷酸，所述WT1辅助肽具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列。本发明还涉及由所述多核苷酸编码的肽。本发明还涉及已导入含有所述多核苷酸的TCR基因的CD4+T细胞、使用CD4+T细胞诱导WT1特异性细胞毒性T‑淋巴细胞(CTL)、癌症的治疗等。
Description
技术领域
本发明涉及癌抗原特异性辅助性T细胞的T细胞受体(TCR)基因中所包含的多核苷酸。具体地说，本发明涉及编码对具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列的WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的各个α链和β链的互补决定区3 (CDR3)的多核苷酸。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。此外，本发明涉及含有这些多核苷酸的TCR基因所导入的CD4+ T细胞，使用所述细胞诱导并加强WT1特异性细胞毒性T细胞(WT1特异性CTL)和使用所述细胞治疗癌症等等。
背景技术
WT1基因(维尔姆斯瘤1基因)是一种被鉴定为造成维尔姆斯瘤的的基因的基团，维尔姆斯瘤是儿童期肾癌(非专利文件1和2)。WT1是一种具有锌指结构的转录因子。最初，WT1基因被认为是肿瘤抑制基因。然而，随后的研究(非专利文件3、4、5和6)表明，WT1基因倒不如说在血液肿瘤和实体癌中起癌基因的作用。
已表明，肽特异性细胞毒性T细胞(CTL)通过使用WT1肽体外刺激外周单核细胞而被诱导，而这些CTL损害内源性表达WT1的血液肿瘤和实体癌中的肿瘤细胞和癌细胞。因为CTL识别呈复合体形式(其中WT1肽与MHC I类分子结合)的WT1肽，所以这类WT1肽因MHC I类亚型而不同(专利文件1、非专利文件7、专利文件2、3和4)。
对癌抗原有特异性的辅助性T细胞的存在对有效诱导CTL是重要的(非专利文件8)。辅助性T细胞通过识别抗原呈递细胞上的MHC II类分子和抗原肽的复合体而被诱导和激活。激活的辅助性T细胞产生例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等细胞因子或干扰素，并有助于B细胞的增殖、分化和成熟。激活的辅助性T细胞还具有促进T细胞的其它亚型(例如Tc细胞)的增殖、分化和成熟的功能。这样一来，由于激活的辅助性T细胞通过促进B细胞和T细胞的增殖和活化而具有激活免疫系统的功能，因此认为通过MHC II类结合抗原肽(辅助肽)提高癌疫苗的作用来提高辅助性T细胞的功能可用于癌症免疫疗法(非专利文件9)。
目前公认的与WT1有关的辅助肽的实例为与HLA-DRB1*04:01分子结合的肽(非专利文件10)；与HLA-DRB1*04:05分子结合的肽、与HLA-DRB1*15:02分子结合的肽(专利文件5)；与HLA-DRB1*04:05分子、HLA-DRB1*15:02分子、HLA-DRB1*15:01分子、HLA-DPB1*09:01分子和HLA-DPB1*05:01分子结合的肽(专利文件6)。
然而，完全不知道识别辅助肽的抗原特异性CD4+辅助性T细胞的T细胞受体(TCR)基因的序列。
背景技术的文件
专利文件
专利文件1：WO2003/106682
专利文件2：WO2005/095598
专利文件3：WO2007/097358
专利文件4：PCT/JP2007/074146
专利文件5：WO2005/045027
专利文件6：WO2008/105462
非专利文件
非专利文件1：Daniel A. Haber等, Cell. 1990 Jun 29; 61(7):1257-69。
非专利文件2：Call KM等, Cell. 1990 Feb 9; 60(3):509-20。
非专利文件3：Menke AL等, Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. 综述。
非专利文件4：Yamagami T等, Blood. 1996 Apr 1; 87(7):2878-84。
非专利文件5：Inoue K等, Blood. 1998 Apr 15; 91(8):2969-76。
非专利文件6：Tsuboi A等, Leuk Res. 1999 May; 23(5):499-505。
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非专利文件10：Knights AJ等, Cancer Immunol Immunother. 2002 Jul; 51(5):271-81。
发明概述
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是测定对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR基因的序列，以获得这些TCR基因所导入的CD4+ T细胞，使用所述细胞提高WT1特异性CTL的诱导，并治疗或预防癌症等。
解决问题的方法
本发明人进行了非常努力的研究以解决上述问题，并成功分离出对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的α链基因和β链基因，并测定了各个CDR3序列。此外，本发明人将含有所测定的序列的TCR基因导入CD4+T细胞中，通过使用这些CD4+ T细胞，成功提高了WT1特异性CTL的诱导和损害了表达WT1的癌细胞。因此，本发明人完成了本发明。
也就是说，本发明提供：
(1) 一种具有选自SEQ ID NO: 1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、30、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、56和58的核苷酸序列的多核苷酸(称为“αCDR3多核苷酸”)，其中所述多核苷酸编码对WT1辅助肽(WT1332肽)有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的α链的CDR3，该肽具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列。
(2) 一种具有选自SEQ ID NO: 2、4、6、7、9、12、15、17、19、21、24、26、29、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57和59的核苷酸序列的多核苷酸(称为“βCDR3多核苷酸”)，其中所述多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的β链的CDR3。
(3) 一对αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸，其中每个多核苷酸具有下列核苷酸序列：
αCDR3多核苷酸 βCDR3多核苷酸
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26
SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29
SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:50
SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:52
SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:54
SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:57
SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:57
SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:59
条件是所述序列可以是其互补序列或简并序列。
(4) 一种TCR基因，其包含(3)的任一对中的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸。
(5) (4)的TCR基因，其可获自对WT1332肽有特异性的CD4+ T细胞。
(6) 一种用于产生对WT1332肽有特异性的CD4+辅助细胞的方法，所述方法包括将(4)的TCR基因导入CD4+ T细胞中。
(7) 通过(5)的方法可获得的CD4+辅助性T细胞。
(8) 一种包含TCR基因的载体，所述TCR基因包含(3)的任一对中的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸。
(9) (6)的方法，其中所述导入使用(8)的载体进行。
(10) 一种用于提高WT1特异性CTL的诱导的方法，所述方法包括将(7)的CD4+辅助性T细胞与外周单核细胞共培养。
(11) 一种通过(10)的方法可获得的WT1特异性CTL。
(12) 一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括将(7)的CD4+辅助性T细胞导入受试者中。
(13) 一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含(7)的CD4+辅助性T细胞。
(14) (7)的CD4+辅助性T细胞用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
(15) 一种DNA芯片，其包含(1)的αCDR3多核苷酸、(2)的βCDR3多核苷酸或(1)的αCDR3多核苷酸和(2)的βCDR3多核苷酸两者。
(16) 一种测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率的方法，所述方法包括使用(15)的DNA芯片。
(17) 一种由(1)的αCDR3多核苷酸的任一个编码的αCDR3肽。
(18) 一种由(2)的βCDR3多核苷酸的任一个编码的βCDR3肽。
(19) 一种由(3)的多核苷酸对的任一个编码的肽对。
(20) 一种芯片，其包含(17)或(18)的肽或(19)的肽对。
(21) 一种针对(17)-(19)中任一个的任一个肽的抗体。
(22) 一种测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率的方法，所述方法包括使用(21)的抗体。
发明效果
按照本发明，获得具有通过本发明测定的CDR3核苷酸序列的TCR基因所导入的CD4+辅助性T细胞。WT1特异性CTL可使用所述CD4+辅助性T细胞诱导，并可有效地治疗或预防癌症。此外，使用TCR序列制备DNA芯片，并可测定样品中WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的频率。
附图简述
[图1A] 图1A显示通过本发明获得的CD4+辅助性T细胞的TCR的CDR3 α链和β链的核苷酸序列和由其编码的CDR3的氨基酸序列。位于各序列右端圆括号中的数字表示序列表中的SEQ ID NO。V-GENE、J-GENE和J-GENE分别描述了各个基因中的V区、J区和D区。
[图1B] 图1B显示通过本发明获得的CD4+辅助性T细胞的TCR的CDR3 α链和β链的核苷酸序列和由其编码的CDR3的氨基酸序列。位于各序列右端圆括号中的数字表示序列表的SEQ ID NO。V-GENE、J-GENE和J-GENE分别描述了各个基因中的V区、J区和D区。
[图2A] 图2A显示已导入表3所示TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的干扰素-γ产生。
[图2B] 图2B显示已导入表3所示TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的IL-2产生。
[图2C] 图2C显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞响应WT1332肽浓度的TNF-α产生。
[图2D] 图2D显示在加入若干种物质的系统中已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的增殖能力。WT1332表示在WT1332肽存在下培养。α-DP表示在抗HLA-DP抗体存在下培养。α-DQ表示在抗HLA-DQ抗体存在下培养。α-DR表示在抗HLA-DR抗体存在下培养。HLAI类表示在抗HLA I类抗体存在下培养。HIV表示在HIV肽(FRKQNPDIVIYQYMDDLYVG)(SEQ IDNO: 124)存在下培养。
[图2E] 图2E显示在用若干种物质脉冲的PBMC存在下已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的增殖。WT1332表示通过用WT1332肽脉冲的自体PBMC刺激。HWT1表示通过用全长的WT1蛋白质脉冲的自体PBMC刺激。HWT3表示通过用截短的WT1蛋白质(不含WT1332序列)脉冲的自体PBMC刺激。PHA-blast表示通过用PHA-blast裂解物脉冲的PBMC刺激。TF1表示通过用表达WT1的白血病细胞系TF-1的裂解物脉冲的PBMC刺激。K562表示通过用表达WT1的白血病细胞系K562的裂解物脉冲的PBMC刺激。
[图2F] 图2F显示在用若干种物质脉冲的PBMC存在下已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的IFN-γ产生。WT1332表示通过用WT1332肽脉冲的自体PBMC刺激。HWT1表示通过用全长的WT1蛋白脉冲的自体PBMC刺激。HWT3表示通过用截短的WT1蛋白(不含WT1332序列)脉冲的自体PBMC刺激。PHA-blast表示通过用PHA-blast裂解物脉冲的PBMC刺激。TF1表示通过用表达WT1的白血病细胞系TF-1的裂解物脉冲的PBMC刺激。K562表示通过用表达WT1的白血病细胞系K562的裂解物脉冲的PBMC刺激。
[图2G] 图2G显示TCR基因所导入的来自3名健康受试者的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞系(HLA-DPB1*05:01-阳性)在响应WT1332肽时若干种细胞因子产生的平均数。黑色条形柱表示通过WT1332肽刺激。白色条形柱表示没有刺激。
[图3A] 图3A显示PBMC与已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞以图中所示比率共培养时CD3+CD8+T细胞的频率。
[图3B] 图3B显示PBMC与已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞以图中所示比率共培养时修饰的WT1235/HLA-A*24:02四聚体-阳性CD8+T细胞的频率。
[图3C] 图3C显示PBMC与已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞以图中所示比率共培养WT1特异性CTL的细胞数。
[图3D]显示在PBMC与已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞以图中所示比率共培养的情况下在响应被修饰的WT1235刺激时表达干扰素-γ的CD8+T细胞的频率。
图4A显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞在图中所示E:T比率造成的损害，表示为表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性白血病细胞系TF-1和表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阴性白血病细胞系TF-1的溶解(%)。
图4B显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞在图中所示E:T比率造成的损害，表示为被迫表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性B-LCL细胞和不表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性B-LCL细胞的溶解(%)。
图4C显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞在图中所示E:T比率造成的损害，表示为K562细胞系和表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性白血病细胞系C2F8的溶解(%)。
图4D显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞中粒酶B (左)和穿孔素(右)表达的流式细胞术结果。
图4E显示按照实施例4所述方法培养的已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞的产生CD107a的细胞和产生IFN-γ的细胞的频率的流式细胞术结果。
图4F是柱状图，显示已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞针对用Ac-IETD-Cho预处理的HLA-CPB1*05:01-阳性TF-1细胞的细胞损害活性与已导入TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞针对用DMSO预处理的TF-1细胞的细胞损害活性的比较结果。柱状图的高度表示具有标准差条的平均值。星号表示p<0.05。
图5显示存活曲线，显示已导入来自WT1332特异性CD4+ T细胞的TCR基因的人CD4+ T细胞的NOG (注册商标)小鼠中的抗肿瘤活性。实线表示转染了已导入HLA-DPB1*05:01限制性WT1332特异性TCR的人CD4+ T细胞的小鼠的存活曲线。虚线表示转染了已导入对照载体的人CD4+ T细胞的小鼠的存活曲线。
具体实施方案
本发明基于对编码含有对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞克隆的TCR的CDR3的α链的多核苷酸(下文称为“αCDR3多核苷酸”)和编码含有对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞克隆的TCR的CDR3的β链的多核苷酸(下文称为“βCDR3多核苷酸”)的测定。因此，一方面，本发明提供具有图1所示核苷酸序列(选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、30、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、56、58)的αCDR3多核苷酸和具有图1所示核苷酸序列(选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2、4、6、7、9、12、15、17、19、21、24、26、29、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57、59)的βCDR3多核苷酸。
优选地，从受体功能表达的观点看，每个克隆所包含的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸包含在一个TCR中。即优选对应于每个克隆的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸形成图1所示的对。因此，又一方面，本发明提供一对αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸，其中构成对的每个多核苷酸具有图1所示核苷酸序列。αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的组合按照每个克隆而不相同。每个克隆中一对αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的核苷酸序列如图1所示。
αCDR3多核苷酸或βCDR3多核苷酸还包括具有与αCDR3多核苷酸或βCDR3多核苷酸互补的核苷酸序列的多核苷酸。另外，αCDR3多核苷酸或βCDR3多核苷酸还包括αCDR3多核苷酸或βCDR3多核苷酸的简并序列，只要它编码图1所示的肽即可。
αCDR3多核苷酸还包括与αCDR3多核苷酸的核苷酸序列具有70%或更高，例如75%或更高、80%或更高、85%或更高或90%或更高，例如92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高的核苷酸序列同一性的多核苷酸。βCDR3多核苷酸还包括与βCDR3多核苷酸的核苷酸序列具有70%或更高，例如75%或更高、80%或更高、85%或更高或90%或更高，例如92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高的核苷酸序列同一性的多核苷酸。
αCDR3多核苷酸还包括具有在严格条件下与αCDR3多核苷酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。βCDR3多核苷酸还包括具有在严格条件下与βCDR3多核苷酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
严格杂交条件的实例包括其中在含有5x SSC、7% (w/v) SDS、100 μg/ml变性鲑精DNA和5x Denhardt溶液的溶液中在48-52℃下进行杂交，然后在0.1x SSC、0.5x SSC、1xSSC或2x SSC中进行洗涤的条件；或其中在含有250 mM NaCl、25 mM柠檬酸三钠、1% SDS、50%甲酰胺和200 μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在42℃下进行杂交，然后在含有15 mM NaCl、1.5 mM柠檬酸三钠和0.1% SDS的溶液中进行洗涤的条件。
另一方面，本发明提供由αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸编码的肽(分别称为“αCDR3肽”和“βCDR3肽”)。这些肽具有图1所示氨基酸序列。优选这些肽形成一对αCDR3肽和βCDR3肽，对应于如图1所示的每个克隆。
在本说明书中，肽的氨基酸序列用常规一字母系统或三字母系统表示。
αCDR3肽或βCDR3肽还包括由αCDR3多核苷酸或βCDR3多核苷酸的变体编码的肽。αCDR3肽还包括与αCDR3肽的氨基酸序列具有70%或更高，例如75%或更高、80%或更高、85%或更高或90%或更高，例如92%或更高或94%或更高的氨基酸序列同一性的肽。βCDR3肽还包括与βCDR3肽的氨基酸序列具有70%或更高，例如75%或更高、80%或更高、85%或更高或90%或更高，例如92%或更高或94%或更高的氨基酸序列同一性的肽。另外，αCDR3肽还包括具有其中1-几个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸被取代、缺失或添加的αCDR3肽的氨基酸序列的肽；βCDR3肽还包括具有其中1-几个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸被取代、缺失或添加的βCDR3肽的氨基酸序列的肽。注意，这些变体肽与原有的αCDR3肽或βCDR3肽具有类似性质。
这些多核苷酸和多肽可采用本领域众所周知的化学方法和/或生物学方法制备。
在本发明中，WT1辅助肽是具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列(Lys Arg TyrPhe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)或其变体氨基酸序列的肽(这些肽称为“WT1332肽”)。WT1332肽可具有WT1多肽的部分序列或变体序列。由SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列组成的肽是这类肽的实例。
已知WT1332肽具有结合HLA-DRB1*15:01分子、HLA-DPB1*09:01分子、HLA-DPB1*05:01分子、HLA-DRB1*04:05分子或HLA-DRB1*15:02分子的能力。
上述SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列的变体序列是指其中1-几个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸被取代、缺失或添加的SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列。或者，上述SEQ IDNO: 123所示氨基酸序列的变体序列是指与SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列具有70%或更高，例如75%或更高、80%或更高、85%或更高或90%或更高同一性的氨基酸序列。优选具有SEQID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列的肽的长度为25个氨基酸以下。具有SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的变体序列的肽与具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列的那些肽具有相似性质。
又一方面，本发明涉及含有属于图1所示任一对的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因。所述TCR基因可从对WT1332肽有特异性的CD4+ T细胞中分离，或可采用众所周知的基因工程技术制备。
又一方面，本发明涉及通过将含有属于图1所示任一对的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因导入CD4+ T细胞而获得的CD4+辅助性T细胞(称为“导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞”)。导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞显示WT1332特异性和HLA II类限制性增殖和细胞因子生产。
本领域技术人员可容易地将含有属于图1所示任一对的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因导入CD4+ T细胞中。例如，可采用各种载体、电穿孔或基因枪等，进行TCR基因的导入。可修饰待导入的TCR基因用于例如改进TCR表达效率的目的。
因此，又一方面，本发明提供含有TCR基因的载体，所述TCR基因含有属于图1所示任一对的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸。
可通过将含有αCDR3多核苷酸的α链基因和含有βCDR3多核苷酸的β链基因插入各自的载体中，并将这些载体导入CD4+ T细胞中，来进行TCR基因的导入。
导入了含有αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因的CD4+ T细胞的实例包括来源于HLA-DRB1*15:01-阳性受试者、HLA-DPB1*09:01-阳性受试者、HLA-DPB1*05:01-阳性受试者、HLA-DRB1*04:05-阳性受试者或HLA-DRB1*15:02-阳性受试者的CD4+ T细胞，但不限于所述细胞。另外，CD4+ T细胞可来源于患有癌症的受试者、可来源于未患癌症的受试者(健康受试者)，或可来源于骨髓移植的供体。
又一方面，本发明还涉及包含含有属于图1所示任一对的αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因的WT1332特异性CD4+辅助性T细胞。
可使用导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞提高WT1特异性CTL的诱导。具体地说，可通过将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞和外周单核细胞共培养，来提高WT1特异性CTL的诱导。因此，又一方面，本发明提供一种用于提高WT1特异性CTL的诱导的方法，所述方法包括将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞和外周单核细胞共培养。另一方面，本发明涉及通过所述方法获得的WT1特异性CTL。
将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞和外周单核细胞共培养的方法和条件是本领域众所周知的。所述方法可在体内或体外进行。一种导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞可用于提高WT1特异性CTL的诱导。然而，优选使用两种或更多种导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞。
用于提高本发明WT1特异性CTL的诱导的方法的外周单核细胞的实例包括来源于HLA-DRB1*15:01-阳性受试者、HLA-DPB1*09:01-阳性受试者、HLA-DPB1*05:01-阳性受试者、HLA-DRB1*04:05-阳性受试者或HLA-DRB1*15:02-阳性受试者的外周单核细胞，但不限于所述细胞。优选外周单核细胞和CD4+ T细胞是来源于其中癌症应得到治疗或预防的受试者的细胞。
在共培养中，优选WT1332肽和/或其它WT1肽同时存在。其它WT1肽的实例包括有结合HLA-DRB1*15:01分子、HLA-DPB1*09:01分子、HLA-DPB1*05:01分子、HLA-DRB1*04:05分子或HLA-DRB1*15:02分子的能力的肽，但不限于所述肽。
必要时，可进一步培养通过上述方法获得的WT1特异性CTL以使细胞数增加，然后给予受试者，以治疗或预防受试者的癌症。在癌症的这种治疗或预防中，优选同时给予WT1332肽和/或其它WT1肽。通过WT1特异性CTL的作用，还可诱导对其它癌抗原有特异性的CTL。
导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞可损害表达WT1的癌细胞。因此，又一方面，本发明是一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞导入受试者中。
又一方面，本发明提供用于治疗或预防癌症的包含导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞的药物组合物、导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途和导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞用于治疗或预防癌症的用途。
本文所用癌症的“治疗”不仅仅是指治疗癌症，例如抑制癌症进展、减轻癌症和消灭癌症，而且还指防止癌症复发。
癌症得到治疗或预防的受试者的实例包括HLA-DRB1*15:01-阳性受试者、HLA-DPB1*09:01-阳性受试者、HLA-DPB1*05:01-阳性受试者、HLA-DRB1*04:05-阳性受试者或HLA-DRB1*15:02-阳性受试者，但不限于他们。上述受试者不限于癌症患者，可以是未患癌症的人(包括健康人)或可以是骨髓移植的供体。
以下描述了上述用于治疗或预防的方法、药物组合物和用途的实施方案。然而，实施方案不限于这些。首先，从需要治疗的癌症患者的外周血得到CD4+ T细胞，将含有αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的TCR基因导入CD4+ T细胞中，以得到导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞。将由此获得的导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞给予癌症患者。在给予前，可将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞在合适的条件下培养并使其增殖以得到足够的细胞数，然后可将所述细胞给予癌症患者。
可以给予一种导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞或两种或更多种导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞。从治疗或预防效果的改进的观点来看，优选将两种或更多种导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞给予受试者。
在将导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞给予受试者的情况下，医师可适当地决定以下条件：例如待给予的细胞数、给药频率、给药间隔。例如，导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞可以仅一次给予，或分几次给予。通常，在成人受试者的情况下，每剂导入有TCR基因的CD4+辅助性T细胞的数目的范围为约109至约1011，但不限于这些数目。
在上述治疗或预防方法、药物组合物和用途中，优选同时给予WT1332肽和/或其它WT1肽。医师可适当地决定给予WT1332肽和/或其它WT1肽的量和频率。另外，可以组合其它抗癌疗法或预防法。
上述治疗或预防方法、药物组合物和用途可应用于各种癌症中，不限于例如血液系统恶性肿瘤，例如急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征和相同类型血液干细胞移植后的复发；实体癌，例如舌癌、龈癌、口底癌、咽癌、喉癌、唾腺癌和甲状腺癌；胸癌，例如乳腺癌、肺癌和胸腺癌；胃肠癌，例如结肠癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、胃肠内分泌瘤和胃肠类癌；泌尿生殖道癌，例如肾癌、尿路上皮癌、生殖细胞瘤，维尔姆斯瘤，前列腺癌、子宫体癌、宫颈癌、子宫肉瘤和卵巢恶性肿瘤；肌骨骼恶性肿瘤，例如原发性骨恶性肿瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)和软组织肉瘤；和其它癌症，例如皮肤癌、成神经细胞瘤、恶性神经胶质瘤(成胶质细胞瘤)、原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤、成神经管细胞瘤和PNET。
CDR3区是最多样化的部分，并且是抗原识别特异性的最大责任部分。因此，本发明的αCDR3多核苷酸、βCDR3多核苷酸、αCDR3肽和βCDR3肽的序列被认为是对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞特有的。因此，在编码α链和β链的CDR区的多核苷酸或相当于具有本发明的多核苷酸或肽的序列的CDR区的肽的情况下，CD4+辅助性T细胞被视为对WT1332肽有特异性。
例如，(i)一种DNA芯片，其包含一种或更多种αCDR3多核苷酸，(ii)一种DNA芯片，其包含一种或更多种βCDR3多核苷酸，或(iii)一种DNA芯片，其包含一种或更多种αCDR3多核苷酸和一种或更多种βCDR3多核苷酸两者，可以用来测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率。具体地说，通过溶解获自受试者的样本中的细胞，提取核酸，来制备样品，并使样品与DNA芯片接触。
例如，在使样品与芯片(i)接触，杂交存在于任何位置上的情况下，使同一样品与芯片(ii)接触以证实杂交存在与否。然后，在芯片(i)中的任何杂交和在芯片(ii)中的任何杂交是与构成图1所示任一对的任何αCDR3多核苷酸和任何βCDR3多核苷酸发生的情况下，可以认定，样品中存在具有功能性TCR的对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞。使用芯片(III)，可以一步进行上述过程。
DNA芯片可为任何形式，例如微芯片和微阵列。这些芯片可通过众所周知的方法制备。例如，可通过众所周知的方法，将αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸固定在玻璃基底上。优选将标记与样品的DNA或芯片上的DNA序列连接，所述标记能够表明杂交存在与否以及杂交的量。
不仅可使用DNA芯片，而且还可使用例如DNA印迹法、RNA印迹法、集落杂交等技术，来测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率。
另外，可使用αCDR3肽和βCDR3肽以获得对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的抗体。可使用所述抗体检测对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞。还可使用所述抗体，刺激对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的受体。所述刺激可以体内或体外进行。
还可使用包含αCDR3肽的芯片、包含βCDR3肽的芯片或包含αCDR3肽和βCDR3肽两者的芯片检测抗对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的抗体。
包含这些肽的芯片可采用众所周知的方法制备。优选加入标记，所述标记可测定与样品中的肽或芯片上的肽的特异性结合存在与否。
还可使用包含抗αCDR3肽和/或βCDR3肽的抗体的芯片测定样品中的αCDR3肽和/或βCDR3肽的种类和量，或测定样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的种类和量。
固定有这些抗体的芯片可采用众所周知的方法制备。优选加入标记，所述标记可测定与样品中的肽或芯片上的抗体的特异性结合存在与否。
序列描述
SEQ ID NO: 1-59是CD4+辅助性T细胞克隆的TCR中所包含的编码CDR3的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 60-118是CD4+辅助性T细胞克隆的TCR中所包含的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 119是用于扩增TCRα链的反向引物。
SEQ ID NO: 120是用于扩增TCRβ链的反向引物。
SEQ ID NO: 121是用于扩增TCRβ链的反向引物。
SEQ ID NO: 122是用于测定CDR3核苷酸序列的引物。
SEQ ID NO: 123是WT1332肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 124是HIV肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 125是天然存在的WT1肽的变体的氨基酸序列。
通过提供以下实施例，对本发明做更详细和更具体的描述。然而，不应解释为实施例限制本发明的范围。
实施例1
实施例1. WT1332特异性CD4+ T细胞克隆的建立和T细胞受体(TCR)基因的分离和测序
实验步骤如下。
(1) 建立WT1332特异性CD4+ T细胞克隆的方法
(i) 收获来源于健康受试者的外周血单核细胞(PBMC)，以3x106个细胞/孔接种到24孔板中。使用补充10% AB血清和40 IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基作为培养基。
(ii) 以20 µg/ml的终浓度将WT1332肽加入上述i中，培养细胞7天。
(iii) 7天后，收集细胞，用补充10% AB血清的X-VIVO 15培养基制备，使得细胞密度为1x107个细胞/ml，然后，各以100 μL接种到96孔圆底板中。
(iv) 分别以40 µg/ml、4 µg/ml和4 µg/ml的终浓度，将WT1332肽、BD GolgiStopTM(BD Bioscience)和CD28/CD49d Costimulatory Reagent (BD Bioscience)加入补充10%AB血清的X-VIVO 15培养基中。
(v) 各以100 μL将上述iv加入上述iii中。
(vi) 各以10 µl将抗人CD154-APC标记的抗体(BD Bioscience)加入上述v中，将板在5% CO2培养箱中于37℃温育6小时。
(vii) 在温育后，收集细胞，用抗人CD4-APC-H7标记的抗体(BD Bioscience)和抗人CD3-Pacific Blue标记的抗体(BD Bioscience)以及用于除去死细胞的7-AAD(eBioscience)染色。
(viii) 从3名健康受试者中收获PBMC，混合，用30 Gy的γ射线照射，并用补充终浓度为10%的10% AB血清、终浓度为100 IU/ml的IL-2和终浓度为3 µg/ml的PHA的X-VIVO15培养基制备，使得细胞密度为1x106个细胞/ml。将这些制备的细胞各以100 μL接种到96孔圆底板中。
(ix) 7-ADD-CD3+CD4+CD154+细胞级分，即含有WT1332特异性CD4+ T细胞的级分是使用FACSAria细胞分选仪分选进入上述viii的各孔中的单细胞。
(x) 在培养10-14天后，使用各孔中的增殖细胞作为独立的CD4+ T细胞克隆。
(2) WT1332特异性CD4+ T细胞克隆的筛选
(i) 上述(1)-x的各CD4+ T细胞克隆用补充1% AB血清的X-VIVO 15培养基制备，使得细胞密度为3x105个细胞/ml。
(ii) 将用WT1332脉冲或未用任何肽脉冲的自体PBMC用30 Gy的γ射线照射，并用补充1% AB血清的X-VIVO 15培养基制备，使得细胞密度为1x106个细胞/ml。
(iii) 将上述(2)-i和ii各以100 μL接种到96孔圆底板中。
(iv) 培养2天后，将3H-胸苷以1 µCi/孔加入各孔中。
(v) 18小时后，测量掺入各CD4+ T细胞克隆中的3H-胸苷，并选择显示WT1332特异性增殖反应的CD4+ T细胞克隆。使用所选的这些克隆作为WT1332特异性CD4+ T细胞克隆。
(vi) 进行WT1332特异性CD4+ T细胞克隆的培养，其中，通过与用30 Gy的γ射线照射用WT1332以1次/1-2周左右的频率脉冲的自体PBMC制备的PBMC共培养，刺激WT1332特异性CD4+ T细胞克隆。
(3) 使用5'-RACE (cDNA末端快速扩增)方法分离TCR基因
(i) 自最后的刺激后，将WT1332特异性CD4+ T细胞克隆培养10天以上。这是为了防止被用于刺激的自体PBMC中所包含的T细胞污染。
(ii) 使WT1332特异性CD4+ T细胞克隆沉淀，将TRIzol试剂(Invitrogen)加入其中，并按其操作手册提取RNA。
(iii) 使用SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，从由上述(3)-ii提取的RNA合成cDNA。
(iv) 使用在上述(3)-iii中合成的cDNA作为模板扩增TCR α链和β链基因。关于所用的引物，MARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒中包含的UPM引物用作正向引物，下列TCR特异性引物用作反向引物：
Cα3’UTR-引物：5’-CAC AGG CTG TCT TAC AAT CTT GCA GAT C-3' (SEQ ID No:119)
Cβ1-3’UTR-引物：5’-CTC CAC TTC CAG GGC TGC CTT CA-3' (SEQ ID No: 120)
Cβ2-3’UTR-引物：5’-TGA CCT GGG ATG GTT TTG GAG CTA-3' (SEQ ID No:121)。
(v) 在94℃，3分钟-> (98℃，10秒钟-> 68℃，1分钟) x 35个循环的条件下，使用可获自的ToYoBo的KOD FX，进行TCR基因的扩增。
(vi) 使用琼脂糖凝胶电泳证实PCR产物的大小，从凝胶上切下1 kbp附近的条带，并纯化。
(vii) 使用Taq聚合酶将腺嘌呤加入在上述(3)-vi中纯化的PCR产物中后，将所得产物连接至pCR 2.1载体中。
(viii) 将HST02感受态细胞用上述(3)-vii转化，从单个克隆中纯化质粒，然后测序。
(ix) 采用国际免疫遗传学信息系统(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanTcR)进行序列分析，并测定各个TCR基因。
有关上述(3) “使用5'-RACE (cDNA末端快速扩增)方法分离TCR基因”，详细的实验步骤见下文。
(3-1) RNA提取
使用TRIzol试剂(Invitrogen)，从T细胞克隆中进行RNA提取。至于所用的T细胞克隆，制备在IL-2存在下在无抗原刺激时培养超过3周的克隆以防止饲养细胞污染。
(3-2) 使用5'-RACE (cDNA末端快速扩增)方法克隆全长TCR (T细胞受体) cDNA
对于TCR α/β的克隆，使用SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)。首先，按照其操作手册进行5'-RACE反应，由此合成第1链cDNA。然后，为了获得全长TCR α链和β链cDNA，使用对各3'UTR (非翻译区)有特异性的反向引物和试剂盒中所含的通用引物(UPM)，并使用合成的第一链cDNA作为模板，进行PCR反应。所用引物如下。
Cα 3'UTR-RACE-引物：CACAGGCTGTCTTACAATCTTGCAGATC (SEQ ID No:119)
Cβ1 3'UTR-RACE-引物：CTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCA (SEQ ID No:120)
Cβ2 3'UTR-RACE-引物：TGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA (SEQ ID No:121)。
此外，使用KOD FX (TOYOBO)，在下列反应溶液组成中进行PCR反应。
[表1]
在PCR反应后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，切下900-1000 bp附近的单一条带，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，将PCR产物用50 μl蒸馏水纯化。需要将腺嘌呤加入PCR产物的两端用于TA-克隆。如下使用Platinum Taq DNA聚合酶(invitrogen)进行腺嘌呤的添加。
(1) 制备下表所示2x反应溶液。
[表2]
(2) 将2x反应溶液在95℃下温育5分钟。
(3) 向其中加入纯化的PCR产物。
(4) 将所得产物在72℃下温育10分钟。
将添加有腺嘌呤的PCR产物纯化，并通过乙醇沉淀浓缩，然后，使用DNA LigationKit，Mighty Mix> (TaKaRa)，插入pCR 2.1载体(invitrogen)中。通过转化将包含PCR产物的pCR 2.1载体导入HST02感受态细胞中，并克隆。
(3-3) 包含全长TCR α链和β链cDNA的质粒的纯化
将转化的HST02感受态细胞铺板于氨苄西林/LB板中，并在37℃下孵育。然后，将单个克隆挑入氨苄西林/LB液体培养基中，在以200 rpm搅拌的同时在37℃下孵育。然后，使用AUTOMATIC DNA ISOLATION SYSTEM PI-50 (KURABO)，从大肠杆菌(Escherichia coli)溶液中纯化出质粒。
(3-4) 通过测序测定TCR的CDR3序列
为了纯化质粒的测序，使用BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)。另外，使用M13反向引物：caggaaacagctatgac (SEQ ID No: 122)。为了分析TCR和CD3，应用IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)。
测定的CDR3的核苷酸和氨基酸序列见图1。在一些克隆中，有2种α链和2种CDR 3序列。
实施例2
实施例2. 将来源于WT1332特异性CD4+ T细胞的T细胞受体(TCR)基因导入人CD4+ T细胞中
证实了用来源于WT1332特异性CD4+ T细胞的T细胞受体(TCR)基因转导的人CD4+ T细胞以WT1332特异性和HLA II类限制性方式显示增殖反应并产生细胞因子。
表3所示TCR基因自克隆9分离，该克隆是以HLA-DPB1*05:01限制性方式特异性识别WT1332的CD4+ T细胞克隆。通过使用慢病毒载体，将这些TCR基因转导入来源于健康受试者的外周血的CD4+ T细胞中，并通过使用细胞因子(干扰素-γ和IL-2)的产生作为指示物，检查对WT1332的反应(图2A和B)。另外，用不携带TCR基因的慢病毒载体转导的CD4+ T细胞(标为模拟品)用作对照。用WT1332特异性TCR基因转导的CD4+ T细胞(在实施例部分中称为“WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞”)仅响应WT1332，即以WT1332特异性方式产生INF-γ和IL-2。另一方面，模拟品转导的CD4+ T细胞不显示细胞因子的WT1332特异性产生。
分析了WT1332肽的浓度对WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞表达细胞因子的作用。将WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞用各种浓度的WT1332肽刺激4小时，并进行了胞内细胞因子染色测定法以分析产TNF-α的CD4+ T细胞与CD4+ T细胞的比例。结果见图2C。细胞因子的产生是WT1332肽浓度依赖性的，ED50为4.85 µM。
在分析WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的增殖效能时，发现了WT1332特异性的强增殖效能，且增殖反应被抗HLA-DP抗体显著抑制(图2D)。
接下来，分析了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞对用WT1332肽脉冲的自体PBMC、用全长WT1蛋白脉冲的自体PBMC、用截短的WT1蛋白(不含WT1332序列)脉冲的自体PBMC、用PHA-blast的裂解物脉冲的PBMC、用表达WT1的白血病细胞系TF-1的裂解物脉冲的PBMC和表达WT1的白血病细胞系K562的裂解物脉冲的PBMC的增殖反应和IFN-γ产生。通过[3H]-胸苷掺入测量了细胞增殖，并通过ELISA测量IFN-γ。结果分别见图2E和图2F。发现WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的增殖和IFN-γ产生被用表达WT1的白血病细胞系(TF-1和K562)的裂解物脉冲的PBMC显著刺激，并且也被用WT1332肽脉冲的自体PBMC和用全长WT1蛋白脉冲的自体PBMC刺激。
此外，还分析了响应类似于实施例2的方法制备的WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞系的WT1332肽时各种细胞因子的产生，所述细胞系来源于3个健康(HLA-DPB1*05:01阳性)供体(即3种细胞系)。3种细胞系的细胞因子生产能力的平均值见图2G。Th1型细胞因子例如IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF大量产生。
[表3]
实施例3
实施例3. 通过用来源于WT1332特异性CD4+ T细胞的TCR基因转导的人CD4+ T细胞提高WT1特异性CTL的诱导
一般而言，已知CD4+ T细胞用作辅助性T细胞，并且对作为攻击癌细胞的原代效应细胞的CD8+ T细胞(CTL)的导入和维持是重要的。因此，分析了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞是否提高WT1特异性CTL的诱导。
将HLA-A*24:02和HLA-DPB1*05:01-阳性健康受试者的PBMC与从相同健康受试者制备的WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞以10:1和5:1 (图3中标为1:0.1和1:0.2)的比率混合，并在修饰的WT1235肽(其中M，与HLA-A*24:02分子结合的天然WT1肽的第2个氨基酸，被修饰成为Y (CYTWNQMNL) (SEQ ID No:125))存在下温育1周，所述修饰的WT1235肽是来源于WT1和WT1332的HLA-A*24:02限制性CTL表位。然后，所得物用修饰的WT1235肽再次刺激(其中与HLA-A*24:02分子的结合能力提高)，并进一步温育1周。在一系列培养中不加入IL-2，以便正确地评价CD4+ T细胞的辅助活性。在总共2周培养后，使用CD8+ T细胞、修饰的WT1235/HLA-A*24:02四聚体-阳性CD8+ T细胞和表达修饰的WT1235特异性干扰素-γ (INF-γ)的CD8+ T细胞的频率作为指示物，检查WT1特异性CTL的诱导是否被WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞提高。因此，当与作为对照的模拟品转导的CD4+ T细胞相比时，在与WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞共培养时，CD8+ T细胞的频率显著较高(图3A)。另外，关于是WT1特异性CTL的修饰的WT1235/HLA-A*24:02四聚体阳性CD8+ T细胞，当与WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞共培养时，发现明显的阳性群，然而，在对照中未发现(图3B)。从这些结果中计算存在于100,000个淋巴细胞中的WT1特异性CTL的细胞数，当与WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞共培养时细胞数是对照的约28倍(图3C)。同样，当与WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞共培养时，通过用修饰的WT1235刺激表达INF-γ的CD8+ T细胞的频率也显著高(图3D)。从上可见，它显示WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞提高WT1特异性CTL的诱导。
实施例4
实施例4：用来源于WT1332特异性CD4+ T细胞的TCR基因转导的人CD4+ T细胞对表达WT1的白血病细胞的HLA-DPB1*05:01限制性损害
接下来，评价了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的细胞毒性活性，即杀死活性。
首先，分离HLA-DPB1*05:01基因，并转染至表达WT1的白血病细胞系TF-1中以制备HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞。如图4A所示，WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞强烈损害HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞，然而，它们对HLA-DPB1*05:01-阴性TF-1细胞不显示细胞毒性活性。然后，为了证实这种细胞毒性活性是否是WT1特异性的，通过在不表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性B-LCL细胞(标为B-LCL(-))中过量表达WT1基因，来制备B-LCL(+)，并且使用这些细胞作为靶细胞以评价WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的细胞毒性活性。如图4B所示，B-LCL(+)被WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞强烈损害，然而，B-LCL(-)不被损害。从这些结果看，显示了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞具有HLA-DPB1*05:01限制性和WT1特异性细胞毒性活性。此外，通过使用HLA-DPB1*05:01-阳性且表达WT1的白血病细胞系C2F8，证实了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的细胞毒性活性(图4C)。
接下来，分析了WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞是否通过粒酶B和穿孔素途径发挥细胞毒性活性。在WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞中发现粒酶B和穿孔素高表达(图4D)。
在抗CD107a-APC-单克隆抗体存在下，将WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞和用模拟品-载体类似处理的CD4+ T细胞(模拟品转导的CD4+ T细胞)与用WT1332肽脉冲的HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞或未用WT1332肽脉冲的HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞一起培养5小时。然后，进行IFN-γ染色，对所得产物进行流式细胞术。只有当WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞与用WT1332肽脉冲的HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞一起孵育时，才发现在WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞中IFN-γ和CD107a共表达(图4E)。这就表明，脱粒发生在WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞中。
为了证实WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞的细胞毒性活性是否依赖于粒酶B/穿孔素途径，将用100 μM粒酶抑制剂Ac-IETD-Cho预处理的HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞用作靶细胞。将HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞用100 μM的Ac-IETD-Cho或DMSO (对照)预处理2小时，然后用51Cr标记，与WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞一起孵育，并进行了51Cr释放测定。与对用DMSO预处理的TF-1细胞的细胞毒性活性相比，WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞对用Ac-IETD-Cho预处理的HLA-DPB1*05:01-阳性TF-1细胞的细胞毒性活性显著较低(图4F)。
同时考虑这些结果，证实了通过本发明得到的WT1332-TCR转导的CD4+ T细胞直接识别表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性白血病细胞，并通过粒酶B/穿孔素途径对其进行损害。
实施例5
实施例5. 用来源于WT1332特异性CD4+ T细胞的TCR基因转导的人CD4+ T细胞在NOG®小鼠中的抗肿瘤作用
将表达WT1的HLA-DPB1*05:01-阳性人白血病细胞C2F8 (5 x 104个细胞)通过尾静脉转移到NOG®小鼠(7只小鼠)中。次日，作为一个实验组，将用来自相同受试者的HLA-DPB1*05:01限制性WT1332特异性TCR基因(SEQ ID No: 14和15)转导的人CD4+ T细胞(5 x106个细胞)和T细胞缺失的人外周血单核细胞(2 x 106个细胞)作为抗原呈递细胞转移至上述NOG®小鼠(3只小鼠)中。作为对照，将用来自相同受试者的对照载体转导的人CD4+ T细胞(5 x 106个细胞)和T细胞缺失的人外周血单核细胞(2 x 106个细胞)作为抗原呈递细胞转移到上述NOG®小鼠(4只小鼠)中。
在1和2周后，将用HLA-DPB1*05:01限制性WT1332特异性TCR基因转导的人CD4+ T细胞(5 x 106个细胞)通过尾静脉转移到实验组的小鼠中。将用对照载体转导的人CD4+ T细胞(5 x 106个细胞)通过尾静脉转移到对照小鼠中。然后，分析小鼠的存活。
结果见图5。由于实验组小鼠的存活率超过对照小鼠的存活率，因此表明，HLA-DPB1*05:01限制性WT1332特异性TCR转导的人CD4+ T细胞具有体内抗肿瘤作用。
工业实用性
本发明可用于治疗或预防癌症的药物领域、癌症研究试剂领域和癌症试验试剂盒或试剂领域等。
Claims (3)
1.CD4+辅助性T细胞在制备用于治疗或预防患者的癌症的药物中的用途，其中通过将TCR基因导入CD4+T细胞获得CD4+辅助性T细胞，
其中TCR基因包含编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的α链的CDR3的αCDR3多核苷酸和编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的β链的CDR3的βCDR3多核苷酸对，其中所述WT1332肽具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列，其中αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸对是：
SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16 和 SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18 和 SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26
SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29
SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:49 和 SEQ ID NO:50
SEQ ID NO:51 和 SEQ ID NO:52
SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54
SEQ ID NO:55 和 SEQ ID NO:57
SEQ ID NO:56 和 SEQ ID NO:57；和
SEQ ID NO:58 和 SEQ ID NO:59
条件是所述序列可以是其互补序列或简并序列。
2.一种测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率的方法，所述方法包括使用包含一对或多对αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸的DNA芯片，其中，
αCDR3多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的α链的CDR3，和βCDR3多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的β链的CDR3，其中所述WT1332肽具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列，
其中αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸对是：
SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:15
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SEQ ID NO:16 和 SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18 和 SEQ ID NO:19
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SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26
SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:4
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SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:49 和 SEQ ID NO:50
SEQ ID NO:51 和 SEQ ID NO:52
SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54
SEQ ID NO:55 和 SEQ ID NO:57
SEQ ID NO:56 和 SEQ ID NO:57；和
SEQ ID NO:58 和 SEQ ID NO:59
条件是所述序列可以是其互补序列或简并序列。
3.一种测量样品中对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的频率的方法，所述方法包括使用针对构成任一对αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸编码的肽对的任一肽的抗体，
其中，
所述αCDR3多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的α链的CDR3，和所述βCDR3多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR的β链的CDR3，其中所述WT1332肽具有SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列或其变体序列，
其中αCDR3多核苷酸和βCDR3多核苷酸对是：
SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4
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SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:12
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SEQ ID NO:56 和 SEQ ID NO:57；和
SEQ ID NO:58 和 SEQ ID NO:59
条件是所述序列可以是其互补序列或简并序列。
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