CN105274053B

CN105274053B - 一种高细胞毒活性的cik细胞的制备方法

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Publication number: CN105274053B
Application number: CN201510837518.5A
Authority: CN
Inventors: 熊桂荣
Original assignee: Shengzhou Mingzhi Technology Service Co Ltd
Current assignee: Beijing Dadi tongnian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105274053A

Abstract

本发明公开了一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×10⁶/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL Turrapubin A的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基，包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL‑2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞。本发明提供的制备方法可以获得高纯度、高增殖力和高细胞毒活性的CIK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。

Description

一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法

技术领域

本发明属于细胞免疫领域，具体涉及一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。

背景技术

免疫治疗作为肿瘤综合治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤免疫治疗主要包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等。肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发。用于抗肿瘤研究的细胞因子主要有干扰素类、白细胞介素类、集落刺激因子类等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬细胞集落刺激因子为多。过继性细胞免疫包括淋巴细胞因子活化的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、DC-CIK等。单克隆抗体免疫疗法的现有研究结果表明，肿瘤分子靶向治疗具有较好的安全性和有效性，如小分子表皮生长因子受体(EGFR)、酪氨酸激酶抑制剂、抗EGFR单克隆抗体、抗血管内皮生长因子单克隆抗体以及其他分子靶向治疗药物，已在临床中取得较好的疗效。

目前用于肿瘤细胞免疫治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、树突状细胞(DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。CIK细胞是一种杀伤力强的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3⁺CD56⁺，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，利用正常健康人单个核细胞库诱导制备CIK细胞，获得的CIK细胞具有很强的增殖力，CD3⁺、CD8⁺和CD3⁺CD56⁺细胞的比例高，并且对肿瘤治疗效果优异。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×10⁶/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL Turrapubin A的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基，包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞。

进一步地，步骤(1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：(a)患者外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；(b)将步骤(a)获得的血液稀释液加入到淋巴细胞分离液的界面上；(c)1500～2500转/分钟，离心15～20分钟，收集中间层，获得单个核细胞。

进一步地，步骤(1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：患者经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集患者的外周血单个核细胞。

进一步地，步骤(2)中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟。

进一步地，步骤(4)所述继续诱导培养为每2～3天用含500～2000IU/mL重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/mL重组人IL-2和100～500IU/mL重组人IL-1完全培养基传代培养。

上述任一所述制备方法制备的CIK细胞。

一种含有上述CIK细胞的细胞制剂。

上述CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的制备方法可以获得高纯度、高增殖力和高细胞毒活性的CIK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。

附图说明

图1为外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞生长曲线图；

图2为外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤肿瘤细胞活性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中，所用的原料或试剂除特别说明外，均为市售可得。

另外，以下实施例中，涉及的完全培养基为含10％(体积百分比)FBS的RPMI 1640培养液；冷冻保护剂是含10％(体积百分比)DMSO的培养基，其中，该培养基是由70％(体积百分比)RPMI1640培养液和20％(体积百分比)FBS(胎牛血清)所构成。

实施例1：CIK细胞的诱导制备和检测

一、CIK细胞的诱导制备

(1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液(Invitrogen公司)，充分混匀。

(2)将步骤(1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)(比重1.077)的界面上(不要破坏界面)，以2000转/分钟，离心20分钟，取中间层-富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99％。

(3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。

(4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1×10⁶/mL。

(5)按照1×10⁶/mL细胞，加入γ-IFN(Peprotech公司)和Turrapubin A(自制，制备方法见文献Bioactive Limonoid and Triterpenoid Constituents of Turraeapubescens，J.Nat.Prod.，2013，76，1166-1174)使其浓度分别为1000IU/mL和100ng/mL，置37℃、5％CO₂培养箱中，开始诱导培养。

(6)步骤(5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单克隆抗体(Biolegend公司)和1000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司)，置37℃、5％CO₂培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，CD3⁺CD56⁺双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性)。

其中，单个核细胞中加入γ-IFN和Turrapubin A，经培养24小时后(诱导第1天)，光镜观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2，经培养24小时后(诱导第2天)，光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细胞明显增大。

(7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/mL重组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞(中国科学院细胞库)活性。

(8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。

其中，在诱导第7天时，肉眼下即可观察到白色斑点，光镜下观察发现，细胞集落明显增多、增大，大集落成黑团，看不清细胞形态，周边游离细胞饱满折光性好，大小形态各异。

二、按照以上方法进行诱导制备CIK细胞的相应检测结果

1、检测CIK细胞扩增倍数

检测方法为：按1×10⁶单个核细胞/孔，接种在24孔板内，按照上述方法进行诱导制备CIK细胞和细胞换液，第7天开始换成25平方厘米细胞培养瓶培养，对诱导的第0、4、7、10、13、16、19天，取1mL样本，通过血细胞计数仪(日本光电公司，MEK-6410P)，进行CIK细胞扩增倍数检测，取5次试验结果的平均值，绘制生长曲线，结果如图1所示。

其中，CIK细胞在诱导培养的第4天开始增值，第7天到第16天进入快速增长期，16天后增殖速度趋缓，第19天CIK细胞最高增殖622倍，最低271倍，平均增殖462.2倍。

2、CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测

患者外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测方法为：取对数生长的K562肿瘤细胞，用含有体积百分比为10％FBS的IMDM培养液，调整细胞数为5×10⁴/mL，每孔100μL，铺于96孔板中，每组设4个复孔。取第7、10、13、16、19天CIK细胞，及未经培养的单个核细胞，用完全培养基调整诱导的CIK细胞数为1×10⁶/mL，取100μL加入96孔板中，效靶比(即CIK细胞：K562肿瘤细胞)20∶1，设空白对照组、效应细胞对照组和靶细胞对照组，置37℃、5％CO²培养箱中，培养48小时后，加入20μL CCK-8(日本同仁化学研究所产品)，继续孵育5小时，显黄色，采用Thermofisher公司multiscanFC酶联仪，双波长，参比波长620mm、检测波长450mm检测OD值。取4次试验结果的平均值，绘制杀伤率曲线，结果如图2所示。

杀伤率的计算公式为：杀伤率(％)＝[1-(效靶细胞组OD值-效应细胞组OD值)/(靶细胞组OD值-空白对照组OD值)]×100％。其中，

效靶细胞组OD值为：CIK细胞和K562靶细胞组检测的波长450nmOD值-波长620nmOD值。

效应细胞组OD值为：单纯CIK细胞检测的波长450nmOD值-波长620nmOD值。

靶细胞组OD值为：K562靶细胞组检测的波长450nmOD值-波长620nmOD值。

空白对照组OD值为：完全培养基和10％FBS的IMDM培养液混合后，检测的波长450nmOD值-波长620nmOD值。

由图2可知，单个核细胞经过1-19天的诱导，第7天，CIK细胞杀伤靶细胞K562活性最高，平均达95.3％(范围95.3±4.2％)，此后逐步下降，第19天最低，平均82％(范围82±10％)。

3、流式细胞仪进行诱导的CIK细胞检测

采用流式细胞仪(BD公司FACS Calibur)，对诱导前的外周血单个核细胞和诱导后的第19天进行CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测。结果：诱导CIK细胞前，外周血单个核细胞的CD3⁺为52.84％，CD4⁺为36.58％，CD8⁺为24.98％，CD3⁺CD56⁺为1.35％；诱导CIK细胞的第19天，CD3⁺为98.91％，CD4⁺为1.56％，CD8⁺为91.37％，CD3⁺CD56⁺为63.72％。

4、CIK细胞表型测定

用pH7.4的1×PBS调整细胞密度至1×10⁶/mL，加入到流式细胞检测管中，200μL/管，分别加入不同荧光标记的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗体(BD公司)，置暗处，4℃标记20分钟，pH7.4的1×PBS洗涤2次，1500转/分钟，离心5分钟，1％甲醛固定后，用流式细胞仪检测。取5次试验结果的平均值，结果见表1。从表1可以看出，随着诱导时间的延长，CIK主要效应细胞CD3⁺CD56⁺双阳性细胞所占比例大幅上升，第19天达到均数为58.8％，范围为52.3％-65.3％。

表1 单个核细胞诱导CIK细胞表型的变化(X±S，％)

诱导时间(天)	CD3<sup>+</sup>	CD4<sup>+</sup>	CD8<sup>+</sup>	CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>
					0	60.8±9.3	31.8±8.5	29.1±13	3.8±2.4
7	96.8±1.3	17.5±5.2	66.9±9.4	9.3±3.5
					10	98.6±0.7	9.9±4.0	73.1±12.7	19.7±3.2
13	98.3±1.1	6.9±4.5	78.4±10.7	23.9±4.3
					16	98.7±1.0	5.3±5.1	79.9±10.0	40.6±7.3
19	97.8±1.8	5.0±4.1	79.9±10.3	58.8±6.5

实施例2：CIK细胞的诱导制备

(2)将步骤(1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)(比重1.077)的界面上(不要破坏界面)，以1500转/分钟，离心20分钟，取中间层-富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99％。

(3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1500转/分钟，离心7分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。

(5)按照1×10⁶/mL细胞，加入γ-IFN(Peprotech公司)和Turrapubin A使其浓度分别为500IU/mL和80ng/mL，置37℃、5％CO₂培养箱中，开始诱导培养。

(6)步骤(5)的细胞培养20小时后，在培养的细胞中，加入50ng/mL抗人CD3单克隆抗体(Biolegend公司)和500IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司)，置37℃、5％CO₂培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，CD3⁺CD56⁺双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性)。

(7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含500IU/mL重组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞(中国科学院细胞库)活性。

本实施例获得CIK细胞具有和实施例1近似的生物学性质和生物活性。

实施例3：CIK细胞的诱导制备和检测

(2)将步骤(1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)(比重1.077)的界面上(不要破坏界面)，以2500转/分钟，离心15分钟，取中间层-富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99％。

(5)按照1×10⁶/mL细胞，加入γ-IFN(Peprotech公司)和Turrapubin A使其浓度分别为2000IU/mL和120ng/mL，置37℃、5％CO₂培养箱中，开始诱导培养。

(6)步骤(5)的细胞培养28小时后，在培养的细胞中，加入1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体(Biolegend公司)和2000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司)，置37℃、5％CO₂培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，CD3⁺CD56⁺双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性)。

(7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含2000IU/mL重组人IL-2和300IU/mL重组人IL-1的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞(中国科学院细胞库)活性。

实施例4：实施例1的对比实例，不添加Turrapubin A

(5)按照1×10⁶/mL细胞，加入γ-IFN(Peprotech公司)使其浓度为1000IU/mL，置37℃、5％CO₂培养箱中，开始诱导培养。

(6)步骤(5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单克隆抗体(Biolegend公司)和1000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司)，置37℃、5％CO₂培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。其中，单个核细胞中加入γ-IFN，经培养24小时后(诱导第1天)，光镜观察发现，细胞折光性一般。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2，经培养24小时后(诱导第2天)，光镜观察发现，细胞有一定程度的聚集，零零散散有小集落开始形成，细胞略有增大。

该实施例制备的CIK细胞的相应检测结果表明：

(1)CIK细胞在诱导培养的第4天开始增值，第7天到第16天进入快速增长期，16天后增殖速度趋缓，第19天CIK细胞最高增殖313倍，最低35倍，平均增殖174倍，显著低于实施例1制备方法制备的CIK细胞。

(2)单个核细胞经过1-19天的诱导，第7天，CIK细胞杀伤靶细胞K562活性最高，平均达54.1％(范围54.1±3.3％)，此后逐步下降，第19天最低，平均36％(范围36±7.5％)，对靶细胞K562的杀伤率明显不及实施例1。

(3)采用流式细胞仪(BD公司FACS Calibur)，对诱导前的外周血单个核细胞和诱导后的第19天进行CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测。结果：诱导CIK细胞前，外周血单个核细胞的CD3⁺为52.84％，CD4⁺为36.58％，CD8⁺为24.98％，CD3⁺CD56⁺为1.35％；诱导CIK细胞的第19天，CD3⁺为68.81％，CD4⁺为2.03％，CD8⁺为44.77％，CD3⁺CD56⁺为22.54％，显著不及实施例1。

(4)用pH7.4的1×PBS调整细胞密度至1×10⁶/mL，加入到流式细胞检测管中，200μL/管，分别加入不同荧光标记的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗体(BD公司)，置暗处，4℃标记20分钟，pH7.4的1×PBS洗涤2次，1500转/分钟，离心5分钟，1％甲醛固定后，用流式细胞仪检测。结果表明随着诱导时间的延长，CIK主要效应细胞CD3⁺CD56⁺双阳性细胞所占比例上升不明显。

对比实施例4和实施例1可发现，Turrapubin A可协同γ干扰素诱导产生高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。比如，收集外周血的单个核细胞部分的方法也可以为：采用COBE Spectra型血细胞分离机(Gambro BC公司)上的淋巴细胞采集程序，单采正常人外周血单个核细胞30mL。

Claims

1.一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；（2）将步骤（1）收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；（3）取单个核细胞按照1×10⁶/mL细胞，加入含500~2000 IU/mL γ干扰素和80~120ng/mL Turrapubin A的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基为含体积百分比为10% FBS的RPMI 1640细胞培养液；（4）步骤（3）的细胞培养20~28小时后，加入50~1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500~2000IU/mL重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2~3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13~21天，获得CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：（a）患者外周血中，加入1~1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；（b）将步骤（a）获得的血液稀释液加入到淋巴细胞分离液的界面上；（c）1500~2500转/分钟，离心15~20分钟，收集中间层，获得单个核细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，离心的转速为1000~1500转/分钟，离心的时间为7~10分钟。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述继续诱导培养，每2~3天用含500~2000IU/mL重组人IL-2的完全培养基或含500~2000IU/mL重组人IL-2和100~500IU/mL重组人IL-1的完全培养基传代培养。

5.权利要求1-4任一所述制备方法制备的CIK细胞。

6.一种含有权利要求5所述CIK细胞的细胞制剂。

7.权利要求5所述CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。