CN103865874A - Cik细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CIK细胞及其制备方法和应用，所述制备方法，包括：构建正常健康人单个核细胞库，利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞。本发明获得的CIK细胞，既具有强大杀伤肿瘤细胞能力，也具有极大的扩增能力，且单个核细胞库的构建及诱导CIK细胞成本低廉，可用于治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞及其制备方法和应用，特别是涉及一种CIK细胞（Cytokine-inducedkiller cells）及其制备方法和应用。
背景技术
外科手术、化疗、放疗是治疗恶性肿瘤的常规手段，这些方法均有一定的侵袭性，会损伤正常细胞，副作用大。肿瘤细胞免疫治疗，能特异性杀伤肿瘤细胞，而不会损伤正常细胞，副作用小，因而免疫治疗一直是抗肿瘤研究热点之一。
细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）是1991年Schmidt-wolf率先发现的，他采用人外周血单个核细胞，在体外经过多种细胞因子诱导扩增，获得的一群非MHC限制的异质细胞，具有强大的杀伤肿瘤细胞能力，其主要表面标志是CD3+CD56+。
CIK细胞与其他免疫细胞相比，具有增值速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血功能影响轻微等优点。
近20年来，国内外大量论文报道了自体CIK细胞治疗恶性肿瘤病人的结果。2010年，有学者报道了75例胃癌病人接受自体CIK细胞治疗联合化疗，中位生存时间为49个月，而对照组（单纯使用化疗）中位生存时间仅为27个月，即采用化疗联合CIK治疗后，肿瘤病人生存期延长1倍【孔炯，蒋敬庭，吴昌平．CIK细胞治疗胃癌者的相关临床因素对其预后的影响．临床肿瘤学杂志，2010，15(4)：295-299】。2011年，有学者评价了119例肾细胞癌患者接受自体CIK细胞治疗的结果，结果显示，CIK细胞治疗能显著改善III、IV期肾细胞癌患者的预后【张静，刘亮，于津浦．细胞因子诱导的杀伤细胞治疗肾细胞癌临床疗效的评价．中国肿瘤生物治疗杂志2011，18（5）：480-484】。
但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种CIK细胞及其制备方法和应用单个核细胞库及其构建和应用。本发明通过利用构建的正常健康人单个核细胞库诱导制备CIK细胞，获得的CIK细胞具有较强的增殖力，CD3+、CD8+和CD3+CD56+细胞的比例较高，并且具有较佳的治疗肿瘤效果。
为解决上述技术问题，本发明的CIK细胞的制备方法，包括步骤：
第一步，构建正常健康人单个核细胞库，其构建步骤包括：
（1）取正常健康人外周血，经检测后，收集外周血的单个核细胞部分，并对单个核细胞计数；
其中，所述检测包括：ABO/Rh血型检测和病原微生物免疫检测；病原微生物免疫检测包括：梅毒螺旋体血清学试验检测、HIV抗体检测、丙型肝炎抗体检测、乙型肝炎表面抗原检测、无菌试验检测；
收集外周血的单个核细胞部分的方法包括：方法A和方法B；其中，方法A，包括步骤：
1）经检测后的正常健康人外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；
其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；
2）将步骤1）获得的血液稀释液轻轻地加入到淋巴细胞分离液的界面上，注意不要破坏界面；
其中，血液稀释液与淋巴细胞分离液的体积比为2:1；
3）离心，收集中间层，获得单个核细胞；其中，离心的转速为1500～2500转/分钟，离心时间为15～20分钟，优选为2000转/分钟，离心时间为20分钟。本步骤中，经离心，血液会分层，红细胞位于底层，单个核细胞位于中间层。
方法B，包括步骤：（1）检测后的正常健康人，经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集正常健康人的外周血单个核细胞。
（2）将步骤（1）收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；其中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟。
（3）在单个核细胞中加入冷冻保护剂，经程序降温（如降温至-80℃）后，置于液氮中冷冻，并建立可供检索的细胞信息档案，从而构建出正常人的单个核细胞库；
其中，冷冻保护剂是含10%（体积百分比）DMSO的培养基，该培养基是由70%（体积百分比）RPMI1640培养液和20%（体积百分比）FBS（胎牛血清）所构成。
第二步，利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞，其步骤包括：
解冻复苏冻存于单个核细胞库中的单个核细胞后，该细胞在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2的诱导下，或在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体、重组人IL-2和重组人IL-1的诱导下，或在重组人纤维蛋白片段（可用市售产品）、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2的诱导下，或在重组人纤维蛋白片段、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2和重组人IL-1的诱导下，经诱导培养13～21天，其中，每隔2～3天传代培养一次，从而获得CIK细胞。
其中，对于第二步的利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞，其具体方法为采用方法I或方法II进行操作，具体如下：
方法I包括步骤：
①取单个核细胞库中的单个核细胞，解冻复苏
取冻存于液氮的单个核细胞库中的单个核细胞，于37℃水浴中，快速解冻后，加入完全培养基，离心，弃上清，获得冻存复苏的单个核细胞沉淀物；
其中，完全培养基，包括：含10%FBS的RPMI1640细胞培养液；
离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟；
②在冻存复苏的单个核细胞中，按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素（γ-IFN）的完全培养基，放入37℃、5%（浓度百分比）二氧化碳的培养箱中，开始诱导培养；
③步骤②的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/ml抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/ml重组人IL-2，放入37℃、5%二氧化碳的培养箱中，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13天～21天，从而获得CIK细胞。步骤③的继续诱导培养中，可每2～3天用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/mL重组人IL-2和100～500IU/mL重组人IL-1的完全培养基进行传代培养，细胞大量扩增，如诱导19天后，最大可扩增600多倍，如果以3×107细胞接种，可获得1.8×1010以上的CIK细胞。
方法II包括步骤：
按照1×106/mL复苏的单个核细胞，加入到包被有1～10μg/ml重组人纤维蛋白片段和1～10μg/ml抗人CD3单克隆抗体的培养板中，然后，加入500～2000IU/mlγ干扰素和500～2000IU/ml重组人IL-2开始诱导培养，并用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/ml重组人IL-2和100～500IU/ml重组人IL-1的完全培养基进行传代培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞。
所述利用所构建的单个核细胞库诱导制备CIK细胞中，整个诱导培养的时间为13天～21天，如诱导培养19天后，可终止培养。
另外，本发明公开了一种如上所述的CIK细胞制备方法所制备的CIK细胞。
再者，本发明又公开了一种细胞制剂，包括：上述的制备的CIK细胞。
同时，本发明还公开了一种上述CIK细胞的应用，如该CIK细胞可在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明获得的CIK细胞，既具有强大杀伤肿瘤细胞能力，也具有极大的扩增能力。正常健康人事先存储外周血单个核细胞于细胞库中，待将来患有肿瘤后，从细胞库中取出，复苏后，诱导大量扩增成为CIK细胞，用于自身肿瘤的治疗；也可根据HLA配型，提供他人治疗肿瘤。本发明的单个核细胞库的构建及诱导CIK细胞成本低廉，富有应用前景，如可用于治疗肿瘤。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是经冻存的健康人外周血单个核细胞诱导制备的光镜下的CIK细胞形态图；其中，A为诱导第0天(光镜放大100倍)，B为诱导第1天（光镜放大200倍），C为诱导第2天（光镜放大100倍），D为诱导第7天（光镜放大100倍）。
图2是经冻存的健康人外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞生长曲线图。
图3是经冻存的健康人外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤肿瘤细胞活性图。
图4是流式细胞仪检测图；其中，A为诱导制备CIK细胞前；B为诱导制备CIK细胞的第19天。
具体实施方式
以下实施例中，所用的原料或试剂除特别说明外，均为市售可得。
另外，以下实施例中，涉及的完全培养基为含10%（体积百分比）FBS的RPMI1640培养液；冷冻保护剂是含10%（体积百分比）DMSO的培养基，其中，该培养基是由70%（体积百分比）RPMI1640培养液和20%（体积百分比）FBS（胎牛血清）所构成。
实施例1
一、单个核细胞库的构建
（1）取正常人外周血30ml，经严格检测程序（流式细胞仪CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测，ABO/Rh血型检测，梅毒螺旋体血清学试验检测，HIV抗体检测，丙型肝炎抗体检测，乙型肝炎表面抗原检测，无菌试验等），确定安全性后，加入等体积的RPMI1640培养液（Invitrogen公司），充分混匀。
（2）将步骤（1）获得的倍比稀释的外周血60ml，加入到30ml淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）（比重1.077）的界面上（不要破坏界面），以2000转/分钟，离心20分钟，取中间层——富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20ml。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99%。
（3）将步骤（2）获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。以1×107个细胞中，加入1mL冷冻保护剂，放入冻存管中密封，并放入含有异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）冻存盒内。
（4）将冻存盒置于4℃冰箱放置15分钟，然后放入-80℃冰箱过夜。
（5）次日，将细胞放入-196℃液氮中长期保存。液氮罐采用Thermofisher公司。留取小部分细胞储存在-80℃冰箱里，作为库存产品信息的复查样本。所有样本信息包括：姓名，地址，联系方式，流式细胞仪检测信息，ABO/Rh血型信息，传染病检测信息，无菌试验信息等输入电脑，建立完整的数据档案备询。
至此，单个核细胞储存库建成。
二、解冻单个核细胞，诱导制备CIK细胞
（1）根据资料信息，在单个核细胞库中，查询到相应的冻存的单个核细胞。取冻存的单个核细胞，放入37℃水浴中，快速融化，复苏细胞。
（2）按照1×107单个核细胞中，加入5ml完全培养基，充分混匀，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
（3）在离心获得的下层细胞沉淀中，加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整细胞浓度为1×106/ml。
（4）按照1×106/ml细胞，加入1000IU/mlγ-IFN（Peprotech公司），置37℃、5%CO2培养箱中，开始诱导培养。
其中，刚复苏的健康人外周血单个核细胞呈悬浮生长，大小均一，折光性一致（如图1-A所示）。
（5）步骤（4）的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入1μg/ml抗人CD3单克隆抗体（Biolegend公司）和1000IU/mL重组人IL-2（Peprotech公司），置37℃、5%CO2培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，CD3+CD56+双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强（非MHC限制性）。
其中，单个核细胞中加入γ-IFN，经培养24小时后（诱导第1天），光镜观察发现，细胞活化透亮，折光性强（如图1-B所示）。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2，经培养24小时后（诱导第2天），光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细胞明显增大（如图1-C所示）。
（6）诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/mL重组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞（中国科学院细胞库）活性。
（7）此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
其中，在诱导第7天时，肉眼下即可观察到白色斑点，光镜下观察发现，细胞集落明显增多、增大，大集落成黑团，看不清细胞形态，周边游离细胞饱满折光性好，大小形态各异（如图1-D所示）。
三、按照以上方法进行诱导制备CIK细胞的相应检测结果
1、检测CIK细胞扩增倍数
检测方法为：按1×106单个核细胞/孔，接种在24孔板内，按照上述方法进行诱导制备CIK细胞和细胞换液，第7天开始换成25平方厘米细胞培养瓶培养，对诱导的第0、4、7、10、13、16、19天，取1mL样本，通过血细胞计数仪（日本光电公司，MEK-6410P），进行CIK细胞扩增倍数检测，取5次试验结果的平均值，绘制生长曲线，结果如图2所示。
其中，CIK细胞在诱导培养的第4天开始增值，第7天到第16天进入快速增长期，16天后增殖速度趋缓，第19天CIK细胞最高增殖622倍，最低271倍，平均增殖462.2倍。
2、CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测
经冻存的健康人外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测方法为：取对数生长的K562肿瘤细胞，用含有体积百分比为10%FBS的IMDM培养液，调整细胞数为5×104/mL，每孔100μL，铺于96孔板中，每组设4个复孔。取第7、10、13、16、19天CIK细胞，及未经培养的单个核细胞，用完全培养基调整诱导的CIK细胞数为1×106/mL，取100μL加入96孔板中，效靶比（即CIK细胞：K562肿瘤细胞）20：1，设空白对照组、效应细胞对照组和靶细胞对照组，置37℃、5%CO2培养箱中，培养48小时后，加入20μL CCK-8（日本同仁化学研究所产品），继续孵育5小时，显黄色，采用Thermofisher公司multiscanFC酶联仪，双波长，参比波长620mm、检测波长450mm检测OD值。取4次试验结果的平均值，绘制杀伤率曲线，结果如图3所示。
杀伤率的计算公式如下：
其中，
效靶细胞组OD值为：CIK细胞和K562靶细胞组检测的波长450nmOD值－波长620nmOD值。
效应细胞组OD值为：单纯CIK细胞检测的波长450nmOD值－波长620nmOD值。
靶细胞组OD值为：K562靶细胞组检测的波长450nmOD值－波长620nmOD值。
空白对照组OD值为：完全培养基和10%FBS的IMDM培养液混合后，检测的波长450nmOD值－波长620nmOD值。
由图3可知，冻存后的单个核细胞经过1-19天的诱导，第7天，CIK细胞杀伤靶细胞K562活性最高，平均达95.3%（范围95.3±4.2%），此后逐步下降，第19天最低，平均82%（范围82±10%）。
3、流式细胞仪进行诱导的CIK细胞检测
采用流式细胞仪（BD公司FACS Calibur），对诱导前的外周血单个核细胞和诱导后的第19天进行CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测，结果分别如图4-A、4-B所示。其中，诱导CIK细胞前，外周血单个核细胞的CD3+为52.84%，CD4+为36.58%,CD8+为24.98%，CD3+CD56+为1.35%；诱导CIK细胞的第19天，CD3+为98.91%，CD4+为1.56%,CD8+为91.37%，CD3+CD56+为63.72%。
4、CIK细胞表型测定
用pH7.4的1×PBS调整细胞密度至1×106/mL，加入到流式细胞检测管中，200μL/管，分别加入不同荧光标记的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗体（BD公司），置暗处，4℃标记20分钟，pH7.4的1×PBS洗涤2次，1500转/分钟，离心5分钟，1%甲醛固定后，用流式细胞仪检测。取5次试验结果的平均值，结果见表1。
从表1可以看出，随着诱导时间的延长，CIK主要效应细胞CD3+CD56+双阳性细胞所占比例大幅上升，第19天达到均数为56.4%,范围为49.5%-63.3%。
表1冻存的健康人单个核细胞诱导CIK细胞表型的变化
实施例2
一、单个核细胞库的构建
（1）采用COBE Spectra型血细胞分离机（Gambro BC公司）上的淋巴细胞采集程序，单采正常人外周血单个核细胞30mL，经严格检测程序（流式细胞仪CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测，ABO/Rh血型检测，梅毒螺旋体血清学试验，HIV抗体检测，丙型肝炎抗体检测，乙型肝炎表面抗原检测，无菌试验等），确定安全性后，加入等体积的RPMI1640培养液，充分混匀。
（2）取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99%。
（3）将步骤（1）的含有培养液的单个核细胞，以1500转/分钟，离心7分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。以1×107个细胞中，加入1ml冷冻保护剂，放入冻存管中密封。
（4）将冻存管放入thermofisher 1284型程控降温仪，按照-1℃/分钟的速率降温，直到-80℃，然后，直接放入-196℃液氮中长期保存。液氮罐采用Themofisher公司。
（5）留取小部分细胞储存在-80℃冰箱里，作为库存产品信息的复查样本。所有样本信息包括：姓名，地址，联系方式，流式细胞仪检测信息，ABO/Rh血型信息，传染病检测信息，无菌试验信息等输入电脑，建立完整的数据档案备询。
至此，单个核细胞储存库建成。
二、解冻单个核细胞，诱导制备CIK细胞
（1）根据资料信息，在上述构建的单个核细胞库中，查询到相应的冻存单个核细胞。取冻存的单个核细胞，放入37℃水浴中，快速融化，复苏细胞。
（2）按照1×107单个核细胞中，加入5ml完全培养基，充分混匀，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
（3）在离心获得的下层细胞沉淀中，加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整细胞浓度为1×106/mL。
（4）按照1×106/mL细胞，加入1000IU/mLγ-IFN，置37℃、5%CO2培养箱中，开始诱导培养。
（5）培养24小时后，在培养的细胞中，加入50ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500IU/mL重组人IL-2，置37℃、5%CO2培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。
（6）诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含500IU/mL重组人IL-2和200IU/mL重组人IL-1（Peprotech公司）的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
（7）此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终止培养。
以上方法均在严格无菌环境内进行。
实施例3
一、单个核细胞库的构建
（1）取正常人外周血30mL，经严格检测程序（流式细胞仪CD3、CD4、CD8、CD3CD56检测，ABO/Rh血型检测，梅毒螺旋体血清学试验，HIV抗体检测，丙型肝炎抗体检测，乙型肝炎表面抗原检测，无菌试验等），确定安全性后，加入30ml的RPMI1640培养液，充分混匀。
（2）将步骤（1）获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液（比重1.077）的界面上（不要破坏界面），以2500转/分钟，离心15分钟，取中间层——富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99%。
（3）将步骤（2）获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。以1×107个细胞中，加入1mL冷冻保护剂，放入冻存管中密封。
（4）将冻存管放入thermofisher 1284型程控降温仪，按照-1℃/分钟的速率降温，直到-80℃，然后，直接放入-196℃液氮中长期保存。液氮罐采用Themofisher公司。
（5）留取小部分细胞储存在-80℃冰箱里，作为库存产品信息的复查样本。所有样本信息包括：姓名，地址，联系方式，流式细胞仪检测信息，ABO/Rh血型信息，传染病检测信息，无菌试验信息等输入电脑，建立完整的数据档案备询。
至此，单个核细胞储存库建成。
二、解冻单个核细胞，诱导制备CIK细胞
（1）根据资料信息，在上述构建的单个核细胞库中，查询到相应的冻存单个核细胞。取冻存的单个核细胞，放入37℃水浴中，快速融化，复苏细胞。
（2）按照1×107单个核细胞中，加入5ml完全培养基，充分混匀，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
（3）在离心获得的下层细胞沉淀中，加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整细胞浓度为1×106/ml。
（4）按照1×106/mL细胞，加入到事先包被的24孔培养板上。加入2000IU/mLγ-IFN，置37℃、5%CO2培养箱中，开始诱导培养。
包被方法如下：将50μl浓度为1μg/μl RetroNectin（北京宝日医生物技术有限公司）和50μl浓度为1μg/μl抗人CD3单克隆抗体,加入到10ml pH7.2 PBS（Invitrogen公司）中，配置成包被液。24孔板中的每孔中加1ml包被液，4℃,避光，过夜，24小时后，弃包被液，PBS洗涤1次，完全培养基洗涤1次。
（5）诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含2000IU/mL重组人IL-2完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
（6）此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终止培养。
以上方法均在严格无菌环境内进行。
综上所述，本发明制备的CIK细胞，可应用于制备抗肿瘤药物中，以提高治疗肿瘤效果。
Claims (9)
1.一种CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
第一步，构建正常健康人单个核细胞库，其构建步骤包括：
（1）取正常健康人外周血，经检测后，收集外周血的单个核细胞部分，并对单个核细胞计数；
（2）将步骤（1）收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；
（3）在单个核细胞中加入冷冻保护剂，经程序降温后，置于液氮中冷冻，并建立供检索的细胞信息档案，从而构建出正常人的单个核细胞库；
第二步，利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞，其步骤包括：
解冻复苏冻存于单个核细胞库中的单个核细胞后，该细胞在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2的诱导下，或在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体、重组人IL-2和重组人IL-1，或在重组人纤维蛋白片段、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2的诱导下，或在重组人纤维蛋白片段、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2和重组人IL-1的诱导下，经诱导培养13～21天，其中，每隔2～3天传代培养一次，获得CIK细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，检测包括：ABO/Rh血型检测和病原微生物免疫检测；其中，病原微生物免疫检测包括：梅毒螺旋体血清学试验检测、HIV抗体检测、丙型肝炎抗体检测、乙型肝炎表面抗原检测、无菌试验检测。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，收集外周血的单个核细胞部分的方法包括：方法A和方法B；
其中，方法A包括步骤：
1）经检测后的正常健康人外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2 PBS缓冲液稀释，充分混匀；
其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；
2）将步骤1）获得的血液稀释液加入到淋巴细胞分离液的界面上；
3）1500～2500转/分钟，离心15～20分钟，收集中间层，获得单个核细胞；
方法B包括步骤：检测后的正常健康人，经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集正常健康人的外周血单个核细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟；
步骤（3）中，冷冻保护剂是含体积百分比为10%DMSO的培养基，该培养基是由体积百分比为70%RPMI1640培养液和体积百分比为20%FBS所构成；程序降温后，降温至-80℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步的利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞中，其具体方法为采用方法I或方法II进行操作，其中，
方法I包括步骤：
①取单个核细胞库中的单个核细胞，解冻复苏；
②在复苏的单个核细胞中，按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素的完全培养基，开始诱导培养；
其中，完全培养基，包括：含体积百分比为10%FBS的RPMI1640细胞培养液；
③步骤②的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/ml抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/ml重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞；
方法II包括步骤：
按照1×106/mL复苏的单个核细胞，加入到包被有1～10μg/ml重组人纤维蛋白片段和1～10μg/ml抗人CD3单克隆抗体的培养板中，然后，加入500～2000IU/mlγ干扰素和500～2000IU/ml重组人IL-2，开始诱导培养，并用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/ml重组人IL-2和100～500IU/ml重组人IL-1的完全培养基进行传代培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤③的继续诱导培养中，每2～3天用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/ml重组人IL-2和100～500IU/ml重组人IL-1的完全培养基传代培养。
7.一种CIK细胞，其特征在于，所述CIK细胞是由如权利要求1-6任一项所述的方法所制备的CIK细胞。
8.一种细胞制剂，其特征在于，包括：如权利要求7所述的CIK细胞。
9.一种如权利要求7所述的CIK细胞的应用，其特征在于：所述CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140618 |