CN111690607A - 一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，包括，主要成分为Anti‑CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL‑2、IL‑1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL‑2、IL‑21的扩增液。本发明构建了一种NK及CIK细胞体外共培养的试剂盒，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，使NK及CIK细胞的培养标准化、简单化。

Description

一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及培养方法

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗技术领域，涉及一种高效杀伤细胞(CNK)体外培养试剂盒及培养方法。

技术背景

从上个世纪八九十年代起，过继性细胞治疗技术应用于肿瘤免疫治疗研究领域一直是热点质疑，主要包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等。

自然杀伤细胞(Natural Killer Cells；NK)在抗病毒、抗肿瘤及抗感染等免疫防御中扮演重要的角色。由于NK细胞不表达T、B淋巴细胞具有的抗原识别受体(TCR或BCR)，以及其他特有标志而曾经被称为裸细胞。通常将CD₃ ^-、TCR^-、BCR^-、CD₅₆ ⁺、CD₁₆ ⁺的淋巴细胞认为是NK细胞。其中又以CD₅₆ ⁺的表达密度不同将其分为CD₅₆ ^bright和CD₅₆ ^dim，前者高表达CD₅₆、CD₉₄/NKG2A和CD₆₂L；后者高表达CD₁₆、PEN5、KIR和FLA-1。]NK细胞杀伤肿瘤不受MHC限制，也无需预先致敏，其表面存在的大量不同的特异性和反应活性受体与靶细胞配体相结合，激活NK细胞产生细胞毒性作用。NK细胞主要通过其表面的杀伤细胞活化受体(Killer activationreceptor，KAR)及杀伤细胞抑制受体(Killer inhibitory receptor，KIR)。在正常机体反应中，KIR与细胞表面的MHCI类分子结合产生抑制信号；并且相对于糖类抗原与KAR结合产生的活化信号占主导地位，而当细胞产生病变时表面的MHCI类分子表达降低或者缺失，NK被活化释放细胞毒性颗粒等杀伤病变细胞。

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine inducedkiller cells,CIK)是由人外周血单个核细胞在体外经过多种细胞因子共同诱导得到的一群异质细胞。CIK细胞同时表达CD₃和CD₅₆两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。在正常人外周血中较为罕见CD₃ ⁺CD₅₆ ⁺仅占1％-5％，但经过体外多因子联合培养后增值倍数可达500倍以上。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等特点而被广泛用于过继性免疫治疗中。

随着肿瘤治疗技术的发展与进步，过继性免疫治疗应用于肿瘤治疗取得了一定的临床疗效。近年来，免疫细胞联合放化疗、抗体治疗、疫苗治疗联合使用治疗肿瘤也取得长足进展，同时多种免疫细胞治疗随着肿瘤治疗技术发展而逐步被关注，NK细胞联合CIK细胞用于实体肿瘤治疗是临床肿瘤治疗较为常见。细胞收获分别回输或者混合回输。临床肿瘤细胞治疗NK和CIK细胞免疫治疗的细胞数量与纯度在临床应用上没有明确规定，实际中，许多临床试验中采用NK细胞治疗数量不少于2.0×10⁹，NK细胞纯度(细胞表型CD3^-CD56⁺)≥60％，CIK细胞细胞治疗数量不少于5.0×10⁹，CIK细胞纯度(细胞表型CD3⁺CD56⁺)≥30％。但由于外周血中NK细胞含量少，目前国内外各研究机构的报道提出了不同的扩增方法，主要基于IL-2、IL-12、IL-15的扩增体系，体外诱导培养NK细胞困难大、扩增效率及NK细胞纯度低，其细胞扩增倍数及杀伤活性有限，尚缺乏有效的体外扩增体系。CIK培养技术虽较为成熟，但由于容易受到试剂因子及实验人员技能影响，导致CIK纯度(细胞表型CD3⁺CD56⁺)存在一定不稳定性。鉴于上述情况开发一种新型、高效、操作简便体外扩增自然杀伤细胞(NK)和CIK试剂及细胞培养方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于构建一种能同时高效共培养NK和CIK细胞的体外培养试剂盒及培养方法，方便临床上同时培养一次回输两种细胞，使细胞培养操作简便，提高细胞纯度和杀伤活性，又能降低培养成本。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，包括，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

作为进一步的方案，所述包被液1ml、诱导液1ml、扩增液1ml。

作为一种可能方案，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度范围为100μg/ml～1000μg/ml；肝素钠有效浓度范围为500IU/cm²～2000IU/cm²。

作为进一步的方案，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为500μg/ml；肝素钠有效浓度为1000IU/cm²。

作为一种可能方案，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度范围分别为10ng/ml～100ng/ml、100IU/ml～500IU/ml、100IU/ml～500IU/ml和20ng/ml～50ng/ml。

作为进一步的方案，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为50ng/ml、250IU/ml、500IU/ml和25ng/ml。

作为一种可能方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为1000IU/ml～2000IU/ml和200IU/ml～1000IU/ml。

作为进一步的方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为1500IU/ml、500IU/ml。

一种利用前述试剂盒培养高效杀伤细胞的培养方法，包括下列步骤：

(1)配制包被液：吸取1ml包被液与4ml缓冲液混合于一个悬浮培养瓶中，包被液孵育悬浮培养瓶2小时，使用前去除包被液。

(2)制备PBMC：采集肝素钠抗凝人外周血20-30ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用；用缓冲液按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用缓冲液重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数。

(3)制备ACTM培养基及NK细胞和CIK细胞的活化:吸取1ml诱导液加入200ml无血清培养液内配制成ACTM培养基；用20ml含10％自体灭活血浆ACTM培养基重悬单个核细胞，接种到包被瓶内，细胞密度范围为2-3×10⁶个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养，Day3、Day5补加ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml。

(4)制备EXPM培养基:吸取1ml扩增液按加入2L无血清培养液内配制成EXPM；

(5)NK细胞及CIK细胞的扩增：Day7转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM培养基，细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(6)细胞检测：培养至Day14，收获细胞并洗涤计数、检测，其中通过流式细胞仪检测NK(CD3-CD56+)和CIK(CD3+CD56+)细胞所占比例，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过构建一种能同时高效共培养NK和CIK细胞的体外培养试剂盒及培养方法，利用同一个细胞培养周期、同一个培养体系内培养出两类效应细胞。解决了以前针对过继性细胞免疫治疗所提倡的多细胞联合治疗，而传统的诱导单一效应细胞的方式，不但增加了细胞培养人员的操作负担，而且相对而言增加了耗材等的消耗，从而加重患者的经济支出。即本发明摒弃传统的诱导单一效应细胞的观念，同时诱导两类效应细胞，既达到了多细胞治疗的目的，又减少了不必要的耗材浪费从而降低经济成本。

(2)本发明提供的试剂盒与培养方法，培养周期为14天，培养周期短，即可收获高纯度、高数量、高杀伤力的NK及CIK两种效应细胞；

(3)本发明NK及CIK细胞培养方法，只需采集患者外周血20-30ml，采血量少，且无需使用细胞分选等系统，减轻患者痛苦及医疗成本。

(4)本发明试剂盒无需额外添加复杂的试剂及因子，为NK及CIK细胞联合培养提供标准化，减少细胞培养误差，是一个实用性高、操作简便的商品化试剂盒。

(5)试剂盒性能稳定，2-8℃保存，有效期长达9个月。

(6)试剂盒采用的成分均为临床治疗级别药物或因子，避免了外源性动物成分的带入，对细胞培养无毒副作用。

综上所述，本发明在现有的NK及CIK细胞培养的基础上，开发出NK及CIK细胞共培养的试剂盒，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，使NK及CIK细胞的培养标准化、简单化。为细胞治疗临床广泛应用和研提供了优质的培养方案。本发明试剂及方法的构建不仅使细胞培养操作简便，同时体外培养扩增效率好、细胞纯度高、杀瘤活性强。

附图说明

图1本发明培养方法在Day3细胞生长图。

图2本发明培养方法在Day5细胞生长图。

图3本发明培养方法在Day7细胞生长图。

图4本发明培养方法与常规方法细胞生长曲线图。

图5为本发明培养方法细胞培养到Day14流式分析检测的结果图。

图6为常规方法NK细胞培养到Day14流式分析检测的结果图。

图7为常规方法CIK细胞培养到Day14流式分析检测的结果图。

图8本发明培养方法与常规方法细胞培养到Day14对MOLT-4细胞杀伤性试验图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：

1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。

2、试剂：鲎试剂、除热原吸嘴、除热原空安瓿、内毒素工作标准品(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)，支原体液体培养液、硫乙醇酸盐流体培养液、胰酪大豆胨液体培养液(珠海经济特区益民生物制品厂)，恒温自动加热仪、台盼蓝染色液、PBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505N-0无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，IgG1-APC、IgG1-FITC、CD56-APC、CD3-FITC(美国贝克曼公司)，MOLT-4细胞株(遵义医学院珠海校区研发中心提供,)MTT试剂盒、二甲亚砜、胎牛血清，人淋巴细胞分离液、肝素钠溶液。

3、仪器与设备：离心机(THERMO，美国)、T75cm²悬浮培养瓶、T225cm²悬浮培养瓶、细胞培养袋(日本NIPRO株式会社)、CO₂培养箱(三洋，中国)、程控降温仪(THERMO，美国)、超净工作台(智净、中国)、50ml离心管(BD，美国)、96孔板、酶联免疫检测仪、移液管、血细胞计数盘(株式会社细胞科学研究所CSTI)、液氮罐。

实施例一：

本实施例用于介绍本发明一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及其制备和试剂盒质量检测，本发明所述高效杀伤细胞(CNK)特指NK和CIK细胞的组合，本发明所述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(NK细胞和CIK细胞)，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，使NK及CIK细胞的培养标准化、简单化。

一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，包括，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。本实施例具体为所述包被液1ml、诱导液1ml、扩增液1ml。

所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度范围为100μg/ml～1000μg/ml；肝素钠有效浓度范围为500IU/cm²～2000IU/cm²。具体地，本实施例所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为500μg/ml；肝素钠有效浓度为1000IU/cm²。

所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度范围分别为10ng/ml～100ng/ml、100IU/ml～500IU/ml、100IU/ml～500IU/ml和20ng/ml～50ng/ml。具体地，本实施例所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为50ng/ml、250IU/ml、500IU/ml和25ng/ml。

所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为1000IU/ml～2000IU/ml和200IU/ml～1000IU/ml。具体地，本实施例所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为1500IU/ml、500IU/ml。

构建本发明所述试剂盒的理论依据为：

本发明试剂盒所述的包被液，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠。CD3分子与TCR以非共价键结合形成TCR-CD3复合物，其主要功能是把TCR与抗原结合后产生的活化信号传递到细胞内，诱导T细胞活化。NK细胞表达CD3ζ链，当用CD3抗体刺激NK细胞时，ζ链发生酪氨酸磷酸化促进NK细胞活化。肝素可结合多种细胞因子及细胞生长因子，如IL-2，IL-21，IL-1α，成纤维细胞生长因子等。此外，肝素表面具有负电荷，可与培养瓶底紧密结合。在培养瓶底部，结合肝素分子的IL-2，可以与结合抗CD3抗体的NK细胞接触，从而激活NK细胞，达到NK细胞优势活化的目的。

本发明试剂盒所述的诱导液主要成分为Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林。CD28可以增加T细胞的活化,并且可以促进IL-2的生成,CD28可以促进抗原特异性的多克隆T细胞的增殖,对初始CD4T细胞活化具有重要作用,CD28的阳性表达与T细胞的细胞毒作用有关,是重建有效抗肿瘤应答的关键因素。Anti-CD28可以和NK细胞可表达低亲和性的IgGFcRIII结合刺激活化NK细胞，对血液病患者外周血NK细胞诱导效果更为明显，同时Anti-CD28单抗通过与T细胞表面的CD28-TCR复合体结合使T细胞激活、大量增值，并与TCR介导的抗体结合以提高CIK杀伤活性CIK细胞的体外扩增需要多种细胞因子协同，促使T细胞大量表达IL-2受体，产生更多内源性IL-2，使T细胞活化，以大量扩增免疫活性细胞，并提高其中CD3⁺CD56⁺细胞的绝对和相对计数。而IL-2可以促进NK细胞的活化、诱导、增殖和促进T细胞增生、IL-1α可提高CIK细胞毒活性。沙培林在体外刺激产生NK细胞激活因子(NKAF)诱导NK细胞活化增值，沙培林可诱导生成INF-γ、IL-2等淋巴因子能增强NK细胞的杀伤活性,同时INF-γ、IL-2可促进诱导CIK细胞生成促进其增殖。

本发明试剂盒所述的扩增液主要成分为IL-2、IL-21两种细胞因子，体外研究均显示IL-2可以促进NK细胞、T细胞活化增殖。IL-21由活化的CD4⁺T细胞分泌,能激活并促进NK和T淋巴细胞增殖，在刺激NK细胞增殖及活化等方面与IL-2有许多相似性，都可以IL-2受体复合物β、γ链结合有关，然而IL-21还可结合于1个新的α链，即IL-21受体，故IL-21促进造血干细胞定向分化为NK细胞，并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活方面有显著的作用，既可以提高CIK纯度，也协同IL-15促进骨髓前体包增殖和NK细胞增殖、分化和细胞毒活性。IL-2、IL-21因子优化组合对促进NK细胞的活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。

本发明涉及的一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒制备方法：

(1)物料准备：准备配制包被液、诱导液、扩增液所需的各类原辅料。

(2)包被液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-AC加入CD3和肝素钠中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-AC冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-AC定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(3)诱导液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-AC加入IL-2、IL-1α、CD28、沙培林中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-AC冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-AC定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(4)扩增液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-EX加入IL-2、IL-21中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-EX冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-EX定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

4.半成品质检：分别对上述包被液、诱导液、扩增液取样，进行PH、渗透压、内毒素检测；

5.分装：符合质检要求后用无菌针头式滤器过滤，按1ml/支分装于无菌冻存管内；

6.包装：经质量检测后将诱导液、刺激液、活化液、扩增液各1支装入包装盒中。

试剂盒质量检测

1.内毒素检测

本发明中试剂盒内毒素检测凝胶法鲎试剂及相关消耗品购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，鲎试剂规格为0.1ml/支，λ＝0.06，内毒素标准品规格为15EU/支。

内毒素检测操作步骤

取细菌内毒素工作标准品一支配制2λ内毒素标准溶液，阴性对照液，

浓度为2λ的内毒素标准溶液做为阳性对照液。取出鲎试剂，分别用除热源吸头加入0.1ml检查用水，轻摇使鲎试剂完全溶解；在溶解的鲎试剂安瓿瓶内分别加入0.1ml的阴性对照液、阳性对照液和供试品液，用封口膜封闭管口轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温器中孵育60min±2min，期间避免振动。

内毒素检测结果判定

孵育结束，将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不成凝胶或者虽呈凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记为(-)；只有当阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，实验方为有效，否则无效。

内毒素检测结果见表1

2.支原体检测

将本试剂盒产品各组分，取100ul到支原体液体培养液内，微需氧环境，35-37℃培养3～7天，观察液体培养液是否变浑浊。

若液体培养液变浑浊再转种支原体固体培养液，微需氧环境，35-37℃继续培养3-7天，观察生长菌落，进行支原体确认。

支原体检测结果见表1。

3.真菌及细菌检测

将本试剂盒检测样品试剂接种于硫乙醇酸盐流体培养液及胰酪大豆胨液体培养液中，置于35-37℃条件下，培养3-7天观察结果；

结果判定：若样品检测管7天均澄清无菌生长，判供试品符合规定；若样品检测管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供若样品检测不符合规定。

检测结果：真菌及细菌检测见表1

实施案例一结果:

表1

作为另外一种实现，一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，包括，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液；所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为100μg/ml；肝素钠有效浓度为500IU/cm²；所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为10ng/ml、100IU/ml、100IU/ml和20ng/ml；所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为1000IU/ml、200IU/ml。

作为又一种实现，一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，包括，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液；所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为1000μg/ml；肝素钠有效浓度为2000IU/cm²；所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为100ng/ml、500IU/ml、500IU/ml和50ng/ml；所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为2000IU/ml、1000IU/ml。

实施例二、试剂盒稳定性检测

1.CNK细胞制备

(1)培养瓶抗体包被：吸取1ml包被液在T-75cm²培养瓶中，加入4ml生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，让溶液在培养培养瓶表面扩散。在室温下，孵育1小时或者保存在4℃直到使用前取出。移除包被溶液，用生理盐水清洗培养瓶一次，洗过的培养瓶要立即使用。

(2)单个核细胞分离

随机抽取健康志愿者3名，采集健康志愿者肝素钠溶液抗凝的人类外周血30ml，缓慢注到两管分别注有15ml淋巴细胞分离液上，室温条件下离心，离心力800xg离心20分钟。离心后血液被分为4层，用无菌吸管采集上层的血浆，倒入灭菌过的离心管中，56℃加热血浆30分钟，保存在冰箱中，备用。用吸管将第2层单核细胞收集至灭菌过的离心管中。加入生理盐水稀释收集细胞，通过500xg离心10分钟沉淀细胞。倒弃或吸取以移除上清液。以生理盐水清洗细胞重复一次。

(3)制备ACTM培养基及NK细胞和CIK细胞的活化:吸取1ml诱导液加入200mlALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM培养基；单个核细胞接种到包被瓶(T75)添加自体灭活血浆1ml和19ml ACTM培养基内，使细胞密度范围为2-3×10⁶个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养，Day3、Day5补加ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，其中，Day3补加ACTM培养基40ml、Day5补加ACTM培养基140ml，且转移至容量较大培养瓶(T225)。

(4)制备EXPM培养基:吸取1ml扩增液按加入2.3L ALyS505N-0内配制成EXPM；

(5)NK细胞及CIK细胞的扩增：Day7转到2个细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM培养基，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养；其中，2个细胞培养袋每次分别补液250、400、500ml。

(6)细胞检测：培养至Day14，收获细胞并洗涤计数，通过流式细胞仪检测NK(CD3^-CD56⁺)和CIK(CD3⁺CD56⁺)细胞所占比例，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

2、稳定性检测结果

试剂盒效期	细胞数量	细胞活率	CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>	CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>
					一个月	1.0×10<sup>10</sup>	>95％	48％	35％
三个月	9.6×10<sup>9</sup>	>95％	52％	30％
					六个月	9.3×10<sup>9</sup>	>95％	50％	36％
九个月	9.4×10<sup>9</sup>	>95％	49％	30％

注：上表数据为3次实验结果取平均值。

表2

实施案例三

采集1名健康志愿者人外周血，分离单个核细胞，进行本发明NK和CIK细胞联合培养方法(简称实验组)与NK和CIK细胞单独培养常规方法(简称NK常规组、CIK常规组)同时进行细胞培养，观察三种方法在细胞增殖倍数、NK细胞表型及杀瘤活性差异。

本发明培养方法包括以下步骤：

(1)配制包被液：吸取1ml包被液与4ml磷酸盐缓冲液(PBS)混合于一个T75cm²培养瓶中，包被液孵育T75cm²悬浮培养瓶2小时，接种前弃掉包被液并用10ml PBS洗涤培养瓶。

步骤(1)中的包被液包含Anti-CD3抗体及注射用肝素钠，Anti-CD3抗体为重组DNA衍生的人源化单克隆抗体。并且，是由悬浮培养于无菌培养基中的哺乳动物细胞产生，经过特定病毒灭活和去除处理，采用亲子色谱法和离子交换法纯化，肝素钠为临床注射用肝素钠试剂。步骤(1)所述包被液包被培养瓶为T75cm²悬浮细胞培养瓶，包被技术不做特殊要求，采用本领域技术人员熟知的手工包被，本发明中优选包被时间2小时，同时用不含钙、镁离子PBS洗涤二次。步骤(1)包被液中的Anti-CD3抗体有效浓度在100μg/ml_～1000μg/ml之间，肝素钠有效浓度在500IU/cm²～2000IU/cm²之间，本发明实施例Anti-CD3抗体浓度为500μg/cm²，肝素钠浓度为1000IU/cm²。

(2)制备PBMC：采集肝素钠抗凝人外周血20ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用(冷却至室温后离心取上清保存于4-8℃备用)，制备单个核细胞：用PBS按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用PBS重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数。

步骤(2)灭活方式采用水浴灭活或者恒温加热仪(BASO)灭活，本发明实施例采用恒温加热仪灭活，减小污染风险；相对离心力优选2000×g，离心时间优选为5min充分去除变性的补体蛋白等成分。步骤(2)中优选CSTI生产的无钙、镁离子的PBS；淋巴细胞分离液无特殊要求，选用操作人员常用产品即可；离心机品牌及离心环境无特殊要求，选用操作人员常用、熟知的即可。洗涤细胞时，为最大限度保证细胞的活性及安全性，本发明也可以选用ALyS505NK-AC无血清培养基(CSTI)洗涤三次，此时，细胞培养时的背景更为干净、清晰。

(3)制备ACTM培养基及NK细胞和CIK细胞的活化：:吸取1ml诱导液加入200mlALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM培养基；单个核细胞接种到包被瓶(T75)添加自体灭活血浆1ml和19mlACTM培养基内，使细胞密度范围为2-3×10⁶个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养，Day3、Day5补加ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，其中，Day3补加ACTM培养基40ml、Day5补加ACTM培养基140ml，且转移至容量较大培养瓶(T225)。

步骤(3)中为了模拟细胞在机体内的温度环境，更好地启动细胞生长，ALyS505NK-AC无血清细胞培养基在使用前需要回温处理，本发明实施例回温条件为35℃～37℃30min，并添加5％的自体血浆。步骤(3)中的诱导液成分包含Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林，有效浓度范围分别为10ng/ml～100ng/ml、100IU/ml～500IU/ml、100IU/ml～500IU/ml和20ng/ml～50ng/ml。本发明实施例中浓度分别为50ng/ml、250IU/ml、500IU/ml和25ng/ml，所含成分均优选临床用药级别。

(4)制备EXPM培养基:吸取1ml扩增液按加入2.3L ALyS505N-0内配制成EXPM；

步骤(4)中扩增液成分包含IL-2及IL-21其有效浓度分别为1000IU/ml～2000IU/ml和200IU/ml～1000IU/ml，本发明实施例优选浓度分别为1500IU/ml和500IU/ml，所含因子均优选临床用药级别。

(5)NK细胞及CIK细胞的扩增：为了保证细胞生长过程中气体交换，满足细胞生长需要，Day7转到2个细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM培养基，细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。具体地，培养到Day7将细胞平均转至两个NIPRO细胞培养袋中并将500ml含有IL-2的ALyS505N-0无血清培养液均分至细胞培养袋内；Day7、Day9，2个细胞培养袋每次分别补液400、500ml。优选日本细胞科学研究所株式会社生产的ALyS505N-0为扩大培养用培养基。如图1、2、3所示依次为Day3、Day5和Day7细胞生长图。

(6)细胞检测：细胞培养至Day14，收获细胞并洗涤计数，通过流式细胞仪检测CD₃ ^-CD₅₆ ⁺细胞CD₃ ⁺CD₅₆ ⁺细胞所占比例，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。步骤(6)中表型检测指标为CD3-CD56+(NK)及CD3+CD56+(CIK)两类；其余检测项目所用的试剂和仪器不作特定要求，按照实际情况及操作员熟练技术进行检测即可。

NK细胞单独培养常规方法，包括以下步骤：

(1)采集40ml外周血小心地将注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃水浴锅内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用。吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次，最后一次洗涤需要进行计数。

(2)取50μgAnti-CD16在T75 cm²培养瓶中，加入4mL生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，让溶液在培养培养瓶表面扩散。在室温下，孵育1小时或者保存在4℃直到使用前取出。移除包被溶液，用生理盐水清洗培养瓶两次，洗过的培养瓶要立即使用。

(3)将单个核细胞接种到培养瓶，加入含IL-2(700IU/ml)、IL-15(20IU/ml)、IL-12(10IU/ml)和IL-7(20IU/ml)的ALyS505N-0无血清细胞培养液40ml，单个核细胞密度大于1.0×10⁶个/ml，加入5ml灭活自体血浆，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，计天为Day0。Day3、补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505N-0无血清细胞培养液，Day5将细胞转移到T175cm²培养瓶中补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505N-0无血清细胞培养液。Day7转入细胞培养袋中扩大培养，补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505N-0无血清细胞培养液。

(4)细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪检测CD₃ ^-CD₅₆ ⁺细胞和CD₃ ⁺CD₅₆ ⁺细胞所占比例。

CIK细胞单独培养常规方法，包括以下步骤：

(1)采集40ml外周血小心地将注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃水浴锅内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用。吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次，最后一次洗涤需要进行计数。

(2)在T-75cm²的细胞培养瓶中加入含10％灭活自体血浆细胞培养液，重悬细胞调整细胞密度≥1.5x10⁶cells/ml，并添加IFN-γ(1000IU/ml)，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养；24h后，培养瓶中加入Lymactin-T(50μg)、IL-2(1000IU/ml)、IL-1α(100IU/ml)，继续培养；Day3加入ALyS505N-0培养基50ml含IL-2(1000IU/ml)、Day5转入细胞培养袋中扩大培养，补加含10％自体灭活血浆及IL-2(1000IU/ml)的ALyS505N-0的培养基。

(3)细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪检测CD₃ ^-CD₅₆ ⁺细胞和CD₃ ⁺CD₅₆ ⁺细胞所占比例。

结果测试

收集由本实施例所述实验组及常规组培养Day14细胞用于各项测试，从以下几个方面比较这两种制备方法获得细胞的差异。

1、细胞增殖倍数的测定

收获培养Day14细胞，用台盼蓝染色并用血球计数板计算细胞总数，实际扩增倍数＝当前细胞总数/初始单个核细胞数，数值即为细胞扩增的增殖倍数，从附图4可看出实施例所述实验组及常规组明显差异，本发明培养方法能够满足临床应用。

2、CD₃ ^-CD₅₆ ⁺NK和CD₃ ⁺CD₅₆ ⁺CIK细胞表型检测

收获培养Day14细胞，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷个/ml，各取两个管分别加入100μl的细胞悬液，每组内一管加5μl IgG1-APC及10μl IgG1-FITC作为同型对照，另一管加5μl CD₅₆-APC及10μl CD₃-FITC作为样品检测；共同冰浴30min后检测。从附图5、6、7可看出实施例所述实验组及常规组明显差异，显示本发明试剂盒及培养方法优秀的联合培养能力。

3、NK及CIK细胞对MOLT-4细胞的杀伤效果

利用MTT法检测其细胞毒性，收集对数生长期的MOLT-4细胞离心计数并调整密度为1×10⁵个/ml。在试验孔中按5:1、10:1、20:1一一对应加入效应细胞及靶细胞各100μl，37℃、5％CO₂培养箱共培养15h，然后每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)继续培养4h，弃掉上清并每孔加入Formazan溶解液110μl/孔，置于摇床低速振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处检测吸光值。计算公式为：细胞毒作用(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞A值)/单独靶细胞A值]×100％。如图8所示，本发明一种NK细胞和CIK细胞联合培养试剂盒及培养方法所获得的NK细胞和CIK细胞展现出较高杀瘤活性。

Claims (9)

1.一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，其特征在于，包括，主要成分为Anti-CD3抗体及注射用肝素钠的包被液，主要成分为抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α、沙培林的诱导液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液1ml、诱导液1ml、扩增液1ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度范围为100μg/ml～1000μg/ml；肝素钠有效浓度范围为500IU/cm²～2000IU/cm²。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为500μg/ml；肝素钠有效浓度为1000IU/cm²。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度范围分别为10ng/ml～100ng/ml、100IU/ml～500IU/ml、100IU/ml～500IU/ml和20ng/ml～50ng/ml。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为50ng/ml、250IU/ml、500IU/ml和25ng/ml。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为1000IU/ml～2000IU/ml和200IU/ml～1000IU/ml。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为1500IU/ml、500IU/ml。

9.一种利用权利要求1-8中任何一个试剂盒培养高效杀伤细胞的培养方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)配制包被液：吸取1ml包被液与4ml缓冲液混合于一个悬浮培养瓶中，包被液孵育悬浮培养瓶2小时，使用前去除包被液。

(2)制备PBMC：采集肝素钠抗凝人外周血20-30ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用；用缓冲液按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞。用缓冲液重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数。

(3)制备ACTM培养基及NK细胞和CIK细胞的活化:吸取1ml诱导液加入200ml无血清培养液内配制成ACTM培养基；用20ml含10％自体灭活血浆ACTM培养基重悬单个核细胞，接种到包被瓶,，细胞密度范围为2-3×10⁶个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养，Day3、Day5补加ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml。

(4)制备EXPM培养基:吸取1ml扩增液按加入2.3L无血清培养液内配制成EXPM；

(5)NK细胞及CIK细胞的扩增：Day7转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM培养基，细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(6)细胞检测：培养至Day14，收获细胞并洗涤计数、检测，其中通过流式细胞仪检测NK和CIK细胞所占比例，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

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