CN112424343A - 从脐带血产生cik nkt细胞 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于培养CIK NKT细胞的方法和定制的培养基组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月10日提交的美国临时申请号62/696,131的优先权，该申请通过引用并入本文。
背景技术
自然杀伤T细胞(NKT细胞)代表表达自然杀伤(NK)细胞表面标志物的T淋巴细胞的子集。NKT细胞的子集(称为恒定NKT细胞(iNKT))表达高度受限的T细胞受体(TCR)。尽管iNKT细胞在连接先天性和适应性免疫反应中起重要作用并且已经涉及多种疾病，例如感染性疾病、过敏、哮喘、自身免疫和肿瘤监测(Juno等PLoS Pathog.2012；8(8))，它们的激活通常需要CD1d限制性脂质配体α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)。引入Gal-Cer(例如以Gal-Cer/CD1d四聚体的形式)所需的程序可以显著地增加使用这些NKT细胞治疗患者的费用并且在一些情况下限制它们的治疗性用途的范围。因此，对可用于治疗具有广泛组织类型的患者的安全且有成本效益的NKT细胞疗法的需求仍然存在。
发明内容
本文提供了可以在不存在Gal-Cer的情况下被激活的CIK NKT细胞。在一些实施方式中，大于50％的所述CIK NKT细胞群体中的所述细胞表达CD 56和CD3并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。还提供了包含来自所述群体的多个CIK NKT细胞的组合物和试剂盒。还提供了产生所述CIN NKT细胞和使用所述细胞治疗癌症的方法。
本公开提供了一种CIK NKT细胞的群体，其中大于50％的所述群体中的所述细胞表达CD 56和CD3并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
任选地，所述CIK NKT细胞的群体可以在不存在α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)的情况下杀伤靶细胞。任选地，所述靶细胞是癌细胞。所述癌细胞系可以选自髓性白血病细胞、髓母细胞瘤细胞和单核细胞。任选地，所述癌细胞选自K562细胞、Daudi细胞、DAOY细胞和THP-1细胞。
任选地，所述CIK NKT细胞以1.0至10.0之间的EC50杀伤多个所述靶细胞。任选地，所述CIK NKT细胞可以以不小于所述CIK NKT细胞在存在Gal-Cer的情况下杀伤所述靶细胞的所述EC50的90％且不大于所述EC50的110％的EC50杀伤所述靶细胞。
本公开还提供了一种组合物，其包含来自上述CIK NKT细胞的群体中的任一者的多个CIK NKT细胞和生理上可接受的赋形剂。
还提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含来自上述CIK NKT细胞的群体中的任一者的多个CIK NKT细胞和容器和/或显示所述试剂盒是用于治疗癌症的标签。
还提供了一种从脐带血样品中富集CIK NKT细胞的方法，所述方法包括：从所述脐带血样品中分离单核细胞；和使分离的单核细胞与选自IL-7、ALT-803或IL-15、FLT3配体和Gal-Cer的一种或多种试剂接触，从而富集CIK NKT细胞。IL-7，如果存在，浓度范围可以是5至20ng/mL。ALT-803，如果存在，浓度范围可以是100至300ng/mL。FLT3配体，如果存在，浓度范围可以是5至20ng/mL。Gal-Cer，如果存在，浓度范围可以是2至10μg/mL。
任选地，所述方法还包括从所述脐带血样品的其余部分分离富集的CIK NKT细胞。任选地，所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与抗CD3、抗CD28和IL2接触以扩增所述CIK NKT细胞。任选地，所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与Gal-Cer接触。任选地，所述Gal-Cer以载有Gal-Cer的CD1d四聚体的形式被使用。任选地，所述抗CD3抗体以5ng/mL至60ng/mL的量存在。任选地，所述抗CD28抗体以0.1μg/mL至2μg/mL的量存在。任选地，IL-2以50ng/mL至500ng/mL的浓度存在。任选地，CIK NKT细胞的富集和/或扩增不包括干扰素-γ。
还提供了一种通过上述的富集、分离和扩增CIK NKT细胞的方法产生的CIK NKT细胞的群体。
还提供了一种在有需要的患者中治疗癌症或病毒感染的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的来自如上所述的CIK NKT细胞的群体中的任一者的CIK NKT细胞，从而治疗癌症。任选地，将每平方米所述患者的体表面积约1x108至约1x1011个细胞施用于患者。任选地，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病、肉瘤和癌。任选地，通过选自静脉内的、腹膜内的和皮下的途径将所述细胞施用于所述患者。任选地，所述方法进一步包括施用抗体。
还提供了权利要求1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞表达CAR和/或细胞因子，并且大于50％的所述CIK NKT细胞群体中的所述细胞表达CD 56和CD3和小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
前述的一般描述和以下的详细描述是示例性和说明性的并且旨在提供对本公开的进一步说明。其他目的、优点和新颖特征对本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
当结合附图考虑以下公开时，参考所述公开将更容易地理解所述目的、特征和优点。
图1是CIK NKT细胞用来杀伤靶细胞的途径的示意图。
图2A显示了用CD3、CD56和Va24染色的CIK NKT细胞的流式细胞术分析的结果。图2A是前向散射图和尺寸散射图；图2B显示了CD3和CD56图；和图2C显示了Va24图。
图3A显示了在存在(以圆圈表示)或不存在(以正方形表示)下脐带血CIK NKT细胞对DAOY细胞的杀伤。图3B显示了脐带血CIK NKT细胞(以正方形表示)或外周血iNKT细胞(以圆圈表示)对表达荧光素酶的THP1细胞的杀伤。
图4显示了脐带血CIK NKT细胞对K562细胞、DAOY细胞和Daudi细胞的杀伤。
具体实施方式
概述
本公开提供了细胞因子诱导的杀伤NKT细胞(CIK NKT细胞)，其可以以非CD1d限制性方式(例如，不依赖于Gal-Cer/CD1d四聚体的形成)杀伤靶细胞。CIK NKT细胞可用于靶向广泛范围的靶细胞并且不会触发移植物抗宿主疾病(GVHD)。GVHD发生是由于淋巴细胞潜入器官(例如肠道、皮肤和肝脏)并在其中引起大量炎症的侵入性能力。已经显示CIK NKT不表达对靶向GVHD器官而言重要的趋化因子受体但表达有助于归巢至肿瘤的受体，因此它们不会触发GVHD。如与生成CIK NKT细胞的现有技术(其一般会产生由CD3+、CD56+单阳性细胞和CD3+/CD56+双阳性细胞组成的异质性群体，并且所述双阳性细胞通常占30％或更少)相比，本方法产生主要由CD3+/CD56+双阳性细胞组成的细胞群体。在一个方面中，所述群体中至少50％的CIK NKT细胞表达CD56和CD3两者并且所述群体中少于10％的细胞表达Va24。产生CIK NKT细胞的方法不需要将细胞暴露于干扰素-γ，这节省了成本。因此，本申请提供了安全且有成本效益的NKT细胞疗法，其可广泛用于治疗各种疾病(例如癌症)而不会引起临床上不良反应(例如GVHD)。
本公开还提供了包含来自所述群体的多个CIK NKT细胞的组合物和试剂盒。还提供了产生所述CIK NKT细胞和使用所述CIK NKT细胞以治疗癌症的方法
术语
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在本说明书和随后的权利要求中将提及许多术语，所述术语应被定义为具有以下含义：
本文中所使用的术语仅出于描述特定的实施方式的目的而无意于进行限制。如在本文中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”旨在同样地包括复数形式，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一个(a)自然杀伤细胞”的提及包括多个自然杀伤细胞。
所有数字标识(例如pH、温度、时间、浓度、量和分子重量，包括范围)是在适当的情况下以0.1或1.0的增量变化((+)或(-))的近似值。应当理解，尽管并非总是明确指出，但是所有数字标识之前都可以加上术语“约”。
如在本文中所使用的，当用于指示特定细胞标志物的存在时，“+”指细胞标志物相对于同种型(isotype)对照可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或在定量或半定量RT-PCR中可在背景以上检测到。
如在本文中所使用的，当用于指示特定细胞标志物的存在时，“-”指细胞标志物相对于同种型对照并未可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或在定量或半定量RT-PCR中无法在背景以上检测到。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，特别是在提供书面说明方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围均可以容易地被认为是充分描述了被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的相同范围，并使其成为可能。作为非限制性实施例，本文讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员也将理解的，所有语言(例如“高达”、“至少”、“大于”、“少于”等等)均包括所列举的数字，并且指的是可以随后被分解为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，以此类推。
还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其相等物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”指随后描述的事件或情况下会或不会发生，并且所述描述包括事件或情况发生的实例和事件或情况没有发生的实例。
术语“包含(comprising)”旨在表示所述组合物和方法包含所列举的要素，但不排除其他的。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”应表示排除对组合物有任何实质意义的其他要素。例如，基本上由本文所定义的要素组成的组合物将不排除不会实质地影响权利要求的基本和新颖特征的其他要素。“由……组成”应表示排除多于痕量的其他成分和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方式在本公开的范围内。
如在本文中所使用的，术语“细胞毒性”和“细胞溶解的”在用于描述效应细胞(例如NK细胞)的活性时意为同义的。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物的、生化的或生物物理的机制中的任一种对靶细胞的杀伤。细胞溶解更具体地指效应子裂解靶细胞的细胞质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀伤。不希望被理论束缚，认为NK细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。
关于细胞/细胞群体的术语“杀伤”旨在包括会导致该细胞/细胞群体的死亡的任何类型的操纵。
术语“细胞因子(cytokine或cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于FLT2配体、干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞(无论是在体外还是原位)。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
术语“治疗/疗法(treating/treatment)”涵盖在受试者(例如人)中对本文所述的疾病或病症的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或病症，即导致疾病的消退；(iii)缓解病症的发展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的发展。向受试者“施用(administering/administration)”单克隆抗体或自然杀伤细胞(术语)包括引入或递送抗体或细胞以执行预期功能的任何途径。可以通过适用于细胞或单克隆抗体递送的任何途径实现施用。因此，递送途径可以包括静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的递送。在一些实施方式中，例如通过至肿瘤的注射将CIK NKT细胞直接施用于肿瘤。在一些实施方式中，肠外施用(例如通过注射、输注或植入(皮下的、静脉内的、肌内的、囊内的或腹膜内的)本文所述的修饰的CIK NKT细胞。
术语“表达”是指基因产物的产生。
如在本文中所使用的，术语“细胞毒性”在用于描述效应细胞(例如NK细胞)的活性时涉及通过多种生物的、生化的或生物物理的机制中的任一种对靶细胞的杀伤。
术语“减少(decrease/reduce/reduction/decrease)”在本文中全部用于表示相比于参照水平减少至少10％，例如减少至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至多且包括100％(即相比于参照样品没有水平)，或相比于参照水平减少10-100％之间的任何幅度。
术语“癌症”指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，其包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、软巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。另外的实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、胰腺内分泌和外分泌肿瘤和前列腺癌。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指相对于未经治疗的患者减轻疾病症状所需的量。用于实施本公开内容以治疗疾病的活性化合物的有效量取决于施用方式，受试者的年龄、体重和总体健康状况。最终，主治医生或兽医将决定适当的量和剂量方案。这种量被称为“有效”量。
为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，其不旨在影响本公开的范围。另外，在下文更具体地定义了本说明书中使用的某些术语。
细胞因子诱导的杀伤自然杀伤T细胞(CIK
NKT细胞)
自然杀伤T细胞是T细胞的异质性群组，其共享T细胞和自然杀伤细胞的特性。例如，NKT细胞表达αβT细胞受体，但也表达通常与NK细胞相关联的各种分子标志物，例如NKp44、NKp46和NKp30。NKT细胞仅构成所有外周血T细胞的约0.1％。NKT细胞已涉及对自身免疫和移植排斥的抑制，对病原体抵抗的促进，以及对肿瘤免疫的促进。
通常基于T细胞受体(TCR)使用的差异将NKT细胞分为I型和II型。I型NKT细胞(通常也称为恒定NKT细胞)是表达高度受限的T细胞受体的NKT细胞，其包含恒定的TCRα链，Va24。
恒定NKT细胞通常是通过识别CD1d呈递的脂质配体α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)来激活的。CD1d是在各种抗原呈递细胞的表面上表达的糖蛋白的CD1家族的成员，并参与脂质抗原的呈递。与分别向CD8+和CD4+ T细胞呈递蛋白抗原的I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)分子相反，CD1分子可以捕获和加工外来和自身脂质抗原以向T细胞展示。Gal-Cer通常源自致病性细胞(例如细菌)。
与I型NKT细胞相比，II型NKT细胞具有更多样化的TCR库和更高的序列多样性。II型NKT细胞不响应Gal-Cer，即它们的激活不依赖于Gal-Cer的存在。
本文公开的CIK NKT细胞属于II型NKT细胞的类别。CIK NKT细胞可以通过细胞因子诱导来产生。在一些情况下，它们是通过例如细胞因子诱导从脐带血产生的。在一些情况下，它们是在从脐带血样品中富集或分离iNKT细胞的过程中产生的。但是，CIK NKT细胞在多个方面不同于典型的iNKT细胞。表型上，不同于表达Va24(TCR受体的α链的标志物)的iNKT细胞(并且表达Va24的iNKT细胞的百分比可以是70％或更高)，CIK NKT细胞具有减少的Va24的表达。例如，表达Va24的CIK NKT细胞的百分比可以少于CIK NKT细胞的整个群体的10％。就细胞毒性而言，不同于通过识别α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)(一种糖脂)激活的iNKT细胞，不需要Gal-Cer来激活CIK NKT细胞并且所述CIK NKT细胞可以在不存在(Gal-Cer)的情况下杀伤细胞。见图3和图4。
因此，就表型而言，本文提供的CIK NKT细胞通常具有高表达水平的CD56和CD3以及低表达的Va24。在一些情况下，至少90％的由脐带血细胞产生的CIK NKT群体表达CD56和CD2，并且所述群体中少于10％的细胞表达Vα24。
分离和培养CIK NKT细胞的方法
收集脐带血
人脐带血具有高的造血干细胞成分并且可以用作产生CIK NKT细胞的来源。为了收集脐带血，通常，人胎盘在生产后不久就被采收。可以在无菌、隔热的运输装置中(例如在如美国专利号7,147,626中所述的脐带血收集试剂盒中)运输胎盘(将胎盘的温度保持在20-28℃之间)。优选地，胎盘在分娩后四到二十四小时被运送至实验室。
可以对胎盘进行常规的脐带血采收过程。通常在重力作用下使用针或套管来放血胎盘(参见例如Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等,美国专利号5,415,665)。通常将针头或套管放入脐静脉并且可以轻柔的按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。这样的脐带血采收可以商业地进行，例如LifeBank Inc.,Cedar Knolls,N.J.,ViaCord,Cord BloodRegistry和CryoCell。优选地，重力排出胎盘而无需进一步的操作，以最小化脐带血采收过程中的组织破坏。
收集脐带血的方法(例如在US20150225697中所述的)是众所周知的。可以使用本领域公知的方法(例如使用Ficoll-Paque的密度梯度法)从收集的脐带血中分离脐带血单核细胞(Comics)。适用于分离Comics的试剂可以例如从Stem cell Technology Inc.商购获得。
富集CIK NKT细胞
可以在各种细胞因子的存在下培养Comics一段时间以对CIK NKT细胞进行富集。富集指增加异质性细胞群体(例如Comics)中靶细胞数目的百分比。富集阶段可以是2天至3周，例如1-2周、5-10天或约2周。可以使用各种生长培养基，例如洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培养基(RPMI)或Dulbecco氏改良的eagle培养基(DMEM)。任选地，所述培养基进一步包含人AB血清和/或Gal-Cer。任选地，所述人AB血清以5-15％v/v(例如约10％v/v)存在。任选地，所述Gal-Cer以2-10μg/mL(例如约5μg/mL)的浓度存在。可以添加至所述培养基的合适的细胞因子可以包含选自干细胞因子、FLT3配体、IL-7和ALT-803或IL-15的一种或多种细胞因子。在一些实施方式中，FLT3配体以范围在5-20ng/mL(例如10ng/mL)的浓度存在；IL-7以范围在5-20ng/mL(例如10ng/mL)的浓度存在；和/或ALT-803以范围在100-300ng/mL(例如约175ng/mL)的浓度存在。
FLT3配体是造血四螺旋束细胞因子并且它在结构上与干细胞因子(SCF)和集落刺激因子1(CSF-1)同源。在与其他生长因子的协同作用下，FLT3配体刺激各种血细胞祖细胞的增殖和分化。它是刺激树突状细胞生长的主要生长因子。
ALT-803是由人IL-15突变体IL-15N72D(位置72处的残基置换)和IL-15Rαsushi-Fc融合蛋白组成的复合物(参见Zhu等J.Immunol.2009；183:3598-607，相关公开通过引用并入本文)。
可以通过本领域公知的方法从上述富集的培养物中分离CIK NKT细胞，例如将所述富集的培养物与偶联针对TCR的Va24-J18链的抗体的磁珠孵育，使得所述CIK NKT细胞将结合至所述磁珠，并且随后分离在磁场的存在下结合至所述珠的所述CIK NKT细胞。可以使用的合适抗体中的一个实例是6B11抗体，其可以从供应商(例如Biolegend(San Diego,CA))商购获得。用于分离CIK NKT细胞的合适试剂来自Miltenyi Biotec,Germany。CIK NKT细胞通常在含PBC的血清(例如人AB血清)中分离。任选地，分离溶液还包含EDTA。
因此，本文提供了一种从脐带血富集CIK NKT细胞的方法，所述方法包括：从脐带血样品，所述方法包括：从脐带血样品分离单核细胞；和使分离的单核细胞与选自IL-7、ALT-803、FLT3配体和Gal-Cer的一种或多种试剂接触以富集CIK NKT细胞。
扩增CIK NKT细胞
如上分离的CIK NKT细胞可以在合适的生长培养基中扩增。扩增是指使靶细胞的分离的群体生长以使靶细胞数量增加。在一些实施方式中，所述生长培养基是NK Macs培养基，其可从Miltenyi Biotec,Germany获得。在一些实施方式中，所述生长培养基补充有适用于NKT细胞生长的量的IL-2、抗CD3和/或抗CD28。在一些实施方式中，所述抗CD3抗体以5ng/mL至60ng/mL(例如20ng/mL)的浓度存在。在一些实施方式中，所述抗CD28抗体以0.1μg/mL至2μg/mL(例如0.5μg/mL)的浓度存在。在一些实施方式中，IL-2以50ng/mL至500ng/mL(例如200ng/mL)的浓度存在。在一些实施方式中，所述生长培养基包含人AB血清(例如约10％v/v)。在一些实施方式中，所述生长培养基进一步包含载有Gal-Cer的CD1d四聚体。在一些实施方式中，所述载有Gal-Cer的CD1d四聚体是可从例如ProImmune(Oxford,UK)商购的预组装的四聚体。组装所述载有Gal-Cer的CD1d四聚体的方法是众所周知的。通常，将Gal-Cer脂质与CD1d蛋白共孵育，其在链霉亲和素表面寡聚以形成四聚体。在Gal-Cer结合至CD1d复合物之后，将其纯化并用作用于扩增的试剂。用于制备所述载有Gal-Cer的CD1d四聚体的一些示例性方法描述于www.proimmune.com/ecommerce/pdf_files/PS_DE000-RPE_V1.1％20％28CD1d％20Tetramer％20Empty％20％28R-PE％20Labeled％29％29.pdf和proimmune.com/ecommerce/pdf_files/ST14.pdf中。在一些实施方式中，所述载有Gal-Cer的CD1d四聚体的用量使得所述生长培养基中的所述Gal-Cer的浓度为约20-200ng/mL，例如50-150ng/mL或80-120ng/mL或约100ng/mL的Gal-Cer。在一些实施方式中，使所述CIK NKT细胞生长并扩增几天或几周以达到适合各种应用的合适数量的细胞。
因此，本公开提供了一种从脐带血生长CIK NKT细胞的方法，所述方法包括：从脐带血样品，所述方法包括：从脐带血样品分离单核细胞；和使分离的单核细胞与选自IL-7、ALT-803、FLT3配体和Gal-Cer一种或多种试剂接触以富集CIK NKT细胞。
表型分型所述CIK
NKT细胞
在某些实施方式中，可以通过检测一种或多种功能相关的标志物(例如CD56和CD3(NKT细胞的标志物)和TCR受体Va24(其高表达表明NKT细胞是恒定NKT细胞))来评估CIKNKT细胞群体。
在一些实施方式中，本文提供了一种CIK NKT细胞群体，其相比于典型的恒定NKT细胞包含较低百分比的Va24+细胞。所述CIK NKT细胞群体包含约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的Va24+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含0-20％、5-10％、1-7％或4-8％的Va24+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含不超过20％、不超过15％、不超过10％的Va24+细胞。
在一些实施方式中，本文提供了一种CIK NKT细胞群体，其包含与典型的恒定NKT细胞群体中的CD56+细胞的百分比基本相似的百分比的CD56+细胞。所述CIK NKT细胞群体包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％的CD56+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含50-100％、70-100％、85-100％、90-100％、95-100％或98-100％的CD56+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含不少于50％、不少于70％、不少于85％、不少于90％、不少于93％或不少于95％的所述CD56+细胞。
在一些实施方式中，本文提供了一种CIK NKT细胞群体，其包含与典型的恒定NKT细胞群体中的CD3+细胞的百分比基本相似的百分比的CD3+细胞。所述CIK NKT细胞群体包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％的CD3+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含50-100％、70-100％、85-100％、90-100％、95-100％或98-100％的所述CD3+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含不少于50％、不少于70％、不少于85％、不少于90％、不少于93％或不少于95％的所述CD3+细胞。
在一些实施方式中，本文提供了一种CIK NKT细胞群体，其包含与典型的恒定NKT细胞群体中的CD56+CD3+细胞的百分比基本相似的百分比的CD56+CD3+细胞。所述CIK NKT细胞群体包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％的CD56+CD3+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含50-100％、70-100％、85-100％、90-100％、95-100％或98-100％的所述CD56+CD3+细胞。在一些实施方式中，所述CIK NKT细胞群体包含不少于50％、不少于70％、不少于85％、不少于90％、不少于93％或不少于95％的所述CD56+CD3+细胞。
所述CIK NKT细胞的细胞毒性
任选地，可以例如在使用肿瘤细胞(例如培养的K562、DAOY、THP-1、LN-19、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1或U266肿瘤细胞等)作为靶细胞的细胞毒性测定中评估分离的或富集的自然杀伤细胞的细胞毒性。本文公开的CIK NKT细胞可以杀伤靶细胞，不管MHC类型，并且不管αGal-Cer的存在。
用于评估细胞毒性的测定(例如MTT测定)是众所周知的。这是基于四唑合物MTT的系统。简而言之，在靶细胞与CIK NKT细胞接触的治疗期之后，将10μL的新鲜稀释的MTT溶液(2.5mg mL-1)加至每个孔，并将板在37℃下湿润的5％CO2气氛中孵育4小时。在孵育期结束时，除去培养基，并将甲瓒产物溶解在100μL的二甲基亚砜中。使用SUNRICE Tecan吸光度读取器(Schoeller)，通过测量570nm处的吸光度来评估细胞活力。由通过绘制细胞存活(％)相对于药物浓度(μM)而构建的曲线计算产生50％细胞生长抑制的化合物浓度(IC50)。将读取值转换为对照的百分比(细胞存活百分比)。细胞杀伤测定的非限制性方法包括磺酰罗丹明B(SRB)测定、中性红(NR)测定(例如www.rsc.org/suppdata/mt/c4/c4mt00112e/c4mt00112e1.pdf中所述的那些，其全部内容通过引用并入本文)。
CIK NKT细胞杀伤靶细胞的效能可以用EC50来评估。在本公开中使用的EC50是指在50％的靶细胞被杀伤的测定中使用的效应物与靶标的比率。在一些实施方式中，CIK NKT细胞能够以1-10(例如1-8、2-6、2-5.5或3-7)的EC50杀伤多个靶细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是THP-1并且所述EC50是4.64。在一些实施方式中，所述靶细胞是DAOY并且所述IC50是3.69。在一些实施方式中，所述靶细胞是K562并且所述IC50是2.6。
修饰的CIK NKT细胞
嵌合抗原受体
如上产生的CIK NKT细胞可以被进一步工程化以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。任选地，所述CAR对肿瘤特异性抗原具有特异性。通过非限制性实例的方式在US2013/0189268、WO1999024566A1、US 7098008和WO 2000020460A1中描述了肿瘤特异性抗原，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于NKG2D、CS1、CS2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19和CD33。可以在表1中找到另外的非限制性的与肿瘤相关的抗原和与其相关的恶性肿瘤。
表1：肿瘤特异性抗原和相关的恶性肿瘤
在一些实施方式中，所述CAR靶向CD19、CD22或CSPG-4。
在实施例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行定点诱变(Carter,1986；Zoller和Smith，1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知的技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
任选地，所述CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。任选地，所述癌症选自白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病(包括粒细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核的和红白血病))和慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞的)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病、固体瘤包括但不限于肉瘤和癌例如纤维肉瘤、黏肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞瘤肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、血管瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在一些实施方式中，使编码CAR的多核苷酸突变以改变编码CAR的氨基酸序列而不改变CAR的功能。例如，可以在以上公开的CAR中进行导致“非必需”的氨基酸残基处的氨基酸置换的多核苷酸置换。可以如例如在专利公开号WO 2014039523、US 20140242701、US20140274909、US 20130280285和WO 2014099671(其每一个的全部内容通过引用并入本文)中所述的工程化CAR。任选地，所述CAR是CD19 CAR、CD33 CAR或CSPG-4CAR。
另外的修饰-细胞因子
在一些实施方式中，进一步修饰表达CAR的CIK NKT细胞以使其表达至少一种细胞因子。在特定的实施方式中，所述至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在优选的实施方式中，所述细胞因子是IL-12。IL-12的代表性多肽包含在登录号IF45_A(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1F45_A)中所示的氨基酸序列和在登录号IF45_B(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1F45_B)中所示的氨基酸序列或由其组成。
治疗性应用
本公开还提供了一种在疾病的任何阶段治疗受试者中的任何类型的癌症的方法。合适的癌症的非限制性实例包括癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施方式中，本发明用于治疗造血来源的癌症，例如白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，所述癌症是固体瘤。
在一些实施方式中，所述治疗受试者中的任何类型的癌症的方法包括向患者施用治疗有效量的CIK NKT细胞，其中从而治疗癌症。所述CIK NKT细胞来自CIK NKT细胞的群体，其中大于90％的所述群体中的所述细胞表达CD 56和CD3，并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
本公开还提供了一种治疗任何类型的病毒感染的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的CIK NKT细胞，其中从而治疗癌症。所述CIK NKT细胞来自CIK NKT细胞的群体，其中大于90％的所述群体中的所述细胞表达CD 56和CD3，并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
还提供了用本文所述的CIK NKT细胞治疗有需要的受试者的方法。在一些实施方式中，所述受试者或患者患有癌症或感染性疾病(例如病毒感染)。
可以将CIK NKT细胞以绝对数的细胞施用于个体，例如可以向所述个体施用约1000个细胞/次注射至高达约100亿个细胞/次注射，例如约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103(以此类推)个CIK NKT细胞/次注射或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。因此，本公开还提供了一种包含多个CIK NKT细胞的组合物，其中细胞数为1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103或5×103个(以此类推)。
在其他实施方式中，可以向所述个体施用约1000个细胞/次注射/m2至高达约100亿个细胞/次注射/m2，例如约、至少约或至多约1×108/m2、1×107/m2、5×107/m2、1×106/m2、5×106/m2、1×105/m2、5×105/m2、1×104/m2、5×104/m2、1×103/m2、5×103/m2(以此类推)个CIK NKT细胞/次注射或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。
在其他实施方式中，可以将CIK NKT细胞以绝对数的细胞施用于这样的个体，例如可以向所述个体施用约1000个细胞至高达约100亿个细胞每千克所述个体，例如约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103或5×103(以此类推)个CIK NKT细胞每千克所述个体或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。
在其他实施方式中，总剂量可以通过体表面积的m2来计算，其包括约1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107个每m2或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。人均约1.6至约1.8m2。在优选的实施方式中，约10亿至约30亿个CIK NKT细胞被施用于患者。在其他实施方式中，每剂量注射的CIK NKT细胞的量可通过体表面积的m2来计算，其包括1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107个每m2。人的平均体表面积为1.6-1.8m2。
在其他实施方式中，可以将CIK NKT细胞以绝对数的细胞施用于这样的个体，例如可以向所述个体施用约1000个细胞至高达约100亿个细胞每千克所述个体，例如约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103或5×103(以此类推)个CIK NKT细胞每千克所述个体或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。
CIK NKT细胞可以对癌症患者施用一次，或者它们可以被多次施用，例如治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或所述数中的任何两个之间的任何范围(包括端点在内)。
在一些实施方式中，CIK NKT细胞以包含CIK NKT细胞和培养基(例如人血清或其等同物)的组合物的形式施用。在一些实施方式中，所述培养基包含人血清白蛋白。在一些实施方式中，所述培养基包含人血浆。在一些实施方式中，所述培养基包含约1％至约15％人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，所述培养基包含约1％至约10％人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，所述培养基包含约1％至约5％人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，所述培养基包含约2.5％人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，所述血清是人AB血清。在一些实施方式中，使用可接受用于人治疗中的血清替代物而非人血清。这样的血清替代物可以是本领域已知的或者在未来被开发的。尽管可以使用超过15％的人血清浓度，但预期大于5％的浓度将会是成本高昂的。在一些实施方式中，CIK NKT细胞以在包含CIK NKT细胞和支持细胞活力的等渗液体溶液的组合物中的形式施用。在一些实施方式中，CIK NKT细胞以在已经从低温保存的样品重配的组合物中的形式施用。
包含CIK NKT细胞的药学上可接受的组合物可以包含多种载体和赋形剂。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不良物质。合适的载体和赋形剂及其制剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21stEdition,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)中。药学上可接受的载体是指在生物学上或其他方面非不良的材料，即将所述材料施用于受试者而不会引起不良生物作用或与其中所含药物组合物的其他组分以有害的方式相互作用。如果施用于受试者，任选地选择载体以最小化活性成分的降解并最小化在受试者中的不良副作用。如在本文中所使用的，术语药学上可接受的与生理学上可接受的和药学上可接受的同义地使用。药物组合物通常将包含用于在储存中缓冲和保存的试剂并且可以包括用于适当运输的缓冲液和载体，其取决于施用的途径。
用于体内或体外的这些组合物可以通过用于细胞的灭菌技术来灭菌。组合物可包含近似生理条件所需的可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂和/或其他试剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用方式和受试者的需要，主要基于体液量、粘度、体重等来选择。
在一个实施方式中，将CIK NKT细胞与用于正被治疗的癌症的一种或多种其他疗法或试剂一起施用于患者。在一些实施方式中，所述用于正被治疗的癌症的一种或多种其他疗法包括例如抗体、放射、化学疗法、干细胞移植或激素疗法。
在一些实施方式中，同时或近似同时地(例如彼此之间相隔约1、5、10、15、20或30分钟)施用CIK NKT细胞和其他癌症试剂/疗法。在一些实施方式中，按序施用所述CIK NKT细胞和所述其他癌症试剂/疗法。在一些实施方式中，在施用所述CIK NKT细胞之后的一、二或三天施用所述其他癌症疗法/试剂。
在一个实施方式中，所述其他癌症试剂是抗体。在一个实施方式中，CIK NKT细胞与靶向患病细胞的抗体联合施用。在一个实施方式中，将CIK NKT细胞和抗体一起施用于患者(例如在相同的制剂中)；分开施用于患者(例如以不同的制剂同时施用)或可以例如按不同的给药时间表或在一天中的不同时间处分别施用。当分开施用时，可以通过任何合适的途径(例如静脉内或肿瘤内注射)施用所述抗体。
在一些实施方式中，本公开的CIK NKT细胞与治疗性抗体和/或其他抗癌试剂组合使用。治疗性抗体可用于靶向表达与癌症相关或与肿瘤相关的标志物的细胞。癌症治疗性单克隆抗体的实例示于表2中。表2.说明性的治疗性单克隆抗体
FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例
FDA批准的治疗性单克隆抗体的实施例
这样的CIK NKT细胞的施用可以与单克隆抗体的施用同时进行，或以按序的方式进行。在一些实施方式中，在用所述单克隆抗体治疗所述受试者之后将所述CIK NKT细胞施用于所述受试者。或者，可以在所述单克隆抗体的同时(例如24小时内)施用所述CIK NKT细胞。
在一些实施方式中，静脉内施用CIK NKT细胞。在一些实施方式中，直接将所述CIKNKT细胞输注至骨髓中。
因此，本公开提供了一种在有需要的患者中治疗癌症或病毒感染的方法，所述方法包括使用本文公开的方法向所述患者施用来自CIK NKT细胞的群体的治疗有效量的CIKNKT细胞，从而治疗癌症。
试剂盒
还公开了使用包含本文所述量的CIK NKT细胞的组合物治疗癌症或感染性疾病的试剂盒。在一些实施方式中，本公开所述的试剂盒还可以包含至少一种单克隆抗体。
在某些实施方式中，所述试剂盒可以包含另外的化合物，例如治疗活性化合物或药物，其在CIK NKT细胞的施用之前、同时或之后施用。这样的化合物的实例包括抗体、维生素、矿物质、氟氢可的松、布洛芬、利多卡因、奎尼丁、化疗剂等。
在各种实施方式中，使用所述试剂盒的说明将包括在癌症或感染性疾病的治疗中使用所述试剂盒组分的说明。所述说明可进一步包括关于如何CIK NKT细胞(例如解冻和/或培养)的信息。所述说明可进一步包括关于施用剂量和频率的指南。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括装有一种或多种本文所述的组合物的一个或多个容器，例如包含如本文所述的CIK NKT细胞的组合物。任选地，与这样的容器相关的可以是显示所述试剂盒是用于治疗癌症的标签，例如本文所述的那些。任选地，所述标签还包括由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反应了所述政府机构对用于人施用的生产、使用或销售的批准。
本公开和工作实施例举例说明了生产和使用衍生自脐带血样品的CIK NKT细胞，本领域的普通技术人员将理解，也可以使用与本文所述方法相似的方法从其他造血祖细胞样品中产生CIK NKT细胞。
公开了材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可用于公开的方法和组合物，可与其结合使用，可用于其制备或可为其产物。在本文中公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开对这些化合物的各种单独的和集体的组合和排列中的每一种的具体提及，但每一种都被特别地考虑并描述于本文中。例如，如果公开并讨论了方法并讨论了可以对多种分子进行的多种修饰(包括所述方法在内)，除非有相反的明确说明，否则将特别地考虑所述方法的每个组合和排列以及可能的修饰。同样地，这些的任何子集或组合也被特别地考虑和公开。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多个可以进行的附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一步都可以用所公开的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集都被特别考虑并且应该被认为是公开的。
实施例
本公开包括以下非限制性实施方式。
实施方式1.一种CIK NKT细胞的群体，其中大于50％的所述群体中的所述细胞表达CD 56和CD3，并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
实施方式2.根据实施方式1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞可以在不存在α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)的情况下杀伤靶细胞。
实施方式3.根据实施方式1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述靶细胞是癌细胞。
实施方式4.根据实施方式1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述癌细胞系选自髓性白血病细胞、髓母细胞瘤细胞和单核细胞组。
实施方式5.根据实施方式3所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述癌细胞选自K562细胞、Daudi细胞、DAOY细胞和THP-1细胞。
实施方式6.根据实施方式2-5所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞以1.0至10.0之间的EC50杀伤多个靶细胞。
实施方式7.根据实施方式6所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞可以以不小于所述CIK NKT细胞在存在Gal-Cer的情况下杀伤所述靶细胞的所述EC50的90％且不大于所述EC50的110％的EC50杀伤所述靶细胞。
实施方式8.一种组合物，其包含来自实施方式1-7中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的多个CIK NKT细胞和生理上可接受的赋形剂。
实施方式9.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含来自实施方式1-7中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的多个CIK NKT细胞，其中所述试剂盒还包括容器和/或显示所述试剂盒是用于治疗癌症的标签。
实施方式10.一种从脐带血样品中富集CIK NKT细胞的方法，所述方法包括：从所述脐带血样品中分离单核细胞；和使分离的单核细胞与一种或多种试剂接触，从而富集CIKNKT细胞，所述试剂选自IL-7、ALT-803或IL-15、FLT3配体和Gal-Cer。
实施方式11.根据实施方式10所述的方法，其中所述IL-7，如果存在，浓度范围为5至20ng/mL。
实施方式12.根据实施方式10或11所述的方法，其中所述ALT-803，如果存在，浓度范围为100至300ng/mL。
实施方式13.根据实施方式10-12中任一项所述的方法，其中所述FLT3配体，如果存在，浓度范围为5至20ng/mL。
实施方式14.根据实施方式10-13中任一项所述的方法，其中所述Gal-Cer以2至10μg/mL的浓度范围存在。
实施方式15.根据实施方式10所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述脐带血样品的其余部分分离富集的CIK NKT细胞。
实施方式16.根据实施方式15所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与抗CD3、抗CD28和IL2接触以扩增所述CIK NKT细胞。
实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与Gal-Cer接触。
实施方式18.根据实施方式17所述的方法，其中所述Gal-Cer以载有Gal-Cer的CD1d四聚体的形式存在。
实施方式19.根据实施方式16所述的方法，其中所述抗CD3抗体以5ng/mL至60ng/mL的量存在。
实施方式20.根据实施方式16-19中任一项所述的方法，其中所述抗CD28抗体以0.1μg/mL至2μg/mL的量存在。
实施方式21.根据实施方式16-20中任一项所述的方法，其中所述IL-2以50ng/mL至500ng/mL的浓度存在。
实施方式22.根据实施方式16-21中任一项所述的方法，其中所述CIK NKT细胞的产生不包括干扰素-γ。
实施方式23.一种在有需要的患者中治疗癌症或病毒感染的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的来自实施方式1-7中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的CIKNKT细胞，从而治疗癌症。
实施方式24.根据实施方式23所述的方法，其中将每平方米所述患者的体表面积约1x108至约1x1011个细胞施用于所述患者。
实施方式25.根据实施方式23所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病、肉瘤和癌。
实施方式26.根据实施方式25所述的方法，其中通过选自静脉内的、腹膜内的和皮下的途径将所述细胞施用于所述患者。
实施方式27.根据实施方式23-26中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用抗体。
实施方式28.一种通过实施方式10-27中任一项所述的方法产生的CIK NKT细胞的群体。
实施方式29.根据实施方式1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞表达CAR和/或细胞因子。
实施例
以下实施例仅用于说明性目的且不应被理解为限制。有多种替代技术和程序供本领域技术人员使用，所述替代技术和程序将类似地允许人们成功地执行以下实施例。
实施例1：CIK NKT细胞的表型
使用来自Stem cell Technology公司的Ficoll-Paque和SepmateTM，通过密度梯度法从脐带血样品中分离脐带血单核细胞(Comics)。将脐带血单核细胞与Gal-Cer(5μg/mL)、FLT3-L(10ng/mL)、IL-7(10ng/mL)和ALT-803(175ng/mL)一起在具有10％人AB血清的RPMI培养基中孵育两周以富集NKT。使用来自Miltenyi Biotec,Germany的试剂通过亲和色谱法分离NKT细胞。随后，在存在抗CD3抗体(20ng/mL)、抗CD28抗体(0.5μg/mL)和IL2(200ng/mL)的情况下，在具有10％人AB血清的NK Macs培养基中扩增分离的细胞以用于载有Gar-Cer的CD1d四聚体对其的过夜激活。载有Gar-Cer的CD1d四聚体来自Prolmmune,Oxford,UK，其用量使得Gar-Cer以100ng/mL的量存在。在一周的扩增之后，用识别CD3、CD56或Va24的抗体染色这些细胞。结果显示大部分的细胞(97.1％)对CD56和CD3两者均为阳性(图2B)，以及小百分比的细胞(6.45％)对Va24为阳性(图2C)。这表明脐带血CIK NKT细胞具有低的Va24表达，但CD3和CD56的表达仍然保持完整。
实施例2：CIK NKT细胞的细胞毒性不依赖于Gal-Cer
评估如实施例2中所述制备的NKT-CIK细胞针对癌细胞系DAOY的细胞毒性。DAOY细胞与Gal-Cer以1μg/mL孵育过夜。然后将经Gal-Cer处理的DAOY细胞与荧光染料Calcien AM孵育30分钟。洗涤细胞，然后将其与CB-NKT CIK细胞以所示的各种效应子与靶标的比率(最高比率为32：1)孵育4小时。DAOY细胞的杀伤是通过细胞裂解来测量的，所述杀伤是通过从细胞释放的CalcienAM染料的量来表示的。图3A显示了由CB-NKT CIK引起的从DAOY细胞释放的CalcienAM染料的量。数据表示为靶细胞的裂解％。结果显示在杀伤方面，在靶细胞载有Gal-Cer的组与靶细胞没有载有Gal-Cer的组之间有显著差异，其表明Gal-Cer治疗没有给予杀伤特异性。
图3B比较了如上所述的衍生自脐带血的NKT-CIK细胞(CB-CIK NKT细胞)相比于PBiNKT细胞(从外周血分离的iNKT细胞)在表达荧光素酶的THP1细胞上的细胞毒性。除了来源是外周血而不是脐带血以外，以与CD-CIK NKT细胞相同的方式(参见实施例1)分离PBiNKT。将THP1细胞与CB-CIK NKT细胞或PBiNKT细胞以所示的各种效应子与靶标的比率共培养，最高比率为32：1。本实验中未使用Gal-Cer。结果表明CB-CIK NKT细胞在杀伤THP-1方面比PBiNKT细胞更有效。
实施例3：CIKNKT细胞在K562和Daudi细胞上的细胞毒性
测定如上获得的CB-NKT CIK细胞杀伤表达荧光素酶的癌细胞系DAOY、Daudi和K562的能力(分别在图4中由三角形、正方形和圆形表示)。外周血分离的iNKT用作对照(图4中的倒三角形)。在将癌细胞和效应细胞(CB CIK NKT或PBiNKT)共培养4小时之后进行细胞杀伤测定。癌细胞的杀伤是通过细胞裂解的百分比来测量的，其是由这些癌细胞系中荧光素酶的损失表示的。如所示使用各种效应子与靶标的比率，最高为32：1。结果表明CB-CIKNKT细胞以非CD1d/MHC限制性方式杀伤靶细胞。
Claims (29)
1.一种CIK NKT细胞的群体，其中大于50％的所述群体中的所述细胞表达CD 56和CD3，并且小于10％的所述群体中的所述细胞表达Va24。
2.根据权利要求1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞可以在不存在α-半乳糖苷神经酰胺(Gal-Cer)的情况下杀伤靶细胞。
3.根据权利要求1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述靶细胞是癌细胞。
4.根据权利要求1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述癌细胞系选自髓性白血病细胞、髓母细胞瘤细胞和单核细胞。
5.根据权利要求3所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述癌细胞选自K562细胞、Daudi细胞、DAOY细胞和THP-1细胞。
6.根据权利要求2所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞以1.0至10.0之间的EC50杀伤多个所述靶细胞。
7.根据权利要求6所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞可以以不小于所述CIK NKT细胞在存在Gal-Cer的情况下杀伤所述靶细胞的所述EC50的90％且不大于所述EC50的110％的EC50杀伤所述靶细胞。
8.一种组合物，其包含来自权利要求1中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的多个CIKNKT细胞和生理上可接受的赋形剂。
9.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含来自权利要求1中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的多个CIK NKT细胞，其中所述试剂盒进一步包括容器和/或显示所述试剂盒是用于治疗癌症的标签。
10.一种从脐带血样品中富集CIK NKT细胞的方法，所述方法包括：
从所述脐带血样品中分离单核细胞；和
使分离的单核细胞与一种或多种试剂接触，从而富集CIK NKT细胞，所述试剂选自IL-7、ALT-803或IL-15、FLT3配体和Gal-Cer。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述IL-7，如果存在，浓度范围为5至20ng/mL。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述ALT-803，如果存在，浓度范围为100至300ng/mL。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述FLT3配体，如果存在，浓度范围为5至20ng/mL。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述Gal-Cer以2至10μg/mL的浓度范围存在。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述脐带血样品的其余部分分离富集的CIK NKT细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与抗CD3、抗CD28和IL2接触以扩增所述CIK NKT细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述分离的CIK NKT细胞与Gal-Cer接触。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述Gal-Cer以载有Gal-Cer的CD1d四聚体的形式存在。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗CD3抗体以5ng/mL至60ng/mL的量存在。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗CD28抗体以0.1μg/mL至2μg/mL的量存在。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述IL-2以50ng/mL至500ng/mL的浓度存在。
22.根据权利要求16所述的方法，其中CIK NKT细胞的产生不包括干扰素-γ。
23.一种在有需要的患者中治疗癌症或病毒感染的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的来自权利要求1-7中任一项所述的CIK NKT细胞的群体的CIK NKT细胞，从而治疗癌症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将每平方米所述患者的体表面积约1x108至约1x1011个细胞施用于所述患者。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病、肉瘤和癌。
26.根据权利要求25所述的方法，其中通过选自静脉内的、腹膜内的和皮下的途径将所述细胞施用于所述患者。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括施用抗体。
28.一种通过根据权利要求10所述的方法产生的CIK NKT细胞的群体。
29.根据权利要求1所述的CIK NKT细胞的群体，其中所述CIK NKT细胞表达CAR和/或细胞因子。
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