CN106434556A - 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外诱导扩增人I型NKT细胞的方法，采用“特异性刺激剂+分阶段细胞因子”的模式，由两个培养阶段构成，第一培养阶段以特异扩增I型NKT数量为主，使用特异性的刺激剂α‑GalCer对I型NKT细胞进行优势扩增，并以荷载α‑GalCer的CD1d表达细胞刺激I型NKT持续增殖，同时加入细胞因子IL‑2和IL‑7以辅助I型NKT生长；第二培养阶段同步进行I型NKT数量扩增与引导功能定向分化，以α‑GalCer孵育的CD1d表达细胞继续刺激I型NKT增殖，同时加入IL‑2、IL‑7与IL‑15，以辅助I型NKT细胞扩增并引导分化，培养结束前1‑2天在培养体系中，加入IL‑12以引导I型NKT细胞进一步定向分化，增强其杀伤活性。本发明所述方法操作简单，能在I型NKT细胞体外大量扩增的同时提高扩增产物的杀伤活性，适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种体外诱导扩增人I型NKT细胞的方法。
背景技术
自然杀伤T细胞（Natrual Killer T cell，NKT细胞）是一个异质性的细胞群，同时具有固有免疫和适应性免疫的反应特征，即：与T细胞一样通过特异性T细胞受体（T CellReceptor，TCR）识别抗原，特异性识别由MHC类似分子CD1d提呈的脂质抗原，并与自然杀伤细胞（Natrual Killer cell，NK细胞）一样能够迅速反应，杀伤靶细胞；与此同时，NKT细胞也产生一系列细胞因子和趋化因子，发挥重要的免疫调控作用，参与抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病的免疫反应。
NKT细胞是有别于T细胞和NK细胞的独立的细胞群，其细胞表面受体、抗原识别特性以及效应能力等均与二者不同。人NKT细胞以CD4+细胞群为主，其次是CD4-CD8-细胞群和CD8+细胞群。依据细胞表达TCR的种类，NKT细胞被分为I型NKT细胞和II型NKT细胞，其中，I型NKT细胞因表达相对固定的TCR又被称为iNKT细胞（invariant NKT cells，iNKT），在机体抗肿瘤以及抗感染免疫反应中发挥重要作用；II型NKT细胞主要通过分泌多种细胞因子发挥免疫调控作用。
I型NKT细胞能够特异性识别由CD1d提呈的脂质抗原，其中α-半乳糖酰基鞘氨醇（α-galactosylceramide，α-GalCer或KRN7000）是其最有效的刺激剂。I型NKT细胞识别抗原后能够迅速反应，通过分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞；通过分泌多种细胞因子，包括IFN-γ、IL-5、IL-2、GM-CSF等，辅助CD8+T细胞、NK细胞以及DC细胞等的活化和增殖，促进适应性免疫应答向Th1型免疫反应发展。与I型NKT细胞不同，II型NKT细胞不识别α-GalCer，主要通过分泌IFN-γ和IL-4等发挥免疫调节作用，抑制机体抗肿瘤、抗感染免疫反应。
基于对其功能研究的深入，NKT细胞在抗肿瘤、抗感染和治疗自身免疫性疾病领域的应用受到重视。但由于两型NKT细胞的功能差别较大，因此，为了充分发挥各自优势，实现各自特异性扩增显得尤为重要。特别是要将NKT细胞应用于抗肿瘤抗感染领域中时，采取特异性扩增I型NKT细胞的策略，能够进一步提高扩增产物对靶细胞的杀伤活性，对提升治疗效果有积极意义。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：
建立I型NKT细胞的体外扩增方法，大量扩增I型NKT细胞的同时提高其分泌效应性细胞因子的水平及其对靶细胞的杀伤能力。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：整个细胞扩增过程由两个培养阶段构成，第一培养阶段以特异扩增I型NKT数量为主，使用特异性刺激剂α-GalCer对I型NKT细胞进行优势扩增，并以荷载α-GalCer的CD1d表达细胞刺激I型NKT持续增殖，同时加入细胞因子以辅助I型NKT生长，所述细胞因子至少包括IL-2和IL-7中的一种；第二培养阶段同步进行I型NKT数量扩增与引导功能定向分化，以α-GalCer孵育的CD1d表达细胞继续刺激I型NKT细胞增殖，同时加入IL-2、IL-7与IL-15，以辅助I型NKT细胞扩增并引导分化，培养结束前1-2天在培养体系中，加入IL-12以引导I型NKT进一步定向分化。
其中，所述CD1d表达细胞包括树突状细胞以及其他可以表达CD1d的细胞和或其他经人工修饰的DC样的抗原提呈细胞。
所述两个培养阶段的主要步骤如下：（1）重悬并调整外周血单个核细胞浓度，加入α-GalCer，进行I型NKT培养；（2）培养第7天，将荷载α-GalCer的DC细胞加入I型NKT细胞培养体系中，同时添加IL-2和IL-7，保持I型NKT细胞培养体系中α-GalCer的浓度不变；（3）培养第14天，将荷载α-GalCer的DC细胞再次加入I型NKT细胞培养体系中，同时添加IL-15，并保持培养体系中α-GalCer、IL-2和IL-7的浓度不变；（4）培养第20天向培养体系中添加IL-12，同时保持体系中α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15浓度不变。培养第21天收集细胞。
上述荷载α-GalCer的DC细胞的制备方法如下：重悬并调整PBMC浓度，加入IL-4和GM-CSF诱导分化DC细胞，其工作浓度分别为500U/ml和50ng/ml, 培养第六天将α-GalCer加入DC细胞培养体系中进行预孵育24h。
此外，用于培养I型NKT细胞的PBMC初始浓度为5×105个/ml~3×106个/ml，用于诱导分化DC细胞的PBMC初始浓度为1×106个/ml~5×106个/ml，所述α-GalCer的工作浓度可以是50ng/ml~500ng/ml；所述IL-2的工作浓度是10U/ml~100U/ml，IL-7的工作浓度是20ng/ml~200ng/ml，IL-12的工作浓度是10ng/ml~100ng/ml，IL-15的工作浓度是10ng/ml~100ng/ml，所述I型NKT细胞的来源可以是PBMC、纯化的CD3+T细胞，或纯化的NKT细胞；I型NKT细胞扩增所用的培养基可以是X-VIVO-15无血清培养基或含有10%FBS或自体血清的RPMI1640培养基，DC细胞诱导过程使用含有10%FBS或自体血清的RPMI1640培养基。
本发明的有益效果是：现有的NKT细胞扩增技术主要是通过“刺激剂+细胞因子”的固定模式扩增NKT细胞，不会对I型或II型NKT细胞进行特异性扩增，不能充分发挥其各自优势。本发明采用“特异性刺激剂+分阶段细胞因子”的模式，其特征在于使用特异性的刺激剂α-GalCer对I型NKT细胞进行优势扩增；同时，根据细胞各个生长阶段的特点以及各种细胞因子的功能特征，在细胞培养的不同时期按照一定顺序加入特定的细胞因子IL-2、IL-7、IL-12、IL-15，在实现细胞大量扩增的同时，提高其分泌效应性细胞因子水平及其杀伤活性的目的，使其充分发挥抗肿瘤和抗感染的能力。此外，整个NKT培养周期中，在培养第7天和第14天分别加入荷载α-GalCer的DC细胞，或其他经人工修饰的DC样的抗原提呈细胞（Antigen Presenting Cells，APC）以高效刺激I型NKT细胞持续增殖。本发明所述的NKT细胞扩增方法操作简单，适合I型NKT细胞的规模化生产。
附图说明
图1是实施例3扩增产物中目标细胞比例示意图；图a是CD3+CD56+细胞比例，图b是iNKT细胞比例（Vα24+Vβ11+）。
图2是实施例4中细胞因子IL-2和IL-7加入时间对I型NKT细胞扩增产物比例影响的示意图；其中a、b、c、d分别对应A、B、C、D四组实验结果。
图3是实施例5中细胞因子IL-15加入时间对I型NKT细胞扩增产物比例影响的示意图；其中a、b、c、d分别对应A、B、C、D四组实验结果。
图4是实施例8中细胞因子IL-12加入时间对I型NKT细胞扩增产物比例影响的示意图；其中a、b、c、d分别对应A、B、C、D四组实验结果。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：外周血PBMC分离
1. 取肝素抗凝的人外周血30ml～50ml于离心管中，采用生理盐水对外周血血液进行1:1 稀释，混合均匀；
2. 另取新的50 mL离心管，加入15ml淋巴细胞分离液（ficoll），然后按ficoll: 血液稀释液体积比1:2，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，使两者形成清晰分层，3000rpm离心30min， ；
3. 离心结束后，吸取单个核细胞层至新的50ml离心管中，加入30ml X-VIVO-15培养基清洗一遍，800g离心5min，弃上清。
4. 加入20ml X-VIVO-15培养基，吹吸混匀，室温200g离心10分钟，弃上清。加入10ml X-VIVO-15培养基重悬计数。
实施例2：诱导分化用于刺激I型NKT细胞增殖的树突状细胞（DC细胞）
1. 用含有10%FBS的RPMI1640培养基将上述PBMC浓度调整至1×106个细胞/ml，铺入T25细胞培养瓶中，37℃ ，5%CO2静置培养1小时。
2. 取出培养瓶，移去上清及未贴壁细胞。用含10%FBS的RPMI1640培养基清洗细胞面2次，而后加入5ml含有10%FBS的RPMI1640培养基，并添加细胞因子GM-CSF和IL-4，其工作浓度分别为500U/ml和50ng/ml。
3.培养第四天，向培养体系中补入3ml含有上述工作浓度GM-CSF和IL-4的培养基。
4. 培养第六天，向培养体系中添加α-Galcer至工作浓度100ng/ml。
5.培养第七天，收集细胞。
实施例3：高杀伤活性的NKT细胞体外扩增
1. 用X-VIVO-15细胞培养基将PBMC浓度调整至3×106个细胞/ml，加入α-GalCer至工作浓度100ng/ml，铺至6孔板中。
2. 培养第3天，向培养体系中补液，并添加α-GalCer至工作浓度。
3. 培养第7天，将实施例2中制备的荷载α-GalCer的DC细胞（约1×105个）加入NKT细胞培养体系中，同时补入刺激因子至工作浓度：α-GalCer 100ng/ml、IL-2 100U/ml和IL-7 20ng/ml。复苏一支PBMC，用于诱导分化DC细胞以再次刺激NKT细胞，方法与实施例2相同。
4.培养第10天，补液并添加α-GalCer、IL-2和IL-7至各自工作浓度。
5. 培养第14天，将荷载α-GalCer的DC细胞再次加入NKT细胞培养体系中，同时补入刺激因子α-GalCer、IL-2和IL-7至各自工作浓度，并向培养体系中添加IL-15至20ng/ml。
6. 培养第17天，补液并添加α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15至各自工作浓度。
7.培养第20天，补液并添加α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15至各自工作浓度，此外，添加IL-12至工作浓度为20ng/ml。
8. 培养第21天，收集细胞，取细胞产物100ul，加入如下荧光抗体： anti-TCR Vα-PE（Beckman Coulter, clone# C15）、anti-TCR Vβ-FITC（Beckman Coulter, clone#C21）、anti-CD3-PB（BD Pharmingen, clone#SP34-2）、anti-CD56-PE-Cy7（BD Pharmingen,clone#NCAM16.2），4℃孵育30min，流式检测产物中目标细胞群比例，结果如图1所示，扩增产物以CD3+CD56+NKT细胞群为主， I型NKT细胞比例可达56.8%左右。
实施例4：细胞因子IL-2和IL-7加入时间对扩增效果的影响
分别取相同培养条件(37℃，5％CO2浓度) 下，A、B、C、D四组不同方法培养的NKT细胞进行效果测试，四组均在培养起始时加入α-GalCer，直至培养结束。其中A组在培养起始时同时加入IL-2，B组为在培养起始时同时加入IL-2和IL-7，C组为培养第3天加入IL-2和IL-7，D组为培养第7天加入IL-2和IL-7。
培养至第21天，分别取A、B、C、D四种方法扩增的NKT细胞产物100ul，加入如下荧光抗体： TCR Vα-PE、TCR Vβ-FITC，4℃孵育30min，流式检测产物中目标细胞群比例，结果如图2显示，A、B、C、D组培养产物中I型NKT细胞比例逐渐提高，证实第七天加入细胞因子IL-2和IL-7能够优势扩增I型NKT细胞，显著提高NKT扩增产物中I型NKT细胞的纯度。
实施例5：细胞因子IL-15加入时间对NKT细胞扩增产物比例的影响
分别取相同培养条件(37℃，5％CO2浓度) 下，A、B、C、D四组不同方法培养的NKT细胞进行效果测试，四组均在培养起始时加入α-GalCer，并在培养第7天加入IL-2和IL-7，直至培养结束。其中A组不添加IL-15，B组为在培养起始时同时加入IL-15，C组为在培养第七天加入IL-15，D组为培养第14天加入IL-15。
培养至第21天，分别取A、B、C、D四种方法扩增的NKT细胞产物100ul，加入如下荧光抗体： anti-TCR Vα-PE、anti-TCR Vβ-FITC、anti-CD3-PB、anti-CD56-PE-Cy7，4℃孵育30min，流式检测产物中目标细胞群比例，结果如图3所示，D组培养产物中I型NKT细胞的比例优于其余3组。
实施例 6： IL-15加入时间对NKT细胞扩增产物分泌细胞因子能力的影响
现有研究结果显示，NKT细胞分泌Th1型细胞因子的能力与其抗肿瘤能力正相关。因此，在本发明中，将检测扩增产物上清中IFN-γ与IL-4含量的比值作为评价扩增产物效应功能的指标之一。
通过用CBA（Cytometric Bead Array，细胞因子微球检测技术）的方法检测实施例5中四组细胞培养上清中IFN-γ:IL-4的比值，评价NKT细胞扩增产物分泌效应性细胞因子的能力，结果如表1：
表1. IL-15加入时间对NKT细胞扩增产物分泌细胞因子能力的影响
| A组 | B组 | C组 | D组 | |
| IFN-γ（pg/ml） | >5000 | >5000 | >5000 | >5000 |
| IL-4（pg/ml） | 4.47 | 3.21 | 3.07 | 1.84 |
| IFN-γ：IL-4 | >1118 | >1558 | >1629 | >2717 |
结果显示，第14天加入IL-15能够显著提高扩增产物上清中IFN-γ:IL-4的比值，从而提高了扩增产物分泌效应性细胞因子的能力。
实施例7：细胞因子IL-15加入时间对NKT细胞扩增产物杀伤能力的影响
乳酸脱氢酶（LDH）是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放至胞外，并催化其底物四唑盐（INT）产生红色产物，生成红色产物的量与细胞裂解量呈正比。本发明中，我们通过检测杀伤体系中INT的量，评价扩增的NKT细胞产物对靶细胞的杀伤能力。该部分采用LDH检测试剂盒（货号CK12，东仁化学）进行检测，按照试剂盒说明书进行操作。
取靶细胞K562细胞离心，调整靶细胞的密度为1×105个/mL，离心收集实施例5中A、D两组不同方法培养的NKT细胞，使效靶比分别为5:1、10:1和20:1，每组设置3个复孔，37℃、5％CO2培养箱中孵育4h，待充分溶解沉淀后于酶联免疫检测仪检测吸光度，计算杀伤率，结果如表2。其中杀伤率的计算公式为：杀伤率(％) ＝（OD490实验孔- OD490阴性孔）/（OD490阳性孔-OD490阴性孔））×100％。比较结果见表2。
表2.细胞因子IL-15对NKT细胞扩增产物杀伤能力的影响
结果显示：培养第14天添加IL-15能够显著提高NKT扩增产物的杀伤能力。
实施例8：细胞因子IL-12加入时间对扩增产物中I型NKT细胞比例的影响
分别取相同培养条件(37℃，5％CO2浓度) 下，A、B、C、D四组不同方法培养的NKT细胞进行效果测试，四组均在培养起始时加入α-GalCer，并在培养第7天加入IL-2和IL-7，培养第14天加入IL-15，直至培养结束。其中A组为不添加IL-12，B组在培养起始时同时加入IL-12，C组为在培养第七天加入IL-12， D组在培养第20天加入IL-12。
培养至第21天，分别取A、B、C、D四种方法扩增的NKT细胞产物100ul，加入如下荧光抗体： TCR Vα-PE、TCR Vβ-FITC，4℃孵育30min，流式检测产物中目标细胞群比例，结果如图4显示，D组培养产物中I型NKT细胞的比例优于其余3组，过早加入IL-12会降低扩增产物中I型NKT细胞的比例，提示若需要加入IL-12，则考虑在培养后期添加。
实施例9：细胞因子IL-12加入时间对NKT细胞扩增产物杀伤能力的影响
取靶细胞K562细胞检测实施例8中A和D组细胞的杀伤能力，结果见表3。
表3.细胞因子IL-12对NKT细胞扩增产物杀伤能力的影响
结果显示：培养第20天添加IL-12能够显著提高NKT细胞扩增产物的杀伤能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种体外诱导扩增I型NKT细胞的方法，其特征在于该方法由两个培养阶段构成，第一培养阶段以特异扩增I型NKT数量为主，使用特异性的刺激剂α-GalCer对I型NKT细胞进行优势扩增，并以荷载α-GalCer的CD1d表达细胞刺激I型NKT持续增殖，并同时加入细胞因子以辅助I型NKT生长，所述细胞因子至少包括IL-2和IL-7中的一种；第二培养阶段同步进行I型NKT数量扩增与引导功能定向分化，以α-GalCer孵育的CD1d表达细胞继续刺激I型NKT细胞增殖，同时加入IL-2、IL-7与IL-15，以辅助I型NKT细胞扩增并引导分化，培养结束前1-2天在培养体系中，加入IL-12以引导I型NKT进一步定向分化。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述CD1d表达细胞包括树突状细胞以及其他可以表达CD1d的细胞和或其他经人工修饰的DC样的抗原提呈细胞。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述两个培养阶段的主要步骤如下：（1）重悬并调整外周血单个核细胞浓度，加入α-GalCer，进行I型NKT培养；（2）培养第7天，将荷载α-GalCer的DC细胞加入I型NKT细胞培养体系中，同时添加IL-2和IL-7，保持I型NKT细胞培养体系中α-GalCer的浓度不变；（3）培养第14天，将荷载α-GalCer的DC细胞再次加入I型NKT细胞培养体系中，同时添加IL-15，并保持培养体系中α-GalCer、IL-2和IL-7的浓度不变；（4）培养第20天向培养体系中添加IL-12，同时保持体系中α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15浓度不变，培养第21天收集细胞。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述荷载α-GalCer的DC细胞的制备方法如下：重悬并调整PBMC浓度，加入IL-4和GM-CSF诱导分化DC细胞，其工作浓度分别为500U/ml和50ng/ml, 培养第六天将α-GalCer加入DC细胞培养体系中进行预孵育24h。
5.根据权利要求3和4所述方法，其特征在于：用于培养I型NKT细胞的PBMC初始浓度为5×105个/ml~3×106个/ml，用于诱导分化DC细胞的PBMC初始浓度为1×106个/ml~5×106个/ml。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述α-GalCer的工作浓度可以是50ng/ml~500ng/ml。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述IL-2的工作浓度是10U/ml~100U/ml，IL-7的工作浓度是20ng/ml~200ng/ml，IL-12的工作浓度是10ng/ml~100ng/ml，IL-15的工作浓度是10ng/ml~100ng/ml。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述诱导培养I型NKT细胞的方法，还包括每隔2 ～ 3 天对细胞进行补液的步骤。
9.根据权利要求1所述方法，I型NKT细胞的来源可以是PBMC、纯化的CD3+T细胞，或纯化的NKT细胞。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于其中，I型NKT细胞扩增所用的培养基可以是X-VIVO-15无血清培养基或含有10%FBS或自体血清的RPMI1640培养基，DC细胞诱导过程使用含有10%FBS或自体血清的RPMI1640培养基。
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