CN104711225A - Nk细胞的体外制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于免疫治疗的NK细胞制备方法。具体提供了一种NK细胞的体外制备方法，所述的NK细胞由胚胎干细胞体外诱导分化形成，所述的制备方法包括以下几个方面：胚胎干细胞的扩增培养，胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞，CD34+造血细胞的纯化、扩增，造血细胞诱导分化为NK细胞。本发明还提供了NK细胞体外制备的诱导培养体系。本发明的制备方法简单，所获得的NK细胞肿瘤靶细胞杀伤效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种NK细胞的体外制备方法，具体的说，涉及一种从胚胎干细胞诱导分化制备成NK细胞的方法。
背景技术
NK细胞（natural killer cells)又称自然杀伤细胞，是一类CD56+，CD3-的淋巴细胞，是机体内天然免疫系统的效应细胞，它无需抗原预先致敏即可识别肿瘤及病毒感染的细胞。它位于机体防御体系的第一道防线，同时它又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫应答，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用。
现阶段临床上获得NK细胞疗法是采用体外培养的方法，把患者自身外周血中的NK细胞进行扩增，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强，再回输患者的体内。取自患者自身的细胞首先限制了其产业化生产的可能性；另外由于外周血中NK细胞的含量低，仅占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，细胞数量有限，且目前尚缺乏有效的高纯度的体外扩增体系，所以在很大程度上限制了 NK细胞的临床应用，这种传统的NK细胞制备方法并不是理想的选择。首先，它主要用于一对一的个体化治疗方法，只能在医院床边开展；第二，这种治疗方法自然杀伤性细胞诱导的时间太长，至少需要6周，对于晚期肿瘤病人，尤其是手术后放疗、化疗的病人，在细胞制备完成或细胞回输之前可能就已经去世；第三，一对一的治疗，即每一个人要做一全套细胞诱导扩增培养的过程，在实验室管理方面，室内质量控制很难，室间质量控制更难；第四，很多病人本身的NK细胞就是缺陷的，回输治疗效果有限。
目前虽然有大量的研究集中在寻找不同来源的CD34+细胞向NK细胞诱导分化的最佳体系，但是尚未有一种方法能够简便、高效地得到高纯度、高数量、杀伤能力强的NK细胞。
随着科研的发展和进步，利用干细胞诱导分化为NK细胞成为可能，是一个极具吸引力的选择，具有广阔的应用前景。胚胎干细胞就是其中的佼佼者，胚胎干细胞具有高度的未分化性以及很强的增殖能力，能够分化为人体组织的各种细胞。目前，人胚胎干细胞已被成功地分化为成熟和功能的子集的每一个胚层，包括细胞的造血系统。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题和不足，提供一种由胚胎干细胞诱导培养NK细胞的体外制备方法，以解决现有技术中NK细胞来源不足、疗效限制和难以产业化生产的问题，具有广阔的应用前景。
本发明同时提供了NK细胞的体外制备的诱导培养体系，简化纯化和鉴定细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种NK细胞的体外制备方法，具体包括以下步骤：
（1）胚胎干细胞的体外培养
采用无饲养层的胚胎干细胞培养体系，胚胎干细胞复苏后在明胶预处理过的培养皿中贴壁培养，培养2-3d后，消化液消化传代。
（2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化
采用基质细胞共培养与细胞因子诱导相结合的方法，胚胎干细胞用2mL分化培养液重悬后，接种于已经预先铺有OP9细胞的6孔板中，放入37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因子Flt3配体（FL），白细胞介素-15（IL-15），白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-7(IL-7)，Kit配体（KL）。培养1天，胚胎干细胞形成悬浮的细胞集落，把这些细胞集落转移到超低吸附培养皿中，并添加上述细胞因子，2-3天后收集细胞。
（3）免疫磁珠分离纯化CD34+细胞
由于造血干细胞主要分布于CD34+细胞中，因此采用免疫磁珠法纯化CD34+造血干细胞，并用流式细胞仪检测所分离得到的CD34+细胞纯度。
（4）CD34+细胞的扩大培养
将纯化后的CD34+细胞以1.0×104cells/mL 密度接种无血清培养基中，置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液。培养液中均含细胞因子：干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、红细胞生成素(EPO)和白细胞介素-6(IL-6)。培养2-3周收集细胞。
（5）CD34+细胞诱导分化NK细胞
CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子组合①：干细胞因子(SCF)，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Flt3配体（FL），37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱培养，24小时后，将细胞转移至新的细胞培养瓶继续培养，添加细胞因子组合②：白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、单克隆抗体anti-CD3(anti-CD3)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-7(IL-7)，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞，每三天换液一次，并补充细胞因子组合②，诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞。
（6）NK细胞杀伤活性的测定。
进一步的，所述的步骤（1）胚胎干细胞的体外培养过程中采用无饲养层的DMEM培养体系，所述的胚胎干细胞的培养液组成是：DMEM培养基，加入20%KnockOut血清替代物、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/mL L-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白细胞因子LIF，0.1mM MEM。
进一步的，所述的步骤（2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化中采用基质细胞共培养与细胞因子诱导相结合的方法，所用的胚胎干细胞分化培养液组成是：α-MEM培养基，体积分数10%KnockOut血清替代品，100μmol/L硫代甘油(MTG)；所用的诱导因子组合为：5ng/mL FL + 20ng/mL IL-15 + 20ng/mL IL-6 + 10 ng/mL IL-7 + 10ng/mL KL。本发明采用无血清造血干细胞的培养基，避免异源基因的污染。
进一步的，所述的步骤（4）为获得足够多的纯净的CD34+细胞，采用先免疫磁珠分离纯化CD34+细胞，后扩大培养CD34+细胞的方法，并且培养过程中采用无血清培养基：IMDM 培养基，5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺；扩增培养中所用的因子组合为50ng/mL SCF + 20ng/mL IL-3 + 4U/mL TPO + 3U/mL EPO + 20ng/mL IL-6。
进一步的，所述的步骤（5）CD34+细胞诱导分化NK细胞中采用细胞因子多次诱导的方法来获取足够的NK细胞，所用的细胞因子组合①为： 30ng/mL SCF + 30ng/mL GM-CSF + 5ng/mL FL；所用的细胞因子组合②为：10ng/mL IL-2 + 20ng/mL IL-12 + 20ng/mL IL-15 + 10ng/mL anti-CD3 + 20ng IL-4 + 10ng/mL IL-7。
本发明的制备方法具备以下优点：
（1）解决NK细胞来源不足的问题，为NK细胞治疗提供了新的思路。
（2）采用无血清培养简化了纯化和鉴定细胞产物的程序，避免了病毒污染造成的危害。
（3）在胚胎干细胞定向造血细胞分化阶段，首创添加了诱导因子5ng/mL FL、20ng/mL IL-15、20ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-7、10ng/mL KL，显著缩短了诱导培养时间，提高了造血细胞的活率。
（4）在造血细胞定向分化为NK细胞阶段创造性地进行了二次诱导，在接种阶段添加了诱导因子组合①：30ng/mL SCF、30ng/mL GM-CSF、5ng/mL FL，培养两天以后，添加诱导因子组合②：10ng/mL IL-2、20ng/mL IL -12、20ng/mL IL-15、10ng/mL anti-CD3、20ng IL-4、10ng/mL IL-7。经过该方法所获得的NK细胞活性高，能达到97%以上，且NK细胞的肿瘤杀伤效果显著。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是NK细胞的体外制备方法的技术方案实施流程图。
具体实施方法
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。参照图1：NK细胞的体外制备方法的技术方案实施流程图所示，本发明具体实施方式如下：
实施例 1 胚胎干细胞的体外培养：
1.将液氮中保存的胚胎干细胞与37℃水浴，快速溶化，细胞悬液由固态变为液态。
2.将上述细胞悬液接种于明胶预处理过的培养皿中，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，培养2-3d，细胞融合度达到85%-90%后，用消化液消化传代。
3.按照1:3-1:5传代到新的培养皿中，补足培养液继续培养。
4.每2-3d用消化液消化传代。
实施例 2 诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化
1.使用前1天将冻存的OP9细胞，以1.5×105 cells/mL细胞浓度接种到预铺有明胶的6孔培养板中。
2.第2天将胚胎干细胞离心，弃清液，用分化培养液重悬后，接种于已经预先有OP9细胞的6孔板中，放入37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因子5ng/mL FL，20ng/mL IL-15，20ng/mL IL-6，10 ng/mL IL-7，10ng/mL KL。
3.培养1d将正在分化的ES转移到新的超低吸附培养皿中，并补加上述细胞因子。
4.培养2-3天后，离心收集细胞，加PBS液清洗细胞，离心（1500r/min，10min）后去上清液，再加PBS液重悬细胞，离心清洗3次；对清洗后细胞加入少量培养液后，制成细胞悬液，计数，备用。
实施例 3 免疫磁珠分离纯化CD34+细胞
1.将收集的细胞以1×108个单核细胞悬于300μl PBS缓冲液中，加入100μl Fc受体阻断剂，再向其中加入100μl抗CD34免疫磁珠，混匀，4℃孵育30min，然后用PBS缓冲液离心洗涤2次，每次以1000rpm的速度离心10min，500μl PBS缓冲液重新悬浮洗涤过的细胞密度为108个/500μl。
2.将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，用1mL缓冲液加压洗脱分离柱，收集CD34+细胞并计数。用流式细胞仪分析CD34+细胞纯度。结果表明该CD34+造血干细胞的纯度为96%以上。
实施例 4 CD34+细胞的扩大培养
将纯化后的富含CD34+细胞以1.0×104cells/mL 密度接种于24孔细胞培养板中，于 37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液。采用无血清培养基并添加50ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、4U/mL TPO、3U/mL EPO和20ng/mL IL-6，并添加双抗（青霉素100IU/L链霉素100mg/L）。培养2-3周收集细胞。
所用无血清培养基成分：IMDM 培养基，5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺。
实施例 5 CD34+细胞诱导分化NK细胞
1.细胞接种：CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子：30ng/mL SCF，30ng/mL GM-CSF，5ng/mL FL，37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养。
2.转移培养：接种后的细胞培养2天后，转移至细胞培养瓶继续培养，加入无血清培养基，并添加因子：10ng/mL IL-2、20ng/mL IL -12、20ng/mL IL-15、10ng/mL anti-CD3、20ng IL-4、10ng/mL IL-7，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞5天。
3.扩大培养：每三天换液一次，并补充营养因子。诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞。结果表明该CD3-CD56+NK细胞的纯度为97%以上。
实施例 6 NK细胞杀伤活性的测定
采用4h LDH 释放测定法，检测NK细胞对人白血病细胞K562的杀伤效果。
1.取传代细胞株K562细胞进行计数，制成1×105cells/mL细胞悬液，加入96孔板，每孔50μl。
2.将培养的NK细胞分别按照效：靶为1:1、10:1、20:1、40:1加入96孔板中，同时设效应细胞和靶细胞自然释放孔，培养基自然释放孔，靶细胞最大释放孔，体积矫正对照，每孔体积100μl，均设3个复孔，250g离心4min，置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中孵育4h。
3.在反应结束前45min靶细胞最大释放孔每孔加入10μl裂解液。反应结束后，每孔吸取50μl上清和50μl LDH酶反应液置于另一新的96孔板，室温避光反应30min，加入反应终止液50μl，酶标仪测其OD值。
4.计算自然杀伤活性。公式为：自然杀伤活性%=（测定管OD值-靶细胞自然释放管OD值-效应细胞自然释放管OD值）/（靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值）×100%。
表1：不同效靶比的细胞杀伤率比较
* 与1∶1 比较P ＜ 0.05。
实验结果：如表1所示，本发明方法所制备的各个效靶比均能杀伤靶细胞，且随着效靶比的升高NK 细胞对靶细胞的杀伤活性随之升高，在效靶比为40:1时可达到90%以上。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种NK细胞的体外制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）胚胎干细胞的体外培养：采用无饲养层的胚胎干细胞培养体系，胚胎干细胞复苏后在明胶预处理过的培养皿中贴壁培养，培养2-3d后，消化液消化传代；
步骤2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化：胚胎干细胞用2mL分化培养液重悬后，接种于已经预先铺有OP9细胞的6孔板中，放入37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因细胞因子Flt3配体（FL），白细胞介素-15（IL-15），白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-7(IL-7)，Kit配体（KL）；培养1天，胚胎干细胞形成悬浮的细胞集落，把这些细胞集落转移到超低吸附培养皿中，并添加上述细胞因子，2-3天后收集细胞；
步骤3）免疫磁珠分离纯化CD34+细胞：采用免疫磁珠法纯化CD34+细胞，并用流式细胞仪检测所分离得到的CD34+细胞的纯度；
步骤4）CD34+细胞的扩大培养：将纯化后的CD34+细胞以1.0×104cells/mL 密度接种无血清培养基中，置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液；培养液中均含细胞因子：干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、红细胞生成素(EPO)和白细胞介素-6(IL-6)；培养2-3周收集细胞；
步骤5）CD34+细胞诱导分化NK细胞：CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子组合①：干细胞因子(SCF)，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Flt3配体（FL），37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，24小时后，将细胞转移至新的细胞培养瓶继续培养，添加细胞因子组合②：白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、单克隆抗体anti-CD3(anti-CD3)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-7(IL-7)，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞，每三天换液一次，并补充细胞因子组合②，诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞；
步骤6）NK细胞杀伤活性的测定。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的NK细胞是由胚胎干细胞在体外定向诱导分化，并采用无血清诱导培养体系制备。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤1）胚胎干细胞的体外培养采用无饲养层的DMEM培养体系，所述的胚胎干细胞的培养体系组成是：DMEM培养基，加入20%KnockOut血清替代物、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/mL L-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白细胞因子LIF，0.1mM MEM。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中诱导胚胎干细胞向造血细胞分化所用的胚胎干细胞分化培养体系组成是：α-MEM培养基，体积分数10%KnockOut血清替代品，100μmol/L硫代甘油(MTG)；所用的诱导因子组合为：5ng/mL FL + 20ng/mL IL-15 + 20ng/mL IL-6 + 10 ng/mL IL-7 + 10ng/mL KL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中CD34+细胞的扩大培养采用的无血清培养体系为：IMDM 培养基，5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺；扩增培养中所用的因子组合为50ng/mL SCF + 20ng/mL IL-3 + 4U/mL TPO + 3U/mL EPO + 20ng/mL IL-6。
6.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤5）中CD34+细胞诱导分化NK细胞采用步骤4）的无血清培养体系，添加的细胞因子组合①具体为：30ng/mL SCF + 30ng/mL GM-CSF + 5ng/mL FL；细胞因子组合②具体为：10ng/mL IL-2 + 20ng/mL IL-12 + 20ng/mL IL-15 + 10ng/mL anti-CD3 + 20ng IL-4 + 10ng/mL IL-7。
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