CN105713879A - 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用，包括AIM-V培养基、血小板裂解液PL、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L、G-CSF、IL-3，还添加了血管生成素样蛋白Angiopoietin-like protein 3(ANGPTL3)、小分子化合物StemRegenin(SR1)和嘧啶吲哚分子UM171。加入适当浓度的ANGPTL3和SR1、UM171组合能够使造血干细胞群体的数量大大增加，为脐带造血干细胞的生长、扩增，更为重要的是能够显著提高造血干细胞在移植到受体体内后的植入能力和造血系统重建能力，从而为脐血干细胞在临床上的应用开辟了新的应用前景。

Description

一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用。

背景技术

造血干细胞移植是治疗白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的最有效治疗方法之一。骨髓中造血干细胞(HSC)数量较低，移植后难以在患者体内有效进行造血重建，这也成为HSC临床应用的一个瓶颈，而且约有30-40％的患者由于找不到相同HLA配型的供者而失去了治疗的机会，脐带血(umbilicalcordblood，UCB)是除骨髓和外周血干细胞外的另一种重要造血干细胞来源，它的优点是采集不影响供者、受巨细胞病毒(CMV)和EB病毒污染机会小、移植后急慢性移植物抗宿主病(GVHD)发生率低于成年供者的骨髓移植、可以建立脐带血库，随时提供移植所需要的HLA相合的干细胞。尽管UCB具有诸多优点。但是由于一份脐带血所含的细胞数有限，这大大限制了其在临床的广泛应用。体外扩增是解决UCB这一缺陷的重要方法，因而优化UCB造血干/祖细胞(HSPCs)的体外扩增方案极为迫切。

发明内容

基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，提供一种更好地提高造血干细胞在体外的生长速度和扩增效率以及CD34⁺CD45RA^-、CD34⁺LKS、CD34^-LKS的比例的培养体系。

本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过在体外培养脐带血细胞的体系中加入不同的细胞因子和小分子化合物，从而能够更好地提高造血干细胞在体外的生长速度和扩增效率以及CD34⁺CD45RA^-、CD34⁺LKS、CD34^-LKS的比例。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，该培养体系包括AIM-V培养基、SCF、Flt-3L，G-CSF，IL-3，StemRegenin(SR1)，UM171，血小板裂解液。

其特征在于各种细胞因子的组合和小分子化合物的联合应用。

所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，各组分的含量如下：

所述血小板裂解液的制备过程：采集的脐带血40～150ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在4～25度温度下，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含血小板血浆，采血袋或采血管中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45～50％。富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12-24h后迅速取出放置25-37度水浴中复苏，如此反复2-5次。于4-25度以2000～5000rpm离心10-30min，取上清液，0.22μm过滤，以0.2-0.5％的浓度添加到脐带血造血干细胞扩增体系中。

其中化合物SR1和UM171的组合，浓度分别为100-1000nM和10-100nM。

所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其中Angiopoietin-likeprotein3的添加，浓度为30-200ng/mL。

SCF是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，调控各系造血细胞的生长发育中起着重要作用，而其它造血细胞因子如G-CSF、Flt-3L等都是作用于较晚期或晚期定向增殖分化的细胞。SCF单独作用刺激造血细胞增殖和促进克隆形成能力都微弱，而与其它细胞因子有明显协同促进造血功能等作用。

1993年Hood等首先提出富血小板血浆，并发现富血小板血浆含丰富的血小板，其数目比全血高3倍以上。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子PDGF-AB，转化生长因子βTGF-β，类胰岛素生长因子IGF，表皮生长因子EGF，血管内皮生长因子VEGF等，分泌后可促进细胞的分裂和增殖、增加胶原的合成、激发血管长入和诱导细胞分化，本发明采用血小板裂解液培养造血干细胞，不仅为造血干细胞的生长提供了生长环境，降低了培养体系中所需细胞因子的用量，也降低了使用FBS给临床应用带来的风险。

嘌呤衍生物StemRegenin(SR1)化合物被认为可在体外促进HSPC扩增。在体外培养人脐带血来源CD34⁺细胞时加入SRl及细胞因子SCF、TPO、Flt3L、IL-6共培养5周后，与相应对照组相比，CD34⁺细胞增加了47倍，相同条件下培养人外周血来源CD34⁺细胞3周即可使CD34⁺细胞增加73倍。而一旦去除了SRl后，细胞则迅速发生分化。通过集落形成实验表明，加入SRl培养后可显著提高各系细胞集落形成单位(CFU)形成。另外，值得注意的是，SR1仅对人、猴、狗来源的HSPC发挥作用，而对小鼠来源HSPC无扩增作用，提示SRl的作用机制可能存在种属特异性。将用这种方法扩增的CD34⁺细胞植人免疫缺鼠体内，发现NOD-SCID重建细胞(SRC)增加了17倍，并且均可保持多系细胞长期重建能力。这也是现有小分子化合物中体外扩增HSPC效果最为显著的小分子化合物。

近期研究表明，SR1可抑制细胞色素P4501B1(CYP1B1)和香烃受体抑制物(AHRR)的表达，两者在转录水平均受到芳香烃受体(AhR)的调节，证明SR1可能作为一种拮抗剂作用于AhR信号通路。芳烃受体(AhR)拮抗剂和配体兴奋剂可促进人脐带血细胞体外扩增，这些细胞移植入免疫缺陷型小鼠体内后，小鼠的重建造血能力可维持16周。

SR1的分子结构式：

与嘌呤衍生物类似，研究发现了一个化学相关的小分子家族嘧啶吲哚分子UM171，它们可以在免疫缺陷型小鼠体内扩增造血干细胞，并维持重建造血功能长达6个月，此化合物可独立抑制芳烃受体，从而更大限度地是造血干细胞发挥再生潜能。

嘧啶吲哚UM171的分子结构式如下：

造血干祖细胞可细分为免疫表型为CD34^-LKS的长期造血重建的干细胞(LT-HSC)、免疫表型为CD34⁺LKS的短期造血重建的干细胞(ST-HSC)和免疫表型为LKS-的祖细胞。HSC不表达各系特异性抗原Lin，包括B-G-M-T等(B细胞分化抗原B220、粒细胞分化抗原Gr-1、单核细胞分化抗原Mac-1、T细胞分化抗原CD4和CD8)，但高水平表达Sca-1和C-kit，简称LKS(Lin-Sca-1+-C-kit+)。HSC功能在移植模型中可以得到证实，CD34^-LKS在经照射处理的小鼠体内能重建长期造血，具备干细胞自我更新的特性，其自我更新能力可保持于整个生命过程。CD34⁺LKS在造血发育过程中更成熟，自我更新能力只能维持约数周的时间。因此，在维护和扩增长期造血干细胞(LT-HSCs)时，大量扩增此种祖细胞具有很好的发展前景。不幸的是，多数扩增系统提供的数据显示，以长期造血干细胞(LT-HSCs)的丢失来获取祖细胞的扩增，这样就增加了晚期移植失败的风险。

血管生成素样蛋白(ANGPTL)是近年来发现的一类新的分泌性糖蛋白。虽然ANGPTL与血管生成素(Ang)在组成上具有一定的同源性，也具有相似的结构域，但在功能上与Ang又有明显的不同。已有大量研究数据证实，在Sca-1⁺CD45⁺造血干细胞体外培养过程中，血管生成素样蛋白Angptl3的添加，不仅能够显著刺激长期再生造血干细胞(LT-HSC)的增殖，还对短期造血干细胞(ST-HSC)的增殖有一定的作用。

本发明所述AIM-V培养基购自lifetechnology公司，所述SCF购自peprotech公司，所述Flt-3L购自peprotech公司，所述G-CSF购自peprotech公司，所述IL-3购自peprotech公司，所述StemRegenin(SR1)购自美国selleck公司，所述UM171由加拿大蒙特利尔大学GuySauvageau教授实验室赠予，所述ANGPTL3购自peprotech公司。

本发明提供的血小板裂解物的制备及使用方法具有以下特点：(1)本发明提供的方法制备的培养基不需要添加FBS，亦可支持造血干细胞的扩增培养，在临床应用时降低了异体血清带来的过敏反应或变态反应。(2)血小板裂解后不仅释放存在于血小板内部的生长因子，而且去除了细胞结构并降低了免疫原性，为异体移植提供了条件，具有比富小板血浆更为广阔的前景。血小板裂解物中含有多种生长因子，如TGF、IGF、PDGF、VEGF、FGF等，更能支持造血干细胞的生长，降低了扩增造血干细胞所需要的细胞因子的用量的1/2～-1/3。(3)本发明制备的血小板裂解液的制备方法不同于常规的制备，节省了操作步骤，分离效率更高。

本发明为了提高扩增体系中CD34⁺LKS、CD34^-LKS的比例，添加了血管生成素样蛋白3(Angiopoietin-likeprotein3)，浓度为30-200ng/mL。

本发明为了提高扩增体系中CD34⁺CD45RA^-的比例及扩增倍数，添加了小分子化合物SR1和UM171的组合，浓度分别为100-1000nM和10-100nM。

SCF即为stemcellfactor，干细胞生长因子；Flt-3L即为FMS-liketyrosinekinase3ligand，FMS样酪氨酸激酶3配体；G-CSF即为Granulocytecolony-stimulatingfactor，粒细胞集落细胞刺激因子；IL-3即为Interleukin3，白介素-3；SR1即为StemRegenin-1，嘌呤霉素衍生物，是一种小分子杂环化合物；UM171是一种嘧啶吲哚分子，被命名为UM-171；Angiopoietin-likeprotein3为血管样生成蛋白3；PDGF-AB即为Platelet-derivedgrowthfactor-AB，血小板衍生生长因子AB；TGF-β即为转化生长因子β，Transforminggrowthfactorbeta；VEGF即为血管内皮生长因子，Vascularendothelialgrowthfactor；IGF即为类胰岛素生长因子，Insulin-likegrowthfactor；EGF即为表皮生长因子，Epidermalgrowthfactor。

附图说明

1、图1是本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34⁺CD45RA^-的比例变化曲线。其中横坐标代表天数，纵坐标代表CD34+CD45RA-细胞的百分比；代表本发明培养系统，代表传统培养系统。

图2是本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34+LKS细胞的百分比变化情况。其中横坐标代表不同天数，分别为第4天、第12天、第15天，纵坐标代表CD34+LSK细胞的百分比；□代表本发明培养系统，代表传统培养系统。

图3本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34^-LKS细胞的百分比变化情况。其中其中横坐标代表不同天数，分别为第4天、第12天、第15天，纵坐标代表CD34^-LSK细胞的百分比；□代表本发明培养系统，代表传统培养系统。

图4本发明培养体系与传统培养体系扩增培养12天后形成的CFU-GEMM。其中横坐标代表第12天，纵坐标代表CD34^-LSK细胞的百分比；□代表本发明培养系统，代表传统培养系统。

制备实施例

本发明公开了一种扩增脐带血造血干细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的扩增脐带血造血干细胞的培养体系已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

(1)采集的脐带血50-80ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在22℃温度下离心，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含血小板血浆，采血袋中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45-50％。用吸管慢慢吸出第3层白膜层细胞，备用。

(2)富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12h后迅速取出放置37度水浴中复苏，如此反复5次。于25度温度下离心，3500rpm，20min，取上清液，0.22μm过滤。4℃冰箱保存备用。

(3)将步骤(2)制备的血小板裂解液，利用PeprotechELISA试剂盒检测血小板中富含的细胞因子TGF-β、IGF、PDGF、VEGF、FGF，血小板裂解液中的细胞因子含量分析，见下表：

血小板数量	(720±35)×106/ml
		FGF2	325±17pg/ml
TGF-β	988±34ng/ml

VEGF	680±91pg/ml
		PDGF-AB	211±18ng/ml

(4)将步骤(1)制备的白膜层细胞用生理盐水重悬后，离心，1200rpm，10min，离心后的细胞沉淀取样，流式细胞仪检测CD34⁺CD45RA^-的比例，分离出的细胞接种至AIM-V培养基中进行脐带血造血干细胞的扩增。

(5)将步骤(2)制备的血小板裂解液以0.4％的浓度添加至含SCF、Flt-3L、G-CSF、IL-3、Angiopoietin-likeprotein3，StemRegenin(SR1)和UM171的造血干细胞培养扩增体系中。

本发明公开了包括上述细胞因子和化合物的培养体系，该培养基为AIM-V培养基，培养体系还包括：30ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt-3L，30ng/mL的G-CSF，10ng/mLIL-3。

上述的培养体系还包括80ng/mL的ANGPTL3蛋白。

上述的培养体系还包括400nM的SR1、80nM的UM171。

利用本发明的培养体系与传统的培养体系相比，造血干细胞的扩增倍数增加25倍，同时维持了造血干细胞的特性，以下试验证明本发明的培养基使造血干细胞的扩增倍数增加：

步骤(5)培养体系中的一部分细胞每两天补液，补充细胞因子、ANGPTL3蛋白、SR1和UM171。另一部分细胞利用现有的传统培养体系培养，记录细胞个数。

本发明在研究过程中采用传统培养法(发明专利：人源脐带血造血干细胞体外高效扩增技术，申请号：201010532713.4)与本发明专利的培养方法作比较，每隔两天对培养的细胞进行细胞计数并流式检测，观察培养体系中细胞数量CD34⁺CD45RA^-、CD34⁺LSK、CD34^-LSK的比例变化。发现培养7天后利用发明培养系统明显比传统培养系统细胞扩增速度快，并且培养到第12天CD34⁺CD45RA^-的比例是传统培养体系的2倍，结果如图1所示。图2代表利用本发明的培养体系与传统培养体系CD34⁺LSK的比例变化情况，图3代表利用本发明的培养体系与传统培养体系CD34^-LSK的比例变化情况。

利用显微镜观察细胞集落形成能力，分别取等量培养12天时的本发明和传统培养基所培养的细胞，发现本发明培养体系中形成的克隆CFU-GEMM的克隆数是传统法的3.75倍，如图4。

利用免疫缺陷NOD-SCID小鼠观察重构造血能力：脐血造血干细胞培养12天后将细胞移植进入NOD-SCID小鼠中，一共分为三组：(1)移植当天分离细胞直接移植；(2)传统培养体系扩增培养的细胞；(3)本发明培养体系培养的细胞。按照每个小鼠移植600个细胞的比例，移植4周后检测小鼠外周血中人源CD45⁺细胞；移植(3)细胞的小鼠外周血细胞中的人源CD45+细胞的数量是移植(2)细胞的2倍。而8周后检测小鼠外周血：移植(1)细胞的15只小鼠中只有1只能够检测到人源细胞(6.6％)；在移植(2)细胞的15只小鼠中有4只能够检测到人源细胞(26.7％)；而在移植(3)细胞的15只小鼠中全部能够检测到人源细胞(100％)，并且移植后20周还能在小鼠中检测到人源细胞。

以上实验充分证明：人源脐带CD34⁺CD45RA^-细胞经过本发明的扩增培养体系体外培养后具有明显增强的移植植入能力，并且能够更好的实现造血系统的重建。

实例2：

(1)采集的脐带血50-80ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在22℃温度下离心，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含血小板血浆，采血袋中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45-50％。用吸管慢慢吸出第3层白膜层细胞，备用。

(2)富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12h后迅速取出放置37度水浴中复苏，如此反复5次。于25度温度下离心，3500rpm，20min，取上清液，0.22μm过滤。4℃冰箱保存备用。

(3)将步骤(1)制备的白膜层细胞用生理盐水重悬后，离心，1200rpm，10min，离心后的细胞沉淀使用MACS-CD34isolationkit，免疫磁珠法分选CD34⁺细胞，流式细胞仪检测造血干细胞纯度，分离出的细胞接种至AIM-V培养基中进行脐带血造血干细胞的扩增。

(4)将步骤(2)制备的血小板裂解液以0.4％的浓度添加至含SCF、Flt-3L、G-CSF、IL-3、Angiopoietin-likeprotein3，StemRegenin(SR1)和UM171的造血干细胞培养扩增体系中。

本发明公开了包括上述细胞因子和化合物的培养体系，该培养基为AIM-V培养基，培养体系还包括：30ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt-3L，30ng/mL的G-CSF，10ng/mLIL-3。

上述的培养体系还包括50ng/mL的ANGPTL3蛋白。

上述的培养体系还包括800nM的SR1、40nM的UM171。

利用本发明的培养体系与传统的培养体系相比，造血干细胞的扩增倍数是传统培养体系的22倍，同时维持了造血干细胞的特性。

脐血造血干细胞体外扩增培养12天后，静脉回输至免疫缺陷NOD-SCID小鼠体内，7天之后对所有小鼠的骨髓细胞进行检测，接受本发明培养系统培养的造血干细胞移植的小鼠骨髓细胞总数明显高于传统培养体系组，并且本发明培养系统中的骨髓LSK细胞的数量增加了5倍；第14天时本发明培养体系中的LSK细胞的数量是传统培养体系组的5.2倍。以上实验说明本发明脐血造血干细胞培养体系扩增的造血干细胞能够在体内存活并明显的发挥作用，促进骨髓造血干细胞的增殖。

血小板裂解液产生的细胞细胞因子可以支持造血干细胞的生长，本发明所使用的方法分离效率较高，联合应用血小板裂解液、ANGLP3、UM171、SR1可以高效地体外扩增造血干细胞，且此方法对造血干细胞的分化具有一定的抑制或延缓作用，因此利用此培养体系体外扩增脐带血造血干细胞的效率更高，为今后造血干细胞的移植提供了强有力的支持，研究证实，LT-HSC可以在体内长期存在，并发挥造血功能，通过体外同时扩增LT-HSC和ST-HSC，降低了移植失败的风险。

上述内容并非对本发明内容作出的限制，一切基于本发明内容作出的实质上的改动均应属于本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于该培养体系包括AIM-V培养基、SCF、Flt-3L，G-CSF，IL-3，StemRegenin(SR1)，UM171，血小板裂解液。

2.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于各种细胞因子的组合和小分子化合物的联合应用。

3.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于，各组分的含量如下：

。

4.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于血小板裂解液的制备过程：采集的脐带血40～150ml以2:1比例缓慢加入盛有淋巴分离液的50ml离心管中，在4～25度温度下，1500-3000rpm，离心10-20min，上层为富含血小板血浆，采血袋或采血管中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45～50％，富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12-24h后迅速取出放置25-37度水浴中复苏，如此反复2-5次，于4-25度以2000～5000rpm离心10-30min，取上清液，0.22μm过滤，以0.2-0.5％的浓度添加到脐带血造血干细胞扩增体系中。

5.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于化合物SR1和UM171的组合，浓度分别为100-1000nM和10-100nM。

6.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于Angiopoietin-likeprotein3的添加，浓度为30-200ng/mL。