KR20190039988A

KR20190039988A - 조혈 줄기 및 전구 세포의 생성, 증식 및 분화를 위한 치환된 아졸 유도체

Info

Publication number: KR20190039988A
Application number: KR1020197006965A
Authority: KR
Inventors: 수딥토 바리; 크리스티나 리 린 차이; 지지 나가르 치 치우; 윌리엄 잉 히 황; 주 렝 로우; 치싱 종
Original assignee: 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르; 싱가포르 헬스 서비시즈 피티이. 엘티디.
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2019-04-16
Also published as: AU2017325511A1; JP2019528066A; WO2018048346A1; JP7168552B2; CN109890805B; EP3500562A4; CN109890805A; ES2968146T3; SG10202101478YA; SG11201901199WA; AU2017325511B2; KR102522572B1; MY197282A; EP3500562B1; US20190359941A1; EP3500562A1

Abstract

본 발명은 생물학적 샘플에서 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생체외 확장, 보다 특히는 보강되지 않은, 즉 생물학적 샘플의 단핵 분획으로부터 수득된 이들 세포의 확장에 있어서 시토카인과 조합된 치환된 아졸 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 이종이식 연구를 통해 개발된 확장된 조혈 이식편의 이식 요법을 추가로 기재한다. 바람직한 실시양태에서, 아졸계 화합물 및 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2로부터 선택된 시토카인을 포함하는 조합물은 제대혈로부터 단리된 단핵화 세포로부터 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포의 확장을 결과한다.

Description

조혈 줄기 및 전구 세포의 생성, 증식 및 분화를 위한 치환된 아졸 유도체

본 발명은 생물학적 샘플에서 CD34를 발현하는 조혈 줄기 및 전구 세포(hematopoietic stem and progenitor cells: HSPC)의 생체외 확장; 보다 특히는 보강되지 않은(non-enriched), 즉 생물학적 샘플의 단핵 분획으로부터 수득된 이들 세포의 확장에 있어서 치환된 아졸 유도체 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 이종이식 연구를 통해 개발된 확장된 조혈 이식편의 이식 요법을 추가로 기재한다.

조혈 줄기 세포 이식 (hematopoietic stem cell transplant: HSCT)은 병든 세포를 건강한 공여자 세포로 대체함으로써 악성 및 양성 장애를 야기하는 혈액 세포에서의 결함을 교정하기 위해 사용된다 [Gratwohl A, et al., JAMA 303(16): 1617-1624 (2010)]. 현재까지 100만개 초과의 HSCT가 수행되어 왔으며 동원된(mobilized) 말초 혈액 줄기 세포 (PBSC), 골수 (BM) 및 제대혈 (UCB)이 이식의 공급원이다. 지난 10년간, 급성 골수성 백혈병과 같은 악성 혈액 장애를 주로 치료하기 위해 등록 HSCT의 수가 3배 만큼 상승하였다 (국립 골수 공여자 프로그램(National Marrow Donor Programme), 미국) [Lund TC, et al., Nature reviews. Clinical Oncology 12(3):163-74 (2015)]. 이식 공급원와 관계없이, 2014년에는 전 세계적으로 약 6,500건의 이식이 수행되었다. 비록 PBSC 또는 BM이 여전히 이식의 주된 공급원으로 간주되긴 하지만, UCB가 2014년에 HSCT를 겪은 환자의 약 31%에게 효과적인 대안으로 부상되었다 [Bari S, et al., Biol Blood Marrow Transplant 21(6):1008-19 (2015)].

최초 UCB 이식이 1988년에 수행된 이래로, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia) 환자를 성공적으로 치료하기 위해, 이 생물학적 폐기물은 공립 및 사립 혈액 은행에 적극적으로 저장되어 왔으며 HSPC의 합법적인 공급원으로서 식품의약국 (FDA, 미국)에 의해 최근에 승인되었다 [Gluckman E, et al., Nouv Rev Fr Hematol 32(6):423-425 (1990); Voelker R. JAMA 306(22): 2442 (2011)]. BM 또는 PBSC와 비교하여, UCB 이식 (UCBT)은 HSPC 수집의 더 큰 용이함, 신속한 이용 가능성 (전 세계적으로 >700,000의 등록 UCB 유닛), 감염성 질환 전파의 더 낮은 위험, 인간 백혈구 항원 (HLA) 장벽에 걸친 더 큰 내성(tolerance), 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 더 낮은 발병률과 연관이 있다 [Lund TC, et al., Nature reviews. Clinical Oncology 12(3): 163-74 (2015); Bari S, et al., Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015)]. 또한, 몇몇 메타-분석에서, UCBT는 일치된 형제 공여자가 없는 성인 및 소아 환자 둘 다에서 완전히 일치된 BM 이식에 등가의 결과를 야기하는 것으로 나타났다 [Hwang WYK, et al., Biol Blood Marrow Transplant 13(4): 444-453 (2007)]. 전 세계적으로, 대략 40%의 백인, 및 최대 55-80%의 백인이 아닌 환자가 8/8 HLA-A,-B,-C, 및 -DR 일치된 비혈연 공여자(matched unrelated donor: MUD)를 찾을 수 없을 것이며, 이는 연간 6,000명이 넘는 환자가 UCBT 자격이 있음을 의미한다 [Cunha R, et al., Bone Marrow Transplant 49(1): 24-29 (2014); Barker JN, et al., Biol Blood Marrow Transplant 16(11): 1541-1548 (2010)]. 그러나, 2014년에는, 단지 960 UCBT (NMDP, 미국)만 수행되었는데, 주로 뱅크 UCB 이식편(banked UCB graft)과 연관된 낮은 총 유핵 세포(total nucleated cell: TNC) 투여의 문제로 인한 것이며, 이는 그의 임상적 사용을 막대하게 제한한다.

단일 이식편이 2천5백만개 세포/체중 kg의 최소 임상 용량을 충족시킬 수 있는 소아 환자에서 비록 UCBT가 성공적으로 사용되었긴 하지만, 성인 환자에서 그의 사용에 대한 상당한 도전과제가 있다 [Gluckman E, Rocha V. Cytotherapy 7(3): 219-227 (2005)]. BM 또는 PBSC에 비해, 성인에서 UCBT 후에 조혈 회복 속도가 특징적으로 더 느린 것은, 성공적인 이식을 매개하기 위한 더 낮은 TNC 및 HSPC 함량, 뿐만 아니라 UCB 이식편에서 생착(engraftment)과 관련된 기능에 대한 내재적 세포 결핍의 결과이다 [Ballen KK, et al., Blood 122(4): 491-498 (2013)]. 이식 성공의 조기 척도인 호중구 생착의 중앙값 시간은 PBSC 또는 BM 이식편의 경우 각각 대략 14일 및 18일의 중앙값에 비해 조작되지 않은 UCB 이식편의 경우 전형적으로 25일 초과이다 [Lund TC, et al., Nature reviews. Clinical Oncology 12(3): 163-74 (2015)]. 호중구 및 혈소판 회복보다 나중에 (>3개월) 전형적으로 발생하는, 다른 면역 세포 예컨대 T, B 및 NK 세포에 대한 재구성 시간은 UCB 세포의 상대적으로 미숙한 면역 상태로 인해 UCBT 후에 더 상당히 지연된다 [Komanduri KV, et al., Blood 110(13): 4543-4551 (2007)]. 조혈 재구성의 극심한 지연은 범혈구감소증 수령자에서 기회 감염성 미생물 및 바이러스 감염의 위험을 증가시키므로 UCBT 이후 >30%의 높은 이식 관련 사망률 (TRM)의 한 원인이 된다 [Bari S, et al., Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015); Hofmeister CC, et al., Bone Marrow Transplant 39(1): 11-23 (2007)]. 그러나, 감염 및 사망 위험은 이식을 위해 주입된 세포 용량이 높을수록 더 낮아지는 것으로 보인다 [Kelly SS, et al., Bone Marrow Transplant 44(10): 673-681 (2009); Dahlberg A, et al., Blood 117(23): 6083-6090 (2011)]. UCBT의 이점을 고려해 볼 때, UCB가 HSCT를 위한 주요 선택의 이식편이 될 수 있게 하는 것이 바람직하다. 그러나, 이 목적을 실현하기 위해, 적절한 예비 요법 (골수 소멸성(myeloablative) 또는 감소된 강도 컨디셔닝)을 받은 성인에서 이식 전에 TNC 및 HSPC의 수를 증가시킬 필요가 있다.

따라서, 이식을 위한 TNC 및 HSPC의 보다 풍부한 공급, 및 이를 제조하는 방법을 제공할 필요가 있다.

우리는 아졸계 소분자(azole-based small molecule)인 IM-29, 및 그의 유도체를 사용하여 냉동 해동된 UCB-단핵 세포 (MNC)로부터 표현형적으로 및 기능적으로 정의된 HSPC를 확장시키는 방법을 기재한다. 표현형적으로 및 기능적으로 정의된 HSPC는 본 발명의 소분자를 사용하여 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 샘플에서 또한 확장될 수 있다. 그렇게 원하는 경우, 본 발명의 소분자는 UCB, 골수 또는 동원된 말초 혈액 샘플로부터 세포의 보강된 CD34+ HSPC 코호트를 확장시키는데 사용될 수 있을 것이다.

바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포 샘플의 총 유핵 세포 및/또는 CD45+CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 서브세트의 생체외 확장 방법으로서,

(i) 상기 샘플의 단핵화 세포 분획(mononucleated cell fraction)을 배지에서 배양하는 단계; 및

(ii) 상기 단핵화 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체외 확장 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 샘플은 제대혈 샘플이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 적어도 하나의 아졸계 소분자는 화학식 (I), 또는 그의 염 및 용매화물에 의해 나타내진다.

상기 식에서,

X는 NR₄, O 또는 S를 나타내고;

R₁은 C_6-10 아릴 또는 6- 내지 10-원 헤테로방향족 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내고;

R₂는 C_6-10 아릴 또는 6- 내지 10-원 헤테로시클릭 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내고;

R₃은 치환되지 않거나 할로, OR₅, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된 C_6-16아릴을 나타내고;

R₄ 및 R₅는 H 또는 C_1-4 알킬 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로부터 독립적으로 선택된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물, 또는 그의 염 및 용매화물로서 나타내진다.

상기 식에서,

R₆은 H, Cl, Br 및 F를 나타내고;

R₇은 H, Cl, Br, F, OR₈을 나타내고;

R₈은 치환되지 않거나 Cl 및 F로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된 C_1-3알킬을 나타내고;

R₁ 및 R₂는 청구항 2 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 화합물, 또는 그의 염 및 용매화물로서 나타내진다.

상기 식에서,

R₉는 H, Cl, Br, F 또는 C_1-3 알킬 (이는 치환되지 않거나 Cl 및 F로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된다)을 나타내고;

R₁₀은 H, Cl, Br, 또는 F를 나타내고;

R₂는 청구항 2 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고;

R₆ 및 R₇은 청구항 12에 정의된 바와 같다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아졸계 소분자는 다음의 군으로부터 선택된다:

(i) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;

(ii) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5-일]피리딘;

(iii) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;

(iv) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;

(v) 4-[2-(1-브로모나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;

(vi) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-이미다졸-5-일]피리딘;

(vii) 2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(피리딘-4-일)-5-(m-톨릴)옥사졸;

(viii) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸;

(ix) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(6-메톡시나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸;

(x) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸;

(xi) 4-(4(5)-(4-플루오로페닐)-2-(7-메톡시나프탈렌-2-일)-1H-이미다졸-5(4)-일)피리딘;

(xii) 4-[4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘; 및

(xiii) 4-[4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 적어도 하나의 시토카인의 존재하에 확장된다. 바람직하게는 적어도 하나의 시토카인은 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L) 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2 중 적어도 2종, 적어도 3종 또는 4종 모두의 존재하에 확장된다. 보다 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml TPO, 50 ng/ml FLT-3L 및 20 ng/ml IGFBP-2의 존재하에 확장된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법은 제대혈 단핵 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자와 적어도 9일의 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 시토카인을 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아졸계 소분자를 을 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법은 약 7일 내지 11일 배양 후에 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 최적의 확장이 관찰되는 대략 10일 또는 11일에 세포를 수확한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포가 확장된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) 조혈 줄기 세포가 확장된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) 조혈 줄기 세포가 확장된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포는 정상적인 핵형을 가지며 어떠한 백혈병성 형질전환도 나타내지 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 적어도 하나의 아졸계 소분자; 및 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 조합물 및/또는 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용하기 위한 본 발명의 임의의 측면에 따라 정의된 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 제대혈의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 아졸계 소분자의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분은 제대혈로부터이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 치료 방법으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에 의해 수득된 유효량의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다.

도 1은 동물성 성분 미함유 (ACF) 배지, IM-29와 함께 그리고 없이 시토카인의 상이한 조합물과 함께 11일 동안 지속된 배양에서 생존 가능한 (7AAD-) 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) 및 총 유핵 세포 (TNC)의 배수 확장을 도시한다. 배지, 시토카인 및 IM-29를 7일째에 보충하였다. 각각의 시토카인의 농도는 다음과 같다: S는 100 ng/ml에서 SCF를 나타내고; T는 100 ng/ml에서 TPO를 나타내고; F는 50 ng/ml에서 FLT-3L을 나타내고; IG는 20 ng/ml에서 IGFBP-2를 나타낸다. 소분자 IM-29는 IM에 의해 나타내지며 5.0 μM의 농도로 투여된다. 다른 모든 조건에서 각각의 군과 비교된 *P < 0.05. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 의미한다.
도 2는 IM-29 및 그의 구조 유사체를 사용하여 UCB HSPC의 생체외 확장을 가능하게 하는 방법을 기재하는 개략도를 도시한다.
도 3은 신선한 UCB로부터 단핵화 세포 (MNC)를 수득하는 공정을 기재하는 개략도이다.
도 4는 UCB-MNC 분획에서 세포의 조성 및 HSPC의 상이한 서브세트의 표현형 발현의 개략도이다.
도 5는 단핵화 세포를 사용하여 IM-29로 생체외 확장으로 인한 UCB 이식편에서 세포의 비율 변화를 기재하는 개략도이다.
도 6A는 소분자 IM-29 (분자량, MW: 383.12 g/mol)가 UCB의 최적 확장을 제공함 (CD45+CD34+CD38-CD45RA-의 표현형 발현에 의해 정의된, 생존 가능한 조혈 전구 세포, HPC의 >1200배 증가, 도 8 (A)에 도시됨)을 나타낸다.
도 6B는 도 8 (A)에 도시된, CD45+CD34+CD38-CD45RA-의 표현형 발현에 의해 정의된 생존 가능한 조혈 전구 세포의 1000 내지 1150배 증가를 초래할 수 있는 소분자 IM-04 (MW: 379.43 g/mol)의 구조를 도시한다.
도 6C는 도 8 (A)에 도시된, CD45+CD34+CD38-CD45RA-의 표현형 발현에 의해 정의된 생존 가능한 조혈 전구 세포 (HPC)의 400 내지 900배 증가를 제공한, IM-29 (도 6 (A)) 및 IM-04 (도 6 (B))의 구조 유사체인, 소분자 IM-01 (MW: 361.45 g/mol), ZQX-33 (MW: 365.13 g/mol), ZQX-36 (MW: 443.04 g/mol), GJ-C (MW:433.41 g/mol), OZ-07 (MW: 380.42 g/mol), IM-03 (MW: 384.16 g/mol), IM-09 (MW: 396.18 g/mol), IM-22 (MW: 388.14 g/mol), ZQX-53 (MW: 394.14 g/mol), IM-44 (MW: 235.11 g/mol) 및 ZQX-42 (MW: 239.09 g/mol)의 구조를 도시한다.
도 6D는 확립된 p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 억제제인 모 화합물 SB203580 (MW: 377.43 g/mol)의 구조를 도시한다. SB203580의 최적 작업 농도는 5.0 μM으로 공지되어 있다.
도 6E는 제대혈 (UCB) 단핵화 세포 (MNC)로부터 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 확장을 연구하기 위해 생성된 모 화합물 SB203580의 유사체의 구조를 도시한다. 구조적 및 화학적 변형을 기반으로 하여, 생성된 유사체는 4개의 광범위한 군 1 내지 4로 세분되었다.
도 7은 세 가지 상이한 UCB 샘플로부터 냉동-해동된 MNC를 사용하여 72시간에서 CD45+ 집단 및 세포 생존력에 미치는 5.0 μM에서 IM-29 및 그의 구조 유사체의 영향을 도시한다. 무혈청 확장 배지 (SFEM) 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. UCB HSPC에 미치는 IM-29 및 그의 구조 유사체의 영향은 UCB 세포를 아넥신-V (초기 아폽토시스 세포 상에 발현된 포스파티딜세린 5에 결합함) 및 7-아미노액티노마이신 D (죽은 세포를 염색하는 7-AAD)로 염색하는 것을 포함하는 생존력 검정을 사용하여 평가하였다. 이 유동 세포 계측기-기반 검정은 게시된 보고서 [Bari S, et al., Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015)]가 CD45+ 백혈구 (HSPC는 이 집단의 서브세트이다)의 자발적 유도가 HSPC 확장 배양의 두드러진 문제임을 시사하고 있기 때문에 선택되었다. 이 데이터는 소분자 중 어느 것도 UCB-MNC 세포에 급성 독성을 갖고 있지 않음을 시사한다.
도 8A는 10일 동안 지속된 배양에서 생존 가능한 (7AAD-) 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) 및 총 유핵 세포 (TNC)의 배수 확장을 도시하며 여기서 무혈청 확장 배지 (SFEM), 시토카인 및 각각의 소분자가 7일째에 보충된다. 각각의 군에서 다른 모든 조건과 비교된 *P < 0.01. SFEM 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n = 4에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8B는 11일 동안 지속된 배양에서 생존 가능한 (7AAD-) 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) 및 총 유핵 세포 (TNC)의 배수 확장을 도시하며 여기서 동물성-성분-미함유 배지 (ACF), 시토카인 및 각각의 소분자가 7일째에 보충된다. 각각의 군에서 다른 모든 조건과 비교된 *P < 0.01. ACF 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8C는 i) UCB MNC를 0시간째에 해동시킨 후에, (ii) 시토카인 대조군 및 (iii) 무혈청 확장 배지 (SFEM)를 사용하여 시토카인을 보충한 5.0 μM의 IM-29에서 10일 동안 배양한 CD45+ 세포의 서브세트인 CD34+CD38-집단을 도시하는 유동 세포 계측 분석으로부터의 대표적인 도트 플롯을 도시한다.
도 9A는 11일 동안 지속된 배양에서 생존 가능한 (7AAD-) 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) 및 총 유핵 세포 (TNC)의 배수 확장을 도시하며 여기서 동물성-성분-미함유 배지 (ACF), 시토카인 및 각각의 소분자가 7일째에 보충된다. 사용된 IM-29의 농도는 1.0, 5.0 및 10.0 μM이다. ACF 배지 중 시토카인 단독이 블랭크 대조군으로서 역할을 하였다. 각각의 군과 비교된 *P < 0.01. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 나타낸다.
도 9B는 줄기 세포를 미리 선택하지 않은 두 개의 별개의 UCB 유닛을 5.0 μM의 IM-29 및 기초 시토카인에서 배양한 경우, 총 유핵 세포 (TNC) 및 콜로니 혈성 단위 (CFU) - 과립구, 대식세포 (GM)의 생체외 확장을 도시한다. 확장 배양은 SFEM, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 10일 동안 지속되었다. SFEM 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n=6에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. 다른 모든 처리 및 각각의 집단과 비교된 *P < 0.01. CFU-GM은 HSPC가 구별되는 콜로니의 형성을 야기하는 시험관내 기능적 검정을 기반으로 하는 메틸셀룰로스이다. 성숙 세포는 이러한 콜로니를 형성할 수 없다.
도 10은 UCB-MNC를 기초 시토카인의 존재하에 5.0 μM IM-29를 함유하는 무혈청 확장 배지 (SFEM) 또는 동물성-성분-미함유 (ACF) 배지에서 배양한 경우 총 유핵 세포 (TNC), 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) 및 콜로니 혈성 단위 (CFU) - 과립구, 대식세포 (GM)의 생체외 확장을 도시한다. 확장 배양은 SFEM/ACF 배지, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 10일 동안 지속되었다. SFEM/ACF 배지 중의 시토카인 단독이 블랭크 대조군으로서 역할을 하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. 각각의 배지에서 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.05. IM-29의 확장 효과는 기초 배양 배지와 관계가 없었다. SFEM 또는 ACF 배지 중 어느 하나의 사용은 각각의 시토카인 대조군과 비교하여 5.0 μM의 IM-29의 존재하에 TNC, HPC (CD45+CD34+CD38-CD45RA-), CFU-GM의 상당히 더 양호한 확장을 결과하였다. SFEM은 소 혈청 알부민을 함유하며 한편 ACF는 화학적으로 정의된다.
도 11은 배양 지속기간/기간의 함수로서 5.0 μM의 IM-29에 의한 UCB의 생체외 확장을 도시한다. 7일, 9일 및 11일 동안 지속된 배양에서 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) (실선) 및 총 유핵 세포 (TNC) (파선)의 배수 확장. 9일 및 11일까지 지속되는 배양을 위해 동물성 성분 미함유 (ACF) 배지, 시토카인 및 IM-29를 7일째에 보충하였다. 이들 실험 세트를 두 가지 상이한 UCB 샘플로 수행하였다. ACF 배지 중 시토카인 단독이 블랭크 대조군으로서 역할을 하였다. 언급된 시점에서 각각의 파라미터에 대해 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.01 또는 **P < 0.01. 데이터는 n = 6에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. IM-29의 확장 효과는 최적 확장 기간이 10일 내지 11일인 배양의 지속기간에 의존적이었다.
도 12는 5.0 μM에서 IM-29의 그것이 배양물에 첨가된 시간의 함수로서의 UCB 생체외 확장 효과를 도시한다. 10일 동안 지속된 배양에서 HPC의 배수 확장. 무혈청 확장 배지 (SFEM) 또는 동물성 성분 미함유 (ACF) 배지, 시토카인 및 IM-29를 표에 상세히 설명된 바와 같이 0일째에 첨가하고 7일째에 보충하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. 각각의 배지에서 다른 모든 군과 비교된 *P < 0.05. UCB HPC의 최적 확장은 확장 배양을 개시할 시점에서 IM-29를 보충한 경우에만 달성되었다. IM-29를 7일째에 배지 및 시토카인과 함께 보충하면 확장이 추가로 상당히 개선되었다.
도 13A는 i) UCB MNC를 0시간째에 해동시킨 후에, (ii) 시토카인 대조군 및 (iii) 무혈청 확장 배지 (SFEM)를 사용하여 시토카인을 보충한 5.0 μM의 IM-29에서 10일 동안 배양한 CD45+CD34+ CD38-CD45RA- 세포의 서브세트인 (a) CD90+ (*로 도시된 영역); (b) CD90+CD49f+ (**로 도시된 영역) 및 (c) CD90-CD49f+ (***로 도시된 영역) 집단을 도시하는 유동 세포 계측 분석으로부터의 대표적인 도트 플롯을 도시한다.
도 13B는 면역결핍 마우스를 생착하는 것으로 공지된 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+의 표현형 발현을 가진 HSC1의 생체외 확장을 도시한다. 확장 배양은 SFEM, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 10일 동안 지속되었다. SFEM 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 나타낸다. SB203580, DMSO 및 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.001.
도 13C는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+의 표현형 발현을 가진 HSC2의 생체외 확장을 도시한다. 확장 배양은 SFEM, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 10일 동안 지속되었다. SFEM 중의 SB203580, DMSO 및 시토카인 단독이 참조 화합물, 비히클 및 블랭크 대조군으로서 각각 역할을 하였다. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 나타낸다. SB203580, DMSO 및 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.001. 선행 줄기 세포 선택 없이, 그러나 IM-29를 사용한 확장된 UCB의 표현형 발현에 대한 상세한 조사는 (a) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) 및 (b) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2)의 항원 발현에 의해 정의된 HSPC의 드문 서브세트에서 상당한 증가를 나타냈다. 조작되지 않은 UCB로부터의 이러한 서브 세트는 생체내 연속 이식 연구에 의해 평가된 바와 같이 높은 자기-재개(self-renewal)/재증식(repopulating) 능력을 갖는 것으로 보고되었다.
도 13D는 기초 시토카인과 함께 동물성 성분 미함유 배지 (ACF)에서 5.0 μM의 IM-29의 존재하에 냉동-해동된 UCB-MNC로부터 확장된 세포의 대표적인 염색체도(karyogram)를 도시한다. 확장 배양은 ACF, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 11일 동안 지속되었다. 확장된 세포의 핵형은 배양되지 않은 UCB-MNC와 비교하여 정상이다.
도 13E는 기초 시토카인과 함께 동물성 성분 미함유 배지 (ACF)에서 5.0 μM의 IM-29 존재하에 냉동-해동된 UCB-MNC로부터 확장된 세포에서 수행된 형광 계내 하이브리드화 (FISH) 및 백혈구 세포화학 임상 시험의 결과를 도시한다. 확장 배양은 ACF, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 11일 동안 지속되었다. 사용된 FISH 탐침은 D7S486 / CEP 7 (급성 골수성 백혈병, AML; 골수이형성 증후군, MDS의 경우); MYC / CEP 8 (비호지킨 림프종, NHL; 급성 림프구성 백혈병, ALL의 경우); CDKN2A / CEP 9 (ALL의 경우); BCR / ABL-1 (ALL; AML; 만성 골수성 백혈병, CML의 경우); MLL (ALL; AML의 경우); TP53 / CEP 17 (만성 림프구성 백혈병, CLL; 다발성 골수종 (MM); NHL의 경우); 및 ETV6 / RUNX1 (AML; ALL; MDS의 경우)이다. 백혈구 세포화학 검사는 배양된 세포 도말에서 하기 염색을 사용하여 수행되었다: 메이-그뢴발트 기엠사(May-Gruenwald Giemsa) (종양 세포를 검출한다); 미엘로퍼옥시다제 (AML과 ALL을 구별한다); 과아이오딘산-쉬프(periodic acid-schiff)(적백혈병을 확인한다); 및 수단 블랙(sudan black) b (AML과 ALL을 구별한다). FISH 및 백혈구 세포화학 진단 검사는 IM-29 확장된 세포가 어떠한 백혈병성 형질전환도 갖지 않음을 시사한다.
도 14는 생체내 기능성을 평가하기 위해 IM-29 확장된 UCB의 면역결핍 마우스에의 이식에 대한 주요 실험 절차를 기재하는 개략도이다.
도 15A는 확장되지 않거나 확장된 UCB로 이식 후 3주째에 NOD/SCID/감마 (NSG) 마우스의 말초 혈액 (PB)에서 인간 CD45 키메라 현상을 도시한다. 시토카인을 보충한 무혈청 확장 배지 (SFEM) 또는 동물성-성분-미함유 (ACF) 배지 중 어느 하나에서 단핵 분획 (즉, CD34 선택없이)을 사용하여 UCB 이식편의 확장을 수행하였다. 이식은 도 14에 도시된 개략도에 의해 수행된다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편 (신선하거나 냉동-해동된 것 중 어느 하나)은 2.5x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 CD45 키메라 현상을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 표시된 실험군 중에서 스튜던트 t-검정(Student's t-test)으로부터 생성된 P 값은 명시된 n 값에 대한 그래프에 도시된다.
도 15B는 도 15A에 따른 이식 후 3주째에 NSG 마우스의 말초 혈액 (PB)에 존재하는 인간 CD45 세포의 계통 개입(lineage commitment)을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 5.0x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편은 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 각각의 개별 동물의 총 인간 세포 중에 존재하는 단핵구 (CD45+CD33+), 과립구 (CD45+CD15+), T 세포 (CD45+CD3+) 및 B 세포 (CD45+CD19+)의 비율을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다.
도 16A는 치사량에 가깝게 조사된 면역결핍 NOD/SCID/감마 (NSG) 마우스에 이식된 상이한 배양 조건하에 확장된 UCB 단핵화 세포의 결과를 도시하며, 이로써 NSG 마우스의 골수에서 생착된 인간 세포의 계통 개입 및 인간 CD45+ 세포의 백분율은 이식 후 19주 후에 결정하였다. 이 데이터 세트에서, 확장되지 않거나 확장된 이식편 (± 5.0 μM IM-29)을 받는 마우스로부터의 키메라 현상은 이식편 유형에 의해서가 아니라 수령자 마우스의 성별에 따라 분리된다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편은 2.5x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 CD45 키메라 현상을 나타내며 각각의 성별의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다.
도 16B는 도 16A에 따른 이식 후 19주째에 암컷 NSG 마우스의 골수 (BM)에서의 인간 CD45 키메라 현상을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg 중 어느 하나였으며, 한편 확장된 이식편 (신선하거나 냉동-해동된 것 중 어느 하나)은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 CD45 키메라 현상을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 표시된 실험군 중에서 스튜던트 t-검정으로부터 생성된 P 값은 명시된 n 값에 대한 그래프에 도시된다.
도 16C는 도 16A에 따른 이식 후 19주째에 수컷 및 암컷 NSG 마우스의 골수 (BM)에서의 총 인간 세포 중에 존재하는 전구 세포의 비율을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg 중 어느 하나였으며, 한편 확장된 이식편은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 공통 전구세포(progenitors)(CD45+CD34+), 골수양 (CD13+CD33+) 및 림프구양 (CD45+CD7+) 전구세포를 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다.
도 16D는 도 16A에 따른 이식 후 19주째에 수컷 및 암컷 NSG 마우스의 골수 (BM)에서의 총 인간 세포 중에 존재하는 골수양 세포(myeloid cell)의 비율을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg 중 어느 하나였으며, 한편 확장된 이식편은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 단핵구 (CD45+CD33+), 과립구 (CD45+CD13+/CD15+/CD66b+) 및 거핵구 (CD45+CD41a+)를 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다.
도 16E는 도 16A에 따른 이식 후 19주째에 수컷 및 암컷 NSG 마우스의 골수 (BM)에서의 총 인간 세포 중에 존재하는 림프구양 세포(lymphoid cell)의 비율을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg 중 어느 하나였으며, 한편 확장된 이식편은 2.5x10⁷개 세포/kg 또는 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 T 헬퍼 세포 (CD45+CD3+CD4+), 세포독성 T 세포 (CD45+CD3+CD8+), B 세포 (CD45+CD19+) 및 NK 세포 (CD45+CD56+) 전구세포를 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 다양한 군 중에서, IM-29 (5.0 μM)로 확장되고 기초 배양 배지와 관계없이 시토카인으로 확장된 UCB가 마우스 수령자에서 이제까지는 최선의 인간 CD45 키메라 형상을 제공하는 것으로 보이는데, 이는 더 신속한 생착 및 장기간 조혈의 유지 능력 둘 다를 시사한다.
도 17A 내지 도 17H는 5.0 μM의 IM-29 및 기초 시토카인의 존재하에 확장된 UCB 단핵화 세포 (MNC)가 주로 골수양 전구세포 및 성숙 세포를 생성하였으며, 이는 치사량에 가깝게 조사된 면역결핍 NOD/SCID/감마 (NSG) 마우스에 이식된 경우, 말초 혈액 (PB) 및 골수 (BM)에서 골수양 및 전구 세포의 조기 생착을 결과하였으며 한편 NSG BM의 장기간 인간 다중-계통 재구성을 확인해 줌을 도시한다.
도 17A는 11일에 걸친 IM-29 및 시토카인 대조군 배양물에서 성숙 골수양 및 림프구양 계통 세포의 확장을 도시한다. 이들 MNC 확장 배양물은 7일째에 ACF 배지, 시토카인 및 IM-29로 보충되었다. 골수양 계통은 CD45+CD33+ 단핵구, CD45+CD13+CD15+ 과립구 및 CD45+CD41a+CD61+ 거핵구로 이루어졌다. 림프구양 계통은 CD45+CD3+ T 세포, CD45+CD19+ B 세포 및 CD45⁺CD56⁺ NK 세포로 이루어졌다. 각각의 처리군에서 각각의 집단과 비교된 *P < 0.001. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 나타낸다.
도 17B는 이식 후 2주째에 NSG 마우스의 말초 혈액 (PB)에서 인간 CD45 키메라 현상의 산란 플롯을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 10.0x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편은 10.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 CD45 키메라 현상을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 표시된 실험군 중에서 스튜던트 t-검정으로부터 생성된 P 값은 명시된 n 값에 대한 그래프에 도시된다.
도 17C는 이식 후 2주째에 NSG 마우스의 말초 혈액 (PB)에서 인간 CD45+CD3+ T 세포 키메라 현상의 산란 플롯을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 10.0x10⁷개 또는 5.0x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 IM-29 확장된 이식편은 10.0x10⁷개 또는 5.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 T 세포 키메라 현상을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 표시된 실험군 중에서 스튜던트 t-검정으로부터 생성된 P 값은 명시된 n 값에 대한 그래프에 도시된다.
도 17D는 이식 후 2주째에 암컷 NSG 마우스의 골수 (BM)에서 인간 CD45+, CD45+CD34+ 전구세포 및 CD45+CD3+ T 세포 키메라 현상의 산란 플롯을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 10.0x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편은 10.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 산란 플롯은 개별 동물의 인간 CD45+, CD45+CD34+ 전구세포 및 CD45+CD3+ T 세포 키메라 현상을 나타내며 각각의 치료법의 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균을 도시한다. 표시된 실험군 중에서 스튜던트 t-검정으로부터 생성된 P 값은 명시된 n 값에 대한 그래프에 도시된다.
도 17E는 60일간의 관찰 기간에 걸쳐 IM-29 또는 시토카인 확장된 UCB-MNC 및 확장되지 않은 이식편으로 이식된 NSG 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 도시한다. 확장되지 않은 이식편의 절대 세포 용량은 10.0x10⁷개 세포/kg이었으며, 한편 확장된 이식편은 10.0x10⁷개 세포/kg의 등가의 세포 투여량으로 이식되었다. 실험군에 대한 전반적인 통계 비교가 또한 도시된다.
도 17F는 확장 배양이 자기적으로 정제된 CD34+ 세포로 개시되는 경우 IM-29 확장된 UCB의 이식 요법을 기재하는 개략도를 도시한다. IM-29 확장 프로토콜이 1 상 임상 시험으로 번역될 수 있게 하기 위해, 정제된 HSPC를 확장시키는 프로토콜의 효능을 입증할 필요가 있다.
도 17G는 표현형 CD45+CD34+CD38-를 가진 정제된 미성숙 HSPC를 기초 시토카인의 존재하에 5.0 μM IM-29를 함유하는 무혈청 확장 배지 (SFEM) 또는 동물성 성분 미함유 (ACF) 배지에서 배양한 경우 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f- (HSC1) 또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2)의 표현형을 가진 HSPC의 생체외 확장의 수준을 도시한다. 확장 배양은 SFEM/ACF 배지, 시토카인 및 IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 10일 동안 지속되었다. SFEM/ACF 배지 중 시토카인 단독이 블랭크 대조군으로서 역할을 하였다. 각각의 배지에서 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.05. 데이터는 n = 3에 대한 평균 ± SD를 나타낸다.
도 17H는 배양이 자기적으로 정제된 CD34⁺ 세포로 개시된 경우 CD34⁺ 세포의 생체외 확장의 수준을 도시한다. 확장 배양은 ACF 배지, 시토카인 및 5.0 μM IM-29 보충이 7일째에 수행되면서 11일 동안 지속되었다. 시토카인 대조군과 비교된 *P < 0.0001. 데이터는 n = 6에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 18은 조작된 UCB 이식편을 수반하는 완료된 임상 시험에서 호중구 회복까지의 중앙값 시간을 요약한 개략도이다. 호중구 회복까지의 중앙값 시간은 일치된 공여자 골수 (BM), 동원된 말초 혈액 (mPB) 또는 제대혈 (UCB)을 이식의 공급원으로서 사용하여 수행될 수 있는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 성공의 주요 지표이다. mPB, BM 또는 UCB를 사용하는, 통상적인 HSCT의 경우 (이식후 타임라인 위에 도시됨), 중앙의 오른쪽 화살표에 의해 나타내지는, 이식 후 타임라인쪽으로 개별 상향/하향 실선 화살표로 표시된 호중구 회복의 중앙값 시간은 각각 14일, 18일 및 25일이다. 조작된 UCB 이식편을 사용한 HSCT의 경우 (이식후 타임라인 아래에 도시됨), 환자는 비-골수 소멸성(non-myeloablative)/감소된 강도 (실선 네모칸) 또는 골수 소멸성 (파선 네모칸) 컨디셔닝 중 어느 하나를 받았다. 이들 시험 각각에 등록된 환자의 수는 각각의 네모칸에 표시된 N 값에 의해 나타내진다. 시험은 두 가지의 광범위한 범주로 분류될 수 있다 (표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같음):
주입된 총 유핵 세포의 절대 수의 증가:
(a) 이중 단위 UCBT (dUCBT);
(b) 일배수-동종(haplo-identical) CD34+ 세포와 조합된 단일 유닛 UCBT (UCB+Haplo CD34+);
(c) 조작되지 않은 유닛으로 공동-이식된 UCB의 단일 유닛의 생체외 확장. 현재까지, 임상적 확장은 다음을 사용하여 행하여져 왔다:
(i) 시토카인;
(ii) 생물 반응기;
(iii) 중간엽 간질 세포 (MSC)와의 공동-배양;
(iv) 생체 분자 예컨대 노치(Notch);
(v) 니코틴아미드 (NAM - SIRT1 억제제);
(vi) 스템레게닌 1 (SR1 - 아릴 탄화수소 수용체의 길항제);
(vii) 테트라에틸렌펜타민 (TEPA - 구리 킬레이트제).
주입된/이식된 세포의 귀소의 개선 :
(a) 또 다른 조작되지 않은 유닛의 정맥내 주입과 함께 또는 없이 단일 UCB 유닛의 골수내 주입(Intrabone marrow infusion) (i.b. 주입);
(b) MSC (UCB+MSC)와 함께 단일 UCB의 정맥내 (i.v.) 공동-투여;
(c) 다양한 화학물질 및 생체-분자 예컨대:
(i) 디메틸-프로스타글란딘 E2 (dmPGE2);
(ii) 보체 단편 3a (C3a); 및
(iii) 이중 단위 UCBT의 설정에서의 푸코실화
로 UCB 유닛의 프라이밍.

본 명세서에서 언급된 서지적 참고문헌은 편의상 참고문헌의 목록의 형태로 열거되어 있으며 실시예의 말미에 추가되어 있다. 이러한 서지적 참고문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

정의

편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어가 여기에 수집되어 있다.

용어 "포함하는"은 본원에서, 다양한 구성요소, 성분 또는 단계가 본 발명을 실시하는데 공동으로 사용될 수 있는 것으로 정의된다. 따라서, 용어 "포함하는"은 보다 제한적인 용어 "본질적으로 로 이루어진" 및 "로 이루어진"을 포함한다.

용어 "할로"는 본원에서 사용되는 경우 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도에 대한 언급을 포함한다.

달리 언급되지 않는 한, 용어 "아릴"은 본원에서 사용되는 경우 C_6-16(예컨대

C_6-14 또는 C_6-10) 아릴 기를 포함한다. 이러한 기는 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있고, 적어도 하나의 고리가 방향족인 6 내지 16개 (예를 들어 6 내지 14개, 또는 6 내지 10개)의 고리 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴 기의 부착 점은 고리계의 임의의 원자를 통해서일 수 있다. 그러나, 아릴 기가 비시클릭 또는 트리시클릭인 경우, 이들은 방향족 고리를 통해 분자의 나머지 부분에 연결된다. C_6-16 아릴 기는 페닐, 나프틸, 페난트라세닐 및 피레닐 등, 예컨대 1,2,3,4-테트라히드로나프틸, 인다닐, 인데닐 및 플루오레닐을 포함한다. 언급될 수 있는 본 발명의 실시양태는 아릴이 페닐, 나프틸, 페난트라세닐 또는 피레닐인 것들을 포함한다..

달리 언급되지 않는 한, 용어 "헤테로방향족"은 본원에서 사용되는 경우 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있고 O, N 및 S로부터 선택된 1 내지 6개 (예를 들어 1 내지 3개, 예컨대 1개)의 헤테로원자를 가질 수 있는 6- 내지 10-원 헤테로방향족 고리계를 포함한다. 헤테로방향족 고리계는 특성상 방향족인 적어도 하나의 고리를 함유하고, 고리계가 비시클릭 또는 트리시클릭인 경우, 고리계는 헤테로방향족 고리를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다.

모노시클릭 헤테로방향족 기는, 예를 들어, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 트리아지닐 등을 포함한다. 비시클릭 헤테로방향족 기는, 예를 들어, 벤즈이미다졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤조푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조피라졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 퓨리닐, 피롤로[2,3-6]피리디닐, 피롤로[5,1-6]피리디닐, 피롤로[2,3-c]피리디닐, 4,5,6,7-테트라히드로벤즈이미다졸릴, 4,5,6,7-테트라히드로벤조피라졸릴, 티에노[5,1-c]피리디닐 등을 포함하며, 이러한 비시클릭 헤테로방향족 기는 5-원 고리 내의 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 트리시클릭 헤테로방향족 기는 아크리디닐, 페나질을 포함한다.

헤테로시클릭 기는 특성상 완전히 포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 전적으로 방향족이거나 또는 부분적으로 방향족일 수 있다. 언급될 수 있는 헤테로시클릭의 가치는 1-아자비시클로[2.2.2]옥타닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤조디옥사닐, 벤조디옥세파닐, 벤조디옥세피닐, 벤조디옥솔릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조[c]이속사졸리디닐, 벤조모르폴리닐, 2,1,3-벤족사디아졸릴, 벤족사지닐 (3,4-디히드로-2H-1,4-벤족사지닐 포함), 벤족사졸리디닐, 벤족사졸릴, 벤조피라졸릴, 벤조[e]피리미딘, 2,1,3-벤조티아디아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 벤조트리아졸릴, 카르바졸릴, 크로마닐, 크로메닐, 시놀리닐, 2,3-디히드로벤즈이미다졸릴, 2,3-디히드로벤조[6]푸라닐, 1,3-디히드로벤조[c]푸라닐, 1,3-디히드로-2,1-벤즈이속사졸릴, 2,3-디히드로피롤로[2,3-b]피리디닐, 디옥사닐, 헥사히드로피리미디닐, 이미다조[1,2-a]피리디닐, 이미다조[2,3-b]티아졸릴, 인다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이소티오크로마닐, 이속사졸리디닐, 이속사졸릴, 모르폴리닐, 나프토[1,2-b]푸라닐, 나프티리디닐 (1,6-나프티리디닐 또는, 특히, 1,5-나프티리디닐 및 1,8-나프티리디닐 포함), 1,2- 또는 1,3-옥사지나닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤로[2,3-b]피리디닐, 피롤로[5,1-b]피리디닐, 피롤로[2,3-c]피리디닐, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 4,5,6,7-테트라히드로벤즈이미다졸릴, 4,5,6,7-테트라히드로벤조피라졸릴, 5,6,7,8-테트라히드로벤조[e]피리미딘, 테트라히드로이소퀴놀리닐 (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리닐 및 5,6,7,8-테트라히드로이소퀴놀리닐 포함), 테트라히드로피라닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로피리미디닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로퀴놀리닐 (1,2,3,4-테트라히드로퀴놀리닐 및 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀리닐 포함), 티에노[5,1-c]피리디닐, 티오크로마닐, 1,3,4-트리아졸로[2,3-b]피리미디닐, 크산테닐 등을 포함한다.

본원에서 (본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태에서) 화학식 I (II 또는 III)의 화합물에 대한 언급은 이러한 화합물 자체에 대한 언급, 이러한 화합물의 호변이성질체, 뿐만 아니라 이러한 화합물의 염 또는 용매화물에 대한 언급을 포함한다.

언급될 수 있는 염은 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 이러한 염은 통상적인 수단에 의해, 예를 들어 화학식 I의 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태를 하나 이상의 등가물의 적합한 산 또는 염기와, 임의로 상기 염이 불용성인 용매 중에서, 또는 매질 중에서 반응시킨 후에, 표준 기술 (예를 들어, 진공 중에서, 동결-건조에 의해 또는 여과에 의해)을 사용하여, 상기 용매 또는 상기 매질을 제거함으로써 형성시킬 수 있다. 염은 또한, 예를 들어 적합한 이온 교환 수지를 사용하여 염의 형태의 화학식 I의 화합물의 반대 이온을 또 다른 반대 이온과 교환함으로써 제조될 수 있다.

염의 예는 무기산 및 유기산으로부터 유래된 산 부가 염, 및 금속 예컨대 나트륨, 마그네슘, 또는 바람직하게는, 칼륨 및 칼슘으로부터 유래된 염을 포함한다.

산 부가 염의 예는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아릴 술폰산 (예를 들어 벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산 및 p-톨루엔술폰산), 아스코르브산 (예를 들어 L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-술폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, 글루콘산 (예를 들어 D-글루콘산), 글루쿠론산 (예를 들어 D-글루쿠론산), 글루탐산 (예를 들어 L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브로민화수소산, 염산, 아이오딘화수소산, 이세티온산, 락트산 (예를 들어 (+)-L-락트산 및 (±-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산 (예를 들어 (-)-L-말산), 말론산, (±-DL-만델산, 메타인산, 메탄술폰산, 1-히드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, 타르타르산 (예를 들어 (+)-L-타르타르산), 티오시안산, 운데실렌산 및 발레르산으로 형성된 산 부가 염을 포함한다.

염의 특정 예는 무기산 예컨대 염산, 브로민화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산으로부터; 유기산, 예컨대 타르타르산, 시트르산, 아세트산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 아릴술폰산으로부터; 및 금속 예컨대 나트륨, 마그네슘, 또는 바람직하게는, 칼륨 및 칼슘으로부터 유래된 염이다.

상기에 언급된 바와 같이, 화학식 I (II 또는 III)에 또한 포함되는 것은 상기 화합물 및 그의 염의 임의의 용매화물이다. 바람직한 용매화물은 무독성 제약상 허용되는 용매 (용매화 용매로서 이하에 지칭됨)의 분자가 본 발명의 화합물의 고체 상태 구조 (예를 들어, 결정 구조)로 혼입되어 형성되는 용매화물이다. 이러한 용매의 예는 물, 알콜 (예컨대 에탄올, 이소프로판올 및 부탄올) 및 디메틸술폭시드를 포함한다. 용매화물은 용매화물 용매를 함유하는 용매의 혼합물 또는 용매로 본 발명의 화합물을 재결정화시킴으로써 제조될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 용매화물이 형성되었는지의 여부는 널리 공지된 표준 기술 예컨대 열 중량 분석 (TGA), 시차 주사 열량계 (DSC) 및 X-선 결정학을 사용하여 화합물의 결정을 분석함으로써 결정될 수 있다.

용매화물은 화학량론적 또는 비화학양론적 용매화물일 수 있다. 특히 바람직한 용매화물은 수화물이고, 수화물의 예는 반수화물, 일수화물 및 이수화물을 포함한다.

용매화물 및 이들을 제조하고 특성화하는데 사용되는 방법에 대한 더 상세한 논의를 위해 문헌 [Bryn et al., Solid-State Chemistry of Drugs, Second Edition, published by SSCI, Inc of West Lafayette, IN, USA, 1999, ISBN 0-967-06710-3]을 참조한다.

화학식 I (II 및 III)의 화합물, 뿐만 아니라 이러한 화합물의 제약상 허용되는 염, 용매화물 및 제약상 기능적 유도체는, 간결성을 위해서, 이하에 "화학식 I의 화합물"로 함께 칭해된다.

화학식 I의 화합물은 이중 결합을 함유할 수 있으며 따라서 각각의 개별 이중 결합에 대해 E (상반되는(entgegen)) 및 Z (함께(zusammen)) 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 그의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

화학식 I의 화합물은 위치이성질체로서 존재할 수 있고 호변이성질현상을 또한 나타낼 수 있다. 모든 호변이성질체 형태 및 그의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

화학식 I의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유할 수 있으며, 따라서 광학적 및/또는 부분입체이성질현상을 나타낼 수 있다. 부분입체이성질체는 통상적인 기술, 예를 들어, 크로마토그래피 또는 분별 결정을 사용하여 분리될 수 있다. 다양한 입체이성질체는 통상적인, 예를 들어 분별 결정 또는 HPLC, 기술을 사용하여 화합물의 라세미 또는 다른 혼합물의 분리에 의해 단리될 수 있다. 대안적으로 목적하는 광학 이성질체는 라세미체화 또는 에피머화를 야기하지 않을 조건 (즉, '키랄 풀(chiral pool)' 방법)하에 적절한 광학 활성 출발 물질의 반응에 의해, 적합한 단계에서 후속적으로 제거될 수 있는 '키랄 보조제'와의 적절한 출발 물질의 반응에 의해, 예를 들어 호모키랄산에 의한 유도체화 (즉, 동적 분할을 포함한 분할), 이어서 크로마토그래피와 같은 통상적인 수단에 의한 부분입체이성질체 유도체의 분리에 의해, 또는 통상의 기술자에게 공지된 조건하에 적합한 키랄 시약 또는 키랄 촉매 모두와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 모든 입체이성질체 및 그의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

언급될 수 있는 본 발명의 추가 실시양태는 화학식 I (II 또는 III)의 화합물이 동위원소 표지된 것들을 포함한다. 그러나, 언급될 수 있는 본 발명의 다른 특정 실시양태는 화학식 I의 화합물이 동위원소 표지되지 않은 것들을 포함한다.

용어 "동위원소 표지된"은, 본원에서 사용되는 경우, 화합물의 하나 이상의 위치에서 비천연 동위원소 (또는 동위원소의 비천연 분포)가 있는 화학식 I의 화합물에 대한 언급을 포함한다. "화합물 중 하나 이상의 위치"에 대한 본원에서의 언급은 화학식 I의 화합물의 원자 중 하나 이상을 지칭한다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 용어 "동위원소 표지된"은 화합물의 하나 이상의 위치에서 동위원소가 보강된 화학식 I의 화합물에 대한 언급을 포함한다.

화학식 I의 화합물의 동위원소 표지 또는 보강은 수소, 탄소, 질소, 산소, 황, 플루오린, 염소, 브로민 및/또는 아이오딘 중 어느 하나의 방사성 또는 비방사성 동위원소로 할 수 있다. 이 점에서 언급될 수 있는 특정 동위원소는 ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹³N, ¹⁵N, ¹⁵O, ¹⁷O, ¹⁸O, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁷Cl, ⁷⁷Br, ⁸²Br 및 ¹²⁵I를 포함한다.

화학식 I의 화합물이 방사성 또는 비방사성 동위원소로 표지되거나 보강되는 경우, 언급될 수 있는 화학식 I의 화합물은 화합물 중 적어도 하나의 원자가 동위원소 분포를 표시하는 것들을 포함하며 여기서 해당 원자의 방사성 또는 비방사성 동위원소는 방사성 또는 비방사성 동위원소의 천연 수준보다 적어도 10% (예를 들어 10% 내지 5000%, 특히 50% 내지 1000%, 보다 특히 100% 내지 500%) 높은 수준으로 존재한다.

화학식 I의 다른 화합물은, 예를 들어 실시예 부분에서 본원에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다.

화학식 I의 최종 화합물 (또는 그에 대한 전구체 및 다른 관련 중간체)에서 R²와 같은 치환기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 이하에 기술되는 공정 이후 또는 공정 동안에 1회 이상 변형될 수 있다. 이러한 방법의 예는 치환, 환원 (예를 들어, 적절한 그리고, 필요한 경우, 화학선택적인 환원제 예컨대 LiBH₄ 또는 NaBH₄의 존재하에 카르보닐 결합 환원), 산화, 알킬화, 아실화, 가수분해, 에스테르화 및 에테르화를 포함한다. 전구체 기는 반응 순서 동안에 임의의 시간에, 상이한 이러한 기, 또는 화학식 I에 정의된 기로 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 통상적인 기술 (예를 들어 재결정화, 칼럼 크로마토그래피, 제조용 HPLC 등)을 사용하여 그의 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다.

이하에 기재되는 공정에서, 중간체 화합물의 관능기는 보호기에 의해 보호 될 필요가 있을 수 있다.

관능기의 보호 및 탈보호는 앞서 언급한 반응에서 반응 전 또는 후에 일어날 수 있다.

보호기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술에 따라 그리고 이하에 기재된 바와 같이 제거될 수 있다. 예를 들어, 이하에 기재된 보호된 화합물/중간체는 표준 탈보호 기술을 사용하여 비보호된 화합물로 화학적으로 전환될 수 있다.

관여된 화학의 유형은 보호기의 필요성 및 유형뿐만 아니라 합성을 완수하기 위한 순서를 좌우할 것이다.

보호기의 사용은 문헌 ["Protective Groups in Organic Chemistry" edited by J W F McOmie, Plenum Press (1973)], 및 ["Protective Groups in Organic Synthesis", 3^rd edition, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999)]에 완전히 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "관능기"는, 보호되지 않은 관능기의 경우에, 히드록시-, 티올로-, 아미노 관능기, 카르복실산 및, 보호된 관능기의 경우에, 저급 알콕시, N-, O-, S- 아세틸, 카르복실산 에스테르를 의미한다.

본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은, 용어 "치료"는, 예방적, 개선적, 치료적 또는 치유적 치료를 지칭한다.

용어 "대상체"는 본원에서 척추동물, 특히 포유동류, 보다 특히 인간으로서 정의된다. 연구의 목적상, 대상체는 특히 적어도 하나의 동물 모델, 예를 들어, 마우스, 래트 등일 수 있다. 예를 들어, 악성 및 양성 혈액 장애의 치료를 위해, 대상체는 급성 골수성 백혈병을 가진 인간일 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 본원에 주어진 방법에 따라 과도한 실험 없이 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 방법, 기술 및 화학물질은 표준 생명공학 및 분자 생물학 교과서의 프로토콜로부터 또는 주어진 참고문헌에 기재된 바와 같다.

바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포 샘플의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장 방법으로서,

(i) 상기 샘플의 단핵화 세포 분획을 배지에서 배양하는 단계; 및

(ii) 단핵화 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체외 확장 방법을 제공한다.

비록 보강되지 않은 샘플을 사용하는데 이점이 있긴 하지만, 확장법은 적어도 하나의 아졸계 소분자의 존재하에 배양을 개시하기 위해 사용되는 경우 제대혈, 골수 또는 말초 혈액 샘플로부터의 보강된/미리 선택된 CD34+ 세포 분획을 또한 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 적어도 하나의 아졸계 소분자는 화학식 (I), 또는 그의 염 및 용매화물에 의해 나타내진다

상기 식에서,

X는 NR₄, O 또는 S를 나타내고;

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, X는 NR₄ 또는 O을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₁은 페닐 또는 6-원 헤테로방향족 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (여기서 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₁은 페닐 또는 피리디닐 (이는 치환되지 않거나 Cl, Br, F 및 메틸로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₂는 페닐 또는 6-원 헤테로시클릭 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로 또는 C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₂는 페닐, 피리딜 또는 디히드로피라닐 (이는 치환되지 않거나 Br, Cl, F 또는 메틸로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₃은 치환되지 않거나 할로, OR₅ 및 C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된 C_10-16아릴을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₃은 나프틸, 페난트라세닐 또는 피레닐 (이는 치환되지 않거나 Br, Cl, F, OR₅ 및 메틸로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₃은 나프틸을 나타내며 이 기는 치환되지 않거나 Cl, F, 및 OR₅로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 I에서, R₄ 및 R₅는 H 또는 메틸 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로부터 독립적으로 선택된다.

상기 식에서,

R₆은 H, Cl, Br 및 F를 나타내고;

R₇은 H, Cl, Br, F, OR₈을 나타내고;

상기 식에서,

R₁₀은 H, Cl, Br, 또는 F를 나타내고;

R₆ 및 R₇은 청구항 12에 정의된 바와 같다.

(ix) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(6-메톡시나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸; 및

(xii) 4-[4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘; 및

(xiii) 4-[4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘.

(vi) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-이미다졸-5-일]피리딘; 및

(vii) 2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(피리딘-4-일)-5-(m-톨릴)옥사졸.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 적어도 하나의 시토카인의 존재하에 확장된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 시토카인은 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 6 (IL-6), 과립구-콜로니 자극 인자 (GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 적어도 하나의 시토카인은 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L) 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2 중 적어도 2종, 적어도 3종 또는 4종 모두의 존재하에 확장된다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2의 존재하에 확장된다. 보다 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml TPO, 50 ng/ml FLT-3L 및 20 ng/ml IGFBP-2의 존재하에 확장된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법은 제대혈 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자와 적어도 9일의 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 방법은 제대혈 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자와 약 11일의 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다. 배양 기간은, 예를 들어, 제대혈의 특정 출발 샘플, 세포의 성장 속도 또는 이식에 필요한 세포의 수에 따라 달라질 수 있다는 점이 이해될 것이다. CD45+CD34+ HSPC 세포를 또한 함유하는, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액이 본 발명의 화합물에 따라 또한 확장될 수 있다는 점이 이해될 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 시토카인을 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가한다. 본 발명자들은 세포 확장으로 인해 배양물이 일반적으로 신선한 배지의 첨가를 필요로 하는 때가 7일째임을 밝혀내어, 시토카인 및 아졸계 소분자를, 원하는 경우, 동시에 보충하였다. 배지를 보충하기 위한 요건은 대략 7일째, 예컨대 6일째 또는 8일째로 다양할 수 있다는 점이 이해될 것이다. 배양 배지는, 예를 들어, 동일 부피의 신선한 배지로 보충될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아졸계 소분자를 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가한다. 아졸계 소분자를 0일째에 첨가한 경우 그리고 배지를 대략 7일째에 보충한 경우 세포의 최적 확장이 일어난다는 것이 밝혀졌긴 하지만, 소분자가 시간 0에서만 첨가된 경우 상당한 확장이 또한 수득되었다 (예를 들어, 도 12 참조). 소분자가 0일째에 첨가되면, 약 7일째까지, 생성된 세포의 수로 인해 배지가 고갈되며 그것은 최적 확장을 달성하기 위해 보충될 필요가 있는 것으로 보인다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포는 정상적인 핵형을 가지며 백혈병성 형질전환의 어떠한 징후도 나타내지 않는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유핵 백혈구의 CD34- 분획은 단리되고, 이를 필요로 하는 대상체로의 생체외 확장된 세포와의 공동-이식에서 사용하기 위해 보유된다. CD34- 분획은 공동-이식되는 경우, 특히 인간에서, 이식된 생체외-확장된 세포의 생착을 개선시키거나 거부 반응의 가능성을 감소시킬 수 있는 림프구양 세포를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 방법은 확장된 조혈 전구 세포 및/또는 조혈 줄기 세포의 적어도 일부를 NK 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 NK 세포는 확장된 조혈 전구 세포 및/또는 조혈 줄기 세포의 이식편으로 치료된 암 환자를 추가로 치료하는데 사용될 수 있다. NK 세포는 치료 후 재발 위험이있는 환자의 예방에서, 또는 이식 치료 후 재발한 환자의 치료에서 사용될 수 있다.

조합물 및/또는 키트의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 시토카인은 제대혈의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용하기 위해 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2를 포함하는 군으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아졸계 소분자는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+ CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포를 확장시킨다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제대혈의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용하기 위한 본 발명의 임의의 측면에 따라 정의된 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물이 제공된다. CD45+CD34+ HSPC 세포를 또한 함유하는, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액이 본 발명의 화합물에 의해 또한 확장될 수 있다는 점이 이해될 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 하는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 방법에 의해 수득된 세포의 용도가 제공된다.

바람직한 실시양태에서, 의약은 생체외 확장된 세포 및 보유된 CD34- 림프구양 세포를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제대혈의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 아졸계 소분자의 용도가 제공된다. CD45+CD34+ HSPC를 또한 함유하는, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액이 본 발명의 화합물에 의해 또한 확장될 수 있다는 점이 이해될 것이다.

바람직한 실시양태에서 적어도 하나의 아졸계 소분자는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+ 조혈 전구 세포를 확장시킨다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 그의 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포의 확장을 필요로 하는 환자의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 아졸계 소분자의 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 치료 방법으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에 의해 수득된 유효량의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 치료는 또한 유효량의 CD34- 림프구양 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 치료 방법으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 임의의 측면에 따른 아졸계 소분자를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 방법은, 예를 들어, 정맥내 투여를 포함할 수 있다. 이러한 치료를 필요로 하는 환자는 낮은 혈구 수 (화학요법 이후 또는 전신 방사선 조사) 또는 골수 질환을 가질 수 있다.

대상체는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증, 발작성야간 헤모글로빈뇨, 판코니 빈혈, 중증성 지중해 빈혈(thalassemia major), 겸상 적혈구 빈혈, 중증 복합 면역결핍, 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 혈구탐식성 림프조직구증식증 및 선천성 대사이상으로부터 선택된 조혈 장애를 가질 수 있다.

실시예 1

방법

UCB 수집, 가공, 해동 및 플레이팅

UCB는 임상적 뱅킹(clinical banking)의 기준을 충족시키지 못하는 기증된 유닛으로부터, 싱가포르 제대혈 은행(Singapore Cord Blood Bank: SCBB)을 통해 입수하였다. 기증모로부터 사전 동의를 얻고 싱가포르 국립 대학교 (NUS)의 기관 감사 위원회(Institutional Review Boards) 및 싱가포르 종합 병원 (SGH)과 함께, SCBB의 연구 자문 윤리위원회(Research Advisory Ethics Committee)가 샘플의 사용을 승인하였다. 단핵 세포 (MNC)는 피콜-히스토파크(Ficoll-Histopaque)™ 프리미엄(Premium) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 영국)을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 신선한 UCB로부터 단리하였다. 계수된 UCB-MNC는 후속 사용을 위해 10% v/v 디메틸-술폭시드 (DMSO) (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국)와 함께 90% v/v 자가 혈장에서 냉동보존하였다. 방법에 대한 간단한 요약이 도 3에 도시되어 있다. UCB-MNC는 인간 혈청 알부민 (25% v/v) (싱가포르 보건과학청(Health Sciences Authority), 싱가포르) 및 덱스트란 40 (75% v/v) (호스피라(Hospira), 미국)을 사용하여 해동시켰다. 100 ng/mL 줄기 세포 인자 (SCF) (페프로테크(PeproTech), 미국) 및 트롬보포이에틴 (TPO) (페프로테크, 미국); 50 ng/mL FLT-3 리간드 (FLT-3L) (페프로테크, 미국); 및 20 ng/mL 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-2 (IGFBP-2) (알앤드디 시스템즈((R&D Systems), 미국)의 인간 시토카인 칵테일이 보충된, 스템스판(StemSpan)™ 무혈청 확장 배지 (SFEM) 또는 동물성 성분 미함유 배지 (ACF) (스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies), 캐나다)에서 임의의 세포 표면 마커 의존성 줄기 세포 보강 없이 경험적으로 결정된 최적 밀도 4.0x10⁵개 세포/mL로 UCB-MNC를 배양하였다. UCB-MNC에 대해 5 μM IM-29와 함께 그리고 없이 다양한 시토카인 조합물 (앞서 기재된 각각의 농도에서)을 시험하여 ACF 배지에서 11일에 걸친 TNC 및 HSPC의 확장에 대한 그의 효과를 결정하였다. 특정 실험의 경우, 세포 배양은 각각 5.0x10⁴개 세포/ml 또는 2.0x10⁶개 세포/ml의 최적 플레이팅 농도에서 정제된 집단 예컨대 조기 (CD45+CD34+CD38-) 또는 후기 (CD45+CD34+CD38+) 전구 세포로 개시하였다. 이러한 순수한 집단은 냉동-해동되고 보강되지 않은 UCB-MNC를 형광 접합된 항체를 사용하여 표지한 후에 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 수득하였다. DMSO에 용해된 치환된 아졸계 소분자를 경험적으로 결정된 최적 농도 5.0 μM으로 배양물에 첨가하였다. 소분자는 없으나 시토카인이 보충된 UCB-MNC 배양물은 대조군으로서 역할을 하였으며, 한편 시토카인 및 DMSO가 보충된 배양물은 비히클 대조군으로서 역할을 하였다.

시험관내 실험을 위한 세포 배양은 6- 또는 24-웰 플레이트 (비디 팔콘(BD Falcon), 미국)에서 행하였으며, 한편 생체내 이식 연구를 위한 배양은 T-175 플라스크 (코닝(Corning), 미국)에서 수행하였다. 세포 배양물을 필요한 지속기간 동안 37℃에서 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 유지하였다. UCB 확장 평가 및 동물 실험을 위해, 7일째에 시토카인 및 소분자 보충을 포함한 확립된 10-11-일 확장 프로토콜을 사용하였다. 인큐베이션의 완료시, 세포를 배양기(culture-ware)로부터 흡인시키고, 후속적으로 둘베코(Dulbecco's) 인산염 완충 식염수 (DPBS) (히클론((Hyclone), 미국)에 의해 헹구었다. 추출된 세포를 자동화된 차동 혈액학 세포 계수기 (쿨터(COULTER)^® Ac^.T™ 차동 혈액학 분석기(diff Hematology Analyzer), 벡크만 쿨터 인크(Beckman Coulter Inc), 미국)를 사용하여 계수하고 마우스에서 후속 시험관내 분석 또는 이식을 위해 DPBS에 재현탁시켰다.

콜로니 형성 단위 검정

새로이 해동된 UCB-MNC 또는 언급된 세포 배양물의 11일간 확장된 세포로부터의 과립구-단핵구 (GM)의 콜로니-형성 단위 (CFU)를 평가하였다. 이중의 새로이 해동된 UCB-MNC (5,000 및 10,000개 세포) 및 확장된 세포 (1,000 및 5,000개 세포)를 더 이상의 배지 조작없이 에리트로포이에틴 (EPO) (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec), 독일)을 가진 1.1 mL의 조혈 줄기 세포 (HSC)-CFU 완전 배지에서 35 mm 페트리 접시 (비디 팔콘, 미국)에서 배양하였다. 가습된 환경에서 37℃ 및 5% CO₂에서 14일 내지 16일 배양 후, 전하-결합 소자 (CCD) 카메라 (올림푸스 유로파 게엠베하(Olympus Europa GmbH), 독일)가 장착된 SZ61 올림푸스 현미경을 사용하여 콜로니를 채점하고 사진을 찍었다.

동물 유지관리, 이식 및 절차

이종이식 연구는 싱가포르 보건 서비스 (싱헬쓰) 동물실험윤리위원회(Singapore Health Services (SingHealth) Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 잭슨 레보러토리(Jackson Laboratory) (바 하버(Bar Harbor), 미국)로부터 구매한, 비-비만 당뇨병 (NOD) - 중증 복합 면역결핍 (SCID) 감마 (NSG) 마우스로 보다 널리 공지된 NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ를 싱헬쓰 실험 의학 센터(SingHealth Experimental Medicine Center)에서 동일 성별의 여섯 개 케이지에 수용하였다. 멸균된 사료 및 물은 무제한으로 접근할 수 있었다. 순응 및 성공적인 번식 후에, 치사량에 가깝게 조사된 (240 cGy) 8 내지 12주령의 마우스를 하기의 꼬리 정맥 투여를 위해 5개의 실험군으로 무작위로 나누었다: (i) 식염수; (ii) 확장되지 않은 UCB-MNC; (iii) 스템스판™-SFEM 또는 스템스판™-ACF에서 시토카인 확장된 UCB-MNC (대조군 확장 배양물); (iv) 스템스판™-SFEM 또는 스템스판™-ACF에서 IM-29 및 시토카인 확장된 UCB-MNC. 생체내 인간 세포 생착 동역학을 조사하기 위해, 확장된 UCB (SFEM 또는 ACF에서 ±IM-29)를 2.5x10⁷개 세포/kg, 5.0x10⁷개 세포/kg 또는 10.0x10⁷개 세포/kg의 경험적으로 최적화된 등가의 투여량으로 이식하였으며 한편 확장되지 않은 UCB를 2.5x10⁷개 세포/kg, 5.0x10⁷개 세포/kg 또는 10.0x10⁷개 세포/kg의 절대 투여량으로 이식하였다. 이식 20주 후에 1차 NSG 수령자의 골수로부터 수득한 자성 항체-표지되고 칼럼 (밀테니 바이오테크, 독일) 정제된 (제조업자의 프로토콜에 따라) 인간 CD45⁺ 세포를 하기 실험군을 위해 꼬리 정맥 주사를 통해 2차 NSG 수령자에게 투여하였다: (i) 확장되지 않은 UCB-MNC; (ii) 시토카인 확장된 UCB-MNC 및 (iii) IM-29 및 시토카인 확장된 UCB-MNC (1x10⁶ 내지 2x10⁶개 세포/마우스의 이식 용량으로).

모든 마우스는 각각 박테리아 감염을 최소화하고 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 기회를 감소시키기 위해 항생제 및 면역억제 약물을 받았다. 간결히 설명하면, 모든 실험군의 경우, 시클로스포린(Cyclosporine) (노바티스(Novartis), 미국) 면역억제 요법을 최초 연속 2일 동안 10 mg/kg의 투여량으로 실험 세포 접종 다음 날부터 시작한 다음에 15 mg/kg을 격일로 3회 초과 용량 (총 5회 용량)으로 투여하였다. 1.1 g/L의 네오마이신 트리술페이트 (시그마-알드리치, 미국) 및 0.1 g/L의 폴리마이신 B 술페이트 (시그마-알드리치, 미국)를 함유하는 산성화된 (pH=2.2) 음용수를 이식 전에 7일 동안 그리고 이식 후에 또 다른 23일 동안 제공하여 박테리아 감염을 최소화하였다. 턱밑 정맥을 통해 수집된 혈액 샘플을 사용하여 이식 2 내지 3주 후 인간 세포 재구성의 평가를 행하였다. 인간 다중-계통 재구성을 분석하기 위해 마우스를 2주 또는 20주의 말미에 희생시켜 골수를 수확하였다.

유동 세포 계측 분석 및 세포 분류

모든 데이터는 샘플당 적어도 10,000개의 이벤트가 수집되는 시토믹스(Cytomics) FC500 유동 세포 계측기 (벡크만 쿨터, 인크., 미국) 또는 BD™ LSR II (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 미국)를 사용하여 획득하였다. 획득된 데이터는 후속적으로 CXP 분석 소프트웨어 (벡크만 쿨터, 인크., 미국) 또는 BD FACSDiva™ 8.0 소프트웨어 (벡톤 딕슨, 미국)로 분석하였다. BD FACSAria™ III (벡톤 딕슨, 미국)을 사용하여 하기에 기재된 적절한 무균 형광 접합 모노클로날 항체로 표지된 UCB-MNC로부터 조기 (CD45+CD34+CD38-) 또는 후기 (CD45+CD34+CD38+) 전구세포를 분류해냈다 (도 17G). 적정을 수행하여 최적 항체 염색을 확인하였다. 분석 동안에 비특이적 항체 결합을 게이팅 아웃(gating out)할 목적으로 이소형 대조군을 사용하였다.

조혈 전구 세포 (HPC)의 표현형 분석 또는 무균 분류를 위해 피코에리트린 (PE) 접합 CD34, 알로피코시아닌 접합 (APC) CD38 및 피코에리트린-Cy7 (PE-Cy7) 접합 CD45를 사용하였다. CD45RA-V450, CD90-FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트) 및 CD49f-PerCP-Cy5.5를 HPC 항체와 조합하여 드문 HSPC 집단을 탐침하였다. 림프구양 계통 전구세포 및 분화된 세포는 CD7-FITC, CD3-BV605, CD19-BUV395, CD56-V450 및 CD138-PerCP-Cy5.5를 사용하여 표현형화하였다. 골수양 계통 전구세포 및 분화된 세포는 CD33-PE-Cy7, CD41a-FITC, CD15-BUV395, CD13-BV421 및 CD61-PerCP-Cy5.5를 사용하여 표현형화하였다. 이들 모든 표현형 발현 연구에서, 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD)를 사용하여 살아 있는 세포 및 죽은 세포를 구별하였다. 모든 항체는 비디 파르밍겐 (미국)으로부터 구매하였다.

아넥신-V-FITC (벡크만 쿨터, 인크., 미국), 7-AAD (벡크만 쿨터, 인크., 미국) 및 CD45-PE-Cy7을 CD45+ 세포 생존력 분석을 위해 사용하였다.

마우스 말초 혈액에서 인간 키메라 현상의 분석은 확장되지 않은 이식편 및 확장된 이식편의 이식 후 14, 21, 42, 63, 84, 105, 126 또는 196일째에 수행하였다. 대략 190 μl의 각각의 혈액 샘플은 염화암모늄 (사내 제제(in-house formulation) 의존성 적혈구 세포 용해를 겪은 후 마우스 및 인간 FcR 시약을 사용하여 차단하여 비특이적 항체 결합을 최소화하였다. 샘플 중의 나머지 백혈구는 항-인간 CD45-APC, CD3-PE/FITC, CD19-비오블루(VioBlue)/PE-Vio615, CD33-PE-Vio770, CD15-PerCP-Vio770, CD34-PE 및 항-마우스 CD45-FITC/비오그린(VioGreen)으로 염색하였다. 모든 항체 및 차단 시약은 밀테니 바이오테크 (독일)로부터 구매하였다.

개별 마우스의 골수는 이식 후 2주 또는 20주째에 2% 소 태아 혈청 (FBS) (시그마-알드리치, 미국) 보충된 RPMI 배지 (인비트로겐(Invitrogen), 미국)를 사용하여 대퇴골과 경골 둘 다에서 플러싱해 냈다. 염화암모늄을 사용하여 모든 샘플에서 적혈구 (RBC)를 용해시켰다. 2% FBS (시그마-알드리치, 미국)를 가진 DPBS (히클론, 미국)를 사용하여, 적절한 형광 접합 항체 및 유동 세포 계측기를 사용하여 추가 인간 세포 표면 마커/항원 분석을 위해 유핵 세포를 세척해내고 재현탁시켰다. 간결히 설명하면, 골수 샘플 중의 나머지 백혈구를 인간 및 마우스 세포를 구별하기 위해 항-인간 CD45-APC 및 항-마우스 CD45-FITC/비오그린으로 염색하였다. 인간 CD34-PE를 사용하여 인간 전구 세포를 분석하였다. 인간 골수양 세포를 CD71-비오블루, CD33-PE-Vio770, CD15-PerCP-Vio770, CD13-PE-Vio615, CD66b-APC-Vio770 및 CD41a-비오그린으로 염색함으로써 분석하였다. 인간 림프구양 세포를 CD3-비오그린, CD4-비오블루, CD7-APC-Vio770, CD8-PerCP-Vio700, CD19-PE-Vio615 및 CD56-PE-Vio770으로 염색함으로써 분석하였다. 모든 항체 및 차단 시약은 밀테니 바이오테크 (독일)로부터 구매하였다.

항체 염색의 완료시, 모든 표지된 세포를 DPBS (히클론, 미국)로 세척한 후, 유동 세포 계측기 기반 분석을 위해 2% FBS (시그마-알드리치, 미국)를 가진 DPBS (히클론, 미국)에 재현탁시켰다.

형광 계내 하이브리드화 (FISH)

UCB-MNC 샘플을 변형 카르노이 고정액(Carnoy's fixative) (레이카 바이오시스템즈(Leica Biosystems), 독일)으로 고정시키고 유리 현미경 슬라이드에 놓은 다음에, 에탄올 (시그마-알드리치, 미국) 시리즈 (70%, 85% 및 100%)를 통해 2분 동안 탈수시킨 후 공기-건조시켰다.

FISH 분석은 LSI D7S486 스펙트럼오렌지(SpectrumOrange)™ CEP 7 스펙트럼그린(SpectrumGreen)™ CEP 8 스펙트럼아쿠아(SpectrumAqua)™/LSI MYC 스펙트럼오렌지™, LSI CDKN2A 스펙트럼오렌지™/CEP 9 스펙트럼그린™, LSI ABL1 스펙트럼오렌지™/BCR 스펙트럼그린™ 이중 융합 전위 탐침, LSI MLL 이중 색상 분해 탐침(dual color break-apart probe), LSI ETV6 스펙트럼그린™/RUNX1 스펙트럼오렌지™ 추가 신호 이중 색상 전위 탐침(extra signal dual color translocation probe), 및 LSI TP53 스펙트럼오렌지™/CEP 17 스펙트럼그린™ 탐침 세트를 포함하는 탐침 (애보트 몰레큘라(Abbott Molecular), 미국)의 패널을 사용하여 수행하였다. FISH 탐침을 고정 세포에 적용하고 75℃에서 공동-변성시킨 후, 37℃에서 밤새 하이브리드화시켰다. 세척을 수행하고 슬라이드를 DAPI 항-퇴색 용액 (베타실드(Vectashield), 벡터 레보러토리(Vector Laboratories), 미국)으로 대조염색하고 에피-형광(epi-fluorescence) 현미경 (레이카(Leica, Germany), 독일)을 사용하여 분석하였다.

LSI D7S486의 손실, 삼염색체 8, CDKN2A의 손실, ABL1 및 BCR을 수반하는 전위, MLL 분해, ETV6 및 RUNX1을 수반하는 전위, 및 TP53의 손실에 대해 100개의 중첩되지 않은 핵으로부터의 신호를 열거하였다. 정상적인 신호 패턴은 D7S486 및 CEP7의 2개의 카피, CEP 8 및 MYC의 2개의 카피, CDKN2A 및 CEP 9의 2개의 카피, ABL1/BCR 융합 신호의 부재, 무손상 MLL 이중 융합 신호, ETV6/RUNX1 융합 신호의 부재, 및 TP53의 2개의 카피에 의해 규정된다.

세포 유전학/핵형

리드 화합물 IM-29의 존재 또는 부재하에 표준 시토카인 칵테일을 함유하는 스템스판^TM-ACF에서 배양되지 않은 UCB-MNC 및 10일간 배양된 세포를 핵형 분석에 사용하였다. 핵형을 연구하기 위해 UCB-MNC 세포를 태아 송아지 혈청 (시그마, 미국), L-글루타민 (깁코(Gibco), 미국) 및 항생제 (깁코, 미국)가 보충된 RPMI 1640 배지 (깁코, 미국)를 사용하여 37℃에서 유지된 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 그 다음에, 배양물을 수확하고 표준 임상 실험실 프로토콜에 따라 G-밴드화하였다. 20개의 세포를 분석하고 핵형을 인간 세포유전학 명명법을 위한 국제 시스템(International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (2016)에 따라 기재하였다.

백혈구 세포화학

메이-그뢴발트 기엠사 (MGG), 수단 블랙 B, 과아이오딘산-쉬프 (PAS) 및 미엘로퍼옥시다제 염료 (p-페닐렌디아민 및 카테콜)를 사용하여 새로이 해동되거나 배양된 UCB-MNC 세포 (± 5.0 μM)로부터의 임상 도말을 표준 임상 실험실 프로토콜을 사용하여 염색하고 직립 현미경을 사용하여 영상화하였다. 모든 염료는 시그마-알드리치, USA로부터 입수하였다.

통계 분석

결과는 도면의 간단한 설명에 명시된 특정된 n 값에 대한 평균의 표준 오차 (SEM) 또는 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 보고된다. 두 군 사이의 차이의 유의성은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정되었으며, P 값은 도면의 간단한 설명에 명시되어 있다. 오리진프로(OriginPro)® 9.1 (오리진프로, 미국), 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6.0 (그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.), 미국) 및 마이크로소프트 오피스 엑셀(Microsoft Office Excel) (마이크로소프트(Microsoft), 미국)을 사용하여 데이터 처리 및 통계 분석을 수행하였다.

실시예 2

주요 방법 단계

본 발명의 실시예에서, IM-29를 사용하여 냉동-해동된 UCB-MNC로부터 HSPC를 확장시키는 방법에 관여하는 주요 단계가 도 2에 도시되어 있다:

(i) 밀도 의존성 원심분리를 사용하여 신선한 UCB를 처리하여 추가 확장을 위해 -180℃에서 냉동되는 단핵화 세포 (MNC) 분획을 단리하는 단계;

(ii) SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2의 시토카인 칵테일을 함유하는 규정된 배양 배지에서 UCB-MNC를 해동시키고 배양하는 단계;

(iii) IM-29를 5.0 μM의 최종 농도로 첨가하는 단계;

(iv) 37℃ 및 5% CO₂에서 유지된 가습된 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션하는 단계;

(v) 3일째에, CD45를 발현하는 백혈구 세포 (WBC)의 생존력을 모니터링하는 단계. HSPC는 CD45 세포의 서브세트이다;

(vi) 7일째 - 성장 배지, 시토카인 및 IM-29를 보충 (리필(top-up))하는 단계;

(vii) 10/11일째 - 시험관내 표현형 및 기능 검정 및 면역결핍 마우스에 대한 생체내 이식을 사용한 확장을 평가하기 위해 세포를 수확하여 재증식 능력을 모니터링하는 단계.

확장 동안에 세포 조성의 변화는 도 5에 도시되어 있다.

실시예 3

화합물 SB203580으로부터 유래된 소분자

소분자 라이브러리는 몇몇 유사체로 이루어졌으며, 이들 모두가, 5 내지 10 μM의 작업 농도에서 최적 활성을 가진, p38 MAPK (미토겐 활성화 단백질 키나제)의 공지된 억제제인 모 화합물 SB203580 (도 6D)으로부터 유래되었다. 도 6A에 도시된 화학 구조를 가진 화합물 IM-29가 시험된 것들 중에서 가장 효과적이다. 도 6B에 도시된 화학 구조를 가진 IM-04가 두 번째로 가장 효과적인 화합물이다. 준-최적 효과를 제공한 IM-29 및 IM-04의 구조 유사체가 도 6C에 도시되어 있다. SB203580의 총 40개의 유사체가 본 연구를 위해 생성되었으며, 이는 도 6E에 도시되어 있으며, 구조 및 화학적 변형을 기반으로 하여 4개의 군으로 광범위하게 나뉘어져 있다. 도 6E의 군 1은 이미다졸의 C-2 위치에서 치환기의 변화를 조사하였으며, 한편 인접한 피리딘-4-일/3-톨릴 또는 피리딘-4-일/3-(트리플루오로메틸)페닐 모이어티를 이미다졸의 C-4 및 C-5 위치에서 보유하여 총 6개의 유사체를 생성시켰다. 두번째로 우수한 화합물 IM-04는 군 1의 구성원이다. 추가의 13개의 상이한 유사체가 군 2에서 생성되었으며 (도 6E에 도시된 바와 같이), 여기서 C-5 위치에서의 피리딘-4-일 치환기가 피란-4-일 치환기로 대체되었으며, 한편 이미다졸의 C-4 위치에서의 톨릴-기 또는 4-플루오로페닐 치환기를 보유하였다. 도 6E의 군 3의 화합물 구조를 사용하여 이미다졸의 C-2 위치에서의 치환기의 변화를 조사하였으며, 한편 인접한 피리딘-4-일/4-플루오로페닐 모이어티를 보유하였다. 리드 화합물 IM-29는 군 3의 구성원이다. 군 4 (도 6E)에서 이미다졸 코어 구조는 옥사졸에 의해 대체되었다. 구조-활성 관계 연구는 HSPC 확장 매개에서 중대한 특정 화학 구조 및 변형을 확인하기 위해 도 6E에 도시된 모든 유사체를 기반으로 하여 수행하였다. 일반적으로, C5 및 C4 위치에서 방향족 영역 및 H-결합 수용체를 제공할 수 있는 인접한 피리딘-4-일/4-플루오로페닐 치환기를 가진 이미다졸은 HPC의 생체외 확장을 유도하는데보다 높은 활성을 나타낸 것으로 관찰되었다. 이미다졸의 C4에서의 치환기가 톨릴 또는 3-(트리플루오로메틸)페닐 기로 대체된 경우 이는 HPC 확장을 증대시키는 유사체의 능력을 감소시켰다. 유사하게, 이미다졸의 C5에서의 치환기가 피란-4-일 기로 대체된 경우, 이는 HPC 확장을 상당히 감소시켰다. 아졸의 C2 위치에 대한 최선의 치환기는 나프틸 치환기이고, 이들 중에서, 1-플루오로나프탈렌-2-일 치환기를 갖는 화합물 IM-29는 스크리닝된 모든 화합물 중에서 HPC의 생체외 확장의 유도를 위한 가장 강력한 화합물인 것으로 확인되었다. 이미다졸의 C2 위치에서 IM-29의 1-플루오로나프탈렌-2-일을 나프탈렌-2-일 (예컨대 화합물 ZQX-33: 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘에서)로 대체하는 것은 HPC 확장 용량을 적어도 2배 감소시켰다 (P < 0.001). 마지막으로, 옥사졸 화합물 (OZ-07)은 HPC의 생체외 확장을 유도하는데 최적으로 활성적이지 않았는데, 이는 분자의 중심 구조에서 H-결합 공여 기를 갖는 것이 필수적임을 시사한다.

모든 화합물은 아넥신 V 및 7-AAD를 사용하여 CD45+ 백혈구의 생존력을 유지하는 그의 능력에 대해 평가되었다. 생체외 배양 동안에 CD45+ 세포에서의 아폽토시스의 유도는 HSPC의 확장을 제한한다. 모든 화합물은 UCB 세포에 최소의 급성 독성을 나타냈다 (도 7).

실시예 4

유사체 IM-29는 생체외에서 HPC 확장을 상당히 개선시킨다

5.0 μM 농도에서의 IM-29는 발현 프로파일 CD45+CD34+CD38-CD45RA-를 가진 조혈 전구 세포 (HPC)를 10일에 걸쳐 적어도 1,200배 만큼 확장시키는 것으로 나타났다 (도 8A). 시토카인 대조군과 비교하여, IM-29는 HPC 확장에 8배의 향상 효과를 부여할 수 있었다. IM-04는 HPC를 10일에 걸쳐 1,000 내지 1,150배 확장시켰으며 (도 8A), 한편 IM-01, ZQX-33, ZQX-36, GJ-C 및 OZ-07은 HPC를 10일에 걸쳐 400 내지 900배 확장시켰다 (도 8A). 스크린은 추가의 아졸계 소분자를 포함한, 동물성-성분-미함유 (ACF) 배지에서 반복하였고, 확장 데이터는 도 8B에 제시되어 있다. 게다가, IM-29는 CD45+CD34+CD38-CD45RA--의 HPC-연관 발현을 시토카인 대조군보다 3배 높은 약 68%로 증가시켰다 (도 8C).

부모 화합물 SB203580에 대한 최적의 작업 농도이기 때문에 5.0 μM에서 소분자가 보충되는 이전의 실험을 수행하였으나; HPC를 확장시키는데 IM-29의 최적 작업 농도를 확인하는 것이 필요하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이, TNC의 최적 확장은 비-선택된 MNC로 개시된 배양의 경우 5.0 μM의 IM-29 농도로 달성되었다. 1.0 μM 또는 10 μM의 IM-29에서, 총 유핵 세포 (TNC)의 확장은 5.0 μM과 비교하여, 각각 0.83배 및 0.70배 만큼 감소하였다. 유사하게, 1.0 μM, 5.0 μM 및 10.0 μM의 IM-29는 HPC의 확장을 시토카인 대조군과 비교하여 각각 2.7배, 3.6배 및 2.4배 만큼 향상시킬 수 있었다 (도 9A). 모든 후속 실험은 5.0 μM의 작업 농도에서 IM-29를 사용하여 수행하였다.

IM-29는 HPC를 확장시키는 신규한 소분자이므로, 우리는 최적의 시토카인 조합을 확인할 목적으로 시토카인의 다양한 조합으로 배양물에 보충된 경우 이 화합물의 효과를 조사하였다 (도 1). 시토카인은 SCF, TPO 및 FLT-3L로 이루어진 가장 흔히 사용되는 칵테일을 사용하여 HSPC를 확장시키는데 중대하다. 도 1에 도시된 바와 같이, 배양물을 SCF (S), TPO (T), FLT-3L (F), IGFBP-2 (IG) 및 IM-29 (IM)로 보충한 경우 1513.9±6.4 배의 최적의 HPC 확장이 관찰되었으며, 이는 4 가지 시토카인 (S+T+F+I) 배양물보다 적어도 4.7배 더 높았다 (P < 0.05). 기초 시토카인 칵테일이 단지 세 가지 시토카인 (예컨대 S+T+F; T+F+IG; F+IG+S; 및 S+IG+T의 조합)으로 이루어진 경우, IM-29의 첨가가 HPC의 확장을 상당히 증대시킬 수 있었다 (P < 0.05). 예를 들어, S+T+F (486.8±27.2 배)와 S+T+F+IM-29 (1265.2±39.1 배)의 조합을 비교하여, 우리는 2.6배의 확장 향상 효과를 관찰하였다 (P < 0.05). 유사하게, IM-29를 S+IG+T의 기초 칵테일에 첨가하는 경우 HPC 확장의 2배 증대가 관찰된다 (P < 0.05). 흥미롭게도, IM-29는 단지 두 가지 시토카인 (예 S+T 또는 T+F)만이 배양 시스템에 첨가된 경우조차 HPC의 비교적 더 양호한 확장을 지지할 수 있었다. 그러나, IM-29가 특정 조합의 시토카인 (예를 들어 S+IM; T+IM; F+IM 또는 IG+IM)과 함께 사용된 경우 최소 확장이 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). IM-29 단독 (즉, 어떠한 시토카인도 없이)의 첨가는 HPC의 확장을 지지하지 않았는데, 이는 어떠한 성장 인자도 없는 세포를 성장시키는 것과 유사하였다 (데이터는 나타내지 않음). TNC의 관점에서, 시토카인 칵테일이 IM-29와 함께 S+T+F+IG로 이루어진 경우 최적의 확장이 관찰되었다 (도 1).

IM-29 처리된 세포는 배양되지 않은 세포와 비교하여 콜로니 형성 단위 (CFU)의 확장을 적어도 100배 만큼 향상시킬 수 있었으며, 한편 시토카인 단독을 사용한 확장은 배양되지 않은 분획과 비교하여 CFU의 약 25배 증가를 결과하였다 (도 9B).

무혈청 확장 배지 (소 혈청 알부민을 함유하는 SFEM) 또는 동물성 성분 미함유 (화학적으로 정의된 ACF) 배지 중 어느 하나에 IM-29의 첨가는 표현형 및 기능 검정에 의해 측정된 바와 같이 UCB HPC의 상당히 더 양호한 확장을 가능하게 하였다 (도 10). IM-29는 시토카인 대조군과 비교하여 HPC의 확장을 적어도 2 내지 3배 만큼 증가시켰다. CFU의 관점에서, IM-29의 첨가는 시토카인 대조군과 비교하여 과립구, 단핵구 (GM) 콜로니를 2.5 내지 5배만큼 증가시켰다. 데이터는 IM-29가 상이한 기초 배지를 사용하여 확장에 효과가 있었다는 것을 시사한다.

실시예 5

배양에서 IM-29 타이밍 및 시간이 HPC 확장에 미치는 영향

IM-29 보충된 배양물에서 UCB의 배양 기간을 7일에서 9일로 증가시키면 HPC의 확장을 적어도 5배만큼 증대되었다. 그러나, 시토카인 배양물에서 HPC의 증가는 동일한 기간에 걸쳐 단지 2.7배였다. 11일까지, IM-29는 총 유핵 세포 (TNC)를 출발 세포 수와 비교하여 약 6배 만큼 증가시켰으며, 한편 시토카인 대조군은 TNC를 많아야 3배 증가시켰다 (도 11).

0일째 및 7일째에 둘 다에 IM-29를 첨가하면, 10일에 걸쳐, 무혈청 확장 배지 (SFEM) 및 동물성-성분-미함유 (ACF) 배지 각각에서 적어도 750- 및 450배 만큼 HPC (CD45+CD34+CD38-CD45RA-)의 확장이 향상되었다 (도 12, 군 1). 기초 배양 배지와 관계없이, 군 1의 HPC 확장은 시토카인 대조군 군 3보다 적어도 12배 더 높았다. 군 2에서, IM-29가 7일째에 보충되지 않은 경우, HPC의 확장은 군 1과 비교하여 적어도 0.7배 만큼 감소하였다. 7일째에 IM-29 단독의 첨가는, 즉, 배양의 시작에서 첨가되지는 않으며 (군 4), HSPC의 확장에 무시해도 될 정도의 영향을 미쳤다. 따라서, UCB HSPC를 최적으로 확장시키려면 0일째 및 7일째 둘 다에 IM-29를 추가할 필요가 있다.

실시예 6

IM-29는 면역결핍 마우스 생착 세포 HSC1 및 HSC2의 비율을 증가시킨다

IM-29 및 시토카인의 존재하에, CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) 및 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) 둘 다의 백분율 발현은 배양되지 않은 세포와 비교하여 4 내지 5배 만큼 증가하였다 (도 13A). 절대 세포 수의 관점에서, IM-29는 면역 결핍 마우스 생착 세포 (HSC1: CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+)의 비율을 0일과 비교하여 10일에 걸쳐 적어도 1,000배 증가시켰으며, 한편, 시토카인-단독 대조군은 동일한 집단을 약 80배만큼 증가시킬 수 있었을 뿐이다 (도 13B). CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+에 의해 정의된 HSC2의 관점에서, IM-29는 10일에 걸쳐 시토카인-단독 대조군과 비교하여 적어도 7.5배 만큼 확장을 향상시킬 수 있었다 (도 13C).

실시예 7

IM-29 배양 세포는 정상적인 핵형을 유지한다

세포유전학 분석은 IM-29 배양된 세포는 배양되지 않은 세포의 핵형과 비교할 때 어떠한 차이도 나타내지 않는, 정상적인 핵형을 유지한 것으로 밝혀졌다 (도 13D) (데이터는 나타내지 않음). 혈액학적 악성 종양과 관련된 다양한 탐침을 사용한 형광 계내 하이브리드화 (FISH)는 시토카인 확장된 이식편 또는 배양되지 않은 이식편과 비교하여 IM-29 확장된 이식편 (도 13E)에 대한 정상적인 결과를 나타냈다. 세포 형태 및 백혈구 세포화학 분석은 IM-29 확장된 이식편의 백혈병성 형질전환의 어떠한 증거도 나타내지 않았다 (도 13E).

IM-29 확장된 UCB 이식편을 면역결핍 마우스 모델에 이식하는 방법을 기재하는 개략도가 도 14에 도시되어 있다. IM-29로 확장된 UCB 단핵 세포를 이식하여 수득한 생착 데이터가 도 15 및 도 16에 도시되어 있다. 치사량에 가깝게 조사된 NOD SCID 감마 (NSG) 마우스에 2.5x10⁷개 세포/kg의 등가의 투여량으로 IM-29 확장된 UCB 이식편 (n=11)의 이식은 확장되지 않은 (P=0.0030; n=11) 그리고 시토카인 확장된 이식편 (P=0.0005; n=12) 각각과 비교하여 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 3.53배 및 2.09배 더 높은 생착을 결과하였다 (도 15A). NSG 마우스에 이식하기 전에 확장된 이식편을 냉동-해동하면 IM-29 이식편이 생체내 재증식 능력을 유지한 것으로 나타냈으며 (P = 0.0730, 신선한 것과 냉동-해동된 IM-29 확장된 이식편과의 사이; 도 15A), 한편 시토카인 확장된 이식편은 3주째에 NSG 마우스의 말초 혈액 (PB)에서 인간 CD45 세포의 생착을 감소시켰다. IM-29 확장된 이식편은 NSG 마우스의 PB에서 최대 적어도 19주 동안 인간 세포 생착을 지속하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이식편은 CD3+ T 세포로 이루어진 확장되지 않은 이식편 (도 15B)과 대조적으로, 주로 골수양 세포 (CD33+/CD15+)를 포함하였다. 더욱이, IM-29 확장된 이식편은 공여자 세포의 신속한 생착을 가능하게 하였다. 조기 말초 혈액 생착에 기여하는 SCID 재증식 세포의 빈도는 조작되지 않은 이식편과 비교하여 IM-29 확장된 이식편에서 2.48배 더 높았다.

실시예 8

IM-29 확장된 이식편은 NSG 마우스에서 장기간 조혈을 부여한다.

IM-29 확장된 이식편은 이식 후 19주째에 수령자 NSG 마우스의 골수를 분석함으로써 관찰된 바와 같이 장기간의 조혈을 부여하는 능력을 보유하였다 (도 16A 내지 도 16E). 다른 사람들에 의해 보고된 바와 같이 [Notta F, et al., Blood 115(18): 3704-7 (2010); McDermott SP, et al., Blood 116(2):193-200 (2010)], 이 마우스 모델에서 이식편과 상관 없이 (즉 확장되거나 확장되지 않거나), 암컷 수령자는 그의 숫컷 대응물보다 더 높은 생착 속도를 가졌다 (도 16A). 절대 기하 평균의 차이에도 불구하고, IM-29-확장된 이식편은 수컷 및 암컷 수령자 둘 다에서 2.5 x 10⁷개 세포/kg 및 5.0 x 10⁷개 세포/kg의 이식 투여량으로 확장되지 않은 이식편의 것과 통계적으로 필적하는 수준의 인간 CD45 (도 16B) 및 공통 (CD45+CD34+), 골수양 (CD45+CD13+CD33+) 및 림프구양 (CD45+CD7+) 전구 세포 생착을 제공하였다 (도 16C). 더욱이, PB에서의 인간 CD45 세포의 조기 생착과 유사하게 (도 15A), 냉동-해동된 IM-29 확장된 이식편의 투여는 필적하는 장기간의 골수 (BM) 인간 세포 생착을 유지하였다 (P = 0.6593, 신선한 것과 냉동-해동된 IM-29 확장된 이식편 사이; 도 16B). 비록 초기 말초 혈액 생착이 골수양 계통 쪽으로 편향되었긴 하지만 성숙한 골수양 (도 16D) 및 림프구양 (도 16E) 인간 세포 둘 다를 포함하는 NSG BM의 다중-계통 재구성은 IM-29-확장된 이식편으로 달성될 수 있었다. 더욱이, IM-29 확장된 이식편은 이식된 NSG 마우스 골수 (BM)에서 어떠한 백혈병성 형질전환도 나타내지 않았다.

실시예 9

IM-29 및 시토카인 보충된 배양은 UCB MNC로부터 골수양 계통 성숙 세포를 주로 유지하고 증가시킨다

도 17A에 도시된 데이터는 생체외 확장 배양이 UCB의 단핵화 세포 (MNC)로 개시되는 경우 IM-29 및 시토카인 보충된 배양이 골수양 계통 성숙 세포 (CD45+CD33+ 단핵구, CD45+CD13+CD15+ 과립구 및 CD45+CD41a+CD61+ 거핵구로 이루어짐)를 주로 유지 및 증가시킨다. 이는 IM-29 확장된 이식편은 이식 이전에 성숙한 림프구양 세포 (CD45+CD3+ T 세포, CD45+CD19+ B 세포 및 CD45⁺CD56⁺ NK 세포로 이루어짐)가 없음을 의미한다. 도 17B에 도시된 바와 같이, 1억개 세포/kg의 보다 높은 이식 투여량에서, IM-29 확장된 이식편은 2주째까지 NSG PB에서 7.1 ± 0.6%의 인간 CD45⁺ 세포를 생성하였으며 이는 총 인간 세포 수의 절대 증가에 의해 추가로 지지된 시토카인 확장된 이식편 수령자 (P < 0.0001; n = 14)보다 적어도 5배 더 높았다. 그러나, 1억개 세포/kg의 이러한 높은 이식 세포 용량에서, 확장되지 않은 UCB는 IM-29 확장된 이식편과 비교하여 적어도 3.7배 만큼 유의하게 (P < 0.0001; n = 15) 더 높은 생착을 제공하였다 (도 17B). 도 15B에 도시된 데이터와 유사하게, 더 높은 세포 투여량 이식에서 확장되지 않은 이식편은 이식 후 2주째에 NSG PB에서 주로 CD35+ T 세포를 초래하였으며, 한편 IM-29 확장된 이식편은 최소한의 인간 T 세포 집단을 유지하였다 (도 17C). 이식 후 2주째에 NSG 마우스 골수 (BM)의 분석은, 확장되지 않은 (n = 6) 그리고 IM-29 확장된 이식편 (n = 6)이 시토카인 확장된 대조군 이식편 (n = 6)보다 유의하게 (P < 0.01) 더 높은 유사한 인간 CD45+ 세포 생착을 재현하는 것으로 나타났다 (도 17D). NSG BM에서 CD34+ 인간 전구세포의 관점에서, IM-29 확장된 이식편은 이식 후 2주째에 확장되지 않은 이식편 (n = 6)의 0.7 ± 0.1%와 비교하여 13.3 ± 0.8% (n = 6)를 유지하였다 (P < 0.001) (도 17D). PB 생착 데이터와 유사하게, 확장되지 않은 UCB로 이식된 NSG 마우스는 확장된 이식편과 비교하여 BM에서 CD3+ T 세포의 우세한 비율을 가졌다 (도 17D). 그러나, 비록 IM-29 확장된 이식편이 초기 인간 세포 생착을 전구세포 및 골수양 세포 쪽으로 편향되었긴 하지만, 장기간의 연구 (이식 후 >19주)에서 이는 NSG 마우스의 BM에서 림프구양 세포를 또한 초래하여 다중-계통 재구성을 유지한다는 점을 도 16A 내지 도 16E에 나타낸 데이터에 기초하여 주목하여야 한다. 확장되지 않은 이식편으로부터 재구성된 인간 T 세포의 증가된 양은 NSG 마우스 수령자에서 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 더 높은 발생률을 결과하였으며 이는 이식 후 60일째에 대략 25%의 더 저조한 생존율을 결과하였다 (도 17E). 확장된 이식편 (IM-29와 함께 또는 없이)을 받은 NSG 마우스의 생존은 GVHD의 최소 증상으로 인해 이식 후 60 일째에 > 70% 생존을 가졌다 (도 17D).

IM-29 확장된 이식편의 효능이 1상 임상 시험에서 연구될 경우, 임상 안전성의 척도로서 제2의 조작되지 않은 이식편을 주입할 필요가 있을 것이다. 도 17A 내지 도 17H에 도시된 데이터에 기초하여, IM-29의 존재하에 UCB MNC의 확장이 주로 CD34+ 전구세포 및 성숙 골수 세포를 초래한다는 것이 명백하다. 제2 면역 세포-함유 조작되지 않은 이식편 (UCB2, 도 17F)과 함께 공동-주입되는 경우 그의 림프구양 세포가 없는 이러한 확장된 이식편은 이식 실패를 결과할 면역 거부 반응에 직면할 가능성이 있다. 따라서, 1상 임상 시험에서 UCB1 이식편의 CD34 선택 동안에 조작되지 않은 제2 단위 (UCB2)와 함께 냉동보존된 CD34- 림프구양 세포를 주입할 필요가 있을 것이다. 이는 도 17F의 개략도에 도시된 다음 단계들에 의해 달성될 수 있을 것이다:

(i) 1 단계 - 이식을 위한 불충분한 세포 투여량을 갖는 임상용 냉동 UCB 유닛 1 (UCB1)을 수득한다. 해동, 세척 및 자성 칼럼 기반의 CD34+ 유닛 선택을 수행한다.

(ii) 2 단계 - 상기에 기재된 바와 같이 UCB1의 CD34+ 세포를 IM-29 확장 프로토콜로 배양한다.

(iii) 3 단계 - 림프구양 계통 성숙 세포를 함유하는 UCB1의 CD34- 분획을 냉동보존한다.

(iv) 4 단계 - 배지, 시토카인 및 IM-29 보충을 7일째에 사용하여 10일 내지 11일 동안 UCB1 CD34+ 세포를 확장시킨다.

(v) 5 단계 - 확장된 UCB1을 수확하고, 세척하고, 특성화한다.

(vi) 6 단계 - UCB1의 확장된 부분을 환자에게 주입한다.

(vii) 7 단계 - UCB1의 CD34- 분획을 해동시키고, 세척하고 환자에게 주입한다.

(viii) 8 단계 - 이식을 위한 충분한 세포 투여량을 갖는 임상 냉동 UCB 유닛 2 (UCB 2)를 수득한다. 해동, 세척 및 환자에의 주입을 수행한다.

비록 IM-29가 보강되지 않은 UCB MNC로부터 HSPC를 확장시킬 수 있었긴 하지만, 1상 임상 시험 확장을 지지하기 위해 정제된 CD34+ 세포로 배양을 개시한 경우 이 분자의 확장 효과를 연구할 필요가 있었다. 정제된 CD34+CD38- 세포로 개시한 배양에서 (형광 활성화 세포 분류에 따라 형광 접합 항체 표지를 사용), 시토카인 배양물과 비교하여 IM-29의 존재하에 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+에 의해 정의된 HSC1의 적어도 15.9배 더 높은 확장이 있었다 (P < 0.0001) (도 17G). 마지막으로, UCB 이식편은 임상 등급 선택 방법을 모방하기 위해 자성 칼럼을 사용하여 CD34 세포가 보강되도록 하였다. 5.0 μM IM-29 및 시토카인 칵테일 (SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2)의 존재하에 이들 CD34⁺ 세포의 배양은 11일 이내에 283.7 ± 14.7 배의 CD34+ 세포를 결과하였는데 이는 시토카인 대조군 배양물과 비교하여 대략 1.9배 더 높았다 (도 17H).

다른 공지된 방법과의 비교

15일까지 지속되는 경쟁하는 소분자 스템레게닌-1 (SR-1) [Wagner JE, et al., Cell stem cell 18(1): 144-155 (2016)]과 유사한 HSPC가 보강된 배양물은 330배의 중앙값 CD34 확장을 제공하였으며, 한편 니코틴아미드 (NAM) [Horwitz ME, et al., J Clin Invest 124(7): 3121-3128 (2014)]를 수반하는 또 다른 경쟁 기술은 CD34 세포를 21일에 걸쳐 72배 만큼 단지 증가시킬 수 있었다. 이는 IM-29가 CD34 선택된 이식편의 확장에 매우 효능이 있어, 더 짧은 기간에 상당히 더 양호한 확장을 달성함을 나타낸다. 이는 시약 비용 (SR1 및 NAM과 비교하여 더 적은 배지, 시토카인 및 소분자 보충) 및 이러한 세포 요법 생성물을 제조하는데 필요한 지속기간 둘 다를 절약할 수 있을 것이다. 표 1 및 표 2에 요약된 다음의 두 가지 광범위한 방법을 사용하여 UCBT와 연관된 낮은 세포 용량 및 느린 조혈 회복의 문제를 그의 주요 단점/들과 함께 극복하기 위해 몇몇 임상 시험이 시도되었다:

주입된 총 유핵 세포의 절대 수의 증가:

접근법/들	결점/들
(i) 이중 단위 UCBT (dUCBT) [Sideri A, et al. Haematologica 96(8): 1213-1220 (2011)]; 및 (ii) 일배수-동종 CD34 세포와 조합된 단일 단위 UCBT (UCB+Haplo CD34) [Liu H, et al., Blood 118(24): 6438-6445 (2011)].	(i) 복잡한 쓰리-웨이 HLA 매칭(Complex three-way HLA matching); (ii) 이식 관련 사망률 (TRM)의 가능성을 증가시키는 GVHD의 더 높은 발병률.
조작되지 않은 유닛으로 공동-이식된 UCB의 단일 유닛의 생체외 확장. 현재까지, 임상적 확장은 (i) 다양한 시토카인 칵테일 [Shpall EJ, et al., Biol Blood Marrow Transplant 8(7): 368-376 (2002)]; (ii) 생물 반응기 [Jaroscak J, et al. Blood 101(12): 5061-5067 (2003)]; (iii) 중간엽 간질 세포 (MSC)와의 공동-배양 [de Lima M, et al., N Engl J Med 367(24): 2305-2315 (2012)]; 및 (iv) 생체분자 예컨대 노치의 외인성 첨가 [Delaney C, et al., Nat Med 16(2): 232-236 (2010)]; 및 (v) 니코틴아미드 (NAM - SIRT1 억제제)를 포함하는 화학물질/소분자 [Horwitz ME, et al., J Clin Invest 124(7): 3121-3128 (2014)]; 스템레게닌 1 (SR1 - 아릴 탄화수소 수용체의 길항제) [Wagner JE, et al., Cell stem cell 18(1): 144-155 (2016)]; 및 테트라에틸렌펜타민 (TEPA - 구리 킬레이트제) [de Lima M, et al., Bone Marrow Transplant 41(9): 771-778 (2008)]을 사용하여 행하여져 왔다.	(i) 선행 줄기 세포 선택은 MSC 공동-배양을 제외한 모든 프로토콜에서 성공적인 확장을 위한 전제 조건이었다. (ii) 모든 프로토콜은 약 3 내지 7개의 성장 인자를 필요로 하였다. (iii) 확장된 세포는 조기 생착을 제공하였으며; 장기간 조혈의 추구는 NAM 및 SR1을 제외한 모든 프로토콜에서 조작되지 않은 유닛에 의해서만 수여되었으며; 후자는 주입 동안에 확장된 유닛의 조작되지 않은 T-세포 분획을 "다시 첨가함"으로써 성공을 달성하였다.

주입된/이식된 세포의 귀소의 개선:

접근법	결점/들
(i) 또 다른 조작되지 않은 유닛의 정맥내(i.v.) 주입과 함께 또는 없이 단일 UCB 유닛의 골수내 주입 (i.b. 주입)[H gglund H, et al., Bone Marrow Transplant 21(4): 331-335 (1998)]; 및 (ii) MSC와 함께 단일 UCB (UCB+MSC)의 정맥내 공동-투여 [Macmillan ML, et al., Bone Marrow Transplant 43(6): 447-54 (2009)].	(i) 생착, 혈구 수치 회복 및 사망률과 관련하여 어떠한 임상적 이익도 결과하지 않은 복잡하고 침습적인 이식 프로토콜.
다양한 화학물질 및 생체-분자 예컨대 (i) 디메틸-프로스타글란딘 E2 (dmPGE2) [Cutler C, et al., Blood 122(17): 3074-3081 (2013)]; (ii) 보체 단편 3a (C3a) [Brunstein CG, et al., Biol Blood Marrow Transplant 19(10): 1474-1479 (2013)]; 및 (iii) 이중 단위 UCBT의 설정에서의 푸코실화 [Popat U, et al., Blood 125(19): 2885-2892 (2015)]로 UCB 유닛의 프라이밍.	(i) dm-PGE2 연구의 C3a, 푸코실화 및 코호트 1에서, 대다수의 환자는 더 큰 세포 투여된 조작되지 않은 유닛으로부터 장기간의 조혈을 달성하여, 더 작은 세포 투여된 유닛의 조작의 한계 이익을 나타냈다. (ii) dm-PGE2 연구의 코호트 2에서, 더 높은 TNC-함유 UCB 유닛이 조작되었으며, 한편 더 작은 이식편은 어떠한 조작없이도 주입되었다. 장기간의 조혈은 조작된 이식편에 의해 기인하였으며, 이는 더 높은 세포 용량을 가진 이식편이 통상 dUCBT에서의 생착을 지배하기 때문에 예상된다. 이러한 결과는 dm-PGE2 프라이밍의 효능에 대한 우려를 제기한다.

상기 표 1 및 표 2에 기재된 대부분의 UCB 조작 시도는 단지 하나의 UCB 이식편을 사용한 지속적인 조혈과 함께 제한된 세포 투여량, 빠른 호중구 및 혈소판 회복 (이식 후 <14일)의 문제를 동시에 해결하지 못하였다. 지금까지, 생체외 확장이 가장 유망한 기술임이 입증되었으나, 대부분의 경우 (>60%) 이는 중등도의 조기 생착만을 결과하였으며, 한편 일생 동안의 조혈은 공동-주입된 조작되지 않은 유닛에 의해 기인하였다. 또한, 상기의 모든 확장 프로토콜은 CD34 또는 CD133에 대한 세포 표면 마커를 사용하여 줄기 세포의 사전 보강을 필요로 한다. 사용된 컨디셔닝 요법과 함께, 앞서 언급한 현재 접근법의 경우, 이식 성공의 조기 척도인, 호중구 회복까지의 시간 (연속 3일 동안 혈액 1 μl당 > 500개 세포의 절대 호중구 수에 의해 정의됨)이 도 17에, 통상적인 HSCT 이식과의 동시 비교와 함께 요약되어 있다. 그러나, 우리는 아졸계 소분자를 사용한 확장은 개별 이식편이 확장되지 않은 대응물이 갖지 않을 충분한 세포 용량을 가질 수 있게 함을 밝혀냈다.

요약

신선한 인간 제대혈 (UCB)은 본 연구에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 공급원이었다.

UCB 단핵화 세포 (UCB-MNC)는 밀도 의존성 원심분리를 수행함으로써 신선한 샘플로부터 수득하였다 (도 3). 확장을 위해, 이들 MNC는 자성 선택을 사용하여 CD34 발현을 위해 보강될 필요가 없다. 그러나, CD34+ 세포가 보강된 샘플은 또한 본 발명에 따른 아졸계 소분자를 사용하는 확장에 적합하다.

임상 환경에서, 단지 냉동된 샘플만이 확장 또는 이식 중 어느 하나에 이용 가능하기 때문에, UCB-MNC는 추가 실험을 위해 냉동한 후에 해동해 냈다 (도 3).

UCB MNC 분획은 CD45를 발현하지 않는 적혈구 (RBC), 및 CD45를 발현하는 백혈구 (WBC)를 포함한다. HSPC는 유핵 WBC의 서브세트이며 CD45와 함께 항원 CD34를 발현한다 (도 4).

HSPC는 상이한 항원의 발현에 의해 상이한 서브세트으로 분류된다 (도 4):

a. 조혈 전구 세포 (HPC) → CD45+CD34+CD38-CD45RA- (최고 빈도이나 최소 자기-재개 능력)

b. 조혈 줄기 세포 1 (HSC1) → CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (중등도의 빈도 및 자기-재개 능력)

c. 조혈 줄기 세포 2 (HSC2) → CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (최저 빈도이나 최고 자기-재개 능력)

IM-29는 HSPC를 확장시키기 위한 가장 효과적인 화합물이었다. IM-29의 구조는 도 6(A)에 도시되어 있다.

IM-04는 HSPC를 확장시키기 위한 두 번째로 가장 효과적인 화합물이었다. IM-04의 구조는 도 6(B)에 도시되어 있다.

IM-29 및 다른 구조 유사체의 작업 농도는 5.0 μM이다.

IM-29로 확장 배양을 개시하기에 바람직한 세포 집단은 UCB 단핵화 세포이며, 즉 세포 표면 마커 예컨대 CD34 및 CD133을 사용하는 어떠한 선행 줄기 세포 선택도 충분한 확장을 달성하기 위해 요구되지 않는다.

우리는 무혈청 확장 배지 (스템스판™-SFEM) 및 동물성-성분-미함유 (스템스판™-ACF) 배지가 IM-29의 존재하에 UCB MNC를 확장시키는데 사용될 수 있음을 밝혀냈다 (도 10). 다른 줄기 세포 확장 배지가 또한 적합할 수 있다.

시토카인 칵테일은 모든 확장 배양물 (IM-29와 함께 또는 없이)에 첨가되었고 100 ng/ml의 줄기 세포 인자 (SCF) 및 트롬보포이에틴 (TPO); 50 ng/ml의 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L); 및 20 ng/ml의 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2) (도 1 및 도 2)를 포함하였다.

IM-29의 존재하에 UCB 이식편을 확장시키기 위한 실시예에서 사용된 물리적 조건은 5% CO₂로 37℃의 온도를 포함한다 (도 2). 그러나, 조혈 줄기 및 전구 세포는 저산소 인큐베이터에서 배양되어 골수 미세환경의 자연 줄기 세포 니치(nich)를 더 잘 모방할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 본 발명은 또한 저산소 배양 조건에서 작용할 가능성이 있다.

IM-29 및 모든 구조 유사체는 3일째까지 UCB 세포에 대해 최소한의 독성을 가졌다 (도 7).

IM-29를 사용하는 UCB MNC의 확장 배양은 약 7일 내지 11일 동안 지속된다. 최적의 확장 배양 지속기간은 표현형 검정에 의해 측정된 바와 같이 10일인 것으로 밝혀졌다 (도 11).

IM-29는 바람직하게는 배양 개시 시점에서 그리고 또한 최적의 확장을 위해 배지 및 시토카인이 보충되는 7일째에 첨가된다 (도 12).

CD90 (HSC1) 및 CD49f (HSC2)를 발현하는 HSPC는 배양이 UCB MNC로 개시될 때 확장된다 (도 13). 확장된 세포는 세포 유전학적 이상 또는 백혈병성 형질전환을 나타내지 않는다 (도 13).

IM-29 확장된 이식편 (신선하거나 냉동-해동된 것)은 일찍이 2 내지 3주 (CD34 전구세포 및 골수양 세포의 1차 생착)에 NSG 마우스 혈액을 재증식할 수 있었으며, 생착은 골수 (줄기 및 전구 세포, 골수양 및 림프구양 세포를 손상시키는 인간 새포의 다중-계통 재구성)에서 적어도 19 내지 20주까지 지속되었다 (도 15 내지 도 17).

UCB의 IM-29 매개 확장은 성인에서 알레르기 이식을 위한 이식편으로서 사용되는 UCB와 연관된 하기 문제점을 극복한다:

1. 이것은 총 유핵 세포를 적어도 5배 만큼 증가시키기 때문에 이식편의 낮은 세포 용량을 극복한다.

2. 조혈 줄기 및 전구 세포를 확장시킨다. 구체적으로 이는 조혈 전구 세포 (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-)를 적어도 1,000배 만큼 확장시킨다. 단지 소분자를 사용하기 전에 이러한 규모의 확장은 보고되지 않았다. 다른 모든 확립된 프로토콜에서, 배양이 선택된/정제된 CD34/CD133 세포로 개시된 경우에만 이러한 확장 규모가 달성되었다. 또한, 우리가 아는 한, 이것은 (a) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1); 및 (b) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2)의 표현형 발현에 의해 정의되는 드문 HSPC 세포의 확장을 보고하는 첫 번째 확장 프로토콜이다.

3. 확장된 UCB 이식편은 시험관내 및 생체내 기능 검정을 사용하여 결정된 바와 같이 줄기 및 전구 세포의 기능을 유지한다. 구체적으로, IM-29 확장된 이식편을 치사량에 가깝게 조사된 면역 결핍 마우스에의 이식은 3주까지 말초 혈액에서 키메라 반응에 의해 나타낸 바와 같이 인간 세포의 더 신속한 생착을 결과한다. 지금까지, 확장된 이식편으로부터 신속한 혈구 수치 회복 (<3주)을 수득하는 것이 이종이식 연구 및 인간 임상 시험 둘 다에서 하나의 도전 과제였다. 마지막으로, 이식편은 이식 후 19 내지 20주에 수령자 면역결핍 마우스의 골수에서 검출될 수 있기 때문에 장기간의 다중-계통 조혈을 지속할 수 있는 능력을 나타냈다.

IM-29 매개 확장 프로토콜에서, UCB의 단지 한 유닛만이 현재 접근법과 비교하여 하기 이점을 갖는 충분한 수의 줄기 및 전구 세포 (>2천5백만개 세포/kg)를 초래하여야 한다:

1. HSPC의 임상적으로 관련된 확장을 수득하기 위해 선행 줄기 세포 선택을 수행할 필요가 없으며; 또한 배양 배지에서의 소 태아 혈청의 보충도 필요하지 않다. 임상적 관점에서 볼 때, 세포의 사전 선택을 우회하는 것은 이점인데, 그 이유는 그것이 매우 원시적인 줄기/전구 세포, 특별히 선택 방법에 의해 요구되는 표면 마커를 발현하지 않는 것들의 손실을 결과할 수 있는 추가적인 조작 단계가 필요 없도록 하기 때문이다.

2. 대부분의 확장 기술은 복잡한 시토카인 칵테일을 필요로 하는데, 그 중 일부는 늦게 작용하는 시토카인으로서 자기-재개를 희생하여 분화를 급속히 촉진한다. 그러나, 제안된 접근법은 확장을 달성하기 위해 소분자와 함께 4개의 성장 인자의 간단한 칵테일을 사용하여, 절차를 단순화한다.

3. UCB의 단지 단일 유닛만이 IM-29 확장된 이식편을 수득하기 위해 필요하며, 이는 현재의 임상 실습과 비교하여 HLA 매칭의 복잡성을 감소시키며 여기서 2개의 조작되지 않은 유닛이 이식편-대-숙주 질환의 더 높은 발병률에도 불구하고, 동시에 이식되어 충분한 세포 용량을 달성한다.

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Claims

제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포 샘플의 총 유핵 세포 및/또는 CD45+CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분(progenitor cell component)의 서브세트의 생체외 확장 방법으로서,
(i) 상기 샘플의 단핵화 세포 분획 및/또는 CD45+CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분을 배지에서 배양하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)의 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체외 확장 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 화학식 (I), 그의 염 및 용매화물에 의해 나타내지는 것인 방법.

상기 식에서,
X는 NR₄, O 또는 S를 나타내고;
R₁은 C_6-10 아릴 또는 6- 내지 10-원 헤테로방향족 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내고;
R₂는 C_6-10 아릴 또는 6- 내지 10-원 헤테로시클릭 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내고;
R₃은 치환되지 않거나 할로, OR₅, C_1-6 알킬, C_1-6 알케닐 또는 C_1-6 알키닐로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 3개 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된 C_6-16아릴을 나타내고;
R₄ 및 R₅는 H 또는 C_1-4 알킬 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로부터 독립적으로 선택된다.
제2항에 있어서, 화학식 I에서, X가 NR₄ 또는 O를 나타내는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 화학식 I에서, R₁이 페닐 또는 6-원 헤테로방향족 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로, C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (여기서 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내는 것인 방법.
제4항에 있어서, 화학식 I에서, R₁이 페닐 또는 피리디닐 (이는 치환되지 않거나 Cl, Br, F 및 메틸로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)을 나타내는 것인 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서, R₂가 페닐 또는 6-원 헤테로시클릭 고리계 (이는 치환되지 않거나 할로 또는 C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)를 나타내는 것인 방법.
제6항에 있어서, 화학식 I에서, R₂가 페닐, 피리딜 또는 디히드로피라닐 (이는 치환되지 않거나 Br, Cl, F 또는 메틸로부터 선택된 1개 이상의 치환기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)을 나타내는 것인 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서, R₃이 치환되지 않거나 할로, OR₅ 및 C_1-3 알킬로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 할로로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된 C_10-16아릴을 나타내는 것인 방법.
제8항에 있어서, 화학식 I에서, R₃이 나프틸, 페난트라세닐 또는 피레닐 (이는 치환되지 않거나 Br, Cl, F, OR₅ 및 메틸로부터 선택된 1개 이상의 기 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로 치환된다)을 나타내는 것인 방법.
제9항에 있어서, 화학식 I에서, R₃이 나프틸을 나타내며, 이 기는 치환되지 않거나 Cl, F, 및 OR₅로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환되는 것인 방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서, R₄ 및 R₅가 H 또는 메틸 (상기 후자의 기는 치환되지 않거나 F로부터 선택된 1개 이상의 기로 치환된다)로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 II의 화합물, 또는 그의 염 및 용매화물로서 나타내지는 것인 방법.

상기 식에서,
R₆은 H, Cl, Br 및 F를 나타내고;
R₇은 H, Cl, Br, F, OR₈을 나타내고;
R₈은 치환되지 않거나 Cl 및 F로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된 C_1-3알킬을 나타내고;
R₁ 및 R₂는 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 III의 화합물, 또는 그의 염 및 용매화물로서 나타내지는 것인 방법.

상기 식에서,
R₉는 H, Cl, Br, F 또는 C_1-3 알킬 (이는 치환되지 않거나 Cl 및 F로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된다)을 나타내고;
R₁₀은 H, Cl, Br, 또는 F를 나타내고;
R₂는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고;
R₆ 및 R₇은 제12항에 정의된 바와 같다.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 다음의 목록으로부터 선택되는 것인 방법:
(i) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(ii) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5-일]피리딘;
(iii) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(iv) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(v) 4-[2-(1-브로모나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(vi) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-이미다졸-5-일]피리딘;
(vii) 2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(피리딘-4-일)-5-(m-톨릴)옥사졸;
(viii) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸;
(ix) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(6-메톡시나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸; 및
(x) 5(4)-(3,6-디히드로-2H-피란-4-일)-2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸;
(xi) 4-(4(5)-(4-플루오로페닐)-2-(7-메톡시나프탈렌-2-일)-1H-이미다졸-5(4)-일)피리딘;
(xii) 4-[4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘; 및
(xiii) 4-[4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘.
제14항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 다음의 목록으로부터 선택되는 것인 방법:
(i) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(ii) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5-일]피리딘;
(iii) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(m-톨릴)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(iv) 4-[2-(나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(v) 4-[2-(1-브로모나프탈렌-2-일)-4(5)-(4-플루오로페닐)-1H-이미다졸-5(4)-일]피리딘;
(vi) 4-[2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-이미다졸-5-일]피리딘; 및
(vii) 2-(1-플루오로나프탈렌-2-일)-4-(피리딘-4-일)-5-(m-톨릴)옥사졸.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 6 (IL-6), 과립구-콜로니 자극 인자 (GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2)를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시토카인의 존재하에 확장되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포가 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2의 존재하에 확장되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 단핵 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자와 적어도 9일의 기간 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액 단핵 세포(들)를 적어도 하나의 아졸계 소분자와 약 11일의 기간 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시토카인을 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자를 배양물에 0일째에 및/또는 7일째에 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10일 내지 11일 배양 후에 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
a) CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포가 확장되고/거나;
b) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포가 확장되고/거나;
c) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포가 확장되는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 확장된 세포를 사용한 추후 공동-이식을 위해 CD34- 세포 분획 (림프구양 세포를 포함)을 별도로 보유하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 아졸계 소분자; 및 적어도 하나의 시토카인을 포함하는 조합물 및/또는 키트.
제25항에 있어서, 적어도 하나의 시토카인이 제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용하기 위해 SCF, TPO, FLT-3L 및 IGFBP-2를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 조합물 및/또는 키트.
제25항 또는 제26항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포를 확장시키는 것인 조합물 및/또는 키트.
제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 아졸계 소분자를 포함하는 조성물.
조혈 줄기 세포 이식을 필요로 하는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제15항 및 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 세포의 용도.
제29항에 있어서, 의약이 생체외 확장된 세포 및 보유된 CD34- 림프구양 세포를 포함하는 것인 용도.
제대혈, 골수 및/또는 동원된 말초 혈액의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 성분의 생체외 확장에 있어서의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 아졸계 소분자의 용도.
제31항에 있어서, 적어도 하나의 아졸계 소분자가 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 조혈 줄기 세포 및/또는 CD45+CD34+CD38-CD45RA- 조혈 전구 세포를 확장시키는 것인 용도.
치료 방법으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제15항 및 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된, 유효량의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를, 임의로 보유된 CD34- 림프구양 세포와 함께, 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.