CN110904038B

CN110904038B - 一种间充质干细胞及其应用

Info

Publication number: CN110904038B
Application number: CN201911284904.0A
Authority: CN
Inventors: 赵萌; 娄琪; 牟丽莎; 陆赢; 蒲祖辉
Original assignee: Shenzhen Lansi Artificial Intelligence Medical Research Institute; Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Lansi Artificial Intelligence Medical Research Institute; Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110904038A

Abstract

本申请公开了一种间充质干细胞及其应用。本申请的间充质干细胞是经过抑制Sirt1基因表达处理或Sirt1基因敲除的间充质干细胞。本申请的间充质干细胞，能够促进造血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能、提高移植后造血干细胞重建能力，从而获得功能更好的造血干细胞，为临床解决造血干细胞短缺难题提供了一种新的解决方案，对于解决造血干细胞的临床问具有重要意义。

Description

一种间充质干细胞及其应用

技术领域

本申请涉及间充质干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞及其应用。

背景技术

间充质干细胞(缩写MSC)最早从骨髓分离出来，体外培养时可以形成纺锤形并具有克隆形成能力的单核细胞。间充质干细胞是一类异质性很高的基质干细胞类群。多种成体组织和器官都含有间充质干细胞。目前采用了一套公认的表面标记分子来定义间充质干细胞，人源的间充质干细胞不表达造血细胞相关的分子如CD45、CD34、CD14及共刺激分子CD80、CD86等，主要表达CD44、CD90、CD73和CD71等表面分子。而鼠源的间充质干细胞不表达造血相关的分子如CD45、Ter119及内皮细胞相关分子CD31等，主要表达PDGFRα、SCA-1及CD44等表面分子。虽然已经用了大量的表面分子来定义间充质干细胞，但是这些表面分子定义的间充质干细胞仍然是一群异质性很高的细胞类群，并不是单一的细胞类群。

目前关于间充质干细胞的生物学功能研究主要集中在三个方面。首先，间充质干细胞具有多向的分化潜能，体外培养时可以分化为成骨细胞，脂肪细胞以及软骨细胞。利用谱系追踪的实验方法同样证明了间充质干细胞在体内可以分化成为成骨细胞，脂肪细胞以及软骨细胞。其次，间充质干细胞不仅在体外培养时可以作为造血干细胞(缩写HSC)的支持细胞，而且大量基于遗传学动物模型的研究表明间充质干细胞在体内同样是造血干细胞微环境中的重要组成部分，通过分泌SCF和CXCL12等相关因子，对造血干细胞静息状态及功能的维持具有重要的调节作用。最后，除了以上两方面的功能，间充质干细胞还被报道具有显著的免疫调节功能。在多种急性炎症模型或者自身免疫疾病模型中，体内输注的间充质干细胞可以迁移至炎症区域，通过分泌多种免疫调节因子发挥相应的免疫调节功能，并且促进损伤细胞的存活。

造血干细胞移植是治疗多种血液系统恶性疾病的重要手段，但是由于免疫排斥以及供体的匮乏获得能用于移植的造血干细胞难度很大。因此提高患者造血干细胞自身的功能或者体外能够扩增足够数量的造血干细胞是治疗临床血液相关疾病的重要手段。间充质干细胞是造血干细胞体外扩增的支持细胞及体内微环境的重要组成部分，关于这方面的研究已经十分充分，但是如何提高间充质干细胞的支撑功能，更好的促进造血干细胞的体外扩增，获得功能更好的造血干细胞对于解决临床问题显得尤为重要。

发明内容

本申请的目的提供一种改进的间充质干细胞及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种经过抑制Sirt1基因表达处理或Sirt1基因敲除的间充质干细胞。

需要说明的是，本申请研究证实，本申请的经过抑制Sirt1基因表达处理或Sirt1基因敲除的间充质干细胞能够促进造血干细胞的体外扩增，增强造血干细胞的功能；并且，本申请的间充质干细胞在特异性的敲除Sirt1后不仅使造血干细胞数量增加，而且细胞周期更为静息，移植后造血干细胞重建能力更好；为临床解决造血干细胞短缺这一难题提供了一种新的解决方案。

还需要说明的是，本申请的关键在于创造性的发现抑制间充质干细胞中的Sirt1基因表达，能够提高间充质干细胞对造血干细胞的支撑功能，更好的促进造血干细胞的体外扩增，获得功能更好的造血干细胞；至于具体如何抑制Sirt1基因表达，可以参考现有的抑制基因表达的方案；同样的Sirt1基因敲除，也可以参考现有的基因敲除方案。

优选的，本申请的抑制Sirt1基因表达处理包括采用化学方法或基因工程方法抑制Sirt1基因的表达或使Sirt1基因沉默。

优选的，化学方法包括采用特异性的Sirt1抑制剂抑制Sirt1基因的表达。

优选的，特异性的Sirt1抑制剂为Sirt1 inhibitor Ⅳ。

需要说明的是，Sirt1 inhibitor Ⅳ只是本申请的一种实现方式中具体采用的特异性的Sirt1抑制剂；可以理解，只要能够特异性的抑制Sirt1基因表达即可用于本申请。

优选的，基因工程方法包括基因沉默技术或RNA干扰技术。

需要说明的是，本申请的关键在于抑制Sirt1基因表达或者使其不表达，具体的实现方案可以参考现有的抑制基因表达或使基因不表达的方法。

本申请的另一面公开了本申请的间充质干细胞在制备促进造血干细胞体外扩增或增强造血干细胞功能的试剂中的应用。

本申请的再一面公开了本申请的间充质干细胞在制备促进移植后造血干细胞重建的药物中的应用。

需要说明的是，本申请的间充质干细胞能够促进造血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能、提高移植后造血干细胞重建能力；因此，可以用于制备促进造血干细胞体外扩增或增强造血干细胞功能的试剂，或者制备促进移植后造血干细胞重建的药物。

本申请的再一面公开了一种用于制备具有调控造血干细胞功能或促进造血干细胞体外扩增的间充质干细胞的试剂，该试剂能够抑制间充质干细胞中的Sirt1基因表达，或者将间充质干细胞中的Sirt1基因敲除。

需要说明的是，本申请的试剂主要是指根据本申请的发明思路结合常规方法设计的抑制Sirt1基因表达或Sirt1基因敲除的核酸片段，例如干扰RNA等。

本申请的再一面公开了特异性的Sirt1抑制剂在制备具有调控造血干细胞功能或促进造血干细胞体外扩增的间充质干细胞中的应用。

本申请的再一面公开了特异性的Sirt1抑制剂在制备促进间充质干细胞表达造血干细胞支持因子的试剂中的应用，造血干细胞支持因子包括SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1中的至少一种。

其中，特异性的Sirt1抑制剂包括但不仅限于Sirt1 inhibitor Ⅳ。

可以理解，本申请的间充质干细胞在特异性的敲除Sirt1后能够促进造血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能、提高移植后造血干细胞重建能力；因此，特异性的Sirt1抑制剂可以用于制备具有调控造血干细胞功能或促进造血干细胞体外扩增的间充质干细胞。本申请研究显示，敲除Sirt1的间充质干细胞之所以能够具有更好的造血干细胞的支撑功能，主要是敲除Sirt1显著的促进了间充质干细胞表达造血干细胞支持因子，例如SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1等；因此，特异性的Sirt1抑制剂能够用于制备促进间充质干细胞表达造血干细胞支持因子的试剂。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的间充质干细胞，能够促进造血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能、提高移植后造血干细胞重建能力，从而获得功能更好的造血干细胞，为临床解决造血干细胞短缺难题提供了一种新的解决方案，对于解决造血干细胞的临床问具有重要意义。

附图说明

图1为本申请实施例中SCF的mRNA相对表达量检测结果；

图2为本申请实施例中CXCL12的mRNA相对表达量检测结果；

图3为本申请实施例中Angpt1的mRNA相对表达量检测结果；

图4为本申请实施例中Vcam1的mRNA相对表达量检测结果；

图5为本申请实施例中Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理间充质干细胞诱导SCF蛋白表达的检测结果；

图6为本申请实施例中间充质干细胞与造血干细胞共培养的造血干细胞数量统计结果；

图7为本申请实施例中共培养后的LT-HSC细胞数量、ST-HSC细胞数量和MPP细胞数量统计结果；

图8为本申请实施例中共培养后的CD150 HSC数量统计结果；

图9为本申请实施例中采用共培养的造血干细胞进行嵌合率时流式的统计结果；

图10为本申请实施例中采用共培养的造血干细胞进行嵌合率时B22 0+细胞的统计结果；

图11为本申请实施例中采用共培养的造血干细胞进行嵌合率时C D3 e+细胞的统计结果；

图12为本申请实施例中采用共培养的造血干细胞进行嵌合率时M ye lo id细胞的统计结果。

具体实施方式

Sirt1是去乙酰化酶Sirt家族中的重要一员，也是Sirt家族中研究最多功能最为重要的一员。SIRT1最早被发现可以去乙酰化组蛋白，随着后续的研究深入，Sirt1还是其它转录因子或者其他蛋白分子的去乙酰化酶。如Sirt1可以去乙酰化FOXO蛋白家族成员，通过调节FOXO家族成员的活性调控脂类代谢以及葡萄糖代谢途径。Sirt1通过调控组蛋白，转录因子以及一些重要蛋白成员的乙酰化水平，在调控下游基因表达，答谢途径调控以及细胞生命周期的调控中发挥了重要作用。已经有文献报道Sirt1可以调控造血干细胞的静息状态及造血功能。

本申请研究发现，Sirt1在造血干细胞微环境中也发挥了重要的作用，间充质干细胞特异性敲除Sirt1后会使造血干细胞数量增加、细胞周期更为静息，并且移植后造血干细胞重建能力更好。体外培养扩增HSC时，间充质干细胞是其重要的支持细胞，抑制Sirt1的活性能显著的增强间充质干细胞对HSC的支持作用，为临床解决造血干细胞短缺这一难题提供了新的解决方案。

本申请的一种实现方式中，具体采用Sirt1 inhibitor Ⅳ抑制Sirt1表达，可以显著的促进间充质干细胞表达造血干细胞支持因子，如SCF、CXCL12、Angpt1及Vcam1等。抑制Sirt1表达的MSC与HSC共培养，可使HSC的数目显著增加，移植后的嵌合率更好。说明，抑制Sirt1表达的MSC可以显著促进造血干细胞的体外扩增，并增强造血干细胞的功能。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材。

实施例

一、试验方法

本例采用特异性的Sirt1抑制剂Sirt1 inhibitorⅣ对间充质干细胞进行处理，抑制Sirt1表达，从而获得本例的具有调控造血干细胞功能和促进造血干细胞体外扩增的间充质干细胞。本例涉及的各步骤试验方法具体如下：

1.造血干细胞支持因子表达水平的检测

本例的体外培养的原代间充质干细胞为采用胶原酶消化的方法分离获得的C57小鼠骨髓原代的间充质干细胞，按照2×10⁵/孔的细胞量接种于12孔板中，本例分别设计了三个组，继续培养待细胞聚合度达到70％-80％左右时，分别向各组的培养液中加入等体积的PBS、1μM的Sirt1 inhibitorⅣ或10μM的Sirt1 inhibitor Ⅳ，再培养24小时；然后，采用Trizol及氯仿抽提细胞总RNA并利用实时荧光定量PCR检测造血干细胞支持因子SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1等基因的表达水平。

其中，本例采用的培养基为含有20％胎牛血清的低糖的DMEM培养基，培养条件为37℃恒温培养箱培养。本例的RNA提取采用TAKARA公司的RNA提取试剂盒，具体的提取方法参考试剂盒使用说明书，在此不累述。实时荧光定量PCR检测也采用TAKARA公司的造血干细胞支持因子检测试剂盒，具体反应体系、反应条件参考试剂盒使用说明书，在此不累述。

2.实时荧光定量PCR

本例分别针对造血干细胞支持因子SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1，设计并合成了特异性检测引物，引物序列如表1所示。

表1造血干细胞支持因子特异性检测引物

表1中，“F”表示上游引物，“R”表示下游引物，“SCF F”和“SCF R”分别表示SCF基因的上游引物和下游引物，其余类似。

抽提细胞RNA：用500μL的Trizol充分裂解细胞后，加入100μL氯仿剧烈震荡，充分分层后，于冷离心机中最大转速离心15分钟，取上清，向上清中并加入等量的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，然后最大转速离心10分钟，弃上清，用DEPC水稀释的70％乙醇洗涤，充分晾干，用DEPC水溶解RNA。

逆转录：用TAKARA(RR036A)逆转录试剂盒进行反转录，反转录250ng RNA，并用双蒸水稀释至100μL进行后续定量PCR。

荧光定量PCR：采用翊圣2×SYBR及BioRad CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行定量PCR实验。PCR反应体系：4.8μL逆转录模板、0.2μL上下游引物混合物、5μL 2×SYBRmix；其中，上下游引物混合物中上游引物和下游引物的浓度均为10mmol/L。

PCR反应程序：95℃预变性1min，然后进入40个循环：95℃ 5s、60℃ 30s，并于60℃收集荧光，循环结束后，95℃ 15s、60℃ 15s、95℃ 15s。

3.流式检测干细胞因子重组蛋白(缩写SCF蛋白)水平的变化

由于SCF-GFP转基因小鼠中SCF的表达与GFP的表达水平一致，通过检测GFP的表达水平的改变就可以反应SCF的实际表达情况，因此，本例采用体外培养SCF-GFP转基因小鼠的间充质干细胞进行试验。具体的，按照4×10⁵/孔的细胞量接种于6孔板中，本例分别设计了两个组，继续培养待细胞聚合度达到70％-80％左右时，两组的培养液中分别加入等体积的PBS或10μM的Sirt1 inhibitor Ⅳ，再培养48小时后，将细胞用0.25％EDTA的胰酶消化下来后进行流式检测，检测GFP+细胞比例的变化。

4.间充质干细胞与造血干细胞的共培养

体外培养的原代间充质干细胞，按照4×10⁵/孔的细胞量接种于6孔板中，继续培养待细胞聚合度达到70％-80％左右时，将小鼠全骨髓细胞按照1×10⁷/孔的数量接种于含有间充质干细胞的6孔板中培养过夜，第二天进行流式检测以及竞争性移植实验。本例分别对比试验了1μM和10μM的Sirt1 inhibitor Ⅳ处理24小时的间充质干细胞和未进行Sirt1inhibitor Ⅳ处理的间充质干细胞与小鼠全骨髓细胞共培养的效果。

5.造血干细胞竞争性移植实验

收集与间充质干细胞共培养过夜的全骨髓细胞，600g离心5分钟，弃上清并对细胞进行计数，取200000细胞与来自CD45.1基因型的C57BL/6小鼠全骨髓200000细胞混匀后尾静脉注射至致死剂量辐照的CD45.1的受体小鼠中，并于移植之后的4周、8周、12周、16周分别采集受体小鼠外周血进行移植嵌合率的检测。具体的，本例分别在不同时间节点上从小鼠尾巴采血，每次采血大约20μL，1mL红细胞37℃恒温培养箱中裂解1分钟，10倍体积的PBS缓冲液终止，采用CD45.1-Percep-cy5.5、CD45.2-BV421、CD3e-Apc、B220-PE、CD11b-Apc-cy7和Gr-1-Pecy7流式抗体冰上染色1小时后流式检测。

二、结果

1.Sirt1 inhibitor Ⅳ刺激间充质干细胞诱导造血干细胞支持因子的表达

本例分别以1μM和10μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理间充质干细胞24小时，然后通过定量PCR的方法检测造血干细胞支持因子SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1等细胞因子的mRNA表达水平的变化，试验结果如图1至图4所示。图1为SCF的mRNA相对表达量分析结果，图2为CXCL12的mRNA相对表达量分析结果，图3为Angpt1的mRNA相对表达量分析结果，图4为Vcam1的mRNA相对表达量分析结果；图1至图4中，各图由左至右的三个柱依序表示PBS处理的对照试验(即“Mock”)，1μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理试验组(即“1μM”)和10μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理试验组(即“10μM”)。图1至图4的结果显示，10μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理24小时后，可以显著的诱导SCF、CXCL12、Angpt1和Vcam1的表达，而1μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的诱导效果较弱，说明Sirt1 Inhibitors Ⅳ抑制剂发挥诱导这些HSC niche因子的表达需要较高浓度，才能获得较好的诱导效果。

2.Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理间充质干细胞诱导SCF蛋白表达

本例采用10μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理SCF-GFP转基因小鼠的间充质干细胞后，通过流式检测GFP+的细胞比例变化，并设置相同的未进行Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的间充质干细胞作为对照，结果如图5所示。图5中，“Mock”图为未处理对照试验的检测结果，“Sirt1 Inhibitors Ⅳ”图为10μM浓度的Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的试验组。图5的结果显示，Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理后，GFP+的细胞比例显著升高。

3.间充质干细胞与造血干细胞共培养后的结果

本例将Sirt1 Inhibitors Ⅳ预处理间充质干细胞24小时后，取野生型小鼠的全骨髓细胞与预处理过的间充质干细胞共培养过夜，然后检测造血干细胞的数量以及移植后的嵌合率，结果如图6至图8所示。图6为造血干细胞统计结果，图中“Mock”图为未处理对照试验组，“Sirt1 Inhibitors”图为Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的试验组；图7为统计的“Mock”对照试验组和Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的试验组的LT-HSC细胞数量、ST-HSC细胞数量和MPP细胞数量，其中白色柱为“Mock”对照试验组，黑色柱为Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的试验组；图8为统计的CD150 HSC数量，其中白色柱为“Mock”对照试验组，黑色柱为Sirt1 Inhibitors Ⅳ处理的试验组。图6至图8的结果显示，与Sirt1 Inhibitors Ⅳ预处理过的间充质干细胞共培养后的LT-HSC(Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2-)以及CD150 HSC的数目显著增加。嵌合率的结果如图9至图12所示，图9为造血干细胞竞争性移植后外周血CD45.2来源的细胞的嵌合率(y轴)随着移植后时间周数(x轴)变化的统计结果，图10为造血干细胞竞争性移植后外周血中B220+细胞中CD45.2来源的细胞的嵌合率随着移植后时间周数变化的统计结果，图11为造血干细胞竞争性移植后外周血中CD3e+细胞中CD45.2来源的细胞的嵌合率随着移植后时间的统计结果，图12为造血干细胞竞争性移植后髓系细胞中B220+细胞中CD45.2来源的细胞的嵌合率随着移植后时间周数的统计结果；图9至图12，各图的纵坐标，即y轴，为嵌合率，横坐标，即x轴，为移植后的周数。图9至图12的结果显示，与Sirt1 Inhibitors Ⅳ预处理过的间充质干细胞共培养的造血干细胞进行体内竞争性移植后的4周、8周、12周和16周后，嵌合率显著升高，并且B细胞，T细胞以及髓系细胞的嵌合率均显著升高。

以上结果说明，Sirt1 Inhibitors Ⅳ预处理过的间充质干细胞，由于特异性的抑制Sirt1表达，使得间充质干细胞能够促进造血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能，并且，提高移植后造血干细胞的嵌合率，即提高造血干细胞的重建能力。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市蓝思人工智能医学研究院

深圳市第二人民医院

<120> 一种间充质干细胞及其应用

<130> 19I28880

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtcgtgttc tggaagaatg a 21

Claims

1.一种经过Sirt1抑制剂处理的间充质干细胞在制备促进造血干细胞体外扩增的试剂中的应用，所述Sirt1抑制剂为浓度10mM的Sirt1 inhibitor Ⅳ，所述造血干细胞为Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2- LT-HSC。

2.一种经过Sirt1抑制剂处理的间充质干细胞在制备促进移植后造血干细胞重建的药物中的应用，所述Sirt1抑制剂为浓度10mM的Sirt1 inhibitor Ⅳ，所述造血干细胞为Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2- LT-HSC。