ES2968146T3

ES2968146T3 - Derivados de azol sustituidos para la generación, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas

Info

Publication number: ES2968146T3
Application number: ES17849203T
Authority: ES
Inventors: Sudipto Bari; Christina Chai; Gigi Chiu; William Hwang; Joo Low; Qixing Zhong
Original assignee: National University of Singapore; Singapore Health Services Pte Ltd
Current assignee: National University of Singapore; Singapore Health Services Pte Ltd
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2024-05-08
Anticipated expiration: 2037-08-18
Also published as: SG10202101478YA; US20190359941A1; KR102522572B1; JP7168552B2; EP3500562A4; EP3500562B1; AU2017325511B2; AU2017325511A1; WO2018048346A1; MY197282A; JP2019528066A; CN109890805B; CN109890805A; SG11201901199WA; EP3500562A1; KR20190039988A

Abstract

La presente invención se refiere a derivados de azol sustituidos en combinación con citocinas en la expansión ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34+ en una muestra biológica, más particularmente la expansión de estas células obtenidas a partir de la fracción mononuclear no enriquecida. de la muestra biológica. La presente invención describe además el régimen de trasplante del injerto hematopoyético expandido desarrollado mediante estudios de xenotrasplante. En una realización preferida, la combinación que comprende los compuestos a base de azol y citoquinas seleccionadas de SCF, TPO, FLT-3L e IGFBP-2 y da como resultado la expansión de células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ y/o Células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ y/o células progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA- de células mononucleadas aisladas de sangre de cordón umbilical. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de azol sustituidos para la generación, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con los derivados de azol sustituidos y su uso en la expansiónex vivode células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC, por sus siglas en inglés) que expresan CD34 en una muestra biológica; más particularmente, la expansión de estas células obtenidas a partir de la fracción no enriquecida, es decir, la fracción mononuclear de la muestra biológica. La presente invención describe, además, el régimen de trasplante del injerto hematopoyético expandido desarrollado a través de estudios de xenotrasplante.

Antecedentes de la invención

Los trasplantes de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés) se usan para corregir defectos en los glóbulos sanguíneos que provocan trastornos malignos y benignos mediante el reemplazo de los enfermos por células sanas de donantes [Gratwohl A,et al.,JAMA 303(16): 1617-1624 (2010)]. Hasta la fecha, se han realizado más de un millón de HSCT con células madre de sangre periférica (PBSC, por sus siglas en inglés) movilizada, siendo la médula ósea (BM, por sus siglas en inglés) y la sangre del cordón umbilical (UCB, por sus siglas en inglés) las fuentes del injerto. En la última década, el número de HSCT de registro se ha triplicado principalmente para tratar trastornos sanguíneos malignos, tales como la leucemia mieloide aguda (National Marrow Donor Programme, EE. UU.) [Lund TC,et al.,Nature reviews. Clinical Oncology 12(3):163-74 (2015)]. Independientemente de la fuente del injerto, en 2014, se realizaron aproximadamente 6.500 trasplantes en todo el mundo. Aunque las PBSC o la BM se siguen considerando la principal fuente de injerto, la UCB surgió como una alternativa eficaz para aproximadamente el 31 % de los pacientes que se sometieron a un HSCT en 2014 [Bari S,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 21(6):1008-19 (2015)].

Desde que se realizó el primer trasplante de UCB en 1988, a fin de tratar con éxito a un paciente con anemia de Fanconi, estos desechos biológicos se han almacenado activamente en bancos de sangre públicos y privados y recientemente han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, EE. UU.) como una fuente legítima de HSPC [Gluckman E,et al.,Nouv Rev Fr Hematol 32(6):423-425 (1990); Voelker R. JAMA 306(22): 2442 (2011)]. En comparación con la BM o las PBSC, los trasplantes de UCB (UCBT, por sus siglas en inglés) se asocian a una mayor facilidad de extracción de HSPC, una disponibilidad inmediata (>700.000 unidades de UCB de registro almacenadas en todo el mundo), un menor riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, una mayor tolerancia a través de las barreras de los antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés) y una menor incidencia de enfermedad injerto contra huésped (GVHD, por sus siglas en inglés) [Lund TC,et al.,Nature reviews. Clinical Oncology 12(3): 163-74 (2015); Bari S,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015)]. Asimismo, en varios metaanálisis, se ha demostrado que los UCBT ofrecen resultados equivalentes a los de los trasplantes de BM totalmente compatibles tanto en pacientes adultos como pediátricos que carecen de hermanos donantes compatibles [Hwang WYK,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 13(4): 444-453 (2007)]. A nivel mundial, aproximadamente el 40 % de la población de raza blanca y hasta el 55-80 % de los pacientes que no son de raza blanca no podrán encontrar un donante no emparentado compatible (MUD, por sus siglas en inglés) con 8/8 HLA-A,-B,-C y -DR, lo que significa que más de 6.000 pacientes al año pueden optar a un UCBT [Cunha R,et al.,Bone Marrow Transplant 49(1): 24-29 (2014); Barker JN,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 16(11): 1541-1548 (2010)]. Sin embargo, en 2014, solo se realizaron 960 UCBT (NMDP, EE. UU.), principalmente debido al problema de la baja dosificación de células nucleadas totales (TNC, por sus siglas en inglés) asociada a los injertos de UCB almacenados, lo que limita enormemente su uso clínico.

Aunque los UCBT se han usado con éxito en pacientes pediátricos, donde un solo injerto es capaz de cumplir la dosis clínica mínima de 25 millones de células/kg de peso corporal, existen desafíos importantes para su uso en pacientes adultos [Gluckman E, Rocha V. Cytotherapy 7(3): 219-227 (2005)]. La tasa característicamente más lenta de recuperación hematopoyética después de los UCBT en adultos, con respecto a la BM o las PBSC, es una consecuencia de un menor contenido de TNC y HSPC para la mediación en un trasplante exitoso, así como una deficiencia celular intrínseca para funciones relacionadas con el procedimiento del injerto en injertos de UCB [Ballen KK,et al.,Blood 122(4): 491-498 (2013)]. La mediana del tiempo de procedimiento del injerto de neutrófilos, que es una medida preliminar del éxito de un trasplante, es típicamente mayor de 25 días, en el caso de los injertos de UCB no manipulados, en comparación con la mediana de aproximadamente 14 días y 18 días, respectivamente, en el caso de los injertos de PBSC o BM [Lund TC,et al.,Nature reviews. Clinical Oncology 12(3): 163-74 (2015)]. Los tiempos de reconstitución de otras células inmunitarias, tales como los linfocitos T, los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales, que típicamente se producen más tarde (>3 meses) que la recuperación de neutrófilos y plaquetas, se retardan de manera más significativa después del UCBT debido al estado inmunitario relativamente inmaduro de las células de UCB [Komanduri KV,et al.,Blood 110(13): 4543-4551 (2007)]. El considerable retardo en la reconstitución hematopoyética aumenta el riesgo de infección microbiana y vírica oportunista en los receptores pancitopénicos, lo que contribuye, por tanto, a la alta mortalidad relacionada con el trasplante (TRM, por sus siglas en inglés) de >30 % después del UCBT [Bari S,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015); Hofmeister CC,et al.,Bone Marrow Transplant 39(1): 11-23 (2007)]. Sin embargo, los riesgos de infección y mortalidad parecen ser menores con una dosis más alta de células infundidas para el trasplante [Kelly SS,etal.,Bone Marrow Transplant 44(10): 673-681 (2009); Dahlberg A,et al.,Blood 117(23): 6083-6090 (2011)]. Varios grupos han intentado ampliar el componente de células madre de los tejidos adultos. La proliferación de células madre de músculo de ratón se potenció mediante el contacto con un inhibidor de la vía de señalización de las MAPK p38, tal como la pequeña molécula a base de azol SB203580 [documento WO 2012/141971 A2]. De manera similar, se han usado inhibidores de las MAPK para potenciar el procedimiento del injerto de células madre hematopoyéticas humanas [documento WO 2017/075274 A1]. Los inhibidores de la señalización del ácido retinoico, tales como DEAB, opcionalmente, con inhibidores de las MAPK p38, tales como ralimetinib (por ejemplo, dimesilato LY222882O), se han usado para diferenciar células ES y PSC [documento WO 2013/086029 A1]. Se han ampliado las células madre hematopoyéticasex vivoen presencia de citocinas, tales como el factor de células madre (SCF, por sus siglas en inglés), la trombopoyetina (TPO, por sus siglas en inglés), el ligando de FLT3 y las proteínas de unión a IGF [Fan X,et al.,Stem Cell Research & Therapy 5(3): 71ff (2014)]. Dadas las ventajas de los UCBT, resulta deseable permitir que la UCB sea un injerto de primera elección para los HSCT. A fin de lograr este objetivo, sin embargo, resulta necesario aumentar el número de TNC y HSPC antes del trasplante en adultos que hayan recibido el régimen preparativo adecuado (acondicionamiento mieloablativo o de intensidad reducida).

Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar un suministro más abundante de TNC y HSPC para el injerto y un método para la producción de las mismas.

Sumario de la invención

Se describe un método de expansión de HSPC definidas fenotípica y funcionalmente a partir de células mononucleares (MNC, por sus siglas en inglés) de UCB en estado de congelación y descongelación usando una pequeña molécula a base de azol, IM-29 y derivados de las mismas. Las HSPC definidas fenotípica y funcionalmente también se pueden expandir en muestras de médula ósea y/o de sangre periférica movilizada usando las moléculas pequeñas de la invención. Si así se desea, las moléculas pequeñas de la invención se podrían usar para expandir una cohorte de células HSPC CD34+ enriquecidas a partir de una muestra de UCB, médula ósea o sangre periférica movilizada. De acuerdo con un aspecto preferido, la presente invención proporciona un método para la expansiónex vivodel componente de las células nucleadas totales y/o un subconjunto de células madre y progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+ de una muestra de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada, que comprende las etapas de:

(i) cultivar un componente de células nucleadas totales o de una fracción de células mononucleadas o células madre y progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+ de la muestra en medios; y

(ii) poner en contacto la/s célula/s de la etapa (i) con una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol, en donde la al menos una molécula pequeña a base de azol se representa mediante la Fórmula (I),

en donde:

X representa NR4 u O, donde R4 es H o metilo;

R1 representa fenilo o piridinilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de Cl, Br, F y metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con F]);

R2 representa fenilo, piridilo o dihidropiranilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de Cl, Br, F y metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con F]);

R3 representa H o naftilo que está sin sustituir o sustituido con uno o más grupos seleccionados de CI, F y OR5, donde R5 es H o metilo, o;

sales y solvatos de los mismos.

La al menos una molécula pequeña a base de azol se puede seleccionar de:

(A) la lista:

(i) 4-[2-(1 -fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(ii) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(m-tolil)-1H-imidazol-5-il]piridina;

(iii) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(iv) 4-[2-(naftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na;

(v) 4-[2-(1-bromonaftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na;

(vi) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4-[3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l]-1H-¡m¡dazol-5-¡l]p¡r¡d¡na;

(v¡¡) 2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-5-(m-tol¡l)oxazol;

(v¡¡¡) 5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol;

(¡x) 5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(6-metox¡naftalen-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol;

(x) 5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol;

(x¡) 4-(4(5)-(4-fluorofen¡l)-2-(7-metox¡naftalen-2-¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l)p¡r¡d¡na;

(x¡¡) 4-[4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na; y

(x¡¡¡) 4-[4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na; o

(B) la l¡sta:

(¡) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na;

(¡¡) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-5-¡l]p¡r¡d¡na;

(¡¡¡) 4-[2-(naftalen-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na;

(¡v) 4-[2-(naftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na;

(v¡) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4-[3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l]-1H-¡m¡dazol-5-¡l]p¡r¡d¡na; y

(v¡¡) 2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-5-(m-tol¡l)oxazol.

Las células madre y progerntoras hematopoyét¡cas se pueden expand¡r en presenc¡a de al menos una c¡toc¡na selecc¡onada del grupo que comprende el factor de células madre (SCF), la trombopoyet¡na (TPO), el l¡gando de t¡ros¡na c¡nasa 3 relac¡onado con Fms (FLT-3L, por sus s¡glas en ¡nglés) y la proteína de un¡ón al factor de crec¡m¡ento s¡m¡lar a la ¡nsul¡na 2 (IGFBP-2, por sus s¡glas en ¡nglés). Preferentemente, las células madre y progerntoras hematopoyét¡cas se expanden en presenc¡a de al menos dos, al menos tres o los cuatro de SCF, TPO, FLT-3L y IGFBP-2. Más preferentemente, las células madre y progerntoras hematopoyét¡cas se expanden en presenc¡a de 100 ng/ml de SCF, 100 ng/ml de TPO, 50 ng/ml de FLT-3L y 20 ng/ml de IGFBP-2.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, el método comprende cult¡var la/s célula/s mononuclear/es de la sangre del cordón umb¡l¡cal con la al menos una molécula pequeña a base de azol durante un período de al menos 9 días.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, las c¡toc¡nas se añaden al cult¡vo el día 0 y/o el día 7.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, la al menos una molécula pequeña a base de azol se añade al cult¡vo el día 0 y/o el día 7.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, el método comprende, además, la etapa de extraer las células después de aprox¡madamente 10 u 11 días cuando se observa una expans¡ón ópt¡ma.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, las células progerntoras hematopoyét¡cas CD45+CD34+CD38-CD45RA-están expand¡das.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, las células madre hematopoyét¡cas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) están expand¡das.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, las células madre hematopoyét¡cas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) están expand¡das.

En otra real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, las células madre y progerntoras hematopoyét¡cas expand¡das poseen un car¡ot¡po normal y no presentan n¡nguna transformac¡ón leucém¡ca.

En otro aspecto de la ¡nvenc¡ón, se proporc¡ona una compos¡c¡ón que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol def¡n¡da de acuerdo con cualqu¡er aspecto de la ¡nvenc¡ón; y al menos una c¡toc¡na selecc¡onada del grupo que comprende SCF, TPO, FLT-3L e IGFBP-2 para su uso en la expans¡ónex vivodel componente de células madre y progerntoras hematopoyét¡cas de la sangre del cordón umb¡l¡cal, la médula ósea y/o la sangre per¡fér¡ca mov¡l¡zada.

En una real¡zac¡ón prefer¡da de la ¡nvenc¡ón, la al menos una molécula pequeña a base de azol se usa en la expans¡ónex vivodel componente de células madre y progerntoras hematopoyét¡cas de la sangre del cordón umb¡l¡cal.

En otro aspecto de la ¡nvenc¡ón, se proporc¡ona el uso de una compos¡c¡ón que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol, tal como se def¡ne en el presente documento, en la expans¡ónex vivodel componente de células madre y progerntoras hematopoyét¡cas de la sangre del cordón umb¡l¡cal, la médula ósea y/o la sangre per¡fér¡ca mov¡l¡zada. Preferentemente, el componente de células madre y progerntoras hematopoyét¡cas prov¡ene de la sangre del cordón umb¡l¡cal.

Breve descripción de las figuras

LaFigura 1muestra el factor de expansión de células progenitoras hematopoyéticas (7AAD-) (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) viables y células nucleadas totales (TNC) en cultivos que duraron 11 días con medios libres de componentes animales (ACF, por sus siglas en inglés), diferentes combinaciones de citocinas con y sin IM-29. Los medios, las citocinas y el IM-29 se repusieron el día 7. Las concentraciones de cada citocina son las siguientes: S representa SCF a 100 ng/ml; T representa TPO a 100 ng/ml; F representa FLT-3L a 50 ng/ml; e IG representa IGFBP-2 a 20 ng/ml. La pequeña molécula IM-29 se representa mediante IM y se administra a una concentración de 5,0 pM. *P < 0,05 en comparación con los respectivos grupos en todas las demás condiciones. Los datos representan la media ± SD para n = 3.

LaFigura 2muestra un esquema que describe el método que permite la expansiónex vivode HSPC de UCB usando IM-29 y sus análogos estructurales.

LaFigura 3es un diagrama esquemático que describe el proceso de obtención de células mononucleadas (MNC) a partir de UCB nueva.

LaFigura 4es una representación esquemática de la composición de las células en la fracción de MNC de UCB y la expresión fenotípica de diferentes subconjuntos de HSpC.

LaFigura 5es un diagrama esquemático que describe el cambio en la proporción de células en el injerto de UCB debido a la expansiónex vivocon IM-29 usando células mononucleadas.

LaFigura 6Amuestra que la pequeña molécula IM-29 (peso molecular, MW: 383,12 g/mol) proporciona una expansión óptima de UCB (factor de aumento >1.200 de células progenitoras hematopoyéticas viables, HPC, definidas por la expresión fenotípica de CD45+CD34+CD38-CD45RA-, que se muestra en la Figura 8 (A)).

LaFigura 6Bmuestra la estructura de la pequeña molécula IM-04 (MW: 379,43 g/mol) que puede efectuar un factor de aumento de 1.000 a 1.150 de células progenitoras hematopoyéticas viables definidas por la expresión fenotípica de CD45+CD34+CD38-CD45RA-, que se muestra en la Figura 8 (A).

LaFigura 6Cmuestra la estructura de pequeñas moléculas IM-01 (MW: 361,45 g/mol), ZQX-33 (MW: 365,13 g/mol), ZQX-36 (MW: 443,04 g/mol), GJ-C (MW: 433,41 g/mol), OZ-07 (MW: 380,42 g/mol), IM-03 (MW: 384,16 g/mol), IM-09 (MW: 396,18 g/mol), IM-22 (MW: 388,14 g/mol), ZQX-53 (MW: 394,14 g/mol), IM-44 (MW: 235,11 g/mol) y ZQX-42 (MW: 239,09 g/mol) que son análogos estructurales deiM-29(Figura 6 (A)) e IM-04 (Figura 6 (B)) que dieron un factor de aumento de 400 a 900 de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) viables definidas por expresión fenotípica de CD45+CD34+CD38-CD45RA- (que se muestra en la Figura 8 (A)).

LaFigura 6Dmuestra la estructura del compuesto precursor SB203580 (MW: 377,43 g/mol), que es un inhibidor establecido de las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK, por sus siglas en inglés) p38. Se sabe que la concentración de trabajo óptima de SB203580 es 5,0 pM.

LaFigura 6Emuestra las estructuras de los análogos del compuesto precursor SB203580 que se generaron para estudiar la expansión de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) a partir de células mononucleadas (MNC) de sangre del cordón umbilical (UCB). Basándose en la modificación estructural y química, los análogos generados se subdividieron en cuatro amplios grupos 1-4.

LaFigura 7muestra el efecto de IM-29 y sus análogos estructurales a 5,0 pM sobre la población de CD45+ y la viabilidad celular a las 72 horas usando MNC en estado de congelación-descongelación de tres muestras diferentes de UCB. El SB203580, el DMSO y las citocinas solos en medios de expansión libres de suero (SFEM, por sus siglas en inglés) sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM para n = 3. El efecto de IM-29 y sus análogos estructurales en HSPC de UCB se evaluó usando un ensayo de viabilidad que incluye la tinción de las células de UCB con Anexina-V (se une a la fosfatidilserina 5 expresada en células apoptóticas tempranas) y 7-aminoactinomicina D (7-AAD que tiñe las células muertas). Se eligió este ensayo basado en citómetro de flujo dado que los informes publicados [Bari S,et al.,Biol Blood Marrow Transplant 21(6): 1008-19 (2015)] sugieren que la inducción espontánea de la apoptosis de los leucocitos CD45+ (HSPC es un subconjunto de esta población) es un problema importante de los cultivos de expansión de HSPC. Estos datos sugieren que ninguna de las moléculas pequeñas tiene toxicidad aguda para las células MNC de UCB.

LaFigura 8Amuestra el factor de expansión de células progenitoras hematopoyéticas (7AAD-) (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) viables y células nucleadas totales (TNC) en cultivos que duraron 10 días, reponiéndose los medios de expansión libres de suero (SFEM), las citocinas y la respectiva molécula pequeña el día 7. *P < 0,01 en comparación con todas las demás condiciones en el respectivo grupo. El SB203580, el DMSO y las citocinas solas en SFEM sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM para n = 4.

LaFigura 8Bmuestra el factor de expansión de células progenitoras hematopoyéticas (7AAD-) (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) viables y células nucleadas totales (TNC) en cultivos que duraron 11 días, reponiéndose los medios libres de componentes animales (ACF), las citocinas y la respectiva molécula pequeña el día 7. *P < 0,01 en comparación con todas las demás condiciones en el respectivo grupo. El SB203580, el DMSO y las citocinas solas en medios ACF sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM para n = 3.

LaFigura 8Cmuestra diagramas de puntos representativos del análisis de citometría de flujo que representan la población de CD34+CD38-, que es un subconjunto de las células CD45+ de (i) MNC de UCB en estado de descongelación a las 0 horas y cultivadas durante 10 días en (ii) control de citocinas y (iii) 5,0 pM de IM-29 suplementada con citocinas usando medios de expansión libres de suero (SFEM).

LaFigura 9Amuestra el factor de expansión de células progenitoras hematopoyéticas (7AAD-) (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) viables y células nucleadas totales (TNC) en cultivos que duraron 11 días, reponiéndose los medios libres de componentes animales (ACF), las citocinas y la respectiva molécula pequeña el día 7. Las concentraciones de IM-29 usadas son 1,0, 5,0 y 10,0 pM. Las citocinas solas en medios ACF sirvieron como control en blanco. *P < 0,01 en comparación con el respectivo grupo. Los datos representan la media ± SD para n = 3.

LaFigura 9Bmuestra la expansiónex vivode células nucleadas totales (TNC) y unidades formadoras de colonias (CFU, por sus siglas en inglés) de granulocitos y macrófagos (GM, por sus siglas en inglés) cuando se cultivaron dos unidades de UCB separadas sin preselección de células madre en 5,0 pM de IM-29 y citocinas basales. Los cultivos de expansión duraron 10 días, realizándose la reposición de<s>F<e>M, citocinas e IM-29 el día 7. El SB203580, el Dm SO y las citocinas solas en SFEM sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM para n = 6. *P < 0,01 en comparación con todos los demás tratamientos y respectivas poblaciones. Las CFU-GM es un ensayo funcionalin vitroa base de metilcelulosa, donde las HSPC conducen a la formación de colonias distintas. Las células maduras no pueden formar tales colonias.

LaFigura 10muestra la expansiónex vivode células nucleadas totales (TNC), células progenitoras hematopoyéticas (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) y unidades formadoras de colonias (CFU) de granulocitos y macrófagos (GM) cuando se cultivaron MNC de UCB en medios de expansión libres de suero (SFEM) o medios libres de componentes animales (ACF) que contenían IM-295,0 pM en presencia de citocinas basales. Los cultivos de expansión duraron 10 días, realizándose la reposición de los medios de SFEM/ACF, las citocinas y la IM-29 el día 7. Las citocinas solas en medios de SFEM/ACF sirvieron como control en blanco. Los datos representan la media ± SEM para n = 3. *P < 0,05 en comparación con el control de citocinas en los respectivos medios. El efecto de expansión de IM-29 fue independiente de los medios de cultivo basales. El uso de medios de SFEM o ACF dio como resultado una expansión significativamente mejor de TNC, HPC (CD45+CD34+CD38-CD45RA-) y CFU-GM en presencia de 5,0 pM de IM-29, en comparación con el respectivo control de citocinas. El SFEM contiene seroalbúmina bovina, mientras que el ACF está químicamente definido.

LaFigura 11muestra la expansiónex vivode UCB en 5,0 pM de IM-29 en función de la duración/el período del cultivo. Factor de expansión de células progenitoras hematopoyéticas (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) (línea continua) y células nucleadas totales (TNC) (línea discontinua) en cultivos que duraron 7, 9 y 11 días. Los medios libres de componentes animales (ACF), las citocinas y la IM-29 se repusieron el día 7, en el caso de los cultivos que duraron hasta los días 9 y 11. Este conjunto de experimentos se llevó a cabo con dos muestras de UCB diferentes. Las citocinas solas en medios ACF sirvieron como control en blanco.*P< 0,01 o**P< 0,01 en comparación con el control de citocinas para el respectivo parámetro en el punto temporal mencionado. Los datos representan la media ± SEM para n = 6. El efecto de expansión de IM-29 dependió de la duración del cultivo, siendo el período de expansión óptimo de 10 a 11 días.

LaFigura 12muestra el efecto de expansiónex vivoen la UCB de IM-29 a 5,0 pM en función del tiempo en el que se añadió al cultivo. Factor de expansión de HPC en cultivos que duraron 10 días. Los medios de expansión libres de suero (SFEM) o medios libres de componentes animales (ACF), las citocinas y la IM-29 se añadieron el día 0 y se repusieron el día 7, tal como se detalla en la tabla. Los datos representan la media ± SEM para n = 3. *P < 0,05 en comparación con todos los demás grupos en los respectivos medios. La expansión óptima de HPC de UCB solo se logró cuando se suplementó IM-29 en el punto de inicio de los cultivos de expansión. La expansión se mejoró significativamente si se reponía IM-29 el día 7 junto con medios y citocinas.

LaFigura 13Amuestra diagramas de puntos representativos del análisis de citometría de flujo que representan (a) la población CD90+ (región representada con *); (b) la población CD90+CD49f+ (región representada con **) y (c) la población CD90-CD49f+ (región representada con ***) que son subconjuntos de células CD45+CD34+ CD38-CD45RA- de (i) MNC de UCB en estado de descongelación a las 0 horas y cultivadas durante 10 días en (ii) control de citocinas y (iii) 5,0 pM de IM-29 suplementada con citocinas usando medios de expansión libres de suero (SFEM).

LaFigura 13Bmuestra la expansiónex vivode HSC1 con expresión fenotípica de CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ que se sabe que se injertan en ratones inmunodeficientes. Los cultivos de expansión duraron 10 días, realizándose la reposición de los SFEM, las citocinas y la IM-29 el día 7. El SB203580, el DMSO y las citocinas solas en SFEM sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SD para n = 3. *P < 0,001 en comparación con SB203580, DMSO y control de citocinas. LaFigura 13Cmuestra la expansiónex vivode HSC2 con expresión fenotípica de CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+. Los cultivos de expansión duraron 10 días, realizándose la reposición de los SFEM, las citocinas y la IM-29 el día 7. El SB203580, el DMSO y las citocinas solas en SFEM sirvieron como compuesto de referencia, vehículo y control en blanco, respectivamente. Los datos representan la media ± SD para n = 3. *P < 0,001 en comparación con SB203580, DMSO y control de citocinas. Investigación detallada de la expresión fenotípica de UCB expandida sin selección previa de células madre, pero el uso de IM-29 mostró un aumento significativo en subconjuntos raros de HSPC definidos por la expresión del antígeno de (a) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) y (b) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2). Se ha indicado que estos subconjuntos de UCB no manipulados poseen una alta capacidad de autorrenovación/repoblación, según lo evaluado por los estudios de trasplantes en seriein vivo.

LaFigura 13Dmuestra un cariograma representativo de células expandidas a partir de MNC de UCB en estado de congelación-descongelación en presencia de 5,0 pM de IM-29 en medios libres de componentes animales (ACF) con citocinas basales. Los cultivos de expansión duraron 11 días, realizándose la reposición de los ACF, las citocinas y la IM-29 el día 7. El cariotipo de las células expandidas es normal en comparación con las MNC de UCB no cultivadas.

LaFigura 13Emuestra los resultados de los ensayos clínicos de hibridación por fluorescenciain situ(FISH, por sus siglas en inglés) y de citoquímica de leucocitos realizados en células expandidas a partir de MNC de UCB en estado de congelación-descongelación en presencia de 5,0 pM de IM-29 en medios libres de componentes animales (ACF) con citocinas basales. Los cultivos de expansión duraron 11 días, realizándose la reposición de los ACF, las citocinas y la IM-29 el día 7. Las sondas de FISH usadas son D7S486/CEP 7 (en el caso de leucemia mieloide aguda, AML, por sus siglas en inglés; síndrome mielodisplásico, MDS, por sus siglas en inglés); MYC/CEP 8 (en el caso de linfoma no hodgkiniano, NHL, por sus siglas en inglés; leucemia linfocítica aguda, ALL, por sus siglas en inglés); CDKN2A/CEP 9 (en el caso de ALL); BCR/ABL-1 (en el caso de ALL; AML; leucemia mielógena crónica, CML, por sus siglas en inglés); MLL (en el caso de ALL; AML); TP53/CEP 17 (en el caso de leucemia linfocítica crónica, CLL, por sus siglas en inglés; mieloma múltiple (MM); NHL); y ETV6/RUNX1 (en el caso de AML; ALL; MDS). Se realizaron ensayos de citoquímica de leucocitos usando las siguientes tinciones en los frotis de células cultivadas: May-Grünwald Giemsa (detecta células tumorales); mieloperoxidasa (distingue entre AML y ALL); ácido peryódico-Schiff (identifica eritroleucemia); y Sudán Negro B (distingue entre AML y ALL). Los ensayos de diagnóstico de FISH y citoquímica de leucocitos sugieren que las células expandidas con IM-29 no tienen transformación leucémica.

LaFigura 14es un esquema que describe los principales procedimientos experimentales para el trasplante de UCB expandida con IM-29 a ratones inmunodeficientes para evaluar la funcionalidadin vivo.

LaFigura 15Amuestra el quimerismo de CD45 humanas en sangre periférica (PB, por sus siglas en inglés) de ratones NOD/SCID/Gamma (NSG, por sus siglas en inglés) en la semana 3 después del trasplante con UCB sin expansión o con expansión. La expansión de los injertos de UCB se llevó a cabo usando la fracción mononuclear (es decir, sin selección de CD34) en el medio de expansión libre de suero (SFEM) o en el medio libre de componentes animales (ACF) que se suplementaron con citocinas. El trasplante se lleva a cabo según el esquema que se muestra en la Figura 14. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos (ya sean nuevos o congelados-descongelados) se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de CD45 humanas de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95% de los respectivos tratamientos. Los valores dePgenerados a partir de la prueba de la t de Student entre los grupos experimentales indicados se muestran en el gráfico para los valores n indicados.

LaFigura 15Bmuestra el compromiso de linaje de las células CD45 humanas que están presentes en la sangre periférica (PB) de ratones NSG en la semana 3 después del trasplante según la Figura 15A. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa la proporción de monocitos (CD45+CD33+), granulocitos (CD45+CD15+), linfocitos T (CD45+CD3+) y linfocitos B (CD45+CD19+) presentes entre el total de células humanas en cada animal individual y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos.

LaFigura 16Amuestra los resultados de células mononucleadas de UCB expandidas en diferentes condiciones de cultivo trasplantadas en ratones NOD/SCID/Gamma (NSG) inmunodeficientes irradiados subletalmente, por lo que se determinó el porcentaje de células CD45+ humanas y el compromiso de linaje de las células humanas injertadas en la médula ósea de los ratones NSG después de 19 semanas después del trasplante. En este conjunto de datos, el quimerismo de ratones que recibieron un injerto expandido o no expandido (± 5,0 pM de IM-29) se segrega en función del sexo de los ratones receptores y no según el tipo de injerto. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de CD45 humanas de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % del respectivo sexo.

LaFigura 16Bmuestra el quimerismo de CD45 humanas en la médula ósea (BM) de ratones NSG hembra en la semana 19 después del trasplante según la Fig. 16A. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos (ya sean nuevos o congeladosdescongelados) se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de CD45 humanas de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos. Los valores dePgenerados a partir de la prueba de la t de Student entre los grupos experimentales indicados se muestran en el gráfico para los valores n indicados.

LaFigura 16Cmuestra la proporción de células progenitoras presentes entre el total de células humanas en la médula ósea (BM) de ratones NSG machos y hembras en la semana 19 después del trasplante según la Fig. 16A. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa los progenitores frecuentes (CD45+CD34+), mieloides (CD13+CD33+) y linfoides (CD45+CD7+) de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos.

LaFigura 16Dmuestra la proporción de células mieloides presentes entre el total de células humanas en la médula ósea (BM) de ratones NSG machos y hembras en la semana 19 después del trasplante según la Fig. 16A. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa los monocitos (CD45+CD33+), granulocitos (CD45+CD13+/CD15+/CD66b+) y megacariocitos (CD45+cD41a+) de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos.

LaFigura 16Emuestra la proporción de células linfoides presentes entre el total de células humanas en la médula ósea (BM) de ratones NSG machos y hembras en la semana 19 después del trasplante según la Fig. 16A. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 2,5*107 células/kg o 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa los progenitores de los linfocitos T cooperadores (CD45+CD3+CD4+), los linfocitos T citotóxicos (CD45+CD3+CD8+), los linfocitos B (CD45+CD19+) y los linfocitos citolíticos naturales (CD45+CD56+) de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos. Entre los diversos grupos, la UCB expandida con la IM-29 (5,0 j M) y las citocinas, independientemente de los medios de cultivo basales, parece proporcionar el mejor quimerismo de CD45 humanas en los receptores de ratón hasta el momento, lo que sugiere tanto un procedimiento del injerto más rápido como la capacidad de mantener la hematopoyesis a largo plazo.

LasFiguras 17A-17Hmuestran que las células mononucleadas (MNC) de UCB se expandieron en presencia de 5,0 j M de IM-29 y las citocinas basales generaron principalmente progenitores mieloides y células maduras que, cuando se trasplantaban en ratones NOD/SCID/Gamma (NSG) inmunodeficientes irradiados subletalmente, dieron como resultado un procedimiento del injerto temprano de células mieloides y progenitoras en sangre periférica (PB) y médula ósea (BM), al tiempo que confirmaron la reconstitución humana de múltiples linajes a largo plazo de la BM de NSG.

LaFigura 17Amuestra la expansión de células maduras de linaje mieloide y linfoide en cultivos de control de IM-29 y citocinas durante 11 días. Estos cultivos de expansión de MNC se suplementaron con medios ACF, citocinas e iM-29 el día 7. El linaje mieloide consistió en monocitos CD45+CD33+, granulocitos CD45+CD13+CD15+ y megacariocitos CD45+CD41a+CD61+. El linaje linfoide consistió en linfocitos T CD45+CD3+, linfocitos B CD45+CD19+ y linfocitos citolíticos naturales CD45+CD56+. *P < 0,001 en comparación con la respectiva población en cada grupo de tratamiento. Los datos representan la media ± SD para n = 3.

LaFigura 17Bmuestra un diagrama de dispersión del quimerismo de CD45 humanas en sangre periférica (PB) de ratones NSG en la semana 2 después del trasplante. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 10,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 10,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de CD45 humanas de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos. Los valores dePgenerados a partir de la prueba de la t de Student entre los grupos experimentales indicados se muestran en el gráfico para los valores n indicados.

LaFigura 17Cmuestra un diagrama de dispersión del quimerismo de linfocitos T CD45+CD3+ humanas en sangre periférica (PB) de ratones NSG en la semana 2 después del trasplante. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 10,0*107 o 5,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos con IM-29 se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 10,0*107 o 5,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de los linfocitos T humanos de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos. Los valores dePgenerados a partir de la prueba de la t de Student entre los grupos experimentales indicados se muestran en el gráfico para los valores n indicados. LaFigura 17Dmuestra un diagrama de dispersión del quimerismo de las CD45+ humanas, las células progenitoras CD45+CD34+ y los linfocitos T CD45+CD3+ en la médula ósea (MO) de ratones NSG hembra en la semana 2 después del trasplante. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 10,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 10,0*107 células/kg. El diagrama de dispersión representa el quimerismo de las CD45+ humanas, las células progenitoras CD45+CD34+ y los linfocitos T CD45+CD3+ de animales individuales y representa la media geométrica con un intervalo de confianza (IC) del 95 % de los respectivos tratamientos. Los valores dePgenerados a partir de la prueba de la t de Student entre los grupos experimentales indicados se muestran en el gráfico para los valores n indicados.

LaFigura 17Emuestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones NSG trasplantados con MNC de UCB expandidas con IM-29 o citocinas e injerto no expandido durante un período de observación de 60 días. La dosis celular absoluta del injerto no expandido fue de 10,0*107 células/kg, mientras que los injertos expandidos se trasplantaron a una dosis celular equivalente de 10,0*107 células/kg. También se muestra la comparación estadística global de los grupos experimentales.

LaFigura 17Fmuestra un esquema que describe el régimen de trasplante de UCB expandida con IM-29 cuando los cultivos de expansión se inician con células CD34+ purificadas magnéticamente. A fin de que el protocolo de expansión con IM-29 se pueda traducir en un ensayo clínico de fase I, resulta necesario demostrar la eficacia del protocolo para expandir HSPC purificadas.

LaFigura 17Gmuestra el nivel de expansiónex vivode HSPC con fenotipo de CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f- (HSC1) o CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) cuando se cultivaron HSPC inmaduras purificadas con fenotipo CD45+CD34+CD38- en medios de expansión libres de suero (SFEM ) o medios libres de componentes animales (ACF) que contienen IM-295,0 j M en presencia de citocinas basales. Los cultivos de expansión duraron 10 días con medios de SFEM/ACF, realizándose la reposición de las citocinas e IM-29 el día 7. Las citocinas solas en medios de SFEM/ACF sirvieron como control en blanco. *P < 0,05 en comparación con el control de citocinas en los respectivos medios. Los datos representan la media ± SD para n = 3.

LaFigura 17Hmuestra el nivel de expansiónex vivode células CD34+ cuando los cultivos se iniciaron con células CD34+ purificadas magnéticamente. Los cultivos de expansión duraron 11 días, realizándose la reposición de los medios ACF, las citocinas y la IM-295,0 pM el día 7.*P <0,0001 en comparación con el control de citocinas. Los datos representan la media ± SEM para n = 6.

LaFigura 18es un esquema que resume el tiempo medio hasta la recuperación de neutrófilos en ensayos clínicos completados que implican injertos de UCB manipulados. El tiempo medio hasta la recuperación de neutrófilos es el principal indicador de éxito del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), que se puede llevar a cabo usando médula ósea (BM), sangre periférica movilizada (mPB, por sus siglas en inglés) o sangre de cordón umbilical (UCB) de un donante compatible como fuente de injerto. El tiempo medio para la recuperación de neutrófilos, indicado mediante flechas continuas individuales en sentido ascendente/descendente hacia la línea temporal posterior al trasplante, que se representa mediante la flecha central derecha, en el caso del HSCT convencional (que se muestra arriba de la línea temporal posterior al trasplante) usando mPB, BM o UCB es de 14, 18 y 25 días, respectivamente. En el caso del HSCT que usa injertos de UCB manipulados (que se muestran debajo de la línea temporal posterior al trasplante), los pacientes recibieron acondicionamiento no mieloablativo/de intensidad reducida (cuadros continuos) o mieloablativo (cuadros discontinuos). El número de pacientes inscritos en cada uno de estos ensayos está representado por el valor N que se muestra en cada cuadro. Los ensayos se pueden clasificar en dos categorías amplias (tal como se muestra en las Tablas 1 y 2):

Número absoluto creciente de células nucleadas totales infundidas:

(a) UCBT de unidad dual (dUCBT, por sus siglas en inglés);

(b) UCBT de una sola unidad combinado con células CD34+ haploidénticas (UCB+Haplo CD34+);

(c) expansiónex vivode una sola unidad de UCB que se trasplantó junto con una unidad no manipulada. Hasta ahora, la expansión clínica se ha realizado usando:

(i) citocinas;

(ii) biorreactores;

(iii) cocultivo con células estromales mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés);

(iv) biomoléculas, tales como Notch;

(v) nicotinamida (NAM, inhibidor de SIRT1);

(vi) stemregenina 1 (SR1, antagonista del receptor de aril hidrocarburo);

(vii) tetraetilenpentamina (TEPA, quelante de cobre).

Mejora de la localización de células infundidas/trasplantadas:

(a) infusión intraósea de médula ósea (infusión i.o.) de una sola unidad de UCB con o sin infusión intravenosa de otra unidad no manipulada;

(b) coadministración intravenosa (i.v.) de una sola UCB junto con MSC (UCB+MSC);

(c) cebado de una unidad de UCB con diversos productos químicos y biomoléculas, tales como:

(i) dimetilprostaglandina E2 (dmPGE2);

(ii) fragmento de complemento 3a (C3a); y

(iii) fucosilación en el contexto de UCBT de unidad dual.

Descripción detallada de la invención

Las referencias bibliográficas mencionadas en la presente memoria descriptiva se enumeran por comodidad de uso en forma de una lista de referencias y se añaden al final de los Ejemplos. Todo el contenido de tales referencias bibliográficas se incorpora al presente documento a modo de referencia.

Definiciones

Por comodidad de uso, determinados términos empleados en la memoria descriptiva, los Ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen aquí.

La expresión "que comprende/n" se define en el presente documento como aquella en la que los diversos componentes, ingredientes, o etapas, se pueden emplear conjuntamente en la práctica de la presente invención. Por consiguiente, la expresión "que comprende/n" abarca las expresiones más restrictivas "que consiste/n esencialmente en" y "que consiste/n en".

El término "halo", cuando se usa en el presente documento, incluye referencias a fluoro, cloro, bromo y yodo.

A menos que se indique otra cosa, el término "arilo", cuando se usa en el presente documento, incluye grupos arilo Ca-16 (tales como Ca-14 o C6-10). Tales grupos pueden ser monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos y tener entre 6 y 16 (por ejemplo, entre 6 y 14 o entre 6 y 10) átomos de carbono en el anillo, en los que al menos un anillo es aromático. El punto de unión de los grupos arilo puede ser a través cualquier átomo del sistema de anillos. Sin embargo, cuando los grupos arilo son bicíclicos o tricíclicos, estos están ligados al resto de la molécula a través de un anillo aromático. Los grupos arilo C6-16 incluyen fenilo, naftilo, fenantracenilo y pirenilo y similares, tales como 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y fluorenilo. Las realizaciones de la invención que se pueden mencionar incluyen aquellas en las que arilo es fenilo, naftilo, fenantracenilo o pirenilo.

A menos que se indique otra cosa, el término "heteroaromático", cuando se usa en el presente documento, incluye sistemas de anillos heteroaromáticos de 6 a 10 elementos que pueden ser monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos y tener de uno a seis (por ejemplo, uno a tres, tal como uno) heteroátomos seleccionados de O, N y S. El sistema de anillos heteroaromático contiene al menos un anillo que es de carácter aromático y cuando el sistema de anillos es bicíclico o tricíclico, el sistema de anillos está unido al resto de la molécula a través de un anillo heteroaromático.

Los grupos heteroaromáticos monocíclicos incluyen, por ejemplo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, triazinilo y similares. Los grupos heteroaromáticos bicíclicos incluyen, por ejemplo, bencimidazolilo, bencisotiazolilo, bencisoxazolilo, benzofuranilo, benzoxazolilo, benzopirazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, indazolilo, indolilo, isoindolilo, purinilo, pirrolo[2,3-6]piridinilo, pirrolo[5,1-6]piridinilo, pirrolo[2,3-c]piridinilo, 4,5,6,7-tetrahidrobencimidazolilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzopirazolilo, tieno[5,1-c]piridinilo y similares, grupos heteroaromáticos bicíclicos que están unidos al resto de la molécula a través de un átomo en el anillo de 5 elementos. Los grupos heteroaromáticos tricíclicos incluyen acridinilo y fenazinilo. Los grupos heterocíclicos pueden estar completamente saturados,

parcialmente insaturados, totalmente aromáticos o parcialmente aromáticos. Los valores de grupos heterocíclicos que se pueden mencionar incluyen 1-azabiciclo[2.2.2]octanilo, bencimidazolilo, bencisotiazolilo, bencisoxazolilo, benzodioxanilo, benzodioxepanilo, benzodioxepinilo, benzodioxolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzo[c]isoxazolidinilo, benzomorfolinilo, 2,1,3-benzoxadiazolilo, benzoxazinilo (incluyendo 3,4-dihidro-2H-1,4-benzoxazinilo), benzoxazolidinilo, benzoxazolilo, benzopirazolilo, benzo[e]pirimidina, 2,1,3-benzotiadiazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzotriazolilo, carbazolilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, 2,3-dihidrobencimidazolilo, 2,3-dihidrobenzo[6]furanilo, 1,3-dihidrobenzo[c]furanilo, 1,3-dihidro-2,1-bencisoxazolilo, 2,3-dihidropirrolo[2,3-6]piridinilo, dioxanilo, hexahidropirimidinilo, imidazo[1,2-a]piridinilo, imidazo[2,3-6]tiazolilo, indazolilo, indolinilo, indolilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiaziolilo, isotiocromanilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, morfolinilo, nafto[1,2-£)]furanilo, naftiridinilo (incluyendo 1,6-naftiridinilo o, particularmente, 1,5-naftiridinilo y 1,8-naftiridinilo), 1,2- o 1,3-oxazinanilo, fenazinilo, fenotiazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolo[2,3-6]piridinilo, pirrolo[5,1-6]piridinilo, pirrolo[2,3-c]piridinilo, quinazolinilo, quinolinilo, quinolizinilo, quinoxalinilo, 4,5,6,7-tetrahidrobencimidazolilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzopirazolilo, 5,6,7,8-tetrahidrobenzo[e]pirimidina, tetrahidroisoquinolinilo (incluyendo 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolinilo y 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolinilo), tetrahidropiranilo, 3,4,5,6-tetrahidropiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidropirimidinilo, 3,4,5,6-tetrahidropirimidinilo, tetrahidroquinolinilo (incluyendo 1,2,3,4-tetrahidroquinolinilo y 5,6,7,8-tetrahidroquinolinilo), tieno[5,1-c]piridinilo, tiocromanilo, 1,3,4-triazolo[2,3-6]pirimidinilo, xantenilo y similares.

Las referencias en el presente documento (en cualquier aspecto o realización de la invención) a compuestos de la Fórmula I incluyen referencias a tales compuestosper se,a tautómeros de tales compuestos, así como a sales o solvatos de tales compuestos.

Las sales que se pueden mencionar incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Tales sales se pueden formar mediante medios convencionales, por ejemplo, mediante la reacción de una forma de ácido libre o de base libre de un compuesto de la Fórmula I con uno o más equivalentes de un ácido o una base adecuados, opcionalmente, en un disolvente o en un medio en el que la sal sea insoluble, seguida de la retirada de dicho disolvente, o dicho medio, usando técnicas convencionales (por ejemplo, al vacío, mediante liofilización o mediante filtración). Las sales también se pueden preparar mediante el intercambio de un contraión de un compuesto de la Fórmula I en forma de una sal con otro contraión, por ejemplo, usando una resina de intercambio iónico adecuada.

Los ejemplos de sales incluyen sales de adición de ácidos derivadas de ácidos minerales y ácidos orgánicos y sales derivadas de metales, tales como sodio, magnesio o, preferentemente, potasio y calcio.

Los ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácidos formadas con ácidos acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico y aril sulfónico (por ejemplo, bencenosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico y p-toluenosulfónico) y ácidos ascórbico (por ejemplo, L-ascórbico), L-aspártico, benzoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+) alcanfórico, alcanfor-sulfónico, (+)-(1S)-alcanfor-10-sulfónico, cáprico, caproico, caprílico, cinámico, cítrico, ciclámico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-disulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, glucoheptónico, glucónico (por ejemplo, D-glucónico), glucurónico (por ejemplo, D-glucurónico), glutámico (por ejemplo, L-glutámico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, isetiónico, láctico (por ejemplo, (+)-L-láctico y (±)-DL-láctico), lactobiónico, maleico, málico (por ejemplo, (-)-L-málico), malónico, (±)-DL-mandélico, metafosfórico, metanosulfónico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiónico, L-piroglutámico, salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tánico, tartárico (por ejemplo (+) -L-tartárico), tiociánico, undecilénico y valérico.

Los ejemplos particulares de sales son sales derivadas de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico; de ácidos orgánicos, tales como ácidos tartárico, acético, cítrico, mélico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y aril sulfónico; y de metales, tales como sodio, magnesio o, preferentemente, potasio y calcio.

Tal como se ha mencionado anteriormente, también están incluidos en la Fórmula I cualesquiera solvatos de los compuestos y sus sales. Los solvatos preferidos son solvatos formados mediante la incorporación en la estructura de estado sólido (por ejemplo, estructura cristalina) de los compuestos de la invención de moléculas de un disolvente no tóxico farmacéuticamente aceptable (denominado en lo sucesivo disolvente solvatante). Los ejemplos de tales disolventes incluyen agua, alcoholes (tales como etanol, isopropanol y butanol) y dimetilsulfóxido. Los solvatos se pueden preparar mediante la recristalización de los compuestos de la invención con un disolvente o una mezcla de disolventes que contenga el disolvente solvatante. Se puede determinar si se ha formado o no un solvato en un caso determinado sometiendo los cristales del compuesto a análisis usando técnicas convencionales y bien conocidas, tales como el análisis termogravimétrico (TGA, por sus siglas en inglés), la calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) y la cristalografía de rayos X.

Los solvatos pueden ser solvatos estequiométricos o no estequiométricos. Los solvatos particularmente preferidos son los hidratos y los ejemplos de hidratos incluyen hemihidratos, monohidratos y dihidratos.

Para obtener un análisis más detallado de los solvatos y los métodos usados para producirlos y caracterizarlos, véase Brynet al.,Solid-State Chemistry of Drugs, Segunda Edición, publicado por SSCI, Inc of West Lafayette, IN, EE. UU., 1999, ISBN 0-967-06710-3.

Los compuestos de la Fórmula I, así como las sales farmacéuticamente aceptables, los solvatos y los derivados farmacéuticamente funcionales de tales compuestos son, por razones de brevedad, se denominan conjuntamente en lo sucesivo en el presente documento "compuestos de la Fórmula I".

Los compuestos de la Fórmula I pueden contener enlaces dobles y, por tanto, pueden existir como los isómeros geométricosE(entgegen) yZ(zusammen) sobre cada enlace doble individual. La totalidad de isómeros y mezclas de los mismos se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los compuestos de la Fórmula I pueden existir como regioisómeros y también pueden presentar tautomerismo. Todas las formas tautoméricas y mezclas de las mismas se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los compuestos de la Fórmula I pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos y, por lo tanto, pueden presentar isomería óptica y/o diastereoisomería. Los diastereoisómeros se pueden separar usando técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía o cristalización fraccionada. Los diversos estereoisómeros se pueden aislar mediante separación de una mezcla racémica o de otro tipo de los compuestos usando métodos técnicas convencionales, por ejemplo, cristalización fraccionada o HPLC. Como alternativa, los isómeros ópticos deseados se pueden preparar mediante la reacción de los materiales de partida ópticamente activos adecuados en condiciones que no causen racemización o epimerización (es decir, un método de "combinación quiral"), mediante la reacción del material de partida adecuado con un "adyuvante quiral" que, posteriormente, se puede retirar en una fase adecuada, mediante la derivatización (es decir, una resolución, incluyendo una resolución dinámica), por ejemplo, con un ácido homoquiral, seguida de la separación de los derivados diastereoisómeros por medios convencionales, tales como cromatografía, o mediante la reacción con un reactivo quiral o catalizador quiral adecuado, todo ello en condiciones conocidas por la persona experta. Todos los estereoisómeros y las mezclas de los mismos se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Las realizaciones adicionales de la invención que se pueden mencionar incluyen aquellas en las que el compuesto de la Fórmula I está marcado isotópicamente. Sin embargo, otras realizaciones particulares de la invención que se pueden mencionar incluyen aquellas en las que el compuesto de la Fórmula I no está marcado isotópicamente.

La expresión "marcado isotópicamente", cuando se usa en el presente documento, incluye referencias a compuestos de la Fórmula I en los que hay un isótopo no natural (o una distribución no natural de isótopos) en una o más posiciones en el compuesto. Aquellos expertos en la materia entenderán que las referencias en el presente documento a "una o más posiciones en el compuesto" se refieren a uno o más de los átomos del compuesto de la Fórmula I. Por tanto, la expresión "marcado isotópicamente" incluye referencias a compuestos de la Fórmula I que están enriquecidos isotópicamente en una o más posiciones en el compuesto.

El marcado o enriquecimiento isotópico del compuesto de la Fórmula I puede ser con un isótopo radiactivo o no radiactivo de cualquiera de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, flúor, cloro, bromo y/o yodo. Los isótopos particulares que se pueden mencionar a este respecto incluyen 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 35S, 18F, 37Cl, 77Br, 82Br y 125I.

Cuando el compuesto de la Fórmula I está marcado o enriquecido con un isótopo radiactivo o no radiactivo, los compuestos de la Fórmula I que se pueden mencionar incluyen aquellos en los que al menos un átomo del compuesto muestra una distribución isotópica en la que un isótopo radiactivo o no radiactivo del átomo en cuestión está presente en niveles de al menos el 10% (por ejemplo, del 10% al 5.000%, particularmente del 50% al 1.000 % y más particularmente del 100%al 500 %) por encima del nivel natural de ese isótopo radiactivo o no radiactivo.

Se pueden preparar otros compuestos de la Fórmula I de conformidad con técnicas que son bien conocidas por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento en la sección de Ejemplos.

Los sustituyentes, tales como R(i) 2, en los compuestos finales de la Fórmula I (o los precursores de los mismos y otros productos intermedios relevantes) se pueden modificar una o más veces, después o durante los procesos descritos en lo sucesivo en el presente documento por medio de métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Los ejemplos de tales métodos incluyen sustituciones, reducciones (por ejemplo, reducciones de enlaces carbonilo en presencia de agentes reductores adecuados y, si es necesario, quimioselectivos, tales como LiBH4 o NaBH4), oxidaciones, alquilaciones, acilaciones, hidrólisis, esterificaciones y eterificaciones. Los grupos precursores se pueden cambiar a un grupo de tal tipo diferente o a los grupos definidos en la Fórmula I, en cualquier momento durante la secuencia de reacción.

Los compuestos de la invención se pueden aislar a partir de sus mezclas de reacción usando técnicas convencionales (por ejemplo, recristalización, cromatografía en columna, HPLC preparativa, etc.).

En los procesos descritos en lo sucesivo en el presente documento, los grupos funcionales de compuestos intermedios pueden necesitar protección mediante grupos protectores.

La protección y desprotección de grupos funcionales puede tener lugar antes o después de una reacción en los esquemas mencionados anteriormente.

Los grupos protectores se pueden retirar de conformidad con técnicas que son bien conocidas por aquellos expertos en la materia y tal como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Por ejemplo, los compuestos/productos intermedios protegidos descritos en lo sucesivo en el presente documento se pueden convertir químicamente en compuestos no protegidos usando técnicas de desprotección convencionales.

El tipo de química implicada dictará la necesidad y el tipo de grupos protectores, así como la secuencia para el logro de la síntesis.

El uso de grupos protectores se describe completamente en "Protective Groups in Organic Chemistry", editado por J W F McOmie, Plenum Press (1973), y "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a edición, T. W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "grupos funcionales" significa, en el caso de grupos funcionales desprotegidos, hidroxi-, tiolo-, función amino, ácido carboxílico y, en el caso de grupos funcionales protegidos, alcoxi inferior, N-, O-, S-acetilo y éster de ácido carboxílico.

El término "tratamiento", tal como se usa en el contexto de la invención, se refiere a tratamiento profiláctico, de mejora, terapéutico o curativo.

El término "sujeto" se define en el presente documento como vertebrado, particularmente mamífero, más particularmente ser humano. Con fines de investigación, el sujeto puede ser particularmente al menos un modelo animal, por ejemplo, un ratón, una rata y similares. Por ejemplo, en el tratamiento de trastornos sanguíneos malignos y benignos, el sujeto puede ser un ser humano con leucemia mieloide aguda.

Una persona experta en la materia apreciará que la presente invención se puede poner en práctica sin experimentación indebida de acuerdo con el método proporcionado en el presente documento. Los métodos, las técnicas y los productos químicos son tal como se describen en las referencias proporcionadas o en los protocolos de los libros de texto convencionales de biotecnología y biología molecular.

De acuerdo con un aspecto preferido, la presente invención proporciona un método para la expansiónex vivode un componente de las células nucleadas totales y/o un subconjunto de células madre y progenitoras hematopoyéticas a CD45+CD34+ de una muestra de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada, que comprende las etapas de:

(ii) poner en contacto la/s célula/s de la etapa (i) con una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol,

en donde la al menos una molécula pequeña a base de azol se representa mediante la Fórmula (I),

en donde:

X representa NR4 u O, donde R4 es H o metilo;

Ri representa fenilo o piridinilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de Cl, Br, F y metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con uno o más grupos seleccionados de F]).

R2 representa fenilo, piridilo o dihidropiranilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de Br, Cl, F o metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con uno o más grupos seleccionados de F]).

R3 representa H o naftilo, grupo que está sin sustituir o sustituido con uno o más grupos seleccionados de CI, F y OR5, donde R5 es H, o metilo o

sales y solvatos de los mismos.

Aunque existen beneficios en el uso de muestras no enriquecidas, el método de expansión también puede usar una fracción de células CD34+ enriquecida/preseleccionada de muestras de sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica cuando se usan para iniciar cultivos en presencia de al menos una molécula pequeña a base de azol. En otra realización preferida de la invención, la al menos una molécula pequeña a base de azol se selecciona del grupo:

(i) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(ii) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(m-tolil)-1H-imidazol-5-il]piridina;

(iii) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(iv) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(v) 4-[2-(1-bromonaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(vi) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-[3-(trifluorometil)fenil]-1H-imidazol-5-il]piridina;

(vii) 2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(piridin-4-il)-5-(m-tolil)oxazol;

(viii) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol;

(ix) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(6-metoxinaftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol; y

(x) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol;

(xi) 4-(4(5)-(4-fluorofenil)-2-(7-metoxinaftalen-2-il)-1H-imidazol-5(4)-il)piridina;

(xii) 4-[4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; y

(xiii) 4-[4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il]piridina.

En otra realización preferida de la invención, la al menos una molécula pequeña a base de azol se selecciona del grupo:

(ii) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(m-tolil)-1H-imidazol-5-il]piridina;

(iii) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(iv) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina;

(vi) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-[3-(trifluorometil)fenil]-1H-imidazol-5-il]piridina; y

(vii) 2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(piridin-4-il)-5-(m-tolil)oxazol.

En otra realización preferida de la invención, las células madre y progenitoras hematopoyéticas se expanden en presencia de al menos una citocina seleccionada del grupo que comprende el factor de células madre (SCF), la trombopoyetina (TPO), el ligando de tirosina cinasa 3 relacionado con Fms (FLT-3L), la interleucina 3 (IL-3), la interleucina 6 (IL-6), el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF, por sus siglas en inglés) y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2). Más preferentemente, la al menos una citocina se selecciona del grupo que comprende el factor de células madre (SCF), la trombopoyetina (TPO), el ligando de tirosina cinasa 3 relacionado con Fms (FLT-3L, por sus siglas en inglés) y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2, por sus siglas en inglés). Preferentemente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas se expanden en presencia de al menos dos, al menos tres o los cuatro de SCF, TPO, FLT-3L y IGFBP-2. Preferentemente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas se expanden en presencia de SCF, TPO, FLT-3L y IGFBP-2. Más preferentemente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas se expanden en presencia de 100 ng/ml de SCF, 100 ng/ml de TPO, 50 ng/ml de FLT-3L y 20 ng/ml de IGFBP-2.

En otra realización preferida de la invención, el método comprende cultivar la/s célula/s mononuclear/es de la sangre del cordón umbilical con la al menos una molécula pequeña a base de azol durante un período de al menos 9 días. Preferentemente, el método comprende cultivar la/s célula/s mononuclear/es de la sangre del cordón umbilical con la al menos una molécula pequeña a base de azol durante un período de aproximadamente 11 días. Se entenderá que el período de cultivo puede variar dependiendo, por ejemplo, de la muestra de partida particular de sangre del cordón umbilical, la tasa de proliferación de las células o el número de células necesarias para el injerto. Se entenderá que la médula ósea y/o la sangre periférica movilizada, que también contienen células HSPC CD45+CD34+, también se pueden expandir de acuerdo con el método de la invención.

En otra realización preferida de la invención, las citocinas se añaden al cultivo el día 0 y/o el día 7. Los inventores hallaron que el día 7 era el momento en el que el cultivo, generalmente, requería la adición de medios nuevos debido a la expansión celular, por lo que se suplementaban citocinas y pequeñas moléculas a base de azol, si se deseaba, al mismo tiempo. Se entenderá que el requerimiento de reposición de los medios puede variar alrededor del día 7, tal como el día 6 o el día 8. Los medios de cultivo se pueden suplementar, por ejemplo, con un volumen igual de medios nuevos.

En otra realización preferida de la invención, la al menos una molécula pequeña a base de azol se añade al cultivo el día 0 y/o el día 7. Se halló que la expansión óptima de las células se producía cuando se añadían pequeñas moléculas a base de azol el día 0 y cuando se suplementan los medios alrededor del día 7, aunque también se obtenía una expansión significativa cuando las moléculas pequeñas se añadían solo en el momento 0 (por ejemplo, véase la Figura 12). Parece que, si la molécula pequeña se añade el día 0, alrededor del día 7 la cantidad de células producidas hace que los medios se agoten y sea necesario suplementarlos para lograr una expansión óptima.

En otra realización preferida de la invención, el método comprende, además, la etapa de extraer las células después de aproximadamente 7 a 11 días en cultivo. Preferentemente, las células se extraen alrededor del día 10 u 11, cuando se observa una expansión óptima.

En otra realización preferida de la invención, las células progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-están expandidas.

En otra realización preferida de la invención, las células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) están expandidas.

En otra realización preferida de la invención, las células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) están expandidas.

En otra realización preferida de la invención, las células madre y progenitoras hematopoyéticas expandidas poseen un cariotipo normal y no presentan ningún signo de transformación leucémica.

En otra realización preferida de la invención, se aísla una fracción CD34- de glóbulos blancos nucleados y se retiene para su uso en el trasplante junto con las células expandidasex vivoen sujetos que lo necesiten. Se entiende que la fracción CD34- comprende células linfoides que pueden, en caso de cotrasplante, reducir la probabilidad de rechazo o mejorar el procedimiento del injerto de las células expandidasex vivotrasplantadas, particularmente en seres humanos.

En otro aspecto de la invención, el método comprende, además, una etapa de diferenciar al menos una proporción de las células progenitoras hematopoyéticas y/o células madre hematopoyéticas expandidas en linfocitos citolíticos naturales. Tales linfocitos citolíticos naturales se pueden usar para tratar adicionalmente a pacientes con cáncer que han sido tratados con un injerto de células progenitoras hematopoyéticas y/o células madre hematopoyéticas expandidas. Los linfocitos citolíticos naturales se pueden usar en la profilaxis de pacientes con riesgo de recaída después del tratamiento o en el tratamiento de pacientes que han recaído después del tratamiento con injerto.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una combinación y/o un kit que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol de acuerdo con cualquier aspecto de la invención; y al menos una citocina.

En una realización preferida de la combinación y/o el kit, la al menos una citocina se selecciona del grupo que comprende SCF, TPO, FLT-3L e IGFBP-2 para su uso en la expansiónex vivodel componente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical.

En otra realización preferida, la al menos una molécula pequeña a base de azol expande células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+, y/o células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ y/o células progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+ CD38-CD45RA-.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol definida de acuerdo con cualquier aspecto de la invención para su uso en la expansiónex vivodel componente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical. Se entenderá que la médula ósea y/o la sangre periférica movilizada, que también contienen células HSPC CD45+CD34+, también se pueden expandir mediante los compuestos de la invención.

Las células obtenidas mediante un método de acuerdo con cualquier realización de la invención se pueden usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que requiere un trasplante de células madre hematopoyéticas.

El medicamento puede comprender las células expandidasex vivoy las células linfoides CD34- retenidas.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de al menos una molécula pequeña a base de azol, tal como se define en el presente documento, en la expansiónex vivodel componente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical. Se entenderá que la médula ósea y/o la sangre periférica movilizada, que también contienen HSPC CD45+CD34+, también se pueden expandir mediante los compuestos de la invención.

En una realización preferida, la al menos una molécula pequeña a base de azol expande células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+, y/o células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ y/o células progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+.

La al menos una molécula pequeña a base de azol, tal como se define en el presente documento, se puede usar para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un paciente que necesita expansión de sus células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+, y/o células madre hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ y/o células progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+CD38-CD45RA-.

Un método de tratamiento puede comprender administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad eficaz de células madre y progenitoras hematopoyéticas obtenidas mediante un método de acuerdo con cualquier aspecto de la invención. En una realización preferida, el tratamiento comprende también administrar una cantidad eficaz de células linfoides CD34- al sujeto.

Un método de tratamiento puede comprender administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad eficaz de una pequeña molécula a base de azol de acuerdo con cualquier aspecto de la invención. El método puede comprender, por ejemplo, la administración intravenosa. Los pacientes que necesitan tal tratamiento pueden tener un recuento bajo de glóbulos sanguíneos (posterior a la quimioterapia o irradiación corporal total) o una enfermedad de la médula ósea.

El sujeto puede tener un trastorno hematopoyético seleccionado de leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, trastornos mieloproliferativos, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple, linfoma no-hodgkiniano, enfermedad de Hodgkin, anemia aplásica, aplasia pura de la serie roja, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia de Fanconi, talasemia mayor, anemia de células falciformes, inmunodeficiencia combinada grave, síndrome de Wiskott-Aldrich, linfohistiocitosis hemofagocítica y enzimopatía congénita.

EJEMPLO 1

MÉTODOS

Extracción, procesamiento, descongelación y preparación de placas de Petri de UCB

La UCB se obtuvo a través del Singapore Cord Blood Bank (SCBB), de unidades donadas que no cumplen con los criterios para el almacenamiento en bancos clínicos. Se obtuvo el consentimiento previo de las madres donantes y del Research Advisory Ethics Committee del SCBB, junto con las Institutional Review Boards de la National University of Singapore (NUS), y el Singapore General Hospita (SGH) aprobó el uso de las muestras. Se aislaron células mononucleares (MNC) de la<u>C<b>nueva mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Histopaque™ Premium (GE Healthcare, Reino Unido). Las MNC de UCB contadas se crioconservaron en plasma autólogo al 90 % v/v con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% v/v (Sigma Aldrich, EE. UU.) para su uso posterior. Un breve resumen del método se muestra en la Figura 3. Las MNC de UCB se descongelaron usando seroalbúmina humana (25 % v/v) (Health Sciences Authority, Singapur) y dextrano 40 (75 % v/v) (Hospira, EE. UU.). Las MNC de UCB se cultivaron a una densidad óptima determinada empíricamente de 4,0*105 células/ml sin ningún enriquecimiento de células madre dependiente de marcador de superficie celular en medios de expansión libres de suero (SFEM) o medios libres de componentes animales (ACF) StemSpan™ (STEMCELL Technologies, Canadá) suplementados con una combinación de citocinas humanas de 100 ng/ml de factor de células madre (SCF) (PeproTech, EE. UU.) y trombopoyetina (TPO) (PeproTech, EE. UU.); 50 ng/ml de ligando de FLT-3 (FLT-3L) (PeproTech, EE. UU.); y 20 ng/ml de proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2) (R&D Systems, EE. UU.). Se analizaron diversas combinaciones de citocinas (en las respectivas concentraciones descritas anteriormente) en las MNC de UCB con y sin IM-295|jMpara determinar sus efectos sobre la expansión de TNC y HSPC durante 11 días en medios ACF. En determinados experimentos, los cultivos celulares se iniciaron con poblaciones purificadas, tales como células progenitoras tempranas (CD45+CD34+CD38-) o tardías (CD45+CD34+CD38+), a una concentración óptima de preparación en placas de Petri de 5,0*104 células/ml o 2,0*10® células/ml, respectivamente. Tales poblaciones puras se obtuvieron mediante el marcado de las MNC de UCB en estado de congelación-descongelación y no enriquecidas usando anticuerpos conjugados con fluorescencia, seguido de una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). Las pequeñas moléculas a base de azol sustituidas disueltas en DMSO se añadieron a los cultivos a una concentración óptima determinada empíricamente de 5,0j M.Los cultivos de MNC de UCB desprovistos de moléculas pequeñas, pero suplementados con citocinas, sirvieron como control, mientras que los cultivos suplementados con citocinas y DMSO sirvieron como control de vehículo.

Los cultivos celulares en experimentosin vitrose realizaron en placas de 6 o 24 pocillos (BD Falcon, EE. UU.), mientras que el cultivo en los estudios de trasplantesin vivose llevó a cabo en matraces T-175 (Corning, EE. UU.). Los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5 % a 37 °C durante el tiempo requerido. En la evaluación de la expansión de la UCB y la experimentación con animales, se usó un protocolo de expansión establecido de 10 a 11 días que incluía la reposición de citocinas y moléculas pequeñas el día 7. Al finalizar la incubación, las células se aspiraron del material de cultivo y se enjuagaron posteriormente con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (Hyclone, EE. UU.). Las células extraídas se contaron usando un contador de células de hematología diferencial automatizado (analizador de hematología diferencia COULTER® AcT™, Beckman Coulter Inc, EE. UU.) y se resuspendieron en DPBS para su posterior análisisin vitroo trasplante en ratones.

Ensayos de unidades formadoras de colonias

Se evaluaron las unidades formadoras de colonias (CFU) de granulocitos y monocitos (GM) de las MNC de UCB recién descongeladas o de células expandidas de 11 días de los cultivos celulares mencionados. Se cultivaron duplicados de MNC de UCB recién descongeladas (5.000 y 10.000 células) y células expandidas (1.000 y 5.000 células) en placas de Petri de 35 mm (BD Falcon, EE. UU.) en 1,1 ml de medios completos de células madre hematopoyéticas (HSC)-CFU con eritropoyetina (EPO) (Miltenyi Biotec, Alemania) sin ninguna manipulación adicional de los medios. Después de 14-16 días en cultivo en un entorno humidificado a 37 °C y con CO2 al 5%, las colonias se calificaron y se fotografiaron usando un microscopio Olympus SZ61 equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD, por sus siglas en inglés) (Olympus Europa GmbH, Alemania).

Mantenimiento, trasplante y procedimientos de los animales

Los estudios de xenotrasplantes fueron aprobados por el Singapore Health Services (SingHealth) Institutional Animal Care and Use Committee. NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ, más conocidos como ratones gamma con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) y diabéticos no obesos (NOD, por sus siglas en inglés) (NSG), adquiridos a través de Jackson Laboratory (Bar Harbor, EE. UU.), se alojaron en jaulas de seis del mismo sexo en el SingHealth Experimental Medicine Centre. Se podía acceder a alimentos y agua esterilizados a libre demanda. Después de la aclimatación y la reproducción exitosa, los ratones de 8 a 12 semanas irradiados subletalmente (240 cGy) se dividieron aleatoriamente en cinco grupos experimentales para la administración en la vena de la cola de: (i) solución salina; (ii) MNC de UCB no expandida; (iii) MNC de UCB expandida con citocinas en STEM StemSpan™ o ACF StemSpan™ (cultivos de expansión de control); (iv) IM-29 y MNC de UCB expandida con citocinas en STEM StemSpan™ o ACF StemSpan™. A fin de investigar la cinética del procedimiento del injerto de células humanasin vivo,se trasplantaron UCB expandidas (± IM-29 en SFEM o ACF) a una dosis equivalente empíricamente optimizada de 2,5*107 células/kg, 5,0*107 células/kg o 10,0*107 células/kg, mientras que la UCB no expandida se trasplantó a una dosis absoluta de 2,5*107 células/kg, 5,0 * 107 células/kg o 10,0 * 107 células/kg. Se administraron células CD45+ humanas purificadas (según el protocolo del fabricante) en columna (Miltenyi Biotec, Alemania) y marcadas con anticuerpos magnéticos obtenidas de la médula ósea de receptores NSGprimariosdespués de 20 semanas de trasplante a receptores de NSGsecundariosa través de la inyección en la vena de la cola para los siguientes grupos experimentales: (i) MNC de UCB no expandida; (ii) MNC de UCB expandida con citocinas y (iii) IM-29 y MNC de UCB expandida con citocinas en dosis de trasplante de 1*10® a 2*10® células/ratón.

Todos los ratones recibieron antibióticos y fármacos inmunosupresores para reducir al mínimo la infección bacteriana y reducir las posibilidades de enfermedad injerto contra huésped (GVHD), respectivamente. En resumen, para todos los grupos experimentales, la terapia inmunosupresora con ciclosporina (Novartis, EE. UU.) comenzó el día después de la inoculación de células experimentales con una dosificación de 10mg/kg durante los dos primeros días consecutivos y, a continuación, 15 mg/kg en días alternos durante tres dosis más (cinco dosis en total). Se administró agua potable acidificada (pH=2,2) que contenía 1,1 g/l de trisulfato de neomicina (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y 0,1 g/l de sulfato de polimicina B (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 7 días antes del trasplante y otros 23 días después del trasplante para reducir al mínimo la infección bacteriana. La evaluación de la reconstitución de células humanas después de dos o tres semanas de trasplante se realizó usando muestras de sangre extraídas a través de la vena submandibular. Los ratones se sacrificaron al final de la semana 2 o 20 para extraer la médula ósea y analizar la reconstitución de múltiples linajes humanos.

1®

Análisis de citometría de flujo o clasificación celular

Todos los datos se adquirieron usando el citómetro de flujo Cytomics FC500 (Beckman Coulter, Inc., EE. UU.) o BD™ LSR II (Becton Dickinson, EE. UU.) y se obtuvieron al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos adquiridos se analizaron posteriormente con el CXP Analysis Software (Beckman Coulter, Inc., EE. UU.) o BD FACSDiva™ Software 8.0 (Beckton Dickson, EE. UU.). BD FACSAria™ III (Beckton Dickson, EE. UU.) se usó para clasificar los progenitores tempranos (CD45+CD34+CD38-) o tardíos (CD45+CD34+CD38+) deMn Cde UCB que se marcaron con los anticuerpos monoclonales estériles conjugados con fluorescencia adecuados (Figura 17G) que se describen a continuación. Se realizó una titulación para identificar la tinción óptima de anticuerpos. Se usaron controles de isotipo con el fin de detectar la unión de anticuerpos no específicos durante el análisis.

La CD34 conjugada con ficoeritrina (PE, por sus siglas en inglés), la CD38 conjugada con aloficocianina (APC, por sus siglas en inglés) y la CD45 conjugada con ficoeritrina-Cy7 (PE-Cy7, por sus siglas en inglés) se usaron para el análisis fenotípico o la clasificación estéril de las células progenitoras hematopoyéticas (HPC). Se usaron CD45RA-V450, CD90-FITC (isotiocianato de fluoresceína) y CD49f-PerCP-Cy5.5 en combinación con anticuerpos dHPC para sondear poblaciones raras de HSPC. Los progenitores del linaje linfoide y las células diferenciadas se fenotiparon usando CD7-FITC, CD3-BV605, CD19-BUV395, CD56-V450 y CD138-PerCP-Cy5.5. Los progenitores del linaje mieloide y las células diferenciadas se fenotiparon usando CD33-PE-Cy7, CD41a-FITC, CD15-BUV395, CD13-BV421 y CD61-PerCP-Cy5.5. En todos estos estudios de expresión fenotípica, las células vivas y muertas se distinguieron usando 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Todos los anticuerpos se compraron en BD Pharmingen (EE. UU.).

La Anexina-V-FITC (Beckman Coulter, Inc., EE. UU.), la 7-AAD (Beckman Coulter, Inc., EE. UU.) y la CD45-PE-Cy7 se usaron para el análisis de viabilidad de las células CD45+.

El análisis del quimerismo humano en la sangre periférica de los ratones se llevó a cabo el día 14, 21, 42, 63, 84, 105, 126 o 196 después del trasplante de los injertos expandidos y no expandidos. Aproximadamente 190 pl de cada muestra de sangre se sometieron a lisis de glóbulos rojos dependiente de cloruro de amonio (formulación interna), seguida de bloqueo usando reactivos de FcR de ratón y humano para reducir al mínimo la unión de anticuerpos no específicos. Los glóbulos blancos restantes en las muestras se tiñeron con CD45-APC antihumana, CD3-PE/FITC, CD19-VioBlue/PE-Vio615, CD33-PE-Vio770, CD15-PerCP-Vio770, CD34-PE y CD45-FITC/VioGreen antirratón. Todos los anticuerpos y reactivos de bloqueo se compraron en Miltenyi Biotec (Alemania).

Se extrajo la médula ósea de un ratón individual de los fémures y las tibias usando medios RPMI (Invitrogen, EE. UU.) suplementados con suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en la semana 2 o 20 después del trasplante. Se usó cloruro de amonio para lisar los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) en todas las muestras. Se usó DPBS (Hyclone, EE.u U.)con FBS al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para lavar y resuspender las células nucleadas para un análisis adicional de marcadores/antígenos de la superficie celular humana usando anticuerpos conjugados fluorescentes adecuados y un citómetro de flujo. En resumen, los glóbulos blancos restantes en las muestras de médula ósea se tiñeron con CD45-APC antihumana y CD45-FITC/VioGreen antirratón para diferenciar las células humanas y murinas. Se usó CD34-PE humana para analizar células progenitoras humanas. Las células mieloides humanas se analizaron mediante tinción con CD71-VioBlue, CD33-PE-Vio770, CD15-PerCP-Vio770, CD13-PE-Vio615, CD66b-APC-Vio770 y CD41a-VioGreen. Las células linfoides humanas se analizaron mediante tinción con CD3-VioGreen, CD4-VioBlue, CD7-APC-Vio770, CD8-PerCP-Vio700, CD19-PE-Vio615 y CD56-PE-Vio770. Todos los anticuerpos y reactivos de bloqueo se compraron en Miltenyi Biotec (Alemania).

Al finalizar la tinción de anticuerpos, todas las células marcadas se lavaron con DPBS (Hyclone, EE. UU.) y, posteriormente, se resuspendieron en DPBS (Hyclone, EE. UU.) con FBS al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para un análisis basado en citómetro de flujo.

Hibridaciónin s itupor fluorescencia (FISH)

Las muestras de MNC de UCB se fijaron con fijador de Carnoy modificado (Leica Biosystems, Alemania) y se colocaron en portaobjetos de vidrio para microscopio y, a continuación, se deshidrataron a través de una serie de etanol (Sigma-Aldrich, EE. UU.) (70 %, 85 % y 100 %) durante 2 minutos, seguido de secado al aire.

Los ensayos de FISH se llevaron a cabo usando un panel de sondas (Abbott Molecular, EE. UU.) que comprende las sondas de translocación de fusión dual LSI D7S486 SpectrumOrange™/CEP 7 SpectrumGreen™, CEP 8 SpectrumAqua™/LSI MYC SpectrumOrange™, LSI CDKN2A SpectrumOrange™/CEP 9 SpectrumGreen™, LSI ABL1 SpectrumOrange™/BCR SpectrumGreen™, la sonda separable de doble color LSI MLL, la sonda de translocación de doble color de señal adicional LSI ETV6 SpectrumGreen™/RUNX1 SpectrumOrange™ y el conjunto de sonda LSI TP53 SpectrumOrange™/CEP 17 SpectrumGreen™. Las sondas de FISH se aplicaron a las células fijadas y se codesnaturalizaron a 75 °C, seguido de una hibridación durante la noche a 37 °C. Se realizaron lavados y el portaobjetos se contratiñó con una solución antidecoloración DAPI (Vectashield, Vector Laboratories, EE. UU.) y se analizó usando un microscopio de epifluorescencia (Leica, Alemania).

Se enumeraron señales de 100 núcleos no superpuestos para detectar la pérdida de LSI D7S486, trisomía 8, pérdida de CDKN2A, translocación que implica ABL1 y BCR, separación de MLL, translocación que implica ETV6 y RUNX1 y pérdida de TP53. Un patrón de señal normal se define como dos copias de D7S486 y CEP7, dos copias de CEP 8 y MYC, dos copias de CDKN2A y CEP 9, ausencia de señales de fusión de ABL1/BCR, señales de doble fusión de MLL intactas, ausencia de señal de fusión de ETV6/RUNX1 y dos copias de TP53.

Citogenética/cariotipado

En el cariotipado, se usaron las MNC de UCB no cultivadas y las células cultivadas del día 10 en medios ACF StemSpan™ que contenían una combinación de citocinas convencional en presencia o ausencia del compuesto principal IM-29. A fin de estudiar el cariotipo, las células MNC de UCB se cultivaron adicionalmente durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 5% mantenida a 37 °C usando medios RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) suplementados con suero bovino fetal (Sigma, EE. UU.), L-glutamina (Gibco, EE. UU.) y antibióticos (Gibco, EE. UU.). A continuación, se extrajeron los cultivos y se les colocaron bandas G de acuerdo con el protocolo estándar de laboratorio clínico. Se analizaron veinte células y se describió el cariotipo de conformidad con el International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2016).

Citoquímica de leucocitos

Se tiñeron frotis celulares de células MNC de UCB recién descongeladas o cultivadas (± 5,0 j M) con tinción de May-Grünwald Giemsa (MGG), Sudán Negro B, ácido peryódico-Schiff (PAS) y mieloperoxidasa (p-fenilendiamina y catecol) usando protocolos estándar de laboratorio clínico y se obtuvieron imágenes usando un microscopio vertical. Todas las tinciones se obtuvieron a través de Sigma-Aldrich, EE. UU.

Análisis estadístico

Los resultados se indican como media ± error estándar de la media (SEM, por sus siglas en inglés) o media ± desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) para el valor n especificado indicado en la breve descripción de las figuras. La importancia de la diferencia entre dos grupos se determinó mediante la prueba de la t de Student de dos colas y el valor dePse indica en la breve descripción de las figuras. El procesamiento de datos y los análisis estadísticos se realizaron con OriginPro® 9.1 (OriginPro, EE. UU.), GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., EE. UU.) y Microsoft Office Excel (Microsoft, EE. UU.).

EJEMPLO 2

Etapas principales del método

En un ejemplo de la invención, las principales etapas implicadas en el método de expansión de HSPC a partir de MNC de UCB en estado de congelación-descongelación usando IM-29 se muestran en la Figura 2:

(i) procesar UCB nueva usando la centrifugación dependiente de la densidad para aislar la fracción mononucleada (MNC) que se congela a -180 °C para su futura expansión;

(ii) descongelar y cultivar MNC de UCB en un medio de cultivo definido que contiene una combinación de citocinas de SCF, TPO, FLT-3L y IGFBP-2;

(iii) añadir IM-29 a una concentración final de 5,0<j>M;

(iv) incubar las células en una incubadora humidificada mantenida a 37 °C y con CO2 al 5 %;

(v) el día 3: controlar la viabilidad de las células leucocitarias (WBC, por sus siglas en inglés) que expresan las CD45. Las HSPC es un subconjunto de células CD45;

(vi) el día 7: reponer (recargar) los medios de proliferación, las citocinas y la IM-29;

(vii) el día 10/11: extraer células para la evaluación de la expansión usando el ensayo funcional y fenotípicoin vitroy el trasplantein vivoa ratones inmunodeficientes para controlar la capacidad de repoblación.

Los cambios en la composición celular durante la expansión se muestran en la Figura 5.

EJEMPLO 3

Pequeñas moléculas derivadas del compuesto SB203580

La biblioteca de moléculas pequeñas consistía en varios análogos, todos los cuales se derivaron del compuesto precursor SB203580 (Figura 6D), que es un inhibidor conocido de MAPK p38 (proteína cinasa activada por mitógenos), con una actividad óptima a una concentración de trabajo de 5 a 10<j>M. El compuesto IM-29 con la estructura química que se muestra en la Figura 6A es el más eficaz de los analizados. El IM-04 con la estructura química que se muestra en la Figura 6B es el segundo compuesto más eficaz. Los análogos estructurales de IM-29 e IM-04 que dieron un efecto subóptimo se muestran en la Figura 6C. En este estudio, se generaron un total de cuarenta análogos de SB203580, que se muestran en la Figura 6E y se dividen, en términos generales, en cuatro grupos, basándose en la estructura y la modificación química. El grupo 1 de la Figura 6E examinó la variación de los sustituyentes en la posición C-2 del imidazol, al tiempo que se retenía el resto adyacente de piridin-4-il/3-tolilo o piridin-4-il/3-(trifluorometil)fenilo en las posiciones C-4 y C-5 del imidazol, lo que dio lugar a un total de seis análogos. El segundo mejor compuesto IM-04 es miembro del Grupo 1. Se generaron trece análogos diferentes más en el Grupo 2 (tal como se muestra en la Figura 6E), donde el sustituyente de piridin-4-ilo en la posición C-5 se reemplazó con un sustituyente de piran-4-ilo, al tiempo que se retenía el grupo tolilo o el sustituyente de 4-fluorofenilo en la posición C-4 del imidazol. La estructura de los compuestos en el Grupo 3 de la Figura 6E se usó para investigar la variación en los sustituyentes en la posición C-2 del imidazol, al tiempo que se retenía el resto adyacente de piridin-4-ilo/4-fluorofenilo. El compuesto principal IM-29 es un miembro del Grupo 3. En el Grupo 4 (Figura 6E), la estructura de núcleo del imidazol se reemplazó por oxazol. Se llevaron a cabo estudios de relación de estructura-actividad basados en todos los análogos que se muestran en la Figura 6E para identificar estructuras químicas específicas y modificaciones que fueron fundamentales para mediar la expansión de HSPC. En general, se observó que los imidazoles con los sustituyentes adyacentes de piridin-4-ilo/4-fluorofenilo que pueden proporcionar la región aromática y el aceptor de enlaces de H en las posiciones C5 y C4 presentaron mayores actividades para inducir la expansiónex vivode las HPC. Si el sustituyente en C4 del imidazol se reemplazaba por un grupo tolilo o 3-(trifluorometil)fenilo, disminuía la capacidad de los análogos para aumentar la expansión de HPC. De manera similar, si el sustituyente en C5 del imidazol se reemplazaba por un grupo piran-4-ilo, se reducía significativamente la expansión de HPC. El mejor sustituyente para la posición C2 de los azoles es el sustituyente de naftilo, y de estos, se identificó que el compuesto IM-29 que tiene un sustituyente de 1-fluoronaftalen-2-ilo es el compuesto más potente para la inducción de la expansiónex vivode HPC entre todos los compuestos analizados. El reemplazo de 1-fluoronaftalen-2-ilo de IM-29 en la posición C2 del imidazol con naftalen-2-ilo (tal como en el compuesto ZQX-33: 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina) redujo la capacidad de expansión de HPC al menos 2 veces(P< 0,001). Finalmente, el compuesto de oxazol (OZ-07) no fue óptimamente activo para inducir la expansiónex vivode HPC, lo que sugiere que resulta indispensable disponer de un grupo donador de enlaces de H en la estructura central de la molécula.

Se evaluó la capacidad de todos los compuestos para mantener la viabilidad de los leucocitos CD45+ usando Anexina V y 7-AAD. La inducción de apoptosis en las células CD45+ durante los cultivosex vivolimita la expansión de HSPC. Todos los compuestos demostraron una toxicidad aguda mínima para las células UCB (Figura 7).

EJEMPLO 4

El análogo IM-29 mejora significativamente la expansiónex vivode HPC

Se demostró que el IM-29 a una concentración de 5,0 pM expande las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) con el perfil de expresión CD45+CD34+CD38-CD45RA- en al menos un factor de 1.200 durante 10 días (Figura 8A). En comparación con el control de citocinas, el IM-29 podría conferir un efecto de mejora de un factor de 8 para la expansión de HPC. El IM-04 expandió las HPC en un factor de entre 1.000 y 1.150 durante 10 días (Figura 8A), mientras que el IM-01, ZQX-33, ZQX-36, GJ-C y OZ-07 expandieron las HPC en un factor de entre 400 y 900 durante 10 días (Figura 8A). La evaluación se repitió en medios libres de componentes animales (ACF), incluyendo moléculas pequeñas a base de azol adicionales, y los datos de expansión se presentan en la Figura 8B. Además, el IM-29 aumentó la expresión asociada a las HPC de CD45+CD34+CD38-CD45RA- hasta aproximadamente un 68 %, lo que fue 3 veces mayor que el control de citocinas (Figura 8C).

Se llevaron a cabo experimentos anteriores con moléculas pequeñas que se suplementaban con 5,0 pM, dado que es la concentración de trabajo óptima para el compuesto precursor SB203580; sin embargo, resultó necesario identificar la concentración de trabajo óptima de IM-29 en la expansión de las HPC. Tal como se muestra en la Figura 9A, la expansión óptima de TNC se logró con una concentración de IM-29 de 5,0 pM, en el caso de los cultivos iniciados con MNC no seleccionadas. A 1,0 pM o 10 pM de IM-29, la expansión de las células nucleadas totales (TNC) se redujo en un factor de 0,83 y 0,70, respectivamente, en comparación con 5,0 pM. De manera similar, 1,0 pM, 5,0 pM y 10,0 pM de IM-29 podrían potenciar la expansión de HPC en un factor de 2,7, 3,6 y 2,4, respectivamente, en comparación con el control de citocinas (Figura 9<a>). Todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo usando IM-29 a una concentración de trabajo de 5,0 pM.

Como el IM-29 es una nueva molécula pequeña que expande las HPC, se investigó el efecto de este compuesto cuando se suplementó en cultivo con una combinación variable de citocinas con el objetivo de identificar una combinación óptima de citocinas (Figura 1). Las citocinas son fundamentales para expandir las HSPC y la combinación más usada comúnmente consiste en SCF, TPO y FLT-3L. Tal como se muestra en la Figura 1, se observó una expansión óptima de HPC de un factor de 1.513,9 ± 6,4 cuando los cultivos se suplementaron con SCF (S), TPO (T), FLT-3L (F), IGFBP-2 (IG) e IM-29 (IM), que fue al menos 4,7 veces mayor que el cultivo de cuatro citocinas (S+T+F+i)) (P < 0,05). Cuando la combinación de citocinas basales consistía en solo tres citocinas (tales como combinaciones de S+T+F; T+F+IG; F+IG+S; y S+IG+T), la adición de IM-29 podía impulsar significativamente (P < 0,05) la expansión de HPC. Por ejemplo, al comparar las combinaciones de S+T+F (factor de 486,8 ± 27,2) y S+T+F+IM-29 (factor de 1.265,2 ± 39,1), se observó un efecto de mejora de la expansión de un factor de 2,6 (P < 0,05). De manera similar, se observa un aumento doble de la expansión de HPC cuando se añade IM-29 a una combinación basal de S+IG+T (P < 0,05). De manera interesante, el IM-29 pudo soportar una expansión comparativamente mejor de HPC incluso cuando solo se añadieron dos citocinas (por ejemplo, S+T o T+F) al sistema de cultivo. Sin embargo, se observó una expansión mínima si se usaba IM-29 con determinadas combinaciones de citocinas (por ejemplo, S+IM; T+IM; F+IM o IG+IM) (no se muestran los datos). La adición de IM-29 solo (es decir, sin ninguna citocina) no apoyó la expansión de HPC, lo que fue similar a la proliferación de las células sin ningún factor de proliferación (no se muestran los datos). En cuanto a las TNC, se observó una expansión óptima cuando la combinación de citocinas consistía en S+T+F+IG junto con IM-29 (Figura 1).

Las células tratadas con IM-29 podrían potenciar la expansión de las unidades formadoras de colonias (CFU) en al menos un factor de 100, en comparación con las células no cultivadas, mientras que la expansión con citocinas solas dio como resultado un factor de aumento de aproximadamente 25 en las CFU, en comparación con la fracción no cultivada (Figura 9B).

La adición de IM-29 a medios de expansión libres de suero (SFEM que contienen seroalbúmina bovina) o a medios libres de componentes animales (ACF, que están químicamente definidos) permitió una expansión significativamente mejor de las HPC de UCB, tal como se mide mediante ensayo fenotípico y funcional (Figura 10). El IM-29 aumentó la expansión de HPC en al menos un factor de 2 a 3, en comparación con el control de citocinas. En cuanto a las CFU, la adición de IM-29 aumentó las colonias de granulocitos y monocitos (GM) en un factor de 2,5 a 5, en comparación con el control de citocinas. Los datos sugieren que el IM-29 podría funcionar con diferentes medios basales para su expansión.

EJEMPLO 5

Efecto del momento y el tiempo de IM-29 en cultivo sobre la expansión de HPC

El aumento del período de cultivo de UCB en cultivos suplementados con IM-29 de 7 días a 9 días impulsó la expansión de HPC en al menos un factor de 5. Sin embargo, en cultivos de citocinas, el aumento de HPC fue únicamente de un factor de 2,7 durante el mismo período de tiempo. El día 11, el IM-29 aumentó el número total de células nucleadas (TNC) en un factor de aproximadamente 6, en comparación con el número de células de partida, mientras que los controles de citocinas aumentaron las TNC en un factor de como máximo 3 (Figura 11).

La adición de IM-29, tanto el día 0 como el día 7, potenció la expansión de HPC (CD45+CD34+CD38-CD45RA-) en al menos un factor de 750 y 450 en medios de expansión libres de suero (SFEM) y medios libres de componentes animales (ACF), respectivamente, durante 10 días (Figura 12, Grupo 1). Independientemente de los medios de cultivo basales, la expansión de HPC del Grupo 1 fue al menos 12 veces mayor que la del Grupo 3 de control de citocinas. En el Grupo 2, cuando no se repuso el IM-29 el día 7, la expansión de HPC se redujo en al menos un factor de 0,7, en comparación con el Grupo 1. La adición de IM-29 solo el día 7, es decir, no se añade al inicio del cultivo (Grupo 4), tuvo un efecto insignificante en la expansión de HSPC. Por lo tanto, resulta necesario añadir IM-29 tanto el día 0 como el 7 para permitir una expansión óptima de las HSPC de UCB.

EJEMPLO 6

IM-29 aumenta la proporción de células HSC1 y HSC2 injertadas en ratones inmunodeficientes

En presencia de IM-29 y citocinas, el porcentaje de expresión tanto de CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1) como de CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2) aumentó en un factor de 4 a 5, en comparación con las células no cultivadas (Figura 13A). En términos de números absolutos de células, el IM-29 aumentó la proporción de células (HSC1: CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+) injertadas en ratones inmunodeficientes hasta al menos un factor de 1.000 durante 10 días, en comparación con el día 0, mientras que los controles de citocinas únicamente pudieron simplemente aumentar la misma población en un factor de aproximadamente 80 (Figura 13B). En términos de HSC2 definidas por CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+, el IM-29 pudo potenciar la expansión en un factor de al menos 7,5, en comparación con el control de citocinas únicamente durante 10 días (Figura 13C).

EJEMPLO 7

Las células cultivadas con IM-29 mantienen el cariotipo normal

El análisis citogenético reveló que las células cultivadas con IM-29 mantuvieron el cariotipo normal (Figura 13D) y no mostraron diferencias en comparación con los cariotipos de células no cultivadas (no se muestran los datos). La hibridaciónin situpor fluorescencia (FISH) que usa diversas sondas relacionadas con neoplasias malignas hematológicas reveló resultados normales para los injertos expandidos con IM-29 (Figura 13E), en comparación con los injertos expandidos con citocinas o los injertos no cultivados (no se muestran los datos). El análisis de morfología celular y citoquímica de leucocitos no mostró evidencia de transformación leucémica de los injertos expandidos con IM-29 (Figura 13E).

En la Figura 14, se muestra un esquema que describe el método de trasplante de injertos de UCB expandida con IM-29 en un modelo de ratón inmunodeficiente. Los datos de injerto obtenidos del trasplante de células mononucleares de UCB que se expandieron con IM-29 se muestran en la Figura 15 y la Figura 16. El trasplante de injertos de UCB expandida con IM-29 (n=11) a una dosificación equivalente de 2,5*107 células/kg en ratones NOD SCID Gamma (NSG) irradiados subletalmente dieron como resultado un procedimiento del injerto de células CD45+ humanas en la sangre periférica 3,53 y 2,09 veces mayor el día 21, en comparación con los injertos no expandidos(P =0,0030; n = 11) y expandidos con citocinas (P = 0,0005; n=12), respectivamente (Figura 15<a>). La congelación y descongelación de los injertos expandidos antes del trasplante en ratones NSG mostró que el injerto con IM-29 mantuvo la capacidad de repoblaciónin vivo (P= 0,0730 entre el injerto expandido con IM-29 nuevo y en estado de congelacióndescongelación; Figura 15A), mientras que el injerto expandido con citocinas había reducido el procedimiento del injerto de células CD45 humanas en la sangre periférica (PB) de ratones NSG en la semana 3 (P = 0,0008 entre el injerto expandido con citocinas nuevo y en estado de congelación-descongelación; Figura 15A). El injerto expandido con IM-29 mantuvo el procedimiento del injerto de células humanas en la PB de los ratones NSG durante al menos 19 semanas (no se muestran los datos). El injerto comprendía principalmente células mieloides (CD33+/CD15+), a diferencia del injerto no expandido que consistía en linfocitos T CD3+ (Figura 15B). Por otra parte, los injertos expandidos con IM-29 permitieron un rápido procedimiento del injerto de células de donantes. La frecuencia de células de repoblación de SCID que contribuyen al procedimiento del injerto temprano de sangre periférica fue 2,48 veces mayor en el injerto expandido con IM-29, en comparación con el injerto no manipulado.

EJEMPLO 8

Los injertos expandidos con IM-29 confieren una hematopoyesis a largo plazo en los ratones NSG

Los injertos expandidos con IM-29 mantuvieron la capacidad de conferir una hematopoyesis a largo plazo, tal como se observó mediante el análisis de la médula ósea de ratones NSG receptores a las 19 semanas después del trasplante (Fig. 16A-16E). Tal como han indicado otros [Notta F,et al.,Blood 115(18): 3704-7 (2010); McDermott SP,et al.,Blood 116(2):193-200 (2010)], en este modelo de ratón independientemente del injerto (es decir, expandido o no expandido), las receptoras hembras tuvieron tasas de procedimiento del injerto más altas que sus homólogos machos (Figura 16A). A pesar de la diferencia en las medias geométricas absolutas, los injertos expandidos con IM-29 dieron un nivel de procedimiento del injerto de células progenitoras CD45 humanas (Figura 16B) y comunes (CD45+CD34+), mieloides (CD45+CD13+CD33+) y linfoides (CD45+CD7+) estadísticamente comparable al de los injertos no expandidos (Figura 16C) a una dosificación de trasplante de 2,5*107 células/kg y 5,0*107 células/kg tanto en receptores machos como hembras. Adicionalmente, de manera similar al procedimiento del injerto temprano de células CD45 humanas en PB (Figura 15A), la administración de injertos expandidos con IM-29 en estado de congelación-descongelación mantuvo el procedimiento del injerto de células humanas de médula ósea (BM) a largo plazo comparable (P = 0,6593 entre el injerto expandido con<i>M-29 nuevo y en estado de congelación-descongelación; Figura 16B). La reconstitución de múltiples linajes de BM de NSG, que comprende células humanas mieloides (Figura 16D) y linfoides (Figura 16E) maduras, se pudo lograr con el injerto expandido con IM-29, aunque el procedimiento del injerto de sangre periférica inicial se inclinó hacia el linaje mieloide. Adicionalmente, los injertos expandidos con IM-29 no presentaron ninguna transformación leucémica en la médula ósea (BM) de ratones NSG trasplantados.

EJEMPLO 9

Los cultivos suplementados con IM-29 y citocinas mantienen y aumentan principalmente las células maduras del linaje mieloide de MNC de UCB

Los datos mostrados en la Figura 17A indican que los cultivos suplementados con IM-29 y citocinas mantienen y aumentan principalmente las células maduras del linaje mieloide (que consisten en monocitos CD45+CD33+, granulocitos CD45+CD13+CD15+ y megacariocitos CD45+CD41a+CD61+) cuando se inician los cultivos de expansiónex vivocon células mononucleadas (MNC) de la UCB. Esto significa que el injerto expandido con IM-29 está desprovisto de células linfoides maduras (que consisten en linfocitos T CD45+CD3+, linfocitos B CD45+CD19+ y linfocitos citolíticos naturales CD45+CD56+) antes del trasplante. Tal como se muestra en la Figura 17B, a una dosificación de trasplante más alta de 100 millones de células/kg, los injertos expandidos con IM-29 produjeron 7,1 ± 0,6 % de células CD45+ humanas en la PB de NSG en la semana 2, que fue al menos 5 veces mayor que los receptores de injertos expandidos con citocinas (P < 0,0001; n = 14), apoyado, además, por un aumento absoluto en el número total de células humanas. Sin embargo, con tal dosis de células de trasplante alta de 100 millones de células/kg, la UCB no expandida proporcionó un procedimiento del injerto significativamente mayor (P < 0,0001; n = 15) en al menos un factor de 3,7, en comparación con un injerto expandido con IM-29 (Figura 17B). De manera similar a los datos mostrados en la Figura 15B, los injertos no expandidos en trasplantes de dosificaciones celulares más altas dieron lugar principalmente a linfocitos T CD3+ en la PB de NSG en la semana 2 después del trasplante, mientras que los injertos expandidos con IM-29 mantuvieron unas poblaciones mínimas de linfocitos T humanos (Figura 17C). El análisis de la médula ósea (BM) de ratones NSG en la semana 2 después del trasplante mostró que los injertos no expandidos (n = 6) y expandidos con IM-29 (n = 6) reproducían un procedimiento del injerto de células CD45+ humanas similar, que fue significativamente (P < 0,01) mayor al de los injertos de control expandidos con citocinas (n = 6) (Figura 17D). En términos de células progenitoras humanas CD34+ en BM de NSG, los injertos expandidos con IM-29 mantuvieron el 13,3 ± 0,8 % (n = 6) en comparación con el 0,7 ± 0,1 % de los injertos no expandidos (n = 6) en la semana 2 después del trasplante (P < 0,001) (Figura 17D). De manera similar a los datos del procedimiento del injerto de PB, los ratones NSG trasplantados con UCB no expandida tenían una proporción predominante de linfocitos T CD3+ en la BM en comparación con los injertos expandidos (Figura 17D). Sin embargo, se debe tener en cuenta, basándose en los datos que se muestran en las Figuras 16A-16E, que, aunque el injerto expandido con IM-29 inclina el procedimiento del injerto temprano de células humanas hacia células progenitoras y mieloides, en los estudios a largo plazo (>19 semanas después del trasplante), este también da lugar a células linfoides en la BM de los ratones NSG, manteniendo, por tanto, la reconstitución de múltiples linajes. La mayor cantidad de linfocitos T humanos reconstituidos a partir del injerto no expandido dio como resultado una mayor incidencia de enfermedad injerto contra huésped (EICH) en los ratones receptores NSG, lo que dio como resultado una tasa más deficiente de supervivencia de aproximadamente el 25 % el día 60 después del trasplante (Figura 17E). La supervivencia de los ratones NSG que recibieron los injertos expandidos (con o sin IM-29) tuvo > 70 % de supervivencia el día 60 después del trasplante debido a síntomas mínimos de GVHD (Figura 17D).

Cuando se vaya a estudiar la eficacia de los injertos expandidos con IM-29 en un ensayo clínico de fase I, resultará necesario infundir un segundo injerto no manipulado como medida de seguridad clínica. Basándose en los datos mostrados en las Figuras 17A-17H, resulta evidente que la expansión de MNC de UCB en presencia de IM-29 dé lugar principalmente a células mieloides maduras y progenitoras CD34+. Tal injerto expandido desprovisto de sus células linfoides, si se lo infunde conjuntamente con un segundo injerto no manipulado que contenga células inmunitarias (UCB2, Fig. 17F), probablemente se enfrentaría a un rechazo inmunitario que daría como resultado el fallo del injerto. Por lo tanto, en un ensayo clínico de fase I, resultará necesario infundir células linfoides CD34- crioconservadas durante la selección de c D34 del injerto de UCB1 junto con la segunda unidad no manipulada (UCB2). Esto se podría lograr mediante las siguientes etapas representadas en el esquema de la Figura 17F:

(i) Etapa 1: obtener la unidad 1 de UCB clínicamente congelada (UCB1) que tiene una dosificación de células insuficiente para el trasplante. Realice la descongelación, el lavado y la selección de CD34+ basada en columna magnética de la unidad.

(ii) Etapa 2: cultivar las células CD34+ de UCB1 en un protocolo de expansión con IM-29, tal como se ha descrito anteriormente.

(iii) Etapa 3: crioconservar la fracción CD34- de UCB1 que contiene las células maduras del linaje linfoide.

(iv) Etapa 4: expandir las células CD34+ de UCB1 durante 10 a 11 días con reposición de medios, citocinas e IM-29 el día 7.

(v) Etapa 5: extraer, lavar y caracterizar la UCB1 expandida.

(vi) Etapa 6: infundir la parte expandida de la UCB1 en el paciente.

(vii) Etapa 7: descongelar, lavar e infundir la fracción CD34- de UCB1 en el paciente.

(viii) Etapa 8: obtener la unidad 2 de UCB clínicamente congelada (UCB2) que tiene una dosificación de células suficiente para el trasplante. Realizar la descongelación, el lavado y la infusión en el paciente.

Aunque la IM-29 pudo expandir las HSPC a partir de las MNC de UCB no enriquecidas, resultó necesario estudiar el efecto de expansión de esta molécula cuando se iniciaron los cultivos con células CD34+ purificadas para respaldar las expansiones de los ensayos clínicos de fase I. En los cultivos iniciados con células CD34+CD38- purificadas (usando el marcado con anticuerpos conjugados por fluorescencia, seguido de la clasificación de células activadas por fluorescencia), hubo una expansión de HSC1 definidas por CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ en presencia de IM-29 al menos 15,9 veces mayor en comparación con los cultivos de citocinas(P< 0,0001) (Figura 17G). Finalmente, los injertos de UCB se enriquecieron con células CD34 usando columnas magnéticas para imitar los métodos de selección de calidad clínica. El cultivo de estas células CD34+ en presencia de la IM-29 5,0 pM y la combinación de citocinas (SCF, TPO, FLT-3L e IGFBP-2) dio como resultado un factor de 283,7 ± 14,7 de células CD34+ en 11 días, que fue aproximadamente 1,9 veces mayor en comparación con los cultivos de control de citocinas (Figura 17H).

Comparación con otros métodos conocidos

Los cultivos enriquecidos con HSPC similares con una molécula pequeña competidora de stemregenina-1 (SR-1) [Wagner JE,et al.,Cell stem cell 18(1): 144-155 (2016)] que duró hasta 15 días dio una expansión media de<c>D34 de un factor de 330, mientras que otra tecnología competidora que implica la nicotinamida (NAM) [Horwitz ME,et al.,J Clin Invest 124(7): 3121-3128 (2014)] solo pudo aumentar las células CD34 en un factor de 72 durante 21 días. Esto indica que el IM-29 fue muy potente en la expansión de injertos seleccionados de CD34, logrando una expansión significativamente mejor en un período de tiempo más corto. Esto podría ahorrar tanto el coste de los reactivos (menos reposición de medios, citocinas y moléculas pequeñas, en comparación con SR1 y NAM) como la duración necesaria para producir tales productos de terapia celular. Varios ensayos clínicos han intentado superar el problema de la dosis celular baja y la recuperación hematopoyética lenta asociada a los UCBT usando los siguientes dos métodos amplios resumidos en las Tablas 1 y 2, junto con su/s principal/es dificultad/es:

Tabla 1. Número absoluto creciente de células nucleadas totales infundidas:

(continuación)

T l 2. M r l l liz i n l l inf n i r l n :

La mayoría de los intentos de manipulación de UCB descritos en las Tablas 1 y 2, anteriores, no han logrado abordar al mismo tiempo el problema de la dosis de células limitada, la recuperación rápida de neutrófilos y plaquetas (<14 días después del trasplante) y la hematopoyesis prolongada usando un solo injerto de UCB. Hasta ahora, la expansiónex vivoha demostrado ser la tecnología más prometedora, pero, en la mayoría de los casos (>60 %), solo ha dado como resultado un procedimiento del injerto moderadamente temprano, al tiempo que la hematopoyesis de larga duración fue aportada por una unidad no manipulada coinfundida. Asimismo, todos los protocolos de expansión anteriores requieren un enriquecimiento previo de las células madre usando marcadores de superficie celular contra CD34 o CD133. El tiempo hasta la recuperación de neutrófilos (definido por el recuento absoluto de neutrófilos de > 500 célulaspor|jl de sangre durante tres días consecutivos), que es una medida preliminar del éxito del trasplante, en el caso de los enfoques actuales mencionados anteriormente, junto con el régimen de acondicionamiento que se usó, se resume en la Figura 17 con una comparación simultánea con los trasplantes de HSCT convencionales. Sin embargo, se muestra que la expansión usando una molécula pequeña a base de azol permite que un injerto individual tenga una dosis celular suficiente que el análogo no expandido no poseería.

Sumario

La sangre del cordón umbilical (UCB) humano nueva fue la fuente de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en el presente estudio.

Las células mononucleadas de UCB (MNC de UCB) se obtuvieron a partir de muestras nuevas mediante la realización de una centrifugación dependiente de la densidad (Figura 3). En lo que respecta a la expansión, no es necesario enriquecer estas MNC para la expresión de CD34 usando la selección magnética. Sin embargo, las muestras enriquecidas en células CD34+ también son adecuadas para la expansión usando moléculas pequeñas a base de azol de acuerdo con la invención.

Dado que, en el contexto clínico, solo hay muestras congeladas disponibles para expansión o trasplante, las MNC de UCB se congelaron antes de descongelarlas para realizar más experimentos (Figura 3).

La fracción de MNC de UCB comprende glóbulos rojos (RBC) que no expresan CD45 y glóbulos blancos (WBC) que expresan CD45. Las HSPC son un subconjunto de WBC nucleados y expresan el antígeno CD34 junto con CD45 (Figura 4).

Las HSPC se clasifican en diferentes subconjuntos según la expresión de diferentes antígenos (Figura 4):

a. células progenitoras hematopoyéticas (HPC) ^ CD45+CD34+CD38-CD45RA- (la mayor frecuencia, pero la mínima capacidad de autorrenovación)

b. células madre hematopoyéticas 1 (Hs C1) ^ CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (frecuencia y capacidad de autorrenovación moderadas)

c. células madre hematopoyéticas 2 (HSC2) ^ CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (la menor frecuencia, pero la mayor capacidad de autorrenovación)

El IM-29 fue el compuesto más eficaz para la expansión de las HSPC. La estructura del IM-29 se muestra en la Figura 6 (A).

El IM-04 fue el segundo compuesto más eficaz para la expansión de las HSPC. La estructura del IM-04 se muestra en la Figura 6(B).

La concentración de trabajo del IM-29 y otros análogos estructurales es de 5,0 pM.

La población celular preferida para el inicio de cultivos de expansión con IM-29 son las células mononucleadas de UCB, es decir, no se requiere selección previa de células madre usando marcadores de superficie celular, tales como CD34 y CD133, para lograr una expansión suficiente.

Se ha demostrado que los medios de expansión libres de suero (SFEM StemSpan™) y libres de componentes animales (ACF StemSpan™) se podrían usar para la expansión de MNC de UCB en presencia del IM-29 (Figura 10). También pueden ser adecuados otros medios de expansión de células madre.

Se añadió una combinación de citocinas a todos los cultivos de expansión (con o sin IM-29) y esta comprendía 100 ng/ml de factor de células madre (SCF) y trombopoyetina (TPO); 50 ng/ml de ligando de tirosina cinasa 3 relacionado con Fms (FLT-3L); y 20 ng/ml de proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2) (Figuras 1 y 2).

Las condiciones físicas usadas en los Ejemplos para la expansión de un injerto de UCB en presencia de IM-29 incluyen una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 % (Figura 2). Sin embargo, se sabe que las células madre y progenitoras hematopoyéticas se pueden cultivar en incubadoras hipóxicas para imitar mejor el nicho de células madre naturales del microentorno de la médula ósea. Resulta probable que la presente invención también funcione en condiciones de cultivo hipóxico.

El IM-29 y todos los análogos estructurales tuvieron una toxicidad mínima en las células de UCB en el día 3 (Figura 7).

Un cultivo de expansión para MNC de UCB con IM-29 dura aproximadamente de 7 a 11 días. Se halló que una duración óptima del cultivo de expansión era de 10 días, tal como se mide mediante un ensayo fenotípico (Figura 11).

El IM-29 se añade preferentemente en el momento de iniciar el cultivo y también el día 7, cuando se reponen los medios y las citocinas para lograr una expansión óptima (Figura 12).

Las HSPC que expresan CD90 (HSC1) y CD49f (HSC2) se expanden cuando se inician los cultivos con MNC de UCB (Figura 13). Las células expandidas no presentan anomalías citogenéticas ni transformación leucémica (Figura 13). Los injertos expandidos con IM-29 (nuevos o en estado de congelación-descongelación) pudieron repoblar la sangre en ratones NSG ya en la semana 2-3 (procedimiento del injerto primario de células mieloides y progenitoras CD34) y el procedimiento del injerto duró hasta al menos la semana 19-20 en la médula ósea (reconstitución de múltiples linajes de células humanas que comprometen las células madre y progenitoras, las células mieloides y linfoides) (Figuras 15 17).

La expansión de UCB mediada por IM-29 supera los siguientes problemas asociados al uso de UCB como injerto para trasplante alergénico en adultos:

1. Supera la baja dosis celular del injerto, dado que aumenta el total de células nucleadas en al menos un factor de 5.

2. Expande las células madre y progenitoras hematopoyéticas. En concreto, expande las células progenitoras hematopoyéticas (HPC: CD45+CD34+CD38-CD45RA-) en al menos un factor de 1.000. No se había indicado de una expansión a tal escala antes usando solo una molécula pequeña. En todos los demás protocolos establecidos, tal escala de expansión se logró solo cuando los cultivos se iniciaron con células CD34/CD133 seleccionadas/purificadas. Asimismo, según el conocimiento de los presentes inventores, este es el primer protocolo de expansión que indica la expansión de células HSPC raras que se definen por la expresión fenotípica de (a) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+ (HSC1); y (b) CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC2).

3. El injerto de UCB expandida mantiene la funcionalidad de las células madre y progenitoras según lo determinado mediante ensayos funcionalesin vitroein vivo.Específicamente, el trasplante del injerto expandido con IM-29 en ratones inmunodeficientes irradiados subletalmente da como resultado un procedimiento del injerto más rápido de células humanas, tal como lo demuestra el quimerismo en sangre periférica en la semana 3. Hasta ahora, la obtención de una recuperación rápida del hemograma (<3 semanas) a partir del injerto expandido ha sido un desafío tanto en los estudios de xenotrasplantes como en los ensayos clínicos en seres humanos. Finalmente, los injertos mostraron la capacidad de mantener una hematopoyesis de múltiples linajes a largo plazo, dado que se pudieron detectar en la médula ósea de los ratones inmunodeficientes receptores después de 19 a 20 semanas de trasplante.

En el protocolo de expansión mediada por IM-29, solo se requiere una unidad de UCB para dar lugar a un número suficiente de células madre y progenitoras (>25 millones de células/kg) que tienen las siguientes ventajas en comparación con los enfoques actuales:

1. A fin de obtener una expansión clínicamente relevante de HSPC, no resulta necesario realizar una selección previa de células madre; tampoco resulta necesaria la suplementación de suero fetal bovino en los medios de cultivo. Desde la perspectiva clínica, prescindir de la preselección de células es una ventaja, dado que elimina la necesidad de una etapa manipulativa adicional que podría provocar la pérdida de células madre/progenitoras muy primitivas, especialmente aquellas que no expresan los marcadores de superficie requeridos en los métodos de selección.

2. La mayoría de las tecnologías de expansión requieren una compleja combinación de citocinas, de las cuales algunas son citocinas de acción tardía que promueven rápidamente la diferenciación a expensas de la autorrenovación. Sin embargo, el enfoque propuesto usa una combinación sencilla de cuatro factores de crecimiento, junto con una pequeña molécula para lograr la expansión, simplificando así los procedimientos. 3. Solo se requiere una unidad de UCBT para obtener un injerto expandido con IM-29, lo que reduce la complejidad de la histocompatibilidad, en comparación con la práctica clínica actual donde se trasplantan dos unidades no manipuladas simultáneamente para lograr una dosis celular suficiente, aunque con una mayor incidencia de enfermedad injerto contra huésped.

BIBLIOGRAFÍA

Ballen KK, Gluckman E, Broxmeyer HE. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood 2013; 122(4): 491-498.

Bari S, Seah KKH, Poon Z, Cheung AMS, Fan X, Ong SY,et al.Expansion and Homing of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Clinical Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2015; 21(6): 1008-19.

Barker JN, Byam CE, Kernan NA, Lee SS, Hawke RM, Doshi KA,et al.Availability of cord blood extends allogeneic hematopoietic stem cell transplant access to racial and ethnic minorities. Biol Blood Marrow Transplant 2010; 16(11): 1541-1548.

Brunstein CG, McKenna DH, DeFor TE, Sumstad D, Paul P, Weisdorf DJ,et al.Complement fragment 3a priming of umbilical cord blood progenitors: safety profile. Biol Blood Marrow Transplant 2013; 19(10): 1474-1479.

Cunha R, Loiseau P, Ruggeri A, Sanz G, Michel G, Paolaiori A,et al.Impact of HLA mismatch direction on outcomes after umbilical cord blood transplantation for hematological malignant disorders: a retrospective Eurocord-EBMT analysis. Bone Marrow Transplant 2014; 49(1): 24-29.

Cutler C, Multani P, Robbins D, Kim HT, Le T, Hoggatt J,et al.Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2013; 122(17): 3074-3081.

Dahlberg A, Delaney C, Bernstein ID.Ex vivoexpansión of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood 2011; 117(23): 6083-6090.

Delaney C, Heimfeld S, Brashem-Stein C, Voorhies H, Manger RL, Bernstein ID,et al.Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nat Med 2010; 16(2): 232-236. de Lima M, McMannis J, Gee A, Komanduri K, Couriel D, Andersson BS,et al.Transplantation ofex vivoexpanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial. Bone Marrow Transplant 2008; 41(9): 771-778.

de Lima M, McNiece I, Robinson SN, Munsell M, Eapen M, Horowitz M,et al.Cord-blood engraftment withex vivomesenchymal-cell coculture. N Engl J Med 2012; 367(24): 2305-2315.

Fan Xiuboet al.Low-dose insulin-like growth factor binding proteins 1 and 2 and angiopoietin-like protein 3 coordinately stimulateex vivoexpansion of human umbilical cord blood hematopoietic stem cells as assayed in NOD/SCIO gamma null mice. Stem Cell Research & Therapy 2014; 5(3): 71.

Gluckman E, Devergié A, Bourdeau-Esperou H, Thierry D, Traineau R, Auerbach A,et al.Transplantation of umbilical cord blood in Fanconi's anemia. Nouv Rev Fr Hematol 1990; 32(6): 423-425.

Gluckman E, Rocha V. History of the clinical use of umbilical cord blood hematopoietic cells. Cytotherapy 2005; 7(3): 219-227.

Gratwohl A, Baldomero H, Aljurf M, Pasquini MC, Bouzas LF, Yoshimi A,et al.Hematopoietic stem cell transplantation: a global perspective. JAMA 2010; 303(16): 1617-1624.

Hagglund H, Ringdén O, Agren B, Wennberg L, Remberger M, Rundquist L,et al.Intraosseous compared to intravenous infusion of allogeneic bone marrow. Bone Marrow Transplant 1998; 21(4): 331-335.

Hofmeister CC, Zhang J, Knight KL, Le P, Stiff PJ.Ex vivoexpansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplant 2007; 39(1): 11-23. Horwitz ME, Chao NJ, Rizzieri DA, Long GD, Sullivan KM, Gasparetto C,et al.Umbilical cord blood expansion with nicotinamide provides long-term multilineage engraftment. J Clin Invest 2014; 124(7): 3121-3128.

Hwang WYK, Samuel M, Tan D, Koh LP, Lim W, Linn YC,et al.A meta-analysis of unrelated donor umbilical cord blood transplantation versus unrelated donor bone marrow transplantation in adult and pediatric patients. Biol Blood Marrow Transplant 2007; 13(4): 444-453.

Jaroscak J, Goltry K, Smith A, Waters-Pick B, Martin PL, Driscoll TA,et al.Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation withexvivo-expanded UCB cells: results of a phase 1 trial using the AastromReplicell System. Blood 2003; 101(12): 5061-5067.

Kelly SS, Sola CBS, de Lima M, Shpall E.Ex vivoexpansion of cord blood. Bone Marrow Transplant 2009; 44(10): 673-681.

Komanduri KV, St John LS, de Lima M, McMannis J, Rosinski S, McNiece I,et al.Delayed immune reconstitution after cord blood transplantation is characterized by impaired thymopoiesis and late memory T-cell skewing. Blood 2007; 110(13): 4543-4551.

Liu H, Rich ES, Godley L, Odenike O, Joseph L, Marino S,et al.Reduced-intensity conditioning with combined haploidentical and cord blood transplantation results in rapid engraftment, low GVHD, and durable remissions. Blood 2011; 118(24): 6438-6445.

Lund TC, Boitano AE, Delaney CS, Shpall EJ, Wagner JE. Advances in umbilical cord blood manipulation-from niche to bedside. Nature reviews. Clinical oncology 2015; 12(3): 163-74.

Popat U, Mehta RS, Rezvani K, Fox P, Kondo K, Marin D,et al.Enforced fucosylation of cord blood hematopoietic cells accelerates neutrophil and platelet engraftment after transplantation. Blood 2015; 125(19): 2885-2892. Macmillan ML, Blazar BR, DeFor TE, Wagner JE. Transplantation of ex-vivo culture-expanded parental haploidentical mesenchymal stem cells to promote engraftment in pediatric recipients of unrelated donor umbilical cord blood: results of a phase I-II clinical trial. Bone Marrow Transplant. 2009; 43(6): 447-54.

McDermott SP, Eppert K, Lechman ER, Doedens M, Dick JE. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 2010; 116(2): 193-200.

Notta F, Doulatov S, Dick JE. Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients. Blood. 2010; 115(18): 3704-7.

Shpall EJ, Quinones R, Giller R, Zeng C, Baron AE, Jones RB,et al.Transplantation ofex vivoexpanded cord blood. Biol Blood Marrow Transplant 2002; 8(7): 368-376.

Sideri A, Neokleous N, Brunet De La Grange P, Guerton B, Le Bousse Kerdilles MC, Uzan G,et al.An overview of the progress on double umbilical cord blood transplantation. Haematologica 2011; 96(8): 1213-1220.

Voelker R. FDA grants approval for first cord blood product. JAMA 2011; 306(22): 2442.

Wagner JE, Brunstein CG, Boitano AE, DeFor TE, McKenna D, Sumstad D,et al.Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell stem cell 2016; 18(1): 144-155.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para la expansiónex vivode un componente de las células nucleadas totales y/o un subconjunto de células madre y progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+ de una muestra de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada, que comprende las etapas de: (i) cultivar un componente de células nucleadas totales o de una fracción de células mononucleadas o células madre y progenitoras hematopoyéticas CD45+CD34+ de la muestra en medios; y (ii) poner en contacto la/s célula/s de la etapa (i) con una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol, en donde la al menos una molécula pequeña a base de azol se representa mediante la Fórmula (I),

en donde: X representa NR4 u O, donde R4 es H o metilo; Ri representa fenilo o piridinilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de CI, Br, F y metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con F]); R2 representa fenilo, piridilo o dihidropiranilo (que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de CI, Br, F y metilo [cuyo último grupo está sin sustituir o sustituido con F]); R3 representa H o naftilo que está sin sustituir o sustituido con uno o más grupos seleccionados de CI, F y OR5, donde R5 es H, o metilo o sales y solvatos de los mismos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la al menos una molécula pequeña a base de azol se selecciona de: (A) la lista: (i) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (ii) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(m-tolil)-1H-imidazol-5-il]piridina; (iii) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (iv) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (v) 4-[2-(1-bromonaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (vi) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-[3-(trifluorometil)fenil]-1H-imidazol-5-il]piridina; (vii) 2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(piridin-4-il)-5-(m-tolil)oxazol; (viii) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol; (ix) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(6-metoxinaftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol; y (x) 5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol; (xi) 4-(4(5)-(4-fluorofenil)-2-(7-metoxinaftalen-2-il)-1H-imidazol-5(4)-il)piridina; (xii) 4-[4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; y (xiii) 4-[4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; o (B) la lista: (i) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (ii) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(m-tolil)-1H-imidazol-5-il]piridina; (iii) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (iv) 4-[2-(naftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (v) 4-[2-(1-bromonaftalen-2-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il]piridina; (vi) 4-[2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-[3-(trifluorometil)fenil]-1H-imidazol-5-il]piridina; y (vii) 2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4-(piridin-4-il)-5-(m-tolil)oxazol.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde las células madre y progenitoras hematopoyéticas se expanden en presencia de: (a) al menos una citocina seleccionada del grupo que comprende el factor de células madre (SCF, por sus siglas en inglés), la trombopoyetina (TPO), el ligando de tirosina cinasa 3 relacionado con Fms (FLT-3L, por sus siglas en inglés), la interleucina 3 (IL-3), la interleucina 6 (IL-6), el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF, por sus siglas en inglés) y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2, por sus siglas en inglés); o (b) SCF, TPO, FLT-3L y IGFBP-2.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende cultivar la/s célula/s mononuclear/es de sangre del cordón umbilical, médula ósea y/o sangre periférica movilizada con la al menos una molécula pequeña a base de azol durante; i) un periodo de al menos 9 días; o ii) un período de aproximadamente 11 días.
5. El método de la reivindicación 3 o 4, en donde las citocinas se añaden al cultivo el día 0 y/o el día 7 y/o la al menos una molécula pequeña a base de azol se añade al cultivo el día 0 y/o el día 7.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, la etapa de extraer las células después de aproximadamente 10 a 11 días en cultivo.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, la etapa de retener por separado una fracción de células CD34- (que comprende células linfoides) para su posterior trasplante junto con las células expandidasex vivo.
8. Una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol definida en la reivindicación 1 o 2; y al menos una citocina seleccionada del grupo que comprende SCF, TPO, FLT-3L e IGFBP-2 para su uso en la expansiónex vivodel componente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y/o la sangre periférica movilizada.
9. Uso de una composición que comprende al menos una molécula pequeña a base de azol definida en las reivindicaciones 1 o 2 en la expansiónex vivodel componente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y/o la sangre periférica movilizada.