JP2015526088A

JP2015526088A - ナチュラルキラー細胞及びその使用

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Publication number: JP2015526088A
Application number: JP2015527530A
Authority: JP
Inventors: ロウエリク; カングリン; ジャンコビクウラジミル; ズハングキアオクイ; アブボトスチュアート; ジェイ．ハリリロバート
Original assignee: アントフロゲネシスコーポレーション; ロウエリク; カングリン; ジャンコビクウラジミル; ズハングキアオクイ; アブボトスチュアート; ジェイ．ハリリロバート
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2015-09-10
Also published as: EP3722416A1; WO2014028453A3; CA2881792C; AU2013302853A1; AU2019204020A1; KR20220166873A; EP2882847A2; AU2022200976A1; CN105008516A; CA2881792A1; WO2014028453A2; RU2015108761A; JP2018183161A; KR20150063374A; CN114134113A; US20150225697A1; JP2020188782A; EP2882847A4; BR112015003149A2; KR20210076150A

Abstract

本明細書に提供されるのは、二工程の増殖及び分化方法を用いて、ナチュラルキラー(NK)細胞及びNK前駆細胞集団を産生する方法である。また本明細書に提供されるのは、三工程の増殖及び分化方法を用いてNK細胞集団及びNK前駆細胞集団を産生する方法である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法によって産生されるNK細胞、NK細胞集団、及びNK前駆細胞集団を用いて腫瘍細胞増殖を抑制する方法、並びに癌又はウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、本明細書に記載の方法によって産生されるNK細胞、NK細胞集団、及びNK前駆細胞集団を、癌又はウイルス感染を有する個体に投与することを含む、方法である。【選択図】図１

Description

(1.分野)
本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー(NK)細胞の集団及びNK前駆細胞の集団を造血前駆細胞の集団から産生する方法、例えば、NK細胞及びNK前駆細胞を、例えば、胎盤灌流液(例えば、ヒト胎盤灌流液)由来の胎盤の細胞、例えば、胎盤由来中間NK細胞、又は他の組織、例えば、臍帯血もしくは末梢血から産生する方法である。また本明細書に提供されるのは、増殖されたNK細胞集団、並びに本明細書に提示される方法によって産生されるNK細胞及びNK前駆細胞の単離された集団である。さらに本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、本明細書に記載のNK細胞及び/又はNK前駆細胞を用いて、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。ある実施態様において、本明細書に記載の方法によって産生されるNK細胞及び/又はNK前駆細胞は、1以上の免疫調節化合物、例えば、本明細書においてIMiDs(登録商標)と呼ばれる免疫調節化合物と組み合わせて使用され、及び/又は該免疫調節化合物で処理される。

(2.背景)
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系の主要な構成要素となる細胞傷害性リンパ球である。NK細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)も、CD3も、表面免疫グロブリン(Ig)B細胞受容体も発現していない。NK細胞は、ヒトでは通常、表面マーカーCD16(FcγRIII)及びCD56を発現するが、あるサブクラスのヒトNK細胞はCD16^-である。NK細胞は細胞傷害性であり;その細胞質中の小顆粒は、パーフォリン、及びグランザイムとして知られるプロテアーゼなどの特殊なタンパク質を含有している。死滅させる標的となった細胞のすぐ近くに放出されると、パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、そこからグランザイム及び関連分子が進入可能になり、アポトーシスが誘導される。1つのグランザイム、グランザイムB(グランザイム2及び細胞傷害性Tリンパ球関連セリンエステラーゼ1としても知られている)は、細胞性免疫応答において標的細胞アポトーシスの迅速な誘導に重要なセリンプロテアーゼである。

NK細胞は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。活性化されたNK細胞は、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞と呼ばれることもあるが、LAK細胞は、通常、NK細胞、CD56+ CD3+ NK様T細胞、及びおそらくは他の細胞傷害性細胞の不均質な集団である。NK細胞の細胞傷害活性は、「活性化受容体」又は「抑制性受容体」とみなされ得る2つのタイプの表面受容体によって主に調節されるが、一部の受容体、例えば、CD94及び2B4は、リガンド相互作用に応じて、どちらでも機能することができる。

他の活性の中でも、NK細胞は、宿主による腫瘍の拒絶において役割を果たし、ウイルス感染細胞を死滅させることができることが示されている。自己のクラスI MHC発現のレベルが変化又は低下している癌細胞は、NK細胞感受性の誘導をもたらす。蓄積しつつある臨床データは、末梢血単核細胞(PBMC)又は骨髄から単離されたヒトNK細胞のハプロタイプ一致性移植が、検出可能な移植片対宿主病(GVHD)を生じることなく、強力な抗白血病効果を媒介することを示唆している。Ruggeriらの文献、Science 295:2097-2100(2002)を参照されたい。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質を欠如しているか、又はそのレベルの低下を示す細胞によって活性化され得る。さらに、NK細胞上に発現される活性化受容体は、活性化受容体に対するリガンドを発現し、それゆえ、NK細胞の活性化を誘発する「ストレスを受けた」又は形質転換された細胞の検出を媒介することが知られている。例えば、NCR1(NKp46)は、ウイルス血球凝集素に結合する。NKG2Dリガンドとしては、CMV UL16結合タンパク質1(ULB1)、ULB2、ULB3、並びにMHC-クラス-I-ポリペプチド関連配列A(MICA)及びMICBタンパク質が挙げられる。NKタンパク質2B4はCD48に結合し、DNAM-1は、ポリオウイルス受容体(PVR)及びNectin-2に結合し、両者とも、急性骨髄性白血病(AML)で常に検出される。Pendaらの文献、Blood 105:2066-2073(2004)を参照されたい。さらに、AMLの溶解は、主に、自然細胞傷害性受容体(NCR)依存的であると記載されている。Fauriatらの文献、Blood 109:323-330(2007)を参照されたい。末梢血由来の活性化され、増殖されたNK細胞、及び場合により、LAK細胞は、進行癌を有する患者のエクスビボ療法とインビボ治療の両方で使用されており、白血病などの骨髄関連疾患;乳癌;ある種のリンパ腫に対してある程度の成功を収めている。NK細胞治療、又は場合により、LAK細胞治療では、患者にまずIL-2を投与し、次に白血球除去療法及び養子移植を施すことが必要とされる。場合によっては、養子移植の前に、回収された自己血液細胞を、IL-2の存在下で数日間、エクスビボでインキュベートし、培養する。治療を終了するためには、NK細胞、又は場合により、LAK細胞を比較的高用量のIL-2と一緒に再注入しなければならない。このパージ治療(purging treatment)は高価であり、重篤な副作用を引き起こすことがある。これらの副作用には、体液貯留、肺水腫、血圧低下、及び高熱が含まれる。

腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を死滅させる上でのNK細胞の有利な特性にもかかわらず、NK細胞は、その腫瘍標的能力及び殺腫瘍能力を培養及び増殖の間に維持するのが難しいことが主な理由で、取扱い及び免疫療法での適用が依然として難しい。したがって、当技術分野では、殺腫瘍機能を保持するナチュラルキラー細胞を産生し、それを増殖する効率的な方法を開発することが必要とされている。

(3.概要)
本明細書に提供されるのは、細胞、例えば、造血細胞、例えば、造血幹細胞、例えば、CD34⁺造血幹細胞を増殖し、分化させて、ナチュラルキラー(NK)細胞及びNK前駆細胞を産生する方法である。

一態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞を産生する方法であって、造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、CD34⁺幹細胞又は前駆細胞を、第一の培地中で培養して、増殖され、分化した細胞(分化は、例えば、細胞の前駆状態の喪失及び/又はCD34発現の喪失によって示される)を産生すること、並びにその後、該増殖された細胞を、該細胞をさらに増殖し、ナチュラルキラー細胞に分化させる第二の培地中で培養することを含む、方法である。第一の工程及び第二の工程は、該細胞を独特な組合せの細胞因子を含む培地中で培養することを含む。通常、第一の工程で使用される培地は、第二の工程で使用される培地とは異なる。ある実施態様において、該細胞因子(例えば、サイトカイン)は、培地の不確定成分(例えば、血清)中に含まれず、例えば、該細胞因子(例えば、サイトカイン、例えば、特定の濃度のサイトカイン)は、培地の不確定成分(例えば、血清)にとって外因性のものである。ある実施態様において、該方法は、二工程法である。ある実施態様において、第二の工程用の培地は、第一の工程由来の培地を交換することなく、第一の工程由来の培養培地に添加される。ある実施態様において、該方法は、細胞を接触させる(又は培養する)第三の工程又は中間工程を含まない。これら2つの工程を使用する本明細書に提供される方法(例えば、二工程法)によって産生されるナチュラルキラー細胞は、本明細書において、TSNK細胞と呼ばれる。

具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する方法であって:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞がNK細胞に分化するように、該集団を、外因性のインターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの一方又は両方を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該外因性のIL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、どのような量のIL-15、SCF、又はIL-7が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えられるものである);並びに(b)第一の工程由来の細胞を、外因性のインターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生すること(ここで、該外因性のIL-2は、どのような量のIL-2が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えられるものである)を含む、方法である。

ある実施態様において、該第一の培地は、インターロイキン-15(IL-15)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL、並びにヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、例えば、1％〜20％v/v、例えば、5％〜20％v/v、幹細胞因子(SCF)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL、FMS様チロシンキナーゼ-3リガンド(Flt-3リガンド)、例えば、1ng/ml〜20ng/mL;インターロイキン-7(IL-7)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL;トロンボポエチン(TPO)、例えば、1ng/mL〜100ng/mL、例えば、1ng/mL〜50ng/mL;インターロイキン-2(IL-2)、例えば、最大2000IU/mL、例えば、50IU/mL〜500IU/mL;及び/又はヘパリン、例えば、0.1IU/mL〜10IU/mLのうちの1つ又は複数を含む培地を含む。具体的な実施態様において、該第一の培地は、IL-15及び幹細胞因子(SCF)又はインターロイキン-7(IL-7)を含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、IL-15、SCF、及びIL-7を含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、成長培地、血清(例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、FBS、又はFCS)、SCF、IL-7、及びIL-15を含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、Flt-3リガンド(Flt3-L)、TPO、IL-2、及び/又はヘパリンをさらに含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、成長培地、10％ヒト血清又は胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)、20ng/mL SCF、10ng/ml Flt3-L、20ng/mL IL-7、20ng/mL TPO、200IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、及び1.5IU/mL ヘパリンを含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、IL-2を含まない。

ある実施態様において、該第一の培地は、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1の比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640を含む。ある実施態様において、該培地は、O-アセチル-カルニチン(アセチルカルニチン、O-アセチル-L-カルニチン、OAC、又はALCARとも呼ばれる)、例えば、約0.5mM〜10mMを含む。一実施態様において、該培地は、STEMSPAN(登録商標)H3000及び/又はDMEM:F12を含む。別の実施態様において、該培地は、OAC、例えば、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10mM、並びにSTEMSPAN(登録商標)H3000及び/又はDMEM:F12を含む。具体的な実施態様において、該培地は、GBGM(登録商標)を含む。別の具体的な実施態様において、該培地は、DMEM:F12及び約5mMのOACを含む。別の具体的な実施態様において、該培地は、STEMSPAN(登録商標)H3000及び約5mMのOACを含む。

ある実施態様において、該第一の培地中で該培養することは、フィーダー細胞、例えば、K562細胞、例えば、マイトマイシンC処理したK562細胞、末梢血単核細胞(PBMC)、例えば、マイトマイシンC処理したPBMC、又は組織培養物接着性幹細胞、例えば、マイトマイシンC処理した組織培養物接着性幹細胞を用いて培養することを含む。別の実施態様において、該第一の培地中で該培養することは、フィーダー細胞を用いて培養することを含まない。

ある実施態様において、該第二の培地は、IL-2、例えば、10IU/mL〜1000IU/mL、並びにヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、例えば、5％〜15％FCS v/v;トランスフェリン、例えば、10μg/mL〜50μg/mL;インスリン、例えば、5μg/mL〜20μg/mL;エタノールアミン、例えば、5×10^-4〜5×10^-5M;オレイン酸、例えば、0.1μg/mL〜5μg/mL;リノール酸、例えば、0.1μg/mL〜5μg/mL;パルミチン酸、例えば、0.05μg/mL〜2μg/mL;ウシ血清アルブミン(BSA)、例えば、1μg/mL〜5μg/mL;及び/又はフィトヘマグルチニン、例えば、0.01μg/mL〜1μg/mL;のうちの1つ又は複数を含む細胞成長培地を含む。より具体的な実施態様において、該第二の培地は、ヒト血清、FBS、もしくはFCS、例えば、10％v/v、IL-2、トランスフェリン、インスリン、エタノールアミン、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ウシ血清アルブミン(BSA)、及び/又はフィトヘマグルチニンを含む細胞成長培地を含む。より具体的な実施態様において、該第二の培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、10％ヒト血清、FBS、又はFCS、400IU/ml IL-2、35μg/mLトランスフェリン、5μg/mLインスリン、2×10^-5Mエタノールアミン、1μg/mLオレイン酸、1μg/mLリノール酸、0.2μg/mLパルミチン酸、2.5μg/mL BSA、及び0.1μg/mLフィトヘマグルチニンを含む。

ある実施態様において、該第二の培地は、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、EL08-1D2、Advanced DMEM(Gibco)、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640を含む。ある実施態様において、該培地は、O-アセチル-カルニチン、又はミトコンドリアでのアセチル-CoA循環に影響を及ぼす化合物、チアゾビビン、Y-27632、パイインテグリン(pyintegrin)、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、カスパーゼ阻害剤、もしくは他の抗アポトーシス化合物/ペプチド、NOVA-RS(Sheffield Bio-Science)、又は他の小分子成長促進剤のうちの1つ又は複数を含む。ある実施態様において、該培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールを含む。ある実施態様において、該培地は、約0.5mM〜10mMのOACを含む。一実施態様において、該培地は、STEMSPAN(登録商標)H3000及び/又はDMEM:F12を含む。別の実施態様において、該培地は、OAC、例えば、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10mM、並びにSTEMSPAN(登録商標)H3000及び/又はDMEM:F12を含む。具体的な実施態様において、該培地は、GBGM(登録商標)を含む。別の具体的な実施態様において、該培地は、DMEM:F12及び約5mMのOACを含む。別の具体的な実施態様において、該培地は、Stemspan(登録商標)H3000及び約5mMのOACを含む。

ある実施態様において、該第二の培地中で該培養することは、例えば、細胞を、該第二の培地中で起こした時に、又はその1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10日後に、フィーダー細胞、例えば、K562細胞(例えば、マイトマイシンC処理したK562細胞)又はPBMC(例えば、マイトマイシンC処理したPBMC)を用いて培養することを含む。別の実施態様において、該第二の培地中で該培養することは、フィーダー細胞を用いて培養することを含まない。ある実施態様において、該第二の培地は、第一の培養培地を除去することなく、第一の培養工程由来の細胞に添加される。

具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する方法であって:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、本明細書に記載の第一の培地、例えば、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、どのような量のIL-15、SCF、又はIL-7が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えられるものである);並びに(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生すること(ここで、該IL-2は、どのような量のIL-2が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えられるものである)を含む、方法である。

別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する二工程法であり、ここで、該方法の第一の工程は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、SCF、IL-7、及びIL-15のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-7、及びIL-15は、どのような量のIL-15、SCF、又はIL-7が該培地の不確定成分(例えば、血清)中に存在するとしても、それに加えられるものであり、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する)を含み;並びに該方法の第二の工程は、第一の工程由来の細胞を、IL-2を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生すること(ここで、該IL-2は、どのような量のIL-2が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えられるものである)を含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、(どのような量が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えて)、Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3-L)、トロンボポエチン(Tpo)、インターロイキン-2(IL-2)、及び/又はヘパリンのうちの1つ又は複数をさらに含む。別の具体的な実施態様において、該第一の培地は、約5％〜20％胎仔ウシ血清又はヒト血清をさらに含む。別の具体的な実施態様において、SCFは、第一の培地中、約1〜約150ng/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、Flt3-Lは、第一の培地中、約1〜約150ng/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、IL-2は、第一の培地中、約50〜約1500IU/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、IL-7は、第一の培地中、約1〜約150ng/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、IL-15は、第一の培地中、1〜約150ng/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、Tpoは、第一の培地中、約1〜約150ng/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、ヘパリンは、第一の培地中、約0.1〜約30U/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、第二の工程のIL-2は、第二の培地中、50〜約1500IU/mLの濃度で存在する。別の具体的な実施態様において、該第二の培地は、(どのような量が該培地の不確定成分中に存在するとしても、それに加えて)、胎仔ウシ血清(FCS)、トランスフェリン、インスリン、エタノールアミン、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ウシ血清アルブミン(BSA)、及びフィトヘマグルチニンのうちの1つ又は複数をさらに含む。

ある具体的な実施態様において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間培養する。ある他の具体的な実施態様において、該細胞を、該第二の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間培養する。より具体的な実施態様において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第一の培地中で21日間培養し、その後、該第二の培地中で21日間培養する。別の具体的な実施態様において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第一の培地中で21日間培養し、その後、該第二の培地中で14日間培養する。

さらに本明細書に提供されるのは、本明細書においてTSNK細胞と呼ばれる、上記の方法によって産生されるナチュラルキラー細胞の集団である。具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はCD3^-CD56⁺である。具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はCD3^-CD56⁺CD16^-である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、CD94⁺CD117⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、CD161^-である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、NKG2D⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞はさらに、NKp46⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞はさらに、CD226⁺である。

ある実施態様において、該TSNK細胞の90％、92％、94％、96％、又は98％超は、CD56⁺及びCD16^-である。いくつかの実施態様において、該TSNK細胞の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、又は90％は、CD3^-及びCD56⁺である。他の実施態様において、該TSNK細胞の90％、92％、94％、96％、又は98％超は、CD56⁺、CD16^-、及びCD3^-である。他の実施態様において、該TSNK細胞の少なくとも50％、52％、54％、56％、58％、又は60％は、NKG2D⁺である。他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、又は3％未満は、NKB1⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、NKAT2⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、CD56⁺及びCD16⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％は、CD117⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、又は45％は、CD94⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％は、CD161^-である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、12％、14％、16％、18％、又は20％は、CD226⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、又は40％は、CD7⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、又は60％は、CD5⁺である。

一実施態様において、TSNK細胞集団は、CD117+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD117⁺細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、NKG2D+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKG2D⁺細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、NKp44+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKp44⁺細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、CD52+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD52⁺細胞を含む。特定の実施態様において、TSNK細胞集団は、CD52+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、CD244+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD244⁺細胞を含む。特定の実施態様において、TSNK細胞集団は、CD244+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、LFA-1+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のLFA-1+細胞を含む。一実施態様において、TSNK細胞集団は、CD94+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該TSNK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD94+細胞を含む。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞集団又はNK前駆細胞集団を産生する本明細書に記載の三段階を含む方法(本明細書において「三段階法」と呼ばれる)である。これらの三段階を使用する本明細書に提供される方法(例えば、三段階法)によって産生されるナチュラルキラー細胞は、本明細書において、三段階法によって産生されるNK前駆細胞又はNK細胞と呼ばれる。ある実施態様において、該方法は、細胞を接触させる(又は培養する)第四の工程又は中間の工程を含まない。

ある態様において、該三段階法は、造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、CD34⁺幹細胞又は前駆細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第一の培地中で特定の期間培養することを含む、第一の段階(「段階1」)を含む。ある実施態様において、第一の培地は、造血前駆細胞の増殖を促進する1以上の因子、増殖する造血前駆集団内でのリンパ球分化の開始のための1以上の因子、及び/又は間質フィーダー支持物を模倣する1以上の因子を含有する。ある実施態様において、第一の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、Flt3L、TPO、SCF)を含む。ある実施態様において、第一の培地は、IL-7を含む。ある実施態様において、第一の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第一の培地は、サイトカインFlt3L、TPO、及びSCF、IL-7、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第一の培地中で、CD34+細胞は、増殖を経て、系譜特異的前駆体になり、これは、その後、CD34-になる。ある実施態様において、第一の培地中で、CD34+細胞の増殖は、該細胞の分化(例えば、多能性の喪失、前駆細胞状態の喪失、CD34発現の喪失、及び/又はCD34-系譜特異的前駆体の増加によって示される分化)を伴う。ある実施態様において、第一の培地中で、CD34-系譜特異的前駆体は優勢になる。ある実施態様において、CD34-細胞は、段階1の終了時に、全集団の50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、又はそれより多くを含む。より具体的な実施態様において、CD34-細胞は、段階1の終了時に、全集団の80％超を含む。

その後、「段階2」において、該細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第二の培地中で特定の期間培養する。ある実施態様において、第二の培地は、リンパ球前駆体の増殖をさらに促進することができる因子、NK系譜に沿った発生に寄与することができる因子、及び/又は間質フィーダー支持物を模倣する因子を含有する。ある実施態様において、第二の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、Flt3L、SCF、IL-15、及び/又はIL-7)を含む。ある実施態様において、第二の培地は、IL-17及び/又はIL-15を含む。ある実施態様において、第二の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第二の培地は、サイトカインFlt3L、SCF、IL-15、及びIL-7、IL-17及びIL-15、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む。

その後、「段階3」において、該細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第三の培地中で特定の期間培養する。ある実施態様において、第三の培地は、CD56+CD3-CD16-細胞の分化及び機能的活性化を促進する因子を含む。一実施態様において、そのような因子は、IL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、又はIL2とIL15とIL18を含む。ある実施態様において、第三の培地は、間質フィーダー支持物を模倣する因子を含む。ある実施態様において、第三の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、SCF、IL-15、IL-7、IL-2)を含む。ある実施態様において、第三の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第三の培地は、サイトカインSCF、IL-15、IL-7、IL-2、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む。

具体的な実施態様において、該三段階法を用いて、NK前駆細胞を産生する。別の具体的な実施態様において、該三段階法を用いて、NK細胞を産生する。ある実施態様において、該三段階法を用いて、活性化されているNK細胞を産生する。ある実施態様において、該三段階法を、間質フィーダー細胞支持物の非存在下で実施する。

ある実施態様において、段階2培地及び/又は段階3培地を、1以上の前段階由来の培地を除去することなく、培養物に添加する。ある実施態様において、段階2培地を、段階1培養物由来の培地を除去することなく、段階1培養物に添加し、次いで、段階3培地を、段階2培養物由来の培地を除去することなく、段階2培養物に添加する。

ある態様において、本明細書に記載の三段階法で使用される第一の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一の培地及び第二の培地の成分のいずれかを含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第一の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、例えば、1％〜20％v/v血清、例えば、5％〜20％v/v血清;幹細胞因子(SCF)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; FMS様チロシンキナーゼ-3リガンド(Flt-3リガンド)、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド;インターロイキン-7(IL-7)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7;トロンボポエチン(TPO)、例えば、1ng/mL〜100ng/mL、例えば、1ng/mL〜50ng/mL TPO;インターロイキン-2(IL-2)、例えば、最大2000IU/mL、例えば、50IU/mL〜500IU/mL;及び/又はヘパリン、例えば、低重量ヘパリン(LWH)、例えば、0.1IU/mL〜10IU/mLヘパリン:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第一の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、第一の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

本明細書に記載の三段階法で使用される第二の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一の培地及び第二の培地の成分のいずれかを含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第二の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、FBS、もしくはFCS、例えば、5％〜20％v/v血清; SCF、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; Flt-3リガンド、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド; IL-7、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7;インターロイキン-15(IL-15)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-15;及び/又はヘパリン、例えば、LWH、例えば、0.1IU/mL〜10IU/mLヘパリン:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第二の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、第二の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

本明細書に記載の三段階法で使用される第三の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一の培地及び第二の培地の成分のいずれか含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第三の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、FBS、又はFCS、例えば、5％〜20％v/v血清; SCF、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; Flt-3リガンド、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド; IL-7、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7; IL-15、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-15;及び例えば、0〜2000IU/mLの範囲のインターロイキン-2(IL-2)、例えば、50IU/mL〜1000IU/mL IL-2:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第三の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、EL08-1D2、Advanced DMEM(Gibco)、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地及び該第二の培地で培養された細胞を、該第三の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30日間、又は30日よりも長い間、培養する。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、2〜12日、3〜11日、例えば、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、又は9〜11日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で該培養することの前に該第二の培地中で、1〜10日、例えば、1〜3、2〜4、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地及び該第二の培地で培養された細胞を、該第三の培地中で、2〜27日、例えば、3〜25日、例えば、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、9〜11、10〜12、11〜13、12〜14、13〜15、14〜16、15〜17、16〜18、17〜19、18〜20、19〜21、20〜22、21〜23、22〜24、又は23〜25日間培養する。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、7〜9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5〜7日間培養し;かつ該第三の培地中で、5〜9日間培養する、すなわち、該細胞を、合計17〜25日間培養する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5日間培養し;かつ該第三の培地中で、7日間培養する、すなわち、該細胞を、合計21日間培養する。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、7〜9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5〜7日間培養し;かつ該第三の培地中で、21〜31日間培養する、すなわち、該細胞を、合計33〜47日間培養する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5日間培養し;かつ該第三の培地中で、21日間培養する、すなわち、該細胞を、合計35日間培養する。

一実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたNK前駆細胞集団であり、ここで、該NK前駆細胞は、本明細書に記載の三段階法に従って産生される。

別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたNK細胞集団であり、ここで、該NK細胞は、本明細書に記載の三段階法に従って産生される。

別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたNK細胞集団であり、ここで、該NK細胞は活性化されており、該活性化されたNK細胞は、本明細書に記載の三段階法に従って産生される。

任意の特定の作動理論によって束縛されるものではないが、該三段階法のある時点で、該三段階法の他の時点で単離される細胞集団の特徴とは異なる特徴、例えば、構造的及び機能的特徴を保有する細胞集団を単離することができるということが本発明者らにより発見された。例えば、より短い第三の培養工程を有する本明細書に記載の三段階法を用いて生成される細胞集団は、より長い第三の工程を有する本明細書に記載の三段階法を用いて生成される細胞集団とは異なる特徴を有する。例えば、他が全て同じであっても、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を有する三段階法から単離される細胞集団は、長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を有する三段階法から単離される細胞集団とは異なる。短い第三の培養工程を有する三段階法から単離されるそのような異なる細胞集団が、NK前駆細胞集団を構成する(すなわち、NK細胞よりも高いパーセンテージのNK前駆細胞を含む細胞集団を構成する)のに対し、長い第三の培養工程を有する三段階法から単離される細胞集団は、NK細胞集団を構成する(すなわち、NK前駆細胞よりも高いパーセンテージのNK細胞を含む細胞集団を構成する)。

したがって、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法によって産生される単離されたNK前駆細胞集団である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、NK細胞集団、例えば、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団と関連するCD3^-CD56⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD3^-CD56⁺細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD3^-CD56⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団、例えば、NK細胞集団と関連するCD3^-CD56⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD3^-CD56⁺細胞を含むNK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD56+細胞よりも大きい割合のCD56-細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、インビボ又はエクスビボで、CD56+細胞の割合が増加した集団に分化する。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD117⁺である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、CD117⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上は、CD117⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、90％〜95％、又は95％〜99％は、CD117⁺である。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD161⁺である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％は、CD161⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％以上は、CD161⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の40％〜45％、45％〜50％、50％〜55％、55％〜60％、60％〜65％、65％〜70％、又は70％〜75％は、CD161⁺である。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、NKp46⁺である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又はそれより多くは、NKp46⁺である。より具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の約25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％は、NKp46⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％以下は、NKp46⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、45％〜50％、50％〜55％、55％〜60％、60％〜65％、65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、又は85％〜90％は、NKp46⁺である。より具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞の25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、45％〜50％、又は50％〜55％は、NKp46⁺である。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団は、CD56⁺CD16^-である細胞を含有する。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内のCD3^-CD56⁺細胞は、CD16^-である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内のCD3^-CD56⁺細胞は、CD16⁺である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD16⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、又は20％〜25％のCD16⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD16⁺細胞を含む。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD16^-である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD117⁺及びCD161⁺である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD16^-、CD117⁺、及びCD161⁺である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞はさらに、CD16^-、CD117⁺、CD161⁺、及びNKp46⁺である。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、約40％以下のCD3-CD56+細胞を含む。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD117+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD117⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NKG2D+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKG2D⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NKp44+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKp44⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD52+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD52⁺細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、CD52+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD244+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD244⁺細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、CD244+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、LFA-1+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のLFA-1+細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD94+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD94+細胞を含む。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するCD34^-CD117⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD34^-CD117⁺細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD34^-CD117⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。ある実施態様において、第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞は、より長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK細胞よりも高い効率で骨髄(例えば、インビボ)に生着する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するCD161⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD161+細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD161⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD161⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD161⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD161⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するNKp46⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのNKp46⁺細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のNKp46⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のNKp46⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のNKp46⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のNKp46⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するCD56⁺CD16-細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD56⁺CD16-細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD56⁺CD16-細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD56⁺CD16-細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD56⁺CD16-細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD56⁺CD16-細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD52+CD117+である細胞を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、造血前駆細胞集団と関連するCD52⁺CD117+細胞のパーセンテージと比較して、より高いパーセンテージのCD52⁺CD117+細胞を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するCD52⁺CD117+細胞のパーセンテージと比較して、より高いパーセンテージのCD52⁺CD117+細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又はそれより多くのCD52⁺CD117+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以上のCD52⁺CD117+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、50％〜55％、55％〜60％、60％〜65％、65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、90％〜95％、又はそれより多くのCD52⁺CD117+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるCD52⁺CD117+細胞を含む該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。具体的な実施態様において、CD52⁺CD117+細胞を含む該NK前駆細胞集団は、合計12日以上、13日以上、14日以上、15日以上、16日以上、17日以上、18日以上、19日以上、20日以上、又は21日以上の培養を含む三段階法を用いて産生される。具体的な実施態様において、CD52⁺CD117+細胞を含む該NK前駆細胞集団は、合計少なくとも12日、13日、又は14日の培養を含むが、21〜25日、25〜30日、又は30〜35日を超える培養を含まない三段階法を用いて産生される。具体的な実施態様において、CD52⁺CD117+細胞を含む該NK前駆細胞集団は、合計21日の培養を含む三段階法を用いて産生される。

さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法によって産生される単離されたNK細胞集団であり、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも大きいパーセンテージのCD3^-CD56⁺細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、90％〜95％、又は95％〜99％のCD3^-CD56⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK細胞集団は、長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

ある実施態様において、該NK細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞は、さらにCD117⁺であるCD3^-CD56⁺細胞を含み、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも小さいパーセンテージのCD3^-CD56⁺CD117⁺細胞を含む。

ある実施態様において、該NK細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞は、さらにCD161⁺であるCD3^-CD56⁺細胞を含み、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも小さいパーセンテージのCD3^-CD56⁺CD161⁺細胞を含む。

ある実施態様において、該NK細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞は、さらにNKp46⁺であるCD3^-CD56⁺細胞を含み、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも大きいパーセンテージのCD3^-CD56⁺NKp46⁺細胞を含む。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、CD117+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD117⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、NKG2D+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKG2D⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、NKp44+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のNKp44⁺細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、CD52+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD52⁺細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK細胞集団は、CD52+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、CD244+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD244⁺細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK細胞集団は、CD244+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、LFA-1+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のLFA-1+細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団は、CD94+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD94+細胞を含む。

具体的な実施態様において、本明細書に記載のNK前駆細胞集団は、NK細胞集団、例えば、本明細書に記載のNK細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団よりも高いパーセンテージのCD56+細胞を有するNK細胞集団よりも大きい骨髄(例えば、インビボ)生着能力を保有する。具体的な実施態様において、本明細書に記載のNK前駆細胞集団は、NK細胞集団、例えば、本明細書に記載のNK細胞集団、例えば、高いパーセンテージのCD16+細胞を有するNK細胞集団よりも大きい骨髄(例えば、インビボ)生着能力を保有する。ある実施態様において、より短い期間培養されたNK前駆細胞及び/又はNK細胞は、より長い期間培養されたNK前駆細胞及び/又はNK細胞よりも高い効率で骨髄に生着する。例えば、ある実施態様において、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団は、長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK細胞集団よりも高い効率で骨髄(例えば、インビボ)に生着する。本明細書に記載のNK前駆細胞集団の生着細胞は、インビボ、例えば、骨髄で持続及び複製することもできる。任意の特定の作動理論によって束縛されるものではないが、本明細書に記載のNK前駆細胞集団の生着細胞がNK細胞集団の細胞よりも大きい程度にインビボで骨髄に生着する能力と該生着細胞がインビボで存続/複製する能力の両方は、そのような細胞が、NK細胞活性が有益であるインビボ法での使用に理想的であることを示していると考えられる。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載のNK前駆細胞集団は、治療方法、例えば、血液癌の治療方法で使用することができ、ここで、該方法は、そのような治療を必要とする患者への該NK前駆細胞集団の投与を含む。そのような実施態様によれば、そのようなNK前駆細胞集団由来の該細胞は、インビボで数多く持続し、最終的に、所望の治療効果をもたらすNK細胞へと成熟することができる。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団を、該NK前駆細胞集団の細胞のNK細胞への分化/成熟を促進する第二の薬剤と共投与することができ、例えば、NK細胞の成熟/分化を誘導することができる第二の薬剤を、患者への該NK前駆細胞集団の投与の前に、それと同時に、又はその後に投与することができる。

したがって、別の態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞増殖を抑制し、ウイルス感染を治療し、又は癌、例えば、血液癌及び固形腫瘍を治療するための、TSNK細胞;並びに/又は本明細書に記載のNK前駆細胞集団及び/もしくは本明細書に記載の三段階法を用いて単離されるNK細胞集団の使用である。ある実施態様において、該TSNK細胞、NK前駆細胞集団、及び/又はNK細胞集団を、免疫調節化合物、例えば、本明細書に記載の免疫調節化合物、もしくはサリドマイドと接触させるか、又はこれらと組み合わせて使用する。ある実施態様において、該TSNK細胞、NK前駆細胞集団、及び/又はNK細胞集団を、免疫調節化合物、例えば、本明細書に記載の免疫調節化合物、もしくはサリドマイドで処理するか、又はこれらと組み合わせて使用する。

具体的な実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。別の実施態様において、該癌は、血液癌である。具体的な実施態様において、該癌は、膠芽腫、原発性腺管癌、白血病、急性T細胞白血病、慢性骨髄リンパ腫(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、肺癌、結腸腺癌、組織球性リンパ腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、又は網膜芽腫である。

別の具体的な実施態様において、TSNK細胞が産生される並びに/又はNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、胎盤灌流液、臍帯血、又は末梢血から得られる。一実施態様において、TSNK細胞が産生される並びに/又はNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、胎盤、例えば、胎盤灌流液から得られる。一実施態様において、TSNK細胞が産生される並びに/又はNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血から得られない。一実施態様において、TSNK細胞が産生される並びに/又はNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、末梢血から得られない。別の具体的な実施態様において、TSNK細胞が産生される並びに/又はNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、胎盤灌流液及び臍帯血、例えば、該灌流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する組み合わされた細胞である。別の具体的な実施態様において、該臍帯血は、該胎盤灌流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離される。ある実施態様において、該組み合わされた細胞は、該臍帯血及び胎盤灌流液をプールするか、又はこれらを組み合わせることによって得ることができる。ある実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、容積で100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせて、該組み合わされた細胞を得る。具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1〜1:10、5:1〜1:5、又は3:1〜1:3の比率で組み合わせる。別の具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、又は1:10の比率で組み合わせる。より具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、8.5:1.5(85％:15％)の比率で組み合わせる。

ある実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、全有核細胞(TNC)含有量で100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせて、該組み合わされた細胞を得る。具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1〜1:10、5:1〜1:5、又は3:1〜1:3の比率で組み合わせる。別の具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、又は1:10の比率で組み合わせる。

一実施態様において、それゆえ、本明細書に提供されるのは、癌又はウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、該個体に、有効量の単離されたTSNK細胞を投与することを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌又はウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、該個体に、有効量の本明細書に記載の単離されたNK前駆細胞集団、例えば、記載された三段階法を用いて産生される単離されたNK前駆細胞集団を投与することを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌又はウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、該個体に、本明細書に記載の三段階法を用いて産生される有効量の単離されたNK細胞集団を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。ある実施態様において、該癌は、血液癌である。具体的な実施態様において、該血液癌は、白血病である。別の具体的な実施態様において、該血液癌は、リンパ腫である。別の具体的な実施態様において、該血液癌は、急性骨髄性白血病である。別の具体的な実施態様において、該血液癌は、慢性リンパ球性白血病である。別の具体的な実施態様において、該血液癌は、慢性骨髄性白血病である。

具体的な実施態様において、単離されたTSNK細胞、並びに/又は本明細書に記載の単離されたNK前駆細胞集団及び/もしくは本明細書に記載の三段階法を用いて単離されるNK細胞集団は、該投与の前に、免疫調節化合物、例えば、本明細書に記載の免疫調節化合物、又はサリドマイドで処理されたものである。具体的な実施態様において、単離されたTSNK細胞、並びに/又は本明細書に記載の単離されたNK前駆細胞集団及び/もしくは本明細書に記載の三段階法を用いて単離されるNK細胞集団は、該投与の前に、IL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、又はIL2とIL15とIL18で処理されたものである。別の具体的な実施態様において、本方法は、個体に、(1)有効量の単離されたTSNK細胞、有効量の単離されたNK前駆細胞集団、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生される有効量の単離されたNK細胞集団;及び(2)有効量の免疫調節化合物又はサリドマイドを投与することを含む。この文脈での「有効量」は、TSNK細胞、NK前駆細胞集団、又はNK細胞集団、及び任意に免疫調節化合物又はサリドマイドを投与されていない該癌又は該感染を有する個体と比較して、該癌又は該感染の1以上の症状の検出可能な改善をもたらす、該TSNK細胞の量、又は該NK前駆細胞集団もしくは該NK細胞集団内の細胞、及び任意に免疫調節化合物又はサリドマイドの量を意味する。具体的な実施態様において、該免疫調節化合物は、レナリドミド又はポマリドミドである。別の実施態様において、該方法は、該個体に、抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数を投与することをさらに含む。

別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、治療有効量のTSNK細胞を腫瘍細胞と近接させること、例えば、腫瘍細胞を該TSNK細胞と接触させることを含む、方法である。以後、別途注記されない限り、「近接」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な近接を指し;例えば、ある実施態様において、近接という用語は、接触を指す。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の三段階法を用いて産生される治療有効量の単離されたNK前駆細胞集団を腫瘍細胞と近接させること、例えば、腫瘍細胞を該NK前駆細胞と接触させることを含む、方法である。

具体的な実施態様において、単離されたTSNK細胞、及び/又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生される単離されたNK前駆細胞集団もしくはNK細胞集団は、該接触させること又は近接させることの前に、免疫調節化合物、例えば、本明細書において、以下に記載されている免疫調節化合物、もしくはサリドマイド、及び/又はIL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、もしくはIL2とIL15とIL18で処理されたものである。別の具体的な実施態様において、有効量の免疫調節化合物、例えば、本明細書において、以下に記載されている免疫調節化合物、又はサリドマイドをさらに、腫瘍細胞と近接させる、例えば、腫瘍細胞を免疫調節化合物又はサリドマイドと接触させる。この文脈での「有効量」は、同等数の該TSNK細胞、NK前駆細胞集団内の細胞、又はNK細胞集団内の細胞、及び任意に免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない腫瘍細胞と比較して、該腫瘍細胞の検出可能な抑制をもたらす、TSNK細胞、NK前駆細胞集団内の細胞、又はNK細胞集団内の細胞、及び任意に免疫調節化合物又はサリドマイドの量を意味する。別の具体的な実施態様において、該方法は、有効量の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物を、腫瘍細胞と近接させること、例えば、腫瘍細胞を抗癌化合物と接触させることをさらに含む。

本方法の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。別の実施態様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、膠芽腫細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、前立腺癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。別の具体的な実施態様において、該接触させること又は近接させることは、インビトロで生じる。別の具体的な実施態様において、該接触させること又は近接させることは、インビボで生じる。より具体的な実施態様において、該インビボで接触させること又は近接させることは、ヒトで生じる。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に、(1)レナリドミド;(2)メルファラン;及び(3)増殖されたNK細胞を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体で多発性骨髄腫を治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されるNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、又は三段階法を用いてNK細胞集団を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。別の実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に増殖されたものである。別の実施態様において、該レナリドミド、メルファラン、及び/又はNK細胞は、互いに別々に投与される。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある具体的な実施形態において、該NK細胞は、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する二工程法によって産生され、ここで、該方法の第一の工程は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-7(IL-7)、及びインターロイキン-15(IL-15)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する)を含み;並びに該方法の第二の工程は、第一の工程由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生することを含む。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生される。

多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法の他の具体的な実施形態において、該NK細胞は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);並びに(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生することを含む方法によって産生される。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、急性骨髄性白血病(AML)を有する個体を治療する方法であって、該個体に、増殖されたNK細胞(IL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、又はIL2とIL15とIL18による前処理よって任意に活性化されたもの)を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体でAMLを治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されるNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、又は本明細書で示される三段階法を用いてNK細胞集団を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。別の実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に増殖されたものである。AMLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞は、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する二工程法によって産生され、ここで、該方法の第一の工程は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-7(IL-7)、及びインターロイキン-15(IL-15)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する)を含み;並びに該方法の第二の工程は、第一の工程由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生することを含む。AMLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生される。特定の実施態様において、前述の方法によって治療されるべきAMLは、難治性AML、予後不良AML、又は小児AMLを含む。

AMLを有する個体を治療する方法の他の具体的な実施態様において、該NK細胞は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);並びに(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生することを含む方法によって産生される。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、慢性リンパ球性白血病(CLL)を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療有効用量の(1)レナリドミド;(2)メルファラン;(3)フルダラビン;及び(4)増殖されたNK細胞、例えば、TSNK細胞又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体で該CLLを治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されるNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、又は本明細書に記載の三段階法を用いてNK細胞集団を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に少なくとも10日間、増殖されたものである。上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該レナリドミド、メルファラン、フルダラビン、及び増殖されたNK細胞は、該個体に別々に投与される。CLLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞は、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する二工程法によって産生され、ここで、該方法の第一の工程は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-7(IL-7)、及びインターロイキン-15(IL-15)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する)を含み;並びに該方法の第二の工程は、第一の工程由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生することを含む。CLLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生される。

CLLを有する個体を治療する方法の他の具体的な実施形態において、該NK細胞は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);並びに(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生することを含む方法によって産生される。

一態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞、例えば、TSNK細胞の集団を凍結保存する方法である。一実施態様において、該方法は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生すること、並びに(c)工程(b)由来のNK細胞を凍結保存培地中で凍結保存することを含む。具体的な実施態様において、該工程(c)は、(1)細胞懸濁溶液を調製すること;(2)凍結保存培地を工程(1)由来の細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得ること;(3)工程(3)由来の凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得ること;及び(4)該凍結保存試料を-80℃未満で保存することをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、工程(a)と(b)の間及び工程(b)と(c)の間の中間工程を含まない。

別の実施態様において、該NK細胞、例えば、TSNK細胞の集団を凍結保存する方法は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、IL-2、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、及びヘパリンのうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-2、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する);(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生すること;並びに(c)工程(b)由来のNK細胞を凍結保存培地中で凍結保存することを含む。具体的な実施態様において、該工程(c)は、(1)細胞懸濁溶液を調製すること;(2)凍結保存培地を工程(1)由来の細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得ること;(3)工程(3)由来の凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得ること;及び(4)該凍結保存試料を-80℃未満で保存することをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、工程(a)と(b)の間及び工程(b)と(c)の間の中間工程を含まず、並びに/又は工程(a)の前の追加の培養工程を含まない。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/又はNK細胞集団を凍結保存する、例えば、本明細書に記載の方法を用いて凍結保存する。ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/又はNK細胞集団を、凍結保存培地、例えば、本明細書に記載の凍結保存培地中で凍結保存する。具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/又はNK細胞集団の凍結保存は、(1)本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/又はNK細胞集団を含む細胞懸濁溶液を調製すること;(2)凍結保存培地を工程(1)由来の細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得ること;(3)工程(3)由来の凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得ること;並びに(4)該凍結保存試料を-80℃未満で保存することを含む。

別の具体的な実施態様において、TSNK細胞が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、例えば、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)により測定したとき、マイクロRNAのhsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b、hsa-miR-520a、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/又はNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、例えば、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)により測定したとき、マイクロRNAのhsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b、hsa-miR-520a、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する。

別の具体的な実施態様において、免疫調節化合物又はサリドマイドを、該TSNK細胞と、該ナチュラルキラー細胞が、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で近接させる。別の具体的な実施態様において、免疫調節化合物、例えば、レナリドミドもしくはポマリドミド、又はサリドマイドを、該TSNK細胞と、該細胞が、該免疫調節化合物、例えば、レナリドミドもしくはポマリドミド、又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞よりも検出可能な程度に大きい該腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示すのに十分な量及び時間で近接させる。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞よりも高いレベルで、BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を発現する。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞よりも高いレベルで、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、及び/又はTBX21のうちの1つ又は複数を発現する。

別の具体的な実施態様において、免疫調節化合物又はサリドマイドを、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞又はNK細胞と、該ナチュラルキラー細胞が、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、NK前駆細胞又はNK細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で近接させる。別の具体的な実施態様において、免疫調節化合物、例えば、レナリドミドもしくはポマリドミド、又はサリドマイドを、該NK前駆細胞又はNK細胞と、該細胞が、該免疫調節化合物、例えば、レナリドミドもしくはポマリドミド、又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、NK前駆細胞又はNK細胞よりも検出可能な程度に大きい該腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示すのに十分な量及び時間で近接させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生される該NK前駆細胞又はNK細胞は、BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、NK前駆細胞又はNK細胞よりも高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、及び/又はTBX21のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、例えば、NK前駆細胞又はNK細胞よりも高いレベルで発現する。

上記の治療又は腫瘍抑制の方法のある実施態様において、TSNK細胞を、他のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、もしくは末梢血から単離されるか又は異なる方法によって造血細胞から産生されるナチュラルキラー細胞と組み合わせる。具体的な実施態様において、TSNK細胞を、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団と組み合わせる。別の具体的な実施態様において、TSNK細胞を、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団と組み合わせる。具体的な実施態様において、TSNK細胞を、別の供給源に由来するか又は異なる方法によって作製されるナチュラルキラー細胞(例えば、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団及び/もしくはNK細胞集団)と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

上記の治療又は腫瘍抑制の方法の他の実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団を、他のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、もしくは末梢血から単離されるか又は異なる方法によって造血細胞から産生されるナチュラルキラー細胞と組み合わせる。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞を、別の供給源に由来するか又は異なる方法によって作製されるナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

上記の治療又は腫瘍抑制の方法のある実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団を、他のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、もしくは末梢血から単離されるか又は異なる方法によって造血細胞から産生されるナチュラルキラー細胞と組み合わせる。具体的な実施態様において、該NK細胞を、別の供給源に由来するか又は異なる方法によって作製されるナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたTSNK細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞から産生される。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該組成物中のTSNK細胞の90％、92％、94％、96％、又は98％超は、CD56⁺及びCD16^-である。他の実施態様において、該組成物中のTSNK細胞の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、又は90％は、CD3^-及びCD56⁺である。他の実施態様において、該細胞の少なくとも50％、52％、54％、56％、58％、又は60％は、NKG2D⁺である。他の実施態様において、該細胞の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、又は3％未満は、NKB1⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、NKAT2⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、CD56⁺及びCD16⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％は、CD117⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、又は45％は、CD94⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、12％、14％、16％、18％、又は20％は、CD226⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、又は40％は、CD7⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、又は60％は、CD5⁺である。

別の具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^-TSNK細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^-ナチュラルキラー細胞(TSNK細胞)は、少なくとも2人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該TSNK細胞による治療が意図される個体とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該TSNK細胞が、免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、TSNK細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触又は近接させたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物又はサリドマイドをさらに含む。ある実施態様において、該免疫調節化合物は、下記の化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

より具体的な実施態様において、該組成物は、TSNK細胞、及び別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の供給源は、胎盤血及び/又は臍帯血である。別の具体的な実施態様において、該他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、TSNK細胞を、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、TSNK細胞、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該TSNK細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該TSNK細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下の第5.2.1.1節に記載の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、TSNK細胞及び胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該TSNK細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該TSNK細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法によって産生される単離されたNK前駆細胞又はNK細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞から産生される。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％. 95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該組成物中のNK前駆細胞又はNK細胞の90％、92％、94％、96％、又は98％超は、CD56⁺及びCD16^-である。他の実施態様において、該組成物中のNK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、又は90％は、CD3^-及びCD56⁺である。他の実施態様において、該細胞の少なくとも50％、52％、54％、56％、58％、又は60％は、NKG2D⁺である。他の実施態様において、該細胞の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、又は3％未満は、NKB1⁺である。ある他の実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、NKAT2⁺である。ある他の実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、CD56⁺及びCD16⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％は、CD117⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、又は45％は、CD94⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも10％、12％、14％、16％、18％、又は20％は、CD226⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、又は40％は、CD7⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ NK前駆細胞又はNK細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、又は60％は、CD5⁺である。

具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^- NK前駆細胞又はNK細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^-ナチュラルキラー細胞(NK前駆細胞又はNK細胞)は、少なくとも2人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、該NK前駆細胞又はNK細胞による治療が意図される個体とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞は、該NK前駆細胞又はNK細胞が、免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、NK前駆細胞又はNK細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触又は近接させたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物又はサリドマイドをさらに含む。ある実施態様において、該免疫調節化合物は、下記の化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。

より具体的な実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞又はNK細胞、及び別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の供給源は、胎盤血及び/又は臍帯血である。別の具体的な実施態様において、該他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該NK前駆細胞又はNK細胞を、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞又はNK細胞、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞又はNK細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞又はNK細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下の第5.2.1.1節に記載の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞又はNK細胞、及び胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK前駆細胞又はNK細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK前駆細胞又はNK細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、本明細書に記載の三段階法によって産生される単離されたNK前駆細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物である。具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞から産生される。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％. 95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団内の細胞の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、又は40％以下は、CD3^-CD56⁺細胞である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上は、CD117⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％以上は、CD161⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下は、NKp46⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％以下は、NKp46⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞は、CD16^-である。

別の具体的な実施態様において、該組成物中の該単離されたNK前駆細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞は、少なくとも2人の異なる個体由来のNK前駆細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物中の該単離されたNK前駆細胞は、該NK前駆細胞による治療が意図される個体とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞は、該NK前駆細胞が、免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、NK前駆細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触又は近接させたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物又はサリドマイドをさらに含む。ある実施態様において、該免疫調節化合物は、下記の化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。

より具体的な実施態様において、該組成物は、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるNK前駆細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の供給源は、胎盤血及び/又は臍帯血である。別の具体的な実施態様において、該他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該組成物中のNK前駆細胞集団を、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるNK前駆細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、NK前駆細胞集団、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞集団と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞集団とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下記の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、NK前駆細胞集団及び胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK前駆細胞集団と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK前駆細胞集団とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

(3.1.定義)
本明細書で使用されるように、「免疫調節化合物」及び「IMiD(商標)」という用語は、サリドマイドを包含しない。

本明細書で使用されるように、「レナリドミド」は、3-(4'アミノイソインドリン-1'-オン)-1-ピペリジン-2,6-ジオン(ケミカル・アブストラクツ・サービス名)、又は2,6-ピペリジンジオン,3-(4-アミノ-1,3-ジヒドロ-1-オキソ-2H-イソインドール-2-イル)-(国際純正応用化学連合(IUPAC)名)を意味する。本明細書で使用されるように、「ポマリドミド」は、4-アミノ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドール-1,3-ジオンを意味する。

本明細書で使用されるように、細胞に言及する場合の「寡能性」は、該細胞が別の細胞型の細胞に分化する能力を有することを意味する。ある実施態様において、「寡能性細胞」は、哺乳動物の体の約260種の細胞型の任意のサブセットに成長する能力を有する細胞である。多能性細胞とは異なり、寡能性細胞は、該細胞型の全てを形成する能力を有するわけではない。

本明細書で使用されるように、「フィーダー細胞」は、第二のタイプの細胞が維持され、おそらくは増殖することができる環境を提供するために、該第二のタイプの細胞と共培養されるあるタイプの細胞を指す。任意の理論に束縛されるものではないが、フィーダー細胞は、標的細胞に対して、例えば、ペプチド、ポリペプチド、電気信号、有機分子(例えば、ステロイド)、核酸分子、成長因子(例えば、bFGF)、他の因子(例えば、サイトカイン)、及び代謝栄養素を提供することができる。ある実施態様において、フィーダー細胞は、単層で成長する。

本明細書で使用されるように、さらなる修飾のない「ナチュラルキラー細胞」又は「NK細胞」には、任意の組織源由来のナチュラルキラー細胞が含まれる。一実施態様において、該NK細胞は、成熟NK細胞マーカーのCD16、低発現のCD56(「CD56dim」)、及びKIRを有する細胞を含むNK細胞集団と特徴付けられる。

本明細書で使用されるように、「NK前駆細胞集団」という用語は、例えば、1以上の表現型マーカー、例えば、CD56、CD16、及びKIRの発現のレベルによって示したとき、まだ成熟NK細胞になっていないナチュラルキラー細胞系譜の細胞を含む細胞の集団を指す。一実施態様において、NK前駆細胞集団は、CD16低及びCD56高の細胞を含む。

本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部に通した、例えば、胎盤血管系に通した灌流溶液を意味し、これは、胎盤に通す間に、該灌流溶液によって回収される複数の細胞を含む。

本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離されるか又は単離可能である有核細胞、例えば、全有核細胞を意味する。

本明細書で使用されるように、「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、腫瘍細胞の集団の成長を、例えば、TSNK細胞もしくはTSNK細胞を含む細胞の集団、NK前駆細胞集団、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団を、該腫瘍細胞の集団と接触又は近接させ、例えば、該腫瘍細胞の集団を、TSNK細胞もしくはTSNK細胞を含む細胞の集団、NK前駆細胞集団、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団と接触させることによって、例えば、該腫瘍細胞の集団内の腫瘍細胞の1つ又は複数を死滅させることにより減速させることを含む。

本明細書で使用されるように、「造血細胞」という用語は、造血幹細胞及び造血前駆細胞を含む。

本明細書で使用されるように、「不確定成分」は、その構成成分が、通常は、提供も定量もされない成分を指す培養培地分野の専門用語である。「不確定成分」の例としては、限定するものではないが、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)及び胎仔血清(例えば、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)又は胎仔ウシ血清(fetal calf serum))が挙げられる。

本明細書で使用されるように、「+」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、該細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別で、アイソタイプ対照と比べて検出可能な程度に存在すること;又は定量的もしくは半定量的RT-PCRで、バックグラウンドを上回って検出可能であることを意味する。

本明細書で使用されるように、「-」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、該細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別で、アイソタイプ対照と比べて検出可能な程度には存在しないこと;又は定量的もしくは半定量的RT-PCRで、バックグラウンドを上回るほど検出可能ではないことを意味する。

(4.図面の簡単な説明)
様々な培地製剤を用いて造血幹細胞(HSC)から分化させたNK細胞の増殖倍率。エラーバーは、3人のドナーからの標準偏差を表す。X軸:培養の日数(D)。Y軸:0日(培養の開始)と比較した増殖倍率。

NK2A培地を用いた培養NK細胞の表現型の特徴付け。細胞をPE-抗CD56、FITC-抗CD3、PerCP-抗CD16で三重標識した。横線、縦線:バックグラウンドを有意に上回る蛍光標識のレベル。

NK2A(FF)、NK2A(フィーダー細胞としての胎盤幹細胞)、NK2A(フィーダー細胞としてのMSC)、又は二段階NK培地を用いて培養されたNK細胞の増殖倍率。X軸:培養の日数(D)。Y軸:0日(培養の開始)と比較した増殖倍率。

培養開始45日後の、NK2A(フィーダー細胞なし)、二段階NK培地;フィーダー細胞としてのCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞(PSC)を含むNK2A、フィーダー細胞としての骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を含むNK2Aを用いて培養されたNK細胞の細胞傷害性。3人のドナーからの代表的なデータを図4に示す。

培養41日目(D41)のNK細胞の表現型の特徴付け。3人の個々のドナーからの代表的なデータを示す。X軸:CD3^-CD56⁺、CD16^-CD56⁺、もしくはCD16⁺CD56⁺であるか;又はNKB1、NKG2D、NKp46、CD94、CD117、CD226、CD7、もしくはCD5を発現する、二段階法によって産生されたNK細胞のパーセンテージ。培養開始後41日(D41)で、細胞を、NK2A(フィーダー細胞なし)、二段階NK培地;フィーダー細胞としてのCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞(PSC)を含むNK2A、フィーダー細胞としての骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を含むNK2A中で培養した。

NK2A培地中でのNK培養の間のCD56⁺CD3^- NK細胞集団におけるCD94及びCD117の発現。CD56⁺CD94⁺CD117⁺細胞の主要な集団を、胚性幹細胞(ESC)由来NK細胞(CD56⁺CD94⁺CD117^low/-)と区別可能であるNK2A培地中の培養NK細胞から同定した。3人のドナーからの代表的なデータを図6に示す。X軸:フィコエリスリン(PE)標識抗CD94由来の蛍光。Y軸:APC標識抗CD117由来の蛍光。横線、縦線:バックグラウンドを有意に上回る蛍光標識のレベル。D13、D20、D28、D35:CD34⁺細胞培養開始後13日、20日、28日、及び35日。

MSC及びNK2A培地のみと比較した培養NK細胞に対する胎盤幹細胞の効果。X軸:フィーダー層(FF)なしでNK2A培地中で培養されたNK細胞;フィーダー層としての骨髄由来間葉系幹細胞(MCS)とともにNK2A培地中で培養されたNK細胞;又はフィーダー層としてのCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC)とともにNK2A培地中で培養されたNK細胞。Y軸(左):残存する腫瘍細胞のパーセンテージとして表された、細胞傷害性(1.0＝100％);細胞傷害性は、白塗りの四角で表示されている。Y軸(右):二工程法を用いたNK細胞の増殖倍率;増殖倍率は、アステリスクとして表されている。

8A〜8B:解凍後CD34⁺細胞の純度に対する臍帯血(UCB)とヒト胎盤灌流液(HPP)の相対比率の効果。図8A:CD34⁺Lin^-純度に対するHPP容積含有量(vol％)の効果。X軸:プールされたUCB及びHPP(組合せ(Combo))中のHPPの容積割合。Y軸:CD34⁺Lin^-細胞のパーセンテージ。図8B.CD34⁺Lin^-純度に対するHPP TNC含有量(TNC％)の効果。Y軸:CD34⁺Lin^-細胞のパーセンテージ。

PKH26-TOPRO3で標識された様々な腫瘍細胞株に対する35日培養(D35)NK細胞のFACSベースの細胞傷害性アッセイ。エラーバーは、3連で実施された実験間の標準偏差を表す。

HCT-116細胞に対するD35 NK細胞の細胞傷害性を評価するためのLDH放出アッセイ。エフェクター(NK細胞)対腫瘍(HCT-116細胞)細胞比をX軸に示す。

K562腫瘍異種移植モデルにおけるD35 NK細胞のインビボ細胞傷害性。

HCT-116腫瘍異種移植モデルにおけるD35 NK細胞のインビボ細胞傷害性。

U-87MG腫瘍異種移植モデルにおけるD35 NK細胞のインビボ細胞傷害性。

図14A〜14B: IL-2(A)もしくはIL-15の存在下、又はサイトカインの非存在下(B)での、BT474腫瘍異種移植モデルにおけるD35 NK細胞のインビボ細胞傷害性。

図15A〜15C:図14Bに示されるインビボ研究の終点で回収されたBT474腫瘍異種移植片の連続切片のヘマトキシリン及びエオシン(H&E; A、左のパネル)及び免疫組織化学(B、C)染色。B及びCでは、ヒトの核が示されており、矢印は、CD56抗体(B、中央のパネル)及びNKp46抗体(C、右のパネル)で染色された細胞を示している。

図16A〜16B: K562細胞(A、上のパネル)及びD35 NK細胞(B、下のパネル)の免疫蛍光解析。全ての画像で核が染色されている;左の画像＝抗CD56;中央の画像＝抗NKG2D;右の画像＝抗NKp46。バー＝50μm。

図17A〜17F:マウス由来のヒト腫瘍異種移植片の免疫蛍光解析。A〜D:ビヒクルの投与後に撮像されたK562異種移植片(A);静脈内(I.V.)投与されたD35 NK細胞(B);ビヒクル＋IL-2 I.V.(C);及びD35 NK細胞＋IL-2 I.V.(D)。E及びF:ビヒクル＋IL-2 I.V.の投与後に撮像されたBT474異種移植片(E);及びD35 NK細胞＋IL-2 I.V(F)。全ての画像で核が染色されている;左の画像＝抗CD56;中央の画像＝抗NKG2d;右の画像＝抗NKp46。バー＝50μm。

図18A〜18D:ヒト造血サイトカイン(IL-2及びIL-15)発現NSGSマウスにおける二段階D35 NK細胞のインビボでの生体分布及び持続性。示されているのは、移植後の様々な時点(d＝日数)のIL-2(A、C)及びIL-15(B、D)処置マウスにおけるマウスCD45と比較したヒトCD45(二段階D35 NK細胞のマーカーとして)のパーセンテージである。A、BS＝血液の解析; C、D＝肝臓の解析。

表示されたマーカーについて蛍光支援細胞選別(FACS)により解析されたインビトロで培養された二段階D35 NK細胞:上＝CD56+対CD16+;左下＝CD56+対KIR2DL2/DL3/DS2+;右下＝CD56+対KIR3DL1/DS1+。

インビボ養子移植後28日目に検出されたヒト造血サイトカイン(IL-15)発現NSGSマウスにおける二段階D35 NK細胞のインビボ成熟。左上＝マウスCD45対ヒトCD45。右のパネルは、ヒトCD45細胞集団のさらなる解析を示す:上＝CD56+対CD16+;下＝KIR2DL2/DL3/DS2+対KIR3DL1/DS1+。

遺伝的に誘導された初代白血病性幹細胞に対するD35 NK細胞集団のインビトロ死滅化活性。D35 NK細胞集団の細胞傷害性の液体共培養アッセイの結果。MLL＝MLL-AF9を発現する改変されたCD34+細胞; THP1＝ヒト急性単球性白血病細胞株; K562＝K562腫瘍細胞株。y軸の値は×10⁶である。

D35 NK細胞集団の細胞傷害性のメチルセルロースアッセイ。示されているのは、図18に示した生体分布研究由来のD35 NK細胞集団のエクスビボで単離された細胞を用いたAMLコロニー形成細胞の死滅化である。MLL＝MLL-AF9を発現する改変されたCD34+細胞; K562＝K562腫瘍細胞株。

図23A〜23F: MLL移植後8週間にわたる白血病細胞検出の頻度。A. MLL細胞の移植後の処置の模式図。DA＝ドキソルビシン及びドセタキセル; D＝日数で示した実験の時点(B及びCのグラフで表示されているように、マウスがそれより早く死なない限り、58日＝終点); NK＝D35 NK細胞集団。B.グラフは、対照群-PBS(B)又はIL-15(C)が投与された群-並びにIL-15及び化学療法のみ(D)又はD35 NK細胞集団のNK細胞＋IL-15及び化学療法のどちらかが投与された群(E)における蛍光細胞の数を示す。(F)は、パートC、D、及びEに示された結果のまとめを提供するものである。残存するAML細胞の量がY軸に示されており;値は、末梢血中のAML細胞のパーセンテージを表している。

インビボ養子移植の4週間後に21日(D21)のNK前駆細胞集団から生成した骨髄生着ヒト細胞集団。

インビボ養子移植の4週間後の骨髄生着D21 NK前駆細胞集団のインビボ細胞周期解析。

D21 NK前駆細胞集団由来骨髄生着CD56-CD16-前駆体のエクスビボ分化。

エクスビボで成熟NK細胞に分化したD21 NK前駆細胞集団の細胞傷害活性。

HL60細胞と比較したときの、D21 NK前駆細胞(NK-D21)及びD35 NK細胞(NK-D35)細胞、並びに末梢血(PB)NK細胞を含む他の細胞の相対的テロメア長。

(5.詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞からNK細胞を産生し、増殖する新規の方法である。また本明細書に提供されるのは、造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞からNK前駆細胞集団及びNK細胞集団を産生する方法、例えば、三段階法である。NK細胞、及びNK細胞集団、並びにNK前駆細胞集団を産生するために使用される造血細胞は、任意の供給源、例えば、限定するものではないが、胎盤、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、又は肝臓から単離されてもよい。ある実施態様において、該NK細胞、NK細胞集団、又はNK前駆細胞集団は、増殖された造血細胞、例えば、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞から産生される。一実施態様において、造血細胞は、そのような細胞の供給源、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、肝臓、及び/又は骨髄から回収される。具体的な実施態様において、造血細胞は、フィーダー細胞を用いないで、第一の培地中で、連続的に増殖され、分化させられる。その後、該細胞は、フィーダー細胞の存在下、第二の培地中で培養される。代替の実施態様において、培養は、フィーダー細胞の非存在下、第二の培地中でのものである。そのような単離、増殖、及び分化は、中心施設で実施することができ、それにより、使用地点、例えば、病院、軍事基地、軍部の前線などでの分散的な増殖及び分化のための輸送用の増殖された造血細胞が提供される。

(5.1造血細胞)
本明細書に開示される方法において有用な造血細胞は、NK細胞及び/又はNK前駆細胞に分化することができる任意の造血細胞、例えば、前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞などであることができる。造血細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血、肝臓など、又はそれらの組合せなどの組織源から得ることができる。造血細胞は、胎盤から得ることができる。具体的な実施態様において、造血細胞は、胎盤灌流液から得られる。一実施態様において、造血細胞は、臍帯血から得られない。一実施態様において、造血細胞は、末梢血から得られない。胎盤灌流液由来の造血細胞は、胎児造血細胞と母親造血細胞の混合物、例えば、母親細胞が造血細胞の総数の5％超を含む混合物を含むことができる。好ましくは、胎盤灌流液由来の造血細胞は、少なくとも約90％、95％、98％、99％、又は99.5％の胎児細胞を含む。

別の具体的な実施態様において、TSNK細胞が産生されるか又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団もしくはNK細胞集団が産生される造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、胎盤灌流液、臍帯血、又は末梢血から得られる。別の具体的な実施態様において、TSNK細胞が産生されるか又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団もしくはNK細胞集団が産生される、造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、胎盤灌流液及び臍帯血、例えば、該灌流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する組み合わされた細胞である。別の具体的な実施態様において、該臍帯血は、該胎盤灌流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離される。ある実施態様において、該組み合わされた細胞は、該臍帯血及び胎盤灌流液をプールするか又は組み合わせることによって得ることができる。ある実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、容積で100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせて、該組み合わされた細胞を得る。具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1〜1:10、5:1〜1:5、又は3:1〜1:3の比率で組み合わせる。別の具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、又は1:10の比率で組み合わせる。より具体的な実施態様において、該臍帯血及び胎盤灌流液を、8.5:1.5(85％:15％)の比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞が産生されるか、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団もしくはNK細胞集団が産生される、造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血と胎盤灌流液の両方に由来するものであるが、その場合、該臍帯血は、該胎盤灌流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離される。

ある実施態様において、該造血細胞はCD34⁺細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に開示される方法において有用な造血細胞は、CD34⁺CD38⁺又はCD34⁺CD38^-である。より具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺CD38^-Lin^-である。別の具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD2^-、CD3^-、CD11b^-、CD11c^-、CD14^-、CD16^-、CD19^-、CD24^-、CD56^-、CD66b^-、及び/又はグリコフォリンA^-のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD2^-、CD3^-、CD11b^-、CD11c^-、CD14^-、CD16^-、CD19^-、CD24^-、CD56^-、CD66b^-、及びグリコフォリンA^-である。別のより具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺CD38^-CD33^-CD117^-である。別のより具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺CD38^-CD33^-CD117^-CD235^-CD36^-である。

別の実施態様において、該造血細胞はCD45⁺である。別の具体的な実施態様において、該造血細胞はCD34⁺CD45⁺である。別の実施態様において、該造血細胞はThy-1⁺である。具体的な実施態様において、該造血細胞はCD34⁺Thy-1⁺である。別の実施態様において、該造血細胞はCD133⁺である。具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺CD133⁺又はCD133⁺Thy-1⁺である。別の具体的な実施態様において、該CD34⁺造血細胞はCXCR4⁺である。別の具体的な実施態様において、該CD34⁺造血細胞はCXCR4^-である。別の実施態様において、該造血細胞は、KDR(血管成長因子受容体2)が陽性である。具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺KDR⁺、CD133⁺KDR⁺、又はThy-1⁺KDR⁺である。ある他の実施態様において、該造血細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼが陽性(ALDH⁺)であり、例えば、該細胞はCD34⁺ALDH⁺である。

ある他の実施態様において、該CD34⁺細胞はCD45^-である。具体的な実施態様において、該CD34⁺細胞、例えば、CD34⁺、CD45^-細胞は、miRNAのhsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b、hsa-miR-520a、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及び/又はhsa-miR-618のうちの1つもしくは複数、又は全てを発現する。

ある実施態様において、該造血細胞はCD34^-である。

該造血細胞はまた、系譜決定(lineage commitment)又は発生的未感作性(developmental naivete)の欠如を示す特定のマーカーを欠如していてもよい。例えば、別の実施態様において、該造血細胞はHLA-DR^-である。具体的な実施態様において、該造血細胞は、CD34⁺HLA-DR^-、CD133⁺HLA-DR^-、Thy-1⁺HLA-DR^-、又はALDH⁺HLA-DR^-である。別の実施態様において、該造血細胞は、系譜マーカーCD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、及びグリコフォリンAのうちの1つ又は複数、好ましくは、その全てが陰性である。

したがって、造血細胞は、未分化状態を示すマーカーの存在に基づくか、又は少なくともいくつかの系譜分化が起こったことを示す系譜マーカーの不在に基づいて、本明細書に開示される方法での使用のために選択することができる。特定のマーカーの存在又は不在に基づいて、造血細胞を含む細胞を単離する方法は、例えば、以下で詳細に論じられている。

本明細書に提供される方法で使用される造血細胞は、実質的に均一な集団、例えば、単一の組織源由来の少なくとも約95％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の造血細胞を含む集団、又は同じ造血細胞関連細胞マーカーを示す造血細胞を含む集団であることができる。例えば、様々な実施態様において、該造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血、又は胎盤、例えば、胎盤灌流液由来の少なくとも約95％、98％、又は99％の造血細胞を含むことができる。

本明細書に提供される方法で使用される造血細胞を、単一の個体から、例えば、単一の胎盤から、又は複数の個体から得ることができ、例えば、プールすることができる。該造血細胞を複数の個体から得て、プールする場合、該造血細胞を同じ組織源から得てもよい。したがって、様々な実施態様において、プールされた造血細胞は全て、胎盤、例えば、胎盤灌流液由来のもの、全て胎盤血由来のもの、全て臍帯血由来のもの、全て末梢血由来のものなどである。

本明細書に開示される方法で使用される造血細胞は、ある実施態様において、2以上の組織源由来の造血細胞を含むことができる。例えば、ある実施態様において、2以上の源由来の造血細胞を本明細書中の方法での使用のために組み合わせる場合、TSNK細胞を産生するために使用される複数の造血細胞は、胎盤、例えば、胎盤灌流液由来の造血細胞を含む。様々な実施態様において、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団もしくはNK細胞集団を産生するために使用される造血細胞は、胎盤由来及び臍帯血由来の;胎盤及び末梢血由来の;胎盤及び胎盤血由来の、又は胎盤及び骨髄由来の造血細胞を含む。好ましい実施態様において、該造血細胞は、臍帯血由来の造血細胞と組み合わせた胎盤灌流液由来の造血細胞を含み、ここで、該臍帯血及び胎盤は、同じ個体に由来するものであり、すなわち、該灌流液及び臍帯血はマッチしている。造血細胞が2つの組織源由来の造血細胞を含む実施態様において、該源由来の造血細胞は、例えば、1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、又は9:1の比率で組み合わせることができる。

(5.1.1.胎盤造血幹細胞)
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で使用される造血細胞は、胎盤造血細胞である。本明細書で使用されるように、「胎盤造血細胞」は、胎盤それ自体から得られる造血細胞であって、胎盤血からも臍帯血からも得られないものを意味する。一実施態様において、胎盤造血細胞はCD34⁺である。具体的な実施態様において、該胎盤造血細胞は、主に(例えば、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％)CD34⁺CD38^-細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤造血細胞は、主に(例えば、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％)CD34⁺CD38⁺細胞である。胎盤造血細胞は、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、灌流によって、分娩後の哺乳動物(例えば、ヒト)胎盤から得ることができる。

別の実施態様において、該胎盤造血細胞はCD45^-である。具体的な実施態様において、該造血細胞はCD34⁺CD45^-である。別の具体的な実施態様において、該胎盤造血細胞はCD34⁺CD45⁺である。

(5.2.ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー細胞集団、及びナチュラルキラー前駆細胞集団の産生)
本方法によるNK細胞、NK細胞集団、及びNK前駆細胞集団の産生は、造血細胞の集団を増殖することを含む。細胞増殖の間に、該造血細胞集団内の複数の造血細胞はNK細胞に分化する。

(5.2.1. TSNK細胞の産生)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する方法であって:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);並びに(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NKの集団を産生することを含む、方法である。

別の実施態様において、本明細書に提供されるNK細胞は、NK細胞の増殖/分化及び成熟の二工程プロセスによって産生される。第一の工程及び第二の工程は、該細胞を独特な組合せの細胞因子を含む培地中で培養することを含む。ある実施態様において、該プロセスは、(a)造血細胞の集団を、該造血細胞集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞がNK細胞に分化する第一の培地中で培養し、増殖すること;及び(b)工程(a)由来のNK細胞を、該NK細胞がさらに増殖され、分化し、かつ該NK細胞が成熟する(例えば、活性化されるか又は別の方法で細胞傷害活性を有する)第二の培地中で増殖することを含む。ある実施態様において、該方法は、工程(a)と(b)の間の中間工程、工程(a)の前の追加の培養工程、及び/又は工程(b)の後の追加の工程(例えば、成熟工程)を含まない。

(5.2.1.1.第一の培養工程)
ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、造血細胞の集団を、該造血細胞集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞がNK細胞に分化する第一の培地中で培養し、増殖する第一の工程を含む。

任意のパラメータ、機序、又は理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に提供される造血細胞の培養は、連続する該造血細胞の増殖と該細胞からのNK細胞及び/又はNK前駆細胞集団の分化をもたらす。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で使用される造血細胞、例えば、幹細胞又は前駆細胞を、フィーダー層を用いて、第一の工程で増殖し、分化させる。他の実施態様において、造血細胞、例えば、幹細胞又は前駆細胞を、フィーダー層を用いないで、第一の工程で増殖し、分化させる。

造血細胞のフィーダー細胞非依存的な増殖及び分化は、細胞の培養及び増殖と適合する任意の容器、例えば、フラスコ、チューブ、ビーカー、ディッシュ、マルチウェルプレート、バッグなどの中で生じることができる。具体的な実施態様において、造血細胞のフィーダー細胞非依存的な増殖は、バッグ、例えば、可撓性で、ガス透過性のフルオロカーボン培養バッグ(例えば、American Fluoroseal製)の中で生じる。具体的な実施態様において、造血細胞を増殖する容器は、例えば、増殖されたNK細胞をさらに増殖し、分化させる、病院又は軍事区域などの場所への輸送に好適である。

ある実施態様において、造血細胞を、例えば、第一の培養培地中で、連続的な様式で、増殖し、分化させる。一実施態様において、該第一の培養培地は、動物成分不含培地である。本明細書に提供される方法において有用な例示的な動物成分不含培地としては、イーグル基本培地(BME)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、グラスゴー最小必須培地(GMEM)、ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12ハム(DMEM/F-12)、最小必須培地(MEM)、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、栄養混合物F-10ハム(ハムF-10)、栄養混合物F-12ハム(ハムF-12)、RPMI-1640培地、ウィリアム培地E、STEMSPAN(登録商標)(カタログ番号Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)、Glycostem基本成長培地(GBGM(登録商標))、AIM-V(登録商標)培地(Invitrogen)、X-VIVO(商標)10(Lonza)、X-VIVO(商標)15(Lonza)、OPTMIZER(Invitrogen)、STEMSPAN(登録商標)H3000(STEMCELL Technologies)、CELLGRO COMPLETE(商標)(Mediatech)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、もしくは任意の改変型変種、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施態様において、第一の培養培地は、インターロイキン-15(IL-15)、並びに1以上の他の培地添加物(例えば、栄養、サイトカイン、及び/又は因子)を含む。本明細書に提供される方法での使用に好適な培地添加物としては、例えば、限定するものではないが、血清(例えば、ヒト血清AB、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS))、ビタミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、アミノ酸(例えば、L-グルタミン)、脂肪酸(例えば、オレイン酸、リノール酸、もしくはパルミチン酸)、インスリン(例えば、組換えヒトインスリン)、トランスフェリン(鉄飽和ヒトトランスフェリン)、β-メルカプトエタノール、幹細胞因子(SCF)、Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3-L)、サイトカイン、例えば、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-7(IL-7)、トロンボポエチン(Tpo)、ヘパリン、又はO-アセチル-カルニチン(アセチルカルニチン、O-アセチル-L-カルニチン、もしくはOACとも呼ばれる)が挙げられる。具体的な実施態様において、本明細書で使用される培地は、ヒト血清ABを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書で使用される培地は、FBSを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書で使用される培地は、OACを含む。

ある実施態様において、第一の培地は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP1α)、又は白血病抑制因子(LIF)のうちの1つ又は複数を含まない。

したがって、一態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞を産生する二工程法であり、ここで、該第一の工程は、造血細胞の集団を、フィーダー細胞の非存在下、第一の培養培地中で増殖し、分化させることを含み、該造血細胞の集団内の複数の造血細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化し、該培地は、1〜約150ng/mLの濃度のIL-15、約1〜約150ng/mLの濃度のSCF、約50〜約1500IU/mLの濃度のIL-2、約1〜約150ng/mLの濃度のIL-7、及び約0.1〜約30IU/mLの濃度のヘパリンを含み、該SCF、IL-2、IL-7、IL-15、及びヘパリンは、該培地の不確定成分(例えば、血清)中に含まれない。ある実施態様において、該培地は、O-アセチル-カルニチン(アセチルカルニチン、O-アセチル-L-カルニチン、もしくはOACとも呼ばれる)、又はミトコンドリアでアセチル-CoA循環に影響を及ぼす化合物、チアゾビビン、Y-27632、パイインテグリン、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、カスパーゼ阻害剤、もしくは他の抗アポトーシス化合物/ペプチド、NOVA-RS(Sheffield Bio-Science)、又は他の小分子成長促進剤のうちの1つ又は複数を含む。ある実施態様において、該培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールを含む。ある実施態様において、該培地は、約0.5mM〜10mMのOACを含む。一実施態様において、該培地は、Stemspan(登録商標)H3000、及び/又はDMEM:F12、及び約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10mMのOACを含む。該方法の具体的な実施態様において、該培地は、GBGM(登録商標)である。別の具体的な実施態様において、該培地は、STEMSPAN(登録商標)H3000及び約5mMのOACを含む。別の具体的な実施態様において、該培地は、DMEM:F12及び約5mMのOACを含む。該OACは、本明細書に提供される培養方法の間、いつでも添加することができる。ある実施態様において、該OACは、第一の培地に及び/又は第一の培養工程の間に添加される。いくつかの実施態様において、該OACは、培養0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21日目に、第一の培地に添加される。具体的な実施態様において、該OACは、第一の培養工程の7日目に、第一の培地に添加される。より具体的な実施態様において、該OACは、培養の7日目に、第一の培地に添加され、第一の培養工程及び第二の培養工程の間中、存在する。ある実施態様において、該OACは、第二の培地に及び/又は第二の培養工程の間に添加される。いくつかの実施態様において、該OACは、培養22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35日目に、第二の培地に添加される。

別の具体的な実施態様において、該培地は、約5〜20％のBSA、約1〜10μg/mLの組換えヒトインスリン、約10〜50μg/mLの鉄飽和ヒトトランスフェリン、及び約10〜50μMのβ-メルカプトエタノールが補充されたIMDMである。別の具体的な実施態様において、該培地は、IL-11、IL-3、ホメオボックス-B4(HoxB4)、及び/もしくはメチルセルロースのうちの1つもしくは複数、又はそのいずれをも含まない。

他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.1〜約500ng/mL;約5〜約100ng/mL;又は約20ng/mLの濃度のSCFを含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約10〜約2000IU/mL;又は約100〜約500IU/mL;又は約200IU/mLの濃度のIL-2を含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.1〜約500ng/mL;約5〜約100ng/mL;又は約20ng/mLの濃度のIL-7を含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.1〜約500ng/mL;約5〜約100ng/mL;又は約10ng/mLの濃度のIL-15を含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.05〜約100U/mL;又は約0.5〜約20U/ml;又は約1.5U/mLの濃度のヘパリンを含む。

該方法のさらに他の具体的な実施態様において、該培地は、約1〜約150ng/mLの濃度のFms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、約1〜約150ng/mLの濃度のトロンボポエチン(Tpo)、又は両方の組合せをさらに含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.1〜約500ng/mL;約5〜約100ng/mL;又は約20ng/mLの濃度のFlt-3Lを含む。他の具体的な実施態様において、該培地は、約0.1〜約500ng/mL;約5〜約100ng/mL;又は約20ng/mLの濃度のTpoを含む。

該方法のより具体的な実施態様において、第一の培養培地は、約20ng/mLのSCF、約20ng/mLのIL-7、約10ng/mLのIL-15を含むGBGM(登録商標)である。該方法の別のより具体的な実施態様において、第一の培養培地は、約20ng/mLのSCF、約20ng/mLのFlt3-L、約200IU/mLのIL-2、約20ng/mLのIL-7、約10ng/mLのIL-15、約20ng/mLのTpo、及び約1.5U/mLのヘパリンを含むGBGM(登録商標)である。別の具体的な実施態様において、該第一の培養培地は、10％のヒト血清(例えば、ヒト血清AB)又は胎仔血清(例えば、FBS)をさらに含む。

別の実施態様において、造血細胞を、免疫調節化合物と接触も近接もさせていない同等数の造血細胞と比較して、所与の時間にわたる該造血細胞の増殖の検出可能な増加をもたらすのに十分な時間及び量で、例えば、該第一の培地中で、免疫調節化合物、例えば、TNF-α阻害化合物と接触又は近接させて培養することによって、該細胞を増殖する。例えば、その開示が引用により完全に本明細書に組み込まれる、米国特許第7,498,171号として発行された、米国特許出願公開第2003/0235909号を参照されたい。ある実施態様において、免疫調節化合物は、アミノ置換イソインドリンである。好ましい実施態様において、免疫調節化合物は、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオン; 3-(4'アミノイソインドリン-1'-オン)-1-ピペリジン-2,6-ジオン; 4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン;又は4-アミノ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドール-1,3-ジオンである。別の好ましい実施態様において、免疫調節化合物は、ポマリドミド、又はレナリドミドである。別の実施態様において、該免疫調節化合物は、以下の構造を有する化合物、又は医薬として許容し得るその塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物であり、

式中、X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH₂であり、R²は、水素もしくは低級アルキルである。別の実施態様において、該免疫調節化合物は、以下の構造を有する化合物、又は医薬として許容し得るその塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物であり、

式中、X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、CH₂又はC=Oであり;
R¹は、H、(C₁-C₈)アルキル、(C₃-C₇)シクロアルキル、(C₂-C₈)アルケニル、(C₂-C₈)アルキニル、ベンジル、アリール、(C₀-C₄)アルキル-(C₁-C₆)ヘテロシクロアルキル、(C₀-C₄)アルキル-(C₂-C₅)ヘテロアリール、C(O)R³、C(S)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)アルキル-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)アルキル-OR⁵、(C₁-C₈)アルキル-C(O)OR⁵、C(O)NHR³、C(S)NHR³、C(O)NR³R^3'、C(S)NR³R^3'、又は(C₁-C₈)アルキル-O(CO)R⁵であり;
R²は、H、F、ベンジル、(C₁-C₈)アルキル、(C₂-C₈)アルケニル、又は(C₂-C₈)アルキニルであり;
R³及びR^3'は、独立に、(C₁-C₈)アルキル、(C₃-C₇)シクロアルキル、(C₂-C₈)アルケニル、(C₂-C₈)アルキニル、ベンジル、アリール、(C₀-C₄)アルキル-(C₁-C₆)ヘテロシクロアルキル、(C₀-C₄)アルキル-(C₂-C₅)ヘテロアリール、(C₀-C₈)アルキル-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)アルキル-OR⁵、(C₁-C₈)アルキル-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)アルキル-O(CO)R⁵、又はC(O)OR⁵であり;
R⁴は、(C₁-C₈)アルキル、(C₂-C₈)アルケニル、(C₂-C₈)アルキニル、(C₁-C₄)アルキル-OR⁵、ベンジル、アリール、(C₀-C₄)アルキル-(C₁-C₆)ヘテロシクロアルキル、又は(C₀-C₄)アルキル-(C₂-C₅)ヘテロアリールであり;
R⁵は、(C₁-C₈)アルキル、(C₂-C₈)アルケニル、(C₂-C₈)アルキニル、ベンジル、アリール、又は(C₂-C₅)ヘテロアリールであり;
R⁶の各々の出現は、独立に、H、(C₁-C₈)アルキル、(C₂-C₈)アルケニル、(C₂-C₈)アルキニル、ベンジル、アリール、(C₂-C₅)ヘテロアリール、もしくは(C₀-C₈)アルキル-C(O)O-R⁵であるか、又はR⁶基は結合して、ヘテロシクロアルキル基を形成することができ;
nは0又は1であり;かつ
^*は、キラル炭素中心を表す。別の実施態様において、該免疫調節化合物は、以下の構造を有する化合物、又は医薬として許容し得るその塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物であり、

式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、もう一方は、CH₂又はC=Oであり;
Rは、H又はCH₂OCOR'であり;
(i)R¹、R²、R³、もしくはR⁴の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R¹、R²、R³、もしくはR⁴のうちの1つは、ニトロもしくは NHR⁵であり、かつR¹、R²、R³、もしくはR⁴のうちの残りは水素であり;
R⁵は、水素又は炭素1〜8個のアルキルであり
R⁶は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R'はR⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)であり;
R⁷は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(C_nH_2n)-であり、ここで、nは0〜4の値を有し;
R⁸及びR⁹の各々は、他方とは独立に、水素もしくは炭素原子1〜8個のアルキルであるか、又はR⁸及びR⁹は一緒になって、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、もしくは-CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-であり、ここで、X₁は、-O-、-S-、もしくは-NH-であり;
R¹⁰は、水素、炭素原子〜8個のアルキル、又はフェニルであり;かつ
^*は、キラル炭素中心を表す。

具体的な実施態様において、造血細胞の増殖は、20％BITS(ウシ血清アルブミン、組換えヒトインスリン、及びトランスフェリン)、SCF、Flt-3リガンド、IL-3、及び4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン(0.05％DMSO中、10μM)が補充されたIMDM中で行われる。より具体的な実施態様において、約5×10⁷個の造血細胞、例えば、CD34⁺細胞を、該培地中で、約5×10¹⁰細胞〜約5×10¹²細胞まで増殖し、これを100mLのIMDMに再懸濁して、増殖された造血細胞の集団を産生する。増殖された造血細胞の集団は、輸送しやすくするために凍結保存されることが好ましい。

様々な具体的な実施態様において、造血細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、又は99％をNK細胞に分化させる。

ある実施態様において、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、増殖及び分化の間、1ミリリットル当たり約2×10⁴〜約6×10⁶細胞、例えば、1ミリリットル当たり約2×10⁴〜約2×10⁵細胞で維持することを含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、1ミリリットル当たり約1×10⁵細胞、1×10⁴細胞、又は1×10³細胞以下で維持することを含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、1ミリリットル当たり約1×10⁵細胞、1ミリリットル当たり2×10⁵細胞、1ミリリットル当たり3×10⁵細胞、1ミリリットル当たり4×10⁵細胞、1ミリリットル当たり5×10⁵細胞、1ミリリットル当たり6×10⁵細胞、1ミリリットル当たり7×10⁵細胞、1ミリリットル当たり8×10⁵細胞、1ミリリットル当たり9×10⁵細胞、1ミリリットル当たり1×10⁶細胞、1ミリリットル当たり2×10⁶細胞、1ミリリットル当たり3×10⁶細胞、1ミリリットル当たり4×10⁶細胞、1ミリリットル当たり5×10⁶細胞、1ミリリットル当たり6×10⁶細胞、1ミリリットル当たり7×10⁶細胞、1ミリリットル当たり8×10⁶細胞、又は1ミリリットル当たり9×10⁶細胞以下で維持することを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される細胞を培養する方法であり、ここで、1cm²当たり約1×10³〜5×10³、5×10³〜1×10⁴、1×10⁴〜5×10⁴、5×10⁴〜1×10⁵、1×10⁵〜5×10⁵、5×10⁵〜1×10⁶、1×10⁶〜5×10⁶、5×10⁶〜1×10⁷、1×10⁷〜5×10⁷個、又はそれよりも多い細胞の密度が達成される。

造血細胞の増殖、及びNK細胞への分化にかかる時間は、例えば、約3日〜約120日であり得る。一実施態様において、分化時間は、約7日〜約75日である。別の実施態様において、分化時間は、約14日〜約50日である。具体的な実施態様において、分化時間は、約21日〜約28日である。

(5.2.1.2.第二の工程)
本明細書に提供される方法では、造血細胞、例えば、幹細胞又は前駆細胞、及び第一の工程から得られる、ナチュラルキラー細胞を、例えば、フィーダー層を用いないで、又はフィーダー細胞の存在下、第二の工程でさらに増殖し、分化させる。本明細書に提供される細胞の培養は、第一の工程由来のNK細胞の連続的な増殖、分化、及び成熟をもたらす。第二の工程では、該NK細胞を、例えば、該第一の培地とは異なるサイトカイン及び/又は生体活性分子を含む第二の培養培地中で、連続的な様式で、増殖し、分化させ、かつ成熟させる。ある実施態様において、第二の培養培地は、動物成分不含培地である。例示的な動物成分不含細胞培養培地は、上で記載されている。

したがって、一態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞を産生する方法であって、上記の第一の工程由来のNK細胞を、フィーダー細胞の存在下で、かつインターロイキン-2(IL-2)と接触又は近接させて、第二の培地中で増殖することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該第二の培地は、IL-2、例えば、10IU/mL〜1000IU/mL、及びヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、例えば、5％〜15％FCS v/v;トランスフェリン、例えば、10μg/mL〜50μg/mL;インスリン、例えば、5μg/mL〜20μg/mL;エタノールアミン、例えば、5×10^-4〜5×10^-5M;オレイン酸、例えば、0.1μg/mL〜5μg/mL;リノール酸、例えば、0.1μg/mL〜5μg/mL;パルミチン酸、例えば、0.05μg/mL〜2μg/mL;ウシ血清アルブミン(BSA)、例えば、1μg/mL〜5μg/mL;及び/又はフィトヘマグルチニン、例えば、0.01μg/mL〜1μg/mL:のうちの1つ又は複数を含む細胞成長培地を含む。より具体的な実施態様において、該第二の培地は、FBS又はFCS、例えば、10％FCS v/v、IL-2、トランスフェリン、インスリン、エタノールアミン、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ウシ血清アルブミン(BSA)、及びフィトヘマグルチニンを含む細胞成長培地を含む。より具体的な実施態様において、該第二の培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、10％FBS又はFCS、400IU IL-2、35μg/mLトランスフェリン、5μg/mLインスリン、2×10^-5Mエタノールアミン、1μg/mLオレイン酸、1μg/mLリノール酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg/mLパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mL BSA(Sigma-Aldrich)、及び0.1μg/mLフィトヘマグルチニンを含む。

ある実施態様において、第二の培地は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP1α)、又は白血病抑制因子(LIF)のうちの1つ又は複数を含まない。

該方法に加えて、本明細書に提供されるのは、組成物としての上記の培地のいずれかである。

フィーダー細胞は、使用するときに、様々な細胞型から樹立することができる。これらの細胞型の例としては、限定するものではないが、線維芽細胞、幹細胞(例えば、組織培養物接着性胎盤幹細胞)、血液細胞(例えば、末梢血単核細胞(PBMC))、及び癌細胞(例えば、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、例えば、K562)が挙げられる。具体的な実施態様において、該第二の培地中で該培養することは、例えば、フィーダー細胞、例えば、K562細胞及び/又は末梢血単核細胞(PBMC)を、該第二の培地中で起こしたとき、その1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10日後に、該細胞を用いて培養することを含む。ある実施態様において、フィーダー細胞は、任意に、それらが支持している細胞とは異なる種に由来するものである。例えば、ヒトNK細胞は、(初代培養物又はテロメア化された株由来の)マウス胚性線維芽細胞によって支持することができる。

ある実施態様において、フィーダー細胞を、任意に、放射線照射(例えば、γ線照射)又は抗有糸分裂剤、例えば、マイトマイシンCによる処理によって不活化し、それらが支持している細胞よりもそれらが成長するのを防ぐが、NK細胞を支持する重要な因子の合成は可能にする。例えば、細胞に、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹(hES)細胞を支持する重要な因子の合成を可能にする用量で放射線照射する(約4000ラドのγ線照射)。

第二の工程のためのNK細胞の培養は、細胞の培養及び増殖と適合する任意の容器、例えば、フラスコ、チューブ、ビーカー、ディッシュ、マルチウェルプレート、バッグなどの中で生じることができる。具体的な実施態様において、NK細胞のフィーダー細胞依存的な培養は、バッグ、例えば、可撓性で、ガス透過性のフルオロカーボン培養バッグ(例えば、American Fluoroseal製)の中で生じる。具体的な実施態様において、NK細胞を培養する容器は、例えば、増殖されたNK細胞をさらに増殖し、分化させ、かつ成熟させる、病院又は軍事区域などの場所への輸送に好適である。

工程1由来の細胞のTSNK細胞への分化は、例えば、フローサイトメトリーによって、NK細胞特異的マーカーを検出することによって評価することができる。NK細胞特異的マーカーとしては、CD56、CD94、CD117、及びNKp46が挙げられるが、これらに限定されない。分化は、NK細胞の形態的特徴、例えば、大きいサイズ、数多くの小胞体(ER)における高いタンパク質合成活性、及び/又は予め形成された顆粒によって評価することもできる。

工程1由来の細胞の増殖、及びTSNK細胞への分化にかかる時間は、例えば、約3日〜約120日であり得る。一実施態様において、分化時間は、約7日〜約75日である。別の実施態様において、分化時間は、約14日〜約50日である。具体的な実施態様において、分化時間は、約10日〜約21日である。

造血細胞のNK細胞への分化は、例えば、フローサイトメトリーによって、マーカー、例えば、CD56、CD94、CD117、NKG2D、DNAM-1、及びNKp46を検出することによって評価することができる。分化は、NK細胞の形態的特徴、例えば、大きいサイズ、数多くの小胞体(ER)における高いタンパク質合成活性、及び/又は予め形成された顆粒によって評価することもできる。NK細胞(例えば、TSNK細胞)の成熟は、1以上の機能的に関連のあるマーカー、例えば、CD94、CD161、NKp44、DNAM-1、2B4、NKp46、CD94、KIR、及びNKG2ファミリーの活性化受容体(例えば、NKG2D)を検出することによって評価することができる。NK細胞(例えば、TSNK細胞)の成熟は、異なる発生段階の間に特異的なマーカーを検出することによって評価することもできる。例えば、一実施態様において、NK前駆細胞は、CD34⁺、CD45RA⁺、CD10⁺、CD117^-、及び/又はCD161^-である。別の実施態様において、NK前駆細胞は、CD34⁺、CD45RA⁺、CD10^-、CD117⁺、及び/又はCD161^-である。別の実施態様において、未成熟NK細胞は、CD34^-、CD117⁺、CD161⁺、NKp46^-、及び/又はCD94/NKG2A^-である。別の実施態様において、CD56^bright NK細胞は、CD117⁺、NKp46⁺、CD94/NKG2A⁺、CD16^-、及び/又はKIR^+/-である。別の実施態様において、CD56^dim NK細胞は、CD117^-、NKp46⁺、CD94/NKG2A^+/-、CD16+、及び/又はKIR⁺である。具体的な実施態様において、NK細胞(例えば、TSNK細胞)の成熟は、CD161^-、CD94⁺、及び/又はNKp46⁺であるNK細胞(例えば、TSNK細胞)のパーセンテージによって決定される。より具体的な実施態様において、成熟NK細胞(例えば、TSNK細胞)の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。別のより具体的な実施態様において、成熟NK細胞(例えば、TSNK細胞)の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％は、CD94⁺である。別のより具体的な実施態様において、成熟NK細胞(例えば、TSNK細胞)の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％は、CD161^-である。

ある実施態様において、造血細胞のNK細胞への分化を、例えば、CD3、CD7もしくはCD127、CD10、CD14、CD15、CD16、CD33、CD34、CD56、CD94、CD117、CD161、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、2B4、又はTO-PRO-3の発現レベルを、例えば、これらの細胞マーカーのうちの1つ又は複数に対する抗体を用いて検出することによって評価する。そのような抗体は、例えば、蛍光標識、例えば、FITC、R-PE、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC、APC-Cy7、又はAPC-H7のような、検出可能な標識にコンジュゲートすることができる。

(5.2.2.三段階法を用いたNK前駆細胞集団及びNK細胞集団の産生)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞集団又はNK前駆細胞集団を産生する三段階法である。ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法に従ってNK前駆細胞集団又はNK細胞集団を産生するための、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、増殖及び分化の間、1ミリリットル当たり約2×10⁴〜約6×10⁶細胞、例えば、1ミリリットル当たり約2×10⁴〜約2×10⁵細胞で維持することを含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、1ミリリットル当たり約1×10⁵細胞以下で維持することを含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載される造血細胞の増殖及び分化の方法は、該造血細胞を含む細胞集団を、1ミリリットル当たり約1×10⁵細胞、1ミリリットル当たり2×10⁵細胞、1ミリリットル当たり3×10⁵細胞、1ミリリットル当たり4×10⁵細胞、1ミリリットル当たり5×10⁵細胞、1ミリリットル当たり6×10⁵細胞、1ミリリットル当たり7×10⁵細胞、1ミリリットル当たり8×10⁵細胞、1ミリリットル当たり9×10⁵細胞、1ミリリットル当たり1×10⁶細胞、1ミリリットル当たり2×10⁶細胞、1ミリリットル当たり3×10⁶細胞、1ミリリットル当たり4×10⁶細胞、1ミリリットル当たり5×10⁶細胞、1ミリリットル当たり6×10⁶細胞、1ミリリットル当たり7×10⁶細胞、1ミリリットル当たり8×10⁶細胞、又は1ミリリットル当たり9×10⁶細胞以下で維持することを含む。

ある実施態様において、該三段階法は、造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、CD34⁺幹細胞又は前駆細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第一の培地中で特定の期間培養することを含む、第一の段階(「段階1」)を含む。ある実施態様において、第一の培地は、造血前駆細胞の増殖を促進する1以上の因子、増殖する造血前駆集団内のリンパ球分化の開始のための1以上の因子、及び/又は間質フィーダー支持物を模倣する1以上の因子を含有する。ある実施態様において、第一の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、Flt3L、TPO、SCF)を含む。ある実施態様において、第一の培地は、IL-7を含む。ある実施態様において、第一の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第一の培地は、サイトカインFlt3L、TPO、及びSCF、IL-7、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6及びGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第一の培地中で、CD34+細胞は、増殖を経て、系譜特異的前駆体になり、これは、その後、CD34-になる。ある実施態様において、この増殖は、速やかに起こる。ある実施態様において、該CD34-細胞は、段階1の終了時に、全集団の50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、又はそれより多くを含む。より具体的な実施態様において、CD34-細胞は、段階1の終了時に、全集団の80％超を含む。

ある実施態様において、その後、「段階2」において、該細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第二の培地中で特定の期間培養する。ある実施態様において、第二の培地は、リンパ球前駆細胞の増殖をさらに促進し得る因子、NK系譜に沿った発生に寄与し得る因子、及び/又は間質フィーダー支持物を模倣する因子を含有する。ある実施態様において、第二の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、Flt3L、SCF、IL-15、及び/又はIL-7)を含む。ある実施態様において、第二の培地は、IL-17及び/又はIL-15を含む。ある実施態様において、第二の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第二の培地は、サイトカインFlt3L、SCF、IL-15、及びIL-7、IL-17及びIL-15、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む。

ある実施態様において、その後、「段階3」において、該細胞を、例えば、本明細書に記載されるように、第三の培地中で特定の期間培養する。ある実施態様において、第三の培地は、NK前駆細胞であり得るCD56+CD3-CD16-細胞の分化及び機能的活性化を促進する因子を含む。一実施態様において、そのような因子は、IL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、又はIL2とIL15とIL18を含む。ある実施態様において、第三の培地は、間質フィーダー支持物を模倣する因子を含む。ある実施態様において、第三の培地は、1以上のサイトカイン(例えば、SCF、IL-15、IL-7、IL-2)を含む。ある実施態様において、第三の培地は、サブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及び/又はGM-CSFを含む。具体的な実施態様において、第三の培地は、サイトカインSCF、IL-15、IL-7、IL-2、並びにサブng/mL濃度のG-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む。

具体的な実施態様において、該三段階法を用いて、NK前駆細胞集団を産生する。別の具体的な実施態様において、該三段階法を用いて、NK細胞集団を産生する。ある実施態様において、該三段階法を、間質フィーダー細胞支持物の非存在下で実施する。ある実施態様において、該三段階法を、外因性に添加されるステロイド(例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、又はそれらの誘導体)の非存在下で実施する。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法で使用される第一の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一又は第二の培地の成分のいずれか含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第一の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、例えば、1％〜20％v/v血清、例えば、5％〜20％v/v血清;幹細胞因子(SCF)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; FMS様チロシンキナーゼ-3リガンド(Flt-3リガンド)、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド;インターロイキン-7(IL-7)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7;トロンボポエチン(TPO)、例えば、1ng/mL〜100ng/mL、例えば、1ng/mL〜50ng/mL TPO;インターロイキン-2(IL-2)、例えば、最大2000IU/mL、例えば、50IU/mL〜500IU/mL;及び/又はヘパリン、例えば、低重量ヘパリン(LWH)、例えば、0.1IU/mL〜10IU/mLヘパリン:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第一の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、該第一の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法で使用される第二の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一又は第二の培地の成分のいずれかを含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第二の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、FBS、もしくはFCS、例えば、5％〜20％v/v血清; SCF、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; Flt-3リガンド、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド; IL-7、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7;インターロイキン-15(IL-15)、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-15;及び/又はヘパリン、例えば、LWH、例えば、0.1IU/mL〜10IU/mLヘパリン:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第二の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、該第二の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法で使用される第三の培地は、二工程法に関連して上で記載されている第一又は第二の培地の成分のいずれかを含有し得る。ある実施態様において、該三段階法で使用される第三の培地は、動物血清、例えば、ヒト血清(例えば、ヒト血清AB)、FBS、又はFCS、例えば、5％〜20％v/v血清; SCF、例えば、1ng/mL〜50ng/mL SCF; Flt-3リガンド、例えば、1ng/ml〜30ng/mL Flt-3リガンド; IL-7、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-7; IL-15、例えば、1ng/mL〜50ng/mL IL-15;及び例えば、0〜2000IU/mLの範囲のインターロイキン-2(IL-2)、例えば、50IU/mL〜1000IU/mL IL-2:のうちの1つ又は複数を含む培地を含む。ある実施態様において、該第三の培地は、以下のもの:抗生物質、例えば、ゲンタマイシン;抗酸化剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、及び/又はβ-メルカプトエタノール;亜セレン酸ナトリウム;アスコルビン酸;エタノールアミン;並びにグルタチオンのうちの1つ又は複数をさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、OACをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、インターロイキン-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、及び/又はMIP-1αをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地は、1以上の抗酸化剤、例えば、ホロ-トランスフェリン、インスリン溶液、還元グルタチオン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、b-メルカプトエタノール、O-アセチル-L-カルニチン、N-アセチルシステイン、(+/-)リポ酸、ニコチンアミド、又はレスベラトロールをさらに含む。ある実施態様において、該第三の培地の基材を提供する培地は、当業者に公知の細胞/組織培養培地、例えば、市販の細胞/組織培養培地、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640であるか;或いは既知の細胞/組織培養培地に通常含まれる成分、例えば、GBGM(登録商標)、AIM-V(登録商標)、X-VIVO(商標)10、X-VIVO(商標)15、OPTMIZER、STEMSPAN(登録商標)H3000、CELLGRO COMPLETE(商標)、DMEM:ハムF12(「F12」)(例えば、2:1比、又は高グルコースもしくは低グルコースDMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、Myelocult(商標)H5100、IMDM、及び/或いはRPMI-1640に含まれる成分を含む培地である。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地及び該第二の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30日間、又は30日よりも長い間、培養する。

ある実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、2〜12日、3〜11日、例えば、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、又は9〜11日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、1〜10日間、例えば、1〜3、2〜4、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日間培養する。ある実施態様において、該第一の培地及び該第二の培地中で培養された細胞を、該第三の培地中で、2〜27日、例えば、3〜25日間、例えば、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、9〜11、10〜12、11〜13、12〜14、13〜15、14〜16、15〜17、16〜18、17〜19、18〜20、19〜21、20〜22、21〜23、22〜24、又は23〜25日間培養する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5日間培養し;かつ該第三の培地中で、7日間培養する、すなわち、該細胞を合計21日間培養する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、7〜9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5〜7日間培養し;かつ該第三の培地中で、21〜35日間培養する、すなわち、該細胞を合計35日間培養する。より具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法において、該造血幹細胞又は前駆細胞を、該第二の培地中で該培養することの前に、該第一の培地中で、9日間培養し;該第三の培地中で該培養することの前に、該第二の培地中で、5日間培養し;かつ該第三の培地中で、21日間培養する、すなわち、該細胞を合計35日間培養する。

(5.3. NK細胞の単離)
ナチュラルキラー細胞を単離する方法は当技術分野で公知であり、該方法を用いて、ナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞もしくはNK細胞を単離することができる。NK細胞は、組織源、例えば、末梢血由来の細胞をCD56及びCD3に対する抗体で染色し、CD56⁺CD3^-細胞を選択することによって単離又は濃縮することができる。NK細胞、例えば、TSNK細胞は、市販のキット、例えば、NK細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて単離することができる。NK細胞、例えば、TSNK細胞は、該NK細胞、例えば、TSNK細胞を含む細胞の集団内のNK細胞以外の細胞の除去によって単離又は濃縮することもできる。例えば、NK細胞、例えば、TSNK細胞は、例えば、CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR、及び/又はCD235a(グリコフォリンA)のうちの1つ又は複数に対する抗体を用いた非NK細胞マーカーを示す細胞の除去によって単離又は濃縮することができる。陰性単離は、市販のキット、例えば、NK細胞陰性単離キット(Dynal Biotech)を用いて実施することができる。これらの方法によって単離される細胞をさらに選別して、例えば、CD16⁺及びCD16^-細胞を分離することができる。

細胞分離は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別(FACS)、又は好ましくは、特異的抗体とコンジュゲートされたマイクロビーズを用いる磁気細胞選別によって達成することができる。該細胞は、例えば、1以上の特異的抗体、例えば、抗CD56抗体を含む磁気ビーズ(例えば、約0.5〜100μmの直径)に結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて単離することができる。磁気細胞分離は、例えば、AUTOMACS(商標)セパレーター(Miltenyi)を用いて実施し、自動化することができる。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を、磁気マイクロスフェア上で行うことができる。その後、ビーズを該細胞と混合し、結合させておく。その後、細胞を磁場に通して、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を完全に分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々のディッシュ、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。

(5.4.胎盤灌流液)
NK細胞、例えば、TSNK細胞、並びに本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK前駆細胞及びNK細胞集団は、任意の供給源、例えば、胎盤組織、胎盤灌流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、肝臓などに由来する造血細胞、例えば、造血幹又は前駆細胞から産生することができる。ある実施態様において、該造血幹細胞は、胎盤灌流液由来及び該胎盤灌流液を生成させるために使用される同じ胎盤に由来する臍帯血由来の組み合わされた造血幹細胞である。例えば、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第7,045,148号及び第7,468,276号に開示される方法によって得ることができる胎盤灌流液細胞を含む胎盤灌流液。

(5.4.1.細胞回収組成物)
造血幹又は前駆細胞を単離し得るか、或いは例えば、NK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に提供される三段階法に従って産生されるNK前駆細胞もしくはNK細胞集団と組み合わせた、腫瘍抑制、又は腫瘍細胞、癌、もしくはウイルス感染を有する個体の治療において有用な、胎盤灌流液及び灌流液細胞は、胎盤細胞回収組成物を用いる、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤の灌流によって回収することができる。灌流液は、任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液、培養培地、又はより複雑な細胞回収組成物を用いる胎盤の灌流によって、胎盤から回収することができる。胎盤の灌流に、並びに灌流液細胞の回収及び保存に好適な細胞回収組成物は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる関連米国特許出願公開第2007/0190042号に詳細に記載されている。

細胞回収組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に好適な任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などを含むことができる。

細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、胎盤細胞を保存する、すなわち、胎盤細胞の死を防止するか、又は胎盤細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞の集団内の胎盤細胞の数を低下させるなどの傾向がある1以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはJNK阻害剤);血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン、もしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、もしくはクロナゼパム);TNF-α阻害剤;及び/又は酸素担持ペルフルオロカーボン(例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化ペルフルオロデシルなど)であることができる。

細胞回収組成物は、1以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)に由来するコラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞回収組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある非制限的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシム、もしくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム(+)及び/又はグラム(-)細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性がある。

細胞回収組成物は、以下の化合物のうち1つ又は複数を含むこともできる:アデノシン(約1mM〜約50mM);D-グルコース(約20mM〜約100mM);マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM);一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の巨大分子(例えば、約25g/l〜約100g/l、もしくは約40g/l〜約60g/lで存在する、合成もしくは天然のコロイド、デキストランなどの多糖類、もしくはポリエチレングリコール);酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、もしくはビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン);細胞内へのカルシウム進入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L);一実施態様において、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン);又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、もしくはイソブチルアミロライド)。

(5.4.2.胎盤の回収及び取扱い)
通常、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施態様において、インフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。

灌流液の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。ある実施態様において、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。通常、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号: Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい)。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank Inc.、Cedar Knolls, N.J.、ViaCord、Cord Blood Registry、及びCryoCellにより行われてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。

通常、臍帯血の回収及び灌流液の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。ある実施態様において、臍帯血の回収前に、近位臍帯を、好ましくは、胎盤への挿入部から4〜5cm(センチメートル)以内のところでクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。

胎盤を、灌流液の回収前に、滅菌条件下、かつ室温又は5〜25℃の温度(摂氏)のどちらかで保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤を、48時間よりも長い時間、好ましくは4〜24時間、保存してもよい。胎盤は、5〜25℃の温度(摂氏)で、抗凝血剤溶液に入れて保存することが好ましい。好適な抗凝血剤溶液は当技術分野で周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウム溶液を用いることができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中に1％w/w)を含む。放血された胎盤は、胎盤灌流液を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。

(5.4.3.胎盤灌流)
哺乳動物の胎盤を灌流する方法及び胎盤灌流液を得る方法は、例えば、その各々の開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Haririの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号、並びに米国特許第8,057,788号として発行されている米国特許出願公開第2007/0190042号及び第20070275362号に開示されている。

灌流液を、灌流溶液、例えば、生理食塩水溶液、培養培地、又は上記の細胞回収組成物を、胎盤血管系に通すことによって得ることができる。一実施態様において、哺乳動物の胎盤を、灌流溶液を臍帯動脈と臍帯静脈のどちらか又は両方に通すことによって灌流する。胎盤を通る灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を用いて達成することができる。好ましくは、灌流溶液を、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて、胎盤に強制的に通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されている、カニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニューレを挿入することができる。この滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。

灌流に備えて、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い地点に位置するような形で、胎盤を配置することが好ましい。灌流溶液を胎盤血管系に通すか、又は胎盤血管系及び周辺組織に通すことによって、胎盤を灌流することができる。一実施態様において、臍帯動脈及び臍帯静脈を、可撓性コネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続する。灌流溶液を臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、及び/又は血管壁を通って胎盤の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。別の実施態様において、灌流溶液を、臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する、すなわち、胎盤血管系(胎児組織)のみに通す。

一実施態様において、例えば、臍帯動脈及び臍帯静脈を、例えば、可撓性コネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続する。灌流溶液を臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、及び/又は血管壁を通って胎盤の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。「受け皿(pan)」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、通常、胎児細胞と母親細胞の混合物である。

別の実施態様において、灌流溶液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、通常、ほとんど胎児のものしかない。

閉回路灌流法を、一実施態様において、次のように実施することができる。分娩後胎盤を、出産後、約48時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯は、廃棄することができるか、又は例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び/もしくは生体材料の産生用に臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜を灌流中保持することができるか、又は例えば、指を用いる鈍的剥離を用いて、絨毛膜から分離することができる。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば、廃棄するか、又は例えば、酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば、羊膜生体材料、例えば、米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている生体材料を産生するために、処理することができる。例えば、滅菌ガーゼを用いて、全ての目に見える血の塊及び残留血液を胎盤から除去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させることにより、臍帯血管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲータークランプを各々の血管の切断端に通して前進させることによって広げる。その後、装置、例えば、灌流装置又は蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプは、この目的に好適な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであることができる。その後、滅菌された回収リザーバ、例えば、250mL回収バッグなどの血液バッグに接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈に挿入する。或いは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、回収リザーバ(複数可)に接続されたチューブを胎盤動脈の一方又は両方に挿入する。その後、胎盤を、一定の容積の灌流溶液、例えば、約750mlの灌流溶液で灌流する。その後、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収する。

一実施態様において、灌流中、近位臍帯をクランプし、より好ましくは、胎盤への臍帯挿入部から4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。

放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流液の最初の回収物は、通常、臍帯血及び/又は胎盤血の残留赤血球のために色が付いている。該灌流液は、灌流が進み、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になっていく。通常、最初に胎盤から血液を洗い流すためには、30〜100mLの灌流液で十分であるが、観察された結果次第で、より多くの又はより少ない灌流液を用いることができる。

胎盤を灌流するために使用される灌流液の容積は、回収しようとする胎盤細胞の数、胎盤の大きさ、単一の胎盤から行われる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施態様において、灌流液の容積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであることができる。通常、放血後、胎盤を700〜800mLの灌流液で灌流する。

胎盤を、数時間又は数日間かけて、複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌流しようとする場合、それを、容器(container)又は他の好適な容器(vessel)中、無菌条件下で維持又は培養し、細胞回収組成物、或いは標準的な灌流溶液(例えば、抗凝血剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)を含むかもしくは含まない、及び/又は抗微生物剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM):ストレプトマイシン(例えば、40〜100μg/ml)、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンフォテリシンB(例えば、0.5μg/ml)などの抗生物質を含むかもしくは含まない生理食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」))で灌流することができる。一実施態様において、単離された胎盤を、灌流及び灌流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は2もしくは3日間、又はそれより長い間、維持又は培養するように、該胎盤を、灌流液を回収しないで、しばらくの間、維持又は培養する。灌流された胎盤を、さらにもう1回以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、又はそれより長い時間、維持し、例えば、700〜800mLの灌流液で再び灌流することができる。胎盤を、1、2、3、4、5回、又はそれより多く、例えば、1、2、3、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様において、回収された有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで、胎盤の灌流、及び灌流溶液、例えば、胎盤細胞回収組成物の回収を繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、細胞、例えば、全有核細胞の時間依存的な集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。

(5.4.4.胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞)
通常、単回の胎盤灌流由来の胎盤灌流液は、約1億〜約5億個の有核細胞を含み、これには、本明細書に開示される方法によってNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK前駆細胞もしくはNK細胞を産生し得る造血細胞が含まれる。ある実施態様において、該胎盤灌流液又は灌流液細胞は、CD34⁺細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞を含む。そのような細胞は、より具体的な実施態様において、CD34⁺CD45^-幹細胞もしくは前駆細胞、CD34⁺CD45⁺幹細胞もしくは前駆細胞、又は同様の細胞を含むことができる。ある実施態様において、該灌流液又は灌流液細胞は、それから造血細胞を単離する前に凍結保存される。ある他の実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞のみ、もしくは胎児細胞と母親細胞の組合せを含むか、又は該灌流液細胞は、胎児細胞のみ、もしくは胎児細胞と母親細胞の組合せを含む。

(5.5. NK及びNK前駆細胞)
(5.5.1. TSNK細胞)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の二工程法によって産生されるNK細胞であるTSNK細胞である(例えば、第5.2.1節を参照されたい)。さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法(例えば、二工程法)によって産生されるTSNK細胞を含む細胞の集団である。具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はCD3^-CD56⁺である。具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はCD3^-CD56⁺CD16^-である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、CD94⁺CD117⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、CD161^-である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞(例えば、TSNK細胞)はさらに、NKG2D⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞はさらに、NKp46⁺である。別の具体的な実施態様において、該NK細胞はさらに、CD226⁺である。

ある実施態様において、該TSNK細胞の50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％超は、CD56⁺及びCD16^-である。他の実施態様において、該TSNK細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、82％、84％、86％、88％、又は90％は、CD3^-及びCD56⁺である。他の実施態様において、該TSNK細胞の少なくとも50％、52％、54％、56％、58％、又は60％は、NKG2D⁺である。他の実施態様において、該細胞の30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、又は3％未満は、NKB1⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の30％、20％、10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、NKAT2⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の30％、20％、10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、CD56⁺及びCD16⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％は、CD117⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％は、CD94⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％は、CD161^-である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、12％、14％、16％、18％、又は20％は、CD226⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、又は40％は、CD7⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、又は60％は、CD5⁺である。

特定の実施態様において、TSNK細胞集団は、CD56+細胞よりも大きい割合のCD56-細胞を含む。特定の実施態様において、TSNK細胞集団は、インビボ又はエクスビボで、CD56+細胞の割合が増加した集団に分化する。

様々な他の実施態様において、TSNK細胞を、例えば、組織源から単離されているが、増殖されていないNK細胞;組織源から単離され、増殖されたNK細胞、又は異なる方法によって産生されたNK細胞、例えば、CD56⁺CD16⁺ナチュラルキラー細胞と、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、又は約9:1の比率で、組み合わせることができる。この文脈で使用される場合、「単離された」とは、細胞がその通常の組織環境から取り出されていることを意味する。

TSNK細胞は、胎児の遺伝子型又は母親の遺伝子型を有することができる。例えば、TSNK細胞を産生するのに好適な造血細胞の供給源としての分娩後胎盤は、胎児由来の組織及び細胞並びに母親由来の組織及び細胞を含むので、胎盤灌流液は、胎児細胞のみ、もしくは胎児細胞の実質的大部分(例えば、約90％、95％、98％、もしくは99％超)を含むことができるか、又は胎児細胞と母親細胞の混合物(例えば、該胎児細胞は、該灌流液の全有核細胞の約90％、80％、70％、60％、もしくは50％未満を含む)を含むことができる。一実施態様において、TSNK細胞は、胎児胎盤造血細胞、例えば、胎盤の閉回路灌流から得られる細胞のみに由来しており、ここで、該灌流は、胎児胎盤造血細胞の実質的大部分、又は胎児胎盤造血細胞のみを含む灌流液を生じさせる。別の実施態様において、TSNK細胞は、胎児細胞及び母親細胞、例えば、受け皿法(上記参照)による灌流によって得られる細胞に由来しており、ここで、該灌流は、胎児細胞と母親胎盤細胞の混合物を含む灌流液を生じさせる。したがって、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、その実質的大部分が胎児の遺伝子型を有する胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎児の遺伝子型を有するナチュラルキラー細胞及び母親の表現型を有するナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。

また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法によって産生されないナチュラルキラー細胞を含むTSNK細胞の集団である。例えば、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、臍帯血、末梢血、骨髄、もしくは前述のもののうちの2つ以上の組合せから単離されたナチュラルキラー細胞も含むTSNK細胞、又は本明細書に記載の方法以外の方法によって増殖されたNK細胞の集団である。そのようなTSNK細胞の集団は、TSNK細胞及び他のNK細胞を、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、又は約1:100などの比率で含むことができる。

ある実施態様において、単離されたナチュラルキラー細胞(例えば、TSNK細胞)又はナチュラルキラー細胞(例えば、TSNK細胞)が濃縮された集団は、1以上の機能的に関連するマーカー、例えば、CD94、CD161、NKp44、DNAM-1、2B4、NKp46、CD94、KIR、及びNKG2ファミリーの活性化受容体(例えば、NKG2D)を検出することによって評価することができる。いくつかの実施態様において、単離された又は濃縮されたナチュラルキラー細胞の純度は、CD56、CD3、及びCD16のうちの1つ又は複数を検出することによって確認することができる。

任意に、単離された又は濃縮されたナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性は、例えば、腫瘍細胞、例えば、培養されたK562、LN-18、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1、又はU266腫瘍細胞などの細胞を標的細胞として用いる細胞傷害性アッセイで評価することができる。

(5.5.2. NK前駆細胞)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたNK前駆細胞集団であり、ここで、該NK前駆細胞は、上の第5.2.2節に記載されている三段階法に従って産生される。

一実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、NK細胞集団、例えば、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団と関連するCD3-CD56+細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD3-CD56+細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD3-CD56+細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団、例えば、NK細胞集団と関連するCD3-CD56+細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD3-CD56+細胞を含むNK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、CD161+である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％は、CD161+である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％以上は、CD161+である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の40％〜45％、45％〜50％、50％〜55％、55％〜60％、60％〜65％、65％〜70％、又は70％〜75％は、CD161+である。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、NKp46+である。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又はそれより多くは、NKp46+である。より具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の約25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％は、NKp46+である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％以下は、NKp46+である。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、45％〜50％、50％〜55％、55％〜60％、60％〜65％、65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、又はそれより多くは、NKp46+である。より具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞の25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、45％〜50％、又は50％〜55％は、NKp46+である。

ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、CD16-である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、CD117+及びCD161+である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、CD16-、CD117+、及びCD161+である。ある実施態様において、該NK前駆細胞集団内の該CD3-CD56+細胞はさらに、CD16-、CD117+、CD161+、及びNKp46+である。

一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、約40％以下のCD3-CD56+細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD117+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD117+細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD52+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD52+細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、CD52+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD244+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD244+細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、CD244+ CD117+である細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、LFA-1+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のLFA-1+細胞を含む。一実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD94+である細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下のCD94+細胞を含む。

特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、CD56+細胞よりも大きい割合のCD56-細胞を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、インビボ又はエクスビボで、CD56+細胞の割合が増加した集団に分化する。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団は、NK細胞集団と関連するCD34^-CD117⁺細胞のパーセンテージと比較して、低いパーセンテージのCD34^-CD117⁺細胞を含み、例えば、該NK前駆細胞集団は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％以下のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK前駆細胞集団は、0％〜5％、5％〜10％、10％〜15％、15％〜20％、20％〜25％、25％〜30％、30％〜35％、35％〜40％、40％〜45％、又は45％〜50％のCD34^-CD117⁺細胞を含む。いくつかの実施態様において、該NK前駆細胞集団は、1％以下、2％以下、3％以下、4％以下、5％以下、10％以下、又は15％以下のCD34^-CD117⁺細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK前駆細胞集団は、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

具体的な実施態様において、本明細書に記載のNK前駆細胞は、NK細胞、例えば、同等の方法を用いて産生されるNK細胞よりも大きい骨髄(例えば、インビボ)生着能力を保有する。例えば、ある実施態様において、短い第三の培養工程、例えば、4〜6、5〜7、6〜8、又は7〜9日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞は、より長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生されるNK細胞よりも高い効率で、骨髄(例えば、インビボ)に生着する。別の実施態様において、本明細書に記載のNK前駆細胞は、末梢血(PB)由来NK細胞よりも長いテロメアを保有する。

(5.5.3.三工程法によって産生されるNK細胞)
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたNK細胞集団であり、ここで、該NK細胞は、上記の第5.2.2節に記載の方法に従って産生される。

一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法によって産生される単離されたNK細胞集団であり、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも大きいパーセンテージのCD3-CD56+細胞を含む。具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、65％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、90％〜95％、又は95％〜99％のCD3-CD56+細胞を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の三段階法によって産生される該NK細胞集団は、長い第三の培養工程、例えば、18〜20、19〜21、20〜22、又は21〜23日の第三の培養工程を含む三段階法を用いて産生される。

ある実施態様において、該NK細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞は、さらにCD161⁺であるCD3^-CD56⁺細胞を含み、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも少ないパーセンテージのCD3^-CD56⁺CD161⁺細胞を含む。

ある実施態様において、該NK細胞集団内の該CD3^-CD56⁺細胞は、さらにCD16-であるCD3^-CD56⁺細胞を含み、ここで、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団、例えば、該NK前駆細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程が、該NK細胞集団を産生するために使用される第三の培養工程よりも持続期間が短いことを除いては同じ三段階法によって産生されるNK前駆細胞集団よりも大きいパーセンテージのCD3^-CD56⁺CD16-細胞を含む。別の実施態様において、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞は、末梢血(PB)由来NK細胞よりも長いテロメアを保有する。

(5.6.胎盤灌流液と組み合わせたNK及びNK前駆細胞)
さらに本明細書に提供されるのは、例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する際に使用するための、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又は接着性胎盤細胞と組み合わせた、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団又はNK前駆細胞集団を含む組成物である。

(5.6.1. NK細胞と灌流液又は灌流液細胞の組合せ)
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団と胎盤灌流液及び/又は胎盤灌流液細胞の組合せを含む組成物である。一実施態様において、例えば、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団が補充された一定の容積の胎盤灌流液である。具体的な実施態様において、例えば、胎盤灌流液の各ミリリットルに、約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、又はそれより多くの本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を補充する。別の実施態様において、胎盤灌流液細胞に、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を補充する。ある他の実施態様において、胎盤灌流液細胞を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、NK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と組み合わせる場合、該胎盤灌流液細胞は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を複数の胎盤灌流液細胞及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と組み合わせる場合、該NK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を用いて胎盤灌流液を補充する場合、細胞を懸濁させる溶液(例えば、生理食塩水溶液又は培養培地など)の容積は、灌流液＋細胞の全容積の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含み、その場合、該NK細胞又はNK前駆細胞を、補充前に、1ミリリットル当たり約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、又はそれより多くの細胞になるように懸濁させる。

他の実施態様において、細胞の上記の組合せのいずれかをさらに、臍帯血又は臍帯血由来の有核細胞と組み合わせる。

さらに本明細書に提供されるのは、2以上の供給源、例えば、2以上の胎盤から得られ、混合された、例えば、プールされた、プール胎盤灌流液である。そのようなプール灌流液は、各々の供給源に由来するほぼ等容積の灌流液を含むことができるか、又は各々の供給源に由来する異なる容積を含むことができる。各々の供給源に由来する相対的な容積は、無作為に選択することができるか、或いは例えば、1以上の細胞因子、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモンなどの濃度もしくは量;各々の供給源に由来する灌流液中の胎盤細胞の数;又は各々の供給源に由来する灌流液の他の特徴に基づくことができる。同じ胎盤の複数回の灌流に由来する灌流液を同様にプールすることができる。

同様に、本明細書に提供されるのは、2以上の供給源、例えば、2以上の胎盤から得られ、プールされた胎盤灌流液細胞及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞である。そのようなプール細胞は、2以上の供給源に由来するほぼ同等数の細胞を含むことができるか、又はプール供給源のうちの1つ又は複数に由来する異なる数の細胞を含むことができる。各々の供給源に由来する細胞の相対的な数は、例えば、プールされるべき細胞における1以上の特定細胞型の数、例えば、CD34⁺細胞の数などに基づいて選択することができる。

さらに本明細書に提供されるのは、例えば、所与の数のNK細胞もしくはNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、或いは所与の容積の灌流液から期待される腫瘍抑制の程度又は量(すなわち、効力)を決定するためにアッセイされた、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、並びにそのような細胞と胎盤灌流液及び/又は胎盤灌流液細胞との組合せである。例えば、一定の分量又はサンプル数の細胞を、そうでなければ腫瘍細胞が増殖するであろう条件下で既知の数の腫瘍細胞と接触又は近接させ、胎盤灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組合せの存在下における経時的な(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10週、又はそれより長い間の)腫瘍細胞の増殖速度を、灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組合せの非存在下における同等数の腫瘍細胞の増殖と比較する。該細胞の効力は、例えば、腫瘍細胞成長を、例えば、約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は同様の程度を抑制するために必要とされる細胞の数又は溶液の容積として表すことができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団は、医薬品等級の投与可能なユニットとして提供される。そのようなユニットは、例えば、15mL、20mL、25mL、30nL. 35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mLなどの個別の容積で提供することができる。そのようなユニットは、他のNK細胞又は灌流液細胞と組み合わせた、指定された数の細胞、例えば、NK細胞もしくはNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、例えば、1ミリリットル当たり1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの細胞、又は1ユニット当たり1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの細胞を含むように提供することができる。具体的な実施態様において、該ユニットは、1ミリリットル当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶個、もしくはそれより多くのNK細胞もしくはNK前駆細胞、又は1ユニット当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの細胞を含むことができる。そのようなユニットは、指定された数のNK細胞もしくはNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、及び/或いは他の細胞のうちのいずれかを含むように提供することができる。

上記の実施態様において、NK細胞もしくはNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、或いはNK細胞もしくはNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と他のNK細胞、灌流液細胞、又は灌流液との組合せは、レシピエントにとって自己のもの(すなわち、該レシピエントから得られたもの)であることができるか、又はレシピエントにとって同種異系(すなわち、少なくとも1人の該レシピエント以外の他の個体から得られたもの)であることができる。

ある実施態様において、各々のユニットの細胞に表示を付けて、容積、細胞の数、細胞のタイプ、該ユニットが特定のタイプの細胞について濃縮されているかどうか、及び／又は該ユニット中の所与の細胞数、もしくは該ユニットの所与のミリリットル数の効力、すなわち、該ユニット中の細胞が、特定のタイプ(単数もしくは複数)の腫瘍細胞の増殖の測定可能な抑制を引き起こすかどうかを明記する。

(5.6.2. NK細胞又はNK前駆細胞と接着性胎盤幹細胞との組合せ)
他の実施態様において、単独の又は胎盤灌流液もしくは胎盤灌流液細胞と組み合わせた、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団に、例えば、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Haririらの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号、並びに米国特許出願公開第2007/0275362号に記載されている、単離された接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及び胎盤寡能性細胞を補充する。「接着性胎盤細胞」とは、該細胞が、組織培養物表面、例えば、組織培養プラスチックに接着することを意味する。本明細書に開示される組成物及び方法において有用な接着性胎盤細胞は、栄養芽細胞でも、胚性生殖細胞でも、胚性幹細胞でもない。ある実施態様において、接着性胎盤幹細胞を、上記のようなプロセス(例えば、二工程法)でフィーダー細胞として用いる。

単独の又は胎盤灌流液もしくは胎盤灌流液細胞と組み合わせた、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団に、例えば、1ミリリットル当たり1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの接着性胎盤細胞、又は1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの接着性胎盤細胞を補充することができる。該組合せ中の接着性胎盤細胞は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、もしくは40回の集団倍加の間、又はそれより長い間、培養された、例えば、接着性胎盤細胞であることができる。

単離された接着性胎盤細胞は、初代培養で培養するか又は細胞培養で増殖したとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器表面(例えば、組織培養プラスチック)に接着する。培養下の接着性胎盤細胞は、通常、線維芽細胞のような星状の外観をしており、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から伸びている。しかしながら、接着性胎盤細胞は、線維芽細胞が示すよりも多くのそのような突起を示すので、接着性胎盤細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態的に区別することができる。形態的には、接着性胎盤細胞は、造血幹細胞からも区別することができ、造血幹細胞は、通常、培養下では、より丸みを帯びた、又は敷石状の形態をとる。

本明細書に提供される組成物及び方法において有用な、単離された接着性胎盤細胞、及び接着性胎盤細胞の集団は、該接着性胎盤細胞を含む細胞、又は該接着性胎盤細胞を含む細胞の集団を同定及び/又は単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書に提供される組成物及び方法において有用な、接着性胎盤細胞、及び接着性胎盤細胞集団には、胎盤、又は任意のその部分(例えば、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤葉、臍帯など)から直接的に得られる接着性胎盤細胞及び接着性胎盤細胞含有細胞集団が含まれる。接着性胎盤幹細胞集団は、一実施態様において、培養下の接着性胎盤幹細胞の集団(すなわち、2個以上の接着性胎盤幹細胞)、例えば、容器、例えば、バッグの中の集団である。

接着性胎盤細胞は、通常、マーカーCD73、CD105、及びCD200、並びに/又はOCT-4を発現し、かつCD34も、CD38も、CD45も発現しない。接着性胎盤幹細胞は、HLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。これらのマーカーを用いて、接着性胎盤細胞を同定し、かつ該接着性胎盤細胞を他の細胞型と区別することができる。接着性胎盤細胞は、CD73及びCD105を発現することができるので、それらは、間葉系幹細胞様の特徴を有することができる。CD34、CD38、及び/又はCD45の発現の欠如により、接着性胎盤幹細胞は非造血幹細胞とみなされる。

ある実施態様において、本明細書に記載の単離された接着性胎盤細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。

ある実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、単離された胎盤幹細胞である。ある他の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、単離された胎盤寡能性細胞である。具体的な実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD34^-、CD10⁺、及びCD105⁺である。より具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞は、寡能性接着性胎盤細胞である。別の具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、又は軟骨形成表現型の細胞に分化する潜在能力を有する。より具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。より具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺接着性胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺及びCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD90⁺、CD45^-接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD80^-及びCD86^-である。

一実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD200⁺、HLA-G⁺である。具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。より具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、及びCD105⁺である。別の実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体様体を産生する。

別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺である。該集団の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、HLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、CD45^-、及びHLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体様体を産生する。

別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD200⁺、OCT-4⁺である。具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、HLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体様体を産生する。

別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G⁺である。具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4⁺である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺、及びCD200⁺である。

別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺幹細胞であり、ここで、該細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で1以上の胚様体様体を産生する。具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様において、単離された接着性胎盤細胞はまた、OCT-4⁺である。より具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。

別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、OCT-4⁺幹細胞であり、ここで、該接着性胎盤幹細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で1以上の胚様体様体を産生し、かつ該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制するとみなされている。

様々な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％は、OCT-4⁺である。上記の集団の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、該幹細胞はCD200⁺である。より具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞はまた、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様において、該単離された接着性胎盤細胞は、増殖されたもの、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回継代されたものである。

上記の実施態様のいずれかのより具体的な実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、ABC-p(胎盤特異的ABC輸送体タンパク質;例えば、Allikmetsらの文献、Cancer Res. 58(23):5337-9(1998)参照)を発現する。

別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、及びCD133^-である。別の実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、IL-6、IL-8、及び単球走化性タンパク質(MCP-1)を構成的に分泌する。

上で参照されている単離された接着性胎盤細胞の各々は、哺乳動物胎盤から直接得られ、単離された細胞、又は培養され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30回、もしくはそれより多くの回数、継代された細胞、又はそれらの組合せを含むことができる。腫瘍細胞抑制性の複数の上記の単離された接着性胎盤細胞は、約、少なくとも、又は高々1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、又はそれより多くの単離された接着性胎盤細胞を含むことができる。

(5.6.3.接着性胎盤細胞馴化培地を含む組成物)
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団、及びさらに馴化培地を含む組成物の使用であり、ここで、該組成物は、腫瘍抑制性であるか、又は癌もしくはウイルス感染の治療において効果がある。本明細書に記載の接着性胎盤細胞を用いて、腫瘍細胞抑制性、抗癌性、又は抗ウイルス性である馴化培地、すなわち、検出可能な腫瘍細胞抑制効果、抗癌効果、又は抗ウイルス効果を有する細胞によって分泌又は排出される1以上の生体分子を含む培地を産生することができる。様々な実施態様において、馴化培地は、該細胞が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日、又はそれより長い間、その中で増殖した(すなわち、培養された)培地を含む。他の実施態様において、馴化培地は、そのような細胞が、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は100％コンフルエンスにまでその中で成長した培地を含む。そのような馴化培地を用いて、細胞、例えば、胎盤細胞、又は別の種類の細胞の別々の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、本明細書に提供される馴化培地は、単離された接着性胎盤細胞、例えば、単離された接着性胎盤幹細胞又は単離された接着性胎盤寡能性細胞、及び単離された接着性胎盤細胞以外の細胞、例えば、非胎盤幹細胞又は寡能性細胞がその中で培養された培地を含む。

そのような馴化培地を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞のいずれか、又はこれらの任意の組合せと組み合わせて、腫瘍細胞抑制性、抗癌性、又は抗ウイルス性である組成物を形成させることができる。ある実施態様において、該組成物は、容積で半分未満の、例えば、容積で約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満の馴化培地を含む。

したがって、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と、単離された接着性胎盤細胞の培養物由来の培養培地とを含む組成物であり、ここで、該単離された接着性胎盤細胞は、(a)基材に接着し;かつ(b)CD34^-、CD10⁺、及びCD105⁺であり;腫瘍細胞の成長もしくは増殖を検出可能な程度に抑制するか、又は抗癌性もしくは抗ウイルス性である。具体的な実施態様において、単離された接着性胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD34^-、CD10⁺、及びCD105⁺である。より具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞は、寡能性接着性胎盤細胞である。別の具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、又は軟骨形成表現型の細胞に分化する潜在能力を有する。より具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺接着性胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。より具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺又はCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD90⁺及びCD45^-である。別のより具体的な実施態様において、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD90⁺、CD45^-接着性胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出したとき、CD80^-及びCD86^-である。

別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と、単離された接着性胎盤細胞の培養物由来の培養培地とを含む組成物であり、ここで、該単離された接着性胎盤細胞は、(a)基材に接着し;かつ(b)CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105、及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105、及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、該集団内の1以上の胚様体様体の形成を促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、該集団内の1以上の胚様体様体の形成を促進し;腫瘍細胞の成長もしくは増殖を検出可能な程度に抑制するか、又は抗癌性もしくは抗ウイルス性である。具体的な実施態様において、該組成物は、複数の該単離された胎盤接着性細胞をさらに含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的な実施態様において、該非胎盤細胞はCD34⁺細胞、例えば、造血前駆細胞、例えば、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、又は胎盤血造血前駆細胞を含む。該非胎盤細胞は、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞を含むこともできる。該非胎盤細胞は、1種類以上の成体細胞又は細胞株であることもできる。別の具体的な実施態様において、該組成物は、抗増殖剤、例えば、抗MIP-1α又は抗MIP-1β抗体を含む。

具体的な実施態様において、上記の細胞又は細胞組合せのうちの1つによって馴化された培養培地は、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、又は約5:1の単離された接着性胎盤細胞対腫瘍細胞の比率で複数の腫瘍細胞と共培養した複数の単離された接着性胎盤細胞から得られる。例えば、馴化された培養培地又は上清は、約1×10⁵個の単離された接着性胎盤細胞、約1×10⁶個の単離された接着性胎盤細胞、約1×10⁷個の単離された接着性胎盤細胞、もしくは約1×10⁸個の単離された接着性胎盤細胞、又はそれより多くのものを含む培養物から得ることができる。別の具体的な実施態様において、馴化された培養培地又は上清は、約1×10⁵〜約5×10⁵個の単離された接着性胎盤細胞及び約1×10⁵個の腫瘍細胞;約1×10⁶〜約5×10⁶個の単離された接着性胎盤細胞及び約1×10⁶個の腫瘍細胞;約1×10⁷〜約5×10⁷個の単離された接着性胎盤細胞及び約1×10⁷個の腫瘍細胞;又は約1×10⁸〜約5×10⁸個の単離された接着性胎盤細胞及び約1×10⁸個の腫瘍細胞を含む共培養物から得られる。

(5.7.細胞の保存)
細胞、例えば、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団、或いは造血幹細胞又は前駆細胞を含む胎盤灌流液細胞を保存する、すなわち、長期保存を可能にする条件下、又は例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。

胎盤灌流液は、細胞回収組成物を、胎盤の少なくとも一部に、例えば、胎盤血管系に通すことによって産生することができる。細胞回収組成物は、灌流液内に含まれている細胞を保存するように作用する1以上の化合物を含む。そのような胎盤細胞回収組成物は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、関連米国特許出願公開第20070190042号に記載されているような、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び/又は酸素担持ペルフルオロカーボンを含むことができる。

一実施態様において、灌流液又は胎盤細胞の集団は、該灌流液又は該細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素担持ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と近接させることにより、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤から回収され、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触も近接もさせていない細胞の集団と比較して、胎盤細胞、例えば、接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤寡能性細胞の集団におけるアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。例えば、該胎盤を該細胞回収組成物で灌流することができ、胎盤細胞、例えば、全有核胎盤細胞をそれから単離する。具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、該JNK阻害剤は、接着性胎盤細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞又は接着性胎盤寡能性細胞の分化も増殖も調節しない。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、分離相中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、乳化剤、例えば、レシチンをさらに含む。別の実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該胎盤細胞を該細胞回収組成物と近接させるときに、約0℃〜約25℃である。別のより具体的な実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該胎盤細胞を該細胞回収組成物と近接させるときに、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別のより具体的な実施態様において、該近接させることは、該細胞の集団の輸送の間に行われる。別のより具体的な実施態様において、該近接させることは、該細胞の集団の凍結及び解凍の間に行われる。

別の実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞を、該灌流液及び/又は細胞をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物と近接させる方法によって回収及び保存することができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触も近接もさせていない灌流液又は胎盤細胞と比較したとき、該細胞のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的な実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されており;VIASPAN(商標)としても知られているもの; Southardらの文献、Transplantation 49(2):251-257(1990)も参照のこと)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液であり、これらの文献の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。別の実施態様において、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はそれらの組合せである。別の実施態様において、胎盤細胞回収組成物は、2相状態にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの、酸素担持ペルフルオロカーボンをさらに含む。

本方法の別の実施態様において、胎盤細胞を、灌流の間、アポトーシス阻害剤及び酸素担持ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はそれらの組合せを含む細胞回収組成物と近接させる。別の実施態様において、胎盤細胞を、灌流による回収の後に、該細胞回収化合物と近接させる。

通常、胎盤細胞の回収、濃縮、及び単離時に、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態様において、それゆえ、胎盤灌流液、又は胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、該保存時に6時間未満の間、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、正常な血中酸素濃度を下回る酸素濃度である。より具体的な実施態様において、該灌流液又は胎盤細胞の集団は、該保存時に2時間未満の間、該低酸素状態に曝される。別のより具体的な実施態様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、1時間未満、もしくは30分未満の間、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的な実施態様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、剪断ストレスに曝されない。

細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、造血細胞、例えば、CD34⁺造血幹細胞;本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団;本明細書に提供される単離された接着性胎盤細胞を、例えば、小型の容器、例えば、アンプル又はセプタムバイアル中の凍結保存培地に入れて凍結保存することができる。ある実施態様において、本明細書に提供される細胞を、1mL当たり約1×10⁴〜5×10⁸細胞の濃度で凍結保存する。具体的な実施態様において、本明細書に提供される細胞を、1mL当たり約1×10⁶〜1.5×10⁷細胞の濃度で凍結保存する。より具体的な実施態様において、本明細書に提供される細胞を、1mL当たり約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、1.5×10⁷細胞の濃度で凍結保存する。

好適な凍結保存培地としては、生理食塩水、例えば、成長培地を含む培養培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695、C2639、もしくはC6039(Sigma);CryoStor(登録商標)CS2、CryoStor(登録商標)CS5、もしくはCryoStor(登録商標)CS10(BioLife Solutions)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、凍結保存培地は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)を含む。凍結保存培地は、追加の薬剤、例えば、メチルセルロース、デキストラン、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)、トレハロース、及び/又はグリセロールを含んでいてもよい。ある実施態様において、凍結保存培地は、約1％〜10％のDMSO、約25％〜75％のデキストラン、及び/又は約20〜60％のヒト血清アルブミン(HSA)を含む。ある実施態様において、凍結保存培地は、約1％〜10％のDMSO、約25％〜75％のトレハロース、及び/又は約20〜60％のヒトHSAを含む。具体的な実施態様において、凍結保存培地は、5％のDMSO、55％のデキストラン、及び40％のHSAを含む。より具体的な実施態様において、凍結保存培地は、5％のDMSO、55％のデキストラン(生理食塩水中、10％w/v)、及び40％のHSAを含む。別の具体的な実施態様において、凍結保存培地は、5％のDMSO、55％のトレハロース、及び40％のHSAを含む。より具体的な実施態様において、凍結保存培地は、5％のDMSO、55％のトレハロース(生理食塩水中、10％w/v)、及び40％のHSAを含む。別の具体的な実施態様において、凍結保存培地は、CryoStor(登録商標)CS5を含む。別の具体的な実施態様において、凍結保存培地は、CryoStor(登録商標)CS10を含む。

本明細書に提供される細胞は、種々の方法のいずれかによって、かつ細胞の培養、増殖、又は分化のいずれかの段階で凍結保存することができる。例えば、本明細書に提供される細胞は、もとの組織もしくは器官、例えば、胎盤灌流液もしくは臍帯血から単離した直後、又は上で概説した方法の第一の工程もしくは第二の工程のいずれかにおいて、又は該第一の工程もしくは第二の工程のいずれかの後に、凍結保存することができる。ある実施態様において、造血細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞は、該もとの組織もしくは器官からの単離後、約1、5、10、15、20、30、45分以内に、又は約1、2、4、6、10、12、18、20、もしくは24時間以内に凍結保存される。ある実施態様において、該細胞は、該もとの組織もしくは器官からの単離後、1、2、又は3日以内に凍結保存される。ある実施態様において、該細胞は、上記のように、第一の培地中で培養された後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間、凍結保存される。いくつかの実施態様において、該細胞は、上記のように、第一の培地中で、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間、及び上記のように、第二の培地中で、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間培養された後、凍結保存される。いくつかの実施態様において、NK細胞又はNK前駆細胞が本明細書に記載の三段階法を用いて作製される場合、該細胞は、第一の培地中で、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25日間培養された後;及び/又は第二の培地中で、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25日間培養された後;及び/又は第三の培地中で、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25日間培養された後、凍結保存される。具体的な実施態様において、NK前駆細胞は、本明細書に記載の三段階法を用いて作製され、該細胞は、第一の培地中で9日間培養された後;第二の培地中で5日間培養された後;及び第三の培地中で7日間培養された後、凍結保存される。

一態様において、本明細書に提供されるのは、NK細胞、例えば、TSNK細胞の集団を凍結保存する方法である。一実施態様において、該方法は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団が増殖し、造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞が、該増殖の間にNK細胞に分化するように、該集団を、インターロイキン-15(IL-15)、並びに任意に幹細胞因子(SCF)及びインターロイキン-7(IL-7)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中に播種すること(ここで、該IL-15並びに任意のSCF及びIL-7は、該培地の不確定成分中に含まれない);(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞の集団を産生すること、並びに(c)工程(b)由来のNK細胞を凍結保存培地中で凍結保存することを含む。具体的な実施態様において、該工程(c)は、(1)細胞懸濁溶液を調製すること;(2)凍結保存培地を工程(1)由来の細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得ること;(3)工程(3)由来の凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得ること;及び(4)該凍結保存試料を-80℃未満で保存することをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、工程(a)と(b)の間及び工程(b)と(c)の間の中間工程を含まず、並びに/又は工程(a)の前の追加の培養工程を含まない。

別の実施態様において、NK細胞、例えば、TSNK細胞の集団を凍結保存する該方法は:(a)造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、IL-2、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、及びヘパリンのうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-2、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する);(b)工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生すること;並びに(c)工程(b)由来のNK細胞を凍結保存培地中で凍結保存することを含む。具体的な実施態様において、該工程(c)は、(1)細胞懸濁溶液を調製すること;(2)凍結保存培地を工程(1)由来の細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得ること;(3)工程(3)由来の凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得ること;及び(4)該凍結保存試料を-80℃未満で保存することをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、工程(a)と(b)の間及び工程(b)と(c)の間の中間工程を含まない。

本明細書に提供される細胞を、速度制御フリーザーで、例えば、凍結保存時に、約0.1、0.3、0.5、1、又は2℃/分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存した細胞を液体窒素に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様において、例えば、アンプルが約-90℃に達したら、それを液体窒素保存領域に移す。凍結保存した細胞を、約25℃〜約40℃の温度で、好ましくは約37℃の温度にして解凍することが好ましい。ある実施態様において、凍結保存した細胞を、約1、2、4、6、10、12、18、20、もしくは24時間、又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、もしくは28日間凍結保存した後に解凍する。ある実施態様において、凍結保存した細胞を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28カ月間凍結保存した後に解凍する。ある実施態様において、凍結保存した細胞を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10年間凍結保存した後に解凍する。

好適な解凍培地としては、生理食塩水、例えば、成長培地、例えば、RPMI培地を含む、プラズマライト(plasmalyte)培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、解凍培地は、培地添加物(例えば、栄養素、サイトカイン、及び/又は因子)のうちの1つ又は複数を含む。本明細書に提供される細胞を解凍するのに好適な培地添加物としては、例えば、限定するものではないが、血清、例えば、ヒト血清AB、胎仔ウシ血清(fetal bovine serum)(FBS)、もしくは胎仔ウシ血清(fetal calf serum)(FCS)、ビタミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、アミノ酸(例えば、L-グルタミン)、脂肪酸(例えば、オレイン酸、リノール酸、もしくはパルミチン酸)、インスリン(例えば、組換えヒトインスリン)、トランスフェリン(鉄飽和ヒトトランスフェリン)、β-メルカプトエタノール、幹細胞因子(SCF)、Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3-L)、サイトカイン、例えば、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、トロンボポエチン(Tpo)、又はヘパリンが挙げられる。具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法において有用な解凍培地は、RPMIを含む。別の具体的な実施態様において、該解凍培地は、プラズマライトを含む。別の具体的な実施態様において、該解凍培地は、約0.5〜20％のFBSを含む。別の具体的な実施態様において、該解凍培地は、約1、2、5、10、15、又は20％のFBSを含む。別の具体的な実施態様において、該解凍培地は、約0.5％〜20％のHSAを含む。別の具体的な実施態様において、該解凍培地は、約1、2.5、5、10、15、又は20％のHSAを含む。より具体的な実施態様において、該解凍培地は、RPMI及び約10％のFBSを含む。別のより具体的な実施態様において、該解凍培地は、プラズマライト及び約5％のHSAを含む。

本明細書に提供される凍結保存法を、長期保存を可能にするように、又は例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下で最適化することができる。一実施態様において、解凍後細胞は、例えば、自動細胞カウンター又はトリパンブルー法によって測定したとき、生細胞の60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％超を含む。別の実施態様において、解凍後細胞は、死細胞の約0.5、1、5、10、15、20、又は25％を含む。別の実施態様において、解凍後細胞は、初期アポトーシス細胞の約0.5、1、5、10、15、20、又は25％を含む。別の実施態様において、解凍後細胞の約0.5、1、5、10、15、又は20％は、例えば、アポトーシスアッセイ(例えば、TO-PRO3又はAnnV/PIアポトーシスアッセイキット)によって測定したとき、解凍されてから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日後に、アポトーシスを経る。ある実施態様において、解凍後細胞を、本明細書に提供される方法を用いて、培養するか、増殖するか、又は分化させた後に、再び凍結保存する。

(5.8. NK細胞を含む組成物)
(5.8.1. TSNK細胞)
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたTSNK細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞から産生される。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％. 95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該組成物中のTSNK細胞の90％、92％、94％、96％、又は98％超は、CD56⁺及びCD16^-である。他の実施態様において、該組成物中のTSNK細胞の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、又は90％は、CD3^-及びCD56⁺である。他の実施態様において、該細胞の少なくとも50％、52％、54％、56％、58％、又は60％は、NKG2D⁺である。他の実施態様において、該細胞の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、又は3％未満は、NKB1⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％未満は、NKAT2⁺である。ある他の実施態様において、該TSNK細胞の10％、8％、6％、4％、又は2％は、CD56⁺及びCD16⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、又は70％は、NKp46⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％は、CD117⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、又は45％は、CD94⁺である。他のより具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも10％、12％、14％、16％、18％、又は20％は、CD226⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも20％、25％、30％、35％、又は40％は、CD7⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-、CD56⁺ TSNK細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、又は60％は、CD5⁺である。

別の具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^-TSNK細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたCD56⁺、CD16^-ナチュラルキラー細胞(TSNK細胞)は、少なくとも2人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞である。別の具体的な実施態様において、該TSNK細胞は、該TSNK細胞が、免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、TSNK細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触又は近接させたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物又はサリドマイドをさらに含む。ある実施態様において、該免疫調節化合物は、下記の化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。

より具体的な実施態様において、該組成物は、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるTSNK細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の供給源は、胎盤血及び/又は臍帯血である。別の具体的な実施態様において、該他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該TSNK細胞を、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、TSNK細胞、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該TSNK細胞と同じ個体に由来するのものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該TSNK細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下の第5.2.1.1節に記載の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、TSNK細胞及び胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該TSNK細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該TSNK細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

(5.8.2.三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞)
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法を用いて産生される単離されたNK前駆細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物である。具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞から産生される。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％. 95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該単離されたNK前駆細胞集団内の細胞の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、又は40％以下は、CD3^-CD56⁺細胞である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上は、CD117⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％以上は、CD161⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下は、NKp46⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％以下は、NKp46⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞はCD16^-である。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK前駆細胞集団、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞集団と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK前駆細胞集団とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下記の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

(5.8.3.三段階法を用いて産生されるNK細胞)
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法を用いて産生される単離されたNK細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物である。具体的な実施態様において、該単離されたNK細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤灌流液、臍帯血、及び/又は末梢血から単離された造血幹細胞又は前駆細胞を用いて産生される。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。別の具体的な実施態様において、該単離されたNK細胞集団は、該組成物中の細胞の少なくとも80％、85％、90％. 95％、98％、又は99％を含む。ある実施態様において、該単離されたNK細胞集団内の細胞の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、又は40％以下は、CD3^-CD56⁺細胞である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％以上は、CD117⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％以上は、CD161⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％以下は、NKp46⁺である。より具体的な実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は55％以下は、NKp46⁺である。ある実施態様において、該CD3^-CD56⁺細胞はCD16^-である。

別の具体的な実施態様において、該組成物中の該単離されたNK細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたNK細胞は、少なくとも2人の異なる個体由来のNK細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物中の該単離されたNK細胞は、該NK細胞による治療が意図される個体とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該NK細胞は、該NK細胞が、免疫調節化合物又はサリドマイドと接触も近接もさせていない同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、NK前駆細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムB又はパーフォリンを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物又はサリドマイドと接触又は近接させたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物又はサリドマイドをさらに含む。ある実施態様において、該免疫調節化合物は、下記の化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。

より具体的な実施態様において、該組成物は、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるNK細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の供給源は、胎盤血及び/又は臍帯血である。別の具体的な実施態様において、該他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該組成物中のNK細胞集団を、別の供給源に由来するか又は別の方法によって作製されるNK細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比率で組み合わせる。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団、及び単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞のどちらかを含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK細胞集団と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該NK細胞集団とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て、又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、赤血球を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物、例えば、下記の免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

別の具体的な実施態様において、該組成物は、NK細胞集団及び胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK細胞集団と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該NK細胞集団とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、1以上の抗癌化合物、例えば、下記の抗癌化合物のうちの1つ又は複数をさらに含む。

(5.9. TSNK細胞並びに三段階法を用いて産生されるNK細胞及びNK前駆細胞の使用)
本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に提供される、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団は、癌を有する個体、例えば、固形腫瘍細胞及び/もしくは血液癌細胞を有する個体、又はウイルス感染を有する人を治療する方法で使用することができる。いくつかのそのような実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞の有効投薬量は、1×10⁴〜5×10⁴、5×10⁴〜1×10⁵、1×10⁵〜5×10⁵、5×10⁵〜1×10⁶、1×10⁶〜5×10⁶、5×10⁶〜1×10⁷、又はそれを上回る細胞/キログラム体重の範囲である。本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に提供される、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法で使用することもできる。

(5.9.1.癌を有する個体の治療)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌、例えば、血液癌又は固形腫瘍を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療有効量の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該個体は、ナチュラルキラー細胞の欠損、例えば、該個体の癌に対して活性があるNK細胞の欠損を有する。具体的な実施態様において、該方法は、該個体に、単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞、例えば、治療有効量の胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞を投与することをさらに含む。別の具体的な実施態様において、該方法は、該個体に、有効量の免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、又はサリドマイドを投与することをさらに含む。本明細書で使用されるように、「有効量」は、例えば、該個体が罹患している癌の1以上の症状の検出可能な改善、該症状の進行の軽減、又は該症状の消失をもたらす量である。

具体的な実施態様において、癌は、血液癌、例えば、白血病又はリンパ腫である。より具体的な実施態様において、癌は、急性白血病、例えば、急性T細胞白血病、急性骨髄性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、前駆B急性リンパ芽球性白血病、前駆T急性リンパ芽球性白血病、バーキット白血病(バーキットリンパ腫)、もしくは急性混合型白血病;慢性白血病、例えば、慢性骨髄リンパ腫、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性単球性白血病、慢性リンパ球性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫、もしくはB細胞前リンパ球性白血病;有毛細胞リンパ腫;T細胞前リンパ球性白血病;又はリンパ腫、例えば、組織球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫(例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞新生物(例えば、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着症、もしくは重鎖病)、節外辺縁帯B細胞リンパ腫(MALTリンパ腫)、節辺縁帯B細胞リンパ腫(NMZL)、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、T細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性NK細胞白血病、成人T細胞白血病/リンパ腫、鼻型の節外NK/T細胞リンパ腫、腸症型T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫(セザリー症候群)、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性障害(例えば、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫もしくはリンパ腫様丘疹症)、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、非特定型の末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、もしくは結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫である。別の具体的な実施態様において、癌は、多発性骨髄腫又は骨髄異形成症候群である。

ある他の具体的な実施態様において、癌は、固形腫瘍、例えば、癌、例えば、腺癌、副腎皮質癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、腺管癌、肺癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒色腫(例えば、悪性黒色腫)、非黒色腫皮膚癌、又は詳細不明の癌;類腱腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;内分泌腫瘍;ユーイング肉腫;胚細胞腫瘍(例えば、精巣癌、卵巣癌、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、胚細胞腫など);肝芽腫;肝細胞癌;神経芽腫;非横紋筋肉腫軟部組織肉腫;骨肉腫;網膜芽腫;横紋筋肉腫;又はウィルムス腫瘍である。別の実施態様において、固形腫瘍は、膵癌又は乳癌である。他の実施態様において、固形腫瘍は、聴神経腫;星状細胞腫(例えば、グレードIの毛様細胞性星状細胞腫、グレードIIの低悪性度星状細胞腫;グレードIIIの未分化星状細胞腫;もしくはグレードIVの多形性膠芽腫);脊索腫;頭蓋咽頭腫;神経膠腫(例えば、脳幹神経膠腫;上衣腫;混合性神経膠腫;視神経神経膠腫;もしくは上衣下腫);膠芽腫;髄芽腫;髄膜腫;転移性脳腫瘍;乏突起膠腫;松果体芽腫;下垂体部腫瘍;未分化神経外胚葉性腫瘍;又は神経鞘腫である。別の実施態様において、癌は、前立腺癌である。

ある実施態様において、癌、例えば、血液癌又は固形腫瘍を有する個体、例えば、ナチュラルキラー細胞の欠損を有する個体は、該投与することの前に骨髄移植を受けた個体である。ある実施態様において、該骨髄移植は、該癌の治療でのものであった。ある他の実施態様において、該骨髄移植は、該癌以外の状態の治療でのものであった。ある実施態様において、個体は、該骨髄移植に加えて、免疫抑制剤を受容した。ある実施態様において、骨髄移植を受けた個体は、該投与のときに、移植片対宿主病(GVHD)の1以上の症状を示している。ある他の実施態様において、骨髄移植を受けた個体に、移植片対宿主病(GVHD)の症状が現われる前に、該細胞を投与する。

ある具体的な実施態様において、癌、例えば、血液癌を有する個体は、該投与することの前に、少なくとも1用量のTNFα阻害剤、例えば、ETANERCEPT(登録商標)(Enbrel)を受容した。具体的な実施態様において、該個体は、該癌の診断から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12カ月以内に、該用量のTNFα阻害剤を受容した。具体的な実施態様において、一定用量のTNFα阻害剤を受容した個体は、急性骨髄性白血病を示している。より具体的な実施態様において、一定用量のTNFα阻害剤を受容し、かつ急性骨髄性白血病を示している個体はさらに、血液細胞の第5番染色体の長腕の欠失を示す。別の実施態様において、癌、例えば、血液癌を有する個体は、フィラデルフィア染色体を示す。

ある他の実施態様において、該個体の癌、例えば、血液癌又は固形腫瘍は、1以上の抗癌薬に不応性である。具体的な実施態様において、癌は、GLEEVEC(登録商標)(メシル酸イマチニブ)に不応性である。

ある実施態様において、該個体の癌、例えば、血液癌は、少なくとも1つの抗癌薬に応答し;この実施態様において、胎盤灌流液、単離された胎盤灌流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞、単離され、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は本明細書に記載のTSNK、NK前駆細胞、もしくはNK細胞、及び/或いはそれらの組合せ、並びに任意に免疫調節化合物を、補助治療として又は該抗癌薬との併用療法として追加する。ある他の実施態様において、癌、例えば、血液癌を有する個体は、少なくとも1つの抗癌薬で治療されたことがあり、かつ該投与することの前に、再発している。ある実施態様において、治療すべき個体は、難治性癌を有する。一実施態様において、本明細書に記載の細胞による癌治療法は、癌の再発を防ぐ(例えば、予防する又は遅延させる)。一実施態様において、本明細書に記載の癌治療法は、1カ月以上、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12カ月以上、1年以上、2年以上、3年以上、又は4年以上の間、癌の緩解をもたらす。

一実施態様において、本明細書に提供されるのは、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に、(1)レナリドミド;(2)メルファラン;及び(3)増殖されたNK細胞を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体の多発性骨髄腫を治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されるNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。別の実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に増殖されたものである。別の実施態様において、該レナリドミド、メルファラン、及び/又はNK細胞は、互いに別々に投与される。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある具体的な実施形態において、該NK細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、IL-2、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、及びヘパリンのうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-2、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する);並びに工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖すること:を含む、方法によって産生される。

別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、急性骨髄性白血病(AML)を有する個体を治療する方法であって、該個体に、増殖されたNK細胞(IL2とIL12とIL18、IL12とIL15、IL12とIL18、IL2とIL12とIL15とIL18、又はIL2とIL15とIL18による前処理よって任意に活性化されたもの)を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体のAMLを治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されるNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、又は三段階法を用いてNK細胞集団を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。別の実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に増殖されたものである。AMLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞は、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を産生する二工程法によって産生され、ここで、該方法の第一の工程は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-7(IL-7)、及びインターロイキン-15(IL-15)のうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、該造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する)を含み;並びに該方法の第二の工程は、第一の工程由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NK細胞を産生することを含む。AMLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施態様において、該NK細胞集団は、本明細書に記載の三段階法によって産生される。特定の実施態様において、前述の方法によって治療されるべきAMLは、難治性AML、予後不良AML、又は小児AMLを含む。難治性AML、予後不良AML、又は小児AMLの治療用にNK細胞を投与するための当技術分野で公知の方法をこの目的に適合させることができる;例えば、Millerらの文献、2005, Blood 105:3051-3057; Rubnitzらの文献、2010, J Clin Oncol. 28:955-959を参照されたく、これらは各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、慢性リンパ球性白血病(CLL)を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療有効量の(1)レナリドミド;(2)メルファラン;(3)フルダラビン;及び(4)増殖されたNK細胞、例えば、TSNK細胞を投与することを含み、ここで、該NK細胞が、該個体で該CLLを治療するのに有効である、方法である。具体的な実施態様において、該NK細胞は、臍帯血NK細胞、又は臍帯血造血幹細胞から産生されたNK細胞である。別の実施態様において、該NK細胞は、NK細胞を産生するための、例えば、TSNK細胞を産生するための、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたものである。上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該NK細胞は、該投与することの前に少なくとも10日間増殖されたものである。上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該レナリドミド、メルファラン、フルダラビン、及び増殖されたNK細胞は、該個体に別々に投与される。CLLを有する個体を治療する方法のある具体的な実施形態において、該NK細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞の集団を、幹細胞因子(SCF)、IL-2、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、及びヘパリンのうちの1つ又は複数を含む第一の培地中で増殖すること(ここで、該SCF、IL-2、IL-7、及びIL-15は、該培地の不確定成分中に含まれず、造血幹細胞又は前駆細胞の集団内の複数の造血幹細胞又は前駆細胞は、該増殖の間にNK細胞に分化する);並びに工程(a)由来の細胞を、インターロイキン-2(IL-2)を含む第二の培地中で増殖して、活性化NKを産生すること:を含む、方法によって産生される。

(5.9.2.腫瘍細胞増殖の抑制)
さらに本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を、腫瘍細胞と近接させ、例えば、該腫瘍細胞を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と接触させることを含む、方法である。任意に、単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞を、腫瘍細胞及び/又は本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団と近接させる。別の具体的な実施態様において、免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、又はサリドマイドを、腫瘍細胞の増殖が、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と近接させていない同じタイプの腫瘍細胞と比較して検出可能な程度に低下するように、腫瘍細胞及び/又は本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団とさらに近接させる。任意に、単離された胎盤灌流液又は単離された胎盤灌流液細胞を、免疫調節化合物と接触又は近接させた、該腫瘍細胞及び/又は本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団と近接させる。

本明細書で使用されるように、ある実施態様において、細胞に関連して、「接触させること」は、一実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞、本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団、及び/又は単離され、組み合わされたナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞との直接的で物理的な、例えば、細胞間の接触を包含する。別の実施態様において、「接触させること」は、同じ物理的空間内での存在を包含し、例えば、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞、本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団、及び/又単離され、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞と同じ容器(例えば、培養ディッシュ、マルチウェルプレート)に入れられる。別の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、又は本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞、本明細書に記載の三段階法に従って産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団と腫瘍細胞とを「接触させること」は、例えば、該胎盤灌流液、又は細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、もしくはナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、個体、例えば、腫瘍細胞を含むヒト、例えば、癌患者に注射又は注入することによって達成される。免疫調節化合物及び/又はサリドマイドとの関連における「接触させること」は、例えば、細胞と免疫調節化合物及び/又はサリドマイドとを、互いに直接的に物理的に接触させるか、又は同じ物理的容積(例えば、細胞培養容器もしくは個体)内に入れることを意味する。

具体的な実施態様において、腫瘍細胞は、血液癌細胞、例えば、白血病細胞又はリンパ腫細胞である。より具体的な実施態様において、癌は、急性白血病、例えば、急性T細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病(AML)細胞、急性前骨髄球性白血病細胞、急性骨髄芽球性白血病細胞、急性巨核芽球性白血病細胞、前駆B急性リンパ芽球性白血病細胞、前駆T急性リンパ芽球性白血病細胞、バーキット白血病(バーキットリンパ腫)細胞、もしくは急性混合型白血病細胞;慢性白血病細胞、例えば、慢性骨髄リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、慢性単球性白血病細胞、慢性リンパ球性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫細胞、もしくはB細胞前リンパ球性白血病細胞;有毛細胞リンパ腫細胞;T細胞前リンパ球性白血病細胞;又はリンパ腫細胞、例えば、組織球性リンパ腫細胞、リンパ形質細胞性リンパ腫細胞(例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞)、脾辺縁帯リンパ腫細胞、形質細胞新生物細胞(例えば、形質細胞性骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞、単クローン性免疫グロブリン沈着症、もしくは重鎖病)、節外辺縁帯B細胞リンパ腫(MALTリンパ腫)細胞、節辺縁帯B細胞リンパ腫(NMZL)細胞、濾胞性リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞、縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫細胞、血管内大細胞型B細胞リンパ腫細胞、原発性滲出液リンパ腫細胞、T細胞大型顆粒リンパ球性白血病細胞、侵攻性NK細胞白血病細胞、成人T細胞白血病/リンパ腫細胞、節外NK/T細胞リンパ腫-鼻型細胞、腸症型T細胞リンパ腫細胞、肝脾T細胞リンパ腫細胞、芽球性NK細胞リンパ腫細胞、菌状息肉腫(セザリー症候群)、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性障害(例えば、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫もしくはリンパ腫様丘疹症)細胞、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫細胞、末梢T細胞リンパ腫-非特定型細胞、未分化大細胞リンパ腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞もしくは結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫細胞である。別の具体的な実施態様において、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞又は骨髄異形成症候群細胞である

具体的な実施態様において、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞、例えば、癌細胞、例えば、腺癌細胞、副腎皮質癌細胞、結腸腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、腺管癌細胞、肺癌細胞、甲状腺癌細胞、上咽頭癌細胞、黒色腫細胞(例えば、悪性黒色腫細胞)、非黒色腫皮膚癌細胞、もしくは詳細不明の癌細胞;類腱腫細胞;線維形成性小円形細胞腫瘍細胞;内分泌腫瘍細胞;ユーイング肉腫細胞;胚細胞腫瘍細胞(例えば、精巣癌細胞、卵巣癌細胞、絨毛癌細胞、内胚葉洞腫瘍細胞、胚細胞腫細胞など);肝芽腫細胞;肝細胞癌細胞;神経芽腫細胞;非横紋筋肉腫軟部組織肉腫細胞;骨肉腫細胞;網膜芽腫細胞;横紋筋肉腫細胞;又はウィルムス腫瘍細胞である。別の実施態様において、腫瘍細胞は、膵癌細胞又は乳癌細胞である。他の実施態様において、固形腫瘍細胞は、聴神経腫細胞;星状細胞腫細胞(例えば、グレードIの毛様細胞性星状細胞腫細胞、グレードIIの低悪性度星状細胞腫細胞;グレードIIIの未分化星状細胞腫細胞;もしくはグレードIVの多形性膠芽腫細胞);脊索腫細胞;頭蓋咽頭腫細胞;神経膠腫細胞(例えば、脳幹神経膠腫細胞;上衣腫細胞;混合性神経膠腫細胞;視神経神経膠腫細胞;もしくは上衣下腫細胞);膠芽腫細胞;髄芽腫細胞;髄膜腫細胞;転移性脳腫瘍細胞;乏突起膠腫細胞;松果体芽腫細胞;下垂体部腫瘍細胞;未分化神経外胚葉性腫瘍細胞;又は神経鞘腫細胞である。別の実施態様において、腫瘍細胞は、前立腺癌細胞である。

本明細書で使用されるように、「治療的に有益な」及び「治療的利益」には、例えば、腫瘍のサイズの低下;腫瘍の増殖の軽減又は停止;転移性疾患の軽減又は予防;単位容積当たりの、組織試料、例えば、血液試料中の癌細胞の数の低下;該個体が有する特定の癌又は腫瘍の任意の症状の臨床的改善、該個体が有する特定の癌の任意の症状の悪化の軽減又は停止などが含まれるが、これらに限定されない。

(5.9.3. NK細胞、NK細胞集団、及びNK前駆細胞集団、並びに他の抗癌剤を用いた癌の治療)
本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を用いた、癌を有する個体の治療は、1以上の他の抗癌剤を含む抗癌治療レジメンの一部であることができる。さらに又は代わりに、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に記載のTSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を用いた、癌を有する個体の治療を用いて、1以上の他の抗癌剤を含む抗癌療法を補完することができる。そのような抗癌剤は、当技術分野で周知である。本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、及び任意に灌流液、灌流液細胞、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団以外のナチュラルキラー細胞に加えて、癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体に投与し得る具体的な抗癌剤としては、限定されないが:アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アドルシル;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン;酢酸アメタントロン;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ(例えば、エルウィニア・クリサン(Erwinia chrysan)由来のもの;エルウィナーゼ(Erwinaze));アスペルリン;アバスチン(ベバシズマブ);アザシチジン;アゼテパ;アゾトマイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ジメシル酸ビスナフィド;ビゼレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;セレコキシブ(COX-2阻害剤);セルビジン(Cerubidine);クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;メシル酸クリスナトール;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;メシル酸デザグアニン;ジアジコン;ドセタキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;デュアゾマイシン;エダトレキセート;塩酸エフロミチン;エルサミトルシン;エルスパー(Elspar);エンロプラチン;エンプロメート;エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール;塩酸エソルビシン;エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール;エトポシド;リン酸エトポシド;エトポフォス(Etopophos);エトプリン;塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;ホスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシ尿素;イダマイシン(Idamycin);塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシン;イプロプラチン;イリノテカン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;メイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;マイトカルシン;マイトクロミン;マイトギリン;マイトマルシン;マイトマイシン;マイトスペル;ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン;ペンタムスチン;硫酸ペプロマイシン;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;塩酸プロカルバジン;プロロイキン(Proleukin);プリネトール(Purinethol);ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン; リューマトレックス(Rheumatrex);リボプリン;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルホセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タブロイド(Tabloid);タリソマイシン;テコガランナトリウム;タキソテール;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;トポサル(Toposar);クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン;トレキサル(Trexall);リン酸トリシリビン;トリメトレキセート;グルクロン酸トリメトレキセート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン;硫酸ビングリシネート;硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;及び塩酸ゾルビシンが挙げられる。

他の抗癌薬としては、限定するものではないが:20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス;アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラフォリド;血管形成阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリクス;抗背方化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィジコリングリシネート;アポトーシス遺伝子調節物質;アポトーシス調節因子;アプリン酸;ara-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット;BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;β-アレチン;βクラマイシンB;ベツリン酸;bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテンA;ビセレシン;ブレフレート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトサール(カンプトとも呼ばれる;イリノテカン)カンプトテシン誘導体;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン(chlorln);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クラムベスシジン816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;クラシンA;シクロペンタントラキノン;シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホスフェート;細胞溶解因子;サイトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデンミンB;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド;デクスラゾキサン;デクスベラパミル;ジアジコン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール、9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドキソルビシン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフル;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン(例えば、Fludara);塩酸フルオロダウノルニシン;フォルフェニメックス;フォルメスタン;フォストリエシン;フォテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イマチニブ(例えば、GLEEVEC(登録商標))、イミキモド;免疫刺激性ペプチド;インスリン様成長因子-1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール、4-;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;ラメラリン-Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン;レトロゾール;白血病阻害因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン;リュープロレリン;レバミソール;リアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;脂溶性二糖ペプチド;脂溶性白金化合物;リッソクリナミド7;ロバプラチン;ロンブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロキソリビン;ルルトテカン;ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン;溶解性ペプチド;マイタンシン;マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;マイトグアゾン;マイトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド;マイトトキシン線維芽細胞成長因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;抗EGFR抗体(例えば、Erbitux(セツキシマブ));抗CD19抗体;抗CD20抗体(例えば、リツキシマブ);抗ジシアロガングリオシド(GD2)抗体(例えば、モノクローナル抗体3F8又はch14>18);抗ErbB2抗体(例えば、ハーセプチン);ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン;モノホスホリル脂質A＋ミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモール;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン;N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチップ;ナロキソン＋ペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素調節物質;窒素酸化物酸化防止剤;ニトルリン;オブリメルセン(GENASENSE(登録商標));O⁶-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン(例えば、Floxatin);オキサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサンポリ硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;酢酸フェニル;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;プロテインAに基づく免疫調節物質;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク質キナーゼC阻害剤、微細藻類性;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン抱合体;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras-GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン;レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチナミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi 1模倣剤;セムスチン;老化誘導阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シゾフィラン;ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテイト;酢酸フェニルナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン;超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポイエチン;トロンボポイエチン模倣剤;チマルファシン;チモポイエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;Vectibix(パニツムマブ)ベラレソール;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボロゾール;Welcovorin(ロイコボリン);Xeloda(カペシタビン);ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げられる。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に記載のTSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を用いた、癌を有する個体の治療は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)に対する抗癌療法レジメンの一部である。一実施態様において、ADCCレジメンは、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に記載のTSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と組み合わせた、1以上の抗体(例えば、上述の段落に記載されている抗体)の投与を含む。限定されないが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)又は他のB細胞悪性腫瘍(リンパ腫及び白血病)、神経芽腫、黒色腫、乳癌、並びに頭頸部癌を含む、数種類の癌を、そのようなADCC法を用いて治療することができる。具体的な実施態様において、ADCC療法は、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、本明細書に記載のTSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と組み合わせた、以下の抗体、抗体EGFR抗体(例えば、Erbitux(セツキシマブ))、抗CD19抗体、抗CD20抗体(例えば、リツキシマブ)、抗ジシアロガングリオシド(GD2)抗体(例えば、モノクローナル抗体3F8もしくはch14>18)、又は抗ErbB2抗体(例えば、ハーセプチン)のうちの1つ又は複数の投与を含む。

(5.9.4.ウイルス感染の治療)
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療有効量の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該個体は、ナチュラルキラー細胞の欠損、例えば、該個体のウイルス感染に対して活性があるNK細胞の欠損を有する。ある具体的な実施態様において、該投与することは、該個体に、単離された胎盤灌流液、単離された胎盤灌流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞、単離され、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数を投与することをさらに含む。ある具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を、該投与することの前に、免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、又はサリドマイドと接触又は近接させる。ある他の具体的な実施態様において、該投与することは、本明細書に記載の方法を用いて産生される該NK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団に加えて、免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、又はサリドマイドを、該個体に投与することを含み、ここで、該量は、例えば、該ウイルス感染の1以上の症状の検出可能な改善、該症状の進行の軽減、又は該症状の消失をもたらす量である。具体的な実施態様において、ウイルス感染は、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パピローマウイルス科、ラブドウイルス科、又はトガウイルス科ファミリーのウイルスによる感染である。より具体的な実施態様において、該ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、コクサッキーウイルス、A型肝炎ウイルス(HAV)、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV2)、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス8型(HHV8)、帯状疱疹(herpes zoster)ウイルス(水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)もしくは帯状疱疹(shingles)ウイルス)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、インフルエンザウイルス(例えば、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、もしくはトゴトウイルス)、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、又は風疹ウイルスである。

他のより具体的な実施態様において、該ウイルスは、アデノウイルス種A、血清型12、18、もしくは31;アデノウイルス種B、血清型3、7、11、14、16、34、35、もしくは50;アデノウイルス種C、血清型1、2、5、もしくは6;種D、血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは51;種E、血清型4;又は種F、血清型40もしくは41である。

ある他のより具体的な実施態様において、該ウイルスは、アポイウイルス(APOIV)、アロアウイルス(AROAV)、バガザウイルス(BAGV)、バンジウイルス(BANV)、ブブイウイルス(BOUV)、カシパコレウイルス(CPCV)、カレイ島ウイルス(CIV)、カウボーンリッジウイルス(CRV)、デングウイルス(DENV)、エッジヒルウイルス(EHV)、ガジェッツガリーウイルス(GGYV)、イルヘウスウイルス(ILHV)、イスラエルターキー髄膜脳脊髄炎ウイルス(ITV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ジュグラウイルス(JUGV)、ジュチアパウイルス(JUTV)、カダムウイルス(KADV)、ケドゥグウイルス(KEDV)、ココベラウイルス(KOKV)、コウタンゴウイルス(KOUV)、キャサヌル森林病ウイルス(KFDV)、ランガトウイルス(LGTV)、メアバンウイルス(MEAV)、モドックウイルス(MODV)、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルスウイルス(MMLV)、マレー渓谷脳炎ウイルス(MVEV)、ウンタヤウイルス(NTAV)、オムスク出血熱ウイルス(OHFV)、ポワサンウイルス(POWV)、リオブラボーウイルス(RBV)、ロイヤルファームウイルス(RFV)、サボヤウイルス(SABV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、サルビエハウイルス(SVV)、サンペルリタウイルス(SPV)、ソーマレズリーフウイルス(SREV)、セピックウイルス(SEPV)、テンブスウイルス(TMUV)、ダニ媒介型脳炎ウイルス(TBEV)、チュレニーウイルス(TYUV)、ウガンダSウイルス(UGSV)、ウスツウイルス(USUV)、ウェセルスブロンウイルス(WESSV)、西ナイルウイルス(WNV)、ヤウンデウイルス(YAOV)、黄熱病ウイルス(YFV)、ヨコセウイルス(YOKV)、又はジカウイルス(ZIKV)である。

他の実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、及び任意に胎盤灌流液及び/又は灌流液細胞を、ウイルス感染を有する個体に、1以上の他の抗ウイルス剤を含む抗ウイルス治療レジメンの一部として投与する。ウイルス感染を有する個体に投与し得る具体的な抗ウイルス剤としては:イミキモド、ポドフィロックス、ポドフィリン、インターフェロンアルファ(IFNα)、レチコロス、ノノキシノール-9、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル;アマンタジン、リマンタジン;リバビリン;ザナマビル及びオセルタミビル;プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、もしくはサキナビル;ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン;又はジドブジン;並びに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピンもしくはエファビレンツが挙げられるが、これらに限定されない。

(5.9.5.投与)
細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の有核細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団の数の決定、並びに免疫調節化合物、例えば、免疫調節化合物、又はサリドマイドの量の決定は、互いに独立に行うことができる。

(5.9.5.1.細胞の投与)
ある実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を、ウイルス感染、癌、又は腫瘍細胞を有する個体、例えば、腫瘍細胞、固形腫瘍、又は血液癌を有する個体、例えば、癌患者に対して検出可能な治療的利益をもたらす任意の量又は数、例えば、有効量で、該個体に使用する、例えば、投与する。そのような細胞を、そのような個体に、細胞の絶対数で投与することができ、例えば、該個体に、約、少なくとも約、又は多くとも約1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、又は1×10¹¹個の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団で投与することができる。他の実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を、そのような個体に、細胞の相対数で投与することができ、例えば、該個体に、該個体のキログラム当たり約、少なくとも約、又は多くとも約1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、又は1×10¹¹個の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団で投与することができる。他の実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を、そのような個体に、細胞の相対数で投与することができ、例えば、該個体に、該個体のキログラム当たり約、少なくとも約、又は多くとも約1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、又は5×10⁸個の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団で投与することができる。本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるいくつかのNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、並びに胎盤灌流液細胞及び/又は任意に本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団以外のナチュラルキラー細胞と、該個体内のいくつかの腫瘍細胞(例えば、推定数)との近似比率に従って、そのような個体に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団を、個体内の腫瘍細胞の数に対して約、少なくとも約、又は多くとも約1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、又は100:1の比率で、該個体に投与することができる。そのような個体内の腫瘍細胞の数は、例えば、該個体由来の組織の試料、例えば、血液試料、生検などにおける腫瘍細胞の数を計数することによって推定することができる。例えば、固形腫瘍についての具体的な実施態様において、該計数することを、腫瘍(単数又は複数)のイメージングと組み合わせて行い、おおよその腫瘍容積を得る。具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、任意に、胎盤灌流液細胞及び/又は本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団以外のナチュラルキラー細胞に加えて、免疫調節化合物又はサリドマイド、例えば、有効量の免疫調節化合物又はサリドマイドを個体に投与する。

ある実施態様において、例えば、個体内の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法;個体のナチュラルキラー細胞の欠損を有する個体の治療;又はウイルス感染を有する個体の治療;又は癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞、血液癌、もしくは固形腫瘍を有する個体の治療は、該腫瘍細胞を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と胎盤灌流液及び/もしくは胎盤灌流液細胞のうちの1つもしくは複数の組合せと近接させること、又は該個体に、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と胎盤灌流液及び/もしくは胎盤灌流液細胞のうちの1つもしくは複数の組合せを投与することを含む。具体的な実施態様において、該方法は、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと近接させること、又は該個体に免疫調節化合物もしくはサリドマイドを投与することをさらに含む。

具体的な実施態様において、例えば、個体のナチュラルキラー細胞の欠損(例えば、NK細胞の数の欠損、又は癌、腫瘍、もしくはウイルス感染細胞に対するNK細胞の反応性の欠損)を有する個体の治療;或いは癌又はウイルス感染を有する個体の治療、或いは腫瘍細胞増殖の抑制は、該腫瘍細胞を、単離された胎盤灌流液細胞もしくは胎盤灌流液が補充された本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団と近接させること、又は該個体に、単離された胎盤灌流液細胞もしくは胎盤灌流液が補充された本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団を投与することを含む。具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団、又は1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団に、1ミリリットル当たり約、又は少なくとも約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの単離された胎盤灌流液細胞、又は1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの単離された胎盤灌流液細胞を補充する。他のより具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団、又は1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団に、約、もしくは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの灌流液、又は約1ユニットの灌流液を補充する。

別の具体的な実施態様において、個体のナチュラルキラー細胞の欠損を有する個体の治療;癌を有する個体の治療;ウイルス感染を有する個体の治療、又は腫瘍細胞増殖の抑制は、該腫瘍細胞を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団と近接させること、又は該個体に、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団を投与することを含み、ここで、該細胞には、接着性胎盤細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞又は寡能性細胞、例えば、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤細胞が補充される。具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団に、1ミリリットル当たり約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸個、もしくはそれより多くの接着性胎盤幹細胞、又は1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、もしくはそれより多くの接着性胎盤細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞もしくは寡能性細胞を補充する。

別の具体的な実施態様において、個体のナチュラルキラー細胞の欠損を有する個体の治療;癌を有する個体の治療;ウイルス感染を有する個体の治療、又は腫瘍細胞増殖の抑制を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団と組み合わせた免疫調節化合物又はサリドマイドを用いて行い、ここで、該細胞には、馴化培地、例えば、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤細胞で馴化された培地、例えば、灌流液1ユニット当たり、又は10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、もしくは10¹¹個の本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団当たり、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mLの幹細胞馴化培養培地が補充される。ある実施態様において、該組織培養プラスチック接着性胎盤細胞は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第7,468,276号及び米国特許出願公開第2007/0275362号に記載されている寡能性接着性胎盤細胞である。別の具体的な実施態様において、該方法は、該腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと近接させるか、又は該個体に免疫調節化合物もしくはサリドマイドを投与することをさらに含む。

別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法を用いて産生される該NK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団に胎盤灌流液細胞が補充される、個体のナチュラルキラー細胞の欠損を有する個体の治療;癌を有する個体の治療;ウイルス感染を有する個体の治療、又は腫瘍細胞増殖の抑制では、該灌流液細胞を、該近接させることの前に、一定期間、インターロイキン-2(IL-2)と近接させる。ある実施態様において、該一定期間は、該近接させることの前の約、少なくとも、又は多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、又は48時間である。

本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、及び任意に灌流液又は灌流液細胞を、一連の抗癌療法の間に1回、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体、もしくは腫瘍細胞を有する個体に投与することができるか;或いは治療の間に複数回、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23時間に1回、又は1、2、3、4、5、6、もしくは7日に1回、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36週間、もしくはそれより長い期間に1回投与することができる。細胞及び免疫調節化合物又はサリドマイドを用いる実施態様において、該免疫調節化合物又はサリドマイド、及び細胞又は灌流液を、該個体に、一緒に、例えば、同じ製剤中で;別々に、例えば、別々の製剤中で、ほぼ同時に投与することができるか;又は別々に、例えば、異なる投与スケジュールで、もしくは1日の異なる時間に投与することができる。同様に、細胞及び抗ウイルス化合物もしくは抗癌化合物を用いる実施態様において、該抗ウイルス化合物又は抗癌化合物、及び細胞又は灌流液を、個体に、一緒に、例えば、同じ製剤中で;別々に、例えば、別々の製剤中で、ほぼ同時に投与することができるか;又は別々に、例えば、異なる投与スケジュールで、もしくは1日の異なる時間に投与することができる。本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又はNK細胞集団、又はNK前駆細胞集団、及び灌流液又は灌流液細胞を、本明細書に記載の方法を用いて産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団、灌流液、又は灌流液細胞が過去に該個体に投与されたことがあるかどうかということには関係なく、投与することができる。

(6.キット)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の組成物、例えば、本明細書に記載の方法によって産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、又は本明細書に記載の三段階法を用いて産生されるNK細胞集団もしくはNK前駆細胞集団を含む組成物のうちの1つ又は複数を充填した1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。そのような容器(複数可)には、薬剤又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められた形での注意書きが任意に関連付けられることがあり、この注意書きは、該機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の認可を示すものである。

本明細書に包含されるキットは、本明細書に記載の方法、例えば、腫瘍細胞の成長を抑制する方法、及び/又は癌、例えば、血液癌を治療する方法、及び/又はウイルス感染を治療する方法に従って使用することができる。一実施態様において、キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載の方法によって産生されるNK細胞、例えば、TSNK細胞、もしくはNK細胞集団、もしくはNK前駆細胞集団、又はそれらの組成物を含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、TSNK細胞又はその組成物を含むキットである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の三段階法によって産生されるNK細胞集団又はその組成物を含むキットである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、NK前駆細胞集団又はその組成物を含むキットである。具体的な実施態様において、該キット中の該NK前駆細胞集団は、本明細書に記載の方法、例えば、本明細書に記載の三段階法によって産生される。

(7.実施例)
(7.1.実施例1:ヒト胎盤灌流液及び臍帯血からの造血幹細胞の回収)
ヒト胎盤灌流液(HPP)及び臍帯血(UCB)細胞を、通常、Ficoll又は塩化アンモニウムのどちらかを用いて精製し、全有核細胞(TNC)を得た。その後、TNCを陽性選択手順で用い、製造業者のプロトコル(StemCell Technologies社)に従って抗CD34ビーズ及びRoboSepを用いて、CD34⁺細胞を単離した。この実験では、CD34⁺細胞を90％を超える純度で単離した。或いは、EasySep(登録商標)ヒト前駆細胞濃縮キット(StemCell Technologies社)を陰性選択手順で用い、以下のヒト細胞表面抗原:CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、及びグリコフォリンAに対するモノクローナル抗体を含むヒト前駆細胞濃縮カクテルを用いることによって、系譜が決定された細胞を除去した。陰性選択を用いて、90％のCD34⁺細胞を原材料から回収した。回収されたHSCの細胞組成を表1にまとめた。

(7.2.実施例2:フィーダー細胞を含まない造血幹細胞の増殖及びナチュラルキラー細胞への分化)
CD34⁺細胞を以下の培地製剤中で最大48日間培養し、細胞のアリコートを、細胞数、細胞生存率の評価(assessment)、ナチュラルキラー細胞分化の特徴付け、及び機能的評価(evaluation)のために採取した。

(NK1培地): pen/strep(カタログ# 15140, Gibco)、20ng/mL SCF(カタログ# 255-SC, R&D Systems)、10ng/mL Flt-3リガンド(カタログ# 308-FK, R&D system)、20ng/mL TPO(カタログ# 288-TP, R&D system)、20ng/mL IL-7(カタログ# 207-IL, R&D Systems)、200IU/mL IL-2(カタログ# 202-IL, R&D Systems)、及び10ng/mL IL-15(カタログ# 247-IL, R&D Systems)が補充されたGBGM(Glycostem Based Growth Medium, Glycostem カタログ# CCT-SCB500, Clear cell technology)。

(NK2培地): 2mM L-グルタミン(カタログ# 25030, Invitrogen)、1％pen/strep、20％ヒト血清AB(カタログ# 100-512, Gemcell)、5ng/mL亜セレン酸ナトリウム(カタログ# S9133, Sigma)、50μMエタノールアミン(カタログ# E0135, Sigma)、25μM β-メルカプトエタノール(カタログ# 21985, Invitrogen)、20mg/mLアスコルビン酸(カタログ# 47863, Sigma)、5ng/mL IL-3(カタログ# 203-IL, R&D Systems)、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3リガンド、20ng/mL IL-7、及び10ng/mL IL-15が1:2で補充されたDMEM(カタログ# MT-10-013-CV, Fisher):ハムF12(カタログ# BW12-615F, Fisher)。

(NK3培地): pen/strep、10％ヒト血清AB(カタログ# 100-512, Gemcell)、及び500IU/mL IL-2が補充されたX-vivo 20(カタログ# BW04-448Q, Fisher)。

(NK2A培地): 10％ヒト血清AB、1％pen/strep、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3リガンド、20ng/mL TPO、20ng/mL IL-7、200IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、及び1.5IU/mL ヘパリン(カタログ# H3149, Sigma)が補充されたGBGM。

(NK2B1培地): 2mM L-グルタミン、1％pen/strep、20％ヒト血清AB、5ng/mL亜セレン酸ナトリウム、50μMエタノールアミン、25μM β-メルカプトエタノール、20μg/mLアスコルビン酸、5ng/mL IL-3、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3リガンド、20ng/mL IL-7、及び10ng/mL IL-15が1:2で補充されたDMEM:ハムF12。

(NK2B2培地): 2mM L-グルタミン、1％pen/strep、20％ヒト血清AB、5ng/mL亜セレン酸ナトリウム、50μMエタノールアミン、25μM β-メルカプトエタノール、20μg/mLアスコルビン酸、200IU/mL IL-2、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3リガンド、20ng/mL IL-7、及び10ng/mL IL-15が1:2で補充されたDMEM:ハムF12。

(NK2C培地): 10％FBS(カタログ# SH30070.03, Hyclone)、2mM L-グルタミン、1％pen/strep、50ng/mL SCF、50ng/mL Flt-3リガンド、100IU/mL IL-2、20ng/mL IL-7、及び20ng/mL IL-15が補充されたRPMI 1640(カタログ# 22400105, Invitrogen)。

(NK2D培地): 1μM合成グルココルチコイドデキサメタゾン(Dex, カタログ# D4902, Sigma, St Louis, MO)、40ng/mLインスリン様成長因子1(IGF-1、カタログ# 291-G1-250, R&D Systems, Minneapolis, MN)、100ng/mL SCF、40μg/mL脂質(コレステロールを多く含む脂質混合物;カタログ# C7305-1G, Sigma, St Louis, MO)、5ng/mL IL-3、200IU/mL IL-2、20ng/mL IL-7、及び20ng/mL IL-15が補充された無血清培地(StemSpan, カタログ# 09650, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)。

異なる時点で回収された細胞をRPMI1640(フェノール不含)及び5％FBSで2回洗浄し、蛍光コンジュゲート抗体(表2及び3)で4℃で15分間標識し、フローサイトメトリー(FACSCanto, BD)及びFlowJoサイトメトリーソフトウェア(Tree Star)で解析した。

PKH26/TO-PRO-3標識を用いた細胞傷害性アッセイ。標的腫瘍細胞を、その親油性脂肪族残基を介して細胞形質膜に挿入する色素であるPKH26(カタログ#PKH26GL, Sigma-Aldrich)で標識し、その後、96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充された200μlのRPMI 1640中で、様々なエフェクター-標的(E:T)比で、増殖されたNK細胞とともにインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO₂で、4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、膜不透過性DNA染料であるTO-PRO-3(Invitrogen カタログ# T3605)を培養物に添加し(1μMの最終濃度)、その後、FACS解析を行った。細胞傷害性を、全PKH26+標的腫瘍細胞内の死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)のパーセンテージとして表した。

CD34⁺細胞の増殖及びNK細胞への分化の最適化。試験した培地製剤NK1、NK2、及びNK3の中で、NK1培地は、21日目(D21)に500倍の増殖を示した。NK2培地もNK3培地も、細胞増殖も分化も維持しなかった。さらなる培地最適化をNK1培地について行い、後継培地をNK2A、NK2B、NK2C、及びNK2Dと命名した。NK2A培地を用いて培養されたCD34⁺細胞は、55日目(D55)に10⁵倍の増殖を示した。NK1、NK2、及びNK3培地からの増殖倍率、分化、及び細胞傷害性の結果に基づいて、第二のバッチのNK2A、NK2B、NK2C、及びNK2D培地の調剤を行い、D55に、10⁵倍の増殖が達成された(図1に示す)。NK2B培地は、約3×10⁴倍の増殖を示した。NK2C培地中での培養は、21日で3×10²倍の増殖をもたらし、その後、細胞生存率を低下させた。NK2D培地は、実験期間の最初から最後まで、細胞を維持しなかった。

48日目(D48)に、NK2A培地中NK細胞の約90％は、CD56⁺CD3^-であった。CD56⁺CD3^-集団内で、細胞の98％超はCD56⁺CD16^-であったが(図2に示す)、58％は活性化受容体NKG2Dを発現し、68％はNKp46⁺であり、17％はCD226⁺であった(表4A及び4Bに示す)。

さらに、NK2A培地中で培養された細胞の97.8％、及びNK2B培地中で培養された細胞の93.1％は、培養21日でCD56⁺CD16^-であった。

(7.3.実施例3:CNK培地中でのNK細胞の培養はNK細胞の増殖及び細胞傷害性を増強する)
27日目(D27)に、NK2A培地中で培養されたCD34⁺細胞を、以下の培地のうちの1つの中でさらに培養した:
・CNK培地及び維持培地を含む、二段階培地。CNK培地は、10％のFCS(Hyclone)、200IU/mLのIL-2(R&D Systems)、35μg/mLのトランスフェリン(Sigma-Aldrich)、5μg/mLのインスリン(Sigma-Aldrich)、2×10^-5Mのエタノールアミン(Sigma-Aldrich)、1μg/mLのオレイン酸(Sigma-Aldrich)、1μg/mLのリノール酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg/mLのパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mLのBSA(Sigma-Aldrich)、及び0.1μg/mLのフィトヘマグルチニン(PHA-P、Sigma-Aldrich)が補充されたIMDM(Invitrogen)である。NK2A培地中で培養されたCD56⁺CD3^- NK細胞を、細胞培養液で処理した24ウェルプレートもしくはT字フラスコ中のCNK培地に2.5×10⁵個の生細胞/mLで再懸濁させた。マイトマイシンC処理した同種異系PBMC及びK562細胞(慢性骨髄性白血病細胞株)を両方とも、フィーダー細胞として、1mL当たり1×10⁶個の最終濃度になるようCNK培地に添加した。NK細胞を、37℃、5％CO₂で、5〜6日間培養した。5〜6日後、及びその後は3〜4日毎に、等容積の維持培地(10％FCS、2％ヒトAB血清、抗生物質、L-グルタミン、及び1mL当たり400ユニットのIL-2を含むIMDM)を該培養物に添加した。
・フィーダー細胞としてのマイトマイシンC処理したCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞を含むNK2A(PDAC)培地;
・フィーダー細胞としてのマイトマイシンC処理した間葉系幹細胞(MSC)を含むNK2A(MSC)培地;又は
・対照としてのフィーダー不含NK2A(FF)培地。

二段階培地は、特に、27日(D27)から48日(D48)の間に、NK2A(FF)、NK2A(PDAC)、及びNK2A(MSC)と比較して、CD34⁺細胞の増殖倍率を高めた。図3を参照されたい。

35日目までに、CD34⁺細胞の割合は、既に、約4％にまで減少していたが、CD56⁺CD3^-の割合は、二段階培地中で約80％にまで増加していた。45日目(D45)に、二段階培地中で培養された細胞は、NK2A(FF)、NK2A(PDAC)、及びNK2A(MSC)中で培養されたNK細胞と比較して、最も高い細胞傷害性を示した(図3に示す)。41日での表現型の特徴付け(図5に示す)は、細胞内でのNKp46及びCD226の発現の増加を示し、細胞傷害性の増強についての考えられる説明を示した。D41では、CD226⁺細胞の割合は、NK2A培地中0.9％±0.8％から二段階培地中13％±4％に増加し;NKp46⁺細胞の割合は、NK2A培地中55.4％±8.7％から二段階培地中80％±7.85％に増加した。D48では、CD226+細胞の割合は、NK2A培地中17.3％±14.3％から二段階培地中52.3％±11.64％に増加し;NKp46⁺細胞の割合は、NK2A培地中67.9％±5.4％から二段階培地中86％±4％に増加した。試験した条件間で、NKG2D発現の有意差はなかった。CD226及びNKp46の発現の変化を下の表5に示す。

(7.4.実施例4:二段階培地で培養されたナチュラルキラー細胞と胚性幹細胞(ESC)に由来するナチュラルキラー細胞の比較)
二段階培地中で培養されたNK細胞を、Wollらの文献(Blood 113(4):6094-6101(2009))の方法によって産生される、胚性幹細胞(ESC)由来のNK細胞と比較した。具体的には、両方の該細胞型の培養のプロセスの間、CD94及びCD117の発現レベルの違いを観察した。図6は、CD117の発現が、7日(D7)から35日(D35)まで、二段階NK細胞で高いか、又は「+」であったのに対し、CD94の発現が徐々に増加したことを示している。35日目(D35)に、CD56⁺CD3^-(二工程)細胞の約44％はCD94⁺CD117⁺細胞であり、CD56⁺CD3^-細胞の37.6％はCD94^-CD117⁺であり、該CD56⁺CD3^-細胞の14.7％はCD94⁺CD117^-であった。したがって、二工程法によって産生されるNK細胞は、ESC由来のNK細胞と区別可能であり、該ESC由来のNK細胞の78％は、培養14日〜35日までCD117^low/-のままであった。下の実施例6に記載するように、CD117⁺ NK細胞は、様々な組織由来の腫瘍細胞株に対して細胞傷害性であるので、このCD117発現の違いは有用である。

これらの結果は、TSNK細胞の分化の経過がESC由来NK細胞とは異なること、及びTSNK細胞がESC由来NK細胞と区別可能であることを示唆している。

(7.5.実施例5:PDACは、NK2A培地中で培養ナチュラルキラー細胞の増殖倍率を高める)
造血幹細胞(HSC)のナチュラルキラー細胞への分化に対するCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞(この実施例ではPDACと呼ぶ)の効果を評価するために、HSCを、0日目及び21日目に、10:1のPDAC/MSC:HSCの比率で、マイトマイシンC処理したPDAC又は骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)で刺激し、一方、フィーダー不含培養物を対照として用いた。NK2A培地を培養培地として用いた。PDACは、培地のみと比較して、培養NK細胞の増殖倍率を高めることが分かった。しかしながら、フィーダー層ありで成長した細胞又はフィーダー層なしで成長した細胞の間で細胞傷害性の有意な差は見られなかった。図7に示すように、MSCで処理された細胞は、最も高い増殖倍率を示したが、最も低い細胞傷害性を示した。

(7.6.実施例6:二段階培地を用いて増殖されたNK細胞の細胞傷害活性)
この実施例は、上記の二段階プロセスを用いて増殖し、分化させたCD34⁺細胞から産生されるNK細胞が、腫瘍細胞株にとって細胞傷害性であることを示す。

乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ。LDH放出アッセイをCYTOTOX 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイキット(Promega, カタログ# G1780)を用いて行った。このアッセイでは、ドナーとマッチするヒト胎盤灌流液(HPP)と臍帯血のユニット(組合せユニット)に由来する培養NK細胞をエフェクター細胞として用い、一方、特定の腫瘍細胞株細胞を標的細胞として用いた。この試験で用いた3つのユニットから、HPP細胞のパーセンテージは56.6％±28.3％であった。エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、2％ヒトAB血清(Gemini, カタログ# 100-512)が補充された100μlのフェノールレッド不含RPMI 1640(Invitrogen, カタログ# 11835-030)中で、様々なエフェクター-標的(E:T)比でインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO₂で、4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの上清を酵素アッセイプレートに移し、LDH活性を、製造業者によって提供されているように検出し、吸収を、ELISAリーダー(Synergy HT, Biotek)中で、490nmで測定した。細胞傷害性を以下の方程式に従って算出した:％細胞傷害性＝(試料-エフェクター自然−標的自然)/(標的最大−標的自然)^*100、ここで、「エフェクター自然」は、エフェクター細胞からのLDHの自然な放出の対照であり;「標的自然」は、標的細胞からのLDHの自然な放出の対照であり;かつ「標的最大」は、本質的に100％の細胞が溶解されたときの最大LDH放出の対照である。

ヒト胎盤灌流液(HPP)CD34+細胞及び臍帯血(UCB)CD34+細胞の単離。HPP細胞及びUCB細胞を、Ficoll又は塩化アンモニウムのいずれかを用いて精製し、全有核細胞(TNC)を得た。その後、TNCを陽性選択手順で用いて、製造業者(StemCell Technologies社)によって提供されているプロトコルに従って抗CD34ビーズ及びRoboSepを用いて、CD34⁺細胞を単離した。この実験では、CD34⁺細胞を、90％を超える純度で単離した。

培養二段階NK細胞に対する腫瘍細胞感受性の研究。ヒト乳癌(HCC2218)、ヒト結腸直腸腺癌(HT-29)、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)、ヒト急性骨髄性白血病(AML)、ヒト膠芽腫(LN-18及びU-118MG)、ヒト多発性骨髄腫(U266)、ヒト組織球性リンパ腫(U937)、並びにヒト網膜芽腫(WERI-RB-1)を含む、腫瘍細胞株(表6)を二段階NK細胞と共培養した。二段階培養NK細胞には、NK2A培地中で21日間培養され、その後、CNK培地中で21日間培養されたNK細胞と、NK2A培地中で28日間培養され、その後、CNK培地中で14日間培養されたNK細胞とが含まれた。NK細胞の細胞傷害性を、4時間の共培養後に、乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイで測定した。10:1のエフェクター対標的(E:T)比で、後者は、通常、前者よりも高い細胞傷害性を示した(表6)。腫瘍細胞株のうち、LN-18が、NK媒介性の死滅に対して最も感受性が高く、K562、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1、及びU266がそれに続いた。

したがって、TSNK細胞は、様々な癌細胞株に対して顕著な細胞傷害性を示した。さらに、NK細胞傷害性は、NK2A培地中での培養期間を21日から28日に延長することによって改善することができるように思われる。

ヒト胎盤灌流液(HPP)CD34+細胞及び臍帯血(UCB)CD34+細胞のマイクロRNAプロファイリング。ドナーとマッチする純化されたHPP CD34+細胞及びUCB CD34+細胞を、MIRVANA(商標) miRNA単離キット(Ambion, カタログ# 1560)を用いるマイクロRNA(miRNA)調製に供した。CD34⁺細胞(0.5〜1.5×10⁶細胞)を変性溶解バッファー中で破壊した。その後、この試料を酸-フェノール＋クロロホルム抽出に供して、低分子RNA種が高度に濃縮されたRNAを単離した。100％エタノールを添加して、該試料を25％エタノールにした。このライセート/エタノール混合物をガラス繊維フィルターに通すと、高分子RNA種は固相化され、低分子RNA種は濾液中に回収された。その後、該濾液のエタノール濃度を55％に増大させ、該混合物を、第二のガラス繊維フィルターに通し、その中で、低分子RNAが固相化されるようになった。このRNAを数回洗浄し、低イオン強度溶液中で溶出させた。回収された低分子RNAの濃度及び純度を、260nm及び280nmでのその吸光度を測定することによって決定した。試験した全てのドナー(n＝3)のHPP CD34+細胞に特有であることが分かったmiRNAには、hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b、及びhsa-miR-520aが含まれた。

(7.7.実施例7:プールされたUCB及びHPPからのCD34⁺細胞の単離)
この実施例は、プールされた臍帯血(UCB)及びヒト胎盤灌流液(HPP)(組合せ)からのCD34⁺細胞の単離を示す。UCB:HPPプール比率を評価するために、3つの異なるプール比率の並列比較を以下のように行った:(1)最大プール:1×UCB(最大容積)+1×HPP(最大容積);(2)HPPの部分プール(33％):1×UCB(最大容積)+0.33×HPP(HPP容積の1/3);及び(3)HPPの部分プール(10％):1×UCB(最大容積)+0.10×HPP(HPP容積の1/10)。合計N＝3の実験反復を実施した。初期のTNC及び容積を記録した。その後、プール試料をCD34⁺細胞について純化し、CD34⁺純度を解凍後に決定した。その後、最適プール比率を、解凍後のCD34⁺純度対容積又は細胞カウント(TNC)比率(組合せの％として)プロットからグラフによって決定した。図8に示すように、終点CD34⁺純度は、HPP容積含有量とはよく相関するが、HPP TNC含有量とはそれほど相関しない。全体としては、UCB 85％v/v、HPP 15％v/vが、80％以上の純度のCD34⁺細胞を得るための最適プール比率であることが分かった。

(7.8.実施例8:GBGM(登録商標)ベースの培地を用いるNK細胞培養の比較)
この実施例は、2つのGBGMベースの培地を用いるNK細胞培養プロセス(三段階プロセス及び二段階プロセス)の比較を示す。この2つのプロセスを表7にまとめる。両プロセスとも、胎盤起源のNK細胞及びCD34⁺細胞の分化のための基本培地としてGBGMを利用した。

実験パラメータを以下のように概説する:

(ドナーロット):
(1)新鮮なUCB由来のCD34⁺細胞:N＝6
(2)新鮮な「組合せ」由来のCD34⁺細胞:N＝2
(3)凍結保存された「組合せ」由来のCD34+:N＝8

(規模):
マルチウェルディッシュからT-25、最大で複数のT-75フラスコまで、1〜80mLの培養容積

(プロセス法):
(1)二段階プロセス
(2)三段階プロセス

(フィーダーの使用):
(1)フィーダーなし
(2)不活化したK562及びPBMCフィーダーを21日目に培養物に添加

(播種密度):
20000〜50000細胞/mL

新鮮なUCB又は新鮮な組合せのいずれかに由来するCD34⁺細胞を生成させ、実施例7、10、及び11に記載の方法で凍結保存した。培養物を、37℃、＞90％湿度、及び5％CO₂のインキュベーター中で維持した。細胞成長を最初から最後までモニタリングし(細胞カウント)、培地交換を週に2回行って、細胞濃度を1mL当たり5×10⁴〜1×10⁶個の範囲内に維持した。分化を21日目及び35日目に表現型解析でモニタリングした。フィーダーを用いる場合、NK培養の21日目に、新鮮な3日培養K562及び解凍後アロPBMCをマイトマイシン-C(16μg/mL、2時間、37℃)で不活化し、1mL当たり1×10⁶個で二段階プロセス条件に添加した。分化途中のNKを1mL当たり0.5×10⁶個になるよう規格化した。35日目に、最後の細胞カウントを行った後、新たに培養し、PKH標識したK562細胞(10:1のE:T比、4時間、37℃)を用いるフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを行って、NKの機能性を評価した。

(結果)

2つのプロセスを用いて新鮮なUCBから得られるCD34⁺細胞のTNC増殖倍率の中央値は、35日で同程度であった。二段階プロセスは、新鮮な組合せから得られるCD34⁺細胞について、三段階プロセスよりも高いTNC増殖倍率を生じさせるように思われた。全体的なTNC増殖倍率は、両プロセスを用いて解凍後の組合せから得られるCD34⁺細胞について同程度であったが、新鮮なUCB又は新鮮な組合せから得られるCD34⁺細胞よりも有意に少なかった。まとめると、三段階プロセスと二段階プロセスは両方とも、培養の最後に同様の細胞収率をもたらした。

21日では、UCB又は組合せから生じた細胞に表現型の顕著な違いはなかった。二段階プロセスは、三段階プロセス(平均6.1％)よりも高いパーセンテージのCD56⁺CD3^- NK細胞(平均14.7％)を生じさせた。分化度(例えば、CD56⁺CD3^-レベル)は、ドナー依存的であるように見えた。CD3⁺CD56^-(T細胞)集団とCD3⁺CD56⁺(NKT様細胞)集団の両方のパーセンテージは、全ての場合においてごくわずかであった。

35日では、両プロセスは、高い終点CD56⁺CD3^-純度レベル(二段階プロセス及び三段階プロセスについて、それぞれ、87.2％及び90.1％)から明らかなように、NK細胞を分化させるのに効果的であることが分かった。二段階プロセスにおけるフィーダーの添加は、NK表現型の純度を高めるように見えたが(フィーダーなしで75.3％;フィーダーありで87.2％)、三段階プロセスの場合、NK純度に対するフィーダーの観察可能な利益は見られなかった(フィーダーなしで90.1％;フィーダーありで84.7％)。

培養NK細胞は、そのCD16^-表現型をずっと維持した。二段階プロセスは、フィーダーの非存在下で(平均11.2％)、他の条件(＜2％)よりもわずかに多いCD56⁺CD3⁺細胞を生じさせるように見えた。両プロセスにおけるPBMCフィーダー及びK562フィーダーの存在は、NK細胞集団上の特定のNK機能マーカー(NKp46、DNAM-1、CD94)を有意に上方調節/活性化した。全体としては、NK純度及び機能マーカー発現プロファイルは、フィーダー条件が同一であるとき、2つのプロセス間で同程度であることが分かった。

4時間のインビトロのK562細胞傷害性アッセイで決定した場合の、培養NK細胞の機能性は、フィーダー条件が同一であるとき、2つのプロセス間で同程度であることが分かった。フィーダーによって活性化されたNK細胞は、インビトロでK562細胞を死滅させるのに極めて効果的であり、平均比溶解は、二段階プロセス及び三段階プロセスについて、それぞれ、93.2％及び93.6％比溶解であった。

まとめると、二段階プロセス及び三段階プロセスは、同じフィーダー条件を用いたとき、NK細胞について、同程度の成長、表現型(純度及び活性化マーカー)、並びにインビトロ機能性を生じさせることが分かった。二段階プロセスは、三段階プロセスと比較して、NK細胞の培養の簡便性及び利便性を提供する。

(7.9.実施例9:様々な基本培地を用いるNK細胞培養の比較)
この研究は、異なる基本培地を用いてCD34⁺由来NK細胞の分化及び増殖を評価することを目的としている。

実験条件を表8にまとめる。細胞を実施例11に記載の通りに培養した。実験は全て、マルチウェルディッシュ/T-フラスコの規模で準備し、37℃、＞90％湿度、及び5％CO₂のインキュベーター中で維持した。細胞成長を最初から最後までモニタリングし(細胞カウント)、培地交換を週に2回行って、細胞濃度を1mL当たり5×10⁴〜1×10⁶個の範囲内に維持した。分化を21日及び35日での表現型解析によりモニタリングした。21日で、新鮮な3日間培養K562及び解凍後アロPBMCを不活化し、成長途中のNK細胞培養物に1mL当たり1×10⁶個で添加した。NK細胞を1mL当たり0.5×10⁶個になるよう規格化した。35日で、最後の細胞カウントを行った後、新たに培養し、PKH標識したK562細胞(10:1のE:T比率、4時間、37℃)を用いるフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを行って、NKの機能性を評価した。

(成長収率)

Stemspan H3000及びOpTmizerは、35日でGBGMと同程度の成長収率(TNC増殖倍率)を示した。Cellgro、X-VIVO 15、AIM-V、X-VIVO 10、DMEM:F12、5mMのOACを含むDMEM:F12は、GBGMよりも低い成長収率を示した。

(表現型解析)

35日(終点)で、GBGMは、約80％の純度のCD56⁺CD3^-細胞を生じさせた。OpTmizer及びStemspan H3000は、約50％の純度のCD56⁺CD3^-細胞を生じさせた。DMEM:F12は、約35％の純度のCD56⁺CD3^-細胞を生じさせた。AIM-V、X-VIVO 10、X-VIVO 15、及びCellgro培地は、約30％未満の純度のCD56⁺CD3^-細胞を生じさせた。培養時のDMEM:F12基本培地へのOACの添加は、終点NK純度を大いに高めることが分かり;培養35日でのCD56⁺CD3^-のパーセンテージは、35％から72％に増大した。

(細胞傷害性/機能性)

培養時のDMEM:F12基本培地への5mMのOACの添加は、NK細胞の活性化状態及びインビトロ機能性を大いに高めることが分かった。OACの添加はまた、NK活性化マーカーNKp46、NKG2D、DNAM-1、及びCD94のレベルを有意に増大させた。35日のNK細胞のインビトロ機能性(K562細胞傷害性)も同様に、21.4％から97.1％に大幅に増大した。

全体として、NK細胞特性は、5mMのOACの添加によって有意に強化された。

(7.10実施例10:NK細胞の保存及び凍結保存)
この実施例は、NK細胞を保存及び凍結保存する方法を示す。ヒト胎盤灌流液(HPP)及び臍帯血細胞から単離されたCD34⁺造血幹細胞を、先の実施例に記載されたプロトコルを用いて増殖し、NK細胞に分化させた。細胞を、HPP及び臍帯血から単離された直後(0日目)に、又はNK細胞の最初の成長期の間(単離9日、14日、21日、又は35日後)に凍結保存した。

該細胞を以下の凍結保存製剤:製剤1-デキストラン凍結培地:5％DMSO(Sigma Aldrich, D2650)、55％デキストラン(生理食塩水中、10％w/v)(0.9％塩化ナトリウム注射液中の10％LMD, Hospira)、40％HAS(Octapharma);製剤2-トレハロース凍結培地:5％DMSO、55％トレハロース(生理食塩水中、10％w/v)、40％HSA;製剤3-CryoStor(登録商標)CS2(BioLife Solutions);製剤4-CryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions);製剤5-CryoStor(登録商標)CS10(BioLife Solutions);製剤6-無血清凍結培地(Sigma-Aldrich, カタログ# 6295);製剤7-グリセロール凍結培地(Sigma-Aldrich, カタログ# C6039);又は製剤8-DMSO及び無血清凍結培地(Sigma-Aldrich, カタログ# 2639)中で凍結保存した。

異なる時点で回収された細胞を培養培地又は生理食塩水溶液で数回洗浄した。その後、該細胞を遠心分離して、細胞ペレットを得た。上清を除去し、細胞ペレットを、1ミリリットル当たり約1×10⁶〜1.5×10⁷個又はそれより多くの細胞になるように凍結保存培地で懸濁させた。該細胞懸濁液を1mL又は2mLのセプタムバイアルに分注し、2〜8℃で約10分間インキュベートした。その後、該細胞を、速度制御フリーザー(Thermo)中、0.5℃/分で凍結させた。凍結バイアルを液体窒素蒸気中での保存のために低温フリーザーに移した。凍結保存したNK細胞は、目に見える氷が全て融解するまで試料を穏やかに旋回させて、37℃の水浴中で急速解凍することができる。細胞試料は、予め温めた培養培地で希釈することができる。

(7.11.実施例11:NK細胞の保存及び凍結保存)
この実施例は、NK細胞を保存及び凍結保存する別の方法を示す。ヒト胎盤灌流液(HPP)及び臍帯血細胞から単離されたCD34⁺造血幹細胞を、上記のプロトコルを用いて増殖し、NK細胞に分化させた。細胞を、HPP及び臍帯血から単離した直後(0日目)に、又はNK細胞の最初の成長期の間(単離9日、14日、21日、又は35日後)に凍結保存した。

細胞懸濁溶液は、デキストラン-40とHSAを60％デキストラン-40 v/v、40％HSA(25％溶液から)v/v)の比率で組み合わせることによって調製した。

2×凍結溶液は、50％デキストラン-40 v/v、40％HSA(25％溶液)v/v、10％DMSO v/vを用いて調製した。まず、DMSOをデキストラン-40にゆっくりと添加し、よく混合した。その後、HSAの25％溶液を混合しながら該溶液にゆっくりと添加した。得られた溶液をよく混合し、室温にした後、使用した。

(凍結保存手順)

細胞数を推定し、細胞懸濁液として細胞懸濁溶液中15×10⁶個になるよう規格化した。細胞懸濁液の容積を決定し、等容積の新たに調製した2×凍結溶液をゆっくりと添加し、混合した。凍結溶液中の最終的な細胞懸濁液容積を記録し、いくつかのバイアルに分配した。マイコプラズマ汚染を検出するために、取っておいた培養上清に対してMycoAlert検査を行った。解凍後の生存率、細胞回復、及び細胞特徴を決定するために、留保しておいた1本のバイアルに対して解凍後試験を行った。

(7.12.実施例12:凍結保存/解凍したNK細胞の解析)
生存率アッセイ。実施例10又は11に見られるような様々な製剤中で凍結保存されたNK細胞を解凍した。細胞を2×10⁶〜3×10⁷細胞/mLの密度で凍結させた。解凍したNK細胞を、新鮮な細胞又は凍結前の細胞と比較して、解凍0日、3日、及び18日後に、Countess(登録商標)自動細胞カウンター(Invitrogen)を用いて、細胞生存率について評価した。簡潔に述べると、10μlの細胞試料を10μlのトリパンブルーと混合した。該細胞混合物をピペッティングして、Countess(登録商標)チャンバースライドに入れた。該スライドを装置に挿入し、細胞をカウントした。凍結-解凍後細胞は、凍結保存製剤の違いによって、約80％〜90％超の生存率の細胞生存率を示した。

アポトーシスアッセイ。解凍したNK細胞を、解凍0日、3日、及び18日後に、BD AnnV/PIアポトーシスアッセイキットを用いて、アポトーシスについても評価した。簡潔に述べると、細胞を1×冷PBSで2回洗浄し、1×結合バッファー(BDアネキシンV/PIアポトーシスキット品番556547、結合バッファー組成物品番51-66121E、0.1M Hepes/NaOH(pH7.4)、 1.4M NaCl、25mM CaCl₂。1×希釈液の場合、9部の蒸留水に対して1部の10×バッファー)に再懸濁させた。約100,000個の細胞を含む100μLの細胞懸濁液をFACSチューブに移した。100μLの1×結合バッファー、5μLのAnnV-FITC、及び5μLのPI-PEを該チューブに添加した。その後、該チューブを軽くボルテックス処理し、暗所で15分間インキュベートした。その後、400μLの1×結合バッファーを添加した。試料を1時間以内に解析した。象限及びゲートを設定するために使用さられた対照は、染色していない細胞、AnnV-FITCのみで染色し、PIで染色していない細胞、及びPIのみで染色し、AnnVで染色していない細胞であった。アポトーシス細胞を、サイズ散乱(FSC対SSC)プロット上で「細胞」としてゲートをかけた事象の集団の％として定量した。凍結-解凍後細胞は、凍結保存製剤の違いによって、約5〜25％の死細胞/後期アポトーシス細胞及び10〜25％の初期アポトーシス細胞を示した。全体として、製剤1(5％DMSO、55％デキストラン(生理食塩水中、10％w/v)、40％HAS)、製剤2(5％DMSO、55％トレハロース(生理食塩水中、10％w/v)、40％HSA)、製剤4-CryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions)、及び製剤5(CryoStor(登録商標)CS10(BioLife Solutions))は、他の製剤と比較して、より高い細胞生存率及びより少ないアポトーシス細胞を示した。

(7.13.実施例13:プロセス内凍結保存細胞バンキングの評価)
この実施例は、プロセス内凍結保存細胞バンキングの評価を示す。HS-AB又はFBSのいずれかを血清供給源として用い、Spanholtzらの文献、PLoS One. 5(2):e9221(2010)に記載されている方法を用い、UCB CD34⁺細胞を用いて、細胞培養を開始した。細胞濃度を決定し、調整し、必要に応じて培地を補充した。7日、9日、10日、又は14日で、約10⁶〜3×10⁶個の細胞を細胞培養物から除去し、遠心分離し、凍結保存培地(5.5％v/vデキストラン-40、10％v/v HSA、5％v/v DMSO)に再懸濁させた。該細胞を速度制御フリーザーで凍結させ、凍結保存用の液相窒素保存場所に移した。約1mLの細胞の各バイアルを、1mL当たり10⁶〜10⁷個の範囲の濃度で凍結保存した。残りの培養物は、終点(35日)まで持ち越され、「新鮮(プロセス内凍結保存なし)」と呼ばれた。表現型解析を細胞培養21日目、28日目、及び35日目に行った。インビトロ機能性(K562細胞傷害性、10:1のE:T)を培養35日(終点)で評価した。

プロセス内凍結保存した培養物試料(9日及び14日)の解凍後性能を以下のように評価した。細胞バンクバイアルを37℃の水浴中で急速解凍した。その後、該細胞をRPMI-FBS培地で希釈し、遠心分離し、再懸濁し、培養培地に播種した。その後、培養条件の各々を、培養過程の開始から累算して35日まで持ち越した。解析(細胞カウント、生存率、表現型解析、機能性評価)を、その「新鮮」対応物と同じやり方で行った。

(結果)

9日、10日、及び14日のプロセス内凍結保存試料は全て、プロセス内時点又は細胞濃度にかかわらず、優れた解凍後生存率をもたらした(96.2％〜97.3％トリパンブルー陰性、86.1％〜93.2％アネキシン-V陰性/TO-PRO-3陰性)。プロセス内バンキングは、培養終了時(35日)の収率損失に対して負の影響を及ぼさなかった。HS-AB又はHS-ABのいずれかを血清供給源とした、解凍9日後又は解凍14日後のいずれかの条件と「新鮮」条件の間の最終的な細胞収率は、同程度である。

21/28/35日の時点での成熟途中のNK細胞の表現型プロファイルは、それぞれ、「新鮮」培養物と「解凍後」培養物の間で全く同等であることが分かった。表現型純度(CD56⁺CD3^-)も同じく同等であることが分かった。特定のNK機能マーカー(CD94、NKG2D)の発現は、測定間のばらつきのために若干異なっていた。

K562細胞傷害性アッセイでは、解凍後9/14日の培養NK細胞は、プロセス内凍結保存していない培養NK細胞と比較して、約0〜20％より低い比K562溶解計測値を出すことが分かった。しかしながら、NK細胞傷害機能に関する表面マーカー(DNAM1、NKp46、NKG2Dなど)の発現レベルが同時には低下しなかったこと考慮すると、ドナー及びアッセイ反復を追加して、その傾向を確認する必要があるであろう。全体として、培養9/14日でのプロセス内凍結保存は、プロセスの結果にごくわずかな影響しか及ぼさなかった。

(7.14.実施例14:NK細胞投与のための解凍後媒体の開発)
この実施例は、動物におけるNK細胞投与のための解凍後媒体の開発を示す。NK細胞の生存率、細胞傷害性、細胞回復、及び凝集塊形成に対する注射媒体及び細胞密度の効果を試験した。生存率はトリパンブルー染色により評価し;細胞傷害性はFACS(10:1の比のNK:K562)により評価し、凝集塊形成(clump formulation)は顕微鏡アッセイにより評価した。結果を、様々なタイプの注射媒体及び細胞密度について表9〜12に示す。

これらの結果は、プラズマライト+1％HSA注射媒体が、PBS+1％FBS注射媒体よりも良好な生存率及び細胞傷害性を有するNK細胞を維持することを示した。また、細胞傷害性は、細胞を注射媒体に懸濁させた後、時間とともに減少した。細胞をプラズマライト+1％HSAに懸濁させた場合、生存率及び細胞傷害性に対する細胞密度効果は観察されなかった。また、NK細胞は、1時間後に、PBS+1％FBS媒体又はプラズマライト+1％HSA媒体中で沈殿したが;細胞は、凝集しないようであった。最後に、凍結-解凍プロセスから、細胞回復及び生存率の明らかな損失は観察されなかった。

(7.15.実施例15:NK細胞投与のための解凍後媒体の開発)
NK細胞の生存率、細胞傷害性、細胞回復、及び凝集塊形成に対する様々なHSA濃度の効果も試験した。実施例14から同じ方法を利用した。結果を、様々なタイプの注射媒体及び細胞密度について表13〜16に示す。

これらの結果は、生存率が、試験した3つ全ての注射媒体で、解凍後4時間にわたって十分に維持されたことを示す。また、細胞傷害性は、3つ全ての注射媒体で時間とともに減少した。しかしながら、低下のレベルは、より高濃度のHSAでより小さかったのに対し、プラズマライト＋5％HSAは最も高い細胞傷害性を維持した。NK細胞が3つ全ての注射媒体中で凝集しないことも観察された。全体として、プラズマライトは、PBSよりも良好な注射媒体候補であるように思われる。

(7.16.実施例16:IL-2なしでのNK細胞の培養)
この実施例は、IL-2の非存在下でのNK細胞の培養を示す。細胞培養を実施例11に記載の二段階プロセスで行った。第一の培地中の5つの異なる濃度:0、200、500、1000、2000U/mLのIL-2を試験した。

結果は、培養下の発生途中のNK細胞が、成長時にIL-2に応答しないようであったことを示す。NK細胞の純度は、IL-2に依存しないようであり:NK細胞は、IL-2の非存在下でCD56⁺CD3^-表現型に分化する。インビトロでのNK細胞発生には、IL-7とIL-15とSCFの組合せで十分であるように思われた。

(7.17.実施例17: CD34+胎盤造血細胞のナチュラルキラー(NK)細胞への培養及び特徴付け)
この実施例は、CD34+胎盤造血細胞のナチュラルキラー(NK)細胞の集団への増殖及び分化のための三工程培養プロセスを記載するものである。この培養プロセスの35日の三工程/三段階培養プロセスの後に得られる細胞集団(「D35 NK細胞」と称される)も、この実施例で記載され、特徴付けられる。

(材料及び方法)

(造血幹細胞(HSC)のNK細胞への増殖及び分化のための培養プロセス)
CD34+細胞をGBGM培地(Glycostem Therapeutics; Spanholtzらの文献、PLoS One(2010)5(2):9221参照)中で培養し、細胞のアリコートを、細胞数、細胞生存率の評価(assessment)、リンパ球分化の特徴付け、及び機能的評価(evaluation)のために採取した。インビトロ増殖及びNK系譜決定を開始させるために、CD34+細胞をGBGM培地中に播種した。細胞を、フィーダーを含まない培養物中で、以下のように三段階で培養した:

段階1(9日): 10％ヒト血清AB(HS)、LWHヘパリン、TPO、SCF、IL-7、Flt3L(25〜27ng/mL)を含むGBGM;

段階2(5日): 10％HS、LWHヘパリン、SCF、IL-7、Flt3L、IL-15(20〜27ng/mL)を含むGBGM;及び

段階3(21日): 10％HS、SCF、IL-7、Flt3L、IL-15(20〜27ng/mL)、IL-2(1000U/mL)を含むGBGM。

(乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ)
LDHは、細胞溶解時に放出される安定な細胞質酵素である。LDH放出についてのアッセイを、CYTOTOX 96(登録商標)比色細胞傷害性アッセイキット(Promega, カタログ# G1780)を用いて実施し、培養されたD35 NK細胞をエフェクター細胞として用い、腫瘍細胞を標的細胞として用いた。エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、2％ヒトAB血清が補充された100μlのフェノールレッド不含RPMI 1640(Invitrogen, カタログ# 11835-030)中で、様々なエフェクター-標的(E:T)比でインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO₂で、4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの上清を酵素アッセイプレートに移した。LDH活性を、製造業者によって提供されているように検出し、吸収を、ELISAリーダー(Synergy HT, Biotek)中、490nmで測定した。細胞傷害性を以下の方程式に従って算出した:％細胞傷害性＝(試料-エフェクター自然−標的自然)/(標的最大−標的自然)^*100。

(インビトロ細胞傷害性解析)
直接的細胞傷害性アッセイは、D35 NK細胞をエフェクター細胞として、腫瘍細胞を標的細胞として用いて実施した。腫瘍細胞を、その親油性脂肪族残基のために細胞形質膜に挿入されるPKH26(Sigma-Aldrich カタログ# PKH26-GL)(Ferlazzo Gらの文献、2004, PNAS USA 101(47):16606-11; Lee-MacAry AEらの文献、2001, J Immunol Methods 252(1-2):83-92)参照)で標識し、その後、96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、培養されたD35 NK細胞とともに、10％FBSが補充された200μlのRPMI 1640中で、様々なエフェクター-標的(E:T)比でインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO₂で、4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、膜不透過性DNA染色剤のTO-PRO-3(Invitrogenカタログ# T3605)を培養物に1μMの最終濃度まで添加し、次いで、BD FACSCanto Iを用いてFACS解析を行った。細胞傷害性を、全PKH26⁺標的腫瘍細胞における死細胞(PKH26⁺TO-PRO-3⁺)のパーセンテージとして表した。

(生体分布及び有効性研究のためのインビボマウスモデル)
6〜8週齢の雌のNSG(NOD-CgPrkdc-scid-Il2rg-tmlWjl-Sz)マウス(The Jackson Laboratory; Bar Harbor, Maine)をこの研究に使用した。インビボ有効性研究は、表17に示すように設定された。

マウスをマイクロアイソレーター飼育箱で飼育し、研究の開始前に数日間隔離した。マトリゲルに再懸濁させた指数成長期の合計5×10⁶個のK562細胞又は6×10⁶個のHCT-116細胞又は2×10⁶個のU087MG細胞をマウスの右脇腹領域に皮下移植した。マウスを、細胞移植後、毎日、腫瘍成長についてモニタリングした。腫瘍体積が約100mm³に達したら、平均値に最も近い腫瘍体積を有するマウスを用いて、マウスを無作為に群に割り付けた。D35 NK細胞による処置を無作為化の翌日に開始し、1回のみの単一用量のD35 NK細胞をマウスに投与した。投与経路は、表17に記載の通り、i.v.(マウス1匹当たり6×10⁶個のNK細胞)又はI.T.(マウス1匹当たり6×10⁶個のNK細胞)注射であった。腫瘍体積を、式V＝L×W×H×π/6(式中、L及びWは、腫瘍の長い方及び短い方の直径を表し、Hは、腫瘍の高さを表す)を用いて測定した。研究全体を通して、腫瘍体積及び体重を週に2回測定した。動物をD35 NK細胞の処置による考えられる毒性効果について観察した。腫瘍体積が＞1,500mm³に達したか、又はもとの体重の減少が20％を超えたか、又は腫瘍性潰瘍が発生したか、又はマウスが瀕死状態になった場合は、予定外の屠殺を行った。実験終了時に、対照群及び各々の処置群の腫瘍成長速度に関する統計解析を行った。

(統計解析)
異なる実験の結果は、平均±平均の標準偏差(STDEV)として記載されている。結果は、0.05以下のP値で有意とみなされた。

(結果)

(インビトロでの腫瘍細胞に対するD35 NK細胞の細胞傷害性)
腫瘍細胞株に対する35日培養された(D35)NK細胞集団の細胞傷害活性を評価した。図9に示すように、10:1のエフェクター対標的(E:T)比において、培養されたD35 NK細胞は、腫瘍細胞をPKH26-TOPROで標識するFACSベースのインビトロ細胞傷害性アッセイによって検出したとき、NTERA-2cl.D1(NT2/D1、精巣癌)、PC-3(前立腺腺癌)、U-87MG(膠芽腫)、K562(慢性骨髄性白血病(CML))、KG-1a(急性骨髄性白血病(AML))、及びBT474(乳癌)を含む様々な腫瘍細胞株に対する細胞溶解活性を示した。D35 NK細胞集団細胞傷害性は効果的であったが、試験した他の細胞株と比べて、Raji細胞(リンパ腫)に対する効果が最も低かった。図10に示すように、LDH放出アッセイを用いて、HCT-116細胞(結腸直腸癌)に対するD35 NK細胞の細胞傷害性も測定した。

(マウス異種移植腫瘍に対するD35 NK細胞の細胞傷害性)
免疫不全マウスにおける異種移植腫瘍に対するD35 NK細胞集団のインビボ有効性研究を実施した。図11〜14Bに示すように、D35 NK細胞集団の単一用量投与は、様々な腫瘍の異種移植NSGマウスモデルで腫瘍成長阻害を示した。図11は、13日でのCML(K562細胞)の成長阻害を示している。図12は、28日での結腸直腸癌(HCT-116細胞)の成長阻害を示している。図13は、24日での膠芽腫(U-87MG細胞)の成長阻害を示している。乳癌(BT474細胞)の異種移植モデルにおいて、D35 NK細胞集団をサイトカインIL-2又はIL-15の存在下及び非存在下で投与した。図14A及び14Bに示すように、D35 NK細胞集団の成長阻害効果は、IL-2又はIL-15の存在下と非存在下の両方で観察された。

(D35 NK細胞集団はBT474異種移植NSGモデルにおいて腫瘍浸潤能力を示す)
上記のD35 NK細胞集団処置BT474異種移植実験(図14B)の終点からのBT474異種移植片のエクスビボ免疫組織化学(IHC)解析により、D35 NK細胞集団が、NSGマウス中の樹立されたBT474腫瘍異種移植片にホーミングし、その中に浸潤することが明らかになっている。具体的には、腫瘍異種移植切片のイメージングにより、蛍光標識した抗CD56(図15B)及び抗NKp46(図15C)によって検出したとき、壊死性腫瘍細胞(ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色で可視化される;図15A)が、腫瘍が浸潤したD35 NK細胞集団と共局在することが明らかになった。これらの結果は、D35 NK細胞集団が、インビボで腫瘍に対する細胞溶解活性を有することを示している。

(7.18.実施例18:異種移植腫瘍に対するD35 NK細胞活性の特徴付け)
この実施例では、マウス異種移植モデルにおける単独の及びIL-2と組み合わせたD35 NK細胞集団のK562及びRPMI8226腫瘍に対する治療効力を評価した。

(材料及び方法)

(マウス)
Jackson Laboratories製の雌のNSG(NOD-CgPrkdc-scid-Il2rg-tmlWjl-Sz)。

(細胞)
CML細胞株K562由来の細胞をマトリゲルとともに5,000,000細胞/脇腹で皮下注射した。RPMI8226、BT474、HL-60という3種の多発性骨髄腫(MM)細胞株を使用した。培養されたD35 NK細胞集団を即時注入用の新鮮な細胞懸濁液として供給した。

(処置レジメン)
三段階法によって調製されたD35 NK細胞集団による処置を腫瘍樹立(腫瘍サイズ＝100mm³)後に開始した。実験群を腫瘍負荷分布に基づいて無作為に割り付けた。処置群を表18に示す。

(免疫組織化学)
以下の抗体を免疫組織化学に使用した: CD56の検出のために、Abcam製の抗NCAMクローン123C3マウスモノクローナルIgG1であるab9272、Invitrogen製の二次抗体AF594コンジュゲートヤギ抗マウスIgG₁; NKG2Dの検出のために、Abcam製のクローンID11マウスモノクローナルIgGであるab35033、Invitrogen製の二次抗体AF488コンジュゲートヤギ抗マウスIgG₁;及びNKp46の検出のために、R&D Systems製のヤギポリクローナルIgGであるAF1850、Invitrogen製の二次抗体AF488コンジュゲートロバ抗ヤギIgG。異種移植片の切除時に、各々の腫瘍の半分を液体窒素中で凍結させ、-80℃で保存した。もう半分をOptimum Cutting Temperature(OCT)媒体中にすぐに包埋し、液体窒素中で凍結させた。5枚の5μm切片をクライオスタット(Leica, Deerfield, IL)で切削した。これらの切片をPBS中で洗浄し、PBS中に2×カゼイン溶液、5％ウマ血清、及び0.3％Triton-X100を含むタンパク質ブロッキング溶液に、室温(RT)で60分間曝露させた。その後、ブロッキング溶液に希釈した(1:50)一次抗体を細胞に適用し、4℃で一晩インキュベートした。翌朝、試料をPBS中で洗浄し、ブロッキング溶液に希釈した(1:500)二次抗体を細胞にRTで30分間適用した。その後、スライドをPBS中で洗浄し、600nMのDAPI溶液をRTで10分間適用して、核を可視化した。全てのスライドを蛍光用の水性媒体(VECTASHIELD, Vector Laboratories)で封入した。免疫組織化学画像を、画像取得及び保管用のNIS Elementsソフトウェアが装備されたPCに接続された高解像度デジタルカメラ(Nikon DXM1200F)が装備されたNIKON Eclipse顕微鏡モデルE800で取得した。これらの実験用の対照は、サイトスピンスライド上に調製された新たに調製されたD35 NK細胞及びK562細胞であった。

(結果)

D35 NK細胞集団処置スケジュールの終了後、異種移植片をマウスから切り出した。各々の腫瘍の半分を液体窒素中ですぐに凍結させ、-80℃で保存した。もう半分をOptimum Cutting Temperature(OCT)媒体中にすぐに包埋し、液体窒素中で凍結させた。5μm切片をクライオスタット(Leica, Deerfield, IL)で切削した。これらの切片を、ルーチンの組織学的研究及び免疫蛍光研究のために、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色に使用した。

抗体が特異的であることを確認するために、免疫蛍光実験を実施した。図16Aに示すように、K562細胞は、CD56マーカーも、NKG2Dマーカーも、Nkp46マーカーを発現していない。図16Bに示すように、新たに調製されたD35 NK細胞集団は、これら3つのマーカーについて陽性染色された。抗体の非特異的結合によるバックグラウンドは、これらの抗体の各々についてのアイソタイプ対照で観察されなかった。

図17Bに示すように、10⁶個の細胞のD35 NK細胞集団の注入後、細胞は、高い有効性でK562腫瘍に局在化し、相当なインビボ生存率を有していた。これは、CD56抗原(左)の陽性シグナルとNKG2D(中央)との共局在によって示された。D35 NK細胞集団の細胞の存在下並びにIL-2の存在下及び非存在下でのK562腫瘍細胞死滅化は、図17B(IL-2なし)及び図17D(IL-2あり)に示されるような腫瘍細胞集団内での顆粒(アポトーシス核)の数の増加によって示された。対照的に、成長する腫瘍の形態を示している図17Aに示されているように、ビヒクル対照(D35 NK細胞集団又はIL-2がない場合のK562腫瘍細胞)では、顆粒性(granularity)が観察されなかった。任意の理論又は機序によって束縛されることを望むものではないが、組織病理学的観察により、D35 NK細胞集団の投与後の腫瘍体積の退行は、アポトーシスによるものである可能性が高いことが示されている。

D35 NK集団で処置されたBT474マウス異種移植腫瘍モデルの免疫組織化学により、腫瘍細胞傷害性を引き起こすIL-2単体(図17E)の能力がD35 NK細胞集団の投与によって増大したことが示されている(図17F)。

それゆえ、これらの結果から、D35 NK細胞が様々なヒト腫瘍型に対する細胞溶解活性を示すことが示されている。

(7.19.実施例19:マウスにおける3段階法を用いて培養されたD35細胞の特徴付け)
この実施例は、D35 NK細胞集団の生体分布及び表現型特徴付け研究を記載するものである。

(材料及び方法)

(造血幹細胞(HSC)のNK細胞への増殖及び分化)
インビトロ増殖及びNK系譜決定を開始させるために、CD34+細胞をGBGM培地中に播種した。細胞を、フィーダーを含まない培養物中で、低用量(50〜250pg/mL)のサイトカイン(IL-6、LIF、G-CSF、GM-CSF、MIP-1a)の存在下で、上記のように三段階で培養した。

(生体分布及び有効性研究のためのインビボマウスモデル)
6〜8週齢の雌のNSG(NOD-CgPrkdc-scid-Il2rg-tmlWjl-Sz)マウス(The Jackson Laboratory; Bar Harbor, Maine)を研究に使用した。マウスをマイクロアイソレーター飼育箱で飼育し、研究の開始前に数日間隔離した。マトリゲルに再懸濁させた指数成長期の合計5×10⁶個のK562細胞をマウスの右脇腹領域に皮下移植した。マウスを、細胞移植後、毎日、腫瘍成長についてモニタリングした。腫瘍体積が約100mm³に達したら、平均値に最も近い腫瘍体積を有するマウスを用いて、マウスを無作為に群に分けた。D35 NK細胞集団による処置を無作為化の翌日に開始し、1回のみの単一用量のD35 NK細胞集団の細胞をマウスに投与した。投与経路は、表17に記載の通り、i.v.(マウス1匹当たり6×10⁶個のNK細胞)又は腫瘍内(I.T.)(マウス1匹当たり6×10⁶個のNK細胞)注射であった。腫瘍体積を、式V＝L×W×H×π/6(式中、L及びWは、腫瘍の長い方及び短い方の直径を表し、Hは、腫瘍の高さを表す)を用いて測定した。研究全体を通して、腫瘍体積及び体重を週に2回測定した。動物をD35 NK細胞集団の処置による考えられる毒性効果について観察した。腫瘍体積が＞1,500mm³に達したか、又はもとの体重の減少が20％を超えたか、又は腫瘍性潰瘍が発生したか、又はマウスが瀕死状態になった場合は、予定外の屠殺を行った。実験終了時に、対照群及び各々の処置群の腫瘍成長速度に関する統計解析を行った。

(メチルセルロースコロニー形成アッセイ)
コロニー形成細胞(CFC)アッセイとも呼ばれるメチルセルロースコロニー形成アッセイを、製造業者のプロトコル(StemCell Technologies社)に従って実施した。簡潔に述べると、CD34+細胞懸濁液又は試験細胞を、表示されたサイトカインがプレート1枚当たり様々な細胞密度で補充されたメチルセルロース培地中に入れた。各々の細胞密度について、3連のアッセイを実施し、その後、2〜3週間インキュベートした。蛍光顕微鏡観察を用いて、コロニーの評価及び計数を実施した。

(結果)

(マウスにおける生体分布及び持続性)
ヒト造血微小環境のモデルを作成するためにヒトIL-3、SCF、及びGM-CSFが遺伝子組換え発現されているNSG免疫不全マウスへの養子移植後に、D35 NK細胞集団の細胞のインビボ生体分布及び持続性を解析した。動物を致死量未満の放射線照射(260Rad)によって前処理し、D35 NK細胞集団を尾静脈注入(6×10⁶細胞/動物)によって投与した。移植されたヒト細胞の持続性、組織分布、及び細胞表面表現型を4週間にわたるフローサイトメトリーによって解析した。動物を、研究期間中、毎日のヒト組換えIL-2又はIL-15サイトカインの注射によって処置し、臨床的に関連する補助サイトカイン療法に対するD35 NK細胞集団のインビボ応答を決定した。

移植されたヒト細胞を、末梢血、脾臓、肝臓、及び骨髄への養子移植後の4つの週1回の時点(7、14、21、及び28日)で解析した。D35 NK細胞集団の細胞を、末梢血及び骨髄中及び肝臓及び脾臓細胞懸濁液中での細胞表面ヒトCD45発現のフローサイトメトリー解析によって検出した。図18B及び図18Dに示すように、IL-15補助療法を受けている動物において、D35 NK細胞集団の細胞は、全4週間の時間経過にわたって、レシピエントマウスのCD45+細胞の1〜5％の相対頻度で、末梢血中に持続した。ヒトCD45+細胞は、IL-15処置動物への移植後21日の肝臓において、レシピエントマウスのCD45+細胞集団と比べて最大20％の頻度に達し(図18D)、D35 NK細胞の肝臓特異的ホーミングを示している。同じ動物において、D35 NK細胞集団の細胞は、全4週間の時間経過にわたって、脾臓及び骨髄中でも容易に検出可能であった。IL-2補助療法を受けている動物において(図18A及び図18C)、ヒト細胞は、IL-15が共投与されたマウスと比較して有意に低いレベルで検出され(図18B及び図18D)、IL-15がD35 NK細胞集団の細胞のインビボ生存及び/又は持続性を増強することを示している。

これらの結果から、D35 NK細胞集団の細胞がマウスで少なくとも4週間持続することが示されている。

(マウスにおける三段階D35 NK細胞の表現型及び機能の成熟)
上記の生体分布研究からのD35 NK細胞集団のエクスビボで検出された細胞を、NK細胞成熟の機能的に関連するマーカーであるCD16の発現について解析した。図19に示すように、インビトロのD35 NK細胞集団の細胞は、低レベル(5％未満)のCD56+CD16+、CD56+KIR2DL2/DL3/DS2+、及びCD56+KIR3DL1/DS1細胞を有し、増殖された胎盤CD34+幹細胞から生成される未成熟NK表現型と一致している。図20に示すように、IL-15処置されたNSGSマウスにおいて、D35 NK細胞集団の細胞は、最大50％のCD56+CD16+、及び90％超のCD56+KIR+に達する、インビトロでのCD16発現の漸進的増加を示す。さらに、上記の研究に示されているように、D35 NK細胞集団の細胞は、養子移植4週後の末梢血中で検出された。これらの結果を合わせると、インビボでのD35 NK細胞集団の細胞の機能的成熟の証拠が提供される。

これらの結果から、D35 NK細胞集団の未成熟(CD16-)細胞のかなりの割合がインビボでCD16+になり、表現型及び機能の成熟を示すことが示されている。

(D35 NK細胞集団の抗腫瘍活性)
この実験では、遺伝的に誘導される白血病モデル(Mulloyらの文献、Cell Cycle. 2008 Nov 1;7(21):3314-9. Epub 2008 Nov 8に概説されている)を用いて、同種異系白血病浸潤細胞及び正常非形質転換臍帯血(「UCB」)CD34+細胞対照に対するD35 NK細胞集団の特異的細胞傷害活性を試験した。2つの異なる方法を用いて、細胞傷害活性を測定した。

簡潔に述べると、第一の方法において、正常及び白血病前駆細胞を液体アッセイで共培養し、D35 NK細胞誘導性細胞傷害性を、4時間のインキュベーション後の共培養物中の残存標的細胞の数を計数することによって測定した。第二の方法において、正常CD34+細胞及び白血病前駆細胞をD35 NK細胞集団と4時間共培養し、その後、メチルセルロース培地中の二次コロニー形成アッセイ中にプレーティングした。メチルセルロースコロニー形成アッセイを、正常及び白血病幹細胞/前駆細胞に対するD35 NK細胞集団の特異的細胞傷害活性の読出しとして使用した。図21及び22に示した結果から、D35 NK細胞集団との共培養による白血病前駆体活性の完全阻害、及び正常同種異系CD34+前駆体に対する効果のなさが示されている。

これらの結果から、D35 NK細胞集団は、MLL-AF9融合タンパク質を発現する改変されたUCB CD34+細胞(これらの改変されたCD34+細胞は、免疫不全マウスへの移植後、白血病へと発展し得る)に対する細胞傷害性を示すが、白血病前駆体のクローン形成能の消失から明らかなように、正常なUCB CD34+細胞に対する細胞傷害性を示さないことが示されている。

(D35 NK細胞集団は異種移植疾患を抑制する)
遺伝的に誘導される白血病モデルを実験で利用して、D35 NK細胞集団のインビボ細胞傷害性を評価した。図23Aに図式化されているように、MLL-AF9融合遺伝子を遺伝子導入したUCB CD34+細胞の移植後、マウスを、8日目、9日目、及び10日目に、化学療法(DA:シタラビン(50mg/kg)/ドキソルビシン(1.5mg/kg))で処置した。D35 NK細胞集団の細胞(6×10⁶細胞/マウス)及びIL-15を11日目に投与した。GFP発現MLL細胞のFACS解析を行い、マウスがそれよりも早く死なない限り、移植後58日目と規定される実験の終点で残存する白血病細胞の頻度を測定した。代表的なグラフを、対照群、すなわち、PBS(図23B)もしくはIL-15(図23C)を投与したマウス、又はIL-15と化学療法単独(図23D)もしくはD35 NK細胞集団＋IL-15及び化学療法の組合せ(図23E)のいずれかを投与した群について示す。図23Fに示すように、58日目に、対照群のマウスの65％は、AML細胞陽性であり;化学療法で処置した群では、マウスの40％がAML細胞陽性であり;化学療法とD35 NK細胞集団の両方で処置した群では、どのマウスもAML細胞陽性でなかった。

これらの結果から、D35 NK細胞集団は、ヒト異種移植白血病モデルにおいて、化学療法後の白血病のインビボ再発を抑制することが示されている。

(7.20.実施例20:ナチュラルキラー前駆細胞集団の作製及び特徴付け)
この実施例は、CD34+胎盤造血細胞のナチュラルキラー(NK)前駆細胞集団への増殖及び分化のための三工程培養プロセスを記載するものである。この培養プロセスの21日後に得られるNK前駆細胞集団もまた、この実施例で記載され、特徴付けられている。

(材料及び方法)

(造血幹細胞(HSC)のNK前駆細胞集団への増殖及び分化のための培養プロセス)
CD34+細胞をGBGM培地(Glycostem Therapeutics; Spanholtzらの文献、PLoS One(2010)5(2):9221参照; GBGMは、IMDMに基づく動物由来成分不含培地であり、ヒト由来又はヒト組換えタンパク質を含有する)中で培養し、細胞のアリコートを、細胞数、細胞生存率の評価(assessment)、リンパ球分化の特徴付け、及び機能的評価(evaluation)のために採取した。インビトロ増殖及びNK系譜決定を開始させるために、CD34+細胞をGBGM培地中に播種した。細胞を、フィーダーを含まない培養物中で、低用量(50〜250pg/mL)のサイトカイン(IL-6、LIF、G-CSF、GM-CSF、MIP-1a)の存在下で、以下のように三段階で培養した:

段階3(7日): 10％HS、SCF、IL-7、Flt3L、IL-15(20〜27ng/mL)、IL-2(1000U/mL)を含むGBGM。

(生着研究のためのインビボマウスモデル)
6〜8週齢の雌のNSG(NOD-CgPrkdc-scid-Il2rg-tmlWjl-Sz)マウス(The Jackson Laboratory; Bar Harbor, Maine)を研究に使用した。マウスをマイクロアイソレーター飼育箱で飼育し、研究の開始前に数日間隔離した。D21 NK前駆細胞集団の細胞による処置を無作為化の翌日に開始し、1回のみの単一用量のD21 NK前駆細胞集団をマウスに投与した。投与経路は、表17に記載の通り、i.v.(マウス1匹当たり6×10⁶個のD21 NK前駆細胞集団の細胞)又はI.T.(マウス1匹当たり6×10⁶個のD21 NK前駆細胞)注射であった。腫瘍体積を、式V＝L×W×H×π/6(式中、L及びWは、腫瘍の長い方及び短い方の直径を表し、Hは、腫瘍の高さを表す)を用いて測定した。研究全体を通して、腫瘍体積及び体重を週に2回測定した。動物をD21 NK前駆細胞集団の処置による考えられる毒性効果について観察した。腫瘍体積が＞1,500mm³に達したか、又はもとの体重の減少が20％を超えたか、又は腫瘍性潰瘍が発生したか、又はマウスが瀕死状態になった場合は、予定外の屠殺を行った。実験終了時に、対照群及び各々の処置群の腫瘍成長速度に関する統計解析を行った。

(クロム(⁵¹Cr)放出細胞傷害性)
エフェクター細胞(D21 NK前駆細胞集団の細胞)を、丸底96ウェルプレート上で、100μlアリコート/ウェルのアッセイ培地(RPMI1640＋10％FBS＋P/S)中に、適当な濃度で播種した。標的腫瘍細胞を、10μCiのクロム酸ナトリウムとともに、37℃で60分間インキュベートし、その後、アッセイ培地で3回洗浄した。その後、⁵¹Cr標識された腫瘍細胞を表示されたエフェクター対標的(E:T)比でエフェクター細胞に添加した。インキュベーションを、5％CO₂インキュベーター中、37℃で4時間実施した。全ての培養を3連で実施し、％細胞傷害性を、式:100×(試験⁵¹Cr放出−自然⁵¹Cr放出)/(最大⁵¹Cr放出−自然⁵¹Cr放出)に従って算出し、ここで、最大及び自然カウントは、それぞれ、2％Triton Xとともに、アッセイ培地中でインキュベートされた3連の標的細胞から算出された。

(結果)

図24Aに示すように、D21 NK前駆細胞集団のインビボ生体分布解析から、養子移植4週間後、レシピエントマウスのCD45+細胞と比べて、＞10％の頻度に達する、骨髄中での高レベルのヒト細胞持続性が示された。骨髄生着細胞は、CD56-CD16-であり(図24B)、わずかなCD117を発現し、マーカー2B4(CD244)について＞50％であり(図24C)、NK前駆細胞表現型を示した。この表現型集団は、D35 NK細胞の養子移植後にも検出されたが、〜10倍低い頻度であった。骨髄生着D21 NK前駆細胞集団を、デノボDNA合成によって細胞のインビボでのS期細胞周期進入を標識するBrdUの一晩の取込みにより、インビボでの細胞周期進入について試験した。図25に示すように、骨髄由来のD21 NK前駆細胞集団の細胞は、高い割合(＞35％のBrdU+細胞)のインビボ周期変動を経ており、その観察されたインビボ増殖と一致する、この集団の活発な代謝回転が示された。

投与28日後に骨髄試料から回収された骨髄生着CD56-CD16- D21 NK前駆細胞集団細胞をFACS選別によって精製し、そのNK分化能を決定するために、NK細胞培養培地(10％FBS、2％HS、IL-2(200U/mL)を含むIMDM)中で、エクスビボで培養した。図26に示すように、NK培養培地中で成長したD21 NK前駆細胞集団の細胞は、表現型の上では成熟しているCD56+CD16+ NK細胞に分化することができる。D21 NK前駆細胞集団の骨髄生着細胞に由来するこれらのエクスビボで分化したCD56+ NK細胞を、K562標的細胞に対するクロム(⁵¹CR)放出細胞傷害性アッセイでも試験した。D21 NK前駆細胞集団の細胞に由来する分化したCD56+ NK細胞の細胞傷害活性を、NK-92細胞株及びインビトロ間質共培養によって生成させたヒトCD34+細胞由来NK細胞と比較した。図27に示すように、D21 NK前駆細胞集団の細胞に由来する分化したCD56+ NK細胞は、同等のエフェクター対標的細胞比の両陽性対照NK細胞型と比較して、同様の又はより大きい細胞傷害活性を示した。

総合すると、D21 NK前駆細胞集団の骨髄生着集団のこれらのエクスビボ解析は、そのNK細胞機能分化能と一貫性があり、これらの細胞が移植時にインビボでの自己再生を維持する能力を示している。

結論として、この実施例から、NK前駆細胞集団が骨髄に遊走し、生着する能力を示すことが示される。これらの骨髄生着細胞は、2B4(CD244)陽性であり、それらがNK前駆細胞であることを示唆している。

(7.21.実施例21: NK前駆細胞集団とNK細胞集団の比較)
この実施例は、上記の3工程プロセスを用いて培養されたD21 NK前駆細胞集団の細胞とD35 NK細胞集団の細胞の表現型を比較したものである。5回の反復に基づく、FACSを用いたインビトロプロファイリング実験において、D35 NK細胞集団の細胞の88.5％±11.2％と比較して、D21 NK前駆細胞集団の細胞の29.9％±13.4％がCD56+CD3-であった。さらに、D35 NK細胞集団の細胞の49.0％±20.4％と比較して、D21 NK前駆細胞集団の細胞の12.3％±5.6％がNKp46+であった。

(7.22.実施例22: D21 NK前駆細胞集団とD35 NK細胞集団の比較)
この実施例では、実施例17〜21に記載されている実験の結果及び結論をまとめている。これらの結果は、ヒトNK細胞集団を、ドナーが一致した臍帯血から単離されたCD34+細胞及び満期ヒト胎盤から得られたヒト胎盤由来幹細胞から生成させる培養方法を樹立するのに成功したことを示している。この培養方法は、フィーダーを含まず、前駆細胞増殖と、それに続く、トロンボポエチン、幹細胞因子、Flt3リガンド、IL-7、IL-15、及びIL-2を含むサイトカインによって支持されるNK細胞集団への分化に基づく。CD34+造血前駆細胞(又は造血幹細胞、HSC)を含む集団からNK細胞を含む集団への段階的進行は、最終的には、約90％のCD3-CD56+表現型を有するNK細胞集団をもたらし、35日間かけて達成される平均10,000倍の増殖を伴う。得られる細胞集団はCD16-であり、かつ低レベルのKIRを発現し、該集団が、主に未成熟なNK細胞表現型を含むことを示している。しかしながら、注目すべきことに、該細胞集団は、広範な腫瘍細胞株標的に対する活発なインビトロ細胞傷害性も示す。

HSC由来NK細胞集団のインビボでの持続、成熟、及び機能的活性を、ヒトサイトカインSCF、GM-CSF、及びIL-3を発現するように操作された免疫不全(NSG)マウス(NSGSマウス)で評価した。ヒトIL-2又はIL-15を週3回腹腔内注射して、インビボ移植されたNK細胞集団に対するサイトカイン補給の効果を試験した。該NK細胞集団の存在及び詳細な免疫表現型を、移植後28日まで7日間の間隔で、末梢血(PB)、骨髄(BM)、脾臓、及び肝臓試料で評価した。サイトカイン補給なしの場合、このNK細胞集団由来の細胞は、どの時点でもほとんど検出されなかった。IL-2の投与により、このヒトNK細胞集団由来の細胞の検出可能であるが、わずかな持続の強化がもたらされた。IL-15補給の効果は顕著により大きく、移植されたNK集団細胞の循環中での強い持続、及びおそらくは、レシピエントマウスの肝臓への特異的ホーミング及びその中での増殖をもたらした。

インビボ移植後、かなりの割合のヒトCD56+細胞がCD16及びKIRを発現し、完全な生理的NK分化を示した。エクスビボで単離されたヒトCD56+細胞は、インビトロ細胞傷害性アッセイでK562標的を効率的に死滅させた。末梢血、脾臓、及び肝臓とは対照的に、BMは、CD56/CD16二重陰性(DN)であるが、CD244及びCD117陽性であるヒト細胞の相当な部分を含み、CD34+由来細胞産物のCD56-画分中の残存前駆体機能を示している。BM生着集団は、増殖の初期段階のNK細胞集団培養物中でより多かったが、35日の培養産物中で維持されていた。BM中のこれらの細胞の頻度は時間とともに増加し、移植28日後のインビボBrdU標識に基づく周期変動の継続を示し、インビボでの顕著な前駆体能を示唆した。興味深いことに、BMから単離されたDN細胞は、K562に対するインビトロ細胞傷害活性を有する成熟CD56+CD16+NK細胞にエクスビボで効率的に分化することができた。インビボにおいて、これらのBM生着細胞は、ヒトにおける成熟NK細胞プールを産生する前駆集団を提供し得る。

HSC由来NK細胞集団のインビボ活性を、微小残存病変(MRD)の遺伝的に改変されたヒトAML異種移植モデルを用いてさらに検討した。これらの実験の結果は、化学療法後にNK細胞集団を受けた動物におけるAML再発の有意な抑制を示している。

(7.23.実施例23: D21及びD35 NK細胞のテロメア長)
この実施例では、上記の三段階プロセスを用いて培養されたD21及びD35細胞をDNAテロメア長について評価した。

有糸分裂の前に、細胞DNAは、DNAポリメラーゼによって二倍化される。この酵素は、染色体の最末端-テロメア領域を複製しない。このため、テロメアは、細胞分裂のたびに短くなり、したがって、テロメアは、「細胞分裂時計」として働く。テロメアは、染色体末端を無傷に保つように機能する。正常細胞では、テロメア短縮は、細胞老化をもたらす。脊椎動物のテロメアは、数百から数千の反復する6ヌクレオチド(TTAGGG)から構成される。テロメア長は、種特異的であり、ヒトでの5〜20キロ塩基(kb)からマウスでの20〜150kbの範囲に及ぶ。

(7.23.1.材料及び方法)
(テロメアPNA-FITC法)
細胞のテロメア配列の検出を、フローサイトメトリー用のテロメアPNAキット/FITC(カタログ# K5327, DAKO, an Agilent Technologies社)を用いて評価した。このキットのプローブはテロメア周辺配列を認識せず、従来のテロメア制限断片(TRF)測定とは対照的に、この方法は、テロメア周辺を含まないテロメア長の推定を可能にする。

(対照細胞)
以下の対照細胞を使用した: HL60細胞株、NK92細胞株、PBMC由来NK細胞、CCRF-CEM、NTERA2、及びNHDF成人線維芽細胞株。

(解析方法)
試料を、対数目盛りのFL1-Hをプローブ蛍光に、均等目盛りのFL3-HをDNA染色に用いるフローサイトメトリーにより解析した。前方散乱、側方散乱、FL1-H、及びFL3-Hの値を記録した。(バリエーションとして、FL3-A及びFL#Wの値を記録することもできる。)

(計算)
RTL＝(プローブありの平均FL1試料細胞−プローブなしの平均FL1試料細胞)×対照細胞のDNA指数×100/(プローブありの平均FL1対照細胞−プローブなしの平均FL1対照細胞)×試料細胞のDNA指数。

(7.23.2.結果及び考察)
テロメアPNA-FITC法を用いて、CCRF-CEM(Tリンパ芽球様細胞株)、HL60(前骨髄芽球細胞株)、NTERA2(精巣胎児性癌細胞株)、NHDF(正常ヒト皮膚線維芽細胞)、NK92細胞株、及び末梢血(PB)NK細胞と比較した、本明細書に記載の三段階プロセスを用いて培養された21日及び35日のNK細胞のテロメア長を測定した。CCRF-CEMについての予想テロメア長は、約15〜20kbであり、HL60については、約15kbである。アッセイ間でばらつきがあるため、試験結果を、HL60と比較した相対テロメア長(RTL)として表した(％RTL＝テロメア長_TEST/テロメア長_HL60×100)。図28に示すように、NK92細胞は、21日のNK細胞(NK-D21)及び35日のNK細胞(NK-D35)よりも長いテロメア長を有している。2人のドナー由来の市販のPB NK細胞は、2人の異なるドナー由来のNK-D21及びNK-D35と比較してより短いテロメア長を有することが示された。これらの結果は、NK-D21及びNK-D35細胞が、PB NK細胞よりも未成熟かつ分化の程度が小さく、それゆえ、PB NK細胞よりも大きいさらなる増殖及び分化の可能性を有し得ることを示している。

等価物:
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載された変さらに加えて、本発明の様々な変更が、上の説明及び添付の図面から当業者に明白となるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

本明細書で引用された全ての参考文献は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が、あらゆる目的のために、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、あらゆる目的のために、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示を目的としたものであり、本発明が先行発明を理由としてそのような刊行物に先行する資格がないという承認と解釈されるべきではない。

Claims

単離されたナチュラルキラー(NK)前駆細胞集団であって、(i)造血幹細胞又は前駆細胞を、Flt3L、TPO、SCF、IL-7、G-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む第一の培地中で培養し、(ii)その後、該細胞を、Flt3L、SCF、IL-15、及びIL-7、IL-17及びIL-15、G-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む第二の培地中で培養し、(iii)その後、該細胞を、SCF、IL-15、IL-7、IL-2、G-CSF、IL-6、及びGM-CSFを含む第三の培地中で培養することを含む方法によって産生される、前記単離されたNK前駆細胞集団。
前記培養工程(i)の持続期間が7〜9日であり、前記培養工程(ii)の持続期間が5〜7日であり、前記培養工程(iii)の持続期間が5〜9日である、請求項1記載の単離されたNK前駆細胞集団。
前記培養工程(i)の持続期間が7〜9日であり、前記培養工程(ii)の持続期間が5〜7日であり、前記培養工程(iii)の持続期間が21〜35日である、請求項1記載の単離されたNK前駆細胞集団。
前記方法で使用される前記造血幹細胞又は前駆細胞がCD34⁺である、請求項1、2、又は3記載の単離されたNK前駆細胞集団。
前記造血幹細胞又は前駆細胞が、ヒト胎盤灌流液由来の造血幹細胞又は前駆細胞、及び臍帯由来の造血幹細胞又は前駆細胞を含み、ここで、該胎盤灌流液及び該臍帯血が、同じ胎盤に由来するものである、請求項1、2、又は3記載の単離されたNK前駆細胞集団。
CD34^-細胞が、前記工程(i)の終了時に、全集団の80％超を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団。
40％以下のCD3^-CD56⁺細胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団。
CD52⁺CD117⁺である細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団。
40％以下のCD3^-CD56⁺細胞を含む、単離されたナチュラルキラー(NK)前駆細胞集団。
CD52⁺CD117⁺である細胞を含む、単離されたナチュラルキラー(NK)前駆細胞集団。
請求項1〜10のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団を含む医薬組成物。
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞を、請求項1〜10のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団又は請求項11記載の組成物と近接させることを含む、前記方法。
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、膠芽腫細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、前立腺癌細胞、又は網膜芽腫細胞である、請求項12記載の方法。
それを必要とする対象における血液癌を治療する方法であって、該対象に、請求項1〜10のいずれか一項記載の単離されたNK前駆細胞集団又は請求項11記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
前記血液癌が急性骨髄性白血病である、請求項14記載の方法。