WO2018110159A1 - 哺乳動物細胞凍結保存液 - Google Patents

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WO2018110159A1
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mammalian
cell
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stem cells
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西村　益浩
奈月 渡邉
泰毅 藤田
圭樹 和田
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株式会社大塚製薬工場
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Definitions

  • the present invention relates to 2.0 to 6.0 (w / v)% trehalose or a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes referred to as “trehaloses”), 4.0 to 7.0 (w / v).
  • trehaloses An isotonic solution containing% dextran or a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes referred to as “dextran”) and dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”) or glycerin (glycerol).
  • a mammalian cell cryopreservation solution and a mammalian cell administration solution and a method for cryopreserving mammalian cells comprising a step of cryopreserving mammalian cells in the mammalian cell cryopreservation solution.
  • Cell cryopreservation has been widely used as an indispensable technique in cell biology research.
  • cell cryopreservation technology has not only preserved various cell lines in cell banks around the world, but also species preservation in the livestock industry, cryopreservation of sperm, eggs, or fertilized eggs for increased livestock production, It is applied to germ cell cryopreservation in reproductive medicine.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (Embryonic Stem cells; ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) have unlimited proliferation ability and pluripotency into various tissue cells It is a cell.
  • Human pluripotent stem cells are expected to be applied to regenerative medicine using their properties.To achieve this, high-quality cell freezing technology, that is, high cell viability and undifferentiation after thawing is required. Establishment of cell freezing technology to ensure is essential.
  • the cell cryopreservation method is generally classified into a slow freezing method and a quick freezing method (vitrification method).
  • the slow freezing method cells are suspended in a cryopreservation solution (Patent Documents 1 to 5) containing glycerin, DMSO, keratin hydrolyzate, hydrolysed gelatin, serum, serum albumin and the like as cryoprotective agents. It is a method of gradually freezing by lowering the temperature to about °C. By slowly cooling, intracellular water molecules are replaced with cryoprotectants, dehydrated, and growth of ice crystals in and around the cells is suppressed, damage to cell membranes and intracellular structures, protein denaturation and Cutting is prevented (Non-Patent Document 1).
  • the vitrification method is a method of freezing into a glass state by rapid cooling in order to suppress the formation of ice crystals inside and outside the cells by freezing.
  • the vitrification method took a long period of time from technical reporting until it was put into practical use in 1937, but in 1985 a glass containing a cryoprotectant composed of high concentrations of DMSO, acetamide, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • a method using a chemical preservation solution has been developed. The development of this method enabled cryopreservation of early mouse embryos and bovine embryos and pig embryos, which was difficult with the slow freezing method.
  • vitrification is used in many institutions including embryo banks.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • Non-Patent Document 3 suspending human ES cells and iPS cells in a cryopreservation solution (STEM-CELLBANKER [manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.]) and cryopreserving them using the simple slow freezing method will increase cell viability after thawing. Is disclosed (Non-Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a cell cryopreservation solution and a mammalian cell administration solution capable of effectively suppressing cell death after cryopreserving and thawing mammalian cells, and mammalian cells using the cell cryopreservation solution It is to provide a cryopreservation method.
  • the present inventor added DMSO or glycerin to the isotonic solution in the course of earnest research to solve the above problems, and further added trehaloses and dextrans to 2.0 to 6.0 (w / When mammalian cells are cryopreserved in a solution added to v)% and 4.0 to 7.0 (w / v)%, cell death after thawing is compared to a conventional mammalian cell cryopreservation solution. Has been found to be effectively suppressed, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows. [1] 2.0 to 6.0 (w / v)% trehalose or a derivative thereof or a salt thereof; 4.0 to 7.0 (w / v)% dextran or a derivative thereof or a salt thereof A mammalian cell cryopreservation solution comprising an isotonic solution containing DMSO or glycerin. [2] The mammalian cell cryopreservation solution according to [1] above, wherein the mammalian cell is a mammalian mesenchymal stem cell.
  • [5] The mammalian cell cryopreservation solution according to any one of [1] to [4] above, wherein the isotonic solution is a lactated Ringer solution.
  • a mammalian cell administration solution comprising the mammalian cell cryopreservation solution according to any one of [1] to [5] above.
  • the liquid for mammalian cell administration described in [6] above, wherein the mammalian cell is a mammalian mesenchymal stem cell.
  • the liquid for mammalian cell administration described in [7] above, wherein the mammalian mesenchymal stem cells are human adipose mesenchymal stem cells.
  • a method for cryopreserving mammalian cells comprising a step of cryopreserving mammalian cells in the mammalian cell cryopreservation solution according to any one of [1] to [5] above.
  • a combination of trehaloses, dextrans, DMSO or glycerin, and isotonic solution for cryopreserving mammalian cells, or a mammalian cell cryopreservation solution is prepared.
  • cell death at the time of thawing cryopreserved mammalian cells can be effectively suppressed as compared with conventional mammalian cell cryopreservation solutions.
  • a liquid can be provided.
  • the mammalian cell cryopreservation solution of the present invention is an isotonic solution containing trehaloses, dextrans, DMSO and / or glycerin (hereinafter referred to as “this case”), which is limited to the use of “for cryopreserving mammalian cells”. It may be referred to as a “freezing preservation solution”.
  • the isotonic solution is not particularly limited as long as it is an isotonic solution in which the salt concentration, sugar concentration, etc. are adjusted with sodium ions, potassium ions, calcium ions, etc. so as to be almost the same as the osmotic pressure of body fluid or cell fluid.
  • physiological saline and physiological saline having a buffering effect Phosphate buffered saline (PBS), Tris buffered saline (Tris buffered saline; TBS), HEPES buffered saline Ringer's solution, lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, bicarbonated Ringer's solution, 5% glucose aqueous solution, basal medium for animal cell culture (DMEM, EMEM, RPMI-1640, ⁇ -MEM, F-12, F-10, M-199) Etc.), isotonic agents (glucose, D-sorbitol, D-mannitol, lactose, sodium chloride, etc.) Ringer's lactate is preferred among Luo.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Tris buffered saline Tris buffered saline
  • HEPES buffered saline Ringer's solution lactated
  • Isotonic solutions may be commercially available or prepared by themselves.
  • Commercially available Otsuka raw food injection (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (saline solution), Ringer's solution “Otsuka” (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (Ringer solution), Lactec (registered trademark) Note (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (Lactate Ringer Solution), Lactate Ringer Solution “KS” (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (Lactate Ringer Solution), Vein F Infusion (Kowa Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.) (Acetate Ringer Solution), Otsuka Sugar Solution 5% (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) 5% glucose aqueous solution), bicanate infusion (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) (bicarbonate Ringer's solution).
  • “isotonic” means that the osmotic pressure is in the range of 250 to
  • trehalose in the above trehaloses is a 1,1-glycosidically linked ⁇ -glucose and ⁇ -glucose.
  • examples include ⁇ , ⁇ -trehalose, which is a disaccharide, and ⁇ , ⁇ -trehalose, which is a disaccharide in which two ⁇ -glucoses are linked by 1,1-glycoside.
  • ⁇ , ⁇ -trehalose is preferable. .
  • trehaloses can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms, production by enzymes, etc., but commercially available products can also be used. Examples thereof include commercially available products such as ⁇ , ⁇ -trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) and ⁇ , ⁇ -trehalose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the trehalose derivative in the trehalose is not particularly limited as long as it is a glycosyl trehalose in which one or a plurality of sugar units are bonded to the disaccharide trehalose. Trehalose and the like are included.
  • Examples of the salt of trehalose and its derivatives in the trehalose include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, Acid addition salts such as succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate And metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, ammonium salt and alkylammonium salt. These salts are used as a solution at the time of use, and the action is preferably the same as that of trehalose. These salts may form a hydrate or a solvate, and can be used alone or in combination of two or more.
  • the dextran in the dextran is not particularly limited as long as it is a polysaccharide (C 6 H 10 O 5 ) n consisting of D-glucose and having an ⁇ 1 ⁇ 6 bond as the main chain, and the weight average molecular weight of dextran
  • These dextrans can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms, production by enzymes, etc., but commercially available products can also be used.
  • commercially available products such as dextran 40 (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and dextran 70 (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) can be mentioned.
  • dextran derivatives in the above dextrans include dextran sulfate, carboxylated dextran, diethylaminoethyl (DEAE) -dextran, and the like.
  • salts of dextran and derivatives thereof in the above dextrans include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, Acid addition salts such as succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate And metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, ammonium salt and alkylammonium salt. These salts are used as a solution at the time of use, and the action is preferably the same as that of dextran. These salts may form a hydrate or a solvate, and can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of trehalose in the present cryopreservation solution may be in the range of 2.0 to 6.0 (w / v)%, for example, 2.0 to 5.6 (w / v)%, 2.0 to 5.2 (w / v)%, 2.0 to 4.8 (w / v)%, 2.0 to 4.4 (w / v)%, 2.0 to 4.0 ( w / v)%, 2.0-3.6 (w / v)%, 2.0-3.2 (w / v)%, 2.0-3.0 (w / v)%, 2.
  • the concentration of dextran in the present cryopreservation solution may be in the range of 4.0 to 7.0 (w / v)%, for example, 4.0 to 6.6 (w / v)%, 4.0 to 6.2 (w / v)%, 4.0 to 5.8 (w / v)%, 4.0 to 5.4 (w / v)%, 4.0 to 5.0 ( w / v)%, 4.4 to 7.0 (w / v)%, 4.8 to 7.0 (w / v)%, 5.2 to 7.0 (w / v)%, 5. Examples thereof include 6 to 7.0 (w / v)% and 6.0 to 7.0 (w / v)%, and 4.0 to 5.0 (w / v)% is preferable.
  • the concentration of DMSO in the present cryopreservation solution is usually 0.1 (v / v)% or more, preferably 0.3 (v / v)% or more, more preferably 0.6 (v / v)% or more, More preferably, it is 1.0 (v / v)% or more, and from the viewpoint of avoiding cytotoxicity, usually 30 (v / v)% or less, preferably 25 (v / v)% or less, more preferably It is 20 (v / v)% or less, more preferably 15 (v / v)% or less.
  • the concentration of DMSO in the present cryopreservation solution is usually within the range of 0.1 to 30 (v / v)%, preferably 0.3 to 25 (v / v)%, more preferably Is 0.6 to 20 (v / v)%, more preferably 1.0 to 15 (v / v)%.
  • DMSO can be produced by chemical synthesis, but commercially available products can also be used. For example, commercially available products such as those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and Nacalai Tesque can be mentioned.
  • the concentration of glycerin in the present cryopreservation solution is usually 0.1 (v / v)% or more, preferably 0.3 (v / v)% or more, more preferably 0.6 (v / v)% or more, More preferably, it is 1.0 (v / v)% or more, and considering the ease of preparation of the present cryopreservation solution, it is usually 50 (v / v)% or less, preferably 40 (v / v) % Or less, more preferably 30 (v / v)% or less, still more preferably 20 (v / v)% or less.
  • the concentration of glycerin in the present cryopreservation solution is usually in the range of 0.1 to 50 (v / v)%, preferably 0.3 to 45 (v / v)%, more preferably Is 0.6 to 30 (v / v)%, more preferably 1.0 to 20 (v / v)%.
  • Glycerin can be produced by chemical synthesis, but a commercially available product can also be used. For example, commercially available products such as those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and Nacalai Tesque can be mentioned.
  • This cryopreservation solution contains trehalose, dextran, DMSO and / or glycerin (hereinafter, these) as active ingredients (cryoprotective ingredients) that suppress cell death when cryopreserving mammalian cells and then thawing them.
  • active ingredients include trehalose, dextran, DMSO and / or glycerin (hereinafter, these) as active ingredients (cryoprotective ingredients) that suppress cell death when cryopreserving mammalian cells and then thawing them.
  • the present cryoprotective component The fact that this cryopreservation solution can suppress cell death when cryopreserving mammalian cells and then thawing them is the cells such as Trypan Blue staining method, TUNEL method, Nexin method, FLICA method, etc. It can be confirmed using a known method capable of detecting death.
  • cryoprotective components other than the present cryoprotective component eg, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, sericin, isomaltoligosaccharide), isotonic agents (eg, glucose, D-sorbitol, D-mannitol, lactose, sodium chloride, etc.), chelating agents (eg, EDTA, EGTA, citric acid, salicylate), solubilizers, preservatives, antioxidants, amino acids (eg, proline, glutamine), etc. it can.
  • the “optional component” means a component that may or may not be included.
  • this cryopreservation solution does not contain serum derived from humans, cows or the like or serum-derived components (eg, albumin).
  • the liquid for mammalian cell administration of the present invention is the present cryopreservation solution limited to the use of “in order to administer mammalian cells to a mammal”, that is, the use of “to cryopreserve mammalian cells”, and An isotonic solution containing trehaloses, dextrans, DMSO and / or glycerin, limited to the use of “for administering mammalian cells to mammals”.
  • the cryopreservation solution (preferably containing little or no serum or serum-derived component) may adversely affect the mammal's living body even if administered directly into the mammal's living body (for example, intravenous administration). Does not reach.
  • the present cryopreservation solution (preferably one containing little or no serum or serum-derived component) is “a mammalian cell is cryopreserved and, after thawing, the mammalian cell is administered to the mammal (for example, Can be advantageously used as a “liquid for intravenous administration”.
  • the method for cryopreserving mammalian cells of the present invention comprises a step of cryopreserving mammalian cells in the present cryopreservation solution, that is, a step of cryopreserving the present cryopreservation solution containing mammalian cells.
  • a slow freezing method for example, the present cryopreservation solution containing mammalian cells is frozen in a low-temperature freezer or an ultra-low temperature freezer (usually within a range of ⁇ 20 ° C. to ⁇ 150 ° C.), and then liquid nitrogen (usually normal And a method of storing in a range of ⁇ 150 ° C. to ⁇ 196 ° C.
  • the rapid freezing method for example, mammalian cells are suspended in the present cryopreservation solution, transferred to a straw as necessary, and rapidly frozen in liquid nitrogen (usually within a range of ⁇ 150 ° C. to ⁇ 196 ° C.).
  • the method of freezing and storing can be mentioned.
  • Cell viability when mammalian cells are cryopreserved and then thawed may vary depending on the type of mammalian cell. For this reason, it is preferable to select a cryopreservation method with a higher cell viability after freeze-thawing according to the cells to be cryopreserved.
  • mammalian cells examples include mammalian islet cells administered intravenously to patients with type I diabetes, mammals administered intravenously to cancer patients, in addition to mammalian stem cells administered via blood vessels for regenerative medicine and the like.
  • mammalian stem cells examples thereof include animal dendritic cells, natural killer cells, alpha-beta ( ⁇ ) T cells, gamma delta ( ⁇ ) T cells, cytotoxic T cells (CTL) and the like.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses and sheep, cats such as dogs and cats, etc.
  • mice, pigs, and humans can be preferably exemplified.
  • stem cell means an immature cell having self-renewal ability and differentiation / proliferation ability.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells (pluripotent stem ce11), multipotent stem cells (multipotent stem ce11), unipotent stem cells (unipotent stem ce11), etc., depending on their differentiation ability.
  • pluripotent stem cell means a cell that cannot be an individual by itself, but has the ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body.
  • a multipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), EG cells, iPS cells, and the like.
  • ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. Methods for producing ES cells are described in, for example, WO96 / 22362, WO02 / 101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like.
  • EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF and bFGF (Ce11, 70: 841-847, 1992).
  • iPS cells are produced by introducing reprogramming factors such as Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (c-Myc or n-Myc as necessary) into somatic cells (eg, fibroblasts, skin cells, etc.).
  • somatic cells eg, fibroblasts, skin cells, etc.
  • Stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 385, 810 (1997); Science, 280, 1256 (1998); Nature Biotechnology, 17,456 (1999); Nature, 394,369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. 2000)).
  • Multipotent stem cells include mesenchymal stem cells that can differentiate into cells such as adipocytes, bone cells, and chondrocytes; hematopoietic stem cells that can differentiate into blood cells such as leukocytes, erythrocytes, and platelets; neurons, astrocytes, Examples include neural stem cells that can differentiate into cells such as oligodendrocytes; somatic stem cells such as bone marrow stem cells and germ stem cells;
  • the multipotent stem cell is preferably a mesenchymal stem cell.
  • mesenchymal stem cell is meant a stem cell that can differentiate into all or some of osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts.
  • Multipotent stem cells can be isolated from a living body by a method known per se.
  • mesenchymal stem cells can be collected by known general methods from mammalian bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, umbilical cord blood and the like.
  • human mesenchymal stem cells can be isolated by culture and passage of hematopoietic stem cells after bone marrow puncture (Journalourof Autoimmunity, 30 (2008) 163-171).
  • Multipotent stem cells can also be obtained by culturing the pluripotent stem cells under appropriate induction conditions.
  • the mesenchymal stem cell is preferably a mesenchymal stem cell derived from human fat.
  • adherent cells can be exemplified.
  • the “adhesive” cell means an anchorage-dependent cell that can survive, proliferate, and produce a substance by adhering to the scaffold.
  • adherent stem cells include pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, nervous system stem cells, bone marrow stem cells, and reproductive stem cells.
  • the adherent stem cells are preferably mesenchymal stem cells.
  • the mammalian cells (population) stored in the present cryopreservation solution may be isolated from the living body or subcultured in vitro, but are isolated or purified. It is preferable.
  • “isolation or purification” means that an operation for removing components other than the target component has been performed.
  • the purity of the isolated or purified mammalian cells is usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, More preferably, it is 90% or more (for example, 100%).
  • the mammalian cells (population) stored in the present cryopreservation solution are preferably in a single cell (single cell) state.
  • the “single cell state” means that the cells do not gather together to form a lump (that is, they are not aggregated).
  • a mammalian cell in the state of a single cell is obtained by suspending the mammalian cell cultured in vitro by enzyme treatment with trypsin / EDTA or the like, and then suspending the cell by a well-known method in the art such as pipetting or tapping. Can be prepared.
  • the proportion of mammalian cells in a single cell state contained in the mammalian cells is usually 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 99% or more (for example, 100%). is there.
  • the proportion of cells in a single cell state is determined by dispersing mammalian cells in PBS and observing the cells under a microscope to examine whether a plurality of randomly selected cells (for example, 1000 cells) are aggregated. Can be determined.
  • a lactated Ringer's solution containing 3 (w / v)% trehalose and 5 (w / v)% dextran 40 may be referred to as a “TDR solution” for convenience.
  • TDR solution consists of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.), low molecular dextran L injection (10 [w / v]% dextran-containing lactec injection) (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) Prepared.
  • hAD-MSC was cultured according to a conventional method. That is, hAD-MSC was converted into ADSC-BM (Adipose Derived Stem Cell Basal Medium) (Lonza Walkersville, PT-3273) containing human adipose-derived stem cell additive factor set (Lonza Walkersville, PT-4503) (hereinafter referred to as PT-3273). It was put into a 75 cm 2 flask to which the simply added “culture medium” was added and subcultured in a CO 2 incubator (under 37 ° C.). The culture medium was changed every 3 days.
  • ADSC-BM Adipose Derived Stem Cell Basal Medium
  • PT-4503 human adipose-derived stem cell additive factor set
  • Preparation and freezing of cryopreservation solution containing mammalian cells Preparation and freezing of a mammalian cell-containing cryopreservation solution were performed according to the following procedures [1] to [12]. [1] The personal incubator was heated to 37 ⁇ 2 ° C. [2] A 75 cm 2 flask in which hAD-MSC was cultured was taken out of the CO 2 incubator. [3] The state of the cells was observed under an inverted microscope, and about 90% (80-100%) confluent was used. [4] The culture solution was aspirated, and 8 mL of PBS ( ⁇ ) was added to each 75 cm 2 flask.
  • trypsin / EDTA (CC-5012, Lonza Walkersville) was added to the flask and incubated for 5 minutes in a personal incubator at 37 ⁇ 2 ° C.
  • trypsin neutralization solution (TNS; CC-5002, manufactured by Lonza Walkersville) was added in an amount of 8 mL each, and the cells were detached by pipetting and transferred to a 50 mL conical tube.
  • STEM-CELLBANKER manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • TDR solution containing 10% DMSO the cell viability immediately after thawing showed the same high value as that of STEM-CELLBANKER (Table 4).
  • the numerical values (number of cells) in the table are shown as relative values when the number of cells immediately after (freezing) thawing is defined as 100 in cells stored with DMSO at various concentrations.
  • the numerical values in the table indicate the cell viability (%) immediately after freezing and thawing.
  • the numerical values in the table indicate the cell viability (%) when allowed to stand at 25 ° C. for 6 hours after freeze-thawing.
  • the numerical values in the table indicate the cell viability (%) when allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours after freeze-thawing.
  • the numerical values (number of cells) in the table are shown as relative values when the number of cells at the time of seeding (immediately after freezing and thawing) is defined as 100 in various cell cryopreservation solutions.
  • the values on the first day to the seventh day are average values ⁇ standard deviation (SD).
  • the trehalose and dextran concentrations in the table indicate the concentration (%) before mixing with DMSO, and the concentration (%) after mixing with DMSO is shown in parentheses. Moreover, the survival rate in a table
  • the trehalose and dextran concentrations in the table indicate the concentration (%) before mixing with DMSO, and the concentration (%) after mixing with DMSO is shown in parentheses. Moreover, the survival rate in a table
  • cell death at the time of thawing a cryopreserved mammalian cell can be effectively suppressed, so that it is useful in the field of transplantation medical treatment and cancer treatment in regenerative medicine.

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Abstract

本発明は、哺乳動物細胞を凍結保存し、融解した後に、細胞死を効果的に抑制できる細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することを課題とする。　２．０～６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０～７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ＤＭＳＯ又はグリセリンとを含む等張液を、哺乳動物細胞凍結保存液又は哺乳動物細胞投与用液とし、当該胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、融解後の細胞死を効果的に抑制できる。

Description

哺乳動物細胞凍結保存液
　本発明は、２．０～６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「トレハロース類」ということがある）と、４．０～７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「デキストラン類」ということがある）と、ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide；以下、「ＤＭＳＯ」という）又はグリセリン（グリセロール）とを含む等張液からなる哺乳動物細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、哺乳動物細胞をかかる哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えた哺乳動物細胞の凍結保存方法に関する。
　細胞の凍結保存は、細胞生物学の研究において必要不可欠な技術として広く利用されてきた。近年、細胞凍結保存技術は、世界中の細胞バンクにて種々の株化細胞の保存のみならず、畜産業界における種の保存、家畜増産のための精子、卵子、又は受精卵の凍結保存や、生殖医療における生殖細胞の凍結保存等に応用されている。
　胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞)や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、無限の増殖能力と多様な組織細胞への多分化能を有する細胞である。ヒト多能性幹細胞は、その性質を利用して再生医療への応用が期待されており、それを実現するためには質の高い細胞凍結技術、すなわち解凍後に高い細胞生存率や未分化性を保障する細胞凍結技術の確立は必須である。
　細胞の凍結保存方法は、一般に緩慢凍結法と急速凍結法（ガラス化法）に大別される。緩慢凍結法は、グリセリン、ＤＭＳＯ、ケラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、血清、血清アルブミン等を凍結保護剤として含む凍結保存液（特許文献１～５）中に細胞を懸濁し、１分に１℃程度に温度を下げて徐々に凍結する方法である。緩慢に冷却することにより細胞内の水分子が凍結保護剤と置換し、脱水され、細胞内や細胞周辺部の氷結晶の成長が抑えられ、細胞膜及び細胞内構造の損傷や、タンパク質の変性及び切断を防ぐ（非特許文献１)。最近では、胚を凍結保存する場合は除き、一般的な細胞を凍結保存する場合は、プログラムフリーザーを用いて温度調節を厳密に制御しなくても、発砲スチロールの箱や市販の細胞凍結ボックスを用いて緩慢に凍結できることがわかってきた。このような方法は簡便であることから、簡易緩慢凍結法とも呼ばれ、研究室や細胞バンク等で広く用いられている。
　他方、ガラス化法は、凍結による細胞内外の氷結晶生成を抑制するため、急速な冷却によりガラス状に凍結させる方法である。ガラス化法は、１９３７年に報告されてから実用化までの技術開発に長い期間を要したが、１９８５年に高濃度のＤＭＳＯ、アセトアミド、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる凍結保護剤を含むガラス化保存液を用いる方法が開発された。この方法の開発により、マウス初期胚の凍結保存や、緩慢凍結法では困難であったウシ胚やブタ胚の凍結保存が可能となった。現在、胚バンクをはじめ多くの機関でガラス化法が用いられている。
　最近、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の凍結保存液の開発や、凍結保存方法の改良が盛んに行なわれている。例えば、ヒトＥＳ細胞を５％ＤＭＳＯ、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）、及び１０％エチレングリコール（ＥＧ）を含む凍結保存液中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることが開示されている（非特許文献２）。また、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を凍結保存液（STEM-CELLBANKER［日本全薬工業社製］）中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることが開示されている（非特許文献３）。
国際公開第２００３／０６４６３４号パンフレット 特開平６－４６８４０号公報 特開平７－２５５４６９号公報 特開平８－３２５１０１号公報 特開２００２－２３３３５６号公報
J. R. Dobrinsky，Theriogenology， 45，17-26 (1996） Y. S. Ha et al., Human Reprod., 20, 1779-1785 (2005) F. Holm et al., Human Reprod., 25, 1271-1279 (2010)
　本発明の課題は、哺乳動物細胞を凍結保存し、融解した後に、細胞死を効果的に抑制できる細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、等張液に、ＤＭＳＯ又はグリセリンを添加し、さらに、トレハロース類及びデキストラン類を、それぞれ２．０～６．０（ｗ／ｖ）％及び４．０～７．０（ｗ／ｖ）％となるように添加した溶液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、融解後の細胞死を効果的に抑制できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕２．０～６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０～７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ＤＭＳＯ又はグリセリンとを含む等張液からなることを特徴とする哺乳動物細胞凍結保存液。
〔２〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔１〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔３〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔２〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔４〕ＤＭＳＯ又はグリセリンが、１．０～１５（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯであることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔５〕等張液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔６〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液からなることを特徴とする哺乳動物細胞投与用液。
〔７〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔６〕に記載の哺乳動物細胞投与用液。
〔８〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔７〕に記載の哺乳動物細胞投与用液。
〔９〕哺乳動物細胞を、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えたことを特徴とする哺乳動物細胞の凍結保存方法。
〔１０〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔９〕に記載の凍結保存方法。
〔１１〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔１０〕に記載の凍結保存方法。
　本発明の実施の他の形態として、哺乳動物細胞を凍結保存するための、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、等張液との組合せや、哺乳動物細胞凍結保存液を調製するための、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、等張液との組合せの使用を挙げることができる。
　本発明によると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、凍結保存した哺乳動物細胞を融解した際の細胞死を、効果的に抑制することができるため、再生医療における良質な移植用細胞含有液を提供することができる。
　本発明の哺乳動物細胞凍結保存液は、「哺乳動物細胞を凍結保存するため」という用途に限定された、トレハロース類とデキストラン類とＤＭＳＯ及び／又はグリセリンとを含む等張液（以下、「本件凍結保存液」ということがある）からなる液である。
　上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水［Phosphate buffered saline；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養用基礎培地（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等）、等張剤（ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）などを挙げることができ、これらの中でも乳酸リンゲル液が好ましい。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、大塚生食注（大塚製薬工場社製）（生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬工場社製）（リンゲル液）、ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）（乳酸リンゲル液）、乳酸リンゲル液「ＫＳ」（共立製薬社製）（乳酸リンゲル液）、ヴィーンＦ輸液（興和興和創薬社製）（酢酸リンゲル液）、大塚糖液５％（大塚製薬工場社製）（５％グルコース水溶液）、ビカネイト輸液（大塚製薬工場社製）（重炭酸リンゲル液）を挙げることができる。本明細書において「等張」とは、浸透圧が２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内であることを意味する。
　上記トレハロース類におけるトレハロースとしては、２つのα-グルコースが１，１－グリコシド結合した二糖類であるα，α－トレハロースの他に、α-グルコースとβ－グルコースとが１，１－グリコシド結合した二糖類であるα，β－トレハロースや、２つのβ－グルコースが１，１－グリコシド結合した二糖類であるβ，β－トレハロースを挙げることができるが、これらの中でもα，α－トレハロースが好ましい。これらトレハロースは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、α，α－トレハロース（株式会社林原社製）、α，α－トレハロース（和光純薬社製）等の市販品を挙げることができる。
　上記トレハロース類におけるトレハロース誘導体としては、二糖類のトレハロースに１又は複数の糖単位が結合したグリコシルトレハロース類であれば特に制限されず、グリコシルトレハロース類には、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース等が含まれる。
　上記トレハロース類におけるトレハロースやその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、トレハロースの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　上記デキストラン類におけるデキストランとしては、Ｄ－グルコースからなる多糖（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎであって、α１→６結合を主鎖とするものであれば特に制限されず、デキストランの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、例えば、デキストラン４０（Ｍｗ＝４００００）、デキストラン７０（Ｍｗ＝７００００）などを挙げることができる。これらデキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、デキストラン４０（東京化成工業社製）、デキストラン７０（東京化成工業社製）等の市販品を挙げることができる。
　上記デキストラン類におけるデキストラン誘導体としては、デキストラン硫酸、カルボキシル化デキストラン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストランなどが含まれる。
　上記デキストラン類におけるデキストランやその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、デキストランの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本件凍結保存液中のトレハロース類の濃度としては、２．０～６．０（ｗ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、２．０～５．６（ｗ／ｖ）％、２．０～５．２（ｗ／ｖ）％、２．０～４．８（ｗ／ｖ）％、２．０～４．４（ｗ／ｖ）％、２．０～４．０（ｗ／ｖ）％、２．０～３．６（ｗ／ｖ）％、２．０～３．２（ｗ／ｖ）％、２．０～３．０（ｗ／ｖ）％、２．４～６．０（ｗ／ｖ）％、２．８～６．０（ｗ／ｖ）％、３．２～６．０（ｗ／ｖ）％、３．６～６．０（ｗ／ｖ）％、４．０～６．０（ｗ／ｖ）％、４．４～６．０（ｗ／ｖ）％、４．８～６．０（ｗ／ｖ）％、５．０～６．０（ｗ／ｖ）％、２．４～６．０（ｗ／ｖ）％、２．４～５．６（ｗ／ｖ）％、２．４～５．２（ｗ／ｖ）％、２．４～４．８（ｗ／ｖ）％、２．４～４．４（ｗ／ｖ）％、２．４～４．０（ｗ／ｖ）％、２．４～３．６（ｗ／ｖ）％、２．４～３．２（ｗ／ｖ）％、２．４～３．０（ｗ／ｖ）％を挙げることができ、２．４～３．０（ｗ／ｖ）％が好ましい。
　本件凍結保存液中のデキストラン類の濃度としては、４．０～７．０（ｗ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、４．０～６．６（ｗ／ｖ）％、４．０～６．２（ｗ／ｖ）％、４．０～５．８（ｗ／ｖ）％、４．０～５．４（ｗ／ｖ）％、４．０～５．０（ｗ／ｖ）％、４．４～７．０（ｗ／ｖ）％、４．８～７．０（ｗ／ｖ）％、５．２～７．０（ｗ／ｖ）％、５．６～７．０（ｗ／ｖ）％、６．０～７．０（ｗ／ｖ）％を挙げることができ、４．０～５．０（ｗ／ｖ）％が好ましい。
　本件凍結保存液中のＤＭＳＯの濃度は、通常０．１（ｖ／ｖ）％以上、好ましくは０．３（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは０．６（ｖ／ｖ）％以上、さらに好ましくは１．０（ｖ／ｖ）％以上であり、また、細胞毒性を回避する観点から、通常３０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは２５（ｖ／ｖ）％以下、より好ましくは２０（ｖ／ｖ）％以下、さらに好ましくは１５（ｖ／ｖ）％以下である。したがって、本件凍結保存液中のＤＭＳＯの濃度としては、通常０．１～３０（ｖ／ｖ）％の範囲内であり、好ましくは０．３～２５（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは０．６～２０（ｖ／ｖ）％であり、さらに好ましくは１．０～１５（ｖ／ｖ）％である。ＤＭＳＯは、化学合成により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等の市販品を挙げることができる。
　本件凍結保存液中のグリセリンの濃度は、通常０．１（ｖ／ｖ）％以上、好ましくは０．３（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは０．６（ｖ／ｖ）％以上、さらに好ましくは１．０（ｖ／ｖ）％以上であり、また、本件凍結保存液の調製のしやすさを考慮すると、通常５０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは４０（ｖ／ｖ）％以下、より好ましくは３０（ｖ／ｖ）％以下、さらに好ましくは２０（ｖ／ｖ）％以下である。したがって、本件凍結保存液中のグリセリンの濃度としては、通常０．１～５０（ｖ／ｖ）％の範囲内であり、好ましくは０．３～４５（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは０．６～３０（ｖ／ｖ）％であり、さらに好ましくは１．０～２０（ｖ／ｖ）％である。グリセリンは、化学合成により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等の市販品を挙げることができる。
　本件凍結保存液は、哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞死を抑制する有効成分（凍結保護成分）として、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ及び／又はグリセリン（以下、これらを総称して「本件凍結保護成分」ということがある）とを含むものである。本件凍結保存液が、哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞死を抑制できるものであることは、トリパンブルー（Trypan Blue）染色法、ＴＵＮＥＬ法、Ｎｅｘｉｎ法、ＦＬＩＣＡ法などの細胞死を検出できる公知の方法を用いて確認することができる。
　本件凍結保存液における任意成分としては、本件凍結保護成分以外の凍結保護成分（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、セリシン、イソマルトオリゴ糖）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、溶解補助剤、保存剤、酸化防止剤、アミノ酸（例えば、プロリン、グルタミン）などを挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
　また、本件凍結保存液は、ヒト、ウシ等由来の血清又は血清由来成分（例えば、アルブミン）を含まない。
　本発明の哺乳動物細胞投与用液は、「哺乳動物細胞を哺乳動物に投与するため」という用途に限定された本件凍結保存液、すなわち、「哺乳動物細胞を凍結保存するため」という用途、及び「哺乳動物細胞を哺乳動物に投与するため」という用途に限定された、トレハロース類とデキストラン類とＤＭＳＯ及び／又はグリセリンとを含む等張液である。本件凍結保存液（好ましくは、上記血清又は血清由来成分がほとんど又は全く含まれないもの）は、哺乳動物の生体内へそのまま投与（例えば、静脈投与）しても、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼさない。このため、本件凍結保存液（好ましくは、上記血清又は血清由来成分がほとんど又は全く含まれないもの）は、「哺乳動物細胞を凍結保存し、融解後に、哺乳動物細胞を哺乳動物に投与（例えば、静脈投与）するための」液として有利に用いることができる。
　本発明の哺乳動物細胞の凍結保存方法としては、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存する工程、すなわち、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を凍結保存する工程を備えたものであれば特に制限されず、緩慢凍結法であっても、急速凍結法（ガラス化法）であってもよい。かかる緩慢凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を、低温フリーザーや超低温フリーザー（通常－２０℃～－１５０℃の範囲内）中で凍結し、その後、液体窒素（通常－１５０℃～－１９６℃の範囲内）中で保存する方法を挙げることができる。上記急速凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に懸濁後、必要に応じてストロー内に移し、液体窒素（通常－１５０℃～－１９６℃の範囲内）中で急速冷凍し、保存する方法を挙げることができる。哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞生存率は、哺乳動物細胞の種類によって異なることがある。このため、凍結保存対象の細胞に応じて、凍結融解後の細胞生存率がより高い凍結保存方法を選択することが好ましい。
　上記哺乳動物細胞としては、再生医療等に血管経由で投与される哺乳動物幹細胞の他に、Ｉ型糖尿病患者に経静脈投与される哺乳動物の膵島細胞、がん患者に経静脈投与される哺乳動物の樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、アルファ・ベータ（αβ）Ｔ細胞、ガンマ・デルタ（γδ）Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte；ＣＴＬ）等を例示することができる。本明細書において、哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。
　また上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞等を挙げることができる。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦを含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ce11,70:841-847,1992）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じてさらにｃ－Ｍｙｃ又はｎ－Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861‐872,2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324,2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007）。また、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞として好ましい（Nature,385,810（1997）；Science,280,1256（1998）；Nature Biotechnology,17,456（1999）；Nature,394,369（1998）；Nature Genetics,22,127（1999）；Proc.Nat1. Acad.Sci.USA,96,14984（1999））、Rideout IIIら（Nature Genetics,24,109（2000））。
　複能性幹細胞としては、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等の細胞に分化可能な間葉系幹細胞；白血球、赤血球、血小板等の血球系細胞に分化可能な造血系幹細胞；ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等の細胞に分化可能な神経系幹細胞；骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞；等を挙げることができる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞を意味する。複能性幹細胞は、自体公知の方法により、生体から単離することができる。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。また、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity，30（2008）163-171）。複能性幹細胞は、上記多能性幹細胞を適切な誘導条件下で培養することによっても得ることができる。間葉系幹細胞は、好ましくはヒト脂肪由来の間葉系幹細胞である。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞として、付着性の細胞を例示することができる。本明細書中、「付着性」細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。付着性幹細胞としては、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等を挙げることができる。付着性幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、生体内から分離されたものであっても、インビトロで継代培養されたものであってもよいが、単離又は精製されていることが好ましい。本明細書中、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された哺乳動物細胞の純度（全細胞数に対する、哺乳動物幹細胞数等の目的とする細胞の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、単一細胞（シングルセル）の状態であることが好ましい。本明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。単一細胞の状態の哺乳動物細胞は、インビトロで培養した哺乳動物細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ等で酵素処理した後、ピペッティングやタッピング等の当該技術分野における周知の方法により細胞を懸濁することにより調製することができる。哺乳動物細胞中に含まれる単一細胞の状態の哺乳動物細胞の割合は、通常７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上（例えば１００％）である。単一細胞の状態の細胞の割合は、哺乳動物細胞をＰＢＳに分散し、これを顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより決定することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、３（ｗ／ｖ）％トレハロース及び５（ｗ／ｖ）％デキストラン４０を含む乳酸リンゲル液を、便宜上「ＴＤＲ液」ということがある。
１．本件凍結保存液が、哺乳動物細胞凍結保存液として有用であることの確認
　本件凍結保存液が、哺乳動物細胞凍結保存液として有用であることを確認するために、哺乳動物細胞を、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、ＴＤＲ液との混合液中に凍結保存し、融解後の細胞生存率を解析した。
１－１　材料及び方法
［哺乳動物細胞］
　試験には、以下の表１に記載のヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ；Human Adipose derived Mesenchymal Stem Cell）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［ＴＤＲ液］
　ＴＤＲ液は、トレハロース（株式会社林原社製）、低分子デキストランＬ注（１０［ｗ／ｖ］％デキストラン含有ラクテック注）（大塚製薬工場社製）、及びラクテック注（大塚製薬工場社製）を用いて調製した。
［哺乳動物細胞の培養］
　ｈＡＤ－ＭＳＣは定法にしたがって培養した。すなわち、ｈＡＤ－ＭＳＣを、ヒト脂肪由来幹細胞添加因子セット（Lonza Walkersville社製、PT-4503）を含むＡＤＳＣ－ＢＭ（Adipose Derived Stem Cell Basal Medium）（Lonza Walkersville社製、PT-3273）（以下、単に「培養液」という）を添加した７５ｃｍ２フラスコに入れ、ＣＯ２インキュベーター（３７℃条件下）内で継代培養した。また、培養液の交換は３日毎行った。
［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］
　哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結は、以下の〔１〕～〔１２〕の手順にしたがって行った。
〔１〕パーソナルインキュベーターを３７±２℃に加温しておいた。
〔２〕ｈＡＤ－ＭＳＣを培養している７５ｃｍ２フラスコを、ＣＯ２インキュベーターから取り出した。
〔３〕倒立顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約９０％（８０～１００％）コンフルエントのものを使用した。
〔４〕培養液を吸引し、ＰＢＳ（－）を各７５ｃｍ２フラスコに８ｍＬずつ添加した。
〔５〕ＰＢＳ（－）を吸引後、トリプシン／ＥＤＴＡ（CC-5012、Lonza Walkersville社製）をフラスコに４ｍＬずつ添加し、パーソナルインキュベーターにて３７±２℃条件下で５分間インキュベートした。
〔６〕細胞が９０％程度剥離するまで倒立顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔７〕トリプシン反応を停止させるために、トリプシン中和液（ＴＮＳ；CC-5002、LonzaWalkersville社製）を８ｍＬずつ加えて、ピペッティングにより細胞を剥離し、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
〔８〕遠心（遠心機の設定条件：２１０×g、遠心時間５分間、２０℃）処理後、上清を除去し、一定量（各７５ｃｍ２フラスコ当たり２ｍＬ）のＰＢＳ（－）を添加し、細胞を懸濁した。
〔９〕細胞懸濁液から一部（２０μＬ）分取し、２０μＬのトリパンブルー染色液（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤で全細胞数及び死細胞数を計測した。なお、計測細胞数は、細胞計数盤を用いて、1ヵ所の細胞計数部における四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数とした。
〔１０〕残りの細胞懸濁液を、フィンピペット（１００－１０００μＬ）を用いて、１５ｍＬクラリファインドポリプロピレンコニカルチューブに一定量ずつ分注し、２１０×ｇ、５分間、２５℃で遠心処理した。
〔１１〕上清を除去し、３．０×１０６細胞／ｍＬとなるように各種細胞凍結保存液（０、０．５、１．０、２．０、５．０、若しくは１０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）又は１０（ｖ／ｖ）％グリセリン（和光純薬工業社製）を含むＴＤＲ液、或いはSTEM-CELLBANKER［日本全薬工業社製］）中に細胞を懸濁した。
〔１２〕専用のバイアルに１ｍＬずつ細胞懸濁液を分注し、バイセル凍結処理容器（日本フリーザー社製）に入れて、－８０℃にて細胞を凍結（３時間以上）し、その後すみやかに液体窒素タンクに移した。
［評価法］
　哺乳動物細胞含有凍結保存液を凍結融解後、生細胞率及び細胞増殖率の評価は、以下の手順〔１〕～〔６〕にしたがって行った。
〔１〕恒温槽を３７℃に設定し、加温しておいた。
〔２〕培養に必要な個数の７５ｃｍ２フラスコに、培養液を添加して、ＣＯ２インキュベーター内で３０分以上静置し、平衡化した。
〔３〕液体窒素タンクから凍結した細胞を含むバイアルを取り出し、素早く３７℃に設定した恒温槽に移し、軽く撹拌しながら融解した。
〔４〕緩やかに攪拌（ピペッティングを５回）し、細胞が懸濁した状態で、その一部（２０μＬ）を、予めトリパンブルー染色液２０μＬを添加した１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。トリパンブルー染色液と混和した細胞懸濁液を、細胞計数盤に分取し、全細胞数及びトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数を計測することにより、凍結融解直後の細胞生存率（表２［ｎ＝１］及び表４［ｎ＝３］）を算出した。
〔５〕残りの細胞懸濁液を用いて、３．０×１０６細胞／ｍＬとなるように、予め用意した培養液を含む７５ｃｍ２フラスコに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。また、一部残った細胞懸濁液は、２５℃で６時間及び２４時間静置した後、上記［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］の項目に記載の手順〔９〕にしたがって、全細胞数及び死細胞数を計測することにより、凍結融解後に２５℃で６時間及び２４時間静置したときの細胞生存率（表５［ｎ＝３］及び表６［ｎ＝３］）を算出した。
〔６〕培養後１、３、５、及び７日目に、上記［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］の項目に記載の手順〔１〕～〔９〕にしたがって、細胞を回収後、全細胞数を計測することにより、凍結融解後に１、３、５、及び７日間培養したときの細胞増加率（表３［ｎ＝２］及び表７［ｎ＝３］）を算出した。
１－２　結果
　まず、ＴＤＲ液に加えるＤＭＳＯの濃度について検討した。その結果、１．０～１０％のＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存すると、融解直後の細胞生存率（表２）や細胞増殖率（表３）は、いずれも高いものであった。これらの結果から、以下の実験においては、ＴＤＲ液に加えるＤＭＳＯの濃度は、１０％に固定した。
　次に既存の細胞凍結保存液であるSTEM-CELLBANKER（日本全薬工業社製）との比較実験を行った。その結果、１０％ＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存したときの融解直後の細胞生存率は、STEM-CELLBANKERと同レベルの高い値を示した（表４）。また、凍結融解後に２５℃で６時間及び２４時間静置したときの細胞生存率は、１０％ＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存した方が、STEM-CELLBANKER中に細胞を凍結保存した場合よりも高かった（表５及び６）。さらに、ＤＭＳＯに代えてグリセリンをＴＤＲ液に添加した細胞凍結保存液を用いた場合も同様の効果が得られた（表５及び６）。なお、ＤＭＳＯ又はグリセリンをＴＤＲ液に混合後、トレハロース濃度は２．７％であり、デキストラン濃度は４．５％であった。一方、１０％ＤＭＳＯ又は１０％グリセリンを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存したときの細胞増殖効率は、STEM-CELLBANKERと同レベルの高い値を示した（表７）。
　以上の結果は、２．７％前後（２．０～６．０％）のトレハロース及び４．５％前後（４．０～７．０％）のデキストランと、ＤＭＳＯやグリセリンとを含む等張液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、既存の哺乳動物細胞凍結保存液（STEM-CELLBANKER）を用いた場合と同程度の増殖効率が得られることを示すとともに、凍結融解後の細胞生存率については、既存の哺乳動物細胞凍結保存液（STEM-CELLBANKER）を用いた場合よりも高いという優れた効果が得られることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表中の数値（細胞数）は、各濃度のＤＭＳＯで保存した細胞において、（凍結）融解直後の細胞数を１００としたときの相対値として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
表中の数値は、凍結融解直後の細胞生存率（％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
表中の数値は、凍結融解後に２５℃で６時間静置したときの細胞生存率（％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
表中の数値は、凍結融解後に２５℃で２４時間静置したときの細胞生存率（％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
表中の数値（細胞数）は、各種細胞凍結保存液において、播種時（凍結融解直後）の細胞数を１００としたときの相対値として示す。また、１日目～７日目の値は平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
２．トレハロース及びデキストランの併用による凍結保護効果、並びに哺乳動物細胞凍結保存液中のトレハロース及びデキストラン濃度の検討
　トレハロース及びデキストランの併用による凍結保護効果、並びに哺乳動物細胞凍結保存液中のトレハロース及びデキストラン濃度を検討するために、実施例１に記載の方法に従って、３％のトレハロース、及び０～１０％のデキストランを含む乳酸リンゲル液と、１０％のＤＭＳＯとの混合液（表８）や、０～１０％のトレハロース、及び５％のデキストランを含む乳酸リンゲル液と、１０％のＤＭＳＯとの混合液（表９）を調製し、これら混合液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解後の細胞生存率（表８及び９）を算出した。
　その結果、トレハロース及びデキストランを併用した方が、トレハロース又はデキストランを単独で用いた場合と比べ、凍結融解後の細胞生存率は高くなることが示された。また、トレハロース及びデキストランの濃度は、それぞれ少なくとも０．９％あれば、９割以上の細胞が生存することが示された（表８及び９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 表中のトレハロース及びデキストラン濃度は、ＤＭＳＯ混合前の濃度（％）を示し、括弧内には、ＤＭＳＯ混合後の濃度（％）を示す。また、表中の生存率は、凍結融解直後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）（％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 表中のトレハロース及びデキストラン濃度は、ＤＭＳＯ混合前の濃度（％）を示し、括弧内には、ＤＭＳＯ混合後の濃度（％）を示す。また、表中の生存率は、凍結融解直後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）（％）を示す。
　本発明によると、凍結保存した哺乳動物細胞を融解した際の細胞死を、効果的に抑制することができるため、再生医療等における移植医療分野やがん治療分野で有用である。
 

Claims (11)

  1. 　２．０～６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０～７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ジメチルスルホキシド又はグリセリンとを含む等張液からなることを特徴とする哺乳動物細胞凍結保存液。
  2. 　哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  3. 　哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  4. 　ジメチルスルホキシド又はグリセリンが、１．０～１５（ｖ／ｖ）％のジメチルスルホキシドであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  5. 　等張液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液からなることを特徴とする哺乳動物細胞投与用液。
  7. 　哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の哺乳動物細胞投与用液。
  8. 　哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の哺乳動物細胞投与用液。
  9. 　哺乳動物細胞を、請求項１～５のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えたことを特徴とする哺乳動物細胞の凍結保存方法。
  10. 　哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の凍結保存方法。
  11. 　哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の凍結保存方法。
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